ES2267154T3

ES2267154T3 - Vectores de expresion basados en poxvirus, que contienen inserciones heterologas derivadas de lentivirus.

Info

Publication number: ES2267154T3
Application number: ES97946609T
Authority: ES
Inventors: James Tartaglia; Enzo Paoletti
Original assignee: Connaught Technology Corp
Current assignee: Connaught Technology Corp
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2017-11-07
Also published as: AU5174598A; PT956360E; JP2007001990A; ATE330023T1; DK0956360T3; EP0956360A1; WO1998021354A1; DE69736126D1; NO992369L; CA2271955A1; JP2003310286A; JP4064466B2; EP0956360B1; DE69736126T2; JP3936303B2; NO992369D0; EP0956360A4; US7255862B1; JP2000509999A; CA2271955C

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PRODUCTOS DE RECOMBINACION QUE CONTIENEN Y EXPRESAN EL ADN DE LENTIVIRUS, DE RETROVIRUS O DE VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA, ASI COMO SUS PROCEDIMIENTOS DE FABRICACION Y DE UTILIZACION. EN UN MODO DE REALIZACION TOMADO COMO EJEMPLO, ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS VIRUS DE RECOMBINACION QUE CONTIENEN UN ADN QUE CODIFICA UN EPITOPO DE VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA FELINO COMO POR EJEMPLO UN ANTIGENO, ASI COMO PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES QUE EMPLEAN ESTOS VIRUS, PRODUCTOS DE EXPRESION DE LOS MISMOS Y ANTICUERPOS GENERADOS A PARTIR DE LOS VIRUS O DE LOS PRODUCTOS DE EXPRESION. LOS PRODUCTOS DE RECOMBINACION PUEDEN SER PRODUCTOS DE RECOMBINACION NYVAC O ALVAC. EL ADN PUEDE CODIFICAR, POR LO MENOS, UN ELEMENTO DE: ENV, GAG, POL O COMBINACIONES DE LOS MISMOS COMO POR EJEMPLO GAG Y POL O PROTEASA O ENV, GAG Y POL O PROTEASA. LOS PRODUCTOS DE RECOMBINACION Y LOS PRODUCTOS GENICOS QUE PROCEDEN DE LOS MISMOS, ASI COMO LOS ANTICUERPOS QUE GENERAN TIENEN VARIAS APLICACIONES PREVENTIVAS, TERAPEUTICAS Y DIAGNOSTICAS. EL ADN QUE PROCEDE DE LOS PRODUCTOS DE RECOMBINACION ES UTIL COMO SONDA, EN LA PRODUCCION DE INICIADORES DE PCR O PARA LA INMUNIZACION. SE HAN VALORADO LA INMUNOGENICIDAD Y LA EFICACIA DE PROTECCION DE PROTOCOLOS DE INMUNIZACION QUE IMPLICAN ALVAC FIV Y EL INICIO CON UN VIRUS CANARIPOXICO DE RECOMBINACION ALVAC - FIV SEGUIDO POR UNA INMUNIZACION DE REFORZADOR CON VACUNA INACTIVADA DE CELULA INFECTADA - FIV CONTRA EL ATAQUE DE FIV EN GATOS Y EL PROTOCOLO RESULTO INDUCIR EFICAZMENTE UNAS RESPUESTAS INMUNES DE PROTECCION ESPECIFICAS - FIV. ADEMAS, SE DESCUBRIO QUE LOS GATOS INMUNIZADOS ESTABAN TOTALMENTE PROTEGIDOS CONTRA UN ATAQUE INICIAL CON UNA CEPA FIV LIGERAMENTE HETEROLOGA (50CID 50 ) Y SE PROTEGIERON PARCIALMENTE CONTRA UN SEGUNDO ATAQUE CON UNA CEPA FIV DISTINTAMENTE HETEROLOGA (75CID 50 ) DADA OCHO MESES DESPUES DEL ATAQUE INICIAL SIN LA INTERVENCION DE NINGUN REFORZADOR.

Description

Vectores de expresión basados en poxvirus, que contienen inserciones heterólogas derivadas de lentivirus.

Declaración de posibles derechos del gobierno

Parte del trabajo informado en la presente invención puede haber recibido apoyo de una beca NIH/NIAID (R01-AI30904) y de una beca de colaboración de Virogenetics Corp./Universidad de Florida. El gobierno podría poseer determinados derechos (sin prejuiciarlos ni admitirlos).

Solicitudes relacionadas

Se hace referencia a la solicitud US nº de serie 08/417.210, presentada el 5 de abril de 1995 como continuación en parte de la solicitud nº de serie 08/223.842, presentada el 6 de abril de 1994, que a su vez es una continuación en parte de la solicitud nº de serie 07/897.382, presentada el 11 de junio de 1992 (ahora solicitud US nº de serie 08/303.275, presentada el 7 de septiembre de 1994), que a su vez es una continuación en parte de la solicitud nº de serie 07/715.921, presentada el 14 de junio de 1991. La solicitud nº de serie 08/417.210 también es una continuación en parte de la solicitud nº de serie 08/105.483, presentada el 13 de agosto de 1993, ahora patente US nº 5.494.807, que a su vez es una continuación de la solicitud nº de serie 07/847.951, presentada el 6 de marzo de 1991, que a su vez es una continuación en parte de la solicitud nº de serie 07/713.967, presentada el 11 de junio de 1991, que a su vez es una continuación en parte de la solicitud nº de serie 07/666.056, presentada el 7 de marzo de 1991 (ahora patente US nº 5.364.773). También se hace mención de la solicitud copendiente autorizada nº de serie 08/184.009, presentada el 19 de enero de 1994 como continuación en parte de la solicitud nº de serie 08/007.115, presentada el 20 de enero de 1993.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a: determinado producto o productos procedentes de lentivirus, retrovirus y/o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VIH, VIS, VAIE, VIB, VIF, que comprenden determinado epítopo o epítopos de interés, preferentemente Env, Gag, Pol y productos génicos accesorios, por ejemplo Tat, Rev, más preferentemente de Gag y Pol o Env, Gag y Pol, y más preferentemente Gag y proteasa; a determinada molécula o moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo ARN, ADN, codificante el producto o productos; a un vector, preferentemente un sistema vector de mamífero, que comprende la molécula o moléculas de ácidos nucleicos y que preferentemente expresa el producto o productos como exógeno al vector, al producto o productos obtenidos u obtenibles a partir de la expresión del vector; a composiciones inmunológicas, inmunogénicas y/o de vacuna, que comprenden el vector y/o el producto o productos; a procedimientos para preparar el producto o productos; a procedimientos para preparar el vector; a procedimientos para preparar las composiciones; y a procedimientos para utilizar el producto o productos, el vector y las composiciones, incluyendo procedimientos para obtener una respuesta inmunológica, tal como mediante regímenes de inmunización en los que el producto o productos, el vector y/o las composiciones, se administran solas o en una configuración de inducción/refuerzo con una vacuna de células infectadas inactivadas o una composición inmunológica o inmunogénica (VCI).

La invención se refiere especialmente a composiciones inmunológicas, inmunogénicas o de vacuna recombinantes y a su utilidad en la estimulación de una respuesta, tal como proporcionar protección frente a la exposición de reto por lentivirus, incluyendo la exposición a una cepa heteróloga. La composición recombinante preferentemente comprende un sistema vector de mamífero que expresa productos génicos de lentivirus utilizados en regímenes de inmunización eficaces solos o en una configuración de inducción/refuerzo con preparaciones de lentivirus inactivadas (por ejemplo VCI) o en preparaciones de subunidades recombinantes.

En la presente solicitud se hacen referencia a varios documentos. Puede encontrarse la citación completa de estos documentos al final de la especificación, inmediatamente antes de las reivindicaciones, o en el sitio dónde se cita el documento, y cada uno de estos documentos se incorpora en la presente memoria como referencia.

Antecedentes de la invención

La literatura de patentes y científica incluye diversos sistemas de vector de mamífero, tales como sistemas de vector basados en virus de mamífero y sistemas de vector basados en ADN de mamífero, y cómo preparar y utilizar estos sistemas de vector, por ejemplo mediante clonación de ADN exógeno y la expresión de las proteínas, así como los usos para estas proteínas y los usos para los productos de estas proteínas.

Por ejemplo, los poxvirus recombinantes (por ejemplo vaccinia, virus avipox) y el ADN exógeno para la expresión en este sistema de vector vírico pueden encontrarse en las patentes US nº 4.603.112, nº 4.769.330, nº 5.174.993, nº 5.505.941, nº 5.338.683, nº 5.494.807, nº 5.503.834, nº 4.722.848, nº 5.514.375, patente UK nº GB 2.269.820 B, patentes WO nº 92/22641, nº 93/03145, nº 94/16716, patente PCT nº US94/06652, y solicitud US autorizada nº de serie 08/184.009, presentada el 19 de enero de 1994. Ver generalmente Paoletti, Applications of pox virus vectors to vaccination. An Update, PNAS USA 93:11349-11353, octubre de 1996; Moss, Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety, PNAS USA 93:11341-11348, octubre de 1996, y Pincus et al., 1995.

Los sistemas de expresión baculovirus y el ADN exógeno para la expresión en los mismos, y la purificación de proteínas recombinantes de los mismos pueden encontrarse en Richardson, C.D. (editor), Methods in Molecular Biology 39, Baculovirus Expression Protocols (1995, Humana Press, Inc.) (ver, por ejemplo, capítulo 18 para la expresión de HA de virus influenza, el capítulo 19 para las técnicas de purificación de proteínas recombinantes); Smith et al., Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector, Molecular and Cellular Biology, diciembre de 1983, vol. 3, nº 12, páginas 2156-2165; Pennock et al., Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galatosidase in Infected Cells with a Baculovirus vector, Molecular and Cellular Biology, marzo de 1984, vol. 4, nº 3, páginas 399-406, documento EPA nº 0 370 573 (ensayo de la piel y kit de ensayo para el SIDA, que comenta los sistemas de expresión baculovirus que contienen parte del gen env de VIH-1, y que cita
la solicitud US nº de serie 920.197, presentada el 16 de octubre de 1986, y la publicación de patente EP nº 265785).

La patente US nº 4.769.331 se refiere a virus herpes como vector. Wandley describe la utilización de virus herpes y baculovirus felinos como vectores de vacuna para los genes Grg y Env del virus de la leucemia felina (ver también Roizman, The Function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors, PNAS USA 93:11307-11312, octubre de 1996; Andreansky et al., The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tums, PNAS USA 93:11313-11318, octubre de 1996. También son conocidos los virus de Epstein-Barr (ver Robertson et al., Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes, PNAS USA 93:11334-11340, octubre de 1996. Además, existen sistemas de vector basados en alfavirus (ver generalmente Frolov
et al, Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications, PNAS USA 93:11371-11377, octubre de 1996.

También existen sistemas de vector poliovirus y adenovirus (ver, por ejemplo, Kitson et al., J. Viral. 65:3068-3075, 1991; Grunhaus et al., 1992, Adenovirus as cloning vectors, Seminars in Virology (vol. 3), páginas 237-52, 1993; Ballay et al., EMBO Journal, vol. 4, páginas 3861-65; Graham, Tibtech 8:85-87, abril de 1990; Prevec et al., J. Gen. Virol. 70:429-434). Ver también las solicitudes US nº de serie 08/675.556 y 08/675.566, presentadas el 3 de julio de 1996 (sistema de vector adenovirus, preferentemente CAV2) y la solicitud PCT nº WO91/11525 (CAV2 modificado para contener una secuencia génica promotora dentro de la región desde el sitio SmaI cercano al extremo de la región de repetición terminal invertida, hasta el promotor para la región temprana 4 (E4).

Existen sistemas de vector ADN. Respecto a las células transfectantes con plásmido de ADN para la expresión desde el mismo, se hace referencia a Feigner et al., J. Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994. Respecto a la inyección directa de plásmido de ADN como procedimiento simple y eficaz de vacunación contra una diversidad de enfermedades infecciosas, se hace referencia a Science 259:1745-49, 1993. Ver también McClements et al., Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunityn animal models of herpes simplex virus-2 disease, PNAS USA 93:11414-11420, octubre de 1996.

En 1983, se identificó el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH1) como el agente causativo del SIDA y posteriormente se clasificó en la subfamilia de los lentivirus de la familia de los retrovirus (Hardy, 1990). Otros miembros de la subfamilia de los lentivirus son el virus de la anemia infecciosa equina (AIEV), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS) y el VIH-2. Se ha prestado mucha atención en el campo de la virología médica a la pandemia de SIDA causada por la infección por VIH. Este sistema lentivirus ha sido investigado respecto a su biología molecular, inmunobiología y patogénesis en un esfuerzo para desarrollar vacunas seguras y eficaces y terapias antivíricas. Hasta el momento, VIH, así como otros estudios de vacunas lentivíricas con diferentes tipos de vacuna han tenido un éxito variable (Heeney et al., 1994; Daniel et al., 1992; Fultz et al., 1992; Girard et al., 1991; Issel et al., 1992). Además, todavía se desconoce la relevancia de las respuestas inmunológicas específicas de VIH sobre la eficacia de las vacunas en el ser humano. De esta manera, tras muchos años, a pesar del masivo esfuerzo realizado en todo el mundo, todavía no se dispone de una vacuna eficaz de VIH1.

La infección de gatos con el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) causa una infección persistente y enfermedades inmunosupresoras como el SIDA similares a la infección por VIH. Como tal, la infección por VIF de los gatos proporciona un modelo para investigar la inmunopatogenicidad de los lentivirus y el desarrollo de vacunas (Pedersen et al., 1987; Johnson et al., 1994). De manera similar al VIH, existe heterogeneidad, de manera que existen múltiples subtipos de VIF (Sadora et al., 1994; Okada et al., 1994). En efecto, al igual que VIH, las cepas de VIF se han clasificado en cuatro subtipos (A-D) basándose en diferencias genéticas, predominantemente en las regiones codificantes de env y, en menor grado, de gag.

Beatly et al. describen un estudio longitudinal de linfocitos T específicos del virus de la inmunodeficiencia felina en gatos infectados experimentalmente mediante inducción específica de antígeno.

De esta manera, mientras que las vacunas VIF completas y las vacunas de células infectadas por VIF inactivado (VCI) han proporcionado protección contra VIF homólogo y ligeramente heterólogo (Hosie et al., 1995; Johnson et al., 1994; Yamamoto et al., 1991, 1993), estas mismas vacunas no indujeron inmunidad protectora contra cepas de VIF claramente heterólogas de otros subtipos, de manera que la inducción de inmunidad protectora contra un amplio rango de subtipos de VIF podría requerir un enfoque de vacuna modificado o diferente. Esto evidentemente plantea problemas relevantes al desarrollo de vacunas. También de indicarse que la prevalencia del VIF en la población de gatos es mayor que la del VIH en el ser humano (Verschoor et al., 1996). El desarrollo de una vacuna de VIF o de una composición inmunogénica no sólo resulta útil para proporcionar un modelo de vacuna de VIH o una composición inmunogénica, sino que, por lo tanto, resulta importante desde una perspectiva de salud veterinaria.

Más particularmente, a partir de los estudios anteriores del VIF (Hosie et al., 1995; Johnson et al., 1994; Yamamoto et al., 1991, 1993), se ha observado no sólo que los gatos con reactividad significativa específica para Env de VIF era probable que estuviesen protegidos contra la exposición a un reto homólogo. No se observó en ningún caso que los animales administrados vacuna y que no manifestaron esta respuesta estuviesen protegidos contra el reto por VIF (Johnson et al., 1994; Yamamoto et al., 1991, 1993). Conjuntamente estos resultados, junto con las observaciones hasta el momento de que las subunidades inmunogénicas no se ha podido demostrar que induzcan una respuesta inmunológica protectora en las especies diana pone de relieve varios puntos importantes relevantes para el estado de la técnica del desarrollo de vacunas de VIH y de lentivirus en general. Grouly et al. describen un ensayo de inmunización de gatos con un adenovirus de tipo 5 de replicación defectiva que expresa el gen Env del virus de la inmunodeficiencia felina. Una excepción quizás es que el sistema de virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS)/macaco, en el que determinadas preparaciones de subunidad recombinante (incluyendo los recombinantes basados en vaccinia) y las combinaciones de estas subunidades recombinantes han proporcionado protección por lo menos parcial frente a la exposición de reto por VIS (Hu, 1992; 1994; 1995). Estos datos presentan un alcance algo limitado, ya que no se ha observado protección completa frente a la infección y los estudios de reto no se llevaron a cabo con una cepa de VIS claramente heteróloga. Además, las subunidades recombinantes de un componente Env de VIS no proporcionaron ningún nivel de protección (Hu et al., 1994).

Resulta relevante al desarrollo de vacunas de VIF, que no se ha proporcionado enseñanza ni se ha sugerido ninguna vacuna candidata basada en subunidad, y no resulta evidente cómo desarrollar una vacuna basada en subunidades.

En segundo lugar, resulta necesario desarrollar un enfoque diferente, o quizás modificado, en comparación con las vacunas convencionales inactivadas, para proporcionar protección frente a las cepas heterólogas (Hosie et al., 1995; Johnson et al., 1994).

Finalmente, las respuestas inmunológicas específicas de Env en la inmunidad protectora podrían resultar importantes (Johnson et al., 1994; Yamamoto et al., 1991, 1993). En efecto, en Flynn et al., ENV-specific CTL Predominate in Cats Protected from Feline Immunodeficiency Virus Infection by Vaccination, The Journal of Immunology 157:3658-3665, 1996, en la página 3664 los autores concluyen que "las CTL específicas de Env de VIF podrían resultar más eficaces en la inmunidad protectora frente a la infección por VIF en gatos domésticos", de manera que "las estrategias de vacunación futuras deberían centrarse en inducir respuestas inmunológicas tanto humorales como mediadas por células, que sean de larga duración, que reconozcan epítopos apropiados sobre la glucoproteína de cubierta vírica, y reconozcan tejidos que es conocido que secuestran virus".

De esta manera, puede apreciarse que la provisión de una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna de subunidad de virus de la inmunodeficiencia felina que induzca una respuesta inmunológica frente a las infecciones por virus de la inmunodeficiencia felina cuando se administran en un huésped, por ejemplo una composición de seguridad mejorada, tal como recombinantes basados en NYVAC o ALVAC que contienen ADN exógeno codificante de un epítopo de VIF de interés, tal como Env, Gag o Pol de VIF, especialmente en una configuración inmunogénica, o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, Gag-VIF-proteasa, Gag-Pol, o Gag y una parte de Pol (tal como una parte de Pol que incluye proteasa) o la totalidad de Env, Gag y Pol, o una parte de Pol, en combinación, resultarían un avance altamente deseable respecto al estado actual de la tecnología. Además, la utilización de estos recombinantes o composiciones que contienen estos recombinantes en un régimen de inducción-refuerzo, por ejemplo en los que la composición recombinante se utiliza en una inmunización inicial y en una inmunización posterior, es con un VIF o VCI inactivado, u otra preparación de subunidad recombinante, resultaría un avance altamente deseable sobre el estado actual de la tecnología.

Y más generalmente, puede apreciarse de esta manera que la provisión de una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna de subunidad recombinante de lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, que induce una respuesta inmunológica contra las infecciones por lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia cuando se administran en un huésped, por ejemplo una composición de seguridad mejorada, tal como recombinantes basados en NYVAC o ALVAC que contienen ADN exógeno codificante de un epítopo de interés de lentivirus, retrovirus o de virus de inmunodeficiencia, tal como Env, Gag o Pol, especialmente en una configuración inmunogénica, o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo Gag-proteasa, Gag-Pol o Gag y una parte de Pol (tal como una parte que incluye una proteasa), la totalidad de Env, Gag y Pol, o una parte de Pol, en combinación, tal como Env, Gag-proteasa, en combinación resultaría un avance altamente deseable respecto al estado actual de la tecnología. Además, la utilización de estos recombinantes o composiciones que contienen estos recombinantes en un régimen de inducción-refuerzo, por ejemplo en los que la composición recombinante se utiliza en una inmunización inicial y una inmunización posterior es con un lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia inactivados, o VCI, u otra preparación de subunidad recombinante, tal como un virus inactivado respectivo, VCI u otra preparación de subunidad recombinante resultaría un avance altamente deseable sobre el estado actual de la tecnología ("respectivo" se refiere a que el recombinante puede ser, por ejemplo, un VIF recombinante, un VIF inactivado o una preparación de VCI de VIF).

Objetivos y sumario de la invención

Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar determinado producto o productos procedentes de lentivirus, retrovirus y/o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VIH, VIS, VAIE, VIB, VIF, virus visna, virus de la artritis carpina-encefalitis, que comprende determinado epítopo o epítopos de interés, preferentemente Env, Gag, Pol o epítopos e los mismos, con funciones accesorias o proteínas opcionales o epítopo o epítopos de interés en los mismos, por ejemplo Tat y/o Rev, más preferentemente Gag y Pol, o Env, Gag y Pol, o Gag y una parte de Pol, o Env, Gag y una parte de Pol, especialmente una parte que incluya una proteasa, y más preferentemente Gag y una proteína, o Env, Gag y una proteasa, o epítopos en los mismos, con funciones o proteínas accesorias opcionales, por ejemplo Tat y/o Rev u otras funciones/proteínas similares, o epítopos sobre las mismas.

El primer objetivo de la invención es un vector que comprende ADN exógeno que codifica por lo menos un epítopo de VIF, caracterizado porque el vector es un poxvirus del canario.

En una realización del primer objetivo de la invención, el vector se caracteriza porque el poxvirus del canario es la cepa ALVAC, o es una cepa de vacuna Rentschler obtenida mediante (a) una atenuación de una cepa de vacuna Rentschler a través de más de 200 subcultivos en serie en fibroblastos de embrión de pollo, (b) someter una semilla madre del mismo a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo ágar, y (c) amplificar un clon de placa mediante cinco subcultivos adicionales.

En una realización adicional, el vector se caracteriza porque el ADN codificante de por lo menos un epítopo de VIF codifica la totalidad o parte de (a) Gag-Pol, (b) Gag-proteasa, (c) Env, Gag-Pol, o (d) Env, Gag-proteasa.

En una tercera realización, el vector se caracteriza porque el ADN codificante de por lo menos un epítopo de VIF codifica la totalidad o parte de Gag-Pol o Gag-proteasa.

En todavía una cuarta realización, el vector se caracteriza porque el ADN codificante de por lo menos un epítopo de VIF codifica la totalidad o parte de Env, Gag-Pol o Env, Gag-proteasa.

En una quinta realización del primer objetivo de la invención, el vector es vCP242, vCP253, vCP255, o vCP329, comprendiendo dicho vector ADN exógeno codificante de por lo menos un epítopo de VIF, en el que vCP242, vCP253, vCP255 o vCP329 son recombinantes de la cepa ALVAC, en la que vCP242 comprende ADN codificante de Env, vCP253 comprende ADN codificante de Gag-proteasa, vCP255 comprende ADN codificante de Env, Gag-proteasa y en el que vCP329 comprende ADN codificante de 97TM, Gag-proteasa.

El segundo objetivo de la invención es la utilización del vector del primer objetivo de la invención o las tres primeras realizaciones de la misma en mezcla con un portador adecuado para la preparación de una composición antigénica, inmunológica o de vacuna para inducir una respuesta antigénica o inmunológica o protectora en un felino.

El tercer objetivo de la invención es la utilización del vector de la cuarta y quinta realizaciones del primer objetivo de la invención en mezcla con un portador adecuado para la preparación de una composición antigénica, inmunológica o de vacuna para inducir una respuesta antigénica o inmunológica o protectora en un felino.

El cuarto objetivo de la invención es la utilización del vector del primer objetivo de la invención o las tres primeras realizaciones de la misma para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de felinos seropositivos que necesitan terapia para estimular o reforzar su sistema inmunológico frente a una cepa homóloga o heteróloga de VIF.

El quinto a séptimo objetivos de la invención son composiciones para inducir una respuesta inmunológica que comprende: un vector del primer objetivo de la invención o las tres primeras realizaciones de la misma, un vector de la cuarta, o un vector de la quinta realización del primer objetivo de la invención, respectivamente en mezcla con un portador adecuado.

El octavo objetivo de la invención es un procedimiento para expresar un producto génico en una célula cultivada in vitro que comprende introducir en la célula un vector del primer objetivo de la invención o las primeras cinco realizaciones de la misma.

Entre las otras funciones o proteínas accesorias que pueden incluirse en el producto o productos o en el epítopo o epítopos de interés se incluyen cualquiera o la totalidad de net, vpu, vit, vpr, y vpx o el epítopo o epítopos sobre los mismos, inter alia; ver Trono, D., Cell 82:189-192, 28 de julio de 1995. Estas funciones o proteínas accesorias pueden considerarse funciones o proteínas no de cubierta, que pueden incluirse en el producto o productos o en el epítopo o epítopos de interés, por ejemplo para la inducción de una respuesta celular. Por ejemplo, para un patógeno dado lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, pueden incluirse del patógeno la función o funciones, o proteína o proteínas, o epítopo o epítopos sobre los mismos, por ejemplo, el producto o productos podrían incluir, de esta manera, Gag-Pro junto con una o más funciones o proteínas accesorias, o uno o más epítopos sobre los mismos.

Se describe determinada molécula o moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo ARN, ADN, codificantes del producto o productos, por ejemplo codificantes de determinado epítopo o epítopos de interés, tales como Gag y proteasa, o la totalidad de Env, Gag y Pol.

Se da a conocer un vector, preferentemente un sistema de vector de mamífero, que comprende la molécula o moléculas de ácidos nucleicos, y que preferentemente expresa el producto o productos en forma exógena al vector, por ejemplo un poxvirus, un baculovirus, un herpesvirus, un virus de Epstein-Barr, un alfavirus, un poliovirus, un adenovirus o un sistema de vector de ADN, así como el producto o productos obtenidos u obtenibles a partir de la expresión del vector. Se describe una composición inmunológica, inmunogénica y/o de vacuna que comprende el vector y/o el producto o productos, así como los procedimientos para preparar el producto o productos, el vector y las composiciones, o para preparar las composiciones.

Además, se dan a conocer procedimientos para utilizar el producto o productos, el vector y las composiciones, incluyendo procedimientos para obtener una respuesta inmunológica, tal como mediante regímenes de inmunización en los que el producto o productos, el vector y/o las composiciones, se administran solas o en una configuración de inducción/refuerzo con preparaciones inactivadas de lentivirus, retrovirus o de subunidad recombinante, por ejemplo en una configuración de inducción/refuerzo con una vacuna inactivada de células infectadas o una composición inmunológica o inmunogénica (VCI), tal como una VCI respectiva.

La presente invención, de esta manera, se refiere a composiciones recombinantes inmunológicas, inmunogénicas o de vacuna y a su utilidad en la inducción de una respuesta, tal como mediante la provisión de protección frente a la exposición al reto por lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia en una especie diana.

Más particularmente, la invención se refiere a un sistema de vector de mamífero para la inserción y la expresión de genes foráneos para la utilización como vehículos de inmunización segura para inducir una respuesta, tal como una respuesta inmunológica protectora frente a lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia.

Se describe un sistema de vector de mamífero, que expresa productos génicos (por ejemplo un producto génico que incluye un epítopo de interés) de un lentivirus, de un retrovirus o de un virus de inmunodeficiencia, tal como VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, siendo preferente en la actualidad el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), así como composiciones inmunogénicas y/o inmunológicas y/o de vacuna que inducen una respuesta inmunológica y/o protectora frente a un lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, tal como la exposición a VAIE, VI, VIB, VIH o VIS, cuando se administran a un huésped diana, por ejemplo VIF y un felino, tal como un gato domesticado o un gato joven.

En un aspecto, se da a conocer un vector de mamífero (por ejemplo poxvirus, baculovirus, herpesvirus, virus Epstein-Barr, alfavirus, poliovirus, adenovirus o sistema de vector de ADN, preferentemente un poxvirus) que expresa un epítopo de interés de lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, preferentemente VIS, y el epítopo de interés preferentemente es GAg/proteasa. El vector resulta útil en la protección de la especie diana (por ejemplo un felino) frente a una exposición a un reto altamente homólogo, y por consiguiente, se da a conocer una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna que comprende el vector y opcionalmente un portador o diluyente aceptable.

En otro aspecto, se da a conocer un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica, preferentemente una respuesta protectora que comprende administrar el vector o composición que comprende el vector a un huésped. El procedimiento puede ser un régimen de inmunización, por ejemplo inducir con el vector o composición que comprende el vector (y expresar los productos génicos epítopo o epítopos de interés de lentivirus, de retrovirus o de virus de inmunodeficiencia (por ejemplo VIF)) y reforzar con una preparación de subunidad recombinante de lentivirus, de retrovirus o de virus de inmunodeficiencia (por ejemplo uno o más epítopos de VIF de interés procedentes del aislamiento desde un recombinante que contiene una o más moléculas de ácidos nucleicos exógenos codificantes de los mismos) para inducir una respuesta inmunológica, tal como proporcionar protección al huésped (por ejemplo gatos) contra aislados de lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia homólogos o heterólogos.

Se describen composiciones antigénicas, de vacuna o inmunológicas adicionales de poxvirus recombinante que presentan un nivel incrementado de seguridad en comparación con las vacunas de poxvirus recombinante conocidas, así como un vector modificado para expresar un producto génico en un huésped, en el que el vector se modifica de manera que presenta una virulencia atenuada en el huésped. Además, se da a conocer un procedimiento para expresar un producto génico en una célula cultivada in vitro utilizando un virus recombinante modificado o un vector modificado que presenta un nivel incrementado de seguridad.

En un aspecto adicional, se da a conocer un vector, preferentemente un virus recombinante modificado que presenta funciones genéticas codificadas en virus inactivado, de manera que el virus recombinante presenta una virulencia atenuada y una mayor seguridad. Las funciones pueden ser no esenciales, o asociadas a la virulencia (por ejemplo esenciales). El virus ventajosamente es un poxvirus, particularmente un virus vaccinia o un virus avipox, tal como un poxvirus aviar y un poxvirus del canario. El vector, que preferentemente es un virus recombinante modificado, puede incluir, en una región esencial o no esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heterólogo que codifica un antígeno o un epítopo derivado de un lentivirus, de un retrovirus o de un virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, preferentemente el virus de la inmunodeficiencia felina, tal como, por ejemplo, Env, Gag, Pol, funciones accesorias (por ejemplo Tat, Rev), o cualquier combinación de los mismos, tal como Gag-Pol o Env, Gag y Pol o Gag y una parte de Pol o Env, Gag y una parte de Pol, tal como una parte de Pol que incluye una proteasa, o Gag-proteasa o Env, Gag y una proteasa.

En otro aspecto, se da a conocer una composición antigénica, inmunológica, inmunogénica o de vacuna, o una composición terapéutica para inducir una respuesta antigénica o inmunológica o protectora en un animal huésped, tal como un felino, por ejemplo un gato doméstico o un gato joven, inoculada con la composición; la composición puede incluir un portador y un vector de la invención que preferentemente es un virus recombinante modificado que presenta funciones genéticas no esenciales codificadas en el virus inactivado, de manera que el virus recombinante presenta una virulencia atenuada y una mayor seguridad; o el producto de expresión de este vector o de un virus recombinante modificado. El virus utilizado en la composición (o para expresar un producto para la utilización en una composición) ventajosamente es un poxvirus, particularmente un virus vaccinia o un virus avipox, tal como un poxvirus aviar y un poxvirus del canario. El virus recombinante modificado puede incluir, dentro de una región esencial o no esencial del genoma del virus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, una secuencia heteróloga de ADN que codifica una proteína antigénica, por ejemplo un epítopo de interés derivado de un lentivirus, de un retrovirus o de un virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, preferentemente del virus de la inmunodeficiencia felina, tal como un antígeno, por ejemplo Env, Gag, proteasa, o cualquier combinación de los mismos, tal como Gag-proteasa, o Env, Gag y proteasa.

En todavía otro aspecto, se da a conocer un procedimiento para inducir una respuesta antigénica, inmunológica, inmunogénica, de vacuna (protectora) y/o terapéutica en un animal huésped, tal como un felino, por ejemplo un gato domesticado o gato joven, por ejemplo un animal huésped que necesita de dicha respuesta, que comprende administrar una cantidad de la composición anteriormente indicada eficaz para obtener la respuesta, sea sola o como parte de un régimen de inducción-refuerzo (por ejemplo mediante la administración de la composición, o administrando cualquiera o ambos de entre lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia inactivados, o VCI o VWI antes o después de administrar la composición).

En un aspecto adicional, se describe un procedimiento para expresar un producto génico en una célula in vitro mediante la introducción en la célula de un vector de la invención, tal como un virus recombinante modificado que presenta una virulencia atenuada y una seguridad incrementada. El vector o virus recombinante modificado puede incluir, dentro de una región no esencial o esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heterólogo que codifica un epítopo de interés, tal como una proteína antigénica, por ejemplo derivada de un retrovirus, lentivirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, preferentemente el virus de la inmunodeficiencia felina, tal como, por ejemplo, Env, Gag, Pol, funciones accesorias (por ejemplo Tat, Rev) o cualquier combinación de los mismos, tal como Gag-Pol, o Env, Gag y Pol, o Gag y una parte de Pol, o Env, Gag o una parte de Pol, en los que la parte puede incluir una proteasa, o Gag-proteasa, o Env, Gag, proteasa. El producto génico puede recolectarse de las células, o las células seguidamente pueden reinfusionarse directamente en el animal o utilizarse para amplificar reactividades específicas para la reinfusión (terapia ex vivo).

De esta manera, en un aspecto adicional específico, se da a conocer un procedimiento para expresar un producto génico en una célula cultivada in vitro mediante la introducción en la célula de un vector, o preferentemente de un virus recombinante modificada, que presenta una virulencia atenuada y una mayor seguridad. El vector o virus recombinante modificado puede incluir, dentro de una región esencial o no esencial del genoma del virus, una secuencia heteróloga de ADN que codifica un epítopo de interés o una proteína antigénica, por ejemplo derivada de un lentivirus, de un retrovirus o de un virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, preferentemente el virus de la inmunodeficiencia felina, tal como, por ejemplo, Env, Gag, Pol, funciones accesorias (por ejemplo Tat, Rev), o cualquier combinación de los mismos, tal como Gag-Pol o Env, Gag y Pol, o Gag y una parte de Pol, o Env, Gag y una parte de Pol, en las que la parte puede incluir una proteasa, o Gag-proteasa o Env, Gag, proteasa. A continuación, el producto puede administrarse al huésped para estimular una respuesta.

Pueden cultivarse anticuerpos con composiciones que incluyen los vectores o recombinantes o productos de expresión de los vectores o recombinantes. Los anticuerpos cultivados pueden resultar útiles en un huésped para la prevención o el tratamiento de un lentivirus, de un retrovirus o de un virus de inmunodeficiencia, tal como el virus de la inmunodeficiencia felino. Los anticuerpos o los productos de expresión de los vectores o recombinantes de la invención pueden utilizarse en kits, ensayos o pruebas diagnósticos para determinar la presencia o ausencia en una muestra, tal como un suero, de lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo del virus de la inmunodeficiencia felina, o de antígenos de los mismos o de anticuerpos contra los mismos, o de recombinantes de la presente invención.

En todavía un aspecto adicional, se da a conocer un virus recombinante modificado que presenta funciones genéticas codificadas en el virus no esenciales o esenciales inactivadas en el mismo, de manera que el virus presenta una virulencia atenuada, y en el que el virus recombinante modificado contiene además ADN procedente de una fuente heteróloga en una región esencial o no esencial del genoma del virus. El ADN puede codificar un antígeno o epítopo de interés de un lentivirus, de un retrovirus o de un virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, preferentemente del virus de la inmunodeficiencia felina, por ejemplo Env, Gag, Pol, funciones accesorias, o cualquier combinación de los mismos, tal como Gag-Pol o Env, Gag y Pol, o Gag y una parte de Pol o Env, Gag y una parte de Pol, en el que la parte de Pol puede incluir una proteasa, o Gag-Proteasa o Env, Gag, proteasa. En particular, las funciones genéticas se inactivan mediante deleción o rompiendo un marco de lectura abierto codificante de un factor de virulencia, por ejemplo una región esencial, o mediante la utilización de virus de huésped naturalmente restringido, especialmente virus de huésped naturalmente restringido que manifiesten una virulencia atenuada tras su subcultivo en serie y/o purificación en placa (con o sin subcultivos posteriores). El virus utilizado ventajosamente es un poxvirus, particularmente un virus vaccinia o un virus avipox, tal como un poxvirus aviar y un poxvirus del canario.

Ventajosamente, el marco de lectura abierto se selecciona de entre el grupo que consiste J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L - K1L e I4L (según la terminología informada en Goebel et al., 1990a, b); cualquier combinación de los mismos y, preferentemente, la combinación de todos ellos. A este respecto, el marco de lectura abierto comprende un gen de timidina quinasa, una región hemorrágica, una región de cuerpo de inclusión de tipo A, un gen de hemaglutinina, una región génica de rango de huésped o una subunidad grande, ribonucleótido reductasa; o, cualquier combinación de los mismos, y preferentemente la combinación de todos ellos. La cepa Copenhagen modificada del virus vaccinia se identifica como NYVAC (Tartaglia et al., 1992). NYVAC y las variaciones de NYVAC presentan deleciones de regiones esenciales o interrupciones en las mismas, y para una publicación posterior a Tartaglia et al., 1992, que al igual que Tartaglia et al, 1992, se refiere a la deleción de regiones esenciales del virus vaccinia (y por lo tanto se refiere a NYVAC, variaciones de NYVAC, o virus enseñados o evidentes a partir de virus, de Tartaglia et al., 1991, tales como NYVAC y variaciones de NYVAC), por ejemplo NYVAC.1, NYVAC.2, se hace referencia a la patente PCT nº WO 95/30018. Con respecto a NYVAC y a variaciones de NYVAC, también se hace referencia a las patentes US nº 5.364.773 y nº 5.494.807. Sin embargo, pueden utilizarse otras cepas de virus vaccinia, tales como la cepa COPAX.

El vector puede ser un poxvirus del canario atenuado, tal como un poxvirus del canario que no sea una población mixta. Por ejemplo, una cepa de vacuna de Rentschler atenuada a través de más de 200 subcultivos en serie en fibroblastos de embrión de pollo, una semilla madre de los mismos se sometió a cuatro purificaciones sucesivas de placa bajo ágar, de los que se amplificó un clon de placa a través de cinco subcultivos adicionales. Este poxvirus de canario se denomina ALVAC.

Los resultados de los digeridos de restricción de una placa derivada de Kanapox son los siguientes: ADN genómico aislado de los aislados de placa números 1, 4 y 5 clonados a partir del poxvirus del canario (Kanapox). El ADN de estas placas y del poxvirus del canario no clonado se digirió con los enzimas de restricción HindIII, BamHI y EcoRI y se corrieron en un gel de agarosa al 0,8%. El gel se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió bajo luz UV (ver la figura 1). Los carriles se etiquetaron como v = poxvirus del canario no clonado, 1 = placa 1, 4 = placa 4, y 5 = placa 4. Se corrió un marcador de peso molecular 1 kb en el carril del extremo izquierdo. Los perfiles de restricción mostraban diferencias claras entre los diversos aislados de placa. La placa 1 se seleccionó como ALVAC (CP_{pp}).

En los patrones de restricción del poxvirus del canario no clonado (carriles = v), pueden observarse varias bandas submolares. Sin embargo, al clonarlas en placas, estas bandas submolares (carriles etiquetados como 1, 4 y 5) se convirtieron en especies molares en por lo menos algunos de los aislados clonados en placa. Esto indica que el poxvirus del canario no clonado (Kanapox) representa una mezcla de variantes genómicas que difieren en los perfiles de restricción.

De esta manera, ALVAC es diferente, presenta propiedades únicas y es superior a Kanapox, y por lo tanto, ALVAC es un vector preferente en la práctica de la invención. En particular, la cepa Rentschler del poxvirus del canario (Kanapox), de análisis de restricción, representan una mezcla de variantes víricas; es decir, Kanapox, del que se derivó ALVAC, era una población mixta. Presenta precedentes que una preparación de vacuna, tal como Kanapox, contenga múltiples variantes. ALVAC no es una población mixta. Como tal, ALVAC presenta varias propiedades únicas que no son compartidas por Kanapox; por ejemplo:

ALVAC presenta un fondo genético uniforme. Esta propiedad proporciona consistencia a ALVAC; la característica única de resultar útil para preparar vacunas basadas en vectores. La consistencia resulta útil para el control de calidad y por consideraciones legales. Esta propiedad de consistencia de ALVAC proporciona a ALVAC la capacidad de pasar controles de calidad y consideraciones legales, es decir, de ser útil en el desarrollo de vacunas basadas en vectores con propiedades genéticas teóricas.

La consistencia biológica se controla utilizando ALVAC para derivar recombinantes. Kanapox no proporciona consistencia biológica. En efecto, Kanapox no puede proporcionar consistentemente un producto recombinante eficaz. La consistencia biológica y un producto recombinante consistentemente eficaz resultan útiles, por ejemplo, para un perfil biológico consistente con respecto a la virulencia, con respecto a las interacciones virus/huésped, y finalmente para la utilización como vehículo de inmunización. ALVAC consigue presentar consistencia biológica y productos recombinantes consistentemente eficaces. Cuando se utiliza Kanapox para derivar recombinantes, no existe control sobre el trasfondo vírico en el que se inserte el gen foráneo y, por lo tanto, las propiedades del recombinante resultante siguen siendo cuestionables (ver estudios con virus vaccinia que ilustran que no todos los trasfondos genéticos de vaccinia son equivalentes como vehículos de inmunización). ALVAC proporciona certidumbre con respecto a su trasfondo vírico, sus propiedades relacionadas con la virulencia, y su funcionamiento como vehículo de inmunización.

Aunque la presente invención principalmente se ha descrito utilizando un vector poxvirus del canario basado en ALVAC, debe entenderse que también se da a conocer la expresión de productos génicos específicos de lentivirus, de retrovirus o de virus de inmunodeficiencia, y su utilidad para proporcionar una respuesta inmunológica, tal como una respuesta inmunológica protectora. Por lo tanto, también se dan a conocer sistemas alternativos de vector de mamífero. Entre los ejemplos de estos sistemas de vector se incluyen otros poxvirus, adenovirus, virus herpes, sistemas basados en alfavirus, sistemas de expresión bacteriano, y formulaciones de inmunógeno basadas en ADN.

Aunque la presente invención se ha descrito principalmente utilizando el lentivirus VIF, debe entenderse que también se da a conocer la expresión de homólogos funcionales de los productos génicos de VIF de otros sistemas víricos de lentivirus, de retrovirus y de virus de inmunodeficiencia, por ejemplo Env, Gag/proteasa (es decir, Env, Gag y Pol o una parte de Pol, o Gag y Pol, o una pare de Pol, en la que la parte de Pol puede incluir proteasa (sin Env), o Env, Gag, proteasa o Gag-proteasa (sin Env) o Env, Gag, Pol, o una parte de Pol y funciones accesorias (por ejemplo Tat, Rev) o Gag, Pol o una parte de Pol en la que la parte de Pol puede incluir proteasa y funciones accesorias (sin Env), o Env, Gag, proteasa y funciones accesorias, o Gag-proteasa y funciones accesorias (sin Env), de VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, inter alia. Por lo tanto, también se dan a conocer otros sistemas de lentivirus, incluyendo los virus 1 y 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2), el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB), el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), así como otros lentivirus de mamífero.

Ésta y otras realizaciones se dan a conocer o resultan evidentes a partir de la descripción detallada siguiente y se encuentran comprendidas en la misma.

Depósitos

Los siguientes han depositado en la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest.

Material	Número de	Fecha de depósito
	acceso
ALVAC	VR-2547	14-NOV-1996
Plásmido MM 138 (pMM138) (que contiene gag/pro de cubierta de VIF)	97795	14-NOV-1996
Plásmido MM 129 (pMM129) (que contiene cubierta de gag/pro de VIF)	97796	14-NOV-1996

De esta manera, la invención comprende moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo producto o productos codificantes que presentan secuencias tal como en el Material Depositado, así como moléculas de ácidos nucleicos que presentan homología sustancial con las mismas (por ejemplo una homología de por lo menos el 85%).

Breve descripción de los dibujos

La descripción detallada siguiente, proporcionada a título de ejemplo, pero que no pretende limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos, que se incorporan en la presente memoria como referencia, en los que:

la fig. 1 muestra los resultados de la purificación en placa de Kanapox, tal como se ha descrito anteriormente;

la fig. 2 muestra la secuencia de nucleótidos de env de VIF de Rone Merieux (SEC ID nº 1) (el codón de inicio de env de VIF se encuentra en la posición 1 y el codón de parada se encuentra en la posición 2.569. El plásmido ptg6184, que contiene la secuencia codificante de env de VIF era de Rhone Merieux (Lyon, Francia). La secuencia codificante de env de VIF en ptg6184 se secuenció y se observaron las diferencias siguientes respecto a la secuencia posteriormente: posición 1218, T es G en ptg6184, cambiando phe a leu; posición 1220, G a A, cambiando gly a glu; y la posición 2201, C a A, cambia ala por glu;

la fig. 3 muestra la secuencia de nucleótidos de las secuencias codificantes gag/pol de VIF de Rhone Merieux (SEC ID nº 2) (el codón de inicio de gag se encuentra en la posición 1 y el codón de parada de gag se encuentra en la posición 1414. El desplazamiento de marco ribosómico se encuentra cerca de la posición 1255. El desplazamiento de marco es -1 en relación al marco de lectura abierto de gag. El desplazamiento de marco entre en el marco de lectura abierto de pol. El codón de parada de pol se encuentra en la posición 4614. El plásmido ptg8133 de Rhone Merieux contiene las secuencias codificantes gag/pol de VIF. Parte de ptg8133 ha sido secuenciado y CG en las posiciones 577-578 posteriormente es GC en ptg8133, cambiando el codón de arg a ala);

la fig. 4 muestra la secuencia de nucleótidos de ALVAC comprendida en el plásmido donante de C6, pC6L (SEC ID nº 3) (el plásmido pC6L contiene los sitios de inserción de C6 SmaI (posición 409) y EcoRI (posición 425));

la fig. 5 muestra la secuencia nucleótida teórica de la inserción vCP242 (SEC ID nº 4) (el promotor H6 se inicia en la posición 55. El codón de inicio de env de VIF se encuentra en la posición 179, y el codón de parada de env de VIF se encuentra en la posición 2749). Las posiciones 1 a 54, y las posiciones 2750 a 2879 flanquean el casete de expresión de env H6/VIF);

la fig. 6 muestra la secuencia de nucleótidos teórica del casete de expresión de gag de VIF promovido por I3L/proteasa y regiones flanqueantes en vCP253 (SEC ID nº 5) (el promotor I3L se inicia en la posición 135. El codón de parada de gag se encuentra en la posición 235 y el codón de parada de la proteasa se encuentra en la posición 1648);

la fig. 7 muestra la secuencia de nucleótidos teórica del casete de expresión env de VIF promovido por H6/gag de VIF promovido por I3L/proteasa, y regiones flanqueantes en vCP255 (SEC ID nº 6) (el promotor H6 se inicia en la posición 129, el codón de parada de env de VIF se encuentra en la posición 253, y el codón de parada de env de VIF se encuentra en la posición 2823. El promotor I3L se inicia en la posición 2830, el codón de parada de gag de VIF se encuentra en la posición 2930, y el codón de parada de gag de VIF se encuentra en la posición 4282. El sitio de desplazamiento de marco ribosómico se encuentra cerca de la posición 4184. El desplazamiento de marco es de -1 en relación al marco de lectura abierto de gag. El desplazamiento de marco entra en el marco de lectura abierto de pol. El codón de parada para el gen de proteasa se encuentra en la posición 4641. Las posiciones 1 a 128 y las posiciones 4642 a 4727 flanquean el casete de expresión env de H6 VIF/gag de I3L VIF/proteasa);

y la fig. 8 muestra la secuencia de nucleótidos teórica de la inserción vCP329 (SEC ID nº 7) (el promotor H6 se inicia en la posición 2146. La secuencia codificante para 97TM de VIF abarca desde la posición 2022 hasta la posición 42. El promotor I3L se inicia en la posición 2253. El codón de inicio de gag de VIF se encuentra en la posición 2353 y el codón de parada de pol se encuentra en la posición 3766).

Descripción detallada de la invención

Tal como se ha comentado anteriormente, se dan a conocer: lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia basado en un vector, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, preferentemente el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) recombinante, preferentemente recombinantes que contiene ADN.

En otro aspecto de la invención, el vector es cCP242, vCP253, vCP255 o vCP329, en los que vCP242, vCP253, vCP255 o vCP329 son recombinantes de la cepa ALVAC, en la que vCP242 comprende ADN codificante de Env, vCP253 comprende ADN codificante de Gag-proteasa, vCP255 comprende ADN codificante de Env, Gag-proteasa, y en el que vCP329 comprende ADN codificante de 97TM, Gag-proteasa.

De esta manera, de una manera general, la invención proporciona un vector que comprende ADN exógeno codificante de por lo menos un epítopo de lentivirus. El epítopo puede ser de un lentivirus que no sea VIS. Más preferentemente, el epítopo es de Gag y Pol o Env, Gag y Pol, o Env, Gag y una parte de Pol o Gag y una parte de Pol o Gag-proteasa, o Env, Gag y proteasa, y más preferentemente, el epítopo es Gag y proteasa, o uno o más epítopos sobre Gag y proteasa que inducen una respuesta que es igual o similar a Gag y proteasa. Y el vector preferentemente induce una respuesta inmunológica, más preferentemente una respuesta inmunológica protectora, cuando se administra a una especie diana (una especie diana es un huésped susceptible al lentivirus; por ejemplo, felinos tales como los gatos domesticados y los gatos jóvenes son una especie diana con respecto a VIF).

Los procedimientos para preparar un vector o recombinante pueden ser iguales o análogos a los procedimientos dados a conocer en las patentes US nº 4.603.112, nº 4.769.330, nº 5.174.993, nº 5.505.941, nº 5.338.683, nº 5.494.807, nº 5.503.834, nº 4.722,848, nº 5.514.375, patente UK nº GB 2.269.820 B, patentes WO nº 92/22641, nº 93/03145, nº 94/16716, la patente PCT nº US94/06652, solicitud US autorizada nº de serie 08/184.009, presentada el 19 de enero de 1994, Paoletti, Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, PNAS USA 93:11349-11353, octubre de 1993; Moss, Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety, PNAS USA 93:11341-11348, octubre de 1996, Richardson, C.D. (editor), Methods in Molecular Biology 39, Baculovirus Expression Protocols (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector, Molecular and Cellular Biology, diciembre de 1983, vol. 3, nº 12, páginas 2156-2165; Pennock et al., Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infected Cells with a Baculovirus Vector, Molecular and Cellular Biology, marzo de 1984, vol. 4, nº 3, páginas 399-406; patente EP nº A-0.370.573, solicitud de patente US nº de serie 920.197, presentada el 16 de octubre de 1986, publicación de patente EP nº 265785, patente US nº 4.769.331; Roizman, The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors, PNAS USA 93:11313-11318, octubre de 1996; Robertson et al., Alphavirus-based expression vectors: STrategies and applications, PNAS USA 93:11371-11377, octubre de 1996; Kitson et al., J. Virol. 6:3068-3075, 1991; Grunhaus et al., 1991, Adenovirus as cloning vectors, Seminars in Virology (vol. 3), páginas 237-52, 1993; Ballay et al., EMBO Journal, vol. 4, páginas 3861-65; Graham, Tibtech 8:85-87, abril de 1990; Prevec et al., J. Gen. Virol. 70:429-434, solicitudes de patentes US nº de serie 08/675.556 y nº 08/675.566, presentada el 3 de julio de 1996, patente PCT nº WO91/11525; Feigner et al., J. Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994; Science 259:1745-49, 1993, y McClements et al., Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease, PNAS USA 93:11414-11420, octubre de 1996.

El virus vaccinia, y más recientemente otros poxvirus, se han utilizado para la inserción y la expresión de genes foráneos. Una técnica básica para insertar genes foráneos en poxvirus vivos infecciosos implica la recombinación entre secuencias de ADN de poxvirus flanqueantes de un elemento genético foráneo en un plásmido donante, y secuencias homólogas presentes en el poxvirus rescatante (Piccini et al., 1987).

Específicamente, pueden construirse poxvirus recombinantes en dos etapas conocidas de la técnica y análogas a los procedimientos para crear recombinantes sintéticos de poxvirus, tales como el virus vaccinia y el virus avipox descritos en las patentes US nº 4.769.330, nº 4.772.848, nº 4.603.112, nº 5.110.587, nº 5.179.993, nº 5.505.941, y nº 5.494.807.

En primer lugar, la secuencia génica de ADN a insertar en el virus, por ejemplo un marco de lectura abierto procedente de una fuente no poxvirus, se introduce en un constructo plásmido, tal como un constructo de plásmido de E. coli en el que se ha insertado ADN homólogo a una sección de ADN del poxvirus. De manera separada, la secuencia génica de ADN a insertar puede ligarse a un promotor. El ligamiento promotor-gen se posiciona en el constructo de plásmido de manera que el ligamiento de promotor-gen se encuentre flanqueado en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN flanqueante a una región de ADN de poxvirus; por ejemplo, de ADN de poxvirus que contiene un locus no esencial (aunque también puede utilizarse un locus esencial). El constructo plásmido resultante seguidamente se amplifica, por ejemplo mediante crecimiento dentro de bacterias de E. coli (Clewell, 1972) y se aísla (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1982). Alternativamente, la secuencia génica de ADN puede, sin ligación separada a un promotor, introducirse simplemente dentro del constructo plásmido de manera que la secuencia génica de ADN se encuentre flanqueada en ambos extremos por ADN homólogo a una secuencia de ADN flanqueante a una región de ADN de poxvirus; por ejemplo, una región situada más abajo de un promotor endógeno, de manera que la expresión de la secuencia génica se encuentre bajo el control del promotor, y el promotor y la parte codificante de la secuencia génica de ADN sean, de esta manera, contiguos.

En segundo lugar, el plásmido aislado que contiene la secuencia génica de ADN a insertar se transfecta en un cultivo celular, por ejemplo en fibroblastos de embrión de pollo, junto con el poxvirus. La recombinación entre el ADN homólogo de poxvirus en el plásmido y el genoma vírico, respectivamente, proporciona un poxvirus modificado por la presencia, por ejemplo en una región no esencial de su genoma, de secuencias de ADN foráneo. El término "foráneo" referido al ADN designa ADN exógeno, particularmente ADN procedente de una fuente no poxvirus, que codifica productos génicos no producidos habitualmente por el genoma en el que se introduce el ADN exógeno.

Sin embargo, lo anteriormente expuesto no pretende limitar los medios para obtener vectores o recombinantes, debido a que puede utilizarse cualquier medio para obtener un vector o recombinante, por ejemplo un recombinante poxvirus-lentivirus, retrovirus y/o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo virus de la inmunodeficiencia felina.

De esta manera, la recombinación genética es, en general, el intercambio de secciones homólogas de ADN entre dos cadenas de ADN. En determinados virus, el ARN puede sustituir el ADN. Las secciones homólogas de ácidos nucleicos son secciones de ácidos nucleicos (ARN o ADN) que presentan la misma secuencia de bases de nucleótidos.

La recombinación genética puede tener lugar naturalmente durante la replicación o preparación de nuevos genomas víricos dentro de la célula huésped infectada. De esta manera, la recombinación genética entre genes víricos puede producirse durante el ciclo de replicación vírica que tiene lugar en una célula huésped que se encuentra coinfectada por dos o más virus diferentes o por otros constructos genéticos. Una sección de ADN de un primer genoma se utiliza intercambiablemente en la construcción de la sección del genoma de un segundo virus coinfectivo en el que el ADN es homólogo con el del primer genoma vírico.

Sin embargo, la recombinación también puede tener lugar entre secciones de ADN en diferentes genomas que no son perfectamente homólogos. Si una de esta secciones es de un primer genoma homólogo a una sección de otro genoma excepto por la presencia dentro de la primera sección de, por ejemplo, un marcador genético o de un gen codificante de un determinante antigénico insertado en una parte del ADN homólogo, la recombinación todavía puede tener lugar y los productos de esta recombinación entonces resultan detectables por la presencia del marcador genético o gen en el genoma vírico recombinante. Por consiguiente, recientemente se ha informado de estrategias adicionales para generar poxvirus recombinantes, tales como virus vaccinia recombinante, y estas estrategias pueden utilizarse en la práctica de la presente invención.

La expresión con éxito de la secuencia genética de ADN insertada mediante el virus infeccioso modificado puede producirse bajo dos condiciones. En primer lugar, la inserción puede ser en una región no esencial del virus con el fin de que el virus modificado siga siendo viable, o en una región esencial de manera que la función esencial no resulte afectada o que la función no resulte necesaria para la viabilidad bajo todas las condiciones. Una segunda condición para la expresión del ADN insertado es la presencia de un promotor en la relación correcta con el ADN insertado. El promotor puede situarse más arriba de la parte codificante de la secuencia ADN a expresar.

Se ha utilizado con éxito el virus vaccinia para inmunizar contra la viruela, culminando en la erradicación mundial de la viruela en 1980. En el curso de su historia, han surgido muchas cepas de vaccinia. Estas diferentes cepas demuestran una inmunogenicidad variable y se encuentran implicadas en grados variables en potenciales complicaciones, las más serias de las cuales son la encefalitis post-vaccinial y la vaccinia generalizada (Behbehani, 1983).

Con la erradicación de la viruela, el virus vaccinia adquirió un nuevo e importante papel, el de un vector de ingeniería genética para la expresión de genes foráneos. Los genes codificantes de un amplio número de antígenos heterólogos se han expresado en el virus vaccinia, resultando con frecuencia en inmunidad protectora frente al reto por el patógeno correspondiente (revisado en Tartaglia et al., 1990a).

El trasfondo genético del vector vaccinia se ha demostrado que afecta a la eficacia protectora del inmunógeno foráneo expresado. Por ejemplo, la expresión del virus Epstein Barr (VEB) gp340 en la cepa de vacuna Wyeth del virus vaccinia no protegió a los monos tití cabeza blanca frente al linfoma inducido por virus VEB, mientras que la expresión del mismo gen en la cepa de laboratorio WR del virus vaccinia sí resultó protector (Morgan et al., 1988).

Resulta extremadamente importante alcanzar un equilibrio fino entre la eficacia y la seguridad de un candidato a vacuna recombinante basada en virus vaccinia. El virus recombinante debe presentar el inmunógeno o inmunógenos de una manera que induzca una respuesta inmunológica protectora en el animal vacunado pero que carezca de cualquier propiedad patogénica significativa. Por lo tanto, la atenuación de la cepa vector resultaría un avance altamente deseable sobre el estado actual de la tecnología.

Se han identificado varios genes de vaccinia que son no esenciales para el crecimiento del virus en cultivo de tejido, y cuya deleción o inactivación reduce la virulencia en una diversidad de sistemas animales.

El gen codificante de la timidina quinasa (TK) del virus vaccinia ha sido mapado (Hruby et al., 1982) y secuenciado (Hruby et al., 1983; Weir et al., 1983). La inactivación o deleción completa del gen de la timidina quinasa no evita el crecimiento del virus vaccinia en una amplia diversidad de células en cultivo de tejido. El virus vaccinia TK^{-} también es capaz de replicarse in vivo en el sitio de inoculación en una diversidad de huéspedes a través de una diversidad de vías.

Se ha demostrado para el virus herpes simplex de tipo 2 que la inoculación intravaginal de cobayas con el virus vaccinia TK^{-} resultaba en títulos de virus significativamente menores en la médula espinal que la inoculación con virus TK^{+} (Stanberry et al., 1985). Se ha demostrado que la actividad de TK codificada por virus herpes no resulta importante para el crecimiento del virus en células en metabolismo activo, pero resulta necesaria para el crecimiento vírico en células quiescentes (Jamieson et al., 1974).

Se ha demostrado la atenuación de vaccinia TK- en ratones inoculados por las vías intracerebral e intraperitoneal (Buller et al., 1985). Se observó atenuación tanto para la cepa de laboratorio WR neurovirulenta como para la cepa de vacuna Wyeth. En ratones inoculados por la vía intradérmica, el virus vaccinia recombinante TK^{-} generó anticuerpos neutralizadores anti-vaccinia equivalentes en comparación con el virus vaccinia TK^{+} parental, indicando que en este sistema experimental, la pérdida de la función de TK no reduce significativamente la inmunogenicidad del vector virus vaccinia. Tras la inoculación intranasal de ratones con virus vaccinia recombinantes TK^{-} y TK^{+} (cepa WR), se observó una diseminación significativamente inferior de virus a otros sitios, incluyendo el cerebro (Taylor et al., 1991a).

Otro enzima implicado en el metabolismo de los nucleótidos es la ribonucleótido reductasa. La pérdida de actividad de ribonucleótido reductasa codificada víricamente en el virus herpes simplex (VHS) mediante deleción del gen codificante de la subunidad grande se demostró que no presentaba ningún efecto sobre el crecimiento vírico y la síntesis de ADN en las células en división in vitro, pero comprometió severamente la capacidad del virus de crecer en células privadas de suero (Goldstein et al., 1988). Mediante la utilización de un modelo de ratón para la infección aguda por VSH del ojo y de infección latente reactivable en los ganglios trigéminos, se demostró un nivel de virulencia reducido para VSH con deleción de la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa, en comparación con la virulencia mostrada por el VSH de tipo salvaje (Jacobson et al., 1989).

La subunidad tanto pequeña (Slabaugh et al., 1988) como grande (Schmidt et al., 1988) de la ribonucleótido reductasa han sido identificadas en el virus vaccinia. La inactivación por inserción de la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa en la cepa WR del virus vaccinia conduce a la atenuación del virus según se midió mediante inoculación intracraneal de ratones (Child et al., 1990).

El gen de la hemaglutinina (HA) del virus vaccinia ha sido mapado y secuenciado (Shida, 1986). El gen HA del virus vaccinia es no esencial para el crecimiento en cultivo de tejido (Ichihashi et al., 1971). La inactivación del gen HA del virus vaccinia resulta en la reducción de la neurovirulencia en conejos inoculados por la vía intracraneal y lesiones más pequeñas en conejos en el sitio de inoculación intradérmica (Shida et al., 1988). El locus HA se utilizó para la inserción de genes foráneos en la cepa WR (Shida et al., 1987), en derivados de la cepa Lister (Shida et al., 1988) y en la cepa Copenhagen (Guo et al., 1989) del virus vaccinia. Se ha demostrado que el virus vaccinia HA- recombinante que expresa genes foráneos es inmunogénico (Guo et al., 1989; Itamura et al., 1990; Shida et al., 1988; Shida et al., 1987) y protector frente al reto por el patógeno relevante (Guo et al., 1989; Shida et al., 1987).

El virus cowpox (cepa roja de Brighton) produce pústulas rojas (hemorrágicos) en la membrana corialantoica de los huevos de pollo. Las deleciones espontáneas dentro del genoma del virus cowpox generan mutantes que producen pústulas blancas (Pickup et al., 1984). La función hemorrágica (u) se localiza en una proteína de 38 kDa codificada por un gen temprano (Pickup et al., 1986). Este gen, que presenta homología con los inhibidores de serina proteasa, se ha demostrado que inhibe la respuesta inflamatoria del huésped frente al virus cowpox (Palumbo et al., 1989) y es un inhibidor de la coagulación sanguínea.

El gen u se encuentra presente en la cepa WR del virus vaccinia (Kotwal et al., 1989b). Los ratones inoculados con un recombinante de virus vaccinia WR en el que se ha inactivado la región u mediante inserción de un gen foráneo producen niveles de anticuerpo más altos contra el producto génico foráneo, en comparación con los ratones inoculados con un virus vaccinia recombinante similar en el que el gen u se encuentra intacto (Zhou et al., 1990). La región u se encuentra presente en una forma defectiva no funcional en la cepa Copenhagen del virus vaccinia (marcos de lectura abiertos B13 y B14 siguiendo la terminología informada en Goebel et al., 1990a,b).

El virus cowpox puede localizarse en células infectadas en cuerpos de inclusión citoplasmáticos de tipo A (ATI) (Kato et al., 1959). La función de ATI se cree que es la protección de los viriones de virus cowpox durante la diseminación de animal a animal (Bergoin et al., 1971). La región ATI del genoma del virus cowpox codifica una proteína de 160 kDa que forma la matriz de los cuerpos ATI (Funahashi et al., 1988; Patel et al., 1987). El virus vaccinia, aunque contiene una región homologa en su genoma, generalmente no produce ATI. En la cepa WR del virus vaccinia, la región ATI del genoma se traduce en una proteína de 94 kDa (Patel et al., 1988). En la cepa Copenhagen del virus vaccinia, la mayor parte de las secuencias de ADN correspondientes a la región ATI han sido delecionadas, encontrándose fusionado el extremo 3' remanente de la región con secuencias de más arriba de la región ATI formando un marco de lectura abierto (ORF) (Goebel et al., 1990a,b).

Se ha informado de una diversidad de deleciones espontáneas (Altenburger et al., 1989; Drillien et al., 1981; Lai et al., 1989; Moss et al., 1981; Paez et al., 1985; Panicali et al., 1981) y de ingeniería genética (Perkus et al., 1991; Perkus et al., 1989; Perkus et al., 1986) cerca del extremo izquierdo del genoma del virus vaccinia. Se ha demostrado que una cepa WR del virus vaccinia con una deleción espontánea de 10 kb (Moss et al., 1981; Panicali et al., 1981) se encuentra atenuada, tras la inoculación intracraneal en ratones (Buller et al., 1985). Esta deleción se demostró posteriormente que incluía 17 ORFs potenciales (Kotwal et al., 1988b). Entre los genes específicos dentro de la región delecionada se incluían viroquina N1L y una proteína de 35 kDa (C3L según la terminología informada por Goebel et al., 1990a,b). La inactivación por inserción de N1L reduce la virulencia tras la inoculación intracraneal en ratones tanto normales como desnudos (Kotwal et al., 1989a). La proteína de 35 kDa se secreta como NIL en el medio de las células infectadas por el virus vaccinia. La proteína contiene homología respecto a la familia de proteínas de control del complemento, particularmente la proteína 4B de unión al complemento (C4bp) (Kotwal et al., 1988a). Al igual que la C4bp celular, la proteína de 35 kDa del virus vaccinia se une al cuarto componente del complemento e inhibe la cascada clásica del mismo (Kotwal et al., 1990). De esta manera, la proteína de 35 kDa del virus vaccinia aparentemente se encuentra implicada en ayudar al virus a evadir los mecanismos de defensa del huésped.

El extremo izquierdo del genoma del virus vaccinia incluye dos genes que han sido identificados como genes de rango de huésped, K1L (Gillard et al., 1986) y C7L (Perkus et al., 1990). La deleción de ambos genes reduce la capacidad del virus vaccinia de crecer en una diversidad de líneas celulares humanas (Perkus et al., 1990).

Para desarrollar una nueva cepa de vacuna vaccinia, NYVAC (vP866), la cepa de vacuna Copenhagen del virus vaccinia, se modificó mediante la deleción de seis regiones no esenciales del genoma codificantes de factores de virulencia conocidos y potenciales. Las deleciones secuenciales se detallan en las patentes US nº 5.364.773 y nº 5.494.807. Todas las denominaciones de los fragmentos de restricción del virus vaccinia, los marcos de lectura abiertos y las posiciones de nucleótidos se basan en la terminología informada en Goebel et al., 1990a,b.

Los loci de deleción también se manipularon para que fuesen loci receptores para la inserción de genes foráneos.

Las regiones delecionadas en NYVAC se indican en la lista siguiente. También se indican las abreviaturas y denominaciones de los marcos de lectura abiertos para las regiones delecionadas (Goebel et al., 1990a,b) y la denominación del recombinante de virus vaccinia (vP) que contiene todas las deleciones hasta la deleción especificada:

(1) gen de la timidina quinasa (TK; J2R) vP410;

(2) región hemorrágica (u; B13R + B14R) vP553;

(3) región de cuerpo de inclusión de tipo A (ATI; A26L) vP618;

(4) gen de la hemaglutinina (HA; A56R) vp723;

(5) región génica de rango de huésped (C7L - K1L) vP804; y

(6) subunidad grande, ribonucleótido reductasa (I4L) vP866.

NYVAC

NYVAC es una cepa de ingeniería genética del virus vaccinia que ha sido generada mediante la deleción específica de dieciocho marcos de lectura abiertos codificantes de productos génicos asociados a la virulencia y al rango de huésped. NYVAC se encuentra altamente atenuada, según varios criterios, entre los cuales se encuentran: i) virulencia reducida tras la inoculación intracerebral en ratones neonatos, ii) inocuidad en ratones inmunocomprometidos genéticamente (nu^{+}/nu^{+}) o químicamente (ciclofosfamida), iii) fracaso de la inducción de infección diseminada en ratones inmunocomprometidos, iv) falta de induración y ulceración significativas en la piel de conejos, v) rápida eliminación del sitio de inoculación, y vi) competencia de replicación muy reducida en varias líneas celulares de cultivo de tejido, incluyendo aquéllas de origen humano. Sin embargo, los vectores basados en NYVAC inducen excelentes respuestas a inmunógenos extrínsecos y proporcionan inmunidad protectora.

Dos sistemas adicionales de vector de vacuna implican la utilización de poxvirus de huésped naturalmente restringido, virus avipox. Tanto los poxvirus aviares (FPV) como los poxvirus del canario (CPV) han sido manipulados para expresar productos génicos foráneos. El poxvirus aviar (FPV) es el virus prototípico del género Avipox de la familia de los Poxvirus. El virus causa una enfermedad económicamente importante de las aves de corral que ha sido bien controlada desde los años 1920 mediante la utilización de vacunas vivas atenuadas. La replicación de los poxvirus aviares se limita a las especies de aves (Matthews, 1982) y no hay informes en la literatura de que el virus avipox cause una infección productiva en ninguna especie no aviar, incluyendo el ser humano. Esta restricción de huésped proporciona una barrera de seguridad inherente a la transmisión del virus a otras especies y hace que la utilización de los vectores de vacuna basados en virus avipox en aplicaciones veterinarias y humanas resulte una propuesta
atractiva.

Se ha utilizado ventajosamente el FPV como vector de expresión de antígenos de patógenos de aves de corral. La proteína hemaglutinina de un virus influenza aviar virulento se ha expresado en un FPV recombinante (Taylor et al., 1988a). Tras la inoculación del recombinante en pollos y pavos, se indujo una respuesta inmunológica que resultó protectora frente al reto de un virus influenza virulento tanto homólogo como heterólogo (Taylor et al., 1988a). También se han desarrollado FPV recombinantes que expresan las glucoproteínas de superficie del virus de la enfermedad de Newcastle (Taylor et al., 1990; Edbauer et al., 1990).

A pesar de la restricción de huésped para la replicación de FPV y de CPV en sistemas aviares, los recombinantes derivados de estos virus se ha observado que expresan proteínas extrínsecas en células de origen no aviar. Además, estos virus recombinantes se ha demostrado que inducen respuestas inmunológicas dirigidas contra el producto génico foráneo y en su caso se demostró que proporcionaban protección frente al reto por el patógeno correspondiente (Tartaglia et al., 1993a,b; Taylor et al., 1992; 1991b; 1988b).

Los recombinantes ALVAC pueden prepararse mediante los procedimientos detallados en Piccini et al., 1983; Perkus et al., 1995, por ejemplo; recombinación que resulta nueva y no evidente con respecto a la presente invención, debido a que resulta un producto nuevo y no evidente a partir de la misma.

TROVAC se refiere a un poxvirus aviar atenuado que era un aislado clonado en placa derivado de la cepa de vacuna FP-1 de poxvirus aviar que se encuentra autorizado para la vacunación de pollos de 1 día de edad. TROVAC es una especie unimolar de poxvirus aviar.

ALVAC es un vector basado en poxvirus del canario atenuado que era un derivado clonado en placa de la vacuna autorizada de poxvirus del canario denominada Kanapox (Tartaglia et al., 1992). ALVAC presenta algunas propiedades generales que son iguales a algunas propiedades generales de Kanapox. ALVAC es una especie unimolar de poxvirus del canario.

También se ha demostrado que los virus recombinantes basados en ALVAC que expresan inmunógenos extrínsecos resultan eficaces como vectores de vacuna (Tartaglia et al., 1993a,b). Este vector avipox se encuentra restringido a las especies de aves en su replicación productiva. En cultivos celulares humanos, la replicación del poxvirus del canario resulta abortada tempranamente en el ciclo de replicación vírica, previamente a la síntesis del ADN vírico. Sin embargo, cuando se manipula para que exprese inmunógenos extrínsecos, se observa expresión y procesamiento auténticos in vitro en células de mamífero y la inoculación en numerosas especies de mamífero induce respuestas inmunológicas de anticuerpos y celulares frente al inmunógeno extrínseco y proporciona protección frente al reto con el patógeno cognato (Taylor et al., 1992; Taylor et al., 1991).

Algunos ensayos clínicos recientes de fase I tanto en Europa como en Estados Unidos de recombinantes ALVAC, por ejemplo la glucoproteína recombinante de poxvirus del canario/rabia (ALVAC-RG) demostró que las vacunas ALVAC eran seguras y bien toleradas y, por ejemplo, inducían niveles protectores de títulos de anticuerpo neutralizador del virus de la rabia (Fries et al., 1996; Pialoux et al., 1994; Cadoz et al., 1992). Además, las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) derivadas de los vacunados con ALVAC-RG demostraron niveles significativos de proliferación de linfocitos al estimularlos con virus purificados de la rabia (Fries et al., 1996).

NYVAC, ALVAC y TROVAC también han sido reconocidos como únicos entre todos los poxvirus en que el National Institutes of Health ("NIH") (sistema sanitario público de los Estados Unidos), el Recombinant DNA Advisory Committee, que publica directrices para la contención física del material genético, tal como virus y vectores, es decir, directrices de procedimientos de seguridad para la utilización de dichos virus y vectores que se basan en la patogenicidad del virus o vector particular, concedió una reducción del nivel de contención física: de BSL2 a BSL1. Ningún otro poxvirus presenta un nivel de contención física BSL1. Incluso la cepa Copenhagen del virus vaccinia, la vacuna común para la viruela, presenta un nivel de contención física más elevado, el BSL2. Por consiguiente, la técnica ha admitido que ALVAC presenta una patogenicidad inferior a la de otros poxvirus.

Se ha demostrado que los virus recombinantes basados en ALVAC estimulan las CTLs CD8+ específicas in vitro de PBMCs humanas (Tartaglia et al., 1993a). Los ratones inmunizados con recombinantes ALVAC que expresan diversas formas de glucoproteína de cubierta de VIH-1 generaron respuestas tanto primarias como de memoria de CTL frente a VIH que podían inducirse nuevamente mediante una segunda inoculación (Tartaglia et al., 1993a; Cox et al., 1993). Los recombinantes ALVAC-env (que expresan la glucoproteína de cubierta de VIH-1) estimularon fuertes respuestas de CTL específicas para VIH de las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) en individuos infectados por VIH-1 (Tartaglia et al., 1993a; Cox et al., 1993). Las PMBC autólogas infectadas agudamente se utilizaron como células estimuladoras para las PBMC restantes. Tras 10 días de incubación en ausencia de IL-2 exógena, las células se evaluaron para las actividades de CTL. ALVAC-env estimularon niveles elevados de actividades anti-VIH en ratones. Estos y otros estudios similares (ver el documento USSN nº 08/417.210) demuestran una utilidad de los recombinantes basados en ALVAC, especialmente con respecto a los virus de inmunodeficiencia. En particular, el carácter de elevada atenuación de ALVAC ha sido demostrado en modelos animales tanto inmunocompetentes como inmunocomprometidos en estos estudios; y la seguridad de los recombinantes basados en ALVAC también ha sido demostrada.

De esta manera, en la presente invención resulta preferente el vector ALVAC basado en el poxvirus del canario.

Claramente, basándose en los perfiles de atenuación de los vectores ALVAC y su capacidad demostrada de inducir respuestas inmunológicas tanto humorales como celulares frente a inmunógenos extrínsecos (Tartaglia et al., 1993a,b; Taylor et al., 1992), estos virus recombinantes ofrecen una ventaja clara sobre virus recombinantes basados en vaccinia descritos con anterioridad.

Quizás más relacionado con VIF (debido a que se encuentran implicados felinos), se ha demostrado que un virus recombinante basado en ALVAC que expresa los productos génicos FeLV (subgrupo A) y gag (ALVAC-FL; vCP97) proporciona protección completa de los gatos frente a la exposición a reto por FeLV oronasal (Tartaglia et al., 1993). De manera significativa, la protección fue proporcionada en ausencia de actividad neutralizadora detectable en suero específica para FeLV previamente al reto.

En determinadas realizaciones de la presente invención, los solicitantes han construido varios recombinantes ALVAC-VIF y han evaluado su capacidad de proporcionar protección de gatos frente a la exposición experimental a VIF. En resumen, los solicitantes han demostrado protección frente a la exposición a reto por VIF homólogo mediante la vacunación de gatos con un recombinante Gag-proteasa de ALVAC-VIF. Los recombinantes que expresaban Env de VIF solo o en combinación con Gag-proteasa no proporcionaron niveles significativos de protección. Sin embargo, los regímenes de vacunación consistentes en inducción con env/gag-proteasa de ALVAC-VIF y refuerzo con una preparación de vacuna de células completas inactivada con adyuvante proporcionó protección completa, demostrando la utilidad de los recombinantes que expresaban Env solo o en combinación con Gag-proteasa, a pesar de que estos recombinantes per se no proporcionan niveles significativos de protección (y, además, estos recombinantes pueden utilizarse, por ejemplo, para expresar productos que, de todas maneras, pueden resultar útiles, por ejemplo, para obtener anticuerpos útiles, o en kits, pruebas, ensayos y similares).

Resulta interesante que los niveles de respuestas humorales específicas de VIF medidos mediante ELISA y transferencia western no eran necesariamente predictivos de protección. Además, las respuestas humorales específicas de Env no se encontraban asociadas con la protección observada.

Además, los datos en la presente invención muestran la eficacia de los recombinantes de la presente invención contra el reto por VIF heterólogo en gatos, especialmente en un protocolo de inducción/refuerzo que implica un recombinante de la invención (por ejemplo un recombinante ALVAC-VIF) y un VCI.

Además, los datos en la presente invención con respecto a VIF y los gatos es capaz de extenderse a otros lentivirus, retrovirus y virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS. De esta manera, el conocimiento en la técnica de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el epítopo o epítopos de interés de estos otros virus, por ejemplo Env, Gag, proteasa, pueden utilizarse para preparar y utilizar recombinantes que expresan uno o más epítopos de interés análogos a los datos de VIF ejemplificados en la presente memoria. Más en particular, utilizando el conocimiento en la técnica de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican Env, Gag, Pol, o una parte de Pol, tal como una parte que incluye una proteasa, funciones accesorias/proteínas o uno o más epítopos de las mismas, para otros lentivirus, retrovirus, y virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIB, VIH o VIS, y utilizando el conocimiento en la técnica de los sistemas de vector, el experto en la materia podrá preparar vectores o recombinantes que expresan Env, Gag y Pol, o una parte de Pol, o Gag y Pol o una parte de Pol, o Env, Gag y proteasa, o Gag y proteasa, con funciones/proteínas opcionalmente accesorias, o que expresan uno o más epítopos de las mismas, de estos otros virus, y pueden utilizarse los vectores o recombinantes en un régimen de inmunización, tal como un régimen de inducción/refuerzo, tal como se ejemplifica en la presente invención con respecto a VIF, sin experimentación indebida. Por consiguiente, se dan a conocer los vectores o recombinantes de lentivirus, retrovirus y virus de inmunodeficiencia, además de VIF (debido a que VIF es un modelo para otros lentivirus, retrovirus y virus de inmunodeficiencia) y los procedimientos para preparar y utilizar estos vectores o recombinantes.

El producto de expresión generado por los vectores o recombinantes de la expresión también puede aislarse a partir de células infectadas o transfectadas y utilizarse para inocular huésped en una configuración de vacuna de subunidad (una composición, o una composición antigénica o inmunológica). Las proteínas generadas por los vectores o recombinantes y anticuerpos inducidos a partir de los mismos también pueden utilizarse en ensayos para detectar la presencia o ausencia de un lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VIF.

Por consiguiente, se dan a conocer inmunógenos o uno o más epítopos de interés, tales como uno o más inmunógenos, o uno o más epítopos de interés de lentivirus, de retrovirus o de virus de inmunodeficiencia, por ejemplo inmunógenos o epítopos de interés de VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS. Por ejemplo de los lentivirus, incluyendo aunque sin limitarse a ellos, VIH-1, VIH-2, VAIE y VIB. Todos los lentivirus expresan homólogos funcionales de Env, Gag-proteasa de VIF. Las técnicas para identificar, clonar y utilizar las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de estos homólogos funcionales son conocidas de la técnica y no requieren ninguna experimentación indebida para la práctica a la luz de la presente exposición.

Con respecto al estado de la técnica, se hace mención particularmente a: Gonda et al., 1990, Development of bovine immunodeficiency-like virus as a model of lentivirus disease, Dev. Biol. Stand. 72:97-110; Garvey et al., 1990, Nucleotide sequence and genome organization of biologically active bovine immunodeficiency-like virus, Virology 175:391-409; Gonda et al., 1987, Characterization and molecular cloning of a bovine lentivirus related to human imunodeficiency virus, Nature 330:388-391; Ball et al., 1988, EIAV genomic organization: further characterization by sequencing of purified glycoproteins and cDNA, Virology 165:601-605; Kawakami et al., 1987, Nucleotide sequence analysis of equine infectious anemia virus proviral DNA, Virology 158:300-312; Yaniv et al., 1986, Molecular cloning and physical characterization of integrated equine infectious anemia virus: molecular and immunological evidence of its close relationship to ovine and caprine lentiviruses, Virology 154:1-8; Stephens et al., 1986, Equine infectious anemia virus gag and pol genes: relatedness to visna and AIDS virus, Science 231:589-594; Chiu et al., 1985, Nucleotide evidence for relationship of AIDS retrovirus to lentiviruses, Nature 317:366-368, así como varias revisiones en Retrovirus Biology and Human Disease, Gallo, R.C. y Wong-Stall, F., editores Marcel Dekker, Inc., New York, 1990.

Además, el ADN codificante de dichos inmunógenos o epítopos de interés de vectores o recombinantes de la invención pueden administrarse a través de la inmunización con sistemas alternativos de expresión de mamífero apropiadamente manipulados, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, estrategias basadas en poxvirus, virus herpes, adenovirus y alfavirus, e inmunógenos basados en ADN desnudo o formulado. Las técnicas para la manipulación de estas subunidades recombinantes son conocidas de la técnica.

Con respecto a las técnicas para estos vehículos de inmunización y el conocimiento en el estado de la técnica, se hace mención particularmente a: Hormaeche y Kahn, Perkus y Paoletti, Shiver et al., todos ellos en: Concepts in Vaccine Development, Kaufman, S.H.E., editor, Walter deGruytes, New York, 1996, y los vectores indicados en: Viruses in Human Gene Therapy, Vos, J.-M.H., editor, Chapman and Hall, Carolina Academic Press, New York, 1995, y en: Recombinant Vectors in Vaccine Development, Brow, F., editor, Karger, New York, 1994.

La invención además proporciona una composición antigénica, inmunogénica, inmunológica o de vacuna, que contiene el virus recombinante o producto de expresión del mismo, y un portador o diluyente aceptable. Una composición inmunológica que contiene el vector o virus recombinante (o un producto de expresión del mismo) induce una respuesta inmunológica, local o sistémica. La respuesta puede ser, aunque no necesariamente, protectora. De la misma manera, una composición inmunogénica que contiene el vector o el virus recombinante (o un producto de expresión del mismo) induce una respuesta inmunológica local o sistémica que puede ser, aunque no necesariamente, protectora. De manera similar, una composición antigénica induce una respuesta inmunológica local o sistémica que puede ser, aunque no necesariamente, protectora. Una composición de vacuna induce una respuesta protectora local o sistémica. Por consiguiente, las expresiones "composición inmunológica", "composición antigénica" y "composición inmunogénica" incluyen "composición de vacuna" (ya que las tres primeras expresiones pueden ser composiciones protectoras). Se entiende que una respuesta protectora es una respuesta, tal como una respuesta humoral y/o secretora y/o mediada por células, que proporciona una inmunidad, entendiéndose que inmunidad comprende la capacidad de resistir o de superar la infección, o de superar la infección con más facilidad en comparación con un sujeto al que no se ha administrado la composición de la invención, o de tolerar mejor la infección en comparación con un sujeto al que no se ha administrado la composición de la invención, por ejemplo una resistencia incrementada a la
infección.

Respecto a los epítopos de interés, el experto en la materia puede determinar un epítopo o región inmunodominante de un péptido o polipéptido y, ergo, el ADN codificante del mismo, a partir del conocimiento de las secuencias de aminoácidos y de ADN correspondiente del péptido o polipéptido, así como de la naturaleza de los aminoácidos particulares (por ejemplo tamaño, carga, etc.) y del diccionario de codones, sin experimentación indebida.

Un procedimiento general para determinar qué partes de una proteína se utilizarán en una composición inmunológica se centra en el tamaño y en la secuencia del antígeno de interés. En general, las proteínas grandes, debido a que presentan más determinantes potenciales, son mejores antígenos que las pequeñas. "Cuanto más foráneo sea un antígeno, es decir, cuanto menos similar sea a las autoconfiguraciones que inducen tolerancia, más eficaz será en provocar una respuesta inmunológica", Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988.

Respecto al tamaño: el experto en la materia puede maximizar el tamaño de la proteína codificada por la secuencia de ADN a insertar en el vector de mamífero (considerando las limitaciones de inserción del vector). Para minimizar el ADN insertado, maximizando simultáneamente el tamaño de la proteína expresada, la secuencia de ADN puede excluir intrones (regiones de un gen que se transcriben pero que posteriormente se extraen del transcrito primario de ARN).

Como mínimo, la secuencia de ADN puede codificar un péptido de por lo menos 8 ó 9 aminoácidos de longitud. Ésta es la longitud mínima que necesita tener un péptido para estimular una respuesta de células T CD4+ (que reconoce células infectadas por virus o células cancerosas). Una longitud mínima del péptido de 13 a 25 aminoácidos resulta útil para estimular una respuesta de células T CD8+ (que reconoce células especiales presentadoras de antígeno que han endocitado el patógeno) (ver Kendrew, The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1995). Sin embargo, debido a que éstas son longitudes mínimas, estos péptidos es probable que generen una respuesta inmunológica, es decir, una respuesta de anticuerpos o de células T, aunque, para una respuesta protectora (tal como desde una composición de vacuna), resulta preferente un péptido más largo.

Con respecto a la secuencia, la secuencia de ADN preferentemente codifica por lo menos regiones del péptido que generan una respuesta de anticuerpos o una respuesta de células T. Un procedimiento para determinar los epítopos de células T y B implica el mapado de los epítopos. La proteína de interés "se fragmenta en péptidos solapantes con enzimas proteolíticos. A continuación, los péptidos individuales se someten a ensayo para su capacidad de unirse a un anticuerpo inducido por la proteína nativa, o para inducir la activación de las células T o B. Este enfoque ha resultado particularmente útil en el mapado de epítopos de células T debido a que las células T reconocen péptidos lineales cortos acomplejados con moléculas del MHC. El procedimiento resulta menos eficaz para determinar los epítopos de las células B", debido a que los epítopos de las células B con frecuencia no son una secuencia lineal de aminoácidos sino que resultan de la estructura terciaria de la proteína tridimensional plegada (Janis Kuby, Immunology, páginas 79-80, 1992).

Otro procedimiento para determinar un epítopo de interés es seleccionar las regiones de la proteína que son hidrofílicos. Con frecuencia, los residuos hidrofílicos se encuentran sobre la superficie de la proteína y, por lo tanto, con frecuencia son las regiones de la proteína que resultan accesibles al anticuerpo (Janis Kuby, Immunology, páginas 79-80, 1992).

Todavía otro procedimiento para determinar un epítopo de interés es llevar a cabo un análisis de cristalografía de rayos X del complejo de antígeno (de longitud completa)-anticuerpo (Janis Kuby, Immunology, página 80, 1992).

Todavía otro procedimiento para seleccionar un epítopo de interés que puede generar una respuesta de células T consiste en identificar, de la secuencia de proteína, motivos de unión potenciales de anclas HLA, que son secuencias de péptido que es conocido que resulta probable que se unan a la molécula de MHC.

El péptido que es un putativo epítopo de interés, para generar una respuesta de células T, debe presentarse en un complejo MHC. El péptido preferentemente contiene motivos de anclaje apropiados para la unión a las moléculas del MHC, y debe unirse con afinidad suficientemente elevada para generar una respuesta inmunológica. Los factores que pueden considerarse son: el tipo HLA del paciente (vertebrado, animal o humano) previsto para la inmunización, la secuencia de la proteína, la presencia de motivos de anclaje apropiados y la incidencia de la secuencia de péptido en otras células vitales.

Se genera una respuesta inmunológica, en general, de la manera siguiente: las células T reconocen proteínas únicamente cuando la proteína ha sido cortada en péptido más pequeños y se presenta en un complejo denominado el "complejo mayor de histocompatibilidad MHC" situado en la superficie de otra célula. Existen dos clases de complejos MHC, la clase I y la clase II, y cada clase está constituida por muchos alelos diferentes. Diferentes pacientes presentan diferentes tipos de alelos de complejo MHC; se dice que presentan un "tipo HLA diferente".

Los complejos MHC de clase I se encuentran en prácticamente todas las células y presentan péptidos de proteínas producidas en el interior de la célula. De esta manera, los complejos MHC resultan útiles para eliminar células que han sido infectadas por virus o que se han convertido en cancerosas como resultado de la expresión de un oncogén. Las células T que presentan una proteína denominada CD4 sobre su superficie se unen a las células MHC de clase I y secretan linfoquinas. Las linfoquinas estimulan una respuesta; las células llegan y eliminan la célula infectada por virus.

Los complejos MHC de clase II se encuentran únicamente en células presentadoras de antígeno y se utilizan para presentar péptidos de patógenos circulantes que han sido endocitados por las células presentadoras de antígeno. Las células T que presentan una proteína denominada CDS se unen a las células del MHC de clase I y eliminan la célula mediante exocitosis de gránulos líticos.

Entre algunas directrices para determinar si una proteína contiene epítopos de interés que estimularán una respuesta de células T se incluyen: longitud del péptido, el péptido debe ser de por lo menos 8 ó 9 aminoácidos de longitud para encajar en el complejo MHC de clase I y de 13 a 25 aminoácidos de longitud para encajar en un complejo MHC de clase II. Esta longitud es un mínimo para que el péptido se una al complejo MHC. Resulta preferente que los péptidos sean más largos que estas longitudes debido a que las células podrían cortar los péptidos expresados. El péptido debe contener un motivo de anclaje apropiado que permita que se una a las diversas moléculas de clase I o de clase II con especificidad suficientemente elevada para generar una respuesta inmunológica (ver Bocchia, M. et al., Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Peptides to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684; Englehard, V.H., Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules, Ann. Rev. Immunol. 12:181, 1994). Esto puede llevarse a cabo, sin experimentación indebida, comparando la secuencia de la proteína de interés con estructuras publicadas de péptidos asociadas con las moléculas del MHC. Los epítopos de proteína reconocidos por los receptores de células T son péptidos generados mediante degradación enzimática de la molécula de proteína y se presentan en la superficie celular en asociación con moléculas de MHC de clase I o de clase II.

Además, el experto en la materia puede determinar un epítopo de interés comparando la secuencia de proteína con secuencias listadas en la base de datos de proteínas. Las regiones de la proteína que comparten poco o ninguna homología son mejores elecciones de epítopo de la proteína y, por lo tanto, resultan útiles en una vacuna o composición inmunológica. Deben evitarse las regiones que comparten una homología elevada con secuencias ampliamente presentes en células vitales.

Además, otro procedimiento es simplemente generar o expresar partes de una proteína de interés, generar anticuerpos monoclonales contra estas partes de la proteína de interés, y después determinar si estos anticuerpos inhiben el crecimiento in vitro del patógeno del que se derivó la proteína. El experto en la materia puede utilizar las otras directrices indicadas en la presente exposición y en la técnica para generar o para expresar partes de una proteína de interés para el análisis de si los anticuerpos de la misma inhiben el crecimiento in vitro.

Por ejemplo, el experto en la materia puede generar partes de una proteína de interés mediante la selección de partes de 8 a 9, o de 13 a 25 aminoácidos de longitud de la proteína, seleccionando las regiones hidrofílicas, seleccionando partes que se ha demostrado que se unen, a partir de datos cristalográficos de rayos X del complejo antígeno(longitud completa)-anticuerpo, seleccionando regiones que difieren en su secuencia con otras proteínas, seleccionando los potenciales motivos de unión a anclajes HLA, o cualquier combinación de estos procedimientos o de otros procedimientos conocidos en la técnica.

Los epítopos reconocidos por los anticuerpos se expresan sobre la superficie de una proteína. Para determinar las regiones de una proteína que es más probable que estimulen una respuesta de anticuerpos, el experto en la materia preferentemente puede llevar a cabo un mapa de epítopos, utilizando los procedimientos generales descritos anteriormente, u otros procedimientos de mapado conocidos en la técnica.

Tal como puede apreciarse de lo anteriormente expuesto, sin experimentación indebida, a partir de la presente exposición y el conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede determinar la secuencia de aminoácidos y correspondiente de ADN de un epítopo de interés de lentivirus para obtener una respuesta de células T, células B y/o de anticuerpos. Además, se hace referencia a Gefter et al., patente US nº 5.019.384, publicada el 28 de mayo de 1991, y los documentos citados en la misma (obsérvese especialmente la sección de "Literatura relevante" de esta patente, y la columna 13 de esta patente, que da a conocer que: "Se ha definido un gran número de epítopos para una amplia diversidad de organismos de interés. Resultan de particular interés aquellos epítopos contra los que se dirigen los anticuerpos neutralizantes. Se dan a conocer estos epítopos en muchas de las referencias citadas en la sección de Literatura Relevante").

El procedimiento de administración para el vector o recombinante de la invención o producto de expresión del mismo, para las composiciones de la invención, tales como las composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna, o las composiciones terapéuticas, puede ser a través de la vía parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea). Esta administración permite producir una respuesta inmunológica sistémica. La administración puede ser por una vía mucosa, por ejemplo oral, nasal, genital, etc. Este tipo de administración permite producir una respuesta inmunológica local.

Más generalmente, las composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna de la invención, o las composiciones terapéuticas (composiciones que contienen los vectores o recombinantes de la invención o los productos de expresión) pueden prepararse de acuerdo con técnicas estándar bien conocidos por los expertos en las técnicas farmacéutica o veterinaria. Estas composiciones pueden administrarse en dosis y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las técnicas médicas y/o veterinarias teniendo en cuenta factores tales como la variedad o la especie, la edad, el sexo, el peso, o pueden coadministrarse o administrarse secuencialmente con otras composiciones de la invención o con otras composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna, o terapéuticas. Entre estas otras composiciones pueden incluirse antígenos o epítopos nativos purificados, o antígenos o epítopos procedentes de la expresión por un poxvirus recombinante o por otro sistema de vector; y se administran teniendo en cuenta los factores anteriormente indicados.

Entre los ejemplos de composiciones de la invención se incluyen preparaciones líquidas para la administración por orificios, por ejemplo por vía oral, nasal, anal, genital, por ejemplo vaginal, etc., tales como suspensiones, jarabes o elixires, y preparaciones ara la administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo la administración inyectable), tales como las suspensiones o emulsiones estériles. En estas composiciones, el recombinante puede encontrarse mezclado con un portador, diluyente o excipiente adecuados, tales como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similar.

Las composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna típicamente pueden contener un adyuvante y una cantidad del producto recombinante o de expresión para inducir la respuesta deseada. En las aplicaciones humanas, la alúmina (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) es un adyuvante típico. La saponina y su componente purificado Quil A, el adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes se utilizan en investigación y en aplicaciones veterinarias. También pueden utilizarse las preparaciones químicamente definidas, tales como el dipéptido muramilo, el monofosforil lípido A, los conjugados de fosfolípidos, tales como aquellos descritos por Goodman-Snitkoff et al., J. Immunol. 147:410-415, 1991, la encapsulación de la proteína dentro de un proteoliposoma, tal como describen Miller et al., J. Exp. Med. 176:1739-1744, 1992, y la encapsulación de la proteína en vesículas de lípidos, tales como las vesículas de lípidos Novasome^{TM} (MicroVesicular Systems, Inc., Nashua, NH).

Las composiciones de la invención pueden empaquetarse en una sola forma de dosificación para la inmunización por vía parenteral (es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o mediante la administración por un orificio, por ejemplo perlingual (es decir, oral), intragástrica, mucosal, incluyendo intraanal, intravaginal y administración similar. Nuevamente, la dosis eficaz y la vía de administración se determinan a partir de la naturaleza de la composición, la naturaleza del producto de expresión, el nivel de expresión si se utiliza directamente el vector o el recombinante, y factores conocidos, tales como la variedad o la especie, la edad, el sexo, el peso, la condición y naturaleza del huésped, así como la LD_{50} y otros procedimientos de cribado que son conocidos y no requieren experimentación indebida.

Las dosis de producto expresado pueden encontrarse comprendidas entre unos cuantos microgramos y unos cuantos cientos de microgramos, por ejemplo entre 5 y 500 \mug. El vector o recombinante de la invención puede administrarse en cualquier cantidad adecuada para conseguir la expresión a estos niveles de dosis. El vector o recombinante de la invención puede administrarse a un animal o infectarse o transfectarse en células en una cantidad de por lo menos aproximadamente 10^{3,5} pfu; de esta manera, el vector o recombinante de la invención preferentemente se administra a un animal o se infecta o se transfecta en células en una cantidad de por lo menos entre aproximadamente 10^{4} pfu y aproximadamente 10^{6} pfu; sin embargo, tal como se muestra en los Ejemplos posteriormente, puede administrarse a los animales una cantidad de por lo menos aproximadamente 10^{8} pfu, de manera que una cantidad más preferente para la administración puede ser de por lo menos entre aproximadamente 10^{7} pfu y aproximadamente 10^{9} pfu. Otros portadores o diluyentes adecuados pueden ser agua o una solución salina tamponada, con o sin el conservante. El producto de expresión o vector o recombinante puede encontrarse liofilizada para su resuspensión en el momento de la administración o puede encontrarse en solución.

El portador también puede encontrarse en un sistema polimérico de liberación retardada. Los polímeros sintéticos resultan particularmente útiles en la formulación de una composición que presente una liberación controlada. Uno de los primeros ejemplos de esto fue la polimerización del metacrilato de metilo en esferas con diámetros inferiores a un micrómetro para formar las denominadas nanopartículas, informadas por Kreuter, J., Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology (M. Donbrow, editor), CRC Press, páginas 125-148.

La microencapsulación se ha aplicado a la inyección de compuestos farmacéuticos microencapsulados para proporcionar una liberación controlada. Varios factores contribuyen a la selección de un polímero particular para la microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis de polímeros y el procedimiento de microencapsulación, el coste de los materiales de microencapsulación y del procedimiento, el perfil toxicológico, los requerimientos para una cinética de libración variable y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos son todos factores que deben tenerse en cuenta. Entre los ejemplos de polímeros útiles se encuentran los policarbonatos, los poliésteres, los poliuretanos, los poliortoésteres y las poliamidas, particularmente aquéllas que son biodegradables.

Una elección frecuente de portador para los compuestos farmacéuticos y más recientemente para los antígenos es el poli(d,1-láctido-co-glicólido) (PLGA). Éste es un poliéster biodegradable con una larga historia de utilización médica en suturas erosionables, placas óseas y otras prótesis temporales, en las que no ha manifestado ninguna toxicidad. Se ha formulado una amplia diversidad de compuestos farmacéuticos, incluyendo péptidos y antígenos, en microcápsulas de PLGA. Se ha acumulado un corpus de datos sobre la adaptación del PLGA a la liberación controlada de antígeno, por ejemplo ver la revisión de Eldridge, J.H. et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 146:59-66, 1989. El atrapamiento de antígenos en microesferas de PLGA de 1 a 10 micrómetros de diámetro se ha demostrado que presenta un efecto adyuvante notable cuando se administran oralmente. El procedimiento de microencapsulación en PLGA utiliza una separación de fases de una emulsión de agua-en-aceite. El compuesto de interés se prepara en forma de solución acuosa y el PLGA se disuelve en un solvente orgánico adecuado, tal como cloruro de metilo y acetato de etilo. Estas dos soluciones inmiscibles se coemulsionan mediante agitación a alta velocidad. A continuación, se añade un no solvente para el polímero, causando la precipitación y que el polímero alrededor de las gotas acuosas forme microcápsulas embrionarias. Las microcápsulas se recogen, se estabilizan con uno de entre una selección de agentes (alcohol polivinílico (PVA), gelatina, alginatos, polivinilpirrolidona (PVP), metilcelulosa) y el solvente se separa mediante secado in vacuo o mediante extracción de solvente.

De esta manera, se contemplan composiciones sólidas, incluyendo líquidos que contienen sólidos, y de gel (incluyendo "cápsulas de gel"). Además, el vector o recombinante de la invención, y los productos de expresión de los mismos, pueden estimular una respuesta inmunológica o de anticuerpos en animales. A partir de estos anticuerpos, mediante técnicas bien conocidas en la técnica, pueden prepararse anticuerpos monoclonales, y estos anticuerpos monoclonales pueden utilizarse en ensayos bien conocidos de unión de anticuerpos, en kits o ensayos diagnósticos para determinar la presencia o ausencia de uno o más antígenos y a partir de ellos la presencia o ausencia del agente causativo natural del antígeno o, para determinar si simplemente se ha estimulado una respuesta inmunológica contra el agente o contra el antígeno o antígenos.

Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas producidas por células de hibridoma. Un anticuerpo monoclonal reacciona con un único determinante antigénico y proporciona una mayor especificidad que un anticuerpo convencional derivado de suero. Además, el cribado de un gran número de anticuerpos monoclonales permite seleccionar un anticuerpo individual con la especificidad, avidez e isotipo deseados. Las líneas celulares de hibridoma proporciona una fuente constante y económica de anticuerpos y preparaciones químicamente idénticas, y estos anticuerpos pueden estandarizarse con facilidad. Los procedimientos para producir los anticuerpos monoclonales son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia, por ejemplo Koprowski, H. et al., patente US nº 4.196.265, publicada el 1 de abril de 1989.

Son conocidos los usos de los anticuerpos monoclonales. Uno de estos usos es en los procedimientos diagnósticos, por ejemplo David, G. y Greene, H., patente US nº 4.376.110, publicada el 8 de marzo de 1983.

También se han utilizando anticuerpos monoclonales para recuperar materiales mediante cromatografía de inmunoadsorción, por ejemplo Milstein, C., Scientific American 243:66, 70, 1980.

Además, el vector o recombinante de la invención o productos de expresión de los mismos puede utilizarse para estimular una respuesta en células in vitro o ex vivo para la posterior reinfusión en un paciente. Si el paciente es seronegativo, la reinfusión es para estimular una respuesta inmunológica, por ejemplo una respuesta inmunológica o antigénica, tal como la inmunización activa. En un paciente seropositivo, la reinfusión es para estimular o reforzar el sistema inmunológico frente a lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VIF.

Por consiguiente, el vector o recombinante de la invención presenta varias utilidades: en las composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna, tales como para la administración a animales o seres humanos seronegativos (o a pacientes, tal como los veterinarios prefieren llamar a los animales, incluyendo el término "pacientes" también a seres humanos); en las composiciones terapéuticas en animales o seres humanos seropositivos que necesiten terapia para estimular o reforzar el sistema inmunológico frente a lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo el virus de inmunodeficiencia felina; in vitro para producir antígenos o inmunógenos o epítopos de interés que puedan utilizarse además en composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna, o en composiciones terapéuticas. Para generar anticuerpos (mediante la administración directa o mediante administración de un producto de expresión de los vectores o de los recombinantes de la invención) que pueda utilizarse adicionalmente: en diagnósticos, ensayos o kits para determinar la presencia o ausencia de antígenos o de epítopos en una muestra, tal como suero, por ejemplo para determinar la presencia o ausencia del lentivirus, del retrovirus o del virus de inmunodeficiencia, por ejemplo el virus de la inmunodeficiencia felina, en una muestra, tal como suero, o para determinar si se ha inducido una respuesta inmunológica contra el lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo contra VIF, o contra uno o más antígenos particulares, o contra uno o más epítopos particulares; o en cromatografía de inmunoadsorción; para generar ADN para la utilización como sondas de hibridación o para preparar cebadores de PCR o para la inmunización con ADN; y los vectores o recombinantes de la invención, productos de expresión de los mismos, e inmunógenos, antígenos y epítopos de los vectores o recombinantes de la invención pueden utilizarse para generar células activadas que pueden utilizarse adicionalmente (reinfusionarse) para estimular una respuesta inmunológica (una respuesta antigénica o inmunológica; o la inmunización activa) o para reforzar o estimular el sistema inmunológico (por ejemplo de un animal o de un ser humano inmunocomprometido o seropositivo). También existen otras utilidades para las realizaciones de la invención.

Puede obtenerse una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas a partir de los ejemplos siguientes, proporcionados a título de ilustración.

Ejemplos Clonación y síntesis de ADN

Se construyeron, cribaron y cultivaron plásmidos mediante procedimientos estándar (Maniatis et al., 1982; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Se obtuvieron endonucleasas de restricción de Bethesda Research Laboratories, GAithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; y de Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN. Se obtuvo fragmento Klenow de polimerasa de E. coli de Boehringer Mannheim Biochemicals. Se obtuvo exonucleasa BAL-31 y ADN ligasa de fago T4 de New England Biolabs. Los reactivos se utilizaron tal como especifican los diversos proveedores.

Se prepararon oligodesoxinucleótidos sintéticos en un sintetizador de ADN Biosearch 8750 o 380B de Applied Biosystems, tal como se ha descrito anteriormente (Perkus et al., 1989). Se llevó a cabo la secuenciación de ADN mediante el procedimiento de la terminación de cadena dideoxi (Sanger et al., 1977) utilizando Sequenase (Taboer et al., 1987), tal como se ha descrito anteriormente (Guo et al., 1989). La amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la verificación de secuencia (Engelke et al., 1988) se llevó a cabo utilizando cebadores oligonucleótidos sintetizados al efecto y un kit de reactivos de amplificación de ADN de GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) en un ciclador térmico de ADN Perkin Elmer Cetus. Las secuencias de ADN en exceso se delecionaron de los plásmidos mediante digestión con endonucleasa de restricción, seguido de la digestión limitada con exonucleasa BAL-31 y mutagénesis (Mandecki, 1986) utilizando oligonucleótidos sintéticos.

Células, virus y transfección

Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa Copenhagen de virus vaccinia han sido descritos con anterioridad (Guo et al., 1989). La generación de virus recombinante mediante recombinación, hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y cribado para la actividad de B-galactosidasa se realizaron tal como se ha descrito con anterioridad (Piccini et al., 1987).

Los orígenes y condiciones de cultivo de la cepa Copenhagen del virus vaccinia y de NYVAC y ALVAC han sido descritos con anterioridad (Guo et al., 1989; Tartaglia et al., 1992, patentes US nº 5.364.773 y nº 5.494.807). La generación de virus recombinante mediante recombinación, la hibridación in situ de filtros de nitrocelulosa y cribado para actividad B-galactosidasa se realizaron tal como se ha descrito con anterioridad (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).

El poxvirus del canario parental (cepa Rentschler) es una cepa de vacuna para canarios. La cepa de vacuna ALVAC, tal como se ha comentado anteriormente, se obtuvo a partir de un aislado de tipo salvaje y atenuado a través de más de 200 subcultivos en serie en fibroblastos de embrión de pollo. Una semilla madre vírica se sometió a cuatro purificación sucesivas en placa bajo ágar y se amplificó un clon de la placa a través de cinco subcultivos adicionales, después de lo cual se utilizó el virus madre como el virus parental en ensayos de recombinación in vitro. El aislado de poxvirus del canario purificado en placa se denominó ALVAC.

La cepa de poxvirus aviar (FPV) denominada FP-1 ha sido descrita con anterioridad (Taylor et al., 1988a). Es una cepa de vacuna atenuada útil en la vacunación de pollos de un día de edad. La cepa Duvette de virus parental se obtuvo en Francia en forma de costra de poxvirus aviar en un pollo. El virus se atenuó mediante aproximadamente 50 subcultivos en serie en huevos embrionados de pollo, seguido de 25 subcultivos en células fibroblásticas de embrión de pollo. El virus se sometió a cuatro purificaciones sucesivas en palca. Un aislado de placa se amplificó adicionalmente en células CEF primarias y se estableció un virus madre, denominado TROVAC.

Se propagaron vectores víricos NYVAC, ALVAC y TROVAC tal como se ha descrito con anterioridad (Piccini et al., 1987; Taylor et al., 1988ª,b; patentes US nº 5.364.773 y nº 5.494.807). Se propagaron células vero y fibroblastos de embrión de pollo (CEF) tal como se ha descrito con anterioridad (Taylor et al., 1988ª,b).

Ejemplo 1 Construcción de ALVAC-env de VIF

La secuencia codificante de env de virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) en el plásmido ptg6184 y las secuencias de nucleótidos de VIF se obtuvieron de Rhone Merieux (Lyon, Francia). El clon de ADNc se derivo de la cepa Villefranche de VIF. La secuencia de nucleótidos de env de VIF se muestra en la figura 2 (SEC ID nº 1).

La secuencia codificante de env de VIF se situó bajo el control del promotor H6 temprano/tardío modificado del virus vaccinia (Perkus et al., 1989). La secuencia codificante de env de VIF contiene dos motivos de secuencia T_{5}NT que podrían permitir la terminación prematura de la transcripción temprana (Yuen y Moss, 1987). Las secuencias T_{5}NT se habían modificado, sin alterar la secuencia codificante teórica de aminoácidos, mediante la sustitución con un fragmento derivado por PCR. Se cambió TTTTTAT entre las posiciones 2059 y 2065 en la figura 2 por TTCTTAT; TTTTTCT entre las posiciones 2110 y 2216 se cambió por TTCTTCT.

Se derivaron dos fragmentos de PCR solapantes procedentes del molde ptg6184, proporcionando un fragmento con secuencias T_{5}NT alteradas. Se generó un fragmento de PCR de 585 pb utilizando los cebadores oligonucleótidos MM040 (SEC ID nº 9) (5'-AAATTCTTATATACAGCTTTCGCTATGCAAGAATTAGGATGTAATCAAAAT
CAATTC TTCT GCAAAATCCCTCCTGGGT-3') y MM042 (SEC ID nº 10) (5'-CCCATCGAGTGCGGCTAC-3'). MM040 ceba hacia las secuencias situadas más hacia el extremo 3' de la secuencia codificante de env (a partir de la posición 2056, figura 2). MM042 ceba desde las secuencias de env situadas más hacia el extremo 3' hacia las secuencias más hacia el extremo 5'. Una segunda PCR se cebó con MM041 (SEC ID nº 11) (5'-GCAGAAGAATT
GATTTTGATTACATCCTAATTCTTGCATAGCGAAAGCTGTATATAAGAATTTTTCCATAGCTTC-3') y MM043 (SEC ID nº 12) (5'-AAGTTCTGGCAACCCATC-3') generó un fragmento de 187 pb. MM041 ceba desde la posición 2118 hacia las secuencias situadas más hacia el extremo 5' de env, y MM043 ceba hacia las secuencias situadas más hacia el extremo 3' de la secuencia codificante de env desde la posición 1931 (figura 2). Los dos productos de PCR se agruparon, se cebaron con MM043 y MM042, y se digirieron con ScaI en la posición de la secuencia codificante de VIF 2020 en la figura 2 y EcoRI en el lado 3' de la secuencia codificante de env. El fragmento de PCR resultante ScaI-EcoRI de 564 pb contenía las secuencias más hacia el extremo 3' de la secuencia codificante de env de VIF con los motivos T_{5}NT alterados.

El plásmido ptg6184 se digirió con EcoRI y se digirió parcialmente con ScaI. Este fragmento derivado de ptg6184 con deleción desde ScaI en el lado 3' de env de VIF (figura 2, posición 2020) hasta EcoRI, en el lado 3' de la secuencia codificante de env, se ligó con el fragmento derivado por PCR ScaI-EcoRI de 564 pb (ver anteriormente). El plásmido pMM120 resultante contenía el env de VIF con motivos T_{5}NT alterados. La secuencia de nucleótidos se confirmó utilizando procedimientos estándar (Goebel et al., 1990a). El fragmento PstI-EcoRI de PMM120 de 2,6 kpb, que contenía la secuencia codificante de env de VIF, se insertó entre los sitios PstI y EcoRI de pBS-SK (Stratagene, La Jolla, California), generando pMM122.

El promotor H6 temprano/tardío modificado del virus vaccinia (Perkus et al., 1989) se añadió a pMM122 mediante solapamiento del codón de inicio de traducción de H6 con el codón de inicio de traducción de env de VIF. Se generó un fragmento que contenía las secuencias promovidas por H6 más hacia el extremo 5' de la secuencia codificante de env, mediante PCR utilizando los cebadores MM037 (SEC ID nº 13) (5'-ATCATCCTGCAGAAGCTTCCCGGGTTCTT
TATTCTATACTT-3'), MM038 (SEC ID nº 14) (5'-CTGCAAATCCTTCTGCCATTACGATACAAACTTAAC-3'), MM065 (SEC ID nº 15) (5'-CGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCAGAAGGATTTGCAGCC-3') y MM036 (SEC ID nº 16) (5'-CCTCTTGAATTTCGTTCC-3'). pMM108, que contenía las secuencias promotoras H6, se utilizó como molde para la PCR con MM037 y MM038, creando un fragmento de 166 pb que contenía el promotor H6 y los pb más hacia el extremo 5' de la secuencia codificante de env de VIF. Se utilizó pMM122 como molde para la PCR con MM065 y MM036 para generar un fragmento de 235 pb con el promotor H6 del lado 3' y el extremo 5' de env. Los dos productos de PCR se agruparon, se cebaron con MM036 y MM037, y el fragmento resultante, que contenía el promotor H6 fusionado con los pb más hacia el extremo 5' de la secuencia codificante de env de VIF, se digirieron con PstI y KpnI, generando un fragmento de 266 pb. pMM122 se digirió con PstI y se digirió parcialmente con KpnI, eliminando las secuencias más hacia el extremo 5' de la región codificante de env de VIF y se insertó el fragmento derivado por PCR PstI-KpnI de 266 pb anteriormente indicado. El plásmido resultante, pMM125, contenía el extremo 3' de env de VIF yuxtapuesto al promotor H6 del virus vaccinia en pBS-SK (Stratagene, La Jolla, California).

El análisis de secuencia de pMM125 demostró la correcta construcción por PCR de las secuencias más hacia el extremo 5' de env de VIF promovidas por H6, aunque se observaron mutaciones de desplazamiento de marco en el lado 3' de la inserción de PCR. No se observaron los desplazamientos de marco en pMM122. Todos los clones de pMM125 contenían desplazamientos de marco. Estos desplazamientos de marco probablemente eran el resultado de la inestabilidad recientemente descrita de las secuencias env en los plásmidos de elevado número de copia (Wang y Mullins, 1995). Diferentes clones de pMM125 presentaban diferentes desplazamientos de marco. Se construyó un env de VIF promovido por H6 sin desplazamientos de marco de la manera siguiente.

Brevemente, éste es un resumen de la descripción detallada siguiente de la construcción de un env de VIF promovido por H6 y sin desplazamientos de marco. Las secuencias promovidas por H6 situadas más hacia el extremo 5' de la secuencia codificante de env de VIF, que no contenían desplazamientos de marco, procedentes de un clon de pMM125 se ligaron con los pb más hacia el extremo 3' de env de VIF sin desplazamientos de marco de otro clon de pMM125. El primer fragmento abarcaba desde el sitio SmaI situado 5' respecto al promotor H6 hasta el sitio AfIII en la secuencia codificante de env de VIF (figura 1, posición 1707). El segundo fragmento abarcaba desde el mismo sitio AfIII hasta el sitio SmaI situado 3' respecto a la secuencia codificante de env. El producto de ligación se digirió con SmaI, liberando tres fragmentos. Un fragmento contenía las secuencias situadas más hacia el extremo 5' y otro fragmento contenía las dos secuencias situadas más hacia el extremo 3'. El tercer producto de digestión con SmaI que contenía el casete de expresión de env de VIF promovido por H6 se aisló y se insertó en un vector C6, generando pRW945. Para eliminar la posibilidad de desplazamientos de marco, pRW945 no se amplificó en bacterias. A continuación se proporcionan detalles de la construcción de pRW945.

Un clon de pMM125, pMM125 nº 11, presentaba la secuencia correcta entre SmaI 5' respecto al promotor H6 y el sitio AfIII en la posición 1707 (figura 2); otro clon de pMM125, pMM125 nº 10, presentaba la secuencia correcta entre el sitio AfIII en la posición 1707 y SmaI 3' respecto a la secuencia codificante de env. El fragmento SmaI-AfIII de pMM125 nº 11 de 1,8 kpb, que contenía las secuencias de env situadas más hacia el extremo 5' promovidas por H6, se ligó con el fragmento SmaI-AfIII parcial de pMM125 nº 10 de 0,9 kpb que contenía la parte 3' de env. El producto de ligación se digirió con SmaI y el fragmento de 2,7 kpb se insertó en el vector de C6, pMM117, proporcionando pRW945.

El plásmido de inserción de C6, pMM117, se construyó de la manera siguiente. Se secuenció el clon HindIII de ALVAC de 3 kpb y se definió un marco de lectura abierto. Se utilizó un fragmento derivado de PCXR para la sustitución del marco de lectura abierto con sitios de restricción para las inserciones de ADN. Se generó el fragmento derivado por PCR con los cebadores C6A1 (SEC ID nº 17) (5'-ATCATCGAGCTCGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT-3'), C6B1 (SEC ID nº 18) (5'-GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAG
TAAGTATTTTTATTTAA-3'), C6C1 (SEC ID nº 19) (5'-CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGAT
TAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA-3') y C6D1 (SEC ID nº 20) (5'-GATGATGGTACCTT
CATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG-3'). Se utilizó ALVAC como molde para PCR utilizando los oligonucleótidos C6A1 y C6B1, generando un fragmento de 380 pb. En una segunda reacción de PCR se utilizó un molde ALVAC y los cebadores C6C1 y C6D1 para generar un fragmento de 1155 pb. Los productos de reacción de PCR se agruparon y se cebaron para una PCR final con C6A1 y C6D1, proporcionando un fragmento de 1613 pb. El producto final de PCR se digirió con SacI y KpnI para la inserción entre los sitios SacI y KpnI de pBS-SK (Stratagene, La Jolla, California). El plásmido de inserción de C6 resultante se denominó pC6L. El plásmido de inserción de C6, pMM117, se construyó mediante la adición de la secuencia GGGGGATCCTTAATTAATTAGTTATTAGACAAGGTGAAAAC
GAAACTATTTGTAGCTTAATTAATTAGCTGCAGGAATTC (SEC ID nº 21) entre los sitios SmaI y EcoRI de pC6L (figura 4; SEC ID nº 3).

El plásmido pRW945 anteriormente indicado contiene la secuencia codificante de env de VIF promovida por H6, con motivos T_{5}NT alterados, en un plásmido de inserción de C6. Se utilizó pRW945 en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como virus resultante para derivar el recombinante vCP242. La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos teórica de la inserción en vCP242 (SEC ID nº 4).

Ejemplo 2 Construcción de recombinante de ALVAC que expresa gag y pro de VIF

Las secuencias codificantes de gag y de pol del virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) en el plásmido ptg8133 y la secuencia codificante de env de VIF en el plásmido ptg6184 se obtuvieron de Rhone Merieux (Lyon, Francia). Los clones de ADNc se derivaron de la cepa Villefrance de VIF. La figura 3 (SEC ID nº 2) contiene la secuencia de nucleótidos de las regiones codificantes de gag y de pol de VIF obtenidas de Rhone Merieux.

Las secuencias de gag de VIF codificantes de los antígenos nucleares, seguido de las secuencias de pol codificantes de una proteasa, transcriptasa inversa e integrasa, se situaron bajo el control del promotor I3L temprano/intermedio del virus vaccinia (Schmitt, J. y Stunneberg, H., 1988; Vos, J. y Stunnenberg, H., 1988). El promotor I3L corresponde a las posiciones 65073 a 64971 en Goebel et al., 1990a,b. Las secuencias codificantes de gag y de pol se construyeron en una sola unidad de transcripción. Los marcos de lectura abiertos (ORFs) de Gag y de Pol son diferentes, y la traducción del ORF de Pol se produce a través de un mecanismo de desplazamiento de marco ribosómico (Morikawa y Bishop, 1992), de la manera que se produce normalmente en las células infectadas por VIF.

Se utilizaron fragmentos derivados por PCR para la construcción del casete gag/pol de VIF promovido por I3L. También se utilizaron los fragmentos derivados por PCR para alterar un motivo de secuencia T_{5}NT, que puede proporcionar la terminación prematura de la transcripción temprana (Yuen y Moss, 1987). Se cambió TTTTTAT entre las posiciones 467 y 473 (figura 3) a TTTTCAT sin alterar la secuencia de aminoácidos teórica. Se llevaron a cabo manipulaciones para construir el casete de expresión gag/pol de VIF promovido por I3L de la manera siguiente.

Se llevó a cabo PCR con ptg8133 como molde, que contenía las secuencias codificantes de gag/pol de VIF, y como cebadores, MM027 (SEC ID nº 22) (5'-CAAAAATGGTGTCCATTTTCATGGAAAAGGCAAGAGAAGGAC-3') y MM028 (SEC ID nº 23) (5'-CTGCTGCAGTAAAATAGG-3') como cebadores, generando un fragmento de 245 pb. MM027 cebó desde la posición 452 (figura 3) hacia las secuencias situadas más hacia el extremo 3' que contenían un cambio de nucleótido en el motivo de secuencia T_{5}NT. MM028 cebó desde la posición 697 más abajo de un sitio HindIII hacia las secuencias de gag situadas más hacia el extremo 5'. El fragmento derivado por PCR de 245 pb contenía la secuencia codificante de gag de VIF entre la posición 452 y la posición 697 con un motivo T_{5}NT
alterado.

Una segunda PCR con ptg8133 como molde y los cebadores MM029 (SEC ID nº 24) (5'-CTTCTCTTGCCTTTTC
CATGAAAATGGACACCATTTTTGGGTC-3') y MM030 (SEC ID nº 25) (5'-CAATTATTTAGGTTTAATCATGGG
GAATGGACAGGGGC-3') generó un fragmento de 508 pb. MM029 ceba desde la posición 490 (fig. 3) hacia las secuencias situadas más hacia el extremo 5' de la secuencia codificante de gag y altera el motivo de secuencia T_{5}NT. MM030 contiene la secuencia más hacia el extremo 3' del promotor I3L y ceba desde el codón de inicio de gag hacia las secuencias situadas más hacia el extremo 3' de la secuencia codificante de gag. El fragmento derivado por PCR de 508 pb contiene el promotor I3L situado más hacia 3' y la secuencia codificante de gag de VIF con un motivo T_{5}NT alterado hasta la posición 490.

El plásmido de molde pMM100, que contiene las secuencias del promotor I3L, se cebó con MM031 (SEC ID nº 26) (5'-CGCCCCTGTCCATTCCCCATGATTAAACCTAAATAATTGTAC-3') y MM032 (SEC ID nº 27) (5'-AT
CATCGTCGACATCGATACATCATGCAGTGGTTAAAC-3'), generando un fragmento derivado por PCR de 137 pb. Las secuencias de MM031 más hacia el extremo 5' contenían los pb más hacia 5' de gag seguido por una secuencia que ceba en las secuencias más hacia 3' del promotor I3L hacia las secuencias del promotor I3L hacia el extremo 5'. MM032 presenta los sitios SalI y ClaI seguidos de una secuencia que ceba desde las secuencias más hacia 5' del promotor I3L hacia las secuencias más hacia 3'. El fragmento derivado por PCR de 137 pb contiene los 20 pb más hacia 5' de gag de VIF promovidos por I3L.

Los tres productos de PCR se agruparon y se cebador para PCR con MM032 y MM028. El fragmento resultante de 814 pb se digirió con HindIII y con SalI, generando un fragmento de 726 pb que contenía las secuencias más hacia 5' de gag de VIF promovidas por I3L con un motivo T_{5}NT alterado.

ptg8133 se digirió con SacI y con SalI, para eliminar las secuencias de plásmido de 7,2 kpb, y el fragmento de 4,7 kpb se aisló y se digirió parcialmente con HindIII. Se aisló el producto de digestión parcial SacI-HindIII de ptg8133 de 4 kpb, que contenía la secuencia codificante de gag de VIF entre la posición 616 y la secuencia codificante de pol de VIF.

pBS-SK digerido con SacI-SalI (Stratagene, La Jolla, California) se ligó con el fragmento derivado por PCR HindIII-SalI de 726 pb (ver anteriormente) y el fragmento SacI-HindIII de ptg8133 de 4 kpb. El plásmido resultante, pMM116, contenía el casete de expresión gag/pol de VIF promovido por I3L en pBS-SK.

El fragmento Asp718-EcI136II de 4,7 kpb que contenía las regiones codificantes de gag/pol de VIF promovidas por I3L se trató con Klenow, en presencia de 20 mM de dNTPs, y se insertó en pMM117 digerido con SmaI, produciendo pMM121. pMM117 es el plásmido de inserción de C6 indicado anteriormente.

El fragmento EcoRI de pMM121 de 1,4 kpb, que contenía la región más hacia 5' de gag/pol de VIF promovida por I3L, se insertó en el sitio EcoRI de pBS-SK (Stratagene, La Jolla, California), generando pMM123. Se utilizó un fragmento derivado por PCR para eliminar las secuencias codificantes correspondientes al extremo carboxi de Pol para conseguir únicamente la expresión de Gag-proteasa. El fragmento derivado por PCR introdujo un codón de terminación tras la secuencia codificante de proteasa en la posición 1709 (fig. 3). Se llevaron a cabo manipulaciones para construir las secuencias codificantes de gag de proteasa de VIF promovidas por I3L, de la manera siguiente.

El molde pMM121, que contiene las secuencias codificantes de gag/pol de VIF promovidas por I3L, se cebaron con MM063 (SEC ID nº 28) (5'-CAGGACATCTAGCAAGAC-3') y MM064 (SEC ID nº 29) (5'-GATGATCCCGGGATAAAAATTATTGAGCCATTACTAACCT-3'), generando un fragmento derivado por PCR de 580 pb. MM063 cebaba desde la posición 1148 (fig. 3) hacia las secuencias más hacia el extremo 3'. MM064 cebaba desde la posición 1709 hacia las secuencias más hacia el extremo 5'. El fragmento derivado por PCR de 580 pb, que contenía la secuencia codificante de la proteasa de VIF con un codón de parada en la posición 1709 (fig. 3), se digirió con EcoRI y con SmaI, proporcionando un fragmento de 475 pb.

Se linearizó pMM123 en el sitio SmaI situado en el lado 3' de la inserción de VIF, seguido de la digestión parcial con EcoRI. Se insertó el fragmento SmaI-EcoRI derivado por PCR (ver anteriormente) de 475 pb en el producto de digestión parcial SmaI-EcoRI de pMM123, digiriendo el sitio EcoRI en la figura 3, posición 1246. El plásmido resultante, pMM127, contenía las secuencias codificantes de gag y de proteasa de VIF, seguido de un codón de parada, en pBS-SK (Stratagene, La Jolla, California). La secuencia de nucleótidos del fragmento derivado por PCR en pMM127 se confirmó utilizando procedimientos estándar (Goebel et al., 1990a). Se observó una deleción de un solo pb en el lado 3' de la secuencia codificante de la proteasa de VIF. MM064 se diseñó para añadir TTTTTAT tras el codón de parada de la proteasa de VIF. Una T en la secuencia TTTTTAT tras el codón de parada se encontraba ausente de pMM127, resultando en la secuencia TTTTAT.

El fragmento BamHI-SmaI de pMM127 de 1,8 kpb, que contenía las secuencias codificantes de gag y de proteasa de VIF promovidas por I3L, se insertó en pMM117 parcialmente digerido con SmaI-BamHI. El plásmido de inserción de C6, pMM117, se ha descrito anteriormente. Se utilizó la digestión parcial con BamHI para digerir el sitio BamHI al lado del sitio SmaI en pMM117. El plásmido resultante, que contenía las secuencias codificantes de gag y de proteasa de VIF promovidas por 13L en un plásmido de inserción de C6, se denominó pMM129. Se utilizó el plásmido pMM129 en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como el virus rescatante, para derivar el recombinante vCP253. La figura 6 (SEC ID nº 5) muestra la secuencia de nucleótidos teórica del casete de expresión de gag/proteasa de VIF promovido por I3L y las regiones flanqueantes en vCP253.

Ejemplo 3 Construcción de ALVAC recombinante que expresa env, gag y pro de VIF

Anteriormente se ha descrito el plásmido pMM125, que contiene env de VIF promovido por H6 con mutaciones de desplazamiento de marco. Una inserción deliberada, que contiene un desplazamiento de marco, en la secuencia codificante de env de VIF permitió el mantenimiento estable del resto del constructo de env de VIF promovido por H6 en bacterias. Tras la amplificación bacteriana, se eliminó la inserción. Se llevaron a cabo manipulaciones para construir la secuencia codificante de env de VIF promovida por H6, con una inserción deliberada de desplazamiento de marco, de la manera siguiente.

Se modificó pMM125 nº 1 (descrita anteriormente) mediante la inserción de un fragmento derivado por PCR que reparó el desplazamiento de marco espontáneo e introdujo un desplazamiento de marco deliberado flanqueado por sitios BstEII. La inserción BstIEII se encontraba en la posición 1920 (fig. 2). La inserción introduce un codón de parada seguido de un desplazamiento de marco, sitios NotI e HindIII. No existen sitios BstEII en pMM125. El fragmento derivado por PCR también cambia la A en la posición 1921 en la figura 2 a C. El cambio de A a C no altera la secuencia codificante teórica de aminoácidos, pero el cambio introduce un sitio BstEII. pMM125 nº 10 presenta un desplazamiento de marco espontáneo en la posición 1604 (figura 2). Se utilizó pMM125 nº 10 como molde para PCR con los cebadores oligonucleótidos RW542 (SEC ID nº 30) (5'-TATGAATTGTAATTGTAC-3') y RW545 (SEC ID nº 31) (5'-GTAGCATAAGGTTACCGCGGCCGCTAAGCTTAGGTTACCATCCCTATAGCAGTA-3') para generar un fragmento de 326 pb que contenía la inserción BstEII. RW542 ceba desde la posición 1632 hacia las secuencias más hacia el extremo 3' de env de VIF; RW545 ceba desde la posición 1919 hacia las secuencias más hacia el extremo 5' de env de VIF (figura 2). Se utilizó pMM125 nº 10 como molde para PCR con RW544 (SEC ID nº 32) (5'-GTAGCATAAGGTAACCTAAGCTTAGCGGCCGCGGTAACCCAATACCACCAAGTTCTGGC-3') y T3 (SEC ID nº 33) (5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3'), generando un fragmento de 791 pb que contenía la inserción BstEII y las secuencias más hacia el extremo 3' de la secuencia codificante de env de VIF. RW544 ceba desde la posición 1914 hacia las secuencias más hacia el extremo 3' de env. T3 ceba en el plásmido pBS-SK, más abajo del codón de parada de env de VIF, hacia las secuencias más hacia el extremo 5' de env de VIF. Los dos productos PCR se agruparon, se cebaron con RW542 y T3, y el producto resultante de 1,1 Kpb se digirió con EcoRI y se digirió parcialmente con AfIII, generando un fragmento de 876 pb que se insertó en el vector pMM125 nº 11 siguiente. El fragmento derivado por PCR y el vector pMM125 nº 11 se digirieron con AfII en la posición 1709 (fig. 2). pMM125 nº 11 se digirió con EcoRI para eliminar las secuencias más hacia el extremo 3' de la secuencia codificante de env de VIF que contenían un desplazamiento de marco espontáneo. Se insertó el fragmento derivado por PCR EcoI-AfIII de 876 pb en el vector EcoRI-AfIII pMM125 nº 11. El plásmido resultante, pMM134, contenía la secuencia codificante de env de VIF yuxtapuesta en el lado 3' con el promotor H6 en pBS-SK (Stratagene, La Jolla, California). pMM134 también contenía una mutación deliberada de desplazamiento de marco insertada entre los dos sitios BstEII. Se confirmó la secuencia de env de VIF en pMM134 promovida por H6, incluyendo la inserción BstEII. Tal como se esperaba, la inserción BstEII permitió el mantenimiento estable del resto del constructo de env de VIF promovido
por H6.

Tras la clonación de la secuencia codificante de env de VIF promovida por H6 de pMM134 en un plásmido de inserción poxvirus, la inserción BstEII debe eliminarse para permitir la expresión de la secuencia codificante de env de VIF de longitud completa. La inserción BstEII se elimina mediante digestión con BstEII, seguido de una reacción de ligación diluida que favorece la ligación intramolecular. El producto de ligación intramolecular contiene env de VIF promovido por H6 sin la inserción BStEII. Tras eliminar la inserción de BstEII, la secuencia codificante de env de VIF promovida por H6 no se espera que se mantenga establemente en bacterias, y el plásmido no se amplificó en bacterias. Tras la ligación, el plásmido se digirió con NotI. Los productos de ligación que contenía la inserción BstEII se digerirían en el sitio NotI dentro de la inserción BstEII. La digestión con NotI dentro de la inserción BstEII evita la capacidad del plásmido de generar un poxvirus recombinante viable. El env de VIF de longitud completa, sin la inserción BstEII, no resulta cortado mediante digestión con NotI; las secuencias codificantes de env de VIF permanecen intactas.

Ejemplo 4 Construcción de la secuencia codificante de env de VIF promovido por H6 en C6 con las secuencias codificantes de gag y de proteasa de VIF promovidas por I3L

La construcción de pMM134 que contiene la secuencia codificante de env de VIF promovida por H6 con una inserción BStEII ha sido descrita anteriormente. El fragmento SmaI de env de VIF promovido por H6 de 2,7 kpb de pMM134, con la inserción BstEII, se clonó en el plásmido de inserción pMM129 siguiente.

pMM128, que contiene las secuencias codificantes de gag y de proteasa de VIF promovidas por I3L, ha sido descrito anteriormente. Se creó un extremo romo en el sitio SalI de pMM129 en el lado 5' del promotor I3L utilizando Klenow en presencia de 20 mM de dNTPs. Se construyó pMM138 mediante la inserción del fragmento SmaI de pMM134 de 2,7 kpb que contenía la secuencia codificante de nev de VIF promovida por H6, con la inserción BStEII, en el sitio SalI de extremo romo de pMM129. La secuencia codificante de env de VIF promovida por H6, en pMM138, se encontraba en el lado 5' de las secuencias codificantes de gag y de proteasa de VIF promovidas por I3L; las secuencias codificantes de VIF se transcriben en la misma dirección.

Los dos sitios BstEII en pMM138 rodean la inserción que contiene un desplazamiento de marco. Tras la digestión de pMM138 con BstEII, para eliminar la inserción, se realizó la ligación. El plásmido resultante pMM146 no se amplificó en bacterias. pMM146 se diseñó para la digestión NotI antes de los experimentos in vitro de recombinación; la digestión con NotI sirvió a dos propósitos. En primer lugar, cualquier plásmido que involuntariamente contenga la inserción BStEII resultaría digerido por NotI dentro de la inserción, y se evitaría que el plásmido donante generase un ALVAC recombinante viable. En segundo lugar, NotI lineariza pMM146 dentro del esqueleto de pBS-SK para la generación eficiente del recombinante ALVAC deseado. Se digirió pMM146 con NotI previamente a la utilización en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como el virus rescatante, para derivar el recombinante vCP255. La figura 7 (SEC ID nº 6) muestra la secuencia de nucleótidos teórica del casete de expresión de env de VIF promovido por H6/gag/proteasa de VIF promovido por I3L y regiones flanqueantes en vCP255.

Ejemplo 5 Construcción de ALVAC recombinante que expresa 97TM, gag y pro de VIF

La glucoproteína de cubierta de VIF está compuesta de dos productos de corte, gp97 y gp40. La secuencia codificante de env de VIF se modificó, mediante la sustitución de gp40 por el dominio de anclaje transmembranal de las secuencias codificantes de env de VIF, en el constructo 97TM de VIF siguiente. 97TM de VIF, que contiene gp97 seguido del dominio de anclaje transmembranal, se construyó de la manera siguiente.

Se sintetizó un fragmento derivado por PCR, VIF1-PCR (242 pb) utilizando pMM125 nº 10 (que contenía el env de VIF anteriormente descrito con la secuencia correcta entre el sitio AfIII y las secuencias más cercanas al extremo 3') como molde, y los oligonucleótidos MW196 (SEC ID nº 34) (5'-ACTTGCCATCGTCATGGGGG-3') y MW195A (SEC ID nº 35) (5'-GATACCTCCCAATAGTCCCTTTTCCTTCTAGGTTTATATTC-3') como cebadores. Se sintetizó un fragmento derivado por PCR, VIF2-PCR (193 pb) utilizando pMM125 nº 10 como molde, y los oligonucleótidos MW194A (SEC ID nº 36) (5'-GAATATAAACCTGAAGGAAAAGGGGACTATTGGGAGGTATC-3') y MW197 (SEC ID nº 37) (5'-ATCATCGAATTCATAAAAATCATTCTTCTCCTTCTACTT-3') como cebadores. Se sintetizó el fragmento derivado por PCR VIF3-PCR (393 pb) utilizando los fragmentos derivados por PCR VIF1-PCR y VIF2-PCR como moldes, y los oligonucleótidos MW196 y MW197 como cebadores. Se llevó a cabo una digestión completa AfIII/EcoRI de VIF3-PCR, y se aisló el fragmento de 284 pb. Esta fragmento se ligó en el fragmento AfIII/EcoRI de 4,8 kb de pM125 nº 11 (que contenía el env de VIF anteriormente descrito con la secuencia correcta entre las secuencias más cercanas al extremo 5' y el sitio EcoRI indicada anteriormente). El plásmido resultante, pMAW103, contenía 97TM de VIF promovido por H6.

Se añadió un sitio PstI más arriba del promotor H6 de la manera siguiente. Se sintetizó el fragmento derivado por PCR VIF4-PCR (359 pb) utilizando pMAW103 como molde, y los oligonucleótidos MW209 (SEC ID nº 8) (5'-AT
CATCAAGCTTCTGCAGTTCTTTATTCTATACTTA-3') y MM036 (SEC ID nº 16) (5'-CCTCTTGAATTTCGTTCC-3') como cebadores. Se llevó a cabo una digestión completa HindIII/NruI de VIF4-PCR, y el fragmento de 110 pb se insertó en el fragmento HindIII/NruI de 5,0 kb de pMAW103, proporcionando el plásmido pMAW103A. El fragmento PstI de pMAW103A de 2126 pb que contenía 97TM de VIF promovido por H6 se insertó en el sitio PstI de pMM117 (descrito anteriormente), proporcionando el plásmido pMAW104.

El producto de digestión parcial con BamHI de pMAW104 de 2852 pb, que contenía 97TM de VIF promovido por H6, se insertó en pMM129 digerido con BamHI (gag y pro de VIF promovidos por I3L en C6 descrito anteriormente). El plásmido resultante, pMAW05 contenía 97TM de VIF promovido por H6, y gag y pro de VIF promovido por I3L en C6. Se utilizó el plásmido pMAW105 en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como el virus rescatante, derivando el recombinante vCP329. La figura 8 (SEC ID nº 7) muestra la secuencia de nucleótidos teórica de la inserción para preparar vCP329.

Ejemplo 6 Análisis de expresión recombinante de ALVAC-VIF

La expresión de los productos génicos específicos de VIF apropiados codificados por los recombinantes de ALVAC llamados vCP242, vCP253, vCP255 y vCP329 quedó demostrada en diversos análisis. Los análisis de expresión se llevaron a cabo utilizando anticuerpos monoclonales apropiados o suero derivado de gatos seropositivos para VIF. Cualquiera de los dos agentes funcionó igualmente bien en la confirmación de la expresión en células infectadas por ALVAC-VIF. Por consiguiente, sin experimentación indebida, a partir de individuos seropositivos pudieron derivarse monoclonales para confirmar la expresión.

Se demostró la expresión de Env a partir de vCP242 VIF mediante ELISA (descrita posteriormente). vCP242 era positiva para la expresión en superficie en un ensayo de inmunofluorescencia FACS con un anticuerpo monoclonal específico para Env de VIF (obtenido de Rhone-Merieux, Lyon, Francia). vCP242 era positivo según una inmunoprecipitación realizada con suero policlonal procedente de gatos infectados por VIF y dos anticuerpos monoclonales diferentes (descritos posteriormente). De esta manera, sin experimentación indebida, pudieron derivarse monoclonales a partir de individuos seropositivos para confirmar la expresión.

vCP253 era positivo para la expresión interna de Gag según FACS. vCP253 era positivo según una inmunoprecipitación para la expresión de Gag p24 madura. Se detectó un precursor dominante de Gag en 37 kDa; se obtuvieron señales adicionales, representando los productos de corte de Gag, en 49 kDa, 40 kDa y 32 kDa.

La expresión en superficie de vCP255 para Env fue positiva según FACS realizada con un anticuerpo monoclonal específico para Env (descrito posteriormente). Se demostró la expresión interna de Gag en vCP255 con un anticuerpo monoclonal específico para Gag mediante FACS. vCP255 se sometió a ensayo mediante inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales contra cada producto génico: Gag era positivo con señales en aproximadamente 49 kDa, 40 kDa, 37 kDa y 24 kDa; la expresión de Env de VIF era positiva, con señales en 130 kDa y 90 kDa.

Se detectó la expresión de 97TM y gag en vCP329 mediante inmunoprecipitación con suero agrupado procedente de gatos infectados por VIF.

Análisis de FACS: vCP255 contenía las secuencias codificantes de env, gag y proteasa del virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) en el locus C6. Se utilizó pMM146 en experimentos de recombinación in vitro con ALVAC como el virus rescatante para derivar el recombinante vCP255. Se sometió a ensayo la expresión de producto génico específico para VIF vCP255 en un separador celular activado por fluorescencia (FACS). El producto proteico Env de VIF se sometió a ensayo sobre la superficie de células infectadas por vCP255. El producto p24 de VIF se sometió a ensayo para utilizar análisis de expresión interna. Los antisueros utilizados para el análisis FACS eran los
siguientes:

1): env monoclonal anti-VIF: 128F10, EP110592 de Rhone Merieux (dilución 1:200)

2): p24 monoclonal anti-VIF: grupo de 125A3, 314B5 EP072092 de Rhone Merieux (dilución 1:100)

3): G anti-rabia monoclonal: 24-3F-10 021387 de C. Trimarchi, Griffin Laboratories, New York State Health Department (dilución 1:200)

4): IgG policlonal de cabra antiratón acoplado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de Boehringer Mannheim, número de catálogo 605240, número de lote 24064 (dilución 1:100)

Análisis FACS de expresión sobre la superficie celular: 1 x 10^{7} células HeLa-S3 (ATCC nº CCL2.2) se infectaron con 5 x 10^{7} PFU de vCP255 en medio mínimo esencial (S-MEM: Gibco nº 380-2380AJ) suplementado con suero de feto bovino al 10%, glutamina 20 mM y penicilina-estreptomicina al 0,5% Las células infectadas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos con agitación ocasional. Las células se lavaron con 10 ml de S-MEM. Tras cada lavado, las células se peletizaron a 1.000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga Beckman GPKR. El pellet de células infectadas se resuspendió en 1 ml de S-MEM, se transfirió a un tubo Sarstadt de 5 ml y se hizo rotar lentamente 37ºC durante la noche.

Tras la incubación durante la noche, se añadieron alícuotas de 100 \mul de las células infectadas a tubos de polipropileno de 5 ml. Las células se lavaron con 3 ml de PBS-CMF (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM y Na_{2}HPO_{4} 8 mM, pH 7,4), que incluía NaN_{3} al 0,2% y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,2%. Las células se peletizaron y el sobrenadante se descartó. Se añadió anticuerpo específico a un tubo y se añadió anticuerpo no específico (G antirabia) a un segundo tubo de la manera siguiente.

Se añadieron a cada pellet celular 100 \mul de anticuerpo (previamente adsorbido con células HeLa) diluido en PBS-CMF suplementado con NaN_{3} al 0,2% y BSA al 0,2%, y se incubó a 4ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron y se peletizaron dos veces en 3 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2% y BSA al 0,2%. Se añadieron 100 \mul de anticuerpo secundario acoplado a FITC (previamente preadsorbido a células HeLa) diluido 1:50 en PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2% y BSA al 0,2%, y se incubó a 4ºC en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron y se peletizaron dos veces en 3 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2% y BSA al 0,2%. Los pellets celulares se resuspendieron en 1 ml de PBS-CMF, que contenía NaN_{3} al 0,2% y BSA al 0,2%, se transfirieron a tubos de poliestireno de 5 ml y se sometieron a ensayo en el FACS.

Análisis FACSCAN de expresión interna: se infectaron 1 x 10 7 células HeLa-S3 (ATCC nº CCL2.2) con 5 x 10^{7} PFU de vCP255 en medio mínimo esencial (S-MEM: Gibco nº 380-2380AJ) suplementado con suero de feto bovino al 10%, glutamina 20 mM y penicilina-estreptomicina al 0,5%. Las células infectadas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos con agitación ocasional. Las células se lavaron con 10 ml de S-MEM. Tras cada lavado, las células se peletizaron a 1.000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga Beckman GPKR. El pellet de células infectadas se resuspendió en 1 ml de S-MEM, se transfirió a un tubo Sarstadt de 5 ml y se hizo rotar lentamente a 37ºC durante la noche.

Tras la incubación durante la noche, se añadieron alícuotas de 100 \mul de las células infectadas a tubos de polipropileno de 5 ml. Las células se lavaron con 3 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2%. Se añadieron 100 \mul de paraformaldehído al 4% (Polysciences Inc., nº 00380), pH 7,4, en PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2%, al pellet celular y se incubó sobre hielo durante 10 minutos. Se añadió anticuerpo específico a un tubo y se añadió anticuerpo no específico (G antirabia) a un segundo tubo de la manera siguiente.

Las células tratadas con paraformaldehído se lavaron con 3 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2%. Tras el lavado, se añadieron 100 \mul de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2%, saponina al 1% (SIGMA S-7900) y suero de bovino recién nacido inactivado (Gibco nº 200-6010AJ). Las células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos y se lavaron con 3 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2%.

Se añadieron 100 \mul de anticuerpo (previamente preadsorbido a células HeLa) diluido en PBS-CMF suplementado con saponina al 0,1% y suero bovino de recién nacido inactivado por calor al 20% a cada pellet celular, y se incubaron a 4ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron y se peletizaron dos veces en 3 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2% y saponina al 0,1%.

Se añadieron 100 \mul de anticuerpo secundario acoplado a FITC (previamente preadsorbido a células HeLa) diluido 1:50 en PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2% y saponina al 0,1% y suero de feto bovino neonato inactivo por calor al 20% y se incubó a 4ºC en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron y se peletizaron dos veces en 3 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2 y saponina al 0,1%. Los pellets celulares se resuspendieron en 1 ml de PBS-CMF que contenía NaN_{3} al 0,2%, se transfirieron a tubos de poliestireno de 5 ml y se sometieron a ensayo en el
FACS.

Análisis FACS de vCP255: se sometieron a ensayo suspensiones de antisueros/HeLa en un citómetro de flujo Becton Dickinson modelo FC FAC-Scan. Los datos se analizaron en software Lysis II (Becton Dickinson, UK). Las suspensiones de antisueros/HeLa se excitaron con un láser de argón de 488 nm, y se identificaron los espectros de emisión de FITC utilizando detectores de canal FL-1. Se recogieron los datos sincronizados de 10.000 célu-
las.

Los espectros de emisión de fluorescencia, obtenidos mediante análisis FACS de células HeLa infectadas por ALVAC, mostraron niveles de fondo de glucoproteína G de la rabia y productos génicos específicos de VIF. Los niveles de fondo de la glucoproteína G de la rabia se obtuvieron mediante análisis FACS de células HeLa infectadas por vCP255.

Los espectros de emisión de fluorescencia de células HeLa infectadas por vCP255, sondeados con anticuerpos monoclonales específicos para VIF, demostraron la expresión de los productos génicos específicos para VIF. El producto de la secuencia codificante de p24 de VIF se detectó internamente a partir de células HeLa infectadas por vCP255. El producto Env de VIF se detectó sobre la superficie de células HeLa infectadas por vCP255.

Análisis de inmunoprecipitación: se infectaron células CEF o VERO a una m.o.i. de 10 pfu/célula con ALVAC (el virus parental), vCP242, vCP253, vCP255 o vCP329. Tras un periodo de adsorción de una hora, se extrajo el inóculo y las células se recubrieron con 2 ml de medio de Eagle modificado(sin cisteína ni metionina) que contenía suero de feto bovino dializado al 2% y [^{35}S]-TRANSlabel (New England Nuclear, Boston, MA; 30 \muCi/ml). Se recogieron los lisados 18 a 24 horas después de la infección mediante la adición de 11 ml de tampón A 3X (NaCl 450 mM, NP-40 al 3%, Tris 30 mM (pH 7,4), EDTA 3 mM, azida-Na al 0,03% y PMSF 0,6 mg/ml) y se analizó para la expresión de los productos génicos env y gag de VIF. Los antisueros policlonales de gato anteriormente indicados y los anticuerpos monoclonales específicos para VIF se utilizaron para el análisis de inmunoprecipitación de la manera
siguiente.

Los lisados se incubaron durante la noche a 4ºC con complejos de antisueros específicos para VIF-proteína A-sefarosa. Las muestras se lavaron 4X con tampón A 1X y 2X con un tampón de LiCl_{2}/urea (LiCl 200 mM, urea 2 M y Tris 10 mM, pH 8,0). Las proteínas precipitadas se disociaron de los complejos inmunológico mediante la adición de tampón Laemmli 2 X (Tris 124 mM, pH 6,8, SDS al 4%, glicerol al 20%, 2-mercaptoetanol al 10%) y ebullición durante 5 minutos. Las proteínas se fraccionaron en geles de SDS-poliacrilamida al 10%, se fijaron en metanol, y se trataron con salicilato-Na 1 M para la fluorografía. Las proteínas del tamaño apropiado precipitaron de los lisados derivados de células infectadas con los recombinantes ALVAC-VIF, pero no precipitaron de las células no infectadas o de las células infectadas por ALVAC. Los resultados indican que los recombinantes ALVAC-VIF expresaron apropiadamente los productos génicos de VIF.

Análisis ELISA: se infectaron células fibroblásticas de embrión primario de pollo (CEF) con vCP219, vCP242 o ALVAC. Las células infectadas se analizaron con los anticuerpos monoclonales específicos para VIF siguientes (Rhone Merieux, Lyon, Francia).

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gag de VIF:: 0126B4 (anti-P15)

\quad: 314B5 (anti-P2)

\quad: 125A3 (anti-p24)

env de VIF:: 128F10

\quad: 117E5

\quad: 115G8

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Muestras de suero sometidas a ensayo mediante ELISA

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1.: Suero procedente de gatos infectados por VIF:

: Recibido de Rhone Merieux.

: Gatos nº 34 y nº 103.

2.: Suero de gato normal: gato nº 1229 (Select Labs, Athens, GA)

3.: Suero de conejo obtenido de la inmunización con vCP65 (ALVAC-RG):

: Conejo A039: semana presangrado nº 14

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Se prepararon lisados de células infectadas de la manera siguiente. Se infectaron botellas de cultivo de células CEF con ALVAC, vCP219 o vCP242 a una MOI de 5 PFU por célula en medio libre de suero. Cada botella de cultivo se recolectó 20 horas después de la infección, cuando las células eran completamente redondas pero no se habían desenganchado. La recolección consistió en decantar el medio, lavar una vez con PBS, y raspar las células en 3 ml de PBS suplementado con aprotinina (3,6 T.I.U.; Sigma nº A-6279). Las células recolectadas se sonicaron durante cuatro minutos sobre hielo, y después se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 x g. Se recuperaron los sobrenadantes y la concentración de proteína se determinó que era de aproximadamente 7 mg/ml para cada preparación.

Se llevó a cabo una ELISA cinética de la manera siguiente. Se sometieron a ensayo muestras de suero (ver anteriormente) mediante una ELISA cinética de sándwich par ala detección de los productos génicos env y gag de VIF. Las placas de microtitulación se recubrieron con los anticuerpos monoclonales agrupados, indicados anteriormente, específicos para env de VIF o para gag de VIF, a una concentración de 2 ó 5 \mug/pocillo. Los lisados de células infectadas se aplicaron a una concentración de 0,2, 1 ó 5 \mug/pocillo, para la captura por parte de los monoclonales. Cada muestra de suero se sometió a ensayo por triplicado a una dilución de 1:100. El anticuerpo se detectó con una dilución 1:200 de suero antigato conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immuno Research nº de cat. 102-035-003) o con suero anticonejo conjugado con HRP (DAKO, nº de cat. P217), seguido de sustrato de HRP, dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD). Se leyeron las densidades ópticas a A_{450} durante 15 minutos y se calcularon las tasas para cada muestra como DOm por minuto.

Los resultados de estas ELISAs demostraron claramente que la expresión de Env y Gag de VIF se detectaba con suero procedente de gatos infectados por VIF, pero no con suero de gato normal (datos no mostrados). Se demostró la expresión de Env con placas preparadas utilizando MAb específico para Env y lisados derivados de células infectadas por vCP242, y no con lisados de células infectadas por ALVAC o por vCP219. De manera similar, se demostró la expresión de Gag con placas preparadas utilizando MAb específico para Gag y lisados de células infectadas por vCP219, y no con células infectadas por ALVAC o por vCP242.

TABLA 1 Detección de la expresión de env de VIF mediante ELISA cinética

	lisado ALVAC^{a}	lisado env	lisado gag
Suero de gato^{b}:	NCS	VIF	NCS	VIF	NCS	VIF
conc. de lisado	KELISA	(DOm/min)
(\mug/pocillo)
0,2	1,3	5,2	1,2	5,1	1,2	3,5
1	1,7	5,0	1,4	11,3	1,7	4,9
5	2,2	5,4	1,6	22,0	2,0	5,0
Suero de conejo^{c}:	PB	Wk 14	PB	Wk 14	PB	Wk 14
0,2	1,3	4,8	0,9	2,3	0,9	2,8
1	1,0	5,0	0,7	4,1	0,8	3,0
5	1,1	6,4	0,9	3,0	1,0	4,6
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Lisados celulares de células CEF infectadas por ALVAC, env de ALVAC-VIF, o gag de ALVAC-VIF que se aplicaron a U.Z. 1 ó 3 \mu g/pocillo a pocillos previamente recubiertos con 2 \mu g/pocillo de MAb específico de env de VIF agrupado\end{minipage}
^{b} Suero de gato: env normal (NCS), gatos infectados por VIF (VIF)
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm}Sueros de conejo: presangrados (PB) y suero de la semana 14 procedente de conejos inoculados con vCP-65 (NYVAC-RG)\end{minipage}

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TABLA 2 Detección de anticuerpos específicos para gag de VIF mediante ELISA cinética

	ALVAC	lisado^{a}	lisado env	lisado gag
Suero de gato^{b}	NCS	VIF	NCS	VIF	NCS	VIF
conc. de lisado	KELISA	(DOm/min)
(\mug/ml)
0,2	2,7	6,7	1,5	3,9	1,4	10,4
1	2,3	6,2	1,8	3,6	1,3	30,7
5	2,7	6,5	1,9	5,3	1,7	32,2
Suero de conejo^{c}	PB	wk 14	PB	wk 14	PB	wk 14
0,2	1,3	5,1	1,0	4,0	1,3	4,4
1	1,1	6,0	1,2	4,0	1,2	4,1
5	1,2	6,6	1,0	4,3	1,0	4,4
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Lisados celulares de células CEI^{2} infectadas por ALVAC, env de ALVAC-VIF o gag de ALVAC-VIF se aplicaron a una concentración de 0,2, 1 ó 5 \mu g/pocillo a pocillos previamente recubiertos con 2 \mu g/pocillo de MAb específico para gag de VIF agrupado\end{minipage}
^{b} Sueros de gato: gatos normales (NCS), gatos infectados por VIF (VIF)
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm}Sueros de conejo: presangrados (PB) y suero de semana 14 de conejos inoculados con vCP-65 (NYVAC-RG)\end{minipage}

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Ejemplo 7 Eficacia de los recombinantes ALVAC-VIF en gatos

Agrupamiento e inmunización: un total de 36 animales SPF adquiridos de Liberty (Waverly, NY), edad: 12 semanas, se dividieron en siete grupos de la manera siguiente:

\newpage

Grupo A	Grupo B	Grupo C	Grupo D	Grupo E	Grupo F	Grupo G
QH4F	QH5F	QQ1F	QQ2M	QH2M	QH3M	QC5F

PY1M	PY3M	QA5F	PY5F	PY2M	PY4M	QG4F

OO1F	QS4F	QU2F	QO2F	QA4F	QA6F	QE4M
QC1M	QC3M	QX3M	QX4M	QC4M

QU1M	QG3F	QI1M	QI2M	QG5F

QL2F	Q32M	QL3F	QL4M	QE3F

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Se administraron inmunizaciones de la manera siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo A (6 gatos)	Inmunización
(Días)
Inmunización primaria: env de ALVAC (VCP242)		Día 0
Inmunización secundaria: env de ALVAC		Día 28
Inmunización terciaria: env de ALVAC		Día 56

Grupo B (6 gatos)
Inmunización primaria: env de ALVAC, gag/pro (vCP255)		Día 0
Inmunización secundaria: env de ALVAC, gag/pro		Día 28
Inmunización terciaria: env de ALVAC, gag/pro		Día 56

Grupo C (6 gatos)
Inmunización primaria: gag/pro de ALVAC (vCP253)		Día 0
Inmunización secundaria: gag/pro de ALVAC		Día 28
Inmunización terciaria: gag/pro de ALVAC		Día 56

Grupo D (6 gatos)
Inmunización primaria: 97TM gag/pro de ALVAC (vCP329)		Día 0
Inmunización secundaria: 97TM gag/pro de ALVAC		Día 28
Inmunización terciaria: 97TM gag/pro de ALVAC		Día 56

Grupo E (6 gatos/control)
Inmunización primaria: ALVAC (CPpp)		Día 0
Inmunización secundaria: ALVAC		Día 28
Inmunización terciaria: ALVAC		Día 56

Grupo F (3 gatos/refuerzo)
Inmunización primaria: env de ALVAC, gag/pro (vCP255)		Día 0
Inmunización secundaria: env, gag/pro de ALVAC		Día 28
Refuerzo: vacuna celular de VIF inactivado (VCI)		Día 56

Grupo G (3 gatos/control)
Inmunización primaria: ALVAC		Día 0
Inmunización secundaria: ALVAC		Día 28
Refuerzo: vacuna celular de VIF		Día 56

\newpage

Todos los gatos recibieron 1 x 10^{8} PFU del recombinante ALVAC respectivo en 1 ml de PBS estéril por la vía intramuscular. El refuerzo de VCI consistió en 2,5 x 10^{7} células T infectadas por VIF Petaluma alogénico (línea celular FI-4), mezcladas con 250 \mug de dipéptido muramilo (Hosie et al., 1995). El refuerzo VCI se administró subcutáneamente.

Reto: todos los gatos se retaron mediante una administración intraperitoneal (IP) 4 semanas después de la inmunización final con 50 CID_{50} de VIF-Petaluma (sobrenadante libre de células derivado de cultivos de PBMC infectados con la cepa Petaluma de VIF).

Los ensayos siguientes se llevaron a cabo para determinar el estatus virológico específico para VIF de los animales retados. Esto proporcionó una medición directa de la eficacia protectora de los candidatos a vacuna para VIF basada en ALVAC.

1): Aislamiento de virus. la detección de VIF infeccioso mediante ensayo de RT. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PMBCs), células de la médula ósea (BM), y células de nódulo linfático (LN) tras el reto, para el aislamiento de virus (Yamamoto et al., 1991, 1993; Okada et al., 1994). El aislamiento de los virus se llevó a cabo mediante seguimiento de la actividad de transcriptasa inversa (RT) en sobrenadantes de cultivo. Las células aisladas se cultivaron en presencia de IL-2 durante 4 semanas. Alícuotas de un ml mediante procedimientos estándar para la actividad de RT dependiente de Mg^{++} (específico para lentivirus).

2): PCR específica para VIF. La detección de las secuencias províricas se llevó a cabo en ADN extraído de células PBMC, BM y LN. Como medio para incrementar la sensibilidad, se utilizaron cuatro conjuntos de cebadores de consenso para amplificar las regiones codificantes específicas para env o para gag, respectivamente (Yamamoto et al., 1991; Okada et al., 1994).

Tras la amplificación por PCR inicial, 1/25avo del producto se amplificó nuevamente con el par de cebadores anidados.

Los resultados de los ensayos virológicos para las muestras antes y después del reto se presentan en las Tablas 3 y 4. Ninguno de los gatos manifestó viremia de VIF previamente al reto, evaluado mediante una determinación RT o mediante el análisis de PCR específico para VIF (Tabla 3). Transcurridas 8 semanas del reto, 4 de los 6 gatos inmunizados con tres dosis del virus ALVAC parental desarrollaron una viremia persistente específica de VIF (Tabla 3). La infección de estos gatos también pudo demostrarse mediante el aislamiento del virus y PCR en muestras de tejido extraídas después del reto y por la aparente seroconversión específica para VIF posterior al reto (Tablas 4 y 5). No se observaron indicaciones claras de infección en los dos otros gatos (QA4 y QE3) en el grupo de control. Además, en comparación con este grupo de control, no se observaron diferencias significativas de eficacia en los grupos de gatos que recibieron tres inoculaciones (10^{8} pfu/dosis) de env de ALVAC-VIF (vCP242), env/gag-pr de ALVAC-VIF (vCP255) o 97TMG de ALVAC-VIF (vCP329).

De manera significativa, tres administraciones de gag-pr de ALVAC-VIF (vCP253) proporcionaron protección completa frente a la exposición al reto de VIF. La protección frente a la infección resultó claramente evidente en la totalidad de los seis gatos a lo largo de todo el periodo de observación posterior de 29 semanas posteriores al reto mediante aislamiento de los virus y PCR específica para VIF en tejido periférico y linfoide (Tablas 3 y 4). Además, estos gatos tampoco se seroconvirtieron respecto a la serorreactividad a VIF según transferencia western o ELISA (Tablas 4 y 5). Con el fin de establecer adicionalmente la eficacia de vCP253, se transfirieron células (PBMCs, nódulo linfático y médula ósea) de dos animales en este grupo se transfirieron a gatos pequeños SPF. Estos gatos hasta el momento han proporcionado resultados negativos en los ensayos según el aislamiento de virus (RT y PCR) y transferencia western específica para VIF, mientras que los gatos SPF que recibieron células similares de un gato de control infectado (Py2) resultaron claramente positivos para la infección según estos criterios.

Colectivamente, estos resultados muestran Gag-pr resulta suficiente para proteger frente a una exposición a reto de lentivirus. Tal como se muestra en la Tabla 6, estos resultados en efecto son estadísticamente significativos. Los resultados también demuestran que la presencia de Env puede interferir de hecho con el establecimiento de una respuesta inmunológica protectora. Además, los datos del brazo experimental en el que los gatos recibieron vCP255 (2x) seguido de inmunógeno VCI ilustran que puede superarse cualquier defecto en Env mediante este régimen de inducción/refuerzo (Tablas 3 y 4). Claramente, la actividad de inducción aportada por vCP255 resultó útil de cara a la protección, debido a que los gatos en el grupo que recibió 2 administraciones de virus parental ALVAC seguidas de VCI se infectaron con facilidad tras exponerlos al reto (Tablas 3 y 4).

En resumen, estos datos dan a conocer por primera vez la producción de protección frente a la infección por VIF en gatos mediante la utilización de una subunidad inmunogénica, que incluía únicamente Gag-pr de VIF. De hecho, la presencia de Env podría presentar una eficacia reducida.

La importancia de estos resultados también resulta generalmente evidente en relación al desarrollo de una vacuna contra los lentivirus. La protección únicamente con Gag-pr proporciona varios elementos importantes para el diseño de vacunas y de diagnósticos. En primer lugar, pueden utilizarse con facilidad ensayos basados en Env ya existentes para discriminar entre individuos vacunados e infectados. En segundo lugar, Gag-pr aparentemente es menos variable que las especies de Env entre aislados de lentivirus y de esta manera podría servir para proveer respuestas protectoras cruzadas.

TABLA 3 Aislamiento de virus (ensayo de transcriptasa inversa y PCR en PBMCs)

Vacuna	nº de cat.	Pre-reto	Post-reto
			4 semanas	8 semanas	12 semanas	17 semanas
		RT	RT	PCR	RT	PCR	RT	PCR	RT	PCR
		PCR
env de	QH4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
ALVAC	PY1	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+
	QQ1	-	-	+	+	+	+	T	T
	QC1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QU1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QL2	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+
Eng,	QH5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
gag/prot	PY3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
de ALVAC	QS4	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+
	QC3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QG3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QE2	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+
gag/prot	QQ1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
de ALVAC-	QA5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QU2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QX3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QI1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QL3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
97TM o	QQ2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
gag/prot	PY5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
de ALVAC	QO2	-	-	+	+	+	+	T+	T+
	QX4	-	-	+	+	+	+	+	+	-	-
	QI2	-	-	-	+	+	+	+	+	+	+
	QL4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
control	QH2	-	-	+	+	+	+	T*
ALVAC	PY2	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+
	QA4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	QC4	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+
	QG5	-	-	+	+	+	+	T*
	QE3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
env, gag,	QH3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
prot y VCI	PY4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
de ALVAC	QA6	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
control	QC5	-	-	+	+	+	+	+	+	T*
y VCI	QG4	-	-	+	+	+	+	+	+	T*
de ALVAC	QE4	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+
*T: el animal fue eutanizado
ND: no determinado

TABLA 4 Aislamiento final de virus en muestras de PBMC y de tejido

Vacuna	nº de	Muestra de tejido
	cat.
		PBL-RT	PCR	LN-RT	PCR	BM-RT	PCR	THY-RT	PCR	WB	ELISA	Tejidos
												extraídos
												a las x
												semanas
												post-
												reto
env de	QH4	-	"+"	-	"+"	-	"+"	-	-	-	-	27
ALVAC	PY1	-	-	-	+	-	-	+	+	+	+	24
	QQ1	+	+	+	+	+	+	ND	ND	+	+	10
	QC1	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	28
	QU1	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	28
	QL2	-	-	+	+	+	+	-	-	+	+	24
Eng,	QH5	-	-	-	-	-	-	-	-	ND	-	28
gag/prot	PY3	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	27
de ALVAC	QS4	-	-	+	+	-	+	-	-	+	+	24
	QC3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	28
	QG3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	28
	QE2	-	"+"	-	+	-	+	-	"+"	+	+	28
gag/prot	QQ1	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	29
de ALVAC-	QA5	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	29
	QU2	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	29
	QX3	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	29
	QI1	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	29
	QL3	-	-	-	-	-	-	ND	ND	-	-	29
97TM o	QQ2	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	27
gag/prot	PY5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	28
de ALVAC	QO2	+	+	+	+	+	+	ND	ND	+	+	10
	QX4	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-/+	25
	QI2	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	25
	QL4	-	-	-	-	-	-	-	-	ND	-	27
control	QH2	+	+	+	+	+	+	ND	ND	+	-/+	10
ALVAC	PY2	+	+	-	-	-	+	ND	ND	+	-	39
	QA4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	28
	QC4	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	26
	QG5	-	+	+	+	-	+	ND	ND	+	+	10
	QE3	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	28
env, gag,	QH3	-	-	-	-	-	-	ND	ND	+	-	36
prot y VCI	PY4	-	-	-	-	-	-	ND	ND	+	-	36
de ALVAC	QA6	-	-	-	-	-	-	ND	ND	+	-	36
control	QC5	+	+	+	+	-	-	ND	ND	+	+	10
y VCI	QG4	-	+	+	+	-	+	ND	ND	+	+	10
de ALVAC	QE4	+	+	ND	ND	+	+	ND	ND	+	+	39
*T: Animal no eutanizado
ND: no determinado
"+": manifiesta ser sólo muy débilmente positivo en la PCR
Nota: transferencia Western: dilución del suero: 1:100
ELISA: dilución del suero: 1:200. Péptido transmembranal utilizado: QELGCNQNQFFCK1

Ejemplo 8 Los recombinantes ALVAC-VIF inducen inmunidad protectora contra el reto por VIF de múltiples subtipos en gatos Materiales y métodos

Animales: se adquirieron animales específicos libres de patógenos (SPF) de Liberty Research, Inc.

Preparación de la vacuna: se generaron recombinantes (ALVAC)-VIF de poxvirus del canario tal como se ha descrito anteriormente (vCP255). La vacuna de ALVAC vCP255 se preparó a partir de lisado libre de suero de CEF infectadas. Se administraron las inmunizaciones de ALVAC vCP255 a 1 x 10^{8} PFU intramuscularmente. La vacuna celular inactivada (VCI) consistía de 2 x 10^{8} células FI-4 inactivadas con paraformaldehído (una línea celular linfoide infectada crónicamente por VIF Petaluma) mezclada con 250 \mug de SAF/adyuvante MDP (Hoise et al., 1995) y se administró subcutáneamente.

Protocolo de agrupamiento y de inmunización: el estudio de reto involucraba 6 gatos; el grupo inmunizado con env,gag/pro/VCI de ALVAC (nº PY4, nº QH3, nº QA6) que recibió el reto de VIF Petaluma descrito en el Ejemplo 7 y un grupo de control de tres gatos SPF de edades correspondientes (nº EJ2, nº DH3, nº GU5) que no habían recibido ninguna inmunización previamente al reto con VIF Bangston (ver la Tabla 5).

Reto: el segundo inóculo de reto consistía en 75 ID_{50} VIF Bangston libre de células (subtipo B) y se administró 8 meses después del reto inicial por VIF Petaluma (ver el Ejemplo 7).

Seguimiento de la inmunogenicidad: se determinó la inducción de respetas de anticuerpo específicas para VIF mediante transferencia Western (inmunotransferencia). Las respuestas de anticuerpo neutralizantes de virus (VNA) se determinaron utilizando ensayos descritos con anterioridad (Yamamoto et al., 1991).

Seguimiento de la infectividad vírica: se realizó un seguimiento de la infección vírica mediante varios procedimientos. Entre ellos se incluían la evaluación de la actividad de transcriptasa inversa vírica en PBMC, en células de médula ósea y de nódulo linfático obtenidas en diversos momentos posteriores al reto mediante procedimientos descritos con anterioridad (Yamamoto et al., 1991). Además, se realizo un seguimiento del ADN provírico (infección latente) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores env de VIF en ADN extraído de PBMC, de células de médula ósea y de nódulo linfático tras cultivar para actividad de RT (Yamamoto et al., 1991; Okada et al., 1994). Además, se determinó la existencia de infección por VIF mediante el seguimiento y la comparación del carácter de las respuestas humorales específicas para VIF y las respuestas de anticuerpos neutralizantes de virus (VN) en suero obtenido antes y después del reto.

Resultados y comentario

Se evaluó la inmunogenicidad y eficacia protectora de los protocolos de inducción/refuerzo para ALVAC contra el reto experimental con un aislado de VIF claramente heterólogo (cepa Bangston). En primer lugar, se comparó la eficacia protectora de inmunizar con env,gag/pol de ALVAC solo con la inducción con env,gag/pol de ALVAC seguido del refuerzo con vacuna de células infectadas por VIF inactivadas (VCI). Todos los gatos recibieron un total de tres inmunizaciones y se retaron 4 semanas después de la inmunización final con 50 ID50 libres de células de VIF Petaluma (ver el Ejemplo 7). El aislado de VIF Petaluma, al igual que el aislado de VIF Villefranche utilizado para generar la vacuna de recombinante ALVAC-VIF, se clasifica como un virus de subtipo A y difiere de VIF Villefranche respecto a las regiones codificantes de aminoácidos de Env y de Gag en el 1% y el 3%, respectivamente.

A continuación, se evaluó si los gatos inmunizados con env,gag/pro/ICV de ALVAC (nº QA6, nº QH3, nº PY4) que resistieron el reto por VIF Petaluma descrito en el Ejemplo 7, podían protegerse de un segundo reto con un aislado de VIF claramente heterólogo de otro subtipo. El segundo reto consistió en 75 ID_{50} de VIF Bangston libre de células (derivado de PMBC) y se administró a los 8 meses del reto inicial sin ningún refuerzo entre medio. El virus VIF Bangston es un aislado de subtipo B y difiere de VIF Petaluma (subtipo A) en el 21% en la región codificante de los aminoácidos de la glucoproteína de cubierta. Tres gatos SPF de edades correspondientes (nº EJ2, nº GU5, nº DH3) sirvieron como gatos de control par el reto por VIF Bangston. Tal como se presenta en la Tabla 7, todos los gatos de control resultaron fácilmente infectados tras el reto. Por el contrario, los gatos inmunizados con env,gag/pro/ICV de ALVAC, nº QH3 y nº QA6, siguieron siendo negativos para el virus según se determinó mediante aislamiento del virus (RT) y PCR de sangre periférica hasta tres meses después del reto. El gato nº PY4 siguió siendo negativo para el virus según se determinó mediante aislamiento del virus (RT) de sangre periférica pero dio positivo en la PCR tres meses después del reto. El análisis de la secuencia de nucleótidos del producto de PCR reveló secuencias específicas del VIF Bangston. De esta manera, los gatos inmunizados con env,gag/pro/VCI resultaron protegidos parcialmente de un reto por VIF de subtipo heterólogo. Resulta claro que estos gatos demostraron, como mínimo, un retraso de la infección, debido a que todos los gatos dieron positivo en el análisis de PCR a las 12 semanas del reto. Esto demuestra una potencial utilidad de los recombinantes que expresan Env.

En resumen, los protocolos de inducción/refuerzo que implican la inducción con recombinantes de ALVAC seguido del refuerzo con vacunas de células infectadas por VIF inactivado pueden inducir inmunidad protectora contra el reto experimental con cepas heterólogas de VIF. Esta inmunidad es duradera y también proporciona protección parcial frente a cepas de VIF claramente heterólogas de otros subtipos. Estos datos apoyan un papel para las respuestas mediadas por células y no por anticuerpos neutralizantes de los virus o de respuestas de anticuerpos específicas para VIF. Estos resultados son relevantes no sólo para el desarrollo de vacunas contra VIF de múltiples subtipos, sino también para el desarrollo de vacunas eficaces contra VIH de múltiples subtipos (así como vacunas de múltiples subtipos para otros lentivirus y otros retrovirus), ya que continúan surgiendo nuevos subtipos y los subtipos existentes crecientemente se están extendiendo a nuevas áreas geográficas.

Se llevó a cabo una prueba exacta de Fisher. Ésta es una modificación de la prueba de Chi cuadrado. Esta prueba debe utilizare al comparar dos grupos de datos discontinuos cuánticos (todos o ninguno). El diseño del análisis fue el siguiente:

	Vacunado	No vacunado
Infectado	A	B
No infectado	C	D

Para una probabilidad de una sola cola, el valor de P se calculó como:

P(probabilidad) = (A+B)!(C+D)!(A+C)!(B+D)!/N!A!B!C!D!

Cada grupo se comparó al grupo de control de ALVAC (n=6) y al grupo de control de ALVAC + grupo de control de ALVAC y VCI (n=9). Se consideró significativo un valor de P igual o inferior a 0,05.

TABLA 5 Títulos de anticuerpo neutralizante de virus tras la inmunización

	Título de VN
Vacuna	nº ID de cat.	pre-inmunización	post-inmunizaciones	posterior al reto
				3 meses	12 meses
env de	QU1	<5	<5	<5
ALVAC	PY1	<5	<5	>100
gag/prot	QX3	<5	<5	<5	<5
de ALVAC	QQ1	<5	<5	<5	<5
	QI1	<5	<5	<5	<5
	QL3	<5	<5	<5	<5
env,gag/pro	QS4	<5	<5	>100
de ALVAC	PY3	<5	<5	<5
env,gag/prot	QH3	<5	<5	5 a 20	<5
de ALVAC	QA3	<5	<5	5 a 20	<5
y VCI	PY4	<5	<5	5 a 20	5 a 20
control	QC4	<5	<5	>100
de ALVAC	PY4	<5	<5	>100	ND^{a}
	QA4	en prep.
	QE3	en prep.
control de	QG4	<5	<5	>100
ALVAC y ICV	QC5	<5	<5	>100
	QE3	<5	<5	>100	ND
^{a} ND - No determinado

TABLA 6 Significancia estadística de los datos de eficacia

vacuna	estatus vírico
	grupo de	grupo de	valor de P	significativo
	vacuna +/-	control +/-	(una cola)
		(control)
env de	3/3	4/2	0,5	no
ALVAC		7/2	0,28	no
gag/prot	0/6	4/2	0,0303	sí
de ALVAC		7/2	0,00914	sí
env,gag/prot	2/4	4/2	0,28	no
de ALVAC		7/2	0,118	no
97TMG	3/3	4/2	0,5	no
de ALVAC		7/2	0,28	no
env,gag/prot	0/3	3/0	0,05	sí
de ALVAC
IWC	0,3	7/2	0,00914	sí
Todos los	8/19	7/2	0,0158	sí
grupos
combinados

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 Parámetros antes y después del reto secundario (VIF Bangston)

título WB antes del	VN antes del	VN después del	después del reto	Tasa de
reto secundario	reto secundario^{a}	reto secundario^{b}	secundario^{b}	protección
	título	título	título	título	título	estatus
	de	de	de	de	de WB	vírico
	VIF_{pet}	VIF_{bang}	VIF_{pet}	VIF_{bang}		RT/PCR
QA6	+(4-5)	<5	ND	>5	ND	+(3-4)	-/-
QH3	+(4)	<5	ND	>5	ND	+(3)	-/-	2/3
PY4	+(4-5)	5 a 20	ND	>5	ND	+(3-4)	-/+
GU5	0(<2)	<5	<5	ND	ND	+(4-5)	+/+
DH3	0(<2)	<5	<5	ND	ND	+(5)	+/+	0/3
EJ2	0(<2)	<5	<5	ND	ND	+(4)	+/+
^{a} Muestra de suero obtenida 8 meses después del reto, el día del reto secundario
^{b} Suero obtenido 4 meses después del reto secundario
^{c} ND - No determinado

Ejemplo 9 Generación de recombinantes adicionales NYVAC y TROVAC

Mediante la utilización de las estrategias descritas de manera general anteriormente para generar ADN codificante de VIF ligado a un promotor, se utiliza ADN flanqueante para NYVAC y TROVAC para insertar en regiones de estos vectores, análogamente a las realizaciones en la patente US nº 5.494.807 y documento USSN nº 08/417.210, con el fin de generar recombinantes NYVAC y TROVAC de VIF. El análisis demuestra que el ADN exógeno se ha incorporado en los vectores y que se ha producido la expresión del mismo. Estos recombinantes adicionales resultan útiles de la misma manera que las realizaciones de ALVAC anteriormente descritas.

Ejemplo 10 Generación de lentivirus adicionales y de recombinantes adicionales de sistemas vectores

Mediante la utilización de estrategias análogas a aquéllas descritas de manera general anteriormente para la generación de ADN codificante de VIF ligado a un promotor, y las estrategias para generar sistemas alternativos de poxvirus, baculovirus, adenovirus, virus herpes, alfavirus, poliovirus, virus Epstein-Barr, sistemas bacterianos y sistemas basados en ADN en los documentos citados en la presente memoria y el conocimiento del ADN codificante de lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, de los documentos citados en la presente memoria, se generan recombinantes alternativos poxvirus, baculovirus, adenovirus, virus herpes, alfavirus, poliovirus, virus Epstein-Barr, recombinantes bacterianos y recombinantes basados en ADN que contienen y expresan ADN procedente de lentivirus, retrovirus o virus de inmunodeficiencia, por ejemplo VAIE, VIF, VIB, VIH o VIS, tales como Env, Gag y proteasa, y Gag y proteasa. El análisis demuestra que el ADN exógeno se ha incorporado en los vectores y que se ha producido la expresión del mismo. Estos recombinantes adicionales resultan útiles de la misma manera que las realizaciones de ALVAC anteriormente descritas.

Referencias

1. Abimiku, A., Franchini, G., Tartaglia, J., Aldrich, K., Myagkikh, M., Markham, P.D., Chong, P., Klein, M., Kieny, M.P., Paoletti, E., Gallo, R.C., and Guroff, M.R., Nature Medicine 1, 321-329 (1995).

2. Altenburger, W., C-P. Suter and J. Altenburger, Archives Virol. 105, 15-27 (1989). Beatty, J. et al., Journal of Virology 70, 6199-6206 (1996).

3. Behbehani, A.M., Microbiological Reviews 47, 455-509 (1983).

4. Bergoin, M., and Dales, S., In Comparative Virology, eds. K. Maramorosch and E. Kurstak, (Academic Press, NY) pp. 169-205 (1971).

5. Berman, P., Gregory, T., Riddle, L., Nakamura, G., Champe, M., Porter, J., Wurm, F., Hershberg, R., Cobb, E. and Eichberg, J., Nature 345, 622-625 (1990).

6. Bocchia, M. et al., Blood 85, 2680-2684.

7. Buller, R.M.L., G.L. Smith, Cremer, K., Notkins, A.L. and Moss, B., Nature 317, 819-815 (1985).

8. Cadoz, M., A. Strady, B. Meignier, J. Taylor, J. Tartaglia, E. Paoletti and S. Plotkin, The Lancet, 339,1429-1432 (1992).

9. Child, S.J., Palumbo, G.J., Buller, R.M.L. and Hruby, D.E. Virology 174, 625-629 (1990).

10. Clements, M.L., Weinhold, K., Siliciano, R., Schwartz, D., Matthews, T., Graham, B., Keefer, M., McElrath, J., Gorse, G., Hsieh, R., Duliege, A.M., Excler, J., Meignier, B., Tartaglia, J., and Paoletti, E., HIV immunity induced by canarypox (ALVAC)-MN g1160, -SF-2, rgp120 or both. XI International Conference on AIDS/Vancouver 1996/Mo.A.281 (1996).

11. Clewell, D.B. and D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969).

12. Clewell, D.B., J. Bacteriol 110, 667-676 (1972).

13. Cox, W.I., Tartaglia, J., and E. Paoletti, Virology 195, 845-850 (1993).

14. Daniel, M.D., Kirchhoff, F., Czajak, S.C., Sehgal, P.K., and Descssers, R., Science 258, 1938-1941 (1992).

15. Drillien et al., Virology 111, 488-499 (1981).

\newpage

16. Edbauer, C., R. Weinberg, J. Taylor, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Virology 179, 901-904 (1990).

17. Eldridge, J.H., et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 146:59-66 (1989).

18. Emini, E., Schleif, W., Nunberg, J., Conley, A., Eda, Y., Tokiyoshi, S., Putney, S., Matsushita, S., Cobb, K., Jett, C., Eichberg, J., and K. Murthy, Nature 355, 728-730 (1992).

19. Engelke, D.R., Hoener, P.A., and Collins, F.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988).

20. Englehard, V.H., Ann. Rev. Immunol. 12:181 (1994).

21. Franchini, G., Tartaglia, J., Markham, P., Benson, J., Fullen, J., Wills, M., Arp, J., Dekaban, G., Paoletti, E., and Gallo, R.C., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11, 307-313 (1995).

22. Francini, G. Guroff, M.R., Tartaglia, J., Aggarwal, A., Abimiku, A., Benson, J., Markham, P., Limbach, K., Hurteau, G., Fullen, J., Aldrich, K., Miller, N., Sadoff, J., Paoletti, E., and Gallo, R.C., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11, 909-920 (1995).

23. Fries et al., 32nd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Anaheim. CA (October 1992).

24. Fries, L.F., Tartaglia, J., Taylor, J., Kauffman, E. K., Meignier, B., Paoletti, E., and Plotkin, S., Vaccine 14, 428-434 (1996).

25. Fultz, -P., Nara, P., Barre-Sinoussi, F., Chaput, A., Greenberg, M., Muchmore, E., Kieny, M.-P. and Girard, M. Science 256, 1687-1689 (1992).

26. Funahashi, S., T. Sato and H. Shida, J. Gen. Virol. 69, 35-47 (1988).

27. Gillard, S., Spehner, D., Drillien, R., and Kirn, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5573-5577 (1986).

28. Girard, M., Kieny, M.-P., Pinter, A., Barre-Sinoussi, F., Nara, P., Kolbe, H., Kusui, K., Chaput, A., Reinhart, T., Muchmore, E., Ronco, J., Kaczorek, M., Gomard, E., Gluckman, J.-C. and Fultz, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88.

29. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow and E. Paoletti, Virology 179, 517-563 (1990b).

30. Goebel, S.J., Johnson, G.P., Perkus, M.E., Davis, S.W., Winslow, J.P., Paoletti, E., Virology 179, 247-266 (1990a).

31. Goldstein, D.J. and S.K. Weller, Virology 166, 41-51 (1988). Gouin P. et al., Veteoluacy Microbiology 45, 393-401, (1995).

32. Goodman-Snitkoff et al., J. Immunol. 147:410-415 (1991).

33. Guo, P., Goebel, S., Davis, S., Perkus, M.E., Languet, B., Desmettre, P., Allen, G., and Paoletti, E., J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).

34. Guo et al., J. Virol. 64, 2399-2406 (1990).

35. Hardy, Jr., W.D. in Retrovirus Biology and Human Disease, Gallo, R.C. and Wong-Staal, eds., Marcel Dekker, New York, pp. 33-86, 1990.

36. Heeney, J.L. Holterman, L., ten Hoaft, P., et al., AIDS Res. Human. Retrovir. 10 suppl. 2, S117-S121 (1994).

37. Hoise, M.J., Osborne, R. Yamamoto, J.K., Neil, J.C., and Jarrett, O. J. Virol. 69, 1253-1255 (1995).

38. Hruby, D.E. and L.A. Ball, J. Virol. 43, 403-409 (1982).

39. Hruby, D.E., R.A. Maki, D.B. Miller and L.A. Ball, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3411-3415 (1983).

40. Hu, S.-L., Polacino, P., Klaniecki, J., Travis, B., Wrey, T., Pennathur, S., Stallard, V., Kornas, H., Langlois, A.J., and Benveniste, R.E. (1995) AIDS Research and Human Retroviruses 11:5136.

\newpage

41. Hu, S.-L., Polacino, P. Stallard, V., Klaniecki, J., Pennathur, S., Travis, B.M., Misher, L., Kornas, H., Langlois, A.J., Morton, W.R., and Benveniste, R. Retroviruses of Human AIDS and Relatad Animal Diseases Nuviéme Colloque des Cent Gardes: pg. 275-281, (1994).

42. Hu, S.-L., Abrams, K., Barber, G., Morn, P., Zarling, J., Langlois, A., Kuller, L., Morton, W. and Benveniste, R., Science 255, 456-459 (1992).

43. Ichihashi, Y. and Dales, S., Virology 46, 533-543 (1971).

44. Issel, C.J., Horohov, D.W., Lea, D.F. et al., J. Vlrology 66, 3398-3408 (1992).

45. Itamura, S., H. Linuma, H. Shida, Y. Morikawa, K. Nerome and A. Oya, J. Gen. Virol. 71, 2859-2865 (1990).

46. Jacobson, J.G., D.A. Leib, D.J. Goldstein, C.L. Bogard, P.A. Schaffer, S.K. Weller and D.M. Coen, Virology 173, 276-283 (1989).

47. Jamieson, A.T., G.A. Gentry and J.H. Subak-Sharpe, J. Gen. Virol. 24, 465-480 (1974).

48. Johnson, C.A., Torres, B.A., Koyama, H., and Yamamoto, J.K AIDS Res. and Human. Retrovir. 10, 225-228 (1994).

49. Kato, S., M. Takahashi, S. Kameyama and J. Kamahora, Biken's 2, 353-363 (1959).

50. Kendrew, In The Encyclopedia of Molecular Biology (Blackweil Sclence Ltd.) (1995).

51. Konishi et al., Virology 190, 454-458 (1992).

52. Kotwal, G.J. and B. Moss, Virology 167, 524-537 (1988b).

53. Kotwal, G.J. and Moss, B., Nature (Lond.) 335, 176-178 (1988a).

54. Kotwal, G.J., S.N. Isaacs, R. McKenzie, M.M. Frank and B. Moss, Science 250, 827-830 (1990).

55. Kotwal, G.J., A.W. Hugin and B. Moss, Virology 171, 579-587 (1989a).

56. Kotwal, G.J. and B. Moss, J. Virol. 63, 600-606 (1989b).

57. Kreuter, J., In Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, M. Donbrow, ed. (CRC Press) p.125-148.

58. Kuby, Janis, Immunology, pp. 79-81 (1992).

59. Lai et al., Virus Res. 12, 239-250 (1989).

60. Lawrence, C., Weinhold, K., McElrath, J., Excler, J.L. Duliege, A.M., Clements, M.L., Belche, R., Dolin, R., and Graham, B., AVUE 022: safety and immunogenicity of live recombinant canarypox vector containing the envelope,gag and protease genes of HIV-1 in seronegative adult volunteers. XI International Conference on AIDS/Vancouver 1996/Mo.A.282 (1996).

61. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7182 (1986).

62. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. In Molecular cloning: a laboratory manual, (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) (1982).

63. Matthews, R.E.F., Intervirology 17, 42-44 (1982).

64. Miller et al., J. Exp. Med. 176, 1739-1744 (1992).

65. Milstein, C., scientific American 243, 66, 70 (1980).

66. Morgan, A.J., M. Mackett, S. Finerty, J.R. Arrand, F.T. Scullion and M.A. Epstein, J. Med. Virol. 25, 189-195(1988).

67. Morikawa, S. and Bishop, D., Virol. 186, 389-397 (1992).

68. Moss, B., E. Winters and J. A. Cooper, J. Virol. 40, 397-395 (1981).

69. Nabel et al., Tibtech, May, 11, 211-215 (1993).

70. Okada, S. Ruiyu, P., Young, E., Stoffs, W.V., and Yamamoto, J.K., AIDS Res. and Human Retrovir, 10, 1739-1746 (1994).

71. Paez et al., PNAS USA 82, 3365-3369 (1985): see also Paez et al., Virology 169, 418-426 (1985).

72. Palumbo, G.J., Pickup, D.J., Fredrickson, T.N., Mcintyre, L.J., and Buller, R.M.L., Virology 172, 262-273 (1989).

73. Panicali, D., Davis, S.W., Mercer, S.R., and Paoletti, E., J. Virol. 37, 1000-1010 (1981).

74. Panicali, D. and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4921 (1982).

75. Patel, D.D. and Pickup, D.J., EMBO 6, 3787-3794 (1987).

76. Patel, D.D., Ray, C.A., Drucker, R.P., and Pickup, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9431-9435 (1968).

77. Pedersen, N.C., Ho, E.W., Brown, M.L., and Yamamoto, J.K., Science 235, 790-793 (1987).

78. Perkus, M.E., S.J. Goebel, S.W. Davis, G.P. Johnson, E.K. Norton and E. Paoletti, Virology 180, 406-410 (1991).

79. Perkus, M.E., Goebel, S.J., Davis, S.W., Johnson, G.P., Limbach, K., Norton, E.K., and Paoletti, E., Virology 179, 276-286 (1990).

80. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas and E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985).

81. Perkus, M.E., Limbach, K., and Paoletti, E., J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).

82. Perkus, M. E., D. Panicali, S. Mercer and E. Paoletti, Virology 152, 285-297 (1986).

83. Pialoux et al., Aids Research and Human Retroviruses, 11(3):373-81 (1995).

84. Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, Methods in Enzymology 153, 545-563 (1987).

85. Pickup, D.J., B.S. Ink, B.L. Parsons, W. Hu and W.K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6817-6821 (1984).

86. Pickup, D.J., B.S. Ink, W. Hu, C.A. Ray and W.K. Joklik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7698-7702 (1986). Pincus et al., Biologicals 23, 159-164 (1995).

87. Sadora, D.L., Shapaer, E.G., Kitchell, B.E., Dow, S.W., Hoover, E.A., and Mullins, J.I., J. Virol, 68 (1994).

88. Sanger, F., Nickel, S. Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467 (1977).

89. Schmidtt, J.F.C. and H.G. Stunnenberg, J. Virol. 62, 1889-1897 (1988).

90. Shida, H., Virology 150, 451-462 (1986).

91. Shida, H., T. Tochikura, T. Sato, T. Konno, K. Hirayoshi, M. seki, Y. Ito, M. Hatanaka, Y. Hinuma, M. Sugimoto, F. Takahashi-Nishimaki, T. Maruyama, K. Miki, K. Suzuki, M. Morita, H. Sashiyama and M. Rayami, EMBO 6, 3379-3384 (1987).

92. Shida, H., Hinuma, Y., Hatanaka, M., Morita, M., Kidokoro, M., Suzuki, K., Maruyzam, T., Takahashi-Nishimaki, F., Sugimoto, M., Kitamura, R., Miyazawa, T., and Hayami, M., J. Virol. 62, 4474-4480 (1988).

93. Slabaugh, M., N. Roseman, R. Davis and C. Mathews. J. Virol. 62, 519-527 (1988).

94. Song, W., Collison, E.W., Bilingsley, P., and Brown, W.C. J. Virol. 66, 5409-5417 (1992).

95. Stanberry, L. R., S. Kit and M. G. Myers, J. Virol. 55, 322-328 (1985).

96. Tabor, S. and C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987).

97. Tartaglia, J., Jarrett, O., Desmettre, P., Paoletti, E., J. Virol. 67, 2370-2375 (1993b).

\newpage

98. Tartaglia, J., Perkus, M.E., Taylor, J., Norton, E.K., Audonnet, J.-C., Cox, W.I., Davis, S.W., Van Der Hoeven, J., Meignier, B., Riviere, M., Languet, B., Paoletti, E., Virology 188, 217-232 (1992).

99. Tartaglia, J., Pincus, S., Paoletti, E., Critical Reviews in Immunology 10, 13-30 (1990a).

100. Tartaglia, J., J. Taylor, W.I. Cox, J.-C. Audonnet, M.E. Perkus, A. Radaelli, C. de Giuli Morghen,
B.-Meignier, M. Riviere, K. Weinhold & E. Paoletti. In - AIDS Research Reviews, W. Koff, F. Wong-Staal & R.C. Kenedy, Eds., Vol. 3, Marcel Dekker, NY, pp. 361-378 (1993a).

101. Tartaglia, J. & E. Paoletti, In Immunochemistry of Viruses, II. The Basis for Serodiagnosis and Vaccines. M.H.V.van Regenmortel & A.R. Neurath, Eds. 125-151. Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1990b).

102. Taylor, J., R. Weinberg, J. Tartaglia,- C. Richardson, G. Alkhatib, D. Briedis, M. Appel, E. Norton & E. Paoletti, Virology 187, 321-328 (1992).

103. Taylor, J., Edbauer, C., Rey-Senelonge, A., Bouquet, J.-F., Norton, E., Goebel, S., Desmettre, P., Paoletti, E., J. Virol. 64, 1441-1450 (1990).

104. Taylor, J., Weinberg, R, Kawaoka, Y., Webster, R.G., and Paoletti, E., Vaccine 6, 504-508 (1988a).

105. Taylor, J., R. Weinberg, B. Lanquet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988b).

106. Taylor, G., E. J. Stott, G. Wertz and A. Ball, J. Gen. Virol. 72, 125-130 (1991a).

107. Taylor, J., C. Trimarchi, R. Weinberg, B. Languet, F. Guillemin, P. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 9, 190-193 (1991b).

108. Van der Ryst, E., Fultz, P.N., Tartaglia, J., Barre-Sinnousi, F., Paoletti, E., Nara, P., Meignier, B., Blondeau, C., Muchmore, E., and Girard, M., Protection from HIV-1 challenge in chimpanzees by immunization with a canarypox virus recombinant. XI International conference on AIDS/Vancouver/1996, We.A.280 (1996).

109. Verschoor, E.J., Willemse, M.J., Stam, J.G., van Vliet, A.L. W., Pouwels, H., Chalmers, S.K., Horzinek, M.C., Sandermeijer, P.J.A., Hesselink, W., and de Ronde, A., Vaccine 14, 285-289 (1996).

110. Vos, J. and Stunnenberg, H., EMBO J. 7, 3487-3492 (1988).

111. Wang, R-F and Mullins, J.I., Gene 153, 197-202 (1995). Wardley et al., J. Gen. Virol 73, 1811-1818 (1992).

112. Webster et al., Vaccine, 12(16), 1495-1498 (1994).

113. Weir, J.P. and B. Moss, J. Virol. 46, 530-537 (1983).

114. Yamamoto, J.K., Hohdatsu, T., Olmstead, R.A., Pu, R., Lowe, H. Zochlinski, H., Acevedo, V., Johnson, H.M., Soulds, G.A., and Gardner, M.B., J. Virol. 67, 601-605 (1993).

115. Yamamoto, J.K., Okuda, T., Ackley, C.D., Lowe, H. Zochlinkski, H., Pembroke, E., and Gardner, M.B., AIDS Res. Human Retrovir. 7, 911-922 (1991).

116. Yuen, L., and Moss, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6417-6421 (1987).

117. Zhou, J., L. Crawford, L. McLean, X. Sun, M. Stanley, N. Almond and G.L. Smith, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190 (1990).

Claims

1. Vector que comprende ADN exógeno codificante de por lo menos un epítopo de VIF, caracterizado porque el vector es un poxvirus de canario.

2. Vector según la reivindicación 1, caracterizado porque el poxvirus de canario es la cepa ALVAC, o es una cepa de vacuna Rentschler obtenida mediante (a) atenuación de una cepa de vacuna Rentschler a través de más de 200 subcultivos en serie de fibroblastos de embrión de pollo, (b) sometimiento de una semilla madre de la misma a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo ágar, y (c) amplificación de un clon de la placa a través de cinco subcultivos adicionales.

3. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el ADN que codifica por lo menos un epítopo de VIF codifica la totalidad o parte de (a) Gag-Pol, (b) Gag-proteasa, (c) Env, Gag-Pol, o (d) Env, Gag-proteasa.

4. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el ADN que codifica por lo menos un epítopo de VIF codifica la totalidad o parte de Gag-Pol o Gag-proteasa.

5. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el ADN que codifica por lo menos un epítopo de VIF codifica la totalidad o parte de Env, Gag-Pol, o Env, Gag-proteasa.

6. Vector según la reivindicación 1, que es vCP242, vCP253, vCP255 o vCP329, comprendiendo dicho vector ADN exógeno que codifica por lo menos un epítopo de VIF, en el que vCP242, vCP253, vCP255 o vCP329 son recombinantes de la cepa de ALVAC, en la que vCP242 comprende ADN codificante de Env, vCP253 comprende ADN codificante de Gag-proteasa, vCP255 comprende ADN codificante de Env, Gag-proteasa, y en el que vCP329 comprende ADN codificante de 97TM, Gag-proteasa.

7. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en mezcla con un portador adecuado para la preparación de una composición antigénica, inmunológica o de vacuna para inducir una respuesta antigénica o inmunológica o protectora en un felino.

8. Utilización de un vector según la reivindicación 5 ó 6, en mezcla con un portador adecuado para la preparación de una composición antigénica, inmunológica o de vacuna para inducir una respuesta antigénica o inmunológica o protectora en un felino.

9. Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento de felinos seropositivos que necesitan terapia para estimular o reforzar su sistema inmunológico frente a una cepa homóloga o heteróloga de VIF.

10. Composición para inducir una respuesta inmunológica, que comprende un vector según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4 en mezcla con un portador adecuado.

11. Composición para inducir una respuesta inmunológica, que comprende un vector según la reivindicación 5 en mezcla con un portador adecuado.

12. Composición para inducir una respuesta inmunológica, que comprende un vector según la reivindicación 6 en mezcla con un portador adecuado.

13. Procedimiento para expresar un producto génico en una célula cultivada in vitro, que comprende introducir en la célula un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.