ES2314980T3 - Composiciones recombinantes de virus de la rabia-viruela y composicion combinadas y sus utilizaciones. - Google Patents

Composiciones recombinantes de virus de la rabia-viruela y composicion combinadas y sus utilizaciones. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBEN Y REIVINDICAN VIRUS RECOMBINANTES ATENUADOS QUE CONTIENEN ADN QUE CODIFICA UN ANTIGENO DEL VIRUS DE LA RABIA EN UN COCTEL O COMPOSICIONES DE COMBINACION O MULTIVALENTES, ASI COMO PROCEDIMIENTOS PARA FABRICAR Y UTILIZAR LAS COMPOSICIONES, LOS PRODUCTOS DE EXPRESION DE LAS MISMAS, Y LOS ANTICUERPOS GENERADOS. LOS VIRUS RECOMBINANTES PUEDEN SER VIRUS RECOMBINANTES NYVAC O ALVAC. LAS COMPOSICIONES Y LOS PRODUCTOS PROCEDENTES DE LAS MISMAS Y LOS ANTICUERPOS GENERADOS PRESENTAN VARIOS USOS PREVENTIVOS, TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO.

Description

Composiciones recombinantes de virus de la rabia-viruela y composiciones combinadas y sus utilizaciones.
Campo de la invención
La presente invención trata de un virus recombinante de la viruela del canario atenuado, especialmente un virus recombinante de la rabia ALVAC, composiciones del mismo y composiciones combinadas y usos del mismo. Por tanto, la invención trata de un virus recombinante de la rabia del canario, el cual expresa productos génicos del virus de la rabia en una composición; la composición incluye cualquiera de entre: antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno de parainfluenza canina, antígeno de parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, o cualquier combinación de estos antígenos. Tal composición puede inducir una respuesta inmunológica contra infecciones del virus de la rabia, así como contra cualquier otro antígeno de la composición, cuando se administra a un huésped; y, la composición puede provocar inmunidad (respuesta) a largo plazo contra la rabia en perros, así como puede proporcionar protección o provocar una respuesta inmunológica en cachorros que tengan inmunidad materna. La invención trata además de procedimientos para generar y utilizar dichas composiciones. Nosotros adicionalmente describimos los productos de expresión del virus de la viruela los cuales por si mismos son útiles para provocar una respuesta inmune por ejemplo, aumentando los anticuerpos, los cuales son útiles contra la infección de la rabia, o cuyos productos de expresión o anticuerpos obtenidos de tal modo, aislados de un animal o humano o cultivo celular como puede ser el caso, son útiles para preparar un equipo de diagnóstico, prueba o ensayo para la detección de la rabia, y el virus recombinante, o de células infectadas, o, de la expresión de los antígenos o productos en otros sistemas. Los productos de expresión aislados y los anticuerpos obtenidos por el virus recombinante son especialmente útiles en equipos, pruebas o ensayos para la detección de anticuerpos o antígenos en un sistema, huésped, suero o muestra; y los productos de expresión son útiles para la generación de anticuerpos.
En la presente solicitud se referencian diversas publicaciones. La mención completa de estas referencias se encuentra al final de la especificación inmediata precedente a las reivindicaciones o donde la publicación se mencione.
Antecedentes de la invención
El virus vaccinia y más recientemente otros virus de la viruela han sido usados para la inserción y expresión de genes foráneos. La técnica básica de inserción de genes foráneos en virus infecciosos y vivos de la viruela implica la recombinación entre secuencias de ADN del virus de la viruela que flanquean un elemento genético foráneo en un plásmido donante y secuencias homólogas presentes en el virus de la viruela rescatado (Piccini y col., 1987).
Específicamente, los virus recombinantes de la viruela se construyen en dos pasos conocidos en la materia y análogos a los procedimientos para crear virus recombinantes de viruela sintéticos tales como el virus vaccinia y el virus de la viruela aviar descritos en las Patentes Americanas 4.769.330, y 4.603.112.
En primer lugar, la secuencia de ADN génica a insertar en el virus, particularmente una pauta abierta de lectura de fuente distinta al virus de la viruela, se coloca en una construcción plasmídica de E. coli en la cual se ha insertado el ADN homólogo a la sección de ADN del virus de la viruela. Por separado, la secuencia de ADN génica insertar se liga a un promotor. La fusión promotor-gen se coloca en la construcción plasmídica de modo que dicha fusión promotor-gen queda flanqueada a ambos lados por ADN homólogo a la secuencia de ADN flanquenate de una región del ADN de viruela que contiene un locus no esencial. La construcción plasmídica resultante se amplifica entonces por crecimiento en bacterias E. coli (Clewell, 1972) y se aísla a continuación (Clewell y col., 1969; Maniatis y col., 1982).
En segundo lugar, el plásmido aislado que contiene la secuencia de ADN génica a insertar se transfecta en un cultivo celular, por ejemplo fibroblastos embrionarios de pollo, junto con el virus de la viruela. La recombinación entre ADN homólogo de viruela en el plásmido y el genoma viral respectivamente produce un virus modificado de la viruela por la presencia, en una región no esencial de su genoma, de secuencias de ADN foráneo. El término ADN "foráneo" designa un ADN exógeno, particularmente ADN que no procede del virus de la viruela y que codifica para productos génicos no producidos comúnmente por el genoma en los cuales se coloca dicho ADN exógeno.
La recombinación genética es en general el intercambio de secciones homólogas de ADN entre dos hebras de ADN. En ciertos virus el ADN puede ser reemplazado por ARN. Las secciones homólogas de ácido nucleico son secciones de ácido nucleico (ADN o ARN) las cuales tienen la misma secuencia de bases nucleotídicas.
La recombinación genética puede tener lugar de forma natural durante la replicación o generación de nuevos genomas virales en la célula huésped infectada. Por tanto, la recombinación genética entre genes virales puede ocurrir durante el ciclo de replicación viral que tiene lugar en una célula huésped, la cual está coinfectada con dos o más virus diferentes u otras construcciones genéticas. Una sección de ADN de un primer genoma se utiliza de modo intercambiable en la construcción de la sección del genoma de un segundo virus coinfectante en el cual el ADN es homólogo con el del primer genoma viral.
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Sin embargo, la recombinación también puede tener lugar entre secciones de ADN de diferentes genomas que no sean perfectamente homólogos. Si una de estas secciones es de un primer genoma homólogo con una sección de otro genoma exceptuando la presencia en la primera sección de, por ejemplo, un marcador genético o un gen codificante de un determinante antigénico insertado en una porción del ADN homólogo, la recombinación todavía puede tener lugar y los productos de esa recombinación son entonces detectables gracias a la presencia de ese marcador genético o gen en el genoma del virus recombinante. Recientemente, se han presentado estrategias adicionales para la generación de virus recombinante de vaccinia.
La expresión exitosa de la secuencia genética de ADN insertada por el virus infeccioso modificado requiere dos condiciones. Primero, la inserción debe estar en una región no esencial del virus con el fin de que el virus modificado permanezca viable. La segunda condición para la expresión del ADN insertado es la presencia de un promotor situado adecuadamente con el ADN insertado. El promotor se debe colocar de manera que se sitúe en dirección 5' de la secuencia de ADN a expresar.
El virus vaccinia se ha utilizado exitosamente para la inmunización contra la viruela, culminando con la erradicación mundial de la viruela en 1980. A lo largo de su historia, han surgido muchas cepas de vaccinia. Estas cepas diferentes demuestran una inmunogenicidad variable y están implicadas en grados diversos en complicaciones potenciales, las más graves de las cuales son la encefalitis post-vaccinial e infección generalizada por vaccinia (Behbehani, 1983).
Con la erradicación de la viruela, se desarrolló una nueva aplicación para vaccinia, el de un vector genéticamente diseñado para la expresión de genes foráneos. Genes que codifican un gran número de antígenos heterólogos se han expresado en vaccinia, a menudo resultando en inmunidad protectora contra una infección del patógeno correspondiente (revisado en Tartaglia y col., 1990).
Se ha demostrado que el fondo genético del vector vaccinia afecta la eficacia protectora del inmunógeno foráneo presentado. Por ejemplo, la expresión del Virus Epstein Barr (EBV, del inglés "Epstein Barr Virus") gp340 en la cepa de vacuna Wyeth del virus vaccinia no protegía a titís cabez blanca contra el linfoma inducido por el virus EBV, mientras que la expresión del mismo gen en la cepa de laboratorio WR del virus vaccinia era protectora (Morgan y col., 1988).
Un buen equilibrio entre la eficacia y la seguridad de un candidato de vacuna recombinante basada en virus vaccinia es sumamente importante. El virus recombinante debe presentar el(los) inmunógeno(s) de forma tal que pueda obtenerse una respuesta inmune protectora en el animal vacunado pero que carezca de propiedades patógenas considerables. Por consiguiente la atenuación de la cepa del vector sería un avance muy deseado en el ámbito actual de la tecnología.
Se han identificado varios genes de vaccinia los cuales no son esenciales para el crecimiento del virus en cultivo tisular y cuya deleción o inactivación reduce la virulencia en diversos sistemas animales.
El gen que codifica la timidina quinasa (TQ) del virus vaccinia se ha localizado (Hruby y col., 1982) y secuenciado (Hruby y col., 1983; Weir y col., 1983). La inactivación o deleción completa del gen timidina quinasa no previene el crecimiento del virus vaccinia en una amplia variedad de células en cultivo tisular. El virus vaccinia TQ- también es capaz de replicarse in vivo en el sitio de inoculación en una variedad de huéspedes y puede ser administrado por vías diversas.
Se ha demostrado para el virus herpes simplex tipo 2 que la inoculación intravaginal de cobayas con virus TQ- resulta en concentraciones considerablemente más bajas de virus en la médula espinal que la inoculación con virus TQ+ (Stanberry y col., 1985). Se ha demostrado que la actividad TQ codificada por el virus herpes in vitro no es importante para el crecimiento del virus en células metabólicamente activas, pero es necesario para el crecimiento del virus en células quiescentes (Jamieson y col., 1974).
La atenuación de vaccinia TQ- ha sido demostrada en ratones inoculados por vía intracerebral e intraperitoneal (Buller y col., 1985). La atenuación se observó tanto en la cepa neurovirulenta de laboratorio WR como en la cepa de vacuna Wyeth. En ratones inoculados por vía intradérmica, el virus recombinantes de vaccinia TQ- generó cantidades equivalentes de anticuerpos neutralizantes anti-vaccinia en comparación con el virus parental TQ+, indicando que en este sistema de prueba la pérdida de función TQ no disminuye considerablemente la inmunogenicidad del vector virus vaccinia. Tras la inoculación intranasal de ratones con virus recombinante de vaccinia TK- y TK+ (cepa WR), se halló una diseminación considerablemente inferior del virus a otras zonas, incluyendo el cerebro (Taylor y col., 1991a).
Otra enzima involucrada en el metabolismo nucleotídico es la ribonucleótido reductasa. Se demostró que la pérdida de actividad de la ribonucleótido reductasa del virus herpes simplex (VHS) mediante deleción del gen que codifica la subunidad mayor no producía efectos sobre el crecimiento viral ni sobre la síntesis de ADN en células en división in vitro, pero comprometía severamente la capacidad del virus para crecer en células privadas de suero (Goldstein y col., 1988). Utilizando un modelo de ratón para la infección ocular aguda por VHS y para la infección latente reactivable en ganglios trigéminos, se demostró una virulencia reducida para el VHS con deleción de la subunidad mayor de la ribonucleótido reductasa, en comparación con la virulencia presentada por el VHS de tipo silvestre (Jacobson y col., 1989).
Tanto la subunidad menor (Slabaugh y col., 1988) como la subunidad mayor (Schmidtt y col., 1988) de la ribonucleótido reductasa han sido identificadas en el virus vaccinia. La inactivación insercional de la subunidad mayor de la ribonucleótido reductasa en la cepa WR del virus vaccinia conduce a la atenuación del virus según cuantificación obtenida mediante inoculación intracraneal del ratón (Child y col., 1990).
El gen de la hemaglutinina (HA) del virus vaccinia se ha mapeado y secuenciado (Shida, 1986). El gen HA del virus vaccinia no es esencial para el crecimiento en cultivo tisular (Ichihashi y col., 1971). La inactivación del gen HA del virus vaccinia trae como consecuencia neurovirulencia reducida en conejos inoculados por vía intracraneal y lesiones más pequeñas en conejos en el sitio de la inoculación intradérmica (Shida y col., 1988). El locus HA se utilizó para la inserción de genes foráneos en la cepa WR (Shida y col., 1987), en derivados de la cepa Lister (Shida y col., 1988) y en la cepa Copenhague (Guo y col., 1989) del virus vaccinia. Se ha demostrado que el virus recombinante de vaccinia HA- que expresa genes foráneos es inmunogénico (Guo y col., 1989; Itamura y col., 1990; Shida y col., 1988; Shida y col., 1987) y protector contra una infección del patógeno relevante (Guo y col., 1989; Shida y col., 1987).
El virus de la viruela bovina (cepa Brighton roja) produce pústulas rojas (hemorrágicas) en la membrana corioalantoidea de los embriones de pollo. Deleciones espontáneas dentro del genoma de la viruela bovina generan mutantes los cuales producen pústulas blancas (Pickup y col., 1984). La función hemorrágica (u) se sitúa en una proteína de 38 kDa codificada por un gen temprano (Pickup y col., 1986). Se ha demostrado que este gen, el cual tiene homología con los inhibidores de serina proteasa, inhibe la respuesta inflamatoria del huésped contra el virus de la viruela bovina (Palumbo y col., 1989) y es un inhibidor de la coagulación sanguínea.
El gen u está presente en la cepa WR del virus vaccinia (Kotwal y col., 1989b). Ratones inoculados con un virus recombinante de vaccinia WR en el cual se ha inactivado la región u mediante inserción de un gen foráneo producen niveles de anticuerpo más elevados contra el producto del gen foráneo comparado con ratones inoculados con un virus recombinante de vaccinia similar en el cual el gen u está intacto (Zhou y col., 1990). La región u se encuentra en una forma defectuosa no funcional en la cepa Copenhague del virus vaccinia (pautas abiertas de lectura B13 y B14 según la terminología dada en Goebel y col., 1990a,b).
El virus de la viruela bovina se localiza en células infectadas en cuerpos de inclusión citoplásmicos tipo A (ITA) (Kato y col., 1959). Se cree que la función de los ITA es la protección de los viriones del virus de la viruela bovina durante la diseminación de animal a animal (Bergoin y col., 1971). La región ITA del genoma de la viruela bovina codifica una proteína de 160 kDa la cual forma la matriz de los cuerpos ITA (Funahashi y col., 1988; Patel y col., 1987). El virus vaccinia, aunque contiene una región homóloga en su genoma, generalmente no produce ITA. En la cepa WR de vaccinia, la región ITA del genoma se traduce como una proteína de 94 kDa (Patel y col., 1988). En la cepa Copenhague del virus vaccinia, la mayoría de las secuencias de ADN que corresponden a la región ITA están delecionadas, con el extremo 3' restante de la región fusionado con secuencias cadena arriba de la región ITA para formar una pauta abierta de lectura (MAL) A26L (Goebel y col., 1990a,b).
Se han notificado varias deleciones espontáneas (Altenburger y col., 1989; Drillien y col., 1981; Lai y col., 1989; Moss y col., 1981; Paez y col., 1985; Panicali y col., 1981) y diseñadas (Perkus y col., 1991; Perkus y col., 1989; Perkus y col., 1986) cerca del extremo izquierdo del genoma del virus vaccinia. Se ha demostrado que la cepa AWR del virus vaccinia con una deleción espontánea de 10 kb (Moss y col., 1981; Panicali y col., 1981) está atenuada mediante experimentos de inoculación intracraneal en ratones (Buller y col., 1985). Más tarde se demostró que esta deleción incluía 17 ORFs potenciales (Kotwal y col., 1988b). Entre los genes específicos dentro de la región delecionada se incluyen el N1L de la viroquina y una proteína de 35 kDa (C3L, según la terminología dada en Goebel y col., 1990a,b). La inactivación insercional de N1L reduce la virulencia tal como se demuestra mediante experimentos de inoculación intracraneal tanto para ratones normales como desnudos (Kotwal y col., 1989a). La proteína de 35 kDa se secreta como N1L en el medio de células infectadas con virus vaccinia. La proteína contiene homología con la familia de las proteínas de control del complemento, particularmente con la proteína de unión al (C4bp, del inglés "complement 4B binding protein") (Kotwal y col., 1988a). Como el C4bp celular, la proteína de 35 kDa de vaccinia se une al cuarto componente del complemento e inhibe la cascada clásica del complemento (Kotwal y col., 1990). Por tanto la proteína de vaccinia de 35 kDa parece estar involucrada en ayudar al virus a evadir los mecanismos de defensa del huésped.
El extremo izquierdo del genoma de vaccinia incluye dos genes los cuales se han identificado como host range genes, K1L (Gillard y col., 1986) y C7L (Perkus y col., 1990). La deleción de ambos genes reduce la capacidad del virus vaccinia para crecer en una variedad de líneas celulares humanas (Perkus y col., 1990).
Dos sistemas adicionales de vectores de vacunas involucran el uso de virus de la viruela restringidos a huésped naturales, los virus de la viruela aviar. Tanto el virus de la viruela aviar en aves de corral (FPV, del inglés "Fowlpox virus") como el virus de la viruela del canario (CPV, del inglés "canarypox virus") han sido diseñados para expresar productos génicos foráneos. El virus de la viruela aviar en aves de corral (FPV) es el virus prototipo del género Avipox de la familia de los Poxvirus. El virus causa una enfermedad en aves de corral económicamente importante la cual ha estado bien controlada desde los años 1920 mediante el uso de vacunas vivas atenuadas. La replicación de los virus de la viruela aviar se limita a la especie aviar (Matthews, 1982) y no hay ninguna documentación bibliográfica sobre el virus de la viruela aviar como causante de una infección productiva en alguna especie no aviar incluyendo el hombre. Esta restricción de huésped proporciona una barrera de seguridad inherente frente a la transmisión del virus a otras especies y hace que el uso de vectores de vacunas basados en el virus de la viruela aviar en veterinaria y aplicaciones humanas sea una propuesta atractiva.
El FPV se ha usado de manera ventajosa como un vector que expresa antígenos de patógenos de aves de corral. La proteína hemaglutinina de un virus influenza virulento aviar se expresó en un virus recombinante de FPV (Taylor y col., 1988a). Tras la inoculación del virus recombinante en pollos y pavos, se indujo una respuesta inmune la cual era protectora contra la infección de un virus virulento influenza homólogo o heterólogo (Taylor y col., 1988a). También se han desarrollado virus recombinantes de FPV que expresan las glicoproteínas de superficie del virus de la enfermedad de Newcastle (Taylor y col., 1990; Edbauer y col., 1990).
A pesar de la restricción del huésped para la replicación de FPV y CPV en sistemas aviares, se descubrió que los virus recombinantes derivados de estos virus expresaban proteínas extrínsecas en células de origen no aviar. Además, se demostró que dichos virus recombinantes provocaban respuestas inmunológicas dirigidas hacia el producto génico foráneo y cuando era apropiado proporcionaban protección contra una infección del patógeno correspondiente (Tartaglia y col., 1993a,b; Taylor y col., 1992; 1991b; 1988b).
En la actualidad, una vacuna antirrábica combinada, polivalente o "cóctel", o una composición inmunológica (el antígeno de la rabia en combinación con uno o más antígenos adicionales en una composición), en particular para canes, no está disponible en EEUU debido a la incapacidad de cualquier combinación previa para pasar las pruebas de eficacia. Dichas combinaciones previas presentan lo que se conoce como "interferencia con la eficacia", es decir un fallo de uno o más antígenos, como el antígeno de la rabia, o de antígenos adicionales en la composición combinada para mantener o conseguir la eficacia deseada. Se cree que esto es debido a la interferencia sobre aquel antígeno que estimula una respuesta inmunológica, antigénica, de anticuerpo, o protectora en el huésped, por ejemplo el perro, cuando se administra debido a la presencia del antígeno de la rabia u otro(s) antígeno(s) adicional(es). Por ejemplo, antígenos de la rabia en combinación con antígenos adicionales sufren interferencia de o interfieren con la estimulación de una respuesta inmunológica, antigénica, de anticuerpo o protectora por esos antígenos adicionales en dicha composición, cuando se administra esa composición a perros. Más particularmente, los antígenos de la rabia, cuando se administran con uno o más, o todos, los antígenos del virus del moquillo canino, antígenos del adenovirus canino, antígenos del coronavirus canino, antígenos de la parainfluenza canina, antígenos del parvovirus canino, y antígenos de Bacterina Leptospira, pueden interferir con la respuesta provocada por estos antígenos, y viceversa. Sin embargo, para otros huéspedes, como los gatos, se conocen vacunas combinadas. Quizás, sin ánimo de estar supeditado a ninguna teoría en concreto, la "interferencia con la eficacia" se debe a (i) alguna peculiaridad del huésped, por ejemplo un huésped canino, sistema biológico o, (ii) la reacción con el huésped, por ejemplo canino, sistema biológico por antígenos de la rabia actualmente conocidos o, (iii) la reacción con el huésped, por ejemplo, sistema biológico canino por antígenos adicionales actualmente conocidos en tales composiciones combinadas previas o, (iv) alguna combinación de los factores de (i) a (iii). Cualquiera de las composiciones combinadas conocidas que contienen el antígeno de la rabia no son mediante virus recombinantes y tienen un adyuvante.
Independientemente de la teoría, se cree que en la actualidad no hay ninguna combinación de rabia con composiciones antigénicas adicionales, especialmente para utilización canina, la cual no muestre interferencia con la eficacia. Hay por tanto necesidad de una composición combinada de la rabia, especialmente para uso canino. Por consiguiente, en cachorros y perros, para su protección los antígenos de la rabia normalmente se administran por separado y no en una composición combinada con antígeno(s). Sería verdaderamente sorprendente, inesperado y nada evidente ser capaz de formular una composición combinada (con otros antígenos) de la rabia, es decir, una composición polivalente de la rabia, la cual muestra ausencia de interferencia con la eficacia, especialmente en canes, en particular, como indica el conocimiento actual y la interferencia con la eficacia, uno no puede simplemente combinar composiciones antigénicas para preparar una composición combinada o polivalente o "cóctel" útil. En este caso (de la frase anterior), "composiciones antigénicas" puede referirse a virus recombinantes de la viruela los cuales codifican y expresan un antígeno ellos mismos o a una combinación de tales virus recombinantes y antígenos. También sería conveniente si un antígeno de la rabia el cual se pueda realmente utilizar en una composición combinada o "cóctel" para canes pueda también utilizarse en dicha composición para otros huéspedes, como por ejemplo los felinos. De esta manera, el antígeno de la rabia para varias composiciones combinadas o polivalentes o "cóctel" de uso veterinario no necesita variar, proporcionando así una ventaja económica en la manufacturación de las mismas.
Adicionalmente, sería ventajoso si tal antígeno de la rabia proporcionara una protección a largo plazo o provocara una respuesta a largo plazo en canes, así como protección o respuesta contra la rabia en cachorros con inmunidad materna. Como es del conocimiento de un experto en la materia, la inmunidad materna es la inmunidad que adquiere un recién nacido de su madre al nacer y/o mediante la lactancia, cuya inmunidad, tras un periodo de tiempo, se pierde en el recién nacido, dejando así al recién nacido susceptible. Además, la presencia de anticuerpos maternos en el recién nacido puede impedir que el recién nacido obtenga una respuesta protectora o inmunológica cuando se le administre una composición antigénica, por ejemplo, una vacuna, lo que significa por tanto que el recién nacido entra en un periodo de poca o ninguna inmunidad, es decir, de susceptibilidad, a riesgo del recién nacido antes de que la administración de una composición antigénica o de vacuna pueda ser considerada. En lo que respecta a la inmunidad materna, se hace referencia a la Patente Americana U.S. 5.338.683, publicada el 16 de Agosto de 1994 y
Sería todavía más ventajoso, sorprendente e inesperado si el antígeno de la rabia, el cual se pueda utilizar en una composición combinada, "cóctel" o polivalente, que carezca de interferencia con la eficacia en canes y que pueda ser utilizada en dicha composición para otros huéspedes como felinos, y, que proporcione una respuesta o protección a largo plazo en perros así como una respuesta o protección en cachorros, a pesar de la inmunidad materna, fuera un virus recombinante, como un virus recombinante de viruela-rabia. Y, además, sería especialmente sorprendente e inesperado si este virus recombinante de viruela-rabia se modificara de manera que estuviera atenuado, por ejemplo, un virus recombinante de vaccinia-rabia atenuado o un virus recombinante de viruela aviar-rabia atenuado, como un virus recombinante de NYVAC-rabia o un virus recombinante de ALVAC-rabia; porque, por ejemplo, por atenuación y, disminución o carencia de replicación productiva del virus de la viruela en el huésped, un experto en la materia no esperaría ni se sorprendería de la inutilidad del virus recombinante atenuado para una composición "cóctel", polivalente, o combinada para canes y otros huéspedes, especialmente en aquélla composición la cual proporciona una respuesta o protección a largo plazo en canes y respuesta o protección en cachorros a pesar de la inmunidad protectora.
Los vectores de virus de la viruela atenuados también serían especialmente ventajosos para composiciones antigénicas o de vacuna, especialmente composiciones combinadas o "cóctel" o polivalentes, particularmente en vista de que los vectores atenuados proporcionan pocas o reducidas propiedades patogénicas, o bien ninguna en lo que se refiere al huésped pretendido o, al no pretendido, posiblemente huéspedes accidentales, tales como aquéllos que trabajan con el vector en la formulación o administración del vector o antígeno, o que puedan entrar en contacto con él. Es decir, los vectores de virus de la viruela atenuados proporcionan pocas, disminuidas o ninguna propiedad patogénica a los huéspedes pretendidos tales como perros, cachorros, gatos, gatitos y similares y a los huéspedes no pretendidos, posiblemente huéspedes accidentales, como humanos ocupados en la formulación del vector en una composición para su administración o en administrar la composición (por ejemplo, veterinarios, técnicos, otros trabajadores) o, aquellos que puedan entrar en contacto de otra manera con el vector (por ejemplo, los dueños de mascotas).
Se puede por tanto apreciar que la provisión de un virus recombinante de viruela y rabia, y de composiciones y productos del mismo, particularmente virus recombinantes de la rabia basados en NYVAC o ALBAC y composiciones y productos de los mismos, especialmente aquellas composiciones que contienen otros antígenos, por ejemplo, composiciones y productos "cóctel" o polivalentes o combinados de los mismos los cuales carecen de interferencia con la eficacia en canes, se pueden administrar a otros huéspedes, tales como los felinos (o bien como una composición de virus recombinante de viruela-rabia o bien como un componente en la composición "cóctel", combinada o multivalente) y, los cuales pueden inducir una respuesta o protección a largo plazo en perros y respuesta o protección en cachorros a pesar de la inmunidad materna, sería un avance muy deseado en el estado actual de la tecnología.
Resumen de la invención
Es por lo tanto un objetivo de esta invención proporcionar virus recombinantes modificados, que tengan una seguridad aumentada, y proporcionar un procedimiento para fabricar dichos virus recombinantes.
Entre los objetivos adicionales de esta invención se incluyen: proporcionar una composición de virus recombinante de viruela o una composición antigénica, preferiblemente una composición de virus recombinante de viruela-rabia, que sea una composición antigénica, de vacuna o inmunológica (es decir, una composición que contenga un virus recombinante el cual exprese un antígeno de la rabia, o el producto de la expresión del antígeno), más preferiblemente, que dicha composición tenga un nivel aumentado de seguridad y/o eficacia comparado con composiciones conocidas y composiciones "cóctel" o polivalentes o combinadas conocidas; proporcionar procedimientos para la fabricación y utilización de las mismas; y más preferiblemente proporcionar composiciones las cuales sean eficaces como composiciones "cóctel" o polivalentes o combinadas para perros, así como para otros huéspedes, tales como felinos, y las cuales también más preferiblemente puedan proporcionar una respuesta o protección a largo plazo, especialmente en canes, y/o una respuesta o protección a pesar de la inmunidad materna.
Es otro objetivo más de esta invención proporcionar un vector modificado para expresar un producto génico en un huésped, donde el vector se modifica para tener una virulencia atenuada en el huésped.
También describimos un procedimiento para expresar un producto génico en una célula cultivada in vitro utilizando un virus recombinante o un vector modificado que tiene un nivel aumentado de seguridad y para proporcionar la utilización de dicho producto en composiciones.
Éstos y otros objetivos y ventajas de la presente invención se harán más evidentes tras la consideración de lo siguiente.
Se describe un virus recombinante que tiene las funciones genéticas codificadas por el virus inactivadas de manera que el virus recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad aumentada. Las funciones pueden ser no esenciales, o asociadas con virulencia. El virus es un virus de la viruela del canario. El virus recombinante incluye, en una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heteróloga la cual codifica un antígeno o epítopo derivado del virus de la rabia, con antígenos de otras enfermedades.
Por un lado, la presente invención se relaciona con una composición antigénica, inmunológica o de vacuna o una composición terapéutica para inducir una respuesta antigénica o inmunológica o protectora en un animal huésped inoculado con la composición, dicha composición incluyendo un transportador y un virus recombinante que tiene las funciones genéticas no esenciales codificadas por el virus inactivadas de manera que el virus recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad aumentada. El virus utilizado en la composición de acuerdo a la presente invención es un virus de la viruela del canario. El virus recombinante incluye, en una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heteróloga la cual codifica por lo menos un epítopo de la glicoproteína G de la rabia y aún más, la composición contiene antígenos adicionales tales como cualquiera de: antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno de la parainfluenza canina, antígeno del parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, cualquier combinación de estos antígenos; u otros virus recombinantes tales como virus recombinantes de otros virus de la viruela los cuales expresan todos o cualquiera de estos antígenos adicionales.
Por otro lado, la presente invención se relaciona con usos que emplean la composición anteriormente mencionada para la preparación de un medicamento para el tratamiento inmunológico de, o para inducir una respuesta inmunológica en, un individuo o animal; por ejemplo, para obtener una respuesta in vivo al antígeno de la rabia o solo o con cualquiera de: antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno de la parainfluenza canina, antígeno del parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, o cualquier combinación de estos antígenos. El medicamento se puede administrar o a canes o a otros huéspedes, tales como felinos. El medicamento se puede administrar a canes u otros huéspedes para una inmunidad o respuesta a largo plazo, o para una respuesta o protección en recién nacidos, por ejemplo, cachorros, a pesar de la inmunidad materna.
La presente invención describe un procedimiento para expresar in vitro un producto génico en una célula introduciendo en la célula un virus recombinante con una virulencia atenuada y una seguridad aumentada. El virus recombinante puede incluir, junto con una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heteróloga la cual codifica una proteína antigénica, por ejemplo, un derivado del virus de la rabia. El producto se puede entonces administrar a individuos o animales para estimular una respuesta inmune, y la administración puede ser del producto únicamente o incluir otros antígenos en una composición polivalente o "cóctel". Los anticuerpos obtenidos pueden ser útiles en individuos para la preparación o tratamiento de la rabia u otras enfermedades y, los anticuerpos de individuos o animales o los productos de expresión in vitro aislados se pueden utilizar en equipos de diagnóstico, ensayos o pruebas para determinar la presencia o ausencia en una muestra, tal como suero, de rabia u otras enfermedades o antígenos de las mismas o anticuerpos para las mismas (y por lo tanto la ausencia o presencia de los virus o antígenos).
Por tanto, la presente invención trata de un virus recombinante y composiciones que lo contienen, con antígenos adicionales o virus recombinantes adicionales que expresan dichos antígenos en una composición "cóctel", o combinada o polivalente y con usos que emplean dicho virus o composición para inducir una respuesta en un huésped, por ejemplo, canes, felinos, canes que tengan inmunidad materna. El virus puede tener funciones genéticas no esenciales codificadas por virus inactivados de manera que el virus tenga una virulencia atenuada, y el virus recombinante contiene ADN de origen heterólogo en una región no esencial del genoma del virus. El ADN codifica un antígeno del virus de la rabia, en combinación con otros antígenos de otras enfermedades. En particular, las funciones genéticas están inactivadas por deleción de una pauta abierta de lectura que codifica un factor de virulencia o por utilización de virus restrin-
gidos a huésped naturales. El virus utilizado de acuerdo a la presente invención es un virus de la viruela del canario.
Un virus de la viruela adecuado en un ALAVC atenuado, por ejemplo, mediante más de 200 pasajes seriados en fibroblastos embrionarios de pollo, un inóculo principal de los mismos se sometió a cuatro purificaciones sucesivas de calvas en agar a partir de las cuales se amplificó un clon de las calvas mediante cinco pasajes adicionales.
También se describe el producto de expresión del virus recombinante de viruela-rabia inventado y los usos del mismo, tales como formar composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna especialmente composiciones polivalentes o "cóctel" o combinadas para administrar a un huésped, por ejemplo, animales, tales como canes o felinos, o a un animal recién nacido o administrar una protección o respuesta a largo plazo o tratar, prevenir, diagnosticar o probar, y, procedimientos que emplean dichas composiciones.
Sin embargo, se señala en este momento que una composición polivalente o "cóctel" o combinada comprende cualquiera de: (i) una composición que contiene un virus recombinante de viruela del canario-rabia de acuerdo a la invención y un antígeno adicional el cual es un antígeno de cualquiera de: antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno de la parainfluenza canina, antígeno del parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, o cualquier combinación de estos antígenos; o (II) una composición que contiene un virus recombinante de viruela del canario-rabia de la presente invención y otro virus recombinante de viruela el cual codifica y expresa otro antígeno el cual es un antígeno de cualquiera de: antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno del parainfluenza canino, antígeno del parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, o cualquier combinación de estos antígenos; o (iii) una combinación que contiene un virus recombinante de viruela del canario de la presente invención el cual codifica y expresa un antígeno de la rabia y otro antígeno el cual es un antígeno seleccionado de cualquiera de : antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno del parainfluenza canino, antígeno del parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, o cualquier combinación de estos antígenos. Por supuesto, en (i), el virus recombinante de viruela-rabia se puede sustituir con el producto de expresión del mismo; en (ii), el virus recombinante de viruela-rabia puede codificar y expresar antígenos adicionales; y, en (iii), antígenos adicionales pueden estar presentes.
Se describe el descubrimiento de que los virus recombinantes de ALVAC, particularmente los virus recombinantes de ALVAC-rabia, no muestran interferencia con la eficacia en combinación con otros antígenos, sean éstos otros antígenos presentes como antígenos mismos o como productos de coexpresión o expresión simultánea (siendo de la expresión del mismo virus recombinante o de virus recombinantes adicionales); y, de que los virus recombinantes de ALVAC-rabia proporcionan protección a largo plazo y protección en presencia de inmunidad materna. La presente invención no requiere necesariamente un adyuvante, y puede emplear virus recombinantes.
Descripción resumida de las figuras
La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, pero sin intención de limitar la invención únicamente a la realización descrita, se puede entender mejor con las gráficas acompañantes, en las cuales:
Fig. 1 muestra esquemáticamente un procedimiento para la construcción del plásmido pSD460 para la deleción del gen timidina quinasa y la generación del virus recombinante de vaccinia vP410;
Fig. 2 muestra esquemáticamente un procedimiento para la construcción del plásmido pS486 para la deleción de la región hemorrágica y la generación del virus recombinante de vaccinia vP553;
Fig. 3 muestra esquemáticamente un procedimiento para la construcción del plásmido pMP494\Delta para la deleción de la región ITA y la generación del virus recombinante de vaccinia vP618;
Fig. 4 muestra esquemáticamente un procedimiento para la construcción del plásmido pSD467 para la deleción del gen de la hemaglutinina y la generación del virus recombinante de vaccinia vP723;
Fig. 5 muestra esquemáticamente un procedimiento para la construcción del plásmido pMPCK1\Delta para la deleción de la batería de genes [C7L-KIL] y la generación del virus recombinante de vaccinia vP804;
Fig. 6 muestra esquemáticamente un procedimiento para la construcción del plásmido pSD548 para la deleción de la subunidad mayor, ribonucleótido reductasa y la generación del virus recombinante de vaccinia vP866 (NYVAC);
Fig. 7 muestra esquemáticamente un procedimiento para la construcción del plásmido pRW842 para la inserción del gen de la glicoproteína G de la rabia en el locus de TK delecionado y la generación del virus recombinante de vaccinia vP879;
Fig. 8 muestra la secuencia de ADN (Nº ID. SEC.:27) de un fragmento PvuII del virus de la viruela del canario que contiene el ORF C5.
Figs. 9A y 9B muestran esquemáticamente un procedimiento para la construcción del virus recombinante de viruela del canario vCP65 (ALVACRG);
Fig. 10 muestra esquemáticamente los ORFs delecionados para generar NYVAC; y
Figs. 11A a 11D muestran gráficas de concentraciones de anticuerpos que neutralizan la rabia (RFFIT, UI/ml), efecto del refuerzo de HDC y vCP65 (10^{5 . 5} DICT_{50}) en voluntarios previamente inmunizados con o la misma o una vacuna alternativa (vacunas administradas en los días 0, 28 y 180, concentraciones de anticuerpo medidas en días 0, 7, 28, 35, 56, 173, 187 y 208).
Descripción detallada de la invención
ALVAC es un vector atenuado basado en el virus de la viruela del canario que era un derivado de una calva clonada de la vacuna con licencia de la viruela del canario (Tartaglia y col., 1992). ALVAC tiene algunas propiedades generales las cuales son las mismas que algunas de las propiedades generales de Kanapox. Se ha demostrado que los virus recombinantes basados en ALVAC que expresan inmunógenos extrínsecos también son eficaces como vectores de vacuna (Tartaglia y col., 1993 a,b). Este vector de la viruela aviar está restringido a especies aviares para la replicación productiva. En cultivos de células humanas, la replicación del virus de la viruela del canario se suspende tempranamente en el ciclo de replicación viral antes de la síntesis del ADN viral. No obstante, cuando se diseña para expresar inmunógenos extrínsecos, se observa expresión auténtica y procesamiento in vitro en células de mamíferos y la inoculación en numerosas especies de mamíferos induce respuestas inmunes celulares y de anticuerpo al inmunógeno extrínseco y proporciona protección contra una infección del patógeno cognado (Taylor y col., 1992; Taylor y col., 1991b). Ensayos clínicos recientes de Fase I tanto en Europa como en Estados Unidos de una glicoproteína recombinante de viruela del canario/rabia (ALVAC-RG) demostraron que la vacuna experimental se toleraba bien e inducía concentraciones del anticuerpo que neutraliza el virus de la rabia a niveles de protección (Cadoz y col., 1992; Fries y col., 1992). Además, células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) derivadas de los vacunados con ALVAC-RG demostraron niveles considerables de proliferación linfocítica cuando se estimularon con virus de la rabia purificado (Fries y col., 1992).
NYVAC, ALVAC y TROVAC han sido reconocidos también como únicos entre todos los virus de la viruela en el sentido de que los Institutos Nacionales de la Salud ("NIH", del inglés "National Institutes of Health") (Servicio de Salud Pública de EEUU), Comité Asesor de ADN Recombinante, el cual establece guías para la contención física de material genético como virus y vectores, es decir, guías para procedimientos seguros para el uso de dichos virus y vectores las cuales se basan en la patogenicidad de un virus o vector en particular, otorgó una reducción del nivel de contención física: de 2 a 1. Ningún otro virus de la viruela tiene un nivel 1 de contención física. Incluso la cepa Copenhague del virus vaccinia -la vacuna contra la viruela común - tiene un nivel de contención física más elevado; concretamente, BSL2. Por consiguiente, dentro del campo se ha reconocido que NYVAC, ALVAC y TROVAC tienen una patogenicidad más baja que cualquier otro virus de la viruela.
En base a los perfiles de atenuación de los vectores NYVAC, ALVAC, y TROVAC y su capacidad demostrada para provocar respuestas inmunológicas tanto humorales como celulares a inmunógenos extrínsecos (Tartaglia y col., 1993a,b; Taylor y col., 1992; Konishi y col., 1992), dichos virus recombinantes ofrecen una clara ventaja sobre los virus recombinantes basados en vaccinia descritos previamente.
El procedimiento de administración del virus recombinante de viruela-rabia o los productos de expresión del mismo, composiciones de la invención tales como composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna o composiciones terapéuticas, incluyendo composiciones polivalentes, "cóctel" o combinadas, puede ser a través de una vía parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea). Dicha administración permite una respuesta inmune sistémica.
Más generalmente, las composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna del virus de viruela-rabia o composiciones terapéuticas (composiciones que contienen los virus recombinantes de viruela-rabia de la invención) se pueden preparar de acuerdo a las técnicas estándar bien conocidas por los expertos en el área farmacéutica o veterinaria. Dichas composiciones se pueden administrar en dosis y por técnicas bien conocidas por aquellos experimentados en el área médica o veterinaria teniendo en cuenta factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del paciente en particular, y la vía de administración. La composición se coadministra o se administra secuencialmente con composiciones de la invención o con "otras" composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna o terapéuticas proporcionando así composiciones polivalentes o "cóctel" o combinadas de la invención y usos que las emplean.
Dichas "otras" composiciones incluyen antígenos purificados a partir de cualquiera de los siguientes:
\quad
antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno del parainfluenza canino, antígeno del parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, o cualquier combinación de estos antígenos;
\quad
o, a partir de la expresión de tales antígenos mediante un virus recombinante de viruela u otro sistema de vector "in vitro"; o dichas "otras" composiciones pueden incluir uno o más virus recombinantes de viruela los cuales expresan antígenos de cualquiera de entre:
\quad
antígeno del virus del moquillo canino, por ejemplo, VDC HA y/o glicoproteínas F, antígeno del adenovirus canino tipo 2, antígeno del coronavirus canino, antígeno del parainfluenza canino, antígeno del parvovirus canino, antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae, o cualquier combinación de estos antígenos. Otra vez, los ingredientes y la manera de administración (secuencial o coadministración), así como las dosis se pueden determinar teniendo en consideración factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del paciente en particular, y, la vía de administración. En este aspecto, también se hace mención a la patente internacional WO 9526751 dirigido a secuencias de nucleótidos y amino ácidos de los antígenos del virus del herpes canino y virus recombinantes de éstos y usos de los mismos, y a la patente internacional WO 9527780 dirigida a virus recombinantes del virus del moquillo canino (VDC) y composiciones y procedimientos que utilizan esos virus recombinantes.
Ejemplos de composiciones de la invención incluyen preparaciones líquidas para administración por un orificio, por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrico, etc., tales como suspensiones, jarabes o elixires; y, preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable) tales como suspensiones estériles o emulsiones. En tales composiciones el virus recombinante de viruela o antígenos pueden estar mezclados con un transportador, diluente, o excipiente adecuado tales como agua estéril, suero fisiológico, glucosa o similares. Las composiciones también pueden estar liofilizadas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, adyuvantes, aditivos gelificantes o espesantes, conservantes, agentes saborizantes, colorantes, y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada. Se pueden consultar libros estándar, como "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17ª edición, 1985 para preparar preparaciones adecuadas sin excesiva experimentación. Dosis adecuadas también pueden basarse en los ejemplos de más abajo.
Además, los productos de expresión de los virus recombinantes de viruela de la invención y las composiciones que los comprenden se pueden utilizar directamente para estimular una respuesta inmune en individuos o en animales. Por tanto, los productos de expresión se pueden utilizar en composiciones de la invención en lugar de o además del virus recombinante de viruela de la invención en las composiciones mencionadas más adelante.
Adicionalmente, el virus recombinante de viruela de la invención y los productos de expresión del mismo y composiciones de la invención estimulan una respuesta inmune o de anticuerpos en humanos y animales; y por consiguiente, estos productos son antígenos. A partir de estos anticuerpos o antígenos, mediante técnicas bien conocidas en el campo, se pueden preparar anticuerpos monoclonales y, estos anticuerpos monoclonales o los antígenos, se pueden emplear en ensayos de unión de anticuerpos, equipos de diagnóstico o pruebas bien conocidas para determinar la presencia o ausencia de antígenos particulares de la rabia u otros antígenos; y por consiguiente, la presencia o ausencia del virus u "otras" enfermedades o expresión del antígeno o antígenos (en sistemas de rabia u "otros" sistemas antigénicos), o para determinar si una respuesta inmune al virus u "otras" enfermedades o antígenos ha sido simplemente estimulada. Estos anticuerpos monoclonales o los antígenos también se pueden emplear en cromatografía de inmunoadsorción para recuperar o aislar agentes de la rabia u "otras" enfermedades o productos de expresión del virus recombinante de viruela o composiciones de la invención.
Procedimientos para producir anticuerpos monoclonales y para su utilización, y, de utilización y procedimientos para antígenos de la rabia u "otros" antígenos -los productos de expresión del virus de la viruela y composiciones inventadas- son bien conocidas por los expertos en la materia. Pueden ser utilizados en procedimientos de diagnóstico, equipos, pruebas o ensayos, así como para recuperar materiales por cromatografía de inmunoadsorción o por inmunoprecipitación.
Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas producidas por células del hibridoma. Un anticuerpo monoclonal reacciona con un único determinante antigénico y proporciona mayor especificidad que un anticuerpo convencional derivado del suero. Además, el cribado de un gran número de anticuerpos monoclonales facilita la selección de un anticuerpo individual con la especificidad, avidez y el isotipo adecuados. Las líneas celulares de hibridomas proporcionan una fuente constante y económica de anticuerpos químicamente idénticos y las preparaciones de estos anticuerpos se pueden fácilmente estandarizar. Los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales son bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, Koprowski, H. y col., Patente Americana U.S. 4.196.265, publicada el 1 de Abril de 1989.
Se conocen varios usos de anticuerpos monoclonales. Uno de ellos es en procedimientos de diagnóstico, por ejemplo, David, G. y Greene, H. Patente Americana U.S. 4.376.110, publicada el 8 de Marzo 1983.
Los anticuerpos monoclonales también se han utilizado para recuperar materiales por cromatografía de inmunoadsorción, por ejemplo, Milstein, C. 1980, Scientific American 243:66, 70.
Por consiguiente, el virus de la viruela y las composiciones de la invención tienen varias utilidades aquí indicadas. También existen otras utilidades para el modo de realización de la invención.
Se tendrá una mejor comprensión de la presente invención y de sus numerosas ventajas a partir de los ejemplos siguientes, proporcionados a modo de ilustración.
Ejemplos
Clonación y Síntesis de ADN. Los plásmidos se construyeron, cribaron y crecieron mediante procedimientos estándares (Maniatis y col., 1982; Perkus y col., 1985; Piccini y col., 1987). Las endonucleasas de restricción se obtuvieron de Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; y Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN. El fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli se obtuvo de Boehringer Mannheim Biochemicals. La exonucleasa BAL-31 y la ADN ligasa del fago T4 se obtuvieron de New England Biolabs. Los reactivos se utilizaron según las especificaciones de los diversos proveedores.
Los oligodesoxiribonucleótidos sintéticos se prepararon con un sintetizador de ADN Biosearch 8750 o Applied Biosystems 380B como se ha descrito previamente (Perkus y col., 1989). La secuenciación de ADN se realizó mediante el procedimiento de terminación de la cadena (Sanger y col., 1977) utilizando Sequenase (Tabor y col., 1987) como se ha descrito previamente (Guo y col., 1989). La amplificación de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la verificación de la secuencia (Engelke y col., 1988) se realizó utilizando los cebadores de oligonucleótidos sintetizados para ello y el equipo GeneAmp DNA amplification Reagent Equipo (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) en un termociclador automatizado de ADN Perkin Elmer Cetus. Las secuencias de ADN en exceso se eliminaron de los plásmidos mediante digestión con endonucleasas de restricción seguida de digestión limitada por exonucleasa BAL-31 y mutagénesis (Mandecki, 1986) utilizando oligonucleótidos sintéticos.
Células, virus, y Transfección. Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa Copenhague del virus vaccinia se han descrito previamente (Guo y col., 1989). La generación del virus recombinante por recombinación, hibridación in situ sobre filtros de nitrocelulosa y cribado de la actividad de la \beta-galactosidasa es tal como se ha descrito previamente (Piccini y col., 1987).
Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa Copenhague del virus vaccinia y NYVAC se han descrito previamente (Guo y col., 1989; Tartaglia y col., 1992). La generación del virus recombinante por recombinación, hibridación in situ sobre filtros de nitrocelulosa y criba de actividad de B-galactosidasa es como se ha descrito previamente (Panicali y col., 1982; Perkus y col., 1989).
El virus parental de la viruela del canario (cepa Rentschler) en una cepa de vacuna para canarios. La cepa de vacuna se obtuvo a partir de un aislado de tipo silvestre y se atenuó mediante más de 200 pasajes seriados en fibroblastos embrionarios de pollo. Un inóculo principal se sometió a cuatro purificaciones de calvas sucesivas en agar y un clon de la calva se amplificó a través de cinco pasajes adicionales tras lo cual el virus madre se utilizó como virus parental en pruebas de recombinación in vitro. El aislado de viruela del canario purificado a partir de una calva se denominó ALVAC.
La cepa del virus de la viruela aviar en aves de corral (FPV) denominada FP-1 se ha descrito previamente (Taylor y col., 1988a). Es una cepa de vacuna atenuada útil en la vacunación de pollos de un día de edad. La cepa de virus parental Duvette se obtuvo en Francia de una costra de pollo. El virus se atenuó mediante aproximadamente 50 pasajes seriados en huevos embrionados de pollo seguidos de 25 pasajes en células fibroblásticas de embrión de pollo. El virus se sometió a cuatro purificaciones de calvas sucesivas. Se amplificó nuevamente una calva aislada en células primarias FEP y se estableció un virus madre, denominado TROVAC.
Los vectores virales NYVAC, ALVAC y TROVAC y sus derivados se propagaron tal como se ha descrito previamente (Piccini y col., 1987; Taylor y col., 1988a,b). Las células Vero y los fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) se propagaron tal como se ha descrito previamente (Taylor y col., 1988a,b).
Respecto a NYVAC y especialmente a los Ejemplos de 1 a 6, se hace referencia a la Patente Americana U.S. 5.364.773.
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Ejemplo 1
(Preparativo)
Construcción del plásmido pSD460 para la deleción del gen de timidina quinase (J2R)
En referencia ahora a la Fig. 1, el plásmido pSD406 contiene J HindIII de vaccinia (pos. 83359-88377) clonado en pUC8. pSD406 se cortó con HindIII y PvuII, y el fragmento de 1,7 kb a la izquierda de J HindIII se clonó en pUC8 cortado con HindIII/SmaI, formando pSD447. pSD447 contiene el gen completo para J2R (pos. 83855-84385). El codón de iniciación se encuentra en una diana NlaIII y el codón de terminación se encuentra en una diana SspI. La dirección de la transcripción se indica con una flecha en Fig. 1.
Para obtener un brazo flanqueante izquierdo, un fragmento HindIII/EcoRI de 0,8 kb se aisló de pSD447, se digirió entonces con NlaIII y se aisló un fragmento HindIII/NlaIII de 0,5 kb. Los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda MPSYN43/MPSYN44 (Nº ID. SEC.:1/Nº ID. SEC.:2)
1
se ligaron con el fragmento HindIII/NlaIII de 0,5 kb en el vector plasmídico pUC18 cortado con HindIII/EcoRI, generando el plásmido pSD449.
Para obtener un fragmento de restricción con las secuencias de un brazo flanqueante derecho de vaccinia y de un vector pUC, se cortó pSD447 con SspI (parcial) con secuencias de vaccinia y HindIII en el enlace de pUC/vaccinia, y se aisló un fragmento de 2,9 kb del vector. Este fragmento del vector se ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda MPSYN45/MPSYN46 (Nº ID. SEC.:3/Nº ID. SEC.:4)
2
Generación de pSD459
Para combinar los brazos flanqueantes izquierdo y derecho en un plásmido, se aisló un fragmento HindIII/SmaI de 0,5 kb de pSD449 y se ligó con el vector plasmídico pSD459 cortado con HindIII/SmaI, generándose el plásmido pSD460. pSD460 se utilizó como plásmido donante para la recombinación con la cepa Copenhague del virus vaccinia parental de tipo silvestre VC-2. La sonda marcada con P^{32} se sintetizó mediante extensión del cebador utilizando MPSYN45 (Nº ID. SEC.:3) como molde y el oligonucleótido de 20mer complementario MPSYN47 (Nº ID. SEC.:5) (5' TTAGTTAATTAGGCGGCCGC 3') como cebador. El virus recombinante vP410 se identificó por hibridación de calvas.
Ejemplo 2
(Preparativo)
Construcción del plásmido pSD846 para la deleción de la región hemorrágica (B13r + B14R)
En referencia ahora a la Fig. 2, el plásmido pSD419 contiene G SalI de vaccinia (pos. 160.744-173.351) clonado en pUC8. pSD422 contiene el fragmento contiguo a SalI de vaccinia hacia la derecha, J SalI (pos. 173.351-182.746) clonado en pUC8. Para construir un plásmido delecionado para la región hemorrágica, u, B13R-B14R (pos. 172.549-173.552), se utilizó pSD419 como fuente para el brazo flanqueante izquierdo y pSD422 para el brazo flanqueante derecho. La dirección de la transcripción para la región de u se indica con una flecha en la Fig. 2.
Para eliminar las secuencias de pSD419 no deseadas, las secuencias a la izquierda del diana NcoI (pos. 172.253) se eliminaron por digestión de pSD419 con NcoI/SmaI seguida de conversión de los extremos en romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligación generando el plásmido pSD476. Un brazo flanqueante derecho de vaccinia se obtuvo por digestión de pSD422 con HopI en el codón de terminación de B14R y por digestión con NruI 0,3 kb a la derecha. Este fragmento de 0,3 kb se aisló y ligó con un fragmento de 3,4 kb HincII del vector asilado de pSD476, generando el plásmido pSD477. La ubicación de la deleción parcial de la región de u de vaccinia en pSD477 se indica con un triángulo. Las secuencias codificantes para B13R restantes en pSD477 se eliminaron por digestión con ClaI/HpaI, y el fragmento del vector resultante se ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda de SD22mer/SD20mer (Nº ID. SEC.:6/Nº ID. SEC.:7)
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3
generando pSD479. pSD479 contiene un codón de iniciación (subrayado) seguido de un diana BamHI. Para colocar la Betagalactosidasa de E. coli en el locus de B13-B14 (u) delecionado bajo el control del promotor de u, se insertó un fragmento BamHI de 3,2 kb con el gen Beta-galactosidasa (Shapira y col., 1983) en el diana BamHI de pSD479, generando pSD479BG. pSD479BG se utilizó como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia vP410. El virus recombinante de vaccinia vP533 se aisló como calvas azules en presencia del sustrato cromogénico X-gal. En vP533 la región B13R-B14R es delecionada y reemplazada por Beta-galactosidasa.
Para eliminar las secuencias Beta-galactosidasa de vP533, se utilizó el plásmido pSD486, un derivado de pSD477 con una región de policlonaje pero sin codón de iniciación en el enlace de deleción de u. Primero el fragmento del vector ClaI/HpaI de pSD477 al que se hace referencia más arriba se ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda SD42mer/SD40mer (Nº ID. SEC.:8/SEQID NO:9)
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4
generando el plásmido pSD478. A continuación la diana EcoRI en el enlace de pUC/vaccinia se destruyó por digestión de pSD478 con EcoRI seguida de conversión de los extremos en romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligación, generando el plásmido pSD478E-. pSD478E- se digirió con BamHI y HpaI y ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda HEM5/HEM6 (Nº ID. SEC.:10/Nº ID. SEC.:11)
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5
generando el plásmido pSD486. pSD486 se utilizó como plásmido donante para la recombinación con el virus recombinante de vaccinia vP533, generando vP553, el cual se aisló como calvas blancas en presencia de X-gal.
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Ejemplo 3
(Preparativo)
Construcción del plásmido pMP494\Delta para la deleción de la región ATI (A26L)
En referencia ahora a la Fig. 3, pSD414 contiene SalI B clonado en pUC8. Para eliminar las secuencias de ADN no deseadas a la izquierda de la región A26L, se cortó pSD414 con XbaI en las secuencias de vaccinia (pos. 137.079) y con HindIII en el enlace de pUC/vaccinia, entonces se hicieron los extremos romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y se ligaron, dando como resultado el plásmido pSD483. Para eliminar las secuencias de ADN de vaccinia no deseadas a la derecha de la región A26L, se cortó pSD483 con EcoRI (pos. 140.665 y en el enlace de pUC/vaccinia) y se ligó, formando el plásmido pSD484. Para eliminar la región codificante para A26L, se cortó pSD484 con NdeI (parcial) ligeramente en dirección 5' del ORF de A26L (pos. 139.004) y con HpaI (pos. 137.889) ligeramente en dirección 3' del ORF de A26L. El fragmento de 5,2 kb del vector se aisló y ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda ATI3/ATI4 (Nº ID. SEC.:12/Nº ID. SEC.:13)
6
reconstruyendo la región en dirección 5' de A26L y reemplazando el ORF de A26L con una corta región de policlonaje que contiene los dianas de restricción BglII, EcoRI y HpaI, tal como se indica más arriba. El plásmido resultante fue denominado pSD485. Puesto que los dianas BglII y EcoRI en la región de policlonaje de pSD485 no son únicos, los dianas BglII y EcoRI no deseados se eliminaron del plásmido pSD483 (descrito más arriba) por digestión con BglII (pos. 140.136) y con EcoRI en el enlace de pUC/vaccinia, seguida de conversión de los extremos en romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligación. El plásmido resultante fue denominado pSD489. El fragmento de 1,8 kb ClaI (pos. 137.198)/EcoRV (pos. 139.048) de pSD489 que contiene el ORF de A26L se reemplazó con el correspondiente fragmento de 0,7 kb ClaI/EcoRV de pSD485 que contiene la región de policlonaje, generando pSD492. Los dianas BglII y EcoRI en la región de policlonaje de pSD492 son únicos.
Un casete BglII de 3,3 kb que contiene el gen Beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa de vaccinia (Bertholet y col., 1985; Perkus y col., 1990) se insertó en el diana BglII de pSD492, formando pSD493KBG. El plásmido pSD493KBG se utilizó en la recombinación con el virus de rescate vP553. El virus recombinante de vaccinia, vP581, que contiene Beta-galactosidasa en la región de deleción de A26L, se aisló como calvas azules en presencia de X-gal.
Para generar un plásmido para la eliminación de las secuencias de Beta-galactosidase del virus recombinante de vaccinia VP581, la región de policlonaje del plásmido pSD492 se delecionó por mutagénesis (Mandecki, 1986) utilizando el oligonucleótido sintético MPSYN177 (Nº ID. SEC.:14) (5' AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTA
TATAACTTATTTTTTGAATATAC 3'). En el plásmido resultante, pMP494\Delta, se deleciona el ADN de vaccinia que abarca las posiciones [137.889-138.937], incluyendo el ORF de A26L entero. La recombinación entre el pMP494\Delta y el virus recombinante de vaccinia que contiene Beta-galactosidasa, vP581, dio como resultado el mutante de vaccinia con deleción de vP618, el cual se aisló como calvas blancas en presencia de X-gal.
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Ejemplo 4
(Preparativo)
Construcción del plásmido pSD467 para la deleción del gen de hemaglutinina (A56R)
En referencia ahora a Fig. 4, el fragmento de restricción de G de vaccinia SalI (pos. 160.744-173.351) se cruza con el enlace de HindIII A/B (pos. 162.539). pSD419 contiene el SalI de la G de vaccinia clonado en pUC8. La dirección de la transcripción en el gen de hemaglutinina (HA) se indica con una flecha en Fig. 4. Las secuencias de vaccinia derivadas de HindIII B se eliminaron por digestión de pSD419 con HindIII en las secuencias de vaccinia y en el enlace de pUC/vaccinia seguida de ligación. El plásmido resultante, pSD456, contiene el gen de HA, A56R, flanqueado por secuencias de vaccinia de 0,4 kb a la izquierda y a la derecha. Las secuencias codificantes para A56R se eliminaron mediante el corte de pSD456 con RsaI (parcial; pos. 161.090) en dirección 5' de las secuencias codificantes para A56R, y con EagI (pos. 162.054) cerca del extremo del gen. El fragmento de 3,6 kb RsaI/EagI del vector de pSD456 se aisló y ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda MPSYN59 (Nº ID. SEC.:15), MPSYN62 (Nº ID. SEC.:16), MPSYN60 (Nº ID. SEC.:17), y MPSYN61 (Nº ID. SEC.:18)
7
reconstruyendo las secuencias de ADN en dirección 5' del ORF de A56R y reemplazando el ORF de A56R con una región de policlonaje como se indica más arriba. El plásmido resultante es pSD466. La deleción de vaccinia en pSD466 abarca las posiciones [161.185-162.053]. El diana de la deleción en pSD466 se indica con un triángulo en Fig. 4.
Un casete BglII/BamHI de 3,2 kb (parcial) que contiene el gen Beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa de vaccinia (Bertholet y col., 1985; Guo y col., 1989) se insertó en la diana BglII de pSD466, formando pSD466KBG. El plásmido pSD466KBG se utilizó en la recombinación con el virus de rescate vP618. El virus recombinante de vaccinia, vP708, que contiene Beta-galactosidasa en la deleción de A56R, se aisló como calvas azules en presencia de X-gal.
Las secuencias de Beta-galactosidasa se delecionaron de vP708 utilizando el plásmido donante pSD467. pSD467 es idéntico a pSD466, con la excepción de que las dianas EcoRI, SmaI y BamHI se eliminaran del enlace de pUC/vaccinia por digestión de pSD466 con EcoRI/BamHI seguida de conversión de los extremos en romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y ligación. La recombinación entre vP708 y pSD467 dió como resultado el mutante delecionado del virus recombinante de vaccinia, vP723, el cual se aisló como calvas blancas en presencia de X-gal.
Ejemplo 5
(Preparativo)
Construcción del plásmido pMPCSK1A para la deleción de los pautas abiertos de lectura [C7L-K1L]
En referencia ahora a Fig. 5, los clones de vaccinia siguientes se utilizaron en la construcción de pMPCSK1\Delta. pSD420 se clonó con SalI H en pUCB. pSD435 se clonó con kpnI F en pUC18. pSD435 se cortó con SphI y se volvió a ligar, formando pSD451. En pSD451, se eliminaron las secuencias de ADN a la izquierda de la diana SohI (pos. 27.416) en HindIII M (Perkus y col., 1990). pSD409 se clonó con HindIII M en pUC8.
Para proporcionar un sustrato para la deleción de la batería de genes [C7L-K1L] de vaccinia, Beta-galactosidasa de E. coli se insertó primero en un locus de M2L delecionado de vaccinia (Guo y col., 1990) como sigue. Para eliminar la diana BglII en pSD409, el plásmido se cortó con BglII en secuencias de vaccinia (pos. 28.212) y con BamHI en el enlace de pUc/vaccinia, y entonces ligados para formar el plásmido pMP409B. pMP409B se cortó en una diana única SphI (pos. 27.416). Las secuencias codificantes para M2L se eliminaron por mutagénesis (Guo y col., 1990; Mandecki, 1986) utilizando el oligonucleótido sintético
8
El plásmido resultante pMP409D, contiene una diana BglII único insertado en el locus de M2L delecionado como se indica más arriba. Un casete BamHI (parcial)/BglII de 3,2 kb que contiene el gen Beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa (Bertholet y col., 1985) se insertó en pMP409D cortado con BglII. El plásmido resultante, pMP409DBG (Guo y col., 1990), se utilizó como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia de rescate vP723. El virus recombinante de vaccinia, vP784, que contiene Beta-galactosidasa insertada en el locus de M2L delecionado, se aisló como calvas azules en presencia de X-gal.
Un plásmido delecionado para genes de vaccinia [C7L-K1L] se ensambló en pUC8 cortado, con SmaI, HindIII y se convirtieron los extremos en romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli. El brazo flanqueante izquierdo consistido de secuencias HindIII C de vaccinia se obtuvo por digestión de pSD420 con XbaI (pos. 18.628) seguida de conversión de los extremos en romos con el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli y digestión con BglII (pos. 19.706). El brazo flanqueante derecho que consistía de secuencias HindIII K de vaccinia se obtuvo por digestión de pSD451 con BglII (pos. 29.062) y EcoRV (pos. 29. 778). El plásmido resultante pMP581CK se delecionó para las secuencias de vaccinia entre la diana BglII (pos. 19.706) en HindIII C y la diana BglII (pos. 29.062) en HindIII K. El sitio de deleción de las secuencias de vaccinia en el plásmido pMP581CK se indica con un triángulo en Fig. 5.
Para eliminar el ADN excedente del enlace de deleción de vaccinia, el plásmido pMP581CK se cortó en las dianas NcoI dentro de las secuencias de vaccinia pos. 18.811; 19.655), tratado con exonucleasa Bal-31 y sometido a mutagénesis (Mandecki, 1986) utilizando el oligonucleótido sintético MPSYN233 (Nº ID. SEC.:20) 5'-TGTCATTTAACACT
ATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT- 3'. El plásmido resultante, PMPCSK1\Delta, se delecionó para secuencias de vaccinia en posiciones 18.805-29.108, abarcando 12 pautas abiertas de lectura de vaccinia [C7L-K1L]. La recombinación entre pMPCSK1\Delta y el virus recombinante de vaccinia que contiene Beta-galactosidasa, vP784, dió como resultado el mutante con deleción de vaccinia, vP804, el cual se aisló como calvas blancas en presencia de X-gal.
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Ejemplo 6
(Preparativo)
Construcción del plásmido pSD548 para la deleción de la subunidad mayor, ribonucleótido reductasa (I4L)
En referencia ahora a la Fig. 6, el plásmido pSD405 contiene HindIII I (pos. 63.875-70.367) de vaccinia clonado en pUC8. pSD405 se digirió con EcoRV dentro de las secuencias de vaccinia (pos. 67.933) y con SmaI en la deleción de pUC/vaccinia, y se ligó, formando el plásmido pSD518. pSD518 se utilizó como fuente de todos los fragmentos de restricción de vaccinia utilizados en la construcción de pSD548.
El gen de vaccinia I4L se extiende desde la posición 67.371 hasta la 65.059. La dirección de la transcripción para I4L se indica con una flecha en la Fig. 6. Para obtener un fragmento del vector plasmídico delecionado para una porción de las secuencias codificantes para I4L, se digirió pSD518 con BamHI (pos. 65.381) y HpaI (pos. 67.001) y se convirtieron los extremos en romos utilizando el fragmento Klenow de la polimerasa de E. coli. Este fragmento del vector de 4,8 kb se ligó con un cassete SmaI de 3,2 kb que contiene el gen Beta-galactosidasa de E. coli (Shapira y col., 1983) bajo el control del promotor de 11 kDa de vaccinia (Bertholet y col., 1985; Perkus y col., 1990), dando como resultado el plásmido pSD524KBG. pSD524KBG se utilizó como plásmido donante para la recombinación con el virus vaccinia vP804. El virus recombinante de vaccinia, vP855, que contiene Beta-galactosidasa en una deleción parcial del gen I4L, se aisló como calvas azules en presencia de X-gal.
Para delecionar Beta-galactosidasa y el resto del ORF de I4L de vP855, se construyó el plásmido de deleción pSD548. Los brazos flanqueantes izquierdo y derecho de vaccinia se ensamblaron separadamente en pUC8 como se detalla más abajo y se representa esquemáticamente en Fig. 6.
Para construir un vector plasmídico para aceptar el brazo flanqueante izquierdo de vaccinia, pUC8 se cortó con BamHI/EcoRI y se ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda 518A1/518A2 (Nº ID. SEC.:21/Nº ID. SEC.:22)
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9
formando el plásmido pSD531. pSD531 se cortó con RsaI (parcial) y BamHI y se aisló un fragmento del vector de 2,7 kb. pSD518 se cortó con BglII (pos. 64.459)/RsaI (pos. 64.994) y se aisló un fragmento de 0,5 kb. Los dos fragmentos se ligaron juntos, formando pSD537, el cual contiene el brazo flanqueante de vaccinia completo a la izquierda de las secuencias que codifican para I4L.
Para construir un vector plasmídico para aceptar el brazo flanqueante derecho de vaccinia, pUC8 se cortó con BamHI/EcoRI y se ligó con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para sonda 518B1/518B2 (Nº ID. SEC.:23/Nº ID. SEC.:24)
10
formando el plásmido pSD532. pSD532 se cortó con RsaI (parcial)/EcoRI y se aisló un fragmento del vector de 2,7 kb. pSD518 se cortó con RsaI dentro de las secuencias de vaccinia (pos. 67.436) y EcoRI en el enlace de vaccinia/pUC y se aisló un fragmento de 0,6 kb. Los dos fragmentos se ligaron juntos, formando pSD538, el cual contiene el brazo flanqueante de vaccinia completo a la derecha de las secuencias que codifican para I4L.
El brazo flanqueante derecho de vaccinia se aisló como un fragmento EcoRI/BglII de 0,6 kb a partir de pSD538 y se ligó en el vector plasmídico pSD537 cortado con EcoRI/BglII. En el plásmido resultante, pSD539, se reemplaza el ORF de I4L (pos. 65.047-67.386) por una región de policlonaje, la cual está flanqueada por ADN de vaccinia de 0,6 kb a la izquierda y ADN de vaccinia de 0,6 kb a la derecha, todo en un fondo pUC. El sitio de deleción dentro de las secuencias de vaccinia se indica con un triángulo en Fig. 6. Para evitar la posible recombinación de secuencias de Beta-galactosidasa en la porción de pSD539 derivada de pUC con secuencias de Beta-galactosidasa en el virus recombinante de vaccinia vP855, el casete de deleción de I4L de vaccinia se movió de pSD539 a pRC11, un derivado de pUC del cual se han eliminado todas las secuencias de Beta-galactosidasa y se han reemplazado por una región de policlonaje (Colinas y col., 1990). pSD539 se cortó con EcoRI/PstI y se aisló el fragmento de 1,2 kb. Este fragmento se ligó en pRC11 cortado con EcoRI/PstI (2,35 kb), formando pSD548. La recombinación entre pSD548 y el virus recombinante de vaccinia que contiene Beta-galactosidasa, vP855, dio como resultado el mutante con deleción de vaccinia vP866, el cual se aisló como calvas blancas en presencia de X-gal.
El ADN del virus recombinante de vaccinia vP866 se analizó con digestiones de restricción seguidas de electroforesis en un gel de agarosa. Las pautas de restricción fueron como se esperaban. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (Engelke y col., 1988) utilizando vP866 como molde y cebadores flanqueando los seis loci delecionados detallados más arriba produjeron fragmentos de ADN de los tamaños esperados. Los análisis de las secuencias de los fragmentos generados por PCR alrededor de las áreas de los enlaces de deleción confirmaron que los enlaces eran como se esperaban. El virus recombinante de vaccinia vP866, que contiene las seis deleciones diseñadas como se describe más arriba, fue denominado cepa de vacuna de vaccinia "NYVAC."
Ejemplo 7
(Preparativo)
Inserción de un gen de la glicoproteína G de la rabia en NYVAC
El gen que codifica para la glicoproteína G de la rabia bajo el control del promotor H6 de vaccinia (Taylor y col., 1988a, b) se insertó en el plásmido con deleción de TQ pSD513. pSD513 es idéntico al plásmido pSD460 (Fig. 1) excepto por la presencia de una región de policlonaje.
En referencia ahora a Fig. 7, la región de policlonaje se insertó cortando pSD460 con SmaI y ligando el vector plasmídico con los oligonucleótidos sintéticos hibridados para generar una sonda VQ1A/VQ1B (Nº ID. SEC.:25/Nº ID. SEC.:26)
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para formar el vector plasmídico pSD513. pSD513 se cortó con SmaI y se ligó con un casete terminado en SmaI de 1,8 kb que contiene el gen que codifica para el gen de la glicoproteína G de la rabia bajo el control del promotor H6 de vaccinia (Taylor y col., 1988a, b). El plásmido resultante fue denominado pRW842. pRW842 se utilizó como plásmido donante para la recombinación con el virus de rescate (vP866). El virus recombinante de vaccinia vP879 se identificó por hibridación de las calvas utilizando una sonda de ADN marcada con ^{32}P para las secuencias que codifican la glicoproteína G de la rabia.
Los virus recombinantes de la presente invención proporcionan ventajas como vectores de vacunas recombinantes. La virulencia atenuada del vector reduce ventajosamente la posibilidad de una infección debida a la vacunación en el individuo vacunado y también disminuye la transmisión entre individuos vacunados y no vacunados o la contaminación del ambiente.
Los virus recombinantes también son ventajosamente útiles en procedimientos para la expresión de un producto génico en un cultivo celular in vitro mediante la introducción en la célula del virus recombinante que tiene ADN foráneo el cual codifica y expresa productos génicos en la célula.
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Ejemplo 8 Construcción de virus recombinantes de ALVAC que expresan glicoproteína G del virus de la rabia
Este ejemplo describe el desarrollo de ALVAC, un vector del virus de la viruela del canario y, de un recombinante de viruela del canario-rabia denominado ALVAC-RG (vCP65) y su seguridad y eficacia.
Células y Virus. El virus parental de la viruela del canario (cepa Rentschler) es una cepa de vacuna para canarios. La cepa de vacuna se obtuvo de un aislado de tipo silvestre y atenuado a través de más de 200 pasajes seriados en fibroblastos embrionarios de pollo. Un inóculo principal del virus se sometió a cuatro purificaciones de calvas sucesivas en agar y se amplificó una clava a través de cinco pasajes adicionales tras los cuales se utilizó el virus madre como virus parental en pruebas de recombinación in vitro. El asilado de viruela del canario purificado de calva se denominó ALVAC.
Construcción de un Vector con Inserción del Virus de la Viruela del Canario. Un fragmento PvuII de 880 pb del virus de la viruela del canario se clonó entre las dianas PvuII de PvuII para formar pRW764.5. La secuencia de este fragmento se muestra en Fig. 8 (Nº ID. SEC. 27) entre las posiciones 1372 y 2251. Se definieron los límites de un pauta abierta de lectura denominado C5. Se determinó que el pauta abierta de lectura se iniciaba en la posición 166 y se terminaba en la posición 487. La deleción de C5 se hizo sin interrupción de pautas abiertas de lectura. Las bases desde la posición 167 hasta la posición 455 se reemplazaron por la secuencia (Nº ID. SEC.:28) GCTTCCCGGGAATTC
TAGCTAGCTAGTTT. Esta secuencia de reemplazamiento contiene las dianas de inserción HindIII, SmaI y EcoRI seguidos de codones de parada de la traducción y una señal de terminación de la transcripción reconocida por la ARN polimerasa del virus vaccinia (Yuen y col., 1987). La deleción del ORF de C5 se realizó como se describe más abajo. El plásmido pRW764.5 se cortó parcialmente con RsaI y se aisló el producto lineal. El fragmento lineal RsaI se volvió a cortar con BglII y el fragmento pRW764.5 ahora con una deleción de RsaI a BglII desde la posición 156 hasta la posición 462 se aisló y se utilizó como vector para los siguientes oligonucleótidos sintéticos:
RW145 (Nº ID. SEC.:29):
ACTCTCAAAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTTTATAAA
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RW146 (Nº ID. SEC.:30):
GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGGAAGCTTTTGAGAGT
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Los oligonucleótidos RW145 y RW146 se hibridados para sonda e insertaron en el vector pRW 764.5 con RsaI y BglII descrito más arriba. El plásmido resultando es denominado pRW831.
Construcción del Vector de Inserción que Contiene el Gen de la G del virus de la Rabia. La construcción de pRW838 se ilustra más abajo. Los oligonucleótidos de A hasta E, los cuales solapan el codón de iniciación de la transcripción del promotor H6 con el ATG de la G de la rabia, se clonaron en pUC9 como pRW737. Los oligonucleótidos de A hasta E contienen el promotor H6, empezando en NruI, a lo largo de la diana HindIII de G de la rabia seguido de BglII. Las secuencias de los oligonucleótidos de A hasta E ((Nº ID. SEC.:31)-(Nº ID. SEC.: 35)) son:
12
13 
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El diagrama de los oligonucleótidos hibridados para generar una sonda de A hasta E es el siguiente:
14 
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Los oligonucleótidos de A hasta E se fosforilaron, se hibridaron para formar una sonda (95ºC durante 5 minutos, entonces se enfriaron a temperatura ambiente), y se insertaron entre las dianas PvuII de pUC9. El plásmido resultante, pRW737, se cortó con HindIII y BglII y se utilizó como vector para el fragmento de 1,6 Kb HindIII-BglII de ptg155PRO (Kieny y col., 1984) generando pRW739. La diana HindIII de ptg155PRO está a 86 pb en dirección 3' del codón de iniciación de la transcripción de la G de la rabia. BglII está en dirección 3' del codón de terminación de la transcripción de G de la rabia en ptg155PRO. pRW739 se cortó parcialmente con NruI, se cortó completamente con BglII, y un fragmento de 1,7 Kb NruI-BglII, que contiene el extremo 3' del promotor H6 previamente descrito (Taylor y col., 1988a,b; Guo y col., 1989; Perkus y col., 1989) a lo largo del gen de la G de la rabia completo, se insertó entre las dianas NruI y BamHI de pRW824. El plásmido resultante es denominado pRW832. La inserción en pRW824 añadió el promotor H6 5' de NruI. La secuencia de pRW824 de BamHI seguido por SmaI es (Nº ID. SEC.:36): GGATCCCCGGG. pRW824 es un plásmido que contiene un gen no pertinente unido precisamente al promotor H6 del virus vaccinia. La digestión con NruI y BamHI eliminó completamente este gen no pertinente. El fragmento de 1,8 Kb SmaI de pRW832, que contiene el gen de la G de la rabia con el promotor H6, se insertó en el SmaI de pRW831, para formar el plásmido pRW838.
Desarrollo de ALVAC-RG. El plásmido pRW838 se transfectó en células primarias FEP infectadas con ALVAC utilizando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio descrito previamente (Panicali y col., 1982; Piccini y col., 1987). Las calvas positivas se seleccionaron mediante hibridación de una sonda específica del gen de la G de la rabia y se sometieron a 6 rondas secuenciales de purificación de calvas hasta que se consiguió una población pura. Se amplificó entonces una calva representativa y el virus recombinante de ALVAC resultante fue denominado ALVAC-RG (vCP65) (véase también Figs. 9A y 9B). La inserción correcta del gen de la G de la rabia en el genoma de ALVAC sin ninguna mutación posterior se confirmó por análisis de la secuencia.
Inmunofluorescencia. Durante las últimas etapas de ensamblaje de las partículas maduras del virus de la rabia, el componente de glicoproteína se transporta del aparato de golgi a la membrana plasmática, donde se acumula con el extremo carboxilo extendiéndose hacia el interior del citoplasma y con la masa de la proteína en la superficie externa de la membrana celular. Para confirmar que la glicoproteína de la rabia expresada en ALVAC-RG se presentaba correctamente, se realizó inmunofluorescencia en células primarias FEP infectadas con ALVAC o ALVAC-RG. La inmunofluorescencia se realizó como se ha descrito previamente (Taylor y col., 1990) utilizando un anticuerpo monoclonal de G de la rabia. Se detectó mucha fluorescencia de superficie en células FEP infectadas con ALVAC-RG pero no en el ALVAC parental.
Inmunoprecipitación. Monocapas preformadas de células primarias FEP, Vero (una línea de células de riñón del cercopiteco verde ATCC Nº CCL81) y MRC-5 (una línea celular de tipo fibroblástico derivada de tejido pulmonar fetal humano ATCC Nº CCL171) se inocularon con virus parental ALVAC y virus recombinante ALVAC-RG a 10 ufc por célula en presencia de ^{35}S-metionina radiomarcada y tratadas como descrito previamente (Taylor y col., 1990). Las reacciones de inmunoprecipitación se realizaron utilizando un anticuerpo monoclonal específico de G de la rabia. La expresión eficiente de una glicoproteína específica de rabia con un peso molecular de aproximadamente 67 kDa se detectó con el virus recombinante ALVAC-RG. Ningún producto específico de rabia se detectó en células no infectadas o en células infectadas con el virus parental ALVAC.
Experimento de Pasajes Secuenciales. En estudios con virus ALVAC en un rango de especies no aviares no se observó ninguna infección proliferativa o enfermedad manifiesta (Taylor y col., 1991b). Sin embargo, para establecer que ni el virus parental ni el virus recombinante se podían adaptar a crecer en células no aviares, se realizó un experimento de pasajes secuenciales.
\newpage
Los dos virus, ALVAC y ALVAC-RG, se inocularon en 10 pasajes secuenciales ciegos en tres sustratos celulares:
(1) Fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) primarios producidos a partir de embriones de gallo Leghorn Blanco de 11 días;
(2) Células Vero - una línea continua de células de riñón de cercopiteco verde (ATCC Nº CCL81); y
(3) Células MRC-5 - una línea celular diploide derivada de tejido pulmonar fetal humano (ATCC Nº CCL171).
La inoculación inicial se realizó a una m.o.i. de 0,1 ufc por célula utilizando placas de 60 mm de cada sustrato celular con 2 X 10^{6} células por placa. Una placa se inoculó en presencia de 40 \mug/ml de Citosina arabinósido (Ara C), un inhibidor de la replicación de ADN. Tras un periodo de absorción de 1 hora a 37ºC, se eliminó el inóculo y se lavó la monocapa para eliminar los virus no absorbidos. En este momento el medio se reemplazó con 5 ml de EMEM + 2% NBCS en dos placas (muestras t0 y t7) y 5 ml de EMEM + 2% NBCS con 40 mg/ml Ara C en la tercera (muestra t7A). La muestra t0 se congeló a -70ºC para proporcionar una indicación del virus residual de entrada. Las muestras t7 y t7A se incubaron a 37ºC durante 7 días, tiempo tras el cual se recogieron los contenidos y se rompieron las células por sonicación indirecta.
Un ml de muestra t7 de cada sustrato celular se inoculó sin diluir en tres placas del mismo sustrato (para proporcionar muestras t0, t7 y t7A) y en una placa de células primarias FEP. Las muestras t0, t7 y t7A se trataron igual que para el pasaje uno. Se incluyó la inoculación adicional en células FEP para proporcionar un paso de amplificación para una detección más sensible de los virus que pudieran estar presentes en las células no aviares.
Este procedimiento se repitió durante 10 (FEP y MRC-5) u 8 (Vero) pasajes secuenciales ciegos. Entonces, las muestras se congelaron y descongelaron tres veces y se sometieron a titulación en monocapas de FEP primarios.
El rendimiento de virus en cada muestra se determinó por titulación de calvas en monocapas de FEP cubiertas con agarosa. Los resultados resumidos del experimento se muestran en Tablas 1 y 2.
Los resultados indican que tanto el ALVAC parental como el virus recombinante ALVAC-RG son capaces de una replicación sostenida en monocapas FEP sin pérdida de título. En células Vero, los niveles de virus cayeron por debajo del nivel de detección tras 2 pasajes para ALVAC y tras 1 pasaje para ALVAC-RG. En células MRC-5, se manifestó un resultado similar, y no se detectó ningún virus tras 1 pasaje. Aunque en Tablas 1 y 2 sólo se muestran los resultados para cuatro pasajes la serie se continuó para 8 (Vero) y 10 (MRC-5) pasajes sin adaptación detectable de ninguno de los virus al crecimiento en las células no aviares.
En el pasaje 1 había niveles relativamente altos de virus en la muestra t7 de las células MRC-5 y Vero. Sin embargo este nivel de virus era equivalente al visto en las muestras t0 y t7 incubadas en presencia de Citosina arabinósido en las cuales no puede ocurrir replicación viral. Esto demostró que los niveles de virus vistos a los 7 días en células no aviares representaban virus residuales y virus no recién replicados.
Para hacer el ensayo más sensible, una porción de la muestra recogida a los 7 días de cada sustrato celular se inoculó en una monocapa de FEP permisivos y se recogieron en efecto citopático (ECP) o a los 7 días si no había ECP evidente. Los resultados de este experimento se muestran en Tabla 3. Incluso tras la amplificación a través de un sustrato celular permisivo, sólo se detectó virus en células MRC-5 y Vero durante dos pasajes adicionales. Estos resultados indicaron que bajo las condiciones utilizadas, no había adaptación de ningún virus al crecimiento en células Vero o MRC-5.
Inoculación de Macacos. Cuatro macacos seropositivos VIH se inocularon inicialmente con ALVAC-RG como se describe en Tabla 4. Al cabo de 100 días estos animales se volvieron a inocular para determinar el efecto del refuerzo, y siete animales adicionales se inocularon con un rango de dosis. Se extrajo sangre a intervalos apropiados y se analizó el suero, tras la inactivación por calor a 56ºC durante 30 minutos, para la presencia de anticuerpos antirrábicos utilizando la Prueba Rápida de Inhibición de Foco Fluorescente (Smith y col., 1973).
Inoculación de Chimpancés. Dos chimpancés machos adultos (de un rango de 50 a 65 kg de peso) se inocularon intramuscularmente o subcutáneamente con 1 X 107 ufc de vCP65. Las reacciones de los animales se monitorearon y se extrajo sangre de los animales a intervalos regulares para analizar la presencia de anticuerpos antirrábicos con la prueba RFFI (Smith y col., 1973). Los animales se volvieron a inocular con una dosis equivalente 13 semanas después de la inoculación inicial.
Inoculación de Ratones. Grupos de ratones se inocularon con entre 50 y 100 ml de un rango de diluciones de diferentes lotes de vCP65. Los ratones se inocularon en la almohadilla del pie. En el día 14, los ratones se infectaron por inoculación intracraneal de entre 15 y 43 DL_{50} de ratón de la cepa virulenta CVS del virus de la rabia. Se monitorizó la supervivencia de los ratones y se calculó una dosis protectora 50% (DP_{50}) a los 28 días post inoculación.
Inoculación de Perros y Gatos. Diez perros beagle, de 5 meses de edad, y 10 gatos, de 4 meses de edad, se inocularon subcutáneamente con log_{10} 6,7 o log_{10} 7,7 DICT_{50} de ALVAC-RG. Cuatro perros y cuatro gatos no se inocularon. Se extrajo sangre de los animales a los 14 y 28 días post inoculación y se valoró el anticuerpo antirrábico en una prueba RFFI. Los animales que recibieron log_{10} 6,7 DICT_{50} de ALVAC-RG se infectaron a los 29 días de vacunación con log_{10} 3,7 DL_{50} de ratón (perros) o log_{10} 4,3 DL_{50} de ratón (gatos) de la cepa infecciosa NYGS del virus de la rabia.
Inoculación de Monos Ardilla. Tres grupos de cuatro monos ardilla (Saimiri sciureus) se inocularon con uno de los tres virus (a) ALVAC, el virus parental de la viruela del canario, (b) ALVAC-RG, el virus recombinante que expresa la glicoproteína G de la rabia o (c) vCP37, un virus recombinante de viruela del canario que expresa la glicoproteína envuelta del virus de la leucemia felina. Las inoculaciones se realizaron bajo anestesia con ketamina. Cada animal recibió al mismo tiempo: (1) 20 ml infundidos en la superficie del ojo derecho sin escarificación; (2) 100 ml en forma de varias gotas en la boca; (3) 100 ml en cada uno de los dos sitios de inyección intradérmica en la piel afeitada de la cara externa del brazo derecho; y (4) 100 ml en el músculo anterior del muslo derecho.
Cuatro monos se inocularon con cada virus, dos con un total de log_{10} 5,9 ufc y dos con un total de log_{10} 7,0 ufc. Se extrajo sangre de los animales a intervalos regulares y los sueros se analizaron para la presencia de anticuerpo antirrábico utilizando un RFFIT (Smith y col., 1973). Las reacciones de los animales a la vacunación se monitorizaron diariamente. Seis meses después de la inoculación inicial los cuatro monos que habían recibido ALVAC-RG, los dos monos que habían recibido inicialmente vCP37, y los dos monos que habían recibido inicialmente ALVAC, así como un mono que no había recibido nada se inocularon subcutáneamente con log_{10} 6,5 ufc de ALVAC-RG. Los sueros se monitorizaron para la presencia de anticuerpos neutralizantes de la rabia mediante un RFFIT (Smith y col., 1973).
Inoculación de Líneas Celulares Humanas con ALVAC-RG. Para determinar si se podía obtener una expresión eficiente de un gen foráneo en células no aviares en las cuales el virus no se replica productivamente, cinco tipos celulares, uno aviar y cuatro no aviares, se analizaron para rendimiento de virus, expresión del gen de la G de la rabia foráneo y acumulación de ADN específico de virus. Las células inoculadas fueron:
(a) Vero, células renales de cercopiteco verde, ATCC Nº CCL81;
(b) MRC-5, pulmón embrionario humano, ATCC Nº CCL 171;
(c) WISH amnióticas humanas, ATCC Nº CCL 25;
(d) Detroit-532, prepucio humano, síndrome de Down, ATCC Nº CCL 54; y
(e) Células primarias FEP.
Fibroblastos embrionarios de pollo producidos a partir de embriones de gallos de 11 días de edad se incluyeron como control positivo. Todas las inoculaciones se realizaron sobre monocapas preformadas de 2 X 106 células como se trata más abajo.
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A. Procedimientos de análisis de ADN
Tres placas de cada línea celular se inocularon con el virus en prueba a 5 ufc/célula, dejando una placa extra de cada línea celular sin inocular. Una placa se inoculó en presencia de 40 \mug/ml de citosina arabinósido (Ara C). Tras un periodo de adsorción de 60 minutos a 37ºC, el inóculo se eliminó y la monocapa se lavó dos veces para eliminar los virus no adsorbidos. El medio (con o sin Ara C) se reemplazó entonces. Las células de una placa (sin Ara C) se recogieron como muestra de tiempo cero. Las placas restantes se incubaron a 37ºC durante 72 horas, tiempo tras el cual se recogieron las células y se utilizaron para analizar la acumulación de ADN. Cada muestra de 2 X 10^{6} células se resuspendió en 0,5 ml de tampón fosfato salino (PBS, del inglés "phosphate buffered saline") con 40 mM EDTA y se incubó durante 5 minutos a 37ºC. Un volumen igual de 1,5% agarosa precalentada a 42ºC y con 120 mM EDTA se añadió a la suspensión de células y se mezcló suavemente. La suspensión se transfirió a una placa de agarosa y se dejó endurecer durante por lo menos 15 min. Las placas de agarosa endurecidas se incubaron durante 12-16 horas a 50ºC en un volumen de tampón de lisis (1% sarkosil, 100 mg/ml proteinasa K, 10 mM Tris HCl pH 7,5, 200 mM EDTA) que cubría completamente la placa. El tampón de lisis se reemplazó entonces por 5,0 ml de TBE estéril 0,5 X (44,5 mM Tris-borato, 44,5 mM ácido bórico, 0,5 mM EDTA) y se equilibró a 4ºC durante 6 horas con cambios del tampón TBE. El ADN viral de la agarosa se fraccionó del ARN y ADN celular utilizando un sistema de electroforesis en campo pulsante. La electroforesis se realizó durante 20 horas a 180 V con una rampa de 50 a 90 segundos a 15ºC en TBE 0,5 X. El ADN se corrió con marcadores de peso molecular de ADN lambda. Tras la electroforesis la banda de ADN viral se visualizó por tinción con bromuro de etidio. El ADN se transfirió entonces a una membrana de nitrocelulosa y se hibridó con una sonda radiomarcada preparada a partir del ADN genómico purificado de ALVAC.
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B. Estimación del rendimiento del virus
Las placas se inocularon exactamente como se describe más arriba, con la excepción de que la multiplicidad de la entrada fue de 0,1 ufc/célula. A las 72 horas de la infección, las células se lisaron mediante tres ciclos sucesivos de congelación y descongelación. El rendimiento del virus se evaluó por titulación de calvas en monocapas de CEF.
C. Análisis de expresión del gen de G de la Rabia
Las placas se inocularon con virus recombinante o parental a una multiplicidad de 10 ufc/célula, dejando una placa adicional como control no infectada por virus. Tras un periodo de adsorción de una hora, el medio se eliminó y se reemplazó con medio libre de metionina. Tras un periodo de 30 minutos, este medio se reemplazó por medio libre de metionina con 25 \muCi/ml de ^{35}S-Metionina. Las células infectadas se marcaron durante la noche (aproximadamente 16 horas), se lisaron entonces por adición de tampón de lisis A. La inmunoprecipitación se realizó como se ha descrito previamente (Taylor y col., 1990) utilizando un anticuerpo monoclonal específico para G de la rabia.
Resultados: Estimación de Rendimiento Viral. Los resultados de la titulación del rendimiento a las 72 horas de inoculación a 0,1 ufc por célula se muestran en la Tabla 5. Los resultados indican que mientras se puede lograr una infección productiva en células aviares, no se puede detectar ningún aumento en el rendimiento de virus por este procedimiento en sistemas celulares no aviares.
Análisis de Acumulación del ADN Viral. Para determinar si el bloqueo de la replicación viral productiva en células no aviares ocurrió antes o después de la replicación de ADN, el ADN de los lisados de células se fraccionó por electroforesis, se transfirió a nitrocelulosa y se hibridó para conocer la presencia de ADN específico del virus. Todos los ADN de células FEP no infectadas, células FEP infectadas con ALVAC-RG a tiempo cero, células FEP infectadas con ALVAC-RG a las 72 horas de la infección y células FEP infectadas con ALVAC-RG a las 72 horas de la infección en presencia de 40 \mug/ml de citosina arabinósido mostraron actividad de fondo, probablemente debida a ADN celular de FEP contaminante en la preparación de la sonda de ADN de ALVAC radiomarcada. Sin embargo, las células CEF infectadas con ALVAC-RG a las 72 horas de la infección mostraron una banda fuerte en la región de 350 Kb aproximadamente representando acumulación de ADN viral específico de ALVAC. Dicha banda no es detectable cuando el cultivo se incuba en presencia del inhibidor de síntesis de ADN, citosina arabinósido. Muestras equivalentes producidas en células Vero mostraron una banda muy débil de aproximadamente 350 Kb en las células Vero infectadas con ALVAC-RG a tiempo cero. Este nivel representaba virus residuales. La intensidad de la banda se amplificó a las 72 horas de la infección indicando que cierto grado de replicación de ADN específico de virus había ocurrido en células Vero, el cual no había resultado en un aumento de la progenie viral. Muestras equivalentes producidas en células MRC-5 indicaron que no se detectó acumulación de ADN específico del virus en estas condiciones y en esta línea celular. Este experimento se amplió entonces para incluir líneas celulares humanas adicionales, específicamente células WISH y Detroit-532. Células FEP infectadas con ALVAC sirvieron de control positivo. No se detectó acumulación de ADN específico del virus ni en células WISH ni en células Detroit inoculadas con ALVAC-RG. Debe destacarse que los límites de detección de este procedimiento no se han establecido completamente y puede estar ocurriendo acumulación de ADN viral, pero a un nivel por debajo de la sensibilidad del procedimiento. Otros experimentos en los cuales la replicación de ADN
viral se midió por incorporación de ^{3}H-timidina respaldan los resultados obtenidos con células Vero y MRC-5.
Análisis de Expresión del Gen de la Rabia. Para determinar si alguna expresión de gen viral, particularmente la del gen foráneo insertado, ocurría en las líneas celulares humanas incluso en ausencia de replicación de ADN viral, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación en lisados marcados con ^{35}S-metionina de células aviares y no aviares infectadas con ALVAC y ALVAC-RG. Los resultados de la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo monoclonal específico para G de la rabia pusieron de manifiesto una inmunoprecipitación específica de una glicoproteína de 67 kDa en células FEP, Vero y MRC-5, WISH y Detroit infectadas con ALVAC-RG. No se detectaron dichos productos específicos del gen de la rabia en ninguno de los lisados de células no infectadas o infectadas parenteralmente.
Los resultados de este experimento indicaron que en las líneas celulares humanas analizadas, aunque el virus recombinante ALVAC-RG era capaz de iniciar una infección y expresar un producto génico foráneo bajo el control transcripcional del promotor H6 temprano/tardío del virus vaccinia, la replicación no procedió con replicación de ADN, y no había progenie viral producida detectable. En las células Vero, aunque se observó cierto grado de acumulación de ADN específico de ALVAC-RG, no se detectó progenie viral mediante estos procedimientos. Estos resultados indicarían que en las líneas celulares humanas analizadas el bloqueo de la replicación viral ocurre con anterioridad al comienzo de la replicación del ADN, mientras que en células Vero, el bloqueo ocurre tras el comienzo de la replicación del ADN.
Para determinar si la glicoproteína de la rabia expresada en ALVAC-RG era inmunogénica, una serie de especies animales se sometieron a una prueba por inoculación del virus recombinante. La eficacia de las vacunas de la rabia actuales se evalúa en un sistema modelo de ratón. Una prueba similar se realizó por tanto utilizando ALVAC-RG. Nueve preparaciones diferentes de virus (incluyendo un lote de vacuna (J) producido tras 10 pasajes seriados del cultivo tisular del virus del inóculo) con títulos infecciosos de entre log_{10} 6,7 y log_{10} 8,4 DICT_{50} por ml se diluyeron serialmente y de 50 a 100 ml de las diluciones se inocularon en la almohadilla del pie de ratones de entre cuatro y seis semanas de edad. Los ratones se infectaron 14 días después por vía intracraneal con 300 ml de la cepa CVS del virus de la rabia que contiene entre 15 y 43 DL_{50} de ratón según se determinó por titulación de la letalidad en un grupo control de ratones. La potencia, expresada como la DP_{50} (Dosis Protectora 50%), se calculó a los 14 días de la infección. Los resultados del experimento se muestran en Tabla 6. Los resultados indicaron que ALVAC-RG era capaz de proteger a los ratones contra la infección del virus de la rabia sistemáticamente con un valor DP_{50} de entre 3,33 y 4,56 con un valor medio de 3,73 (STD 0,48). Como extensión de este estudio, ratones machos se inocularon intracranealmente con 50 ml de virus con log_{10} 6,0 DICT_{50} de ALVAC-RG o con un volumen equivalente de una suspensión de células no infectadas. Los ratones se sacrificaron a los 1, 3 y 6 días post inoculación y sus cerebros se extrajeron, fijaron y seccionaron. El examen histopatológico no mostró evidencias de neurovirulencia de ALVAC-RG en los ratones.
Para evaluar la seguridad y eficacia de ALVAC-RG en perros y gatos, se analizó un grupo de 14 beagles de 5 meses de edad y 14 gatos de 4 meses de edad. Cuatro animales de cada especie no se vacunaron. Cinco animales recibieron DICT_{50} con log_{10} 6,7 subcutáneamente y cinco animales recibieron DICT_{50} con log_{10} 7,7 por la misma vía. Se extrajo sangre de los animales para análisis de anticuerpo antirrábico. Los animales que no recibieron inoculación o que recibieron DICT_{50} con log_{10} 6,7 de ALVAC-RG se infectaron a los 29 días de vacunación con log_{10} 3,7 DL_{50} de ratón (perros, en el músculo temporal) o log_{10} 4,3 DL_{50} de ratón (gatos, en el cuello) de la cepa de infección NYGS del virus de la rabia. Los resultados del experimento se muestran en Tabla 7.
No se vieron reacciones adversas a la inoculación ni en gatos ni en perros con ninguna de las dosis del inóculo vírico. Cuatro de los 5 perros inmunizados con log_{10} 6,7 DICT_{50} tuvieron títulos a los 29 días. Todos los perros estaban protegidos de una infección la cual mató a tres de los cuatro controles. En gatos, tres de los cinco gatos que recibieron DICT_{50} con log_{10} 6,7 tuvieron títulos específicos de anticuerpo en el día 14 y todos los gatos estaban protegidos en el día 29 aunque el título de anticuerpo medio era bajo a 2,9 UI. Tres de los cinco gatos sobrevivieron una infección la cual mató a todos los controles. Todos los gatos inmunizados con DICT_{50} con log_{10} 7,7 tuvieron títulos de anticuerpos en el día 14 la Media Geométrica del Título en el día 29 se calculó como 8,1 Unidades Internacionales.
Se examinó la respuesta inmune de los monos ardilla (Saimiri sciureus) a la inoculación con ALVAC, ALVAC-RG y un virus recombinante de viruela del canario no relacionado. Grupos de monos se inocularon como se describe más arriba y los sueros se analizaron para la presencia de anticuerpo específico de la rabia. Aparte de las reacciones cutáneas menores típicas a la inoculación por vía intradérmica, no se vio reactividad adversa en ninguno de los monos. Pequeñas cantidades de virus residual se aislaron de lesiones de la piel tras la inoculación intradérmica solamente a los dos y cuatro días post inoculación. Todos los especímenes fueron negativos a partir del día siete. No hubo ninguna reacción local a la inyección intramuscular. Los cuatro monos inoculados con ALVAC-RG desarrollaron anticuerpos séricos neutralizantes de rabia según se midió en una prueba RFFI. Aproximadamente seis meses después de la inoculación inicial todos los monos y un mono adicional que no había sido inoculado se volvieron a inocular por vía subcutánea en la cara externa del muslo izquierdo con DICT_{50} log_{10} 6,5 de ALVAC-RG. Los sueros se analizaron para la presencia de anticuerpo antirrábico. Los resultados se muestran en Tabla 8.
Cuatro de cinco monos que no habían sido vacunados para la rabia desarrollaron una respuesta serológica a los siete días post inoculación con ALVAC-RG. Los cinco monos tuvieron anticuerpo detectable a los 11 días post inoculación. De los cuatro monos con exposición previa a glicoproteína de la rabia, todos mostraron un aumento significativo en el título de neutralización en suero entre los días 3 y 7 post-vacunación. Los resultados indican que la vacunación de monos araña con ALVAC-RG no produce efectos secundarios adversos y que se puede inducir una respuesta primaria de anticuerpos neutralizantes. También se puede inducir una respuesta anamnésica tras una revacunación. La exposición previa a ALVAC o a un virus recombinante de viruela del canario que expresa un gen foráneo no relacionado no interfiere con la inducción de una respuesta inmune antirrábica tras una revacunación.
Se evaluó la respuesta inmunológica de macacos seropositivos VIH-2 a la inoculación con ALVAC-RG. Los animales se inocularon como se describe más arriba y se valoró la presencia de anticuerpo neutralizante antirrábico en suero con una prueba RFFI. Los resultados, mostrados en Tabla 9, indicaron que los animales VIH-2 positivos inoculados por vía subcutánea desarrollaron anticuerpo antirrábico a los 11 días tras una inoculación. Se detectó una respuesta anamnésica tras una inoculación de refuerzo dada aproximadamente tres meses después de la primera inoculación. No se detectó ninguna respuesta en los animales que recibieron el virus recombinante por vía oral. Además, una serie de seis animales se inocularon con dosis decrecientes de ALVAC-RG dadas o por vía intramuscular o por vía subcutánea. Cinco de los seis animales inoculados respondieron a los 14 días post vacunación sin una diferencia considerable en título de anticuerpo.
Dos chimpancés con exposición previa a VIH se inocularon con log_{10} 7,0 ufc de ALVAC-RG por vía subcutánea o intramuscular. A los 3 meses post-inoculación ambos animales se revacunaron de idéntica manera. Los resultados se muestran en Tabla 10.
No se observó ninguna reactividad adversa a la inoculación por vía intramuscular o por vía subcutánea. Ambos chimpancés respondieron a la inoculación primaria a los 14 días y se detectó un fuerte aumento de la respuesta tras la revacunación.
TABLA 1 Pasaje Secuencial de ALVAC en Células Aviares y No Aviares
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TABLA 2 Pasaje Secuencial de ALVAC-RG en Células Aviares y No Aviares
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TABLA 3 Ampliación del Virus Residual por pasaje en células FEP
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TABLA 4 Diagrama de inoculación de macacos Rhesus con ALVAC-RG (vCP65)
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TABLA 5 Análisis de rendimiento en células aviares y no aviares inoculadas con ALVAC-RG
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TABLA 6 Potencia de ALVAC-RG probada en ratones
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TABLA 7 Eficacia de ALVAC-RG en perros y gatos
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TABLA 8 Respuesta serológica antirrábica de monos ardilla inoculados con virus recombinantes de viruela del canario
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TABLA 9 Inoculación de macacos Rhesus con ALVAC-RG^{a}
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TABLA 10 Inoculación de chimpancés con ALVAC-RG
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Ejemplo 9 Inmunización de humanos utilizando glicoproteína de la rabia que expresa el virus de la viruela del canario (ALVAC-RG; vCP65)
ALVAC-RG (vCP65) se generó tal como se describe en el Ejemplo 9 y las Figs. 9A y 9B. Para aumentar la escala y fabricar la vacuna ALVAC-RG (vCP65) se creció en cultivos primarios de FEP derivados de huevos específicos libres de patógenos. Las células se infectaron a una multiplicidad de 0,1 y se incubaron a 37ºC durante tres días.
La suspensión del virus de la vacuna se obtuvo por lisis de las células infectadas en medio libre de suero; los desechos celulares se eliminaron entonces mediante centrifugación y filtración. La suspensión clarificada resultante se suplementó con una estabilizador de liofilización (mezcla de amino ácidos), se repartió en viales monodosis y se liofilizó. Tres lotes con títulos decrecientes se prepararon mediante diez diluciones seriadas de la suspensión del virus en una mezcla de medio libre de suero y estabilizador de la liofilización, antes de la liofilización.
Se realizaron pruebas de control de calidad sobre los sustratos celulares, medio y inóculos de virus y producto final haciendo énfasis en la búsqueda de agentes adventicios e inocuidad de los roedores de laboratorio.
Datos preclínicos. Estudios in vitro indicaron que las células VERO o MRC-5 no admiten el crecimiento de ALVAC-RG (vCP65); una serie de ocho (VERO) y 10 (MRC) pasajes seriados ciegos no causaron una adaptación detectable del virus para permitir su crecimiento en estas líneas no aviares. El análisis de las líneas celulares (MRC-5, WISH, Detroit 532, HEL, HNK o células linfoblastoides transformadas con EBV) infectadas o inoculadas con ALVAC-RG (vCP65) no mostró acumulación de ADN específico del virus, sugiriendo que en estas células el bloqueo de la replicación ocurre antes de la síntesis de ADN. Sin embargo, la expresión del gen de la glicoproteína del virus de la rabia en todas las líneas celulares probadas indica que el paso abortivo en el ciclo de replicación del virus de la viruela del canario ocurre antes de la replicación del ADN viral.
La seguridad y la eficacia de ALVAC-RG (vCP65) se documentaron en una serie de experimentos en animales. Un número de especies incluyendo canarios, pollos, patos, gansos, roedores de laboratorio (ratones lactantes y adultos), hámsteres, cobayas, conejos, gatos y perros, monos araña, macacos Rhesus y chimpancés, se inocularon con dosis de entre 10^{5} y 10^{8} ufc. También se han inoculado humanos con virus ALVAC-rabia y virus NYVAC-rabia con seguridad y anticuerpos neutralizantes observados (véase también la discusión de más adelante). Se utilizaron vías diversas, más comúnmente subcutánea, intramuscular e intradérmica pero también oral (monos y ratones) e intracerebral (ratones).
En canarios, ALVAC-RG (vCP65) causó una lesión "tomada" en el sitio de la cicatrización sin indicación de enfermedad o muerte. La inoculación intradérmica de conejos resultó en una reacción de inoculación típica de virus de la viruela la cual no se extendió y se curó al cabo de siete a diez días. No hubo efectos secundarios adversos debidos al virus de la viruela del canario en ninguno de de las pruebas animales. La inmunogenicidad se documentó por el desarrollo de anticuerpos atirrábicos tras la inoculación de ALVAC-RG (vCP65) en roedores, perros, gatos, y primates, según medidas obtenidas mediante Prueba Rápida de Inhibición de Foco Fluorescente (RFFIT, del inglés "Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test"). La protección también se demostró por experimentos de infección por virus de la rabia en ratones, perros, y gatos inmunizados con ALVAC-RG (vCP65).
Voluntarios. Se inscribieron veinticinco adultos sanos de entre 20 y 45 años sin historia previa de inmunización para la rabia. Se evaluó su estado de salud mediante historias médicas completas, exámenes físicos, análisis químicos histológicos y de sangre. Entre los criterios de inclusión se incluían embarazo, alergias, depresión inmune de cualquier tipo, enfermedad debilitante crónica, cáncer, inyección de inmunoglobinas en los últimos tres meses, y seropositividad al antígeno de superficie del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o al virus de la hepatitis B.
Diseño del estudio. Los participantes se repartieron aleatoriamente para recibir la vacuna estándar de células diploides humanas (HDC, del inglés "Human Diploid Cell Rabies") lote número E0751 (Pasteur Merieux Serums & Vaccine, Lyon, France) o la vacuna de estudio ALVAC-RG (vCP65).
La prueba se designó como un estudio de dosis escalonada. Tres lotes de la vacuna experimental ALVAC-RG (vCP65) se utilizaron secuencialmente en tres grupos de voluntarios (Grupos A, B y C) con intervalos de dos semanas entre cada paso. La concentración de los tres lotes era 103,5, 104,5, 105,5 Dosis de Infección de Cultivo Tisular (DICT_{50}) por dosis, respectivamente.
Cada voluntario recibió dos dosis de la misma vacuna subcutáneamente en la región deltoidea en un intervalo de cuatro semanas. Los participantes no conocían la naturaleza de la vacuna inyectada en el momento de la primera inyección pero sí la conocía el investigador.
Para minimizar el riesgo de hipersensibilidad inmediata en el momento de la segunda inyección, los voluntarios del Grupo B a los que se les asignó la dosis media de la vacuna experimental fueron inyectados 1 h antes con la dosis más baja y aquellos a los que se les asignó la dosis más alta (Grupo C) recibieron sucesivamente la dosis más baja y la dosis media en intervalos de una hora.
Seis meses después, a los receptores de la dosis más alta de ALVAC-RG (vCP65) (Grupo C) y de la vacuna HDC se les ofreció una tercera dosis de vacuna; entonces se mezclaron aleatoriamente para recibir o bien la misma vacuna como anteriormente o la vacuna alternativa. Como resultado, se formaron cuatro grupos concordando con el siguiente esquema de inmunización: 1. HDC, HDC-HDC; 2. HDC, HDC-ALVAC-RG (vCP65); 3. ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65)-HDC; 4. ALVACRG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65).
Monitorización de Efectos Secundarios. Todos los sujetos se monitorizaron durante 1 h tras la inyección y se reexaminaron cada día durante los cinco días siguientes. Se les pidió que registraran las reacciones locales y sistémicas durante las tres semanas siguientes y se les preguntó por teléfono dos veces a la semana.
Investigadores de Laboratorio. Se obtuvieron muestras de sangre antes de la inscripción y dos, cuatro y seis días después de cada inyección. Los análisis incluían recuento completo de células sanguíneas, enzimas hepáticas y pruebas de creatinquinasa.
Ensayos de Anticuerpo. Los ensayos de anticuerpo se realizaron siete días antes de la primera inyección y en los días 7, 28, 35, 56, 173, 187 y 208 del estudio.
Los niveles de anticuerpos neutralizantes de la rabia se determinaron utilizando la Prueba Rápida de Inhibición de Foco Fluorescente (RFFIT) (Smith y col., 1973). Los anticuerpos del virus de la viruela del canario se midieron por ELISA directo. Se recubrieron microplacas con el antígeno, una suspensión de virus de la viruela del canario purificado roto con 0,1% Triton X100. Diluciones fijas de los sueros se reaccionaron durante dos horas a temperatura ambiente y los anticuerpos que reaccionaron se revelaron con un suero de cabra anti-IgG humana marcada con peroxidasa. Los resultados se expresan como densidad óptica leída a 490 nm.
Análisis. Veinticinco sujetos se inscribieron y completaron el estudio. Había 10 machos y 15 hembras y la media de edad era de 31,9 (de 21 a 48). Todos los sujetos menos tres tenían evidencias de vacunación previa contra la viruela; los tres sujetos restantes no tenían historias típicas de costra y vacunación. Tres sujetos recibieron cada uno las dosis bajas de la vacuna experimental (10^{3,5} y 10^{4,5} DICT_{50}), nueve sujetos recibieron 10^{5,5} DICT_{50} y diez recibieron la vacuna HDC.
Seguridad (Tabla 11). Durante la primera serie de inmunización, se observó fiebre más alta de 37,7ºC durante las 24 horas después de la inyección en un huésped de HDC (37,8ºC) y en un huésped de vCP65 10^{5,5} DCT_{50} (38ºC). No se observó ninguna otra reacción sistémica atribuible a la vacunación en ningún participante.
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Se observaron reacciones locales en 9/10 de los huéspedes de la vacuna HDC inyectados subcutáneamente y en 0/3, 1/3 y 9/9 de los huéspedes de vCP65 10^{3,5}, 10^{4,5}, 10^{5,5} DICT_{50}, respectivamente.
La blandura fue el síntoma más común y fue siempre leve. Entre otros síntomas locales se incluyeron enrojecimiento e induración, los cuales también fueron leves y transitorios. Todos los síntomas normalmente remitieron en 24 horas y nunca duraron más de 72 horas.
No hubo ningún cambio considerable en el recuento de células sanguíneas, enzimas hepáticas y valores de creatinquinasa.
Respuestas Inmunes; Anticuerpos Neutralizantes de la Rabia (Tabla 12). Veintidós días después de la primera inyección, todos los huéspedes de HDC presentaron títulos protectores (\geq0,5 UI/ml). Por el contrario, ninguno de los huéspedes de ALVAC-RG (vCP65) en los grupos A y B (103,5 y 104,5 DICT_{50}) y sólo 2/9 de los huéspedes de ALVAC-RG (vCP65) en el grupo C (105,5 DICT_{50}) alcanzaron este título protector.
En el día 56 las medias geométricas de los títulos fueron 0,05, 0,47, 4,4 y 11,5 UI/ml en grupos A, B, C y HDC respectivamente.
En el día 180, los títulos de anticuerpo de la rabia habían disminuido sustancialmente en todos los sujetos pero permanecían por encima del título protector mínimo de 0,5 UI/ml en 5/10 de los huéspedes de HCD y en 5/9 de los huéspedes de ALVAC-RG (vCP65); las medias geométricas de los títulos fueron 0,51 y 0,45 UI/ml en los grupos HCD y C, respectivamente.
Anticuerpos para el virus de la Viruela del Canario (Tabla 13). Los títulos preinmunes observados variaron ampliamente con títulos que variaron desde 0,22 hasta 1,23 unidades de D.O. a pesar de la ausencia de cualquier contacto previo con canarios en aquellos sujetos con los títulos más altos. Si se define como un aumento de más del doble entre los títulos de la preinmunización y los de después de la segunda inyección, se obtuvo seroconversión en 1/3 de los sujetos en el grupo B y en 9/9 de los sujetos en el grupo C mientras que ningún sujeto se seroconvirtió a los grupos A o HDC.
Inyección de Refuerzo. La vacuna se toleró similarmente bien seis meses después, en el momento de la inyección de refuerzo: se observó fiebre en 2/9 de los huéspedes del refuerzo de HDC y en 1/10 de los huéspedes del refuerzo de ALVAC-RG (vCP65). Se presentaron reacciones locales en 5/9 de los huéspedes del refuerzo de HDC y en 6/10 de los huéspedes del refuerzo de ALVAC-RG (vCP65).
Observaciones. Las Figs. 11A-11D muestran los gráficos de los títulos de anticuerpos neutralizantes de la rabia (Prueba Rápida de Inhibición de Foco Fluorescente o RFFIT, UI/ml): El efecto del refuerzo de HDC y vCP65 (10^{5,5} DICT_{50}) en voluntarios previamente inmunizados con la misma vacuna o con una vacuna alternativa. Las vacunas se dieron en los días 0, 28 y 180. Los títulos de anticuerpos se cuantificaron los días 0, 7, 28, 35, 56, 173, y
187 y 208.
Como se muestra en las Figs. 11A a 11D, la dosis de refuerzo dada resultó en un mayor aumento de los títulos de anticuerpos de la rabia en cada sujeto cualquiera que fuera el esquema de inmunización. Sin embargo, el refuerzo de ALVAC-RG (vCP65) provocó globalmente respuestas inmunes más bajas que el refuerzo de HDC y el grupo ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65)-ALVAC-RG (vCP65) tuvo títulos considerablemente más bajos que los otros tres grupos. De manera similar, la inyección de refuerzo de ALVAC-RG (vCP65) resultó en un aumento de los títulos de anticuerpos de la viruela del canario en 3/5 de los sujetos quienes habían recibido previamente la vacuna HDC y en los cinco sujetos previamente inmunizados con ALVAC-RG (vCP65).
En general, ninguno de los efectos secundarios locales por administración de vCP65 fue indicativo de una replicación local del virus. En particular, no hubo lesiones de la piel tales como aquéllas observadas tras la inyección de la vacuna. A pesar de la ausencia aparente de replicación del virus, la inyección resultó en que los voluntarios generaron cantidades considerables de anticuerpos tanto para el vector de la viruela de la rabia como para la glicoproteína de la rabia.
Los anticuerpos neutralizantes de la rabia se analizaron mediante la Prueba Rápida de Inhibición de Foco Fluorescente (RFFIT) la cual se sabe que se correlaciona bien con la prueba de seroneutrolización en ratones. De 9 huéspedes de DICT_{50} de 10^{5,5}, cinco tuvieron respuestas de nivel bajo tras la primera dosis. Se obtuvieron títulos protectores de anticuerpos de la rabia tras la segunda inyección en todos los receptores de la dosis más alta probada e incluso en 2 de los 3 receptores de la dosis media. En este estudio, ambas vacunas se administraron subcutáneamente como normalmente se recomienda para vacunas vivas, pero no para la vacuna HDC inactivada. Se seleccionó esta vía de inyección puesto que permitía una examinación cuidadosa del sitio de inyección, pero esto podría explicar la apariencia tardía de anticuerpos en los huéspedes de HDC: de hecho, ninguno de los huéspedes de HDC tuvo un aumento de anticuerpos en el día 7, mientras, en la mayoría de los estudios donde la vacuna HDC se da intramuscularmente una proporción considerable de sujetos sí que lo tiene (Klietmann y col., Geneva, 1981; Kuwert y col., Geneva, 1981). Sin embargo, esta invención no se limita necesariamente a la vía de administración subcutánea.
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La MGT (media geométrica de los títulos) de los anticuerpos neutralizantes de rabia fue menor con la vacuna en investigación que con la vacuna HDC control, pero todavía muy por encima del título mínimo requerido para protección. La clara respuesta dosis efecto obtenida con las tres dosis utilizadas en este estudio sugiere que una dosis más alta podría inducir una respuesta más fuerte. Sin duda a partir de esta divulgación el experto en la materia puede seleccionar una dosis apropiada para un paciente dado.
La capacidad de reforzar la respuesta de anticuerpos es otro resultado importante de este Ejemplo; de hecho, un aumento en los títulos de anticuerpo de la rabia se obtuvo en todos los sujetos tras la dosis de los 6 meses cualquiera que fuera el esquema de inmunización, mostrando que una inmunidad preexistente producida por o bien el vector del virus de la viruela del canario o bien la glicoproteína de la rabia no tenía ningún efecto de bloqueo sobre el refuerzo con la vacuna recombinante candidata o la vacuna convencional HDC de rabia. Esto contrasta con las conclusiones de otros con virus recombinantes de vaccinia en humanos de que una respuesta inmune se puede bloquear por una inmunidad preexistente (Cooney y col., 1991; Etinger y col., 1991).
Por tanto, este Ejemplo claramente demuestra que un virus de la viruela no replicativo puede servir como vector inmunizante en humanos, con todas las ventajas que los agentes de replicación confieren sobre la respuesta inmune, pero sin la seguridad creada por un virus completamente permisivo. Y, a partir de esta divulgación, así como de este y otros Ejemplos, dosis adecuadas y modos o vías para la inmunización o administración de virus recombinantes que contienen el virus de la rabia u otros productos codificantes, o de expresión del mismo se encuentran dentro del ámbito del experto en la materia, así como los modos para la expresión in vitro.
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TABLA 11 Reacciones al cabo de 5 días tras la vacunación
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TABLA 12 Anticuerpos neutralizantes de la rabia (RFFIT;UI/ml). Títulos individuales y media geométrica de los títulos (MGT)
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TABLA 13 Anticuerpos de la viruela del canario: Media Geométrica de los Títulos obtenidos por ELISA*
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Ejemplo 10 Comparación del DL_{50} de ALVAC y NYVAC con varias cepas de virus vaccinia
Ratones. Ratones machos exogámicos Swiss Webster se adquirieron de Taconic Farms (Germantown, NY) y se mantuvieron con pienso para ratones y agua ad libitum hasta su utilización a las 3 semanas de edad (ratones "normales"). Los ratones exogámicos Swiss Webster recién nacidos eran de ambos sexos y se obtuvieron siguiendo embarazos programados realizados por Taconic Farms. Todos los ratones recién nacidos utilizados fueron librados en un plazo de dos días.
Virus. ALVAC se derivó por purificación de calvas de una población de virus de la viruela del canario y se preparó en fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) primarios. Tras la purificación por centrifugación en gradientes de densidad de sacarosa, ALVAC se enumeró por unidades de formación de calvas en células FEP. La variante WR(L) del virus vaccinia se derivó por selección de fenotipos de calva grande de WR (Panicali y col., 1981). La cepa de vacuna Wyeth New York State Board of Health del virus vaccinia se obtuvo de Pharmaceuticals Calf Lymph Type vaccine Dryvax, número de control 302001B. La cepa Copenhague del virus VC-2 se obtuvo de Institut Merieux, France. La cepa NYVAC del virus vaccinia se derivó de la cepa Copenhague del virus VC-2. Todas las cepas de virus vaccinia excepto la cepa Wyeth se cultivaron en células hepáticas Vero de cercopiteco verde, se purificaron por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y se enumeraron por unidades de formación de calvas células Vero. La cepa Wyeth se creció en células FEP y se enumeró por unidades de formación de calvas en células FEP.
Inoculaciones. Grupos de 10 ratones normales se inocularon intracranealmente (ic) con 0,05 ml de una de las varias diluciones del virus preparadas mediante 10 diluciones seriadas de las preparaciones del virus madre en tampón fosfato salino. En algunos casos, se utilizó la preparación del virus madre sin diluir para la inoculación.
Grupos de 10 ratones recién nacidos, de 1 a 2 días de edad, se inocularon ic de manera similar a la efectuada en los ratones normales excepto en que se utilizó un volumen de inyección de 0,03 ml.
Diariamente se observó la mortalidad de todos los ratones durante un periodo de 14 días (ratones recién nacidos), o 21 días (ratones normales) tras la inoculación. Los ratones encontrados muertos a la mañana siguiente de la inoculación se excluyeron debido a muerte potencial por trauma.
La dosis letal requerida para producir una mortalidad del 50% de la población experimental (DL_{50}) se determinó por el procedimiento proporcional de Reed y Muench (Reed y Muench, 1938).
Comparación de la DL_{50} de ALVAC y NYVAC con varias cepas de Virus Vaccinia para Ratones Normales, Jóvenes Exogámicos por Vía ic. En ratones jóvenes, normales, la virulencia de NYVAC y ALVAC fue varios órdenes de magnitud inferior a la de las otras cepas de virus vaccinia probadas (Tabla 14). Se descubrió que las cepas NYVAC y ALVAC eran 3.000 veces menos virulentas en ratones normales que la cepa Wyeth; más de 12.500 veces menos virulentas que la cepa parental VC-2; y más de 63.000.000 veces menos virulentas que la variante WR(L). Estos resultados sugerirían que NYVAC está muy atenuada en comparación con otras cepas de vaccinia, y que ALVAC es generalmente no virulenta para ratones jóvenes cuando se administra intracranealmente, aunque ambas podrían causar mortalidad en ratones en dosis extremadamente altas (3,85x10^{8} UFCs, ALVAC y 3x10^{8} UFCs, NYVAC) por un mecanismo indeterminado por esta vía de inoculación.
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Comparación de DL_{50} de ALVAC y NYVAC con varias cepas de Virus Vaccinia para Ratones Recién Nacidos Exogámicos por Vía ic. La virulencia relativa de 5 cepas de virus de la viruela en ratones normales recién nacidos se examinó mediante titulación en un sistema modelo de infección intracraneal (ic) (Tabla 15). Con la mortalidad como punto final, los valores de DL_{50} indicaron que ALVAC es más de 100.000 veces menos virulenta que la cepa de vacuna Wyeth del virus vaccinia; más de 200.000 veces menos virulenta que la cepa Copenhague VC-2 del virus vaccinia; y más de 25.000.000 veces menos virulenta que la variante WR-L del virus vaccinia. No obstante, la dosis más alta probada, 6,3 x10^{7} UFCs, resultó en el 100% de mortalidad. Se observaron índices de mortalidad del 33,3% con 6,3x10^{6} UFCs. La causa de la muerte, aunque no realmente determinada, no fue probablemente de naturaleza toxicológica o traumática puesto que el tiempo de supervivencia medio (TSM) de los ratones del grupo de dosis más alta (aproximadamente 6,3 DD_{50}) fue de 6,7 \pm 1,5 días. Cuando se comparó con WR(L) a una dosis de infección de 5 DL_{50}, donde el TSM es de 4,8 \pm 0,6 días, el TSM de los ratones infectados con ALVAC fue considerablemente más largo (P P=0,001).
En relación a NYVAC, Wyeth resultó ser más de 15.000 veces más virulenta; VC-2, más de 35.000 veces más virulenta; y WR(L), más de 3.000.000 veces más virulenta. De manera similar a ALVAC, las dos dosis más altas de NYVAC, 6x10^{8} y 6x10^{7} UFCs, causaron el 100% de mortalidad. Sin embargo, el TSM de los ratones infectados con la dosis más alta, correspondiente a 380 DL_{50}, fue de sólo 2 días (9 muertes en el día 2 y 1 en el día 4). Por el contrario, todos los ratones infectados con la dosis más alta de WR-L, equivalente a 500 DL_{50}, sobrevivieron hasta el día 4.
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TABLA 14 Dosis Letal 50% calculada en ratones para varias cepas del virus vaccinia y para el virus de la viruela del canario (ALVAC) por vía ic
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TABLA 15 Dosis Letal 50% calculada en ratones recién nacidos para varias cepas del virus vaccinia y para el virus de la viruela del canario (ALVAC) por vía ic
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Ejemplo 11 Evaluación de NYVAC (vP866) y NYVAC-RG (vP879)
Inmunoprecipitaciones. Monocapas preformadas de células aviares y no aviares se inocularon con 10 ufc por célula del virus parental NYVAC (vP866) o NYVAC-RG (vP879). La inoculación se realizó en EMEM libre de metionina y suplementado con 2% de suero fetal bovino dializado. Tras una hora de incubación, el inóculo se eliminó y el medio se reemplazó con EMEM (libre de metionina) con 20 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Después de una incubación durante la noche de aproximadamente 16 horas, las células se lisaron mediante la adición de Tampón A (1% Nonidet P-40, 10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% azida sódica, 500 unidades por ml de aprotinina, y 0,02% fenil metil sulfonil fluoruro). La inmunoprecipitación se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal específico de la glicoproteína de la rabia designado 24-3F10 suministrado por el Dr. C. Trinarchi, GRIFFITH Laboratories, New York State Department of Health, Albany, New York, y un conjugado anti-ratón en rata obtenido de Boehringer Mannheim Corporation (Nº de Cat. 605-500). Proteína A Sefarosa CL-48 obtenida de Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, New Jersey, se utilizó como matriz de soporte. Los inmunoprecipitados se fraccionaron en geles de poliacrilamida al 10% de acuerdo al procedimiento de Dreyfuss y col. (1984). Los geles se fijaron, se trataron para fluorografía con salicilato de sodio 1M durante una hora, y se expusieron a películas Kodak XAR-2 para visualizar la especie proteínica inmunoprecipitada.
Procedencia de los Animales. Se obtuvieron conejos New Zealand White de Hare-Marland (Hewitt, New Jersey). Ratones Swiss Webster exogámicos machos de tres semanas de edad, ratones Swiss Webster exogámicos hembras con embarazo programado, y ratones Swiss Webster desnudos (nu+nu+) de cuatro semanas de edad se obtuvieron de Taconic Farms, Inc. (Germantown, New York). Todos los animales se mantuvieron de acuerdo a la guía NIH. Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el IACUC institucional. Cuando se consideró necesario, a los ratones que eran enfermos terminales se les practicó la eutanasia.
Evaluación de Lesiones en Conejos. Uno de cada dos ratones se inoculó intradérmicamente en múltiples sitios con 0,1 ml de PBS con 104, 105, 106, 107, o 108 ufc de cada virus en prueba o con PBS sólo. Los conejos se observaron diariamente desde el día 4 hasta la resolución de la lesión. Las induraciones y ulceraciones se cuantificaron y registraron.
Recuperación de Virus de los Sitios de Inoculación. Un único conejo se inoculó intradérmicamente en múltiples sitios con 0,1 ml de PBS con 106, 107, o 108 ufc de cada virus en prueba o con PBS sólo. Al cabo de 11 días, se practicó la eutanasia al conejo y los especimenes de biopsia de piel tomados de cada uno de los sitios de inoculación se prepararon asépticamente mediante rotura mecánica y sonicación indirecta para la recuperación de virus. El virus infeccioso se analizó por titulación de las calvas en monocapas de FEP.
Virulencia en Ratones. Grupos de diez ratones, o cinco en el experimento con ratones desnudos, se inocularon ip con una de las varias diluciones de virus en 0,5 ml de PBS estéril. También se hace referencia al Ejemplo 11.
Tratamiento con Ciclofosfamida (CY). Se inyectaron ratones por vía ip con 4 mg (0,02 ml) de CY (SIGMA) en el día -2, seguido de inyección de virus en el día 0. En los siguientes días post-infección, los ratones se inyectaron ip con CY: 4 mg en el día 1; 2 mg en los días 4, 7 y 11; 3 mg en los días 14, 18, 21, 25 y 28. Se monitorizó la inmunosupresión indirectamente por enumeración de glóbulos blancos con un contador Coulter en el día 11. El recuento medio de glóbulos blancos fue de 13.500 células por ml en los ratones no tratados (n=4) y de 4.220 células por ml en ratones control tratados con CY (n=5).
Cálculo de DL_{50}. La dosis letal requerida para producir el 50% de mortalidad (DL_{50}) se determinó por el procedimiento proporcional de Reed y Muench (Reed y Muench 1938).
Prueba de Potencia de NYVAC-RG en Ratones. Se inocularon ratones de cuatro a seis semanas de edad en la almohadilla del pie con entre 50 y 100 ml de un rango de diluciones (log_{10} 2,0-log_{10} 8,0 dosis de infección de cultivo tisular 50% (DICT_{50})) de VV-RG (Kieny y col., 1984), o ALVAC-RG (Taylor y col., 1991b), o NYVAC-RG. Cada grupo consistió en ocho ratones. A los 14 días post- vacunación, los ratones se infectaron mediante inoculación intracraneal con 15 DL_{50} de la cepa CVS del virus de la rabia (0,03 ml). En el día 28, se contaron los ratones supervivientes y se calcularon las dosis protectoras del 50% (DP_{50}).
Derivación de NYVAC (vP866). La cepa NYVAC del virus vaccinia se generó a partir de VC-2, una calva clonada y aislada de la cepa COPENHAGUE de vaccinia. Para generar NYVAC a partir de VC-2, dieciocho ORFs de vaccinia, incluyendo un número de funciones virales asociadas con virulencia, se delecionaron con precisión en una serie de manipulaciones secuenciales como se ha descrito anteriormente en esta revelación. Estas deleciones se construyeron de una manera diseñada para prevenir la aparición de nuevas pautas abiertas de lectura no deseadas. La Fig. 10 representa esquemáticamente los ORFs delecionados para generar NYVAC. En la parte de arriba de la Fig. 10 se representa el mapa de restricción con HindIII del genoma del virus vaccinia (aislado de calva de VC-2, cepa COPENHAGUE). Las seis regiones de VC-2 que se delecionaron secuencialmente en la generación de NYVAC están expandidas. Estas deleciones se han descrito en esta descripción (Ejemplos de 1 a 6). Bajo dicho locus delecionado están listados los ORFs que se delecionaron de ese locus, así como las funciones u homologías y peso molecular de sus productos génicos.
Estudios de Replicación de NYVAC y ALVAC en Líneas Celulares de Tejido Humano. Para determinar el nivel de replicación de la cepa NYVAC del virus vaccinia (vP866) en células de origen humano, seis líneas celulares se inocularon con una multiplicidad de entrada de 0,1 ufc por célula en cultivo líquido y se incubaron durante 72 horas. El clon parental de COPENHAGUE (VC-2) se inoculó en paralelo. Se incluyeron fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) primarios (obtenidos a partir de huevos embrionados de entre 10 y 11 días de edad de origen SPF, Spafas, Inc., Storrs, CT) para representar un sustrato celular permisivo para todos los virus. Los cultivos se analizaron sobre la base de dos criterios: la ocurrencia de replicación viral productiva y la expresión de un antígeno extrínseco.
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El potencial de replicación de NYVAC en un número de células derivadas de humano se muestra en la Tabla 16. Ambos VC-2 y NYVAC son capaces de realizar replicación productiva en células FEP, aunque NYVAC con rendimientos ligeramente reducidos. VC-2 también es capaz de una replicación productiva en las seis líneas celulares derivadas de humano probadas con rendimientos comparables excepto en la línea celular de linfoblastos transformados con EBV, JT-1 (línea celular linfoblastoide humana transformada con virus de Epstein-Barr, véase Rickinson y col., 1984). Por el contrario, la capacidad de NYVAC para replicarse productivamente en cualquiera de las líneas celulares derivadas de humano probadas está muy atenuada. Se obtuvieron pequeños aumentos de virus infeccioso por encima de los niveles de virus residual en células MRC-5 (ATCC Nº CCL171, origen de pulmón embrionario humano), DETROIT 532 (ATCC Nº CCL54, prepucio humano, síndrome de Down), HEL 299 (ATCC Nº CCL137, células de pulmón embrionario humano) y HNK (células renales de neonato humano, Whittiker Bioproducts, Inc. Walkersville, MD, Nº de Catálogo 70-151) infectadas con NYVAC. La replicación en estas líneas celulares estaba considerablemente reducida en comparación con los rendimientos de virus obtenidos con células FEP infectadas con NYVAC o con VC-2 parental (Tabla 16). Debería señalarse que los rendimientos a las 24 horas en células FEP tanto para NYVAC como para VC-2 son equivalentes al rendimiento a las 72 horas. El dejar los cultivos de líneas celulares humanas incubando durante 48 horas adicionales (otros dos ciclos de crecimiento virales) podría, por lo tanto, haber amplificado el rendimiento relativo de virus obtenido.
En concordancia con los bajos niveles de rendimiento de virus obtenidos en las líneas celulares derivadas de humano, MRC-5 y DETROIT 532, se observaron niveles de acumulación de ADN específico de NYVAC detectables pero reducidos. El nivel de acumulación de ADN en las líneas celulares MRC-5 y DETROIT infectadas con NYVAC en relación con el observado en células FEP infectadas con NYVAC es paralelo a los rendimientos relativos de virus. No se observó acumulación de ADN viral específica de NYVAC en ninguna de las otras células derivadas de humano.
Un experimento equivalente se realizó también utilizando el virus de la viruela aviar, ALVAC. Los resultados de replicación de virus se muestran también en Tabla 16. No había progenie de virus detectable en ninguna de las líneas celulares humanas en concordancia con el rango de restricción de huésped del virus de la viruela del canario a especies aviares. También está en concordancia con la ausencia de replicación productiva de ALVAC en estas células derivadas de humano la observación de que no había acumulación de ADN específico de ALVAC detectable en ninguna de las líneas celulares derivadas de humano.
Expresión de Glicoproteína de la Rabia por NYVAC-RG en Células Humanas. Para determinar si se podía obtener una expresión eficiente de un gen foráneo en ausencia de niveles considerables de replicación viral productiva, las mismas líneas celulares se inocularon con el virus recombinante de NYVAC que expresa la glicoproteína del virus de la rabia (vP879, Ejemplo 7) en presencia de ^{35}S-metionina. La inmunoprecipitación de la glicoproteína de la rabia se realizó a partir del lisado del cultivo radiomarcado utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la glicoproteína de la rabia. Se detectó inmunoprecipitación de una proteína de 67kDa en concordancia con una forma completamente glicosilada de la glicoproteína de la rabia. No se detectó ningún producto de reacción cruzada serológica en lisados celulares no infectados o en lisados celulares parentales infectados con NYVAC parental. Se obtuvieron resultados equivalentes con todas las otras células humanas analizadas.
Inoculaciones en la Piel de Conejo. La inducción y naturaleza de las lesiones de piel de los conejos tras inoculaciones intradérmicas (id) ha sido utilizada previamente como medida de patogenicidad de las cepas del virus vaccinia (Buller y col., 1988; Child y col., 1990; Fenner, 1958, Flexner y col., 1987; Ghendon y Chernos 1964). Por lo tanto, la naturaleza de las lesiones asociadas con inoculaciones id con las cepas de vaccinia WR (ATCC Nº VR119 calva purificada en células CV-1, ATCC Nº CCL70, y una calva aislada denominada variante L, ATCC Nº VR2035 seleccionado, como se describe en Panicali y col., 1981)), WYETH (ATCC Nº VR325 comercializado como DRYVAX por Wyeth Laboratories, Marietta, PA), COPENHAGUE (VC-2), y NYVAC se evaluó por inoculación de dos conejos (A069 y A128). Los dos conejos mostraron diferentes sensibilidades generales a los virus, con el conejo A128 mostrando menos reacciones severas que el conejo A069. En el conejo A128, las lesiones fueron relativamente pequeñas y se resolvieron a los 27 días post inoculación. En el conejo A069, las lesiones fueron intensas, especialmente en los sitios de inoculación de WR, y se resolvieron sólo después de 49 días. La intensidad de las lesiones también dependía de la localización de los sitios de inoculación en relación con el sistema de drenaje linfático. En particular, todos los sitios localizados por encima de la espina dorsal mostraron lesiones más intensas y necesitaron tiempos más largos para resolver las lesiones localizadas en los flancos. Todas las lesiones se midieron diariamente desde el día 4 hasta la desaparición de la última lesión, y se calcularon las medias de tamaño máximo de lesión y días para su resolución (Tabla 17). No se observó ninguna reacción local en los sitios inyectados con el control PBS. Se observaron lesiones ulcerosas en los sitios inyectados con cepas WR, VC-2 y WYETH del virus vaccinia. De manera significativa, no se observó ninguna induración o lesión ulcerosa en los sitios de inoculación con NYVAC.
Persistencia de Virus Infeccioso en el Sitio de Inoculación. Para evaluar la persistencia relativa de esos virus en el sitio de inoculación, se inoculó un conejo intradérmicamente en múltiples sitios con 0,1 ml PBS con 106, 107 o 108 ufc de VC-2, WR, WYETH o NYVAC. Para cada virus, la dosis de 107 ufc se localizó por encima de la espina dorsal, flanqueada por las dosis de 106 y 108. Los sitios de inoculación se observaron diariamente durante 11 días. WR produjo la respuesta más intensa, seguido de VC-2 y WYETH (Tabla 18). Se observó ulceración por primera vez en el día 9 para WR y WYETH y en el día 10 para VC-2. Los sitios inoculados con NYVAC o PBS control no mostraron induración o ulceración. En el día 11 tras la inoculación, se extirparon muestras de piel de los sitios de inoculación, se rompieron mecánicamente, y el virus se tituló en células FEP. Los resultados se muestran en la Tabla 18. En ningún caso se recuperó más virus en este momento que el que se administró. La recuperación de la cepa de vaccinia, WR, fue de aproximadamente 106 ufc de virus en cada sitio independientemente de la cantidad de virus administrada. La recuperación de las cepas de vaccinia WYETH y VC-2 fue de 10^{3} a 10^{4} ufc independientemente de la cantidad administrada. No se recuperó ningún virus infeccioso de los sitios inoculados con NYVAC.
Inoculación de Ratones Genética o Químicamente Inmunodeficientes. La inoculación intraperitoneal de dosis altas de NYVAC (5 x 10^{8} ufc) o ALVAC (10^{9} ufc) en ratones desnudos no causó ninguna muerte, ni lesión, ni enfermedad aparente a lo largo del periodo de observación de 100 días. Por el contrario, los ratones inoculados con WR (de 10^{3} a 10^{4} ufc), WYETH (5 x 10^{7} o 5 x 10^{8} ufc) o VC-2 (de 10^{4} a 10^{9} ufc) presentaron lesiones diseminadas típicas de virus de la viruela primero en los dedos de los pies, luego en la cola, seguido de orquitis severa en algunos animales. En los ratones infectados con WR o WYETH, la apariencia de lesiones diseminadas generalmente condujo finalmente a la muerte del animal, mientras que la mayoría de los ratones infectados con VC-2 se recuperaron. Los valores de DL_{50} calculados se proporcionan en la Tabla 19.
En particular, los ratones inoculados con VC-2 empezaron a presentar lesiones en los dedos de los pies (pápulas rojas) y 1 o 2 días más tarde en la cola. Estas lesiones ocurrieron entre 11 y 13 días postinoculación (pi) en ratones a los que se les había dado las dosis más altas (10^{9}, 10^{8}, 10^{7} y 10^{6} ufc), en el día 16 pi en ratones a los que se les había dado 10^{5} ufc y en el día 21 pi en ratones a los que se les había dado 10^{4} ufc. No se observaron lesiones en ratones inoculados con 10^{3} y 10^{8} ufc, y aproximadamente 7 días más tarde en los otros grupos (de 10^{7} a 10^{4} ufc). La orquitis fue especialmente intensa en los grupos 10^{9} y 10^{8} ufc y, aunque en disminución, se observó hasta el final del periodo de observación de 100 días. Se percibieron algunas lesiones de tipo viruela en la piel de algunos ratones, que ocurrieron alrededor de los días 30-35 pi. La mayoría de las lesiones de viruela se curaron normalmente entre 60 y 90 días pi. Sólo un ratón murió en el grupo inoculado con 10^{9} ufc (Día 34 pi) y un ratón murió en el grupo inoculado con 10^{8} ufc (Día 94 pi). No se observó ninguna otra muerte en los ratones inoculados con VC-2.
Los ratones inoculados con 10^{4} ufc de la cepa WR de vaccinia comenzaron a presentar lesiones de viruela en el día 17 pi. Estas lesiones parecieron idénticas a las lesiones presentadas por los ratones inyectados con VC-2 (cola, dedos de los pies hinchados). Los ratones inoculados con 10^{3} ufc de la cepa WR no desarrollaron lesiones hasta 34 días pi. Se percibió orquitis sólo en los ratones inoculados con la dosis más alta de WR (10^{4} ufc). Durante las siguientes etapas del periodo de observación, las lesiones aparecieron alrededor de la boca, y los ratones dejaron de comer. Todos los ratones inoculados con 10^{4} ufc de WR murieron o se les practicó la eutanasia cuando se consideró necesario entre 21 y 31 días pi. Cuatro de los 5 ratones inyectados con 10^{3} ufc de WR murieron o se les practicó la eutanasia cuando se consideró necesario entre 35 y 57 días pi. No se observó ninguna muerte en los ratones inoculados con dosis más bajas de WR (de 1 a 100 ufc).
Los ratones inoculados con la cepa WYETH del virus vaccinia a dosis altas (5 x 10^{7} y 5 x 10^{8} ufc) mostraron lesiones en los dedos de los pies y colas, desarrollaron orquitis, y murieron. Los ratones inyectados con 5 x 10^{6} ufc o menos de WYETH no mostraron ningún signo de enfermedad o lesión.
Como se muestra en Tabla 19, los ratones tratados con CY proporcionaron un modelo más sensible para analizar la virulencia del virus de la viruela que los ratones inmunodeficientes nude. Los valores DL_{50} para las cepas del virus vaccinia WR, WYETH, y VC-2 fueron significativamente más bajos en este sistema modelo que en el modelo de ratón nude. Además, se desarrollaron lesiones en los ratones inyectados con los virus vaccinia WYETH, WR y VC-2, como se destaca más abajo, con las dosis más altas de cada virus resultando en formación más rápida de lesiones. Como se vio con los ratones nude, los ratones tratados con CY inyectados con NYVAC o ALVAC no desarrollaron lesiones. Sin embargo, a diferencia de los ratones nude, se observaron algunas muertes en los ratones tratados con CY infectados con NYVAC o ALVAC, independientemente de la dosis. Se sospecha que estas incidencias aleatorias sean la causa de la muerte.
Los ratones inyectados con todas las dosis de WYETH (de 9,5 x 10^{4} a 9,5 x 10^{8} ufc) presentaron lesiones de viruela en la cola y/o en los dedos de los pies entre 7 y 15 días pi. Además, las colas y dedos de los pies se hincharon. La evolución de las lesiones en la cola fue típica de una lesión de viruela con formación de una pápula, ulceración y finalmente formación de una costra. Los ratones inoculados con todas las dosis de VC-2 (de 1,65 x 10^{5} a 1,65 x 10^{9}) también desarrollaron lesiones de viruela en la cola y/o dedos de los pies de manera análoga con aquéllos ratones inyectados con WYETH. Estas lesiones se observaron entre 7 y 12 días post inoculación. No se observó ninguna lesión en los ratones inyectados con dosis más bajas de virus WR, aunque ocurrieron muertes en estos grupos.
Prueba de Potencia de NYVAC-RG. Para determinar que la atenuación de la cepa COPENHAGUE del virus vaccinia se había efectuado sin alterar considerablemente la capacidad de la cepa NYVAC resultante para ser un vector útil, se realizaron pruebas comparativas de potencia. Para monitorizar el potencial inmunogénico del vector durante las manipulaciones genéticas secuenciales realizadas para atenuar el virus, se utilizó una glicoproteína del virus de la rabia como antígeno reportero extrínseco. La eficacia de protección de los vectores que expresan el gen de la glicoproteína de la rabia se evaluó mediante la prueba de potencia estándar NIH para la rabia en ratones (Seligmann, 1973). La Tabla 20 demuestra que los valores DP_{50} obtenidos con el vector NYVAC altamente atenuado son idénticos a aquéllos obtenidos utilizando un virus recombinante basado en COPENHAGUE que contiene el gen de la glicoproteína de la rabia en el locus tq (Kieny y col., 1984) y similares a los valores DP_{50} obtenidos con ALVAC-RG, un vector basado en el virus de la viruela del canario con replicación restringida a especies aviares.
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Observaciones. NYVAC, delecionado de genes de virulencia conocidos y con características de restricción de crecimiento "in vitro", se analizó en sistemas de modelo animal para evaluar sus características de atenuación. Estos estudios se realizaron en comparación con la cepa de laboratorio neurovirulenta del virus vaccinia, WR, dos cepas de vacuna del virus vaccinia, WYETH (New York City Board of Health) y COPENHAGUE (VC-2), así como con una cepa del virus de la viruela del canario, ALVAC (Véase también Ejemplo 11). Juntos, estos virus proporcionaron un espectro de potenciales relativamente patogénicos en el modelo de infección de ratón y en el modelo de piel de conejo, siendo WR la cepa más virulenta, WYETH y COPENHAGUE (VC-2) unas cepas de vaccinia atenuadas utilizadas previamente con características documentadas, y ALVAC un ejemplo de un virus de la viruela cuya replicación se restringe a especies aviares. Los resultados de estos análisis in vivo demuestran claramente las propiedades altamente atenuadas de NYVAC en relación con las cepas del virus vaccinia, WR, WYETH y COPENHAGUE (VC-2) (Tablas 14-20). De manera significativa, los valores DL_{50} de NYVAC eran comparables a aquéllos observados en el virus de la viruela aviar restringido a huésped aviar, ALVAC. Sólo se observaron muertes debidas a NYVAC, así como a ALVAC, cuando se administraron dosis extremadamente altas de virus por vía intracraneal (Ejemplo 11, Tablas 14, 15, 19). Todavía no se ha se ha establecido si estas muertes se debieron a consecuencias inespecíficas de la inoculación de una concentración alta en proteína. Los resultados de análisis en modelos de ratón inmunocomprometidos (nude y tratados con CY) también demuestran las características de atenuación relativamente alta de NYVAC, en comparación con las cepas WR, WYETH y COPENHAGUE (Tablas 17 y 18). De manera significativa, no se observó ninguna evidencia de infección diseminada de vaccinia o enfermedad vaccinial en animales inoculados con NYVAC o en animales inoculados con ALVAC a lo largo del periodo de observación. La deleción de múltiples genes asociados con virulencia en NYVAC muestra una sinergia con respecto a la patogenicidad. Otra medida de la inocuidad de NYVAC fue proporcionada por la administración intradérmica en piel de conejo (Tablas 17 y 18). Considerando los resultados con ALVAC, un virus incapaz de replicarse en especies no aviares, la capacidad de replicarse en el sitio de inoculación no es la única correlación con la reactividad, puesto que la inoculación intradérmica de ALVAC causó áreas de induración de manera dosis dependiente. Por lo tanto es probable que otros factores además de la capacidad replicativa del virus contribuyan a la formación de las lesiones. La deleción de genes específicos asociados con la virulencia en NYVAC previene la ocurrencia de lesiones.
Los resultados en este Ejemplo y los de los Ejemplos precedentes, incluyendo el Ejemplo 10, demuestran la naturaleza altamente atenuada de NYVAC en relación con WR, y las cepas de vacuna del virus vaccinia utilizadas previamente, WYETH y COPENHAGUE. De hecho, el perfil patogénico de NYVAC, en los sistemas de modelo animal probados, era similar al de ALVAC, un virus de la viruela que se sabe se replica productivamente sólo en especies aviares. La capacidad aparentemente restringida de NYVAC para replicarse productivamente en células derivadas de humanos (Tabla 16) y otras especies, incluyendo el ratón, cerdo, perro y caballo, proporciona una barrera considerable que limita o previene la transmisión potencial por contactos con no vacunados o al ambiente general, además de proporcionar un vector con probabilidad reducida de diseminación dentro del individuo vacunado.
De manera significativa, se ha demostrado que los candidatos a vacuna basados en NYVAC son eficaces. Los virus recombinantes de NYVAC que expresan productos génicos foráneos de una serie de patógenos han provocado respuestas inmunológicas hacia los productos génicos foráneos en varias especies animales, incluyendo los primates. En particular, un virus recombinante basado en NYVAC que expresa la glicoproteína de la rabia era capaz de proteger a los ratones contra la infección letal de la rabia. La potencia del virus recombinante basado en NYVAC con la glicoproteína de la rabia fue comparable al valor DP_{50} de un virus recombinante basado en COPENHAGUE que contiene la glicoproteína de la rabia en el locus tq (Tabla 20). Se ha demostrado que los virus recombinantes basados en NYVAC provocan anticuerpos neutralizantes del virus del sarampión en conejos y protección contra el virus de la pseudorabia y contra el virus de la encefalitis japonesa en cerdos. La cepa altamente atenuada NYVAC confiere ventajas en seguridad con humanos, animales, aplicaciones médicas y veterinarias (Tartaglia y col., 1992). Además, la utilización de NYVAC como sistema de vector de expresión general de laboratorio podría reducir enormemente los riesgos biológicos asociados con la utilización de virus vaccinia.
Por los siguientes criterios, los resultados de este Ejemplo y los Ejemplos de aquí, incluyendo el Ejemplo 10, muestran que NYVAC está altamente atenuado: a) ninguna induración o ulceración detectable en el sitio de inoculación (piel de conejo); b) despeje rápido del virus infeccioso del sitio intradérmico de inoculación (piel de conejo); c) ausencia de inflamación testicular (ratones desnudos); d) virulencia enormemente reducida (infección intracraneal, ratones ambos de tres semanas de edad y recién nacidos); e) patogenicidad enormemente reducida e incapacidad para diseminarse en sujetos inmunodeficientes (ratones desnudos y tratados con ciclofosfamida); y f) capacidad drásticamente reducida para replicarse en una variedad de células en cultivo de tejido humano. Sin embargo, a pesar de estar altamente atenuado, NYVAC, como vector, conserva la capacidad de inducir respuestas inmunes fuertes ante antígenos foráneos.
TABLA 16 Replicación de COPENHAGUE (VC-2), NYVAC y ALVAC en líneas celulares aviares o derivadas de humano
38
TABLA 17 Induración y ulceración en el sitio de inoculación intradérmica en la piel del conejo
40
TABLA 18 Persistencia del virus de la viruela en el sitio de inoculación intradérmica
41 
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TABLA 19 Estudios de virulencia en ratones inmunocomprometidos
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TABLA 20 Eficacia comparativa de NYVAC-RG y ALVAC-RG en ratones
43 
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Ejemplo 12 Duración de la inmunidad en perros por vCP-65
Este Ejemplo analiza en perros la duración de la inmunidad inducida por el virus recombinante de viruela del canario-rabia vCP65, utilizando una única inmunización con 10^{6,7} DICT_{50}.
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Materiales
53 perros, de 8 meses de edad, sin anticuerpos de la rabia (Beagle) y, virus recombinante vCP-65 producido en FEP en el 6º pasaje, con 10^{6,7} DICT_{50}/ml.
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Procedimientos Inmunización
En el día 0, se inocularon 41 perros por vía subcutánea, con 1 ml de la suspensión de vCP65. Doce (12)perros no se inocularon (animales control). Dos animales vacunados murieron de muerte no específica.
Prueba Serológica
Se extrajo sangre de todos los perros en el día 0 y después de 1, 2, 3, 6 meses tras la vacunación. Se extrajo sangre a algunos de los perros en momentos adicionales (12, 24, y 36 meses después de la vacunación).
Para un seguimiento corto, se extrajo sangre de 10 perros en los días 0, 7, 14 y 21.
Anticuerpos de la rabia: Prueba RFFIT (SN).
Anticuerpos de la viruela del canario: ELISA: técnica indirecta contra un virus purificado completo.
Prueba de Seguridad
Desde el día 0 hasta el día 7: observación diaria y registro de temperatura en cada animal.
Desde el día 7 hasta el día 28: observación semanal.
Infección
Un primer grupo de 5 perros se infectó seis meses después de la vacunación, por inoculación intramuscular de 10^{3,4} dosis letal (DL) 50 %/ratón, en el músculo temporal (2 x 0,5 ml). Tres (3) animales control no vacunados recibieron la misma infección al mismo tiempo.
Un segundo grupo de 11 perros vacunados se infectó bajo las mismas condiciones, 12 meses después de la vacunación, y, al mismos tiempo, tres (3) animales control también se infectaron.
Un tercer grupo de 11 vacunados se infectó, bajo las mismas condiciones, 24 meses después de la vacunación. Al mismo tiempo, tres (3) animales control también se infectaron.
Un cuarto grupo de doce (12) perros vacunados se infectó bajo las mismas condiciones, 36 meses después de la vacunación. Al mismo tiempo, tres (3) animales control también se infectaron.
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Resultados Seguridad de vCP65
Ninguno de los perros presentó una reacción local o general (véase temperatura Tablas 26 y 27).
Serología
Anticuerpos de la rabia: Ac SN de la rabia se obtuvieron por inmunoprecipitación en todos los 41 perros vacunados. El nivel máximo se observa entre los 14 y los 28 días y es seguido de un descenso rápido (véase Tablas 21, 22, y 29).
Anticuerpos CP: Todos los perros fueron positivos en el día 28. Sólo un perro obtuvo un nivel de Ac muy bajo y esto se correlaciona con un nivel de anticuerpo de la rabia bajo (véase Tablas 23 y 24).
Infección
Todos los perros vacunados sobrevivieron tras una infección llevada a cabo 6 ó 12 meses más tarde (véase Tabla 25). Diez de los once (10/11) sobrevivieron a la infección a los 24 meses y 11/12 sobrevivieron a la infección 36 meses después de la vacunación (véase tabla 28).
Titulación del Ac de la rabia se hizo 2 meses después de la infección en los perros supervivientes (infección a los 6 meses). Los cinco (5) perros tuvieron un nivel de Ac alto.
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Discusión
La cinética de los anticuerpos observada en perros inmunizados fue muy rápida y en el momento de la infección, a los 12 meses la mayoría de ellos fueron casi "negativos". A pesar de este hecho, el 100% estaba protegido. Varios perros provocaron niveles particularmente bajos de Ac de la rabia: menos de 1 U.I. un mes después de la vacunación. Uno de ellos resistió a una infección a los 12 meses. Los otros 3 se infectaron más tarde.
TABLA 21 Cinética de anticuerpos de la rabia (RFFIT) del virus recombinante de la viruela canario/rabia vCP65
44
45
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TABLA 22 Cinética de los anticuerpos (RFFIT) del virus recombinante de viruela del canario/rabia vCP65
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TABLA 23 Cinética de los anticuerpos (ELISA) del virus recombinante de viruela del canario/rabia vCP65
49
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TABLA 24 Cinética de anticuerpos de la rabia (ELISA) del virus recombinante de viruela del canario/rabia vCP65
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TABLA 25
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TABLA 26 Estudio de la duración de la inmunidad en perros con el virus recombinante de viruela del canario/rabia vCP65
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TABLA 27 Temperaturas
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TABLA 28
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TABLA 29 Cinéticas de anticuerpos de la rabia (RFFIT) del virus recombinante de viruela del canario/rabia vCP65
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TABLA 30
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Ejemplo 13 Inmunización con virus recombinantes ALVAC/rabia vCP65 de cachorros con anticuerpos maternos Materiales
Animales: 16 cachorros Beagle nacidos a partir de perras inmunes, reforzadas con Rabisin dos semanas antes de parir.
Vacunas: Alvac/Rabia (vCP65): lote liofilizado, con 10^{8} DICT_{50} 1 ml y Rabisin: lote 1 RBN de 581,7 U.I./dosis.
Procedimientos
Inmunización: Los cachorros permanecieron con su madre hasta el destete. Cuando tenían dos semanas de edad, se mezclaron aleatoriamente y se distribuyeron en 4 grupos:
A: 4 cachorros que recibieron 1 ml SC vCP65 a 10^{8} DICT_{50}/ml
B: 4 cachorros que recibieron 1 ml SC vCP65 a 10^{6,7} DICT_{50}/ml
C: 4 cachorros que recibieron 1 ml SC/Rabisin
D: 4 cachorros que permanecieron sin vacunar = "Controles"
Serología: Se extrajo sangre a todos los cachorros en los días 0, 14, 28, 49, 82, 105 y 119. También se extrajo sangre a los animales supervivientes tras la infección en el día 160. Titulación del Ac de la rabia: RFFIT. Titulación del Ac CP: ELISA.
Infección: En el día 119 después de la inmunización, todos los cachorros se infectaron mediante inoculación IM de 10^{4,1} DLM_{50} en el músculo temporal.
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Resultados
Anticuerpos CP (viruela del canario, del inglés "canarypox") (Véase tabla 31): A pesar del fondo alto y heterólogo observado, la vacunación se mostró según la media de Ac CP (anticuerpos de la viruela del canario) en aumento.
Anticuerpo (Ac) de la rabia y tasa de protección (Véase Tablas 31 y 32): En comparación con el Ac pasivo en disminución en los controles, una estabilización, o incluso un aumento limitado en el título de SN se observa hasta el día 28 en los grupos vacunados. No es posible diferenciar los 3 grupos vacunados. Todos los cachorros inmunizados con Rabisin o vCP65 a 10^{8} DICT_{50} sobrevivieron tras la infección mientras que el 50% (2/4) de los cachorros vacunados con 10^{6,7} DICT están protegidos.
Inmunización de cachorros de 2 semanas de edad, con una tasa de Ac en el sobrenadante elevada, fue posible con Rabisin o vCP65 a 10^{8} DICT_{50}.
Vacunación bajo las mismas condiciones, utilizando vCP-65 a 10^{6,7} DICT_{50}, indujo al 50% de protección.
Este Ejemplo muestra como composiciones del virus recombinante de la viruela del canario-rabia (por ejemplo, composiciones de vCP65) pueden producir protección a pesar de la inmunidad materna en cachorros.
TABLA 31
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TABLA 32
68
TABLA 33
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Ejemplo 14 Prueba de un año de la inmunogenicidad y seguridad de una vacuna contra la rabia en perros usando una fracción recombinante de rabia (vCP65) en combinación con fracciones convencionales: moquillo canino, adenovirus canino de tipo 2, coronavirus canino, parainfluenza canina, parvovirus canino, vacuna de la rabia, virus vivos modificados, vector del virus de la viruela del canario, bacterinas de leptospira canicola-icterohaemorrhagiae
Este ejemplo demuestra la protección frente al virus de la rabia durante al menos un año tras la vacunación y evalúa la eficacia, seguridad y ausencia de interferencias de esta vacuna recombinante en cachorros de 9 a 12 semanas.
Más específicamente, este ejemplo demuestra la protección frente a la rabia durante al menos un año, mediante un antígeno recombinante del virus de la rabia (vCP65) que se incluye en la vacuna de combinación canina DACPiP-CP65 y DACIP+LCI, y evalúa la seguridad de esta vacuna de combinación cuando se administra mediante la ruta subcutánea (SC) a cachorros, y la ausencia de interferencias de las diferentes fracciones en cada una (Ver también el Ejemplo 15, más abajo).
Un vector del virus vivo de la viruela del canario se usó para preparar un virus recombinante de la rabia como vacuna. El vector del virus de la viruela del canario ha sido manipulado mediante técnicas de ingeniería genética para que tenga el gen codificante para la glicoproteína de superficie (G) del virus de la rabia. El antígeno recombinante de la vacuna de la rabia se preparó a partir del virus de quinto pasaje (vCP65X+5) del virus inicial. Este productor de antígeno puede usarse en una vacuna monovalente. También puede ser liofilizado en combinación con otros cinco antígenos caninos vivos modificados. Con propósito aclaratorio, se usarán las siguientes abreviaturas para estos antígenos en este Ejemplo y en las Tablas que se incluyen en el mismo:
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Componente MLV Abreviaturas
Virus del Moquillo Canino (CDV)
D
Adenovirus Canino (CAV-2)
A
Coronavirus Canino (CCV)
C
Parainfluenza Canina (CPi)
Pi
Parvovirus Canino (CPV)
P
Vector del virus de la viruela del canario/Rabia (recombinante)
CP65
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La bacterina bivalente de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae utilizada para rehidratar la vacuna DACPiPCP65 y DACPiP se abrevia como LCI.
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Procedimiento
Treinta (30) perros seronegativos para la rabia fueron vacunados dos veces subcutáneamente con una dosis de 1 ml de una vacuna de combinación liofilizada (DACPiP-CP65+LCI) que contenía DACPiP y una fracción de virus recombinante de la rabia (vCP65), diluida en una combinación bacterina de dos Leptospiras (LCI). Treinta (30) perros seronegativos para la rabia fueron vacunados con la misma vacuna de combinación sin la fracción del recombinante de la rabia (DACPiP+LCI), y sirvieron como controles de la rabia. Se recogieron muestras de suero los días 0, 28, 60, 90, 180, 270, y 390 tras la vacunación y se usó RFFIT, para obtener el título de anticuerpos de la rabia. Todos los perros se infectaron 365 días después de la segunda vacunación. Se registraron diariamente los síntomas y muertes durante 90 días tras la infección. Más específicamente.
Animales: Sesenta (60) perros seronegativos para la rabia, entre 9 y 12 semanas de edad se consiguieron de Harlan Sprague Dawley.
Vacunaciones: Treinta (30) de los perros recibieron su primera vacunación con la combinación del recombinante de la rabia (DACPiP-CP65+LCI) a las edades siguientes (Tabla 34):
TABLA 34
70 
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Controles: Los treinta (30) perros control que recibieron la misma vacuna de combinación menos el recombinante de la rabia (DACPiP+LCI), se clasificaron en base a la edad como sigue:
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TABLA 35
71
Vacunas: DACPiP-CP65 Y DACPiP: Estas vacunas se prepararon mediante la siguiente formulación:
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TABLA 36
72 
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Estas suspensiones de vacuna DACPiP-CP65 y DACPiP se distribuyeron en viales que contenían 1,3 ml de suspensión y se liofilizaron en los días -8 y -61 respectivamente. Sus títulos tras la liofilización se definen más abajo.
Bacterina de Leptospira (LCI): La LCI era una bacterina distribuida comercialmente por la USDA con número de serie 32010.
Virus de Infección: El cultivo del virus de infección era una cepa del virus de la rabia callejera obtenida de la NVSL. Bajo prescripción, el cultivo de infección se diluyó 1:100 en CVS, se alicuotó en viales de 1 ml y se guardó congelado a -70ºC hasta su uso.
Se utilizó la siguiente tabla durante este estudio (Tabla 37):
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TABLA 37
74 
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Vacunación
Grupo de Vacunación: Treinta (30) perros recibieron una dosis de 1 ml, SC, de la vacuna liofilizada (DACPiP-CP65) rehidratada con la bacterina (LCI) líquida.
Grupo de Control: Treinta (30) perros recibieron una dosis de control, SC, de DACPiP rehidratada con LCI.
Vacunación de Refuerzo: Cuatro semanas tras la primera vacunación, el grupo de vacunación recibió una dosis de 1 ml, SC, de DACPiP-CP65 y el grupo de control recibió una segunda dosis de 1 ml, SC, de DACPiP. Ambas vacunas se rehidrataron con LCI.
Infección Preliminar: Nueve perros se dividieron en tres grupos de tres perros cada uno. Los perros del Grupo 1 se infectaron con el cultivo de infección diluido a 10^{-4}, los perros del Grupo 2 fueron infectados con el cultivo de infección diluido a 10^{-5} y los perros del grupo 3 fueron infectados con el cultivo de infección diluido a 10^{-6}. La dilución del cultivo de infección se hizo en el diluyente CVS. La mitad de 1 ml de cultivo de infección se inyectó intramuscularmente (IM) en cada músculo masetero de cada perro. Se observó diariamente la mortalidad y/o los signos clínicos asociados a la rabia en cada perro.
Infección: Basándose en los resultados de la infección preliminar, el cultivo de infección se diluyó a 10^{-4,3} en una disolución de CVS. Dos viales previamente diluidos a 10^{-2} y congelados a -70ºC, fueron descongelados y unidos. Un mililitro y medio (1,5 ml) de este conjunto se añadieron a 28,5 ml de diluyente CVS para obtener una dilución de 10^{-3,3}. Se hizo una segunda dilución de la de 10^{-3,3} transfiriendo 15 ml en 135 ml de CVS, para obtener una dilución final del cultivo de infección de 10^{-4,3}.
La dilución final del cultivo de infección se dispensó en 15 viales de 10 ml, inmediatamente situados en dos cajas con hielo y se transportaron donde los perros estaban albergados. El cultivo de infección diluido se mantuvo en hielo durante la administración del virus. Todos los perros (vacunados y controles) fueron infectados mediante inoculación intramuscular de 0,5 ml del cultivo de infección inyectándolo en cada músculo masetero.
Resultados
El título de la fracción del recombinante de la rabia era de 10^{5,6} DICT_{50}/dosis.
Ninguno de los cachorros mostró ninguna reacción local o generalizada tras la vacunación.
No se observaron interferencias para ninguna fracción (ver Ejemplo 15, más abajo).
La vacuna protegió 28 de 30 (93,3%) de los perros vacunados contra un virus que mató 26 de 30 (86,7%) de los perros control.
Más específicamente,
Tras la Infección: Los perros se observaron cada día durante los 90 días tras la infección y se registraron los resultados. Se registraron diariamente observaciones como signos nerviosos, parálisis y muerte. Se extrajeron tejidos cerebrales del cerebelo, el puente troncoencefálico y el hipocampo de cada perro que murió tras el tras la infección. Los tejidos se mantuvieron congelados hasta el final del periodo de observación. Al final del periodo de observación, todos los perros que sobrevivieron fueron sacrificados.
Se prepararon frotis cerebrales de cada animal que murió por infección de la rabia, se fijaron con acetona y se tiñeron con globulinas anti-rabia marcadas con fluoresceína. Una FA (fluorescencia del anticuerpo) positiva se consideró como confirmación de infección por el virus de la rabia.
Las muestras de sangre se recolectaron aproximadamente a los días 0, 30, 60, 90, 180, 270, 365 y 395 tras la primera vacunación y se analizaron mediante la prueba rápida de inhibición de foco fluorescente (RFFIT). Esto se llevó a cabo de acuerdo con el código de regulación federal 9 CFR 113.209.
También por seguridad, los perros se observaron diariamente para detectar cualquier reacción clínica local o sistémica adversa relacionada con la administración de la vacuna.
Concentraciones de la Vacuna: Se tituló cada fracción del componente liofilizado de las muestras de la vacuna que se retuvo tras la vacunación, y dieron las siguientes concentraciones (Tabla 38):
TABLA 38
75 
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Infección Preliminar: Los resultados de la infección preliminar se muestran en la Tabla 39 más abajo:
TABLA 39
76
77 
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Titulación del Cultivo de Infección: Los resultados de la titulación inversa en ratones del cultivo de infección, tanto para antes de la infección y la infección final, se recogen en la Tabla 40. El título real del virus era 10^{7,2} DLM_{50}/ml.
Infección de los Perros: Los resultados de la infección final se recogen en la Tabla 41 (Vacunados) y en la Tabla 42 (Controles). Cada perro recibió una dosis de infección de 10^{7,15} DLM_{50}/ml, basada en las titulaciones replicadas.
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Mortalidad
Controles: Veintiséis (26) de los 30 perros control murieron entre los 11 y 23 días tras la infección. Esto representa un porcentaje de muerte de 86,7%.
Vacunados: Veintiocho de los 30 perros vacunados sobrevivieron a la infección. Esto es un porcentaje de protección de 93,3%.
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Pruebas de FA de frotis Cerebral (Tablas 41 y 42)
Vacunados: La FA directa en los portas con el frotis cerebral de los dos perros que murieron mostró que ambos eran positivos para el virus de la rabia.
Controles: La FA directa en los portas con el frotis cerebral mostró que la muerte de 26 perros control estaba causada por el virus de la rabia.
Serología: Los títulos de RFFIT de las muestras de suero recolectadas los días 0, 30, 60, 90, 180, 270, y 390 tras la primera vacunación se muestran en las Tablas 43 y 44. Los títulos muestran que los perros eran seronegativos para la rabia cuando el estudio comenzó y que los controles permanecieron negativos a lo largo del día de infección. Las pruebas se realizaron de acuerdo con el código de regulación federal 9 CFR 113.209.
La seroconversión con respecto a la edad a la que los cachorros fueron vacunados se analizó y se calculó el valor medio para el Día 30 tras la segunda vacunación (Tabla 45). La tabla mostró que la respuesta al título de anticuerpo tras la vacunación aumentaba independientemente de la edad de vacunación.
Seguridad: Ninguno de los cachorros vacunados mostraron ninguna reacción adversa local o sistémica tras ninguna de las dos vacunaciones.
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Conclusión
Dos dosis administradas subcutáneamente de una vacuna DACPiP-CP65+LCI que contiene 10^{5,6} DICT_{50}/dosis de la rabia vCP65:
Son seguras en perros de 9 a 12 semanas de edad.
Inducen una seroconversión baja y temporal.
Protegen a los perros muy eficientemente de la infección de la rabia severa durante al menos un año.
Más específicamnete, los perros vacunados a la edad de 9 a 12 semanas están protegidos mediante la vacuna de la rabia recombinate (vCP65) en combinación con otras vacunas caninas (DACPiP) y rehidratada con Bacterias Leptospira. La mortalidad debida al cultivo de infección no depende de la edad del perro a la que es vacunado por primera vez.
Los perros se serocovertían significativamente incluso cuando eran vacunados a las 9-12 semanas de edad, tiempo en el que el anticuerpo maternal estaba presente. Sin embargo, en el momento de la infección, los perros vacunados no tenían virtualmente anticuerpo detectable, y fueron protegidos.
El cultivo de infección diluido en el tampón adecuado y conservado a -70ºC puede ser empleado en perros infectados. La titulación antes de la infección es necesaria antes de llevar a cabo un estudio de inmunogenicidad riguroso. La dosis de infección administrada era 50 veces superior a la dosis que causó el 100% de mortalidad en los experimentos llevados a cabo por el NVSL.
La vacuna del recombinante de la rabia vCP65 con un título de 10^{5,6} DICT_{50}/ml en combinación con DACPiP, con o sin LCI, confiere protección durante un periodo de al menos un año.
Las fracciones de esta vacuna de combinación no interfieren con la inmunogenicidad de la fracción del recombinante de la rabia: La vacuna del recombinante de la rabia protegió el 93,3% de los vacunados frente a un virus severo y virulento que mató al 86,7% de los controles. La vacuna de combinación del recombinante de la rabia canina es segura cuando se administra a cachorros a través de la ruta subcutánea.
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TABLA 40 Titulación en Ratón del Virus de infección de la Rabia, Lote 92-5, Diluido 10^{-4,3} para la Infección de Perro
78
TABLA 41 Resultados en Vacunados del Estudio de un año de Duración de Infección para la Inmunidad frente a la Rabia
80
TABLA 42 Resultados en Controles del Estudio de un año de Duración de Infección para la Inmunidad a la Rabia
82
TABLA 43 Titulación de La Rabia del Grupo Vacunado (Log_{10}) mediante RFFIT
84
TABLA 44 Titulación de La rabia del Grupo Control (Log_{10}) mediante RFFIT
86
TABLA 45 Titulación de los Anticuerpos de La rabia (Log_{10}) mediante RFFIT
88 
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Ejemplo 15 Estudio de interferencia en perros de una vacuna que utiliza una fracción recombinante del virus de la rabia (vCP65) en combinación con fracciones convencionales: moquillo canino, adenovirus de tipo 2, coronavirus, parainfluenza, parvovirus, vacuna de la rabia, virus vivos modificados, vector del virus vivo de la viruela del canario, bacterina de leptospira
Este ejemplo demuestra la ausencia de interferencias en perros de la fracción del VIRUS recombinante de la rabia vCP65 incorporada en combinación con otras fracciones liofilizadas de CDV, CAV-2, CCV, CPi, CPV, y diluida en bacterina de Leptospira (LCI) para la inmunización de perros.
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Procedimiento
Treinta (30) perros seronegativos para la rabia se vacunaron dos veces subcutáneamente con una dosis de 1 ml de una vacuna de combinación liofilizada (DACPiP-CP65+LCI) que contiene DACPiP y una fracción del recombinante de la rabia (vCP65), diluida en una bacterina de combinación bivalente de leptospira (LCI). Treinta (30) perros seronegativos para la rabia fueron vacunados con la misma vacuna de combinación sin la fracción del recombinante de la rabia (DACPiP+LCI) y sirvieron como controles de la rabia para el estudio de eficacia en el Ejemplo 14.
Se recogieron muestras de suero los días 0, 30 y 60 tras la vacunación de los perros de cada grupo, y fueron probadas mediante métodos de seroneutralización del virus, y se empleó RFFIT para realizar los ensayos de anticuerpos de la rabia. Los resultados de las pruebas de seroneutralización de cada virus fueron comparadas usando el título medio \pm la desviación estándar entre los vacunados y los controles. Más específicamente: El antígeno de vacuna recombinante de la rabia se preparó con el quinto pasaje (vCP65X +5) de el virus de la semilla principal, como en el Ejemplo 14. Este antígeno puede usarse como una vacuna monovalente. Éste puede también, como se describe en este Ejemplo y en el Ejemplo 14, liofilizarse en combinación con otros cinco antígenos caninos modificados.
Las abreviaturas en este Ejemplo son las misma que las del Ejemplo 14.
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Material
Vacunas: DACPiP-CP65 Y DACPiP se prepararon, distribuyeron y liofilizaron como en el Ejemplo 14. El título de cada componente de la vacuna rehidratado en agua estéril tras la liofilización era como en el Ejemplo 14.
La fracción líquida de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae es una vacuna producida normalmente que se distribuyó a la venta por el USDA-NVSL el 22 de Septiembre de 1992.
Animales, Alojamiento y Administración de la Vacuna: Sesenta (60) perros de 9 a 12 semanas de edad en la primera vacunación, divididos en dos grupos de 30 cada uno, recibieron las siguientes vacunas en intervalos de 4 semanas:
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TABLA 46
89 
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Se recogió suero de cada perro el Día 0 (día de la vacunación), y los Días 28 y 60 tras la primera vacunación. El suero de cada perro se tituló por neutralización de anticuerpos (SN, del inglés: seroneutralization) para CDV, CAV-2, CPi, CPV, y mediante RFFIT para el virus de la rabia. Se confirma la falta de interferencias con cada componente cuando se observa una seroconversión de magnitudes comparables entre los sueros de tanto vacunados como controles.
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Resultados
La Tabla 47 de abajo resume la titulación SN para cada fracción viral en la vacuna:
TABLA 47
90
Anticuerpos que Neutralizan el Virus Moquillo Canino: Los resultados individuales se muestran en la Tabla 48, más abajo. Aunque la mayoría de los perros eran seropositivos el Día 0 (prevacunación), la vacunación con la vacuna de combinación aumentó la seroconversión a la actividad SN específica para CDV en ambos grupos con diferencias no estadísticas.
Anticuerpos que Neutralizan el Adenovirus Canino Tipo 2: Los resultados individuales se muestran en la Tabla 49, más abajo. Los datos indican no sólo una excelente seroconversión en ambos grupos sin diferencias estadísticas, sino también una notable disminución en la desviación estándar en el título individual entre animales.
Anticuerpos que Neutralizan el Virus de la Parainfluenza Canina: Los resultados individuales se muestran en la Tabla 50, más abajo. Los datos indicaron la seroconversión en ambos grupos sin diferencias estadísticas.
Anticuerpos que Neutralizan el Parvovirus Canino: Los resultados individuales se muestran en la Tabla 51, más abajo. Los datos indicaron excelente seroconversión en el Día 30 y Día 60 tras la primera vacunación con una desviación estándar de la misma magnitud en ambos grupos.
Anticuerpos que Neutralizan el Coronavirus Canino: Los resultados Individuales se muestran en la Tabla 52, más abajo. Los datos indicaron una clara seroconversión inducida por la vacuna de combinación DACPiP-CP65+LCl, tras sólo una inyección, con un título muy homogéneo, y sin diferencias con el grupo de control.
Vector Recombinante del Virus de la Viruela del Canario y de la Rabia (vCP65): Anticuerpos del Suero que lo Neutralizan:(Ver Tabla 53, más abajo). Se detectaron los anticuerpos que neutralizan el virus de la rabia mediante la prueba rápida de inhibición de foco fluorescente (RFFIT). Hay un claro aumento en el título medio de anticuerpo (log_{10}) desde 0,88 \pm 0,24 a 1,38 \pm 0,33 en el Día 60 tras la vacunación. De los 20 perros que tenían concentraciones < 1,0 (log_{10}) en el Día 0, 17 se habían seroconvertido para tener concentraciones > 1,0-2,0 (log_{10}) en el Día 30 tras la vacunación.
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Conclusión
Las fracciones recombinantes de la rabia (vCP65) no provocan ninguna interferencia en la respuesta inmune de las otras fracciones liofilizadas. A pesar de la presencia de anticuerpos en el día de la primera vacunación, se observó una clara seroconversión por vacunación con todos los componentes, con magnitudes equivalentes en ambos grupos.
La inoculación con la combinación DACPiP-CP65 induce una seroconversión significativa incluso en presencia de anticuerpos previos a la vacunación. Un aumento medio en el título de 0,5 (log_{10}) resultó ser suficiente para inducir protección contra el virus virulento del virus de la rabia callejera (Ver Ejemplo 14).
Experiencias anteriores han mostrado que la vacunación con vacunas convencionales de la rabia no siempre inducen grandes cantidades de anticuerpos circulantes detectables. El mismo fenómeno se observó con las vacunas de combinación del recombinante de la rabia; pero, aunque la seroconversión era de baja magnitud, el título de anticuerpo se había duplicado al menos en dos tercios de los vacunados en el día 30 tras la segunda vacunación. En este experimento, el 93% de los vacunados quedaron protegidos contra el virus de la rabia. De los animales supervivientes al virus de la rabia virulenta, algunos perros se habían seroconvertido, mientras que otros no lo habían hecho. Además, al momento de la infección, virtualmente todos los perros vacunados no tenían actividad SN específica para la rabia.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 48 Seroneutralización CDV
92
TABLA 49 Seroneutralización CAV2
93
94 
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TABLA 50 Seroneutralización CPi
95
950 
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TABLA 51 Seroneutralización CPV
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97 
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TABLA 52 Seroneutralización CCV
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TABLA 53 Seroneutralización de virus de la rabia RFFIT
101
Ejemplo 16 Prueba de la actividad viricida in vitro de la bacterina de leptospira canicola-icterohaemorrhagiae como diluyente para una vacuna liofilizada que contiene la fracción del recombinante de la rabia (vCP65) En combinación con fracciones caninas convencionales: vacuna del moquillo -adenovirus tipo 2-coronavirus-parainfluenza-parvovirus caninos - de la rabia, virus vivo modificado, vector virus de la viruela del canario-bacterina de leptospira
La vacuna, DACPiP-CP65, se rehidrató con LCI y agua. Cada componente de la fracción se tituló para determinar el efecto viricida de LCI comparando las concentraciones del mismo componente cuando se diluye en LCI o agua. El antígeno de vacuna del recombinante de la rabia se preparó con el quinto pasaje (vCP65 X+5) de la semilla madre como en el Ejemplo 14. El antígeno de la rabia se liofilizó en combinación con otros cinco antígenos caninos vivos modificados y se usó para los estudios de eficacia e interferencia en perros como se describe en los Ejemplos 14 y 15. La bacterina bivalente de Leptospira canicola y Leptospira icterohaemorrhagiae se utilizó para rehidratar la vacuna. Las abreviaturas en los Ejemplos 14 y 15 se utilizan también aquí.
La Tabla 54 más abajo resume las concentraciones obtenidas para cada fracción cuando se diluyen en LCI o agua estéril.
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TABLA 54
103 
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La formulación más abajo se utilizó para obtener las vacunas de combinación que se prepararon como en el Ejemplo 14.
La fracción líquida de L. canicola y L. icterohaemorrhagiae era una producción normal en serie (Número 32010), con fecha de caducidad 17 Julio 1995. Este número de serie fue distribuido por el NVSL el 22 Septiembre 1992.
Líneas Celulares: La línea celular de riñón perro Madin Darby (MDCK, del inglés: Madin Darby Canine Kidney) se utilizó para la titulación de CAV-2, CPi y CPV. La células de firoblastos de embrión de pollo (FEB) se utilizó para la titulación del virus del recombinante de la rabia. El medio de crecimiento era F15 con suero fetal bovino.
La actividad viricida de la bacterina LCI líquida utilizada para rehidratar CACPiP-CP65 se llevó a cabo de acuerdo con el código de regulación federal 9 CFR 113.35.
La vacuna liofilizada DACPiP-CP65 se rehidrató con agua estéril y se probó en paralelo con el componente de más arriba de acuerdo con el código de regulación federal CFR 113.35. Los métodos de titulación fueron los estándares. El título del virus (Log_{10} DICT_{50} para CDV, CAV-2, CCV, CPi, CPV y CP65) se calculó de acuerdo con el método de Spearman-Karber.
Los resultados de la titulación del virus se resumen en la Tabla 55, más abajo. La rehidratación de DACPiP-CP65 con el líquido LCI no redujo las concentraciones de CDV, CAV-2, CPi, CPV, CCV y CP65 cuando se compararon con la rehidratación con agua estéril.
TABLA 55
105
Ejemplo 17 Vacuna de parvovirus de la rabia canina recombinante, virus vivo modificado: seguridad y eficacia tras dos inoculaciones subcutáneas de perros con la vacuna vCP136
Este Ejemplo demuestra la seguridad, antigenicidad, y eficacia de una vacuna de parvovirus canino vCP136 del recombinante de la rabia en perros (los genes de la glicoproteína de la rabia y el parvovirus canino VP2 (CPV) insertados en el mismo vector del virus de la viruela del canario). El vCP136 recombinante basado en el virus de la viruela del canario contiene los genes de la glicoproteína de la rabia y el parvovirus canino VP2 (VP136 y su construcción se describen en la USSN 08/105.483, que se incorpora aquí mediante referencia); y este Ejemplo demuestra la reacción de los perros que recibieron la vacunación subcutánea con dos dosis de la vacuna vCP136, con 22 días de intervalo, con la respuesta de los anticuerpos humorales de los perros inoculados dos veces con vCP136 recombinante a 10^{7} UFC/dosis, y la respuesta inmune protectora de los perros vacunados siguiendo la infección con el CPV virulento via oronasal.
Resultados
Ninguno de los perros vacunados mostró ninguna reacción local o sistémica adversa tras la vacunación. Los perros vacunados desarrollaron un título del anticuerpo que neutraliza (VNA, del inglés: Virus Neutralizing Antibody) al parvovirus que se encontraba en el intervalo de 1:380 a 1:1.530 con una media geométrica de título de anticuerpo (MGT) de 1:740.
Tras la infección oronasal con el CPV virulento obtenido del NVSL, cinco o seis perros no vacunados desarrollaron signos clínicos de infección por CPV (anorexia y diarrea). Ninguno de los perros vacunados mostraron ningún signo de infección por CPV.
El CVP se aisló de los seis perros control a una media de 3,0 días de aislamiento por perro. El CVP se aisló de dos de los cuatro perros vacunados a una media de 0,5 días de aislamiento por perro.
Las muestras de temperatura rectal permanecieron normales en los perros vacunados y en los no vacunados.
Se observó una diferencia estadísticamente significativa en leucopenia en el Día 6 tras la infección entre los vacunados y los controles.
Los títulos del anticuerpo de la rabia (RFFIT) eran muy altas en todos los perros vacunados, incluso después de una única inyección con vCP136.
Más específicamente: Estado de Salud de los Perros Beagle: El suero de todos los perros dio negativo para VNA a CPV en el Día -4 (día de llegada) y de nuevo en el Día cero (0) (día de la primera vacunación).
Seguridad de la Vacuna: Los cuatro perros vacunados dos veces subcutáneamente en la región dorsal superior del cuello (en el Día 0 y Día 22) con vCP136 no mostraron reacciones locales o sistémicas adversas.
Estado Serológico para CPV (Tabla 56): Los niveles de actividad de el anticuerpo que neutraliza a CPV en suero, obtenidos de los perros, en dos inoculaciones subcutáneas de la vacuna vCP136 y la subsecuente infección con el CPV virulento, se muestran en la Tabla 56. Los diez perros no tenían concentraciones detectables de VNA, en una dilución final del suero 1:2 en el Día 0. Seis perros no vacunados permanecieron susceptibles a CPA en el Día 37. Veintidós días tras la primera vacunación con vCP136, los perros 2002, 2021 y 2025 tenían niveles detectables de VNA desde 1:8 a 1:12. El perro 2007 no tenía VNA detectable a una dilución del suero final de 1:4.
Quince días tras la vacunación de refuerzo con vCP136, se registró un marcado aumento en el título de VNA. Los niveles de VNA variaban desde 1:380 a 1:1.530 (2,6 a 3,2 log_{10}) y una MGT de 1:740 (2,8 log_{10}). Treinta días tras la infección, los perros control no vacunados tenían el título de VNA entre 1:1.530 y 1:16.380 (MGT=1:5.260). Por otro lado, los perros vacunados tenían un título de VNA variable entre 1:1.530 y 1:3.070 (MGT=1:2.090).
Estado Serológico del Componente de la Rabia (Tabla 57): Los cuatro perros vacunados se seroconvirtieron con títulos de anticuerpo excelentes tras la primera inyección subcutánea. Se registró un aumento altamente significativo en el título de anticuerpo tras la segunda inyección. Ninguno de los perros control se seroconvirtió.
Ensayo de Inmunidad: El Recuento de los Glóbulos Blancos (Tabla 58): Cuatro de los seis perros no vacunados mostraron leucopenia al comienzo del Día 6 tras la infección. El conteo de los glóbulos blancos volvió a un intervalo de valores normal en poco tiempo. Dos de los cuatro perros vacunados mostraron una tendencia a la baja en el conteo de los glóbulos blancos hasta el Día 8 tras la infección. El perro 2002 tuvo leucopenia el Día 5 y el perro 2021 en el Día 7 tras la infección.
Temperatura Rectal (Tabla 59): No se notó ninguna diferencia aparente en los valores de temperatura rectal diaria entre los perros vacunados y no vacunados; no se detectaron anormalidades.
Signos Clínicos (Tabla 61): Cinco de los seis perros no vacunados desarrollaron evidencias visibles de la infección por virus. Se observaron grados variables de anorexia y la ocurrencia de diarrea mucosa o con sangre. Ninguno de los cuatro perros vacunados mostraron evidencias clínicas de infección por CVP.
Aislamiento del Virus (Tabla 61): El virus se aisló de los seis perros control. En algunos de estos perros, el virus se detectó como pronto el Día 1 tras la infección y como tarde el Día 8 tras la infección. En algunos casos, el virus se detectó sólo tras un segundo pasaje en células CRFK. Los virus fueron aislados de dos de los cuatro vacunados, sólo durante un día para cada perro, y sólo tras el segundo subpasaje en cultivo celular de CRFK.
La prueba es válida porque los seis perros control permanecieron susceptibles a CPV en el día de la infección. No se registró ninguna diferencia en la temperatura rectal diaria entre los perros vacunados y los no vacunados. El análisis estadístico del conteo de los glóbulos blancos reveló una diferencia significativa entre los perros control y los vacunados sólo en el día 6 tras la infección. Sólo se observaron evidencias clínicas de infección por CPV (anorexia y diarrea) entre los perros no vacunados. El virus de infección se replicó durante un total de 18 días de aislamiento a una media de 3 días de aislamiento por perro no vacunado en comparación con un total de 2 días de aislamiento a una media de 0,5 días de aislamiento por perro vacunado. Además, entre los perros vacunados el virus sólo podía detectarse tras el segundo subcultivo en cultivo celular, sugiriendo que una baja cantidad de virus es excretado en los especímenes fecales.
Los perros no fueron infectados con el virus de la rabia virulento. Sin embargo, el nivel de actividad SN de la rabia mostrado tras dos inyecciones era consistente con los niveles asociados a la protección frente a la exposición al virus de infección. Los datos presentados aquí muestran una respuesta de protección notable de los perros vacunados a el virus de infección CPV cuando se comparan con los perros no vacunados.
Conclusiones
Dos inoculaciones subcutáneas a perros susceptibles con una vacuna de parvovirus canino del recombinante de la rabia basado en el virus de la viruela de canario (composición vCP136) con 10^{7} UFC por dosis, resultaron en: Producción de niveles satisfactorios de anticuerpos que neutralizan al CPV; y diferencia significativa en las manifestaciones clínicas y subclínicas de la infección con CPV entre los perros vacunados y los no vacunados. Por consiguiente, vCP136, o una composición que contenga un codificante recombinante para la rabia y otro antígeno, es útil y no muestra interferencia con la eficacia.
TABLA 56 Nivel de anticuerpos que neutralizan al CPV y al virus de la rabia en suero obtenido de perros vacunados y no vacunados con vCP136
106 
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TABLA 57 Título de Anticuerpo contra la rabia de Perros Vacunados Subcutáneamente Dos Veces con vCP136
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111
112 
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Ejemplo 18 Respuesta serológica a la vacuna de la rabia y al vector del virus vivo de la viruela del canario y seguridad, en gatos infectados y no infectados por el virus de la leucemia felina
Este Ejemplo demuestra la seguridad y la respuesta de los anticuerpos de la rabia a un virus recombinante de la rabia y viruela del canario (vCP65) en gatos infectados con el virus de la leucemia felina (gatos FeLv+) y no infectados (gatos FeLv-). Entre estos grupos, 30 gatos estuvieron expuestos previamente al virus recombinante de leucemia felina y viruela de canario. Los 28 gatos restantes no habían sido tratados con el vector del virus de la viruela del canario (Ver Tabla 65). Dos dosis de vCP65 se administraron subcutáneamente (Día 0 y Día 20-22). Las respuestas de los anticuerpos contra la rabia se determinaron mediante la prueba rápida de inhibición de foco fluorescente (RFFIT). Más específicamente: (vCP97 se describe en USSN 08/105.483; vCP212 se generó utilizando vCP177 (USSN 08/105.483, Ejemplo 50) como el virus de rescate y pC3DOFGAGVQ (USSN 08/105.483, ejemplo 53) como el ADN donante (USSN 08/105.483 incorporada aquí como referencia)).
Animales: Grupo 1 (FeLV-)
Se utilizaron diez gatos negativos para anticuerpos de la rabia previamente vacunados con dos dosis de un virus recombinante de viruela del canario y leucemia felina (vCP97) e infectados con el virus de la leucemia felina (FeLV). Habían recibido (vCP97) el Día 0 y Día 21. Fueron infectados dos semanas después siguiendo una dosis inmunosupresora de corticosteroides. Se les sacó sangre bisemanalmente tras la infección y se evaluó su suero para la presencia del antígeno FELV p27 mediante ELISA. Sólo un gato (Nº1953) era transitoriamente antigenémico tras la infección. Nueve semanas tras la infección todos los gatos eran negativos para la antigenemia de FeLV antes de la vacunación con el virus de la viruela de canario y la rabia (vCP65).
Grupo 1 (Ver Tabla 64): Los gatos (n=10) se dividieron en dos grupos de dosis. Un grupo (N=5) recibió dos dosis de 10^{6.0} DICT_{50}/dosis y el otro grupo (n=5) recibió 10^{7.0}DICT_{50}/dosis. Se vacunaron ambos grupos y se reforzaron aproximadamente tres semanas después. Se recogieron muestras de sangre de acuerdo con la siguiente tabla (Tabla 62):
TABLA 62
113
Grupo 2 (FeLV+)
Se utilizaron dieciocho gatos negativos para anticuerpos de la rabia. Los gatos no estaban vacunados con un virus recombinante antes de la infección. Estos fueron infectados con el FeLV siguiendo una inmunosupresión. Once semanas tras la infección había 7 gatos FeLV negativos (FeLVe) y 11 gatos FeLV positivos (FeLV+) antes de la vacunación con el virus de viruela del canario y la rabia (vCP65).
Grupo 2 (Ver Tabla 65): Los gatos (n=18) se dividieron en dos grupos de dosis y recibieron dos dosis de vCP65 a 10^{5.0} o 10^{6.0} DICT_{50}/dosis. Estos se vacunaron una vez y entonces se reforzaron veintidós días después. Se recogieron muestras de sangre de acuerdo con la siguiente tabla (Tabla 63):
TABLA 63
114
Grupo 3: (FeLV-)
Se utilizaron treinta gatos negativos para anticuerpos de la rabia. Los gatos recibieron una dosis de (vCP97) sola o en combinación con otro recombinante de virus de la viruela del canario y FeVL (vCP212), y una segunda dosis tres semanas después, y fueron infectados dos semanas después de la segunda dosis siguiendo una dosis inmunosupresora de corticosteroides. Fueron sangrados bisemanalmente tras la infección y su suero se evaluó para la presencia del antígeno FeLV p27 mediante ELISA. Solamente un gato (K2) era antigenémico a FeLVe tras la infección. Nueve semanas tras la infección veintinueve gatos eran FeLVe y un gato permaneció FeLV+ antes de la vacunación con los recombinantes del virus de la viruela del canario y la rabia (vCP65) y el herpes felino (FHV) (vCP243 y vP1164).
Generación de un Recombinante Basado en ALVAC que Expresa las Glicoproteínas gB, gC, y gD de FHV-1 (vCP243). Los genes que codifican los homólogos de gB, gC y gD de FHV-1, bajo el control de los promotores de la I2L, H6 y 42K, respectivamente, se insertaron en un único vector ALVAC en el sitio C6 para generar vCP243. El plásmido donante requerido para esta inserción, pJCA109, se generó como sigue.
Construcción del plásmido donante pJCA109. Un promotor I3L/casete de expresión del gen FHV-1 gB se obtuvo como dos fragmentos del plásmido pJCA109: un fragmento de 840 pb SmaI/BamHI que contenía al promotor I3L unido a la fracción 5' del gen gB (fragmento A) y un fragmento de 2155 pb BamI/HindIII que contenía la porción restante 3' del gen gB (fragmento B).
Un fragmento de 1650 pb NruI/EcoRI que contenía el extremo 3' del promotor H6 unido al gen FHV-1 gC se obtuvo del plásmido pJCA109 y se ligó con un fragmento del vectorp BS-SK+H6 digerido con NruI/EcoRI (Este vector contenía al promotor H6 clonado en la región del polinker pBS-SK).El plásmido resultante se designó como pJCA108. El casete de expresión H6/gC se aisló del pJCA108 como un fragmento de 1830 pb HindIII/EcoRI (fragmento C).
Un promotor 42K/casete de expresión del gen FHV-1 gD se obtuvo del plásmido pJCA080 como un fragmento EcoRI/XhoI (fragmento D).
Los fragmentos A, B, C y D fueron ligados subsecuentemente con un fragmento del vector pCL6 digerido con SmaI/XhoI para generar el plásmido pJCA109. El plásmido donante del sitio C6 de pJCA109 ALVAC contiene los casetes de expresión promotor I3L/gen gB, el promotor H6/gen gC y el promotor 42K/gen gD orientadas de izquierda a derecha, respectivamente, entre los brazos extremos de ALVAC C6.
La derivación de plásmidos intermedios usados en la generación de pJCA109 es como sigue.
pJCA079: El plásmido pJCA001 (USSN 07/502.834, Ejemplo 15) se digirió con BamHI y EcoRI para obtener un fragmento de 900 pb que contenía la porción central de gB (fragmento A). El plásmido pJCA076 se digirió con XbaHI y BamHI para obtener un fragmento de 840 pb que contenía el promotor I3L unido a la porción 5' mutada de gB (fragmento B). el plásmido pJCA077 se digirió con EcoRI y XhoI para obtener un fragmento de 1255 pb que contenía la porción 3' de gB (fragmento C). Los fragmentos A, B y C se ligaron juntos en el vector pBS-SK+ digerido con XbaI-XhoI para producir pJCA079.
pJCA076: Los cebadores JCA158 (SEC ID Nº 37) (5' TTTTTCTAGACTGCAGCCCGGGACATCATGC AGTGG
TTAAAC 3') y JCA211 (SEC ID Nº: 56) (5' GTGGACACATATAGAAAGTCG 3') se usaron para sintetizar mediante PCR un fragmento de 510 pb XbaI romo (fragmento A) que contenía una señal mutada TTTTTNT usando el plásmido pJCA075 como molde. Los cebadores JCA212 (SEC ID Nº: 38) (5' CACCTT CAGGATCTACTGTCG 3') y JCA213 (SEC ID Nº: 39) (5' GGGTTTCAGAGGCAGTTC 3') se utilizaron para sintetizar mediante PCR un fragmento de 330 pb romo BamHI (fragmento B) utilizando el plásmido pJCA001 como molde. El fragmento A se digirió con XbaI y se fosforiló. El fragmento B se digirión con BamHI y se fosforiló. Los fragmentos A y B fueron entonces ligados juntos en el vector pBS-SK+ digerido con XbaI-BamHI para producir pJCA076.
pJCA075: los cebadores MP287 (SEC ID Nº: 40) (5'GATTAAACCTAAATAATTGT 3') y JCA158 (SEC ID Nº: 41) (5'TTTTTCTAGACTGCAGCCCGGGACATCATGCAGTGGTTAAAC 3') se usaron para sintetizar mediante PCR un fragmento del promotor I3L de 120 pb XbaI romo (fragmento A) usando un plásmido pMP691 como molde (pMP691 contiene el promotor I3L unido a un gen irrelevante -el gen de la glicoproteína de la rabia- en el plásmido pCOPCS). Los cebadores JCA213 (SEC ID Nº 42) (5'GGGTTTCAGAGG CAGTTC 3') y JCA238 (SEC ID Nº: 43) (5'ATGTCCACTCGTGGCGATCTT 3') se usaron para sintetizar mediante PCR un fragmento de 720 pb que se extiende desde el extremo FHV gB 5' ATG (fragmento B) utilizando el plásmido pJCA001 como molde. El fragmento A se digirió con XbaI y se fosforiló. El fragmento B se digirió con BamhI y se fosforiló. Los fragmentos A y B fueron entonces ligados juntos en el vector pBS-SK+ digerido con XbaI-BamHI para producir el plásmido pJCA075.
pJCA077: Los cebadores JCA239 (SEC ID Nº: 44) (5'ACGCATGATGACAAGATTATTATC 3') y JCA249 (SEC ID Nº: 45) (5'CTGTGGAATTCGCAATGC 3') se utilizaron para sintetizar mediante PCR un fragmento de 695 pb de FHV gB (fragmento A) usando el plásmido pJCA001 como molde. Los cebadores JCA221 (SEC ID Nº: 46) (5'AAAACTGCAGCCCGGGAAGCTTACAAAAATTAGACAAGATTTGTTTC AGTATC 3') y JCA247 (SEC ID Nº: 47) (5'GGTATGGCAAATTTCTTTCAGGGACTCGGGGATGTG 3') se utilizaron para sintetizar mediante PCR un fragmento (fragmento B) de 560 pb romo-PstI del extremo 3' de FHV gB usando el plásmido pJCA001 como molde. El fragmento A se digirió con EcoRI y se fosforiló. El fragmento B se digirió con PstI y se fosforiló. Los fragmentos A y B se ligaron entonces juntos en el vector pIBI24 digerido con EcoRI-PstI para producir el plásmido pJCA077.
pJCA100: Los cebadores JCA274 (SEC ID Nº: 48) (5' CATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGA GACGATATAGGATGGGAC3') y JCA275(SEC ID Nº:49) (5'ACTATTTTCAATACTGAC3') se utilizaron para sintetizar mediante PCR un fragmento de 107 pb NruI-SalI que contiene el extremo 3' del promotor H6 unido a la porción 5' de gC (fragmento A) utilizando el plásmido pFHVEcoRIF como molde. Los cebadores JCA276 (SEC ID Nº: 50) (5' AAATGTGTACCACGGGAC 3') y JCA 277 (SEC ID Nº: 51) (5' AAGAA GCTTCTGCAGAATTCGTTAACAAAAATCATTATAATCGCCGGGGATGAG 3) se utilizaron para sintetizar mediante PCR un fragmento de 370 pb EcoRV-HindIII que contenía la porción 3' de gC (fragmento B) utilizando el plásmido pJCA095 como molde. El fragmento A se digirió con NruI y SalI. el fragmento B se digirió con EcoRV y HindIII. se obtuvo un fragmento de 100 pb HindIII-NruI conteniendo el extremo 5' del promotor H6 (fragmento C). el plásmido pJCA095 se digirió con BamHI y EcoRV para obtener un fragmento de 580 pb que contenía la porción central de gC (fragmento D). Los fragmentos A y C se ligaron juntos en el vector pBS-SK+ digerido con HindIII-SalI para producir el plásmido pJCA097. Los fragmentos B y D se ligaron juntos en el vector pBS-SK+ digerido con BamHI-HindIII para producir pJCA099. El plásmido pJCA097 se digirió con PstI y SalI para obtener un fragmento de 200 pb que contenían el promotor H6 unido a la porción 5' de gC (fragmento E). El plásmido pFHVEcoRIF se digirió con BamHI y SalI para obtener un fragmento de 600 pb de gC (fragmento F). Los fragmentos E y F se ligaron juntos en el vector pBS-SK+ digerido con RamHI-PstI para producir pJCA098. el plásmido pJCA098 se digirió con EcoRI y BamHI para obtener un fragmento de 820 pb que contenía el promotor H6 unido a la porción 5' de gC (fragmento G). El plásmido pJCA099 se digirió con BamHI y HindIII para obtener el fragmento de 960 pb que contenía la porción 3' de gC (fragmento H). Los fragmentos G y H se ligaron entonces juntos con el vector PBS-SK+ digerido con EcoRI-HindIII para producir pJCA100, que contiene el casete de expresión del gen H6/gC (532 aa) en pBS-SK+.
pFHVEcoRIF: El fragmento de 7500 pb EcoRI "F" de la cepa CO de FHV-1 se clonó en el pBSSK+ digerido con EcoRI para generar el plásmido pFHVEcoRIF. El gen gC FHV-1 se identificó entre este fragmento mediante comparación de la secuencia de nucleótidos con el gen gC HSV-1.
pJCA080: El plásmido pJCA073 (USSN 08/105.483, Ejemplo 57) se digirió con BamHI y XhoI para obtener el fragmento de 960 pb que contiene la porción 3' de FHV gD (fragmento D). Los cebadores RG286 (SEC ID Nº: 52) (5' TTTATATTGTAATTATA 3') y M13F (SEC ID Nº: 53) (5' GTAAAACGACGGCCAGT 3') se utilizaron para sintetizar mediante PCR un fragmento de 130 pb EcoRI-romo que contenía el promotor 42K (fragmento E) utilizando el plásmido pJCA038 como molde. Los cebadores JCA234 (SEC ID Nº: 54) (5' ATGATGACACGTCTACATTTT 3') y JCA235 (SEC ID Nº: 55) (5' TGTTACATAA CGTACTTCAGC 3') se utilizaron para sintetizar un fragmento de 185 pb Romo-BamHI que contiene la porción 5' de FHV gD (fragmento F). Los fragmentos E y F se digirieron respectivamente con EcoRI y BamHI, y se fosforiló, y se ligaron juntos en el vector pBS-SK+ digerido con BamHI-EcoRI para producir el plásmido pJCA078. el plásmido pJCA078 se digirió con HpaI y BamHI para obtener un fragmento de 310 pb que contenía al promotor 42K unido a la porción 5' del gen gD (fragmento G). Los fragmentos D y G se ligaron juntos en un vector pBS-SK+ digerido con EcoRV y XhoI para producir pJCA080.
Generación y caracterización de vCP243. Los genes FHV-1 gB, gC y gD se insertaron en el genoma de ALVAC en el sitio C6 mediante recombinación in vitro entre el plásmido donante pJCA109 linearizado con NotI y el ADN genómico de ALVAC. Un recombinante que contenía los genes gB, gC y gD se identificó mediante hibridación de calvas, purificación y amplificación de una calva. Este recombinate se designó vCP243.
La expresión de estas glicoproteínas en células CRFK, FEB y/o Vero infectadas por vcp243, se evaluó con el antisuero policlonal monoespecífico de oveja a gB, gC y gD mediante transferencia de Western y/o análisis de inmunprecipitación. Mediante estos ensayos, las siguientes proteínas de FHV-1 fueron expresadas en células infectadas con vCP243: polipéptidos de gB de 100, 60 y 55 kDa; un polipéptido de gC de 110 kDa; un polipéptido de gD de 60 kDa.
Generación de un Recombinante Basado en NYVAC que Expresa las GLICOPROTEÍNAS DE FHV-1 gB, gC, y gD (vP1164). Los genes que codifican los homólogos de FHV-1 homólogos de gB, gC y gD, bajo el control de los promotores I3L, H6 y 42K, respectivamente, se insertaron en un único vector NYVAC vector en el sitio ATI para generar vP1164. el plásmido donante requerido para esta inserción, pJCA107, se generó como sigue.
Construcción del Plásmido donante pJCA107. Un promotor I3L/casete de expresión del gen FHV-1 se obtuvo en dos fragmentos del plásmido pJCA079: un fragmento de 1740 pb SmaI/EcoRI que contenía el promotor I3L unido a la porción 5' del gen gB (fragmento A) y un fragmento de 1255 pb EcoRI/HindIII que contiene la porción 3' restante del gen gB (fragmento B).
Un promotor H6/casete de expresión del gen FHV-1 gC se obtuvo del plásmido pJCA100 como un fragmento de 1755 pb HindIII/PstI (fragmento C).
Un promotor 42K/casete de expresión del gen FHV-1 gD se obtuvo del plásmido pJCA080 como un fragmento PstI/XhoI (fragmento D).
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Los fragmentos A, B, C y D fueron ligados subsecuentemente con un fragmento del vector pSD541VC digerido con SmaI/XhoI para generar el plásmido pJCA107. El plásmido donante del sitio ATI de NYVAC pJCA107 contiene el promotor I3L/casete de expresión del gen gB, el promotor H6/casete de expresión del gen gC y el promotor 42K/casete de expresión del gen gD orientados de izquierda a derecha, respectivamente, entre los brazos extremos de NYVAC ATI.
Generación y caracterización de vP1164. Los genes FHV-1 gB, gC y gD se insertaron en el genoma de NYVAC en el sitio ATI mediante recombinación in vitro entre el plásmido donante pJCA107 linearizado con NotI y el ADN genómico de NYVAC. Se identificó el recombinante que contiene los genes gB, gC y gD mediante hibridación de calvas, purificación y amplificación de una calva aislada. Este recombinante se designó vP1164.
La expresión de estas glicoproteínas en células CRFK, FEB y/o Vero infectadas con vPll64 se evaluó con el antisuero policlonal monoespecífico de oveja a gB, gC y gD mediante transferencia de Western y/o análisis de inmunprecipitación. Mediante estos ensayos, las siguientes proteínas de FHV-1 se expresan en células infectadas con vCP243: polipéptidos de gB de 100, 60 y 55 kDa; un polipéptido de gC de 110 kDa; un polipéptido de gD de 60 kDa.
Grupo 3 (Ver Tabla 65): los gatos (n= 30) se dividieron en cinco grupos de dosis (n=6/grupo). Tres grupos recibieron dos dosis de vCP65 a 10 ^{4,0}, 10^{5,0} y 10^{6,0} DICT_{50}/dosis. Un grupo (n=6) recibió sólo una inyección de CP65 a 10^{6,0} DICT_{50}/dosis y un grupo (n=6) no se vacunó como control de contacto. Los gatos se vacunaron y tres semanas después fueron reforzados. Se recogieron muestras de sangre de acuerdo con la tabla siguiente (Tabla 64):
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TABLA 64
115 
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TABLA 65 Resumen de los grupos de vacunación
116 
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Se sedaron ligeramente a los gatos para la recolección de la sangre usando hidrocloruro de quetamina (100 mg/ml) o quetamina en combinación con xilazina (5-10 mg/ml) administrado intramuscularmente a 5-10 mg/kg. La atropina (0,54 mg/ml) se administró a 0,1-0,2 ml por gato subcutáneamente para disminuir la salivación durante la anestesia. Se observaron el dolor y el malestar de los gatos después de la inyección, observándolos diariamente y siguíendolos bisemanalmente para detectar signos clínicos adversos.
Se recogieron muestras de suero y se evaluaron para los anticuerpos que neutralizan el virus de la rabia mediante la prueba rápida de inhibición de foco fluorescente (RFFIT). Se determinó el título de las muestras y se ajustaron a un virus estándar de referencia. Las concentraciones se reportan como log_{10}, antilog_{10} y unidades internacionales. Las tablas 67-71 reportan los datos en log_{10} y antilog_{10}.
Los gatos del grupo 3 fueron también vacunados con recombinates que contenían los genes del virus del herpes felino (FHV) vCP243 (n=10) (Ver Tablas 69 y 70). Los virus se administraron subcutáneamente dos veces, utilizando aproximadamente 10^{7,0} DICT_{50}/dosis, al mismo tiempo pero en un lugar diferente que las inyecciones de CP65.
Virus: el virus recombinante de la viruela del canario (vCP65), era un pasaje X + 5 del virus que estaba titulado a 10^{8,0} TCI_{50}/ml. Antes de su uso fue diluido en el medio de cultivo tisular F10-199.
Fibroblastos Embrionarios de Pollo (FEB) Primarios: Las suspensiones de células FEB recibidas de Select Laboratories se usaron para titular el virus tras la administración.
Las diluciones del virus fueron tituladas tras la administración para los tres grupos de gatos. Doce gatos en el Grupo 2 recibieron 10^{6,2}DICT_{50}/dosis en lugar de los 10^{6,0} y 10^{5,0} DICT_{50}/dosis deseadas, como primera vacunación. Por lo tanto, para la vacunación de refuerzo, todos los gatos del Grupo 2 (n=18) recibieron 10^{5,8} DICT_{50}/dosis. Las concentraciones de cinco réplicas/vacuna son las que siguen (Tabla 66).
TABLA 66
117
Las concentraciones de anticuerpos que neutralizan el virus de la rabia de los gatos individualmente (Grupos 1, 2 y 3) se muestran en las Tablas 67, 68 y 71 respectivamente.
Grupo 1: (Ver Tabla 67): Los gatos FeLVe con exposición previa a el vector del virus de la viruela del canario (n=10) demostraron una fuerte respuesta serológica a vCP65. En el refuerzo siguiente, cinco de cinco gatos que recibieron 10^{7,1} DICT_{50}/dosis tenían concentraciones de anticuerpo de la rabia mayores que 3,0 log_{10} (MGT=log_{10} 3,68 \pm 0,4; Antilog = 4786). En el refuerzo siguiente, cinco de cinco gatos que recibieron 10^{6,1} DICT_{50}/dosis respondieron con tres de cinco gatos que tenían concentraciones de anticuerpo de la rabia mayores que 3,0 log_{10} (MGT=log_{10} 2,96 \pm 0,8; Antilog = 912).
Grupo 2: (Ver Tablas 68, 69 y 70): Los gatos FeLVe y los FeLVe que no habían recibido una exposición previa al vector del virus de la viruela del canario (n=18) demostraron una fuerte respuesta serológica a vCP65 (MGT)=log_{10} 2,10\pm 0,5, Antilog=631).
Como se muestra en la Tabla 69: Los gatos FeLVe de este grupo (n=7) respondieron a la primera vacunación con buenas concentraciones de anticuerpos de la rabia (MGT=190\pm0,6, Antilog=79). Tras el siguiente refuerzo, estos gatos demostraron un buen aumento de los anticuerpos de la rabia (MGT=log_{10}2,96 \pm 0,4, antilog 912).
Como se muestra en la Tabla 70: Los gatos FeLVe de este grupo (n=11) también demostraron una buena respuesta serológica a vCP65 tras una inyección (MGT=2,24\pm0,4, Media=174). En el siguiente refuerzo, la mayoría de los gatos FeLVe demostraron un aumento en los anticuerpos de la rabia (MGT= log_{10} 2,8 \pm 0,6, Antilog = 630). Los gatos FeLVe Nº82 y 84 no respondieron a la vacunación de refuerzo y por lo tanto anularon la MGT de los gatos FeLVe post-refuerzo. El análisis post-refuerzo de los gatos FeLV+, sin estos dos que no respondieron, es similar, si no ligeramente mejor, que los gatos FeLVe del Grupo 2 (MGT = log_{10} 2,99 \pm 0,4, Antilog =977).
No hubo diferencias significativas en la respuesta de anticuerpos de los gatos del Grupo 2 que recibieron 10^{6,2} DICT_{50} frente a los 10^{5,8} TCDI_{50} para la primera vacunación.
Grupo 3: Los gatos control (n=6) que no fueron vacunados pero que se mantuvieron en contacto con los vacunados, permanecieron serológicamente negativos para los anticuerpos de la rabia tras la vacunación.
Seguridad: Cincuenta y siete o cincuenta y ocho gatos permanecieron clínicamente sanos a lo largo de la duración del experimento. El virus vCP65 se administró de manera indolora. No se observó hinchazón o inflamación tras la vacunación, o signos de enfermedad sistémica.
El gato K2 (Grupo 3) era FeLV+ antes de la vacunación. Este gato se sacrificó 37 días después de la primera vacunación debido a pérdida de peso, anorexia e infecciones bacterianas secundarias. Se le realizó una necropsia y se encontraron lesiones en la superficie de los miembros posteriores y de los labios superiores. No se detectaron anormalidades internas. Se congelaron las muestras de los tejidos labiales y se conservaron. Se cree que este gato mostraba signos relacionados con infección por FeLV; sin embargo, fue el único gato FeLV+ que mostró la enfermedad clínica usando el modelo de infección del NVSL tras la infección. Los gatos de control de contacto en el Grupo 3 permanecieron clínicamente sanos a lo largo de la duración del ensayo.
El virus (vCP65) demostró una excelente seguridad en los gatos infectados por FeLV. Interesantemente, nueve de once gatos FeLV+ respondieron también a la vacunación de refuerzo como lo hicieron los gatos FeLVe. Este descubrimiento es sorprendente, pues en esta función inmune suprimida es una secuela frecuente a la infección por FeLV. Sin embargo, como se describe en la bibliografía, los gatos SPF alojados en condiciones "limpias" no son sujetos a infecciones ambientales por lo tanto no están tan inmunocomprometidos como los gatos de casa.
De esta descripción, sin excesiva experimentación, una persona entrenada en el área puede determinar la dosis mínima protectora de este virus (vCP65) en gatos, especialmente siguiendo el régimen de combinación canino de más arriba. Se puede preparar una dosis única del producto vCP65, o un producto monovalente vCP65, si se desea, de esta descripción sin excesiva experimentación.
El experimento también demuestra una falta de supresión de la respuesta inmune para las administraciones previas al vector del virus de la viruela del canario. La administración previa de un virus de viruela del canario y FeLV no afectó negativamente a la respuesta inmune de los gatos al virus de la viruela del canario y la rabia. La exposición previa puede, en realidad, aumentar la vacunación subsecuente con el mismo vector (es decir, los gatos del Grupo 1 que recibieron 10^{6,0} DICT_{50} respondieron con una MGT mayor que los gatos del Grupo 2 que recibieron la misma dosis del virus). Así las vacunaciones múltiples de los virus recombinantes, tales como vCP65, durante el tiempo, son también posibles, demostrando por tanto la aplicabilidad de los vectores del virus de la viruela, por ejemplo, virus recombinante de viruela-rabia, y especialmente este vector (ALVAC), y particularmente de vCP65, en programas de vacunación anuales. Este modelo animal (es decir, gatos infectados con FeLV) se usa normalmente como paralelo a humanos infectados por VIH. Los gatos FeLVe se consideran inmunocomprometidos y más susceptibles a los efectos patogénicos de los agentes infecciosos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 67 Títulos de neutralización de suero (títulos RFFIT) de gatos del grupo 1
118
TABLA 68 Títulos de neutralización de suero (TÍTULOS RFFIT) de gatos del grupo 2
120 
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Tablas 69 y 70
Títulos de Neutralización de Suero (RFFIT) de Gatos FeLV+ frente a los FeLVe 
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TABLA 69 Gatos FeLVe del Grupo 2
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TABLA 70 Gatos FeLVe del Grupo 2
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TABLA 71 Títulos de Neutralización de Suero (Títulos RFFIT) de Gatos del Grupo 3
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125 
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Ejemplo 19 Protección de perros contra la infección de CDV mediante ALVAC-CDVHF (vCP258)
El vCP2S8 se discute en la USSN 08/416.616, presentada el 5 de Abril, 1995. La eficacia protectora del virus recombinante CDV HA y F basado en ALVAC se estableció mediante la exposición de los perros a la infección del CDV vivo seguida de vacunación. En este experimento, 13 beagles seronegativos a CDV se dividieron en dos grupos vacunados (3 perros para una dosis de vacuna vCP258 de 10^{7} ufc y 4 perros para una dosis de vacuna de 10^{5,5} ufc) y un grupo control de no vacunados (6 perros). La vacunación consistió en dos inoculaciones subcutáneas con 10^{7} DICT_{50}/dosis (grupo 1) o 10^{5,5} DICT_{50}/dosis (grupo 2) de vCP258 con un intervalo de tres semanas. En el día 42, todos los perros fueron infectados mediante administración intracraneal 1:10 de un virus CDV en reserva de la NVSL. Los perros se observaron diariamente durante los 28 días siguientes a la infección para seguir la morbilidad/mortalidad.
No se observaron reacciones locales o sistémicas adversas en los perros vacunados con vCP258. Todos los perros control no vacunados desarrollaron signos clínicos de infección por CDV incluyendo anorexia, conjuntivitis, depresión, pérdida de peso y deshidratación en los días 6-17 tras la infección. Se observaron cuatro picos febriles (>103,5ºF) en los días 1,3,8 y 13 tras la infección. Cuatro de los 6 animales control tuvieron manifestaciones clínicas más severas. De hecho, uno de estos perros murió 12 días tras la infección mientras que otros tres fueron sacrificados entre los días 13-17 tras la infección. Los dos animales control que sobrevivieron, que tenían una sintomatología más suave de la enfermedad, comenzaron a recuperarse y, de hecho, comenzaron a ganar peso 19 días después de la infección.
Considerablemente, ningún perro en ninguno de los grupos dosificados con vacuna desarrollaron signos clínicos de la infección por CDV. Todos ellos ganaron peso y mostraron un comportamiento normal durante el periodo de observación. Además, no se observaron episodios febriles.
La Tabla 72 recoge las respuestas serológicas específicas de CDV en cada grupo a varios tiempos antes de la infección. Los títulos de anticuerpo se expresan como el 50% del punto final de neutralización y representan los títulos medios de cada grupo. De manera interesante, aunque una dosis de vacuna 10^{5,5} DICT_{50} no provoca niveles equivalentes de actividad que neutralizan al CDV, todos los perros vacunados con esta dosis más baja estaban completamente protegidos frente a la infección del CDV virulento.
TABLA 72 Respuestas serológicas específicas de CDV
126 
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Ejemplo 20 Eficacia en perros de ALVAC-CDV (vCP258) y ALVAC-rabia (vCP65) cuando se utiliza en una forma de combinación con otros patógenos caninos
Con objeto de determinar si ALVAC-CDV (vCP258) proporcionaría una eficacia protectora cuando se utiliza en una vacuna de combinación con otros patógenos caninos, se llevó a cabo el siguiente estudio. El ALVAC-CDV (vCP258) se diluyó a dosis de 10^{4,6},10^{4,8} y 10^{5,5} DICT_{50} por ml y se mezclaron con dosis de vacuna de Adenovirus Canino Tipo 2 (CAV_{2}), Coronavirus Canino (CCV), Parainfluenza Canina (CPi), Parvovirus Canino (CPV_{x1}), Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae (LCI) y ALVAC-Rabia (vCP65). Veinticuatro perros seronegativos y dos perros seropositivos se inocularon como se muestra en la Tabla 73 con ALVAC-CDV solo o en una combinación canina. Los perros recibieron dos inoculaciones en los días 0 y 21 a través de la ruta subcutánea. Se recogió sangre para la determinación los títulos de neutralización del suero de CDV en los días 0, 21 y antes de la infección. Los perros fueron infectados en dos grupos bien los días 24 o 50 tras la segunda inoculación mediante la ruta intracraneal con el virus infector CDV suministrado por la USDA. Tras la infección, los perros se observaron durante 5 meses para seguir los signos de la infección con CDV. Los resultados de la serología e infección se muestran en la Tabla 74.
Los resultados indican que los perros inoculados con 4,8 log_{10}DICT_{50} de ALVAC-CDV (vCP258) solo, inducían un título de anticuerpo específico que neutraliza medio de 1,2 mientras que dosis de 5,5 log_{10} y 4,8 log_{10} en la combinación de vacunas caninas inducían títulos medios de 1,0 y 7,0 respectivamente. Todos los perros en estos grupos de vacunación sobrevivieron a la infección. Un perro en el grupo que recibió la combinación más 4,8 log_{10}DICT_{50} desarrolló los síntomas específicos de la infección por CDV. Las titulaciones de los virus, los títulos de anticuerpos para CDV, los títulos de anticuerpos para el virus de la rabia, la morbilidad/mortalidad y la pérdida/ganancia de peso se muestran en las Tablas de la 75 a la 80.
En este estudio, la respuesta serológica a la vacunación con la vacuna de coronavirus canino, y la vacuna de ALVAC-rabia también fue observada. Considerablemente, la inclusión de ALVAC-CDV en la vacuna de combinación no interfirió con la respuesta serológica de los otros componentes, especialmente los componentes coronavirus canino y virus de la rabia. Y, el componente virus de la rabia, vCP65, no interfirió con ningún otro antígeno.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 73 Tabla de vacunación de los perros inoculados con ALVAC-CDV (vCP258) solo o en combinación con otras vacunas caninas
128
TABLA 74 Resultados de la serología e infección de los perros inoculados con ALVAC-CDV (vCP258) solo o en combinación con otras vacunas caninas
130
TABLA 75 Titulaciones de virus de vacunas (media geométrica de cinco pruebas replicadas)
131 
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TABLA 76 Títulos de anticuerpos de seroneutralización (Log_{10}) del virus de moquillo canino
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133
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TABLA 77 Títulos de anticuerpos seroneutralizantes (Log_{10}) del coronavirus canino
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TABLA 78 Títulos de los anticuerpos contra la rabia por RFFIT (Log_{10})
137
138
TABLA 79 Morbilidad/mortalidad día 28 tras la infección con el virus de moquillo canino
139 
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TABLA 80 Pérdida de peso/ganancia tras la infección B. expresado en libras/peso corporal
140
141 
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Ejemplo 21 Vacuna de combinación de la rabia canina con vCP65 recombinante: ausencia de interferencias de vCP65, Cepa rockborn de CDV, y CPV_{XL}, en la vacuna DACPiPCP65 + LCI
Este ejemplo demuestra que las cepas CPV (P_{XL}) y el CDV (Rockborn) pueden utilizarse intercambiablemente con las cepas CPV y CDV (Onderstepoort) respectivamente sin causar ninguna interferencia a los otros componentes de la vacuna de combinación: DACPiPCP65 + LCI, que la adición de CP65 a la vacuna de combinación canina (DACPiP) no interfiere con la inmunogenicidad de los otros componentes, y que la vacuna de combinación (DACPiPCP65) es segura para los perros para obtener una licencia para la vacuna de combinación + LCI y sus productos derivados.
Procedimiento General: Se prepararon siete lotes de vacunas con componentes antígenos variables. Treinta y ocho (38) perros se dividieron en diferentes grupos basándose en la vacuna que recibieron y se midió su respuesta inmune mediante serología. La eficacia del coronavirus canino se midió mediante vacunación/infección. Los títulos de seroneutralización (SN) del anticuerpo se utilizaron para demostrar si se causaba alguna interferencia por la adición de diferentes antígenos de la vacuna. Todas las vacunas se reconstituyeron con licencia de la USDA y LCI seriado (32010) probado satisfactoriamente e inyectadas en los perros.
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(Tabla pasa a página siguiente)
Abreviaturas
142 
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Materiales
Animales, Fuente, Edad: Diecisiete (17) perros de varias edades se adquirieron de Harlan Sprague Dawley (HDS). Cinco perros, 12-16 semanas de edad, se adquirieron de James A. Baker Institute of animal Health, cornell University. Dieciséis perros, 8-10 semanas de edad, se adquirieron de Liberty. Todos eran seronegativos para todos los componentes de las vacunas implicadas en los estudios respectivos.
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Vacunas
Todas las vacunas se prepararon con diferentes cosechas de antígeno emitido por el mismo virus de la semilla principal.
Se prepararon cuatro lotes de vacunas:
D_{R}APiP (lote A)
D_{R}ACPiP_{XL} (lote B)
D_{O}ACPiPCP65 (lote C)
D_{R}ACPiP_{XL}CP65 (lote D)
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Las vacunas de arriba se formularon con los siguientes componentes:
143 
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Se produjeron dos vacunas adicionales:
D_{R}ACPiP_{XL}CP65
D_{O}ACPiPCP65
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Vacuna D_{R}ACPiP_{XL}CP65
144 
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Vacuna: D_{O}ACPiPCP65
146 
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Se preparó también una vacuna que no incluía la fracción CDV:
Vacuna: ACPiP_{XL}CP65
147 
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Titulación: Se tituló cada fracción de los diferentes lotes de vacuna bien en el día la primera vacunación o ambos días de vacunación. La titulación se llevó a acabo en tres-cinco réplicas.
Métodos: Vacunación: Todas las vacunas (1 dosis = 1 ml) se administraron dos veces a través de la ruta subcutánea con 21 días de intervalo. Se utilizó LCI distribuido en serie (Nº 32010) como diluyente para cada vacuna.
Sangrado: Se extrajo sangre de los perros los días 0, 21, y 35-42 tras la vacunación.
Evaluación de los resultados: títulos de seroneutralización: Las muestras de suero derivadas de cada perro y de cada fecha de extracción se analizaron para la presencia de títulos de anticuerpo que neutralicen el virus. Para medir la interferencia, se usó como parámetro la seroconversión interpretada mediante el título de anticuerpo. Se utilizaron diferentes grupos de perros por cada componente de la vacuna estudiada porque algunos grupos habían estado ya expuestos a ciertos virus y poseían elevados títulos de anticuerpo antes de la vacunación: por ejemplo, de los perros HSD que recibieron las cuatro primeras vacunas (A-D) muchos confirmaron haber experimentado un brote de Parvovirus canino en sus colonias antes de ser adquiridos.
Vacunación/Infección (CCV): Se infectaron doce (12) perros vacunados con la combinación CP65 que contiene la vacuna CCV_{L} y seis (6) perros control vacunados con una vacuna de combinación sin CP65 no CCV_{L}, con el CCV virulento en el Día 35 tras la vacunación y se hizo la necropsia en el día 41. Los resultados del reaislamiento del virus de la heces se utilizaron para demostrar las no interferencias de vCP65 en la protección concedida por la vacuna CCV.
Evaluación de la Seguridad: Tras cada administración de la vacuna, se palpó a cada perro en el lugar de la inoculación, y se observó al menos durante dos horas tras la vacunación para ver cualquier reacción clínica local o sistémica adversa. Las observaciones continuaron a lo largo del periodo de estudio.
Resultados: Los títulos de anticuerpo (SN) inducidos por CP65 preparados en combinación con las virus de la semilla principal de CDV (Rockborn o Onderstepoort) y CPV (virus de la semilla principal viejo o P_{XL}) son equivalentes. La adición de CP65 a otros componentes (D, A, C, Pi, P) no interfiere con la respuesta inmune de ninguno de ellos. La CCV (MLV) en la vacuna de combinación protegió a los perros de la infección en presencia de todos los otros componentes, incluyendo CP65, independientemente de que se use el virus de la semilla principal de CDV o CPV. No se observaron signos clínicos sistémicos o locales en los perros a lo largo del experimento.
Títulos de los Componentes Antígenos en las Vacunas: El título de cada antígeno en cada lote de vacuna analizado en la primera y/o segunda vacunación se muestra en las Tablas 81a, b y c más abajo:
TABLA 81a Título (log_{10}) de los Componentes Víricos: Titulaciones Levadas a Cabo los Días de Vacunación (V_{1} y V_{2}*)
148 
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TABLA 81b Títulos (Log_{10}) de Componentes Víricos Probados en los Días de Vacunación
149 
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TABLA 81c Títulos de los Componentes Víricos
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Los resultados muestran que:
- Los títulos de CP65 se encuentran en su mayoría entre la MPD, dosis mínima protectora, (5,6) y el título esperado a la fecha (6,3).
- Los títulos de D_{R} se encuentran siempre por encima del título de salida, 3,2 (log_{10}/ml).
- Los títulos de P_{XL} se encuentran siempre por encima del título de salida esperado, 3,3 (log_{10} ml).
Títulos de los Anticuerpos Seroneutralizantes (RFFIT) para el Recombinante de la Rabia (CP65): Dos de las vacunas en las que la única diferencia era un cambio de las cepas CDV y CPV, dieron los siguientes títulos de los anticuerpos que neutralizan la rabia (Tabla 82):
TABLA 82 Títulos de los Anticuerpos que Neutralizan el Virus de la Rabia (log_{10})
152 
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Los anticuerpos SN de la rabia demostraron una buena seroconversión comparable a las obtenidas en los Ejemplos de más arriba.
Análisis Estadístico (test t) mostraron que los títulos de los anticuerpos que neutralizan la rabia en las vacunas de más arriba (tabla 82) no son significativamente diferentes: ambos cambios en el virus de la semilla principal de Moquillo y Parvovirus no presentan interferencias in vivo en la eficacia de vCP65 en perros.
Influencia de CDV y CPV respectivamente en los Títulos de SN de la Rabia (CP65). La influencia de CDV (cepa Rockborn) en los Títulos de SN de la Rabia (CP65).
TABLA 83 Los títulos individuales de los anticuerpos (RFFIT) para la rabia en dos vacunas producidas con y sin CDV_{R} se muestran en la Tabla 83 (abajo)
154 
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Cuando se añade CDV (Rockborn) a una Vacuna Combo canina (ACPiP_{XL}CP65) no se causa ninguna interferencia en el título de anticuerpos seroneutralizantes de la rabia inducida por vCP65.
Influencia de CPV (P_{XL}) en Los Títulos de SN de la Rabia (CP65).
TABLA 84 Títulos de los anticuerpos de la rabia
156 
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El cambio del virus de la semilla principal de CPV a un nuevo de CPV (P_{XL}) no resultó en ninguna diferencia significativa en el título de anticuerpo SN de la rabia. Se observó una buena seroconversión en todos los perros incluso cuando la dosis de CP65 se acercaba a la dosis mínima protectora en el grupo de los vacunados con el lote D que recibieron D_{R} y P_{XL}.
Influencia al añadir el Recombinante de la Rabia (vCP65) en las otras fracciones de Vacuna Canina.
Influencia de CP65 en el Título de SN de CDV (cepa Rockborn).
TABLA 85 Títulos de SN de Sistemper (Log_{10}/ml)
157
Cuando se incorpora la vacuna de Recombinante de la Rabia (vCP65) en diferentes vacunas combo caninas, no interfiere con la producción de anticuerpos que neutralizan el CDV. Incluso a títulos bajos, el D_{R} combinado induce una excelente seroconversión en todos los animales.
Influencia de la adición del recombinante de la rabia (CP65) en el Título de SN de CPV (P_{XL}).
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TABLA 86 Títulos individuales de CPV(P_{XL}) (log_{10}/ml)
159 
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Cuando se añadía el Recombinante de la Rabia (vCP65) a la vacuna combo canina que contiene DACPiP (P o P_{XL}) no había interferencia en la producción de anticuerpo seroneutralizante (SN) contra CPV en los animales previamente no tratados.
Influencia de la adición de del recombinante de la rabia (CP65) en el Título de SN de CAV-2.
TABLA 87 Títulos individuales de anticuerpos a CAV-2 (Log_{10}/ml)
161 
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La adición de CP65 (vacuna de rabia recombinante) a vacunas caninas de combinación que contienen CAV-2 no interfiere con la respuesta inmune a CAV-2 medida mediante métodos serológicos.
Influencia de la adición del recombinante de la rabia (CP65) en el título de SN de CPi.
TABLA 88 Títulos individuales de anticuerpos a CPi (Log_{10}/ml)
163 
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La adición de vCP65 a la vacuna existente con D_{R}P_{XL} no causa interferencias en los títulos de anticuerpos de seroneutralización de CPi.
Influencia de la adición de la Rabia Recombinante (CP65) en la inmunogenicidad de CCV (mediante serología):
TABLA 89 Títulos individuales de anticuerpo de CCV en log_{10}/ml
165
La Tabla 89 demuestra que la vacuna del recombinante de la rabia (CP65) cuando se añade a los componentes (DACPiP) de la licencia D_{R}ACPiP no interfiere con la inmunogenicidad tal como se mide mediante los títulos de SN.
Infección Bv: En los ejemplos de más arriba se ha demostrado que CDV(D_{R}) y CPV_{XL} no interfieren en la eficacia de la vacuna D_{R}ACPiP_{XL}, mediante vacunación/infección.
Se vacunaron tres grupos de perros con vacunas que contenían vCP65 o que no lo contenían como muestra la Tabla 89 y se discute más arriba. Todos los perros fueron infectados con CCV siguiendo el procedimiento descrito en los Ejemplos de más arriba.
La eficacia de la vacuna se evaluó mediante el reaislamiento del virus en las heces de los perros seis días después de la infección.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 90 Protección Tras la Infección
166 
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La Tabla 90 confirma que la CP65 no interfiere en la vacunación con CCV como se demuestra con la protección tras la infección. Todas las vacunas de coronavirus canino que contienen CP65 protejen muy eficientemente a los perros contra infecciones muy severas que afectan a los perros control.
Se encontró que todas las vacunas de este Ejemplo eran seguras para los perros que fueron observados cuidadosamente tras la vacunación. No se observó ninguna reacción clínica local o sistémica a lo largo del periodo de prueba.
Estos experimentos demostraron mediante procedimientos serológicos que la adición de una fracción del recombinante de la rabia, vCP65, no causa ninguna interferencia con ningún otro componente, incluyendo DR y PXL.
La comparación de dos vacunas de combinación completas liofilizadas, D_{O}ACPiPCP65/LCI y D_{R}ACPiP_{XL}CP65/
LCI, donde D_{O} se cambia a D_{R}, ha mostrado que no hay interferencia en la respuesta de anticuerpos de la rabia. Al nivel de anticuerpos de la rabia con D_{R}ACPiP_{XL}CP65 es incluso mayor o igual al nivel de aquellos perros vacunados con D_{O}ACPiPCP65 y que sobrevivieron a la infección.
Para seguir demostrando que D_{R} no interfiere con la respuesta inmune de vCP65, se hizo la comparación de los anticuerpos de SN de las dos vacunas con y sin D_{R}. Los resultados en cualquier caso eran equivalentes, indicando que la cepa D_{R} puede añadirse al resto de la fracción ACPiP_{XL}CP65.
Cuando se añadió el Parvovirus Canino (P_{XL}) para completar la vacuna de combinación (D_{R}ACPiP_{XL}CP65) y se comparó con otra vacuna de combinación (D_{O}ACPiPCP65) no se observaron interferencias con la serología de CP65.
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La respuesta inmune humoral del parvovirus canino en vacunas de combinación (DACPiPCP65) donde P y P_{XL} se usaron indistintamente, es equivalente en cualquier caso. Además, los resultados confirmaron que el cambio de un MSV (virus de la semilla principal, del inglés: máster seed virus) a otra del virus no interfiere con las respuestas inmunológicas de los perros a otras fracciones.
La evaluación de la no-interferencia de D_{R}, P_{XL} y CP65 en la protección proporcionada por la vacuna CCV MLV fue llevada a cabo mediante vacunación/infección. El reaislamiento de CCV en las heces muestra que el MSV de CDV (Rockborn) y CPV (P_{XL}) puede ser usado en la vacuna de combinación D_{R}ACPiP_{XL}CP65. Ambas vacunas corona caninas que contienen CP65 protegen muy eficazmente a los perros contra la infección por coronavirus que afectaba al 100% de los perros control no vacunados (Tabla 89).
La vacuna recombinante de la rabia (vCP65) y vector del virus de la viruela del canario, combinada con los antígenos de los virus D, A, C, Pi y P, es segura y eficaz en perros independientemente de si se usa la MSV del Parvovirus canino o el virus de Moquillo Canino.
Tal como se ha evaluado mediante procedimientos serológicos, la adición del recombinate de la rabia vCP65 a DACPiP no causa ninguna interferencia en ninguna otra fracción de virus canino.
Tal como se evalúa por infección, la presencia del recombinante de la rabia (vCP65), D_{R}, P_{XL}, en la vacuna de combinación, no causa ninguna interferencia en la eficacia del componente CCV.
La combinación de la rabia canina rehidratada induce unas respuestas inmunes protectoras excelentes con respecto a todos los componentes.
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Ejemplo 22 Virus de la viruela del canario/rabia (CP65): estudio preliminar de la seguridad e inmunogenicidad en combinación con otras vacunas de antígenos de gatos
Este Ejemplo demuestra la seguridad y la inmunogenicidad de las vacunas de combinación de la rabia y muestra que los antígenos convencionales no interfieren con la inmunogenicidad de vCP65; y muestra la seguridad en gatos.
Procedimiento General: Veinticinco gatos (cinco gatos por grupo) fueron vacunados con lotes experimentales de vacuna que contenía 10^{4,8}-10^{5,3} DICT_{50}/dosis de vCP65 en combinación con antígenos convencionales (FVR-C-P-FPn + FeLV). Los gatos recibieron una o más dosis de vacuna, subcutáneamente, y se les extrajo sangre los Días 0, 18 y 32 tras la primera vacunación.
Materiales: Animales: Veinticinco gatos fueron usados concurrentemente en la prueba. Los gatos tenían 14-16 semanas de edad en el momento de la primera vacunación. Estos se habían recuperado recientemente de una infección por el virus del Herpes felino, originada por el suministrador antes de recibirlos.
Vacuna: Se prepararon vacunas experimentales pentavalentes felinas (Lotes B y C; ver Tabla 92) que contenían rhinotracheitis felino (FVR); calicivirus felino (C); virus de la panleucopenia felina (P); Chlamydia psittici (FPn) y el recombinate de virus de la viruela del canario y la rabia (CP65).
Las vacunas liofilizadas se rehidrataron antes de la inyección utilizando una vacuna para la Leucemia felina convencional (Código de Producto 1555.20; Nº Serie 65026) o agua estéril. Esta serie de vacuna contra el FeLV tiene resultados relativos de prueba de potencia de 2,6, 2,8, 2,6.
Los gatos se vacunaron como muestra la Tabla 92.
TABLA 92
168
Los gatos se vacunaron, subcutáneamente en el área escapular, una o dos veces con 18 días de intervalo. Fue necesario un intervalo entre las inyecciones más corto para permitir un análisis adecuado de los títulos de los anticuerpos de rabia. Se sangraron los gatos antes de la vacunación y en los días 18 y 32 posteriores a la primera vacunación. Se analizó el suero para evaluar los anticuerpos a la rabia mediante la prueba rápida de inhibición de foco fluorescente(RFFIT). Se observó a los gatos durante aproximadamente 15 minutos tras la inyección para reacciones adversas a la vacuna (es decir, dolor o picor). El sitio de vacunación también se palpó 18 y 32 días tras la inyección. Se titularon los virus vivos modificados FVR-C-P-FPn. Se tituló el virus recombinante vCP65. Durante la primera vacunación, el gato FXI recibió dos inyecciones de 10^{4,8} DICT_{50}/dosis; reduciéndose el número de gatos en el Grupo 3 a cuatro animales.
Resultados: Se muestran en la Tabla 93.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 93
169
Las vacunas se titularon para contener las siguientes cantidades de virus (Tabla 94). Los valores de la titulación de vCP65 se recogen como la media geométrica de los títulos de tres réplicas.
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TABLA 94
170
Los títulos de anticuerpos individuales y de grupo se resumen en la Tabla 95. La media geométrica del título se calculó para cada grupo para cada fecha. El título de anticuerpos para la rabia del gato HB1 en el día 0 se reportó erróneamente como 1,58.
No se observaron reaccione adversas a las vacunas. Los sitios de inoculación se palparon los días 18 y 32. No se observaron bultos o anormalidades. La mayoría de los gatos vacunados parecían sanos durante el ensayo. Sin embargo, en unos pocos gatos aparecieron signos respiratorios evidentes debidos a la infección por Herpes.
Títulos de anticuerpo de la rabia \geq 1,0 log_{10} indicaban una respuesta a las vacunas. Los gatos en los Grupos 1, 2 y 3 tenían unos pocos gatos (2-3 por grupo) que semanalmente respondían tras la vacunación. Estos gatos recibieron una o dos dosis de vacuna (10^{4,8}DICT_{50}/dosis) rehidratada con la vacuna convencional de FeLV; una o dos dosis se rehidrataron con agua.
El grupo 4 tenía dos gatos (FZI & HH3) que semanalmente respondían a la vacunación que consistió en dos dosis de vacuna (10^{4,8}DICT_{50}/dosis) rehidratada con agua. El resto de gatos de este grupo (FU2, GR3 y HG1) respondieron bien con títulos de anticuerpo de la rabia \geq1,8 tras la segunda vacunación.
El grupo 5 recibió dos dosis de vacuna (10^{5,3}DICT_{50}/dosis) rehidratada con FeLV. Este grupo tuvo la mejor respuesta global a la vacunación (MGT = 2,2 \pm 1,03). sin embargo, un gato GQ3 no respondió a la vacunación.
Estos Ejemplos demuestran la inmunogenicidad y seguridad de las vacunas de combinación recombinantes de virus de la viruela del canario y de la rabia. También muestra la respuesta serológica de gatos no expuestos previamente al virus de la viruela del canario, a una o dos dosis de vCP65.
Este Ejemplo demuestra también que no hay interferencia real entre vCP65 y los componentes convencionales de la vacuna. Comparando los Grupos 2 y 4, parece que a dosis bajas de vCP65 (es decir, 10^{4,8}TCDI_{50}/dosis) la vacuna FeLV que se usa en este Experimento (Código de Producto 1555.20) parecían suprimir moderadamente los títulos de anticuerpos de la rabia a las dos semanas de la segunda vacunación. Puesto que no se recogieron muestras adicionales después del Día 32, la respuesta a anticuerpos de la rabia en estos gatos podría haber sido meramente retrasada. Sin embargo, las vacunas que contenían vCP65 a 10^{5,3}DICT_{50}/dosis, rehidratadas con la vacuna convencional FeLV, eran inmunogénicas en gatos; demostrándose así la falta de interferencia.
Este Ejemplo indica que vCP65 (10^{5,3} DICT_{50}/dosis) en combinación con antígenos convencionales, es segura e inducirá buenos títulos de anticuerpos de la rabia tras dos dosis en gatos (es decir, Grupo 5 MGT = 2,12 \pm 1,03). Así, se puede concluir que:
Los virus recombinantes de viruela-rabia (vCP65), en combinación con antígenos convencionales, son seguros en gatos;
Los antígenos convencionales no interfieren con la inmunogenicidad de los virus recombinates de viruela-rabia (por ejemplo, vCP65), especialmente a 10^{5,3}TCDI_{50}/dosis;
Y, dos dosis de virus recombinante de viruela-rabia (por ejemplo, vCP65)(10^{5,3}DICT_{50}/dosis), combinadas con antígenos convencionales y rehidratados con la vacuna FeLV, resultaron en una respuesta más alta de anticuerpo de la rabia.
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TABLA 95 Títulos de Anticuerpo Individuales y de Grupo de los Gatos Vacunados con Las Vacunas de Combinación de Rabia Experimentales(log_{10})
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\bulletTARTAGLIA, J.; PERKUS, M.E.; TAYLOR, J.; NORTON, E.K.; AUDONNET, J-C.; COX, W.I.; DAVIS, S.W.; VAN DER HOEVEN, J.; MEIGNIER, B.; RIVIERE, M. Virology, 1992, vol. 188, 217-232 [0451]
\bulletTARTAGLIA, J.; J. TAYLOR; W.I. COX; J.-C. AUDONNET; M.E. PERKUS; A. RADAELLI; C. DE GIULI MORGHEN; B. MEIGNIER; M. RIVIERE; K. WEINHOLD. AIDS Research Reviews. Marcel Dekker, 1993, vol. 3, 361-378 [0451]
\bulletTARTAGLIA, J.; JARRETT, O.; DESMETTRE, P.; PAOLETTI, E. J. Virol., 1993, vol. 67, 2370-2375 [0451]
\bulletTARTAGLIA, J.; PINCUS, S.; PAOLETTI, E. Critical Reviews in Immunology, 1990, vol. 10, 13-30 [0451]
\bulletTAYLOR, G.; E.J. STOTT; G. WERTZ; A. BALL. J. Gen. Virol., 1991, vol. 72, 125-130 [0451]
\bulletTAYLOR, J.; C. TRIMARCHI; R. WEINBERG; B. LANGUET; F. GUILLEMIN; P. DESMETTRE; E. PAOLETTI. Vaccine, 1991, vol. 9, 190-193 [0451]
\bulletTAYLOR, J.; WEINBERG, R.; KAWAOKA, Y.; WEBSTER, R.G.; PAOLETTI, E. Vaccine, 1988, vol. 6, 504-508 [0451]
\bulletTAYLOR, J.; R. WEINBERG; B. LANQUET; P. DESMETTRE; E. PAOLETTI. Vaccine, 1988, vol. 6, 497-503 [0451]
\bulletTAYLOR, J.; R. WEINBERG; J. TARTAGLIA; C. RICHARDSON; G. ALKHATIB; D. BRIEDIS; M. APPEL; E. NORTON; E. PAOLETTI. Virology, 1992, vol. 187, 321-328 [0451]
\bulletTAYLOR, J.; EDBAUER, C.; REY-SENELONGE, A.; BOUQUET, J.-F.; NORTON, E.; GOEBEL, S.; DESMETTRE, P.; PAOLETTI, E. J. Virol., 1990, vol. 64, 1441-1450 [0451]
\bulletTOYODA, T.; T. SAKAGUCHI; K. IMAI; N. M. INOCENCIO; B. GOTOH; M. HAMAGUCHI; Y. NAGAI. Virology, 1987, vol. 158, 242-247 [0451]
\bulletWEIR, J.P.; B. MOSS. J. Virol., 1983, vol. 46, 530-537 [0451]
\bulletYUEN, L.; MOSS, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 6417-6421 [0451]
\bulletZHOU, J.; L. CRAWFORD; L. MCLEAN; X. SUN; M. STANLEY; N. ALMOND; G.L. SMITH. J. Gen. Virol., 1990, vol. 71, 2185-2190 [0451]
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Paoletti, Enzo
\hskip3.9cm
Maki, Joanne 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y COMPOSICIONES DE COMBINACIÓN Y USOS DEL VIRUS RECOMBINANTE DE LA VIRUELA-RABIA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 55
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Curtis, Morris & Safford, P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 530 Fifth Avenue, 25th Floor
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: New York
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: New York
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: United States of America
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 10036
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO INFORMÁTICO LEGIBLE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPRTE: Disquete flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
INFORMACIÓN DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOLICITUD NÚMERO: US 08/486,969
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 07-JUN-1995
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Frommer, William S.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 25,506
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 454310-2600
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212) 840-3333
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX:(212) 840-0712
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATTAACTA GCTACCCGGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTACATTAAT TGATCGATGG GCCCTTAA 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:3:
\vskip1.000000\baselineskip
172 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍATICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:4:
\vskip1.000000\baselineskip
173 
\vskip1.000000\baselineskip
(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAGTTAATT AGGCGGCCGC 
\hfill
20 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TYPE: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGATTACTAT GAAGGATCCG TT 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATGATACT TCCTAGGCAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGATTACTAG ATCTGAGCTC CCCGGGCTCG AGGGATCCGT T 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATGATCTA GACTCGAGGG GCCCGAGCTC CCTAGGCAA 
\hfill
39 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: CDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCGAATT CTAGCT 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTTAAGATC GA 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: -75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:12:
\vskip1.000000\baselineskip
174 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:13:
\vskip1.000000\baselineskip
175 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAATGGGCG TGGATTGTTA ACTTTATATA ACTTATTTTT TGAATATAC 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 67 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:15:
\vskip1.000000\baselineskip
176 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGCTTACT AAAAGATTTC ATAAACCTTT CAAAATATCC ATCAACTATC T 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
STRAMEDNESS: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTAAAAATA AATCACTTTT TATACTAAGA TCTCCCGGGC TGCAGC 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:18:
\vskip1.000000\baselineskip
177 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTCTGTATA TTTGCACCAA TTTAGATCTT ACTCAAAATA TGTAACAATA 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTCATTTAA CACTATACTC ATATTAATAA AAATAATATT TATT 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:21:
\vskip1.000000\baselineskip
178 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:22:
\vskip1.000000\baselineskip
179 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:23:
\vskip1.000000\baselineskip
180 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:24:
\vskip1.000000\baselineskip
181 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGAGATCTC TCGAGCTGCA GGGCGCCGGA TCCTTTTTCT 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCTCTAGAG AGCTCGACGT CCCGCGGCCT AGGAAAAAGA 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3209 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico -
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:27:
\vskip1.000000\baselineskip
182
183
184 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTTCCCGGG AATTCTAGCT AGCTAGTTT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTCTCAAAA GCTTCCCGGG AATTCTAGCT AGCTAGTTTT TATAAA 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTTTATA AAAACTAGCT AGCTAGAATT CCCGGGAAGC TTTTGAGAGT 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:31:
\vskip1.000000\baselineskip
185 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATTACGATA CAAACTTAAC GGATATCGCG ATAATGAAAT AATTTCAG 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:33:
\vskip1.000000\baselineskip
186 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGAGATCTA AGCTTGTCTG GGATCGTGTA AATAGGGAAT TTCCCAAAAC A 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAACGGAAAA ACCAGAAGGG GTACAAACAG GAGAGCCTGA GGAAC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCCCGG G 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTTCTAGA CTGCAGCCCG GGACATCATG CAGTGGTTAA AC 
\hfill
42 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACCTTCAGG ATCTACTGTC G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTTTCAGA GGCAGTTC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATTAAACCT AAATAATTGT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTTTCTAGA CTGCAGCCCG GGACATCATG CAGTGGTTAA AC 
\hfill
42 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTTTCAGA GGCAGTTC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGTCCACTC GTGGCGATCT T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGCATGATG ACAAGATTAT TATC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGTGGAATT CGCAATGC 
\hfill
18 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAACTGCAG CCCGGGAAGC TTACAAAAAT TAGACAAGAT TTGTTTCAGT ATC 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTATGGCAA ATTTCTTTCA GGGACTCGGG GATGTG 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATTATCGCG ATATCCGTTA AGTTTGTATC GTAATGAGAC GATATAGGAT GGGAC 
\hfill
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTATTTTCA ATACTGAC 
\hfill
18 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAATGTGTAC CACGGGAC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGAAGCTTC TGCAGAATTC GTTAACAAAA ATCATTATAA TCGCCGGGGA TGAG 
\hfill
54 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTATATTGT AATTATA 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAAAACGAC GGCCAGT 
\hfill
17 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGATGACAC GTCTACATTT T 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.:55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TIPO DE CADENA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Nº ID. SEC.:55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTTACATAA CGTACTTCAG C 
\hfill
21

Claims (11)

1. Composición destinada a inducir una respuesta inmunológica que comprende:
(i)
un virus recombinante de la viruela del canario modificado para presentar una virulencia atenuada en un huésped; y que contiene ADN exógeno en una región no esencial del genoma viral, dicho ADN exógeno codifica y expresa por lo menos un epítopo de la Glicoproteína G de la rabia; y (ii) por lo menos un antígeno adicional donde el antígeno adicional es cualquiera de entre: el antígeno del virus del moquillo canino, el antígeno del adenovirus tipo 2 canino, el antígeno del coronavirus canino, el antígeno del parainfluenza canino, el antígeno del parvovirus canino o el antígeno de Bacterina de Leptospira Canicola-Icterohaemorrhagiae; o cualquier combinación de estos antígenos.
2. Composición según la reivindicación 1, donde el virus de la viruela del canario es una cepa de vacuna Reutschler la cual está atenuada a través de más de 200 pasajes seriados sobre fibroblastos embrionarios de pollo, el inóculo principal de éste se ha sometido a cuatro purificaciones de calvas sucesivas en agar, de las cuales se amplificó un clon de las calvas tras cinco pasajes adicionales.
3. Composición según la reivindicación 2 en donde el virus de la viruela del canario es un virus recombinante ALVAC.
4. Composición según la reivindicación 1 o 2 en donde el antígeno del virus del moquillo canino es VDC HA y/o glicoproteínas.
5. Composición según la reivindicación 1 en donde el antígeno adicional se obtiene a partir de una composición liofilizada.
6. Composición según la reivindicación 1 donde el antígeno adicional se obtiene a partir de otro virus recombinante en la composición.
7. Composición según la reivindicación 1 en donde el antígeno adicional se obtiene a partir de ADN que codifica el antígeno adicional en el interior del virus recombinante, además del ADN que codifica por lo menos un epítopo de glicoproteína G de la rabia, el cual también se expresa.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende, cualquiera de los antígenos siguientes: antígeno del virus del moquillo canino, antígeno del adenovirus tipo 2 canino, antígeno del coronavirus canino, antígeno del parainfluenza canino, y el antígeno del parvovirus canino.
9. Utilización de una composición que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 en la preparación de un medicamento para el tratamiento inmunológico de un individuo o animal, o para inducir una respuesta inmunológica en un individuo o animal.
10. Utilización de un virus recombinante de la viruela del canario (i) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 para la preparación de un medicamento, el cual comprende por lo menos un antígeno adicional (ii), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 para el tratamiento inmunológico de un individuo o animal, o para inducir una respuesta inmunológica en un individuo o animal.
11. Productos que comprenden un virus recombinante de la viruela del canario modificado (i) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, y por lo menos un antígeno adicional (ii), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, para la coadministración o la administración secuencial.
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