ES2293639T3

ES2293639T3 - Secuencias de nucleotidos y aminoacidos de los virus gb, gc y gd del herpes canino y sus usos.

Info

Publication number: ES2293639T3
Application number: ES95915474T
Authority: ES
Inventors: Enzo Paoletti; Keith Jeffrey Limbach
Original assignee: Connaught Technology Corp
Current assignee: Connaught Technology Corp
Priority date: 1994-03-30
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2015-03-30
Also published as: CA2182888C; ATE369876T1; DK0752888T3; WO1995026751A1; AU683557B2; US6017542A; DE69535561T2; JPH09511145A; AU2234495A; JP3745370B2; EP0752888B1; EP0752888A4; EP0752888A1; DE69535561D1; CA2182888A1

Abstract

SE PRESENTAN Y REIVINDICAN NUCLEOTIDOS PARA GENES QUE CODIFICAN LOS HOMOLOGOS GB, GC Y GD DE HERPESVIRUS CANINOS (CHV). ESTOS GENES CODIFICAN POLIPEPTIDOS DE LOS AMINOACIDOS 879, 459 Y 345, RESPECTIVAMENTE QUE TAMBIEN SE PRESENTAN Y REIVINDICAN. LOS GENES SON UTILES COMO SONDAS DE DNA, O PARA PREPARAR CARGAS INICIADORAS PCR. LOS POLIPEPTIDOS TIENEN UTILIDAD EN LOS COMPUESTOS ANTIGENICOS E INMUNOLOGICOS ASI COMO EN LAS VACUNAS. LOS NUCLEOTIDOS PUEDEN EXPRESARSE EN CUALQUIER SISTEMA VECTORIAL ADECUADO, PERMITIENDO LA PRODUCCION DE POLIPEPTIDOS. ADICIONALMENTE, EL SISTEMA VECTORIAL QUE CONTIENE CUALQUIERA O CUALQUIER COMBINACION DE LOS NUCLEOTIDOS PUEDE EMPLEARSE EN UN COMPUESTO ANTIGENICO, INMUNOLOGICO O VACUNA, TAL COMO UN SISTEMA VECTORIAL POXVIRUS, P.E. UNA VACUNA CHV O RECOMBINANTE DE VIRUS AVIPOX, ASI COMO LOS PRODUCTOS DE SU EXPRESION TALES COMO LAS GLUCOPROTEINAS GB, GC Y GD. LOS ANTICUERPOS OBTENIDOS DE GLUCOPROTEINAS O A PARTIR DE LA EXPRESION DEL VECTOR QUE CONTIENE EL NUCLEOTIDO-STAMBIEN TIENEN UTILIDAD. TAMBIEN SE EXPONEN Y REIVINDICAN LOS METODOS PARA HACER Y UTILIZAR EL COMPUESTO. TAMBIEN SE EXPONEN Y SE REIVINDICAN LOS RECOMBINANTES GB, GC Y GD DE CANARIPOX-CHV, VCP 320, VCP322 Y VCP294 AL IGUAL QUE METODOS PARA HACERLOS Y UTILIZARLOS.

Description

Secuencias de nucléotidos y aminoácidos de los virus gB, gC y gD del herpes canino y sus usos.

Campo de la invención

Esta invención está relacionada con el virus herpes canino (CHV), con nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican para glicoproteínas gB, gC y gD de CHV y con sus secuencias de aminoácido, vectores, tales como un poxvirus recombinante, por ejemplo, recombinantes de virus vaccinia y de virus avipox, que contienen gB, gC y/o gD de CHV que codifican o expresan el mismo, glicoproteínas procedentes del mismo, vacunas, composiciones inmunológicas o antigénicas procedentes del nucleótido (tales como vectores, por ejemplo, poxvirus recombinantes, por ejemplo, virus vaccinia o virus avipox recombinantes que contienen gB, gC y/o gD de CHV que codifican y expresan la(s) glicoproteína(s) procedente(s) del mismo), o de las glicoproteínas, por ejemplo, procedentes de la expresión de los nucleótidos en un sistema vector y con procedimientos que utilizan los nucleótidos, las glicoproteínas y las
composiciones.

En el siguiente texto se citan diversas publicaciones, proporcionándose una descripción completa de cada una de ellas en la sección titulada Referencias. Las publicaciones citadas a lo largo del texto son incorporadas el presente documento por medio de referencia.

Antecedentes de la invención

El virus herpes canino (CHV) provoca una enfermedad hemorrágica mortal en cachorros recién nacidos y una infección auto-limitativa, habitualmente subclínica, en el tracto respiratorio superior en los perros adultos (Appel, 1987). Se ha demostrado que diversas cepas y aislados de CHV pueden distinguirse los unos de los otros en base a diferencias en los patrones de rotura de la endonucleasa de restricción de sus DNAs (Xuan et al., 1990). No obstante, se sabe muy poco acerca de la estructura genómica del CHV. El genoma no ha sido mapeado y no se ha publicado ninguna secuencia de nucleótido. Además, si bien se han generado anticuerpos neutralizadores de CHV después de la inmunización de ratones con CHV (Xuan et al., 1991) o glicoproteínas de CHV purificadas (Limcumpao et al., 1991), los genes que codifican para las proteínas inmunológicamente pertinentes no han sido identificados.

Las glicoproteínas del virus herpes median en funciones víricas esenciales, tales como la unión y la penetración celular, la extensión célula a célula del virus y, muy importante, determinan el perfil de patogenicidad de la infección. Las glicoproteínas del virus herpes constituyen componentes críticos en la interacción con el sistema inmunitario huésped (Spear, 1985a; Spear 1985b). Las glicoproteínas del virus herpes son antígenos reconocidos tanto por el sistema humoral como por el celular y se ha demostrado que evocan respuestas inmunoprotectoras en huéspedes vacunados (Wachsman et al., 1987; Marchioli et al., 1987; Eberle et al., 1980; Papp-Vid et al., 1979).

Durante una infección por virus herpes, la mayor parte de la respuesta inmune va dirigida frente a las glicoproteínas de cobertura vírica. Se ha demostrado que estos antígenos provocan respuestas inmunes tanto humorales como celulares. Diversos informes han indicado que en otros sistemas de virus herpes, la inmunización con las glicoproteínas de los virus herpes gB, gC y/o gD puede inducir una respuesta inmunoprotectora.

Entre las bien caracterizadas glicoproteínas del virus herpes simplex se incluyen gB, gC, gD, gG, gH, gI, gJ, gK, gL y gM (Spear, 1985a; Spear 1985b; Ackermann et al., 1986; Frink et al., 1983; Frame et al., 1986; Longnecker et al., 1987; Richman et al., 1986; Swain et al., 1985; Zezulak, 1984; Roizman and Sears, 1990; Hutchinson et al., 1992a; Hutchinson et al., 1992b; Baines and Roizman, 1993). Un número de estudios ha indicado la importancia de las glicoproteínas del virus herpes simplex a la hora de provocar respuestas inmunes. Por lo tanto, se ha informado acerca de que gB y gD pueden generar respuestas inmunes importantes (Berman et al., 1983; Cantin et al. 1987, Cremer et al., 1985; Lasky et al., 1984; Martin et al., 1987a; Martin et al., 1987b, Paoletti et al., 1984; Perkus et al., 1985; Rooney et al., 1988; Wachsman et al., 1987; Zarling et al., 1986a; Zarling et al, 1986b). la gC puede estimular a los linfocitos citotóxicos restringidos de la clase I (Glorioso et al. 1985, Rosenthal et al., 1987), mientras que la gD puede estimular las respuestas de las células T citotóxicas de clase II; Martin et al., 1987a; Martin et al., 1987b; Wachsman et al., 1987; Zarling et al., 1986a; Zarling et al 1986b).Se demostró que la gG constituía un objetivo para la neutralización del virus dirigido a anticuerpo complemento-dependiente (Sullivan et al., 1987; Sullivan et al., 1988). Se ha demostrado que un determinado número de glicoproteínas procedente de otro virus herpes generaba importantes respuestas inmunes.

Ambos subtipos de virus herpes equino (Allen et al., 1986; Allen et al., 1986; expresan seis abundantes glicoproteínas (Allen et al 1986; Allen et al, 1987). Las partes genómicas de las secuencias de DNA que codifican para gp2, gp10, gp13, gp14, gp17/18 y gp21/22a han sido determinadas utilizando vectores de expresión gt11 lambda y anticuerpos monoclonales (Allen et al., 1987). Las glicoproteínas gp13 y gp14 estaban localizadas en las mismas ubicaciones dentro del componente L del genoma que los homólogos gC y gB, respectivamente, del mapa del virus herpes simplex (Allen et al, 1987). Las glicoproteínas de cobertura son los principales inmunógenos de los virus herpes involucrados en el desencadenamiento de respuestas inmunes de huéspedes humorales y celulares (Ben-Porat et al., 1986; Cantin et al., 1987; Glorioso et al., 1984; Wachsman et al., 1988; Wachsman et al., 1989) y por ello resultan del más elevado interés para aquellos que intentan diseñar vacunas.

Recientemente, se ha informado acerca de la secuencia de nucleótidos de la cepa Kentucky T431 de la unidad transcripcional EHV-1 que codifica para gp13 (Allen et al., 1988). Se demostró que la glicoproteína era homóloga a gC-1 y gC-2 del virus herpes simplex (HSV), a gIII del virus preudorrabia (PRV) y a gpV del virus de varicela-zoster (VZV) (Allen et al., 1988). Así pues, EHV-1 gp13 es la homóloga estructural de las glicoproteínas de tipo gC de virus herpes.

La secuencia de nucleótidos de EHV-1 gp14 (Whalley et al., 1989; Riggio et al., 1989) ha sido hecha pública recientemente. El análisis de la secuencia predicha de aminoácido de la proteína gp14 reveló una homología significativa con la correspondiente glicoproteína de HSV, gB.

Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a algunas glicoproteínas EHV-1 son neutralizadores (Sinclair et al., 1989). Experimentos de inmunización pasiva demostraron que los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a gp13 o gp14 (Shimizu et al., 1989) o frente a gp13, gp14 o gp17/18 (Stokes et al., 1989) podían proteger a hámsters frente a un desafío letal. En la protección frente a enfermedades provocadas por virus herpes alfa se ha involucrado también a otros análogos de glicoproteína gB y gC (Cantin et al., 1987; Cranage et al., 1986; Glorioso et al., 1984).

El virus pseudorrabia (PRV), un virus herpes alfa, es el agente causante de la enfermedad de Aujesky. El genoma de PRV consiste en un DNA de doble hebra de 90 x 10^{6} Dalton (Rubenstein et al., 1975), separada por secuencias de repetición invertidas en segmentos únicos largos (U_{L}) o segmentos únicos cortos (U_{S}) (Stevely, 1977; Ben-Porat et al., 1979). El genoma de PRV codifica para aproximadamente 100 polipéptidos cuya expresión es regulada en forma de cascada, de modo similar a otros virus herpes (Ben-Porat et al., 1985; Hampl et al., 1984).

La glicoproteína gp50 de PRV es el análogo gD de virus herpes simplex de tipo 1 (HSV-1) (Wathen et al., 1984). El marco de lectura abierta de DNA codifica para 402 aminoácidos (Petrovskis et al., 1986). La forma glicosilada madura (50-60 kDa) contiene carbohidrato unido a O sin glicosilación unida a N (Petrovskis et al., 1986). El suero porcino resulta altamente reactivo con gp50 de PRV, sugiriendo su importancia como inmunogen. Los anticuerpos monoclonales para gp50 neutralizan al PRV in vitro con o sin complemento (Wathen et al., 1984; Wathen 1985; Eloit et al., 1988) y protegen a los ratones de forma pasiva (Marchioli et al., 1988). Los recombinantes de virus vaccinia que expresan gp50 de PRV inducían anticuerpos neutralizadores de suero y protegían tanto a los ratones como a los cerdos frente al desafío letal de PRV (Kost et al., 1989; Marchioli et al., 1987; Ishii et al., 1988).

GIII de PRV es el análogo gC de HSV-1 (Robbins et al., 1986). La sustitución funcional de gIII de PRV por HSVgC no fue observada (Whealy et al., 1989). Si bien gIII de PRV no resulta esencial para replicación in vitro (Wathen et al., 1986; Robbins et al., 1986), la forma glicosilada madura (98 kDa) es un constituyente abundante de la cobertura de PRV. Los anticuerpos monoclonales anti-gpIII neutralizan el virus in vitro, con o sin complemento (Hampl et al., 1984; Eloit et al., 1988; Wathen et al., 1986) y pueden proteger a los ratones y los cerdos de forma pasiva (archioli et al., 1988). La glicoproteína gIII de PRV puede proteger a los ratones y a los cerdos frente a desafío letal de PRV después de inmunización con una proteína de fusión Cro/gIII expresada en E. coli (Robbins, A., R. Watson, L. Enquist, European Patent Application 0162738A1) o cuando es expresada en un recombinante vaccinia (Panicali, D., L. Gritz, G. Mazzara, European Patent Application 0261940A2).

La gpII de PRV es la homóloga gB de HSV-1 (Robbins et al., 1987). Se ha demostrado que anticuerpos monoclonales dirigidos frente a gpII de PRV neutralizan el virus in vitro (Ben-Porat et al., 1986), con o sin complemento (Wittmann et al., 1989). Además, estudios de inmunización pasiva demostraron que anticuerpos monoclonales neutralizadores protegían parcialmente a los cerdos (Marchioli et al., 1988). Se ha demostrado que la inmunización con recombinantes basados en NYVAC (virus vaccinia altamente atenuado) que expresan gII (gB) o gp50 (gD) de virus pseudorrabia (PRV) protegía a los cerdos frente al desafío con PRV virulento (Brockmeier et al., 1993). Además, se ha demostrado que recombinantes vaccinia que expresan gII y gp50 de PRV, o gII, gIII(gC) y gp50 provocan un nivel más elevado de protección que los recombinantes que expresan gII o gp50 en solitario, sugiriendo un potencial efecto de sinergia con estas glicoproteínas (Riviere et al., 1992).

El genoma del virus de tipo I de herpes simplex (HSVI) codifica para al menos once glicoproteínas antigénicamente diferentes: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL y gM (Roizman et al., 1990). Los ratones inmunizados con gB, gC o gD de HSV1 purificado están protegidos frente al desafío con HSV1 letal (Chan, 1983). Los ratones también han sido protegidos frente al desafío letal con HSV1 o HSV2 mediante inmunización pasiva con anticuerpos de virus HSV1 total (Davis et al., 1979) o HSV2 (Oakes et al., 1978) o con anticuerpos de las glicoproteínas gB, gC, gD o gE de HSV2 (Balachandran et al., 1982).

Se ha demostrado que vectores de virus vaccinia que expresan la gB de HSV1 (McLaughlin-Taylor et al., 1988) y la gC de HSV1 (Rosenthal et al., 1987) inducían respuestas de células T citotóxicas. Además, se ha demostrado que los ratones inmunizados con virus vaccinia recombinante que expresa o bien gB de HSV1 (Cantin et al., 1987), Gc de HSV1 (Weir et al., 1989) o gD de HSV1 (Paoletti et al., 1984) están protegidos frente a desafío letal con HSV1. Se ha demostrado que un virus vaccinia recombinante que expresa gD de HSV1 resultaba también protector frente a HSV2 en un sistema de modelo de cobayo (Wachsman et al., 1987).

El virus herpes bovino 1 (BHV1) específica más de 30 polipéptidos estructurales, once de los cuales son glicosilados (Misra et al., 1981). Tres de estas glicoproteínas, gI, gIII y gIV han sido caracterizadas y encontradas homólogas a las glicoproteínas gB, gC y gD del virus herpes simplex (HSV) (Lawrence et al., 1986; Zamb, 1987). Se ha demostrado que la inmunización con gI (gB), gIII (gC) y/o gIV (gD) del virus herpes bovino de tipo 1 purificado protege al ganado vacuno frente a desafío con BHV1/Pasteurella haemolytica (Babiuk et al., 1987).

Se ha demostrado que el virus herpes felino de tipo 1 (FHV-1) contiene al menos 23 proteínas diferentes (Meas et al., 1984; Fargeaud et al., 1984). De estos, al menos cinco son glicosilados (Fargeaud et al., 1984; Compton, 1989) con masas moleculares informadas que oscilan entre 120 kDa y 60 kDa. Se ha demostrado que las glicoproteínas FHV-1 eran inmunogénicas (Meas et al., 1984; Compton, 1989). Al igual que otros virus herpes alfa, el FHV-1 parece tener un homólogo de glicoproteína B (gB) de HSV-1 (Maeda et al., 1992). La glicoproteína gB de FHV-1 es un complejo de 134 kDa que es disociado con B-mercaptoetanol en dos glicoproteínas de 66 kDa y 60 kDa. El genoma del DNA de FHV-1 tiene un tamaño de aproximadamente 134 Kb (Rota et al., 1986).

El virus de Epstein Barr (EBV), un virus herpes B linfotrófico humano, es un miembro del genus de virus linfocito que pertenece a la subfamilia de virus herpes gamma (Roizman et al, 1990). Desde que el genoma de EBV fue completamente secuenciado (Baer et al., 1984) como los genomas de VZV (Davison et al., 1986), HSV1 (McGeoch et al., 1988), MCHV (Chee et al., 1990) y EHV1 (Telford et al., 1992) se han descrito numerosas homologías entre estos diferentes virus herpes (Kieff et al., 1990).

El citomegalovirus humano (HCMV) es un miembro de la subfamilia de virus herpes virinae beta (familia Herpesviridae). Se han descrito tres familias inmunológicamente diferentes de glicoproteínas asociadas con la cobertura de HCMV (Gretch et al., 1988): gCI (gp55 y gp93-130); gCII (gp47-52); y gCIII (gp85-p145). El gen que codifica para gCI es homólogo a gB de HSVI.

Además, se ha demostrado que la inmunización con un recombinante de poxvirus de ave de corral que expresa gB del virus de la enfermedad de Marek (MDV), protege frente a un desafío con MDV virulento (Nazarian et al.,
1992).

Los resultados de estos estudios indican que una respuesta inmune frente a glicoproteínas gB, gC y/o gD puede proteger a especies animales objetivo frente a desafío con virus herpes y que la provisión de nucleótidos para glicoproteínas gB, gC y gD de CHV constituye un avance valioso sobre el actual estado de la técnica, dado que el mismo permite la provisión de las glicoproteínas y composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna procedentes de los sistemas de vectores o de las glicoproteínas. Además, las glicoproteínas procedentes de la expresión de nucleótidos pueden ser utilizadas para generar anticuerpos que pueden ser adicionalmente utilizados en ensayos de diagnóstico de unión a anticuerpo, kits o pruebas para averiguar la presencia o la ausencia en una muestra, tal como sueros de la(s) glicoproteína(s) y, por consiguiente, la presencia o ausencia de CHV o de una respuesta inmune o antigénica (ya sea frente a CHV o frente a las glicoproteínas). Así pues, muchas utilidades se desprenden de la provisión de los nucleótidos para las glicoproteínas gB, gC y gC de CHV.

Para la expresión de DNA exógeno existen diversos sistemas de vectores, tales como los fagos, por ejemplo, los sistemas lambda y de E. Coli (Allen et al., 1987; Robbins, EPA 0162738A1; Panicali, EPA 0261940A2, cada uno de los cuales es expresamente incorporado en el presente documente mediante referencia).

Para la inserción y la expresión de genes extraños se han utilizado virus vaccinia y, más recientemente, otros poxvirus. La técnica básica para la inserción de genes extraños en poxvirus infecciosos vivos conlleva la recombinación entre secuencias de DNA de poxvirus que flanquean un elemento genético extraño en un plásmido donante y secuencias homólogas presentes en el poxvirus de rescate (Piccini et al., 1987).

Específicamente, los poxvirus recombinantes son construidos en dos pasos conocidos en el estado de la técnica y análogos a los procedimientos para crear recombinantes sintéticos de poxvirus tales como el virus vaccinia y el virus avipox, descritos en las patentes USA números 4.769.330, 4.772.848, 4.603.112, 5.100.587 y 5.179.993, las descripciones de las cuales son incorporadas por referencia al presente documento.

Primero, la secuencia de gen de DNA que tiene que ser insertada en el virus, particularmente un marco de lectura abierto procedente de una fuente no poxvirus, es colocada en una construcción de plásmido de E. Coli, en la cual ha sido insertado DNA homólogo a una sección de DNA del poxvirus. Separadamente, la secuencia del gen de DNA que tiene que ser insertada es ligada a un promotor. La unión promotor-gen está posicionada en la construcción de plásmido de tal forma que la unión promotor-gen está flanqueada en ambos extremos por DNA homólogo a una secuencia de DNA que flanquea una región de DNA de poxvirus que contiene un emplazamiento no esencial. La construcción de plásmido resultante es después amplificada mediante crecimiento dentro de bacterias de E. Coli (Clewell, 1972) y aislada (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1982).

Segundo, el plásmido aislado que contiene la secuencia del gen de DNA que tiene que ser insertada es transfectado a un cultivo celular, por ejemplo, fibroblastos de embrión de pollo, junto con el poxvirus. La recombinación entre el DNA de poxvirus homólogo en el plásmido y el genoma vírico respectivamente proporciona un poxvirus modificado por la presencia, en una región no esencial de su genoma, de secuencias de DNA extrañas. El término DNA "extraño" designa DNA exógeno, particularmente DNA procedente de una fuente no-poxvirus, que codifica para productos genéticos producidos ordinariamente por el genoma en el cual se coloca el DNA exógeno.

La recombinación genética es en general el intercambio de secciones homólogas de DNA entre dos hebras de DNA. En determinados virus, RNA puede sustituir al DNA. Las secciones homólogas de ácido nucleico son secciones de ácido nucleico (DNA o RNA) que tienen la misma secuencia de bases de nucleótido.

La recombinación genética puede tener lugar de forma natural durante la replicación o la fabricación de nuevos genomas víricos dentro de la célula huésped infectada. Por lo tanto, la recombinación genética entre genes víricos puede ocurrir durante el ciclo de replicación vírico que tiene lugar en la célula huésped que es co-infectada con dos o más virus diferentes u otras construcciones genéticas. Para la construcción de la sección del genoma de un segundo virus co-infectador, en el cual el DNA es homólogo con el del primer genoma vírico, se utiliza, de forma intercambiable, una sección de DNA procedente de un primer genoma.

No obstante, la recombinación puede tener también lugar entre secciones de DNA en genomas diferentes que no son perfectamente homólogas. Si una de las citadas secciones procede de un primer genoma homólogo con una sección de otro genoma, con la excepción de la presencia dentro de la primera sección de, por ejemplo, un marcador genético o un gen que codifica para un determinante antigénico insertado en una parte del DNA homólogo, la recombinación puede tener lugar todavía y los productos de la citada recombinación son después detectables por la presencia de ese marcador genético o gen en el genoma vírico recombinante. Recientemente, se ha informado acerca de estrategias adicionales para generar virus vaccinia recombinantes.

La expresión exitosa de la secuencia genética de DNA insertada por el virus infeccioso modificado requiere dos condiciones. Primero, la inserción tiene que producirse en una región no esencial del virus, con vistas a que el virus modificado permanezca viable. La segunda condición para la expresión de DNA insertado, es la presencia de un promotor en la relación propia con el DNA insertado. El promotor tiene que ser ubicado de tal forma que el mismo esté ubicado aguas arriba de la secuencia de DNA que tiene que ser expresada.

El virus vaccinia ha sido utilizado exitosamente para inmunizar frente a viruela, culminando en la erradicación mundial de la viruela humana en 1980. En el transcurso de su historia, han aparecido muchas cepas de vaccinia. Estas diferentes cepas demuestran una inmunogenicidad variante y están implicadas en grados variables con complicaciones potenciales, las más graves de las cuales son la encefalitis post-vaccinales y la vaccinia generalizada (Behbehani, 1983).

Con la erradicación de la viruela, un nuevo papel para vaccinia devino importante, el de ser un vector diseñado por ingeniería genética para la expresión de genes extraños. Genes que codifican para un gran número de antígenos heterólogos han sido expresados en vaccinia, dando lugar a menudo a una inmunidad protectora frente al desafío por parte del patógeno correspondiente (revisado en Tartaglia et al., 1990a).

Se ha demostrado que el antecedente genético del vector vaccinia afecta a la eficacia protectora del inmunogen extraño expresado. Por ejemplo, la expresión del gp340 del virus Epstein Barr (EBV) en la cepa de vacuna de Wyeth del virus vaccinia no protegía a los tamarines de cresta de algodón frente al linfoma inducido por el virus EBV, mientras que la expresión del mismo gen en la cepa de laboratorio WR del virus vaccinia resultaba protectora (Morgan et al., 1988).

Un equilibrio adecuado entre la eficacia y la seguridad de un candidato de vacuna recombinante, basado en virus vaccinia, resulta extremadamente importante. El virus recombinante tiene que presentar al(los) inmunogen(es) de tal forma que desencadene una respuesta inmune protectora en el animal vacunado, pero carezca de cualquier propiedad patogénica significativa. Por consiguiente, la atenuación de la cepa del vector constituiría un avance altamente deseable sobre el estado actual de la tecnología.

Se ha identificado un determinado número de genes vaccinia que no resultan esenciales para el crecimiento del virus en cultivo tisular y cuya supresión o inactivación reduce la virulencia en una diversidad de sistemas animales.

El gen que codifica para la timidita-quinasa (TK) del virus vaccinia ha sido mapeado (Hruby et al., 1982) y secuenciado (Hruby et al., 1983; Weir et al., 1983). La inactivación o la supresión completa del gen de timidina quinasa no evita el crecimiento de virus vaccinia en una amplia variedad de células en cultivo tisular. El virus vaccinia TK^{-} es también capaz de replicación in vivo en el punto de inoculación en una diversidad de huéspedes, a través de una variedad de rutas.

Para el virus de tipo 2 de herpes simplex se ha demostrado que la inoculación intravaginal de cobayos con virus TK^{-} se traducía en titulaciones de virus significativamente más bajas en le médula espinal que las generadas mediante la inoculación con virus TK^{+} (Stanberry et al., 1985). Se ha demostrado que el virus herpes que codificaba la actividad de TK in vitro no resultaba importante para el crecimiento del virus en células activamente metabolizadoras, pero resultaba necesario para el crecimiento del virus en células quiescentes (Jamieson et al., 1974).

Atenuación de vaccinia TK^{-} ha sido observada en ratones inoculados a través de las rutas intracerebral e intraperitoneal (Buller et al., 1985).La atenuación fue observada tanto para la cepa de laboratorio neurovirulenta WR como para la cepa de vacuna de Wyeth. En ratones inoculados a través de la ruta intradérmica, la vaccinia recombinante TK^{-} generaba anticuerpos neutralizantes anti-vaccinia, en comparación con el virus vaccinia TK^{+} parental, indicando que en este sistema de prueba la perdida de función TK no reduce la inmunogenicidad del vector virus vaccinia de forma significativa. Después de la inoculación intranasal de ratones con virus vaccinia recombinante TK^{-} y TK^{+} (cepa WR), se ha encontrado una significativa reducción en la diseminación de virus hacia otras ubicaciones, incluyendo el cerebro (Taylor et al., 1991a).

Otro enzima involucrado con el metabolismo de nucleótido es la ribonucleótido-reductasa. Se demostró que la pérdida de actividad de la ribonucleótido-reductasa codificada víricamente en virus herpes simplex (HSV), mediante supresión del gen que codifica para la subunidad grande, no tenía efecto sobre el crecimiento vírico y la síntesis de DNA en células que se dividen in vitro, pero comprometía gravemente la capacidad del virus de crecer sobre células privadas de suero (Goldstein et al., 1988). Utilizando un modelo de ratón para la infección por HSV aguda del ojo y una infección latente reactivable en el ganglio trigémido, se demostró la existencia de una reducción en la virulencia para el HSV privado de la subunidad grande de ribonucleótido-reductasa, en comparación con la virulencia mostrada por HSV de tipo natural (Jacobson et al., 1989).

Tanto las subunidades de ribonucleótido-reductasa pequeñas (Slabaugh et al., 1988) como las grandes (Schmitt et al., 1988) han sido identificadas en el virus vaccinia. La inactivación insercional de la subunidad grande de ribonucleótido-reductasa en la cepa WR de virus vaccinia conduce a la atenuación del virus, tal y como se mide a través de inoculación intracranial de ratones (Child et al., 1990).

El gen de hemaglutinina de virus vaccinia (HA) ha sido mapeado y secuenciado (Shida, 1986). El gen HA de virus vaccinia no resulta esencial para el crecimiento en cultivo tisular (Ichihashi et al., 1971). La inactivación del gen HA del virus vaccinia se traduce en una neurovirulencia reducida en conejos inoculados a través de la ruta intracranial y en lesiones más pequeñas en conejos en el sitio de inoculación intradérmica (Shida et al., 1988). La ubicación HA se utilizó para la inserción de genes extraños en la cepa WR (Shida et al., 1987), derivados de la cepa Lister (Shida et al., 1988) y la cepa Copenhagen (Guo et al., 1989) de virus vaccinia. Se ha demostrado que el virus vaccinia HA^{-} recombinante que expresa genes extraños es inmunogénico (Guo et al., 1989; Itamura et al., 1990; Shida et al., 1988; Shida et al., 1987) y protector frente al desafío por parte del patógeno relevante (Guo et al., 1989; Shida et al.,
1987).

El poxvirus vacuno (cepa roja Brighton) produce pústulas (hemorrágicas) rojas sobre la membrana corioalantoica de los huevos de gallina. Las supresiones espontáneas dentro del genoma poxvirus vacuno generan mutantes que producen pústulas blancas (Pickup et al., 1984). La función hemorrágica (u) traza el mapa hacia una proteína de 38 kDa codificada por un gen temprano (Pickup et al., 1986). Se ha demostrado que este gen, que guarda homología con inhibidores de serina-proteasa, inhibe la respuesta inflamatoria frente al poxvirus vacuno (Palumbo et al., 1989) y es un inhibidor de la coagulación sanguínea.

El gen u está presente en la cepa WR del virus vaccinia (Kotval et al., 1989b). Ratones inoculados con un virus vaccinia WR recombinante, en el que la región u ha sido inactivada mediante la inserción de un gen extraño, producen niveles más elevados de anticuerpo para el producto de gen extraño, en comparación con los ratones inoculados con un virus vaccinia recombinante similar en el que el gen u está intacto (Zhou et al., 1990). La región u está presente en una forma no funcional deficiente en cepa Copenhagen de virus vaccinia (marcos de lectura abierta B13 y B14, a través de la terminología publicada en Goebel et al., 1990a,b).

El poxvirus vacuno está localizado en células infectadas en cuerpos de inclusión citoplásmicos de tipo A (ATI) (Kato et al., 1959). Se considera que la función de ATI es la de protección de viriones de poxvirus vacuno durante la diseminación de animal a animal (Bergoin et al., 1971). La región ATI del genoma del poxvirus vacuno codifica para una proteína de 160 kDa que forma la matriz de los cuerpos ATI (Funahashi et al., 1988; Patel et al., 1987). El virus vaccinia, a pesar de que contiene una región homóloga en su genoma, no produce generalmente ATI. En la cepa WR de vaccinia, la región ATI del genoma es traducida como una proteína de 94 kDa (Patel et al., 1988). En la cepa Copenhagen del virus vaccinia, la mayor parte de las secuencias de DNA correspondientes a la región ATI han sido abandonadas, habiendo sido la terminación 3' restante de la región fusionada con secuencias aguas arriba de la región ATI para formar marcos de lectura abierta (ORF) A26L (Goebel et al., 1990a,b).

Se ha informado acerca de una diversidad de supresiones espontáneas (Altenburger et al., 1989; Drillien et al., 1981; Lai et al., 1989; Moss et al., 1981; Paez et al., 1985; Panicali et al., 1981) y obtenidas mediante ingeniería (Perkus et al., 1991); Perkus et al., 1989; Perkus et al., 1986), en las proximidades de la terminación izquierda del genoma del virus vaccinia. Se demostró que una cepa WR del virus vaccinia con una supresión espontánea de 10 kb (Moss et al., 1981; Panicali et al., 1981) resultaba atenuada mediante inoculación intracraneal en ratones (Buller et al., 1985). Más adelante, se demostró que esta supresión incluía 17 potenciales ORFs (Kotval et al., 1988b). Entre los genes específicos dentro de la región suprimida se incluye la viroquina N1L y una proteína de 35 kDa (C3L, mediante la terminología reportada por Goebel et al., 1990a,b). La inactivación insercional de N1L reduce la virulencia mediante inoculación intracraneal, tanto en ratones normales como en ratones atímicos (Kotwal et al., 1989a). La proteína de 35 kDa es secretada como N1L en el medio de las células infectado con virus vaccinia. La proteína contiene homología con la familia de proteínas control de complemento, particularmente con la proteína de unión 4B de complemento (C4bp) (Kotwal et al., 1988a). Al igual que la C4bp, la proteína de 35 kDa vaccinia se une al cuarto componente del complemento e inhibe las típicas cascadas de complemento (Kotwal et al., 1990). Por lo tanto, la proteína de 35kDa vaccinia parece estar involucrada en ayudar al virus a evadir los mecanismos de defensa del
huésped.

La terminación izquierda del genoma de vaccinia incluye dos genes que han sido identificados como genes de rango huésped, K1L (Gillard et al., 1986) y C7L (Perkus et al., 1990). La supresión de ambos genes reduce la capacidad del virus vaccinia de crecer en una diversidad de líneas celulares humanas (Perkus et al., 1990).

Dos sistemas adicionales de vector vacuna conllevan la utilización de poxvirus y de avipoxvirus de origen natural restringidos a huésped. Tanto el virus poxvirus de aves de corral (FPV) como el poxvirus del canario (CPV) han sido sometidos a ingeniería genética para que expresen los productos de genes extraños. El poxvirus de aves de corral (FPV) es el virus prototipo del género avipox de la familia de poxvirus. El virus provoca una enfermedad económicamente importante de las aves de corral, la cual ha sido bien controlada desde 1920 mediante la utilización de vacunas vivas atenuadas. La replicación de los virus avipox queda limitada a especies de aves (Matthews 1982b) y no se ha informado en la literatura acerca de virus avipox que provoquen una infección productiva en cualquier especie no aviar, incluyendo el hombre. Esta restricción de huésped proporciona una barrera de seguridad inherente para la transmisión del virus a otras especies y convierte el uso de vectores vacuna basados en virus avipox en aplicaciones veterinarias y humanas en una proporción atractiva.

El FPV ha sido utilizado con ventaja como vector de expresión de antígenos a partir de patógenos de aves de corral. La proteína hemaglutinina de un virus de gripe aviar virulento fue expresada como un FPV recombinante (Taylor et al., 1988a). Después de la inoculación del recombinante en gallinas y pavos, se indujo una respuesta inmune que resultaba protectora frente a o bien desafíos de virus de gripe virulentos homólogos o heterólogos (Taylor et al., 1988a). Los FPV recombinantes que expresan las glicoproteínas superficiales del virus de la enfermedad de Newcastle también han sido desarrollados (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990).

A pesar de la restricción de huésped para replicación de FPV y CPV en sistemas aviares, se averiguó que recombinantes derivados de estos virus expresaban proteínas extrínsecas en células de origen no aviar. Además, se demostró que los citados virus no recombinantes desencadenaban respuestas inmunológicas dirigidas hacia el producto gen de origen y, cuando resultaba adecuado, se demostró que proporcionaban protección frente al desafío del patógeno correspondiente (Tartaglia et al., 1993 a, b; Taylor et al., 1992; 1991b; 1988b).

Si bien se ha demostrado previamente que glicoproteínas de virus herpes canino purificadas por afinidad, cuando inyectadas en ratones, pueden desencadenar la producción de anticuerpos neutralizadores del virus (Limcumpao et al., 1991), hasta la fecha, no se han sugerido o descrito las secuencias de nucleótido y de aminoácido de las glicoproteínas gB, gC y gD de CHV, y la provisión de las citadas secuencias resultaría de gran valor. Nuevas vacunas, composiciones antigénicas o inmunológicas procedentes de los nucleótidos para las glicoproteínas gB, gC y gD de CHV (tales como las procedentes de sistemas vector que contienen los citados nucleótidos), al igual que de las propias glicoproteínas (cuando son expresadas a partir de sistemas de vectores que contienen los citados nucleótidos) no han sido descritas o sugeridas y, estos nucleótidos, sistemas vector, glicoproteínas y composiciones resultarían de gran
valor.

Objetivos y resumen de la invención

Constituye por tanto un objetivo de la invención el de proporcionar ácidos nucleicos que codifican para gB, gC y gD de CHV, en donde el ácido nucleico es seleccionado de entre el grupo que comprende:

a): ácidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleótido de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 11 y 18, en donde la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1 codifica para la glicoproteína gB del virus herpes canino, la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 11 codifica para la glicoproteína gC del virus herpes canino y la SEQ ID NO: 18 codifica para la glicoproteína gD del virus herpes canino;

b): ácidos nucleicos que codifican para la glicoproteína gB del virus herpes canino que tienen como secuencia de aminoácidos la SEQ ID NO: 2;

c): ácidos nucleicos que codifican para la glicoproteína gC del virus herpes canino que tienen como secuencia de aminoácido la SEQ ID NO: 12 ó 13; y

d): ácidos nucleicos que codifican para la glicoproteína gD del virus herpes canino que tienen como secuencia de aminoácido la SEQ ID NO: 19.

Constituye un nuevo objetivo de la invención el de proporcionar vectores que contienen nucleótidos o ácidos nucleicos aislados que codifican para gB, gC y/o gD de CHV.

Constituye un nuevo objetivo de la invención el de proporcionar glicoproteínas gB, gC y/o gD de CHV, especialmente las procedentes de la expresión de nucleótidos o ácidos nucleicos aislados, por consiguiente en un sistema vector.

Constituye un objetivo adicional de la invención el de proporcionar composiciones antigénicas, de vacuna o inmunológicas a partir de nucleótidos gB, gC y/o gD de CHV o ácidos nucleicos aislados o un vector que contiene los mismos o, procedentes de las propias glicoproteínas, tal como a través de la expresión a través del vector.

Constituye todavía otro objetivo de esta invención el de proporcionar virus recombinantes modificados, los cuales presentan una seguridad reforzada y proporcionar un procedimiento para la preparación de los citados virus recombinantes.

Constituye un objetivo adicional de esta invención el de proporcionar una composición antigénica de poxvirus recombinante, de vacuna o inmunológica, que tiene un nivel incrementado de seguridad, en comparación con composiciones inmunológicas, de vacuna o antigénicas de poxvirus recombinantes conocidas.

Constituye un nuevo objetivo de la invención el de proporcionar un vector modificado para la expresión de un producto gen en un huésped, en el que el vector es modificado a los efectos de que el mismo tenga una virulencia atenuada en el huésped.

Constituye otro objetivo de la invención el de proporcionar un procedimiento para la expresión de un producto gen, tal como una gB, gC y/o gD de CHV en una célula cultivada in vitro utilizando un virus recombinante modificado o un vector modificado que tiene un nivel de seguridad incrementado.

Estos y otros objetivos y ventajas de la presente invención resultarán más rápidamente aparentes tras la consideración de lo siguiente.

La presente invención conlleva la elucidación de los nucleótidos gB, gC y gD de CHV, glicoproteínas procedentes de los mismos y las composiciones inmunológicas, de vacuna o antigénicas que utilizan las secuencias de nucleótido y las glicoproteínas.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para la glicoproteína gB del virus herpes canino, en el que el ácido nucleico se ha definido anteriormente.

La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para la glicoproteína gC del virus herpes canino, en el que el ácido nucleico se ha definido anteriormente.

La presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para la glicoproteína gD del virus herpes canino, en el que el ácido nucleico se ha definido anteriormente.

Los nucleótidos son preferiblemente DNA. Los nucleótidos o los ácidos nucleicos aislados tienen preferiblemente las secuencias de DNA expuestas en las Figs. 1, 4 y 7.

La presente invención proporciona también la glicoproteína gB del virus herpes canino codificada por el ácido nucleico de la invención.

La presente invención proporciona también la glicoproteína gC del virus herpes canino codificada por el ácido nucleico de la invención.

La presente invención proporciona también la glicoproteína gD del virus herpes canino codificada por el ácido nucleico de la invención.

La presente invención proporciona además un vector que contiene el nucleótido o el ácido nucleico aislado para la gB, gC y/o gD del herpes de virus canino. Preferiblemente, el vector es un poxvirus recombinante, tal como un virus vaccinia recombinante o un virus avipox, más preferiblemente el virus vaccinia o el virus avipox es atenuado, tal como NYVAC, ALVAC o TROVAC.

Así pues, en un aspecto preferido, la presente invención está relacionada con un virus recombinante modificado, que tiene funciones genéticas codificadas por virus inactivadas, a los efectos de que el virus recombinante presente una virulencia atenuada y una seguridad reforzada. Las funciones pueden resultar no esenciales o estar asociadas con virulencia. El virus es ventajosamente un poxvirus, particularmente un virus vaccinia o un virus avipox, tal como un poxvirus de aves de corral y un poxvirus del canario. El virus recombinante modificado puede incluir, dentro de una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de DNA heteróloga que codifica para una proteína antigénica de CHV, por ejemplo, gC, gB y gD de CHV, o cualquier combinación de las mismas.

En todavía un nuevo aspecto preferido, la presente invención está relacionada con un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticas codificadas por virus no esenciales inactivadas en el mismo, a los efectos de que el virus presente una virulencia atenuada y en el que el virus recombinante modificado contiene además DNA procedente de una fuente heteróloga en una región no esencial del genoma del virus. El DNA puede codificar para una gB, gC y gD de CHV o una combinación de las mismas. En particular, las funciones genéticas son inactivadas por supresión de un marco de lectura abierta que codifica para un factor de virulencia o mediante la utilización de virus de origen natural de huésped restringido. El virus utilizado según la presente invención es ventajosamente un poxvirus, particularmente un virus vaccinia o un virus avipox, tal como un poxvirus de aves de corral y un poxvirus de canario. De forma ventajosa, el marco de lectura abierta es seleccionado de entre el grupo que comprende J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L e I4L (según la terminología utilizada en Goebel et al., 1990a,b); y las combinación de los mismos. En este sentido, el marco de lectura abierta comprende un gen timidita-quinasa, una región hemorrágica, una región de cuerpo de inclusión de tipo A, un gen hemaglutinina, una región de gen de gama huésped o una subunidad grande, ribonucleótido-reductasa; o la combinación de los mismos. La cepa Copenhagen modificada del virus vaccinia es identificada como NYVAC (Tartaglia et al., 1992).

La presente invención proporciona además todavía una composición inmunológica, de vacuna o antigénica para inducir una respuesta inmunológica o antigénica en un huésped, tal como un perro, que comprende un vector adecuado que contiene el(los) nucleótido(s) o el(los) acido(s) nucleico(s) aislado(s) para la gB, gC y/o gD del virus herpes canino y un soporte adecuado; o la(s) glicoproteína(s) gB, gC y/o gD del virus herpes canino, tal como a partir de la expresión de los mismos en un vector que contiene el(los) nucleótido(s) o el(los) ácido(s) nucleico(s) asociado(s), glicopro-
teína(s), composición(es).

Así pues, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de gB, gC y/o gD de virus herpes canino, que comprende la inserción del nucleótido(s) o del ácido(s) nucleico(s) asociado(s) para los mismos en un vector adecuado, el cultivo del vector, y la recogida de la glicoproteína procedente del vector. El vector puede ser un poxvirus, tal como vaccinia o un virus avipox, un fago tal como lambda, o E. Coli o cualquier otro virus adecuado o vector bacteriano. El cultivo puede efectuarse mediante infección de células susceptibles de infección vírica a través del vector virus o a través del cultivo de colonias del sistema de vector bacteriano, tales como procedimientos de caldo o de placa y la recogida puede ser efectuada mediante separación de la(s) glicoproteína(s) procedentes de las células infectadas por virus o de las células bacterianas.

Así pues, en un aspecto preferido, la presente invención está relacionada con un procedimiento para la expresión de un producto genético en una célula cultivada in vitro, mediante la introducción en la célula de un virus recombinante modificado que tiene una virulencia atenuada y una seguridad reforzada. El virus recombinante modificado puede incluir, dentro de una región no esencial, una secuencia de DNA heteróloga del genoma del virus, una secuencia de DNA heteróloga que codifica para una proteína antigénica, por ejemplo, gB, gC y gD de CHV o cualquiera de sus combinaciones.

De forma similar, la invención proporciona un procedimiento para inocular o para estimular una respuesta inmunológica o antigénica en un huésped, tal como perro frente a virus herpes canino, que comprende la administración de la composición inmunológica, de vacuna o antigénica al huésped, por ejemplo perro. Adicionalmente, la invención incluye un anticuerpo generado a través de la expresión del nucleótido(s) de la invención. El anticuerpo puede ser generado en un anticuerpo monoclonal a través de técnicas conocidas y el anticuerpo o el anticuerpo monoclonal pueden ser utilizados en un ensayo de diagnosis de unión, prueba o kit para determinar la presencia o ausencia de gB, gC y/o gD de CHV en una muestra, tal como suero y, por consiguiente, la presencia o ausencia de CHV o de un anticuerpo o respuesta inmune frente a CHV o frente a sus glicoproteínas.

Estas y otras realizaciones dentro de la presente invención se describen o resultan obvias a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los gráficos

La siguiente descripción detallada, proporcionada a título de ejemplo, no pretende limitar la invención exclusivamente a las realizaciones específicas descritas, puede ser comprendida mejor en conjunción con los gráficos que se acompañan, en los cuales:

La Fig. 1 muestra la secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácidos anticipada del homólogo gB de CHV (SEQ ID NOS:1, 2);

La Fig. 2 muestra el análisis de hidropaticidad del homólogo gB de CHV;

Las Figs. 3A y 3B muestran la homología de aminoácido de 8 homólogos gB (SEQ ID NOS: 3-10);

La Fig. 4 muestra la secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácidos anticipada del homólogo gC de CHV y ORF2 (SEQ ID NOS: 11-13);

La Fig. 5 muestra el análisis de hidropaticidad del homólogo gC de CHV;

La Fig. 6 muestra la homología de aminoácido de 4 homólogos gC (SEQ ID NOS: 14-17);

La Fig. 7 muestra la secuencia de nucleótidos del homólogo gD de CHV; (SEQ ID NOS: 18-20);

La Fig. 8 muestra el análisis de hidropaticidad del homólogo gD de CHV;

La Fig. 9 muestra la homología de aminoácido de 4 homólogos gD (SEQ ID. NOS: 20-23);

La Figura 10 muestra, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del plásmido pSD460 para la supresión del gen timidita-quinasa y la generación de virus vaccinia recombinante vP410.

La Figura 11 muestra, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del plásmido pSD486, para la supresión de la región hemorrágica y la generación de virus vaccinia recombinante vP553.

La Figura 12 muestra, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del plásmido pMP494\Delta para la supresión de la región ATI y la generación de virus vaccinia recombinante vP618.

La Figura 13 muestra, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del plásmido pSD467, para la supresión del gen hemaglutinina y la generación de virus vaccinia recombinante vP723.

La Figura 14 muestra, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del plásmido pMPCK1\Delta, para la supresión de la agrupación de genes [C7L-K1L] y la generación de virus vaccinia recombinante vP804.

La Figura 15 muestra, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del plásmido pSD548, para la supresión de subunidad grande, ribonucleótido-reductasa y la generación de virus vaccinia recombinante vP866 (NYVAC);

La Fig. 16 muestra, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del plásmido pRW842 para inserción del gen de la glicoproteína G de la rabia en el emplazamiento de supresión TK y la generación del virus vaccinia recombinante vP879;

La Fig. 17 muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO: 62) de un fragmento PvuII del poxvirus del canario, que contiene el ORF C5;

Las Figs. 18A y 18B muestran, de forma esquemática, un procedimiento para la construcción del poxvirus del canario recombinante vCP65 (ALVAC-RG);

La Fig. 19 muestra, de forma esquemática, los ORFs suprimidos para generar NYVAC;

La Fig. 20 muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO:72) de un fragmento de DNA TROVAC que contiene un ORF F8;

La Fig. 21 muestra la secuencia de DNA (SEQ ID NO: 75) de un fragmento de pares de base de DNA TROVAC que contiene el ORF F7;

Las Figs. 22A a 22D muestran gráficas de títulos de anticuerpos neutralizadores de rabia (RFFIT, IU/ml), el efecto estimulador de HDC y vCP65 (10^{5.5} TCID50) en voluntarios previamente inmunizados con o bien la misma vacuna o la vacuna alternativa (vacunas proporcionadas durante los días 0, 28 y 180, titulaciones de anticuerpo medidas durante los días 0, 7, 28, 35, 56, 173, 187 y 208);

La Fig. 23 muestra la secuencia de nucleótidos del gen gB de CHV promocionado por I3L contenido en pCHV37 y vCP320;

La Fig. 24 muestra la secuencia de nucleótidos de los brazos flanqueantes ALVAC C6;

La Fig. 25 muestra el análisis de inmunoprecipitación de células infectadas con vCP320 (Lisatos procedentes de células infectadas simuladamente marcadas con ^{35}S (calle A), células infectadas con ALVAC (calle B), células infectadas con vCP320 (calle C) y células infectadas con CHV (calle D) fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo monoclonal específico para gB, 1125B2 (obtenido en Rhone Merieux, Lyon, France), y resueltos sobre un gel SDS-poliacrilamida. Los estándares de peso molecular se resuelven en la calle E);

La Figura 26 muestra la secuencia de nucleótidos del gen gC de CHV promocionado por H6, contenido en pCHV40 y vCP322;

La Fig. 27 muestra el análisis de inmunoprecipitación de células infectadas con vCP322 (lisatos procedentes de células infectadas simuladamente marcadas con ^{35}S (calle A), células infectadas con ALVAC (calle B), células infectadas con vCP322 (calle C) y células infectadas con CHV (calle D) fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo monoclonal específico para gC de CHV, 2011A9 (obtenido en Rhone Merieux, Lyon, Francia) y resueltos sobre un gel de SDS-poliacrilamida. Los estándares de peso molecular se resuelven en la calle E);

La Fig. 28 muestra la secuencia de nucleótido del gen gD de CHV promocionado por H6, contenido en pCHV26 y vCP294; y

La Fig. 29 muestra el análisis de inmunoprecipitación de células infectadas con vCP294 (lisatos procedentes de células infectadas simuladamente marcadas con ^{35}S (calle A), células infectadas con ALVAC (calle B), células infectadas con vCP294 (calle C) y células infectadas con CHV (calle D) fueron inmunoprecipitados con un anticuerpo monoclonal específico para gD de CHV, 208D11 (obtenido en Rhone Merieux, Lyon, Francia) y resueltos sobre un gel de SDS-poliacrilamida. Los estándares de peso molecular se resuelven en la línea E.

Descripción detallada

Esta invención proporciona nucleótidos, tal y como se define en la reivindicación 1, que codifican para los genes gB, gC y gD de CHV. Estos genes codifican para polipéptidos de los aminoácidos 879, 459 y 345, respectivamente. La comparación de la secuencia anticipada de aminoácidos de estas glicoproteínas con las secuencias de aminoácido gB, gC y gD de otros virus herpes, indica que el CHV es un virus herpes alfa; una conclusión que concuerda con la clasificación previa de este virus según las propiedades biológicas. Este análisis reveló también que la homología entre los homólogos gB es superior a la homología entre los homólogos gC o gD, sugiriendo que las restricciones estructurales y funcionales sobre gB pueden ser superiores a las existentes sobre gC o sobre gD.

La alineación de polipéptidos gB, gC y gD homólogos reveló que la inmensa mayoría de restos cisteina están perfectamente conservados. Estos resultados sugieren que estos restos cristalinos, debido a su capacidad para formar enlaces disulfuro, resultan importantes a la hora de mantener la integridad estructural y funcional de las glicoproteínas gB, gC y gD. De hecho, en gD de HSV1, se ha demostrado que la cisteina 1 forma un enlace disulfuro con la cisteina 5, la cisteina 2 forma un enlace disulfuro con la cisteina 6 y la cisteina 3 forma un enlace disulfuro con la cisteina 4 (Long et al., 1992). Además, se ha demostrado que una mutación de cualquiera de estos restos ejerce un profundo efecto sobre la conformación, el procesado y la función de la glicoproteína resultante (Wilcox et al., 1988; Long et al., 1990). Por consiguiente, la conservación de los restos cisteina en las glicoproteínas de la invención puede tener también un significado estructural.

El elevado grado de homología entre los homólogos gC, gD y, en particular, gB, sugiere también que estas glicoproteínas desempeñan funciones comunes. De hecho, se ha demostrado que el homólogo de gB en BHV1 puede rescatar un virus PRV gB^{-}, indicando que estas 2 glicoproteínas resultan funcionalmente equivalentes (Kopp & Mettenleiter, 1992).

La alineación de las secuencias de aminoácido gB, gC y gD reveló también que los sitios de glicosilación unidos a N son conservados de alguna forma. Se considera que la glicosilación unida a N desempeña un papel en una diversidad de funciones, tales como el mantenimiento de la conformación proteínica y la protección frente a la degradación proteolítica. No obstante, el significado biológico de los carbohidratos unidos a N sobre glicoproteínas de virus herpes no está completamente entendido. Por ejemplo, se ha demostrado que el tratamiento con tunicamicina de células infectadas con HSV1 inhibe la producción de viriones infecciosos (Pizer et al., 1980). Además, se ha demostrado que el tratamiento con endoglicosidasa de viriones de HSV1 reduce la infectividad (Kuhn et al., 1988). Por otro lado, la glicosilación unida a N de gD de HSV1 no parece resultar absolutamente esencial, dado que la mutagénesis de los sitios de glicosilación de esta glicoproteína no afectan a la infectividad (Sodora et al., 1991). Por lo tanto, si bien los puntos de glicosilación sobre las glicoproteínas gB, gC y gD están relativamente bien conservados, la propia glicosilación de cada uno de estos polipéptidos puede resultar no absolutamente esencial.

El contenido G + C del virus herpes oscila entre el 33 y el 75% (Roizman, 1982). Se ha sugerido que esta variabilidad extensiva es debida a una propensión mutacional no selectiva basada en la presencia (o en la ausencia) de enzimas inducidos o codificados víricamente involucrados en el metabolismo de nucleótidos (Honess, 1984). Por ejemplo, el VZV y el virus herpes saimiri (HSV) presentan ambos un bajo contenido en G + C (46% y 46%, respectivamente) y codifican ambos para un enzima, la timidilato-sintetasa, el cual está involucrado en la síntesis de TTP (Davison & Scott, 1986, Honess et al., 1986). El HSV1, HCMV y EBV, por otro lado, presentan un contenido en G + C relativamente elevado (68%, 57% y 60%, respectivamente) y no parecen codificar para la timidilato-sintetasa (Honess et al., 1986). Se ha determinado, a través de análisis de densidad de DNA, que el CHV presenta el contenido en G+C más bajo de todos los virus herpes, el 33% (Plummer et al., 1969; Roizman, 1982); un valor que está en consonancia con el contenido en G+C relativamente bajo de los nucleótidos de la invención (29%). Sin pretender quedar vinculados por la teoría de que el CHV no codifica para un enzima involucrado en el metabolismo de nucleótido, a partir de la presente invención, el ORF localizado inmediatamente aguas abajo del gen gC de CHV, no es homólogo con la timidilato-sintetasa de VZV. Por consiguiente, si el CHV contiene un gen timidilato-sintetasa, el mismo no es encontrado en la misma ubicación genómica que el VZV.

Los cachorros recién nacidos expuestos a CHV mueren habitualmente sin formar anticuerpos neutralizadores específicos para CHV. Asimismo, los anticuerpos maternales o el tratamiento con suero inmune procedente de perros seropositivos puede proteger a los cachorros de una infección mortal con CHV (Carmichael, 1970). Por lo tanto, los anticuerpos neutralizadores del suero pueden proteger a los cachorros frente a la infección con CHV mortal. De forma similar, los anticuerpos neutralizadores del suero pueden proteger a los perros adultos frente a la infección del tracto respiratorio superior, subclínicamente auto-limitativo.

Se tiene conocimiento de que tres glicoproteínas de CHV, gp145/112, gp80 y gp47, generan anticuerpos neutralizadores de CHV (Xuan et al., 1991). Los genes que codifican para estas glicoproteínas no han sido identificados. Sin desear quedar vinculados por cualquier teoría, resulta no obstante posible que estos antígenos sean codificados por los genes gB, gC y gD de esta invención. Dado que diversos informes han indicado que una respuesta inmune frente a gB, gC y/gD puede proporcionar protección de animales de especies objetivo frente al desafío con virus herpes (Babiuk et al., 1987; Nazarian et al., 1992; Riviere et al., 1992; Brockmeier et al., 1993), los genes gB, gC y gD de CHV de esta invención proporcionan glicoproteínas CHV, composiciones vacuna o inmunológicas eficaces y procedimientos para su utilización.

En particular, los nucleótidos de esta invención pueden ser insertados en cualquier sistema vector para expresión. Por ejemplo, el(los) nucleótido(s) puede(n) ser insertado(s) en cualquier sistema vector bacteriano adecuado, tal como el sistema E. coli, utilizando procedimientos conocidos (ver, por ejemplo, Robbins, EPA 0162738A1; Panicali, EPA 0261940A2).

El(los) nucleótido(s) puede(n) ser insertado(s) en cualquier fago o sistema de vector vírico adecuado, tal como lambda, poxvirus, virus herpes (ver Roizman, patente USA nº. 4.769.331, incorporada en el presente documento como referencia), baculovirus, virus de la polio (ver Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991, incorporada al presente documento por referencia), y sistemas adenovirus (ver Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors", Seminars in Virology, (vol. 3), p 237-52, 1993; Ballay et al., EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65; Graham., Tibtech 8, 85-87, Abril 1990; Prevec et al., J. Gen. Virol. 70, 429-434, cada una de los cuales es incorporado al presente documento por referencia), utilizando procedimientos conocidos.

El sistema de vector preferido es un sistema de vector poxvirus, especialmente un sistema de virus vaccinia avipox, en el que la recombinación es como en las patentes USA nºs. 4.769.330, 4.772.848, 4.603.112, 5.100.587 y 5.179.993. No obstante, un sistema poxvirus atenuado resulta incluso más preferido.

Para desarrollar una nueva cepa de vacuna vaccinia, NYVAC (vP866), la cepa de vacuna Copenhagen de virus vaccinia fue modificada mediante la supresión de seis regiones no esenciales del genoma que codifican para factores conocidos o de potencial virulencia. Las supresiones secuenciales se detallan más adelante. La totalidad de designaciones de fragmentos de restricción vaccinia se basan en la terminología reportada en Goebel et al., 1990a,b.

Los lugares de supresión fueron diseñados como lugares de recepción para la inserción de genes extraños.

Las regiones suprimidas en NYVAC son listadas más adelante. Se listan también las abreviaciones y las designaciones de marco de lectura abierta para las regiones suprimidas (Goebel et al., 1990a,b) y la designación del recombinante vaccinia (vP) que contiene la totalidad de supresiones a través de la especificada supresión:

(1): gen timidina-quinasa (TK; J2R) vP410;

(2): región hemorrágica (u; B13R + B14R) vP553;

(3): región de cuerpo de inclusión de tipo A (ATI; A26L) vP618;

(4): gen hemaglutinina (HA, A56R) vP723;

(5): región de gen de rango huésped (C7L-K1L) vP804; y

(6): subunidad grande, ribonucleótido-reductasa (I4L) vP866 (NYVAC).

La NYVAC es una cepa de virus vaccinia obtenida por medio de ingeniería genética, que fue generada a través de la supresión específica de dieciocho marcos de lectura abierta que codifican para productos genéticos asociados con virulencia y rango huésped. La NYVAC resulta altamente atenuada mediante un número de criterios, que incluyen 1) virulencia reducida después de inoculación intracerebral en ratones recién nacidos, ii) inocuidad en ratones inmunodeprimidos, genética (nu^{+}/nu^{+}) o químicamente (ciclofosfamida), iii) fracaso en la obtención de infección diseminada en ratones inmunodeprimidos, iv) falta de induración significativa y de ulceración en piel de conejo, v) rápida liberación desde el punto de inoculación, y vi) competencia de replicación grandemente reducida en un número de líneas de células de cultivo tisular, incluyendo las de origen humano. Sin embargo, los vectores basados en NYVAC inducen excelentes respuestas frente a inmunógenos extrínsecos y proporcionan una inmunidad protectora.

TROVAC se refiere a un poxvirus de ave de corral atenuado que era un derivado aislado clonado en placa procedente de la cepa de vacuna FP-1 de poxvirus de ave de corral, licenciado para vacunación a pollitos de un día de edad. ALVAC s un vector basado en poxvirus del canario atenuado que era un derivado clonado en placa de la vacuna poxvirus del canario licenciada, Kanapox (Tartaglia et al., 1992). ALVAC tenía algunas propiedades generales que son coinciden con algunas de las propiedades generales de Kanapox. Se ha demostrado también que los virus recombinantes basados en ALVAC que expresan inmunógenos extrínsecos, resultan también eficaces como vectores vacuna (Tartaglia et al., 1993a,b). Este vector avipox está restringido a especies aviares para replicación productiva. En cultivos celulares humanos, la replicación del poxvirus del canario es abortada de forma temprana en el ciclo de replicación vírico, con anterioridad a la síntesis de DNA vírico. Sin embargo, cuando mediante ingeniería genética expresa inmunógenos extrínsecos, la expresión y el procesado auténtico son observados in vitro en células de mamífero, y la inoculación en numerosas especies de mamífero da lugar a respuestas inmunes de anticuerpo y celulares frente al inmunógeno extrínseco y proporciona protección frente a desafío con patógeno consanguíneo (Taylor et al., 1992; Taylor et al., 1991). Recientes ensayos clínicos en fase I, tanto en Europa como en USA, del recombinante poxvirus del canario/glicoproteína de la rabia (ALVAC-RG), han demostrado que la vacuna experimental resultaba bien tolerada e inducía niveles de protección de títulos de anticuerpo neutralizadores de virus de la rabia (Cadoz et al., 1992; Fries et al., 1992). Adicionalmente, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), derivadas de vacunados ALVAC-RG, mostraron niveles significativos de proliferación de linfocito cuando eran estimuladas con virus de rabia purificado (Fries et al., 1992).

NYVAC, ALVAC y TROVAC han sido también reconocidos como únicos entre los poxvirus, pro el hecho de que los Nacional Institutes of Health ("NHI") (US Public Health Service), Recombinant DNA Advisory Comité, el cual publica guías para la contención física de material genético, tales como virus y vectores, a saber, guías para procedimientos de seguridad para la utilización de los citados virus y vectores que están basados en la patogenicidad del virus o vector en particular, otorgó una reducción en el nivel de contención física: desde BSL2 hasta BSL1. Ningún otro poxvirus presentaba un nivel de contención física BSL1. Incluso la cepa Copenhagen del virus vaccinia -la vacuna de la viruela humana- presenta un nivel de contención física más elevado; es decir, BSL2. Por consiguiente, la técnica ha reconocido que NYVAC, ALVAC y TROVAC presentan una patogenicidad más baja que la de cualquier otro poxvirus.

En base claramente a los perfiles de atenuación de los vectores NYVAC, ALVAC y TROVAC y a su mostrada capacidad para generar tanto respuestas inmunológicas humorales como celulares (Tartaglia et al., 1993a,b; Taylor et al., 1992; Konishi et al., 1992), los citados virus recombinantes ofrecen una ventaja distinta sobre los virus recombinantes basados en vaccinia descritos anteriormente.

Después de cultivar las bacterias o las células infectantes con los virus recombinantes, la(s) glicoproteína(s) es(son) recogida(s) a través de técnicas conocidas, tales como la cromatografía (ver, Robbins, EPA 0162738A1; Panicali, EPA 0261940A2).

La(s) glicoproteína(s) recogida(s) puede(n) ser utilizada(s) en una composición de vacuna, antigénica o inmunológica, que contiene también un soporte adecuado. Por consiguiente, los nucleótidos inventivos resultan bastante útiles.

Alternativamente, el sistema de vector vírico, especialmente el sistema de vector poxvirus preferido, puede ser utilizado en una composición de vacuna, antigénica o inmunológica, que contiene también un soporte adecuado. El poxvirus recombinante CHV en la composición expresa la glicoproteína CHV in vivo, después de la administración o la inoculación.

La composición de vacuna antigénica o inmunológica de la invención (conteniendo ya sea glicoproteína(s) expresada(s) a partir de un sistema vector que contiene el(los) nucleótido(s) inventivo(s) o que contiene un sistema de vector adecuado, tal como el poxvirus recombinante CHV), es administrada a cachorros de la misma forma que los anticuerpos maternales o en inmunosuero procedente de perros seropositivos (Carmichael, 1970). A los perros seronegativos se les administra la composición de la misma forma que se administran otras composiciones de vacuna inmunológicas, antigénicas. Un experto en la tecnología veterinaria puede determinar las dosis a partir de esta descripción, sin necesidad de llevar a cabo una profunda investigación, tomando en consideración el hecho de que factores tales como la edad, el peso, la raza, el sexo y el estado de salud general del perro o del cachorro en particular.

Adicionalmente, el poxvirus recombinante inventivo y los productos de expresión procedentes del mismo estimulan una respuesta inmune o de anticuerpo en animales. A partir de estos anticuerpos, mediante técnicas que resultan bien conocidas, pueden prepararse anticuerpos monoclonales y, los anticuerpos monoclonales o los antígenos expresados a partir de los nucleótidos inventivos, pueden ser utilizados en ensayos de unión a anticuerpo bien conocidos, en kits de diagnóstico o en pruebas para determinar la presencia o la ausencia de antígeno(s) gD y/0 gB, gC de HCV particular(es)
o de anticuerpos frente a los mismos y, a partir de ello, la presencia o ausencia del virus o, para determinar si una respuesta inmune para el virus o antígeno(s) ha sido simplemente estimulada.

Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas producidas a través de células hibridoma. Un anticuerpo monoclonal reacciona con un determinante antigénico sencillo y proporciona una mayor especificidad que un anticuerpo derivado de suero convencional. Además, el cribado de un gran número de anticuerpos monoclonales hace posible seleccionar un anticuerpo individual con la deseada especificidad, avidez e isotipo. Las líneas de célula hibridoma proporcionan una fuente barata y constante de anticuerpos químicamente idénticos y preparaciones de los citados anticuerpos pueden ser estandarizadas fácilmente. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales son bien conocidos por parte de aquellos que tienen una práctica ordinaria en la técnica, por ejemplo, Koprowski, H. et al., patente USA nº. 4.196.265, concedida el 1 de abril de 1989, incorporada al presente documento a título de referencia.

Los usos de los anticuerpos monoclonales resultan conocidos. Uno de los citados usos es en procedimientos de diagnosis, por ejemplo, David, G. Y Green, H. Patente USA nº. 4.376.110, concedida el 8 de marzo de 1983, incorporada al el presente documento por referencia.

Los anticuerpos monoclonales han sido también utilizados para recuperar materiales a través de cromatografía de inmunoadsorción, por ejemplo, Milstein, C., 1980, Scientific American 243: 66, 70, incorporado al presente documento por referencia.

Adicionalmente, los nucleótidos inventivos pueden ser utilizados como sondas para determinar la presencia de DNA de CHV en muestras, al igual que en la generación de cebadores PCR para replicar o clonar DNA de CHV. Los procedimientos para utilizar DNA como sondas o para la preparación de cebadoras PCR son conocidos en el estado de la técnica.

Por lo tanto, los nucleótidos inventivos y los productos de expresión de los nucleótidos inventivos (y por tanto los nucleótidos) resultan bastante útiles.

Los siguientes Ejemplos no limitativos se proporcionan únicamente a título de ilustración y no tienen que ser considerados como una limitación de esta invención.

Ejemplos Procedimientos y materiales

Preparación de DNA de CHV genómico. CHV (obtenido de L. Carmichael, Cornell University) fue propagado sobre células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (ATCC CCL34). El DNA vírico fue aislado por medio de una metodología estándar (Tartaglia et al., 1990).

Hibridación de DNA. DNA genómico de CHV fue digerido con enzimas de restricción, hecho circular sobre geles y transferido a membranas Gene-Screen (New England Nuclear), bajo condiciones recomendadas por los fabricantes. Las hibridaciones fueron llevadas a cabo a 44ºC, 53ºC o 59ºC, en NaCl 1M, SDS 1% y sulfato dextrano 10%. La sonda de hibridación incluía un fragmento BamHI-XbaI de 1800 bp, que contiene un segmento interno del gen gB de virus herpes felino (FHV), un fragmento de BamHI-EcoRI de 950 bp, que contiene la terminación 3' del gen gC de FHV y un fragmento BamHI-HindIII de 970 bp, que contiene la terminación 3' del gen gD de FHV (Audonnet, resultados no publicados).

Clonado y secuenciado de DNA. Fragmentos genómicos de CHV fueron subclonados en pBluescriptSK (Stratagene). Se preparó y manipuló el DNA plásmido, utilizando técnicas estándar. El secuenciado de nucleótidos fue llevado a cabo sobre plantillas de plásmido de doble hebra, utilizando el enzima T7 modificado, Sequenqase (U.S. Biological Corporation) y de acuerdo con los protocolos estándar recomendados por el fabricante. Para obtener la secuencia inicial se utilizaron cebadores M13 directos e inversos y, para las reacciones subsiguientes, se utilizaron cebadores habituales, preparados con un sintetizador de oligonucleótidos Applied Biosystems 380B o un Biosearch 8700.

Análisis de secuencia de aminoácido y de DNA. Los análisis de las secuencias de aminoácido y de DNA fueron efectuados con paquetes de software PC/GENE (IntelliGenetics, Incorporated), ALIGN Plus (Scientific and Educational Software) e IBI-Pustell (International Biotechnologies, Incorporated). Las búsquedas de homología fueron llevadas a cabo sobre la base de datos SWISS_PROT (Release 20 o 23) (IntelliGenetics, Incorporated), utilizando el programa FASTA (Pearson & Lipman, 1988).

Síntesis y clonado de DNA. Los plásmidos fueron construidos, cribados y cultivados a través de procedimientos estándar (Maniatis et al., 1982; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Las endonucleasas de restricción fueron obtenidas en Bethesda Laboratoires, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; y Boehringer Manheim Biochemichals, Indianapolis, IN. El fragmento Klenow de E. Coli polimerasa fue obtenido en Boehringer Mannheim Biochemicals. La exonucleasa BAL-31 y la T4 DNA ligasa de fago fueron obtenidas en New England Biolabs. Los reactivos fueron utilizados según las especificaciones de los diversos suministradores.

Los oligodesoxirribonucleótidos sintéticos fueron preparados en un sintetizador Biosearch 8750 o Applied Biosystems 380B DNA, tal y como se ha mencionado anteriormente (Perkus et al., 1989). El secuenciado del DNA fue llevado a cabo a través del procedimiento de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al., 1977), utilizando Sequenasae (Tabor et al., 1987), tal y como se ha descrito anteriormente (Guo et al., 1989). La amplificación de DNA, por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR), para verificación de secuencia (Engelke et al., 1988) fue llevada a cabo utilizando cebadores oligonucleótido sintetizados según la práctica habitual y el kit Reagen de amplificación de DNA (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), en un Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler automatizado. El exceso de secuencias de DNA fue suprimido de los plásmidos a través de digestión con endonucleasa de restricción, seguido de digestión limitada mediante exonucleasa BAL-31 y mutagénesis (Mandecki, 1986), utilizando oligonucleótidos sintéticos.

Células, Virus y Transfección. Los orígenes y las condiciones de cultivo de la cepa Copenhague de virus vaccinia han sido descritos anteriormente (Guo et al., 1989). La generación de virus recombinante por medio de precombinación, hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y cribado para determinar la actividad de \beta-galactosidasa, son tal y como se ha descrito anteriormente (Piccini et al., 1987).

Los orígenes y las condiciones de cultivo de la cepa Copenhague de virus vaccinia y NYVAC han sido descritas previamente (Guo et al., 1989; Tartaglia et al., 1992). La generación de virus recombinante por medio de recombinación, hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y cribado para determinar la actividad de \beta-galactosidasa, son tal y como se ha descrito anteriormente (Panicalli et al., 1982; Perkus et al., 1989).

El poxvirus parental del canario (cepa Rentschler) es una cepa vaccinal para canarios. La cepa vacuna fue obtenida a partir de un aislado natural y atenuada a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito. Una semilla vírica master fue sometida a cuatro purificaciones de placa sucesivas, bajo agar y se amplificó un clon de placa a través de cinco pasos adicionales, después de lo cual se utilizó el virus stock como virus parental en las pruebas de recombinación in vitro. El aislado de poxvirus del canario purificado en placa se designa ALVAC.

La cepa de poxvirus de ave de corral (FPV) designada como FP-1 ha sido descrita anteriormente (Taylor et al., 1988a). Se trata de una cepa de vacuna atenuada que resulta de utilidad en la vacunación de pollitos de un día de edad. La cepa de virus parental Duvette fue obtenida en Francia como una escala de poxvirus de ave de corral procedente de un pollo. El virus fue atenuado mediante aproximadamente 50 pasos en serie en huevos embrionados de gallina, seguido de 25 pasos sobre células de fibroblasto de embrión de pollo. El virus fue sometido a cuatro purificaciones de placa sucesivas. Un aislado de placa fue amplificado adicionalmente en células CEF primarias y se estableció un virus stock, designado como TROVAC.

Los vectores víricos NYVAC, ALVAC y TROVAC y sus derivados fueron propagados, tal y como se ha descrito anteriormente (Piccini et al., 1987; Taylor et al., 1988a,b). Células Vero y fibroblastos de embrión de pollito (CEF) fueron propagados tal y como se ha descrito anteriormente (Taylor et al., 1988a,b).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Identificación y secuenciado del gen gB de CHV

La hibridación de DNA genómico de CHV, en condiciones de estringencia relativamente bajas, con una sonda radiomarcada que contiene los genes gD, gC y gB de virus herpes felino (FHV) (Audonnet, resultados no publicados) identificó una secuencia complementaria. Un fragmento XbaI de 6 kb que contiene esta secuencia fue clonado y se determinó la secuencia de nucleótidos de la región de hibridación. La secuencia del nucleótido que codifica para el gen gB de CHV se muestra en la Fig. 1, conjuntamente con la expresión de aminoácido anticipada (glicoproteína gB) a partir de los mismos. Las regiones transmembrana putativas y las potenciales secuencias señal de poliadenilación, TATA y CAAT están subrayadas. Los nucleótidos y los restos de aminoácido anticipados son numerados hacia la derecha de la secuencia.

Fue identificado un marco de lectura abierta (ORF), con inicio en la posición 201 y final en la posición 2840. El producto de traducción (anticipado) de este ORF tiene una longitud de 879 aminoácidos. La comparación de esta secuencia de aminoácidos con la base de datos SWISS-PROT (Release 20), reveló una homología significativa con la glicoproteína gB de numerosos virus herpes. Análisis adicionales revelaron que el producto del gen CHV (anticipado) era más homólogo con la glicoproteína gB de virus herpes alfa, tal como el tipo 1 de virus simplex de herpes (HSV1), que los virus herpes beta- o gamma, tales como el citomegalovirus (HCMV) o el virus Epstein-Barr (EBV) humanos. Estos análisis y los resultados de los mismos se muestran más adelante en la Tabla 1. Estos resultados indican que el CHV debe ser clasificado como un virus herpes alfa; una conclusión que está en consonancia con la clasificación anterior de este virus según las propiedades biológicas (Carmichael et al., 1965; Roizman, 1982).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Homología entre las secuencias de aminoácido anticipadas de 10 glicoproteínas gB de virus herpes

1

\vskip1.000000\baselineskip

Los valores en la Tabla 1 fueron obtenidos utilizando el programa ALIGN Plus y son expresados como porcentaje de homología. Se utilizó la secuencia completa de aminoácidos gB. Los parámetros de alineación fueron: penalidad por mal emparejamiento= 2, penalidad por espacio abierto= 4, penalidad por espacio ampliado= 1. Referencias: FHV (Maeda et al., 1992), EHV1 (Whalley et al., 1989), PRV (Robbins et al., 1987), BHV1 (Whitbeck et al., 1988), VZV (Keller et al., 1986), MDV (Ross et al., 1989), HSV1 (Bzik et al., 1984), HCMV (Kouzarides et al., 1987) y EBV (Pellet et al., 1985).

Ejemplo 2

Análisis de la secuencia de nucleótidos de gB de CHV

Las regiones no codificadoras 5' y 3' del gen gB de CHV contienen numerosos motivos de secuencia reguladora de RNA polimerasa II, tales como caja TATA, caja CAAT y secuencias señal de poliadenilación (Corden et al., 1980; Proudfoot & Brownlee, 1976) (Fig 1). Las secuencias de caja TATA potenciales están localizadas en las posiciones 34, 36, 119 y 148, aproximadamente a 165 bp, 160 bp, 80 bp, y 50 bp aguas arriba del codón de iniciación gB de CHV. Las secuencias de caja CAAT potenciales (ATTG) se encuentran en las posiciones 89, 97 y 165, aproximadamente 110 bp, 100 bp y 35 bp aguas arriba del codón de iniciación gB. Las secuencias señal de poliadenilación potenciales (AATAAA) se encuentran en las posiciones 2839 y 2961, aproximadamente a 0 y 120 bp aguas abajo del codón de terminación gB de CHV.

La secuencia de nucleótido que rodea el codón de iniciación ha demostrado afectar a la eficacia de la iniciación de la traducción (Kozac, 1986). En particular, se ha averiguado que la secuencia [A/G]NNATGG resultaba ser la más eficaz. Por tanto, en relación con las reglas de Kozak, la secuencia de nucleótidos que rodea el codón de iniciación gB de CHV (AGTATGT) resulta favorable en la posición -3, pero no en la posición +4 (Fig. 1). El hecho de que el gen gB de CHV no siga las reglas de Kozac no es inusual. Los genes gB de FHV (Maeda et al., 1992), PRV (Robbins et al., 1987), del virus de varicela-zoster (VZV) (Keller et al., 1986), del MDV (Ross et al., 1989) y del HSV1 (Bzik et al., 1984) contienen también una pirimidina en la posición +4.

Ejemplo 3

Análisis de la secuencia de aminoácido de gB de CHV anticipada

La secuencia de aminoácido deducida del homólogo gB de CHV es presentada en la Fig. 1. El análisis de hidropaticidad de esta secuencia de aminoácido se muestra en la Fig. 2. El perfil se obtuvo con el programa PC/GENE SOAP, utilizando el procedimiento de Kyte & Doolittle (1982) y un intervalo de 13 aminoácidos. El eje vertical representa la hidropaticidad relativa, en las que los valores positivos son hidrófobos y los valores negativos hidrófilos. El eje horizontal representa el número de aminoácidos del homólogo gB de CHV.

Los análisis de hidropaticidad de esta secuencia de aminoácidos revelaron la presencia de 2 picos hidrófobos destacados. El primer pico, localizado en el N terminal, sin pretender quedar vinculados por ninguna teoría, representa una secuencia señal potencial. Las secuencias señal N terminales inician el transporte a través de la membrana del retículo endoplásmico y pueden resultar críticas para la propia modificación post-traduccional y la dirección hacia las glicoproteínas (Blobel, 1980). Las secuencias señal varían en longitud entre aproximadamente 15 y 30 restos y comprenden habitualmente una región N-terminal básica, una región central hidrófoba y una región C-terminal relativamente polar, corta. Además, el punto de rotura está habitualmente en consonancia con la regla -3, -1, en la que el resto situado en la posición -1 es pequeño (Ala, Ser, Gly, Cys, Thr o Gln) y el resto situado en la posición -3 no es aromático (Phe, His, Tyr o Trp), cargado (Asp, Glu, Lys o Arg) o es grande y polar (Asn o Gln), y los restos situados entre -3 y +1 no son Pro (von Heijne, 1986). Si bien el análisis con PSIGNAL, un programa PC/GENE diseñado para detectar secuencias señal eucariotas, no identifica la terminación N terminal del gB de CHV como una secuencia señal potencial, esta región tiene elementos que están en consonancia con secuencias señal habituales; es decir un núcleo hidrófobo (restos 2-17) y una región C-terminal relativamente polar (Fig. 1). El hecho de que PSIGNAL no detecte una secuencia señal en la región N- terminal del gB de CHV no es único. Este algoritmo tampoco detecta una secuencia señal en la región N-terminal del homólogo gB de VZV.

El(los) segundo(s) pico(s) hidrófobo(s), muy amplio(s), (Fig. 2), con segmentos entre membrana anticipados entre los restos de aminoácido 725 - 741 y 746 - 750 y 766 - 772 (utilizando el procedimiento de Klein et al., (1985)), sin querer quedar vinculados por ninguna teoría, funciona como una región ancla de membrana. Se ha hipotizado en el sentido de que el dominio transmembrana de gB de HSV1, al igual que otros homólogos gB, atraviesa la membrana 3 veces (Pellet et al., 1985). El análisis de hidropaticidad de gB de CHV revela la presencia de al menos dos picos hidrófobos distintos. Por lo tanto, el gB de CHV y el gB de HSV1 tienen estructuras transmembrana similares.

La alineación de la secuencia de aminoácidos de gB de CHV con secuencias similares procedentes de otros virus herpes reveló una amplia homología a lo largo de la secuencia completa, con la excepción del N terminal, una región que rodea el punto de rotura putativo (ver más adelante) y una región próxima al C terminal. Las Figs. 3A y 3B muestran la homología de aminoácidos de 8 homólogos de gB. Las secuencias de aminoácido de los homólogos gB de EBV y HCMV, VZV, HSV1, PRV, EHV1, FHV y CHV (para referencias en relación con la procedencia de las secuencias, ver el texto de la Tabla 1, más adelante), fueron alineadas utilizando el programa PC/GENE CLUSTAL. Los espacios vacíos, indicados mediante línea discontinua, fueron introducidos para maximizar la homología. Los restos alineados que son idénticos en todas las 8 secuencias son indicados mediante el asterisco (*). Los restos alineados que son idénticos en la mayoría de secuencias son indicados mediante un período (.). Los restos cisteina conservados son marcados en cajas. Los puntos potenciales de glicosilación unida a N están sombreados. Los puntos de rotura proteolítica putativos están subrayados.

Esta alineación reveló también que la inmensa mayoría de restos cisteina están perfectamente conservados. Por ejemplo, el gB de CHV contiene 11 restos cisteina, 10 de los cuales están perfectamente conservados en todos los virus herpes alfa, beta y gamma. De hecho, el único resto cisteina en gB de CHV que no se ha conservado se localiza en las proximidades del N terminal y puede ser localizado en la secuencia señal putativa. Estos resultados muestran que las glicoproteínas gB presentan estructuras terciarias relativamente similares.

La alineación de las secuencias de aminoácido gB reveló también que los puntos de glicosilación unidos a N potenciales se encuentran relativamente bien conservados (Figs. 3A y 3B). Pueden añadirse oligosacáridos unidos a N a restos Asn que presentan la secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde X no es Pro (Bause, 1983). El gB de CHV contiene 13 sitios de glicosilación unidos a N. Tres de estos sitios, no obstante, están situados en el dominio citoplasmático putativo y, por consiguiente, pueden no estar glicosilados. La localización de los sitios de glicosilación unidos a N está relativamente bien conservada en la mayoría de glicoproteínas gB (Figs. 3A y 3B).

La glicoproteína gB de la mayoría de virus herpes resulta rota internamente durante la maduración, siendo mantenidos unidos los subsiguientes péptidos a través de enlaces disulfuro. El homólogo de gB de VZV (gpII), por ejemplo, es roto entre los restos Arg y Ser, proporcionando 2 glicoproteínas de aproximadamente 60 kd (Keller et al., 1986). Las glicoproteínas gB de FHV (Maeda et al., 1992), el virus herpes equino de tipo 1 (EHV1) (Whalley et al., 1989), el PRV (Robbins et al, 1987), el BHV1 (Whitbeck et al., 1988), el MDV (Ross et al., 1989) y el HCMV (Kouzarides et al., 1988) resultan también rotos. Además, una secuencia, Arg-X-Arg-Arg/Lys- -Ser/Ala, similar a la secuencia en el punto de rotura VZV, Arg-Thr-Arg-Arg- -Ser, se encuentra presente en virtualmente la misma localización en cada una de estas glicoproteínas gB. Por el contrario, esta secuencia no se encuentra en las glicoproteínas gB de HSV1 (Bzik et al., 1984) y EBV (Pellet et al., 1985), las cuales no resultan rotas. El significado de esta rotura es desconocido. No obstante, no parece resultar esencial para la replicación, in vitro, dado que cepas de BHV1 (Blewett & Misra, 1991) y HCMV (Spaete et al., 1990) que han sido mutadas en el sitio de rotura y, por tanto, codifican para una glicoproteína gB no rota, resultan todavía infecciosas. Sin querer quedar vinculados por la teoría de que el gB de CHV es rota internamente, proteolíticamente, la secuencia Arg-Lys-Arg-Arg- -Ser se encuentra presente en la misma localización en CHV que en VZV, FHV, EHV1, PRV, BHV1, NDV y HCMV.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4

Identificación y secuenciado del gen gC de CHV

Fragmentos genómicos de CHV fueron clonados al azar en pBlescriptSK. Se determinó la secuencia de nucleótido de las terminaciones de estos fragmentos y las secuencias anticipadas de aminoácidos de los potenciales marcos de lectura abierta fueron analizadas para determinar la homología frente a la base de datos de aminoácidos SWISS-PROT (Release 20). Utilizando esta metodología, se identificó un fragmento XbaI de 12 kb que codificaba para un ORF con homología para glicoproteínas gC de herpes de virus. La secuencia de nucleótidos de este ORF se presenta en la Fig. 4. La Fig. 4 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos anticipada del homólogo gC de CHV y ORF2. La región transmembrana putativa y las secuencias señal de poliadenilación y las TATA y CAAT potenciales se muestran subrayadas. Los nucleótidos y los restos de aminoácido anticipados son numerados hacia la derecha de la secuencia. El gen gC de CHV putativo empieza en la posición 201 y termina en la posición 1580. El producto de traducción anticipado es un aminoácido con una longitud de 459. La comparación de esta secuencia de aminoácido con la secuencia de las glicoproteínas gC procedentes de otros virus herpes es mostrada en la Tabla 2, que sigue, y reveló una amplia homología, indicando que este ORF codifica para el homólogo gC de CHV
(Tabla 2).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Homología entre las secuencias de aminoácido anticipadas de 9 glicoproteínas gC de virus herpes

2

Los valores en la Tabla 2 fueron obtenidos utilizando el programa ALIGN Plus y son expresados como porcentaje de homología. Se utilizó la secuencia completa de aminoácidos gC. Ver la Tabla 1 para los parámetros de alineación. Referencias: FHV (Audonnet, resultados no publicados), EHV1 (Allen & Coogle, 1988), EHV4 (Nicholson & Onions, 1990), PRV (Robbins et al., 1986), BHV1 (Fitzpatrick et al., 1989), VZV (Davison & Scott, 1986), MDV (Ihara et al., 1989) y HSV1 (McGeoch et al., 1988).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Análisis de la secuencia de nucleótidos gC de CHV

Las secuencias de caja TATA potenciales (TATA) se encuentran en las posiciones 22 y 81, aproximadamente a 180 bp y 120 bp aguas arriba del codón de iniciación gC de CHV (Fig. 4). Una secuencia adicional es encontrada en la posición 175. No obstante, debido a su proximidad con el codón de iniciación gC, esta secuencia puede no ser una secuencia caja TATA potencial. Las secuencias caja TATA potenciales (CAAT y ATTG) se encuentran en las posiciones 13, 59 y 119, aproximadamente 190 bp, 140 bp y 80 bp aguas arriba del codón de inicio de gC. Una secuencia señal de poliadenilación potencial (AATAAA) es encontrada en la posición 1744, aproximadamente 165 bp aguas debajo del codón de terminación gC de CHV y 45 bp dentro del ORF2 (ver más adelante). Otras potenciales secuencias tipo señal de poliadenilación son también encontradas en la región no codificadora gC 3'.

Al igual que con el gen gC de CHV, la secuencia de nucleótidos que rodea el codón de iniciación gC de CHV (AAAATGA) es favorable en relación con las reglas Kozak en la posición 3', pero no lo es en la posición +4 (Fig. 4). Los genes gC de FHV (Audonnet, resultados no publicados), de EHV1 (Allen & Coogle, 1988) y de VZV (Davison & Scott, 1986) contienen también un nucleótido desfavorable en la posición +4.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Análisis de la secuencia de aminoácidos anticipada de gC de CHV

La secuencia de aminoácidos deducida para el homólogo gC de CHV se presenta en la Fig. 4. La Fig. 5 muestra el análisis de hidropaticidad del homólogo gC de CHV. El perfil fue obtenido con el programa PC/GENE SOAP, utilizando el procedimiento de Kite & Doolittle (1982) y un intervalo de 13 aminoácidos. El eje vertical representa la hidropaticidad relativa, en la que los valores positivos son hidrófobos y los valores negativos son hidrófilos. El eje horizontal representa el número de aminoácidos del homólogo gC de CHV.

El análisis de hidropaticidad de la secuencia de aminoácidos gC de CHV anticipada reveló la presencia de 2 picos hidrófobos prominentes (Fig. 5). El primer pico, localizado en el N terminal, sin pretender quedar vinculados por la teoría, representa una secuencia señal potencial. Si bien el análisis con PSIGNAL no identifica la terminación N terminal de este polipéptido como secuencia señal potencial, esta región tiene una región N- terminal básica, un núcleo hidrófobo (restos 6-20) y una región C terminal relativamente polar (Fig. 4). El segundo pico hidrófobo, con un segmento entre membrana entre los restos 424-433 y 449-456 (utilizando el procedimiento de Klein et al. (1985)), sin pretender quedar vinculados por ninguna teoría, funciona como una región ancla de membrana. La Fig. 6 muestra la homología de aminoácidos de 4 homólogos gC. Las secuencias de aminoácido de los homólogos gC de CHV, FHV, EHV1 y HSV1 (para referencias, ver la Tabla 2), fueron alineadas utilizando el programa PC/GENE CLUSTAL. Los espacios vacíos, indicados mediante línea discontinua, fueron introducidos para maximizar la homología. Los restos alineados, idénticos en las 4 secuencias, son indicados mediante un asterisco (*). Los restos alineados que son idénticos en la mayoría de secuencias son indicados a través de un período (.). Los restos cisteina conservados están encajados. Los potenciales sitios de glicosilación unidos a N están sombreados.

La alineación de la secuencia de aminoácidos de gC de CHV con las secuencias homólogas procedentes de otros virus herpes mostró un moderado nivel de homología a través de la secuencia completa, con la excepción del N terminal (Fig. 6). Esta alineación reveló también que la mayoría de los restos cisteina están perfectamente conservados. Por ejemplo, el gC de CHV contiene 10 restos cisteina, 8 de los cuales están perfectamente conservados en la totalidad de virus herpes alfa. De hecho, los únicos restos cisteina en gC de CHV que no son conservados están localizados en la transmembrana putativa o en los dominios intracelulares. Estos resultados muestran que las glicoproteínas de gC presentan estructuras terciarias relativamente similares. La alineación con otras secuencias gC reveló también la conservación relativa de los potenciales sitios de glicosilación unidos a N.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7

Identificación y secuenciado de ORF2

El análisis de secuencia de nucleótidos de la región situada aguas abajo del gen gC de CHV reveló la presencia de un segundo ORF (Fig. 4). Este ORF (ORF2) comienza en la posición 1699 y termina en la posición 2226. El producto de traducción anticipado tiene una longitud de 175 aminoácidos. La Tabla 3, expuesta más adelante, que muestra la comparación de esta secuencia de aminoácidos con la base de datos SWISS-PROT (Release 23), revelaba una homología significativa con los ORFs localizados aguas debajo de los otros genes gC de virus herpes alfa. Los marcadores de homología para los homólogos de ORF2 muestran que en CHV, FHV, EHV1, virus herpes equino de tipo 4 (EHV4), MDV, virus herpes de pavo (HTV) y posiblemente en HSV1, el ORF localizado aguas abajo del gen gC representa una familia genética altamente divergente, pero evolucionariamente relacionada. Por el contrario, el ORF (gen 13) localizado en las proximidades del gen gC de VZV, no nuestra una homología significativa con ningunos de los restantes ORFs comparablemente posicionados. Además, el gen 13 está orientado sobre el genoma en la dirección opuesta en relación con la totalidad de genes de tipo ORF2 (Davison & Scott, 1986). Estos resultados están en consonancia con las funciones propuestas de las proteínas codificadas por estos 2 grupos de genes; el gen 13 de VZV codifica para una timidilato-sintetasa (Davison and Scott, 1986), mientras que el gen de tipo ORF2 HSV1 (UL45) codifica para una proteína virión putativa (Telford et al. 1992). Por lo tanto, los marcos de lectura abierta localizados en las proximidades del gen gC en CHV, FHV, EHV1, EHV4, MDV, HVT y posiblemente HSV1, codifican para proteínas que están estructural y funcionalmente relacionadas con la proteína codificada aguas abajo a del homólogo gC de VZV.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Homología entre las secuencias de aminoácido anticipadas de los ORFs localizados en posición adyacente a la del gen gC en 8 virus herpes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Los valores en la Tabla 3 fueron obtenidos utilizando los programas FASTA y RDF2 (Pearson & Lipman, 1988). Se utilizó un ktup de 1. Los valores entre paréntesis representan el número de desviaciones estándar entre el marcador FASTA y el promedio de marcadores obtenido a partir de 100 versiones aleatoriamente permutadas de la secuencia potencialmente relacionada. Referencias: FHV (Audonnet, resultados no publicados), EHV1 (Telford et al., 1992), EHV4 (Nicolson & Onions, 1990), MDV (Ihara et al., 1989), HTV (Kato et al., 1989), HSV1 (McGeoch et al., 1988) y VZV (Davison & Scott, 1986).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Análisis de la secuencia de nucleótido ORF2 de CHV

Secuencias de caja TATA potenciales (TATA) son encontradas en las posiciones 1604, 1606, 1635 y 1662, aproximadamente a 95, 93, 65 y 35 bp aguas arriba del codón de iniciación de ORF2 y aproximadamente a 24, 26, 55 y 80 bp aguas abajo del codón de terminación del gen gC (Fig. 4). Una secuencia de caja CAAT potencial (CAAT) es localizada en la posición 1584, aproximadamente a 115 bp aguas arriba del codón de iniciación. Las potenciales secuencias señal de poliadenilación (AATAAA) son encontradas en las posiciones superpuestas 2225, 2229, 2234 y 2238, aproximadamente a entre 0-15 bp aguas abajo del codón de terminación ORF2. La secuencia de nucleótidos que rodea al codón de iniciación ORF2 (AATATGG) es favorable en relación con las reglas de Kozak en las posiciones -3 y +4.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Identificación y secuenciado del gen gD del CHV

Utilizando la misma metodología que la que se utilizó para mapear el homólogo del gC de CHV, se identificó un fragmento PstI de 7 kb que codifica para un ORF con homología para las glicoproteínas del gD de virus herpes. La Fig. 7 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos anticipada del homólogo gD de CHV. La secuencia de señal putativa, la región transmembrana y las secuencias señal de poliadenilación potenciales están subrayadas. Los nucleótidos y los restos de aminoácido anticipados son numerados hacia la derecha de la secuencia. El gen gD de CHV empieza en la posición 201 y termina en la posición 1238. El producto de traducción (anticipado) tiene una longitud de 345 aminoácidos. La Tabla 4, mostrada más adelante, proporciona la comparación de esta secuencia de aminoácidos con la secuencia de otras glicoproteínas gD y reveló una homología extensiva, indicando que este ORF codifica para el homólogo gD de CHV.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Homología entre las secuencias de aminoácido anticipadas de 6 glicoproteínas de gD de virus herpes

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Los valores en la Tabla 4 fueron obtenidos utilizando el programa ALIGN Plus y son expresadas en forma de porcentaje de homología. Se utilizó la secuencia de aminoácido de gD completa. Ver la Tabla 1 para los parámetros de alineación. Referencias: FHV (Audonnet, resultados no publicados), EHV1 (Flowers et al., 1991), PRV (Petrovskis et al. 1986), BHV1 (Tikoo et al., 1990) y HSV1 (Lasky & Dowbenko, 1984).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Análisis de la secuencia de nucleótido de gD de CHV

No se detectaron secuencias TATA o CAAT/ATTG inmediatamente aguas arriba del gen gD de CHV (Fig. 7). No obstante, se encontraron numerosas secuencias potenciales de tipo caja TATA. Potenciales secuencias de señal de poliadenilación (AATAAA) fueron encontradas en las posiciones 1260 y 1287, aproximadamente 25 bp y 50 bp aguas abajo del codón de terminación gD de CHV. Al igual que los genes gC y gB de CHV, la secuencia de nucleótidos que rodea al codón de iniciación de gD de CHV (AAAATGA) es favorable en relación con las reglas de Kozak en la posición -3, pero no en la posición +4 (Fig. 7). Los genes gD de FHV (Audonnet, resultados no publicados), EHV1 (Audonnet et al., 1990; Flowers et al., 1991), PRV (Petrovskis et al., 1986) y BHV1 (Tikoo et al., 1990) contienen también un nucleótido no favorable en la posición +4.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Análisis de la secuencia de aminoácidos gD de CHV anticipada

La secuencia de aminoácidos deducida del homólogo gD de CHV es presentada en la Fig. 7. La Fig. 8 muestra el análisis de hidropaticidad del homólogo gD de CHV. El perfil fue obtenido con el programa PC/GENE SOAP, utilizando el procedimiento de Kyte & Doolitle (1982) y un intervalo de 11 aminoácidos. El eje vertical representa la hidropaticidad relativa, en el que los valores positivos son hidrófobos y los valores negativos hidrófilos. El eje horizontal representa el número de aminoácidos del homólogo gD de CHV.

El análisis de hidropaticidad de la secuencia de aminoácidos de gD CHV anticipada reveló la presencia de 2 picos hidrófobos prominentes (Fig. 8). El primer pico, localizado en el N terminal, sin pretender quedar vinculados por ninguna teoría, representa una secuencia señal potencial. De hecho, el PSIGNAL identificó un potencial sitio de rotura entre las posiciones 16 y 17. El segundo pico hidrófobo, con un segmento entre membrana anticipado, entre los restos 304-311 y 327-332 (utilizando el procedimiento de Klein et al., (1985)), sin pretender quedar vinculados por ninguna teoría, funciona como una región ancla de membrana.

La Fig. 9 muestra la homología de aminoácidos de 4 homólogos gD. Las secuencias de aminoácido de los homólogos gD de CHV, FHV, EHV1 y HSV1 (para referencias ver la Tabla 4), fueron alineadas utilizando el programa PC/GENE CLUSTAL. Espacios vacíos, indicados mediante una línea punteada, fueron introducidos para maximizar la homología. Los restos alineados que son idénticos en las 4 secuencias son indicados mediante un asterisco (*). Los restos alineados que son idénticos en la mayoría de secuencias son indicadas a través de un período (.). Los restos de cisteina conservados están incluidos en cajas. Los potenciales sitios de glicosilación unida a N están sombreados. La alineación de la secuencia de aminoácidos de gD de CHV, con secuencias homólogas procedentes de otros virus herpes, reveló un moderado nivel de homología a lo largo de toda la secuencia, con la excepción del N terminal (Fig. 9). Esta alineación reveló también que la vasta mayoría de restos cisteina están perfectamente conservados. Por ejemplo, el gD de CHV contiene 6 restos cisteina, la totalidad de los cuales están perfectamente conservados en la totalidad de virus herpes alfa. Estos resultados muestran que las glicoproteínas gD tienen estructuras terciarias relativamente similares. Esta alineación reveló también que los potenciales sitios de glicosilación unidos a N están bien conservados. Sin pretender quedar vinculados por ninguna teoría, en el sentido de que se utilizan sitios de glicosilación de gD de CHV, es sabido que se utilizan la totalidad de los potenciales sitios de glicosilación de gD de HSV1 (Sodora et al., 1991).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Organización genómica

Los genes gD, gC y gB no fueron mapeados en localizaciones específicas en el genoma de CHV. No obstante, los análisis de secuencia de nucleótidos de las regiones que flanquean estos genes, indican que la organización genómica de CHV es similar a la de otros virus herpes alfa. Por ejemplo, el ORF localizado inmediatamente aguas arriba del gen gB de CHV tiene homología con el gen 30 de VZV (Davison & Scott, 1986) y UL28 de HSV1 (McGeoch et al., 1988), los cuales están ambos localizados en esos virus. El ORF2, localizado inmediatamente aguas debajo del gen gC de CHV, tiene homología con los ORFs situados inmediatamente aguas abajo del homólogo de gC en FHV (Audonnet, resultados no publicados), EHV1 (Telford et al, 1992), EHV4 (Nicolson & Onions, 1990), HVT (Kato et al., 1988) y quizás HSV1 (McGeoch et al., 1988). Adicionalmente, el ORF localizado inmediatamente aguas abajo del gen gD de CHV tiene homología con el gen gI de EHV1 (Audonnet et al., 1990) y con el gen gp63 de PRV (Petrovskis, et al. 1986), los cuales están ambos localizados inmediatamente aguas abajo del homólogo gD de esos virus (datos no mostrados).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

Construcción de plásmido psD460 para supresión de gen de timidina-quinasa (J2R)

En referencia ahora a la Fig. 10, el plásmido pSD406b contiene vaccinia HindIII J (pos. 83359-88377) clonado en pUC8. El pSD406 fue cortado con HindIII y PvuII, y el fragmento de 1,7 kb procedente del lado izquierdo de HindIII J clonado en pUC8, cortado con HindIII/SmaI, formando pSD447. El pSD447 contiene el gen completo para J2R (pos. 83855-84385). El codón de iniciación está contenido dentro del un sitio NlaIII y el codón de terminación está contenido dentro del sitio SspI. La dirección de transcripción es indicada por medio de una flecha en la
Fig. 10.

Para obtener un brazo flanqueante izquierdo, se aisló un fragmento HindIII/EcoRI de 0,8 kb, a partir de pSD447, se digirió después con NlaIII y se aisló un fragmento HindIII/NlaIII de 0,5 kb. Los oligonucleótidos sintéticos anillados MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID NO: 24/SEQ ID NO: 25).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

500

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

fueron ligados con el fragmento HindIII/NlaIII de 0,5 kb en un vector pUC plásmido cortado con HindIII/EcoRI, generando el plásmido pSD449.

\newpage

Para obtener un fragmento de restricción que contiene un brazo flanqueante derecho de vaccinia y secuencias vector pUC, se cortó pSD447 con SspI (parcial) dentro de secuencias vaccinia y HindIII en la articulación pUC/vaccinia y se aisló un fragmento de vector de 2,9 kb. Este fragmento de vector fue ligado con oligonucleótidos sintéticos MPSYN45/MPSYN46 (SEQ ID NO: 26/SEQ ID NO: 27 anillados.

501

Para combinar los brazos flanqueantes izquierdo y derecho en un plásmido, un fragmento HindIII/SmaI de 0,5 kb fue aislado a partir de pSD449 y ligado con el plásmido vector pSD459 cortado con HindIII/SmaI, generando el plásmido pSD460. El pSD460 fue utilizado como plásmido donante para recombinación con la cepa Copenhagen de virus vaccinia parental de tipo natural VC-2. Una sonda marcada con ^{32}P fue sintetizada por medio de extensión con cebador utilizando MPSYN45 (SEQ ID NO. 26) como plantilla y el oligonucleótido complementario de 20 meros MPSYN47 (SEQ ID NO: 28) 5'-TTAGTTAATTAGGCGGCCGC-3', como cebador. El virus recombinante vP410 fue identidficado por medio de hibridación en placa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14

Construcción de plásmido pSD486 para supresión de la región hemorrágica (B13R + B14R)

En relación ahora con la Fig. 11, el plásmido pSD449 contiene vaccinia SalIG (pos. 160.744-173.351) clonado en pUC8. El pSD422 contiene el fragmento SalI de vaccinia contiguo al derecho, SalI (pos. 173.351-182.746) clonado en pUC8. Para construir un plásmido suprimido para la región hemorrágica, u, B13R-B14R (pos. 172.549-173.552), se utilizó pSD419 como fuente para el brazo flanqueante izquierdo y se utilizó pSD422 como fuente para el brazo flanqueante derecho. La dirección de transcripción para la región u es indicada por medio de una flecha en la Fig. 11.

Para eliminar secuencias no deseadas a partir de pSD449, las secuencias hacia la izquierda del sitio NcoI (pos. 172.253) fueron eliminadas por medio de digestión del pSD419 con NcoI/SmaI, seguido de terminación roma con fragmento Klenow de polimerasa de E. Coli y unión, generando el plásmido pSD476. Se obtuvo un brazo flanqueante derecho de vaccinia por medio de digestión de pSD422 con HpaI en el codón de terminación de B14R y a través de digestión con NruI 0,3 kb hacia la derecha. Este fragmento de 0,3 kb fue aislado y ligado con un fragmento de vector HincII de 3,4 kb aislado a partir de pSD476, generando el plásmido pSD477. La localización de la supresión parcial de la región u de vaccinia en pSD477 es indicada por medio de un triángulo. Las restantes secuencias de codificación B13R en pSD477 fueron eliminadas por medio de digestión con ClaI/HpaI, y el fragmento de vector resultante fue ligado con oligonucleótidos sintéticos anillados SD22mer/SD20mer (SEQ ID NO: 29/SEQ ID NO: 30).

502

Generando pSD479. El pSD479 contiene un codón de iniciación (subrayado) seguido por un sitio BamHI. Para colocar la E. Coli beta-galactosidasa en el locus de supresión B13-B14 (u), bajo el control del promotor u, un fragmento BamHI de 3,2 kb que contiene el gen de beta-galactosidasa (Dhapira et al., 1983) fue insertado en el sitio BamHI de pSD479, que genera pSD479BG. El pSD479BG fue utilizado como un plásmido donante para recombinación con virus vaccinia vP410. El virus vaccinia recombinante vP533 fue aislado como una placa azul en presencia de sustrato cromogénico X-gal. En el vP533 la región B13R-B14R es suprimida y sustituida por beta-galactosidasa.

Para eliminar las secuencias beta-galactosidasa de vP533, plásmido pSD486, se utilizó un derivado de pSD477 que contiene una región poli-unidora, pero no codón de iniciación en la articulación de supresión u. En primer lugar, el fragmento de vector ClaI/Hpal procedente de pSD477, mencionado anteriormente, fue unido con oligonucleótidos sintéticos anillados SD42mer/SD40mer /SEQ ID NO:31/SEQ ID NO: 32).

503

generando el plásmido pSD478. Seguidamente, el sitio EcoRI en la articulación pUC/vaccinia fue destruido a través de digestión de pSD478 con EcoRI seguido de terminación roma con fragmento Klenow de E. Coli polimerasa y unión, generando el plásmido pSD478E^{-}. El plásmido pSD478E^{-} fue digerido con BamHI y HpaI y unido a oligonucleótidos sintéticos anillados HEM5/HEM6 (SEQ ID NO: 33/ SEQ ID NO: 34)

504

generando el plásmido pSD486. El pSD486 fue utilizado como plásmido donante para recombinación con virus vP533 vaccinia recombinante, generando vP553, que fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

Ejemplo 15

Construcción de plásmido pMP494\Delta para la supresión de la región ATI (A26l)

En relación ahora con la Fig. 12, el pSD414 contiene SalI B clonado en pUC8. Para eliminar las secuencias de DNA no queridas hacia la izquierda de la región A26L, el pSD414 fue cortado con XbaI, dentro de secuencias vaccinia (pos. 137.079) y con HindI, en la articulación pUC/vaccinia y se redondeó la terminación con fragmento Klenow de E. Coli polimerasa y ligándose la misma, dando lugar al plásmido pSD483. Para eliminar las secuencias de DNA de vaccinia no queridas hacia la derecha de la región A26L, el pSD483 fue cortado con EcoRI (pos. 140.665 y en la articulación pUC/vaccinia) y ligado, formando el plásmido pSD484. Para eliminar la región de codificación A26L, el pSD484 fue cortado con NdeI (parcial) ligeramente aguas arriba del ORF A26L (pos. 139.004) y con HpaI (pos. 137.889), ligeramente aguas abajo del ORF A26L. El fragmento de vector de 5,2 kb fue aislado y ligado con oligonucleótidos sintéticos anillados ATI3/ATI4 (SEQ ID NO: 35/SEQ ID NO: 36).

505

506

Reconstruyendo la región aguas arriba de A26L y sustituyendo el ORF A26L por una región poli-unidora corta que contiene los sitios de restricción BglII, EcoRI y HpaI, tal y como se ha indicado anteriormente. El plásmido resultante fue diseñado como pSD485. Dado que los sitios BglII y EcoRI en la región de poli-unidora de pSD485 no es única, los sitios BglII y EcoRI fueron eliminados del plásmido pSD483 (descrito anteriormente), por medio de digestión con BglII (pos. 140.136) y con EcoRI en la articulación pUC/vaccinia, seguido de terminación roma con fragmento Klenow de E. Coli polimerasa y unión. El plásmido resultante fue designado como pSD489. El fragmento ClaI (pos. 137.198)/EcoR (pos. 139.048) de 1,8 kb, procedente de pSD489, que contiene el ORF A26L fue sustituido por el correspondiente fragmento ClaI/EcoRV que contiene poli-unidor de 0,7 kb, procedente de pSD485, generando pSD492. Los sitios BglII y EcoRI en la región de poli-unidora de pSD492 son únicos.

Una casette BglII de 3,3 kb que contiene el gen E. Coli de beta-galactosidasa (Shapira et al., 1983) bajo control del promotor vaccinia de 11 kDA (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990) fue insertado en el sitio BglII de pSD492, formando el pSD493 KBG. El plásmido pSD493 KBG fue utilizado en recombinación con rescate de virus vP553. El virus vaccinia recombinante, vP581, que contiene beta-galactosidasa en la región de supresión A26L, fue aislado como una placa azul en presencia de X-gal.

Para generar un plásmido para la eliminación de secuencias beta-galactosidasa procedentes de virus vaccinia recombinante vP581, la región poli-unidora de plásmido pSD492 fue suprimida por medio de mutagénesis (Mandecki, 1986), utilizando oligonucleótido sintético MPAYN177 (SEQ ID NO: 37) (5' AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTT
TATATAACTTATTTTTTGAATATAC 3'). En el plásmido resultante, pMP494\Delta, las posiciones que abarcan el DNA de vaccinia (137.889-138.937), incluyendo la A26L ORF completa es suprimida. La recombinación entre pMP494\Delta y la beta-galactosidasa que contiene vaccinia recombinante, vP581, dio lugar al mutante de supresión de vaccinia vP618, el cual fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16

Construcción de plásmido pSD467 para la supresión del gen hemaglutinina (A56R)

En relación ahora con la Fig. 13, el fragmento de restricción SalI G de vaccinia (pos. 160.744-173.351) cruza la articulación HindIII A/B (pos. 162.539). El PSD419 contiene SalI G de vaccinia clonado en pUC8. La dirección de transcripción para el gen de hemaglutinina (HA) es indicada mediante una flecha en la Fig. 13. Las secuencias de vaccinia derivadas de HindIII B fueron eliminadas por medio de digestión de pSD419 con HindIII dentro de las secuencias vaccinia y en la articulación pUC/vaccinia, seguido de unión. El plásmido resultante, pSD456, contiene el gen HA, A56R, flanqueado por 0,4 kb de secuencias de vaccinia hacia la izquierda y 0,4 kb de secuencias de vaccinia hacia la derecha. Las secuencias codificadores de A56R fueron eliminadas mediante corte de pSD456 con RsaI (parcial; pos. 161.090) aguas arriba de las secuencias codificadoras A56R, y con EagI (pos. 162.054) cerca de la terminación del gen. El fragmento vector RsaI/EagI de 3,6 kb procedente de pSD456 fue aislado y ligado con oligonucleótidos sintéticos anillados MPSYN59 (SEQ ID NO: 38), MPSYN62 (SEQ ID NO: 39), MPSYN (SEQ ID NO: 40) y MPSYN61 (SEQ ID NO: 41)

507

reconstruyendo las secuencias de DNA aguas arriba del ORF A56R y sustituyendo el ORF A56R por una región poli-unidora tal y como se ha indicado anteriormente. El plásmido resultante es pSD466. La supresión de vaccinia en pSD466 abarca las posiciones [161.185-162.053]. El sitio de la supresión en pSD466 es indicado por un triángulo en la Fig. 13.

Una casette BglII/BamHI (parcial) de 3,2 kb, conteniendo el gen beta-galactosidasa de E. Coli (Shapira et al., 1983) bajo control del promotor de vaccinia de 11 kDa (Bertholet et al., 1985; Guo et al., 1989), fue insertada en el sitio BglII de pSD466, formando pSD466KBG. El plásmido pSD466KBG fue utilizado en recombinación con virus vP618 rescatador. El virus vaccinia recombinante, vP708, que contiene beta-galactosidasa en la supresión A56R, fue aislado como una placa azul en la presencia de X-gal.

Las secuencias de beta-galactosidasa fueron suprimidas desde vP708, utilizando el plásmido donante pSD467. El pSD467 es idéntico a pSD466, con la excepción de que los sitios EcoRI, SmaI y BamHI fueron eliminados de la articulación pUC/vaccinia, por medio de digestión de pSD466 con EcoRI/BamHI, seguida de terminación roma con fragmento Klenow de E. Coli polimerasa y unión. La recombinación entre vP708 y pSD467 dió lugar a mutante de supresión vaccinia recombinante, vP723, el cual fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

Ejemplo 17

Construcción de plásmido pMPCSK1\Delta para supresión de marcos de lectura abierta [C7L-K1L]

Haciendo ahora referencia a la Fig. 14, se utilizaron los siguientes clones vaccinia en la construcción de
pMPCSK1\Delta. El pSD420 es SalI H clonado en PUC8. El pSD435 es KpnI F clonado en pUC18. El pSD435 fue cortado con SphI y relegado, formando pSD451. En pSD451, las secuencias de DNA hacia la izquierda del sitio SphI (pos. 27.416) en HindIII M, son eliminadas (Perkus et al., 1990). El pSD409 es HindIII M clonado en pUC8.

Para proporcionar un sustrato para la supresión de la agrupación del gen [C7L-K1L] procedente de vaccinia, la E. Coli beta-galactosidasa fue insertada en primer lugar en la ubicación de supresión M2L de vaccinia (Guo et al., 1990), tal como se indica a continuación. Para eliminar el sitio BglII en pSD409, el plásmido fue cortado con BglII en secuencias vaccinia (pos. 28.212) y con BamHI en la articulación pUC/vaccinia, después ligado para formar el plásmido pMP409B. El pMP409B fue cortado en el único sitio SphI (pos. 27.416). Las secuencias codificadoras M2L fueron eliminadas por medio de mutagénesis (Guo et al., 1990; Mandecki, 1986), utilizando oligonucleótido sintético

508

El plásmido resultante, pMP409D, contiene un único sitio BglII insertado en la ubicación de supresión M2L, tal y como se ha indicado anteriormente. Una casette BamHI (parcial)/BglII de 3,2 kb, conteniendo el gen beta-galactosidasa de E. Coli (Shapira et al., 1983) bajo control del promotor de 11 kDa (Bertholet et al., 1985), fue insertada en pMP409D cortado con BglII. El plásmido resultante, pMP409DBG (Guo et al., 1990), fue utilizado como plásmido donante para recombinación con virus vaccinia de rescate vP723. El virus vaccinia recombinante, vP784, que contiene la beta-galactosidasa insertada en la ubicación de supresión de M2L, fue aislado como una placa azul en presencia de X-gal.

Un plásmido suprimido para genes vaccinia [C7L-K1L] fue ensamblado en pUC8 cortado con SmaI, HindIII y las terminaciones se redondearon con fragmento Klenow de E. coli polimerasa. El brazo flanqueante izquierdo, que comprende secuencias HindIII C de vaccinia, fue obtenido por medio de digestión de pSD420 con XbaI (pos. 18.628), seguido de conversión roma con fragmento Klenow de E. Coli polimerasa y digestión con BglII (pos. 19.706). El brazo flanqueante derecho, que comprende secuencias HindIII K de vaccinia, fue obtenido por medio de digestión de pSD451 con BglII (pos. 29.062) y EcoRV (pos. 29.778). El plásmido resultante, pMP581CK, es suprimido en lo concerniente a secuencias vaccinia entre los sitios BglII (pos. 19.706) y HindIII C y el sitio BglII (pos. 29.062) en HindIII K. El sitio de la supresión de las secuencias vaccinia en el plásmido pMP581CK es indicado mediante un triángulo en la Fig. 14.

Para eliminar el exceso de DNA en la articulación de supresión de vaccinia, el plásmido pMP581CK fue cortado en los sitios NcoI dentro de las secuencias vaccinia (pos. 18.811, 19.655), tratado con exonucleasa Bal-31 y sometido a mutagénesis (Mandecki, 1986), utilizando oligonucleótido sintético MPSYN233 (SEQ ID NO: 43) TGT
CATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3. El plásmido resultante, pMPCSK1\Delta, es suprimido en lo concerniente a las posiciones de secuencia vaccinia 18.805-29.108, que abarcan 12 marcos de lectura abierta de vaccinia [C7L-K1L]. La recombinación entre pMPCSK1\Delta y el recombinante de vaccinia que contiene beta-galatosidasa, vP784, dió lugar al mutante resultante de la supresión de vaccinia, vP804, el cual fue aislado en forma de placa clara en presencia de X-gal.

Ejemplo 18

Construccion de plásmido pSD548 para supresión de la subunidad grande, ribonucleótido-reductasa (14L)

En referencia ahora a la Fig. 15, el plásmido pSD405 contiene vaccinia HindIII I (pos. 63.875-70.367) clonado en pUC8. El pSD405 fue digerido con EcoRV dentro de secuencias vaccinia (pos. 67.933) y con SmaI en la articulación pUC/vaccinia y ligado, formando el plásmido pSD518. El pSD518 fue utilizado como fuente de todos los fragmentos de restricción de vaccinia utilizados en la construcción de pSD548.

El gen 14L de vaccinia se extiende desde la posición 67.371 hasta la 65.059. La dirección de transcripción para 14L se indica por medio de una flecha en la Fig. 15. Para obtener un fragmento plásmido de vector suprimido en lo concerniente a una parte de las secuencias de codificación 14L, el pSD518 fue digerido con BamHI (pos. 65.381) y HpaI (pos. 67.001) y las terminaciones se redondearon utilizando fragmento Klenow de E. Coli polimerasa. Este fragmento de vector de 4,8 kb fue ligado con una casette SmaI de 3,2 kb que contiene el gen de E. Coli beta-galactosidasa (Shapira et al., 1985; Perkus et al., 1990), bajo control del promotor de 11 kDa vaccinia (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), dando lugar al plásmido pSD524KBG. El pSD524KBG fue utilizado como plásmido donante para la recombinación con virus vaccinia vP804. El virus vaccinia recombinante, vP855, que contiene beta-galatosidasa en una supresión parcial del gen 14L, fue aislado en forma de placa azul en presencia de X-gal.

Para suprimir la beta-galactosidasa y el remanente del ORF 14L de vP855, se construyó el plásmido de supresión pSD548. Los brazos flanqueantes izquierdo y derecho vaccinia fueron ensamblados separadamente en pUC8, tal y como se describe y presenta más adelante en la Fig. 15.

Para construir un vector plásmido que acepte el brazo flanqueante izquierdo de vaccinia, el pUC8 fue cortado con BamHI/EcoRI y ligado con oligonucleótidos sintéticos anillados 518A1/518A2 (SEQ ID NO:44/SEQ ID NO: 45)

509

510

formando el plásmido pSD531. El pSD531 fue cortado con RsaI (parcial) y BamHI y se aisló un fragmento de vector de 2,7 kb. El pSD518 fue cortado con BglII (pos. 64.459)/RsaI y se aisló un fragmento de 0,5 kb. Los dos fragmentos fueron ligados conjuntamente, formando el pSD537, el cual contiene la izquierda del brazo flanqueante vaccinia completo de las secuencias de codificación 14L.

Para construir un plásmido vector que acepte el brazo flanqueante vaccinia derecho, se cortó pUC8 con BamHI/
EcoRI y se ligó con los oligonucleótidos sintéticos anillados 518B1/518B2 (SEQ ID NO: 46/SEQ ID NO: 47)

511

formando el plásmido pSD532. El pSD532 fue cortado con RsaI (parcial)/EcoRI y se aisló un fragmento de vector de 2,7 kb. El pSD518 fue cortado con RsaI dentro de secuencias vaccinia (pos. 67.436) y EcoRI en la articulación pUC de vaccinia y se aisló un fragmento de 0,6 kb. Los dos fragmentos fueron ligados conjuntamente, formando pSD538, el cual contiene el brazo flanqueante de vaccinia completo, hacia la derecha de las secuencias de codificación 14L.

El brazo flanqueante de vaccinia derecho fue aislado como un fragmento EcoRI/BglII de 0,6 kb, procedente de pSD538 y ligado en un plásmido vector pSD537 cortado con EcoRI/BglII. En el plásmido resultante, pSD539, el ORF 14L (pos. 65.047-67.386) es sustituido por una región poli-unidora, la cual está flanqueada por DNA de vaccinia de 0,6 kb hacia la izquierda y DNA de vaccinia de 0,6 kb hacia la derecha, todo ello en un fondo pUC. El sitio de supresión dentro de secuencias vaccinia es indicado por un triangulo en la Fig. 15. Para evitar la posible recombinación de secuencias de beta-galactosidasa en la parte de pSD539 derivada de pUC con secuencias beta-galatosidasa en virus vaccinia recombinante vP855, la casette de supresión 14L de vaccina, fue trasladada de pSD539 a pRC11, un derivado pUC a partir del cual todas las secuencias beta-galactosidasa han sido eliminadas y sustituidas por una región poli-unidora (Colinas et al., 1990). El pSD539 fue cortado con EcoRI/PstI y se aisló el fragmento de 1,2 kb. Este fragmento fue ligado en pCR11, cortado con EcoRI/PstI (2,35 kb), formando pSD548. La recombinación entre pSD548 el recombinante vaccinia que contiene beta-galactosidasa, vP855, dió como resultado el mutante de supresión vaccinia vP866, el cual fue aislado como una placa clara en presencia de X-gal.

El DNA procedente de virus vaccinia recombinante vP866 fue analizado por medio de digeridos de restricción, seguido de electroforesis sobre gel de agarosa. Los patrones de restricción fueron los esperados. Las reacciones en cadena de polimerasa (PCR) (Engelke et al., 1988), utilizando vP866 como plantilla, y los cebadores que flanquean las seis localizaciones detalladas anteriormente, producían fragmentos de DNA de los tamaños esperados. Los análisis de secuencia de los fragmentos generados mediante PCR alrededor de áreas de las articulaciones de supresión confirmaron que las articulaciones eran las esperadas. El virus vaccinia recombinante vP866, que contiene las seis supresiones diseñadas por ingeniería genética, tal y como se ha descrito anteriormente, fue designado como la cepa de vacuna vaccinia "NYVAC".

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 19

Inserción de un gen de glicoproteína G de la rabia en NYVAC

El gen que codifica para la glicoproteína G de la rabia, bajo control del promotor H6 de vaccinia (Taylor et al., 1988a,b), fue insertado en el plásmido de supresión de TK, pSD513. El pSD513 es idéntico al plásmido pSD460 (Fig. 6), con la excepción de la presencia de una región poli-unidora.

En referencia ahora a la Fig. 16, la región poli-unidora fue insertada mediante el corte de pSD460 con SmaI y unión del vector plásmido con oligonucleótidos sintéticos anillados VQ1A/VQ1B (SEQ ID NO: 48/SEQ ID NO: 49)

512

para formar el vector plásmido pSD513. El pSD513 fue cortado con SmaI y ligado con una casette de 1,8 kb terminada en SmaI que contiene el gen que codifica para el gen G de la glicoproteína de la rabia, bajo control del promotor H6 de vaccinia (Taylor et al., 1988a,b). El plásmido resultante fue designado pRW842. El pRW842 fue utilizado como plásmido donante para recombinación con virus rescatador NYVAC (vP866). El virus vaccinia recombinante vP879 fue identificado por medio de hibridación en placa, utilizando una sonda de DNA marcada con ^{32}P para secuencias que codifican para glicoproteína G de la rabia.

Los virus recombinantes modificados de la presente invención proporcionan ventajas cuando se comparan con vectores de vacuna recombinantes. La virulencia atenuada del vector reduce de forma ventajosa la oportunidad de tener la posibilidad de una infección amplia, debido a la vacunación en el individuo vacunado y reduce también la transmisión desde individuos vacunados a individuos no vacunados o la contaminación del entorno.

Los virus recombinantes modificados son también utilizados de forma ventajosa en un procedimiento para expresar un producto genético en una célula cultivada in vitro, mediante la introducción en la célula del virus recombinante modificado que tiene el DNA extraño que codifica para y expresa productos genéticos en la célula.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 20

Construcción de TROVAC-NDV que expresa la fusión y glicoproteínas hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la enfermedad de Newcastle

Este ejemplo describe el desarrollo de TROVAC, un poxvirus de ave de corral y de un recombinante de virus de la enfermedad de Newcastle poxvirus de ave de corral, designado como TROVAC-NDV y su seguridad y eficacia. Se construyó un vector de poxvirus de ave de corral (FPV), que expresa tanto los genes F como los HN de la cepa Texas NDV virulenta. El recombinante producido fue designado como TROVAC-NDV. El TROVAC-NDV expresa glicoproteínas NDV auténticamente procesadas en células aviares infectadas con el virus recombinante y la inoculación de pollitos de un día de edad protege frente al desafío de NDV virulento subsiguiente.

Células y virus. La cepa Texas de NDV es una cepa velógena. La preparación de clones cDNA de los genes F y HN ha sido descrita previamente (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990). La cepa de FPV designada FP-1 ha sido descrita previamente (Taylor et al., 1988a). Es una cepa de vacuna que resulta de utilidad en la vacunación de pollos de un día de edad. La cepa Duvette de virus parental fue obtenida en Francia como costra de poxvirus de ave de corral, procedente de un pollo. El virus fue atenuado mediante aproximadamente 50 pasos en serie en huevos embrionados de gallina, seguido de 25 pases sobre células de fibroblasto de embrión de pollo. El virus fue sometido a cuatro purificaciones en placa sucesivas. Un aislado de placa fue amplificado nuevamente en células CEF primarias y se estableció un virus stock, designado como TROVAC. El virus stock utilizado en la prueba de recombinación in vitro para producir TROVAC-NDV había sido sometido a doce pasos en células CEF primarias, a partir del aislado de placa.

Construcción de una casette para NDV-F. Un fragmento BamHI de 1,8 kbp conteniendo la totalidad menos 22 de los nucleótidos desde el extremo 5' de la secuencia de codificación de proteínas, fue extraído de pNDV81 (Taylor et al., 1990) e insertado en el sitio BamHI de pUC18 para formar pCE13. El promotor H6 de virus vaccinia descrito previamente (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989) fue insertado en pCE13, mediante la digestión de pCE13 con SalI, rellenado de los extremos pegajosos con fragmento Klenow de E. Coli DNA polimerasa y digestión con HindIII. Un fragmento HindIII-EcoRV que contiene la secuencia de promotor H6 fue después insertado en pCE13 para formar pCE38. Un extremo 5' perfecto fue generado mediante la digestión de pCE38 con KpnI y NruI e inserción de los oligonucleótidos quinasados y anillados CE75 (SEQ ID NO: 50) y CE76 (SEQ ID NO: 51) para generar pCE47.

1000

Con vistas a eliminar la secuencia no codificadora a partir el extremo 3' del NDV-F, un fragmento SmaI a PstI procedente de pCE13 fue insertado en los sitios SmaI y PstI de pUC18 para formar pCE23. Las secuencias no codificadoras fueron eliminadas por medio de digestión secuencial de pCE23 con SacI, BamHI, Exonucleasa III, nucleasa SI y EcoRI. Los oligonucleótidos quinasados y anillados CE42 (SEQ ID NO: 52) y CE43 (SEQ ID NO: 53) fueron después insertados para formar pCE29.

1001

El extremo 3' de la secuencia NDV-F fue entonces insertado en el plásmido pCE20 que ya contiene el extremo 5' de NDV-F, por medio del clonado de un fragmento PstI-SacI procedente de pCE29 en los sitios PstI y SacI de pCE20 para formar pCE32. La generación de pCE20 ha sido descrita previamente en Taylor et al., 1990

Con vistas a alinear las secuencias del promotor H6 y de NDV-F5' contenidas en pCE47 con las secuencias 3' NDV-F contenidas en pCE32, un fragmento HindIII-PstI de pCE47 fue insertado en los sitios HindIII y PstI de pCE32 para formar pCE49. Las secuencias NDV-F promocionadas por H6 fueron después transferidas a la localización de-ORFed F8 (descrita más adelante), por medio del clonado de un fragmento HindIII-NruI de pCE49 en los sitios HindIII y SmaI de pJCA002 (descrita más adelante) para formar pCE54. Señales de detención de transcripción fueron insertadas en pCE54 a través de la digestión de pCE54 con SacI, digiriendo parcialmente con BamHI e insertando los oligonucleótidos quinasados y anillados CE166 (SEQ ID NO: 54) y CE167 (SEQ ID NO: 55) para generar pCE58.

1002

Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con pCE54 como plantilla y los oligonucleótidos CE182 (SEQ ID NO: 56) y CE183 (SEQ ID NO: 57) como cebadores se obtuvo una terminación 3' perfecta para NDV-F.

1003

El fragmento PCR fue digerido con PvuII y HpaI y clonado en pCE58 que había sido digerido con HpaI y digerido parcialmente con PvuII. El plásmido resultante fue designado pCE64. Señales de detención de transcripción fueron insertadas mediante clonado de un fragmento HindIII-HpaI, el cual contiene la secuencia de codificación completa para F y el promotor H6 procedente de pCE64, hacia los sitios HindIII y HpaI de pRW846, para generar pCE71, la casette final para NDV-F. El plásmido pRW846 es esencialmente equivalente al plásmido pJCA002 (descrito más adelante) pero conteniendo el promotor H6 y las señales de detención de traducción y transcripción. La digestión de pRW846 con HindIII y HpaI elimina el promotor H6 pero deja las señales de detención intactas.

Construcción de casette para NDV-HN. La construcción del plásmido pRW802 fue descrita previamente en Edbauer et al., 1990. Este plásmido contiene las secuencias NDV-HN unidas al extremo 3' del promotor H6 del virus vaccinia en un vector pUC9. Un fragmento HindIII-EcoRV que abarca el extremo 5' del promotor H6 del virus vaccinia fue insertado en los sitios HindIII y EcoRV de pRW802 para formar pRW830. Se obtuvo una terminación 3' perfecta para NDV-HN, mediante la inserción de oligonucleótidos quinasados y anillados CE162 (SEQ ID NO: 58) y CE163 (SEQ ID NO: 59) en el sitio EcoRI de pRW830 para formar pCE59, la casette final para NDV-HN.

1004

Construcción de vector de inserción FPV. El plásmido pRW731-15 contiene un fragmento PvuII-PvuII de 10 kb clonado a partir de DNA genómico. La secuencia de nucleótidos fue determinada en ambas hebras para un fragmento PvuII-EcoRV de 3660 bp. Los límites de un marco de lectura abierta designado aquí como F8 fueron determinados. El plásmido pRW761 es un subclon de pRW731-15 que contiene un fragmento EcoRV-EcoRV. El ORF F8 estaba enteramente contenido entre un sitio XbaI y un sitio SspI en pRW761. Con vistas a crear un plásmido de inserción que una vez recombinado con DNA genómico TROVAC eliminara el ORF F8, se siguieron los siguientes pasos. El plásmido pRW761 fue digerido completamente con XbaI y parcialmente digerido con SspI. Se aisló una banda Xba-SspI de 3700 bp a partir del gel y se ligó con los oligonucleótidos de doble hebra anillados JCA017 (SEQ ID NO: 60) y JCA018 (SEQ ID NO: 61).

1005

El plásmido resultante a partir de esta unión fue designado pJCA002.

Construcción de vector de inserción doble para NDV F y HN. La secuencia NDV-HN promocionada por H6 fue insertada en la casette NDV-F promocionada por H6, mediante clonado de un fragmento HindIII procedente de pCE59, que había sido rellenado con fragmento Klenow de E. coli polimerasa en el sitio HpaI de pCE71, para formar pCE80. El plásmido pCE80 fue completamente digerido con NdeI y parcialmente digerido con BglII, para generar un fragmento NdeI-BglII de 4760 bp que contiene los genes F y HN de NDV, ambos dirigidos por el promotor H6 y unidos a los brazos flanqueantes F8. El plásmido pJCA021 fue obtenido mediante la inserción de un fragmento PvuII-HindII de 4900 bp procedente de pRW731-15 a los sitios SmaI y HindII de pBSSK+. El plásmido pJCA021 fue después digerido con NdeI y BglII y ligado al fragmento NdeI-BglII de 4760 bp de pCE80, para formar pJCA024. Por lo tanto, el plásmido pJCA024 contiene los genes HN y F de NDV, insertados en orientación contraria con los extremos 3' adyacentes entre los brazos flanqueantes FPV. Ambos genes están unidos al promotor H6 del virus vaccinia. El brazo flanqueante derecho, adyacente a la secuencia NDV-F comprende la secuencia FPV de 2350 bp. El brazo flanqueante izquierdo, adyacente a la secuencia NDV-HN comprende 1.700 bp de la secuencia FPV.

Desarrollo de TROVAC-NDV. El plásmido pJCA024 fue transfectado en células CEH primarias infectadas con TROVAC, mediante la utilización del procedimiento de precipitación con fosfato cálcico descrito anteriormente (Panicalli et al., 1982; Piccini et al., 1987). Se seleccionaron placas positivas sobre la base de hibridación hacia sondas radiomarcadas por HN y NDV-F específicas y sometidas a cinco rondas secuenciales de purificación de placa hasta que se logró una población pura. Una placa representativa fue después amplificada y el recombinante TROVAC resultante fue designado como TROVAC-NDV (vFP96).

Inmunofluorescencia. Se llevó a cabo una inmunofluorescencia indirecta tal y como se ha descrito (Taylor et al., 1990), utilizando un suero anti-NDV policlonal y, como reactivos mono-específicos, sueros producidos en conejos frente a recombinantes de virus vaccinia que expresan NDV-F o NDV-HN.

Inmunoprecipitación. Se llevaron a cabo reacciones de inmunoprecipitación tal y como se ha descrito (Taylor et al., 1990), utilizando un suero anti-NDV policlonal obtenido en SPAFAS Inc., Storrs, CT.

El virus stock fue cribado por medio de hibridación en placa in situ, para confirmar que el ORF F8 se había suprimido. La inserción correcta de los genes NDV en el genoma TROVAC y la supresión del ORF F8 fue también confirmada mediante hibridación por método Southern.

En las células infectadas por NDV, la glicoproteína F está anclada en la membrana a través de una región transmembrana hidrófoba próxima al carboxilo terminal y requiere la rotura post-traduccional de un precursor, F_{0}, en dos polipéptidos F_{1} y F_{2} unidos por disulfuro. La rotura de F_{0} es importante a la hora de determinar la patogenicidad de una cepa NDV proporcionada (Homma and Ohuchi, 1973; Nagai et al., 1976; Nagai et al., 1980) y la secuencia de aminoácidos en el sitio de rotura resulta por tanto crítica a la hora de determinar la virulencia vírica. Se ha determinado que los aminoácidos en el sitio de rotura en la secuencia NDV-F insertados en FPV para formar vFP29 recombinante tenían la secuencia Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (SEQ ID NO: 42) (Taylor et al., 1990), la cual está de acuerdo con la secuencia acerca de la cual se ha averiguado constituía un requisito para las cepas NDV virulentas (chambers et al., 1986; Espion et al., 1987; Le et al., 1988; McGinnes and Morrison, 1986; Toyoda et al., 1987). La glicoproteína HN sintetizado en células infectadas con cepas virulentas de NDV es una glicoproteína no rota de 74 kDa. Cepas extremadamente avirulentas, tales como Ulster y Queensland codifican para un precursor HN (HNo), lo cual requiere rotura para activación (Garten et al., 1980).

La expresión de los genes F y HN en TROVAC-NDV fue analizada para confirmar que los productos genéticos eran procesados y presentados de forma auténtica. La inmunofluorescencia indirecta utilizando un suero de pollo anti-NDV policlonal confirmó que las proteínas inmunorreactivas se preparaban sobre la superficie de la célula infectada. Para determinar que ambas proteínas estaban presentes sobre la membrana de plasma, se prepararon sueros de conejo no-específicos frente a recombinantes vaccinia que expresaban o bien las glicoproteínas F o las HN. La inmunofluorescencia indirecta utilizando estos sueros confirmó la presentación superficial de ambas proteínas.

Se llevaron a cabo experimentos de inmunoprecipitación mediante la utilización de lisatos de células CEF infectadas con virus parentales y recombinantes, marcados con (^{35}S) metionina. Los valores esperados de los pesos moleculares aparentes de las formas glicosiladas de F_{1} y F_{2} eran 54,7 y 10,3 kDa, respectivamente (Chambers et al., 1986). En los experimentos de inmunoprecipitación utilizando suero anti-NDV policlonal, se detectaron productos específicos de fusión del tamaño adecuado, procedentes del recombinante sencillo de NDV-F, vFP29 (Taylor et al., 1990) y del recombinante doble de TROVAC-NDV vFP96. La glicoproteína HN de tamaño adecuado fue también detectada a partir del recombinante sencillo de NDV-HN, VFP-47 (Edbauer et al., 1990) y de TROVAC-NDV. No se detectaron productos específicos de NDV procedentes de células CEF no infectadas y de células CEF infectadas por TROVAC parentales.

En células CEF, las glicoproteínas F y HN son presentadas de forma apropiada sobre la superficie celular infectada, donde son reconocidas por suero inmune a NDV. Los análisis de inmunoprecipitación indicaban que la proteína F_{0} es rota automáticamente en los componentes F_{1} y F_{2}, requeridos en cepas virulentas. De forma similar, las glicoproteína HN fue procesada de forma auténtica en células CEF infectadas con TROVAC-NDV recombinante.

Informes previos (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990; Boursnell et al., 1990a,b,c; Ogawa et al., 1990) indicaban que la expresión de cualquiera de HN o F en solitario resultaba suficiente para generar inmunidad protectora frente a desafío NDV. El trabajo efectuado sobre otros paramixovirus ha indicado, no obstante, que, para lograr la inmunidad protectora completa, puede resultar necesaria la presencia de anticuerpo frente a ambas proteínas. Se ha demostrado que el virus SV5 podría extenderse en cultivos titulares en presencia de anticuerpo para glicoproteína HN, pero no para la glicoproteína F (Merz et al., 1980). Además, se ha sugerido que los fracasos en vacunas con vacunas de virus de sarampión destruido eran debidos a la inactivación del componente de fusión (Norrby et al., 1975). Dado que ambas glicoproteínas NDV han mostrado resultar sensibles a la hora de generar virus neutralizadores de anticuerpo (Avery et al., 1979) y que ambas glicoproteínas, cuando son expresadas de forma individual en un vector poxvirus de ave de corral, son capaces de inducir una respuesta inmunoprotectora, puede apreciarse el hecho de que la vacuna NDV más eficaz debería expresar ambas glicoproteínas.

Ejemplo 21

Construcción de recombinantes ALVAC que expresan glicoproteína G de virus de la rabia

Este ejemplo describe el desarrollo de ALVAC, un vector del poxvirus del canario canario y de un recombinante de poxvirus del canario-rabia designado como ALVAC-RG (vCP65) y con su seguridad y eficacia.

Células y virus. El poxvirus del canario parental (cepa Rentschler) es una cepa de virus vaccinal para canarios. La cepa de vacuna fue obtenida a partir de un aislado de tipo natural y atenuada a través de más de 200 pasos en serie sobre fibroblastos de embrión de pollito. Una semilla vírica master fue sometida a cuatro purificaciones en placa sucesivas bajo agar y un clon de placa fue amplificado a través de cinco pasos adicionales, después de lo cual el virus stock fue utilizado como virus parental en pruebas de recombinación in vitro. El aislado de poxvirus del canario es designado como ALVAC.

Construcción de un vector de inserción de poxvirus del canario. Un fragmento PvuII de poxvirus del canario de 880 bp fue clonado entre los sitios PvuII de pUC9, para formar pRW764.5. La secuencia de este fragmento es mostrada en la Fig. 17 (SEQ ID NO: 62) entre las posiciones 1372 y 2251. Los límites de un marco de lectura abierta, designado como C5 fueron definidos. Se determinó que el marco de lectura abierta se iniciaba en la posición 166 dentro del fragmento y terminaba en la posición 487. La supresión C5 fue efectuada sin interrupción de marcos de lectura abiertos. Las bases desde la posición 167 hasta la posición 455 fueron sustituidas por la secuencia (SEQ ID NO: 63) GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTT. Esta secuencia de sustitución contiene sitios de inserción HindI, SmaI y EcoRI, seguidos de terminaciones de traducción y de una señal de terminación de transcripción reconocida por virus vaccinia de RNA polimerasa (Yuen et al., 1987). La supresión del ORF C5 fue llevada a cabo tal y como se describe más adelante. El plásmido pRW764.5 fue cortado parcialmente con RsaI y el producto lineal aislado. El fragmento lineal de RsaI fue cortado de nuevo con BglII y el fragmento pRW764.5 ahora con una supresión RsaI a BglII, desde la posición 156 a la posición 462, aislado y utilizado como vector para los siguientes oligonucleótidos sintéticos: RW145 (SEQ ID NO: 64):

1006

Los oligonucleótidos RW145 y RW146 fueron anillados e insertados en pRW764.5 RsaI y el vector BglII descrito anteriormente. El plásmido resultante es designado como pRW831.

Construcción del vector de inserción que contiene el gen G de la rabia. La construcción de pRW838 es ilustrada más adelante. Los oligonucleótidos de A hasta E, que se superponen con el codón de iniciación de la traducción del promotor H6 con el ATG de la rabia, fueron clonados en pUC9 como pRW737. Los oligonucleótidos de A hasta E contienen el promotor H6, que empieza en NruI, hasta el sitio HindIII de la rabia G, seguido de BglII. Las secuencias de oligonucleótido de A hasta E ((SEQ ID NO: 66)-(SEQ ID NO. 70)) son:

5

El diagrama de oligonucleótidos anillados desde A hasta E es el siguiente:

6

Los oligonucleótidos comprendidos entre A y E fueron quinasados, anillados (95ºC durante 5 minutos, después enfriados a temperatura ambiente) e insertados entre sitios PvuII de pUC9. El plásmido resultante, pRW737, fue cortado con HindIII y BglII y utilizado como vector para el fragmento HindIII-BglII de 1,6 kbp de ptg155PRO (Kieny et al., 1984), generando pRW739. El sitio ptg155PROHindIII está situado 86 bp aguas abajo del codón de iniciación de traducción G de la rabia. El BglII está situado aguasabajo del codón de terminación de traducción G de la rabia en pgt155PRO. El pRW739 fue cortado parcialmente con NruI, cortado completamente con BglII y un fragmento NruI-BglII de 1,7 kbp, conteniendo la terminación 3' del promotor H6 descrito previamente (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989) a través del gen C completo de la rabia, fue insertado entre los sitios NruI y BamHI de pRW824. El plásmido resultante es designado como pRW832. La inserción en el pRW824 añadió el promotor H6 5' de NurI. La secuencia de pRW824 de BamHI seguida de SmaI es (SEQ ID NO: 71): GGATCCCCGGG. El pRW824 es un plásmido que contiene un gen no pertinente unido precisamente al promotor H6 del virus vaccinia. La digestión con NruI y con BamHI separaba completamente este gen no pertinente. El fragmento pRW832 SmaI de 1,8 kbp, que contiene G de la rabia promovido por H6, fue insertado en el SmaI de prW831, para formar el plasmado pRW838.

Desarrollo de ALVAC-RG. El plásmido pRW838 fue transfectado en células CEF primarias infectadas con ALVAC, mediante la utilización del procedimiento de precipitación con sulfato cálcico escrito anteriormente (Panicali et al., 1982, Piccini et al., 1987). Se seleccionaron placas positivas en base a hibridación hacia una sonda G de rabia específica y se sometieron a 6 rondas secuenciales de purificación de placa, hasta que se obtuvo una población pura. Una placa representativa fue ampliada después y el recombinante ALVAC resultante fue designado como ALVAC-RG(vCP65) (ver también las Figs. 18A y 18B). La inserción correcta del gen G de la rabia en el genoma ALVAC sin mutación subsiguiente fue confirmada mediante análisis de secuencia.

Inmunofluorescencia. Durante los estadios finales del ensamblaje de partícula de virus de la rabia maduras, el componente glicoproteína es transportado desde el aparato de golgi hasta la membrana plasmática, donde se acumula con el carboxi terminal que se extiende en el citoplasma y la masa de la proteína sobre la superficie externa de la membrana celular. Con vistas a confirmar que las glicoproteína de la rabia expresada en ALVAC-RG era presentada correctamente, la inmunofluorescencia fue llevada a cabo sobre células CEF primarias infectadas con ALVAC o con ALVAC-RG. La inmunofluorescencia fue llevada a cabo tal y como se ha descrito anteriormente (Taylor et al., 1990), utilizando un anticuerpo monoclonal G de la rabia. Se detectó una fuerte fluorescencia superficial sobre las células infectadas con ALVAC-RG, pero no con ALVAC parental.

Inmunoprecipitación. Monocapas preformadas de CEF primarias, Vero (una línea de células de riñón de mono verde africano, ATCC # CCL81) y células MRC-5 (una línea celular de tipo fibroblasto derivada de tejido de pulmón fetal humano normal, ATCC # CCL171) fueron inoculadas a razón de 10 pfu por célula con virus parental ALVAC y virus recombinante ALVAC-RG, en presencia de ^{35}S-metionina radiomarcada y tratadas como se ha descrito anteriormente (Taylor et al., 1990). Se llevaron a cabo reacciones de inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo monoclonal específico para G de la rabia. La expresión eficaz de una glicoproteína específica para la rabia con un peso molecular de aproximadamente 67 kDa fue detectada con el ALVAC-RG recombinante. No se detectaron productos específicos de rabia en células no infectadas o en células infectadas con el virus parental ALVAC.

Experimento de paso secuencia. En estudios llevados a cabo con virus ALVAC en una gama de especies no aviares, no se observó infección proliferativa o enfermedad evidente (Taylor et al., 1991b). No obstante, con vistas a establecer que ni el virus parental ni el virus recombinante podían ser adaptados para cultivo en células no aviares, se llevó a cabo un experimento de paso secuencial.

Los dos virus, ALVAC y ALVAC-RG, fueron inoculados en 10 pasos ciegos secuenciales en tres líneas celulares:

(1): células fibroblasto de embrión de pollito primarias (CEF), obtenidas a partir de embriones Leghorn blancos de 11 días de edad;

(2): células Vero- una línea continua de células de riñón de mono verde africano (ATCC # CCL81); y

(3): células MRC-5 - una línea celular diploide derivada de tejido de pulmón fetal humano (ATCC # CCL171).

La inoculación inicial fue llevada a cabo a una m.o.i. de 0,1 pfu por célula, utilizando tres platos de 60 mm de cada una de las líneas celulares que contienen 2 x 10^{6} células por plato. Un plato fue inoculado en presencia de 40 \mug/ml de citosina arabinósido (Ara C), un inhibidor de la replicación de DNA. Después de transcurrido un período de absorción de 1 hora a 37ºC, se extrajo el inoculum y se lavó la monocapa para eliminar el virus no absorbido. En este momento, el medio fue sustituido con 5 ml de EMEM + NBCS 2% sobre dos platos (muestras t0 y t7) y 5 ml de EMEM + NBCS 2%, conteniendo 40 \mug/ml de Ara C sobre el tercero (muestra t7A). La muestra t0 fue congelada a -70ºC para proporcionar una indicación del virus input residual. Las muestras t7 y t7A fueron incubadas a 37ºC durante 7 días, después de lo cual los contenidos fueron recogidos y las células interrumpidas por medio de sonicación indirecta.

Un ml de muestra t7 de cada una de las líneas celulares fue inoculado sin diluir sobre tres platos de la misma línea celular (para proporcionar las muestras t0, t7 y t7A) y sobre un plato de células CEF primarias. Las muestras t0, t7 y t7A fueron tratadas al igual que en el paso uno. La inoculación adicional sobre células CEF fue incluida con vistas a proporcionar un paso de amplificación para una detección más sensible del virus que pudiera estar presente en las células no aviares.

Este procedimiento fue repetido para 10 (CEF y MRC-5) u 8 (Vero) pasos de ciego secuenciales. Las muestras fueron después congeladas y descongeladas tres veces y sometidas a ensayo por titulación sobre monocapas de CEF primarias.

El rendimiento del virus en cada una de las muestras fue después determinado a través de titulación en placa sobre monocapas CEF, bajo agarosa. Los resultados resumidos del experimento se muestran en las Tablas 5 y 6.

Los resultados indican que tanto el ALVAC parental como el ALVAC-RG recombinante son capaces de replicación sostenida sobre monocapas CEF, sin pérdida de título. En células Vero, los niveles de virus caen por debajo del nivel de detección, después de dos pasos por ALVAC y un paso por ALVAC-RG. En células MRC-5, resultó evidente un resultado similar y no se detectó virus alguno después de un paso. Si bien los resultados para tan solo cuatro pasos se muestran en las Tablas 5 y 6, la serie continuó para 8 (Vero) y 10 (MRC-5) pasos, en ausencia de adaptación detectable de cualquier virus para crecimiento en células no aviares.

En el paso 1 estaban presentes niveles relativamente elevados de virus en la muestra t7 en las células MRC-5 y Vero. No obstante, este nivel de virus era equivalente al observado en la muestra t0 y en la muestra t7A incubadas en presencia de citosina arabinosido, en la que no tenía lugar replicación vírica. Esto demostró que los niveles de virus observados a los 7 días en células no aviares representaban virus residuales y no virus nuevamente
replicados.

Con vistas a convertir el ensayo en más sensible, una parte de la cosecha del día 7 procedente de cada una de las líneas celulares fue inoculada sobre una monocapa CEF permisiva y recogida con efecto citopático (CPE) o a los 7 días, si no resultaba evidente ningún efecto citopático. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 7. Incluso después de amplificación a través de línea celular permisiva, el virus fue tan solo detectado en células MRC-5 y en células Vero durante dos pasos adicionales. Estos resultados indican que, bajo las condiciones utilizadas, no había adaptación de ninguno de los virus al crecimiento en células Vero o MRC-5.

Inoculación de macacos. Cuatro macacos HIV seropositivos fueron inoculados inicialmente con ALVAC-RG, tal y como se describe en la Tabla 8. Transcurridos 100 días, estos animales fueron re-inoculados para determinar un efecto estimulador, y siete animales adicionales fueron inoculados con una gama de dosis. Se extrajo sangre a intervalos adecuados y se analizaron los sueros, después de inactivación con calor a 56ºC durante 30 minutos, para determinar la presencia de anticuerpo antirrabia, utilizando el Rapad Fluorescent Focus Inhibition Assay (Smith et al.,
1973).

Inoculación de chimpancés. Dos chimpancés machos adultos (en la banda de peso comprendida entre 50 y 65 kg) fueron inoculados intramuscularmente o subcutáneamente con 1 x 10^{7} pfu de vCP65. Los animales fueron monitorizados para determinar reacciones y se les extrajo sangre a intervalos regulares para ser analizada con vistas a determinar la presencia de anticuerpo antirrabia, con la prueba RFFI (Smith et al., 1743). Los animales fueron re-inoculados con una dosis equivalente 13 semanas después de la inoculación inicial.

Inoculación de ratones. Grupos de ratones fueron inoculados con entre 50 y 100 \mul de una gama de diluciones de diferentes lotes de vCP65. Los ratones fueron inoculados en la planta del pie. El día 14, los ratones fueron sometidos a desafío mediante inoculación intracraneal de entre 15 a 43 LD_{50} de ratón de la cepa CVS virulenta de virus de la rabia. La supervivencia de los ratones fue monitorizada y se calculó una dosis protectora del 50% (PD_{50}) a los 28 días de la post-inoculación.

Inoculación de perros y gatos. Diez perros beagle, de 5 meses de edad y 10 gatos, de cuatro mese de edad, fueron inoculados subcutáneamente con o bien 6,7 ó 7,7 log_{10} TCID_{50} de ALVAC-RG. Cuatro perros y cuatro gatos no fueron inoculados. Se extrajo sangre de los animales a los 14 y a los 28 días subsiguientes a la inoculación y se valoró el anticuerpo antirrabia en una prueba RFFI. Los animales que habían recibido 6,7 log_{10} TCID_{50} de ALVAC-RG fueron sometidos a desafío a los 29 días posteriores a la vacunación, con 3,7 log_{10} de LD_{50} de ratón (perros) o 4,3 log_{10} LD_{50} de ratón (gatos) de la cepa de desafío de virus de la rabia NYGS.

Inoculación de monos ardilla. Tres grupos de cuatro monos ardilla (Saimiri sciureus) fueron inoculados con uno de tres virus (a) ALVAC, el poxvirus del canario parental, (b) ALVAC-RG, el recombinante que expresa la glicoproteína G de la rabia o (c) vCP37, un recombinante poxvirus del canario que expresa la glicoproteína de cobertura de virus leucemia felino. Las inoculaciones fueron llevadas a cabo bajo anestesia con ketamina. Cada uno de los animales recibió al mismo tiempo: (1) 20 \mul instilados sobre la superficie del ojo derecho, sin cicatrización; (2) 100 \mul en forma de varias gotitas en la boca; (3) 100 \mul en cada uno de los dos sitios de inyección intradérmica en la piel afeitada de la cara externa del brazo derecho; y (4) 100 \mul en el músculo anterior del muslo
derecho.

Cuatro monos fueron inoculados con cada uno de los virus, dos con un total de 5,0 log_{10} pfu. Se extrajo sangre de los animales a intervalos regulares y se analizaron los sueros para determinar la presencia de anticuerpo antirrabia, utilizando una prueba RFFI (Smith et al., 1973). Los animales fueron monitorizados diariamente para detectar reacciones frente a la vacunación. Transcurridos seis meses desde la inoculación inicial, los cuatro monos que habían recibido ALVAC-RG, dos monos que habían recibido inicialmente vCP37 y dos monos que habían recibido inicialmente ALVAC, al igual que un mono no sometido previamente a experimentación fueron inoculados con 6,5 log_{10} pfu de ALVAC-RG, subcutáneamente. Se monitorizaron los sueros para determinar la presencia de anticuerpo neutralizador de la rabia en una prueba RFFI (Smith et al., 1973).

\newpage

Inoculación de líneas celulares con ALVAC-RG. Con vistas a determinar si la expresión eficaz de un gen extraño podía ser obtenida en células no aviares en las cuales el virus no se replica de forma productiva, cinco tipos de células, uno aviar y cuatro no aviares, fueron analizadas para averiguar el rendimiento en virus, la expresión del gen G de la rabia extraño y la acumulación de DNA específico vírico. Las células inoculadas eran:

(a): Vero, células de riñón de mono verde africano, ATCC # CCL81;

(b): MRC-5, de pulmón embriónico humano, ATC # CCL 171;

(c): Amnión humano WISH, ATCC # CCL 25;

(d): Detrosit-532, prepucio humano, síndrome de Down, ATCC # CCL 54; y

(e): células CEF primarias.

: Células fibroblasto de embrión de pollo producidas a partir de embriones Leghorn blancos de 11 días de edad fueron incluidas como control positivo. Todas las inoculaciones fueron llevadas a cabo sobre monocapas preformadas de 2 x 10^{6} células, tal y como se discute más adelante.

A.: Procedimientos para análisis de DNA.

: Tres platos de cada una de las líneas celulares fueron inoculados a 5 pfu/célula del virus objeto de prueba, permitiendo un plato extra de cada una de las líneas celulares no inoculado. Uno de los platos fue incubado en presencia de 40 \mug/ml de citosina arabinósido (Ara C).

: Transcurrido un período de adsorción de 60 minutos a 37ºC, el inoculum fue eliminado y la monocapa lavada dos veces para eliminar el virus no adsorbido. El medio (con o sin Ara C) fue después reemplazado. Células procedentes de un plato (sin Ara C) fueron recogidas como una muestra a tiempo 0. Los restantes platos fueron incubados a 37ºC durante un período de 72 horas, transcurrido el cual las células fueron recogidas y utilizadas para analizar la acumulación de DNA. Cada una de las muestras de 2 x 10^{6} células fue resuspendida en 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), conteniendo EDTA 40 mM e incubada durante un período de 5 minutos a 37ºC. Un volumen igual de agarosa al 1,5%, precalentada a 42ºC y conteniendo EDTA 120 mM fue añadido a la suspensión celular y mezclado suavemente. La suspensión fue transferida a un molde relleno de agarosa y dejada endurecer durante al menos 15 minutos. Lo rellenos de agarosa son después eliminados e incubados durante 12-16 horas a 50ºC, en un volumen de tampón de lisis (sarcosilo 1%, proteinasa K 100 \mug/ml, Tris HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 200 mM). El cual cubre completamente el relleno. El tampón de lisis fue después sustituido por 0,5 ml de 0,5 X TBE estéril (Tris-borato 44,5 mM, ácido bórico 44,5 mM, EDTA 0,5 mM) y equilibrado a 4ºC durante 6 horas con tres cambios de tampón TBE. El DNA vírico dentro del relleno fue fraccionado a partir de RNA y DNA celular, utilizando un sistema de electroforesis de campo de impulso.

: La electroforesis fue llevada a cabo durante un período de 20 horas a 180 V, con un desnivel de 50-90 segundos a 15ºC en 0,5 x TBE. El DNA fue hecho circular con estándares de peso molecular de DNA lambda. Después de la electroforesis, se visualizó la banda de DNA mediante teñido con bromuro de etidio. El DNA fue después transferido a una membrana de nitrocelulosa y sondado con una soda radiomarcada, preparada a partir de DNA genómico ALVAC purificado.

B.: Estimación de rendimiento de virus.

: Se inocularon platos exactamente tal y como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que el input de multiplicidad era de 0,1 pfu/célula. A las 72 horas posteriores a la infección, las células fueron sometidas a lisis por medio de tres ciclos sucesivos de congelado y descongelado. El rendimiento en virus fue valorado por medio de titulación en placa sobre monocapas CEF.

C.: Análisis de expresión del gen G de la rabia

: Se inocularon platos con virus recombinante o parental, a una multiplicidad de 10 pfu/célula, dejando un plato adicional como control de virus no infectado. Transcurrida una hora de período de absorción, el medio fue eliminado y sustituido por medio exento de metionina. Transcurrido un período de 30 minutos, éste medio fue sustituido por medio exento de metionina que contiene 25 uCi/ml de ^{35}S-metionina. Las células infectadas fueron marcadas durante el transcurso de una noche (aproximadamente 16 horas), después sometidas a lisis mediante la adición de tampón de lisis de tampón A. La inmunoprecipitación fue llevada a cabo tal y como se ha descrito previamente (Taylor et al., 1990), utilizando un anticuerpo monoclonal específico para G de la rabia.

\newpage

Resultados. Estimación de rendimiento vírico. Los resultados de titulación para determinar el rendimiento a las 72 horas de la incubación a 0,1 pfu por célula se muestran en la Tabla 9. Los resultados indican que si bien puede alcanzarse una infección productiva en las células aviares, no se puede detectar ningún incremento en el rendimiento de virus a través de este procedimiento en los cuatro sistema de células no aviares.

Análisis de acumulación de DNA vírico. Con vistas a determinar si el bloqueo a la replicación vírica productiva en las células no aviares tenía lugar antes o después de la replicación de DNA, el DNA procedente de los lisatos celulares fue fraccionado y sondado para determinar la presencia de DNA específico vírico. El DNA procedente de células CEF no infectadas, células CEF infectadas por ALVAC-RF en el tiempo 0, células CEF infectadas con ALVAC-RG a las 72 horas posteriores a la infección y células CEF infectadas con ALVAC-RG a las 72 horas posteriores a la infección, en presencia de 40 \mug/ml de citosina arabinósido, mostraron todos ellos alguna actividad de fondo, debida probablemente a DNA celular de CEF contaminante en la preparación de sonda de DNA ALVAC radiomarcada. No obstante, las células CEF infectadas con ALVAC-RF, mostraban a las 72 horas posteriores a la infección una fuerte banda en la región de aproximadamente 350 kbp, que representaba la acumulación de DNA vírico específico de ALVAC. La citada banda no resulta detectable cuando el cultivo es incubado en presencia del inhibidor de síntesis de DNA, citosina arabinósido. Muestras equivalentes producidas en células Vero mostraban una banda muy débil a aproximadamente 350 kbp en las células Vero infectadas con ALVAC-RG, a tiempo cero. Este nivel representaba virus residual. La intensidad de la banda fue amplificada a las 72 horas posteriores a la infección, indicando que había tenido lugar algún nivel de replicación de DNA específico vírico en las células Vero, el cual no se había traducido en un incremento en la progenie vírica. Muestras equivalentes producidas en células MRC-5 indicaron que, en estas condiciones, no se había acumulado DNA específico vírico en esta línea celular. Este experimento fue ampliado después para incluir líneas celulares humanas adicionales, específicamente células Detroit-532 y WISH. Células CEF infectadas con ALVAC sirvieron como control positivo. No se detectó acumulación de DNA específico no vírico en ningunas de las células WISH o Detroit inoculadas con ALVAC-RG. Debe destacarse el hecho de que los límites de detección de este procedimiento no han sido completamente averiguados y puede que tenga lugar la acumulación de DNA vírico, pero a un nivel por debajo de la sensibilidad del procedimiento. Otros experimentos en los cuales la replicación de DNA vírico fue medida a través de la incorporación de ^{3}H-timidina apoyan los resultados obtenidos con células Vero y células MRC-5.

Análisis de expresión de gen de la rabia. Con vistas a determinar si tenía lugar alguna expresión genética vírica, en particular del gen extraño insertado, en las líneas celulares humanas, incluso en ausencia de replicación de DNA vírico, se llevaron a cabo experimentos de inmunoprecipitación sobre lisatos de células aviares y no aviares afectadas por ALVAC y ALVAC-RG, marcadas con ^{35}S-metionina. Los resultados de inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo monoclonal específico para rabia G ilustraban una inmunoprecipitación específica de una glicoproteína de 67kDa en células CEF, Vero y MRC-5, WISH y Detroit, infectadas con ALVAC-RG. No se detectaron productos genéticos de rabia específicos en ninguno de los listados de células infectadas parentalmente, ni en los lisatos celulares no infectados.

Los resultados de este experimento indicaban que en las líneas celulares humanas analizadas, si bien el recombinante ALVAC-RG resultaba capaz de iniciar una infección y de expresar un producto de gen extraño bajo el control transcripcional del promotor del virus vaccinia temprano/tardío H6, la replicación to tenía lugar a través de replicación de DNA, ni se detectaba la presencia de ninguna progenie vírica producida. En las células Vero, si bien se observaba algún nivel de acumulación de DNA específica de ALVAC-RG, no se detectó la presencia de progenie vírica mediante estos procedimientos. Estos resultados indicarían que en las líneas celulares humanas analizadas, el bloqueo de la replicación vírica tiene lugar con anterioridad del inicio de la replicación de DNA, mientras que en las células Vero, el bloqueo tiene lugar después del inicio de la replicación de DNA.

Con vistas a determinar si la glicoproteína de la rabia expresada en ALVAC-RG era inmunogénica, se efectuaron pruebas con un determinado número de especies animales a través de inoculación del recombinante. La eficacia de las actuales vacunas de la rabia es evaluada en un sistema modelo de ratón. Una prueba similar fue llevada a cabo en consecuencia utilizando ALVAC-RG. Nueve diferentes preparaciones de virus (incluyendo un lote de vacuna (J) producido después de 10 pasos de cultivo tisular en serie del virus semilla), con títulos infecciosos que oscilaban entre 6,7 y 8,4 log_{10} TCID_{50} por ml fueron diluidos en serie y entre 50 y 100 \mul de diluciones inyectados en la planta del pie de ratones de entre 6 y 10 semanas de edad. Los ratones fueron sometidos a desafío 14 días más tarde a través de la ruta intracraneal con 300 \mul de la cepa CVS del virus de la rabia, conteniendo entre 15 y 43 LD_{50} de ratón, tal y como se determinó a través de titulación de la letalidad en un grupo control de ratones. Se calculó la potencia, expresada como PD_{50} (50% de la dosis protectora) a los 14 días posteriores al desafío. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 10. Los resultados indicaban que el ALVAC-RG resultaba consistentemente capaz de proteger a los ratones frente al desafío de la rabia con valores de PD_{50} que oscilaban entre 3,33 y 4,56, con un valor promedio de 3,73 (STD 9,48). Como una ampliación de este estudio, ratones macho fueron inoculados intracranealmente con 50 \mul de virus que contiene 6,0 log_{10} TCID_{50} de ALVAC-RG o con un volumen equivalente de una suspensión de células no infectadas. Los ratones fueron sacrificados en los días 1, 3 y 6 posteriores a la infección y se extrajeron sus cerebros, se fijaron y seccionaron. El examen histopatológico no mostró evidencias de neurovirulencia de ALVAC-RG en los ratones.

Con vistas a evaluar la seguridad y la eficacia de ALVAC-RG en perros y gatos, se analizaron un grupo de beagles de 14 y 5 meses de edad y un grupo e gatos de 14 y 4 meses de edad. Cuatro animales de cada especie no fueron vacunados. Cinco animales recibieron 6,7 log_{10} TCID_{50} subcutáneamente y cinco animales recibieron 7,7 log_{10} TCID_{50} a través e la misma ruta. Se extrajo sangre de los animales para proceder a su análisis, para determinar la existencia de anticuerpos anti-rabia. Los animales que no habían recibido inoculación o que habían recibido 6,7 log_{10} TCID_{50} fueron sometidos a desafío a los 29 días posteriores a la vacunación con 3,7 log_{10} de ratón LD_{50} (perros, en el músculo temporal) o 4,3 log_{10} de ratón LD_{50} (gatos, en el cuello) de la cepa de desafío de virus e la rabia NYGS. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 11.

No se observaron reacciones adversas a la inoculación, ni en los perros ni en los gatos inoculados con cualquier dosis de virus. Cuatro de los cinco perros inmunizados con 6,7 log_{10} TCID_{50} presentaban títulos de anticuerpo a los 14 días posteriores a la vacunación y todos los perros tenían títulos a los 29 días. Todos los perros estaban protegidos frente al desafío que mató a tres de los cuatro perros control. En los gatos, tres de los cinco gatos que habían recibido 6,7 log_{10} TCID_{50} presentaban títulos de anticuerpo específico a los 14 días y todos los gatos dieron positivo a los 29, si bien el título de anticuerpo promedio era bajo a 2,9 I.U. Tres de cinco gatos sobrevivieron al desafío que mató a todos los de control. Todos los gatos inmunizados con 7,7 log_{10} TCID_{50} presentaban títulos de anticuerpo a los 14 días y el Título Promedio Geométrico a los 29 días fue calculado como 8,1 Unidades
Internacionales.

Se examinó la respuesta inmune de los monos ardilla (Saimiri sciureus) frente a inoculación con ALVAC, ALVAC-RG y un recombinante de poxvirus del canario no relacionado. Grupos de monos fueron inoculados, tal y como se ha descrito anteriormente, y los sueros fueron analizados para determinar la presencia de anticuerpo específico de la rabia. Aparte de reacciones típicas de la piel de menor importancia a través de la ruta intradérmica, no se observó reactividad adversa en ninguno de los monos. Pequeñas cantidades de virus residual fueron aisladas a partir de lesiones en la piel después de inoculación intradérmica, tan solo a los dos y a los cuatro días posteriores a la inoculación. Todas las muestras dieron resultado negativo al séptimo día y en los días posteriores. No existió reacción local frente a inyección intra-muscular. La totalidad de los cuatro monos inoculados con ALVAC-RG desarrollaron anticuerpos neutralizadores del suero antirrabia, según indicaban las mediciones en la prueba RFFI. Transcurridos aproximadamente seis meses desde la inoculación inicial, la totalidad de los monos y un mono no sometido previamente a experimentación adicional, fueron re-inoculados, a través de la vía subcutánea, sobre la cara externa del muslo izquierdo, con 6,5 log_{10} TCID_{50} de ALVAC-RG. Se analizaron los sueros para determinar la presencia de anticuerpo antirrabia. Los resultados se muestran en la Tabla 12.

Cuatro de los cinco monos no sometidos previamente a la rabia desarrollaron una respuesta serológica a los siete días de la inoculación con ALVAC-RG. La totalidad de los cinco monos presentaban anticuerpo detectable a los 11 días de la inoculación. De los cuatro monos con exposición previa a la glicoproteína de la rabia, todos ellos mostraban un incremento significativo en el título de neutralización de suero entre los días 3 y 7 posteriores a la vacunación. Los resultados indican que la vacunación de monos ardilla con ALVAC-RG no genera efectos secundarios adversos y que puede inducirse una respuesta de anticuerpo neutralizante primaria. A través de la revacunación se induce también una respuesta amnanéstica. La exposición anterior a ALVAC o a un recombinante de poxvirus del canario que expresa un gen extraño no relacionado, no interfiere con la inducción de una respuesta inmune antirrabia tras la
revacunación.

Se valoró la respuesta inmunológica a los macacos seropositivos HIV-2 frente a la inoculación con ALVAC-RG. Los animales fueron inoculados tal y como se ha descrito anteriormente y se valoró la presencia de anticuerpo neutralizador de suero antirrabia en una prueba RFFI. Los resultados, mostrados en la Tabla 13, indicaban que los animales HIV-2 positivos inoculados a través de la ruta subcutánea desarrollaron anticuerpos antirrabia a los 11 días posteriores a la inoculación. Después de un refuerzo de inoculación, se detectó una respuesta anamnéstica, aproximadamente a los tres meses desde la primera inoculación. No se detectó respuesta alguna en animales que habían recibido el recombinante a través de la ruta oral. Además, una serie de seis animales fueron inoculados con dosis decrecientes de ALVAC-RG, proporcionadas a través de, o bien la ruta intramuscular o la ruta subcutánea. Cinco de los seis animales inoculados respondieron a los 14 días posteriores a la vacunación, sin diferencia significativa en el título de
anticuerpo.

Dos chimpancés que habían estado expuestos anteriormente a HIV fueron inoculados con 7,0 log_{10} pfu de ALVAC-RG, a través de la vía subcutánea o intramuscular. A los 3 meses de la inoculación, ambos animales fueron revacunados de una forma idéntica. Los resultados se muestran en la Tabla 14.

No se observó reactividad adversa frente a la inoculación, ni a través de la vía subcutánea ni a través de la vía intramuscular. Ambos chimpancés respondieron a la inoculación primaria, transcurridos 14 días, y se detectó una respuesta fuertemente creciente después de la revacunación.

TABLA 5 Paso secuencial de ALVAC en células aviares y no aviares

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{127mm} esta muestra fue recogida a
tiempo cero y representa el virus input residual. El título es
expresado como  log _{10} pfu por ml. \end{minipage} \cr  b: \+
 \begin{minipage}[t]{127mm} esta muestra fue recogida a los 7
días de la infección \end{minipage} \cr  c: \+
 \begin{minipage}[t]{127mm} esta muestra fue inoculada en
presencia de 40  \mu g/ml de citosina arabinósido y recogida a los 7
días  de la infección. \end{minipage} \cr  d: \+ no
detectable\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Paso secuencial de ALVAC-RG en células aviares y no aviares

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{127mm} esta muestra fue recogida a
tiempo cero y representa el virus input residual. El título es
expresado como  log _{10} pfu por ml. \end{minipage} \cr  b: \+
 \begin{minipage}[t]{127mm} esta muestra fue recogida a los 7
días de la infección. \end{minipage} \cr  c: \+
 \begin{minipage}[t]{127mm} esta muestra fue inoculada en
presencia de 40  \mu g/ml de citosina arabinósido y recogida a los 7
días  de la infección. \end{minipage} \cr  d: \+ no
detectable\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 Amplificación de virus residual a través de paso en células CEF

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{127mm} el paso 2 representa la
amplificación en células CEF de la muestra de 7 días procedente del
paso 1. \end{minipage} \cr  b: \+ título expresado como
log _{10}  pfu por ml.\cr  c: \+ no
detectable.\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 Programa de inoculación en macacos resus con ALVAC-RG (vCP65)

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{138mm} vCP82 es un recombinante de
poxvirus del canario que expresa la fusión del virus de sarampión y
genes  hemaglutinina.
\end{minipage} \cr}

TABLA 9 Análisis de rendimiento en células aviares y no aviares inoculadas con ALVAC-RG

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

a:	título expresado como log_{10} pfu por ml.
b:	cultivo incubado en presencia de 40 \mug/ml de citosina arabinósido.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 10 Potencia de ALVAC-RG, tal como se ha probado en ratones

\vskip1.000000\baselineskip

17

a:	expresado como LD_{50} de ratón
b:	expresado como log_{10} TCID_{50}

\newpage

TABLA 11 Eficacia de ALVAC-RG en perros y gatos

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{138mm} anticuerpo el día 29 después
de la inoculación expresado como el título promedio geométrico en
Unidades  Internacionales. \end{minipage} \cr  b: \+ expresado
como una relación de supervivientes sobre animales
desafiados.\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 12 Respuesta serológica antirrabia de monos ardilla inoculados con recombinantes de poxvirus del canario

\vskip1.000000\baselineskip

20

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{138mm} Tal y como se ha determinado
a través de la prueba RFFI en los días indicados y expresado en
Unidades Internacionales. \end{minipage} \cr  b: \+ el día 196
representa suero procedente del día 28 después de la vacunación
primaria.\cr  c: \+ los animales recibieron 5,0 log _{10} 
TCID _{50}  de ALVAC\cr  d: \+ los animales recibieron 5,0
log _{10}  TCID _{50}  de vCP37\cr  e: \+ los animales recibieron
5,0 log _{10}  TCID _{50}  de ALVAC  -  RG\cr  f: \+ los
animales recibieron 7,0 log _{10}  TCID _{50}  de
ALVAC  -  RG\cr  g: \+ no
comprobado\cr}

TABLA 13 Inoculación de macacos resus con ALVAC-RG^{a}

\vskip1.000000\baselineskip

22

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+ ver la Tabla o para el programa de inoculaciones\cr  b: \+
 \begin{minipage}[t]{138mm} los animales 176L y 185L recibieron
8,0 log _{10}  pfu a través de vía     oral en 5 ml Tang. El animal 
187L recibió 7,0 log _{10}  pfu a través de    vía oral, no en Tang.
\end{minipage} \cr  c: \+  \begin{minipage}[t]{138mm} día
de revacunación para los animales 176L, 185L, 177L y 186L, a    
través de la vía SC y vacunación primaria  para los animales 178L,  
 182L, 179L, 183L, 180L, 184L y 187L. \end{minipage} \cr  d: \+
 \begin{minipage}[t]{138mm} títulos expresados como recíprocos
de la última dilución que         mostró inhibición de fluorescencia
 en una prueba RFFI.
\end{minipage} \cr}

TABLA 14 Inoculación de chimpancés con ALVAC-RG

23

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{138mm} título expresado como
recíproco de la última dilución     que muestra inhibición de
fluorescencia en una  prueba     RFFI. \end{minipage} \cr  b:
\+ día de
re  -  inoculación.\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 22

Inmunización de humanos utilizando poxvirus de canario que expresa glicoproteína de la rabia (ALVAC-RG; vCP65)

El ALVAC-RG (vCP65) fue generado tal y como se ha descrito en el Ejemplo 21 y en las Figs. 18A y 18B. Para el escalado y la fabricación de la vacuna, el ALVAC-RG (vCP65) fue cultivado en células CEF primarias derivadas de huevos libres de patógeno. Las células fueron infectadas a una multiplicidad de 0,01 e incubadas a 37ºC durante tres días.

La suspensión de virus de vacuna fue obtenida mediante interrupción ultrasónica en medio exento de suero de las células infectadas; los restos celulares fueron eliminados posteriormente por medio de centrifugación y filtración. La suspensión resultante clarificada fue suplementada con estabilizador de liofilización (mezcla de aminoácidos), ubicada en viales de una dosis única y liofilizada. Tres lotes de título decreciente fueron preparados diluyendo en serie diez veces la suspensión de virus en una mezcla de medio exento de suero y estabilizador de liofilización, con anterioridad a la liofilización.

A los sustratos celulares, medios, semillas de virus y al producto final se les aplicaron pruebas de control de calidad, poniendo énfasis en la investigación de agentes adventicios y en la inocuidad en ratones de laboratorio. No se encontró ningún rasgo indeseable.

Datos preclínicos. Estudios efectuados in vitro indicaron que las células VERO o las células MRC-5 no apoyaban el crecimiento de ALVAC-RG (vCP65); una serie de ocho (VERO) y 10 (MRC) pasos en serie ciegos no provocó adaptación detectable del virus a cultivar en estas líneas no aviares. Los análisis de las líneas celulares humanas (MRC-5, WISH, Detroit 532, HEL, HNK o células linfoblastoides transformadas con EBV) infectadas o inoculadas con ALVAC-RG (vCP65) no mostraban acumulación de DNA específico de virus, sugiriendo que en éstas células el bloqueo en la replicación tiene lugar con anterioridad a la síntesis del DNA. No obstante, de forma significativa, la expresión del gen de glicoproteína de virus de la rabia en todas las líneas celulares objeto de prueba indicaba que el paso abortivo en el ciclo de replicación de poxvirus del canario tiene lugar con anterioridad a la replicación del
DNA.

La seguridad y la eficacia de ALVAG-RG (vCP65) fueron documentadas en una serie de experimentos en animales. Un determinado número de especies, incluyendo canarios, pollos, patos, gansos, roedores de laboratorio (ratones en período de amamantamiento y ratones adultos), hámsteres, cobayos, conejos, gatos y perros, monos ardilla, macacos resus y chimpancés fueron inoculados con dosis que oscilaban entre 10^{5} y 10^{8} pfu. Se utilizaron una diversidad de vías, muy habitualmente subcutáneas, intramusculares e intradérmicas, pero también oral (monos y ratones) e intracerebral (ratones).

En canarios, el ALVAC-RG (vCP65) provocó una lesión "adquirida" en el sitio de cicatrización, sin indicación de enfermedad o muerte. La inoculación intradérmica de conejos dió como resultado una reacción a la inoculación de poxvirus, la cual ni se extendió ni curó entre siete y diez días. No se generaron efectos secundarios adversos como consecuencia del poxvirus del canario en ninguno de los animales objeto de prueba.

La inmunogenicidad fue documentada a través del desarrollo de anticuerpos antirrabia después de la inoculación de ALVAC-RG (vCP65) en roedores, perros, gatos, y en primates, medida a través de la denominada prueba rápida de inhibición de foco fluorescente (RFFIT). Se demostró también la existencia de protección mediante experimentos de desafío de virus de la rabia en ratones, perros y gatos inmunizados con ALVAC-RG (vCP65).

Voluntarios. Veinticinco adultos sanos de edad comprendida entre 20 y 45 años, sin historial previo de inmunización frente a la rabia, fueron aceptados en un ensayo. Sus estados de salud fueron valorados a través de sus historiales médicos completos, exámenes físicos, análisis químicos de sangre y hematológicos. Entre los criterios de exclusión se incluían el embarazo, las alergias, la inmunodeficiencia de cualquier tipo, las enfermedades debilitadoras crónicas, el cáncer, la inyección de inmunoglobinas durante los tres últimos meses y la seropositividad frente al virus de inmunodeficiencia adquirida humano (HIV) o frente al antígeno de superficie del virus de la hepatitis
B.

Diseño del estudio. Los participantes fueron distribuidos al azar en lo referente a la recepción de o bien vacuna frente a la rabia de célula diploide humana estándar (HDC), lote E0751 (Pasteur Merieux Serums & Vaccine, Lyon, France) o la vacuna de estudio ALVAC-RG (vCP65).

El ensayo fue diseñado como un estudio de escalado de dosis. Tres lotes de vacuna ALVAC-RG (vCP65) experimental fueron utilizados secuencialmente en tres grupos de voluntarios (Grupos A, B y C), con dos intervalos de dos semanas entre cada paso. La concentración de los tres lotes era de 10^{3.5}, 10^{4.5}, 10^{5.5} Dosis Infecciosa de Cultivo Tisular (TCID_{50}) por dosis, respectivamente.

Cada uno de los voluntarios recibió dos dosis de la misma vacuna de forma subcutánea en la región deltoide, a un intervalo de cuatro semanas. La naturaleza de la vacuna inyectada no era conocida por los participantes en el momento de la primera inyección pero si era conocida por el investigador.

Con vistas a minimizar el riesgo de hipersensibilidad inmediata en el momento de la segunda inyección, los voluntarios del grupo B a los que se les había asignado la dosis de vacuna experimental media fueron inyectados una hora antes con la dosis más baja y los que tenían que recibir la dosis más elevada (Grupo C) recibieron sucesivamente la dosis más baja y la dosis media a intervalos horarios.

Seis meses más tarde, a los que habían recibido las dosis más elevadas de ALVAC-RG (vCP65) (Grupo C) y de vacuna HDC se les ofreció una tercera dosis de vacuna; los participantes fueron distribuidos aleatoriamente con vistas a recibir o bien la misma vacuna ya recibida anteriormente o una vacuna alternativa. Como resultado, se formaron cuatro grupos correspondientes al siguiente programa de inmunización: 1. HDC, HDC-HDC; 2. HDC, HDC- ALVAC-RG (vCP65); 3. ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65)-HDC; 4. ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65), ALVAC-RG (vCP65).

Monitorización de los efectos secundarios. Todos los sujetos fueron monitorizados durante 1 hora después de la inyección y re-examinados cada día durante los siguientes cinco días. Se les pidió que registraran las reacciones localizadas y las generalizadas durante las siguientes tres semanas y se les consultó telefónicamente dos veces por semana.

Investigadores de laboratorio. Se obtuvieron muestras de sangre con anterioridad a la inclusión en el ensayo y a los dos, cuatro y seis días subsiguientes a cada una de las inyecciones. Los análisis incluyeron el contaje completo de células sanguíneas, los enzimas del hígado y ensayos de creatinina quinasa.

Ensayos de anticuerpo. Se llevaron a cabo ensayos de anticuerpo con siete días de antelación a la primera inyección y a los 7, 28, 35, 56, 173. 187 y 208 días de estudio.

Los niveles de anticuerpos neutralizadores frente a la rabia fueron determinados utilizando la prueba de inhibición rápida de foco fluorescente (RFFIT) (Smith & Yaeger, In Laboratory Techniques on Rabies). Los anticuerpos de poxvirus de canario fueron medidos a través de ELISA directo. El antígeno, una suspensión de poxvirus de canario purificado interrumpido con Triton X100 0,1%, fue revestido en microplacas. Diluciones fijadas de los sueros fueron hechas reaccionar durante dos horas a temperatura ambiente y los anticuerpos reaccionantes fueron revelados con un suero anti-humano de IgG de cabra marcado con peroxidasa. Los resultados se expresan como lecturas de densidad óptica a 490 nm.

\newpage

Análisis. Veinticinco sujetos fueron incluidos en el estudio y completaron el mismo. Había diez varones y 15 hembras y el promedio de edad era de 31,9 (21 a 48). La totalidad de sujetos, salo tres de ellos, presentaban evidencias de vacunación previa frente a viruela humana: los tres sujetos restantes no presentaban la habitual cicatriz ni tenían historial de vacunación. Tres de los sujetos recibieron cada una de las dosis inferiores de vacuna experimental (10^{3.5} y 10^{4.5} TCID_{50}), nueve de los sujetos recibieron 10^{5.5} TCID_{50} y diez de ellos recibieron la vacuna
HDC.

Seguridad. Durante la serie primaria de vacunación, se anotaron casos de fiebre superior a 37,7ºC dentro de las 24 horas subsiguientes a la inyección en un receptor de HDC (37,8ºC) y en uno de los receptores de vCP65 10^{5.5} TCID_{50} (38ºC). No se observó ninguna otra reacción generalizada atribuible a la vacunación en otros participantes.

Se tomaron nota de reacciones localizadas en 9/10 participantes de vacuna HDC inyectada subcutáneamente y en 0/3, 1/3 y 9/9 de los receptores de vCP65 10^{3.5}, 10^{4.5}, 10^{5.5} TCID_{50}, respectivamente.

La sensibilidad resultó ser el síntoma más común y resultaba siempre moderada. Entre otros síntomas localizados se incluía el enrojecimiento y el indurecimiento, los cuales resultaron ser también moderados y transitorios. La totalidad de los síntomas subsistían habitualmente dentro de las 24 horas y en ningún caso duraron más de 72 horas.

No se produjo ningún cambio significativo en el contaje de células sanguíneas, ni en los valores de enzimas del hígado o en los valores de creatinina quinasa.

Respuestas inmunes; Anticuerpos neutralizadores frente a la rabia (Tabla 16). Veintiocho días después de la primera inyección, la totalidad de receptores de HDC presentaban títulos protectores (\geq 0,5 IU/ml). Por el contrario, ninguno de los receptores de ALVAC-RG (vCP65) de los grupos A y B (10^{3,5} y 10^{4.5} TCID_{50}) y tan solo 2/9 en el grupo C (10^{5.5} TCID_{50}) alcanzó este nivel de protección.

En el día 56 (a saber, 28 días después de la segunda inyección) se alcanzaron niveles protectores en 0/3 receptores del Grupo A, 2/3 receptores del Grupo B y 9/9 receptores del Grupo C de vacuna ALVAC-RG (vCP65) y persistía en todos los 10 receptores de HDC.

En el día 56, los títulos de la media geométrica eran 0,05, 0,47, 4,4 y 11,5 IU/ml, en los grupos A, B, C y HDC, respectivamente.

En el día 180, los títulos de anticuerpo de la rabia se habían reducido sustancialmente en todos los sujetos pero permanecían por encima del título protector mínimo de 0,5 IU/ml en 5/10 receptores de HDC y en 5/9 receptores de ALVAC-RG (vCP65); los títulos de media geométrica eran 0,51 y 0,45 IU/ml en los grupos HDC y C, respectivamente.

Anticuerpos frente al poxvirus del canario (Tabla 17). Los títulos preinmunes observados variaban ampliamente, variando los títulos entre 0,22 y 1,23 O.D. unidades, a pesar de la ausencia de cualquier contacto previo con canarios, en aquellos sujetos con los títulos más elevados. Cuando se definía como superior a un incremento de más del doble entre la preinmunización y los títulos posteriores a la segunda inyección, se obtuvo una seroconversión en 1/3 sujetos en el grupo B y en 9/9 sujetos en el grupo C, a la vez que ningún sujeto resultó seroconvertido en los grupos A o
HDC.

Infección ampliada. La vacuna fue similarmente bien tolerada seis meses más tarde, en el momento de la inyección de ampliación: menos receptores de los anotados en 2/9 receptores ampliados de HDC y en 1/10 de los receptores ampliados ALVAC-RG (VCP65).

Observaciones. Las Figuras 22A-22D muestran gráficas de títulos de anticuerpo neutralizadores de la rabia (Prueba de inhibición rápida de foco fluorescente o RFFIT, IU/ml): el efecto de ampliación del HDC y de vCP65 (10^{5,5} TCID_{50}) en voluntarios previamente inmunizados con o bien la misma vacuna o una vacuna alternativa. Las vacunas fueron administradas los días 0, 28, y 180. Los títulos de anticuerpo fueron medidos los días 0, 7, 28, 35, 56, 173 y
208.

Tal y como se muestra en las Figs. 22A-22D, la dosis de ampliación proporcionada dió lugar a un nuevo incremento en los títulos de anticuerpo de la rabia en cada uno de los sujetos, con independencia del programa de inmunización. No obstante, el ampliador ALVAC-RG (vCP65) desencadenó respuestas inmunes más bajas que el ampliador HDC y el ALVAC-RG (vCP65), el grupo ALVAC-RG (vCP65)-ALVAC-RG (vCP65) presentaba significativamente menos títulos que los otros tres grupos. De forma similar, la inyección ampliadora de ALVAC-RG (vCP65) dió lugar a un incremento en los títulos de anticuerpo de poxvirus del canario en 3/5 sujetos que habían recibido previamente la vacuna HDC y en la totalidad de sujetos previamente inmunizados con ALVAC-RG (vCP65).

En general, ninguno de los efectos secundarios localizados derivados de la administración de vCP65 resultaba indicativo de una replicación localizada del virus. En particular, no se encontraban presente lesiones de la piel, tales como las observadas después de la inyección de la vacuna. A pesar de la aparente ausencia de replicación del virus, la infección dio lugar a la generación de cantidades significativas de anticuerpos frente a tanto el vector poxvirus del canario como a la glicoproteína de la rabia expresada.

Los anticuerpos neutralizadores de la rabia fueron sometidos a ensayo con la prueba de Inhibición Rápida de Foco Fluorescente (RFFIT), acerca de la cual se tiene conocimiento de que correlaciona bien con la prueba de neutralización de suero en ratones. De los 9 receptores de 10^{5,5} TCID_{50}, cinco presentaban niveles bajos de respuesta después de la primera dosis. Se obtuvieron títulos protectores de anticuerpos de la rabia después de la segunda inyección en todos los receptores de la dosis más elevada objeto de comprobación e incluso en 2 de los tres receptores de la dosis media. En este estudio, ambas vacunas fueron suministradas por vía subcutánea tal y como se recomienda habitualmente para las vacunas vivas, pero no para la vacuna de HDC inactivada. Esta vía de inyección fue seleccionada dado que la misma permitía un cuidadoso examen del sitio de inyección, pero esto podía explicar la aparición tardía de anticuerpos en receptores HDC: ciertamente, ningunos de los receptores HDC presentaba un incremento de anticuerpo el día 7, mientras que, en la mayoría de los estudios en los que la vacuna HDC se proporciona por vía intramuscular, una proporción significativa de sujetos si mostraba un incremento (Klietmann et al., Int'l Green Cross-Geneva, 1981; Kuwert et al., Int'l Green Cross-Geneva, 1981). No obstante, esta invención no está necesariamente limitada a la vía de administración subcutánea.

Los GMT (títulos promedio geométricos) de anticuerpos neutralizadores de la rabia resultaban inferiores con la vacuna investigacional que con la vacuna control de HDC, pero todavía bien por encima del título mínimo requerido para la protección. La respuesta del efecto de dosis clara obtenida con las tres dosis utilizadas en este estudio sugiere que una dosis más elevada podría inducir una respuesta más fuerte. Ciertamente, a partir de esta descripción, el experto en la materia puede seleccionar una dosis adecuada para un paciente determinado.

La capacidad de ampliar la respuesta del anticuerpo constituye otro importante resultado de este ejemplo; ciertamente, un incremento en los títulos de anticuerpo de la rabia fue obtenido en cada uno de los sujetos después de 6 meses de la dosis, cualquiera que sea el programa de inmunización, mostrando que la inmunidad preexistente generada por o bien el vector poxvirus del canario o la glicoproteína de la rabia, no tenía efecto bloqueador sobre la ampliación con el candidato de vacuna recombinante o la vacuna de la rabia HDC convencional. Esto contrasta con las averiguaciones de otros con recombinantes vaccinia en humanos, en el sentido de que la respuesta inmune puede ser bloqueada por inmunidad pre-existente (Cooney et al., Lancet q991, 337: 567-72; Etinger et al., Vaccine 9: 470-72,
1991).

Por lo tanto, este ejemplo demuestra claramente que un poxvirus no replicante puede servir como vector inmunizador en animales o humanos, con todas las ventajas que los agentes replicantes confieren a la respuesta inmune, pero sin el problema de seguridad creado por un virus plenamente permisivo.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 15 Reacciones en los 5 días subsiguientes a la vacunación

\vskip1.000000\baselineskip

24

TABLA 16 Anticuerpos neutralizadores de la rabia (REFIT; IU/ml) Títulos individuales y títulos promedio geométricos GMT)

26

\text{*}p=: prueba de estudiante t 0,007

TABLA 17 Anticuerpos de poxvirus del canario: títulos Promedio Geométrico ELISA*

27

Ejemplo 23

Comparación de la LD_{50} de ALVAC y NYVAC con diversas cepas de virus vaccinia

Ratones. Ratones macho Swiss Webster criados externamente fueron adquiridos en Taconic Farms (Germantown, NY) y mantenidos a base de comida para ratón y agua ad libitum hasta las tres semanas de edad (ratones "normales"). Los ratones Swiss Webster recién nacidos criados externamente eran de ambos sexos y fueron obtenidos siguiendo embarazos programados llevados a cabo por Taconic Farms. Todos los ratones recién nacidos utilizados fueron suministrados dentro de un período de dos días.

Virus. El ALVAC fue derivado a través de purificación de placa de una población de poxvirus del canario y fue preparado en células fibroblasto de embrión de pollito (CEF). Después de purificación por centrifugación sobre gradientes de densidad de sacarosa, el ALVAC fue enumerado para unidades formadoras de placa en células CEF. La variante WR(L) del virus vaccinia fue derivada por selección de grandes placas de fenotipos de WR (Panicali et al., 1981). La cepa de vacuna de The Wyeth New York State Board of Health del virus vaccinia fue obtenida a partir de la vacuna Drivax de Pharmaceuticals Calf Lymph Type, número de control 302001B. El virus vaccinia VC-2 de la cepa Copenhaguen fue obtenido en el Institut Merieux, France. La cepa NYVAC de virus vaccinia fue derivada de Copenhagen VC-2. Todas las cepas de virus vaccinia, con excepción de la cepa Wyeth, fueron cultivadas en células de riñón de mono verde africano Vero, purificadas mediante centrifugación de densidad de gradiente de sacarosa y enumeradas para unidades formadoras de placa sobre células Vero. La cepa Wyeth fue cultivada en células CEF y enumerada en células CEF.

Inoculaciones. Grupos de 10 ratones normales fueron inoculados intracranealmente (ic) con 0,05 ml de una de diversas diluciones de virus preparadas por medio de dilución en serie 10 veces de preparaciones stock en solución salina estéril tamponada con fosfato. En algunos casos, la preparación de virus no diluida fue utilizada para inoculación.

Grupos de 10 ratones recién nacidos, de entre 1 y 2 días de edad, fueron inoculados ic de forma similar a la de los ratones normales, con la excepción de que se utilizó un volumen de inyección de 0,03 ml.

Todos los ratones fueron observados diariamente en relación con la mortalidad durante un período de 14 días (ratones recién nacidos) o 21 días (ratones atímicos), después de la incubación. Los ratones hallados muertos a la mañana siguiente de la inoculación fueron excluidos, debido a potencial muerte por traumatismo.

La dosis letal requerida para producir mortalidad para el 50% de la población experimental (LD_{50}) fue determinada por medio del procedimiento proporcional de Reed y Muench.

Comparación de la LD_{50} de ALVAC y de NYVAC con diversas cepas de virus vaccinia, para ratones normales, jóvenes criados externamente, a través de la vía ic. En ratones normales, jóvenes, la virulencia de NYVAC y ALVA alcanzaba varios órdenes de magnitud por debajo de la de otras cepas de virus vaccinia comprobadas (Tabla 18). Se averiguó que NYVAC y ALVAC resultaban más de 3.000 veces menos virulentos en ratones normales que la cepa Wyeth; más de 12.500 veces menos virulentos que la cepa VC-2 parental; y más de 63.000.000 veces menos virulentos que la variante WR(L). Estos resultados sugerían que NYVAC resulta altamente atenuado en comparación con otras cepas vaccinia, que ALVAC resultaba generalmente no virulento para jóvenes ratones, cuando es administrada de forma intracraneal, si bien ambos pueden provocar mortalidad en ratones a dosis extremadamente elevadas (3,85 x 10^{8} PFUs, ALVAC y 3 x 10^{8} PFUs, NYVAC), a través de un mecanismo no determinado mediante esta vía de inoculación.

Comparación de la LD_{50} de ALVAC y NYVAC con diversas cepas de virus vaccinia para ratones recién nacidos criados externamente, a través de la vía ic. La virulencia relativa de 5 cepas de virus de la viruela para ratones recién nacidos, normales, fue objeto de comprobación por medio de titulación en un sistema modelo de desafío intracraneal (IC) (Tabla 19). Tomando la mortalidad como punto final, los valores LD_{50} indicaban que ALVAC es más de 100.000 veces menos virulento que la cepa de vacuna Wyeth del virus vaccinia; más de 200.000 veces menos virulenta que la cepa VC-2 Copenhagen de virus vaccinia; y más de 25.000.000 de veces menos virulenta que la variante WR-L del virus vaccinia. Sin embargo, a la dosis más elevada objeto de prueba, 6,3 x 10^{7} PFUs, se generaba una mortalidad del 100%. Tasas de mortalidad del 33,3% fueron observadas a 6,3 x 10^{6} PFUs. La causa de la muerte, si bien no se ha determinado realmente, probablemente no tenía origen toxicológico o traumático, dado que el tiempo de supervivencia promedio (MST) de los ratones del grupo de dosis más elevada (aproximadamente 6,3 LD_{50}) era de 6,7 \pm 1,5 días. Cuando se comparaba con WR(L), a una dosis de desafío de 5 LD_{50}, en donde MST es 4,8 \pm 0,6 días. El MST de ratones desafiados con ALVAC resultaba significativamente más largo (p= 0,001).

En relación con NYVAC, se averiguó que Wyeth resultaba más de 15.000 veces más virulento; el VC-2 más de 35.000 veces más virulento; y WR(L) más de 3.000.000 veces más virulento. De modo similar a ALVAC, las dos dosis más elevadas de NYVAC, 6 x 10^{8} y 6 x 10^{7} PFUs, provocaron una mortalidad del 100%. No obstante, el MST de ratones desafiados con la dosis más elevada, correspondiente a 380 LD_{50}, era de tan solo 2 días (9 muertes al 2º día y 1 muerte al 4º día). Por el contrario, la totalidad de los ratones desafiados con la dosis más elevada de WR-L, equivalente a 500 LD_{50}, sobrevivió al día 4.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 18 Dosis Letal 50% calculada para ratones a través de diversas cepas de virus vaccinia para poxvirus del canario (ALVAC), a través de la vía ic

28

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 19 Dosis Letal 50% calculada para ratones recién nacidos, a través de diversas cepas de virus vaccinia y para poxvirus del canario (ALVAC), a través de la vía ic

29

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 24

Evaluación de NYVAC (vP866) y NYVAC-RG (vP879)

Inmunoprecipitaciones. Capas preformadas de células aviares o no aviares fueron inoculadas con 10 pfu por célula de virus NYVAC parental (vP866) o de virus NYVAC-RG (vP879) parental. La inoculación fue llevada a cabo en EMEM exento de metionina y suplementado con suero bovino fetal dializado al 2%. Transcurrida una hora de incubación, se eliminó el inoculum y se sustituyó el medio por EMEM (exento de metionina) conteniendo 20 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Después de incubación nocturna durante aproximadamente 16 horas, las células fueron sometidas a lisis mediante la adición de Tampón A (Nonidet P-40 1%, Tris 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, azida sódica 0,01%, 500 unidades por ml de aprotinina, y fluoruro de sulfonilmetilfenilo 0,02%). La inmunoprecipitación fue efectuada utilizando un anticuerpo monoclonal designado como 24-3F10, específico para glicoproteína de la rabia, suministrado por el Dr. C. Trimarchi, Griffith Laboratorios, New Cork State Department of Health, Albany, New York, y un conjugado anti-ratón de rata obtenido en Boehringer Mannheim Corporation (cat. # 605-500). Como matriz de apoyo se utilizó Proteína A Sepharose CL-48, obtenida en Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, New Jersey. Los inmunoprecipitados fueron fraccionados sobre geles de poliacrilamida al 10%, según el procedimiento de Dreyfuss et al., (1984). Los geles fueron fijados, tratados mediante fluorografía con salicilato sódico 1M, durante un período de una hora, y expuestos a película KODAK XAR-2 para visualizar la especie de proteína inmunoprecipitada.

Fuentes de animales. Los conejos blancos New Zealand fueron obtenidos en Hae-Marland (Hewitt, New Jersey). Ratones Swiss Webster machos, criados externamente, de tres semanas de edad, ratones Swiss Webster hembras embarazadas criados externamente y ratones atímicos (nu^{+}nu^{+}) Swiss Webster de cuatro semanas de edad fueron obtenidos en Taconic Farms, Inc. (Germantown, New York). La totalidad de los animales fue mantenida según las guías NIH. La totalidad de protocolos fueron aprobados por la IACUC institucional. Cuando se consideró necesario, los ratones que se encontraban obviamente en estado terminal fueron sacrificados.

Evaluación de lesiones en conejos. Cada uno de dos conejos fue inoculado intradérmicamente en múltiples sitios con 0,1 ml de PBS conteniendo 10^{4}, 10^{5}, 10^{6}, 10^{7} o 10^{8} pfu de cada uno de los virus de prueba o con PBS únicamente. Los conejos fueron observados diariamente, desde el día 4 hasta la resolución de la lesión. Las induraciones y las ulceraciones fueron medidas y registradas.

Recuperación de virus procedente de los sitios de inoculación. Un único conejo fue inoculado intradérmicamente en múltiples sitios con 0/1 ml de PBS conteniendo 10^{6}, 10^{7} o 10^{8} pfu de cada uno de los virus de prueba o con únicamente PBS. Transcurridos 11 días, el conejo fue sacrificado y muestras de biopsia de piel obtenidas de cada uno de los sitios de inoculación fueron preparadas de forma aséptica, a través de interrupción mecánica y sonicación indirecta para recuperación del virus. Los virus infecciosos fueron sometidos a ensayo por medio de titulación en placa sobre monocapas de CEF.

Virulencia en ratones. Grupos de diez ratones, o de cinco en el experimento con ratones atímicos, fueron inoculados ip con una de entre varias diluciones de virus en 0,5 ml de PBS estéril. Se hace también referencia al Ejemplo 23.

Tratamiento con ciclofosfamida (CY). Los ratones fueron inyectados a través de la vía ip con 4 mg (0,02 ml) de CY (SIGMA) en el día -2, seguido de inyección de virus en el día 0. Durante los días subsiguientes a la infección, los ratones fueron inyectados ip con CY: 4 mg el día 1; 2 mg los días 4, 7 y 11; 3 mg los días 14, 18, 21, 25 y 28. La inmunosupresión fue monitorizada indirectamente, mediante la enumeración de los glóbulos blancos con un Contador Coulter el día 11. La cuenta promedio de glóbulos blancos era de 13.500 por \mul para ratones no tratados (n=4) y de 4.220 por \mul para ratones control tratados con CY (n=5).

Cálculo de LD_{50}. La dosis letal requerida para producir el 50% de la mortalidad (LD_{50}) fue determinada a través del método proporcional de Reed y Muench (Read and Muench 1938).

Comprobación de potencia de NYVAC-RG en ratones. Ratones de entre cuatro y seis semanas de edad fueron inoculados en la planta del pie con entre 50 y 100 \mul de una gama de diluciones (2,0-8,0 log_{10} 50% de dosis infecciosa de cultivo tisular (TCID_{50})) de o bien VV-RG (Kieny et al., 1984), ALVAC-RG (Taylor et al., 1991b) o el NYVAC-RG. Cada uno de los grupos constaba de ocho ratones. A los 14 días de la vacunación, los ratones fueron desafiados a través de inoculación intracraneal con 15 LD_{50} de la cepa CVS del virus de la rabia (0,03 ml). El día 28, los ratones supervivientes fueron contados y se calculó el 50% de la dosis protectora (PD_{50}).

Derivación de NYVAC (vP886). La cepa NYVAC de virus vaccinia fue generada a partir de VC-2, un aislado de la cepa vacuna COPENHAGEN clonado en placa. Para generar NYVAC a partir de VC-2, dieciocho ORFs vaccinia, incluyendo un número de funciones víricas asociadas con virulencia, fueron suprimidas de forma precisa en una serie de manipulaciones secuenciales, tal y como se ha descrito antes en esta descripción. Estas supresiones fueron construidas de una manera concebida para evitar la aparición de marcos de lectura abierta no deseados. La Fig 19 muestra, de forma esquemática, los ORFs suprimidos para generar NYVAC. En la parte superior de la Fig. 19 se muestra el mapa de restricción HindIII del genoma del virus vaccinia (aislado de placa VC-2, cepa COPENHAGEN). Las seis regiones de VC-2 que fueron suprimidas de forma secuencial en la generación de NYVAC son expandidas. Las supresiones fueron descritas anteriormente en esta descripción (Ejemplos 13 a 18). Debajo de este lugar de supresión se listan los ORFs que fueron suprimidos del citado lugar, junto con las funciones u homologías y el peso molecular de sus productos genéticos.

Estudios de replicación de NYVAC y ALVAC en líneas celulares de tejido humano. Con vistas a determinar el nivel de replicación de la cepa NYVAC de virus vaccinia (vP866) en células de origen humano, seis líneas celulares fueron inoculadas con una multiplicidad de entrada de 0,1 pfu por célula en cultivo líquido e incubadas durante un período de 72 horas. El clon parental COPENHAGEN (VC-2) fue inoculado en paralelo. Células fibroblasto de embrión de pollito primarias (CEF) (obtenidas a partir de huevos embrionados de entre 10 y 11 días de edad de origen SPF, Spafas, Inc. Storrs, CT) fueron incluidas para representar un sustrato de células permisivas para todos los virus. Los cultivos fueron analizados en base a dos criterios: la ocurrencia de replicación vírica productiva y la expresión de un antígeno extrínseco.

El potencial de replicación de NYVAC en un determinado número de células derivadas humanas se muestra en la Tabla 20. Tanto VC-2 como NYVAC son capaces de replicación productiva en células CEF, si bien NYVAC presenta rendimientos ligeramente reducidos. VC-2 resulta también capaz de replicación productiva en las seis líneas derivadas humanas comprobadas, con rendimientos comparables, con la excepción de la línea celular linfoblastoide transformada por EBV JT-1 (línea celular linfoblastoide humana transformada con virus Epstein-Barr, ver Rickinson et al., 1984). Por el contrario, NYVAC resulta altamente atenuado en su capacidad de replicación productiva en cualquiera de las líneas celulares derivadas humanas objeto de comprobación. Se obtuvieron pequeños incrementos de virus infecciosos por encima de los niveles de virus residuales a partir de células MRC-5 infectadas por NYVAC (ATCC # CCl171, origen en pulmón embriónico humano), DETROIT 532 (ATCC # CCL54, prepucio humano, Síndrome de Down), HEL 299 (ATCC #CCL137, células de pulmón embrionicas humanas) y HNK (células de riñón neonatal humano, Whittiker Bioproducts, Inc. Walkersville, MD, Cat #70-151). La replicación de estas líneas celulares resultaba significativamente reducida cuando se compararon los rendimientos en virus obtenidos a partir de células CEF infectadas por NYVAC o con VC-2 parental (Tabla 20). Debe destacarse el hecho de que los rendimientos a las 24 horas en células CEF, tanto para el caso de NYVAC como VC-2, son equivalentes al rendimiento de 72 horas. El permitir que los cultivos de líneas celulares humanas se incuben durante un período adicional de 48 horas (otros dos ciclos de crecimiento vírico) puede, por tanto, haber amplificado el rendimiento de virus relativo obtenido.

En congruencia con los bajos nivele de virus obtenidos en las líneas celulares derivadas de humanos, MRC-5 y DETROIT 532, se detectaron niveles detectables, aunque reducidos, de acumulación de DNA específico de NYVAC. El nivel de acumulación de DNA en las líneas celulares infectadas por NYVAC, MRC-5 y DETROIT 532, en relación con el observado en células CEF infectadas por NYVAC se situaba en paralelo con los rendimientos de virus relativos. La acumulación de DNA vírico específico de NYVAC no fue observada en ninguna de las restantes células derivadas de humano.

Se llevó también a cabo un experimento equivalente utilizando el virus de la viruela aviar, ALVAC. Los resultados de la replicación el virus se muestran también en la Tabla 20. No se detectó virus progenie en ninguna de las líneas celulares humanas, en consonancia con la restricción de rango de huésped del poxvirus del canario, para especies aviares. Está también en consonancia con la falta de replicación productiva de ALVAC en estas células derivadas de humanos, la observación de que no se detectó acumulación de DNA específico de ALVAC en ninguna de las líneas celulares derivadas de humanos.

Expresión de glicoproteína de la rabia a través de NYVAC-RG (vP879) en células humanas. Con vistas a determinar si podía obtenerse una expresión eficaz de un gen extraño en ausencia de niveles significativos de replicación vírica productiva, las mismas líneas celulares fueron inoculadas con el recombinante NYVAC que expresa la glicoproteína del virus de la rabia (vP879, Ejemplo 19), en presencia de ^{35}S-metionina. La inmunoprecipitación de la glicoproteína de la rabia fue llevada a cabo a partir del lisato de cultivo radiomarcado, utilizando un anticuerpo monoclonal específico para la glicoproteína de la rabia. La inmunoprecipitación de una proteína de 67kDa fue detectada en consonancia con una forma plenamente glicosilada de la glicoproteína de la rabia. No se detectó producto serológicamente reactivo cruzado en lisatos celulares infectados por NYVAC parentales o en lisatos no infectados. Se obtuvieron resultados equivalentes a los de la totalidad de las otras células humanas analizadas.

Inoculaciones sobre la piel de conejo. La inducción y la naturaleza de las lesiones de piel en conejos después de inoculaciones intradérmicas (id) ha sido utilizada previamente como medida de patogenicidad de cepas de virus vaccinia (Buller et al., 1988; Child et al., 1990; Fenner, 1958, Flexner et al., 1987; Ghendon and Chernos 1964). Por lo tanto, la naturaleza de las lesiones asociadas con inoculaciones id con las cepas vaccinia WR (ATCC # VR119 purificada en placa sobre células CV-1, ATCC #CCL70 y un aislado de placa designado como variante L, ATCC # VR2035 seleccionado, tal y como se ha descrito en Panicali et al., 1981)), WYETH (ATCC # VR325 comercializada como DRYVAC por Wyeth Laboratorios, Marietta, PA), COPENHAGEN (VC-2) y NYVAC, fue evaluada a través de inoculación de dos conejos (A069 y A128). Los dos conejos mostraron deferentes sensibilidades globales hacia los virus, desplegando el conejo A128 reacciones menos graves que el conejo A069. En el conejo A128, las lesiones eran relativamente pequeñas y se resolvieron a los 27 días de la inoculación. En el conejo A069, las lesiones eran intensas, especialmente en los sitios de inoculación de WR, y se resolvieron tan solo después de 49 días. La intensidad de las lesiones estaba en función de la localización de los sitios de inoculación, en relación con la red de drenaje linfático. En particular, todos los sitios localizados por encima del espinazo mostraron lesiones más intensas y requerían tiempos más prolongados para resolver las lesiones localizadas sobre los flancos. Todas las lesiones fueron medidas diariamente, a partir del día 4 y hasta la desaparición de la última lesión, y se calcularon los tamaños promedio de lesión máxima y los días de resolución (Tabla 21). No se observaron reacciones locales a partir de los sitios inyectados con la PBS control. Se observaron lesiones ulcerosas en los sitios inyectados con cepas de virus vaccinia WR, VC-2 y WYETH. De forma significativa, no se observaron lesiones ulcerosas ni induraciones en los sitios de inoculación con
NYVAC.

Persistencia de virus infeccioso en el sitio de inoculación. Para valorar la persistencia relativa de estos virus en el sitio de inoculación, se inoculó un conejo intradérmicamente en múltiples sitios con 0,1 ml de PBS que contiendo 10^{6}, 10^{7} o 10^{8} pfu de VC-2, WR, WYETH o NYVAC. Para cada uno de estos virus, la dosis de 10^{7} pfu fue localizada por encima del espinazo, flanqueada por las dosis de 10^{6} y 10^{8}. Lo sitios de inoculación fueron observados diariamente, durante 11 días. El WR generó las respuestas más intensas, seguido del VC-2 y WYETH (Tabla 22). La ulceración fue observada primeramente en el día 9 para WR y WYETH y en el día 10 para VC-2. Los sitios inoculados con NYVAC o PBS control no mostraron induración o ulceración. En el día 11 después de la inoculación, se obtuvieron muestras de piel, mediante medios mecánicos, a partir de los sitios de inoculación y el virus fue titulado sobre células CEF. Los resultados se muestran en la Tabla 22. En ningún caso no se recuperó más virus en este momento que el que fue administrado. La recuperación de la cepa vaccinia, WR, era de aproximadamente 10^{6} pfu de virus de cada uno de los sitios, con independencia de la cantidad de virus administrada. La recuperación de cepas vaccinia WYETH y VC-2 era de entre 10^{3} y 10^{4} pfu, con independencia de la cantidad administrada. No se recuperó virus infeccioso a partir de los sitios inoculados con NYVAC.

Inoculación de ratones genética o químicamente inmunodeprimidos. La inoculación intraperitoneal de elevadas dosis de NYVAC (5 x 10^{8} pfu) o de ALVAC (10^{9} pfu) en ratones atímicos no provocó muertes, ni lesiones, ni ninguna enfermedad aparente a lo largo de los 100 días del período de observación. Por el contrario, los ratones inoculados con WR (10^{3} a 10^{4} pfu), mostraron lesiones diseminadas típicas de los poxvirus, primero en los dedos de los pies, después en la cola, seguido de orquitis grave en algunos animales. En ratones infectados con WR o WYETH, la aparición de lesiones diseminadas conducía generalmente a la muerte final, mientras que muchos de los ratones infectados con VC-2 se recuperaron finalmente. Los valores calculados de LD_{50} se proporcionan en la Tabla 23.

En particular, los ratones inoculados con VC-2 empezaron a mostrar lesiones en los dedos (manchas rojas) y uno o dos días más tarde, en la cola. Estas lesiones se produjeron entre los días 11 y 13 posteriores a la inoculación (pi) en ratones a los que se les había proporcionado las dosis más elevadas (10^{9}, 10^{8}, 10^{7} y 10^{6} pfu), en el día 16 pi en ratones a los que se había proporcionado 10^{5} pfu y en el día 21 pi en ratones a los que se les había proporcionado 10^{4} pfu. No se observaron lesiones en ratones inoculados con 10^{3} y 10^{2} pfu durante los 100 días del período de observación. La orquitis fue detectada en día 23 pi en ratones a los que se había proporcionado 10^{9} y 10^{8} pfu y aproximadamente 7 días después en los otros grupos (10^{7} a 10^{4} pfu). La orquitis fue especialmente intensa en los grupos 10^{9} y 10^{8} pfu y, aunque hubo reducción, fue observada hasta la terminación del período de observación de 100 días. Algunas lesiones de tipo poxvirus fueron detectadas en la piel de unos pocos ratones, teniendo lugar entre 30 y 35 días después pi. La mayor parte de las lesiones de poxvirus se curaron normalmente entre 60 y 90 días pi. Tan solo un ratón murió en el grupo inoculado con 10^{9} pfu (día 34 pi) y un ratón murió en el grupo inoculado con 10^{8} pfu (día 94 pfi). No se observaron otras muertes en los ratones inoculados con VC-2.

Los ratones inoculados con 10^{4} pfu de la cepa WR de vaccinia empezaron a mostrar lesiones de poxvirus el día 17 pi. Estas lesiones parecían idénticas a las lesiones mostradas por ratones inyectados con VC-2 (dedos hinchados, cola). Los ratones inoculados con 10^{3} pfu de la cepa WR no desarrollaron lesiones hasta 34 días pi. La orquitis fue observada tan solo en los ratones inoculados con las dosis más elevada de WR (10^{4} pfu). Durante las últimas fases del período de observación, aparecieron lesiones alrededor de la boca y los ratones dejaron de comer. La totalidad de los ratones inoculados con 10^{4} pfu de WR murieron o fueron sacrificados, cuando se estimó necesario, entre los días 21 y 31 pi. Cuatro de los cinco ratones inyectados con 10^{3} pfu de WR murieron o fueron sacrificados cuando se consideró necesario entre 35 y 57 días pi. No se observaron muertes en ratones inoculados con dosis más bajas de WR (1 a 100 pfu).

Ratones inoculados con la cepa WYETH de virus vaccinia a dosis más elevadas (5 x 10^{7} y 5 x 10^{8} pfu) mostraron lesiones en los dedos y en las colas, desarrollaron orquitis y murieron. Los ratones inyectados con 5 x 10^{6} pfu o menos de WYETH no mostraron señales de enfermedad o de lesiones.

Tal y como se muestra en la Tabla 23, los ratones tratados con CY proporcionaron un modelo más sensible para ensayar la virulencia del poxvirus que el de los ratones atímicos. Los valores LD_{50} para las cepas de virus vaccinia WR, WYETH y VC-2 eran significativamente más bajos en este sistema modelo que en el modelo de ratón atímico. Adicionalmente, en los ratones inyectados con virus vaccinia WR, WYETH, y VC-2, tal como se ha mencionado anteriormente, se desarrollaron lesiones, traduciéndose las dosis más elevadas de cada uno de los virus en una formación más rápida de lesiones. Tal y como se observó con los ratones atímicos, los ratones tratados con CY, inyectados con NYVAC o ALVAC, no desarrollaron lesiones. No obstante, a diferencia de los ratones atímicos, se observaron algunas muertes en los ratones tratados con CY desafiados con NYVAC o ALVAC, con independencia de la dosis. Estas incidencias aleatorias hacen sospechar acerca de la causa de la muerte.

Los ratones inyectados con todas las dosis de WYETH (de 9,5 x 10^{4} hasta 9,5 x 10^{8} pfu) mostraron lesiones provocadas por poxvirus en sus colas y/o en sus dedos, entre 7 y 15 días pi. Además, las colas y los dedos estaban hinchados. La evolución de las lesiones sobre la cola resultaba típica de lesiones de poxvirus, con formación de una mancha, ulceración y, finalmente, formación de una costra. Los ratones inoculados con todas las dosis de VC-2 (entre 1,65 x 10^{5} y 1,65 x 10^{9}) desarrollaron también lesiones de poxvirus en sus colas y en sus dedos, análogas a las de los ratones inyectados con WYETH. Estas lesiones fueron observadas entre 7 y 12 días posteriores a la inoculación. No se observaron lesiones en ratones inyectados con dosis más bajas de virus WR, s bien en este grupo tuvieron lugar algunas muertes.

Comprobación de potencia de NYVAC-RG. Con vistas a determinar que se había efectuado la atenuación de la cepa COPENHAGEN de virus vaccinia sin alteración significativa de la capacidad de la cepa NYVAC resultante de ser un vector de utilidad, se llevaron a cabo pruebas de potencia comparativas. Con vistas a monitorizar el potencial inmunogénico del vector durante las manipulaciones genéticas secuenciales llevadas a cabo para atenuar el virus, se utilizó como antígeno extrínseco informador una glicoproteína de virus de la rabia. La eficacia protectora de los vectores que expresan el gen de glicoproteína de la rabia fue evaluada en la prueba de potencia de ratón NIH estándar (Seligmann, 1973). La Tabla 24 demuestra que los valores PD_{50} obtenidos con el vector NYVAC altamente atenuado son idénticos a los obtenidos utilizando un recombinante de base COPENHAGEN que contiene el gen de la glicoproteína de la rabia en la localización tk (Kient et al., 1984) y similar a los valores PD_{50} obtenidos con ALVAC-RG, un vector basado en poxvirus del canario restringido a replicación en especies aviares.

Observaciones. El NYVAC, suprimido de genes de virulencia conocida y teniendo características de crecimiento in vitro restrictivas, fue analizado en sistemas de modelo animal, para valorar sus características de atenuación. Estos estudios fueron llevados a cabo en comparación con la cepa de laboratorio de virus vaccinia neovirulenta, WR, dos cepas de vacuna de virus vaccinia, WYETH (New York City Board of Health) y COPENHAGEN (VC-2), al igual que con una cepa de poxvirus del canario, ALVAC (Ver también el ejemplo 23). Conjuntamente, estos virus proporcionaron un espectro de potenciales patogénicos relativos, en el modelo de desafío de ratón y en el modelo de piel de conejo, siendo WR la cepa más virulenta, proporcionando WYETH y COPENHAGEN (VC-2) cepas de vacuna atenuadas utilizadas previamente con características documentadas y proporcionando ALVAC un ejemplo de poxvirus cuya replicación está restringida a especies aviares. Los resultados a partir de estos análisis in vivo demuestran claramente las propiedades altamente atenuadas de NYVAC, en relación con las cepas de virus vaccinia WR, WYETH y COPENHAGEN (VC-2) (Tablas 18 a 24). De forma significativa, los valores LD_{50} para NYVAC eran comparables a los observados con el virus avipox de huésped aviar restringido, ALVAC. Muertes debidas a NYVAC, al igual que ALVAC, fueron observadas tan solo cuando dosis extremadamente elevadas de virus eran administradas a través de la ruta intracraneal (Ejemplo 23, Tablas 18, 19, 23). No se ha establecido si estas muertes eran debidas a consecuencias no específicas de inoculación de una masa de proteína elevada. Los resultados de los análisis en modelos de ratón inmunodeprimido (atímicos y tratados con CY), demostraron también las características de atenuación relativamente elevadas de NYVAC, en comparación con las de las cepas WR, WYETH y COPENHAGEN (Tablas 21 y 22). De forma significativa, no se observó evidencia de infección de vaccinia diseminada ni de enfermedad debida a vaccinia en animales inoculados con NYVAC o en animales inoculados con ALVAC a lo largo del período de observación. La supresión de genes asociados con virulencia múltiple en NYVAC muestra un efecto sinérgico con relación a la patogenicidad. Otra medida de la inocuidad de NYVAC fue proporcionada por la administración intradérmica sobre piel de conejo (Tablas 21 y 22). Considerando los resultados con ALVAC, un virus incapaz de replicarse en especies no aviares, la capacidad de replicación en el sitio de inoculación no es la única que está relacionada con la reactividad, dado que la inoculación intradérmica de ALVAC provocaba áreas de induración de una forma dependiente de la dosis. Por lo tanto, resulta probable que factores diferentes a la capacidad replicativa del virus contribuyan a la formación de las lesiones. La supresión de genes en NYVAC evita la ocurrencia de
lesiones.

Conjuntamente, los resultados en este ejemplo y en los ejemplos anteriores, incluyendo el Ejemplo 23, demuestran la naturaleza altamente atenuada de NYVAC en relación con WR y las cepas vacuna de virus vaccinia utilizadas con anterioridad, WYETH y COPENHAGEN. De hecho, el perfil patogénico de NYVAC, en los sistemas de modelo animal probados, resultaba similar a la de ALVAC, un poxvirus conocido por replicarse de forma productiva tan solo en especies aviares. La capacidad aparentemente restringida de NYVAC para replicarse productivamente en célula derivadas de humanos (Tabla 20) y de otras especies, incluyendo ratón, cerdo, perro y caballo, proporciona una barrera considerable que limita o evita la transmisión potencial hacia contactos no vacunados o hacia el entorno general, además de proporcionar un vector con probabilidad reducida de diseminación dentro del individuo
vacunado.

De forma significativa, los candidatos vacuna basados en NYVAC han demostrado resultar eficaces. Recombinantes NYVAC que expresan productos de genes extraños a partir de un determinado número de patógenos han generado respuestas inmunológicas hacia los productos del gen extraño en diversas especies de animales, incluyendo los primates. En particular, un recombinante basado en NVAC que expresa las gricloproteína de la rabia era capaz de proteger a los ratones frente al desafío de la rabia letal. La potencia del recombinante de glicoproteína de la rabia basado en NYVAC era comparable con el valor PD_{50} para un recombinante basado en COPENHAGEN que contiene la glicoproteína de la rabia en la localización tk (Tabla 24). Los recombinantes basados en NYVAC han demostrado también poseer capacidad para generar anticuerpos neutralizadores de virus del sarampión en conejos y protección frente al virus de pseudorrabia y frente al desafío del virus de encefalitis japonesa en cerdos. La cepa NYVAC altamente atenuada confiere ventajas de seguridad en aplicaciones humanas y veterinarias (Tartaglia et al., 1990). Además, la utilización de NYVAC como sistema vector de expresión de laboratorio puede reducir en gran manera los riesgos biológicos asociados con la utilización de virus vaccinia.

A través de los siguientes criterios, los resultados de este ejemplo y los ejemplos del presente documento, incluyendo el ejemplo 23, se indican las razones por las que NYVAC resulta ser altamente atenuado: a) ausencia de induración o de ulceración detectables en el sitio de inoculación (piel de conejo); b) liberación rápida de virus infeccioso a partir del sitio intradérmico de inoculación (piel de conejo); c) ausencia de inflamación testicular (ratones atímicos); d) virulencia reducida de forma acusada (desafío intracraneal, tanto en ratones recién nacidos como en ratones de tres semanas de edad; e) patogenicidad reducida en gran manera y fallo en la diseminación en sujetos inmunodeprimidos (ratones tratados con ciclofosfamida y atímicos); y f) reducción drástica en la capacidad de replicación en una variedad de células de cultivo de tejido humano. Sin embargo, en lugar de resultar altamente atenuado, NYVAC, como vector, conserva la capacidad de incluir potentes respuestas inmunes frente a antígenos
extrínsecos.

TABLA 20 Replicación de COPENHAGEN (VC-2), NYVAC y ALVAC en líneas celulares aviares y en líneas celulares derivadas de humano

30

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a: \+  \begin{minipage}[t]{140mm} rendimiento de NYVAC a las 72
horas posteriores a la infección, expresado como porcentaje de
rendimiento  de VAC-2 después de 72 horas en la
misma línea celular. \end{minipage} \cr  b: \+ título expresado
como LOG _{50}  pfu por ml.\cr  c: \+ la muestra fue incubada en
presencia de 40  \mu g/ml de citosina arabinósido.\cr  d: \+ no
determinado\cr  e: \+ ATCC # CCL25 células amniónicas
humanas\cr}

TABLA 21 Induración y ulceración en el sitio de inoculación intradérmica de la piel de conejo

\vskip1.000000\baselineskip

32

	^{a}	pfu de virus vaccinia indicado en 0,1 ml de PBS inoculado intradérmicamente en un sitio
	^{b}	tamaño máximo promedio de lesiones (mm^{2})
	^{c}	tiempo promedio después de la inoculación para el curado completo de la lesión.
	^{d}	ausencia de lesiones discernibles

TABLA 22 Persistencia de virus de viruela en el sitio de inoculación intradérmica

\vskip1.000000\baselineskip

34

a.: expresado como log_{10} pfu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 23 Estudios de virulencia en ratones inmunodeprimidos

\vskip1.000000\baselineskip

35

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a. \+  \begin{minipage}[t]{138mm} dosis letal 50% calculada
(pfu) para ratones atímicos o ratones tratados con ciclofosfamida,
por medio de  los virus vaccinia indicados y para ALVAC, a través de
la vía intreperitoneal. \end{minipage} \cr  b. \+ 5 de 10
ratones murieron a raíz de la dosis más elevada de 5 x 10 ^{8} 
pfu.\cr}

TABLA 24 Eficacia comparativa de NYVAC-RG y ALVAC-RG en ratones

\vskip1.000000\baselineskip

37

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a. \+  \begin{minipage}[t]{138mm} ratones de entre cuatro y
seis semanas de edad fueron inoculados en la planta del pie con
entre 50 y 100  \mu l  de una gama de diluciones (50% de la dosis de
infección de cultivo tisular 2,0 - 8,0 log _{10}  (TCID _{50} )  de
o bien VV-RG (Kieny  et al ., 1984),
ALVAC-RG (vCP65) o NYVAC-RG (vP879).
En el día 14, ratones de cada uno  de los grupos fueron desafiados
mediante inoculación intracraneal de 30  \mu l de un virus de la
rabia, cepa  CVS vivo, correspondiente a 15 dosis letal 50%
(LD _{50} ) para ratón. En el día 28, los ratones supervivientes 
fueron contados y se calculó una dosis protectora 50% (PD _{50} ).
\end{minipage} \cr}

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 25

Construcción de recombinantes TROVAC que expresan las glicoproteínas hemaglutinina de los virus de la gripe aviar

Este ejemplo describe el desarrollo de recombinantes de poxvirus de aves de corral que expresan los genes de hemaglutinina de tres serotipos de virus de la gripe aviar.

Células y virus. Plásmidos que contienen clones cDNA de genes de hemaglutinina H4, H5 y H7 fueron obtenidos en Dr. Robert Webster, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tenessee. La cepa de FPV designada como FP-1 ha sido descrita anteriormente (Taylor et al., 1988a,b). Es una cepa de vacuna útil en la vacunación de pollos de un día de edad. La cepa Duvette de virus parental fue obtenida en Francia como una crosta de poxvirus de ave de corral en un pollo. El virus fue atenuado mediante aproximadamente 50 pasos en serie en huevos embrionados de pollo, seguido de 25 pasos sobre células fibroblasto (CEF) de embrión de pollito. Este virus fue obtenido en septiembre de 1980 por Rhone Merieux, Lyon, France y se estableció una semilla vírica master. El virus fue recibido por Virogenetics en septiembre de 1989, y fue sometido a cuatro purificaciones en placa sucesivas. Un aislado de placa fue amplificado adicionalmente en células CEF primarias y se estableció un virus stock, designado como TROVAC. El virus stock utilizado en la prueba de recombinación in vitro para producir TROVAC-AIH5 (vFP89) y TROVAC-AIH4 (vFP92) había sido amplificado adicionalmente a través de 8 pasos en células CEF primarias. El virus stock utilizado para producir TROVAC-AIH7 (vFP100) había siso amplificado adicionalmente a través de 12 pasos en células CEF primarias.

Construcción de plásmido de inserción de poxvirus de aves de corral en la localización F8. El plásmido pRW731,15 contiene un fragmento de 10 kbp PvuII-PvuII clonado a partir de DNA genómico TROVAC. La secuencia de nucleótidos fue determinada sobre ambas hebras para un fragmento de 3659 bp PvuII-EcoRV. Esta secuencia es mostrada en la Fig. 20 (SEQ ID NO: 72). Los límites de un marco de lectura abierta, designado en este laboratorio como F8, fueron determinados dentro de esta secuencia. El marco de lectura abierta se inicia en la posición 495 y termina en la posición 1887. Se efectuó una supresión desde la posición 779 a la posición 1926, tal y como se describe más
adelante.

El plásmido pRW761 es un subclón de pRW731.15, que contiene un fragmento EcoRV-EcoRV de 2430 bp. El plásmido pRW761 fue completamente digerido con XbaI y parcialmente digerido con SspI. Una banda XbaI-SspI de 3700 bp fue aislada y ligada con los oligonucleótidos de doble hebra anillados JCA017 (SEQ ID NO. 60) y JCA018 (SEQ ID NO: 61).

38

El plásmido resultante de esta unión fue designado como pJCA002. El plásmido pJCA004 no contiene un gen pertinente unido al promotor H6 de virus vaccinia en el plásmido pJCA002. La secuencia del promotor H6 de virus vaccinia ha sido descrita previamente (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989). El plásmido pJCA004 fue digerido con EcoRV y BamHI, que suprimen el gen no pertinente y una parte del extremo 3' del promotor H6. Los oligonucleótidos RW178 (SEQ ID NO: 73) y RW179 (SEQ ID NO: 74) anillados fueron cortados con EcoRV y BamHI e insertados entre los sitios EcoRV y BamHI de JCA004 y pRW846.

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

Por lo tanto, el plásmido pRW846 contiene el promotor H6 5' de EcoRV en la localización de-ORFFedF8. El sitio HincII 3' del promotor H6 en pRW846 es seguido por codónes de terminación de traducción, una secuencia de terminación transcripcional reconocida por promotores tempranos del virus vaccinia (Yuen et al., 1987) y un sitio SmaI.

Construcción de plásmido de inserción de poxvirus de ave de corral en la localización F7. El plásmido de inserción original F7 no de-ORFFed, pRW731.13 contenía un fragmento PvuII genómico FP de 5,5 bp en el sitio PvuII de pUC9. El sitio de inserción era un HincII único dentro de estas secuencias. La secuencia de nucleótidos mostrada en la Fig. 21 (SEQ ID NO: 75) fue determinada para una región de 2356 bp que abarca el único sitio HincII. El análisis de esta secuencia reveló que el único sitio HincII (Gig 21, subrayado) estaba situado dentro de un ORF que codifica para un polipéptido de 90 aminoácidos. El ORF comienza con un ATG en la posición 1531 y termina en la posición 898 (posiciones marcadas por medio de flechas en la Fig. 21).

Los brazos para el plásmido de inserción de-ORFFed fueron derivados mediante PCR, utilizando pRW731.13 como plantilla. Un brazo de 596 bp (designado como HB), correspondiente a la región situada aguas arriba del ORF fue amplificado con oligonucleótidos F73PH2 (SEQ ID NO: 76) (5'-GACAATCTAAGTCCTATATTAGAC-3') y F73PB (SEQ ID NO: 77) (5'-GGATTTTTAGGTAGACAC-3'). Un brazo de 270 bp (designado como EH), correspondiente a la región aguas abajo del marco de lectura abierta, fue amplificada utilizando los polinucleótidos F75PE (SEQ ID NO: 58) (5'-TCATCGTTCATCATCG-3') y F73PH1 (SEQ ID NO: 79) (5'-GTCTTAAACTTATTGTAAGGGTATACCTG-3').

El fragmento EH fue digerido con EcoRV para generar un fragmento de 126 bp. El sitio EcoRV está en el extremo 3' y el extremo 5' fue obtenido, mediante PCR, con vistas a contener el extremo 3' de un sitio HincII. Este fragmento fue insertado en pBS-SK (Stratagene, La Jolla, CA), digerido con HincII para formar el plásmido pF7D1. La secuencia fue confirmada mediante análisis de secuencia de didesoxinucleótido. El plásmido pF7D1 fue linearizado con ApaI, se redondearon los extremos utilizando T4 DNA polimerasa y se ligó al fragmento HB de 596 bp. El plásmido resultante fue designado como pF7D2. La secuencia completa y la orientación fueron confirmadas a través de análisis de secuencia de nucleótido.

El plásmido pF7D2 fue digerido con EcoRV y BglII para generar un fragmento de 600 bp. Este fragmento fue insertado en pBS-SK que fue digerido con ApaI, se redondearon los extremos con T4 DNA polimerasa y subsiguientemente digerido con BamHI. El plásmido resultante fue designado como pF7D3. Este plásmido contiene un brazo HB de 404 bp y un brazo EH de 126 bp.

El plásmido pF7D3 fue linearizado con XhoI y se redondearon los extremos con el fragmento Klenow de la E. Coli DNA polimerasa, en presencia de dNTPs 2 mM. Este plásmido linearizado fue ligado con los oligonucleótidos anillados F7MCSB (SEQ ID NO: 80) (5'-AACGATTAGTTAGTTACTAAAAGCTTGCTGCAGCCCGGGTTTTTT ATTAGTTTAGTTAGTC-3') y F7MCSA (SEQ ID NO: 81) (5'-GACTAACTAACTAATAAAAAACCCGGGCTG
CAGCAAGCTTTTTGTAAC TAACTAATCGTT-3'). Esto fue llevado a cabo para insertar una región de clonado múltiple que contiene los sitios de restricción para HindIII, PstI y SmaI, entre los brazos EH y HB. El plásmido resultante fue designado como pF7DO.

Construcción de plásmido de inserción para hemaglutinina H4 en la localización F8. Una copia de cDNA que codifica para el H4 de gripe aviar procedente de A/Ty/Min/833/80, fue obtenida en Dr. R. Webster, en el plásmido pTM4H833. El plásmido fue digerido con HindIII y NruI y los extremos se redondearon utilizando el fragmento Klenow de DNA polimerasa, en presencia de dNTPs. El fragmento de extremos redondeados HindIII-NruI de 2,5 kbp, que contiene la región de codificación H4, fue insertado en el sitio HincII de pIBI25 (International Biotechnologies, Inc. New Haven, CT). El plásmido pRW828 resultante fue cortado parcialmente con BanII, el producto lineal aislado y recortado con HindIII. El plásmido pRW828, ahora con una supresión HindIII-BanII de 100 bp, fue utilizado como vector para los oligonucleótidos sintéticos RW151 (SEQ ID NO: 82) y RW 153 (SEQ ID NO: 83). Estos oligonucleótidos representan la parte 3' del promotor H6 procedente del sitio EcoRV y alinean el ATG del promotor con el ATG del H4 cDNA.

40

Los oligonucleótidos fueron anillados con BanII y HindIII e insertados en el vector pRW828 con HindIII-BanII suprimido, descrito anteriormente. El plásmido pRW844 resultante fue cortado con EcoRV y DraI y el fragmento de 1,7 bp que contiene la secuencia de codificación H4 promocionada por H6 3' fue insertado entre los sitios EcoRV y HincII de pRW846 (descrito anteriormente), formando el plásmido pRW848. El plásmido pRW848 contiene, por tanto, la secuencia de codificación H4 unida al promotor H6 de virus vaccinia en la localización de-ORFFed F8 del poxvirus de ave de corral.

Construcción de plásmido de inserción para hemaglutinina H5, en la localización F8. Un clon cDNA de virus de la gripe aviar H5 derivado de A/Turkey/Ireland/1378/83, fue recibido en plásmido pTH29 en Dr. R. Webster. Los oligonucleótidos sintéticos RW10 (SEQ ID NO: 84) a RW13 (SEQ ID NO: 87), fueron designados para sobreponer el codón de inicio de la traducción del promotor H6 del virus vaccinia descrito anteriormente con el ATG del gen H5. La secuencia continua a través del sitio 5' SalI del gen H5 y comienza de nuevo en el sitio 3' H5 DraI que contiene el codón de terminación H5.

41

Los oligonucleótidos fueron anillados a 95ºC durante tres minutos, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Esto da lugar a la siguiente estructura de doble hélice con los extremos indicados

42

El clonado de oligonucleótidos entre los sitios EcoRV y PstI de pRW742B dió lugar al pRW744. El plásmido pRW742B contiene el promotor H6 de virus vaccinia unido a un gen no pertinente insertado en el sitio HincII de pRW731.15, descrito anteriormente. La digestión con PstI y EcoRV elimina el gen no pertinente y el extremo 3' del promotor H6. El plásmido pRW744 contiene ahora la parte 3' del promotor H6 que se superpone con el ATG del virus de la gripe aviar H5. El plásmido contiene también la secuencia H5 a través del sitio 5' SalI y la secuencia 3' del codón de detención de H5 (que contiene un sitio DraI). La utilización del sitio DraI elimina la terminación 3' no codificadora de H5. Los oligonucleótidos añaden una señal de terminación de transcripción reconocida por la RNA polimerasa del virus vaccinia temprano (Yuen et al., 1987). Para completar la construcción H5 promocionada por H6, la región codificante H5 fue aislada como un fragmento SalI-DraI de 1,6 kbp, procedente de pTH29. El plásmido pRW744 fue parcialmente digerido con DraI, el fragmento lineal aislado, recortado con SalI y el plásmido ahora con ocho bases suprimidas entre SalI y DraI se utilizó como vector para el fragmento DraI y el fragmento pTH29 de 1,6 kpb. El plásmido resultante pRW759 fue cortado con EcoRV y DraI. El fragmento PRW759EcoRV-DraI de 1,7 kbp que contiene el promotor H6 3' y el gen H5 fue insertado entre los sitios EcoRV y HincII de pRW846 (descritos previamente). El plásmido resultante pRW849 contiene el gen H5 del virus de la gripe aviar promocionado por H6, en la localización de-ORFed F8.

Construcción del vector de inserción para H7 hemaglutinina en la localización F7. El plásmido pCVH71 que contiene la hemaglutinina H7 procedente de A/CK/VIC/1/85 fue recibido desde Dr. R. Webster. Un fragmento EcoRI-BamHI que contiene el gen H7 fue redondeado en el extremo con el fragmento Klenow de DNA polimerasa e insertado en el sitio HincII de pIBI25 como pRW827. Los oligonucleótidos sintéticos RW165 (SEQ ID NO: 88) y RW166 (SEQ ID NO: 89) fueron anillados, cortados con HincII y StyI e insertados entre los sitios EcoRV y StyI de pRW827, para generar pRW845.

43

Los oligonucleótidos RW165 (SEQ ID NO: 88) y RW166 (SEQ ID NO: 89) unen la parte 3' del promotor H6 con el gen H7. El extremo no codificador 3' fue eliminado por medio de aislamiento del producto lineal de una digestión ApaLI de pRW845, recorte con EcoRI, aislamiento del fragmento y anillado con los oligonucleótidos RW227 (SEQ ID NO: 90) y RW228 (SEQ ID NO: 91). El plásmido resultante era pRW854.

513

514

El codón de finalización de H7 en PRW854 es seguido de un sitio HpaI. La construcción H7 en la localización de-ORFedF7 (descrita más adelante), promocionada por el intermedio H6, fue generada mediante el desplazamiento de pRW854 EcoRV-HpaI hacia pRW858 que había sido cortado con EcoRV y redondeado en su extremo en su sitio PstI. El plásmido pRW858 (descrito más adelante) contiene el promotor H6 en un plásmido de-ORFed F7.

El plásmido pRW858 fue construido mediante inserción de un fragmento SmaI/HpaI de 850 bp, que contiene el promotor H6 unido a un gen no pertinente, en el sitio SmaI de pF7DO descrito anteriormente. Las secuencias no pertinentes fueron extraídas por medio de digestión de pRW858 con EcoRV (sitio de 24 bp aguas arriba de la terminación 3' del promotor H6) y PstI. El fragmento resultante de 3,5 kb fue aislado y redondeado en los extremos utilizando el fragmento Klenow de la E. Coli DNA polimerasa, en presencia de dNTPs 2 mM. Este fragmento de extremos redondeados fue ligado a un fragmento EcoRV/HpaI de 1700 bp derivado de pRW854 (descrito anteriormente). Este fragmento EcoRV/HpaI contiene el gen AIV HA (H7), yuxtapuesto 3' con la mayoría de las 24 bp de 3' del promotor VV H6. El plásmido resultante fue designado como pRW861.

El brazo EH de 126 bp (definido anteriormente) fue extendido en pRW861 para incrementar la frecuencia de recombinación con DNA TROVAC genómico. Para lograr esto, un fragmento AccI/SnaBI fue derivado de pRW731.13 (definido anteriormente). El fragmento fue aislado e insertado entre los sitios AccI y NaeI de pRW861. El plásmido resultante, que contiene un brazo EH de 725 bp y un brazo HB de 404 bp que flanquean al gen AIV H7, fue designado como pRW869. Por lo tanto, el plásmido pRW869 comprende la secuencia de codificación de H7 unida a su extremo 5' con el promotor H6 del virus vaccinia. El brazo flanqueante izquierdo comprende 404 bp de la secuencia TROVAC y el brazo flanqueante derecho de 725 bp de la secuencia TROVAC que dirige la inserción con la localización de-ORFFe F7.

Desarrollo de recombinantes del virus de la gripe aviar TROVAC. Plásmidos de inserción que contienen las secuencias de codificación del virus HA de la gripe aviar fueron transfectados de modo individual en células CEF primarias infectadas con TROVAC, mediante la utilización del procedimiento de precipitación con fosfato cálcico descrito anteriormente (Panicali et al., 1982, Piccini et al., 1987). Las placas positivas fueron seleccionadas en base a la hibridación con sondas radiomarcadas específicas para HA y sometidas a rondas secuenciales de purificación en placa hasta que se logró una población pura. Una placa representativa fue entonces amplificada para producir un virus stock. El plásmido pRW849 fue utilizado en una prueba de recombinación in vitro para producir TROVAC-AIH5 (vFP89) recombinante que expresa la hemaglutinina H5. El plásmido pRW848 fue utilizado para producir TROVAC-AIH4 recombinante (vFP92) que expresa la hemaglutinina H4. El plásmido pRW869 fue utilizado para producir TROVAC-AIH7 recombinante (vFP100) que expresa la hemaglutinina H7.

Inmunofluorescencia. En células infectadas con virus de la gripe, la molécula HA es sintetizada y glicosilada en forma de molécula precursora en el retículo endoplásmico áspero. Durante el paso hacia la membrana de plasma, la misma sufre una amplia modificación post-traduccional que culmina en la rotura proteolítica en las subunidades HA_{1} y HA_{2}, unidas por disulfuro, y la inserción en la membrana de la célula huésped, donde es incorporada con posterioridad en coberturas víricas maduras. Con vistas a determinar si las moléculas HA producidas en células infectadas con los virus recombinantes TROVAC-AIV eran expresadas en la superficie, se llevaron a cabo estudios de inmunofluorescencia. La inmunofluorescencia directa fue llevada a cabo tal y como se ha descrito (Taylor et al., 1990). La expresión en superficie de la hemaglutinina H5 en TROVAC-AIH5, de la hemaglutinina H4 en TROVAC-AIH4 y de la hemaglutinina H7 en TROVAC-AIH7 fue confirmada a través de inmunofluorescencia indirecta. La expresión de la hemaglutinina H5 fue detectada utilizando una agrupación de anticuerpos monoclonales específicos para H5HA. La expresión de H4HA fue analizada para H5HA. La expresión de H4HA fue analizada utilizando un suero anti-H4 de cabra monoespecífico. La expresión de H7HA fue analizada utilizando una preparación de anticuerpo monoclonal específico para H7.

Inmunoprecipitación. Se ha determinado que la secuencia situada en y en los alrededores del sitio de rotura de la molécula hemaglutinina desempeña un importante papel a la hora de determinar la virulencia vírica, dado que la rotura del polipéptido hemaglutinina resulta necesaria para que las partículas de virus se conviertan en infecciosas. Las proteínas hemaglutinina de los virus H5 y H7 virulentos poseen más de un aminoácido básico en el carboxilo terminal de HA1. Se considera que esto permite el que las proteasas celulares, las cuales reconocen una serie de aminoácidos básicos, rompan la hemaglutinina y permiten que el virus infeccioso se extienda tanto in vitro como in vivo. Las moléculas hemaglutinina de las cepas no virulentas H4 no son rotas en cultivo tisular, a menos que se añada una tripsina endógena.

Con vistas a determinar que las moléculas de hemaglutinina expresadas por los recombinantes TROVAC eran procesadas auténticamente, se llevaron a cabo experimentos de inmunoprecipitación, tal y como se ha descrito anteriormente (Taylor et al., 1990), utilizando los reactivos específicos descritos anteriormente.

El análisis de inmunoprecipitación de la hemaglutinina H5 expresada por TROVAC-AIH5 (vFP89) mostraba que la glicoproteína resultaba evidente como los dos productos de rotura HA_{1} y HA_{2},_{ }con pesos moleculares aproximados de 44 y 23 kDa, respectivamente. Las citadas proteínas no fueron precipitadas a partir de células no infectadas o de células infectadas con TROVAC parental. De modo similar, los análisis de inmunoprecipitación de la hemaglutinina expresada por TROVAC-AIH7 (vFP100) mostraban inmunoprecipitación específica del producto de rotura HA_{2}. El producto de rotura HA_{1} no fue reconocido. No se precipitaron proteínas a partir de células CEF no infectadas o de células CEF infectadas con TROVAC. Por el contrario, los análisis de inmunoprecipitación del producto de expresión de TROVAC-AIH4 (vFP92) mostraron la expresión de tan solo la proteína precursora HA_{o}. Esto está de acuerdo con la falta de rotura de las hemaglutininas de subtipos no virulentos en cultivo tisular. No se detectaron proteínas específicas H4 en células CEF no infectadas con TROVAC. La generación de virus recombinantes a través de recombinación, hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y el cribado para determinar la actividad de la beta-galactosidasa, son tal y como se ha descrito anteriormente (Panicali et al., q982; Perkus et al., 1989).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 26

Nucleótidos gB, gC y gD de CHV en sistema vector, expresión a partir del mismo y utilización del sistema vector y producto de expresión

La expresión de la glicoproteína gB de CHV se logra mediante la ubicación del gen homólogo gB de CHV bajo el control del promotor 13L del virus vaccinia. La expresión de la glicoproteína gC de CHV se logra colocando el gen homólogo gC de CHV bajo el control del promotor H6 del virus vaccinia. La expresión de la glicoproteína gD de CHV se logra colocando el gen homólogo gD de CHV bajo el control del promotor del gen 42K del virus entomopox. La codificación de gC y gB se produce en el locus ATI y la codificación gD en el locus HA.

Generación de plásmido donante. La secuencia codificadora de gB de CHV es derivada mediante PCR. El fragmento gB de CHV es fusionado con un fragmento derivado de PCR que contiene el elemento promotor I3L en un plásmido que contiene la casette I3L-CHV, en la localización ATIdeorfed. El codificador gC de CHV es derivado mediante PCR y fusionado en una ubicación HA en un plásmido.

Para insertar la construcción doble gB de IL3-CHV - gC de H6-CHV en la localización NYVAC ATI deorfed, se utiliza un plásmido donante.

La recombinación in vitro es llevada a cabo en células Vero utilizando el plásmido donante y vP866 (NYVAC) como virus rescatador. Para identificar y purificar el virus recombinante se utilizaron protocolos estándar (Piccini et al., 1987). El recombinante de base NYVAC que contiene los genes gB y gC de CHV en la localización ATI deorfed, es designado como NYVAC-CHVgBgC.

Generación de plásmido donante. La secuencia codificadora de gD de CHV se fusiona con el promotor 42K y se genera un plásmido resultante para inserción con la localización NYVAC HA deorfed.

La recombinación in vitro se lleva a cabo en células Vero utilizando el plásmido donante gD de CHV de 42K y el virus vaccinia recombinante NYVAC-CHVgBgC (antecedentes NYVAC) como virus de rescate. Esto se consigue por medio de procedimientos estándar (Piccini et al., 1987). El recombinante de base NYVAC que contiene los genes gB y gC de CHV en la localización ATI deorfed y el gen gD de CHV en la localización HA deorfed, es designado como NYVAC-CHVgBgCgD.

Generación de plásmido donante ALVAC. A partir de los plásmidos mencionados anteriormente, se construye un plásmido donante de plásmido para insertar la triple construcción gB de IL3-CHV - - gC de H6-CHV - - gD de CHV-42K, en la localización ALVAC C3 deorfed.

La recombinación in vitro se lleva a cabo en fibroblastos de embrión de pollito primarios, utilizando el plásmido donante y CPpp (ALVAC) como virus de rescate. Para identificar y purificar el recombinante generado se siguen procedimientos estándar (Piccini et al., 1987). El recombinante basado en ALVAC contiene los genes gB, gC y gD de CHV en la localización C3 deorfed, y es designado como ALVAC-CHVgBgCgD.

El análisis confirma la expresión de las glicoproteínas por parte de los recombinantes y que las glicoproteínas se encuentran sustancialmente dentro de las secuencias anticipadas.

Ejemplo 27

Generación de Vcp320; un recombinante ALVAC que expresa gB de CHV

El vCP320, un recombinante ALVAC que expresa gB de CHV, fue generado a través del siguiente procedimiento. Un fragmento XbaI de 6 kb, que contiene el gen gB de CHV, fue aislado a partir de DNA de CHV y clonado en el sitio XbaI de pBSK+. Al plásmido generado por esta manipulación se le denomina pCHV2.

El gen gB de CHV fue entonces clonado entre los brazos flanqueantes de poxvirus del canario. Esto fue logrado mediante el clonado del fragmento SacI-EcoRV de pCHV2, de 3.700 bp, que contiene el gen gB de CHV, en el fragmento SacI-NaeI de 5.800 bp de pBHVC16. (pBHVC16 contiene una copia del gen gC de BHV1 clonado en los brazos flanqueantes C5). Al plásmido generado a través de esta manipulación se le denomina pCHV14.

La secuencia no codificadora extraña 3' fue entonces eliminada. Esto fue logrado mediante el clonado de un fragmento PCR de 210 bp, digerido por SmaI-ClaI, que contiene el extremo 3' del gen gB, en el fragmento SmaI-ClaI parcial de 5.500 bp de pCHV4. (Este fragmento PCR fue generado a partir del plásmido, pCHV2, con los cebadores CHVP39 (SEQ ID NO: 92); 5'-TAAGAATGGTAATTCT-3') y CHVP40 (SEQ ID NO: 93; 5'-TTCCCGGGTTAAACTTTACTTTCATTTTC-3'. Al plásmido generado a través de esta manipulación se le denomina pCHV15.

El promotor I3L fue después clonado aguas arriba del codón de iniciación gB. Además, se modificaron las secuencias señal de terminación de transcripción temprana 3T_{5}NT localizadas en el extremo 5' del gen gB. Esto fue logrado mediante el clonado de un fragmento PCR digerido por ScaI-SalI de 140 bp, que contiene el promotor I3L y el extremo 5' modificado por T_{5}NT del gen gB, en el fragmento de 6.300 bp ScaI-SalI de pCHV15. (Este fragmento PCR fue generado a partir del plásmido pCHV2, con los cebadores CHVP42 (SEQ ID NO: 94): TTGTCGACTGAGATAAAGT
GAAAATATATATCATTATATTACAAAGTAC AATTATTTAGGTTTAATCATGTTTTCATTGTATCTATAT-3') y
CHVP78 (SEQ ID NO: 95): 5'-TTAGTACTTTCCGGTGTTGTTGGATCACATATTATT AAAGTATAAATAATAAA
GAA-3'). El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV27.

Un error en la secuencia que flanquea el fragmento ScaI-SalI de pCHV27 fue corregido entonces. Esto fue logrado mediante el clonado del fragmento ScaI-SalI de 180 bp de pCHV27, que contiene el promotor I3L y la terminación 5' modificada por T_{5}NT del gen gB, en el fragmento ScaI-SalI de 6.300 bp de pCHV15. El plásmido generado por esta manipulación es denominado pCHV28.

Una secuencia señal de terminación de transcripción temprana próxima a la terminación 3' del gen gB de CHV fue entonces modificada. Esto fue logrado mediante el clonado de un fragmento PCR de 330 bp digerido por SpeI-Asp718, que contiene la región del gen gB de CHV modificada por T_{5}NT, en el fragmento SpeI-Asp718 de 5.450 bp de pCHV28. (Este fragmento PCR fue generado a partir de un fragmento PCR de 150 bp, un fragmento PCR de 280 bp y los cebadores, CHVP89 (SEQ ID NO: 96): 5'-TGGAATGAAGTTATGAAACT-3') y CHVP92 (SEQ ID NO: 97); 5'-TGCACTGATCATTTCAATTTC-3'). El fragmento PCR de 150 bp fue generado a partir del plásmido pCHV2, con los cebadores CHVP89 (SEQ ID NO: 96): 5'-TGGAATGAAGTTATGAAACT-3') y CHVP90 (SEQ ID NO: 98): 5'-TGGAATTTTGAATGAAAACACTAGAACC-3'). El fragmento PCR de 280 bp fue generado a partir del plásmido pCHV2, con los cebadores CHVP91 (SEQ ID NO: 99): 5'-TTCTAGTGTTTTCATTCAAAATTCCAT-3') y CHVP92 (SEQ ID NO: 97): 5'-TGCACTGATCATTTCAATTTC-3'). El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV31.

Una secuencia de señal de terminación de transcripción temprana en el centro del gen gB de CHV fue entonces modificada. Esto fue logrado mediante el clonado de un fragmento PCR de 480 bp digerido con BamHI-BsaBI, que contiene la región del gen gB modificada por T_{5}NT, en el fragmento BamHI-BsaBI de 5.000 bp de pCHV31. (Este fragmento PCR fue generado a partir de un fragmento PCR de 380 bp), un fragmento PCT de 210 bp y los cebadores CHVP87 (SEQ ID NO: 100): 5'-CCTTCAAAGTTTAATACACC-3') y CHV94 (SEQ ID NO: 101): 5'-TATGGCTT
CACGTTTGGCAC-3'). El fragmento PCR de 380 bp fue generado a partir el plásmido pCHV2 con los cebadores CHV93 (SEQ ID NO: 102): 5'-CACCGGGGGATATAATTCATATGTCCCCTTTCTTTGGATTACGAGATGGT-3') y CHVP94 (SEQ ID NO: 101): 5'-TATGGCTTCACGTTTGGCAC-3'). El fragmento PCR de 210 bp fue generado a partir del plásmido pCHV2 con los cebadores CHVP87 (SEQ ID NO: 100): 5'-CCTTCAAAGTTTAATACACC-3') y CHVP (SEQ ID NO: 103): 5'-CCATCTCGTAATCCAAAGAAAGGGGACATATGAAT-3'). El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV32.

Una parte del gen gB extraído en la manipulación previa fue entonces clonado de nuevo en pCHV32. Esto fue logrado mediante el clonado del fragmento parcial BsaBI-PstI de 2.000 bp de pCHV31, que contiene la terminación 3' del gen gB eliminada en la manipulación previa, en el fragmento BsaBI-PstI de 5.450 bp, de pCHV32. El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV36.

El gen gB promocionado por I3L fue entonces clonado entre los brazos flanqueantes C6. Esto fue logrado mediante el clonado del fragmento SalI-SmaI de 2750 bp de pCHV36, que contiene el gen gB promocionado por I3L, en el fragmento SalI-SmaI de 4.350 bp de pHIV34. (el pHIV34 contiene una copia del gen HIV2gp120(+TM), promocionado por H6, clonado entre los brazos flanqueantes C6). El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV37. La secuencia de DNA del gen gB promocionado por I3L en pCHV37 (SEQ ID NOS: 104, 105 y 106) se muestra en la Fig. 23. La secuencia de DNA de los brazos flanqueantes ALVAC C6 (SEQ ID NOS: 107, 108) se muestra en la Fig. 24.

El pCHV37 se utiliza en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como virus de rescate para generar vCP320.

Se llevó a cabo un análisis de inmunoprecipitación para determinar si vCP320 expresa gB de CHV. Monocapas de células MDCK fueron o bien infectadas de modo simulado o infectadas con virus parental (ALVAC) (m.o.i.= 15 PFU/célula), vCP320 (m.o.i.= 15 PFU/célula) o CHV (m.o.i.= 10 PFU/célula). Después de un período de adsorción de una hora, el inoculum fue eliminado y las células fueron recubiertas con 2 mls de medio Eagle modificado (menos cisteina) conteniendo suero bovino fetal dializado al 2% y [^{35}S]-cisteina (50 \muCi/ml). Los lisatos fueron recogidos a las 18 horas de la infección en 1ml de 3X tampón A (NaCl 450 mM, NP-40 3%, Tris 30 mM (pH= 7,4), EDTA 3 mM, Azida Na 0,03% y PMSF 0,6 mg/ml) y analizados para determinar la expresión de gB en CHV utilizando una dilución 1:100 de un anticuerpo monoclonal específico para gB, 1125B2 (obtenido en Dr. Michel Riviere, Rhone Merieux, Lyon, Francia). Los listados, reliberados con sueros de ratón normales y un complejo cabra-anti-ratón-proteína A-sepharose, fueron incubados durante el transcurso de una noche a 4ºC, con un complejo anticuerpo nonoclonal-cabra anti-ratón-proteína A-sepharose y lavados 4X con 1X tampón A y 2X con un tampón LiCl_{2}/urea. Las proteínas precipitadas fueron disociadas de los complejos inmunes mediante la adición de 2X tampón de Laemmli (Tris 125 mM (pH= 6,8), SDS 4%, glicerol 20%, 2-mercaptoetanol 10%), e hirviendo durante 5 minutos. Las proteínas fueron fraccionadas sobre un gel de SDS-poliacrilamida, fijadas y tratadas con salicilato sódico 1M, para fluorografía. Las proteínas del tamaño adecuado fueron precipitadas a partir de células infectadas por CHV (calle D) y células infectadas con vCP320 (calle C), pero no fueron precipitadas a partir de células infectadas de modo simulado (calle A) o de células infectadas con ALVAC (calle B) (Fig. 25). Estos resultados indican que el vCP320 expresa gB de CHV.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 28

Generación de vCP322; un recombinante ALVAC que expresa gC de CHV

El vCP322, un recombinante ALVAC que expresa gC de CHV, fue generado a través del siguiente procedimiento. Un fragmento EcoRI de 2,2 kb, que contiene el gen gC de CHV, fue aislado a partir de DNA de CHV genómico y clonado en el sitio EcoRI de pVQH6CP3LSA. (pVQH6CP3LSA contiene una copia del promotor H6 clonado entre los brazos flanqueantes C3). Esta manipulación posiciona el gen gC aguas abajo del promotor H6 y entre los brazos flanqueantes C3. El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV17.

La secuencia de no codificación 3' extraña fue después eliminada y las secuencias de señal de terminación de transcripción temprana 3 T_{5}NT localizadas en las proximidades de la terminación 3' del gen gC fueron modificadas. Esto fue logrado mediante el clonado de los oligonucleótidos CHVL66 (SEQ ID NO: 109): 5'-CGATGTTAATAAGTAT
TACCACAATA ATTGGTGGAGCCATTTTCGTTATAGTATTGATTTTCATA ACAGCTTTATGTTTCTATTGTTCA
AAAAATAATAAGATCTAACTGCA-3') y CHVL67 (SEQ ID NO: 110); 5'-GTTAGATCTTATTATTTTTTGAA
CAATAGA AACATAAAGCTGTTATGAA AATCAATACTATAACGAA AATGGCTCCACCAATTATTGTGGTAAT
ACTTATTAACAT-3'), en el fragmento ClaI-PstI parcial de 8.400 bp de pCHV17. El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV20.

El codón de iniciación del gen gC fue después alineado con el codón de iniciación del promotor H6. Además, 2 secuencias de señal de terminación de transcripción temprana fueron modificadas. Esto fue logrado mediante el clonado de un fragmento PCR de 740 bp digerido con NruI-BsrGI, que contiene la terminación 3' del promotor H6 y la terminación 5' del gen gC modificado por T_{5}NT, en el fragmento NruI-BsrGI de 7.900 bp de pCHV20 (este fragmento PCR fue generado a partir de un fragmento PCR de 500 bp, un fragmento PCR de 300 bp y los oligonucleótidos CHVP96 (SEQ ID NO: 111; 5'-CGTAGATTCCAATGGAAAGT-3') y CHVP97 (SEQ ID NO: 112; 5'-TTTTCGCGATATCCGT
TAAGT-3'). El fragmento PCR de 500 bp fue generado a partir del plásmido pCHV13, con los oligonucleótidos CHVP68 (SEQ ID NO:113; 5'-TTTTCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTTTTAAAAATTTCTATC
TAATATATGTAATTATAATTTTCATAAACTCGATAATAAC-3') y CHVP69 (SEQ ID NO: 114; 5'-TTTGTATACC
TAATAAGAAATCATTATAAAAGT-3'). El fragmento PCR de 300 bp fue generado a partir del plásmido pCHV13 con los oligonucleótidos CHVP95 (SEQ ID NO: 115; 5'-CTTTTATAATGATTTCTTATTAGGTATACAAAATC-3') y CHVP96 (SEQ ID NO: 111; 5'-CGTAGATTCCAATGGAAAGT-3'). El pCHV13 fue obtenido mediante el clonado de un fragmento genómico EcoRI CHV de 2,2 kb, que contiene el gen gC, en el sitio EcoRI de pBSK+). El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV38.

El gen gC promocionado por H6 fue después clonado entre los brazos flaqueantes C6. Esto fue logrado mediante el clonado del fragmento NruI-PstI de 1400 bp de pCHV38, que contiene el gen gC promocionado por H6 y el oligonucleótido CHVL98 (SEQ ID NO: 116; 5'-AATTTGCA-3') en el fragmento NruI-EcoRI de 4.500 bp de pHIV34 (el pHIV34 contiene una copia del gen HIV2 gp120 (+TM) promocionado por H6, clonado entre los brazos flanqueantes C6). El plásmido generado por esta manipulación es denominado pCHV40. La secuencias de DNA del gen gC promocionado por H6 en pCHV40 (SEQ ID NOS: 117, 118, 119) se muestra en la Fig. 26. La secuencia de DNA de los brazos flanqueantes C6 de ALVAC (SEQ ID NOS: 107, 108) se muestra en la Fig. 24.

El pCHV40 fue utilizado en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como virus de rescate para generar vCP322.

Para determinar si vCP322 expresa gC de CHV se llevó a cabo un análisis de inmunoprecipitación. Monocapas de células MDCK fueron o bien infectadas de forma simulada o infectadas con el virus parental (ALVAC) (m-o.i.= 15 PFU/célula), vCP322 (m.o.i.= 15 PFU/célula) o CHV (m.o.i.= 10 PFU/célula). Transcurrido un período de adsorción de una hora, el inoculum fue eliminado y las células fueron recubiertas con 2 mls de medio Eagle modificado (menos cisteina) que contiene suero bovino fetal dializado al 2% y [^{35}S]-cisteina (50 \muCi/ml). Los lisatos fueron recogidos a las 18 horas de la infección, en 1ml de 3X tampón A (NaCl 450 mM, NP-40 3%, Tris 30 mM (pH= 7,4), EDTA 3 mM, Azida Na 0,03% y PMSF 0,6 mg/ml) y analizados para determinar la expresión de gC en CHV, utilizando una dilución 1:100 de un anticuerpo monoclonal específico para gC, 2011A9 (obtenido en Dr. Michel Riviere, Rhone Merieux, Lyon, Francia). Los lisatos, preliberados con sueros de ratón normales y un complejo proteína A anti-ratón de cabra-sepharose, fueron incubados durante el transcurso de una noche a 4ºC con un complejo anticuerpo monoclonal-cabra anti-ratón-proteína A-sepharose y lavados 4X con 1X tampón A y 2X con un tampón LiCl_{2}/urea. Las proteínas precipitadas fueron disociadas de los complejos inmunes mediante la adición de 2X tampón de Laemmli (Tris 125 mM (pH= 6,8), SDS 4%, glicerol 20%, 2-mercaptoetanol al 10%), hirviendo durante 5 minutos. Las proteínas fueron fraccionadas sobre un gel de SDS-poliacrilamida, fijadas y tratadas con salicilato sódico 1M para fluorografía. Las proteínas del tamaño adecuado fueron precipitadas a partir de células infectadas por CHV (calle D) y células infectadas con vCP322 (calle C), pero no fueron precipitadas a partir de células infectadas de modo simulado (calle A) o de células infectadas con ALVAC (calle B) (Fig. 27). Estos resultados indican que el vCP322 expresa gC de CHV.

Ejemplo 29

Generación de vCP294, un recombinante ALVAC que expresa gD de CHV

VCP294, un recombinante ALVAC que expresa el gD de CHV, fue generado a través del siguiente procedimiento. Un fragmento PstI de 7 kb, conteniendo el gen gD de CHV, fue aislado a partir del DNA de CHV y clonado en el sitio PstI de pBSK+. El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV11.

El gen gD de CHV fue entonces clonado entre brazos flanqueantes de poxvirus del canario. Esto fue logrado a través de clonado del fragmento PstI-SnaBI de 1.475 bp de pCHV11, que contiene el gen gD de CHV, en el fragmento PstI-SmaI de 5.600 bp de pHIV34 (el pHIV34 contiene una copia del gen HIV2 gp120 (+TM), promocionado por H6 clonado entre brazos flanqueantes C6). Esto coloca el gen gD de CHV entre los brazos flanqueantes C6 y aguas abajo del promotor H6. El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV18.

El codón de iniciación del promotor H6 fue después alineado con el codón de iniciación del gen gD de CHV. Esto fue logrado mediante el clonado de los oligonucleótidos CHVL81 (SEQ ID NO:120; 5'-CGATATCCGTTAAGTTTG
TATCGTAATGATTAAACTTCTATTTATCTTATTTTATTTTAACCCAATAA-3') y CHVL82 (SEQ ID NO:121; 5'-TTGGGTTAAAATAAAATAAGATAAATAGAAGTTTAATCATTACGATACAAACTTAACGGATATCG-3'), en el
fragmento NruI-PflMI de 5.600 bp de pCHV18. El plásmido generado por esta manipulación es denominado pCHV21.

Tres secuencias señal de terminación de transcripción temprana en el extremo 3' del gen gD de CHV fueron después modificadas. Esto fue logrado mediante clonado del fragmento BglII-Asp718 de 1.400 bp de pCHV22 que contiene la terminación 3' "modificada por T_{5}NT" del gen gD de CHV y el brazo flanqueante C3, en el fragmento BglII-Asp718 de 3.700 bp de pCHV21 (el pCHV22 fue generado mediante clonado de un fragmento PCR digerido por BglII-EcoRI de 430 bp, que contiene la terminación 3' "modificada por T_{5}NT" del gen gD de CHV, en el fragmento BglII-EcoRI de 3.900 bp de pHIV43 (el pHIV43 contiene una copia del gen de fusión HIV gp120-IL-2 murino, promocionado por H6, clonado entre los brazos flanqueantes C3). (Este fragmento PCR fue generado a partir del plásmido pCHV18 con los oligonucleótidos CHVP79 (SEQ ID NO: 122; 5'-TTGAATTCCTAAACATTTGTTGTTAATTTTTT
ATAATTATTATATATTTTTTGTCTTTTATAAACAAAGAAT-3') y CHVP80 (SEQ ID NO: 123; 5'-TTAGATCTG
TAGGAGCATCAA AAGTTGACGATGAACTTTTCTATCTAA ATAGAGCTGGTCCCCAAACCCTGCTTAAATAT
TATGTTATTA AAGATTTCTAT-3')). El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV24.

La región central "modificada por T_{5}NT" del gen gD de CHV fue después clonada en pCHV24. Esto fue logrado mediante el clonado de un fragmento PCR digerido con BglII de 240 bp, que contiene la región central "modificada por T_{5}NT" del gen gD de CHV, en el sitio BglII de pCHV24. (Este fragmento fue generado a partir del plásmido pCHV18, con los oligonucleótidos CHVP83 (SEQ ID NO: 124; 5'-TTAGATCTAGATTCCTTACACCATTCCA
TAAAAGTTGGTTCA AATTTATCTTCTTTAGAGAA ATAACAAGTTTCTCGTGGTAATTGAACCATA AAATCA
GTATAGAAAAC-3') y CHVP84 (SEQ ID NO: 125; 5'-TATTTTGATTGTGATCC-3')). El plásmido generado a través de esta manipulación es denominado pCHV25.

El brazo flanqueante C3 fue entonces sustituido por brazos flanqueantes C6. Esto fue logrado mediante el clonado del fragmento EcoRI-Asp718 de 1.160 bp de pCHV21, que contiene el brazo flanqueante C6, en el fragmento EcoRI-Asp718 de 4.100 bp de pCHV25. El plásmido generado a través de esta mutación es denominado pCHV26. La secuencia de DNA del gen gD promocionado por H6 en pCHV26 (SEQ ID NOS 126, 127, 128) es mostrada en la Fig. 28. La secuencia de DNA de los brazos flanqueantes

\hbox{C6 de ALVAC (SEQ ID NOS: 107,
108) es mostrada en la Fig. 24.}

El pCHV26 fue utilizado en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como virus de rescate para generar vCP294.

Para determinar si vCP294 expresa gD de CHV se llevó a cabo un análisis de inmunoprecipitación. Monocapas de células MDCK fueron o bien infectadas de forma simulada o infectadas con el virus parental (ALVAC) (m-o.i.= 15 PFU/célula), vCP294 (m.o.i.= 15 PFU/célula) o CHV (m.o.i.= 10 PFU/célula). Transcurrido un período de adsorción de una hora, el inoculum fue eliminado y las células fueron recubiertas con 2 mls de medio Eagle modificado (menos cisteina) que contiene suero bovino fetal dializado al 2% y [^{35}S]-cisteina (50 \muCi/ml). Los lisatos fueron recogidos a las 18 horas de la infección en 1ml de 3X tampón A (NaCl 450 mM, NP-40 3%, Tris 30 mM (pH= 7,4), EDTA 3 mM, Azida Na 0,03% y PMSF 0,6 mg/ml) y analizados para determinar la expresión de gD en CHV, utilizando una dilución 1:100 de un anticuerpo monoclonal específico para gD, 208D11 (obtenido en Dr. Michel Riviere, Rhone Merieux, Lyon, Francia). Los lisatos, preliberados con sueros de ratón normales y un complejo anticuerpo monoclonal de cabra anti-ratón-proteína A-sepharose, fueron incubados durante el transcurso de una noche a 4ºC con un complejo anticuerpo monoclona de cabra anti-ratón-proteína A-sepharose y lavados 4X con 1X tampón A y 2X con un tampón LiCl_{2}/urea. Las proteínas precipitadas fueron disociadas de los complejos inmunes mediante la adición de 2X tampón de Laemmli (Tris 125 mM (pH= 6,8), SDS 4%, glicerol 20%, 2-mercaptoetanol al 10%) hirviendo durante 5 minutos. Las proteínas fueron fraccionadas sobre un gel de SDS-poliacrilamida, fijadas y tratadas con salicilato sódico 1M para fluorografía. Las proteínas del tamaño adecuado fueron precipitadas a partir de células infectadas por CHV (calle D) y células infectadas con vCP294 (calle C), pero no fueron precipitadas a partir de células infectadas de modo simulado (calle A) o de células infectadas con ALVAC (calle B) (Fig. 29). Estos resultados indican que el vCP294 expresa gC de CHV.

Habiendo por tanto descrito en detalle las realizaciones preferidas de la presente invención, debe darse por entendido que la invención definida por las siguientes reivindicaciones no tiene que estar limitada por los detalles particulares expuestos en la descripción mencionada anteriormente, dado que resultan posibles muchas variaciones de la misma sin apartarse del espíritu o campo de cobertura de la misma.

Los recombinantes pueden ser utilizados para estimular una respuesta de anticuerpo o una respuesta inmune en cachorros y en perros adultos frente a CHV y lo mismo pude ocurrir con los productos de expresión que pueden ser aislados a partir de células infectadas por los recombinantes. Además, los recombinantes o los productos de expresión procedentes de los mismos pueden ser utilizados para generar anticuerpos en un animal al que se le han administrado los recombinantes o los productos de expresión derivados de los mismos y, los anticuerpos pueden ser utilizados adicionalmente tal y como se describe en el presente documento.

Referencias

1. Ackermann, M., R. Longnecker, B. Roizman, and L. Pereira, Virology 150, 207-220 (1986).

2. Allen, G. P. and M. R. Yeargan, J. Virol. 61, 2454-2461 (1987).

3. Allen, G. P. and J. T. Bryans, In: Progress in Veterinary Microbiology and Immunology, Vol. 2, ed. R. Pandey (Basel), pp. 78-144 (1986).

4. Allen, G. P., and L. D. Coogle, J. Virol. 62, 2850-2858 (1988).

5. Altenburger, W., C-P. Suter and J. Altenburger, Archives Virol. 105, 15-27 (1989).

6. Appel, M., In Virus Infections of Vertebrates, vol. 1, pp. 5-15. Edited by M. Appel. Amsterdam-Oxford-New York-Tokyo: Elsevier Science Publishers (1987).

7. Audonnet, J.-C., Winslow, J., Allen, G. & Paoletti, E., Journal of General Virology 71, 2969-2978 (1990).

8. Avery, R. J., and J. Niven., Infect. and Immun. 26, 795-801 (1979).

9. Babiuk, L. A., J. L'Italien, S. van Drunen Littel-van den Hurk, T. Zamb, M. J. P. Lawman, G. Hughes, and G. A. Gifford, J. Virol. 159, 57-66 (1987).

10. Baer, R., A. T. Bankier, M. D. Biggin, P. L. Deininger, P. J. Farrell, T. J. Gibson, G. Hatfull, G. S. Hudson, S. C. Satchwell, C. Seguin, P. S. Tuffnell, and B. G. Barrell, Nature 310, 207-211 (1984).

11. Baines, J., and B. Roizman, J. Virol. 67, 1441-1452 (1993).

12. Balachandran, N., S. Bacchetti, and W. E. Rawls, Infect. Immun. 37, 1132-1137 (1982).

13. Bause, E., Biochemical Journal 209, 331-336 (1983).

14. Behbehani, A. M., Microbiological Reviews 47, 455-509 (1983).

15. Ben-Porat, T., J. DeMarchi, J. Pendrys, R. A. Veach, and A. S. Kaplan, J. Virol. 57, 191-196 (1986).

16. Ben-Porat, T. and A. S. Kaplan, In: The Herpesviruses, vol. 3, ed. B. Roizman (Plenum Publishing Corp., New York) pp. 105-173 (1985).

17. Ben-Porat, T., F. J. Rixon, and M. L. Blankenship, Virology 95, 285-294 (1979).

18. Bergoin, M., and Dales, S., In Comparative Virology, eds. K. Maramorosch and E. Kurstak, (Academic Press, NY) pp. 169-205 (1971).

19. Berman, P. W., D. Dowbenko, L. A. Lasky, and C. C. Simonsen, Science 222, 524-527 (1983).

20. Bertholet, C., Drillien, R., and Wittek, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985).

21. Blewett, E. & Misra, V., Journal of General Virology 72, 2083-2090 (1991).

22. Blobel, G., Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 77, 1496-1500 (1980).

23. Boursnell, M. E. G., P. F. Green, J. I. A. Campbell, A. Deuter, R. W. Peters., F. M. Tomley, A. C. R. Samson, P. Chambers, P. T. Emmerson, and M. M. Binns, J. Gen. Virol. 71, 621-628 (1990a).

24. Boursnell, M. E. G., P. F. Green, J. I. A. Campbell, A. Deuter, R. W. Peters, F. M. Tomley, A. C. R. Samson, P. T. Emmerson, and M. M. Binns, Veterinary Microbiology 23, 305-316 (1990b).

25. Boursnell, M. E. G., P. F. Green, A. C. R. Samson, J. I. A. Campbell, A. Deuter, R. W. Peters, N. S. Millar, P. T. Emmerson, and M. M. Binns, Virology 178, 297-300. (1990c).

26. Brockmeier, S., Lager, K., Tartaglia, J., Riviere, M., Paoletti, E. & Mengeling, W., Veterinary Microbiology 38, 41-58 (1993).

27. Buller, R. M. L., G. L. Smith, Cremer, K., Notkins, A. L., and Moss, B., Nature 317, 813-815 (1985).

28. Buller, R. M. L., Chakrabarti, S., Cooper, J. A., Twardzik, D. R., and Moss, B., J. Virol. 62, 866-874 (1988).

29. Bzik, D. J., B. A. Fox, N. A. DeLuca, and S. Person, Virology 133, 301-307 (1984).

30. Cadoz, M., A. Strady, B. Meignier, J. Taylor, J. Tartaglia, E. Paoletti and S. Plotkin, The Lancet, 339, 1429 (1992).

31. Cantin, E. M., R. Eberle, J. L. Baldick, B. Moss, D. E. Willey, A. L. Notkins, and H. Openshaw, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5908-5912 (1987).

\newpage

32. Carmichael, L., Strandberg, J. & Barnes, F., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 120, 644-650 (1965).

33. Carmichael, L., Journal of the American Veterinary Medical Association 156, 1714-1721 (1970).

34. Chambers, P., N. S. Millar, and P. T. Emmerson, J. Gen. Virol. 67, 2685-2694 (1986).

35. Chan, W., Immunol. 49, 343-352 (1983).

36. Child, S. J., Palumbo, G. J., Buller, R. M. L., and Hruby, D. E. Virology 174, 625-629 (1990).

37. Clewell, D. B., J. Bacteriol. 110, 667-676 (1972).

38. Clewell, D. B. and D. R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969).

39. Colinas, R. J., R. C. Condit and E. Paoletti, Virus Research 18, 49-70 (1990).

40. Compton, T., In: Cell Biology of Virus Entry, Replication, and Pathogenesis, eds. Compans, R.W., A. Helenius, and M.B.A. Oldstone (Alan R. Liss, Inc.) pp. 45-56 (1989).

41. Cooney E. L., Corrier A. C., Greenberg P. D., et al., Lancet 337, 567-572 (1991).

42. Corden, J., Wasylyk, B., Buchwalder, A., Sassone-Corsi, P., Kedinger, C. & Chambon, P., Science 209, 1406-1414 (1980).

43. Cranage, M. P., T. Kouzarides, A. T. Bankier, S. Satchwell, K. Weston, P. Tomlinson, B. Barrell, H. Hart, S. E. Bell, A. C. Minson, and G. L. Smith, EMBO J. 5, 3057-3063 (1986).

44. Cremer, K. J., M. Mackett, C. Wohlenberg, A. L. Notkins, and B. Moss, Science 228, 737-740 (1985).

45. Davis, W. B., J. A. Taylor, and J. E. Oakes, J. Infect. Dis. 140, 534-540 (1979).

46. Davison, A. J., and J. E. Scott, J. gen. Virol. 67, 1759-1816 (1986).

47. Drillien, R., F. Koehren and A. Kirn, Virology 111, 488-499 (1981).

48. Eberle, R., and R. J. Courtney, J. Virol. 35, 902-917 (1980).

49. Edbauer, C., R. Weinberg, J. Taylor, A. Rey-Senelonge, J. F. Bouquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Virology 179, 901-904 (1990).

50. Engelke, D. R., Hoener, P. A., and Collins, F. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988).

51. Espion, D., S. de Henau, C. Letellier, C.-D. Wemers, R. Brasseur, J. F. Young, M. Gross, M. Rosenberg, G. Meulemans and A. Burny, Arch. Virol. 95, 79-95 (1987).

52. Etinger H. M., Altenburger W., Vaccine 9, 470-472 (1991).

53. Fargeaud, D., C. Benoit Jeannin, F. Kato, and G. Chappuis, Arch. Virol. 80, 69-82 (1984).

54. Fenner, F., Virology 5, 502-529 (1958).

55. Fitzpatrick, D. R., Babiuk, L. A. & Zamb, T. J., Virology 173, 46-57 (1989).

56. Flexner, C., Hugen, A., and Moss, B., Nature 330, 259-262 (1987).

57. Flowers, C., Eastman, E. & O'Callaghan, D., Virology 180, 175-184 (1991).

58. Frame, M. C., H. S. Marsden, and D. J. McGeoch, J. gen. Virol. 67, 745-751 (1986).

59. Fries et al., 32nd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Anaheim, CA (October 1992).

60. Frink, R. J., M. R. Eisenberg, G. Cohen, and E. K. Wagner, J. Virol. 45, 634-647 (1983).

61. Funahashi, S., T. Sato and H. Shida, J. Gen. Virol. 69, 35-47 (1988).

62. Garten, W., Kohama, T., and H-D. Klenk. J. Gen. Virol. 51, 207-211 (1980).

63. Ghendon, Y. Z., and Chernos, V. I., Acta Virol. 8, 359-368 (1964).

64. Gillard, S., Spehner, D., Drillien, R., and Kirn, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5573-5577 (1986).

65. Glorioso, J., C. H. Schroder, G. Kumel, M. Szczesiul, and M. Levine, J. Virol. 50, 805-812 (1984).

66. Glorioso, J., U. Kees, G. Kumel, H. Kirchner, and P. Krammer, J. Immunol. 135, 575-582 (1985).

67. Goebel, S. J., Johnson, G. P., Perkus, M. E., Davis, S. W., Winslow, J. P., Paoletti, E., Virology 179, 247-266 (1990a).

68. Goebel, S. J., G. P. Johnson, M. E. Perkus, S. W. Davis, J. P. Winslow and E. Paoletti, Virology 179, 517-563 (1990b).

69. Goldstein, D. J. and S. K. Weller, Virology 166, 41-51 (1988).

70. Gretch, D. R., B. Kari, L. Rasmussen, R. C. Gehrz, and M. F. Stinski, J. Virol. 62, 875-881 (1988).

71. Guo, P., Goebel, S., Davis, S., Perkus, M. E., Languet, B., Desmettre, P., Allen, G., and Paoletti, E., J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).

72. Guo et al., J. Virol. 64, 2399-2406 (1990).

73. Hampl, H., T. Ben-Porat, L. Ehrlicher, K-O. Habermehl, and A. S. Kaplan, J. Virol. 52, 583-590 (1984).

74. Homma, M., and M. Ohuchi, J. Virol. 12, 1457-1465 (1973).

75. Honess, R. W., Journal of General Virology 65, 2077-2107 (1984).

76. Honess, R. W., Bodemer, W., Cameron, K. R., Niller, H.-H. & Fleckenstein, B., Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 83, 3604-3608 (1986).

77. Hruby, D. E., R. A. Maki, D. B. Miller and L. A. Ball, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3411-3415 (1983).

78. Hutchinson, L., Browne, H., Wargents, V., Doris-Poynter, N., Primorac, S., Goldsmith, K., Minson, A., and D. C. Johnson. J. Virol. 66, 2240-2250 (1992).

79. Hutchinson, L., Goldsmith, K., Snoddy, A., Ghash, H., Graham, F. and D. Johnson. J. Virol. 66, 5603-5609 (1992b).

80. Hruby, D. E. and L. A. Ball, J. Virol. 43, 403-409 (1982).

81. Ichihashi, Y. and Dales, S., Virology 46, 533-543 (1971).

82. Ihara, T., Kato, A., Ueda, S., Ishihama, A. & Hirai, K., Virus Genes 3, 127-140 (1989).

83. Ishii, H., Y. Kobayashi, M. Kuroki and Y. Kodama, J. gen. Virol. 69, 1411-1414 (1988).

84. Jacobson, J. G., D. A. Leib, D. J. Goldstein, C. L. Bogard, P. A. Schaffer, S. K. Weller and D. M. Coen, Virology 173, 276-283 (1989).

85. Jamieson, A. T., G. A. Gentry and J. H. Subak-Sharpe, J. Gen. Virol. 24, 465-480 (1974).

86. Kato, A., Sato, I., Ihara, T., Ueda, S., Ishihama, A. & Hirai, K., Gene 84, 399-405 (1989).

87. Kato, S., M. Takahashi, S. Kameyama and J. Kamahora, Biken's 2, 353-363 (1959).

88. Keller, P. M., A. J. Davison, R. S. Lowe, C. D. Bennett, and R. W. Ellis, Virology 152, 181-191 (1986).

89. Kieff, E., and D. Liebowitz, In: Virology, Second Edition, eds. Fields, B.N. et al. (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1889-1920 (1990).

90. Kieny, M. P., Lathe, R., Drillien, R., Spehner, D., Skory, S., Schmitt, D., Wiktor, T., Koprowski, H., and Lecocq, J. P., Nature (London) 312, 163-166 (1984).

91. Klein, P., Kanehisa, M. & DeLisi, C., Biochimica Biophysica Acta 815, 468-476 (1985).

92. Konishi et al., Virology 190, 454-458 (1992).

93. Kopp, A. & Mettenleiter, T., Journal of Virology 66, 2754-2762 (1992).

94. Kost, T. A., E. V. Jones, K. M. Smith, A. P Reed, A. L. Brown, and T. J. Miller, Virology 171, 365-376 (1989).

95. Kotwal, G. J., A. W. Hugin and B. Moss, Virology 171, 579-587 (1989a).

96. Kotwal, G. J. and B. Moss, J. Virol. 63, 600-606 (1989b).

97. Kotwal, G. J., S. N. Isaacs, R. McKenzie, M. M. Frank and B. Moss, Science 250, 827-830 (1990).

98. Kotwal, G. J. and Moss, B., Nature (Lond.) 335, 176-178 (1988).

99. Kouzarides, T., Bankier, A. T., Satchwell, S. C., Weston, K., Tomlinson, P. & Barrell, B. G., Virology 157, 397-413 (1987).

100. Kozak, M., Cell 44, 283-292 (1986).

101. Kuhn, J., Eing, B., Brossmer, R., Munk, K. & Braun, R., Journal of General Virology 69, 2847-2858 (1988).

102. Lai, A. C.-K. and B. G.-T. Pogo, Virus Res. 12, 239-250 (1989).

103. Lasky, L. A., D. Dowbenko, C. C. Simonsen, and P. W. Berman, Bio-Technology 2, 527-532 (1984).

104. Lawrence, W. C., R. C. D'Urso, C. A. Kundel, J. C. Whitbeck and L. J. Bello, J. Virol. 60, 405-414 (1986).

105. Le, L., R. Brasseur, C. Wemers, G. Meulemans, and A. Burny, Virus Genes 1, 333-350 (1988).

106. Long, D., Cohen, G., Muggeridge, M. & Eisenberg, R., Journal of Virology 64, 5542-5552 (1990).

107. Long, D., Wilcox, W., Abrams, W., Cohen, G. & Eisenberg, R., Journal of Virology 66, 6668-6685 (1992).

108. Longnecker, R., S. Chatterjee, R. Whitley, and B. Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4303-4307 (1987).

109. Maeda, K., Horimoto, T., Norimine, J., Kawaguchi, Y., Tomonaga, K., Niikura, M., Kai, C., Takahashi, E. & Mikami, T., Archives of Virology 127, 387-397.

110. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7182 (1986).

111. Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) (1982).

112. Marchioli, C. C., R. J. Yancey, Jr., R. C. Wardley, D. R. Thomsen and L. E. Post, Am. J. Vet. Res. 48, 1577-1583 (1987).

113. Marchioli, C., R. J. Yancey, Jr., J. G. Timmins, L. E. Post, B. R. Young, and D. A. Povendo, Am. J. Vet. Res. 49, 860-864 (1988).

114. Marchioli, C. C., R. J. Yancey, Jr., E. A. Petrovskis, J. G. Timmins, and L. E. Post, J. Virol. 61, 3977-3982 (1987).

115. Matthews, R. E. F., Intervirology 17, 42-44 (1982).

116. McGeoch, D. J., M. A. Dalrymple, A. J. Davison, A. Dolan, M. C. Frame, D. McNab, L. J. Perry, J. E. Scott, and P. Taylor, J. gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).

117. McGinnes, L. W., and T. G. Morrison, Virus Research 5, 343-356 (1986).

118. McLaughlin-Taylor, E., D. E. Willey, E. M. Cantin, R. Eberle, B. Moss, and H. Openshaw, J. gen. Virol. 69, 1731-1734 (1988).

119. Meas, R. K., S. L. Fritsch, L. L. Herr, and P. A. Rota, J. Virol. 51, 259-262 (1984).

120. Merz, D. C., A. Scheid, and P. Choppin, J. Exper. Med. 151, 275-288 (1980).

121. Misra, V., R. M. Blumenthal and L. A. Babiuk, J. Virol. 40, 367-378 (1981).

122. Morgan, A. J., M. Mackett, S. Finerty, J. R. Arrand, F. T. Scullion and M. A. Epstein, J. Med. Virol. 25, 189-195 (1988).

123. Moss, B., E. Winters and J. A. Cooper, J. Virol. 40, 387-395 (1981).

124. Nagai, Y., H. D. Klenk, and R. Rott, Virology 72, 494-508 (1976).

125. Nagai, Y., T. Yoshida, M. Hamaguchi, H. Naruse, M. Iinuma, K. Maeno, and T. Matsumoto, Microbiol. Immunol. 24, 173-177 (1980).

126. Nazerian, K., Lee, L., Yanagida, N. & Ogawa, R., Journal of Virology 66, 1409-1413 (1992).

127. Nicolson, L. & Onions, D. E., Virology 179, 378-387 (1990).

128. Norrby, E., and Y. Gollmar, Infect. and Immun. 11, 231-239 (1975).

129. Oakes, J. E., and H. Rosemond-Hornbeak, Infect. Immun. 21, 489-495 (1978).

130. Ogawa, R., N. Yanagida, S. Saeki, S. Saito, S. Ohkawa, H. Gotoh, K. Kodama, K. Kamogawa, K. Sawaguchi and Y. Iritani, Vaccine 8, 486-490 (1990).

131. Paez, E., S. Dallo and M. Esteban, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3365-3369 (1985).

132. Palumbo, G. J., Pickup, D. J., Fredrickson, T. N., Mcintyre, L. J., and Buller, R. M. L., Virology 172, 262-273 (1989).

133. Panicali, D., S. W. Davis, S. R. Mercer, and E. Paoletti, J. Virol. 37, 1000-1010 (1981).

134. Panicali, D. and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).

135. Panicali, D., Davis, S. W., Mercer, S. R., and Paoletti, E., J. Virol. 37, 1000-1010 (1981).

136. Paoletti, E., B. R. Lipinskas, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 193-197 (1984).

137. Papp-Vid, G., and J. B. Derbyshire, Can. J. Comp. Med. 43, 231-233 (1979).

138. Patel, D. D. and Pickup, D. J., EMBO 6, 3787-3794 (1987).

139. Patel, D. D., Ray, C. A., Drucker, R. P., and Pickup, D. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9431-9435 (1988).

140. Pearson, W. R. & Lipman, D. J., Proceedings of the National Academy of Sciences 85, 2444-2448 (1988).

141. Pellett, P. E., M. D. Biggin, B. L. Barrell, and B. Roizman, J. Virol. 56, 807-813 (1985).

142. Perkus M. E., Piccini A., Lipinskas B. R., et al., Science 229, 981-984 (1985).

143. Perkus, M. E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).

144. Perkus, M. E., A. Piccini, B. R. Lipinskas, and E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985).

145. Perkus, M. E., Goebel, S. J., Davis, S. W., Johnson, G. P., Limbach, K., Norton, E. K., and Paoletti, E., Virology 179, 276-286 (1990).

146. Perkus, M. E., D. Panicali, S. Mercer and E. Paoletti, Virology 152, 285-297 (1986).

147. Perkus, M. E., Limbach, K., and Paoletti, E., J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).

148. Perkus, M. E., S. J. Goebel, S. W. Davis, G. P. Johnson, E. K. Norton and E. Paoletti, Virology 180, 406-410 (1991).

149. Petrovskis, E. A., J. G. Timmins, M. A. Armentrout, C. C. Marchioli, R. J. Yancey, Jr., and L. E. Post, J. Virol. 59, 216-223 (1986).

150. Petrovskis, E. A., J. G. Timmins, and L. E. Post, J. Virol. 60, 185-193 (1986).

151. Piccini, A., M. E. Perkus, and E. Paoletti, Methods in Enzymology 153, 545-563 (1987).

152. Piccini, A., M. E. Perkus, and E. Paoletti, In: Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and L. Grossman (Academic Press) pp. 545-563 (1987).

153. Pickup, D. J., B. S. Ink, W. Hu, C. A. Ray and W. K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7698-7702 (1986).

154. Pickup, D. J., B. S. Ink, B. L. Parsons, W. Hu and W. K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6817-6821 (1984).

155. Pizer, L., Cohen, G. & Eisenberg, R., Journal of Virology 34, 142-153 (1980).

156. Plummer, G., Goodheart, C., Henson, D. & Bowling, C., Virology 39, 134-137 (1969).

157. Proudfoot, N. J. & Brownlee, G. G., Nature 163, 211-214 (1976).

158. Reed, L. J. and Muench, H., Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).

159. Richman, D. D., A. Buckmaster, S. Bell, C. Hodgman and A. C. Minson, J. Virol. 57, 647-655 (1986).

160. Riggio, M. P., A. A. Cullinane, and D. E. Onions, J. Virol. 63, 1123-1133 (1989).

161. Riviere, M., Tartaglia, J., Perkus, M. E., Norton, E. K., Bongermino, C. M., Lacoste, F., Duret, C., Desmettre, P. & Paoletti, E., Journal of Virology 66, 3424-3434 (1992).

162. Robbins, A. K., R. J. Watson, M. E. Whealy, W. W. Hays, and L. W. Enquist, J. Virol. 58, 339-347 (1986).

163. Robbins, A. K., D. J. Dorney, M. W. Wathen, M. E. Whealey, C. Gold, R. J. Watson, L. E. Holland, S. D. Weed, M. Levine, J. C. Glorioso, and L. W. Enquist, J. Virol. 61, 2691-2701 (1987).

164. Roizman, B. and A. E. Sears, In: Virology, eds. Fields, B.N. and D.M. Knipe (Raven Press, Ltd., New York) pp. 1795-1841 (1990).

165. Roizman, B., In The Herpesviruses, vol. 1, pp. 1-23, Ed. B. Roizman, New York & London: Plenum Press (1982).

166. Rooney, J. F., C. Wohlenberg, K. J. Cremer, B. Moss, and A. L. Notkins, J. Virol. 62, 1530-1534 (1988).

167. Rosenthal, K. L., J. R. Smiley, S. South, and D. C. Johnson, J. Virol. 61, 2438-2447 (1987).

168. Ross, L., Sanderson, M., Scott, S., Binns, M., Doel, T. & Milne, B., Journal of General Virology 70, 1789-1804 (1989).

169. Rota, P. A., R. K. Maes, and W. T. Ruyechan, Virology 154, 168-179 (1986).

170. Rubenstein, A. S. and A. S. Kaplan, Virology 66, 385-392 (1975).

171. Sanger, F., S. Nicklen, and A. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

172. Schmidtt, J. F. C. and H. G. Stunnenberg, J. Virol. 62, 1889-1897 (1988).

173. Seligmann, E. B., In Laboratory Techniques in Rabies, eds. M. M. Kaplan and H. Koprowski, (World Health Organization, Geneva) pp. 279-285 (1973).

174. Shapira, S. K., Chou, J., Richaud, F. V. and Casadaban, M. J., Gene 25, 71-82 (1983).

175. Shida, H., Virology 150, 451-462 (1986).

176. Shida, H., T. Tochikura, T. Sato, T. Konno, K. Hirayoshi, M. Seki, Y. Ito, M. Hatanaka, Y. Hinuma, M. Sugimoto, F. Takahashi-Nishimaki, T. Maruyama, K. Miki, K. Suzuki, M. Morita, H. Sashiyama and M. Hayami, EMBO 6, 3379-3384 (1987).

177. Shida, H., Hinuma, Y., Hatanaka, M., Morita, M., Kidokoro, M., Suzuki, K., Maruyzam, T., Takahashi-Nishimaki, F., Sugimoto, M., Kitamura, R., Miyazawa, T., and Hayami, M., J. Virol. 62, 4474-4480 (1988).

178. Shimizu, M., K. Satou, and N. Nishioka, Arch. Virol. 104, 169-174 (1989).

179. Sinclair, R., R. F. Cook, and J. A. Mumford, J. gen. Virol. 70, 455-459 (1989).

180. Slabaugh, M., N. Roseman, R. Davis and C. Mathews, J. Virol. 62, 519-527 (1988).

181. Smith, J. S., P. A. Yager and G. M. Baer, In Laboratory Techniques in Rabies, eds. M. M. Kaplan and H. Koprowski (WHO Geneva) pp. 354-357 (1973).

182. Sodora, D., Cohen, G., Muggeridge, M. & Eisenberg, R., Journal of Virology 65, 4424-4431 (1991).

183. Spaete, R., Saxena, A., Scott, P., Long, G., Probert, W., Britt, W., Gibson W., Rasmussen, L. & Pachl, C., Journal of Virology 64, 2922-2931 (1990).

184. Spear, P. G., In: The Basis for Serodiagnosis and Vaccines, Immunochemistry of Viruses, Vol. 2, eds. M. H. V. Van Regenmortel and A.R. Neurath (New York), pp. 425-443 (1985a).

185. Spear, P. G., In: The Herpesvirus, Vol. 3, ed. B. Roizman (New York), pp. 315-356 (1985b).

186. Stanberry, L. R., S. Kit and M. G. Myers, J. Virol. 55, 322-328 (1985).

187. Stevely, W. S., J. Virol. 22, 232-234 (1977).

188. Stokes, A., G. P. Allen, L. A. Pullen, and P. K. Murray, J. gen. Virol. 70, 1173-1183 (1989).

189. Sullivan, V. and G. L. Smith, J. gen. Virol. 68, 2587-2598 (1987).

190. Sullivan, V. and G. L. Smith, J. gen. Virol. 69, 859-867 (1988).

191. Swain, M. A., R. W. Peet, and D. A. Galloway, J. Virol, 53, 561-569 (1985).

192. Tabor, S., and C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987).

193. Tartaglia, J. & E. Paoletti, In Immunochemistry of Viruses, II. The Basis for Serodiagnosis and Vaccines. M. H. V. van Regenmortel & A.R. Neurath, Eds. 125-151. Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1990).

194. Tartaglia, J., J. Taylor, W. I. Cox, J.-C. Audonnet, M. E. Perkus, A. Radaelli, C. de Giuli Morghen, B. Meignier, M. Riviere, K. Weinhold & E. Paoletti, In AIDS Research Reviews, W. Koff, F. Wong-Staal & R. C. Kenedy, Eds., Vol. 3, Marcel Dekker, NY (In press)(1993a).

195. Tartaglia, J., Perkus, M. E., Taylor, J., Norton, E. K., Audonnet, J.-C., Cox, W. I., Davis, S. W., Van Der Hoeven, J., Meignier, B., Riviere, M., Languet, B., Paoletti, E., Virology 188, 217-232 (1992).

196. Tartaglia, J., Jarrett, O., Desmettre, P., Paoletti, E. (1993b) J. Virol., in press.

197. Taylor, J., C. Trimarchi, R. Weinberg, B. Languet, F. Guillemin, P. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 9, 190-193 (1991b).

198. Taylor, J., C. Trimarchi, R. Weinberg, B. Languet, F. Guillemin, P. Desmettre & E. Paoletti, Vaccine 9, 190 (1991).

199. Taylor, J., Weinberg, R., Kawaoka, Y., Webster, R. G., and Paoletti, E., Vaccine 6, 504-508 (1988a).

200. Taylor, J., R. Weinberg, B. Lanquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988b).

201. Taylor, J., R. Weinberg, J. Tartaglia, C. Richardson, G. Alkhatib, D. Briedis, M. Appel, E. Norton & E. Paoletti, Virology 187, 321-328 (1992).

202. Taylor, G., E. J. Stott, G. Wertz and A. Ball, J. Gen. Virol. 72, 125-130 (1991a).

203. Taylor, J., Edbauer, C., Rey-Senelonge, A., Bouquet, J.-F., Norton, E., Goebel, S., Desmettre, P., Paoletti, E., J. Virol. 64, 1441-1450 (1990).

204. Telford, E. A., Watson, M. S., McBride, K. & Davison, A. J. (1992). The DNA sequence of equine herpesvirus-1. Virology 189, 304-316.

205. Tikoo, S. K., Fitzpatrick, D. R., Babiuk, L. A. & Zamb, T. J., Journal of Virology 64, 5132-5142 (1990).

206. Toyoda, T., T. Sakaguchi, K. Imai, N. M. Inocencio, B. Gotoh, M. Hamaguchi, and Y. Nagai, Virology 158, 242-247 (1987).

\newpage

207. Wachsman, M., L. Aurelian, J. C. R. Hunter, M. E. Perkus, and E. Paoletti, Bioscience Reports 8, 323-334 (1988).

208. Wachsman, M., J. H. Luo, L. Aurelian, M. E. Perkus, and E. Paoletti, J. gen. Virol. 70, 2513-2520 (1989).

209. Wachsman, M., L. Aurelian, C. C. Smith, B. R. Lipinskas, M. E. Perkus, and E. Paoletti, J. Infect. Dis. 155, 1188-1197 (1987).

210. Wathen, M. W. and L. M. K. Wathen, J. Virol. 58, 173-178 (1986).

211. Wathen, M. W. and L. M. K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984).

212. Wathen, L. M. K., K. B. Platt, M. W. Wathen, R. A. Van Deusen, C. A. Whetstone, and E. C. Pirtle, Virus Res. 4, 19-29 (1985).

213. Weir, J. P., M. Bennett, E. M. Allen, K. L. Elkins, S. Martin, and B. T. Rouse, J. gen. Virol. 70, 2587-2594 (1989).

214. Weir, J. P. and B. Moss, J. Virol. 46, 530-537 (1983).

215. Whalley, J. M., G. R. Robertson, N. A. Scott., G. C. Hudson, C. W. Bell, and L. M. Woodworth, J. gen. Virol. 70, 383-394 (1989).

216. Whealy, M. E., A. K. Robbins and L. W. Enquist, J. Virol. 63, 4055-4059 (1989).

217. Whitbeck, J. C., L. Z. Bello, and W. C. Lawrence, J. Virol. 62, 3319-3327 (1988).

218. Wilcox, W. C., Long, D., Sodora, D. L., Eisenberg, R. J. & Cohen, G. H., Journal of Virology 62, 1941-1947 (1988).

219. Wittmann, G. and H.-J. Rziha, In: Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs, ed. G. Wittmann (Kluwer Academic Publishers) pp. 230-325 (1989).

220. Xuan, X., Horimoto, T., Limcumpao, J. A., Takumi, A., Tohya, Y., Takahashi, E. & Mikami, T., Archives of Virology 116, 185-195 (1991).

221. Zamb, T., Abstract No., 330, 68th Annual Meeting of Conference of Research Workers in Animal Disease, 16 and 17 November 1987, Chicago, IL., USA (1987).

222. Zarling, J. M., P. A. Moran, R. L. Burke, C. Pachl, P. W. Berman, and L. A. Lasky, J. Immunol. 136, 4669-4673 (1986a).

223. Zarling, J. M., P. A. Moran, L. A. Lasky, and B. Moss, J. Virol. 59, 506-509 (1986b).

224. Zezulak, K. M., and P. G. Spear, J. Virol. 49, 741-747 (1984).

225. Zhou, J., L. Crawford, L. McLean, X. Sun, M. Stanley, N. Almond and G. L. Smith, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190 (1990).

226. Xuan et al., Nippon Juigakn Zasshi 52, 1181-1181 (1990).

227. Limcumpao et al., J. Vet. Med. Sci 53, 423-432 (1991).

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

La lista de referencias citadas por el solicitante está indicada solamente para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rehusa cualquier responsabilidad en este respecto.

Patentes citadas en la descripción

\bullet EP 0162738 A1 [0013]: \bullet US 4769331 A [0087]

\bullet EP 0261940 A2 [0013]: \bullet US 47962665A [0101]

\bullet US 4769330 A [0025][0088]: \bullet US 4376110 A [0102]

\bullet US 4772848 A [0025][0088]: \bullet IE 137883 [0304]

\bullet US 4603112 A [0025][0088]: \bullet US 08413118 B [0353]

\bullet US 5100587 A [0025][0088]: \bullet US 08220151 B [0353]

\bullet US 5179993 A [0025][0088]

Bibliografía no citada en la descripción

\bulletKITSON et al. J. Virol., 1991, vol. 65, 3068-3075 [0087]

\bulletGRUNHAUS et al. Adenovirus as cloning vectors. Seminars in Virology, 1993, vol. 3, 237-52 [0087]

\bulletBALLAY et al. EMBO Journal, vol. 4, 3861-65 [0087]

\bulletGRAHAM. Tibtech, April 1990, vol. 8, 85-87 [0087]

\bulletPREVEC et al. J. Gen. Virol., vol. 70, 429-434 [0087]

\bulletMILSTEIN, C. Scientific American, 1980, vol. 243 (66), 70 [0103]

\bulletCOONEY et al. Lancet, 1991, vol. 337, 567-72 [0255]

\bulletETINGER et al. Vaccine, 1991, vol. 9, 470-72 [0255]

\bulletACKERMANN, M.; R. LONGNECKER; B. ROIZMAN; L. PEREIRA. Virology, 1986, vol. 150, 207-220 [0352]

\bulletALLEN, G. P.; M. R. YEARGAN. J. Virol., 1987, vol. 61, 2454-2461 [0352]

\bulletALLEN, G. P.; J. T. BRYANS. Progress in Veterinary Microbiology and Immunology. 1986, vol. 2, 78-144 [0352]

\bulletALLEN, G. P.; L. D. COOGLE. J. Virol., 1988, vol. 62, 2850-2858 [0352]

\bulletALTENBURGER, W.; C-P. SUTER; J. ALTENBURGER. Archives Virol., 1989, vol. 105, 15-27 [0352]

\bulletAPPEL, M. Virus Infections of Vertebrates. Elsevier Science Publishers, 1987, vol. 1, 5-15 [0352]

\bulletAUDONNET, J.-C.; WINSLOW, J.; ALLEN, G.; PAOLETTI, E. Journal of General Virology, 1990, vol. 71, 2969-2978 [0352]

\bulletAVERY, R. J.; J. NIVEN. Infect. and Immun., 1979, vol. 26, 795-801 [0352]

\bulletBABIUK, L. A.; J. L'ITALIEN; S. VAN DRUNEN LITTEL-VAN DEN HURK; T. ZAMB; M. J. P. LAWMAN; G. HUGHES; G. A. GIFFORD. J. Virol., 1987, vol. 159, 57-66 [0352]

\bulletBAER, R.; A. T. BANKIER; M. D. BIGGIN; P. L. DEININGER; P. J. FARRELL; T. J. GIBSON; G. HATFULL; G. S. HUDSCIN; S. C. SATCHWELL; C. SEGUIN. Nature, 1984, vol. 310, 207-211 [0352]

\bulletBAINES, J.; B. ROIZMAN. J. Virol., 1993, vol. 67, 1441-1452 [0352]

\bulletBALACHANDRAN, N.; S. BACCHETTI; W. E. RAWLS. Infect. Immun., 1982, vol. 37, 1132-1137 [0352]

\bulletBAUSE, E. Biochemical Journal, 1983, vol. 209, 331-336 [0352]

\bulletBEHBEHANI, A. M. Microbiological Reviews, 1983, vol. 47, 455-509 [0352]

\bulletBEN-PORAT, T.; J. DEMARCHI; J. PENDRYS, R. A. VEACH; A. S. KAPLAN. J. Virol., 1986, vol. 57, 191-196 [0352]

\bulletBEN-PORAT, T.; A. S. KAPLAN. The Herpesviruses. Plenum Publishing Corp, 1985, vol. 3, 105-173 [0352]

\bulletBEN-PORAT, T.; F. J. RIXON; M. L. BLANKENSHIP. Virology, 1979, vol. 95, 285-294 [0352]

\bulletBERGOIN, M.; DALES, S. Comparative Virology. Academic Press, 1971, 169-205 [0352]

\bulletBERMAN, P. W.; D. DOWBENKO; L. A. LASKY; C. C. SIMONSEN. Science, 1983, vol. 222, 524-527 [0352]

\bulletBERTHOLET, C.; DRILLIEN, R.; WITTEK, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 2096-2100 [0352]

\bulletBLEWETT, E.; MISRA, V. Journal of General Virology, 1991, vol. 72, 2083-2090 [0352]

\bulletBLOBEL, G. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1980, vol. 77, 1496-1500 [0352]

\bulletBOURSNELL, M. E. G.; P. F. GREEN; J. I. A. CAMPBELL; A. DEUTER; R. W. PETERS.; F. M. TOMLEY; A. C. R. SAMSON; P. CHAMBERS; P. T. EMMERSON; M. M. BINNS. J. Gen. Virol., 1990, vol. 71, 621-628 [0352]

\bulletBOURSNELL, M. E. G.; P. F. GREEN; J. I. A. CAMPBELL; A. DEUTER; R. W. PETERS; F. M. TOMLEY; A. C. R. SAMSON; P. T. EMMERSON; M. M. BINNS. Veterinary Microbiology, 1990, vol. 23, 305-316 [0352]

\bulletBOURSNELL, M. E. G.; P. F. GREEN; A. C. R. SAMSON; J. I. A. CAMPBELL; A. DEUTER; R. W. PETERS; N. S. MILLAR; P. T. EMMERSON; M. M. BINNS. Virology, 1990, vol. 178, 297-300 [0352]

\bulletBROCKMEIER, S.; LAGER, K.; TARTAGLIA, J.; RIVIERE, M.; PAOLETTI, E.; MENGELING, W. Veterinary Microbiology, 1993, vol. 38, 41-58 [0352]

\bulletBULLER, R. M. L.; G. L. SMITH; CREMER, K.; NOTKINS, A. L.; MOSS, B. Nature, 1985, vol. 317, 813-815 [0352]

\bulletBULLER, R. M. L.; CHAKRABARTI, S.; COOPER, J. A.; TWARDZIK, D. R.; MOSS, B. J. Virol., 1988, vol. 62, 866-874 [0352]

\bulletBZIK, D. J.; B. A. FOX; N. A. DELUCA; S. PERSON. Virology, 1984, vol. 133, 301-307 [0352]

\bulletCADOZ, M.; A. STRADY; B. MEIGNIER; J. TAYLOR; J. TARTAGLIA; E. PAOLETTI; S. PLOTKIN. The Lancet, 1992, vol. 339, 1429 [0352]

\bulletCANTIN, E. M.; R. EBERLE; J. L. BALDICK; B. MOSS; D. E. WILLEY; A. L. NOTKINS; H. OPEN- SHAW. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 5908-5912 [0352]

\bulletCARMICHAEL, L.; STRANDBERG, J.; BARNES, F. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1965, vol. 120, 644-650 [0352]

\bulletCARMICHAEL, L. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1970, vol. 156, 1714-1721 [0352]

\bulletCHAMBERS, P.; N. S. MILLAR; P. T. EMMERSON. J. Gen. Virol., 1986, vol. 67, 2685-2694 [0352]

\bulletCHAN, W. Immunol, 1983, vol. 49, 343-352 [0352]

\bulletCHILD, S. J.; PALUMBO, G. J.; BULLER, R. M. L.; HRUBY, D. E. Virology, 1990, vol. 174, 625-629 [0352]

\bulletCLEWELL, D. B. J. Bacteriol., 1972, vol. 110, 667-676 [0352]

\bulletCLEWELL, D. B.; D. R. HELINSKI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1969, vol. 62, 1159-1166 [0352]

\bulletCOLINAS, R. J.; R. C. CONDIT; E. PAOLETTI. Virus Research, 1990, vol. 18, 49-70 [0352]

\bulletCOMPTON, T. Cell Biology of Virus Entry, Replication, and Pathogenesis. Alan R. Liss, Inc, 1989, 45-56 [0352]

\bulletCOONEY E. L.; CORRIER A. C.; GREENBERG P. D. et al. Lancet, 1991, vol. 337, 567-572 [0352]

\bulletCORDEN, J.; WASYLYK, B.; BUCHWALDER, A.; SASSONE-CORSI, P.; KEDINGER, C.; CHAMBON, P. Science, 1980, vol. 209, 1406-1414 [0352]

\bulletCRANAGE, M. P.; T. KOUZARIDES; A. T. BANKIER; S. SATCHWELL; K. WESTON; P. TOMLINSON; B. BARRELL; H. HART; S. E. BELL; A. C. MINSON. EMBO J., 1986, vol. 5, 3057-3063 [0352]

\bulletCREMER, K. J.; M. MACKETT; C. WOHLENBERG; A. L. NOTKINS; B. MOSS. Science, 1985, vol. 228, 737-740 [0352]

\bulletDAVIS, W. B.; J. A. TAYLOR; J. E. OAKES. J. Infect. Dis., 1979, vol. 140, 534-540 [0352]

\bulletDAVISON, A. J.; J. E. SCOTT. J. gen. Virol., 1986, vol. 67, 1759-1816 [0352]

\bulletDRILLIEN, R.; F. KOEHREN; A. KIRN. Virology, 1981, vol. 111, 488-499 [0352]

\bulletEBERLE, R.; R. J. COURTNEY. J. Virol., 1980, vol. 35, 902-917 [0352]

\bulletEDBAUER, C.; R. WEINBERG; J. TAYLOR; A. REY-SENELONGE; J. F. BOUQUET; P. DESMETTRE; E. PAOLETTI. Virology, 1990, vol. 179, 901-904 [0352]

\bulletENGELKE, D. R.; HOENER, P. A.; COLLINS, F. S. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 544-548 [0352]

\bulletESPION, D.; S. DE HENAU; C. LETELLIER; C.-D. WEMERS; R. BRASSEUR; J. F. YOUNG; M. GROSS; M. ROSENBERG; G. MEULEMANS; A. BURNY. Arch. Virol., 1987, vol. 95, 79-95 [0352]

\bulletETINGER H. M.; ALTIENBURGER W. Vaccine, 1991, vol. 9, 470-472 [0352]

\bulletFARGEAUD, D.; C. BEINOIT JEANNIN; F. KATO; G. CHAPPUIS. Arch. Virol., 1984, vol. 80, 69-82 [0352]

\bulletFENNER, F. Virology, 1958, vol. 5, 502-529 [0352]

\bulletFITZPATRICK, D. R.; BABIUK, L. A.; ZAMB, T. J. Virology, 1989, vol. 173, 46-57 [0352]

\bulletFLEXNER, C.; HUGEN, A.; MOSS, B. Nature, 1987, vol. 330, 259-262 [0352]

\bulletFLOWERS, C.; EASTMAN, E.; O'CALLAGHAN, D. Virology, 1991, vol. 180, 175-184 [0352]

\bulletFRAME, M. C.; H. S. MARSDEN; D. J. MCGEOCH. J. gen. Virol., 1986, vol. 67, 745-751 [0352]

\bulletFRIES et al. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Anaheim, October 1992 [0352]

\bulletFRINK, R. J.; M. R. ESENBERG; G. COHEN; E. K. WAGNER. J. Virol., 1933, vol. 45, 634-647 [0352]

\bulletFUNAHASHI, S.; T. SATO; H. SHIDA. J. Gen. Virol., 1988, vol. 69, 35-47 [0352]

\bulletGARTEN, W.; KOHAMA, T.; H-D. KLENK. J. Gen. Virol., 1980, vol. 51, 207-211 [0352]

\bulletGHENDON, Y. Z.; CHEIRNOS, V. I. Acta Virol., 1964, vol. 8, 359-368 [0352]

\bulletGILLARD, S.; SPEHNER, D.; DRILLIEN, R.; KIRN, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, vol. 83, 5573-5577 [0352]

\bulletGLORIOSO, J.; C. H. SCHRODER; G. KUMEL; M. SZCZESIUL; M. LEVINE. J. Virol., 1984, vol. 50, 805-812 [0352]

\bulletGLORIOSO, J.; U. KEES; G. KUMEL; H. KIRCHNER; P. KRAMMER. J. Immunol, 1985, vol. 135, 575-582 [0352]

\bulletGOEBEL, S. J.; JOHNSON, G. P.; PERKUS, M. E.; DAVIS, S. W.; WINSLOW, J. P.; PAOLETTI, E. Virology, 1990, vol. 179, 247-266 [0352]

\bulletGOEBEL, S. J.; G. P. JOHNSON; M. E. PERKUS; S. W. DAVIS; J. P. WINSLOW; E. PAOLETTI. Virology, 1990, vol. 179, 517-563 [0352]

\bulletGOLDSTEIN, D. J.; S. K. WELLER. Virology, 1988, vol. 166, 41-51 [0352]

\bulletGRETCH, D. R.; B. KARI; L. RASMUSSEN; R. C. GEHRZ; M. F. STINSKI. J. Virol., 1988, vol. 62, 875-881 [0352]

\bulletGUO, P.; GOEBEL, S.; DAVIS, S.; PERKUS, M. E.; LANGUET, B.; DESMETTRE, P.; ALLEN, G.; PAOLETTI, E. J. Virol., 1989, vol. 63, 4189-4198 [0352]

\bulletGUO et al. J. Virol., 1990, vol. 64, 2399-2406 [0352]

\bulletHAMPL, H.; T. BEN-PORAT; L. EHRLICHER; K-O. HABERMEHL; A. S. KAPLAN. J. Virol., 1984, vol. 52, 583-590 [0352]

\bulletHOMMA, M.; M. OHUCHI. J. Virol., 1973, vol. 12, 1457-1465 [0352]

\bulletHONESS, R. W. Journal of General Virology, 1984, vol. 65, 2077-2107 [0352]

\bulletHONESS, R. W.; BODEMER, W.; CAMERON, K. R.; NILLER, H.-H.; FLECKENSTEIN, B. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1986, vol. 83, 3604-3608 [0352]

\bulletHRUBY, D. E.; R. A. MAKI; D. B. MILLER; L. A. BALL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 3411-3415 [0352]

\bulletHUTCHINSON, L.; BROWNE, H.; WARGENTS, V.; DORIS-POYNTER, N.; PRIMORAC, S.; GOLDSMITH, K.; MINSON, A.; D. C. JOHNSON. J. Virol., 1992, vol. 66, 2240-2250 [0352]

\bulletHUTCHINSON, L.; GOLDSMITH, K.; SNODDY, A.; GHASH, H.; GRAHAM, F.; D. JOHNSON. J. Virol., 1992, vol. 66, 5603-5609 [0352]

\bulletHRUBY, D. E.; L. A. BALL. J. Virol., 1982, vol. 43, 403-409 [0352]

\bulletICHIHASHI, Y.; DALES, S. Virology, 1971, vol. 46, 533-543 [0352]

\bulletIHARA, T.; KATO, A.; UEDA, S.; ISHIHAMA, A.; HIRAI, K. Virus Genes, 1989, vol. 3, 127-140 [0352]

\bulletISHII, H.; Y. KOBAYASHI; M. KUROKI; Y. KODAMA. J. gen. Virol., 1988, vol. 69, 1411-1414 [0352]

\bulletJACOBSON, J. G.; D. A. LEIB; D. J. GOLDSTEIN; C. L. BOGARD; P. A. SCHAFFER; S. K. WELLER; D. M. COEN. Virology, 1989, vol. 173, 276-283 [0352]

\bulletJAMIESON, A. T.; G. A. GENTRY; J. H. SUBAK-SHARPE. J. Gen. Virol., 1974, vol. 24, 465-480 [0352]

\bulletKATO, A.; SATO, I.; IHARA, T.; UEDA, S.; ISHIHAMA, A.; HIRAI, K. Gene, 1989, vol. 84, 399-405 [0352]

\bulletKATO, S.; M. TAKAHASHI; S. KAMEYAMA; J. KAMAHORA. Biken's, 1959, vol. 2, 353-363 [0352]

\bulletKELLER, P. M.; A. J. DAVISON; R. S. LOWE; C. D. BENNETT; R. W. ELLIS. Virology, 1986, vol. 152, 181-191 [0352]

\bulletKIEFF, E.; D. LIEBOWITZ et al. Virology. Rayen Press, Ltd, 1990, 1889-1920 [0352]

\bulletKIENY, M. P.; LATHE, R.; DRILLIEN, R.; SPEHNER, D.; SKORY, S.; SCHMITT, D.; WIKTOR, T.; KOPROWSKI, H.; LECOCQ, J. P. Nature, 1984, vol. 312, 163-166 [0352]

\bulletKLEIN, P.; KANEHISA, M.; DELISI, C. Biochimica Biophysica Acta, 1985, vol. 815, 468-476 [0352]

\bulletKONISHI et al. Virology, 1992, vol. 190, 454-458 [0352]

\bulletKOPP, A.; METTENLEITER, T. Journal of Virology, 1992, vol. 66, 2754-2762 [0352]

\bulletKOST, T. A.; E. V. JONES; K. M. SMITH; A. P REED; A. L. BROWN; T, J. MILLER. Virology, 1989, vol. 171, 365-376 [0352]

\bulletKOTWAL, G. J.; A. W. HUGIN; B. MOSS. Virology, vol. 171, 579-587 [0352]

\bulletKOTWAL, G. J.; B. MOS S. J. Virol., vol. 63, 600-606 [0352]

\bulletKOTWAL, G. J.; S. N. ISAACS; R. MCKENZIE; M. M. FRANK; B. MOSS. Science, 1990, vol. 250, 827-830 [0352]

\bulletKOTWAL, G. J.; MOSS, B. Nature, 1988, vol. 335, 176-178 [0352]

\bulletKOUZARIDES, T.; BANKIER, A. T.; SATCHWELL, S. C.; WESTON, K.; TOMLINSON, P.; BARRELL, B. G. Virology, 1987, vol. 157, 397-413 [0352]

\bulletKOZAK, M. Cell, 1986, vol. 44, 283-292 [0352]

\bulletKUHN, J.; EING, B.; BROSSMER, R.; MUNK, K.; BRAUN, R. Journal of General Virology, 1988, vol. 69, 2847-2858 [0352]

\bulletLAI, A. C.-K.; B. G.-T. POGO. Virus Res., 1989, vol. 12, 239-250 [0352]

\newpage

\bulletLASKY, L. A.; D. DOWBENKO; C. C. SIMONSEN; P. W. BERMAN. Bio-Technology, 1984, vol. 2, 527-532 [0352]

\bulletLAWRENCE, W. C.; R. C. D'URSO; C. A. KUNDEL; J. C. WHITEIECK; L. J. BELLO. J. Virol, 1986, vol. 60, 405-414 [0352]

\bulletLE, L.; R. BRASSEUR; C. WEMERS; G. MEULEMANS; A. BURNY. Virus Genes, 1988, vol. 1, 333-350 [0352]

\bulletLONG, D.; COHEN, G.; MUGGERIDGE, M.; EISENBERG, R. Journal of Virology, 1990, vol. 64, 5542-5552 [0352]

\bulletLONG, D.; WILCOX, W.; ABRAMS, W.; COHEN, G.; EISENBERG, R. Journal of Virology, 1992, vol. 66, 6668-6685 [0352]

\bulletLONGNECKER, R.; S. CHATTERJEE; R. WHITLEY; B. ROIZMAN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 4303-4307 [0352]

\bulletMAEDA, K.; HORIMOTO, T.; NORIMINE, J.; KAWAGUCHI, Y.; TOMONAGA, K.; NIIKURA, M.; KAI, C.; TAKAHASHI, E.; MIKAMI, T. Archives of Virology, vol. 127, 387-397 [0352]

\bulletMANDECKI, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, vol. 83, 7177-7182 [0352]

\bulletMANIATIS, T.; E. F. FRITSCH; J. SAMBROOK. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 [0352]

\bulletMARCHIOLI, C. C.; R. J. YANCEY, JR.; R. C. WARDLEY; D. R. THOMSEN; L. E. POST. Am. J. Vet. Res., 1987, vol. 48, 1577-1583 [0352]

\bulletMARCHIOLI, C.; R. J. YANCEY, JR.; J. G. TIMMINS; L. E. POST; B. R. YOUNG; D. A. POVENDO. Am. J. Vet. Res., 1988, vol. 49, 860-864 [0352]

\bulletMARCHIOLI, C. C.; R. J. YANCEY, JR.; E. A. PETROVSKIS; J. G. TIMMINS; L. E. POST. J. Virol., 1987, vol. 61, 3977-3982 [0352]

\bulletMATTHEWS, R. E. F. Intervirology, 1982, vol. 17, 42-44[0352]

\bulletMCGEOCH, D. J.; M. A. DALRYMPLE; A. J. DAVISON; A. DOLAN; M. C. FRAME; D. MCNAB; L. J. PERRY; J. E. SCOTT; P. TAYLOR. J. gen. Virol., 1988, vol. 69, 1531-1574 [0352]

\bulletMCGINNES, L. W.; T. G. MORRISON. Virus Research, 1986, vol. 5, 343-356 [0352]

\bulletMCLAUGHLIN-TAYLOR, E.; D. E. WILLEY; E. M. CANTIN; R. EBERLE; B. MOSS; H. OPENSHAW. J. gen. Virol., 1988, vol. 69, 1731-1734 [0352]

\bulletMEAS, R. K.; S. L. FRITSCH; L. L. HERR; P. A. ROTA. J. Virol, 1984, vol. 51, 259-262 [0352]

\bulletMERZ, D. C.; A. SCHEID; P. CHOPPIN. J. Exper. Med., 1980, vol. 151, 275-288 [0352]

\bulletMISRA, V.; R. M. BLUMENTHAL; L. A. BABIUK. J. Virol., 1981, vol. 40, 367-378 [0352]

\bulletMORGAN, A. J.; M. MACKETT; S. FINERTY; J. R. ARRAND; F. T. SCULLION; M. A. EPSTEIN. J. Med. Virol, 1988, vol. 25, 189-195 [0352]

\bulletMOSS, B.; E. WINTERS; J. A. COOPER. J. Virol., 1981, vol. 40, 387-395 [0352]

\bulletNAGAI, Y.; H. D. KLENK; R. ROTT. Virology, 1976, vol. 72, 494-508 [0352]

\bulletNAGAI, Y.; T. YOSHIDA; M. HAMAGUCHI; H. NARUSE; M. IINUMA; K. MAENO; T. MATSUMOTO. Microbiol. Immunol., 1980, vol. 24, 173-177 [0352]

\bulletNAZERIAN, K.; LEE, L.; YANAGIDA, N.; OGAWA, R. Journal of Virology, 1992, vol. 66, 1409-1413 [0352]

\bulletNICOLSON, L.; ONIONS, D. E. Virology, 1990, vol. 179, 378-387 [0352]

\bulletNORRBY, E.; Y. GOLLMAR. Infect. and Immun., 1975, vol. 11, 231-239 [0352]

\bulletOAKES, J. E.; H. ROSEMOND-HORNBEAK. Infect. Immun., 1978, vol. 21, 489-495 [0352]

\bulletOGAWA, R.; N. YANAGIDA; S. SAEKI; S. SAITO; S. OHKAWA; H. GOTOH; K. KODAMA; K. KAMOGAWA; K. SAWAGUCHI; Y. IRITANI. Vaccine, 1990, vol. 8, 486-490 [0352]

\bulletPAEZ, E.; S. DALLO; M. ESTEBAN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3365-3369 [0352]

\bulletPALUMBO, G. J.; PICKUP, D. J.; FREDRICKSON, T. N.; MCINTYRE, L. J.; BULLER, R. M. L. Virology, 1989, vol. 172, 262-273 [0352]

\bulletPANICALI, D.; S. W. DAVIS; S. R. MERCER; E. PAOLETTI. J. Virol, 1981, vol. 37,1000-1010 [0352]

\bulletPANICALI, D.; E. PAOLETTI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, 4927-4931 [0352]

\bulletPANICALI, D.; DAVIS, S. W.; MERCER, S. R.; PAOLETTI, E. J. Virol., 1981, vol. 37, 1000-1010 [0352]

\bulletPAOLETTI, E.; B. R. LIPINSKAS; C. SAMSONOFF; S. MERCER; D. PANICALI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 193-197 [0352]

\bulletPAPP-VID, G.; J. B. DERBYSHIRE. Can. J. Comp. Med., 1979, vol. 43, 231-233 [0352]

\bulletPATEL, D. D.; PICKUP, D. J. EMBO, 1987, vol. 6, 3787-3794 [0352]

\bulletPATEL, D. D.; RAY, C. A,; DRUCKER, R. P.; PICKUP, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 9431-9435 [0352]

\bulletPEARSON, W. R.; LIPMAN, D. J. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1988, vol. 85, 2444-2448 [0352]

\bulletPELLETT, P. E.; M. D. BIGGIN; B. L. BARRELL; B. ROIZMAN. J. Virol., 1985, vol. 56, 807-813 [0352]

\bulletPERKUS M. E.; PICCINI A.; LIPINSKAS B. R. et al. Science, 1985, vol. 229, 981-984 [0352]

\bulletPERKUS, M. E.; K. LIMBACH; E. PAOLETTI. J. Virol., 1989, vol. 63, 3829-3836 [0352]

\bulletPERKUS, M. E.; A. PICCINI; B. R. LIPINSKAS; E. PAOLETTI. Science, 1985, vol. 229, 981-984 [0352]

\bulletPERKUS, M. E.; GOEBEL, S. J.; DAVIS, S. W.; JOHNSON, G. P.; LIMBACH, K.; NORTON, E. K.; PAOLETTI, E. Virology, 1990, vol. 179, 276-286 [0352]

\bulletPERKUS, M. E.; D. PANICALI; S. MERCER; E. PAOLETTI. Virology, 1986, vol. 152, 285-297 [0352]

\bulletPERKUS, M. E.; LIMBACH, K.; PAOLETTI, E. J. Virol., 1989, vol. 63, 3829-3836 [0352]

\bulletPERKUS, M. E.; S. J. GOEBEL; S. W. DAVIS; G. P. JOHNSON; E. K. NORTON; E. PAOLETTI. Virology, 1991, vol. 180, 406-410 [0352]

\bulletPETROVSKIS, E. A.; J. G. TIMMINS; M. A. ARMENTROUT; C. C. MARCHIOLI; R. J. YANCEY, JR.; L. E. POST. J. Virol, 1986, vol. 59, 216-223 [0352]

\bulletPETROVSKIS, E. A.; J. G. TIMMINS; L. E. POST. J. Virol., 1986, vol. 60, 185-193 [0352]

\bulletPICCINI, A.; M. E. PERKUS; E. PAOLETTI. Methods in Enzymology, 1987, vol. 153, 545-563 [0352]

\bulletPICCINI, A.; M. E. PERKUS; E. PAOLETTI. Methods in Enzymology. Academic Press, 1987, vol. 153, 545-563 [0352]

\bulletPICKUP, D. J.; B. S. INK; W. HU; C. A. RAY; W. K. JOKLIK. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, vol. 83, 7698-7702 [0352]

\bulletPICKUP, D. J.; B. S. INK; B. L. PARSONS; W. HU; W. K. JOKLIK. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6817-6821 [0352]

\bulletPIZER, L.; COHEN, G.; EISENBERG, R. Journal of Virology, 1980, vol. 34, 142-153 [0352]

\bulletPLUMMER, G.; GOODHEART, C.; HENSON, D.; BOWLING, C. Virology, 1969, vol. 39, 134-137 [0352]

\bulletPROUDFOOT, N. J.; BROWNLEE, G. G. Nature, 1976, vol. 163, 211-214 [0352]

\bulletREED, L. J.; MUENCH, H. Am. J. Hyg., 1938, vol. 27, 493-497 [0352]

\bulletRICHMAN, D. D.; A. BUCKMASTER; S. BELL; C. HODGMAN; A. C. MINSON. J. Virol., 1986, vol. 57, 647-655 [0352]

\bulletRIGGIO, M. P.; A. A. CULLINANE; D. E. ONIONS. J. Virol., 1989, vol. 63, 1123-1133 [0352]

\bulletRIVIERE, M.; TARTAGLIA, J.; PERKUS, M. E.; NORTON, E. K.; BONGERMINO, C. M.; LACOSTE, F.; DURET, C.; DESMETTRE, P.; PAOLETTI, E. Journal of Virology, 1992, vol. 66, 3424-3434 [0352]

\bulletROBBINS, A. K.; R. J. WATSON; M. E. WHEALY; W. W. HAYS; L. W. ENQUIST. J. Virol., 1986, vol. 58, 339-347 [0352]

\bulletROBBINS, A. K.; D. J. DORNEY; M. W. WATHEN; M. E. WHEALEY; C. GOLD; R. J. WATSON; L. E. HOLLAND; S. D. WEED; M. LEVINE; J. C. GLORIOSO. J. Virol., 1987, vol. 61, 2691-2701 [0352]

\bulletROIZMAN, B.; A. E. SEARS. Virology. Rayen Press, Ltd, 1990, 1795-1841 [0352]

\bulletROIZMAN, B. The Herpesviruses. Plenum Press, 1982, vol. 1, 1-23 [0352]

\bulletROONEY, J. F.; C. WOHLENBERG; K. J. CREMER; B. MOSS; A. L. NOTKINS. J. Virol., 1988, vol. 62, 1530-1534 [0352]

\bulletROSENTHAL, K. L.; J. R. SMILEY; S. SOUTH; D. C. JOHNSON. J. Virol., 1987, vol. 61, 2438-2447 [0352]

\bulletROSS, L.; SANDERSON, M.; SCOTT, S. BINNS, M.; DOEL, T.; MILNE, B. Journal of General Virology, 1989, vol. 70, 1789-1804 [0352]

\bulletROTA, P. A.; R. K. MAES; W. T. RUYECHAN. Virology, 1986, vol. 154, 168-179 [0352]

\bulletRUBENSTEIN, A. S.; A. S. KAPLAN. Virology, 1975, vol. 66, 385-392 [0352]

\bulletSANGER, F.; S. NICKLEN; A. COULSON. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, vol. 74, 5463-5467 [0352]

\bulletSCHMIDTT, J. F. C.; H. G. STUNNENBERG. J. Virol., 1988, vol. 62, 1889-1897 [0352]

\bulletSELIGMANN, E. B. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization, 1973, 279-285 [0352]

\bulletSHAPIRA, S. K.; CHOU, J.; RICHAUD, F. V.; CASADABAN, M. J. Gene, 1983, vol. 25, 71-82 [0352]

\bulletSHIDA, H. Virology, 1986, vol. 150, 451-462 [0352]

\bulletSHIDA, H.; T. TOCHIKURA; T. SATO; T. KONNO; K. HIRAYOSHI; M. SEKI; Y. ITO; M. HATANAKA; Y. HINUMA; M. SUGIMOTO. EMBO, 1987, vol. 6, 3379-3384 [0352]

\bulletSHIDA, H.; HINUMA, Y.; HATANAKA, M.; MORITA, M.; KIDOKORO, M.; SUZUKI, K.; MARUYZAM, T.; TAKAHASHI-NISHIMAKI, F.; SUGIMOTO, M.; KITAMURA, R. J. Virol., 1988, vol. 62, 4474-4480 [0352]

\bulletSHIMIZU, M.; K. SATOU; N. NISHIOKA. Arch. Virol., 1989, vol. 104, 169.174 [0352]

\bulletSINCLAIR, R.; R. F. COOK; J. A. MUMFORD. J. gen. Virol., 1989, vol. 70, 455-459 [0352]

\bulletSLABAUGH, M.; N. ROSEMAN; R. DAVIS; C. MATHEWS. J. Virol., 1988, vol. 62, 519-527 [0352]

\bulletSMITH, J. S.; P. A. YAGER; G. M. BAER. Laboratory Techniques in Rabies. WHO Geneva, 1973, 354-357 [0352]

\bulletSODORA, D.; COHEN, G.; MUGGERIDGE, M.; EISENBERG, R. Journal of Virology, 1991, vol. 65, 4424-4431 [0352]

\bulletSPAETE, R.; SAXENA, A.; SCOTT, P.; LONG, G.; PROBERT, W.; BRITT, W.; GIBSON W.; RASMUSSEN, L.; PACHL, C. Journal of Virology, 1990, vol. 64, 2922-2931 [0352]

\bulletSPEAR, P. G. The Basis. for Serodiagnosis and Vaccines, Immunochemistry of Viruses. 1985, vol. 2, 425-443 [0352]

\bulletSPEAR, P. G. The Herpesvirus. 1985, vol. 3, 315-356 [0352]

\bulletSTANBERRY, L. R.; S. KIT; M. G. MYERS. J. Virol., 1985, vol. 55, 322-328 [0352]

\bulletSTEVELY, W. S. J. Virol., 1977, vol. 22, 232-234 [0352]

\bulletSTOKES, A.; G. P. ALLEN; L. A. PULLEN; P. K. MURRAY. J. gen. Virol., 1989, vol. 70, 1173-1183 [0352]

\bulletSULLIVAN, V.; G. L. SMITH. J. gen. Virol., 1987, vol. 68, 2587-2598 [0352]

\bulletSULLIVAN, V.; G. L. SMITH. J. gen. Virol., 1988, vol. 69, 859-867 [0352]

\bulletSWAIN, M. A.; R. W. PEET; D. A. GALLOWAY. J. Virol, 1985, vol. 53, 561-569 [0352]

\bulletTABOR, S.; C. C. RICHARDSON. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, 4767-4771 [0352]

\bulletTARTAGLIA, J.; E. PAOLETTI. Immunochemistry of Viruses, II. The Basis for Serodiagnosis and Vaccines. Elsevier Science Publishers, 1990, 125-151 [0352]

\bulletTARTAGLIA, J.; J. TAYLOR; W. I. COX; J.-C. AUDONNET; M. E. PERKUS; A. RADAELLI; C. DE GIULI MORGHEN; B. MEIGNIER; M. RIVIERE; K. WEINHOLD. AIDS Research Reviews. Marcel Dekker, 1993, vol. 3 [0352]

\bulletTARTAGLIA, J.; PERKUS, M. E.; TAYLOR, J.; NORTON, E. K.; AUDONNET, J.-C.; COX, W. I.; DAVIS, S. W.; VAN DER HOEVEN, J.; MEIGNIER, B.; RIVIERE, M. Virology, 1992, vol. 188, 217-232 [0352]

\bulletTARTAGLIA, J.; JARRETT, O.; DESMETTRE, P.; PAOLETTI, E. J. Virol., 1993 [0352]

\bulletTAYLOR, J.; C. TRIMARCHI; R. WEINBERG; B. LANGUET; F. GUILLEMIN; P. DESMETTRE; E. PAOLETTI. Vaccine, 1991, 190-193 [0352]

\bulletTAYLOR, J.; C. TRIMARCHI; R. WEINBERG; B. LANGUET; F. GUILLEMIN; P. DESMETTRE; E. PAOLETTI. Vaccine, 1991, vol. 9, 190 [0352]

\bulletTAYLOR, J.; WEINBERG, R.; KAWAOKA, Y.; WEBSTER, R. G.; PAOLETTI, E. Vaccine, 1988, vol. 6, 504-508 [0352]

\bulletTAYLOR, J.; R. WEINBERG; B. LANQUET; P. DESMETTRE; E. PAOLETTI. Vaccine, 1988, vol. 6, 497-503 [0352]

\bulletTAYLOR, J.; R. WEINBERG; J. TARTAGLIA; C. RICHARDSON; G. ALKHATIB; D. BRIEDIS; M. APPEL; E. NORTON; E. PAOLETTI. Virology, 1992, vol. 187, 321-328 [0352]

\bulletTAYLOR, G.; E. J. STOTT; G. WERTZ; A. BALL. J. Gen. Virol., 1991, vol. 72, 125-130 [0352]

\bulletTAYLOR, J.; EDBAUER, C.; REY-SENELONGE, A.; BOUQUET, J.-F.; NORTON, E.; GOEBEL, S.; DESMETTRE, P.; PAOLETTI, E. J. Virol., 1990, vol. 64, 1441-1450 [0352]

\bulletTELFORD, E. A.; WATSON, M. S.; MCBRIDE, K.; DAVISON, A. J. The DNA sequence of equine herpesvirus-1. Virology, 1992, vol. 189, 304-316 [0352]

\bulletTIKOO, S. K.; FITZPATRICK, D. R.; BABIUK, L. A.; ZAMB, T. J. Journal of Virology, 1990, vol. 64, 5132-5142 [0352]

\bulletTOYODA, T.; T. SAKAGUCHI; K. IMAI; N. M. INOCENCIO; B. GOTOH; M. HAMAGUCHI; Y. NAGAI. Virology, 1987, vol. 158, 242-247 [0352]

\bulletWACHSMAN, M.; L. AURELIAN; J. C. R. HUNTER; M. E. PERKUS; E. PAOLETTI. Bioscience Reports, 1988, vol. 8, 323-334 [0352]

\bulletWACHSMAN, M.; J. H. LUO; L. AURELIAN; M. E. PERKUS; E. PAOLETTI. J. gen. Virol., 1989, vol. 70, 2513-2520 [0352]

\bulletWACHSMAN, M.; L. AURELIAN; C. C. SMITH; B. R. LIPINSKAS; M. E, PERKUS; E. PAOLETTI. J. Infect. Dis., 1987, vol 155, 1188-1197 [0352]

\bulletWATHEN, M. W.; L. M. K. WATHEN. J. Virol., 1986, vol. 58, 173-178 [0352]

\bulletWATHEN, M. W.; L. M. K. WATHEN. J. Virol., 1984, vol. 51, 57-62 [0352]

\bulletWATHEN, L. M. K.; K. B. PLATT; M. W. WATHEN; R. A. VAN DEUSEN; C. A. WHETSTONE; E. C. PIRTLE. Virus Res., 1985, vol. 4, 19-29 [0352]

\bulletWEIR, J. P.; M. BENNETT; E. M. ALLEN; K. L. ELKINS; S. MARTIN; B. T. ROUSE. J. gen. Virol., 1989, vol. 70, 2587-2594 [0352]

\bulletWEIR, J. P.; B. MOSS. J. Virol., 1983, vol. 46, 530-537 [0352]

\bulletWHALLEY, J. M.; G. R. ROBERTSON; N. A. SCOTT.; G. C. HUDSON; C. W. BELL; L. M. WOODWORTH. J. gen. Virol., 1989, vol. 70, 383-394 [0352]

\bulletWHEALY, M. E.; A. K. ROBBINS; L. W. ENQUIST. J. Virol., 1989, vol. 63, 4055-4059 [0352]

\bulletWHITBECK, J. C.; L. Z. BELLO; W. C. LAWRENCE. J. Virol., 1988, vol. 62, 3319-3327 [0352]

\bulletWILCOX, W. C.; LONG, D.; SODORA, D. L.; EISENBERG, R. J.; COHEN, G. H. Journal of Virology, 1988, vol. 62, 1941.1947 [0352]

\bulletWITTMANN, G.; H.-J. RZIHA. Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs. Kluwer Academic Publishers, 1989, 230-325 [0352]

\bulletXUAN, X.; HORIMOTO, T.; LIMCUMPAO, J. A.; TAKUMI, A.; TOHYA, Y.; TAKAHASHI, E.; MIKAMI, T. Archives of Virology, 1991, vol. 116, 185-195 [0352]

\bulletZAMB, T. 68th Annual Meeting of Conference of Research Workers in Animal Disease, 16 November 1987, vol. 330 [0352]

\bulletZARLING, J. M.; P. A. MORAN; R. L. BURKE; C. PACHL; P. W. BERMAN; L. A. LASKY. J. Immunol., 1986, vol. 136, 4639-4673 [0352]

\bulletZARLING, J. M.; P. A. MORAN; L. A. LASKY; B. MOSS. J. Virol., 1986, vol. 59, 506-509 [0352]

\bulletZEZULAK, K. M.; P. G. SPEAR. J. Virol., 1984, vol. 49, 741-747 [0352]

\bulletZHOU, J.; L. CRAWFORD; L. MCLEAN; X. SUN; M. STANLEY; N. ALMOND; G. L. SMITH. J. Gen. Virol., 1990, vol. 71, 2185-2190 [0352]

\bulletXUAN et al. Nippon Juigakn Zasshi, 1990, vol. 52, 1181-1181 [0352]

\bulletLIMCUMPAO et al. J. Vet. Med. Sci, 1991, vol. 53, 423-432 [0352]

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: PAOLETTI, ENZO

\hskip3,9cm

LIMBACH. KEITH J.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS DE AMINOÁCIDO Y DE NUCLEÓTIDO DE VIRUS DE gB, gC Y gD DE VIRUS DE HERPES CANINO Y USOS PARA LOS MISMOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 128

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA

\vskip0.800000\baselineskip

: DESTINATARIO: CURTIS, MORRIS & SAFFORD, P.C.

\vskip0.800000\baselineskip

: CALLE: 530 FIFTH AVENUE, 25 TH FLOOR

\vskip0.800000\baselineskip

: CIUDAD: NEW YORK

\vskip0.800000\baselineskip

: ESTADO: NEW YORK

\vskip0.800000\baselineskip

: PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

\vskip0.800000\baselineskip

: ZIP: 10036

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

FORMA LEIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.800000\baselineskip

: TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE

\vskip0.800000\baselineskip

: ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.800000\baselineskip

: SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.800000\baselineskip

: SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE SOLICITUD: US/08/413.118

\vskip0.800000\baselineskip

: FECHA DE SOLICITUD: 23 MARZO 1995

\vskip0.800000\baselineskip

: CLASIFICACIÓN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/220.151

\vskip0.800000\baselineskip

: FECHA DE SOLICITUD: 30 DE MARZO DE 1994

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN RELATIVA AL AGENTE/ATTORNEY

\vskip0.800000\baselineskip

: NOMBRE: FROMMER, WILLIAM S.

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE REGISTRO: 25.506

\vskip0.800000\baselineskip

: REFERENCIA/NÚMERO DE DOSIER: 454310-2670

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.800000\baselineskip

: TELÉFONO: (212) 840-3333

\vskip0.800000\baselineskip

: TELEFAX: (212) 840-0712

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3000 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

44

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 879 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 879 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

52

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1041 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

59

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 980 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): MOLÉCULA TIPO: peptídico

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

61

62

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 913 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

65

66

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 868 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(V): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

69

70

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 903 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

73

74

75

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 906 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

80

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 857 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: amino ácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

84

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2280 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

86

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 459 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

88

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 175 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: peptídica

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 459 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

92

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 533 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(V): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

94

95

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 468 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA:sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(V): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

97

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 511 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

100

101

\newpage

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1320 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

103

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 345 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

105

106

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 345 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

108

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 374 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

110

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 442 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(V): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

112

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 393 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

114

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATTAACTA GCTACCCGGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACATTAAT TGATCGATGG GCCCTTAA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencillaC

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

515

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 69 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

516

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGTTAATT AGGCGGCCGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATTACTAT GAAGGATCCG TT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencillaC

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATGATACT TCCTAGGCAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATTACTAG ATCTGAGCTC CCCGGGCTCG AGGGATCCGT T

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATGATCTA GACTCGAGGG GCCCGAGCTC CCTAGGCAA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCCGAATT CTAGCT

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO E¿DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTAAGATC GA

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 75 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

517

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

518

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAATGGGCG TGGATTGTTA ACTTTATATA ACTTATTTTT TGAATATAC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

519

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTGCTTACT AAAAGATTTC ATAAACCTTT CAAAATATCC ATCAACTATC T

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAAAATA AATCACTTTT TATACTAAGA TCTCCCGGGC TGCAGC

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

520

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCTGTATA TTTGCACCAA TTTAGATCTT ACTCAAAATA TGTAACAATA

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTCATTTAA CACTATACTC ATATTAATAA AAATAATATT TATT

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

\vskip1.000000\baselineskip

521

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

522

523

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46:

\vskip1.000000\baselineskip

524

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

\vskip1.000000\baselineskip

525

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAGATCTC TCGAGCTGCA GGGCGCCGGA TCCTTTTTCT

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTCTAGAG AGCTCGACGT CCCGCGGCCT AGGAAAAAGA

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 59 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGATATCCGT TAAGTTTGTA TCGTAATGGG CTCCAGATCT TCTACCAGGA TCCCGGTAC

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCTG GTAGAAGATC TGGAGCCCAT TACGATACAA ACTTAACGGA TATCG

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCGAGCT CCCCGGG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGGGGAGC TCG

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTTATAA AAAGTTAACT ACGTAG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCCTACGT AGTTAACTTT TTATAAAAAG AGCT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTAACTCAG CTGACTATCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACGTAGTTA ACTTTTTATA AAAATCATAT TTTTGTAGTG GCTC

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencila

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

\vskip1.000000\baselineskip

526

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

\vskip1.000000\baselineskip

527

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 68 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

\vskip1.000000\baselineskip

528

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:

\vskip1.000000\baselineskip

529

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3209 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

116

117

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTCCCGGG AATTCTAGCT AGCTAGTTT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCTCAAAA GCTTCCCGGG AATTCTAGCT AGCTAGTTTT TATAAA

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCTTTATA AAAACTAGCT AGCTAGAATT CCCGGGAAGC TTTTGAGAGT

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:

\vskip1.000000\baselineskip

530

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTACGATA CAAACTTAAC GGATATCGCG ATAATGAAAT AATTTCAG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:

\vskip1.000000\baselineskip

531

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAGATCTA AGCTTGTCTG GGATCGTGTA AATAGGGAAT TTCCCAAAAC A

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACGGAAAA ACCAGAAGGG GTACAAACAG GAGAGCCTGA GGAAC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCCCGG G

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3659 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:

119

120

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): tipo de hebra: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATTATCGC GATATCCGTG TTAACTAGCT AGCTAATTTT TATTCCCGGG ATCCTTATCA

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATAAGGAT CCCGGGAATA AAAATTAGCT AGCTAGTTAA CACGGATATC GCGATAATGA

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2356 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:

\vskip1.000000\baselineskip

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACAATCTAA GTCCTATATT AGAC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTTTTAG GTAGACAC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): C

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATCGTCTT CATCATCG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTTAAACT TATTGTAAGG GTATACCTG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 61 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:

\vskip1.000000\baselineskip

532

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTAACTAA CTAATAAAAA ACCCGGGCTG CAGCAAGCTT TTTGTAACTA ACTAATCGTT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 99 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82:

\vskip1.000000\baselineskip

533

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 99 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:

\vskip1.000000\baselineskip

534

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:

\vskip1.000000\baselineskip

535

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:

\vskip1.000000\baselineskip

536

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86:

\vskip1.000000\baselineskip

537

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACCACGCAA ACAACTCAAC AAAACAGGTC GACTTTAAAT TTTTCTGCA

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 132 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:88:

\vskip1.000000\baselineskip

538

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 132 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:89:

\vskip1.000000\baselineskip

539

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAACATGCG GTGCACCATT TGTATATAAG TTAACGAATT CCAAGTCAAG C

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTGACTTG GAATTCGTTA ACTTATATAC AAATGGTGCA CCGCATGTTA T

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGAATGGT AATTCT

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCCGGGTT AAACTTTACT TTCATTTTC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:94:

\vskip1.000000\baselineskip

540

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 56 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:95:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGTACTTT CCGGTGTTGT TGGATCACAT ATTATTAAAG TATAAATAAT AAAGAA

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAATGAAG TTATGAAACT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCACTGATC ATTTCAATTT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAATTTTG AATGAAAACA CTAGAACC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTAGTGTT TTCATTCAAA ATTCCAT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTCAAAGT TTAATACACC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATGGCTTCA CGTTTGGCAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:102:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCGGGGAT ATAATTCATA TGTCCCCTTT CTTTGGATTA CGAGATGGT

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:103:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCTCGTA ATCCAAAGAA AGGGGGACATA TGAAT

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2951 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:104:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

125

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2951 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

127

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 879 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(V): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:106:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

129

130

131

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1615 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): Tipo de hebra: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:107:

\newpage

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1615 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:108:

135

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 112 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:109:

\vskip1.000000\baselineskip

541

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 106 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:110:

\vskip1.000000\baselineskip

542

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:111:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTAGATTCC AATGGAAAGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:112:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTCGCGAT ATCCGTTAAG T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:113:

\vskip1.000000\baselineskip

543

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:114:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGTATACC TAATAAGAAA TCATTATAAA AGT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:115:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTATAAT GATTTCTTAT TAGGTATACA AAATC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:116:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTTGCA

\hfill

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1760 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:117:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

136

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1760 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:118:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 319 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(V): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:119:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

139

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 68 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:120:

\vskip1.000000\baselineskip

544

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:121:

545

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:122:

546

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 101 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:123:

547

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 110 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:124:

548

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:125:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:125:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTTTGATT GTGATCC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1415 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:126:

\vskip1.000000\baselineskip

141

142

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:127:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1415 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:127:

\vskip1.000000\baselineskip

143

144

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:128:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 345 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(V): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:128:

\vskip1.000000\baselineskip

145

Claims

1. Ácido nucleico que codifica para la glicoproteína gB, gC o gD del virus herpes canino, en donde el ácido nucleico es seleccionado de entre el grupo que comprende:

(a): ácidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleótido de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 11 y 18, en donde la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 codifica para la glicoproteína gB del virus herpes canino, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11 codifica para la glicoproteína gC del virus herpes canino y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 codifica para la glicoproteína gD del virus herpes canino;

(b): ácidos nucleicos que codifican para una glicoproteína gB de virus herpes canino que tiene como una de las secuencias de aminoácido la SEQ ID NO: 2;

(c): ácidos nucleicos que codifican para una glicoproteína gC de virus herpes canino que tiene como una de las secuencias de aminoácido la SEQ ID NO: 12 ó 13;

(d): ácidos nucleicos que codifican para una glicoproteína gD de virus herpes canino que tiene como una de las secuencias de aminoácido la SEQ ID NO: 19.

2. Ácido nucleico de la reivindicación 1, que es DNA.

3. Vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2.

4. Vector de la reivindicación 3, en donde el vector es un poxvirus.

5. Vector de la reivindicación 4, en donde el poxvirus es un virus avipox o un virus vaccinia.

6. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, el cual es un virus recombinante modificado, teniendo el citado virus recombinante modificado funciones genéticas codificadas por virus inactivadas en el mismo, con la finalidad de que el virus tenga una virulencia atenuada, reteniendo sin embargo su eficacia; comprendiendo adicionalmente el citado virus DNA exógeno que tiene al menos uno de los ácidos nucleicos de las reivindicaciones 1 ó 2.

7. Vector de la reivindicación 6, en donde las funciones genéticas son inactivadas mediante la supresión de al menos un marco de lectura abierta.

8. Vector de la reivindicación 7, en donde las funciones genéticas suprimidas incluyen un marco de lectura abierta C7L-K1L o funciones de gama huésped.

9. Vector de la reivindicación 8, en donde:

(a): al menos un marco de lectura abierta adicional seleccionado de entre el grupo que comprende J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, 14L, un gen de la timidita-quinasa, una región hemorrágica, una región de cuerpo de inclusión de tipo A, un gen hemaglutinina, y una subunidad grande, ribonucleótido-reductasa,

(b): J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L y 14L ó

(c): un gen timidina-quinasa, una región hemorrágica, una región de cuerpo de inclusión de tipo A, un gen hemaglutinina, una región de gama huésped, y una subunidad grande ribonucleótido-reductasa

es suprimida del virus.

10. Vector de la reivindicación 9, que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, el cual es un virus recombinante NYVAC.

11. Vector de la reivindicación 3, el cual es un virus avipox recombinante modificado, que es modificado a los efectos de que tenga una virulencia atenuada en un huésped; y que contiene DNA exógeno en una región no esencial del genoma del virus, teniendo el citado DNA exógeno al menos uno de los ácidos nucleicos de las reivindicaciones 1 ó 2.

12. Vector de la reivindicación 11, en donde el citado virus es un poxvirus del canario.

13. Vector de la reivindicación 12, en donde el poxvirus del canario es una cepa de vacuna Rentschler que ha sido atenuada a través de más de 200 pasos en serie sobre fibroblastos de embrión de pollito, una semilla master del mismo fue sometida a cuatro purificaciones en placa sucesivas en agar, a partir de las cuales se amplificó un clon de placa a través de cinco pasos adicionales.

14. Vector de la reivindicación 13, que contiene el ácido nucleico de las reivindicaciones 1 ó 2, el cual es un virus recombinante ALVAC.

15. Vector de la reivindicación 14, en donde el citado ácido nucleico es el acido nucleico según la reivindicación 1(b) bajo control del promotor I3L; el ácido nucleico según la reivindicación 1(c) bajo control del promotor H6; o el ácido nucleico según la reivindicación 1(d) bajo el control del promotor H6.

16. Procedimiento para expresar un producto genético en una célula cultivada in vitro, que comprende la introducción en la célula de un vector como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15.

17. Glicoproteína gB, gC o Gd de virus herpes canino, codificada por un ácido nucleico de las reivindicaciones 1 ó 2.

18. Glicoproteína de virus herpes canino de la reivindicación 17, que ha sido aislada a partir de la expresión in vitro según la reivindicación 16.

19. Composición vacuna y/o farmacéutica que comprende un vector como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 y/o la glicoproteína gB, gC o gD de virus herpes canino de las reivindicaciones 17 ó 18, en mezcla con un soporte adecuado.

20. Anticuerpo que reconoce específicamente una glicoproteína gB, gC o gD de virus herpes canino de las reivindicaciones 17 ó 18.

21. Anticuerpo de la reivindicación 20, que es un anticuerpo monoclonal.

22. Uso de un ácido nucleico de las reivindicaciones 1 ó 2 como sonda y/o para la generación de un cebador PCR.

23. Composición para diagnosis que comprende el anticuerpo de la reivindicación 20 ó 21.