ES2210401T3 - Poxvirus recombinante-virus de la peritonitis infecciosa felina, sus composiciones y metodos para obtenerlos y usarlos. - Google Patents
Poxvirus recombinante-virus de la peritonitis infecciosa felina, sus composiciones y metodos para obtenerlos y usarlos.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN Y REIVINDICAN VIRUS RECOMBINANTES ATENUADOS QUE CONTIENEN DNA QUE CODIFICA ANTIGENO(S) DEL FIPV, COMPOSICIONES DE LOS MISMOS, ASI COMO METODOS PARA FABRICAR Y UTILIZAR LAS COMPOSICIONES, LOS PRODUCTOS DE EXPRESION DE LOS MISMOS, Y LOS ANTICUERPOS GENERADOS. LOS VIRUS RECOMBINANTES PUEDEN SER VIRUS RECOMBINANTES NYVAC O ALVAC. LAS COMPOSICIONES Y PRODUCTOS DE LOS MISMOS Y LOS ANTICUERPOS GENERADOS TIENEN VARIOS USOS PREVENTIVOS, TERAPEUTICOS Y DIAGNOSTICOS.
Description
Poxvirus recombinante-virus de la
peritonitis infecciosa felina, sus composiciones y métodos para
obtenerlos y usarlos.
La presente invención se refiere a poxvirus
recombinantes modificados, sus composiciones y métodos para
obtenerlos y usarlos; por ejemplo, un virus Vaccinia o un
virus de la viruela aviar (p.ej.: viruela de los canarios o viruela
de las aves de corral). Por ejemplo, la invención se refiere a
recombinantes de poxvirus modificado y virus de la peritonitis
infecciosa felina (FIPV), sus composiciones, y métodos para obtener
y usar los recombinantes y composiciones. La invención se refiere
además a los recombinantes atenuados, especialmente recombinantes
NYVAC- o ALVAC-FIPV, sus composiciones y métodos
para obtener y usar los recombinantes y composiciones. Por tanto, la
invención se refiere a un recombinante de
poxvirus-FIPV, recombinantes tales que expresan uno
o varios productos génicos de FIPV, composiciones que contienen
tales recombinantes y/o producto o productos génicos, y métodos para
obtener y usar los recombinantes o composiciones. El producto
génico puede ser FIPV N, M, y tres versiones de S (S1- proyección
superficial completa; S2- proyección superficial menos la secuencia
señal; y S3- sección C-terminal de la proyección
superficial) o sus combinaciones, como M y N. Los recombinantes o
composiciones que los contienen pueden inducir una respuesta
inmunológica frente a la infección de FIPV, cuando se administran a
un hospedador. El hospedador es preferiblemente un felino, p.ej.,
un gato o gatito. La respuesta puede ser protectora. Por tanto, la
composición puede ser inmunológica o antigénica, o una vacuna.
La invención se refiere adicionalmente a los
productos de expresión del poxvirus que, por sí mismos, son útiles
para provocar una respuesta inmunitaria, p.ej., incrementar los
anticuerpos o estimular respuestas celulares. Dichos anticuerpos o
respuestas son útiles frente a la infección de FIPV, o dichos
productos de expresión o los anticuerpos producidos por los mismos,
aislados de un medio de cultivo o de un animal, son útiles para
preparar un kit diagnóstico, un ensayo o prueba para la detección
del FIPV, o del virus recombinante, o de células infectadas, o de
la expresión de los antígenos o productos en otros sistemas. Los
productos de expresión y anticuerpos producidos por el virus
recombinante son especialmente útiles en kits, pruebas o ensayos
para la detección de anticuerpos o antígenos en un sistema,
hospedador, suero o muestra; y los productos de expresión son útiles
para la producción de anticuerpos.
En esta solicitud se hace referencia a varias
publicaciones. La cita completa a estas referencias se encuentra al
final de la memoria descriptiva, inmediatamente antes de las
reivindicaciones, o donde se menciona la publicación.
El virus Vaccinia y, más recientemente,
otros poxvirus se han usado para la inserción y expresión de genes
extraños. La técnica básica de insertar genes extraños en poxvirus
infecciosos vivos implica la recombinación entre secuencias de DNA
de pox que flanquean un elemento genético en un plásmido donador y
secuencias homólogas presentes en el poxvirus suministrador (Piccini
et al., 1987).
Específicamente, los poxvirus recombinantes se
construyen en dos etapas conocidas en la técnica, que son análogas a
los métodos para crear recombinantes sintéticos de poxvirus, como el
virus Vaccinia y el virus de la viruela aviar, descritos en
las patentes de EE.UU. N^{os} 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112,
5.110.587 y 5.174.993.
Primero, la secuencia génica de DNA a insertar en
el virus, particularmente un marco de lectura abierto de una fuente
distinta del pox, se coloca en una construcción génica de un
plásmido de E. coli en la que se ha insertado DNA homólogo a
una sección de DNA del poxvirus. Por separado, la secuencia génica
de DNA a insertar se une a un promotor. La conexión promotor- gen
se coloca en la construcción del plásmido, de forma que está
flanqueada en ambos extremos por DNA homólogo a una secuencia de
DNA que flanquea una región de DNA de pox que contiene un locus no
esencial. La construcción de plásmido resultante se amplifica a
continuación mediante crecimiento en bacterias de E. coli
(Clewell, 1972) y se aísla (Clewell et al., 1969; Maniatis
et al., 1982).
En segundo lugar, el plásmido aislado que
contiene la secuencia génica de DNA a insertar se transfecta en un
cultivo celular, p.ej. fibroblastos de embrión de pollo, junto con
el poxvirus. La recombinación entre el DNA de pox homólogo en el
plásmido y el genoma viral, respectivamente, produce un poxvirus
modificado por la presencia de secuencias de DNA extrañas en una
región no esencial de su genoma. El término DNA "extraño"
designa DNA exógeno, particularmente DNA de una fuente distinta del
pox, que codifica para productos génicos no producidos
ordinariamente por el genoma en el que se coloca el DNA
exógeno.
La recombinación génica es, en general, el
intercambio de secciones homólogas de DNA entre dos hebras de DNA.
En ciertos virus, el RNA puede reemplazar al DNA. Las secciones de
ácido nucleico homólogas son secciones de ácido nucleico (DNA o
RNA) que tienen la misma secuencia de bases nucleotídicas.
La recombinación génica se puede producir de
forma natural durante la replicación o producción de nuevos genomas
virales en la célula hospedadora infectada. Por tanto, la
recombinación génica entre genes virales se puede producir durante
el ciclo de replicación viral que se produce en una célula
hospedadora que se infecta conjuntamente con dos o más virus u otras
construcciones génicas diferentes. Una sección de DNA de un primer
genoma se usa de forma intercambiable para construir la sección del
genoma de un segundo virus que infecta conjuntamente, en el que el
DNA es homólogo al del primer genoma viral.
Sin embargo, la recombinación se puede producir
también entre secciones de DNA en diferentes genomas que no son
perfectamente homólogos. Si una de tales secciones es de un primer
genoma homólogo a una sección de otro genoma, excepto por la
presencia en la primera sección de, por ejemplo, un marcador
genético o un gen que codifica para un determinante antigénico
insertado en una porción del DNA homólogo, la recombinación aún se
puede producir y los productos de dicha recombinación se pueden
detectar entonces mediante la presencia de dicho marcador genético
en el genoma viral recombinante. Se han descrito recientemente
estrategias adicionales para producir virus Vaccinia
recombinantes.
La expresión acertada de la secuencia genética de
DNA insertada mediante el virus infeccioso modificado, requiere dos
condiciones. Primero, la inserción tiene que producirse en una
región no esencial del virus, a fin de que el virus modificado
permanezca viable. La segunda condición para la expresión del DNA
insertado es la presencia de un promotor en relación adecuada con el
DNA insertado. El promotor se tiene que colocar de forma que esté
localizado aguas arriba de la secuencia de DNA a expresar.
El virus Vaccinia se ha usado con éxito
para inmunizar frente a la viruela, culminando con la erradicación
mundial de la viruela en 1980. En el curso de su historia, han
aparecido muchas cepas del virus Vaccinia. Estas cepas
diferentes muestran una inmunogenicidad variada y están implicados
en grados variables con complicaciones potenciales, las más serias
de los cuales son la encefalitis pos-vacunación y
la viruela vacuna generalizada (Behbehani, 1983).
Con la erradicación de la viruela, adquirió
importancia un nuevo papel para el virus Vaccinia, el de
vector obtenido mediante ingeniería genética para la expresión de
genes extraños. Se han expresado en el virus Vaccinia genes
que codifican para un vasto número de antígenos heterólogos,
originando frecuentemente una inmunidad protectora frente a la
estimulación mediante el patógeno correspondiente (reseñado en
Tartaglia et al., 1990a, 1990b).
Se ha demostrado que los antecedentes genéticos
del vector de Vaccinia afectan a la eficacia protectora del
inmunógeno extraño expresado. Por ejemplo, la expresión del virus
de Epstein Barr (EBV) gp340 en cepa Wyeth del virus Vaccinia
no protegió a monos del nuevo mundo frente al linfoma inducido por
el virus EBV, mientras que la expresión del mismo gen en la cepa de
laboratorio WR del virus Vaccinia era protectora (Morgan
et al., 1988).
Es extremadamente importante un equilibrio fino
entre la eficacia y la seguridad de un candidato de vacuna
recombinante basado en el virus Vaccinia. El virus
recombinante tiene que presentar el inmunógeno o inmunógenos en una
forma que provoque una respuesta inmunitaria protectora en el
animal vacunado pero que carezca de propiedades patogénicas
significativas. Por tanto, la atenuación de la cepa del vector
sería una ventaja altamente deseable sobre el estado actual de la
tecnología.
Se han identificado diversos genes que no son
esenciales para el crecimiento del virus en cultivo tisular y cuya
deleción o inactivación reduce la virulencia en diversos sistemas
animales.
El gen que codifica para la
timidina-quinasa (TK) del virus de la viruela
vacuna, se ha cartografiado (Hruby et al., 1982) y
secuenciado (Hruby et al., 1983; Weir et al., 1983).
La inactivación o deleción completa del gen de la
timidina-quinasa no evita el crecimiento del virus
Vaccinia en una amplia variedad de células en cultivo
tisular. El virus Vaccinia TK^{-} es capaz también de
replicarse in vivo en el sitio de inoculación, en diversos
hospedadores y administrado por diversas rutas.
Se ha mostrado para el virus Herpes simplex de
tipo 2, que la inoculación intravaginal de cobayas con virus
TK^{-} producía titulaciones de virus significativamente menores
en la médula espinal, que la inoculación con virus TK^{+}
(Stanberry et al., 1985). Se ha demostrado que la actividad
TK codificada por Herpesvirus in vitro no era importante
para el crecimiento de virus en células metabolizando activamente,
pero se requería para el crecimiento del virus en células en reposo
(Jamieson et al., 1974).
La atenuación del virus Vaccinia TK^{-}
se ha mostrado en ratones inoculados por las rutas intracerebral y
peritoneal (Buller et al., 1985). La atenuación se observó,
tanto para la cepa de laboratorio neurovirulenta WR, como para la
cepa vacunal Wyeth. En ratones inoculados por la ruta intradérmica,
los virus Vaccinia recombinantes TK^{-} generaron
anticuerpos neutralizantes anti-Vaccinia, comparados con el
virus Vaccinia TK^{+} parental, indicando que en este
sistema de ensayo, la pérdida de la función TK no reduce
significativamente la inmunogenicidad del vector del virus
Vaccinia. Tras la inoculación intranasal de ratones con virus
Vaccinia recombinantes TK^{-} y TK^{+} (cepa WR), se ha
encontrado significativamente menos diseminación de virus a otras
localizaciones, incluyendo el cerebro (Taylor et al.,
1991a).
Otra enzima implicada en el metabolismo de los
nucleótidos es la ribonucleótido-reductasa. Se
demostró que la pérdida de actividad
ribonucleótido-reductasa codificada por virus en el
virus herpes simplex (HSV) por deleción del gen que codificaba la
subunidad mayor, no producía ningún efecto sobre el crecimiento
viral y la síntesis de DNA en células en división in vitro,
pero comprometía gravemente la capacidad del virus para crecer en
células privadas de suero (Goldstein et al., 1988). Usando un
modelo de ratón para infección de HSV aguda del ojo e infección
latente reactivable en los ganglios trigeminales, se demostró una
virulencia reducida para HSV del que se había delecionado la
subunidad grande de la ribonucleótido-reductasa,
comparada con la virulencia presentada por el HSV de tipo silvestre
(Jacobson et al., 1989).
Se han identificado tanto las subunidades pequeña
(Slabaugh et al., 1988) como grande (Schmidtt et al.,
1988) de la ribonucleótido-reductasa, en virus
Vaccinia. La inactivación por inserción de la subunidad
grande de la ribonucleótido-reductasa en la cepa WR
del virus Vaccinia, conduce a la atenuación del virus, como
se midió mediante inoculación intracraneal de ratones (Child et
al., 1990).
El gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la
viruela vacuna se ha cartografiado y secuenciado (Shida, 1986). El
gen HA del virus Vaccinia no es esencial para el crecimiento
en cultivo tisular (Ichihashi et al., 1971). La inactivación
del gen HA del virus Vaccinia produce una neurovirulencia
reducida en conejos inoculados por la ruta intracraneal y lesiones
menores en conejos en el sitio de inoculación intradérmica (Shida
et al., 1988). El locus HA se usó para la inserción de genes
extraños en la cepa WR (Shida et al., 1987), derivados de la
cepa Lister (Shida et al., 1988) y de la cepa Copenhagen (Guo
et al., 1989) del virus Vaccinia. Se ha demostrado que
virus Vaccinia recombinantes HA^{-} son inmunogénicos (Guo
et al., 1989; Itamura et al., 1990; Shida et
al., 1988; Shida et al., 1987) y protectores frente a la
estimulación por el patógeno relevante (Guo et al., 1989,
Shida et al., 1987).
El virus Cowpox (cepa roja de Brighton)
produce manchas rojas (hemorrágicas) sobre la membrana
corioalantoidea de los huevos de pollo. Las deleciones espontáneas
en el genoma de Cowpox generan mutantes que producen manchas
blancas (Pickup et al., 1984). La función hemorrágica
(u) se correlaciona con una proteína de 38 kDa codificada
por un gen temprano (Pickup et al., 1986). Se ha demostrado
que este gen, que tiene homología con los inhibidores de
serina-proteasa, inhibe la respuesta inflamatoria
del hospedador frente al virus Cowpox (Palumbo et
al., 1989) y es un inhibidor de la coagulación sanguínea.
El gen u está presente en la cepa WR del
virus Vaccinia (Kotwal et al., 1989b). Ratones
inoculados con un recombinante de virus Vaccinia WR en el
que la región u se ha inactivado mediante inserción de un gen
extraño, producen niveles de anticuerpo superiores frente al
producto génico extraño, comparados con ratones inoculados con un
virus Vaccinia recombinante similar, en los que el gen
u está intacto (Zhou et al., 1990). La región u
está presente en una forma no funcional defectiva en la cepa
Copenhagen del virus Vaccinia (marcos de lectura abiertos B13
y B14 mediante la terminología descrita en Goebel et al.,
1990a, b).
El virus Cowpox se localiza en células
infectadas en los cuerpos de inclusión citoplásmicos de tipo A
(ATI) (Kato et al., 1959). Se cree que la función de ATI es
la protección de los viriones de virus Cowpox durante la
diseminación entre animales (Bergoin et al., 1971). La región
ATI del genoma de Cowpox codifica una proteína de 160 kDa
que forma la matriz de los cuerpos ATI (Funahashi et al.,
1988; Patel et al., 1987). El virus Vaccinia, aunque
contiene una región homóloga en su genoma, generalmente no produce
ATI. En la cepa WR de Vaccinia, la región ATI del genoma se
traduce en forma de una proteína de 94 kDa (Patel et al.,
1988). En la cepa Copenhagen del virus Vaccinia, la mayoría
de las secuencias correspondientes a la región ATI se delecionan,
estando el extremo 3' restante de la región fusionado con
secuencias aguas arriba respecto de la región ATI, para formar el
marco de lectura abierto (ORF) A26L (Goebel et al., 1990a,
b).
Se han descrito diversas deleciones espontáneas
(Altenburger et al., 1989; Drillien et al., 1981; Lai
et al., 1989; Moss et al., 1981; Paez et al.,
1985; Panicalli et al., 1981) y obtenidas mediante
ingeniería genética (Perkus et al., 1991; Perkus et
al., 1989; Perkus et al., 1986) cerca del extremo
izquierdo del genoma del virus Vaccinia. Se demostró que una
cepa WR del virus Vaccinia con una deleción espontánea de
10kb (Moss et al., 1981; Panicali et al., 1981) se
atenuaba mediante inoculación intracraneal en ratones (Buller et
al., 1985). Se demostró más tarde que esta deleción incluía 17
ORFs potenciales (Kotwal et al., 1988b). Genes específicos
dentro de la región delecionada incluyen la viroquina N1L y una
proteína de 35 kDa (C3L, por la terminología descrita en Goebel
et al., 1990a, b). La inactivación por inserción de N1L
reduce la virulencia por inoculación intracraneal, tanto para
ratones normales como inmunosuprimidos (Kotwal et al.,
1989a). La proteína de 35 kDa se secreta como N1L en el medio de
células infectadas por virus Vaccinia. La proteína tiene
homología con la familia de las proteínas de control del
complemento, particularmente con la proteína que se une al
complemento 4B (C4bp) (Kotwal et al., 1988a). Como la C4bp
celular, la proteína de 35 kDa de Vaccinia se une al cuarto
componente del complemento, e inhibe la clásica cascada del
complemento (Kotwal et al., 1990). Por tanto, la proteína de
35 kDa de Vaccinia parece estar implicada en ayudar al virus
a eludir los mecanismos de defensa del hospedador.
El extremo izquierdo del genoma de
Vaccinia incluye dos genes que se han identificado como
genes del ámbito del hospedador, K1L (Gillard et al., 1986)
y C7L (Perkus et al., 1990). La deleción de ambos genes
reduce la capacidad del virus Vaccinia para crecer en diversas
líneas celulares humanas (Perkus et al., 1990).
Dos sistemas de vector vacunal adicionales
implican el uso de poxvirus con restricciones de hospedador de forma
natural, los virus de la viruela aviar. Tanto el virus de la
viruela de aves de corral (fowlpoxvirus, FPV), como el virus
de la viruela del canario (canarypoxvirus, CPV), se han
alterado mediante ingeniería genética para expresar productos
génicos extraños. El virus de la viruela de las aves de corral
(FPV) es el virus prototipo del género Avipox de la familia de los
Poxvirus. Este virus causa una enfermedad económicamente importante
en las aves de corral, que se ha controlado bien desde la década de
1920, mediante el uso de vacunas vivas atenuadas. La replicación de
los virus de la viruela aviar está limitada a especies aviares
(Matthews, 1982) y no existen descripciones en la literatura de
virus de la viruela aviar que originen una infección productiva en
ninguna especie no aviar, incluyendo el hombre. Esta restricción de
hospedador proporciona una barrera intrínsecamente segura para la
transmisión del virus a otras especies y hace del uso de los
vectores vacunales basados en virus de la viruela aviar en
aplicaciones veterinarias y humanas, una proposición atractiva.
El FPV se ha usado ventajosamente como un vector
que expresa antígenos de patógenos de aves de corral. La proteína
hemaglutinina de un virus de la influenza aviar virulento se
expresó en un recombinante FPV (Taylor et al., 1988a). Tras
la inoculación del recombinante en pollos y pavos, se indujo una
respuesta inmunológica que era protectora, bien frente a una
estimulación con virus de la influenza virulento homólogo o
heterólogo (Taylor et al., 1988a). Se han desarrollado
asimismo recombinantes FPV que expresan las proteínas superficiales
del virus de la enfermedad de Newcastle (Taylor et al.,
1990; Edbauer et al., 1990).
A pesar de la restricción de hospedador para la
replicación de FPV y CPV en sistemas aviares, se encontró que
recombinantes derivados de dichos virus expresaban proteínas
extrínsecas en células de origen no aviar. Adicionalmente, se
demostró que tales virus recombinantes provocaban respuestas
inmunológicas dirigidas hacia el producto del gen extraño y, en su
caso, se demostró que proporcionaban protección a partir de la
estimulación frente al patógeno correspondiente (Tartaglia et
al., 1993a,b; Taylor et al., 1992; 1991b; 1988b).
El virus de la peritonitis infecciosa felina
(FIPV) produce una enfermedad crónica, progresiva, mediada
inmunológicamente, en felinos como los gatos domésticos y exóticos.
Se cree que la ruta de la infección de FIPV se produce
primariamente a través de la cavidad oral y la faringe. La FIP
clínicamente evidente se produce una vez que el virus atraviesa la
barrera mucosa y una viremia primaria lleva el FIPV a sus muchos
órganos diana (hígado, bazo, intestino y pulmones). Se han descrito
dos formas de la enfermedad, como efusiva (húmeda) y no efusiva
(seca). La forma efusiva produce la acumulación de fluido clásica
observada en gatos infectados que se produce por una vasculitis de
tipo Arthus en los órganos diana, mediada por activación del
complemento, y una respuesta inflamatoria intensa. La forma no
efusiva se caracteriza por acumulación escasa o inexistente de
fluido ascítico, pero los órganos internos se pueden infiltrar con
depósitos fibrinosos granulares. Por tanto, los anticuerpos
formados como respuesta a la infección por FIPV (principalmente a la
proteína de la proyección superficial) tienden a favorecer la
patogénesis de la enfermedad y, obviamente, no son deseados en una
vacuna o composición inmunológica (Olsen y Scott, 1991). (Sin
embargo, la expresión de tales proteínas por un recombinante y los
propios recombinantes en sí son útiles si uno desea antígenos o
anticuerpos de los mismos para un kit, prueba o ensayo o
similares).
FIPV es un miembro de la familia
Coronaviridae. Los coronavirus son virus de RNA de hebra
positiva, grandes, con longitudes genómicas de 27-30
kb. El virión está recubierto y está lleno de estructuras
peploméricas denominadas proyecciones superficiales. La mitad
izquierda del genoma de FIPV codifica una poliproteína grande que
se escinde en fragmentos más pequeños, algunos de los cuales están
implicados en la replicación del RNA. La mitad derecha del genoma
de FIPV codifica 3 proteínas estructurales principales denominadas
nucleocápsida (N), matriz (M) y proyección superficial (S). El
producto del gen S de FIPV media la unión del virus al receptor
celular, desencadena la fusión de membranas y produce anticuerpos
neutralizantes del virus. La proteína N es necesaria para
encapsidar el RNA genómico y dirigir su incorporación al interior de
la cápsida, y se cree que está implicado en la replicación del RNA.
Parece que la glicoproteína M de FIPV es importante para la
maduración viral de FIP y para la determinación del sitio en el que
se ensamblan las partículas del virus (Spann et al.,
1988).
Debido a la activación dependiente de anticuerpos
de FIP (ADE) en gatos, los intentos para producir una vacuna o una
composición inmunológica seguras y eficaces frente a FIPV, han sido
altamente desafortunados. Las vacunas de FIPV inactivado y las
vacunas de coronavirus vivos heterólogos no produjeron ninguna
protección frente a la infección por FIPV y la vacunación produjo
normalmente una sensibilización incrementada a la enfermedad. Una
vacuna de virus vivo modificado, Primucell, es la primera vacuna
para FIPV, y la única comercializada. Primucell es una cepa de FIPV
sensible a la temperatura que se puede replicar a las temperaturas
más frías de la cavidad nasal, pero no a temperaturas corporales
sistémicas (Gerber et al., 1990). Por tanto, la vacuna
Primucell administrada intranasalmente se cree que produce una
inmunidad localizada frente a FIPV. Sin embargo, quedan cuestiones
importantes referentes a la eficacia y potencial de activación de
esta vacuna (Olsen y Scott, 1991).
El virus Vaccinia se ha usado como vector
para generar virus recombinantes que expresen genes estructurales
de FIPV. Se demostró que un recombinante que expresaba el gen M de
FIP, incrementaba el tiempo de supervivencia de gatos, tras
estimulación con FIPV (Vennema et al., 1990).
Vennema et al., (1991) se refiere a la
estructura primaria de los genes de las proteínas de la membrana y
de la nucleocápsida del virus de la peritonitis infecciosa felina,
y a ciertos de sus virus recombinantes de Vaccinia
introducidos en gatitos. El gen de la matriz de FIPV de Vennema
et al., se clonó a partir de una cepa patógena
(79-1146) y su secuencia parece ser idéntica al gen
de la matriz (del que se habla en esta memoria). El recombinante de
Vennema et al., vFM, contiene la región codificadora de la
matriz acoplada al promotor de Vaccinia de 7,5 K
temprano/tardío insertado en el locus de la
timidina-quinasa (tk). Hay que destacar que el
promotor no estaba unido exactamente al codón de iniciación ATG de
la matriz, sino más bien a una posición 48 pb aguas arriba desde el
ATC. Asimismo, no se eliminó una señal de terminación
transcripcional temprana T5NT de Vaccinia (Yuen et
al., 1987), localizada en la región codificadora del gen de la
matriz.
Adicionalmente, la cepa de Vaccinia en
Vennema et al. es la cepa WR (Vennema et al., en
página 328, columna izquierda, 2 primeras líneas; véanse también
los plásmidos donadores y virus testigos, según se mencionan en la
misma página, en la sección "Construction of Recombinant
Vaccinia Viruses expressing the FIPV M and N proteins",
que empieza en la parte central de la columna izquierda, que
indican claramente a través de citas de literatura que se usa la
cepa WR). La elección de cepa es importante porque la cepa WR es un
virus de laboratorio -no una cepa vacunal- y las características de
la cepa WR no la hacen un vector actualmente aceptable para un
recombinante que pueda ponerse en contacto con humanos y mucho
menos un recombinante en una composición como una vacuna o una
composición antigénica o inmunológica direccionada a felinos, como
gatitos u otros animales en contacto con humanos, especialmente
niños pequeños o individuos inmunosuprimidos, debido a las
recientes preocupaciones de transmisión por contacto (tales
"otros animales" podrían ser cultivos celulares de laboratorio
o animales para la expresión antigénica o para producción de
anticuerpos para producir kits, ensayos o pruebas).
Por tanto, en los artículos de Vennema et
al., no describen o sugieren los recombinantes, composiciones y
métodos de la presente invención.
Más en particular, los recombinantes de la
presente invención emplean preferiblemente NYVAC o vectores (NYVAC y
ALVAC son vectores altamente atenuados que tienen un nivel de
confinamiento BSL1).
Además, en construcciones de la presente
invención, preferiblemente la región codificadora está acoplada al
promotor en un acoplamiento preciso al codón ATG, sin que medie
ninguna secuencia. (Cualquier secuencia T5NT se puede inactivar
mediante una sustitución de base que no cambia la secuencia
aminoácida pero evitará una terminación transcripcional temprana en
un vector de poxvirus). Además, pueden estar presentes copias
múltiples, p.ej. dos, de la región codificadora directamente
acoplada al promotor, en cada genoma viral recombinante de la
presente invención.
El estudio de eficacia de Venema et al.
usó gatitos SPF (13-14 semanas de edad) que se
vacunaron subcutáneamente en el día 0 y en el día 21 con 1 x
10^{8} y 5 x 10^{8} ufp, respectivamente. En el día 35, los
gatos se estimularon oralmente con la cepa 79-1146
de FIP.
El protocolo en la presente invención fue
similar, siendo la principal diferencia una dosis de vacunación
inferior (1 x 10^{7}). Los resultados de protección de Vennema se
basaban en la mortalidad, sobreviviendo 3 de cada 8 gatos vacunados
con vFM (37,5%). Vennema et al., estimaron su estimulación
suficiente, ya que 7 de cada 8 gatos no vacunados sucumbieron a la
exposición a la estimulación y murieron. Tras la necropsia,
todos los gatos estimulados, en Vennema et al.,
incluyendo los tres gatos vacunados con vFM supervivientes,
tenían signos patológicos de infección por FIP, incluyendo efusiones
peritoneales y lesiones granulomatosas sobre las vísceras.
Por contraste, los experimentos realizados en la
presente invención fueron más restrictivos. En la presente
invención, los solicitantes contabilizaron la protección como
supervivientes y exentos de patología FIP tras la necropsia.
Usando este criterio, los solicitantes obtuvieron 3 gatos protegidos
(60%) de cada 5 gatos vacunados con vCP262, y 0% de gatos
protegidos de los gatos sin vacunar. Si los resultados de Vennema
et al. se contabilizaran usando los criterios de los
solicitantes, Vennema no habría obtenido ninguna protección; y, por
tanto, ningún recombinante adecuado para uso vacunal. Además,
Vennema et al. observaron fiebre y pérdida de peso en todos
los gatos estimulados. En los experimentos de los solicitantes,
(véase experimento 3 en particular), se observó incluso ninguna
pérdida de peso y una respuesta febril inferior tras la
estimulación.
Por tanto, los recombinantes de la presente
invención emplean un vector aceptable para cualquier uso y un nivel
de protección sorprendentemente superior a una dosis inferior que
el recombinante de Vaccinia de Vennema et al.
Estudios recientes usando anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el gen S (Olsen et al., 1992)
han mostrado también que los mABs que neutralizan el virus pueden
producir también ADE. No se observa ninguna activación con los mABs
frente a las proteínas de la matriz o la nucleocápsida.
Por tanto, previamente a la presente invención,
se necesitaban recombinantes de poxvirus-FIPV,
especialmente recombinantes tales que usaran un vector aceptable y
recombinantes tales que presentaran expresión a dosis bajas, las
cuales producen, en efecto, protección; y se necesitaban
composiciones que contuvieran tales recombinantes, así como métodos
para producirlos y usarlos. Y, además, sería especialmente
sorprendente e inesperado si este recombinante
poxvirus-FIPV se modificase para atenuarlo, p.ej, un
recombinante de virus Vaccinia-FIPV atenuado o un
recombinante avipox-FIPV atenuado, como un
recombinante NYVAC-FIPV o
ALVAC-FIPV. Debido, por ejemplo, a la atenuación y a
la replicación productiva reducida o inexistente del poxvirus en el
hospedador, un experto en la técnica no habría esperado y se habría
sorprendido por la utilidad del recombinante atenuado,
especialmente para felinos y otros hospedadores, y más
especialmente en una composición tal que proporciona una respuesta
que incluye la protección en felinos.
Los vectores de poxvirus atenuados serían también
especialmente ventajosos para composiciones antigénicas o vacunales,
particularmente a la vista de que los vectores atenuados
proporcionan propiedades patogénicas reducidas, escasas o
inexistentes con respecto al hospedador previsto o a hospedadores no
previstos, posiblemente accidentales, como aquellos que trabajan
con el vector, formulando o administrando el vector o antígeno, o
que puedan entrar en contacto de otra forma con él. Es decir, los
vectores de poxvirus atenuados proporcionan propiedades patogénicas
reducidas, escasas o inexistentes frente a hospedadores previstos,
como gatos, gatitos y similares, y frente a hospedadores no
previstos, posiblemente accidentales, como seres humanos implicados
en la formulación del vector en una composición para administración
o en la administración de la composición (p.ej. veterinarios,
técnicos, u otros trabajadores), o que pueden entrar en contacto de
otra forma con el vector (p.ej. propietarios de mascotas).
Se puede apreciar por tanto, que el suministro de
un poxvirus recombinante de FIPV, y de sus composiciones y
productos, particularmente recombinantes de FIPV basados en NYVAC o
ALVAC y sus productos y composiciones, sería un avance altamente
deseable sobre el estado actual de la tecnología.
Por tanto, un objeto de esta invención es
proporcionar virus recombinantes modificados, los cuales tienen una
seguridad incrementada, y proporcionar un método para obtener tales
virus recombinantes.
Objetos adicionales de esta invención incluyen:
proporcionar un recombinante poxvirus-FIPV,
composiciones que contienen dicho recombinante, antígeno o
antígenos procedentes del recombinante o de la composición, métodos
para usar las composiciones o el recombinante, p.ej., usos in
vivo e in vitro para expresión mediante administración o
infección. Preferiblemente, la composición de recombinante
poxvirus-FIPV es una composición antigénica, vacuna
o composición inmunológica (es decir, una composición que contiene
un recombinante que expresa antígeno, o el producto procedente de
expresión del antígeno).
En un aspecto, la presente invención se refiere a
un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticas
codificadas por el virus inactivadas, de forma que el virus
recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad
incrementada. Las funciones pueden ser no esenciales, o asociadas
con la virulencia. El virus es ventajosamente un poxvirus,
particularmente un virus Vaccinia o un virus de la viruela
aviar, como el virus de la viruela de las aves de corral y el virus
de la viruela de los canarios. El virus recombinante modificado
puede incluir, dentro de una región no esencial del genoma del
virus, una secuencia de DNA heteróloga que codifica un antígeno o
epítope derivado de FIPV.
En otro aspecto, la presente invención se refiere
a una composición antigénica, inmunológica o de una vacuna o a una
composición terapéutica para inducir una respuesta antigénica o
inmunológica o protectora en un animal hospedador inoculado con la
composición, incluyendo dicha composición un vehículo y un virus
recombinante modificado que tiene funciones genéticas codificadas
por virus, no esenciales, inactivadas, de forma que el virus
recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad
incrementada. El virus usado en la composición según la presente
invención es ventajosamente un poxvirus, particularmente un virus
Vaccinia o un virus de la viruela aviar, como virus de la
viruela de las aves de corral o virus de la viruela de los
canarios. El virus recombinante modificado puede incluir, en una
región no esencial del genoma viral, una secuencia de DNA heterólogo
que codifica una proteína antigénica, p.ej. derivada de FIPV. La
composición puede contener un poxvirus recombinante que contiene la
codificación para y expresa el antígeno o antígenos de FIPV o el
antígeno o antígenos aislados.
En otro aspecto adicional, la presente invención
se refiere a métodos que emplean el recombinante o composición
mencionados anteriormente; por ejemplo, para obtener una respuesta
in vivo al antígeno o antígenos de FIPV. El método puede
comprender administrar el recombinante o composición, bien a
felinos, o a otros hospedadores, p.ej., animales de laboratorio como
roedores, p.ej. ratas, ratones, jerbos o similares, para producción
de anticuerpos para kits, ensayos y similares.
En otro aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un virus recombinante modificado y a composiciones que
lo contienen. El virus puede tener funciones genéticas codificadas
por el virus, no esenciales, inactivadas, de forma que el virus
tiene virulencia atenuada, y el virus recombinante modificado
contiene además DNA de una fuente heteróloga en una región no
esencial del genoma del virus. El DNA puede codificar para un
antígeno o antígenos de FIPV. En particular, las funciones
genéticas se inactivan mediante deleción de un marco de lectura
abierto que codifica para un factor de virulencia, o utilizando
virus restringidos a un hospedador, existentes en la naturaleza. El
virus usado según la presente invención es ventajosamente un
poxvirus, particularmente un virus Vaccinia o un virus de la
viruela aviar, como el virus de la viruela de las aves de corral o
el virus de la viruela de los canarios. Ventajosamente, el marco de
lectura abierto se selecciona del grupo formado por J2R, B13R +
B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, e I4L (mediante la terminología
descrita en Goebel et al., 1990a, b); y sus combinaciones. A
este respecto, el marco de lectura abierto comprende regiones
genómicas que comprenden un gen de
timidina-quinasa, una región hemorrágica, una región
de cuerpos de inclusión de tipo A, un gen de hemaglutinina, un gen
de ámbito de hospedador o una
ribonucleótido-reductasa de la subunidad grande; o
sus combinaciones. Una cepa Copenhagen modificada adecuada del
virus Vaccinia se identifica como NYVAC (Tartaglia et
al., 1992), o virus Vaccinia del cual se han eliminado
por deleción J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L-K11 e
I4L o un gen de timidina-quinasa, una región
hemorrágica, una región de un cuerpo de inclusión de tipo A, un gen
de hemaglutinina, una región de ámbito de hospedador, y una
ribonucleótido-reductasa de subunidad grande
(Véase también patente de EE.UU. Nº 5.364.773).
Alternativamente, un poxvirus adecuado es ALVAC o un virus de la
viruela de los canarios (cepa vacunal de Rentschler) que se ha
atenuado, por ejemplo, a través de más de 200 pases en serie sobre
fibroblastos de embrión de pollo, una siembra patrón del mismo se
sometió a cuatro purificaciones de placa sucesivas en agar, de las
cuales se amplificó un clon de placa a través de cinco pases
adicionales.
La invención, en otro aspecto adicional, se
refiere al producto de expresión del recombinante
poxvirus-FIPV de la invención y a sus usos, como
para formar composiciones antigénicas, inmunológicas o vacunales,
para administración a un hospedador, p.ej., animales, como felinos,
o para administración para protección o respuesta o para
tratamiento, prevención, diagnóstico o ensayo, y a métodos que
emplean dichas tales composiciones. El antígeno o antígenos de FIPV,
o el DNA que codifica dicho antígeno o antígenos de FIPV, puede
codificar M, N y las tres versiones de S; S1, S2, S3 o sus
combinaciones, p.ej., M+N.
La presente invención (recombinantes,
composiciones y métodos y usos) se basa en los descubrimientos de
que los recombinantes NYVAC y ALVAC, particularmente los
recombinantes NYVAC- y ALVAC-FIPV, sorprendentemente
presentan expresión a pesar de la atenuación, y una expresión que
puede conferir una respuesta verdaderamente protectora en un
hospedador susceptible.
Esta y otras realizaciones de la invención se
describen mediante la siguiente descripción detallada, o son obvias
a partir de la misma y se encuentran incluidas.
La siguiente descripción detallada, proporcionada
a modo de ejemplo, pero no destinada a limitar la invención
solamente a las realizaciones especificadas descritas, se puede
entender mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los
que:
Figura 1 muestra la secuencia de DNA del marco de
lectura abierto del gen de la matriz FIPV (cepa
79-1146);
Figura 2 muestra la secuencia de DNA del plásmido
donador del gen de la matriz de FIPV (la región codificadora del
gen de la matriz modificado se inicia en 2408 y termina en 1620; el
promotor de 42K entomopox comienza en 2474; el brazo izquierdo de
C5 va de 1 a 1549 y el brazo derecho de C5 va de 2580 a 2989);
Figura 3 muestra la secuencia de DNA del marco de
lectura abierto del gen de la nucleocápsida de FIPV;
Figura 4 muestra la secuencia de DNA del plásmido
donador del gen de la nucleocápsida de FIPV (la región codificadora
del gen de la nucleocápsida empieza en 2101 y termina en 968; el
promotor I3L de Vaccinia empieza en 2160; el brazo izquierdo
de C3 va de 1 a 939 y el brazo derecho de C3 va de 2285 a
4857);
Figura 5 muestra la secuencia de DNA del marco de
lectura abierto del gen de la proyección superficial de FIPV (cepa
79-1146);
Figura 6 muestra la secuencia de DNA del plásmido
donador del gen de la proyección superficial de FIPV (la región
codificadora del gen de la proyección superficial modificado se
inicia en 591 y termina en 4976; el promotor H6 de Vaccinia
empieza en 471; el brazo izquierdo C6 va de 1 a 387 y el brazo
derecho de C6 va de 4983 a 6144);
Figura 7 muestra la secuencia de DNA del plásmido
donador de la secuencia señal negativa del gen de la proyección
superficial de FIPV (la región codificadora del gen de la proyección
superficial modificado se inicia en 591 y termina en 4922; el
promotor H6 de Vaccinia empieza en 471; el brazo izquierdo
C6 va de 1 a 387 y el brazo derecho de C6 va de 4929 a 6090);
Figura 8 muestra la secuencia de DNA del plásmido
donador del fragmento C-terminal del gen de la
proyección superficial de FIPV (la región codificadora del gen de la
proyección superficial modificado se inicia en 591 y termina en
2369; el promotor H6 de Vaccinia empieza en 471; el brazo
izquierdo C6 va de 1 a 387 y el brazo derecho de C6 va de 2386 a
3537);
Figura 9 muestra la secuencia de DNA de un
fragmento de 7351 pb de DNA del virus de la viruela de los
canarios, que contiene el marco de lectura abierto de C3 (el ORF de
C3 empieza en la posición 1458 y termina en la posición 2897);
Figura 10 muestra la secuencia de DNA de un
fragmento de 3208 pb de DNA del virus de la virus de la viruela de
los canarios, que contiene el marco de lectura abierto de C5 (el ORF
de C5 empieza en la posición 1537 y termina en la posición 1857);
y,
Figura 11 muestra la secuencia de DNA de un
fragmento de 3706 pb de DNA del virus de la viruela de los
canarios, que contiene el marco de lectura abierto de C6 (el ORF de
C6 empieza en la posición 377 y termina en la posición 2254).
Para desarrollar una nueva cepa vacunal de
Vaccinia, NYVAC (vP866), la cepa vacunal de Copenhagen del
virus Vaccinia se modificó mediante la deleción de seis
regiones no esenciales del genoma, que codificaban factores de
virulencia conocidos o potenciales. Las deleciones secuenciales se
detallan más adelante (véase patente de EE.UU. Nº 5.364.773). Todas
las denominaciones de los fragmentos de restricción de
Vaccinia, los marcos de lectura abiertos y las posiciones de
nucleótidos, se basan en la terminología descrita por Goebel et
al., 1990a, b.
\newpage
Los loci delecionados se transformaron también
mediante ingeniería genética como loci receptores para la inserción
de genes extraños.
Las regiones delecionadas en NYVAC se enumeran
debajo. Asimismo, se enumeran las abreviaturas y las denominaciones
de los marcos de lectura abiertos para las regiones delecionadas
(Goebel et al., 1990a, b) y la denominación del recombinante
de Vaccinia (vP) que contiene todas las deleciones a través
de la deleción especificada:
- (1)
- gen de timidina-quinasa (TK; J2R) vP410;
- (2)
- región hemorrágica (u; B13R + B14R) vP553;
- (3)
- una región de cuerpo de inclusión de tipo A (ATI; A26L) vP618;
- (4)
- gen de hemaglutinina (HA; A56R) vP723;
- (5)
- región del ámbito del hospedador (C7L-K1L) vP804; y
- (6)
- ribonucleótido-reductasa de la subunidad grande (I4L) vP866 (NYVAC).
NYVAC.
NYVAC es una cepa de virus Vaccinia
modificada mediante ingeniería genética, que se generó mediante la
deleción específica de dieciocho marcos de lectura abiertos que
codifican productos génicos asociados con la virulencia y el ámbito
de hospedador. NYVAC se atenúa mucho mediante varios criterios, que
incluyen i) virulencia reducida tras inoculación cerebral en ratones
recién nacidos, ii) inocuidad en ratones con inmunidad comprometida
genética (nu*/nu*) o químicamente (ciclofosfamida),
iii) incapacidad para producir infección diseminada en ratones con
inmunidad comprometida, iv) carencia de induración y ulceración
significativa en piel de conejo, v) eliminación rápida desde el
sitio de inoculación, y vi) competencia de replicación muy reducida
sobre varias líneas celulares en cultivo tisular, incluyendo las de
origen humano. No obstante, los vectores basados en NYVAC inducen
excelentes respuestas frente a inmunógenos extrínsecos y
proporcionan inmunidad protectora.
TROVAC se refiere a un virus de la viruela de las
aves de corral atenuado, que era un aislado clonado en placa,
derivado de la cepa vacunal FP-1 de un virus de la
viruela de las aves de corral que está aprobada para la vacunación
de pollos. ALVAC es un vector basado en virus de la viruela de los
canarios atenuado, que era un derivado clonado en placa de la
vacuna aprobada de la viruela de los canarios, Kanapox (Tartaglia
et al., 1992). ALVAC tiene algunas propiedades generales que
son las mismas que algunas propiedades de Kanapox. Se ha demostrado
también que los virus recombinantes basados en ALVAC que expresan
inmunógenos extrínsecos, son eficaces como vectores vacunales
(Tartaglia et al., 1993a, b). Este vector del virus de la
viruela aviar está restringido a especies aviares para replicación
productiva. Sobre cultivos celulares humanos, la replicación del
virus de la viruela de los canarios se interrumpe tempranamente en
el ciclo de replicación viral, previamente a la síntesis de DNA
viral. No obstante, cuando se transforma mediante ingeniería
genética para expresar inmunógenos extrínsecos, se observa
auténtica expresión y tratamiento in vitro en células de
mamífero y la inoculación en numerosas especies de mamífero induce
respuestas inmunológicas de anticuerpos y celulares frente al
inmunógeno extrínseco, y proporciona protección frente a la
estimulación con el patógeno afín (Taylor et al., 1992;
Taylor et al., 1991b). Experimentos clínicos recientes de
fase I, tanto en Europa como en Estados Unidos, de un recombinante
de glicoproteína de la rabia/virus de la viruela de los canarios
(ALVAC-RG), demostraron que la vacuna experimental
se toleraba bien, e inducía niveles protectores de títulos de
anticuerpos neutralizantes del virus de la rabia (Cadoz et
al., 1992; Fries et al., 1992). Adicionalmente, células
mononucleares de sangre periférica (PBMCs) derivadas de vacunados
ALVAC-RG, demostraban niveles significativos de
proliferación de linfocitos, cuando se estimulaban con FIPV
purificado (Fries et al., 1992).
NIVAC, ALVAC y TROVAC se han reconocido también
como únicos entre todos los poxvirus, ya que el National Institute
of Health ("NIH") (servicio de salud pública de EE.UU.), el
Recombinant DNA Advisory Committee, que emite normas para el
confinamiento físico del material genético como virus y vectores,
es decir, normas para procedimientos de seguridad para el uso de
tales virus y vectores que están basados en la patogenicidad del
virus o vector particular, concedieron una reducción en el nivel de
confinamiento físico: de BSL2 a BSL1. Ningún otro poxvirus tiene el
nivel de confinamiento BSL1. Incluso la cepa Copenhagen del virus
Vaccinia -la vacuna de la viruela común- tiene un nivel de
confinamiento superior, es decir, BSL2. Consecuentemente, la técnica
ha reconocido que NYVAC, ALVAC y TROVAC tienen una patogenicidad
inferior a cualquier otro poxvirus.
Basándose claramente en los perfiles de
atenuación de los vectores de NYVAC, ALVAC y TROVAC y en su
capacidad demostrada para provocar tanto respuestas inmunológicas
humorales como celulares frente a inmunógenos extrínsecos
(Tartaglia et al., 1993a, b; Taylor et al., 1992;
Konishi et al., 1992), tales virus recombinantes ofrecen una
ventaja distintiva sobre los virus recombinantes basados en
Vaccinia descritos previamente.
El procedimiento de administración para el
recombinante poxvirus-FIPV o su producto de
expresión, las composiciones de la invención, como composiciones
inmunológicas, antigénicas, vacunales o terapéuticas, puede ser vía
una ruta parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea). Tal
administración permite una respuesta inmunológica sistémica, o
respuestas humorales o celulares.
Más generalmente, los recombinantes
poxvirus-FIPV, las composiciones inmunológicas,
antigénicas, vacunales poxvirus-FIPV o composiciones
terapéuticas de la invención, se pueden preparar según técnicas
estándar bien conocidas para los expertos en la técnica veterinaria
o farmacéutica. Tales composiciones se pueden administrar en dosis
y mediante técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica
veterinaria o farmacéutica, teniendo en cuenta factores tales como
la edad, sexo, peso, especie y estado del paciente particular, y la
vía de administración. Las composiciones se pueden administrar
solas o se pueden administrar conjunta o secuencialmente con
composiciones, p.ej., con "otras" composiciones inmunológicas,
antigénicas, vacunales o terapéuticas, proporcionando así
composiciones multivalentes o "cóctel" o de combinación, y
métodos para emplearlas. De nuevo, los ingredientes y la manera
(secuencial o administración conjunta) de administración, así como
las dosis, se pueden determinar considerando factores tales como la
edad, sexo, peso, especie y estado del paciente particular y la vía
de administración. A este respecto, se hace referencia a la patente
de EE.UU. Nº 5.843.456, presentada el 7 de junio de 1995, y
referida a composiciones de la rabia, composiciones de combinación y
sus usos.
Ejemplos de composiciones de la invención
incluyen preparaciones líquidas para administración a través de
orificios, p.ej., oral, nasal, anal, vaginal, peroral,
intragástrica, etc., tales como suspensiones, jarabes o elixires; y
preparaciones para administración parenteral, subcutánea,
intradérmica, intramuscular o intravenosa (p.ej., administración
inyectable), como suspensiones o emulsiones estériles. En tales
composiciones, el poxvirus o los antígenos recombinantes pueden
estar mezclados con un vehículo, diluyente o excipiente adecuado,
como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o
similares. Las composiciones también pueden estar liofilizadas. Las
composiciones pueden contener sustancias auxiliares, como agentes
humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH,
adyuvantes, aditivos mejoradores de gelificación o viscosidad,
conservantes, agentes saborizantes, colorantes y similares,
dependiendo de la ruta de administración y de la preparación
deseada. Se pueden consultar textos estándar, como "REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCE", edición 17, 1985, para obtener
preparaciones adecuadas, sin experimentación excesiva. Las dosis
adecuadas se pueden basar también en los ejemplos de más
adelante.
Además, los productos de expresión de los
poxvirus recombinantes de la invención y las composiciones que los
comprenden, se pueden usar directamente para estimular una
respuesta inmunológica en individuos o en animales. Por tanto, los
productos de expresión se pueden usar en composiciones de la
invención, en vez de, o además del poxvirus recombinante de la
invención, en las composiciones anteriormente mencionadas.
Adicionalmente, el poxvirus recombinante de la
invención, sus productos de expresión y las composiciones de la
invención estimulan una respuesta inmunológica o de anticuerpos en
animales y, por tanto, esos productos son antígenos. A partir de
esos anticuerpos o antígenos, mediante técnicas bien conocidas en
la técnica, se pueden preparar anticuerpos monoclonales, y esos
anticuerpos monoclonales o los antígenos se pueden emplear en
ensayos de unión a anticuerpo, kits diagnósticos o ensayos bien
conocidos, para determinar la presencia o ausencia de un antígeno o
antígenos de FIPV particulares; y, por tanto, la presencia o
ausencia del virus o del antígeno o antígenos, o para determinar
simplemente si se ha estimulado una respuesta inmunológica al virus
o al antígeno o antígenos. Esos anticuerpos monoclonales o los
antígenos se pueden emplear también en cromatografía de
inmunoadsorción para recuperar o aislar el antígeno o antígenos de
FIPV o los productos de expresión del poxvirus recombinante o las
composiciones de la invención.
Los métodos para producir anticuerpos
monoclonales y para usos de anticuerpos monoclonales y para usos y
métodos para antígenos de FIPV -los productos de expresión del
poxvirus y composiciones de la invención- se conocen bien por los
expertos medios en la técnica y se pueden usar en métodos de
diagnóstico, kits, pruebas o ensayos, así como para recuperar
materiales mediante cromatografía de inmunoadsorción o mediante
inmunoprecipitación.
Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas
producidas mediante células de hibridoma. Un anticuerpo monoclonal
reacciona con un único determinante antigénico y proporciona mayor
especificidad que un anticuerpo convencional, derivado del suero.
Adicionalmente, la selección de un gran número de anticuerpos
monoclonales permite seleccionar un anticuerpo individual con
especificidad, avidez e isotipo deseados. Las líneas celulares de
hibridoma proporcionan una fuente constante, barata de anticuerpos
químicamente idénticos y las preparaciones de tales anticuerpos se
pueden estandarizar fácilmente. Los métodos para producir
anticuerpos monoclonales son bien conocidos para los expertos
medios en la técnica, p.ej., Koprowski, H. et al., patente de
EE.UU. Nº 4.196.265, concedida el 1 de abril de 1989.
Los usos de anticuerpos monoclonales son
conocidos. Uno de tales usos son los métodos diagnósticos, p.ej.,
David, G. y Greene H. patente de EE.UU. Nº 4.376.110, concedida el
8 de marzo de 1983. Los anticuerpos monoclonales se han usado
también para recuperar materiales mediante cromatografía de
inmunoadsorción, p.ej., Milstein, C., 1980, Scientific American
243:66, 70.
Consecuentemente, el poxvirus recombinante y las
composiciones de la invención tienen varias utilidades indicadas
aquí. También existen otras utilidades para las realizaciones de la
invención. A partir de los siguientes ejemplos, proporcionados a
modo de ilustración, se comprenderá mejor la presente invención y
sus muchas ventajas.
Se construyeron, seleccionaron y cultivaron
plásmidos mediante procedimientos estándar (Maniatis et al.,
1982; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Se
obtuvieron endonucleasas de restricción de Bethesda Research
Laboratories, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; y
Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN. El fragmento de
Klenow de la polimerasa de E. coli se obtuvo de Boehringer
Mannheim Biochemicals. La exonucleasa BAL-31 y la
ligasa de DNA del fago T4 se obtuvieron de New England Biolabs. Los
reactivos se usaron como se especificaba por los distintos
fabricantes.
Se prepararon oligodesoxirribonucleótidos
sintéticos en un sintetizador de DNA de Biosearch 8750 o de Applied
Biosystems 380B, como se describió previamente (Perkus et
al., 1989). La secuenciación de DNA se realizó mediante el
método de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al.,
1977), usando Sequenase (Tabor et al., 1987) como se
describió previamente (Guo et al., 1989). La amplificación
de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
verificación de secuencia (Engelke et al., 1988) se realizó
usando cebadores oligonucleotídicos sintetizados al uso y un kit de
reactivos de amplificación de DNA de GeneAmp (Perkin Elmer Cetus,
Norwalk, CT) en un ciclador térmico de DNA de Perkin Elmer Cetus.
Las secuencias de DNA en exceso se eliminaron por deleción a partir
de los plásmidos mediante digestión con endonucleasa de
restricción, seguida de digestión limitada mediante exonucleasa
BAL-31 y mutagénesis (Mandecki, 1986), usando
oligonucleótidos sintéticos.
Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa
Copenhagen del virus Vaccinia se han descrito previamente
(Guo et al., 1989). La generación del virus recombinante
mediante recombinación, hibridación in situ de filtros de
nitrocelulosa y selección para actividad
\beta-galactosidasa, son como se describieron
previamente (Piccini et al., 1987).
Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa
Copenhagen del virus Vaccinia y NYVAC se han descrito
previamente (Guo et al., 1989; Tartaglia et al.,
1992). La generación del virus recombinante mediante recombinación,
hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y selección
para actividad \beta-galactosidasa, son como se
describieron previamente (Panicali et al., 1982; Perkus
et al., 1989).
NYVAC se prepara mediante referencia a la patente
de EE.UU. Nº 5.364.773 y a la solicitud de patente de EE.UU. Nº de
serie 105.483, admitida a trámite.
El virus parental de la viruela de los canarios
(cepa de Rentschler) es una cepa vacunal para canarios. La cepa
vacunal se obtuvo de un aislado del tipo silvestre y atenuado
mediante más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embrión de
pollo. Una siembra viral patrón se sometió a cuatro purificaciones
de placa sucesivas en agar y un clon de placa se amplificó a través
de cinco pases adicionales, tras lo cual se usó la cepa viral como
virus parental en ensayos in vitro de recombinación. El
aislado de virus de la viruela de los canarios purificado en placa
se designa ALVAC.
La cepa del virus de la viruela de las aves de
corral (FPV), denominada FP-1, se ha descrito
previamente (Taylor et al., 1988a). Es una cepa vacunal
atenuada, útil en la vacunación de pollos de días de edad. La cepa
viral parental Duvette se obtuvo en Francia como una costra cutánea
de virus de la viruela de aves de corral, de un pollo. El virus se
atenuó mediante aproximadamente 50 pases en serie en huevos de
pollo embrionados, seguidos por 25 pases sobre células de
fibroblasto de embrión de pollo. El virus se sometió a cuatro
purificaciones en placa sucesivas. Un aislado de placa se amplificó
nuevamente en fibroblastos de embrión de pollo (CEF) primarios y se
estableció una cepa de virus, denominada TROVAC.
Los vectores virales NYVAC, ALVAC y TROVAC y sus
derivados se propagaron como se describió previamente (Piccini et
al., 1987; Taylor et al., 1988a, b). Las células Vero y
los fibroblastos de embrión de pollo (CEF) se propagaron como se
describió previamente (Taylor et al., 1988a, b).
(vCP262).
La cepa 79-1146 de FIPV se obtuvo
del Dr. F. Scott (Cornell University, Ithaca, NY). El RNA total se
aisló de células CRFK infectadas por FIPV, usando el procedimiento
del isotiocianato de cuanidium-cloruro de cesio, de
Chirgwin et al., (1979). El cDNA de la primera hebra se
sintetizó usando transcriptasa inversa AMV y cebadores
oligonucleotídicos aleatorios (6-meros), mediante
el procedimiento de Watson y Jackson (1985), produciendo cDNA
monocatenario complementario al mRNA de hebra positiva del FIPV.
El gen de la matriz (M) se amplificó mediante PCR
a partir del cDNA de la primera hebra, usando los cebadores
oligonucleotídicos RG739 (SEQ ID NO : 1)
(5'-TAAGAGCTCATGAAGTACATTTTGCT-3') y
RG740 (SEQ ID NO : 2)
(5'-ATTGGTACCGTTTAGTTACACCATATG-3').
Estos cebadores se derivaron de la secuencia de Genbank COFIPVMN (nº
de acceso X56496) (Vennema et al., 1991). Este fragmento de
PCR de 800 pb se digirió con Asp718/SacI, se purificó en gel, y se
unió en pBluescript SK+, digerido con Asp718/SacI, para producir
pBSFIPM. El ORF del gen M se secuenció y se presenta en la Figura 1
(SEQ ID NO : 3).
pBSFIPM se transformó en células GM48 (dam-), y
se aisló el DNA del plásmido, que se desmetiló
(pBSFIPM-desmet). Se amplificó un fragmento de PCR
de 330 pb a partir de pBSFIPM, usando los oligonucleótidos RG751
(SEQ ID NO: 4)
(5'-TCTGAGCTCTTTATTGGGAAGAATATGATAATATTTTGGGATTTCAAAATTGAAAATATATAAT
TACAATATAAAATGAAGTACATTTTGCT-3') y RG752 (SEQ ID NO: 5) (5'-CACATGATCAGCATTTTAATGC
CATAAACGAGCCAGCTAAATTGTGGTCTGCCATATTG TAACACTGTTATAAATACAATC-3') y se digirió con SacI/BclI. Este fragmento se purificó en gel, se ligó en pBSFIPM (desmet), y se digirió con BclI para producir pFIPM42K. Se generó un fragmento de 85 pb como un cebador-dímero de PCR, a partir de los oligonucleótidos RG749 (SEQ ID NO: 6) (5'-TCCGAGCTCTAATTAATT-AACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3') y RG750 (SEQ ID NO: 7) (5'-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGA
GAACG-3'). Este fragmento se digirió con SacI y se introdujo en pFIPM42K digerido con SacI para producir pFIPM42KVQ. Esta construcción del plásmido contiene una casete de expresión formada por el ORF completo de la matriz de FIPV (con una señal de parada transcripcional temprana T5NT, mutada), acoplada al promotor de 42K de entomopox (SEQ ID NO: 8) (5' TTTATTGGGAAGAATATGATAATATTTTGGG-ATTTCAAAATTGAAAATA
TATAATTACAATATAAA-3'). La secuencia T5NT está modificada de forma que ya no funciona como una señal de parada de transcripción temprana y no se cambia ningún aminoácido. Esta casete se escindió digiriendo pFIPM42KVQ con Asp718/HindIII y se aisló en forma de un fragmento de 950 pb. Los extremos de este fragmento se hicieron romos usando la polimerasa de Klenow y se introdujeron en el locus de inserción ALVAC C5 del plásmido de inserción pNC5LSP-5, digerido con SmaI. El plásmido donador resultante, pC5FIPM42K, se confirmó mediante análisis de secuencia del DNA. Éste está formado por el promotor de 42K de entomopox, acoplado al ORF de la matriz de FIPV en el ATG, flanqueado por los brazos izquierdo y derecho del locus de inserción C5 de ALVAC (Figura 2 (SEQ ID NO: 9)).
TACAATATAAAATGAAGTACATTTTGCT-3') y RG752 (SEQ ID NO: 5) (5'-CACATGATCAGCATTTTAATGC
CATAAACGAGCCAGCTAAATTGTGGTCTGCCATATTG TAACACTGTTATAAATACAATC-3') y se digirió con SacI/BclI. Este fragmento se purificó en gel, se ligó en pBSFIPM (desmet), y se digirió con BclI para producir pFIPM42K. Se generó un fragmento de 85 pb como un cebador-dímero de PCR, a partir de los oligonucleótidos RG749 (SEQ ID NO: 6) (5'-TCCGAGCTCTAATTAATT-AACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3') y RG750 (SEQ ID NO: 7) (5'-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGA
GAACG-3'). Este fragmento se digirió con SacI y se introdujo en pFIPM42K digerido con SacI para producir pFIPM42KVQ. Esta construcción del plásmido contiene una casete de expresión formada por el ORF completo de la matriz de FIPV (con una señal de parada transcripcional temprana T5NT, mutada), acoplada al promotor de 42K de entomopox (SEQ ID NO: 8) (5' TTTATTGGGAAGAATATGATAATATTTTGGG-ATTTCAAAATTGAAAATA
TATAATTACAATATAAA-3'). La secuencia T5NT está modificada de forma que ya no funciona como una señal de parada de transcripción temprana y no se cambia ningún aminoácido. Esta casete se escindió digiriendo pFIPM42KVQ con Asp718/HindIII y se aisló en forma de un fragmento de 950 pb. Los extremos de este fragmento se hicieron romos usando la polimerasa de Klenow y se introdujeron en el locus de inserción ALVAC C5 del plásmido de inserción pNC5LSP-5, digerido con SmaI. El plásmido donador resultante, pC5FIPM42K, se confirmó mediante análisis de secuencia del DNA. Éste está formado por el promotor de 42K de entomopox, acoplado al ORF de la matriz de FIPV en el ATG, flanqueado por los brazos izquierdo y derecho del locus de inserción C5 de ALVAC (Figura 2 (SEQ ID NO: 9)).
Este plásmido donador, pC5FIPM42K, se usó en
recombinación in vivo (Piccini et al., 1987) con el
vector del virus ALVAC, para generar el virus recombinante
vCP262.
El análisis de inmunoprecipitación de un lisado
de células Vero marcado radiactivamente, infectadas con vCP262,
usando un anticuerpo monoclonal específico de la matriz de FIP,
denominado 15A9.9 (Olsen et al., 1992), mostraba la
expresión de una banda polipeptídica de 30 kDa. Esto era consecuente
con el tamaño esperado del producto del gen M. Además, la banda
migraba conjuntamente con una banda inmunoprecipitada a partir de
células infectadas con FIPV. El análisis de separación de células
activadas por fluorescencia (FACS), usando el mismo anticuerpo
monoclonal, mostraba que esta proteína expresada de vCP262 se
localizaba en el citoplasma de la célula infectada.
(vCP261A).
El gen de la nucleocápsida de FIPV (N) se
amplificó mediante PCR usando el cDNA de la primera hebra (descrito
en 1, más arriba), como molde y los cebadores oligonucleotídicos
RG741 (SEQ ID NO : 10)
(5'-TAAGAGCTCATG-GCCACACAGGGACAA-3')
y RG742 (SEQ ID NO : 11)
(5'-TATGGTACCTTA-GTTCGTAACCTCATC-3').
Estos cebadores se derivaron de la secuencia de Genbank COFIPVMN
(Nº de acceso X56496) (Vennema et al., 1991). El fragmento
de 1150 pb resultante se digirió con Asp718/SacI y se ligó en
pBluescript SK+, digerido con Asp718/SacI, produciendo pBSFIPN. El
ORF del gen N se secuenció y se presenta en la Figura 3 (SEQ ID NO:
12).
El promotor I3L de Vaccinia (SEQ ID NO:
13)
(5'-TGAGATAAAGTGAAAATATATATCATTATATTACAAAG
TACAATTATTTAGGTTTAATC-3') (Schmitt y Stunnenberg, 1988) se acopló al ATG del ORF N, de la siguiente forma: Un fragmento de 370 pb se amplificó mediante PCR, usando pBSFIPN como molde y los cebadores oligonucleotídicos RG747 (SEQ ID NO: 14) (5'-CATCAGCATGAGGTCCTGTACC-3') y RG748 (SEQ ID NO: 15) (5'-TAA
GAGCTCTGAGATAAAGTGAAAATATATA-TCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGCCA
CACAGGGACAA-3'). Este fragmento se digirió con SacI/PPuMI y se ligó en pBSFIPN digerido con SacI/PPuMI, produciendo pFIPNI3L. Se generó un fragmento de 85 pb como un cebador-dímero de PCR a partir de los oligonucleótidos RG749 (SEQ ID NO: 6) (5'-TCCGAGCTCTAATTAATTAACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3') y RG750 (SEQ ID NO:7) (5'-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGA
GAACG-3'). Este fragmento se digirió con SacI y se ligó en pFIPNI3L digerido con SacI, para producir pFIPNI3LVQ. La casete de expresión del gen N (N bajo el promotor I3L) se escindió en forma de un fragmento de 1300 pb, mediante digestión de pFIPNI3LVQ con Asp718/HindIII. Los extremos de este fragmento se hicieron romos con la polimerasa de Klenow y se ligaron en el plásmido de inserción C3, pSPCP3LSA (véase más adelante), digerido con SmaI. El plásmido donador resultante, pC3FIPNI3L, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA. Dicho plásmido está formado por el promotor I3L de Vaccinia, acoplado al ORF del gen N de FIPV, flanqueado por los brazos izquierdo y derecho del locus de inserción C3 de ALVAC (Figura 4 (SEQ ID NO: 16)).
TACAATTATTTAGGTTTAATC-3') (Schmitt y Stunnenberg, 1988) se acopló al ATG del ORF N, de la siguiente forma: Un fragmento de 370 pb se amplificó mediante PCR, usando pBSFIPN como molde y los cebadores oligonucleotídicos RG747 (SEQ ID NO: 14) (5'-CATCAGCATGAGGTCCTGTACC-3') y RG748 (SEQ ID NO: 15) (5'-TAA
GAGCTCTGAGATAAAGTGAAAATATATA-TCATTATATTACAAAGTACAATTATTTAGGTTTAATCATGGCCA
CACAGGGACAA-3'). Este fragmento se digirió con SacI/PPuMI y se ligó en pBSFIPN digerido con SacI/PPuMI, produciendo pFIPNI3L. Se generó un fragmento de 85 pb como un cebador-dímero de PCR a partir de los oligonucleótidos RG749 (SEQ ID NO: 6) (5'-TCCGAGCTCTAATTAATTAACGAGCAGATAGTCTCGTTCTCGCCCTGCCTG-3') y RG750 (SEQ ID NO:7) (5'-TACGAGCTCAAGCTTCCCGGGTTAATTAATTAGTCATCAGGCAGGGCGA
GAACG-3'). Este fragmento se digirió con SacI y se ligó en pFIPNI3L digerido con SacI, para producir pFIPNI3LVQ. La casete de expresión del gen N (N bajo el promotor I3L) se escindió en forma de un fragmento de 1300 pb, mediante digestión de pFIPNI3LVQ con Asp718/HindIII. Los extremos de este fragmento se hicieron romos con la polimerasa de Klenow y se ligaron en el plásmido de inserción C3, pSPCP3LSA (véase más adelante), digerido con SmaI. El plásmido donador resultante, pC3FIPNI3L, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA. Dicho plásmido está formado por el promotor I3L de Vaccinia, acoplado al ORF del gen N de FIPV, flanqueado por los brazos izquierdo y derecho del locus de inserción C3 de ALVAC (Figura 4 (SEQ ID NO: 16)).
Este plásmido donador, pC3FIPNI3L, se usó en
recombinación in vivo (Piccini et al., 1987) con el
vector del virus ALVAC, para generar el virus recombinante
vCP261A.
El análisis de inmunoprecipitación de un lisado
de células Vero marcado radiactivamente, infectadas con vCP261A,
usando un anticuerpo monoclonal específico de la nucleocápsida de
FIP, denominado 17B7.1 (Olsen et al., 1992), mostraba la
expresión de una banda polipeptídica de 45 kDa. Esto era
consecuente con el tamaño esperado del producto del gen N. Además,
la banda migraba conjuntamente con una banda inmunoprecipitada a
partir de células infectadas con FIPV. El análisis de separación de
células activadas por fluorescencia (FACS), usando el mismo
anticuerpo monoclonal, mostraba que esta proteína expresada de
vCP261A se localizaba en el citoplasma de la célula infectada.
(vCP282).
El plásmido pC5FIPM42K (Figura 2, SEQ ID NO : 9),
que contenía el ORF del gen de la matriz de FIPV acoplado al
promotor de 42K de entomopox, se usó en recombinación in vivo
(Piccini et al., 1987) con el recombinante
ALVAC-FIP-N (vCP261A) (descrito en
2, más arriba), para generar el recombinante doble vCP282. Este
recombinante contiene el ORF del gen M de FIPV (promotor de 42K),
insertado en el locus C5 y el ORF del gen N de FIPV (promotor I3L),
insertado en el locus C3.
El análisis de inmunoprecipitación a partir de un
lisado marcado radiactivamente de células Vero infectadas con
vCP282, usando un anticuerpo monoclonal específico de la matriz,
denominado 15A9.9 (Olsen et al., 1992), mostraba la
expresión de una banda polipeptídica de 30 kDa, mientras que usando
un anticuerpo monoclonal específico de la nucleocápsida, denominado
17B7.1, mostraba la expresión de una banda polipeptídica de 30 kDa,
mientras que, usando un anticuerpo monoclonal específico de la
nucleocápsida, mostraba la expresión de una banda polipeptídica de
45 kDa. Esto era consecuente con el tamaño esperado de los
productos de los genes M y N, respectivamente. Además, ambas bandas
migraban conjuntamente con bandas inmunoprecipitadas a partir de
células infectadas con FIPV. El análisis de separación de células
activadas por fluorescencia (FACS), usando el mismo anticuerpo
monoclonal, mostraba que estas proteínas expresadas de vCP282 se
localizaban en el citoplasma de la célula infectada.
(vCP281).
El gen de la proteína de la proyección
superficial (S) de FIPV se obtuvo mediante amplificación PCR a
partir del molde de cDNA de la primera hebra (descrito en 1, más
arriba), en tres secciones. Los cebadores de PCR se sintetizaron
basándose en la secuencia de Genbank COFIPE2 (Nº de acceso X06170)
(De Groot et al., 1987). El extremo 5' se amplificó mediante
PCR, usando los cebadores oligonucleotídicos JP53 (SEQ ID NO: 17)
(5'-CATCATGAGCTCAT
GATTGTGCTCGTAAC-3') y JP77 (SEQ ID NO: 18) (5'-AACAGCCGCTTGTGCGC-3'). El fragmento de 1630 pb aislado se digirió con SacI/HindIII y se ligó en pBluescript SK+ digerido con SacI/HindIII, para producir pBSFIP-SA, lo cual se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.
GATTGTGCTCGTAAC-3') y JP77 (SEQ ID NO: 18) (5'-AACAGCCGCTTGTGCGC-3'). El fragmento de 1630 pb aislado se digirió con SacI/HindIII y se ligó en pBluescript SK+ digerido con SacI/HindIII, para producir pBSFIP-SA, lo cual se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.
La sección intermedia de S se amplificó mediante
PCR, usando los cebadores oligonucleotídicos JP84 (SEQ ID NO: 19)
(5'-CTTGGTATGAAGCTTAG-3') y JP85
(SEQ ID NO: 20)
(5'-GGTGACTTAAAGCTTGC-3'). El
fragmento de 1715 pb aislado se digirió con HindIII y se ligó en
pBluescript SK+ digerido con HindIII. Se secuenciaron dos clones,
pKR5 y pKW13, y se encontró que tenían errores (basándose en la
secuencia de Genbank COFIPE2), pero en diferentes localizaciones.
Para corregir estos errores de PCR, se reemplazó una sección de
pKW13 por un subfragmento de pKR5, de la siguiente forma. PKR5 se
digirió con ClaI, sus extremos se hicieron romos con la polimerasa
de Klenow, se digirió con BstEII, se aisló un fragmento de 750 pb,
y se clonó en pKR13, digerido con SmaI/BstEII. El plásmido
resultante, pBSFIPS-MII, se confirmó mediante
análisis de secuencia de DNA.
La sección 3' de S se amplificó mediante PCR,
usando los cebadores oligonucleotídicos JP71 (SEQ ID NO: 21)
(5'-TAATGATGCTATACATC-3') y JP90
(SEQ ID NO : 22)
(5'-CATCATGGTACCTTAGTGGACATGCACTTT-3').
El fragmento de 1020 pb aislado se digirió con HindIII/Asp718 y se
introdujo en pBluescript SK+ digerido con HindIII/Asp718, para
producir pBSFIPS-C, el cual se confirmó mediante
análisis de secuencia de DNA.
La secuencia de DNA completa del gen de la
proyección superficial de FIPV, según se derivó del cDNA de la cepa
79-1146, se presenta en la Figura 5 (SEQ ID NO:
23).
El ORF de la proyección superficial contiene
señales de parada transcripcional temprana T5NT. Dos se eliminaron
de la sección intermedia introduciendo mutaciones a través de PCR.
Un fragmento de PCR de 330 pb se amplificó de
pBSFIPS-MII, usando los cebadores oligonucleotídicos
RG757B (SEQ ID NO : 24)
(5'-CATTAGACTCTGTGACGC
CATGTGATGTAA-GCGCACAAGCGGCTGTTATCGATGGTGCCATAGTTGGAGCTATGACTTCCATTAACAG
T-GAACTGTTAGGCCTAACACATTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3') y RG758B (SEQ ID NO: 25) (5'-CATTAGACTGTAAACCTGCATGTATTCAACTTG-CACAGATATTGTAAAATTTGTAGGTATCGTGACATTACC
AGTGCTAATTGGTTGCACGT-CTCCGTCAGAATGTGTGACGTTAATAAATACCAAAG-3'), se digirió con HgaI/
BspMI, y se clonó en pBSFIPS-MII digerido con HgaI/BspMI, para producir pMJ5. El análisis de secuencia de pMJ5 reveló una deleción de 33 pb que se corrigió reemplazando el fragmento de 250 pb StuI/BspMI con un fragmento de PCR amplificado a partir de pBSFIPS-MII usando los cebadores oligonucleotídicos RG758B (SEQ ID NO: 25) y JP162 (SEQ ID NO: 26) (5'-GTGAACTGTTAGGCCTAACACA-TTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3'). El fragmento aislado se digirió con StuI/BspMI y se ligó en pMJ5 digerido con StuI/BspMI, para producir pNR3. Este plásmido tenía un cambio de base en posición 2384, que se corrigió usando el kit de mutagénesis U.S.E. (Pharmacia), para producir pBSFIPS-MIIDII. Este plásmido contiene la región intermedia del gen S con secuencias T5NT cambiadas, y la introducción de nuevos sitios ClaI y StuI, aunque manteniendo la secuencia aminoácida correcta.
CATGTGATGTAA-GCGCACAAGCGGCTGTTATCGATGGTGCCATAGTTGGAGCTATGACTTCCATTAACAG
T-GAACTGTTAGGCCTAACACATTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3') y RG758B (SEQ ID NO: 25) (5'-CATTAGACTGTAAACCTGCATGTATTCAACTTG-CACAGATATTGTAAAATTTGTAGGTATCGTGACATTACC
AGTGCTAATTGGTTGCACGT-CTCCGTCAGAATGTGTGACGTTAATAAATACCAAAG-3'), se digirió con HgaI/
BspMI, y se clonó en pBSFIPS-MII digerido con HgaI/BspMI, para producir pMJ5. El análisis de secuencia de pMJ5 reveló una deleción de 33 pb que se corrigió reemplazando el fragmento de 250 pb StuI/BspMI con un fragmento de PCR amplificado a partir de pBSFIPS-MII usando los cebadores oligonucleotídicos RG758B (SEQ ID NO: 25) y JP162 (SEQ ID NO: 26) (5'-GTGAACTGTTAGGCCTAACACA-TTGGACAACGACACCTAATTTCTATTAC-3'). El fragmento aislado se digirió con StuI/BspMI y se ligó en pMJ5 digerido con StuI/BspMI, para producir pNR3. Este plásmido tenía un cambio de base en posición 2384, que se corrigió usando el kit de mutagénesis U.S.E. (Pharmacia), para producir pBSFIPS-MIIDII. Este plásmido contiene la región intermedia del gen S con secuencias T5NT cambiadas, y la introducción de nuevos sitios ClaI y StuI, aunque manteniendo la secuencia aminoácida correcta.
A fin de acoplar el promotor H6 de
Vaccinia (SEQ ID NO: 27)
(5'-TTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAA
TAAATACAAAGGTTCTTGA-GGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAAAAAAATAATCATAAATTATTTCAT
TATCGCG-ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTA-3') (Perkus et al., 1989) al ATG del gen S, se llevó a cabo lo siguiente. El extremo 3' del promotor H6 acoplado al gen S, se amplificó como un fragmento de PCR, a partir de pBSFIPS-A (sección 5' del gen S), usando los cebadores oligonucleotídicos RG755 (SEQ ID NO : 28) (5'-CTTGTATGCATTCAT
TATTTG-3') y RG756 (SEQ ID NO: 29) (5'-TCCGAGCTCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGATTGTGCTC
GTAAC-3'). El fragmento de 100 pb se digirió con SacI/NsiI y se ligó en pBSFIPS-A digerido con SacI/NsiI, para producir pBSFIPS-AH6.
TAAATACAAAGGTTCTTGA-GGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAAAAAAATAATCATAAATTATTTCAT
TATCGCG-ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTA-3') (Perkus et al., 1989) al ATG del gen S, se llevó a cabo lo siguiente. El extremo 3' del promotor H6 acoplado al gen S, se amplificó como un fragmento de PCR, a partir de pBSFIPS-A (sección 5' del gen S), usando los cebadores oligonucleotídicos RG755 (SEQ ID NO : 28) (5'-CTTGTATGCATTCAT
TATTTG-3') y RG756 (SEQ ID NO: 29) (5'-TCCGAGCTCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGATTGTGCTC
GTAAC-3'). El fragmento de 100 pb se digirió con SacI/NsiI y se ligó en pBSFIPS-A digerido con SacI/NsiI, para producir pBSFIPS-AH6.
Para eliminar la secuencia T5NT en la sección 5'
del gen de la proyección superficial sin alterar la secuencia
aminoácida, se amplificó un fragmento de PCR de 350 pb, a partir de
pBSFIPS-AH6, usando los cebadores oligonucleotídicos
RG753 (SEQ ID NO: 30)
(5'-TCACTGCAGATGTACAATCTG-3') y
RG754 (SEQ ID NO: 31) (5'-CAGTA
TACGATGTGTAAGCAATTGTCCAAAAA-GCTCCACTAACACCAGTGGTTAAAT-TAAAAGATATACAACCA
ATAGGAAATGTGCTAAAGAAATTGTAACCATTAATATAGAAATGG-3'). El fragmento se digirió con PstI/AccI y se introdujo en pBSFIPS-AH6 digerido con PstI/AccI, para producir pNJ1.
TACGATGTGTAAGCAATTGTCCAAAAA-GCTCCACTAACACCAGTGGTTAAAT-TAAAAGATATACAACCA
ATAGGAAATGTGCTAAAGAAATTGTAACCATTAATATAGAAATGG-3'). El fragmento se digirió con PstI/AccI y se introdujo en pBSFIPS-AH6 digerido con PstI/AccI, para producir pNJ1.
Los extremos 5', intermedio y 3' del gen S se
acoplaron conjuntamente para formar el ORF completo, de la forma
siguiente. Primero, la sección 3' se escindió en forma de un
fragmento de 1000 pb, digiriendo pBSFIPS-C con
Asp718/HinDIII y ligando en pNJ1 (sección 5') digerido con
Asp718/HinDIII, produciendo pBSFIPS-A/CH6. La
sección intermedia se añadió, escindiendo un fragmento de 1700 pb
de pBSFIPSMIIDII, digiriendo con HinDIII y ligando en
pBSFIPS-A/CH6 digerido con HinDIII, y seleccionado
para orientación. El plásmido resultante, pBSFIPSH6II, contiene el
ORF completo de S acoplado al extremo 3' del promotor H6, con todas
las secuencias T5NT eliminadas.
Para insertar el ORF de S completo en un plásmido
donador C6, se escindió una casete de 4,4 kb de pBSFIPSH6II,
digiriendo con EcoRV/EcoRI y rellenando los extremos con polimerasa
de Klenow. Esta casete se introdujo en pJCA070 digerido con
EcoRV/EcoRI y se rellenó con polimerasa de Klenow. El plásmido
resultante, pOG9, se encontró, mediante análisis de secuencia de
DNA, que tenía un inserto de 110 pb en el promotor H6 entre los
sitios NruI y EcoRV. Para eliminar estas secuencias, pOG9 se
digirió con NruI/EcoRV y se volvió a ligar, para producir el
plásmido donador pC6FIPSH6II, que tiene el promotor H6 completo,
menos cuatro pares de bases entre los sitios NruI y EcoRI, que no
se requieren para la transcripción temprana y tardía. Este plásmido
está formado por el brazo izquierdo del locus C6, el promotor H6,
el ORF del gen S completo y el brazo derecho del locus C6 (Figura 6
(SEQ ID NO : 32)). Una mutación en el codón de parada añade nueve
aminoácidos adicionales al extremo C-terminal de la
proyección superficial (Figura 7).
Este plásmido donador, pC6FIPSH6II, se usó en
recombinación in vitro (Piccini et al., 1987) con el
vector del virus ALVAC, para generar el virus recombinante
vCP281.
El análisis de inmunoprecipitación a partir de un
lisado de células CRFK infectadas con vCP281, usando un anticuerpo
monoclonal específico de la proyección superficial de FIP,
denominado 23F4.5 (Olsen et al., 1992), mostraba la
expresión de una banda polipeptídica de 220 kDa. Esto era
consecuente con el tamaño esperado del producto del gen S. Además,
la banda migraba conjuntamente con una banda inmunoprecipitada a
partir de células infectadas con FIPV, consecuente con la
glicosilación adecuada. El análisis FACS usando el mismo anticuerpo
monoclonal, mostraba que esta proteína expresada a partir de vCP281
estaba localizada en el citoplasma de la célula infectada. Sin
embargo, la inoculación de monocapas de células CRFK con vCP281
mostraba una gran actividad fusigénica, indicando que la proteína
estaba también en la superficie de estas células. No se observó
ninguna actividad fusigénica en células CRFK infectadas con el
virus ALVAC parental (testigo).
(vCP283B).
La secuencia señal de 57 pb se eliminó del
extremo N-terminal del gen S y se reemplazó por un
ATG, insertando un fragmento de PCR de 270 pb en pOG9, como sigue.
El fragmento de PCR se amplificó a partir de
pBSFIPS-A, usando los cebadores oligonucleotídicos
RG759 (SEQ ID NO : 33)
(5'-GCTATTTTCCATGGCTTCC-3') y RG760
(SEQ ID NO: 34)
(5'-TCCGAGCTCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGA-CAACAAATAATGAATGC-3').
El fragmento se digirió con EcoRV/NcoI y se ligó en pOG9 digerido
con EcoRV/NcoI, para producir pOM12. pOM12 se digirió con
EcoRV/NruI y se volvió a ligar para eliminar el inserto de 110 pb
en el promotor H6. El plásmido donador resultante,
pC6FIPSH6-SS, se confirmó mediante análisis de
secuencia de DNA (Figura 7 (SEQ ID NO :35)).
Este plásmido donador,
pC6FIPSH6-SS, se usó en recombinación in vivo
(Piccini et al., 1987) con el vector del virus ALVAC, para
generar el virus recombinante vCP283B.
El análisis de inmunoprecipitación a partir de un
lisado marcado radiactivamente de células CRFK infectadas con
vCP283B, usando un suero de gato inmune a FIP (Nº 511), mostraba la
expresión de una banda polipeptídica de aproximadamente 145\pm10
kDa. Esto era consecuente con el tamaño predicho de un producto
génico S no glicosilado. El análisis de inmunofluorescencia usando
el mismo suero policlonal, mostraba que esta proteína expresada se
localizaba en el citoplasma de células CEF infectadas con vCP283B.
No se observaba actividad fusigénica en células CRFK.
(vCP315).
Las 1749 pb C-terminales del gen
S (582 aminoácidos terminales, de 1452 aminoácidos totales) se
conectaron al promotor H6 como sigue. pOG9 se digirió con
NruI/BstEII y se aisló un fragmento de 6,2 kb. Este fragmento
contiene la porción C-terminal de 1749 pb del gen
S. Se generó un fragmento que contenía el extremo 3' del promotor
H6 unido a un codón ATG flanqueado por un sitio BstEII, mediante
anillamiento de los oligonucleótidos JP226 (SEQ ID NO: 36)
(5'-CATTAGCATGATATCCGTTAAGTTTGTATCGT-AATGGGTAACCCTGAGTAGCAT-3')
y JP227 (SEQ ID NO: 37)
(5'-ATGCTACTCAGGGTTACCCATTACGATACAAACTTAACGGATATCATGCTAATG-3'),
y digiriendo con NruI/BstEII. Este fragmento se ligó en el
fragmento pOG9 de 6,2 kb (véase 4 más arriba), para producir el
plásmido donador pC6FIPSH6-C, que se confirmó
mediante análisis de secuencia de DNA (Figura 8 (SEQ ID NO :
38)).
Este plásmido donador,
pC6FIPSH6-C, se usó en recombinación in vivo
(Piccini et al., 1987) con el vector del virus ALVAC, para
generar el virus recombinante vCP315.
El análisis de transferencia Western a partir de
un lisado de células CRFK infectadas con vCP315 usando un suero de
gato inmune a FIP (Nº 511), mostraba la expresión de una banda
polipeptídica de 56 kDa. Ésta era ligeramente más pequeña que el
tamaño predicho del producto del gen S no glicosilado, truncado (64
kDa). El análisis de inmunofluorescencia usando el mismo suero
policlonal mostraba una detección débil de la proteína localizada
en el citoplasma de células CEF infectadas por vCP315. No se
observó ninguna actividad fusigénica en células CRFK.
Se clonó un fragmento de BglII del virus de la
viruela de los canarios de 8,5 kb, en el sitio BamI de pBluescript
SK+ (Stratagene, La Jolla, CA), para producir pWW5. El análisis de
la secuencia nucleotídica de este fragmento reveló un marco de
lectura abierto denominado C3, iniciado en la posición 1458 y
terminado en la posición 2897, en la secuencia presentada en la
Figura 9 (SEQ ID NO : 39). A fin de delecionar el marco de lectura
abierto (ORF) C3 completo, se diseñaron cebadores de PCR para
amplificar un fragmento 5' y un fragmento 3', relativos al ORF C3.
Los cebadores oligonucleotídicos RG277 (SEQ ID NO: 40)
(5'-CAGTTG-GTACCACTGGTATTTTATTTCAG-3')
y RG278 (SEQ ID NO: 41)
(5'-TATCTGAATTCCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAAATG-TGAGTTAATAT
TAG-3') se usaron para amplificar el fragmento 5' a partir de pWW5 y los cebadores oligonucleotídicos RG279 (SEQ ID NO: 42) (5'-TCGCTGAATTCGATATCAAGCTTATCGATTTTTATGACTAGTTAATCAAATAAAAA-GCATA
CAAGC-3') se usaron para amplificar el fragmento 3' desde pWW5. El fragmento 5' se digirió con Asp718/EcoRI y el fragmento 3' se digirió con EcoRI/SacI. Los brazos 5' y 3' se ligaron a continuación en pBluescript SK+ digerido con Asp718/SacI, para producir pC3I. Este plásmido contiene el sitio de inserción de C3, con el ORF de C3 eliminado por deleción y reemplazado por un sitio de clonación múltiple, flanqueado por una señal de terminación de traducción y traducción temprana de Vaccinia. pC3I se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.
TAG-3') se usaron para amplificar el fragmento 5' a partir de pWW5 y los cebadores oligonucleotídicos RG279 (SEQ ID NO: 42) (5'-TCGCTGAATTCGATATCAAGCTTATCGATTTTTATGACTAGTTAATCAAATAAAAA-GCATA
CAAGC-3') se usaron para amplificar el fragmento 3' desde pWW5. El fragmento 5' se digirió con Asp718/EcoRI y el fragmento 3' se digirió con EcoRI/SacI. Los brazos 5' y 3' se ligaron a continuación en pBluescript SK+ digerido con Asp718/SacI, para producir pC3I. Este plásmido contiene el sitio de inserción de C3, con el ORF de C3 eliminado por deleción y reemplazado por un sitio de clonación múltiple, flanqueado por una señal de terminación de traducción y traducción temprana de Vaccinia. pC3I se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA.
Los brazos que flanquean a pC3I se alargaron como
sigue. Se obtuvo un fragmento de 908 pb aguas arriba del locus C3,
mediante digestión de pWW5 con NsiI y SspI. Un fragmento de PCR de
604 pb se amplificó a partir de pWW5, usando los cebadores
oligonucleotídicos CP16 (SEQ ID NO: 43)
(5'-TCCGGTACCGCGGCCGCAGA
TATTTGTTAGCTTCTGC-3') y CP17 (SEQ ID NO: 44) (5'-TCGCTCGAGTAGGATACCTACCTACTACCTA-CG-3'), digerido con Asp718/XhoI y se ligó en pIBI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), para producir pSPC3LA. pSPC3LA se digirió en pIBI25 con EcoRV y dentro del inserto (DNA del virus de la viruela de los canarios), con NsiI y se ligó al fragmento Nsi/SspI de 908 pb, gnerando pSPCPLAX, que contiene 1444 pb del DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba desde el locus C3. Se aisló un fragmento BglII/StyI de 2178 pb de pXX4 (que contiene un fragmento NsiI de 6,5 kb de DNA del virus de la viruela de los canarios, clonado en el sitio PstI de pBluescript SK+). Se amplificó un fragmento de PCR de 279 pb de pXX4, usando los cebadores oligonucleotídicos CP19 (SEQ ID NO: 45) (5'-TCGCTCGAGCTTTCTTGACAATAACATAG-3') y CP20 (SEQ ID NO: 46) (5'-TAGGAGCTCTTTATACTACTGGGTTACAAC-3'), se digirió con XhoI/SacI, se ligó en pIBI25 digerido con SacI/XhoI, para producir pSPC3RA.
TATTTGTTAGCTTCTGC-3') y CP17 (SEQ ID NO: 44) (5'-TCGCTCGAGTAGGATACCTACCTACTACCTA-CG-3'), digerido con Asp718/XhoI y se ligó en pIBI25 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), para producir pSPC3LA. pSPC3LA se digirió en pIBI25 con EcoRV y dentro del inserto (DNA del virus de la viruela de los canarios), con NsiI y se ligó al fragmento Nsi/SspI de 908 pb, gnerando pSPCPLAX, que contiene 1444 pb del DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba desde el locus C3. Se aisló un fragmento BglII/StyI de 2178 pb de pXX4 (que contiene un fragmento NsiI de 6,5 kb de DNA del virus de la viruela de los canarios, clonado en el sitio PstI de pBluescript SK+). Se amplificó un fragmento de PCR de 279 pb de pXX4, usando los cebadores oligonucleotídicos CP19 (SEQ ID NO: 45) (5'-TCGCTCGAGCTTTCTTGACAATAACATAG-3') y CP20 (SEQ ID NO: 46) (5'-TAGGAGCTCTTTATACTACTGGGTTACAAC-3'), se digirió con XhoI/SacI, se ligó en pIBI25 digerido con SacI/XhoI, para producir pSPC3RA.
Para añadir sitios exclusivos al sitio de
clonación múltiple (MCS) en pC3I, se digirió pC3I con EcoRI/ClaI
(en el MCS) y se ligó a los oligonucleótidos digeridos con quinasa
y anillados CP12 (SEQ ID NO: 47) (5'-AATTCCTC
GAGGGATCC-3') y (SEQ ID NO: 48) (5'-CGGGATCCCTCG-AGG-3') (que contenían un extremo cohesivo EcoRI, un sitio XhoI, un sitio BamHI y un extremo cohesivo compatible con ClaI), para producir pSPCP3S. pSPCP3S se digirió en las secuencias del virus de la viruela del canario, aguas abajo del locus C3, con StyI y SacI (de pBluescript SK+) y se ligó en un fragmento BglII/SacI de 261 pb de pSPC3RA y al fragmento BglII/StyI de 2178 pb de pXX4, generando pCPRAL que contenía 2572 pb de secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3. pSPCP3S se digirió en las secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del locus C3, con Asp718 (en pBluescript SK+) y AccI, y se ligó a un fragmento Asp718/AccI de 1436 pb de pSPCPLAX, generando pCPLAI, que contenía 1457 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del locus C3. pCPLAI se digirió en las secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3, con StyI y SacI (en pBluescript SK+) y se ligó a un fragmento StyI/SacI de 2438 pb de pCPRAL, generando el plásmido pSPCP3LA. El brazo izquierdo de pSPCP3LA se acortó en aproximadamente 500 pb como sigue. pSPCP3LA se digirió con NotI/NsiI y se aisló un fragmento de 6433 pb. Los oligonucleótidos CP34 (SEQ ID NO: 49) (5'-GGCCGCGTCGACATGCA-3') y CP35 (SEQ ID NO: 50) (5'-TGTCGACGC-3') se anillaron y se ligaron en este fragmento, para producir pSPCP3LSA. Este es el plásmido de inserción de C3, que está formado por 939 pb del DNA del virus de la viruela de los canarios aguas arriba del locus C3, codones de parada en seis marcos de lectura, señal de terminación transcripcional temprana, un MCS, señal de terminación transcripcional temprana, codones de parada en seis marcos de lectura y 2572 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3.
GAGGGATCC-3') y (SEQ ID NO: 48) (5'-CGGGATCCCTCG-AGG-3') (que contenían un extremo cohesivo EcoRI, un sitio XhoI, un sitio BamHI y un extremo cohesivo compatible con ClaI), para producir pSPCP3S. pSPCP3S se digirió en las secuencias del virus de la viruela del canario, aguas abajo del locus C3, con StyI y SacI (de pBluescript SK+) y se ligó en un fragmento BglII/SacI de 261 pb de pSPC3RA y al fragmento BglII/StyI de 2178 pb de pXX4, generando pCPRAL que contenía 2572 pb de secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3. pSPCP3S se digirió en las secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del locus C3, con Asp718 (en pBluescript SK+) y AccI, y se ligó a un fragmento Asp718/AccI de 1436 pb de pSPCPLAX, generando pCPLAI, que contenía 1457 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del locus C3. pCPLAI se digirió en las secuencias del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3, con StyI y SacI (en pBluescript SK+) y se ligó a un fragmento StyI/SacI de 2438 pb de pCPRAL, generando el plásmido pSPCP3LA. El brazo izquierdo de pSPCP3LA se acortó en aproximadamente 500 pb como sigue. pSPCP3LA se digirió con NotI/NsiI y se aisló un fragmento de 6433 pb. Los oligonucleótidos CP34 (SEQ ID NO: 49) (5'-GGCCGCGTCGACATGCA-3') y CP35 (SEQ ID NO: 50) (5'-TGTCGACGC-3') se anillaron y se ligaron en este fragmento, para producir pSPCP3LSA. Este es el plásmido de inserción de C3, que está formado por 939 pb del DNA del virus de la viruela de los canarios aguas arriba del locus C3, codones de parada en seis marcos de lectura, señal de terminación transcripcional temprana, un MCS, señal de terminación transcripcional temprana, codones de parada en seis marcos de lectura y 2572 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas abajo del locus C3.
Se construyó una genoteca de DNA del virus de la
viruela de los canarios en el vector cósmido pVK102 (Knauf y
Nester, 1982), se sometió a análisis mediante sondas de ácidos
nucleicos con pRW764.5 (un plásmido basado en pUC9 que contiene un
fragmento PvuII del virus de la viruela de los canarios de 880 pb,
que incluye el ORF de C5) y se identificó un clon del cósmido que
contenía un inserto de 29 kb (pHCOS1). Se identificó un fragmento
ClaI de 3,3 kb de pHCOS1 que contenía la región C5. El ORF de C5 se
inicia en la posición 1537 y termina en la posición 1857, en la
secuencia mostrada en la Figura 10 (SEQ ID NO: 51).
El vector de inserción de C5 se construyó en dos
etapas. La secuencia aguas arriba de 1535 pb se generó mediante
amplificación PCR a partir de DNA genómico purificado de virus de
la viruela de los canarios, usando los cebadores oligonucleotídicos
C5A (SEQ ID NO: 52)
(5'-ATCATCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTTG-3')
y C5B (SEQ ID NO: 53)
(5'-GGGGGTACCTTTGAGAGTACCACTTCAG-3').
Este fragmento se digirió con EcoRi y se ligó en pUC8 digerido con
EcoRI/SmaI, para producir pC5LAB. El brazo de 404 pb se generó
mediante amplificación PCR, usando los oligonucleótidos C5C (SEQ ID
NO: 54) (5'-GGGTCTAGAGCGGCCGCTTA
TAAAGATCTAAAATGCATAATTTC-3') y C5DA (SEQ ID NO: 55) (5'-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAG
GAATAGATG-3'). Este fragmento se digirió con PstI y se clonó en pC5LAB digerido con SmaI/PstI, para producir pC5L. pC5L se digirió en el MCS con Asp718/NotI y se ligó a los oligonucleótidos CP26 (SEQ ID NO: 56) (5'-GTACGTGACTAATTAGCTATAAAAAGGATCCGGTACCCTCGAGTCTAGAATCGATCC-CGGGTTTTTATGAC
TAGTTAATCAC-3') y CP27 (SEQ ID NO: 57) (5'-GGCCGTGATTAACTAGTCATAAAAACCCGGGATCGATTC
TAGACTCGAGGGTACCGG-ATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCAC-3') digeridos con quinasa y anillados, para producir pC5LSP. Este plásmido se digirió con EcoRI, se ligó con el oligonucleótido CP29 (SEQ ID NO : 58) (5'-AATTGCGGCCGC-3') digerido con quinasa y anillado, y se digirió con NotI. El plásmido linealizado se purificó y se ligó consigo mismo, para generar pNC5LSP-5. Este plásmido de inserción de C5 contiene 1535 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del ORF de C5, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura, señal de terminación de la transcripción temprana de Vaccinia, un MCS con sitios de restricción BamHI, KpnI, XhoI, ClaI y SmaI, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura y 404 pb de la secuencia del virus de la viruela de los canarios aguas abajo (31 pb de la secuencia codificadora de C5 y 373 pb de la secuencia del virus de la viruela de los canarios aguas abajo).
TAAAGATCTAAAATGCATAATTTC-3') y C5DA (SEQ ID NO: 55) (5'-ATCATCCTGCAGGTATTCTAAACTAG
GAATAGATG-3'). Este fragmento se digirió con PstI y se clonó en pC5LAB digerido con SmaI/PstI, para producir pC5L. pC5L se digirió en el MCS con Asp718/NotI y se ligó a los oligonucleótidos CP26 (SEQ ID NO: 56) (5'-GTACGTGACTAATTAGCTATAAAAAGGATCCGGTACCCTCGAGTCTAGAATCGATCC-CGGGTTTTTATGAC
TAGTTAATCAC-3') y CP27 (SEQ ID NO: 57) (5'-GGCCGTGATTAACTAGTCATAAAAACCCGGGATCGATTC
TAGACTCGAGGGTACCGG-ATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCAC-3') digeridos con quinasa y anillados, para producir pC5LSP. Este plásmido se digirió con EcoRI, se ligó con el oligonucleótido CP29 (SEQ ID NO : 58) (5'-AATTGCGGCCGC-3') digerido con quinasa y anillado, y se digirió con NotI. El plásmido linealizado se purificó y se ligó consigo mismo, para generar pNC5LSP-5. Este plásmido de inserción de C5 contiene 1535 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba del ORF de C5, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura, señal de terminación de la transcripción temprana de Vaccinia, un MCS con sitios de restricción BamHI, KpnI, XhoI, ClaI y SmaI, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura y 404 pb de la secuencia del virus de la viruela de los canarios aguas abajo (31 pb de la secuencia codificadora de C5 y 373 pb de la secuencia del virus de la viruela de los canarios aguas abajo).
La Figura 11 (SEQ ID NO: 59) es la secuencia de
un segmento de 3,7 kb del DNA del virus de la viruela de los
canarios. El análisis de secuencia reveló un ORF denominado C6L,
iniciado en la posición 377 y terminado en la posición 2254. A
continuación se describe un plásmido de inserción de C6, construido
eliminando por deleción el ORF de C6 y reemplazándolo por un MCS
flanqueado por señales de terminación transcripcional y de
traducción. Se amplificó un fragmento de PCR de 380 pb de DNA
genómico del virus de la viruela de los canarios, usando los
cebadores oligonucleotídicos C6A1 (SEQ ID NO: 60)
(5'-ATCATCGAG-CTCGCGGCCGCCTAT
CAAAAGTCTTAATGAGTT-3') y C6B1 (SEQ ID NO: 61) (5'-GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCCGGGTTTTTA
TAGCTAATTAGTCATTTT-TTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA-3'). Se amplificó un fragmento de PCR de 1155 pb de DNA genómico del virus de la viruela de los canarios, usando los cebadores oligonucleotídicos C6C1 (SEQ ID NO: 62) (5'-CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTT-TTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATT
GAAAAAGTAA-3') y C6D1 (SEQ ID NO: 63) (5'-GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTT-AAGTTG-3'). Los fragmentos de 380 pb y 1155 pb se fusionaron entre sí, añadiéndolos conjuntamente como molde y amplificando un fragmento de PCR de 1613 pb, usando los cebadores oligonucleotídicos C6A1 (SEQ ID NO: 49) y C6D1 (SEQ ID NO: 52). Este fragmento se digirió con SacI/KpnI y se ligó en pBluescript SK+ digerido con SacI/KpnI. El plásmido resultante, pC6L, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA. Dicho plásmido está formado por 370 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba de C6, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura, un MCS que contiene sitios SmaI, PstI, XhoI y EcoRI, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura y 1156 pb de la secuencia aguas abajo del virus de la viruela de los canarios.
CAAAAGTCTTAATGAGTT-3') y C6B1 (SEQ ID NO: 61) (5'-GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCCGGGTTTTTA
TAGCTAATTAGTCATTTT-TTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA-3'). Se amplificó un fragmento de PCR de 1155 pb de DNA genómico del virus de la viruela de los canarios, usando los cebadores oligonucleotídicos C6C1 (SEQ ID NO: 62) (5'-CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTT-TTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATT
GAAAAAGTAA-3') y C6D1 (SEQ ID NO: 63) (5'-GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTT-AAGTTG-3'). Los fragmentos de 380 pb y 1155 pb se fusionaron entre sí, añadiéndolos conjuntamente como molde y amplificando un fragmento de PCR de 1613 pb, usando los cebadores oligonucleotídicos C6A1 (SEQ ID NO: 49) y C6D1 (SEQ ID NO: 52). Este fragmento se digirió con SacI/KpnI y se ligó en pBluescript SK+ digerido con SacI/KpnI. El plásmido resultante, pC6L, se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA. Dicho plásmido está formado por 370 pb de DNA del virus de la viruela de los canarios, aguas arriba de C6, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura, un MCS que contiene sitios SmaI, PstI, XhoI y EcoRI, señal de terminación temprana de Vaccinia, codones de parada de traducción en seis marcos de lectura y 1156 pb de la secuencia aguas abajo del virus de la viruela de los canarios.
pJCA070 se derivó de pC6L ligando una casete que
contenía el promotor H6 de Vaccinia acoplado a otro gen
extraño, en los sitios SmaI/EcoRI de pC6L. Al cortar pJCA070 con
EcoRV/EcoRI, se escinde el gen extraño y el extremo 5' del promotor
H6.
Experimento
1
Veinticinco gatos de 10-12
semanas de edad exentos de patógeno específico (SPF) de Harlan
Sprague Dawley, Inc., se dividieron aleatoriamente en cinco grupos
(5 gatos/grupo). Los grupos se vacunaron subcutáneamente (área del
cuello) dos veces (día 0 y día 21) con 10^{7} TCID_{50}/dosis,
bien con vCP261, vCP262, vCP282 o vCP261A + vCP262. Cinco gatos en
un grupo no se vacunaron y sirvieron como testigos de estimulación.
En el día 35, todos los gatos se estimularon por vía oral con
10^{3,5} TCID_{50} por gato con un virus de FIP virulento (cepa
1146). Los gatos se observaron diariamente durante 33 días después
de la estimulación, para controlar la mortalidad y las
manifestaciones visibles de infección por virus FIP. En el día 33, a
todos los gatos se les realizó la necropsia y se examinaron para
patología de FIP. La forma no efusiva se detectó mediante
aislamiento del virus FIP a partir del tracto intestinal e
identificación mediante ensayos de neutralización del virus. Los
gatos con la forma efusiva tenían un fluido amarillo espeso en la
cavidad peritoneal, un fluido edematoso blanco en la cavidad
pleural y lesiones en el intestino, bazo e hígado. Algunos gatos
infectados mostraban una implicación ocular, con conjuntivitis,
blefaroespasmo y retina opalescente.
Ninguno de los gatos vacunados mostraba ninguna
reacción adversa local o sistémica posterior a la vacunación. Los
cinco gatos no vacunados, bien murieron con señales de FIP, o
cuando se les realizó la necropsia tenían señales de FIP, validando
por tanto la dosis de estimulación. Los gatos muertos y moribundos
presentaban señales tanto de formas efusiva, como no efusiva, de
FIP. Los resultados de los gatos vacunados con el recombinante
ALVAC-FIP se presentan en la Tabla 1. Ninguno de
estos gatos desarrolló anticuerpos neutralizantes del previamente a
la estimulación en el día 35. Todos los gatos presentaban una
respuesta febril tras la estimulación. Todos los grupos vacunados
mostraban una protección parcial, con la mejor protección en los
grupos vacunados vCP262 y vCP282, conteniendo cada uno 3/5 gatos
sin ninguna señal de FIP o mortalidad. Por tanto, a partir de este
estudio parece que los recombinantes ALVAC-matriz de
FIP proporcionan la mejor protección global.
Experimento
2
En este experimento se usaron veintitrés gatos
SPF de 10-12 semanas de edad de Hill Grove, Gran
Bretaña. Diez gatos se vacunaron subcutáneamente con vCP262 a una
dosis de 10^{8} ufp en los días 0 y 21. Cinco gatos recibieron
una vacuna de FIP comercializada (PRIMUCELL, Smithkline Beecham),
que se proporcionó como se recomendaba por el fabricante (2 dosis
separadas por 21 días, intranasal, 10^{4,8} TCID^{50} por
dosis). Ocho gatos no se vacunaron y sirvieron como testigos de
estimulación. En el día 35, todos los gatos se estimularon con un
virus de FIP virulento (cepa 79-1146) a una dosis de
320 DECP_{50} proporcionada intranasalmente. Los gatos
supervivientes se volvieron a estimular en el día 84 y a aquellos
que sobrevivieron se les realizó la necropsia en el día 104 y se
les examinó para patología FIP.
Ninguno de los gatos vacunados mostró ninguna
reacción local o sistémica adversa tras la vacunación. Dentro del
grupo testigo, cuatro de los gatos, bien murieron, o bien tenían
patología de FIP cuando se les realizaba la necropsia. Los cuatro
testigos restantes (alojados en una unidad separada de los otros
testigos) sobrevivieron a ambas estimulaciones y parecían estar
protegidos. Todos ellos mostraban un incremento significativo en
los anticuerpos neutralizantes del suero frente a FIP tras la
estimulación, indicando por tanto la exposición al virus. No se
sabe si esto indica problemas técnicos con el protocolo de
estimulación o una protección natural.
Los análisis serológicos mostraban titulaciones
de anticuerpos neutralizantes virales frente a FIP no
significativas, en gatos que recibían dos inoculaciones de vCP262.
Por contraste, se observaban titulaciones significativas tras una
inoculación de PRIMUCELL y estas titulaciones se dispararon tras la
segunda inoculación. Los gatos en ambos grupos mostraban
titulaciones elevadas tras la estimulación.
Los resultados de los datos de mortalidad para
los gatos vacunados se presentan en la Tabla 2. En el grupo vCP262,
8/10 gatos (80%) sobrevivían a la primera estimulación, mientras
que 6/10 (60%) sobrevivían a ambas estimulaciones (60%). Por
contraste, en el grupo de PRIMUCELL, sólo 1/5 gatos sobrevivían a
la primera estimulación. El gato superviviente, también sobrevivía
a la segunda estimulación. Es importante destacar que 3 de los 4
gatos vacunados con PRIMUCELL muertos, murieron en el día 11 o
antes, lo cual indica un incremento de la progresión normal de la
enfermedad. No se observó mejora con gatos vacunados con vCP262.
Por tanto, comparado con PRIMUCELL, vCP262 proporciona una mayor
protección, sin incremento de la enfermedad.
Experimento
3
Se recibieron treinta y seis gatos SPF de 9
semanas de edad de Harlan Sprague Dawley, Inc. y se dividieron
aleatoriamente en seis grupos (6 gatos/grupo). Los grupos
recibieron dos inoculaciones subcutáneas (dosis de aproximadamente
10^{7} TCID_{50} para cada recombinante en los días 0 y 21),
con los siguientes recombinantes: 1) vCP262 (matriz), 2) vCP262 más
vCP281 (S1 proyección superficial completa), 3) vCP262 más vCP283B
(S2 proyección superficial menos secuencia señal) y 4) vCP262 más
vCP315 (S3 proyección superficial - sección
C-terminal). Un grupo se vacunó intranasalmente con
una vacuna de FIP disponible comercialmente (PRIMUCELL, Pfizer
Animal Health), como se recomendaba por el fabricante (2 dosis, día
0 y día 21). Un grupo no se vacunó y sirvió como testigo de
estimulación. Quince días después de la segunda vacunación (día
36), todos los gatos se estimularon oralmente con
10^{3,5}TCID_{50} por gato, con un virus de FIP virulento (NVSL
FIP-1146, 89-5-1).
Los gatos se controlaron para el peso, temperatura, respuesta
serológica y mortalidad durante 35 días tras la estimulación. Se
realizó la necropsia en la mayoría de los gatos muertos, para
observar señales de FIP y el virus FIPV se aisló de dos gatos para
confirmar la infección.
Ninguno de los gatos vacunados con recombinantes
ALVAC mostró ninguna reacción local o sistémica tras la vacunación.
Todos los gatos vacunados con PRIMUCELL tenían titulaciones
neutralizantes de virus. En los grupos recombinantes, sólo los
gatos del grupo que recibía la matriz más la proyección superficial
completa tenía titulaciones neutralizantes de virus (3/6 tras la
segunda vacunación).
Los datos de mortalidad se presentan en la Tabla
3. Los gatos a los que se les realizó la necropsia mostraban
señales tanto formas efusiva (mayoría) como no efusiva de la
enfermedad. Un gato tenía encefalitis inducida por FIP (grupo
testigo). La mortalidad más baja (33%) se observó en el grupo
vacunado con vCP262 (matriz) solo. Los grupos que recibían vCP262
más cualquiera de los recombinantes de la proyección superficial
mostraban escasa protección, si la había. El grupo vacunado con
PRIMUCELL mostraba una mortalidad de 66,7%. El incremento inducido
por anticuerpos (muerte temprana) se observó tanto en los grupos de
PRIMUCELL como en los de vCP281 (S1 proyección superficial
completa). Cinco de cada seis (83,3%) de los gatos no vacunados
testigo murieron de infección por FIP, lo cual validaba la
estimulación.
La fiebre y la pérdida de peso son indicadores de
enfermedad por FIP. Existía una pérdida de peso relativa tras la
vacunación en todos los grupos. Sin embargo, el grupo vacunado con
vCP262 mostraba sólo una ligera pérdida de peso, comparada con el
de PRIMUCELL y los grupos testigo. Se observó fiebre crónica en
todos los gatos, sin embargo, el grupo que se vacunó con vCP262
presentaba consecuentemente temperaturas inferiores a los otros
grupos.
A partir de este estudio, se concluyó que vCP262
proporcionaba protección (67,7%) frente a una estimulación grave con
FIP. Además, los gatos vacunados con este recombinante mostraban
una respuesta febril inferior y menos pérdida de peso tras la
estimulación. Los otros recombinantes de FIP (vCP281, vCP283B y
vCP315), así como el grupo de PRIMUCELL, proporcionaban escasa
protección e incluso un incremento de la mortalidad (PRIMUCELL,
vCP281).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
1. Titulaciones expresadas como el recíproco de la dilución del suero final. | |
2. Los números entre paréntesis representan los gatos con señales de FIP en la necropsia. | |
3. Sin mortalidad o señales de FIP. |
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ 1. Incluye gatos a los que se les realizó la necropsia, con patología de FIP en el día 104.\cr 2. Tres de estos gatos murieron en el día 11 o antes, indicando un incremento.\cr}
- 1.
- Muerte en el día 15 tras la estimulación, o previamente.
Se generan los recombinantes de (S1), (S2), (S3),
y (M+N), usando loci de inserción y promotores como en la patente de
EE.UU. Nº 5.494.807, p.ej. mediante modificación del plásmido pRW842
para inserción del gen G de la glicoproteína de la rabia en el
locus de deleción TK (usado para la generación de vP879), p.ej.
eliminando por escisión a partir de pRW842 el DNA de la rabia, e
insertando por tanto el DNA de FIPV aquí descrito que codifica para
M, N y las tres versiones de S, S1, S2 y S3, o sus combinaciones
(por ejemplo M y N), y empleando a continuación los plásmidos
resultantes en recombinación con NYVAC, vP866,
NYVAC-FIPV(M), (N) y las tres versiones de
(S). El análisis confirma la expresión.
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Claims (10)
1. Un poxvirus recombinante que contiene DNA del
virus de la peritonitis infecciosa felina, que comprende una
secuencia que codifica la proteína M, en una región no esencial del
genoma del poxvirus, en el que el poxvirus es:
- (i)
- un virus Vaccinia en el que J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L y 14L se delecionan del virus, o se delecionan del virus un gen de timidina-quinasa, una región hemorrágica, una región de un cuerpo de inclusión de tipo A, un gen de hemaglutinina, una región de ámbito de hospedador, y una ribonucleótido-reductasa de la subunidad grande; o el poxvirus es:
- (ii)
- un virus de la viruela de los canarios atenuado.
2. El recombinante de la reivindicación 1, en el
que el virus de la viruela de los canarios se atenuó a través de
más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embrión de pollo,
una siembra patrón del mismo se sometió a cuatro purificaciones en
placa sucesivas en agar, de las cuales se amplificó un clon de placa
a través de cinco pases adicionales.
3. El recombinante de la reivindicación 1, en el
que el virus de la viruela de los canarios atenuado es ALVAC.
4. El recombinante de la reivindicación 1, en el
que el poxvirus es el virus Vaccinia.
5. El recombinante de la reivindicación 4, en el
que el virus Vaccinia es NYVAC.
6. El recombinante de la reivindicación 1, en el
que el DNA del virus de la peritonitis infecciosa felina codifica
además N.
7. El recombinante de las reivindicaciones 1 a 6,
en el que el DNA codifica además uno, dos, o los tres de S1, S2 y
S3.
8. Una composición inmunológica que comprende un
recombinante según las reivindicaciones 1 a 7.
9. El uso de un recombinante según las
reivindicaciones 1 a 7, para preparar una composición farmacéutica
para inducir una respuesta inmunológica en un hospedador, siendo
adecuada dicha composición farmacéutica para administrarla a un
hospedador.
10. El uso de un recombinante según las
reivindicaciones 1 a 7 para preparar una composición inmunológica
para inducir una respuesta inmunológica, siendo adecuada dicha
composición inmunológica para administrarla, conjuntamente con un
vehículo, a un hospedador.
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