JP3936303B2 - レンチウイルスから誘導した非相同挿入部分を含むポックスウイルスベースの発現ベクター - Google Patents
レンチウイルスから誘導した非相同挿入部分を含むポックスウイルスベースの発現ベクター Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
(レンチウイルスから誘導した非相同挿入部分を含むポックスウイルスベースの発現ベクター政府の権利の可能性についての言明)
本文中で報告する研究の一部は、NIH/NIAID補助金(R01‐AI30904)およびVirogenetics Corp./フロリダ大学共同研究補助金の援助を受けたものである。政府は何らかの権利を有する可能性がある(権利の侵害あるいは承認を伴わない)。
【0002】
(関連出願)
1994年4月6日出願の米国特許願連続番号第08/223,842号の一部継続出願として、1995年4月5日出願の米国特許願連続番号第08/417,210号を参照する。前者は1992年6月11日出願の連続番号第07/897,382(現在は1994年9月7日出願の米国特許願連続番号第08/303,275号)号の一部継続出願であり、またそれは1991年6月14日出願の連続番号第07/715,921号の一部継続出願である。特許願連続番号第08/417,210号も、1993年8月13日出願の特許願連続番号第08/105,483号、現在の米国特許第5,494,807号の一部継続出願であり、後者は1992年3月6日出願の連続番号第07/847,951号の継続出願であり、またそれは1991年6月11日出願の連続番号第07/713,967号の一部継続出願であり、またそれは1991年3月7日出願の連続番号第07/666,056号(現在の米国特許第5,364,773号)の一部継続出願である。1993年1月20日出願の連続番号第08/007,115号の一部継続出願として1994年1月19日に出願された、共同審理中の特許願連続番号第08/184,009号についても言及する。前述したおよび上記に参照した特許願および特許は、それぞれ参照してここに組み込まれる。
【0003】
(発明の分野)
本発明は次のものに関する:対象となる特定のエピトープ、好ましくはEnv、Gag、Polと付属遺伝子産物、たとえばTat、Rev、より好ましくはGagとPolまたはEnv、GagとPol、最も好ましくはGagとプロテアーゼを含む、レンチウイルス、レトロウイルスおよび/あるいは免疫不全ウイルス、たとえばHIV、SIV、EIAV、BIV、FIVからの特定産物;当該産物をコードする特定核酸分子、たとえばRNA、DNA;当該核酸分子を含み、好ましくは当該産物をベクターに外因性として発現するベクター、好ましくは哺乳類ベクター;当該ベクターによる発現から得られたあるいは得ることができる産物;当該ベクターおよび/あるいは当該産物を含む免疫学的、免疫原性および/あるいはワクチン組成;当該産物を調製するための方法;当該ベクターを作製するための方法;当該組成を調製するための方法;当該産物、ベクターおよび/あるいは組成を単独で、または不活性化レンチウイルス、レトロウイルスあるいは組換えサブユニット製剤とのプライム/ブースト形態として、たとえば不活性化感染細胞ワクチンあるいは免疫学的または免疫原性組成(ICV)とのプライム/ブースト形態として投与する免疫処方によるような、免疫応答を得るための方法を含む、当該産物、ベクターおよび組成を使用するための方法。
【0004】
本発明は特に、組換え型免疫学的、免疫原性あるいはワクチン組成、ならびに非相同株への暴露を含む、レンチウイルス攻撃誘発暴露に対する防御を提供するような、応答を刺激する上でのそれらの有用性に関する。組換え型組成は、好ましくは、単独で、あるいは不活性化レンチウイルス製剤(たとえばICV)または組換えサブユニット製剤とのプライム/ブースト形態での有効な免疫処方において使用される、レンチウイルス遺伝子産物を発現する哺乳類ベクター系を含む。
【0005】
本出願中でいくつかの資料を参照する。これらの資料に関する詳細な引用は、請求の範囲の直前の本明細書の最後の部分、あるいは資料に言及する箇所に示されている;またこれらの資料の各々は参照してここに組み込まれる。
【0006】
【従来の技術】
(発明の背景)
特許および学術文献には、哺乳類ウイルスベースのベクター系や哺乳類DNAベースのベクター系のような様々な哺乳類ベクター系、そしてこれらのベクター系をどのようにして作製し、使用するか、たとえば外因性DNAのクローニングや蛋白の発現のための使用、ならびにそのような蛋白についての用途およびそのような蛋白からの産物についての用途が含まれている。
【0007】
たとえば、このウイルスベクター系における発現のための組換え型ポックスウイルス(たとえばワクシニアウイルス、アビポックスウイルス)と外因性DNAが、米国特許第4,603,112号、4,769,330号、5,174,993号、5,505,941号、5,338,683号、5,494,807号、5,503,834号、4,722,848号、5,514,374号、英国特許第GB 2 269 820 B号、第WO92/22641号、第WO93/03145号、第WO94/16716号、第PCT/US94/06652号、および1994年1月19日出願の認可された米国特許願連続番号第08/184,009号の中に認められる。一般的には、Paoletti、「Applications of pox virus vectors to vaccination:An update」PNAS USA 93:11349‐11353、1996年10月;Moss、「Genetically engineered poxuiruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety」PNAS USA 93:11341‐11348、1996年10月参照。
【0008】
バキュロウイルス発現系およびそれらにおける発現のための外因性DNA、およびそれらからの組換え型蛋白の精製は、Richardson,C.D.(編集者)、Methods in Molecular Biology 39、「Baculovirus Expression Protocol」(1995 Humana Press Inc.)(たとえばインフルエンザHA発現についての第18章、組換え型蛋白精製手法についての第19章参照)、Smithら、「Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with aBaculovirus Expression Vector」Moleculra and Cellular Biology,1983年12月、第3巻、12号、p.2156‐2165;Pennockら、「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B‐Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus Vector」Molecular and Cellular Biology 1984年3月、第4巻、3号、p.399‐406;第EPA 0 370 573号(AIDSに関する皮膚試験および試験キット、HIV‐1 env遺伝子の一部を含むバキュロウイルス発現系を論じ、1986年10月16日出願の米国特許願連続番号第920,197号およびEP特許願公開番号第265785号を引用している)の中に認められる。
【0009】
米国特許第4,769,331号はベクターとしてのヘルペスウイルスに関する。また、Roizman,「The function of herpessimplex virus genes:A primer for genetic enginnering of novel vectors」PNAS USA 93:11307‐11312、1996年10月;Andreanskyら、「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors」PNAS USA 93:11313‐11318、1996年10月も参照のこと。エプスタイン−バーウイルスベクターも知られている。Robertsonら、「Epstein‐Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」PNAS USA 93:11334‐11340、1996年10月参照。さらに、アルファウイルスベースのベクター系がある。一般的にはFrolovら、「Alphvirus‐based expression vectors:Strategies and applications」PNAS USA 93:11371‐11377、1996年10月参照。
【0010】
ポリオウイルスおよびアデノウイルスベクター系も存在する(たとえばKitsonら、J.Virol.65、3068‐3075、1991;Grunhausら、1992、「Adenovirus as cloning vectors」Seminars in Virology(第3巻)p.237‐52、1993;Ballayら、EMBO Journal、第4巻、p.3861‐65;Graham,Tibtech 8、85‐87、1990年4月;Preveoら、J.Gen Virol.70、429‐434参照)。また1996年7月3日出願の米国特許願連続番号第08/675,556号および08/675,566号(アデノウイルスベクター系、好ましくはCAV2)およびPCT第WO91/11525号(逆向き末端反復領域の端に近いSmaI部位から初期領域4(E4)についてのプロモーターまでの領域内にプロモーター遺伝子配列を含むように修飾されたCAV2)も参照のこと。
【0011】
DNAベクター系も存在する。それらからの発現のためのプラスミドDNAによる細胞のトランスフェクションについては、Felgnerら(1994)、J.Biol.Chem.269、2550‐2561を参照する。様々な感染性疾患に対するワクチン接種の簡単で有効な方法としてのプラスミドDNAの直接注射については、Science,259:1745‐49、1993を参照する。またMcClementsら、「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein Dor glycoprotein B, alone or in combination,induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus‐2 disease」PNAS USA 93:11414‐11420、1996年10月も参照のこと。
【0012】
1983年に、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV1)がAIDSの原因物質として同定され、その後レトロウイルス科のレンチウイルス亜科に分類された(Hardy、1990)。レンチウイルス亜科の他の成員は、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)およびHIV‐2である。医学ウイルス学の分野では、HIVの感染によって引き起こされる汎流行性のAIDSに多大の関心が注がれてきた。このレンチウイルス系は、安全で有効なワクチンと抗ウイルス療法を開発するための努力の一貫として、その分子生物学、免疫生物学および病因に関して詳細に検討されてきた。現在まで、HIVならびに種々のワクチン型を用いた他のレンチウイルスワクチン試験は様々な度合の成功を収めてきた(Heeneyら、1994;Danielら、1992;Fultzら、1992;Girardら、1991;Isselら、1992)。さらに、ヒトでのワクチンの効果に関する特異的HIV免疫応答の関連性については、まだ知識が欠如している。それ故、長年を経たあとも、多大の世界的な努力にもかかわらず、有効なHIV1ワクチンはまだ得られていない。
【0013】
ネコ免疫不全ウイルス(FIV)によるネコの感染は、持続感染と、HIV感染に類似したAIDS様の免疫抑制性疾患を引き起こす。ネコのFIV感染は、それ自体で、レンチウイルスの免疫病原性とワクチン開発を検討するためのモデルを提供する(Pedersenら、1987;Johnsonら、1994)。HIVと同様に、異質性が存在し、それ故多数のFIV亜型が存在する(Sadoraら、1994;Okadaら、1994)。実際に、HIVのように、FIV株は主としてenv、そしてより小さな度合でgagコード領域における遺伝的差異に基づいて、4つの亜型(A‐D)に分類されてきた。
【0014】
それ故、完全な不活性化FIVワクチンと不活性化FIV感染細胞ワクチン(ICV)は相同なFIVとわずかに非相同なFIVに対する防御を得たが(Hosieら、1995;Johnsonら、1994;Yamamotoら、1991、1993)、これらの同じワクチンは他の亜型の明白に非相同なFIV株に対しては防御免疫を誘発することができなかったため、広い範囲のFIV亜型に対する防御免疫の誘発は、修正されたあるいは異なるワクチンアプローチを必要とすると考えられる。このことは明らかにワクチン開発に関する懸念を提起する。また、ネコ個体群におけるFIVの罹患率がヒトにおけるHIV罹患率より高いことにも留意しなければならない(Verschoorら、1996)。FIVワクチンあるいは免疫原性組成の開発は、HIVワクチンあるいは免疫原性組成のためのモデルを提供する上で有用であるのみならず、獣医学的保健衛生の将来という観点からも重要である。
【0015】
特に、これまでのFIV試験から(Hosieら、1995;Johnsonら、1994;Ymamamotoら、1991、1993)、有意のFIV Env特異的血清反応性を持つネコだけが同種攻撃誘発暴露に対して防御される可能性が高いことが認められた。そのような反応を欠如しているワクチン投与動物では、FIV攻撃誘発に対する防御は認められなかった(Johnsonら、1994;Yamamotoら、1991、1993)。同時に、これらの結果を、現在までの、サブユニット免疫原は標的種における防御免疫応答の誘発を示さなかったという所見と合わせて考えられると、FIVおよびレンチウイルスについての技術水準、一般的なワクチン開発に関連した最前線のいくつかの重要な点が提起される。ひとつの例外はおそらくサル免疫不全ウイルス(SIV)/マカク系に関するものであり、この系では、一部の組換え型サブユニット製剤(ワクシニアベースの組換え型を含む)あるいはこれらの組換え型サブユニットの組合せが、SIV攻撃誘発暴露からの少なくとも部分的な防御をもたらした(Hu、1992;1994;1995)。感染からの完全な防御は認められておらず、攻撃誘発試験は明白に非相同なSIV株に関して実施されたものではなかったので、このデータはいくぶん範囲が限定されている。さらに、SIV Env成分を持たない組換え型サブユニットによっては、いかなるレベルの防御ももたらされなかった(Huら、1994)。
【0016】
FIVワクチン開発に関して、サブユニットベースの候補ワクチンは全く教示あるいは提案されてこなかった;いかにしてサブユニットワクチンを開発するかについての教示は全くない;またどのようにしてサブユニットベースのワクチン候補を開発するかに関しても明らかではない。
【0017】
第二に、非相同株に対する防御を与えるためには、不活性化された従来のワクチンと比較して、異なるあるいはおそらく修正されたアプローチが開発される必要がある(Hosieら、1995;Johnsonら、1994)。
【0018】
最後に、保護免疫におけるEnv特異的免疫応答は重要であると考えられる(Johnsonら、1994;Yamamotoら、1991、1993)。実際に、Flynnらの「ETV特異的CTLは、ワクチン接種によってネコ免疫不全ウイルス感染から防御されるネコにおいて優勢である」The Journal of Immunology,1996,157;3658‐3665において、3664ページで著者は、「FIV Env特異的CTLはペットのネコのFIV感染に対する防御免疫においてより有効と考えられる」ので、「今後のワクチン戦略は、長命で、ウイルスエンベロープの糖蛋白上の適切なエピトープを認識し、ウイルスを隔離することが知られている組織を標的する、体液性と細胞媒介の両方の免疫反応を誘発することを目指すべきである」と結論している。
【0019】
それ故、宿主に投与したときネコ免疫不全ウイルス感染に対して免疫応答を誘発する、ネコ免疫不全ウイルス組換え型サブユニットの免疫原性、免疫学的あるいはワクチン組成、たとえばFIV、Env、Gag、あるいはPolのFIVエピトープのような対象となるFIVエピトープをコードする外因性DNAを、特に免疫原性形態で、あるいはそれらの組合せで、たとえばFIV Gag‐プロテアーゼ、Gag‐Pol、あるいはGagとPolの一部(プロテアーゼを含むPolの部分のような)あるいはEnv、GagとPolの全部またはPolの一部の組合せで含む、NYVACあるいはALVACベースの組換え型のような高い安全性を有する組成を提供することは、現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろうと評価できる。さらに、プライム‐ブースト処方において、たとえば当該組換え型組成を初回免疫において使用し、その後の免疫を不活性化FIV、ICV、あるいは他の組換え型サブユニット製剤で行う場合、そのような組換え型あるいはそのような組換え型を含む組成の使用は現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろう。
【0020】
より一般的には、宿主に投与したときレンチウイルス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス感染に対する免疫応答を誘発する、レンチウイルス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス組換え型サブユニットの免疫原性、免疫学的あるいはワクチン組成、たとえばEnv、Gag、あるいはPolのような対象となるレンチウイルス、レトロウイルス、あるいは免疫不全ウイルスエピトープをコードする外因性DNAを、特に免疫原性形態で、あるいはそれらの組合せで、たとえばGag‐プロテアーゼ、Gag‐Pol、あるいはGagとPolの一部(プロテアーゼを含む部分のような)あるいはEnv、Gagの全部とPolまたはPolの一部を、Env、Gag‐プロテアーゼの組合せで含む、NYVACあるいはALVACベースの組換え型のような高い安全性を有する組成を提供することは、現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろうと評価できる。さらに、プライム‐ブースト処方において、たとえば当該組換え型組成を初回免疫において使用し、その後の免疫を不活性化レンチウイルス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス、あるいはICV、あるいは各々の不活性化ウイルス、ICVまたは他の組換え型サブユニット製剤のような他の組換え型サブユニット製剤で行う場合、そのような組換え型あるいはそのような組換え型を含む組成の使用は現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろう(「各々の」に関しては、組換え型がたとえばFIV組換え型であれば、不活性化FIVあるいはFIV ICV製剤が「各々の」になるであろう)。
【0021】
【発明が解決しようとする課題】
(発明の目的および要旨)
従って、本発明の目的は、レンチウイルス、レトロウイルスおよび/または免疫不全症ウイルス(例えば、HIV、SIV、EIAV、BIV、FIV)、ビスナウイルス、ヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルスに由来する特定の産物を提供することである。この産物は、目的の特定のエピトープを含み、好ましくはEnv、Gag、Polまたはそれらに関するエピトープを、必要に応じて、それらに対する目的の補助的機能体またはタンパク質またはエピトープ(例えば、Tatおよび/またはRev)を伴って含む。より好ましくは、GagおよびPol、またはEnv、GagおよびPol、またはGagおよびPolの一部分、またはEnv、GagおよびPolの一部分である(特に、そのような部分はプロテアーゼを含む)。最も好ましくは、Gagおよびプロテアーゼ、またはEnv、Gagおよびプロテアーゼ、またはそれらに関するエピトープで、必要に応じて、補助的な機能体またはタンパク質(例えば、Tatおよび/またはRevまたは他のそのような機能体/タンパク質、またはそれらに関するエピトープ)を伴うものである。目的の産物またはエピトープに含むことができる他の補助的な機能体またはタンパク質として、net、vpu、vit、vprおよびvpx、またはそれらに関するエピトープのいずれかまたはすべてが挙げられる(特に、Trono,D、Cell、82:189−192、July 28、1995を参照のこと)。そのような補助的な機能体またはタンパク質は、非エンベロープ性の機能体またはタンパク質と考えることができる。これらは、例えば、細胞性応答の誘導に関して、目的の産物またはエピトープに含めることができる。例えば、特定のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの病原体については、そのような病原体の補助的な機能体またはタンパク質またはそれらに関するエピトープは含まれ得る:従って、例えば、産物には、Gag−Proおよび補助的な機能体またはタンパク質またはそれに関するエピトープを含むことができる。
【0022】
本発明のさらなる目的は、特定の核酸分子を提供することである。このような核酸分子は、例えば、産物をコードするRNA、DNAであり、例えば、目的の特定のエピトープ(GagおよびプロテアーゼあるいはEnv、GagおよびPolのすべてなど)をコードするRNA、DNAである。
【0023】
本発明のさらなる目的は、ベクター(好ましくは、哺乳動物のベクター系)を提供することである。このようなベクターは核酸分子を含み、そして好ましくは、産物を以下のベクターに対する外因性として発現する:例えば、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスまたはDNAベクター系。
【0024】
本発明のさらなる目的は、前記のベクターによる発現から得られるか、または得ることができる産物を提供することである。
【0025】
本発明のなおさらなる目的は、前記のベクターおよび/または前記の産物を含む免疫学的な免疫原性および/またはワクチン組成物を提供することである。
【0026】
本発明のなお別の目的は、前記の産物を調製するための方法を提供することである。
【0027】
本発明のなお別の目的は、前記のベクターを調製するための方法を提供することである。
【0028】
本発明のなおさらなる目的は、前記の組成物を調製するための方法を提供することである。
【0029】
従って、本発明の目的は、レンチウイルス、レトロウイルスおよび/または免疫不全症ウイルス(例えば、HIV、SIV、EIAV、BIV、FIV)、ビスナウイルス、ヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルスに由来する特定の産物を提供することである。この産物は、目的の特定のエピトープを含み、好ましくはEnv、Gag、Polまたはそれらに関するエピトープを、必要に応じて、それらに対する目的の補助的機能体またはタンパク質またはエピトープ(例えば、Tatおよび/またはRev)を伴って含む。より好ましくは、GagおよびPol、またはEnv、GagおよびPol、またはGagおよびPolの一部分、またはEnv、GagおよびPolの一部分である(特に、そのような部分はプロテアーゼを含む)。最も好ましくは、Gagおよびプロテアーゼ、またはEnv、Gagおよびプロテアーゼ、またはそれらに関するエピトープで、必要に応じて、補助的な機能体またはタンパク質(例えば、Tatおよび/またはRevまたは他のそのような機能体/タンパク質、またはそれらに関するエピトープ)を伴うものである。目的の産物またはエピトープに含むことができる他の補助的な機能体またはタンパク質として、net、vpu、vit、vprおよびvpx、またはそれらに関するエピトープのいずれかまたはすべてが挙げられる(特に、Trono,D、Cell、82:189−192、July 28、1995を参照のこと)。そのような補助的な機能体またはタンパク質は、非エンベロープ性の機能体またはタンパク質と考えることができる。これらは、例えば、細胞性応答の誘導に関して、目的の産物またはエピトープに含めることができる。例えば、特定のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの病原体については、そのような病原体の補助的な機能体またはタンパク質またはそれらに関するエピトープは含まれ得る:従って、例えば、産物には、Gag−Proおよび補助的な機能体またはタンパク質またはそれに関するエピトープを含むことができる。
【0030】
本発明のさらなる目的は、特定の核酸分子を提供することである。このような核酸分子は、例えば、産物をコードするRNA、DNAであり、例えば、目的の特定のエピトープ(GagおよびプロテアーゼあるいはEnv、GagおよびPolのすべてなど)をコードするRNA、DNAである。
【0031】
本発明のさらなる目的は、ベクター(好ましくは、哺乳動物のベクター系)を提供することである。このようなベクターは核酸分子を含み、そして好ましくは、産物を以下のベクターに対する外因性として発現する:例えば、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスまたはDNAベクター系。
【0032】
本発明のさらなる目的は、前記のベクターによる発現から得られるか、または得ることができる産物を提供することである。
【0033】
本発明のなおさらなる目的は、前記のベクターおよび/または前記の産物を含む免疫学的な免疫原性および/またはワクチン組成物を提供することである。
【0034】
本発明のなお別の目的は、前記の産物を調製するための方法を提供することである。
【0035】
本発明のなお別の目的は、前記のベクターを調製するための方法を提供することである。
【0036】
本発明のなおさらなる目的は、前記の組成物を調製するための方法を提供することである。
【0037】
そして、本発明のさらなる目的は、前記の産物、ベクターおよび組成物を使用するための方法を提供することである。この方法は、免疫化療法などによる免疫学的応答を得るための方法を含む。そのような免疫化療法において、前記の産物、ベクターおよび/または組成物は、単独で、あるいは不活性化されたレンチウそして、本発明のさらなる目的は、前記の産物、ベクターおよび組成物を使用するための方法を提供することである。この方法は、免疫化療法などによる免疫学的応答を得るための方法を含む。そのような免疫化療法において、前記の産物、ベクターおよび/または組成物は、単独で、あるいは不活性化されたレンチウイルス、レトロウイルスまたは組換えサブユニット調製物による初期/追加免疫形状で投与される:例えば、不活性化した感染細胞ワクチンまたは免疫学的または免疫原性の組成物(ICV)(個々のICVなど)による初期/追加免疫形状で投与される。
【0038】
従って、本発明は、組換えの免疫学的な免疫原性またはワクチン組成物、および標的種においてレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの抗原暴露から保護することなどにより応答を増強させることにおけるそれらの利用に関する。
【0039】
【課題を解決するための手段】
より具体的には、本発明は、応答(レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスに対する保護的な免疫応答など)を増強するための安全な免疫化ビヒクルとして使用するための外来遺伝子の挿入および発現に必要な哺乳動物ベクター系に関する。
【0040】
従って、本明細書中の目的によれば、本発明は、哺乳動物ベクター系に関する。このベクター系は、以下のウイルスの遺伝子産物(例えば、目的のエピトープを含む遺伝子産物)を発現する:レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIVなど:ネコ免疫不全症ウイルス(FIV)が現在のところ好ましい)。本発明は、免疫原性および/または免疫学的および/またはワクチンの組成物に関する。このような組成物は、以下のウイルスの暴露に対する免疫学的および/または保護的な応答を、標的宿主(例えば、FIVおよびネコ(飼いネコまたは子ネコ))に投与したときに誘導する:レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIVなど)。
【0041】
さらなる本明細書中の目的でのある局面において、本発明は、以下の哺乳動物ベクターを含む(例えば、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスまたはDNAベクター系;好ましくは、ポックスウイルス)。このような哺乳動物ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIV;好ましくはFIV)の目的エピトープを発現する。目的のエピトープは、好ましくは、Gag/プロテアーゼである。ベクターは、高度に相同的な抗原の暴露に対する標的種(例えば、ネコ)の保護において有用である。従って、本発明は、ベクターおよび必要に応じて受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む免疫学的な免疫原性またはワクチン組成物を包含する。
【0042】
本明細書中の目的による別の局面において、本発明は、免疫学的応答(好ましくは、保護的な応答)を誘導するための方法を含む。この方法は、ベクターまたはベクターを含む組成物を宿主に投与することを含む。この方法は免疫化療法であり得る。この免疫化療法は、例えば、ベクターまたはベクターを含む組成物により最初に行われ(そして、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、FIV)の目的エピトープの遺伝子産物を発現する)、そして個々のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスのサブユニット調製物(例えば、FIVの不活性化全細胞(ICV)調製物)を用いるか、または個々のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの組換えサブユニット調製物(例えば、そのようなものをコードする外因性の核酸分子を含有する組換え体の発現からからそのようもの単離することから得られるFIVの目的エピトープ)を用いて追加免疫して、同種および異種のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス集団から宿主(例えば、ネコ)を保護するなどの免疫学的応答を増強する。
【0043】
本発明のさらなる目的は、公知の組換えポックスウイルスワクチンと比較して、安全性のレベルが増大している組換えポックスウイルスの抗原、ワクチンまたは免疫学的組成物を提供することである。
【0044】
本発明のさらなる目的は、宿主において遺伝子産物を発現するために改変されたベクターを提供することである。この場合、このベクターは、宿主における毒力が低減されるように改変される。
【0045】
本発明の別の目的は、in vitroで培養される細胞内で遺伝子産物を発現するための方法を提供することである。この方法は、安全性のレベルが増大している改変された組換えウイルスまたは改変されたベクターを使用する。
【0046】
本発明のこれらの目的および利点および他の目的および利点は、以下を考察した後ではより容易に明らかになる。
【0047】
さらなる局面において、本発明はベクターに関する。好ましくは、不活性化されたウイルスコードの遺伝子的機能を有する改変された組換えウイルスに関し、その結果組換えウイルスは、弱毒化されて安全性が増強される。この機能は、本質的ではあり得ないか、または毒力(例えば、本質的)と結合し得る。ウイルスはポックスウイルスが好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス(鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなど)が好都合である。好ましくは改変された組換えウイルスであるベクターは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、異種のDNA配列を含むことができる。この異種DNA配列は、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIV;好ましくはネコ免疫不全症ウイルス)に由来する抗原またはエピトープ(例えば、Env、Gag、Pol、補助的機能体(例えば、Tat、Rev)または以下のようなそれらの任意の組合せをコードする:Gag−PolまたはEnv、Gag、およびPolまたはGagおよびPolまたはEnvの一部、GagおよびPolの一部(プロテアーゼ、またはGag−プロテアーゼまたはEnv、Gag、およびプロテアーゼを含むPolの一部など)など。
【0048】
別の局面において、本発明は、抗原性で免疫学的、免疫原性またはワクチンの組成物、あるいは抗原性または免疫学的または保護的な応答を、該組成物が接種された宿主動物(ネコ(例えば、飼いネコまたは子ネコ)など)において誘導するための治療組成物に関する。この組成物は、キャリアおよび考案されたベクター(好ましくは、不活性化された非必須ウイルスコードの遺伝子的機能を有する改変された組換えウイルスであり、その結果組換えウイルスは弱毒化されて安全性が増強される)、あるいはそのようなベクターまたは改変された組換えウイルスの発現産物を含むことができる。本発明による組成物(または組成物において使用される産物を発現するための)ウイルスは、ポックスウイルスが好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス(鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなど)が好都合である。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、抗原性タンパク質をコードする異種DNA配列を含むことができる。このようなタンパク質は、例えばレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIV;好ましくはネコ免疫不全症ウイルス)に由来する目的エピトープ(抗原など、例えば、Env、Gag、プロテアーゼ、またはそれらの任意の組合せ(Gag−プロテアーゼまたはEnv、Gag、およびプロテアーゼなど))である。
【0049】
なお別の局面において、本発明は、抗原性の免疫学的、免疫原性、ワクチン(保護的)および/または治療的応答を、宿主動物(ネコ(飼いネコまたは子ネコ)など)で、例えばそのような応答を必要とする宿主動物において誘導するための方法に関する。この方法は、応答を得るために効果的な量の本発明の上記組成物を、単独で、あるいは初期−追加免疫療法(例えば、本発明の組成物を投与するか、あるいは不活性化されたレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスまたはICVまたはIWVのいずれかまたは両方を、本発明の組成物を投与する前またはその後のいずれかで投与する療法)の一部としてのいずれかで投与することを含む。
【0050】
さらなる局面において、本発明は、本発明のベクター(弱毒化されて安全性が増強されている改変された組換えウイルスなど)を細胞に導入することによって、in vitroの細胞内で遺伝子産物を発現するための方法に関する。ベクターまたは改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、抗原タンパク質などの目的のエピトープをコードする異種のDNA配列を含むことができる。このような抗原タンパク質は、例えば、レトロウイルス、レンチウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIV;好ましくはネコ免疫不全症ウイルス)に由来し、例えば、Env、Gag、Pol、補助的機能体(例えば、Tat、Rev)、または以下のようなそれらの任意の組合せなどである:Gag−Pol、またはEnv、GagおよびPol、またはGagおよびPolまたはEnvの一部、GagまたはPolの一部分(この場合、その部分は、プロテアーゼ、またはGag−プロテアーゼまたはEnv、Gag、およびプロテアーゼを含むことができる)。遺伝子産物は細胞から集めることができる。あるいは、次いで細胞を動物に直接、再注入することができ、あるいは細胞は、再注入に必要な特異的な反応性を増幅するために使用することができる(エクスビボ治療)。
【0051】
従って、特定のさらなる局面において、本発明は、ベクター、好ましくは弱毒化されて安全性が増強されている改変された組換えウイルスを細胞に導入することによってin vitroで培養された細胞内で遺伝子産物を発現するための方法に関する。ベクターまたは改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、目的のエピトープまたは抗原タンパク質をコードする異種のDNA配列を含むことができる。このような抗原タンパク質は、例えば、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIV;好ましくはネコ免疫不全症ウイルス)に由来し、例えば、Env、Gag、Pol、補助的機能体(例えば、Tat、Rev)、または以下のようなそれらの任意の組合せなどである:Gag−Pol、またはEnv、GagおよびPol、またはGagおよびPolの一部分、またはEnv、GagおよびPolの一部分、この場合、その部分は、プロテアーゼ、またはGag−プロテアーゼまたはEnv、Gag、およびプロテアーゼを含むことができる。次いで、産物を宿主に投与して、応答を刺激することができる。
【0052】
抗体は、本発明のベクターまたは組換え体あるいは本発明のベクターまたは組換え体の発現産物を含む組成物により惹起させることができる。惹起された抗体は、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(ネコ免疫不全症ウイルスなど)を予防または処置するために宿主において有用であり得る。抗体あるいは本発明のベクターまたは組換え体の発現産物は、診断キット、アッセイまたは試験において有用であり、サンプル(血清など)におけるレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、ネコ免疫不全症ウイルス)、あるいはそれらの抗原、あるいはそれらに対する抗体、あるいは本発明の組換え体の抗原または抗体の存在または非存在を決定することができる。従って、本発明の一局面は、そのような抗体、診断キット、アッセイまたは試験を含む。
【0053】
さらにさらなる局面において、本発明は、改変された組換えウイルスに関する。このウイルスは、非必須または必須のウイルスコードの遺伝子的機能がその中で不活性化され、その結果ウイルスは弱毒化される。この改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に異種起源に由来するDNAをさらに含有する。DNAは、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス(例えば、EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIV;好ましくは、ネコ免疫不全症ウイルス)の以下のような目的の抗原またはエピトープをコードすることができる:例えば、Env、Gag、Pol、補助的機能体、または以下のようなそれらの任意の組合せ(Gag−Pol、またはEnv、GagおよびPol、またはGagおよびPolまたはEnvの一部分、GagおよびPolの一部分:この場合、Polの部分は、プロテアーゼ、またはGag−プロテアーゼまたはEnv、Gag、およびプロテアーゼを含むことができる)。特に、遺伝子的機能は、ビルエンス因子(例えば、必須領域)をコードするオープンリーデングフレームの欠失または破壊によって、あるいは天然の宿主制限ウイルス(特に、連続的な継代物および/またはプラーク精製(その後の継代を伴うか伴わない)であることから弱毒化を呈する天然の宿主制限ウイルス)の利用によって不活性化される。本発明に従って使用されるウイルスは、ポックスウイルスが好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス(鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなど)が好都合である。
【0054】
好都合なことには、オープンリーデングフレームは、J2R、B13R+B14R、A26L、A56R、C7L−K1LおよびI4L(Goebelら.、1990a、bに報告される用語による)、それらの任意の組合せからなる群から、好ましくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。この点に関して、オープンリーデングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子領域、出血領域領域、A型封入体領域領域、血球凝集素遺伝子領域、宿主域遺伝子領域またはラージサブユニット、リボヌクオチドレダクターゼ;またはそれらの任意の組合せを含む:好ましくは、それらの任意の組合せである。ワクシニアウイルスの改変されたCopenhagen株が、NYVACとして同定された(Tartaglia et al.、1992)。NYVACおよびNYVAC変異株は、必須領域がその中で欠失または破壊されている。Tartaglia et al.、1992のその後の刊行物に関して、それは、Tartaglia et al.、1992と同様に、ワクシニアウイルスの必須領域の欠失に関する(従って、NYVAC、NYVAC変異株、あるいはTartaglia et al.、1992のウイルス(例えば、NYVACおよびNYVAC変異株)により教示されるかまたはそれから明らかな変異株に関する):例えば、NYVAC.1、NYVAC.2。PCT WO 95/30018を参照のこと。NYVACおよびNYVAC変異株に関しては、米国特許第5,364,773号および同第5,494,807号もまた参照のこと。しかし、他のワクシニアウイルス株(COPAK株など)もまた、本発明の実施において使用することができる。
【0055】
別の好ましい実施態様において、ベクターは、弱毒化されたカナリアポックスウイルス(混合集団でないカナリアポックスウイルスなど)である。例えば、Rentschlerワクチン株は、ニワトリ胚線維芽細胞での200代を超える連続的な継代により弱毒化され、それから得られる元となる種株は、寒天下の4回の連続したプラーク精製を行い、そこからプラーククローンをさらに5回の継代により増幅した。そのようなカナリアポックスウイルスはALVACと呼ばれる。
【0056】
カナポックスから得られるプラークの制限消化の結果は、以下の通りである。ゲノムDNAを、カナリアポックスウイルス(カナポックス)のクローン化されたプラーク単離物1,4および5から単離した。これらのプラークから得られたDNAおよびクローン化していないカナリアポックスウイルスから得られたDNAを制限酵素HindIII、BamHIおよびEcoRIで消化し、0.8%アガロースゲルで流した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、UV光線下で写真撮影を行った(図1を参照のこと)。レーンに印を付ける:v=非クローン化カナリアポックスウイルス、1=プラーク1、4=プラーク4、および5=プラーク4。1kbの分子量マーカーを左端のレーンで流した。制限プロフィールは、種々のプラーク単離物の間に明らかな違いを示す。プラーク1を、ALVAC(CPPP)として選んだ。
【0057】
非クローン化カナリアポックスウイルスの制限消化パターン(レーン=v)において、いくつかのサブモーラーバンドを認めることができる。しかし、クローン化されたプラークの場合、これらのサブモーラーバンド(レーン:1、4および5)は、少なくともプラーククローン化された単離体のいくつかではモーラー試料になる。このことは、非クローン化のカナリアポックスウイルス(カナポックス)が、制限プロフィールが異なるゲノム変異体の混合物であることを示す。
【0058】
従って、ALVACはカナポックスと異なり、カナポックス以上に特徴的な特性を有し、カナポックスより優れている。従って、ALVACは、本発明の実施における好ましいベクターである。特に、Rentschler株のカナリアポックスウイルス(カナポックス)は、制限分析からウイルス変異体の混合物であることを示す。すなわち、ALVACが誘導されたカナポックスは混合集団であった。カナポックスなどのワクチン調製物が複数の変異体を含有することは、今回初めてのことではない。ALVACは混合集団ではない。従って、ALVACは、カナポックスが有さないいくつかの特徴的な特性を有する。例えば、以下の通りである。
【0059】
ALVACは、均一的な遺伝子背景を有する。この特性により、矛盾しない(一致した)ALVACが得られる:ベクターに基づくワクチンを調製するために有用であるという独特の特徴。一致していることは、品質問題および定期的な検討に関して有用である。ALVACの一致しているというこの特性により、品質管理および定期的な検討に合格する能力を有するALVACが得られ、すなわち、予想される遺伝子的特性を有するベクターに基づくワクチンの開発において有用である。
【0060】
生物学的一致性は、組換え体を得るためにALVACを使用して調節される。カナポックスは、生物学的一致性を与えない。実際、カナポックスは、効果的な組換え産物を矛盾することなく提供することができない。生物学的一致性および一致した効果的な組換え産物は有用である:例えば、毒力に関して、ウイルス/宿主の相互作用に関して一致した生物学的プロフィールについて、および究極的には免疫化ビヒクルとしての使用について。ALVACは、生物学的一致性および一致した効果的な組換え産物を達成する。カナポックスを組換え体誘導において使用する場合、外来遺伝子が導入されるウイルス背景に関するコントロールがない。従って、得られる組換え体の特性は疑わしいままである(すべてのワクシニアの遺伝子的背景は必ずしも免疫化ビヒクルとして等価でないことを明らかにするワクシニアウイルスによる研究と比較すること)。ALVACは、そのウイルス背景、毒力に関連するその特性、および免疫化ビヒクルとしてのその機能性に関して確実性を提供する。
【0061】
本発明を、主として、カナリアポックスウイルス(ALVAC)に基づくベクターを使用して説明してきたが、発明はまた、本明細書中において、特定のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの遺伝子産物の発現、および免疫応答(保護的な免疫応答など)を与えるためのそれらを利用することに権利を有することを理解しなければならない。それ故、本発明はまた、代替的な哺乳動物ベクター系に関する。そのようなベクター系の例には、他のポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルスに基づく系、細菌発現系、およびDNAに基づく免疫原処方物が含まれる。
【0062】
本発明を、主として、レンチウイルスのFIVを使用して説明してきたが、本発明はまた、本明細書中において、他のレンチウイルスおよびレトロウイルスおよび免疫不全症ウイルスの系に由来するFIV遺伝子産物の機能的ホモログの発現に権利を有することを理解しなければならない:例えば、Env、Gag/プロテアーゼ(すなわち、Env、GagおよびPolまたはPolの一部分、またはGagおよびPolまたはPolの一部分:この場合、Polの部分は以下のものをを含むことができる;プロテアーゼ(Envを有しない)、またはEnv、Gag、プロテアーゼまたはGag−プロテアーゼ(Envを有しない)またはEnv、Gag、PolまたはPolの一部分および補助的機能体(例えば、Tat、Rev)またはGag、PolまたはPolの一部分(この場合、Polの部分は、プロテアーゼおよび補助的な機能体(Envを有しない)またはEnv、Gagプロテアーゼおよび補助的な機能体またはGag−プロテアーゼおよび補助的な機能体(Envを有しない)を含むことができる);特に、EIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIVのものである)。それ故、本発明は他のレンチウイルス系に関し、これには、ヒト免疫不全症ウイルス−1、−2(HIV−1、HIV−2)、ウシ免疫不全症ウイルス(BIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ならびに他の哺乳動物のレンチウイルスが含まれる。
【0063】
これらの実施態様および他の実施態様は開示される、あるいは以下の詳細な説明から明らかであり、そしてそれにより包含される。
【0064】
(寄託)
以下のものは、ブタペスト条約の条件下でATCCに寄託されている。
【0065】
【表1】
従って、本発明は核酸分子を包含する。これには、寄託された物質内の配列を有するコード産物、ならびにそれらに実質的な(例えば、少なくと85%の相同性で)相同性を有する核酸分子が含まれる。
【0066】
【発明の実施の形態】
(発明の詳細な説明)
上で述べられているとおり、本発明は、好ましいポックスウイルスベクターとしてTROVAC、NYVACおよびALVAC(NYVACおよびALVACは、最も好まれ、そしてALVACは、特に好ましい)のような弱毒化ポックスウイルスと共に、ベクター基礎のレンチウイルス、レトロウイルス、または免疫欠損ウイルス、例えばEIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIV、好ましくはネコの免疫欠損ウイルス(FIV)組換え体、好ましくは目的のエピトープ(類)をコードするDNAを含有する組換え体、さらに好ましくはEnv、GagまたはPol、またはGagおよびPolまたはPolの一部、またはEnv、GagおよびPol、またはPolまたはGagの一部およびプロテアーゼ、またはEvn、Gag、およびプロテアーゼのようなそれらの組合せ;そして発明の組換え体およびそれらの発現産物を含有する組成物;および発明の組換え体、それらの発現産物、およびその組換え体および/または発現産物を含有する組成物を製造する方法および使用する方法に関する。
【0067】
したがって、一般的方法で、本発明は、少なくとも1種のレンチウイルス・エピトープをコードする外因性DNAを包含するベクターを提供する。エピトープは、SIV以外のレンチウイルスから得ることができる。さらに好ましくは、エピトープは、GagおよびPolまたはEnv、GagおよびPolまたはEnv、GagおよびPolまたはGagの一部およびPolまたはGag−プロテアーゼの一部、またはEnv、Gagおよびプロテアーゼのもの;そして最も好ましくは、エピトープは、Gag上のGagおよびプロテアーゼまたはエピトープ(類)、およびGagおよびプロテアーゼと同じかまたは類似する反応を引出すGagおよびプロテアーゼである。そして、標的種(標的種は、レンチウイルスにに罹りやすい宿主であり、例えば、家ネコおよび小ネコのようなネコは、FIVに対する標的種である)に投与した場合、ベクターは、好ましくは免疫反応を、さらに好ましくは保護的免疫反応を導入する。
【0068】
ベクターまたは組換え体を造る方法は、米国特許第4,603,112号、4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第5,503,834号、第4,722,848号、第5,514,375号、英国特許GB2 269 820B、国際公開WO92/22641号、国際公開WO93/03145号、国際公開WO94/16716号、PCT/US94/06652号、Paolettiの「ポックスベクターをワクチン化する使用法」の1994年1月19日に出願された特許が付与された米国特許出願番号第08/184,009号;Mossの「組換え体遺伝子発現、ワクチン化および安全性についての遺伝子操作されたポックスウイルス;現状」のPNAS USA 93:11349−11353、1996年10月、Richardson、C.D.(編集者)、Methods in Molecular Biology 39、1996年10月のPNAS USA 93:11341−11348;「バキュロウイルス発現プロトコール」(1995年、Humana Press Inc.)、Smithら、「バキュロウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞でのヒト・ベータインターフェロンの生成」、Molecular and Cellular Biology、3巻、12号、2156−2165頁、1983年12月;Pennockら、「バキュロウイルスベクターに感染した細胞でのエッシェリキア・コリ(Escherichia coli)のB−ガラクトシダーゼの強力なそして制御された発現」、Molecular and Cellular Biology、4巻、3号、399−406頁、1984年3月;欧州特許EPA 0 370 573号、1986年10月16日に出願された米国特許出願番号第920,197号、欧州特許公報番号第265785号、米国特許第4,769,331号、Roizmanの「単純ヘルペスウイルス遺伝子の機能:新規ベクターの遺伝子操作のためのプライマー」、PNAS USA 93:11307−11312、1996年10月;Andreanskyら、「実験的な脳腫瘍の治療への遺伝子操作された単純ヘルペスウイルスの使用法」PNAS USA93:11313−11318頁、1996年10月;Robertsonら、「Bリンパ球への遺伝子送出のためのエプスタイン−バー・ウイルスベクター」PNAS USA93:11334−11340頁、1996年10月;Frolovら、「アルファウイルス基礎の発現ベクター:攻略法および使用法」PNASUSA93:11371−11377頁、1996年10月;Kitsonら、J.Virol.65巻、3068−3075頁、1991年;Gruhausら、1992、「クローニングベクターとしてのアデノウイルス」Semiars in Virology(3巻)、237−52頁、1993年、Ballayら、EMBO Journal、4巻、3861−65頁、Graham、Tibtech 8、85−87頁、1990年4月;Prevecら、J.Gen Virol. 70、429−434頁;1996年7月3日に出願された米国出願番号第08/675,556号および第08/675,566号;PCTのWO91/11525号、Felgnerら、J.Biol.Chem.269巻、2550−2561頁(1994年);Science、259頁:1746−49頁、1993年、およびMcClementsら、「単独でまたは組合せで糖タンパクDまたは糖タンパクBをコードするDNAワクチンを用いた免疫化が、単純ヘルペス疾患の動物モデルでの保護的免疫性を誘導する」PNAS USA 93:11414−11420、1996年10月に開示される方法によるものであるか、またはそれに類似する。
ワクシニアウイルスおよびさらに最近の他のポックスウイルスが、外来遺伝子の挿入および発現のために使用された。外来遺伝子を生きた感染性ポックスウイルスに挿入する基本技術が、供与プラスミドでの外来遺伝子要素を隣接するポックスDNA配列と、奪取ポックスウイルスに存在する相同の配列との間の組換えに関与する(Picciniら、1987年)。
【0069】
特に、組換え体ポックスウイルスは、当業界で知られ、そして米国特許第4,769,330号、第4,772,848号、第4,603,112号、第5,110,587号、第5,179,993号、第5,505,941号、および第5,494,807号に記述されたワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルスのような合成組換え体のポックスウイルスを造る方法に類似する2つの段階で構築できる。これらの開示は、ここに引用される全ての文献の開示と同様に、参照してここに組込まれる。
【0070】
第一に、ウイルスに挿入されるべきDNA遺伝子配列、例えばポックスウイルスのDNAの区分に相同なDNAが挿入された非ポックスウイルスから得た開放読取枠を、イー.コリ(E.coli)プラスミド構築物のようなプラスミド構築物に入れる。別に、挿入されるべきDNA遺伝子配列は、プロモーターにライゲートできた。プロモーター遺伝子連結は、プラスミド構築物に位置決めされ、その結果プロモーター遺伝子連結は、ポックスDNAの領域を挟むDNA配列に相同なDNAによって両方の末端で挟まれる。例えば、ポックスDNAは、必須でない遺伝子座を含む(基礎的な遺伝子座も、使用できる)。その後、生じるプラスミド構築物を、例えば、イー.コリ細菌内での成長によって増幅し(Clewell、1972年)、そして単離する(Clewellら、1969年;Maniatisら、1982年)。代わりに、プロモーターと別のライゲーションなしのDNA遺伝子配列は、単にプラスミド構築物内に入れて、その結果DNA遺伝子配列は、ポックスDNAの領域を挟むDNA配列に相同なDNAによって両方の末端に挟まれる;例えば、したがって、遺伝子配列の発現が、プロモーターの制御下であるような外因性プロモーターから下流の領域、およびDNA遺伝子配列のコーディング部分が隣接する。
【0071】
第二に、挿入されるべきDNA遺伝子配列を含む単離プラスミドを、ポックスウイルスと一緒に、トリの胚フィブロブラストのような細胞培養物にトランスフェクトさせる。プラスミド中の相同のポックスDNAと、ウイルスのゲノムとの間の組換えは、それぞれ、外来DNA配列の、例えばそれのゲノムの必須でない領域での存在によって修飾されたポックスウイルスを付与する。語句「外来」DNAは、外因性DNAが入れられるゲノムによって元来生成されない遺伝子産物についてコードする外因性DNA、特に非ポックス源から得たDNAを意図する。
【0072】
しかし、先述のものは、ベクターまたは組換え体、例えばポックスウイルス−レンチウイルス、レトロウイルスを得るためのあらゆる方法として、本発明のベクターまたは組換え体を得るための手段を限定することを意図せず、および/または免疫欠損ウイルス、例えばネコの免疫欠損ウイルス、組換え体は、本発明を得るのに使用できる。
【0073】
したがって、遺伝的組換えは、一般に、2つのDNAの株の間のDNAの相同な画分の交換である。ある種のウイルスでは、RNAは、DNAを置換できる。核酸の相同の画分は、ヌクレオチド塩基の同一の配列を示す核酸(DNAまたはRNA)の画分である。
【0074】
遺伝的組換えは、感染した宿主細胞内の新規ウイルスのゲノムの複製または製造のあいだに自然に生じうる。したがって、ウイルス遺伝子の間の遺伝的組換えは、2つまたはそれ以上の様々なウイルスまたは他の遺伝子構築物と同時感染される宿主細胞に起こるウイルスの複製サイクルの間に生じる可能性がある。第一のゲノムから得たDNAの画分は、DNAが第一のウイルスゲノムのものと相同である第二の同時感染ウイルスのゲノムの画分を構築する時に相互に交換可能に使用される。
【0075】
しかし、組換えは、完全に相同でない様々なゲノムでのDNAの画分の間でも起りうる。1つのそのような画分が、例えば相同なDNAの一部に挿入された抗遺伝子決定基をコードする遺伝子マーカーまたは遺伝子の第一の画分内に存在することを除き、別のゲノムの画分と相同な第一のゲノムから由来する場合、組換えは、依然として生じることができ、そしてその後、その組換えの産物は、組換えウイルスゲノム中のその遺伝子マーカーまたは遺伝子の存在によって検出できる。したがって、組換えワクシニアウイルスのような組換えポックスウイルスを生成する更なる攻略法が、最近報告され、そしてこれらの攻略法は、本発明の実施に使用できる。
【0076】
修飾感染性ウイルスによって挿入されたDNA遺伝子の配列を首尾よく発現するのは、2つの条件下で起こりうる。第一に、挿入は、修飾されたウイルスが、生存できるままにするためにウイルスの必須でない領域に、またはそれにより必須の機能が中断されないか、またはその機能が全ての条件下で生存可能なために必須でない領域にできる。
【0077】
挿入DNAの発現のための第二の条件は、挿入DNAと適切な関係にあるプロモーターの存在である。そのプロモーターは、発現されるべきDNA配列のコーディング領域から上流に位置しうる。
【0078】
ワクシニアウイルスは、疱瘡に対して首尾よく免疫化するのに使用され、それにより1980年以来疱瘡の世界規模の撲滅を完了させた。その歴史の経路で、多くのワクシニアの株が作られた。これらの様々な株は、免疫原性が変化することを示し、そして潜在的複雑さを示す可変の程度まで影響され、それらの最も重大なのは、後期ワクシニア脳炎および全身化ワクシニアである(Behbehani、1983年)。
【0079】
疱瘡の撲滅について、外来遺伝子の発現のための遺伝子操作されたベクターものであるワクシニアの新たな役割は、重要になった。莫大な数の異種の抗原をコードする遺伝子が、ワクシニアで発現され、しばしば対応の病原による対抗に対する保護的免疫性を生じた(Tartagliaらで再検討された、1990a)。
【0080】
ワクシニアベクターの遺伝的背景は、発現外来免疫原の保護効率に影響されることが示されてきた。例えば、ワクシニアウイルスのウエイスのワクチン株内でのエプスタイン・バー・ウイルス(EBV)gp340の発現は、EBVウイルス誘発リンパ腫に対してコットントップ・タマリンを保護しなかった一方で、ワクシニアウイルスのWRの実験室株にある同じ遺伝子の発現は、保護的であった(Morganら、1988年)。
【0081】
ワクシニアウイルス基本の組換え体ワクチン候補の効力および安全性との間の細かなバランスは、厳密に重要である。組換えウイルスは、ワクチンを与えたが、なんら顕著な病原特性を欠く動物での保護的免疫反応を引出す方法で、免疫原を表すに違いない。したがって、ベクター株の弱毒化は、技術の現状を超えて非常に望ましい利点である。
【0082】
組織培養中のウイルスの成長に必須でなく、その欠失または不活性化が様々な動物系で毒性を減少させた、多くのワクシニア遺伝子が確認された。
【0083】
ワクシニアウイルス・チミジンキナーゼ(TK)をコードする遺伝子がマッピングされ(Hrubyら、1982年)、そしてシーケンシングされた(Hrubyら、1983年;Weirら、1983年)。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化または完全な欠失は、組織培養中の広範な細胞中のワクシニアウイルスの成長を避けない。TK−ワクシニアウイルスは、様々な経路により、様々な宿主での接種の部位でインビボで複製する能力もある。
【0084】
TK−ウイルスでモルモットを膣内接種すると、TK+ウイルスで接種したものより脊椎で明かに低いウイルス力価を生じることが、単純ヘルペスウイルス2型について分かっている(Stanberryら、1985年)。ヘルペスウイルスにコードされたTK活性が、細胞を活発に代謝する上でウイルスの成長にとって重要でないが、静止細胞でのウイルス成長には必要であることが例示された(Jamiesonら、1974年)。
【0085】
TK−ワクシニアの弱毒化は、大脳内および腹膜内経路によって接種したマウスで示された(Bullerら、1985年)。WRの神経毒性の実験室株について、そしてウエイスのワクシニア株についての両方の弱毒化が観察された。皮膚内経路によって接種されたマウスでは、TK−組換えワクシニアは、親のTK+ワクシニアウイルスと比較して抗体を中和する同等の抗ワクシニアを生成し、それによりこの試験系で、TK機能の欠損は、ワクシニアウイルスベクターの免疫原性を明かには減少しないことを示した。マウスにTK−およびTK+組換えワクシニアウイルス(WR株)を鼻腔内接種することに続いて、脳を含めた他の場所へのウイルスの散在は明かに少ないことが分かった(Taylorら、1991a)。
【0086】
ヌクレオチド代謝に関与した別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。大きなサブユニットをコードする遺伝子を欠失させることによる、単純ヘルペスウイルス(HSV)でのウイルスでコードされたリボヌクレオチドレダクターゼ活性の損失は、in vitroで細胞を分割する際のウイルス成長およびDNA合成に何の影響も及ぼさないことが示されたが、しかし血清を欠乏させた細胞での清澄に対するウイルスの能力を重篤に傷つけた(Goldsteinら、1988年)。目の急性HSV感染および三叉神経節での反応しうる潜在性感染のマウスモデルを用いて、野生型HSVによって示された毒性と比較して、リボヌクレオチドリダクターゼの大きなサブユニットの欠失されたHSVについて毒性が減少させたことが例示された(Jacobsonら、1989年)。
【0087】
リボヌクレオチドリダクターゼの小さな(Slabaughら、1988年)および大きな(Schmidttら、1988年)サブユニットの両方が、ワクシニアウイルスで確認された。マウスの頭蓋内接種によって測定した場合、WR株のワクシニアウイルスにあるリボヌクレオチドリダクターゼの大きなサブユニットの挿入的不活性化が、そのウイルスの弱毒化に至る(Childら、1990年)。
【0088】
ワクシニアウイルス・ヘマグルチニン遺伝子(HA)は、マッピングされそしてシーケンシングされている(Shida、1986年)。ワクシニアウイルスのHA遺伝子は、組織培養での成長には必須でない(Ichihashiら、1971年)。ワクシニアウイルスのHA遺伝子を不活性化すると、頭蓋内経路によって接種されたウサギで神経毒性が減少する(Shidaら、1988年)。HA遺伝子座は、ワクシニアウイルスのWR株(Shidaら、1987年)、リスター株(Shidaら、1988年)およびコペンハーゲン株(Guoら、1989年)の外来遺伝子の挿入のために使用した。外来遺伝子を発現する組換え体HA−ワクシニアウイルスは、免疫原性であること(Guoら、1989年;Itamuraら、1990年;Shidaら、1988年;Shidaら、1987年)、そして同等の病原による対抗に対して保護的であること(Guoら、1989年;Shidaら、1987年)が示された。
【0089】
牛痘(ブライトン・レッド株)は、ニワトリの卵の漿尿膜の赤い(出血性)痘疹を生じる。牛痘ゲノム内の突発性欠失が、白色痘疹を生じる突然変異体を発生させる(Pickupら、1984年)。出血機能(u)は、初期遺伝子によってコードされた38kDaのタンパク質にマッピングする(Pickupら、1986年)。セリンプロテアーゼ阻害剤に相同性を示すこの遺伝子は、牛痘に対する宿主の炎症反応を阻害することが示され(Palumboら、1989年)、そして血液凝固の阻害剤である。
【0090】
u遺伝子は、ワクシニアウイルスのWR株に存在する(Kotwalら、1989年b)。u領域が、外来遺伝子の挿入によって不活性化されたWRワクシニアウイルス組換え体を接種したマウスは、u遺伝子が不活性である同様の組換え体ワクシニアウイルスを接種したマウスと比較して、外来遺伝子産物に高いレベルの抗体を生じる(Zhouら、1990年)。u領域は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株で欠乏性の機能しない形態で存在する(Goebelら、1990年a、bに報告された技術による開放読取枠B13およびB14)。
【0091】
牛痘ウイルスは、細胞質A型封入体(ATI)中の感染細胞に位置する(Katoら、1959年)。ATIの機能は、動物から動物への伝播の間牛痘ウイルスビリオンの保護であると考えられる(Bergoinら、1971年)。牛痘ゲノムのATI領域は、ATI体のマトリックスを形成する160kDaのタンパク質をコードする(Funahashiら、1988年;Patelら、1987年)。そのゲノムに相同な領域を含むが、ワクシニアウイルスは、一般にATIを生成しない。ワクシニアのWR株では、ゲノムのATI領域を、94kDaタンパク質として翻訳する(Patelら、1988年)。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株では、ATI領域に対応するDNA配列のほとんどが、ATI領域から上流の配列と融合した領域の残りの3’末端と一緒に欠失されて、開放読取枠(ORF)A26Lを形成する(Goebelら、1990年a、b)。
【0092】
様々な自発的(Altenburgerら、1989年;Drillienら、1981年;Laiら、1989年;Mossら、1981年;Paezら、1985年;Panicaliら、1981年)および遺伝子操作された(Perkusら、1991年;Perkusら、1989年;Perkusら、1986年)欠失が、ワクシニアウイルスゲノムの左末端に隣接することが報告された。10kbの自発性欠失を示すワクシニアウイルスのWR株(Mossら、1981年;Panicaliら、1981年)は、マウスで頭蓋内接種することによって弱毒化されることが示された(Bullerら、1985年)。この欠失は、17個の潜在的ORFを含むことが後に示された(Kotwalら、1988年b)。欠失領域内の特異的遺伝子は、バイロキンN1Lおよび35kDaタンパク質を包含する(Goebelら、1990年a、bで報告された技術によってC3L)。N1Lの挿入不活性化は、正常およびヌードマウスの両方に頭蓋内接種することによって毒性を減少させる(Kotwalら、1989年a)。35kDaタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地に、N1Lのように分泌される。そのタンパク質は、相補な対照タンパク質、特に相補な4B結合タンパク質(C4bp)のファミリーと相同性を含む(Kotwalら、1988年a)。細胞性C4pbのように、ワクシニアの35kDaタンパク質は、相補物の4番目の要素を結合し、そして古典的相補カスケードを阻害する(Kotwalら、1990年)。したがって、ワクシニアの35kDaタンパク質は、宿主の防御機構をすり抜ける上でウイルスを助けることに関与するように見える。
【0093】
ワクシニアゲノムの左の末端は、宿主範囲の遺伝子K1L(Gillardら、1986年)およびC7L(Perkusら、1990年)と同定された2つの遺伝子を包含する。これらの遺伝子の両方を欠失されることは、様々なヒト・セルラインで清澄するワクシニアウイルスの能力を減少させる(Perkusら、1990年)。
【0094】
新たなワクシニアワクチン株NYVAC(vP866)を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株は、公知または潜在性毒性因子をコードするゲノムの6つの非必須領域の欠失によって修飾された。連続欠失は、米国特許番号第5,364,773号および第5,494,807号に詳説される。ワクシニア制限断片、開放読取枠およびヌクレオチド位置の全ての名称は、Goebelら、1990年a、bで報告された技術に基づく。
【0095】
欠失遺伝子座は、外来遺伝子の挿入のための授与遺伝子座としても操作された。
【0096】
NYVAC中で欠失された領域は、下に列記される。さらに列記されるのは、略号および欠失領域のための開放読取枠の名称であり(Goebelら、1990年a、b)、そしてワクシニア組換え体(vP)の名称は、特定化された欠失による全ての欠失を含む:
(1)チミジンキナーゼ遺伝子(TK;J2R)vP410;
(2)出血性領域(u;B13R+B14R)vP553;
(3)A型封入体領域(ATI、A26L)vP618;
(4)ヘマグルチニン領域(HA;A56R)vP723;
(5)宿主範囲遺伝子領域(C7L−K1L)vP804;
および
(6)大きなサブユニットのリボヌクレオチドレダクターゼ(I4L)vP866(NYVAC)。
【0097】
NYVACは、一般に、毒性に関連した遺伝子産物をコードする18個の開放読取枠および宿主範囲の特定の欠失によって生じた遺伝子操作ワクシニアウイルス株である。NYVACは、i)、新生マウスで大脳内接種後毒性が減少したこと、ii)遺伝的に(nu +/nu +)または化学的に(シクロホスファミド)免疫を発揮できないマウスでの接種性、iii)免疫を発揮できないマウスでの散在性感染を起こすのに失敗すること、iv)ウサギの皮膚に目立った硬化および腫瘍化を欠くこと、v)接種の部位からの迅速なクリアランスおよびvi)ヒト起源のものを含めた多数の組織培養セルラインでの複製能力が非常に減少されたことを含めた多くの条件によって高度に弱毒化される。それにもかかわらず、NYVAc基本ベクターは、固有の免疫原に対する素晴らしい反応を誘導し、保護的免疫を提供した。
【0098】
2つのさらなるワクシニアベクター系は、自然に宿主を制限したポックスウイルス、アビポックスウイルスを使用することに関連する。鶏痘ウイルス(FPV)およびカナリア痘ウイルス(CPV)の両方は、外来遺伝子産物を発現するように操作された。鶏痘ウイルス(FPV)は、ポックスウイルスファミリーの鳥類のポックスウイルスのプロトタイプのウイルスである。ウイルスは、生の弱毒化ワクチンを使用することによって、1920年代以来十分に制御された家禽の経済的に重要な疾患を引起こす。鳥類ポックスウイルスの複製は、鳥類の種に限定され(Matthews、1982年)、そしてヒトを含めた全ての非鳥類の種での生産的感染を引起こす鳥類ポックスウイルスの文献についての報告はない。この宿主制限は、他の種に対するウイルスの伝達に対する遺伝的安全性防御を提供し、そして獣医学およびヒト用途でのワクチンベクターを、魅力的な計画にする。
【0099】
FPVは、家禽の病原から得た抗原を発現するベクターとして有利に利用された。毒性の鳥類インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質は、FPV組換え体内で発現された(Taylorら、1988年a)。組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種した後、同種または異種のいずれかの毒性インフルエンザウイルス対抗に対して保護的である免疫反応が、導入された(Taylorら、1988年a)。ニューキャッスル病ウイルスの表層糖タンパクを発現するFPV組換え体も、開発されてきた(Taylorら、1990年;Edbauerら、1990年)。
【0100】
鳥類系に対するFPVおよびCPVの複製のための宿主制限の代わりに、これらのウイルスから誘導される組換え体が、非鳥類起源の細胞中の固有のタンパク質を発現することが分かった。さらに、このような組換え体ウイルスは、外来遺伝子産物に向けて指示され、そして対応の病原に対する対抗から保護できることが適切であると示された免疫学的反応を引起こすことが示された(Tartagliaら、1993年a、b;Taylorら、1992年;1991年b;1988年b)。
【0101】
ALVAC組換え体は、Picciniら、1983年;Perkusら、1995年に詳述された方法、例えば、新規で非自明な産物がそれから生じるとき、新規で、そして本発明に関して非自明である組換え体によってできる。
【0102】
TROVACは、1日齢のニワトリのヒナのワクチン化として許可されている鶏痘のFP−1ワクチン株から誘導されたプラーク−クローン化単離物である弱毒化鶏痘に該当する。
【0103】
ALVACは、許可されたカナリヤポックスウイルス、カナポックス(Kanapox)のプラーク−クローン化誘導体であった弱毒化カナリヤポックスウイルス基本のベクターである(Tartagliaら、1992年)。ALVACは、カナポックスのある種の一般的特性と同じ、ある種の一般的特性を示す。ALVACは、単モルのカナリアポックスウイルス種である。
【0104】
固有の免疫原を発現するALVAC基本の組換えウイルスは、ワクチンベクターとして有効であることも示された(Tartagliaら、1993年a、b)。この鳥類ポックスウイルスは、生産的複製について鳥類の種に限定される。ヒト細胞培養で、カナリアポックスウイルス複製は、ウイルス性DNA合成の前にウイルスの複製サイクルで初期に中断される。それにもかかわらず、固有の免疫原を発現するように操作される時に、真正な発現および経過が、哺乳類の細胞中、in vitroで観察され、そして多数の哺乳類の種に接種することが、固有の免疫原に対する抗体および細胞免疫反応を導入し、そして同種の病原との対抗に対して保護を供する(Taylorら、1992年;Taylorら、1991年)。
【0105】
カナリポックス/狂犬病の糖タンパク組換え体(ALVAC−RG)のALVAC組換え体の欧州および米国の両方での最近のフェースIの臨床治験は、ALVACワクチンが安全で、充分に耐性があることを示し、そして例えば、抗体力価を中和する狂犬病ウイルスの保護レベルを誘導した(Friesら、1996年;Pialouxら、1994年;Cadozら、1992年)。さらに、ALAC−RGワクチンから誘導される末梢血の単核細胞(PBMC)は、精製した狂犬病ウイルスで刺激された時に、際立ったレベルのリンパ球増殖を例示した(Friesら、1996年)。
【0106】
NYVAC、ALVACおよびTROVACは、ウイルスまたはベクターのような遺伝的材料の物理的混入についての指針、すなわち特定のウイルスまたはベクターの病理学性に基づいたこのようなウイルスおよびベクターを使用する安全手段についての指針を発行するナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス(「NIH」)(米国公衆衛生局)、組換えDNA助言委員会は、BSL2からBSL1までの物理的混入レベルでの減少を授与するという点で全ポックスウイルスのなかでも特徴的であるとして認識された。他のポックスウイルスは、BSL1物理的混入レベルを示すものはない。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株でさえ、共通の疱瘡ワクチンは、高い物理的混入レベル、すなわちBSL2を示す。したがって、当業者は、他のポックスウイルスより低い病理原性を示すことを認識している。
【0107】
ALVAC−基本の組換え体ウイルスは、ヒトPBMCから得たin vitroでの特定のCD8+CTLを刺激することが示された(Tartagliaら、1993年a)。種々の形態のHIV−1エンベロープ糖タンパクを発現するALVAC組換え体で免疫されたマウスは、二次接種によって呼起こすことができる一次および記憶HIV特異的CTL反応の両方を発生した(Tartagliaら、1993年a;Coxら、1993年)。ALVAC−env組換え体(HIV−1エンベロープ糖タンパクを発現する)は、HIV−1感染個体の末梢血液単核細胞(PBMC)からの強力なHIV−特異的CTL反応を刺激する(Tartagliaら、1993年a;Coxら、1993年)。急性に感染した自己PBMCを、残りのPBMCのための刺激細胞として使用した。外因性IL−2の不在下で10日インキュベーションした後、細胞を、CTL活性について評価した。ALVAC−envは、マウスでの高いレベルの抗−HIV活性を刺激した。これらの、そして類似の研究(米国特許出願番号第08/417,210号参照)は、特に免疫欠損ウイルスに対するALVAC−基本の組換え体の利用性を示す。特に、ALVACの高度に弱毒化された特徴は、このような研究で免疫感応および免疫を発揮できない動物モデルの両方で表される。そしてALVAC−基本の組換え体の安全性も示された。
【0108】
したがって、本発明では、カナリアポックスウイルス基本のALVACベクターが好まれる。
【0109】
明らかに、ALVACベクターの弱毒化プロフィール、および固有の免疫原に対するヒトのおよび細胞の免疫学上の反応の両方を引出すその例示の能力に基づいて(Tartagliaら、1993年a;Taylerら、1992年)、このような組換え体ウイルスは、先に記述されるワクシニア基本の組換え体ウイルスより際立った利点を供する。
【0110】
おそらくFIVにさらに関連して(ネコが関与している場合)、FeLV(サブグループA)envおよびgag遺伝子産物を発現するALVAC−基本の組換え体ウイルス(ALVAC−FL;vCP97)は、口鼻のFeLVチャレンジ暴露に対してネコを完全に保護できることが見られる(Tartagliaら、1993年)。明かに、保護は、対抗の前に検出可能なFeLV−特異的血清中和活性の不在下で可能にされた。
【0111】
本発明の特定の実施態様で、出願人らは、数種のALVAC−FIV組換え体を操作し、そして実験的FIV暴露に対してネコの保護を可能にするそれらの能力を評価した。要約すると、出願人らは、ALVAC−FIVのGag−プロテアーゼ組換え体を用いてネコのワクチン化によって、相同のFIVチャレンジ暴露から保護を示した。FIV Env単独またはGag−プロテアーゼと組合せて発現する組換え体は、保護のレベルを際立たせなかった。さらに、ALVAC−FIV env/gag−プロテアーゼで初期免疫すること、そしてアジュバント化した不活性化全細胞ワクチンの追加免疫することから構成されるワクチン化計画は、完全な保護を提供し、それにより、Env単独またはGag−プロテアーゼと組合せて発現する組換え体の活用が示されたが、それにもかかわらず、これらの組換え体は、それ自身目立ったレベルの保護をできなかった(そしてさらに、これらの組換え体は、本発明の他の局面、例えばそれにもかかわらず、例えば有用な抗体、またはキット、試験、アッセイなどで得るのに有用でありうる産物を発現するのに使用できる)。
【0112】
興味深いことに、ELISAによって測定したFIV固有の体液反応およびウェスタンブロットは、必ずしも防御性を予測するわけではない。しかも、Env固有の体液反応は、認められた防御性とは関連付けられなかった。
【0113】
さらに、ここでのデータは、ネコにおける、特に、発明による組換え体(ALVAC-FIV組換え体など)およびICVを含むプライム/ブーストプロトコルでの、異種FIV抗原投与に対する本発明の組換え体のFIV効率を示す。
【0114】
その上、ここでのデータは、FIVおよびネコについて、他のレンチウィルス、レトロウィルス、およびEIAV、FIV、BIV、HIVあるいはSIVなどの免疫不全ウィルスに拡張可能である。したがって、Env、Gag、プロテアーゼなどこれらの他のウィルスから対象とするエピトープをコード化する核酸分子に関する当業界内の知識は、ここで例証されたFIVデータに類似した、対象とするエピトープを発現する組換え体を作成および使用するのに利用できる。また特に、他のレンチウィルス、レトロウィルス、EIAV、FIV、BIV、HIVあるいはSIVなどの免疫不全ウィルス用の、Env、Gag、Pol、または、プロテアーゼ、付属官能基/タンパク質、あるいはそのエピトープを含む部分などのPolの一部をコード化する核酸分子の当業界内の知識を用い、ベクターシステムの当業界内の知識を用いると、当業者は、随意に付属官能基/タンパク質とともに、これらの他のウィルスの、Env、GagおよびPolまたはPolの一部、あるいはGagおよびPolまたはPolの一部、あるいはEnv、Gagおよびプロテアーゼ、Gagおよびプロテアーゼ、あるいはそのエピトープを発現するベクターまたは組換え体を作成でき、FIVに関してここで例証したように、プライム/ブースト処置などの免疫処置においてベクターまたは組換え体を、必要以上の実験を行わずに使用できる。したがって、本発明は、レンチウィルス、レトロウィルスおよびFIV以外(FIVは他のレンチウィルス、レトロウィルスおよび免疫不全ウィルスのモデルであるため)の免疫不全ウィルスのベクターまたは組換え体と、これらのベクターおよび組換え体の作成および使用方法を包む。
【0115】
発明によるベクターまたは組換え体が産生する発現生成物は、感染細胞または形質移入細胞から単離し、サブユニット・ワクチン形状(組成物、あるいは抗原または免疫組成物)で宿主に接種することもできる。ベクターまたは組換え体が産生するタンパク質、およびそれから導出される抗体も、レンチウィルス、レトロウィルス、またはFIVなどの免疫不全ウィルスの有無を検出するアッセイに使用できる。
【0116】
したがって、本発明は、レンチウィルス、レトロウィルスまたは免疫不全ウィルス免疫源などの、対象とする免疫原またはエピトープ、あるいは、EIAV、FIV、BIV、HIV、またはSIV免疫原などの対象とするエピトープ、あるいは対象とするエピトープを含む。実際には、本発明は、HIV-1、-2、EIAV、BIVを含むがこれに限定されない、レンチウィルスの対象とする免疫原またはエピトープを含む。すべてのレンチウィルスは、FIV、Env、Gag-プロテアーゼの機能同族体を発現する。これらの機能同族体をコード化する核酸配列の識別、クローニング、利用の技術は当業者に既知であり、本開示に照らして実施するのに必要以上の実験は不要である。
【0117】
最新技術に関しては、特に以下を参照する:Gondaら(1990)レンチウィルス疾患のモデルとしてのウシ免疫不全様ウィルス. Dev. Biol. Stand. 72:97-110;Garveyら(1990)生物活性ウシ免疫不全様ウィルスヌクレオチド配列およびゲノム構造. Virology 175:391-409;Gondaら(1987)ヒト免疫不全ウィルスに関連したウシレンチウィルスのキャラクタリゼーションおよび分子クローニング. Nature 330:388-391;Ballら(1988)EIAVゲノム構造:精製糖タンパク質およびcDNAの配列による、さらなるキャラクタリゼーション. Virology 165:601-605;Kawakamiら(1987)ウマ伝染性貧血症ウィルスプロウイルスDNAのヌクレオチド配列分析. Virology 158:300-312;Yanivら(1986)統合ウマ伝染性貧血症ウィルスの分子クローニングおよび物理キャラクタリゼーション:ヒツジおよびヤギレンチウィルスとの密接な関係についての分子的および免疫学上の証拠. Virology 154:1-8;Stephensら(1986)ウマ伝染性貧血症ウィルスgagおよびpol遺伝子:ビズナおよびAIDSウィルスとの関係. Science 231:589-594;Chiuら(1985)AIDSレトロウィルスのレンチウィルスに対する関係のヌクレオチドの証拠. Nature 317:366-368;はもちろんのこと、Retrovirus Biology and Human Disease、Gallo, R.C and Wong−Stall, F. 編、Marcel Dekker, Inc. New York、1990の多数の総説。
【0118】
さらに、発明のベクターまたは組換え体から、このような対象とする免疫原またはエピトープをコード化するDNAは、他のポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウイルス、アルファウィルスに基づく方法、および、裸または調整されたDNAに基づく免疫原を含むがこれに限定されない、代わりの適切に処理された哺乳類発現システムを用いて、免疫処置により投与できる。このような組換え体サブユニットの処理技術は、当業者に既知である。
【0119】
これらの免疫処置の媒質および最新知識に関する技術については、特に以下を参照する:Hormaeche and Kahn, Perkus and Paoletti, Shiverら Concepts in Vaccine Development、Kaufman, S. H. E.編、Walter deGruytes, New York, 1996、のすべて、および、Viruses in Human Gene Therapy, Vos, J. -M. H編、Chapman and Hall, Carolina Academic Press, New York, 1995 および Recombinant Vectors in Vaccine Development, Brown, F.編, Karger, New York, 1994で述べられたベクター。
【0120】
さらに本発明は、 組換えウィルスまたはその発現生成物を含む抗原性、免疫原性、免疫性またはワクチン組成物、および、許容できる担体または希釈剤を提供する。ベクターまたは組換えウィルス(またはその発現生成物)免疫組成物は、局所的または系統的な免疫反応を誘発する。この反応は、必要はないが、防御的になり得る。同様に抗原組成物は、局所的または系統的な免疫反応を誘発する。この反応は、必要はないが、防御的になり得る。したがって、"免疫組成物"、"抗原組成物"および"免疫原組成物"という語は、(この3つの語は防御的組成物になり得るため)"ワクチン組成物"を含む。防御反応は、体液性および/または分泌性および/または細胞媒介反応などの反応と理解され、免疫を付与する。免疫とは、感染に抵抗または感染を克服する能力、あるいは、発明組成物が処方されない被験者と比べて感染を容易に克服する能力、あるいは、発明組成物が処方されない被験者と比べて感染に耐える、すなわち感染への耐性の向上と理解される。
【0121】
対象とするエピトープに関し、当業者は、アミノ酸とペプチドまたはポリペプチドの該当するDNA配列の知識はもちろんのこと、特定のアミノ酸の性質(サイズ、電荷など)およびコドンディクショナリから、必要以上の実験を行わずに、ペプチドまたはポリペプチド、したがって、そのためにコード化DNAのエピトープまたは免疫優性領域を決定できる。
【0122】
免疫組成物にタンパク質の使用部分を決定する一般的な方法では、対象とする抗原のサイズと配列に注目する。"一般に、大型のタンパク質は、潜在的な決定因子を多く持っているため、小型のタンパク質よりも優れた抗原である。抗原が異質になればなるほど、すなわち、耐性を生じさせる自己の配置に最も類似しなくなると、免疫反応が効果的に起こる。"Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988。
【0123】
サイズに関して:当業者は、哺乳類ベクターに挿入されるDNA配列がコード化するタンパク質のサイズを最大限にできる(ベクターの挿入限界に留意する)。発現されるタンパク質のサイズを最大限にしながら、挿入するDNAを最小限にするために、DNA配列は介在配列(転写されるが、引き続きプライマリRNAから実施される遺伝子の領域)を除くことができる。
【0124】
DNA配列は、最低で、少なくとも8または9個のアミノ酸長のペプチドをコード化できる。これは、ペプチドが(ウィルス感染細胞または癌性細胞を認識する)CD4+T細胞反応を促進するために必要な最小限の長さである。アミノ酸が13〜25個の最低ペプチド長は、(病原体を取りこんだ、特殊な抗原を示す細胞を認識する)CD8+T細胞反応を促進するのに有効である。KendrewのThe Encyclopedia of Molecular Biology(Blackwell Science Ltd 1995)を参照のこと。しかし、これらのペプチドは最小限の長さであるため、免疫反応、すなわち、抗体またはT細胞反応を生成しやすい;しかし、(ワクチン組成物などによる)防御反応の場合は、さらに長いペプチドが好ましい。
【0125】
配列に関して、DNA配列は、少なくとも、抗体反応またはT細胞反応を生成するペプチドの領域をコード化することが好ましい。TおよびB細胞エピトープを決定するひとつの方法として、エピトープマッピングがある。対象とするタンパク質は"タンパク質分解酵素を用いて重複ペプチドに断片化される。そして各ペプチドについて、未変性のタンパク質が誘発した抗原への結合能力、あるいは、T細胞またはB細胞活性化を引き起こす能力を試験する。この手法は、T細胞によって、MHC分子と結合した短い線形のペプチドが認識されるため、T細胞エピトープのマッピングに特に有効である。この方法は、B細胞エピトープの決定にはあまり有効ではない。"なぜなら、B細胞エピトープは、たいてい線形アミノ酸配列ではなく、折れ曲がった3次元タンパク質の三次構造から生じるからである。Janis Kuby, Immunology, pp. 79-80(1992)。
【0126】
対象とするエピトープを決定するもうひとつの方法は、親水性のタンパク質の領域を選択することである。親水性残基は、通常、タンパク質表面にあるため、たいてい、抗原に到達可能なタンパク質領域である。Janis Kuby, Immunology, p. 81(1992)。
【0127】
対象とするエピトープを決定するさらにもうひとつの方法は、抗原(全長)-抗体複合体のX線結晶解析を行うことである。Janis Kuby, Immunology, p. 80(1992)。
【0128】
T細胞反応を産生可能な対象とするエピトープを選択するまた別の方法は、MHC分子に結合しやすいことが知られているペプチド配列である、タンパク質配列電位HLAアンカー結合モチーフから識別することである。
【0129】
T細胞反応を産生するには、対象とする推定上のエピトープであるペプチドが、MHC複合体中に示されることが望ましい。このペプチドは、好ましくは、MHC分子に結合するための適切なアンカーモチーフを含み、免疫反応を産生するのに十分な高さの親和力によって結合する。考慮可能な因子は次のとおりである:免疫化される(脊椎動物、動物またはヒト)患者のHLA型、タンパク質の配列、適切なアンカーモチーフの存在、他の生体細胞のおけるこのペプチド配列の発生。
【0130】
免疫反応は、一般に、以下のように産生する:T細胞は、タンパク質がさらに小さいペプチドに切断され、別の細胞表面に位置する"主組織適合性複合体MHC"と呼ばれる複合体の形で現れた場合のみに、タンパク質を認識する。MHC複合体には、クラスIとクラスIIの2つのクラスがあり、各クラスは、多くの種々の対立遺伝子で構成される。それぞれの患者は、異なる型のMHC複合体対立遺伝子を持つ;すなわち、'異なるHLA型'を持つと言われる。
【0131】
クラスIMHC複合体は、本質的にすべての細胞に見られ、細胞内で生成されたタンパク質からペプチドを生じさせる。したがって、クラスIMHC複合体は、ウィルスに感染した細胞や発ガン遺伝子の発現の結果として癌化した細胞を殺すのに有効である。表面にCD4というタンパク質を持つT細胞は、MHCクラスI細胞に結合し、リンフォカインを分泌する。リンフォカインは、反応を促進する;細胞がウィルス感染細胞に到達し、これを殺す。
【0132】
クラスIIMHC複合体は、抗原提示細胞のみに見られ、抗原を示す細胞により形質膜陥入された循環病原体からペプチドを生じさせるのに用いられる。CD8と呼ばれるタンパク質を持つT細胞は、MHCクラスI細胞に結合し、溶菌顆粒の開口分泌により細胞を殺す。
【0133】
タンパク質が、T細胞反応を促進する対象とするエピトープを含むかどうかを判定するための、あるガイドラインは、以下の事項を含む:ペプチド長 - ペプチドは、MHCクラスI複合体に適合させるには少なくともアミノ酸8〜9個の長さで、MHCクラスII複合体に適合させるには少なくともアミノ酸13〜25個の長さであることが望ましい。この長さは、MHC複合体に結合するペプチドにとっては最小限の長さである。細胞が、発現されたペプチドを切断することがあるため、ペプチドはこれ以上の長さであることが好ましい。
【0134】
ペプチドは、そのペプチドを、免疫反応を生じさせるのに十分に高い特異性によって種々のクラスIまたはクラスII分子に結合させる、適切なアンカーモチーフを含むことが望ましい(Bocchia, M.ら、Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Peptides to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684;Englehard, VH, Structure of peptide associated with class I and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12:181(1994)を参照)。これは、必要以上の実験をせずに、対象とするタンパク質の配列を、MHC分子に結合するペプチドの公表された構造と比較することにより実施できる。T細胞レセプタが認識するタンパク質エピトープは、タンパク質分子の酵素分解によって生成するペプチドであり、クラスIまたはクラスIIMHC分子に結合して、細胞表面に現れる。
【0135】
さらに、当業者は、タンパク質配列を、タンパク質データベースに示された配列と比較することによって、対象とするエピトープを確認できる。わずかしか、あるいは全く一致しないタンパク質の領域を、そのタンパク質のエピトープとして選択したほうがよく、ワクチンまたは免疫組成物に有効である。生体細胞に存在する、広範に見られる配列と大部分が一致する領域は、避けることが望ましい。
【0136】
またさらに、別の方法は、対象とするタンパク質の部分を生成または発現させ、対象とするタンパク質のこの部分に対するモノクローナル抗体を産生して、これらの抗体が、タンパク質が誘導された病原体の生体外での成長を阻害するかどうかを確認するだけである。当業者は、本開示および当業界で公表されたもうひとつのガイドラインを用いて、抗体による生体外での成長の阻害の有無を分析するために、対象とするタンパク質の一部を生成または発現させることができる。
【0137】
たとえば、当業者は、対象とするタンパク質の一部を、以下の手順によって生成できる:タンパク質のアミノ酸長が8〜9個または13〜25個の部分を選択、親水性領域を選択、抗原(全長)-抗体複合体のX線データから、結合するために、示された部分を選択、他のタンパク質による配列と異なる領域を選択、潜在的なHLAアンカーモチーフを選択、あるいは、これらの方法または当業者に既知の他の方法の組み合わせ。
【0138】
抗体によって認識されたエピトープをタンパク質の表面上で発現させた。ある技巧的な技術で抗体応答を刺激しそうなタンパク質の領域を決定するには、上記の一般的な方法又は技術的に公知の他のマッピング方法を用いて、エピトープマップを好ましく実施することが可能である。
【0139】
前記の記述、この公報及び技術的知見を参照することが可能であるので、当業者は、過度の実験なしに、T細胞、B細胞及び/又は抗体反応を得るための関心のレンチウイルスエピトープのアミノ酸とそれに対応するDNA配列を確認することが可能である。加えて、参考文献として、Getterらの1991年5月28日発行の米国特許第5,019,384号とそれに引用された文献があり、ここに、参考文献として組み込んだ。(この特許の「関連する文献」の項と開示したこの特許の13欄を特に注意すること。そこには、次の記述がある。「多数のエピトープを広範囲の様々なの関心のある有機体に対して明らかにした。格別の関心は、抗体を中和するそれらのエピトープである。それらのエピトープの記述は、関連文献の欄に引用した多くの文献にある。」
発明のベクター又は組換え体又はその発現産生物、免疫組成物、抗原組成物又はワクチンの組成物、あるいは治療組成物に対する投与処置は、皮内、筋肉内又は皮下のような非経口的経路を介して行うことができる。そのような投与は、全身性の免疫学的応答に利用できる。投与は、口、鼻、生殖器等のような粘膜を通じても可能である。そのような投与は、局所的な免疫学的応答に利用できる。
【0140】
さらに広くは、本発明の抗原組成物、免疫学組成物又はワクチン組成物あるいは治療の組成物(本発明のベクター又は組換え体又は発現産物を含んでいる組成物)は、製薬あるいは獣医学技術の当業者によく知られている標準的技術に従って調製することが可能である。そのような組成物は、投薬で投与することができ、薬学及び/または獣医学の当業者がよく熟知している技術によって、品種又は種類、年齢、性別、体重、特定の患者の状態及び投薬経路のような因子を考慮して、そのような組成物を投与することができる。その組成物は、単独で投与するか、他と一緒に投与するか、本発明の他の組成物又は他の免疫組成物、抗原組成物、ワクチン組成物又は治療組成物と一緒に順序的に投与することができる。そのような別の組成物として、精製された天然の抗原又はエピトープ、あるいはポックスウイルス組換え体又は他のベクター系による発現からの抗原又はエピトープを含むことが可能であり、そして、前述の要素を考慮して投与される。
【0141】
本発明の組成物の実施例は、口、鼻、肛門、膣のような生殖器等の開口部に対する液体調製物;懸濁液、シロップ剤又はあるいはエリキシルのような投与;また、非経口、皮下、皮内、筋肉内又は例えば注射可能な静脈内投与用の滅菌した懸濁液又はエマルジョンのような調整、を含んでいる。そのような組成物では、組換え体が、滅菌水、生理的食塩水、グルコース又はその類似物のような、適当な担体、希釈剤、賦形剤とともに混合剤中に入っていてもよい。
【0142】
抗原組成物、免疫組成物又はワクチン組成物は、典型的に、補助剤と望ましい応答を生じるような量の組換え体又は発現産物を含むことができる。ヒトへの適用においては、燐酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムのようなアルムが典型的な補助剤である。サポニン及びその精製成分Quil A、Freundの完全な補助剤と他の補助剤は、研究や獣医学の応用において用いられている。ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピッドA、リン脂質の調製は化学的に定義されており、それらは、Goodman-Snilkoff らによって、 J. Immunol.147:410-415(1991)に記載されており、ここに文献として組み込んだ。また、Miller らによる J. EXP. Med.176:1739-1744(1992)に記載されたプロテオリポソーム中へのタンパク質のカプセル充填の文献があり、ここに文献として組み込んだ。さらに、NovasomeTM脂肪小胞(Micro Vesicular Systams, Inc., Nashua,NH)のような脂肪小胞中でのタンパク質のカプセル化もまた使用可能である。
【0143】
本発明の組成物は、非経口投与(すなわち、筋肉内、皮内又は皮下)か、例えば舌経由(すなわち、経口、)胃、口腔内、肛門内、膣内を含む粘膜及びその類似体へのオリフィス投与によって免疫処置するために、単一の剤形中にパッケージしてもよい。また、再び、投与の有効薬量と経路は、その組成物の性質、発現産物の性質、直接ベクターや組換え体を利用する場合はその発現レベル、品種、種類、年齢、体重、状態及び宿主の性質並びにLD50及び公知で過度の実験を要しない他のスクリーニング法などによって決定する。
【0144】
発現産物の薬量は、例えば、5〜500μgのように、微量から数百マイクログラムに及ぶことが可能である。本発明のベクター又は組換え体は、これらの薬量レベルで発現を達成するような適当量で投与することができる。本発明のベクター又は組換え体は、少なくとも約103.5pfuの投与量で、動物へ投与し、感染させ、細胞に形質転換することが可能である。例えば、本発明のベクター又は組換え体は、好ましくは、少なくとも104〜約106pfuで、動物へ投与し、感染させ、細胞に形質転換することが可能である。しかしながら、下記の実施例に示すように、動物は少なくとも約108pfu投与しなければならない。さらに好ましい投与量は、少なくとも約107pfuから約109pfuである。他の適当な担体又は希釈剤には、水、緩衝食塩水を用いることができ、防腐剤を用いても用いなくてもよい。発現産物又はベクター又は組換え体は、投与時に再懸濁するために凍結乾燥してもよく、溶液中に存在させることもできる。
【0145】
担体は、また、ポリマー性遅延遊離系統であってもよい。合成ポリマーは、制御された遊離を有する化合物と剤型において特に有用である。この初期の例としては、いわゆるナノ粒子を形成するために1ミクロン未満の直径を持っている球体へメタクリル酸メチルの重合があり、それは、Kreuterによって、 J., Microcap-sules and Nanoparticles in Madieine and Pharmacology. (M. Donbrow, ed.) CRC Press, p. 125-148に報告されている。
【0146】
制御した遊離を行うために、マイクロカプセル化した薬剤の注射が適用された。マイクロカプセル化のために特別のポリマーの選択に多くの因子が寄与する。ポリマー合成及びマイクロカプセル化工程の再現性、マイクロカプセル化の原料と工程の費用、毒性学の性質、可変解放動力学のための必要条件及びポリマーと抗原の物理化学的な適合性が考慮されるべきすべての因子である。有用なポリマーの実施例は、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタンである。ポリオルトエステルとポリアミドは、特に生物分解性のものである。
【0147】
薬剤と最近の抗原に対する担体の頻繁な選択は、ポリ(d、l−ラクチド-co−グリコライド)(PLGA)である。これは、生物分解性のポリエステルであり、縫合、骨折治療用プレート、他の治療人口器官において医薬用途の長い歴史があり、毒性は示されなかった。ペプチド及び抗原を含む薬剤の幅広い種類は、PLGAマイクロカプセル中に調製した。例えば、Eldridge, J.H.らによるCurrent Topics in Microbiology and Immunology. 1989, 146:59-65にあるように、抗原の制御された遊離に対するPJGAの適応に関して、データ主要部を蓄積した。経口で投与された場合、直径で1〜10ミクロンのPLGA微粒子中の抗原の包括が、注目すべき補助剤効果を持っていることが示された。PLGAマイクロカプセル化工程は、オイルの中の水のエマルジョンの相分離を使用する。水溶液とPLGAで調製した関心のある化合物を、塩化メチレン、酢酸エチルのような適当な有機溶媒に溶解した。これらの混合しない2つの溶液を高速撹拌によって乳化した。その後、ポリマーに対し非溶剤を加え、未成熟のマイクロカプセルを形成するため、水性小滴のまわりにポリマーの析出を生じさせた。マイクロカプセルを収集し、ポリビニルアルコール(PVA)、ゼラチン、アルギナート、ポリビニルピロリドン(pvp)、メチルセルロースの様々な試剤のうち1つで固定させ、溶媒を真空乾燥、溶媒抽出のいずれかで除去した。
その後、固体、液体含有の固体、液体及びゲル(「ゲル・キャップ」を含む)組成物を組成物)固形物含んでいる液体を含む固形物、液体およびゲル(「ゲル・キャップ」を含む)組成物を形成した。さらに、本発明のベクター又は組換え体及びそれらからの発現産物は、動物中で免疫性又は抗体応答を刺激することが可能である。公知の技術によって、それらの抗体からモノクローナル抗体を調節し、それらのモノクローナル抗体が抗原が存在するか否か、それらから抗原の天然の原因因子が存在するか否かを判定する、あるいは、試剤に対する免疫応答が刺激された抗原に対する免疫応答かを判定する、よく知られている結合測定、診断キット又はテストに供することができる。
【0148】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生されたイムノグロブリンである。モノクローン抗体はシングルの抗原決定基抗原決定要素と反応し、従来よりも特異的に大きい血清由来抗体を提供する。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることによって、希望する特異性、結合活性及びアイソタイプを伴う個々の抗体を選択することが可能である。ハイブリドーマ細胞系は、化学上同一の抗体の恒常的で低費用の源を提供し、容易にそのような抗体の調製を標準化することが可能である。モノクローナル抗体を産生する方法は従来技術において通常の技術として十分に知られており、例えば、Koprowski, H. らの1989年4月1日発行の米国特許第4,196,265号があり、ここに文献として組み込んだ。
【0149】
モノクローナル抗体の利用はよく知られている。そのような1つの利用は、診断方法である。例えば、David, G. と Greene, Kの1983年3月8日発行の米国特許第4,376,110があり、ここに文献として組み込んだ。
【0150】
モノクローナル抗体は免疫吸着クロマトグラフィーによって物質を回収するのに用いられてきた。例えば、Milstein, Cによる1980年発行の Scientific American 243:66, 70の文献があり、ここに文献として組み込んだ。
【0151】
更に、本発明のベクター又はそれからの組換え体発現産物は、患者への継続的な自家輸血法のためのin vitro又はex vivoの細胞に応答を刺激することができる。もし、患者が血清陰性であれば、時下輸血法は、例えば能動免疫のような免疫学的な又は抗原応答免疫応答を刺激する。血清陽性の患者においては、自家輸血法は、レンチウイルス、レトロウイルス又は免疫不全ウイルス(例えばFIV)に対する免疫システムを刺激するか増加させる。
【0152】
さらに、本発明のベクターあるいは組換え体はいくつかの有用性を持っている。血清陰性の動物やヒト(ヒトを含む患者に加えて、獣医が動物に対して称する患者を含める)に投与するような抗原組成物、免疫組成物又はワクチン組成物。レンチウイルス、レトロウイルス又はネコ不全ウイルスのような免疫不全ウイルスに対する免疫システムを刺激するか増加させる治療の要求における血清陽性の動物又はヒトへの治療組成物。さらに、in vitroで抗原組成物、免疫組成物、ワクチン組成物又は治療組成物を利用することができる、抗原、免疫原、対象とするエピトープを産生する。さらに利用することができる、直接投与によるか本発明のベクター又は組換え体の発現産物の投与による抗体の産生。血清のような試料中に抗原又はエピト−プが存在するか否を確認するための診断、テスト又はキット。例えば、血清のような試料中の、レンチウイルス、レトロウイルス、又はネコ免疫不全ウイルスのような免疫不全ウイルスの存在有無の確認。あるいは、レンチウイルス、レトロウイルス、又はネコ免疫不全ウイルスのような免疫不全ウイルスに対し免疫応答が誘発されたかどうかを検出するための、あるいは特定の抗原又はエピトープのための診断、テスト又はキット。あるいは、クムノクロマトグラフィー。ハイブリダイゼーションプローブとして利用するためのDNAの産生又はPCRプライマーの調製又はDNA免疫処置。そして、本発明のベクター又は組換え体、それらからの発現産物、免疫原、抗原あるいは本発明のベクター又は組換え体からのエピトープは、刺激された命令を引き起こすために用いることができ、それは、さらに、免疫応答(抗原応答又は免疫学的応答あるいは活動免疫)を刺激するか、免疫系(例えば、免疫無防備状態又血清陽性の動物又はヒトの免疫系)を刺激するか増加させるために用いることが可能である。他の有用性は、また本発明の実施例において説明する。
【0153】
本発明についてのさらなる理解と多くの有用性が、下記の実施例によって実例を通じて得られるであろう。
【0154】
【実施例】
(実施例)
DNAのクローニングおよび合成
プラスミドは標準的手法により構築してスクリーニングし、育成した(Maniatis et al.,1982;Perkus et al.,1995;Piccini et al.,1987)。制限エンドヌクレアーゼは、ベセスダ・リサーチラボラトリー(Bethesada Research Laboratory,Gaithersburg,MD,New England Biolabs,Beverly,MA)およびベーリンガー・マンハイムバイオケミカルズ(Boehringer mannheim Biochemicals,Indianapolis,IN.)より入手した。E.coliポリメラーゼのKlenow fragmentは、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社(Boehringer Mannheim Biochemicals)より入手した。BAL-81エキソヌクレアーゼおよびファージT4DNAリガーゼは、New England Biolabsより入手した。使用した試薬は多様な提供者から得たものをspecifiedした。
【0155】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述(Perkus et al.,1989)のようにBiosearch 8750またはアプライド・バイオシステムズ社製(Applied Biosystems )380B DNAシンセイサイザにより調製した。DNAの塩基配列決定は、後述(Guo et al.,1989)のように、シーケナーゼ(Tabor et al.,1987)を使用してジデオキシ鎖ターミネーション法(Sanger et al.,1977)により実施した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による塩基配列補正(Engelke et al.,1988)を使ったDNAの増幅は、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびGene Amp DNA増幅試薬キット(パーキン・エルマー・シータス社(Perkin elmer Cetus,norwalk,CT)を自動化パーキン・エルマー・シータスDNAサーマルサイクラー(Automated Perkin Elmer Cetus,Norwak,CT))に入れて使用した。過剰のDNA配列は、制限エンドヌクレアーゼ消化法によりプラスミドから消化し、続いてBAL−31エキソヌクレアーゼによる限定消化法にて消化し、合成オリゴヌクレオチドにより突然変異生成(Mandecki,1986)を起こした。
【0156】
細胞、ウイルスおよび形質転換
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株の起源および培養条件は前述のとおり(Guo et al.,1989)とした。組み換えによる組み換えウイルスの発生、ニトロセルロースフィルターを使用したin situハイブリダイゼーションおよびBーガラクトシダーゼ活性を指標とするスクリーニングは前述のとおり(Piccini et al.,1987)である。
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株、NYVACおよびALVACの起源および培養条件は前述のとおり(Guo et al.,1989;Tartaglia et al.,1992;米国特許第5,364,773号および第5,494,887号)である。組み換えによる組み換えウイルスの発生、ニトロセルロースフィルターを使用したin situハイブリダイゼーションおよびBーガラクトシダーゼ活性を指標とするスクリーニングは前述のとおり(Panicali et al.,1982,Perkus et al.,1989)である。
【0157】
親株のカナリポックスウイルス(Rentschler株)は、カナリアのワクチニアル株である。ALVACワクチン株は、前述のように、ニワトリ胎児線維芽細胞を連続200回経代して単離し弱毒化した野生株から得た、マスターのウイルス播種は、寒天上で4回連続してプラーク精製にかけ、1つのプラーククローンを保存用ウイルスを親ウイルスとしてin vitro組み換え試験にてさらに5回経代して増幅させた。プラーク精製によるカナリポックス単離体をALVACと命名した。
【0158】
FP−1と命名したファウポックスウイルス(FPV)株は前述のとおり(Taylor et al.,1988a)である。これは、1日齢のニワトリにおいてワクチン接種をする場合に有用なアテニュエートされたワクチン株である。親ウイルス株であるDuvetteは、ニワトリからFowlpox scabとしてフランスより入手した。このウイルスは連続約50回の経代に続き、ニワトリ胎児線維芽細胞を25回経代してアテニュエートした。このウイルスを連続4回プラーク精製にかけた。1個のプラーク単離体をさらに初代CEF細胞内で増幅させ、保存用ウイルス(TROVAC)と命名し確立した。
【0159】
NYVAC、ALVACおよびTROVACウイルスベクターとその単離体を、前述のように(Piccini et al.,1987;Tailor et al.,1988a,b,米国特許第5,364,773号および第5,494,807号)にて増殖させた。Vero細胞およびニワトリ胎児線維芽細胞(CEF)を前述のように(Taylor et al.,1988a,b)増殖させた。
【0160】
実施例1−ALVAC−FIV(env)の構築
プラスミドptg6184中にコードされた配列であるネコ免疫不全ウイルス(FIV)envと、FIVヌクレオチド配列をRhens Mericux(Lyen,France)から入手した。このcDNAクローンをFIVのVillefranche株から誘導した。FIVenvヌクレオチド配列を図2(配列番号1)に示す。
【0161】
FIVenvコード配列を、初期/後期ワクシニアウイルスH6プロモーター(Perkus et al.,1989)の管理下においた。FIVenvコード配列は、未成熟の初期転写終了用に提供される2つのT5NT配列にモチーフを含有する(Yuen and Moss,1987)。T5NT配列は、予想されるアミノ酸コード配列を変化させることなくPCR誘導画分と置き換わることにより改変される。図2の2059と2065の間の位置にあるTTTTTATは、TTCTTATに変化し、2110と2116の間に位置するTTTTTCTは、TTCTTCTに変化する。
【0162】
重複する2つのPCR画分は、ptg6184テンプレートより誘導され、T5NT配列の変化した画分が得られる。585bpのPCR画分は、オリゴヌクレオチドプライマーMM040(配列番号5)(5’−AAATTCTTATATACAGCTTTCGCTATGCAAGAATTA−GGATGAATCAAAATCAATTCTTCT GCAAAATCCCTCCTGGGT−3’)と、MM042(配列番号10)(5’−CCCATGGAGTGCGGCTAC−3’)を使って発生させた。3’側が大半を占める配列から得たMM042は、5’側がほとんどを占める配列に向かう。MM041(配列番号11)を伴う2番目のPCRは、(5’−GCAGAAGAATTGATTTTGATTACATCCTAATTCTT−3’)とMM043(配列番号12)(5’−AAGTTCTGGCAACCCATC−3’)は、187bp画分を発生させた。MM041は2118の位置に始まり、envの5’側が大半を占める配列方向へ向かい、MM043は、1931の位置(図2)から続くenvコード配列の3’側が大半を占める配列へ向かう。二つのPCR生成物をプールし、MM043とMM042とでプライムさせ、図2の2020のFIVコード配列位置でScaIにて消化し、envコード配列の3’部分をEcoRIで消化した。こうしてできた564bpのScaI−EcoRI−PCR画分は、T5NTモチーフの変化したFIVenvコード配列を含む。
【0163】
プラスミドptg6184をEcoRIで消化し、部分的にScaIで消化した。この、ScaI消化した(図2の2020の位置)5’−FIVenvからenvコード配列のEcoRI−3’までを含む ptg6184由来画分を、564bpのScaI−EcoRIによるPCR誘導画分(前述)に結合させた。こうしてできたプラスミドpMN120は、T5NTモチーフの変化したFIVenvを含む。このヌクレオチド配列を、標準的手順(Goebel et al.,1990a)にて確認した。FIVenvコード配列を含む2.6kbpのpMN120 PstI−EcoRI画分を、pBS−SK(Stratagene,La Jolla,california)PstIとEcoRI部位に挿入してpMM122を発生させた。
【0164】
改変した初期/後期ワクシニアウイルスH6プロモーター(Perkus et al.,1989)を、H6転写開始コドンとFIVenv転写開始コドンの重複したpMM122に添加した。H6をプロモートしたほぼ5’−側の配列からなるenvコード配列を、プライマーMM037(配列番号13)(5’−ATCATCCTGCAGAAGCTTCCCGGGTTCTTTATTCTATACTT−3’)、MM038(配列番号14)(5’−CTGCAAATCCTTCTGCCATTACGATACAAACTTAAC−3’)、MM065(配列番号15)(5’−CGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCAGAAGGATTTGCAGCC−3’)、およびMM036(配列番号16)(5’−CCTCTTGAATTTCGTTCC−3’)を使って発生させた。pMM108は、H6プロモーター配列を含み、MM037およびMM038のテンプレートとなり、H6プロモーターと5’−側のほとんどからなるFIVenvコード配列を含む166bpの画分を創出した。pMM122は、MM065とMM0036のテンプレートとなり、3’−H6プロモーターおよび5’−env末端部を伴う235bpの画分を創出した。二つのPCR生成物をプールし、MM036とMM037でプライムし、こうしてできた画分すなわちFIVenvコード配列の5’側の大半から成るbpに融合したH6プロモーターを、PstIおよびKpnIで消化して266bpの画分を創出した。pMM122をPstIで消化し、部分的にKpnIで消化してFIVenvコード領域の5’側の大半からなる配列を消化し、前述のPstI−KpnIによるPCR由来画分を挿入した。こうしてできたプラスミドpMM125は、pBS−SK(Stratagene,La,Jolla,California)のワクシニアH6プロモーター の3’側に近接してFIVenvを含む。
【0165】
pMM125の配列解析により、H6プロモートFIVenv5’−側を大半とする配列が正しくPCRによって構築されたことが示されたが、PCR挿入部の3’側にフレームシフト突然変異が認められた。このフレームシフトはpMM122には認められなかった。pMM125のクローンはすべてフレームシフトを含んでいた。これらフレームシフトは、おそらく最近記述されたコピー数の多いプラスミド(Wamg and Mullins,1995)中にenv配列が組み込まれたことによる。別個のpMM125クローンは、異なるフレームシフトを有する。フレームシフトをもたないH6プロモートFIVenvを、次の方法により構築した。
【0166】
簡単にいえば、これは、フレームシフトを有しないH6プロモートFIVenvについての詳細な記述を要約したものである。フレームシフトを有しないFIVenvコード配列の、H6プロモート5’側を大半とするpMM125の1個のクローン由来の配列を、別のpMM125クローンから得た3’側を大半とするFIVenv末端部のフレームシフトしていない残りのbpに結合させた。最初の画分は、H6プロモータの5’側のSmaI部位からFIVenvコード配列のAflII部位までとした(図2の1707の位置)。2番目の画分は、同一のAflII部位からenvコード配列の3’側のSmaI部位であった。結合による生成物をSmaIで消化し、3つの画分を遊離させた。一方の画分は、2つの5’側を大半とする配列を含み、他方の画分は、2つの3’側を大半とする配列を含んでいた。FIVenv発現カセットを含む3つ目のSmaI消化画分を単離して、H6プロモートベクターに挿入し、pRW945を作った。フレームシフトの可能性を排除するために、pRW945はバクテリア内で増幅させなかった。pRW945の構築については後で詳しく記す。
【0167】
1個のpMM125クローンpMM125#11は、H6プロモーターのSmaIの5’側からAflII部位を、1707の位置において正しい配列を有していた。別のpMM125クローンであるpMM125#10は、1707の位置におけるAflII部位からenvコード配列のSmaI3’までの正しい配列を含んでいた。H6プロモート5’側を大半とするenv配列を含む1.8kbpのpMM125#11のSmaI−AlfII画分を、0.9kbpのpMM125#10のSmaI−部分的AflII画分に結合した。結合によってできた生成物を、SmaIで消化し、2.7kbpの画分を、C6ベクターpMM117に挿入し、pRW945を得た。
【0168】
C6挿入プラスミドpMM117を以下の方法で構築した。3kbpのALVAC・HindIIIクローンの塩基配列を決定し、オープン読取りフレームを定義した。オープン読取りフレームと、DNA挿入における制限部位とを置き換えるため、PCR由来画分を使用した。PCR由来画分は、プライマC6A1(配列番号17)(5’−ATCATGGAGCTVVCVVCCVCCTATVAAAAGTCTTAATGAGTT−3’)、C6B1(配列番号18)(5’−GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA−3’)、C6C1(配列番号19)(5’−CCCGGGCTGCAGCTCGAGGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGA AAAGTAA−3’)、およびC6D1(配列番号20)(5’−GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG−3’)を使用して作った。オリゴヌクレオチドC6A1とC6B1を使ったPCRのテンプレートにはALVACを使用し、380bpの画分を得た。2回目のPCR反応では、ALVACテンプレートと、プライマーC6C1およびC6D1を使用し、1155bpの画分を得た。このPCR反応生成物をプールし、最終PCRとしてプライマーC6A1、C6D1にプライムし、1613bpの画分を得た。最終PCR生成物をSacIとKpnIで消化し、pBS−SKのSacIとKpnI部位の間に挿入した(Stratagene,La Jolla、California)。こうして生成したC6挿入プラスミドを、pC6Lと命名した。このC6挿入プラスミドpMM117を、pC6L(図5、配列番号3)のSmaI、EcoRI部位の間の配列GGGGGATCCTTAATTAATTAGTTATTAGACAAGGTGAAAACGAAACTATTTGTAGCTTAATTAATTAGCTGCAGGAATTC(配列番号21)を添加することにより構築した。
【0169】
前述のプラスミドpRW945は、C6挿入プラスミドにおいてT5NTモチーフの変化したH6プロモートFIVenvコード配列を含む。pRW945を使用して、ウイルスのレスキュー用にALVACを使い、in vitroの組み換え実験を実施し、組み換え体VCR242を誘導した。図6は、VCP242(配列番号4)に挿入された予想されるヌクレオチド配列を示す。
【0170】
実施例2−FIVgagおよびproを発現する組み換えALVACの構築
プラスミドptg8133中のネコ免疫不全ウイルス(FIV)gagおよびpolコード配列と、プラスミドptg6184内のFIVenvコード配列を、Rhone Merieux(Lyon,France)より入手した。このcDNAクローンは、FIVのVillafranche株に由来した。図3および図4(配列番号2)は、Rhone Merieuxから入手したFIVgagおよびpolコード配列に相当するヌクレオチド配列を含む。
【0171】
コア抗原をコードするFIVgag配列、そしてプロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼをコードするpol配列を、初期/中期ワクシニアI3Lプロモータ(Schmitt,J and Stunnenberg,H,1988;Vos,J and Stunneuberg H.,1988)の管理下においた。I3Lプロモーターは、Goebel et al.,1990a,bでは、65073から64971の位置に相当する。単一転写ユニット中で、gagおよびpolコード配列を合成した。gagとpolオープン読取りフレーム(ORFS)はたがいに異なり、polORFの翻訳は、通常、FIV感染細胞中で行われるように、リボゾーム・フレームシフトメカニズム(Morikawa and Bishop,1992)を介在して起こる。
【0172】
PCR由来画分を使用し、I3LプロモートFIVgag/polカセットを構築した。PCR由来画分はまた、未成熟の初期転写終了を提供するT5NT配列モチーフを変化させる目的でも使用した(Yuen and Meas,1987)。467から473(図3および図4)の間に位置するTTTTTATは、予想されるアミノ酸コード配列を変化させなくても、TTTTCATに変化した。以下の方法により、I3LプロモートFIVgag/pol発現の構築をマニピュレートした。
【0173】
FIVgag/polコード配列を含むptg8133をテンプレートに使い、プライマーとしてMM027(配列番号22)(5’−CAAAATGGTGTCCATTTTCATGGAAAAGGCAAGAGAAGGAC−3’)とMM028(配列番号23)(5’−CTGCTGCAGTAAAATAGG−3’)を使って、PCRを実施し、245bpの画分を作成した。MM027は、452の位置(図3および図4)からプライムし、T5NT配列モチーフにヌクレオチドの変化を含んでいる3’側を大半とする配列へ向かった。MM028は、HindIIIより下流の697の位置からプライムし、gagの5’側を大半とする配列に向かった。245bpのPCR由来画分は、452の位置から、変化の生じたT5NTモチーフの存在する697の位置にあるFIVgagコード配列を含む。
【0174】
2回目のPCRでは、ptg8133をテンプレートとし、MM029(配列番号24)(5’−CTTCTCTTGCCTTTTCCATGAAAATGGACACCATTTTTGGGTC−3’)とMM030(配列番号25)(5’−CAATTATTTAGGTTTAATCATGGGGAATGGACAGGGGC−3’)をプライマーに使用して、508bpの画分を作成した。MM029は490の位置(図3および図4)からプライムして、gagコード配列の5’側を大半とする配列に向かい、T5NT配列モチーフを変化させる。MM030はI3Lプロモーターの3’側配列をほとんど含み、gag開始コドンからプライムして、gagコード配列の3’側を大半とする配列に向かう。508bpのPCR由来画分は、I3Lプロモーターの3’側の大半と、490の位置まで続くT5NTモチーフが変化したFIVgagコード配列とを含む。
【0175】
I3Lプロモーター配列を含むプラスミドテンプレートpMM100を、MM031(配列番号26)(5’−CGCCCCTGTCCATTCCCCATGATTAAACCTAAATAATTGTAC−3’)とMM032(配列番号27)(5’−CGCCCCTGTCCATTCCCCATGATTAAACCTAAATAATTGTAC−3’)とをプライマーとして137bpのPCR由来画分を作成した。このMM031は、5’側を大半とし、続いてI3Lプロモーターの3’側を大半とする配列からプライムして、I3Lプロモーターの5’側を大半とする配列へ続くbpを含む。MM032はSalIおよびClaI部位を有し、I3Lプロモーター5’側を大半とする配列がこれに続き、3’側を大半とする配列に続く。137bpのPCR由来画分は、I3LプロモートFIVgagの5’側を大半とする画分を含む。
【0176】
3つのPCR画分をプールし、MM032とMM028とをプライマーとしてプライムした。こうしてできた814bpの画分を、HindIIIとSalIで消化し、I3LプロモーターFIVgagの5’側を大半とする配列にT5NTモチーフが付加した配列を含む726bpの画分を作成した。
【0177】
ptg8133をSacIとSalIで消化し、7.2kbpのプラスミド配列を除去して、4.7bpの画分を単離し、HindIIIで部分的に消化した。FIVgagコード配列を615の位置からFIVpolコード配列まで含む、4kbpのptg8133SacI−HindIII部分消化生成物を単離した。
【0178】
SacI−SalI消化したpBS−SK(Stratagene,La Jolla,California)を、726bpのHindIII−SalIによるPCR由来画分(前述)と、4kbpのptg8133・SacI−HindIII画分と共に結合する。こうしてできたプラスミドpMM116は、pBS−SK中において、I3LプロモートFIVgag/pol発現カセットを含む。
【0179】
I3LプロモーターFIVgag/polコード配列を含む4.7kbpのpMM116・Asp718−Ecl136II画分を、 20mMのdNTPs存在下でKlwnow処理し、SmaI消化したpMM117に挿入して、pMM121を作成した。pMM117は前述したC6挿入プラスミドである。
【0180】
I3LプロモーターFIVgag/pol・5’側を大半とする領域を含む1.4kbpのpMM121・EcoRI画分を、pBS−SK(Stratagene,La Jolla,California)のEcoRI部位に挿入して、pMM123を得た。PCR由来画分を使い、polのカルボキシル末端に相当する部分を除去して、gag−プロテアーゼ発現のみを起こすようにした。PCR由来画分は終末コドンを誘導し、続いて1709の位置において(図3および図4)プロテアーゼコード配列を誘導した。I3LプロモーターFIVgagおよびプロテアーゼコード配列を構築するマニピュレートを、以下の方法で構築した。
【0181】
I3LプロモーターFIVgag/polコード配列を含有するテンプレートpMM121を、MM063(配列番号28)(5’−CAGGACATCTAGCAAGAC−3’)と、MM064(配列番号29)(5’−GATGATCCCGGGATAAAAATTATTGAGCCATTACTAACCT−3’)とをプライマーとしてプライムし、580bpのPCR由来画分を作成した。MM063は1148の位置(図3および図4)からプライムして、3’側を大半とする配列へ向かった。MM064は、1709の位置からプライムして、5’側を大半とする配列へ向かった。FIVプロテアーゼコード配列および1709の位置(図3および図4)に停止コドンを含む580bpのPCR由来画分を、EcoRIとSmaIで消化して、475bpの画分を得た。
【0182】
pMM123をFIV挿入部位のSmaI3’部位において直線状にし、続いてEcoRIで部分的に消化した。475bpのSmaI−EcoRI・PCR由来画分(前述)をpMM123・SmaI−EcoRI部分消化生成物に挿入し、EcoRI部位を図3および図4における1246の位置で消化した。こうして得られたプラスミドpMM127はFIVgagおよびプロテアーゼコード配列を含み、続いて停止コドンをpBS−SK(Stratagene,La Jolla,California)に含む。pMM127におけるPCR由来画分のヌクレオチド配列を、標準的手順(Goebel et al.,1990a)にて確認した。FIVプロテアーゼコード配列の3’側における1bpのみの消化が観察された。MM064を、FIVプロテアーゼ停止コドンの後にTTTTTATを添加するよう設計した。 停止コドンの後ろにあるTTTTTAT配列のTは、pMM127から1個喪失し、その結果として配列TTTTATとなった。
【0183】
I3LプロモーターFIVgagおよびプロテアーゼコード配列を含む1.8kbpのpMM127・BamHI−SmaI画分を、部分的に消化したpMM117のSmaI−BamHI部位に挿入した。C6挿入プラスミドpMM117は前述のとおりである。BamHIによる部分的消化は、pMM117中のSmaI部位に隣接するBamHI部位を消化する目的で行った。結果として生じたI3LプロモーターFIVgagおよびプロテアーゼコード配列をC6挿入部位に含むプラスミドを、pMM129と命名さいた。プラスミドpMM129は、ALVACをレスキューウイルスとして使用するin vitroの組み換え実験に使用し、組み換え体VCP253を誘導した。図7(配列番号5)は、VCP253におけるI3LプロモーターFIVgag/プロテアーゼ発現カセットについて予想されるヌクレオチド配列と、フランク領域を示す。
【0184】
実施例3−FIVのenv、gagおよびproを発現する組み換えALVACの構築
フレームシフト突然変異を起こしているH6プロモーターFIVenvのプラスミドpMM125は前述のとおりである。FIVenvコード配列にフレームシフトを含む計画的挿入を行った結果、バクテリア内部においてH6プロモーターFIVenv構築物の残留部分を安定して維持できるようになった。バクテリアにおける増幅後、挿入部を除去した。H6プロモーターFIVenvコード配列を構築するマニピュレーションを、計画的フレームシフト挿入により以下の方法で実施した。
【0185】
pMM125#11(前述)を、フレームシフトを自発的に修復したPCR由来画分を挿入することによって修飾し、BstEII部位によりフランクにした計画的フレームシフトを誘導した。BstEII挿入部は1920の位置(図2)にある。この挿入により、停止コドンが誘導され、続いてフレームシフト、NotIおよびHindIII部位が誘導される。pMM125にはBstEII部位が一つもない。PCR由来画分はまた、図2における1920の位置で、AをCに変化させる。AからCへの変化は、予想されるアミノ酸コード配列を変化させないが、この変化はBstEII部位を誘導する。pMM125#10は1604の位置(図2)に自発的フレームシフトを有する。pMM125#10をPCRのテンプレートに使い、オリゴヌクレオチドプライマーRW542(配列番号30)(5’−GTAGCATAAGGTTACCGCGGCCGCTAAGCTTAGGTTACCATCCCTATAGCAGTA−3’)を使って、BstEII挿入部を含む326bpの画分を作成した。RW542は1632の位置からプライムしてFIVenvの3’側を大半とする配列へ向かい、RW545は1919の位置からプライムしてFIVenv5’側を大半とする配列へ向かった(図2)。pMM125#10をPCRのテンプレートに使い、RW544(配列番号32)(5’−GTAGCATAAGGTAACCTAAGCTTAGCGGCCGCGGTAACCCAATACCACCAAGTTCTGGC−3’)とT3(配列番号33)(5’−ATTAACCCTCACTAAAG−3’)をプライマーに使用して、BstEII挿入部とFIVenvコード配列の3’側の大半を含む配列を含む791bpの画分を作成した。RW544は1914の位置からプライムしてenvの3’側を大半とする配列に向かう。T3はpBS−SKプラスミドにおいて、FIVenv停止コドンの下流からプライムし、FIVenvの5’側を大半とする配列に向かう。2つのPCR生成物をプールし、RW542とT3でプライムして、結果として生じた1.1kbpの生成物をEcoRIで消化し、部分的にAflIIで消化して、次のpMM125#11ベクターへ挿入する876bpの画分を作成した。PCR由来画分とpMM125#11ベクターを、AflIIによって1907の位置(図2)で消化した。pMM125#11をEcoRIとEcoRIとで消化して、FIVenvコード配列の3’側を大半とする、自発的フレームシフトを含んだ配列を除去した。このEcoRI−AflII・PCR由来画分である376bpの画分を、pMM125#11・EcoRI−AflIIベクターに挿入した。結果として生じたプラスミドpMM134は、pBS−SK(Staratagene,La Jolla,California)中においてH6プロモーターの3’に近接するFIVenvコード配列を含む。pMM134はまた、二つのBstEII部位化に挿入した計画的フレームシフト突然変異を含む。pMM134におけるH6プロモーターFIVenv配列全体は、BstEII挿入部を含むことが確認された。期待されたとおり、BstEII挿入により、H6プロモーターFIVenv構築物の残留物が安定して維持できることがわかった。
【0186】
pMM134からH6プロモーターFIVenvコード配列をポックスウイルス挿入プラスミドへクローンしたあと、BstEII挿入部を除去して、FIVenvコード配列全長が発現できるようにすること。BstEII挿入部をBstEII消化により除去し、続いて分子内結合を促進するべく希釈結合反応を行う。分子内結合生成物は、BstEII挿入を実施しなくても、H6プロモーターFIVenvを含むことになる。BstEII挿入部を除去したあと、H6プロモーターFIVenvコード配列はバクテリア内で安定して維持されるとは予測されず、このプラスミドがバクテリア内で増幅されなかった。結合後、このプラスミドをNotIで消化した。BstEII挿入部を含む結合生成物を、BstEII挿入部において、NotI部位において消化されたと考えられる。BstEII挿入部内でのNotI消化によって、プラスミドが生きたままの組み換えポックスウイルスを発生させる能力が予防されると考えられれる。BstEII挿入部のないFIVenvの全長が、NotI消化によって増えるとは考えられず、FIVenvコード配列は影響を受けないまま残ると考えられる。
【0187】
実施例4−I3LプロモーターFIVgagおよびプロテアーゼコード配列を伴うC6におけるH6プロモーターFIVenvコード配列の構築
BstEII挿入部を伴ったH6プロモーターFIVenvコード配列を含むpMM134は前述のとおりであった。BstEIIを伴うpMM134由来の、2.7kbpのH6プロモーターFIVenvコード配列を有するSmaI画分を、次のpMM129挿入プラスミドへクローン化した。
【0188】
C6にI3LプロモーターFIVgagおよびプロテアーゼコード配列を有するpMM129は前述のとおりであった。pMM129における、I3LプロモーターのSalI5’部位を、30mMのdNTPs存在下でKlenow処理によりブラント化した末端部とした。H6プロモーターFIVenvコード配列を含み、BstEII挿入部を伴う 2.7kbpのpMM134SmaI画分を、pMM129のブラント末端化したSalI部位に挿入した。H6プロモーターFIVenvコード配列は、pMM138において、I3LプロモーターFIVgagおよびプロテアーゼコード配列の5’側に位置する。FIVコード配列は、同じ方向へ転写される。
【0189】
pMM138における2つのBstEII部位は、フレームシフト部分を含む挿入部を取り囲んでいる。pMM138をBstEIIで消化して、挿入部を除去し、続いて結合させた。こうしてできたプラスミドpMM146をバクテリア内で増幅させなかった。pMM146をin vitro組み換え試験実施前に、NotIで消化するよう設計した。NotI消化には2つの目的があった。一つ目は、BstEII挿入部を含まないようにしたいあらゆるプラスミドを、挿入部においてNotIで消化し、ドナープラスミドを排除して生きたままのALVAC組み換え体を得ることであった。2つ目は、NotIがpBS−SKバックボーンにおいてpMM146を直線化し、所望するALVACを効率よく得ることであった。ALVACをレスキューウイルスとして使用するin vitroでの組み換え試験実施前に、pMM146をNotIで消化して、組み換え体VCP255を誘導した。図8および図9(配列番号6)は、VCP255におけるH6プロモーターFIVenv/I3LプロモーターFIVgag/プロテアーゼ発現カセットと、フランク領域を示す。
【0190】
実施例5−FIV 97TM、gag、およびproを発現する組み換え体ALVACの構築
FIVエンベロープグリコプロテインは断裂生成物gp97とgp40から構成される。FIVenvコード配列を、gp40とFIVenvコード配列から得た膜透過アンカードメインと交換することによって、続くFIV 97TMの構築において修飾した。gp97を含有するFIV 97TMを、以下の方法で構築した。
【0191】
PCR由来画分PCR−FTV1(242bp)を、pMM125#10(前述のFIVenvに、AflII部位から3’側の大半からなる配列までの正確な配列を含む)をテンプレートとして使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドMW196(配列番号34)(5’−ACTTGCCATCGTCATGGGGG−3’)と、MW195A(配列番号35)(5’−GATACFTCCCAATAGTCCCCTTTTCCTTCTAGGTTTATATTC−3’)を使用して合成した。PCR由来画分PCR−FIV2(193bp)は、pMM125#10をテンプレートとして使い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドMW294A(配列番号36)(5’−GAATATAAACCTAGAAGGAAAAGGGACTATTGGGAGGTATC−3’)とMW197(配列番号37)(5’−ATCATGGAATTCATAAAAATCATTCTTCTCCTTCTACTTC−3’)を使用して合成した。PCR−FIV3(393bp)は、 PCR由来画分PCR−FTV1とPCR−FIV2をテンプレートとし、オリゴヌクレオチドMW196MW197をプライマーとして合成した。PCR−FIV3のAflII/EcoRIによる完全な消化を実施し、284bpの画分を単離した。この画分を、pMM125#11(前述のFIVenvと、5’側を大半とする配列から前述のEcoRI部位までを含む正確な配列を含む)の4.8kbpからなるAflII/EcoRI画分に結合させた。こうして得られたプラスミドpMAW103は、H6プロモーターFIV 97TMを含む。
【0192】
PstI部位をH6プロモーターの上流へ、以下の方法により添加した。PCR由来画分PCR−FIV4(359bp)を、pMAW103をテンプレートにし、オリゴヌクレオチドMW209(配列番号38)(5’−ATCATCAAGCTTCTGCAGTTCTTTATTCTATACTTA−3’)とMM036(配列番号16)(5’−CCTCTTGAATTTCGTTCC−3’)をプライマーとして合成した。PCR−FIV4のHindIII/NruIによる完全消化を実施し、110bpの画分をpMAW103の5.0kbpからなるHindIII/NruI画分に挿入し、プラスミドpMAW103Aを得た。この2126bpからなるpMAW103の、H6プロモーターFIV 97TMを含むPstI画分を、pMW117(前述)のPstI部位へ挿入し、プラスミドpMAW104を得た。
【0193】
2852bpからなるpMAW104をBamHIで部分的に消化して得た、H6プロモーターFIV 97TM含有の生成物を、BamHI消化したpMW129(I3LプロモーターFIVgagおよびproが前述のようにC6に含まれる)に挿入した。こうして得られたプラスミドpMAW105は、C6においてH6プロモーターFIV 97TMおよびI3LプロモーターFIVgagおよびproを含む。プラスミドpMAW105を使用して、ALVACをレスキュー用ウイルスとして使用するin vitroでの組み換え実験において、組み換え体VCP329を誘導した。図10および図11(配列番号7)は、VCP329を作成する上で予測されるヌクレオチド配列を示す。
【0194】
実施例6 ALVAC FIV 組換体発現分析
ALVAC組換体であるvCP242、vCP253、vCP255やvCP329にコードされた適当なFIV−特異的遺伝子産物の発現を各種の分析より示した。発現解析は、FIV血清陽性のネコより得た適当なモノクローナル抗体または血清を用いて行った。これら抗体、血清のALVAC−FIV−感染した細胞中の発現を確認する上での性能は同等であった。従って、特に記載されていない限り、血清陽性の個体よりモノクローナル抗体を得て、これを利用して発現を確認した。
【0195】
VCP242 FIV Envの発現はELISA(後述)により確認した。FIV Env特異モノクローナル抗体(Rhone−Merieux,Lyon,France)を用いたFACSによる免疫蛍光アッセーではVCP242は表面に発現していた。FIVに感染したネコから得たポリクローナル血清と2種類のモノクローナル抗体(後述)を用いた免疫沈降では、VCP242は沈降反応陽性であった。即ち、特別な実験なしに発現確認のためのモノクローナル抗体を血清陽性の個体から得ることができる。
【0196】
FACSによりVCP253ではGagは内部発現していることが確認された。VCP253は成熟型Gag p24の発現を調べる免疫沈降試験で陽性であった。主要なGag前駆体は37kDaの大きさを示す位置に検出された;Gagの開裂産物を示す別のシグナルが49kDa、40kDaと32kDaの位置に確認された。
【0197】
Env特異モノクローナル抗体(後述)を用いたFACSでは、EnvはVCP255の表面に発現していた。Gag特異抗体を用いたFACSではVCP255ではGagは内部で発現していことが示された。VCP255を各遺伝子産物に対するモノクローナル抗体で免疫沈降させて調べた;Gagはおよそ49kDa、40kDa、37kDaと24kDaの位置にシグナルを持っていた;FIV Envの発現体は130kDaと90kDaの位置にシグナルを持っていた。
【0198】
VCP329による97TMとgagの発現はFIVに感染したネコより集めたプール血清を用いた免疫沈降法により検出した。
【0199】
FACS分析:VCP255はC6座の中にネコ免疫不全ウイルス(FIV)のenv、gagならびにプロテアーゼをコードしている配列を含んでいる。pMM146をALVACを用いたin vitroでの組換体発現実験にレスキューウイルスとして利用し、組換体VCP255を誘導した。VCP255 FIV−特異遺伝子産物の発現は蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いて調べた。VCP255感染細胞の表面上のFIVのEnv蛋白質産物を測定した。内部での発現解析のためにFIV p24を測定した。FACS解析に用いた抗血清は次の通りである。
【0200】
1)モノクローナル抗−FIA env:Rohne Merieuxより得た128F10 EP110592(1:200希釈)
2)モノクローナル抗−FIA p24:Rohne Merieuxより得たプール125A3、314B5 EP072092(1:100希釈)
3)モノクローナル抗−狂犬病G:C,Trimarchi、GriffinLaboratories、New York State Health Departmentより得た24−3F−10 021387(1:200希釈)
4)Boerhinger Mannheimより得たイソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)が結合したポリクローナルヤギ抗−マウスIgG、カタログ番号605340、ロット番号24064(1:100希釈)
細胞表面での発現に関するFACS分析 :10%のウシ胎児血清、20mMグルタミンと0.5%ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた最低必須培地(S−MEM:Gibco#380−2380AJ)の中で1×107のHeLa−S3細胞(ATCC #CCL2.2)に5×107FFUのVCP255を感染させた。細胞を10mlのS−MEMで洗浄した。洗浄後、細胞をBeckman GPKR遠心分離装置で1000RPM、5分間遠心して沈殿した。感染細胞の沈殿を1mlのS−MEMに再懸濁し、5mlのサーシュタット(Sarstadt)チューブに移し、37℃で一晩ゆっくりと回転した。
【0201】
一晩反応させた後、この感染細胞の一部100μlを5mlのポリプロピレンチューブに移した。この細胞を3mlの0.2%のNaN3と0.2%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS−CMF(137mM、NaCl、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、8mM Na2PO4;pH7.4)で洗浄した。細胞を沈殿させ、上清を捨てた。次の様にして特異抗体を第一のチューブに、そして非特異抗体(抗狂犬病G)を第二のチューブに加えた。
【0202】
0.2%NaN3と0.2%のBSAを加えたPBS−CMFで希釈された抗体(事前にHeLa細胞で前吸収した)100μlを各沈殿細胞に加え、4℃で30分間反応させる。細胞を3mlの0.2%NaN3と0.2%のBSAを含むPBS−CMFで2回洗浄し、沈殿させた。0.2%NaN3と0.2%のBSAを含むPBS−CMFで1:50に希釈したFITC結合二次抗体(事前にHeLa細胞で前吸収した)100μlを加え、暗所4℃で30分間反応させた。細胞を3mlの0.2%NaN3と0.2%のBSAを含むPBS−CMFで2回洗浄し、沈殿させた。沈殿した細胞を0.2%NaN3と0.2%のBSAを含む1mlのPBS−CMFに再懸濁し、5mlのポリスチレンチューブに移してからFACSにかけて測定した。
【0203】
内部発現に関するFACSCAN分析 :10%のウシ胎児血清、20mMグルタミンと0.5%ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた最低必須培地(S−MEM:Gibco#380−2380AJ)の中で1×107のHeLa−S3細胞(ATCC #CCL2.2)に5×107PFUのVCP255を感染させた。感染した細胞は37℃で30分間時々混合を加え、反応させた。細胞を10mlのS−MEMで洗浄した。洗浄後、細胞をBeckman GPKR遠心分離装置で1000RPM、5分間遠心して沈殿させた。感染細胞の沈殿を1mlのS−MEMに再懸濁し、5mlのサーシュタット(Sarstadt)チューブに移し、37℃で一晩ゆっくりと回転した。
【0204】
一晩反応させた後、この感染細胞の一部100μlを5mlのポリプロピレンチューブに移した。この細胞を3mlの0.2%のNaN3を含むPBS−CMFで洗浄した。0.2%のNaN3を含むPBS−CMFの4%パラフォルムアルデヒド(Polysiences Inc。#00380)液、pH7.4 100μlを沈殿した細胞に加え、氷上で10分間反応させた。次の様にして特異抗体を第一チューブに、そして非特異抗体(抗狂犬病G)を2番目のチューブ加えた。
【0205】
パラホルムアルデヒド処理された細胞を0.2%のNaN3を含む3mlのPBS−CMFで洗浄した。洗浄後、0.2%NaN3と1%のサポニン(SIGMAS−7900)と20%の加熱不活化したウシ新生児血清(Gibco #200−6010AJ)を含むPBS−CMF100μlを加えた。細胞を氷上で20分間反応させてから0.2%のNaN3を含む3mlのPBS−CMFで洗浄した。
【0206】
0.1%サポニンと20%の加熱不活化したウシ新生児血清を加えたPBS−CMFで希釈された抗体(事前にHeLa細胞で前吸収した)100μlを各沈殿細胞に加え、4℃で30分間反応させた。細胞を3mlの0.2%NaN3と0.1%のサポニンを含むPBS−CMFで2回洗浄し、沈殿させた。
【0207】
0.2%NaN3と0.1%のサポニンと20%の加熱不活化したウシ新生児血清を含むPBS−CMFで1:50に希釈したFITC結合二次抗体(事前にHeLa細胞で前吸収した)100μlを加え、暗所4℃で30分間反応させた。細胞を3mlの0.2%NaN3と0.1%のサポニンを含むPBS−CMFで2回洗浄し、沈殿させた。沈殿した細胞を0.2%NaN3を含む1mlのPBS−CMFに再懸濁し、5mlのポリスチレンチューブに移してからFACSにかけて測定した。
【0208】
VCP255のFACS分析:抗血清/HeLa懸濁液をBecton DickinsonモデルFC FACScanフローメーターにかけて測定した。データはLysisIIソフトウエアー(Becton Dickinson,UK)で分析した。抗血清/HeLa懸濁液は488nmのアルゴンレーザーで励起され、FITC放射光スペクトラをFL−1チャンネル検出器で特定した。10,000細胞について非ゲートデータを集めた。
【0209】
ALVAC感染HeLa細胞のFACS分析から得た放射蛍光スペクトラより狂犬病GとFIV−特異遺伝子産物のバックグランドレベルが示された。rabiesGグリコタンパク質のバックグランドレベルは、VCP255感染HeLa細胞のFACS分析によって得られる。
【0210】
FIV特記モノクローナル抗体を用いて得たVCP255が感染したHeLa細胞の放射蛍光スペクトラからは、FIV−特異遺伝子産物の発現が示された。FIV p24をコードする配列の産物はVCP255感染HeLa細胞の内部に検出された。FIV Env産物はVCP255感染HeLa細胞の表面に検出された。
【0211】
免疫沈降分析:CEFあるいはVERO細胞にALVAC(親ウイルス)、VCP242,VCP253,VCP255あるいはVCP329を10pfu/細胞のm.o.iで感染させた。1時間吸収させた後、イノキュラムを除き、細胞に、2%の透析したウシ胎児血清と[35S]−TRANSラベル(New England Nuclear, Boston,MA;30uCi/ml)を含む2mlの改良型イーグル培地(Eagle’s medium)(システインとメチオニンを除いた)を重層した。感染後18−24時間目に1mlの3×緩衝液A(450mM NaCl、3% NP−40、30mM Tris(pH7.4),3mM EDTA、0.03% Na−アザイドと0.6mg/ml PMSF)を加えて融解物を集め、FIV envとgag遺伝子産物の発現について解析した。上記のポリクローナルネコ血清あるいはFIV−特異モノクローナル抗体を用い、次の様にして免疫沈降解析を行った。
【0212】
融解物を一晩4℃でFIV−特異抗血清−プロテインA−セファロース複合体と反応させた。サンプルを1×の緩衝液Aで4回洗浄し、さらにLiCl2/尿素緩衝液(200mM LiCl、2M 尿素と10mmTris、pH8.0)で2回洗浄した。2×Laemmli緩衝液(124mM Tris(pH6.8)、4% SDS、20%グリセロール、10%の2−メルカプトエタノール)を加えて5分間煮沸し、沈殿した蛋白質を解離させた。この蛋白質を10%のSDS−ポリアクリルアミドゲルで分画してからメタノールで固定し、1MのNa−サリチル酸で処理してフルオログラフィーにかけた。ALVAC−FIV組換体に感染した細胞からは適当な大きさを持つ蛋白質が沈殿してきたが、感染していない細胞やALVAC感染細胞では沈殿してこなかった。この結果はALVAC−FIV組み換え体ではFIV遺伝子産物が適切に発現していることを示している。
【0213】
ELISA 分析:一次ニワトリ胚繊維芽(CEF)細胞にVCP219,VCP242,あるいはALVACを感染させた。感染細胞を次のFIV−特異的モノクローナル抗体を用いて分析した(Rhone Merieux,Lyon,France)。
【0214】
ELISAにより試験した血清サンプル:
1.FIV−感染ネコの血清:
Rhone Merieuxより得た。
【0215】
ネコ番号#34と#103
2.正常ネコ血清:ネコ番号#1229(Select Labs,Athens,GA)
3.VCP65(ALVAC−RG)で免疫し得たウサギ血清:
ウサギ番号A039:前採血 14週
感染細胞融解物は次のようにして調整した。CEF細胞のローラーボトルに、無血清培地中細胞当たり5PFUのMOIでALVAC,VCP219、あるいはVCP242を感染させた。感染20時間後、細胞が完全に円形になるが剥離していない状態で各ローラーボトルから細胞を集めた。採取した細胞を培地中にそそぎ、PBSで1回洗浄してからアプロチニン(3.6 T.I.U;Sigma #A−6279)を添加された3mlのPBSを加えて細胞を解離させた。採取した細胞を氷上で4分間超音波処理してから1000×gで10分間遠心分離した。上清を集めたところ、各調整サンプルの蛋白濃度はおよそ7mg/mlであった。
【0216】
カイネティックELISAを次の様にして行った。血清サンプル(前記)をサンドイッチカイネティックELISAを用いて測定し、FIVenvとgag遺伝子の産物を検出した。マイクロタイタープレートは上記一覧したFIV envまたはFIVgagに特異的なプールしたモノクローナル抗体を用いて2または5μg/ウエルで固相化した。感染した細胞の融解物を0.2、1または5μg/ウエルの割合で加え、モノクローナル抗体により補足させた。各血清サンプルは1:100に希釈して3重測定した。抗体は1:200に希釈された西洋ワサビ過酸化酵素(HRP)標識抗ネコ血清(Jackson Immuno Research カタログ番号102−035−003)あるいはHRP標識抗ウサギ血清(DAKO、カタログ番号P217)と、HRP基質であるo−フェニレンジアミン ジヒチロクロライド(o−phenylenediaminedihycrochloride)(OPD)を用いて検出した。A450の最適密度を15分間測定し、各サンプルについて1分当たりのmODとして速度を計算した。
【0217】
これらELISAの結果よりFIV Envが感染したネコの血清ではFIVがEnvとGagの発現が検出できるが、正常ネコ血清では検出できないことが明瞭に示された(データ未提示)。EnvはEnv−特異的MAbで調整したプレートを利用した場合VCP242に感染した細胞に由来する融解物には示されたが、ALVACからの融解物またはVCP219に感染した融解物については検出されなかった。同様にGagはGag−特異Mabを用いたプレートを利用しVCP219に感染した細胞を調べた場合には検出されたが、ALVACあるいはVCP242に感染した細胞については検出されなかった。
【0218】
【表2】
【表3】
実施例7−ネコに於けるALVAC−FIV組換体効率
グループ分けと免疫感作:週齢12週のSPF動物を
合計36種類Liberty(Waverly,NY)より得て、次の7つの群に分けた:
【表4】
免疫感作は以下の様に行った:
A群(ネコ6匹) 感作日(日)一次感作:ALVAC−env(VCP242) 0日目
二次感作:ALVAC−env 28日目
三次感作:ALVAC−env 56日目
B群(ネコ6匹)
一次感作:ALVAC−env、gag/pro(VCP255) 0日目
二次感作:ALVAC−env、gag/pro 28日目
三次感作:ALVAC−env、gag/pro 56日目
C群(ネコ6匹)
一次感作:ALVAC−gag/pro(VCP253) 0日目
二次感作:ALVAC−gag/pro 28日目
三次感作:ALVAC−gag/pro 56日目
D群(ネコ6匹)
一次感作:ALVAC−97TM gag/pro(VCP329)0日目
二次感作:ALVAC−97TM gag/pro 28日目
三次感作:ALVAC−97TM gag/pro 56日目
E群(ネコ6匹/コントロール)
一次感作:ALVAC(CPpp) 0日目
二次感作:ALVAC 28日目
三次感作:ALVAC 56日目
F群(ネコ3匹/ブースト)
一次感作:ALVAC−env、gag/pro(VCP255) 0日目
二次感作:ALVAC−env、gag/pro 28日目
ブースト:不活性化FIV細胞ワクチン(ICV) 56日目
G群(ネコ3匹/コントロール) 一次感作:ALVAC 0日目
二次感作:ALVAC 28日目
ブースト:不活性化FIV細胞ワクチン 56日目
全てのネコに筋注により1mlの滅菌PBS注に1×108PFUのALVAC組換体液を投与された。ICVブーストは2.5×107固定同種FIV−Petalumaが感染したネコT−細胞(F1−4細胞株)に250μgのムラミルジペプチドが混合し調整された。ICVブーストは皮下投与された。
【0219】
誘発:全てのネコには最終免疫感作終了4週後に50CID50のFIV−Petaluma(FIV Petaluma株を感染させたPBMC培養体から得た無細胞上清)が投与され誘発された。
【0220】
誘発を受けた動物のFIV−特異的ウイルス学的状態を調べるために次の検査を行った。これによりALVACをベースにしたFIVワクチン候補の予防効果を直接測ることができる。
【0221】
1)ウイルス分離:RTアッセーによる感染性FIVの検出。ウイルス分離のための誘発を行った後、末梢血単核細胞(PBMCs)、骨髄(BM)細胞およびリンパ節(LN)細胞を分離した(Yamamotoら、1991、1993;Okadaら、1994)。ウイルス分離は培養上清中の逆転写酵素(RT)活性をモニタリングして行った。分離した細胞をIL−2存在下に4週間培養した。通常の測定法(レンチウイルス特異的な)に従いMg++−依存型RT活性を測定するために上清の一部100μlを取った。
【0222】
2)FIV−特異的PCR。PBMC,BM,およびLN細胞から抽出したDNAについてプロウイルス配列を検出した。感度を上げるために4種類のコンセサンスプライマーを利用して、env−あるいはgag−特異的コーディング域を増幅した(Ymamotoら、1991;Okadaら、1994)。
【0223】
最初のPCR増幅に続けて、増幅産物の1/25を取りネステッドプライマーペアーを利用して2回目の増幅を行った。
【0224】
誘発前後にサンプルについて行ったウイルス学的アッセーの結果を表3と4に示した。RT測定またはFIV−特異的PCR分析でも誘発前にFIVウイルス血症を示したネコはいなかった(表3)。誘発後8週までにALVAC親株ウイルスを3回投与された6匹のネコのうち4匹が持続性のFIV−特異的血症を発症した(表3)。これらのネコが感染していることは、誘発後に採取した組織サンプルからウイルスが分離されることや、PCRの結果、そして誘発後に明瞭はFIV−特異的なセロコンバージョンがみられることからも示された(表4と5)。コントロール群のその他の2匹のネコ(QA4とQE3)については、感染を示す明確な徴候は観察されなかった。さらに、ALVAC−FIV env(VCP242)、ALVAC−FIV env/gag−pr(VCP255)、またはALVAC−FIV 97TMG(VCP329)のいずれかを3回接種された(108pfu/回)ネコの群と上記コントロール群との間に感染効率について差は認められなかった。
【0225】
ALVAC−FIV gag−pr(VCP253)を3回接種すると、明らかにFIV誘発の暴露による感染から完全に防御された。対象となった6匹のネコの全例で感染が防御されたことが、誘発後29週間にわたって行われた末梢およびリンパ組織を対象としたウイルス分離実験ならびにFIV−特異的PCR測定から明瞭にしめされた(表3と4)。さらに、ウエスタンブロットあるいはELISAによればこれらのネコではFIVに対し血清反応性となるセロコンバージョンが起きていなかった(表4と5)。VCP253の感染効率をさらに確認するために、この群の2匹の動物から細胞(PBMCs、リンパ節と骨髄)を取りSPF子ネコに移植した。しらべた限りではこれらのネコはウイルス分離(RTおよびPCR)ならびにFIV−特異ウエスタンブロットについて陰性であったが、一方感染したコントロールのネコ(Py2)から得た同様の細胞を移植されたSPFネコについては、これら検査から明瞭に感染していることが示された。
【0226】
これらの結果は、Gag−prはレンチウイルスの誘発暴露を十分に防御することを示している。表6に見られる様に、これらの結果は統計的にも有意である。またこの結果はEnvの存在が防御的免疫反応の確立に積極的に干渉する可能性があることも示している。また、VCP255(2×)を接種され、さらにICV免疫源を追加した実験のデータは、一次/ブースト処理によりEnvの干渉に打ち勝てることを示している(表3と4)。ALVAC親株ウイルスの投与を2回受けてからICVを追加された群のネコは誘発暴露を受けるとたやすく感染してしまうことから、VCP255がこのプライミング活性を担っていることは明らかである(表3と4)。
【0227】
まとめると、本データはFIV Gag−prだけを含むサブユニット免疫源を利用することでネコをFIV感染から初めて防御したことを示している。事実、Envは感染効率を低下させた。
【0228】
これらデータの重要点はレンチウイルスワクチンの開発にとって一般的なものとも考えられる。Gag−Prだけを用いた防御はワクチンおよび診断方法にとり重要ないくつかの要素を提供する。第一は、既存のEnvをベースとしたアッセーを行い、ワクチン接種を受けた個体と感染した個体とをたやすく分けることができることである。第二に、Gag−prはEnv種に比べ各種のレンチウイルス分離株間で変異が少なく、従ってこれら変異株をまたいだ防御反応が展望できることである。
【0229】
【表5】
【表3】
【表6】
【表4】
実施例8 − ネコの体内における多様な亜類型 FIV 誘発(攻撃)試験に対して、ALVAC−FIV組換え型は防御免疫性を引き起こす
材料と方法
動物:特定の病原体フリー(SPF)が、リバティー研究所より購入された。
【0230】
ワクチン調製:カナリポックスウイルス(ALVAC)−FIV組換え型を、上記のように生成した(VCP255)。 ALVAC VCP255ワクチンは、感染したCEFの溶解物フリー血清から調製した。ALVAC VCP255免疫を、筋肉内に1×108PFUで投与した。細胞不活性化ワクチン(ICV)は、250μgのSAF/MDPアジュバント(Hioseら、1995)と混合されたパラホルムアルデヒドで不活性化されたFl−4細胞(長期にわたってFIV Petalumaを感染させたネコのリンパ細胞系)2×108からなり、これを皮下投与した。
【0231】
グループ分けおよび免疫プロトコル:誘発研究では6匹のネコを使った。すなわち、実施例7で記載したFIV Petaluma誘発を受けた、ALVAC−env、gag/pro/ICV免疫処置したグループ(#PY4、#QH3、#QA6)、およびFIV Bangstonのチャレンジの前に免疫処置を受けていない、年齢を釣り合わせた3匹のSPFネコ(#EJ2、#DH3、#GU5)の制御(管理)グループ。(表5を参照)。
【0232】
チャレンジ(誘発):第2の誘発接種源は75 ID50細胞フリーFIV Bangston(亜類型B)からなっており、最初のFIV Petaluma誘発後、8ヶ月後に投与された(実施例7を参照)。
【0233】
免疫原性監視:FIV特殊抗体反応の誘導を、Western blotting( 免疫ブロット)により確認した。ウイルス中和抗体反応(VNA)が、先に記載した分析検定を使って確認された(Yamamotoら、1991)。
【0234】
ウイルス伝染性監視:ウイルス感染はさまざまな方法で監視が行われた。これには、PBMC内のウイルス反転写酵素活性、先に記載した方法(Yamamotoら、1991)により、誘発後、数回にわたり採取された骨髄およびリンパ節細胞の評価が含まれる。加えて、プロウイルスDNA(潜在感染)は、PBMCから抽出されたDNA上のFIV−envプライマー、RT活性用培養上の骨髄およびリンパ節細胞(Yamamotoら、1991、Okadaら、1994)を使った、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)により監視された。さらに、FIV感染は、誘発前後に採取された血清中のFIV−特殊体液反応およびウイルス中和(VN)抗体反応の特性を監視・比較して確認された。
【0235】
結果および討論
ALVAC 初回(一次)免疫/追加免疫プロトコルの免疫原性および防御有効性が、明白な異種構造のFIV分離株(Bangston株)を使った実験誘発に対して評価が行われた。まず、ALVAC−env、gag/polだけでの免疫処置の防御有効性が、ALVAC−env、gag/polとの初回(一次)免疫、さらに不活性化されたFIV−感染細胞ワクチン(ICV)による追加免疫との比較が行われた。すべてのネコに合計3回の免疫処置を受けさせ、
細胞フリーのFIV Petaluma50 ID50による最終免疫処置の4週間後に、誘発実験を行った(実施例7を参照)。ALVAC−FIV組換え型ワクチンを生成するために使われる、FIV Villefranche分離株と同様、FIV Petaluma分離株は亜類型Aウイルスとして分類され、FIV Villefrancheとは、Envにおいて3%、Gag アミノ酸暗号部位では1%異なっている。
【0236】
次に、実施例7で記載したFIV Petaluma 誘発に抵抗力のあるALVAC−env、gag/pro/ICV免疫処置されたネコ(#QA6、#QH3、#PY4)が別の亜類型の明確な異種構造を持つFIV分離株による第2の誘発から保護されうるかどうかが評価された。第2誘発は、細胞フリーの75 ID50FIV Bangston(誘導PBMC)から成り、いかなる中間追加抗原も行わない最初の誘発の8ヶ月後に投与された。FIV Bangstonは亜類型B分離株であり、FIV Petaluma(亜類型A)とは、エンベロープ糖蛋白質暗号化部位において21%異なっている。年齢が合わせられた3匹のSPFネコ(#EJ2、#GU5、#DH3)は、FIV Bangston誘発のために、コントロール(対照用)ネコとして使用された。表7に示したように、すべてのコントロールネコは誘発でたやすく感染した。対照的に、ALVAC−env、gag/pro/ICV免疫処置したネコ#QH3および#QA6は、誘発後3ヶ月まで、末梢血液のウイルス隔離(RT)およびPCRで確認されたようにウイルス陰性のままであった。ネコ#PY4は、末梢血液のウイルス隔離(RT)により確認されたようにウイルス陰性のままであったが、誘発後3ヶ月の時点でPCRにより陽性という結果が出た。PCR生成物のヌクレオチド連鎖分析で、FIV Bansgton特殊連鎖が明らかになった。このように、ALVAC−env、gag/pro/ICV免疫処置されたネコは、部分的に、異種構造亜類型FIV攻撃から防御された。少なくとも、これらのネコには、すべての統制ネコが誘発後6週間までにウイルス血症になったように感染における遅延を証明し、ALVAC−env、gag/pro/ICV免疫処置された3匹のネコのうち一匹だけが、誘発後12週間の時点で、PCR分析に基づいて、陽性になったことが明らかである。これは、Env発現組換えに対する潜在的有益性を示すものである。
【0237】
要約すると、ALVAC組換え型の初回(一次)免疫(priming)とそれに続く不活性化FIV−感染細胞ワクチンの追加免疫(boosting)を伴うを伴うprime/boostプロトコルは、異種構造FIV菌種による実験誘発に対して防御的免疫性を引き出すことが可能である。この免疫性は長期にわたって継続し、また他の亜類型の明確に異種構造をしたFIV−菌種に対して部分的防御性がある。データーでは、ウイルス中和抗体反応やFIV−特殊抗体反応よりもむしろ、仲介細胞に対する役割が裏付けされている。これらの研究結果は、新しい亜類型が次々と出現し、既存の亜類型がますます地理的に新しい範囲に広まっていいるように、多様な亜類型FIV−ワクチンの開発だけでなく、有効な多様亜類型HIVワクチン(他のレンチウイルスおよびレトロウイルスのための多様な亜類型ワクチンだけでなく)の開発にもつながるものである。
【0238】
フッシャーの精密なテストが行われた。これは、カイ2乗テストを修正したものである。本テストは、2組の断続的な、2者択一(全か無の)データーを比較するときに使われることになっている。分析は次のように準備が行われた。
【0239】
【表7】
単一末尾確率に対して、P値を次のように計算した。
【0240】
P(確率)=(A+B)!(C+D)!(A+C)!(B+D)!/N!A!B!C!D!
各グループを、ALVAC−コントロールグループ(n = 6)およびALVAC−コントロールグループ+ALVAC−コントロールおよびICVグループ(n = 9)と比較した。0.05または0.05以下のP値は、有意であると見なされた。
【0241】
【表8】
【表9】
【表10】
実施例9−付加的なNYVACおよびTROVAC組換え型の生成
プロモーターに連接したDNAをコードするFIV生成のために上記で述べた方策を用いること、米国特許第5,494,807およびUSSN 08/417,210における具体例に同様なものや、これらベクターの部位に挿入するためのNYVAVCおよびTROVAC用のDNAを配置することが、NYVACおよびTROVAC FIV組換え型生成のために使われた。分析により、ベクターへの外来性DNAおよびその発現の組み込みが証明されている。このような付加的組換え型は、同じように、上記のALVACの具体化として有効である。
【0242】
実施例10−付加的レンチウイルス、および付加的ベクターシステム組換え型の生成
プロモーターに連接したDNA暗号化FIV生成のために上記で述べたことに類似する方策、ここに引用した資料中の、代替の、ポックスウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、 エプスタイン−バーウイルス、細菌性およびDNAベースシステムを生成するための方策、さらにレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全ウイルス、たとえばEIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIVからDNAを、ここに挙げた資料からの代替ポックスウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、エプステイン−バーウイルス、細菌性、およびレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全ウイルス、たとえば、Env、Gagおよびプロテアーゼのような、EIAV、FIV、BIV、HIV、またはSIVからDNAを含み、表現するDNAベース組換え型を、暗号化する知識を用いて、組換え型を生成する。分析により、外来性DNA およびそれからの発現のベクターへの組み込みが証明された。このような付加的組換え型は、同様に、上記ALVAC具体化として有効である。
【0243】
このように、本発明の好ましい具体化を詳細に記述することで追加請求により定義された本発明は、そこからの多くの明白な変化形態が、その意図および範囲を逸脱することなく可能であるように、上記で説明した詳細事項で制限するべきでないことが理解される必要がある。
【0244】
参考文献を以下に示す。
【0245】
【表11】
【0246】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
実施例の方法によって示されるが、記述される実施態様にのみ本発明を限定することが意図されない以下の詳細な説明は、ここに参照して組込まれる付随の図面と関連して理解するのが最もよい。ここで、
【図1】図1は、上に記述のとおりプラーク精製カナポックスの結果を示す。
【図2】図2は、Rhone Merieuxから得たFIV envのヌクレオチド配列(配列番号:1)(FIV env開始コドンは、位置1にあり、そして停止コドンは位置2569にある。FIV envのコーディング配列を含有するプラスミドptg6184は、Rhone Merieux(フランス国、リオン(Lyon、France)から得た。ptg6184にあるFIV envコーディング配列を、シーケンシングし、そして以下の配列を示す以下の差異を観察した。位置1218Tは、pheをleuに変えるptg6184にあるGである;位置1220GからAを、glyからgluに変え;そして位置2201CからAは、alaからgluに変わる。)を示す。
【図3】図3は、Rhone Merieuxから得たFIVgag/polコーディング配列のヌクレオチド配列(配列番号:2)(gag開始コドンは、位置1にあり、そしてgag停止コドンは、位置1414にある。リボソーム枠シフト部位は、位置1255の近くにある。枠シフトは、gag開放読取枠に対して−1である。枠シフトは、pol開放読取枠に加わる。pol開始コドンは、位置4614にある。Rhone Merieuxから得たプラスミドptg8133は、FIVgag/polコーディング配列を含有する。ptg8133の一部をシーケンシングした。そして以下の位置577−578にあるCGは、ptg8133中のGCであり、argからalaまでのコドンを変化する。)を示す。
【図4】図4は、図3の続きのヌクレオチド配列である。
【図5】図5は、C6供与プラスミドpC6L(配列番号:3)(プラスミドpC6Lは、C6挿入部位SmaI(位置409)およびEcoRI(位置425)を含有する)に含まれるALVAC−ヌクレオチド配列を示す。
【図6】図6は、vCP242挿入の推定ヌクレオチド配列(配列番号:4)(H6プロモーターは、位置55で開始する。FIVenv開始コドンは、位置179にあり、そしてFIVenv停止コドンは、位置2749にある。位置1から54および位置2750から2879は、H6/FIVenv発現カセットの両端を挟む)を示す。
【図7】図7は、FIVgag/プロテアーゼ発現カセットを促進し、vCP253にある領域(配列番号:5)を挟むI3Lの推定ヌクレオチド配列(I3Lプロモーターは、位置135で始まる。gag開始コドンは、位置235にあり、そしてプロテアーゼ停止コドンは、位置1648にある)を示す。
【図8】図8は、FIVenv/I3L促進FIVgag/プロテアーゼ発現カセットを促進し、そしてvCP255にある領域(配列番号:6)を挟むH6の推定ヌクレオチド配列(H6プロモーターは、位置129で開始し、FIVenv開始コドンは、位置253にあり、そしてFIVenv停止コドンは、位置2823にある。I3Lプロモーターは、位置2830で開始し、FIVgag開始コドンは、位置2930あり、そしてFIVgag停止コドンは、位置4282にある。リボソーム枠シフト部位は、位置4184の近くにある。枠シフトは、gag開放読取枠に対して−1である。枠シフトは、pol開放読取枠に加わる。プロテアーゼ遺伝子のための停止コドンは、位置4641にある。位置1から128および位置4642から4727は、H6FIVenv/I3L FIVgag/プロテアーゼ発現カセットを挟む)を示す。
【図9】図9は、図8の続きの推定ヌクレオチド配列である。
【図10】図10は、vCP329挿入物の推定ヌクレオチド配列(配列番号:7)(H6プロモーターは、位置2146で開始する。FIV97TMについてのコーディング配列は、位置2022から位置42である。I3Lプロモーターは、位置2253で開始する。FIVgag開始コドンは、位置2353あり、そしてpol停止コドンは、位置3766にある。)を示す。
【図11】図11は、図10の続きの推定ヌクレオチド配列である。
Claims (5)
- ネコ免疫不全ウイルスに対する防御免疫応答を誘発するワクチンであって、ネコにおいて、FIV Gagおよびプロテアーゼのタンパク質をコードする核酸分子を生体内にて発現するカナリポックスウイルス組換えポックスウイルスを含む、ワクチン。
- Gagおよびプロテアーゼのタンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号5の位置235〜1648で表されるヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載のワクチン。
- 前記カナリポックスウイルスがALVAC株である、請求項1または2に記載のワクチン。
- 前記組換えポックスウイルスが配列番号5を含む、請求項3に記載のワクチン。
- ネコにおけるFIVに対して防御免疫応答を誘発する方法であって、請求項1〜4のいずれか1つに記載のワクチンをネコに投与することを含む、方法。
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