JP2003310286A - レンチウイルスから誘導した非相同挿入部分を含むポックスウイルスベースの発現ベクター - Google Patents

レンチウイルスから誘導した非相同挿入部分を含むポックスウイルスベースの発現ベクター

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JP2003310286A JP2003081436A JP2003081436A JP2003310286A JP 2003310286 A JP2003310286 A JP 2003310286A JP 2003081436 A JP2003081436 A JP 2003081436A JP 2003081436 A JP2003081436 A JP 2003081436A JP 2003310286 A JP2003310286 A JP 2003310286A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明の目的は、レトロウイルスおよび／ま
たは免疫不全症ウイルスに由来する特定の遺伝子産物を
発現するベクターを提供することである。 【解決手段】 本発明は、少なくとも１個のＦＩＶエピ
トープをコードする外因性ＤＮＡを含むベクターであっ
て、前記ベクターがＪ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２
６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、および１４Ｌからな
る群から選択されるオープンリーディングフレームの一
つあるいはこれらの組み合わせにおいて、オープンリー
ディングフレームが欠失されたワクシニアウイルス、ま
たはアビポックスウイルスであり、ヒトを除く動物に前
記ベクターと適当な担体とを混合して投与した際に、前
記動物に免疫応答を惹起することを特徴とするベクター
である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】（レンチウイルスから誘導し
た非相同挿入部分を含むポックスウイルスベースの発現
ベクター政府の権利の可能性についての言明）本文中で
報告する研究の一部は、ＮＩＨ／ＮＩＡＩＤ補助金（Ｒ
０１‐ＡＩ３０９０４）およびＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｒｐ．／フロリダ大学共同研究補助金の援助を
受けたものである。政府は何らかの権利を有する可能性
がある（権利の侵害あるいは承認を伴わない）。
【０００２】（関連出願）１９９４年４月６日出願の米
国特許願連続番号第０８／２２３，８４２号の一部継続
出願として、１９９５年４月５日出願の米国特許願連続
番号第０８／４１７，２１０号を参照する。前者は１９
９２年６月１１日出願の連続番号第０７／８９７，３８
２（現在は１９９４年９月７日出願の米国特許願連続番
号第０８／３０３，２７５号）号の一部継続出願であ
り、またそれは１９９１年６月１４日出願の連続番号第
０７／７１５，９２１号の一部継続出願である。特許願
連続番号第０８／４１７，２１０号も、１９９３年８月
１３日出願の特許願連続番号第０８／１０５，４８３
号、現在の米国特許第５，４９４，８０７号の一部継続
出願であり、後者は１９９２年３月６日出願の連続番号
第０７／８４７，９５１号の継続出願であり、またそれ
は１９９１年６月１１日出願の連続番号第０７／７１
３，９６７号の一部継続出願であり、またそれは１９９
１年３月７日出願の連続番号第０７／６６６，０５６号
（現在の米国特許第５，３６４，７７３号）の一部継続
出願である。１９９３年１月２０日出願の連続番号第０
８／００７，１１５号の一部継続出願として１９９４年
１月１９日に出願された、共同審理中の特許願連続番号
第０８／１８４，００９号についても言及する。前述し
たおよび上記に参照した特許願および特許は、それぞれ
参照してここに組み込まれる。
【０００３】（発明の分野）本発明は次のものに関す
る：対象となる特定のエピトープ、好ましくはＥｎｖ、
Ｇａｇ、Ｐｏｌと付属遺伝子産物、たとえばＴａｔ、Ｒ
ｅｖ、より好ましくはＧａｇとＰｏｌまたはＥｎｖ、Ｇ
ａｇとＰｏｌ、最も好ましくはＧａｇとプロテアーゼを
含む、レンチウイルス、レトロウイルスおよび／あるい
は免疫不全ウイルス、たとえばＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡ
Ｖ、ＢＩＶ、ＦＩＶからの特定産物；当該産物をコード
する特定核酸分子、たとえばＲＮＡ、ＤＮＡ；当該核酸
分子を含み、好ましくは当該産物をベクターに外因性と
して発現するベクター、好ましくは哺乳類ベクター；当
該ベクターによる発現から得られたあるいは得ることが
できる産物；当該ベクターおよび／あるいは当該産物を
含む免疫学的、免疫原性および／あるいはワクチン組
成；当該産物を調製するための方法；当該ベクターを作
製するための方法；当該組成を調製するための方法；当
該産物、ベクターおよび／あるいは組成を単独で、また
は不活性化レンチウイルス、レトロウイルスあるいは組
換えサブユニット製剤とのプライム／ブースト形態とし
て、たとえば不活性化感染細胞ワクチンあるいは免疫学
的または免疫原性組成（ＩＣＶ）とのプライム／ブース
ト形態として投与する免疫処方によるような、免疫応答
を得るための方法を含む、当該産物、ベクターおよび組
成を使用するための方法。
【０００４】本発明は特に、組換え型免疫学的、免疫原
性あるいはワクチン組成、ならびに非相同株への暴露を
含む、レンチウイルス攻撃誘発暴露に対する防御を提供
するような、応答を刺激する上でのそれらの有用性に関
する。組換え型組成は、好ましくは、単独で、あるいは
不活性化レンチウイルス製剤（たとえばＩＣＶ）または
組換えサブユニット製剤とのプライム／ブースト形態で
の有効な免疫処方において使用される、レンチウイルス
遺伝子産物を発現する哺乳類ベクター系を含む。
【０００５】本出願中でいくつかの資料を参照する。こ
れらの資料に関する詳細な引用は、請求の範囲の直前の
本明細書の最後の部分、あるいは資料に言及する箇所に
示されている；またこれらの資料の各々は参照してここ
に組み込まれる。
【０００６】
【従来の技術】（発明の背景）特許および学術文献に
は、哺乳類ウイルスベースのベクター系や哺乳類ＤＮＡ
ベースのベクター系のような様々な哺乳類ベクター系、
そしてこれらのベクター系をどのようにして作製し、使
用するか、たとえば外因性ＤＮＡのクローニングや蛋白
の発現のための使用、ならびにそのような蛋白について
の用途およびそのような蛋白からの産物についての用途
が含まれている。
【０００７】たとえば、このウイルスベクター系におけ
る発現のための組換え型ポックスウイルス（たとえばワ
クシニアウイルス、アビポックスウイルス）と外因性Ｄ
ＮＡが、米国特許第４，６０３，１１２号、４，７６
９，３３０号、５，１７４，９９３号、５，５０５，９
４１号、５，３３８，６８３号、５，４９４，８０７
号、５，５０３，８３４号、４，７２２，８４８号、
５，５１４，３７４号、英国特許第ＧＢ ２ ２６９
８２０ Ｂ号、第ＷＯ９２／２２６４１号、第ＷＯ９３
／０３１４５号、第ＷＯ９４／１６７１６号、第ＰＣＴ
／ＵＳ９４／０６６５２号、および１９９４年１月１９
日出願の認可された米国特許願連続番号第０８／１８
４，００９号の中に認められる。一般的には、Ｐａｏｌ
ｅｔｔｉ、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｘ
ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａ
ｔｉｏｎ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９
３：１１３４９‐１１３５３、１９９６年１０月；Ｍｏ
ｓｓ、「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ
ｐｏｘｕｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｖａｃｃｉｎ
ａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ
９３：１１３４１‐１１３４８、１９９６年１０月参
照。
【０００８】バキュロウイルス発現系およびそれらにお
ける発現のための外因性ＤＮＡ、およびそれらからの組
換え型蛋白の精製は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．
（編集者）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」（１９９
５ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）（たとえば
インフルエンザＨＡ発現についての第１８章、組換え型
蛋白精製手法についての第１９章参照）、Ｓｍｉｔｈ
ら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａ Ｂｅｔ
ａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅ
ｌｌｓ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａＢａｃｕｌｏ
ｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ」Ｍ
ｏｌｅｃｕｌｒａ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，１９８３年１２月、第３巻、１２号、ｐ．２
１５６‐２１６５；Ｐｅｎｎｏｃｋら、「Ｓｔｒｏｎｇ
ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ‐Ｇａｌ
ａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｅｌｌ
ｓ ｗｉｔｈ ａ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔ
ｏｒ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８４年３月、第４巻、３号、
ｐ．３９９‐４０６；第ＥＰＡ ０ ３７０ ５７３号
（ＡＩＤＳに関する皮膚試験および試験キット、ＨＩＶ
‐１ ｅｎｖ遺伝子の一部を含むバキュロウイルス発現
系を論じ、１９８６年１０月１６日出願の米国特許願連
続番号第９２０，１９７号およびＥＰ特許願公開番号第
２６５７８５号を引用している）の中に認められる。
【０００９】米国特許第４，７６９，３３１号はベクタ
ーとしてのヘルペスウイルスに関する。また、Ｒｏｉｚ
ｍａｎ，「Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｐ
ｅｓｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓ：Ａ ｐ
ｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｎｅ
ｒｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ ９３：１１３０７‐１１３１２、１９９６
年１０月；Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙら、「Ｔｈｅ ａｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ
ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｒａｉｎ ｔｕｍ
ｏｒｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３１３‐１１３
１８、１９９６年１０月も参照のこと。エプスタイン−
バーウイルスベクターも知られている。Ｒｏｂｅｒｔｓ
ｏｎら、「Ｅｐｓｔｅｉｎ‐Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｖ
ｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｔｏ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ
９３：１１３３４‐１１３４０、１９９６年１０月参
照。さらに、アルファウイルスベースのベクター系があ
る。一般的にはＦｒｏｌｏｖら、「Ａｌｐｈｖｉｒｕｓ
‐ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３７１‐１１
３７７、１９９６年１０月参照。
【００１０】ポリオウイルスおよびアデノウイルスベク
ター系も存在する（たとえばＫｉｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６５、３０６８‐３０７５、１９９１；Ｇｒｕ
ｎｈａｕｓら、１９９２、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａ
ｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｓｅｍｉｎａｒ
ｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３巻）ｐ．２３７‐５
２、１９９３；Ｂａｌｌａｙら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ、第４巻、ｐ．３８６１‐６５；Ｇｒａｈａｍ，Ｔ
ｉｂｔｅｃｈ ８、８５‐８７、１９９０年４月；Ｐｒ
ｅｖｅｏら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７０、４２９‐
４３４参照）。また１９９６年７月３日出願の米国特許
願連続番号第０８／６７５，５５６号および０８／６７
５，５６６号（アデノウイルスベクター系、好ましくは
ＣＡＶ２）およびＰＣＴ第ＷＯ９１／１１５２５号（逆
向き末端反復領域の端に近いＳｍａＩ部位から初期領域
４（Ｅ４）についてのプロモーターまでの領域内にプロ
モーター遺伝子配列を含むように修飾されたＣＡＶ２）
も参照のこと。
【００１１】ＤＮＡベクター系も存在する。それらから
の発現のためのプラスミドＤＮＡによる細胞のトランス
フェクションについては、Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９９
４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２５５０‐２
５６１を参照する。様々な感染性疾患に対するワクチン
接種の簡単で有効な方法としてのプラスミドＤＮＡの直
接注射については、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５
‐４９、１９９３を参照する。またＭｃＣｌｅｍｅｎｔ
ｓら、「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈＤＮＡ
ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｌｙｃｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｄｏｒ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ，
ａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，
ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｅｒ
ｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ‐２ ｄｉｓｅａ
ｓｅ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１４１４‐１１４２
０、１９９６年１０月も参照のこと。
【００１２】１９８３年に、ヒト免疫不全ウイルス１型
（ＨＩＶ１）がＡＩＤＳの原因物質として同定され、そ
の後レトロウイルス科のレンチウイルス亜科に分類され
た（Ｈａｒｄｙ、１９９０）。レンチウイルス亜科の他
の成員は、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ
免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス
（ＢＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびＨ
ＩＶ‐２である。医学ウイルス学の分野では、ＨＩＶの
感染によって引き起こされる汎流行性のＡＩＤＳに多大
の関心が注がれてきた。このレンチウイルス系は、安全
で有効なワクチンと抗ウイルス療法を開発するための努
力の一貫として、その分子生物学、免疫生物学および病
因に関して詳細に検討されてきた。現在まで、ＨＩＶな
らびに種々のワクチン型を用いた他のレンチウイルスワ
クチン試験は様々な度合の成功を収めてきた（Ｈｅｅｎ
ｅｙら、１９９４；Ｄａｎｉｅｌら、１９９２；Ｆｕｌ
ｔｚら、１９９２；Ｇｉｒａｒｄら、１９９１；Ｉｓｓ
ｅｌら、１９９２）。さらに、ヒトでのワクチンの効果
に関する特異的ＨＩＶ免疫応答の関連性については、ま
だ知識が欠如している。それ故、長年を経たあとも、多
大の世界的な努力にもかかわらず、有効なＨＩＶ１ワク
チンはまだ得られていない。
【００１３】ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）によるネ
コの感染は、持続感染と、ＨＩＶ感染に類似したＡＩＤ
Ｓ様の免疫抑制性疾患を引き起こす。ネコのＦＩＶ感染
は、それ自体で、レンチウイルスの免疫病原性とワクチ
ン開発を検討するためのモデルを提供する（Ｐｅｄｅｒ
ｓｅｎら、１９８７；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４）。
ＨＩＶと同様に、異質性が存在し、それ故多数のＦＩＶ
亜型が存在する（Ｓａｄｏｒａら、１９９４；Ｏｋａｄ
ａら、１９９４）。実際に、ＨＩＶのように、ＦＩＶ株
は主としてｅｎｖ、そしてより小さな度合でｇａｇコー
ド領域における遺伝的差異に基づいて、４つの亜型（Ａ
‐Ｄ）に分類されてきた。
【００１４】それ故、完全な不活性化ＦＩＶワクチンと
不活性化ＦＩＶ感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）は相同なＦ
ＩＶとわずかに非相同なＦＩＶに対する防御を得たが
（Ｈｏｓｉｅら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９
４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９３）、これ
らの同じワクチンは他の亜型の明白に非相同なＦＩＶ株
に対しては防御免疫を誘発することができなかったた
め、広い範囲のＦＩＶ亜型に対する防御免疫の誘発は、
修正されたあるいは異なるワクチンアプローチを必要と
すると考えられる。このことは明らかにワクチン開発に
関する懸念を提起する。また、ネコ個体群におけるＦＩ
Ｖの罹患率がヒトにおけるＨＩＶ罹患率より高いことに
も留意しなければならない（Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒら、１
９９６）。ＦＩＶワクチンあるいは免疫原性組成の開発
は、ＨＩＶワクチンあるいは免疫原性組成のためのモデ
ルを提供する上で有用であるのみならず、獣医学的保健
衛生の将来という観点からも重要である。
【００１５】特に、これまでのＦＩＶ試験から（Ｈｏｓ
ｉｅら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４；Ｙｍ
ａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９３）、有意のＦＩ
ＶＥｎｖ特異的血清反応性を持つネコだけが同種攻撃誘
発暴露に対して防御される可能性が高いことが認められ
た。そのような反応を欠如しているワクチン投与動物で
は、ＦＩＶ攻撃誘発に対する防御は認められなかった
（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、
１９９１、１９９３）。同時に、これらの結果を、現在
までの、サブユニット免疫原は標的種における防御免疫
応答の誘発を示さなかったという所見と合わせて考えら
れると、ＦＩＶおよびレンチウイルスについての技術水
準、一般的なワクチン開発に関連した最前線のいくつか
の重要な点が提起される。ひとつの例外はおそらくサル
免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）／マカク系に関するもので
あり、この系では、一部の組換え型サブユニット製剤
（ワクシニアベースの組換え型を含む）あるいはこれら
の組換え型サブユニットの組合せが、ＳＩＶ攻撃誘発暴
露からの少なくとも部分的な防御をもたらした（Ｈｕ、
１９９２；１９９４；１９９５）。感染からの完全な防
御は認められておらず、攻撃誘発試験は明白に非相同な
ＳＩＶ株に関して実施されたものではなかったので、こ
のデータはいくぶん範囲が限定されている。さらに、Ｓ
ＩＶ Ｅｎｖ成分を持たない組換え型サブユニットによ
っては、いかなるレベルの防御ももたらされなかった
（Ｈｕら、１９９４）。
【００１６】ＦＩＶワクチン開発に関して、サブユニッ
トベースの候補ワクチンは全く教示あるいは提案されて
こなかった；いかにしてサブユニットワクチンを開発す
るかについての教示は全くない；またどのようにしてサ
ブユニットベースのワクチン候補を開発するかに関して
も明らかではない。
【００１７】第二に、非相同株に対する防御を与えるた
めには、不活性化された従来のワクチンと比較して、異
なるあるいはおそらく修正されたアプローチが開発され
る必要がある（Ｈｏｓｉｅら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏ
ｎら、１９９４）。
【００１８】最後に、保護免疫におけるＥｎｖ特異的免
疫応答は重要であると考えられる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、
１９９４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９
３）。実際に、Ｆｌｙｎｎらの「ＥＴＶ特異的ＣＴＬ
は、ワクチン接種によってネコ免疫不全ウイルス感染か
ら防御されるネコにおいて優勢である」Ｔｈｅ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９６，１
５７；３６５８‐３６６５において、３６６４ページで
著者は、「ＦＩＶ Ｅｎｖ特異的ＣＴＬはペットのネコ
のＦＩＶ感染に対する防御免疫においてより有効と考え
られる」ので、「今後のワクチン戦略は、長命で、ウイ
ルスエンベロープの糖蛋白上の適切なエピトープを認識
し、ウイルスを隔離することが知られている組織を標的
する、体液性と細胞媒介の両方の免疫反応を誘発するこ
とを目指すべきである」と結論している。
【００１９】それ故、宿主に投与したときネコ免疫不全
ウイルス感染に対して免疫応答を誘発する、ネコ免疫不
全ウイルス組換え型サブユニットの免疫原性、免疫学的
あるいはワクチン組成、たとえばＦＩＶ、Ｅｎｖ、Ｇａ
ｇ、あるいはＰｏｌのＦＩＶエピトープのような対象と
なるＦＩＶエピトープをコードする外因性ＤＮＡを、特
に免疫原性形態で、あるいはそれらの組合せで、たとえ
ばＦＩＶ Ｇａｇ‐プロテアーゼ、Ｇａｇ‐Ｐｏｌ、あ
るいはＧａｇとＰｏｌの一部（プロテアーゼを含むＰｏ
ｌの部分のような）あるいはＥｎｖ、ＧａｇとＰｏｌの
全部またはＰｏｌの一部の組合せで含む、ＮＹＶＡＣあ
るいはＡＬＶＡＣベースの組換え型のような高い安全性
を有する組成を提供することは、現在のテクノロジー水
準に比べて極めて望ましい進歩になるであろうと評価で
きる。さらに、プライム‐ブースト処方において、たと
えば当該組換え型組成を初回免疫において使用し、その
後の免疫を不活性化ＦＩＶ、ＩＣＶ、あるいは他の組換
え型サブユニット製剤で行う場合、そのような組換え型
あるいはそのような組換え型を含む組成の使用は現在の
テクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるで
あろう。
【００２０】より一般的には、宿主に投与したときレン
チウイルス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス
感染に対する免疫応答を誘発する、レンチウイルス、レ
トロウイルスあるいは免疫不全ウイルス組換え型サブユ
ニットの免疫原性、免疫学的あるいはワクチン組成、た
とえばＥｎｖ、Ｇａｇ、あるいはＰｏｌのような対象と
なるレンチウイルス、レトロウイルス、あるいは免疫不
全ウイルスエピトープをコードする外因性ＤＮＡを、特
に免疫原性形態で、あるいはそれらの組合せで、たとえ
ばＧａｇ‐プロテアーゼ、Ｇａｇ‐Ｐｏｌ、あるいはＧ
ａｇとＰｏｌの一部（プロテアーゼを含む部分のよう
な）あるいはＥｎｖ、Ｇａｇの全部とＰｏｌまたはＰｏ
ｌの一部を、Ｅｎｖ、Ｇａｇ‐プロテアーゼの組合せで
含む、ＮＹＶＡＣあるいはＡＬＶＡＣベースの組換え型
のような高い安全性を有する組成を提供することは、現
在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩にな
るであろうと評価できる。さらに、プライム‐ブースト
処方において、たとえば当該組換え型組成を初回免疫に
おいて使用し、その後の免疫を不活性化レンチウイル
ス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス、あるい
はＩＣＶ、あるいは各々の不活性化ウイルス、ＩＣＶま
たは他の組換え型サブユニット製剤のような他の組換え
型サブユニット製剤で行う場合、そのような組換え型あ
るいはそのような組換え型を含む組成の使用は現在のテ
クノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであ
ろう（「各々の」に関しては、組換え型がたとえばＦＩ
Ｖ組換え型であれば、不活性化ＦＩＶあるいはＦＩＶ
ＩＣＶ製剤が「各々の」になるであろう）。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】（発明の目的および要
旨）従って、本発明の目的は、レンチウイルス、レトロ
ウイルスおよび／または免疫不全症ウイルス（例えば、
ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶ）、ビスナ
ウイルス、ヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルスに由来する特
定の産物を提供することである。この産物は、目的の特
定のエピトープを含み、好ましくはＥｎｖ、Ｇａｇ、Ｐ
ｏｌまたはそれらに関するエピトープを、必要に応じ
て、それらに対する目的の補助的機能体またはタンパク
質またはエピトープ（例えば、Ｔａｔおよび／またはＲ
ｅｖ）を伴って含む。より好ましくは、ＧａｇおよびＰ
ｏｌ、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＧａ
ｇおよびＰｏｌの一部分、またはＥｎｖ、Ｇａｇおよび
Ｐｏｌの一部分である（特に、そのような部分はプロテ
アーゼを含む）。最も好ましくは、Ｇａｇおよびプロテ
アーゼ、またはＥｎｖ、Ｇａｇおよびプロテアーゼ、ま
たはそれらに関するエピトープで、必要に応じて、補助
的な機能体またはタンパク質（例えば、Ｔａｔおよび／
またはＲｅｖまたは他のそのような機能体／タンパク
質、またはそれらに関するエピトープ）を伴うものであ
る。目的の産物またはエピトープに含むことができる他
の補助的な機能体またはタンパク質として、ｎｅｔ、ｖ
ｐｕ、ｖｉｔ、ｖｐｒおよびｖｐｘ、またはそれらに関
するエピトープのいずれかまたはすべてが挙げられる
（特に、Ｔｒｏｎｏ，Ｄ、Ｃｅｌｌ、８２：１８９−１
９２、Ｊｕｌｙ ２８、１９９５を参照のこと）。その
ような補助的な機能体またはタンパク質は、非エンベロ
ープ性の機能体またはタンパク質と考えることができ
る。これらは、例えば、細胞性応答の誘導に関して、目
的の産物またはエピトープに含めることができる。例え
ば、特定のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫
不全症ウイルスの病原体については、そのような病原体
の補助的な機能体またはタンパク質またはそれらに関す
るエピトープは含まれ得る：従って、例えば、産物に
は、Ｇａｇ−Ｐｒｏおよび補助的な機能体またはタンパ
ク質またはそれに関するエピトープを含むことができ
る。
【００２２】本発明のさらなる目的は、特定の核酸分子
を提供することである。このような核酸分子は、例え
ば、産物をコードするＲＮＡ、ＤＮＡであり、例えば、
目的の特定のエピトープ（Ｇａｇおよびプロテアーゼあ
るいはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌのすべてなど）をコ
ードするＲＮＡ、ＤＮＡである。
【００２３】本発明のさらなる目的は、ベクター（好ま
しくは、哺乳動物のベクター系）を提供することであ
る。このようなベクターは核酸分子を含み、そして好ま
しくは、産物を以下のベクターに対する外因性として発
現する：例えば、ポックスウイルス、バキュロウイル
ス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、
アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスま
たはＤＮＡベクター系。
【００２４】本発明のさらなる目的は、前記のベクター
による発現から得られるか、または得ることができる産
物を提供することである。
【００２５】本発明のなおさらなる目的は、前記のベク
ターおよび／または前記の産物を含む免疫学的な免疫原
性および／またはワクチン組成物を提供することであ
る。
【００２６】本発明のなお別の目的は、前記の産物を調
製するための方法を提供することである。
【００２７】本発明のなお別の目的は、前記のベクター
を調製するための方法を提供することである。
【００２８】本発明のなおさらなる目的は、前記の組成
物を調製するための方法を提供することである。
【００２９】従って、本発明の目的は、レンチウイル
ス、レトロウイルスおよび／または免疫不全症ウイルス
（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩ
Ｖ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルス
に由来する特定の産物を提供することである。この産物
は、目的の特定のエピトープを含み、好ましくはＥｎ
ｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌまたはそれらに関するエピトープ
を、必要に応じて、それらに対する目的の補助的機能体
またはタンパク質またはエピトープ（例えば、Ｔａｔお
よび／またはＲｅｖ）を伴って含む。より好ましくは、
ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏ
ｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌの一部分、またはＥｎ
ｖ、ＧａｇおよびＰｏｌの一部分である（特に、そのよ
うな部分はプロテアーゼを含む）。最も好ましくは、Ｇ
ａｇおよびプロテアーゼ、またはＥｎｖ、Ｇａｇおよび
プロテアーゼ、またはそれらに関するエピトープで、必
要に応じて、補助的な機能体またはタンパク質（例え
ば、Ｔａｔおよび／またはＲｅｖまたは他のそのような
機能体／タンパク質、またはそれらに関するエピトー
プ）を伴うものである。目的の産物またはエピトープに
含むことができる他の補助的な機能体またはタンパク質
として、ｎｅｔ、ｖｐｕ、ｖｉｔ、ｖｐｒおよびｖｐ
ｘ、またはそれらに関するエピトープのいずれかまたは
すべてが挙げられる（特に、Ｔｒｏｎｏ，Ｄ、Ｃｅｌ
ｌ、８２：１８９−１９２、Ｊｕｌｙ ２８、１９９５
を参照のこと）。そのような補助的な機能体またはタン
パク質は、非エンベロープ性の機能体またはタンパク質
と考えることができる。これらは、例えば、細胞性応答
の誘導に関して、目的の産物またはエピトープに含める
ことができる。例えば、特定のレンチウイルス、レトロ
ウイルスまたは免疫不全症ウイルスの病原体について
は、そのような病原体の補助的な機能体またはタンパク
質またはそれらに関するエピトープは含まれ得る：従っ
て、例えば、産物には、Ｇａｇ−Ｐｒｏおよび補助的な
機能体またはタンパク質またはそれに関するエピトープ
を含むことができる。
【００３０】本発明のさらなる目的は、特定の核酸分子
を提供することである。このような核酸分子は、例え
ば、産物をコードするＲＮＡ、ＤＮＡであり、例えば、
目的の特定のエピトープ（Ｇａｇおよびプロテアーゼあ
るいはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌのすべてなど）をコ
ードするＲＮＡ、ＤＮＡである。
【００３１】本発明のさらなる目的は、ベクター（好ま
しくは、哺乳動物のベクター系）を提供することであ
る。このようなベクターは核酸分子を含み、そして好ま
しくは、産物を以下のベクターに対する外因性として発
現する：例えば、ポックスウイルス、バキュロウイル
ス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、
アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスま
たはＤＮＡベクター系。
【００３２】本発明のさらなる目的は、前記のベクター
による発現から得られるか、または得ることができる産
物を提供することである。
【００３３】本発明のなおさらなる目的は、前記のベク
ターおよび／または前記の産物を含む免疫学的な免疫原
性および／またはワクチン組成物を提供することであ
る。
【００３４】本発明のなお別の目的は、前記の産物を調
製するための方法を提供することである。
【００３５】本発明のなお別の目的は、前記のベクター
を調製するための方法を提供することである。
【００３６】本発明のなおさらなる目的は、前記の組成
物を調製するための方法を提供することである。
【００３７】そして、本発明のさらなる目的は、前記の
産物、ベクターおよび組成物を使用するための方法を提
供することである。この方法は、免疫化療法などによる
免疫学的応答を得るための方法を含む。そのような免疫
化療法において、前記の産物、ベクターおよび／または
組成物は、単独で、あるいは不活性化されたレンチウそ
して、本発明のさらなる目的は、前記の産物、ベクター
および組成物を使用するための方法を提供することであ
る。この方法は、免疫化療法などによる免疫学的応答を
得るための方法を含む。そのような免疫化療法におい
て、前記の産物、ベクターおよび／または組成物は、単
独で、あるいは不活性化されたレンチウイルス、レトロ
ウイルスまたは組換えサブユニット調製物による初期／
追加免疫形状で投与される：例えば、不活性化した感染
細胞ワクチンまたは免疫学的または免疫原性の組成物
（ＩＣＶ）（個々のＩＣＶなど）による初期／追加免疫
形状で投与される。
【００３８】従って、本発明は、組換えの免疫学的な免
疫原性またはワクチン組成物、および標的種においてレ
ンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイル
スの抗原暴露から保護することなどにより応答を増強さ
せることにおけるそれらの利用に関する。
【００３９】
【課題を解決するための手段】より具体的には、本発明
は、応答（レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫
不全症ウイルスに対する保護的な免疫応答など）を増強
するための安全な免疫化ビヒクルとして使用するための
外来遺伝子の挿入および発現に必要な哺乳動物ベクター
系に関する。
【００４０】従って、本明細書中の目的によれば、本発
明は、哺乳動物ベクター系に関する。このベクター系
は、以下のウイルスの遺伝子産物（例えば、目的のエピ
トープを含む遺伝子産物）を発現する：レンチウイル
ス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（ＥＩＡ
Ｖ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶなど：ネコ免
疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）が現在のところ好まし
い）。本発明は、免疫原性および／または免疫学的およ
び／またはワクチンの組成物に関する。このような組成
物は、以下のウイルスの暴露に対する免疫学的および／
または保護的な応答を、標的宿主（例えば、ＦＩＶおよ
びネコ（飼いネコまたは子ネコ））に投与したときに誘
導する：レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不
全症ウイルス（ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまた
はＳＩＶなど）。
【００４１】さらなる本明細書中の目的でのある局面に
おいて、本発明は、以下の哺乳動物ベクターを含む（例
えば、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ヘルペス
ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、アルファウイ
ルス、ポリオウイルス、アデノウイルスまたはＤＮＡベ
クター系；好ましくは、ポックスウイルス）。このよう
な哺乳動物ベクターは、レンチウイルス、レトロウイル
スまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩ
Ｖ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましくはＦＩＶ）
の目的エピトープを発現する。目的のエピトープは、好
ましくは、Ｇａｇ／プロテアーゼである。ベクターは、
高度に相同的な抗原の暴露に対する標的種（例えば、ネ
コ）の保護において有用である。従って、本発明は、ベ
クターおよび必要に応じて受容可能なキャリアまたは希
釈剤を含む免疫学的な免疫原性またはワクチン組成物を
包含する。
【００４２】本明細書中の目的による別の局面におい
て、本発明は、免疫学的応答（好ましくは、保護的な応
答）を誘導するための方法を含む。この方法は、ベクタ
ーまたはベクターを含む組成物を宿主に投与することを
含む。この方法は免疫化療法であり得る。この免疫化療
法は、例えば、ベクターまたはベクターを含む組成物に
より最初に行われ（そして、レンチウイルス、レトロウ
イルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＦＩＶ）の
目的エピトープの遺伝子産物を発現する）、そして個々
のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウ
イルスのサブユニット調製物（例えば、ＦＩＶの不活性
化全細胞（ＩＣＶ）調製物）を用いるか、または個々の
レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイ
ルスの組換えサブユニット調製物（例えば、そのような
ものをコードする外因性の核酸分子を含有する組換え体
の発現からからそのようもの単離することから得られる
ＦＩＶの目的エピトープ）を用いて追加免疫して、同種
および異種のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免
疫不全症ウイルス集団から宿主（例えば、ネコ）を保護
するなどの免疫学的応答を増強する。
【００４３】本発明のさらなる目的は、公知の組換えポ
ックスウイルスワクチンと比較して、安全性のレベルが
増大している組換えポックスウイルスの抗原、ワクチン
または免疫学的組成物を提供することである。
【００４４】本発明のさらなる目的は、宿主において遺
伝子産物を発現するために改変されたベクターを提供す
ることである。この場合、このベクターは、宿主におけ
る毒力が低減されるように改変される。
【００４５】本発明の別の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
培養される細胞内で遺伝子産物を発現するための方法を
提供することである。この方法は、安全性のレベルが増
大している改変された組換えウイルスまたは改変された
ベクターを使用する。
【００４６】本発明のこれらの目的および利点および他
の目的および利点は、以下を考察した後ではより容易に
明らかになる。
【００４７】さらなる局面において、本発明はベクター
に関する。好ましくは、不活性化されたウイルスコード
の遺伝子的機能を有する改変された組換えウイルスに関
し、その結果組換えウイルスは、弱毒化されて安全性が
増強される。この機能は、本質的ではあり得ないか、ま
たは毒力（例えば、本質的）と結合し得る。ウイルスは
ポックスウイルスが好都合であり、特にワクシニアウイ
ルスまたはアビポックスウイルス（鶏痘ウイルスおよび
カナリアポックスウイルスなど）が好都合である。好ま
しくは改変された組換えウイルスであるベクターは、ウ
イルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、異種
のＤＮＡ配列を含むことができる。この異種ＤＮＡ配列
は、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症
ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶ
またはＳＩＶ；好ましくはネコ免疫不全症ウイルス）に
由来する抗原またはエピトープ（例えば、Ｅｎｖ、Ｇａ
ｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体（例えば、Ｔａｔ、Ｒｅｖ）
または以下のようなそれらの任意の組合せをコードす
る：Ｇａｇ−ＰｏｌまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏ
ｌまたはＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎｖの一部、Ｇａ
ｇおよびＰｏｌの一部（プロテアーゼ、またはＧａｇ−
プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアー
ゼを含むＰｏｌの一部など）など。
【００４８】別の局面において、本発明は、抗原性で免
疫学的、免疫原性またはワクチンの組成物、あるいは抗
原性または免疫学的または保護的な応答を、該組成物が
接種された宿主動物（ネコ（例えば、飼いネコまたは子
ネコ）など）において誘導するための治療組成物に関す
る。この組成物は、キャリアおよび考案されたベクター
（好ましくは、不活性化された非必須ウイルスコードの
遺伝子的機能を有する改変された組換えウイルスであ
り、その結果組換えウイルスは弱毒化されて安全性が増
強される）、あるいはそのようなベクターまたは改変さ
れた組換えウイルスの発現産物を含むことができる。本
発明による組成物（または組成物において使用される産
物を発現するための）ウイルスは、ポックスウイルスが
好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポッ
クスウイルス（鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウ
イルスなど）が好都合である。改変された組換えウイル
スは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内
に、抗原性タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を含
むことができる。このようなタンパク質は、例えばレン
チウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス
（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳ
ＩＶ；好ましくはネコ免疫不全症ウイルス）に由来する
目的エピトープ（抗原など、例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、
プロテアーゼ、またはそれらの任意の組合せ（Ｇａｇ−
プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアー
ゼなど））である。
【００４９】なお別の局面において、本発明は、抗原性
の免疫学的、免疫原性、ワクチン（保護的）および／ま
たは治療的応答を、宿主動物（ネコ（飼いネコまたは子
ネコ）など）で、例えばそのような応答を必要とする宿
主動物において誘導するための方法に関する。この方法
は、応答を得るために効果的な量の本発明の上記組成物
を、単独で、あるいは初期−追加免疫療法（例えば、本
発明の組成物を投与するか、あるいは不活性化されたレ
ンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイル
スまたはＩＣＶまたはＩＷＶのいずれかまたは両方を、
本発明の組成物を投与する前またはその後のいずれかで
投与する療法）の一部としてのいずれかで投与すること
を含む。
【００５０】さらなる局面において、本発明は、本発明
のベクター（弱毒化されて安全性が増強されている改変
された組換えウイルスなど）を細胞に導入することによ
って、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞内で遺伝子産物を発現す
るための方法に関する。ベクターまたは改変された組換
えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必
須領域内に、抗原タンパク質などの目的のエピトープを
コードする異種のＤＮＡ配列を含むことができる。この
ような抗原タンパク質は、例えば、レトロウイルス、レ
ンチウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩ
ＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましく
はネコ免疫不全症ウイルス）に由来し、例えば、Ｅｎ
ｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体（例えば、Ｔａｔ、
Ｒｅｖ）、または以下のようなそれらの任意の組合せな
どである：Ｇａｇ−Ｐｏｌ、またはＥｎｖ、Ｇａｇおよ
びＰｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎｖの一
部、ＧａｇまたはＰｏｌの一部分（この場合、その部分
は、プロテアーゼ、またはＧａｇ−プロテアーゼまたは
Ｅｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼを含むことができ
る）。遺伝子産物は細胞から集めることができる。ある
いは、次いで細胞を動物に直接、再注入することがで
き、あるいは細胞は、再注入に必要な特異的な反応性を
増幅するために使用することができる（エクスビボ治
療）。
【００５１】従って、特定のさらなる局面において、本
発明は、ベクター、好ましくは弱毒化されて安全性が増
強されている改変された組換えウイルスを細胞に導入す
ることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞内で
遺伝子産物を発現するための方法に関する。ベクターま
たは改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必
須領域内または非必須領域内に、目的のエピトープまた
は抗原タンパク質をコードする異種のＤＮＡ配列を含む
ことができる。このような抗原タンパク質は、例えば、
レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイ
ルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまた
はＳＩＶ；好ましくはネコ免疫不全症ウイルス）に由来
し、例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体
（例えば、Ｔａｔ、Ｒｅｖ）、または以下のようなそれ
らの任意の組合せなどである：Ｇａｇ−Ｐｏｌ、または
Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏ
ｌの一部分、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌの一部
分、この場合、その部分は、プロテアーゼ、またはＧａ
ｇ−プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテ
アーゼを含むことができる。次いで、産物を宿主に投与
して、応答を刺激することができる。
【００５２】抗体は、本発明のベクターまたは組換え体
あるいは本発明のベクターまたは組換え体の発現産物を
含む組成物により惹起させることができる。惹起された
抗体は、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不
全症ウイルス（ネコ免疫不全症ウイルスなど）を予防ま
たは処置するために宿主において有用であり得る。抗体
あるいは本発明のベクターまたは組換え体の発現産物
は、診断キット、アッセイまたは試験において有用であ
り、サンプル（血清など）におけるレンチウイルス、レ
トロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ネコ
免疫不全症ウイルス）、あるいはそれらの抗原、あるい
はそれらに対する抗体、あるいは本発明の組換え体の抗
原または抗体の存在または非存在を決定することができ
る。従って、本発明の一局面は、そのような抗体、診断
キット、アッセイまたは試験を含む。
【００５３】さらにさらなる局面において、本発明は、
改変された組換えウイルスに関する。このウイルスは、
非必須または必須のウイルスコードの遺伝子的機能がそ
の中で不活性化され、その結果ウイルスは弱毒化され
る。この改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノム
の必須領域内または非必須領域内に異種起源に由来する
ＤＮＡをさらに含有する。ＤＮＡは、レンチウイルス、
レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、Ｅ
ＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好まし
くは、ネコ免疫不全症ウイルス）の以下のような目的の
抗原またはエピトープをコードすることができる：例え
ば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体、または以
下のようなそれらの任意の組合せ（Ｇａｇ−Ｐｏｌ、ま
たはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＧａｇおよび
ＰｏｌまたはＥｎｖの一部分、ＧａｇおよびＰｏｌの一
部分：この場合、Ｐｏｌの部分は、プロテアーゼ、また
はＧａｇ−プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、および
プロテアーゼを含むことができる）。特に、遺伝子的機
能は、ビルエンス因子（例えば、必須領域）をコードす
るオープンリーデングフレームの欠失または破壊によっ
て、あるいは天然の宿主制限ウイルス（特に、連続的な
継代物および／またはプラーク精製（その後の継代を伴
うか伴わない）であることから弱毒化を呈する天然の宿
主制限ウイルス）の利用によって不活性化される。本発
明に従って使用されるウイルスは、ポックスウイルスが
好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポッ
クスウイルス（鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウ
イルスなど）が好都合である。
【００５４】好都合なことには、オープンリーデングフ
レームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ
５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌ（Ｇｏｅｂｅｌ
ら．、１９９０ａ、ｂに報告される用語による）、それ
らの任意の組合せからなる群から、好ましくはそれらの
任意の組合せからなる群から選択される。この点に関し
て、オープンリーデングフレームは、チミジンキナーゼ
遺伝子領域、出血領域領域、Ａ型封入体領域領域、血球
凝集素遺伝子領域、宿主域遺伝子領域またはラージサブ
ユニット、リボヌクオチドレダクターゼ；またはそれら
の任意の組合せを含む：好ましくは、それらの任意の組
合せである。ワクシニアウイルスの改変されたＣｏｐｅ
ｎｈａｇｅｎ株が、ＮＹＶＡＣとして同定された（Ｔａ
ｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９９２）。ＮＹＶＡ
ＣおよびＮＹＶＡＣ変異株は、必須領域がその中で欠失
または破壊されている。Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａ
ｌ．、１９９２のその後の刊行物に関して、それは、Ｔ
ａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９９２と同様に、
ワクシニアウイルスの必須領域の欠失に関する（従っ
て、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ変異株、あるいはＴａｒｔ
ａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９９２のウイルス（例え
ば、ＮＹＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ変異株）により教示さ
れるかまたはそれから明らかな変異株に関する）：例え
ば、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２。ＰＣＴ ＷＯ
９５／３００１８を参照のこと。ＮＹＶＡＣおよびＮＹ
ＶＡＣ変異株に関しては、米国特許第５，３６４，７７
３号および同第５，４９４，８０７号もまた参照のこ
と。しかし、他のワクシニアウイルス株（ＣＯＰＡＫ株
など）もまた、本発明の実施において使用することがで
きる。
【００５５】別の好ましい実施態様において、ベクター
は、弱毒化されたカナリアポックスウイルス（混合集団
でないカナリアポックスウイルスなど）である。例え
ば、Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒワクチン株は、ニワトリ胚線
維芽細胞での２００代を超える連続的な継代により弱毒
化され、それから得られる元となる種株は、寒天下の４
回の連続したプラーク精製を行い、そこからプラークク
ローンをさらに５回の継代により増幅した。そのような
カナリアポックスウイルスはＡＬＶＡＣと呼ばれる。
【００５６】カナポックスから得られるプラークの制限
消化の結果は、以下の通りである。ゲノムＤＮＡを、カ
ナリアポックスウイルス（カナポックス）のクローン化
されたプラーク単離物１，４および５から単離した。こ
れらのプラークから得られたＤＮＡおよびクローン化し
ていないカナリアポックスウイルスから得られたＤＮＡ
を制限酵素ＨｉｎｄIII、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化し、０．８％アガロースゲルで流した。ゲルを臭
化エチジウムで染色し、ＵＶ光線下で写真撮影を行った
（図１を参照のこと）。レーンに印を付ける：ｖ＝非ク
ローン化カナリアポックスウイルス、１＝プラーク１、
４＝プラーク４、および５＝プラーク４。１ｋｂの分子
量マーカーを左端のレーンで流した。制限プロフィール
は、種々のプラーク単離物の間に明らかな違いを示す。
プラーク１を、ＡＬＶＡＣ（ＣＰ ＰＰ）として選んだ。
【００５７】非クローン化カナリアポックスウイルスの
制限消化パターン（レーン＝ｖ）において、いくつかの
サブモーラーバンドを認めることができる。しかし、ク
ローン化されたプラークの場合、これらのサブモーラー
バンド（レーン：１、４および５）は、少なくともプラ
ーククローン化された単離体のいくつかではモーラー試
料になる。このことは、非クローン化のカナリアポック
スウイルス（カナポックス）が、制限プロフィールが異
なるゲノム変異体の混合物であることを示す。
【００５８】従って、ＡＬＶＡＣはカナポックスと異な
り、カナポックス以上に特徴的な特性を有し、カナポッ
クスより優れている。従って、ＡＬＶＡＣは、本発明の
実施における好ましいベクターである。特に、Ｒｅｎｔ
ｓｃｈｌｅｒ株のカナリアポックスウイルス（カナポッ
クス）は、制限分析からウイルス変異体の混合物である
ことを示す。すなわち、ＡＬＶＡＣが誘導されたカナポ
ックスは混合集団であった。カナポックスなどのワクチ
ン調製物が複数の変異体を含有することは、今回初めて
のことではない。ＡＬＶＡＣは混合集団ではない。従っ
て、ＡＬＶＡＣは、カナポックスが有さないいくつかの
特徴的な特性を有する。例えば、以下の通りである。
【００５９】ＡＬＶＡＣは、均一的な遺伝子背景を有す
る。この特性により、矛盾しない（一致した）ＡＬＶＡ
Ｃが得られる：ベクターに基づくワクチンを調製するた
めに有用であるという独特の特徴。一致していること
は、品質問題および定期的な検討に関して有用である。
ＡＬＶＡＣの一致しているというこの特性により、品質
管理および定期的な検討に合格する能力を有するＡＬＶ
ＡＣが得られ、すなわち、予想される遺伝子的特性を有
するベクターに基づくワクチンの開発において有用であ
る。
【００６０】生物学的一致性は、組換え体を得るために
ＡＬＶＡＣを使用して調節される。カナポックスは、生
物学的一致性を与えない。実際、カナポックスは、効果
的な組換え産物を矛盾することなく提供することができ
ない。生物学的一致性および一致した効果的な組換え産
物は有用である：例えば、毒力に関して、ウイルス／宿
主の相互作用に関して一致した生物学的プロフィールに
ついて、および究極的には免疫化ビヒクルとしての使用
について。ＡＬＶＡＣは、生物学的一致性および一致し
た効果的な組換え産物を達成する。カナポックスを組換
え体誘導において使用する場合、外来遺伝子が導入され
るウイルス背景に関するコントロールがない。従って、
得られる組換え体の特性は疑わしいままである（すべて
のワクシニアの遺伝子的背景は必ずしも免疫化ビヒクル
として等価でないことを明らかにするワクシニアウイル
スによる研究と比較すること）。ＡＬＶＡＣは、そのウ
イルス背景、毒力に関連するその特性、および免疫化ビ
ヒクルとしてのその機能性に関して確実性を提供する。
【００６１】本発明を、主として、カナリアポックスウ
イルス（ＡＬＶＡＣ）に基づくベクターを使用して説明
してきたが、発明はまた、本明細書中において、特定の
レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイ
ルスの遺伝子産物の発現、および免疫応答（保護的な免
疫応答など）を与えるためのそれらを利用することに権
利を有することを理解しなければならない。それ故、本
発明はまた、代替的な哺乳動物ベクター系に関する。そ
のようなベクター系の例には、他のポックスウイルス、
アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス
に基づく系、細菌発現系、およびＤＮＡに基づく免疫原
処方物が含まれる。
【００６２】本発明を、主として、レンチウイルスのＦ
ＩＶを使用して説明してきたが、本発明はまた、本明細
書中において、他のレンチウイルスおよびレトロウイル
スおよび免疫不全症ウイルスの系に由来するＦＩＶ遺伝
子産物の機能的ホモログの発現に権利を有することを理
解しなければならない：例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ／プロ
テアーゼ（すなわち、Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌまた
はＰｏｌの一部分、またはＧａｇおよびＰｏｌまたはＰ
ｏｌの一部分：この場合、Ｐｏｌの部分は以下のものを
を含むことができる；プロテアーゼ（Ｅｎｖを有しな
い）、またはＥｎｖ、Ｇａｇ、プロテアーゼまたはＧａ
ｇ−プロテアーゼ（Ｅｎｖを有しない）またはＥｎｖ、
Ｇａｇ、ＰｏｌまたはＰｏｌの一部分および補助的機能
体（例えば、Ｔａｔ、Ｒｅｖ）またはＧａｇ、Ｐｏｌま
たはＰｏｌの一部分（この場合、Ｐｏｌの部分は、プロ
テアーゼおよび補助的な機能体（Ｅｎｖを有しない）ま
たはＥｎｖ、Ｇａｇプロテアーゼおよび補助的な機能体
またはＧａｇ−プロテアーゼおよび補助的な機能体（Ｅ
ｎｖを有しない）を含むことができる）；特に、ＥＩＡ
Ｖ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶのものであ
る）。それ故、本発明は他のレンチウイルス系に関し、
これには、ヒト免疫不全症ウイルス−１、−２（ＨＩＶ
−１、ＨＩＶ−２）、ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩ
Ｖ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびに
他の哺乳動物のレンチウイルスが含まれる。
【００６３】これらの実施態様および他の実施態様は開
示される、あるいは以下の詳細な説明から明らかであ
り、そしてそれにより包含される。
【００６４】（寄託）以下のものは、ブタペスト条約の
条件下でＡＴＣＣに寄託されている。
【００６５】
【表１】 従って、本発明は核酸分子を包含する。これには、寄託
された物質内の配列を有するコード産物、ならびにそれ
らに実質的な（例えば、少なくと８５％の相同性で）相
同性を有する核酸分子が含まれる。
【００６６】
【発明の実施の形態】（発明の詳細な説明）上で述べら
れているとおり、本発明は、好ましいポックスウイルス
ベクターとしてＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶ
ＡＣ（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、最も好まれ、そ
してＡＬＶＡＣは、特に好ましい）のような弱毒化ポッ
クスウイルスと共に、ベクター基礎のレンチウイルス、
レトロウイルス、または免疫欠損ウイルス、例えばＥＩ
ＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ、好ましく
はネコの免疫欠損ウイルス（ＦＩＶ）組換え体、好まし
くは目的のエピトープ（類）をコードするＤＮＡを含有
する組換え体、さらに好ましくはＥｎｖ、Ｇａｇまたは
Ｐｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌまたはＰｏｌの一
部、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＰｏｌ
またはＧａｇの一部およびプロテアーゼ、またはＥｖ
ｎ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼのようなそれらの組合
せ；そして発明の組換え体およびそれらの発現産物を含
有する組成物；および発明の組換え体、それらの発現産
物、およびその組換え体および／または発現産物を含有
する組成物を製造する方法および使用する方法に関す
る。
【００６７】したがって、一般的方法で、本発明は、少
なくとも１種のレンチウイルス・エピトープをコードす
る外因性ＤＮＡを包含するベクターを提供する。エピト
ープは、ＳＩＶ以外のレンチウイルスから得ることがで
きる。さらに好ましくは、エピトープは、Ｇａｇおよび
ＰｏｌまたはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎ
ｖ、ＧａｇおよびＰｏｌまたはＧａｇの一部およびＰｏ
ｌまたはＧａｇ−プロテアーゼの一部、またはＥｎｖ、
Ｇａｇおよびプロテアーゼのもの；そして最も好ましく
は、エピトープは、Ｇａｇ上のＧａｇおよびプロテアー
ゼまたはエピトープ（類）、およびＧａｇおよびプロテ
アーゼと同じかまたは類似する反応を引出すＧａｇおよ
びプロテアーゼである。そして、標的種（標的種は、レ
ンチウイルスにに罹りやすい宿主であり、例えば、家ネ
コおよび小ネコのようなネコは、ＦＩＶに対する標的種
である）に投与した場合、ベクターは、好ましくは免疫
反応を、さらに好ましくは保護的免疫反応を導入する。
【００６８】ベクターまたは組換え体を造る方法は、米
国特許第４，６０３，１１２号、４，７６９，３３０
号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１
号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７
号、第５，５０３，８３４号、第４，７２２，８４８
号、第５，５１４，３７５号、英国特許ＧＢ２ ２６９
８２０Ｂ、国際公開ＷＯ９２／２２６４１号、国際公開
ＷＯ９３／０３１４５号、国際公開ＷＯ９４／１６７１
６号、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６６５２号、Ｐａｏｌｅｔ
ｔｉの「ポックスベクターをワクチン化する使用法」の
１９９４年１月１９日に出願された特許が付与された米
国特許出願番号第０８／１８４，００９号；Ｍｏｓｓの
「組換え体遺伝子発現、ワクチン化および安全性につい
ての遺伝子操作されたポックスウイルス；現状」のＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３４９−１１３５３、１９９６
年１０月、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ．Ｄ．（編集
者）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ３９、１９９６年１０月のＰＮＡＳ ＵＳＡ
９３：１１３４１−１１３４８；「バキュロウイルス
発現プロトコール」（１９９５年、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ Ｉｎｃ．）、Ｓｍｉｔｈら、「バキュロウイル
ス発現ベクターで感染させた昆虫細胞でのヒト・ベータ
インターフェロンの生成」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎ
ｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻、１２号、
２１５６−２１６５頁、１９８３年１２月；Ｐｅｎｎｏ
ｃｋら、「バキュロウイルスベクターに感染した細胞で
のエッシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）のＢ−ガラクトシダーゼの強力なそして制御さ
れた発現」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻、３号、３９９−４０６
頁、１９８４年３月；欧州特許ＥＰＡ ０３７０ ５７３
号、１９８６年１０月１６日に出願された米国特許出願
番号第９２０，１９７号、欧州特許公報番号第２６５７
８５号、米国特許第４，７６９，３３１号、Ｒｏｉｚｍ
ａｎの「単純ヘルペスウイルス遺伝子の機能：新規ベク
ターの遺伝子操作のためのプライマー」、ＰＮＡＳ Ｕ
ＳＡ ９３：１１３０７−１１３１２、１９９６年１０
月；Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙら、「実験的な脳腫瘍の治療
への遺伝子操作された単純ヘルペスウイルスの使用法」
ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：１１３１３−１１３１８頁、１
９９６年１０月；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、「Ｂリンパ球
への遺伝子送出のためのエプスタイン−バー・ウイルス
ベクター」ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：１１３３４−１１３
４０頁、１９９６年１０月；Ｆｒｏｌｏｖら、「アルフ
ァウイルス基礎の発現ベクター：攻略法および使用法」
ＰＮＡＳＵＳＡ９３：１１３７１−１１３７７頁、１９
９６年１０月；Ｋｉｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５
巻、３０６８−３０７５頁、１９９１年；Ｇｒｕｈａｕ
ｓら、１９９２、「クローニングベクターとしてのアデ
ノウイルス」Ｓｅｍｉａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
（３巻）、２３７−５２頁、１９９３年、Ｂａｌｌａｙ
ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、４巻、３８６１−６５
頁、Ｇｒａｈａｍ、Ｔｉｂｔｅｃｈ ８、８５−８７
頁、１９９０年４月；Ｐｒｅｖｅｃら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖ
ｉｒｏｌ． ７０、４２９−４３４頁；１９９６年７月
３日に出願された米国出願番号第０８／６７５，５５６
号および第０８／６７５，５６６号；ＰＣＴのＷＯ９１
／１１５２５号、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６９巻、２５５０−２５６１頁（１９９４
年）；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９頁：１７４６−４９頁、
１９９３年、およびＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓら、「単独で
または組合せで糖タンパクＤまたは糖タンパクＢをコー
ドするＤＮＡワクチンを用いた免疫化が、単純ヘルペス
疾患の動物モデルでの保護的免疫性を誘導する」ＰＮＡ
Ｓ ＵＳＡ ９３：１１４１４−１１４２０、１９９６年
１０月に開示される方法によるものであるか、またはそ
れに類似する。ワクシニアウイルスおよびさらに最近の
他のポックスウイルスが、外来遺伝子の挿入および発現
のために使用された。外来遺伝子を生きた感染性ポック
スウイルスに挿入する基本技術が、供与プラスミドでの
外来遺伝子要素を隣接するポックスＤＮＡ配列と、奪取
ポックスウイルスに存在する相同の配列との間の組換え
に関与する（Ｐｉｃｃｉｎｉら、１９８７年）。
【００６９】特に、組換え体ポックスウイルスは、当業
界で知られ、そして米国特許第４，７６９，３３０号、
第４，７７２，８４８号、第４，６０３，１１２号、第
５，１１０，５８７号、第５，１７９，９９３号、第
５，５０５，９４１号、および第５，４９４，８０７号
に記述されたワクシニアウイルスおよびアビポックスウ
イルスのような合成組換え体のポックスウイルスを造る
方法に類似する２つの段階で構築できる。これらの開示
は、ここに引用される全ての文献の開示と同様に、参照
してここに組込まれる。
【００７０】第一に、ウイルスに挿入されるべきＤＮＡ
遺伝子配列、例えばポックスウイルスのＤＮＡの区分に
相同なＤＮＡが挿入された非ポックスウイルスから得た
開放読取枠を、イー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド
構築物のようなプラスミド構築物に入れる。別に、挿入
されるべきＤＮＡ遺伝子配列は、プロモーターにライゲ
ートできた。プロモーター遺伝子連結は、プラスミド構
築物に位置決めされ、その結果プロモーター遺伝子連結
は、ポックスＤＮＡの領域を挟むＤＮＡ配列に相同なＤ
ＮＡによって両方の末端で挟まれる。例えば、ポックス
ＤＮＡは、必須でない遺伝子座を含む（基礎的な遺伝子
座も、使用できる）。その後、生じるプラスミド構築物
を、例えば、イー．コリ細菌内での成長によって増幅し
（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９７２年）、そして単離する（Ｃ
ｌｅｗｅｌｌら、１９６９年；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１
９８２年）。代わりに、プロモーターと別のライゲーシ
ョンなしのＤＮＡ遺伝子配列は、単にプラスミド構築物
内に入れて、その結果ＤＮＡ遺伝子配列は、ポックスＤ
ＮＡの領域を挟むＤＮＡ配列に相同なＤＮＡによって両
方の末端に挟まれる；例えば、したがって、遺伝子配列
の発現が、プロモーターの制御下であるような外因性プ
ロモーターから下流の領域、およびＤＮＡ遺伝子配列の
コーディング部分が隣接する。
【００７１】第二に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列
を含む単離プラスミドを、ポックスウイルスと一緒に、
トリの胚フィブロブラストのような細胞培養物にトラン
スフェクトさせる。プラスミド中の相同のポックスＤＮ
Ａと、ウイルスのゲノムとの間の組換えは、それぞれ、
外来ＤＮＡ配列の、例えばそれのゲノムの必須でない領
域での存在によって修飾されたポックスウイルスを付与
する。語句「外来」ＤＮＡは、外因性ＤＮＡが入れられ
るゲノムによって元来生成されない遺伝子産物について
コードする外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源から得たＤ
ＮＡを意図する。
【００７２】しかし、先述のものは、ベクターまたは組
換え体、例えばポックスウイルス−レンチウイルス、レ
トロウイルスを得るためのあらゆる方法として、本発明
のベクターまたは組換え体を得るための手段を限定する
ことを意図せず、および／または免疫欠損ウイルス、例
えばネコの免疫欠損ウイルス、組換え体は、本発明を得
るのに使用できる。
【００７３】したがって、遺伝的組換えは、一般に、２
つのＤＮＡの株の間のＤＮＡの相同な画分の交換であ
る。ある種のウイルスでは、ＲＮＡは、ＤＮＡを置換で
きる。核酸の相同の画分は、ヌクレオチド塩基の同一の
配列を示す核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の画分である。
【００７４】遺伝的組換えは、感染した宿主細胞内の新
規ウイルスのゲノムの複製または製造のあいだに自然に
生じうる。したがって、ウイルス遺伝子の間の遺伝的組
換えは、２つまたはそれ以上の様々なウイルスまたは他
の遺伝子構築物と同時感染される宿主細胞に起こるウイ
ルスの複製サイクルの間に生じる可能性がある。第一の
ゲノムから得たＤＮＡの画分は、ＤＮＡが第一のウイル
スゲノムのものと相同である第二の同時感染ウイルスの
ゲノムの画分を構築する時に相互に交換可能に使用され
る。
【００７５】しかし、組換えは、完全に相同でない様々
なゲノムでのＤＮＡの画分の間でも起りうる。１つのそ
のような画分が、例えば相同なＤＮＡの一部に挿入され
た抗遺伝子決定基をコードする遺伝子マーカーまたは遺
伝子の第一の画分内に存在することを除き、別のゲノム
の画分と相同な第一のゲノムから由来する場合、組換え
は、依然として生じることができ、そしてその後、その
組換えの産物は、組換えウイルスゲノム中のその遺伝子
マーカーまたは遺伝子の存在によって検出できる。した
がって、組換えワクシニアウイルスのような組換えポッ
クスウイルスを生成する更なる攻略法が、最近報告さ
れ、そしてこれらの攻略法は、本発明の実施に使用でき
る。
【００７６】修飾感染性ウイルスによって挿入されたＤ
ＮＡ遺伝子の配列を首尾よく発現するのは、２つの条件
下で起こりうる。第一に、挿入は、修飾されたウイルス
が、生存できるままにするためにウイルスの必須でない
領域に、またはそれにより必須の機能が中断されない
か、またはその機能が全ての条件下で生存可能なために
必須でない領域にできる。
【００７７】挿入ＤＮＡの発現のための第二の条件は、
挿入ＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターの存在であ
る。そのプロモーターは、発現されるべきＤＮＡ配列の
コーディング領域から上流に位置しうる。
【００７８】ワクシニアウイルスは、疱瘡に対して首尾
よく免疫化するのに使用され、それにより１９８０年以
来疱瘡の世界規模の撲滅を完了させた。その歴史の経路
で、多くのワクシニアの株が作られた。これらの様々な
株は、免疫原性が変化することを示し、そして潜在的複
雑さを示す可変の程度まで影響され、それらの最も重大
なのは、後期ワクシニア脳炎および全身化ワクシニアで
ある（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ、１９８３年）。
【００７９】疱瘡の撲滅について、外来遺伝子の発現の
ための遺伝子操作されたベクターものであるワクシニア
の新たな役割は、重要になった。莫大な数の異種の抗原
をコードする遺伝子が、ワクシニアで発現され、しばし
ば対応の病原による対抗に対する保護的免疫性を生じた
（Ｔａｒｔａｇｌｉａらで再検討された、１９９０
ａ）。
【００８０】ワクシニアベクターの遺伝的背景は、発現
外来免疫原の保護効率に影響されることが示されてき
た。例えば、ワクシニアウイルスのウエイスのワクチン
株内でのエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ
３４０の発現は、ＥＢＶウイルス誘発リンパ腫に対して
コットントップ・タマリンを保護しなかった一方で、ワ
クシニアウイルスのＷＲの実験室株にある同じ遺伝子の
発現は、保護的であった（Ｍｏｒｇａｎら、１９８８
年）。
【００８１】ワクシニアウイルス基本の組換え体ワクチ
ン候補の効力および安全性との間の細かなバランスは、
厳密に重要である。組換えウイルスは、ワクチンを与え
たが、なんら顕著な病原特性を欠く動物での保護的免疫
反応を引出す方法で、免疫原を表すに違いない。したが
って、ベクター株の弱毒化は、技術の現状を超えて非常
に望ましい利点である。
【００８２】組織培養中のウイルスの成長に必須でな
く、その欠失または不活性化が様々な動物系で毒性を減
少させた、多くのワクシニア遺伝子が確認された。
【００８３】ワクシニアウイルス・チミジンキナーゼ
（ＴＫ）をコードする遺伝子がマッピングされ（Ｈｒｕ
ｂｙら、１９８２年）、そしてシーケンシングされた
（Ｈｒｕｂｙら、１９８３年；Ｗｅｉｒら、１９８３
年）。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化または完全な
欠失は、組織培養中の広範な細胞中のワクシニアウイル
スの成長を避けない。ＴＫ−ワクシニアウイルスは、様
々な経路により、様々な宿主での接種の部位でインビボ
で複製する能力もある。
【００８４】ＴＫ−ウイルスでモルモットを膣内接種す
ると、ＴＫ＋ウイルスで接種したものより脊椎で明かに
低いウイルス力価を生じることが、単純ヘルペスウイル
ス２型について分かっている（Ｓｔａｎｂｅｒｒｙら、
１９８５年）。ヘルペスウイルスにコードされたＴＫ活
性が、細胞を活発に代謝する上でウイルスの成長にとっ
て重要でないが、静止細胞でのウイルス成長には必要で
あることが例示された（Ｊａｍｉｅｓｏｎら、１９７４
年）。
【００８５】ＴＫ−ワクシニアの弱毒化は、大脳内およ
び腹膜内経路によって接種したマウスで示された（Ｂｕ
ｌｌｅｒら、１９８５年）。ＷＲの神経毒性の実験室株
について、そしてウエイスのワクシニア株についての両
方の弱毒化が観察された。皮膚内経路によって接種され
たマウスでは、ＴＫ−組換えワクシニアは、親のＴＫ ＋
ワクシニアウイルスと比較して抗体を中和する同等の抗
ワクシニアを生成し、それによりこの試験系で、ＴＫ機
能の欠損は、ワクシニアウイルスベクターの免疫原性を
明かには減少しないことを示した。マウスにＴＫ−およ
びＴＫ＋組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）を鼻腔内
接種することに続いて、脳を含めた他の場所へのウイル
スの散在は明かに少ないことが分かった（Ｔａｙｌｏｒ
ら、１９９１ａ）。
【００８６】ヌクレオチド代謝に関与した別の酵素は、
リボヌクレオチドレダクターゼである。大きなサブユニ
ットをコードする遺伝子を欠失させることによる、単純
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）でのウイルスでコードされ
たリボヌクレオチドレダクターゼ活性の損失は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで細胞を分割する際のウイルス成長およびＤ
ＮＡ合成に何の影響も及ぼさないことが示されたが、し
かし血清を欠乏させた細胞での清澄に対するウイルスの
能力を重篤に傷つけた（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９８
８年）。目の急性ＨＳＶ感染および三叉神経節での反応
しうる潜在性感染のマウスモデルを用いて、野生型ＨＳ
Ｖによって示された毒性と比較して、リボヌクレオチド
リダクターゼの大きなサブユニットの欠失されたＨＳＶ
について毒性が減少させたことが例示された（Ｊａｃｏ
ｂｓｏｎら、１９８９年）。
【００８７】リボヌクレオチドリダクターゼの小さな
（Ｓｌａｂａｕｇｈら、１９８８年）および大きな（Ｓ
ｃｈｍｉｄｔｔら、１９８８年）サブユニットの両方
が、ワクシニアウイルスで確認された。マウスの頭蓋内
接種によって測定した場合、ＷＲ株のワクシニアウイル
スにあるリボヌクレオチドリダクターゼの大きなサブユ
ニットの挿入的不活性化が、そのウイルスの弱毒化に至
る（Ｃｈｉｌｄら、１９９０年）。
【００８８】ワクシニアウイルス・ヘマグルチニン遺伝
子（ＨＡ）は、マッピングされそしてシーケンシングさ
れている（Ｓｈｉｄａ、１９８６年）。ワクシニアウイ
ルスのＨＡ遺伝子は、組織培養での成長には必須でない
（Ｉｃｈｉｈａｓｈｉら、１９７１年）。ワクシニアウ
イルスのＨＡ遺伝子を不活性化すると、頭蓋内経路によ
って接種されたウサギで神経毒性が減少する（Ｓｈｉｄ
ａら、１９８８年）。ＨＡ遺伝子座は、ワクシニアウイ
ルスのＷＲ株（Ｓｈｉｄａら、１９８７年）、リスター
株（Ｓｈｉｄａら、１９８８年）およびコペンハーゲン
株（Ｇｕｏら、１９８９年）の外来遺伝子の挿入のため
に使用した。外来遺伝子を発現する組換え体ＨＡ−ワク
シニアウイルスは、免疫原性であること（Ｇｕｏら、１
９８９年；Ｉｔａｍｕｒａら、１９９０年；Ｓｈｉｄａ
ら、１９８８年；Ｓｈｉｄａら、１９８７年）、そして
同等の病原による対抗に対して保護的であること（Ｇｕ
ｏら、１９８９年；Ｓｈｉｄａら、１９８７年）が示さ
れた。
【００８９】牛痘（ブライトン・レッド株）は、ニワト
リの卵の漿尿膜の赤い（出血性）痘疹を生じる。牛痘ゲ
ノム内の突発性欠失が、白色痘疹を生じる突然変異体を
発生させる（Ｐｉｃｋｕｐら、１９８４年）。出血機能
（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた３８ｋＤａ
のタンパク質にマッピングする（Ｐｉｃｋｕｐら、１９
８６年）。セリンプロテアーゼ阻害剤に相同性を示すこ
の遺伝子は、牛痘に対する宿主の炎症反応を阻害するこ
とが示され（Ｐａｌｕｍｂｏら、１９８９年）、そして
血液凝固の阻害剤である。
【００９０】ｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのWR株に
存在する（Ｋｏｔｗａｌら、１９８９年ｂ）。ｕ領域
が、外来遺伝子の挿入によって不活性化されたＷＲワク
シニアウイルス組換え体を接種したマウスは、ｕ遺伝子
が不活性である同様の組換え体ワクシニアウイルスを接
種したマウスと比較して、外来遺伝子産物に高いレベル
の抗体を生じる（Ｚｈｏｕら、１９９０年）。ｕ領域
は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株で欠乏性の
機能しない形態で存在する（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０
年ａ、ｂに報告された技術による開放読取枠Ｂ１３およ
びＢ１４）。
【００９１】牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴ
Ｉ）中の感染細胞に位置する（Ｋａｔｏら、１９５９
年）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播の間牛痘
ウイルスビリオンの保護であると考えられる（Ｂｅｒｇ
ｏｉｎら、１９７１年）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は、
ＡＴＩ体のマトリックスを形成する１６０ｋＤａのタン
パク質をコードする（Ｆｕｎａｈａｓｈｉら、１９８８
年；Ｐａｔｅｌら、１９８７年）。そのゲノムに相同な
領域を含むが、ワクシニアウイルスは、一般にＡＴＩを
生成しない。ワクシニアのＷＲ株では、ゲノムのＡＴＩ
領域を、９４ｋＤａタンパク質として翻訳する（Ｐａｔ
ｅｌら、１９８８年）。ワクシニアウイルスのコペンハ
ーゲン株では、ＡＴＩ領域に対応するＤＮＡ配列のほと
んどが、ＡＴＩ領域から上流の配列と融合した領域の残
りの３’末端と一緒に欠失されて、開放読取枠（ＯＲ
Ｆ）Ａ２６Ｌを形成する（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年
ａ、ｂ）。
【００９２】様々な自発的（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ
ら、１９８９年；Ｄｒｉｌｌｉｅｎら、１９８１年；Ｌ
ａｉら、１９８９年；Ｍｏｓｓら、１９８１年；Ｐａｅ
ｚら、１９８５年；Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８１年）
および遺伝子操作された（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９１
年；Ｐｅｒｋｕｓら、１９８９年；Ｐｅｒｋｕｓら、１
９８６年）欠失が、ワクシニアウイルスゲノムの左末端
に隣接することが報告された。１０ｋｂの自発性欠失を
示すワクシニアウイルスのＷＲ株（Ｍｏｓｓら、１９８
１年；Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８１年）は、マウスで
頭蓋内接種することによって弱毒化されることが示され
た（Ｂｕｌｌｅｒら、１９８５年）。この欠失は、１７
個の潜在的ＯＲＦを含むことが後に示された（Ｋｏｔｗ
ａｌら、１９８８年ｂ）。欠失領域内の特異的遺伝子
は、バイロキンＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質を包
含する（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年ａ、ｂで報告され
た技術によってＣ３Ｌ）。Ｎ１Ｌの挿入不活性化は、正
常およびヌードマウスの両方に頭蓋内接種することによ
って毒性を減少させる（Ｋｏｔｗａｌら、１９８９年
ａ）。３５ｋＤａタンパク質は、ワクシニアウイルス感
染細胞の培地に、Ｎ１Ｌのように分泌される。そのタン
パク質は、相補な対照タンパク質、特に相補な４Ｂ結合
タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のファミリーと相同性を含む
（Ｋｏｔｗａｌら、１９８８年ａ）。細胞性Ｃ４ｐｂの
ように、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は、相補物
の４番目の要素を結合し、そして古典的相補カスケード
を阻害する（Ｋｏｔｗａｌら、１９９０年）。したがっ
て、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は、宿主の防御
機構をすり抜ける上でウイルスを助けることに関与する
ように見える。
【００９３】ワクシニアゲノムの左の末端は、宿主範囲
の遺伝子Ｋ１Ｌ（Ｇｉｌｌａｒｄら、１９８６年）およ
びＣ７Ｌ（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９０年）と同定された
２つの遺伝子を包含する。これらの遺伝子の両方を欠失
されることは、様々なヒト・セルラインで清澄するワク
シニアウイルスの能力を減少させる（Ｐｅｒｋｕｓら、
１９９０年）。
【００９４】新たなワクシニアワクチン株ＮＹＶＡＣ
（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニアウイルス
のコペンハーゲンワクチン株は、公知または潜在性毒性
因子をコードするゲノムの６つの非必須領域の欠失によ
って修飾された。連続欠失は、米国特許番号第５，３６
４，７７３号および第５，４９４，８０７号に詳説され
る。ワクシニア制限断片、開放読取枠およびヌクレオチ
ド位置の全ての名称は、Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年
ａ、ｂで報告された技術に基づく。
【００９５】欠失遺伝子座は、外来遺伝子の挿入のため
の授与遺伝子座としても操作された。
【００９６】ＮＹＶＡＣ中で欠失された領域は、下に列
記される。さらに列記されるのは、略号および欠失領域
のための開放読取枠の名称であり（Ｇｏｅｂｅｌら、１
９９０年ａ、ｂ）、そしてワクシニア組換え体（ｖＰ）
の名称は、特定化された欠失による全ての欠失を含む： （１）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４
１０； （２）出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５
３； （３）Ａ型封入体領域（ＡＴＩ、Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１
８； （４）ヘマグルチニン領域（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２
３； （５）宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０
４；および （６）大きなサブユニットのリボヌクレオチドレダクタ
ーゼ（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。
【００９７】ＮＹＶＡＣは、一般に、毒性に関連した遺
伝子産物をコードする１８個の開放読取枠および宿主範
囲の特定の欠失によって生じた遺伝子操作ワクシニアウ
イルス株である。ＮＹＶＡＣは、ｉ）、新生マウスで大
脳内接種後毒性が減少したこと、ｉｉ）遺伝的に（ｎｕ
＋／ｎｕ ＋）または化学的に（シクロホスファミド）免
疫を発揮できないマウスでの接種性、ｉｉｉ）免疫を発
揮できないマウスでの散在性感染を起こすのに失敗する
こと、ｉｖ）ウサギの皮膚に目立った硬化および腫瘍化
を欠くこと、ｖ）接種の部位からの迅速なクリアランス
およびｖｉ）ヒト起源のものを含めた多数の組織培養セ
ルラインでの複製能力が非常に減少されたことを含めた
多くの条件によって高度に弱毒化される。それにもかか
わらず、ＮＹＶＡｃ基本ベクターは、固有の免疫原に対
する素晴らしい反応を誘導し、保護的免疫を提供した。
【００９８】２つのさらなるワクシニアベクター系は、
自然に宿主を制限したポックスウイルス、アビポックス
ウイルスを使用することに関連する。鶏痘ウイルス（Ｆ
ＰＶ）およびカナリア痘ウイルス（ＣＰＶ）の両方は、
外来遺伝子産物を発現するように操作された。鶏痘ウイ
ルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルスファミリーの鳥類
のポックスウイルスのプロトタイプのウイルスである。
ウイルスは、生の弱毒化ワクチンを使用することによっ
て、１９２０年代以来十分に制御された家禽の経済的に
重要な疾患を引起こす。鳥類ポックスウイルスの複製
は、鳥類の種に限定され（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、１９８２
年）、そしてヒトを含めた全ての非鳥類の種での生産的
感染を引起こす鳥類ポックスウイルスの文献についての
報告はない。この宿主制限は、他の種に対するウイルス
の伝達に対する遺伝的安全性防御を提供し、そして獣医
学およびヒト用途でのワクチンベクターを、魅力的な計
画にする。
【００９９】ＦＰＶは、家禽の病原から得た抗原を発現
するベクターとして有利に利用された。毒性の鳥類イン
フルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質は、Ｆ
ＰＶ組換え体内で発現された（Ｔａｙｌｏｒら、１９８
８年ａ）。組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種した
後、同種または異種のいずれかの毒性インフルエンザウ
イルス対抗に対して保護的である免疫反応が、導入され
た（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８年ａ）。ニューキャッス
ル病ウイルスの表層糖タンパクを発現するＦＰV組換え
体も、開発されてきた（Ｔａｙｌｏｒら、１９９０年；
Edbauerら、１９９０年）。
【０１００】鳥類系に対するＦＰＶおよびＣＰＶの複製
のための宿主制限の代わりに、これらのウイルスから誘
導される組換え体が、非鳥類起源の細胞中の固有のタン
パク質を発現することが分かった。さらに、このような
組換え体ウイルスは、外来遺伝子産物に向けて指示さ
れ、そして対応の病原に対する対抗から保護できること
が適切であると示された免疫学的反応を引起こすことが
示された（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ、ｂ；
Ｔａｙｌｏｒら、１９９２年；１９９１年ｂ；１９８８
年ｂ）。
【０１０１】ＡＬＶＡＣ組換え体は、Ｐｉｃｃｉｎｉ
ら、１９８３年；Ｐｅｒｋｕｓら、１９９５年に詳述さ
れた方法、例えば、新規で非自明な産物がそれから生じ
るとき、新規で、そして本発明に関して非自明である組
換え体によってできる。
【０１０２】ＴＲＯＶＡＣは、１日齢のニワトリのヒナ
のワクチン化として許可されている鶏痘のＦＰ−１ワク
チン株から誘導されたプラーク−クローン化単離物であ
る弱毒化鶏痘に該当する。
【０１０３】ＡＬＶＡＣは、許可されたカナリヤポック
スウイルス、カナポックス（Ｋａｎａｐｏｘ）のプラー
ク−クローン化誘導体であった弱毒化カナリヤポックス
ウイルス基本のベクターである（Ｔａｒｔａｇｌｉａ
ら、１９９２年）。ＡＬＶＡＣは、カナポックスのある
種の一般的特性と同じ、ある種の一般的特性を示す。Ａ
ＬＶＡＣは、単モルのカナリアポックスウイルス種であ
る。
【０１０４】固有の免疫原を発現するＡＬＶＡＣ基本の
組換えウイルスは、ワクチンベクターとして有効である
ことも示された（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年
ａ、ｂ）。この鳥類ポックスウイルスは、生産的複製に
ついて鳥類の種に限定される。ヒト細胞培養で、カナリ
アポックスウイルス複製は、ウイルス性ＤＮＡ合成の前
にウイルスの複製サイクルで初期に中断される。それに
もかかわらず、固有の免疫原を発現するように操作され
る時に、真正な発現および経過が、哺乳類の細胞中、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで観察され、そして多数の哺乳類の種に
接種することが、固有の免疫原に対する抗体および細胞
免疫反応を導入し、そして同種の病原との対抗に対して
保護を供する（Ｔａｙｌｏｒら、１９９２年；Ｔａｙｌ
ｏｒら、１９９１年）。
【０１０５】カナリポックス／狂犬病の糖タンパク組換
え体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）のＡＬＶＡＣ組換え体の欧州
および米国の両方での最近のフェースＩの臨床治験は、
ＡＬＶＡＣワクチンが安全で、充分に耐性があることを
示し、そして例えば、抗体力価を中和する狂犬病ウイル
スの保護レベルを誘導した（Ｆｒｉｅｓら、１９９６
年；Ｐｉａｌｏｕｘら、１９９４年；Ｃａｄｏｚら、１
９９２年）。さらに、ＡＬＡＣ−ＲＧワクチンから誘導
される末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）は、精製した狂犬
病ウイルスで刺激された時に、際立ったレベルのリンパ
球増殖を例示した（Ｆｒｉｅｓら、１９９６年）。
【０１０６】ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡ
Ｃは、ウイルスまたはベクターのような遺伝的材料の物
理的混入についての指針、すなわち特定のウイルスまた
はベクターの病理学性に基づいたこのようなウイルスお
よびベクターを使用する安全手段についての指針を発行
するナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス
（「ＮＩＨ」）（米国公衆衛生局）、組換えＤＮＡ助言
委員会は、ＢＳＬ２からＢＳＬ１までの物理的混入レベ
ルでの減少を授与するという点で全ポックスウイルスの
なかでも特徴的であるとして認識された。他のポックス
ウイルスは、ＢＳＬ１物理的混入レベルを示すものはな
い。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株でさえ、共
通の疱瘡ワクチンは、高い物理的混入レベル、すなわち
ＢＳＬ２を示す。したがって、当業者は、他のポックス
ウイルスより低い病理原性を示すことを認識している。
【０１０７】ＡＬＶＡＣ−基本の組換え体ウイルスは、
ヒトＰＢＭＣから得たｉｎ ｖｉｔｒｏでの特定のＣＤ
８＋ＣＴＬを刺激することが示された（Ｔａｒｔａｇｌ
ｉａら、１９９３年ａ）。種々の形態のＨＩＶ−１エン
ベロープ糖タンパクを発現するＡＬＶＡＣ組換え体で免
疫されたマウスは、二次接種によって呼起こすことがで
きる一次および記憶ＨＩＶ特異的ＣＴＬ反応の両方を発
生した（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ；Ｃｏｘ
ら、１９９３年）。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ組換え体（ＨＩ
Ｖ−１エンベロープ糖タンパクを発現する）は、ＨＩＶ
−１感染個体の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの強
力なＨＩＶ−特異的ＣＴＬ反応を刺激する（Ｔａｒｔａ
ｇｌｉａら、１９９３年ａ；Ｃｏｘら、１９９３年）。
急性に感染した自己ＰＢＭＣを、残りのＰＢＭＣのため
の刺激細胞として使用した。外因性ＩＬ−２の不在下で
１０日インキュベーションした後、細胞を、ＣＴＬ活性
について評価した。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖは、マウスでの
高いレベルの抗−ＨＩＶ活性を刺激した。これらの、そ
して類似の研究（米国特許出願番号第０８／４１７，２
１０号参照）は、特に免疫欠損ウイルスに対するＡＬＶ
ＡＣ−基本の組換え体の利用性を示す。特に、ＡＬＶＡ
Ｃの高度に弱毒化された特徴は、このような研究で免疫
感応および免疫を発揮できない動物モデルの両方で表さ
れる。そしてＡＬＶＡＣ−基本の組換え体の安全性も示
された。
【０１０８】したがって、本発明では、カナリアポック
スウイルス基本のＡＬＶＡＣベクターが好まれる。
【０１０９】明らかに、ＡＬＶＡＣベクターの弱毒化プ
ロフィール、および固有の免疫原に対するヒトのおよび
細胞の免疫学上の反応の両方を引出すその例示の能力に
基づいて（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ；Ｔａ
ｙｌｅｒら、１９９２年）、このような組換え体ウイル
スは、先に記述されるワクシニア基本の組換え体ウイル
スより際立った利点を供する。
【０１１０】おそらくＦＩＶにさらに関連して（ネコが
関与している場合）、ＦｅＬＶ（サブグループＡ）ｅｎ
ｖおよびｇａｇ遺伝子産物を発現するＡＬＶＡＣ−基本
の組換え体ウイルス（ＡＬＶＡＣ−ＦＬ；ｖＣＰ９７）
は、口鼻のＦｅＬＶチャレンジ暴露に対してネコを完全
に保護できることが見られる（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、
１９９３年）。明かに、保護は、対抗の前に検出可能な
ＦｅＬＶ−特異的血清中和活性の不在下で可能にされ
た。
【０１１１】本発明の特定の実施態様で、出願人らは、
数種のＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組換え体を操作し、そして実
験的ＦＩＶ暴露に対してネコの保護を可能にするそれら
の能力を評価した。要約すると、出願人らは、ＡＬＶＡ
Ｃ−ＦＩＶのＧａｇ−プロテアーゼ組換え体を用いてネ
コのワクチン化によって、相同のＦＩＶチャレンジ暴露
から保護を示した。ＦＩＶ Ｅｎｖ単独またはＧａｇ−
プロテアーゼと組合せて発現する組換え体は、保護のレ
ベルを際立たせなかった。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ
ｅｎｖ／ｇａｇ−プロテアーゼで初期免疫すること、
そしてアジュバント化した不活性化全細胞ワクチンの追
加免疫することから構成されるワクチン化計画は、完全
な保護を提供し、それにより、Ｅｎｖ単独またはＧａｇ
−プロテアーゼと組合せて発現する組換え体の活用が示
されたが、それにもかかわらず、これらの組換え体は、
それ自身目立ったレベルの保護をできなかった（そして
さらに、これらの組換え体は、本発明の他の局面、例え
ばそれにもかかわらず、例えば有用な抗体、またはキッ
ト、試験、アッセイなどで得るのに有用でありうる産物
を発現するのに使用できる）。
【０１１２】興味深いことに、ELISAによって測定したF
IV固有の体液反応およびウェスタンブロットは、必ずし
も防御性を予測するわけではない。しかも、Env固有の
体液反応は、認められた防御性とは関連付けられなかっ
た。
【０１１３】さらに、ここでのデータは、ネコにおけ
る、特に、発明による組換え体（ALVAC-FIV組換え体な
ど）およびICVを含むプライム/ブーストプロトコルで
の、異種FIV抗原投与に対する本発明の組換え体のFIV効
率を示す。
【０１１４】その上、ここでのデータは、FIVおよびネ
コについて、他のレンチウィルス、レトロウィルス、お
よびEIAV、FIV、BIV、HIVあるいはSIVなどの免疫不全ウ
ィルスに拡張可能である。したがって、Env、Gag、プロ
テアーゼなどこれらの他のウィルスから対象とするエピ
トープをコード化する核酸分子に関する当業界内の知識
は、ここで例証されたFIVデータに類似した、対象とす
るエピトープを発現する組換え体を作成および使用する
のに利用できる。また特に、他のレンチウィルス、レト
ロウィルス、EIAV、FIV、BIV、HIVあるいはSIVなどの免
疫不全ウィルス用の、Env、Gag、Pol、または、プロテ
アーゼ、付属官能基/タンパク質、あるいはそのエピト
ープを含む部分などのPolの一部をコード化する核酸分
子の当業界内の知識を用い、ベクターシステムの当業界
内の知識を用いると、当業者は、随意に付属官能基/タ
ンパク質とともに、これらの他のウィルスの、Env、Gag
およびPolまたはPolの一部、あるいはGagおよびPolまた
はPolの一部、あるいはEnv、Gagおよびプロテアーゼ、G
agおよびプロテアーゼ、あるいはそのエピトープを発現
するベクターまたは組換え体を作成でき、FIVに関して
ここで例証したように、プライム/ブースト処置などの
免疫処置においてベクターまたは組換え体を、必要以上
の実験を行わずに使用できる。したがって、本発明は、
レンチウィルス、レトロウィルスおよびFIV以外（FIVは
他のレンチウィルス、レトロウィルスおよび免疫不全ウ
ィルスのモデルであるため）の免疫不全ウィルスのベク
ターまたは組換え体と、これらのベクターおよび組換え
体の作成および使用方法を包む。
【０１１５】発明によるベクターまたは組換え体が産生
する発現生成物は、感染細胞または形質移入細胞から単
離し、サブユニット・ワクチン形状（組成物、あるいは
抗原または免疫組成物）で宿主に接種することもでき
る。ベクターまたは組換え体が産生するタンパク質、お
よびそれから導出される抗体も、レンチウィルス、レト
ロウィルス、またはFIVなどの免疫不全ウィルスの有無
を検出するアッセイに使用できる。
【０１１６】したがって、本発明は、レンチウィルス、
レトロウィルスまたは免疫不全ウィルス免疫源などの、
対象とする免疫原またはエピトープ、あるいは、EIAV、
FIV、BIV、HIV、またはSIV免疫原などの対象とするエピ
トープ、あるいは対象とするエピトープを含む。実際に
は、本発明は、HIV-1、-2、EIAV、BIVを含むがこれに限
定されない、レンチウィルスの対象とする免疫原または
エピトープを含む。すべてのレンチウィルスは、FIV、E
nv、Gag-プロテアーゼの機能同族体を発現する。これら
の機能同族体をコード化する核酸配列の識別、クローニ
ング、利用の技術は当業者に既知であり、本開示に照ら
して実施するのに必要以上の実験は不要である。
【０１１７】最新技術に関しては、特に以下を参照す
る：Gondaら（1990）レンチウィルス疾患のモデルとし
てのウシ免疫不全様ウィルス. Dev. Biol. Stand. 72:9
7-110；Garveyら（1990）生物活性ウシ免疫不全様ウィ
ルスヌクレオチド配列およびゲノム構造. Virology 17
5：391-409；Gondaら（1987）ヒト免疫不全ウィルスに
関連したウシレンチウィルスのキャラクタリゼーション
および分子クローニング.Nature 330：388-391；Ballら
（1988）EIAVゲノム構造：精製糖タンパク質およびcDNA
の配列による、さらなるキャラクタリゼーション. Viro
logy 165：601-605；Kawakamiら（1987）ウマ伝染性貧
血症ウィルスプロウイルスDNAのヌクレオチド配列分析.
Virology 158：300-312；Yanivら（1986）統合ウマ伝
染性貧血症ウィルスの分子クローニングおよび物理キャ
ラクタリゼーション：ヒツジおよびヤギレンチウィルス
との密接な関係についての分子的および免疫学上の証
拠. Virology 154：1-8；Stephensら（1986）ウマ伝染
性貧血症ウィルスgagおよびpol遺伝子：ビズナおよびAI
DSウィルスとの関係. Science 231：589-594；Chiuら
（1985）AIDSレトロウィルスのレンチウィルスに対する
関係のヌクレオチドの証拠.Nature 317：366-368；はも
ちろんのこと、Retrovirus Biology and Human Diseas
e、Gallo, R.C and Wong−Stall, F. 編、Marcel Dekke
r, Inc. New York、1990の多数の総説。
【０１１８】さらに、発明のベクターまたは組換え体か
ら、このような対象とする免疫原またはエピトープをコ
ード化するDNAは、他のポックスウィルス、ヘルペスウ
ィルス、アデノウイルス、アルファウィルスに基づく方
法、および、裸または調整されたDNAに基づく免疫原を
含むがこれに限定されない、代わりの適切に処理された
哺乳類発現システムを用いて、免疫処置により投与でき
る。このような組換え体サブユニットの処理技術は、当
業者に既知である。
【０１１９】これらの免疫処置の媒質および最新知識に
関する技術については、特に以下を参照する：Hormaech
e and Kahn, Perkus and Paoletti, Shiverら Concepts
inVaccine Development、Kaufman, S. H. E.編、Walte
r deGruytes, New York, 1996、のすべて、および、Vir
uses in Human Gene Therapy, Vos, J. -M. H編、Chapm
an and Hall, Carolina Academic Press, New York, 19
95 および Recombinant Vectors in Vaccine Developme
nt, Brown, F.編, Karger, New York, 1994で述べられ
たベクター。
【０１２０】さらに本発明は、 組換えウィルスまたは
その発現生成物を含む抗原性、免疫原性、免疫性または
ワクチン組成物、および、許容できる担体または希釈剤
を提供する。ベクターまたは組換えウィルス（またはそ
の発現生成物）免疫組成物は、局所的または系統的な免
疫反応を誘発する。この反応は、必要はないが、防御的
になり得る。同様に抗原組成物は、局所的または系統的
な免疫反応を誘発する。この反応は、必要はないが、防
御的になり得る。したがって、"免疫組成物"、"抗原組
成物"および"免疫原組成物"という語は、（この3つの語
は防御的組成物になり得るため）"ワクチン組成物"を含
む。防御反応は、体液性および/または分泌性および/ま
たは細胞媒介反応などの反応と理解され、免疫を付与す
る。免疫とは、感染に抵抗または感染を克服する能力、
あるいは、発明組成物が処方されない被験者と比べて感
染を容易に克服する能力、あるいは、発明組成物が処方
されない被験者と比べて感染に耐える、すなわち感染へ
の耐性の向上と理解される。
【０１２１】対象とするエピトープに関し、当業者は、
アミノ酸とペプチドまたはポリペプチドの該当するDNA
配列の知識はもちろんのこと、特定のアミノ酸の性質
（サイズ、電荷など）およびコドンディクショナリか
ら、必要以上の実験を行わずに、ペプチドまたはポリペ
プチド、したがって、そのためにコード化DNAのエピト
ープまたは免疫優性領域を決定できる。
【０１２２】免疫組成物にタンパク質の使用部分を決定
する一般的な方法では、対象とする抗原のサイズと配列
に注目する。"一般に、大型のタンパク質は、潜在的な
決定因子を多く持っているため、小型のタンパク質より
も優れた抗原である。抗原が異質になればなるほど、す
なわち、耐性を生じさせる自己の配置に最も類似しなく
なると、免疫反応が効果的に起こる。"Ivan Roitt, Ess
ential Immunology, 1988。
【０１２３】サイズに関して：当業者は、哺乳類ベクタ
ーに挿入されるDNA配列がコード化するタンパク質のサ
イズを最大限にできる（ベクターの挿入限界に留意す
る）。発現されるタンパク質のサイズを最大限にしなが
ら、挿入するDNAを最小限にするために、DNA配列は介在
配列（転写されるが、引き続きプライマリRNAから実施
される遺伝子の領域）を除くことができる。
【０１２４】DNA配列は、最低で、少なくとも8または9
個のアミノ酸長のペプチドをコード化できる。これは、
ペプチドが（ウィルス感染細胞または癌性細胞を認識す
る）CD4+T細胞反応を促進するために必要な最小限の長
さである。アミノ酸が13〜25個の最低ペプチド長は、
（病原体を取りこんだ、特殊な抗原を示す細胞を認識す
る）CD8+T細胞反応を促進するのに有効である。Kendrew
のThe Encyclopedia ofMolecular Biology（Blackwell
Science Ltd 1995）を参照のこと。しかし、これらのペ
プチドは最小限の長さであるため、免疫反応、すなわ
ち、抗体またはT細胞反応を生成しやすい；しかし、
（ワクチン組成物などによる）防御反応の場合は、さら
に長いペプチドが好ましい。
【０１２５】配列に関して、DNA配列は、少なくとも、
抗体反応またはT細胞反応を生成するペプチドの領域を
コード化することが好ましい。TおよびB細胞エピトープ
を決定するひとつの方法として、エピトープマッピング
がある。対象とするタンパク質は"タンパク質分解酵素
を用いて重複ペプチドに断片化される。そして各ペプチ
ドについて、未変性のタンパク質が誘発した抗原への結
合能力、あるいは、T細胞またはB細胞活性化を引き起こ
す能力を試験する。この手法は、T細胞によって、MHC分
子と結合した短い線形のペプチドが認識されるため、T
細胞エピトープのマッピングに特に有効である。この方
法は、B細胞エピトープの決定にはあまり有効ではな
い。"なぜなら、B細胞エピトープは、たいてい線形アミ
ノ酸配列ではなく、折れ曲がった3次元タンパク質の三
次構造から生じるからである。Janis Kuby, Immunolog
y, pp. 79-80（1992）。
【０１２６】対象とするエピトープを決定するもうひと
つの方法は、親水性のタンパク質の領域を選択すること
である。親水性残基は、通常、タンパク質表面にあるた
め、たいてい、抗原に到達可能なタンパク質領域であ
る。Janis Kuby, Immunology,p. 81（1992）。
【０１２７】対象とするエピトープを決定するさらにも
うひとつの方法は、抗原（全長）-抗体複合体のX線結晶
解析を行うことである。Janis Kuby, Immunology, p. 8
0（1992）。
【０１２８】T細胞反応を産生可能な対象とするエピト
ープを選択するまた別の方法は、MHC分子に結合しやす
いことが知られているペプチド配列である、タンパク質
配列電位HLAアンカー結合モチーフから識別することで
ある。
【０１２９】T細胞反応を産生するには、対象とする推
定上のエピトープであるペプチドが、MHC複合体中に示
されることが望ましい。このペプチドは、好ましくは、
MHC分子に結合するための適切なアンカーモチーフを含
み、免疫反応を産生するのに十分な高さの親和力によっ
て結合する。考慮可能な因子は次のとおりである：免疫
化される（脊椎動物、動物またはヒト）患者のHLA型、
タンパク質の配列、適切なアンカーモチーフの存在、他
の生体細胞のおけるこのペプチド配列の発生。
【０１３０】免疫反応は、一般に、以下のように産生す
る：T細胞は、タンパク質がさらに小さいペプチドに切
断され、別の細胞表面に位置する"主組織適合性複合体M
HC"と呼ばれる複合体の形で現れた場合のみに、タンパ
ク質を認識する。MHC複合体には、クラスＩとクラスII
の2つのクラスがあり、各クラスは、多くの種々の対立
遺伝子で構成される。それぞれの患者は、異なる型のMH
C複合体対立遺伝子を持つ；すなわち、'異なるHLA型'を
持つと言われる。
【０１３１】クラスＩMHC複合体は、本質的にすべての
細胞に見られ、細胞内で生成されたタンパク質からペプ
チドを生じさせる。したがって、クラスＩMHC複合体
は、ウィルスに感染した細胞や発ガン遺伝子の発現の結
果として癌化した細胞を殺すのに有効である。表面にCD
4というタンパク質を持つT細胞は、MHCクラスＩ細胞に
結合し、リンフォカインを分泌する。リンフォカイン
は、反応を促進する；細胞がウィルス感染細胞に到達
し、これを殺す。
【０１３２】クラスIIMHC複合体は、抗原提示細胞のみ
に見られ、抗原を示す細胞により形質膜陥入された循環
病原体からペプチドを生じさせるのに用いられる。CD8
と呼ばれるタンパク質を持つT細胞は、MHCクラスＩ細胞
に結合し、溶菌顆粒の開口分泌により細胞を殺す。
【０１３３】タンパク質が、T細胞反応を促進する対象
とするエピトープを含むかどうかを判定するための、あ
るガイドラインは、以下の事項を含む：ペプチド長 -
ペプチドは、MHCクラスＩ複合体に適合させるには少な
くともアミノ酸8〜9個の長さで、MHCクラスII複合体に
適合させるには少なくともアミノ酸13〜25個の長さであ
ることが望ましい。この長さは、MHC複合体に結合する
ペプチドにとっては最小限の長さである。細胞が、発現
されたペプチドを切断することがあるため、ペプチドは
これ以上の長さであることが好ましい。
【０１３４】ペプチドは、そのペプチドを、免疫反応を
生じさせるのに十分に高い特異性によって種々のクラス
ＩまたはクラスII分子に結合させる、適切なアンカーモ
チーフを含むことが望ましい（Bocchia, M.ら、Specifi
c Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pept
ides to HLA Class I Molecules, Blood 85：2680-268
4；Englehard, VH, Structure of peptide associated
with class I and class II MHC molecules Ann. Rev.
Immunol. 12:181（1994）を参照）。これは、必要以上
の実験をせずに、対象とするタンパク質の配列を、MHC
分子に結合するペプチドの公表された構造と比較するこ
とにより実施できる。T細胞レセプタが認識するタンパ
ク質エピトープは、タンパク質分子の酵素分解によって
生成するペプチドであり、クラスＩまたはクラスIIMHC
分子に結合して、細胞表面に現れる。
【０１３５】さらに、当業者は、タンパク質配列を、タ
ンパク質データベースに示された配列と比較することに
よって、対象とするエピトープを確認できる。わずかし
か、あるいは全く一致しないタンパク質の領域を、その
タンパク質のエピトープとして選択したほうがよく、ワ
クチンまたは免疫組成物に有効である。生体細胞に存在
する、広範に見られる配列と大部分が一致する領域は、
避けることが望ましい。
【０１３６】またさらに、別の方法は、対象とするタン
パク質の部分を生成または発現させ、対象とするタンパ
ク質のこの部分に対するモノクローナル抗体を産生し
て、これらの抗体が、タンパク質が誘導された病原体の
生体外での成長を阻害するかどうかを確認するだけであ
る。当業者は、本開示および当業界で公表されたもうひ
とつのガイドラインを用いて、抗体による生体外での成
長の阻害の有無を分析するために、対象とするタンパク
質の一部を生成または発現させることができる。
【０１３７】たとえば、当業者は、対象とするタンパク
質の一部を、以下の手順によって生成できる：タンパク
質のアミノ酸長が8〜9個または13〜25個の部分を選択、
親水性領域を選択、抗原（全長）-抗体複合体のX線デー
タから、結合するために、示された部分を選択、他のタ
ンパク質による配列と異なる領域を選択、潜在的なHLA
アンカーモチーフを選択、あるいは、これらの方法また
は当業者に既知の他の方法の組み合わせ。
【０１３８】抗体によって認識されたエピトープをタン
パク質の表面上で発現させた。ある技巧的な技術で抗体
応答を刺激しそうなタンパク質の領域を決定するには、
上記の一般的な方法又は技術的に公知の他のマッピング
方法を用いて、エピトープマップを好ましく実施するこ
とが可能である。
【０１３９】前記の記述、この公報及び技術的知見を参
照することが可能であるので、当業者は、過度の実験な
しに、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又は抗体反応を得るための
関心のレンチウイルスエピトープのアミノ酸とそれに対
応するＤＮＡ配列を確認することが可能である。加え
て、参考文献として、Ｇｅｔｔｅｒらの１９９１年５月
２８日発行の米国特許第５，０１９，３８４号とそれに
引用された文献があり、ここに、参考文献として組み込
んだ。（この特許の「関連する文献」の項と開示したこ
の特許の１３欄を特に注意すること。そこには、次の記
述がある。「多数のエピトープを広範囲の様々なの関心
のある有機体に対して明らかにした。格別の関心は、抗
体を中和するそれらのエピトープである。それらのエピ
トープの記述は、関連文献の欄に引用した多くの文献に
ある。」 発明のベクター又は組換え体又はその発現産生物、免疫
組成物、抗原組成物又はワクチンの組成物、あるいは治
療組成物に対する投与処置は、皮内、筋肉内又は皮下の
ような非経口的経路を介して行うことができる。そのよ
うな投与は、全身性の免疫学的応答に利用できる。投与
は、口、鼻、生殖器等のような粘膜を通じても可能であ
る。そのような投与は、局所的な免疫学的応答に利用で
きる。
【０１４０】さらに広くは、本発明の抗原組成物、免疫
学組成物又はワクチン組成物あるいは治療の組成物（本
発明のベクター又は組換え体又は発現産物を含んでいる
組成物）は、製薬あるいは獣医学技術の当業者によく知
られている標準的技術に従って調製することが可能であ
る。そのような組成物は、投薬で投与することができ、
薬学及び／または獣医学の当業者がよく熟知している技
術によって、品種又は種類、年齢、性別、体重、特定の
患者の状態及び投薬経路のような因子を考慮して、その
ような組成物を投与することができる。その組成物は、
単独で投与するか、他と一緒に投与するか、本発明の他
の組成物又は他の免疫組成物、抗原組成物、ワクチン組
成物又は治療組成物と一緒に順序的に投与することがで
きる。そのような別の組成物として、精製された天然の
抗原又はエピトープ、あるいはポックスウイルス組換え
体又は他のベクター系による発現からの抗原又はエピト
ープを含むことが可能であり、そして、前述の要素を考
慮して投与される。
【０１４１】本発明の組成物の実施例は、口、鼻、肛
門、膣のような生殖器等の開口部に対する液体調製物；
懸濁液、シロップ剤又はあるいはエリキシルのような投
与；また、非経口、皮下、皮内、筋肉内又は例えば注射
可能な静脈内投与用の滅菌した懸濁液又はエマルジョン
のような調整、を含んでいる。そのような組成物では、
組換え体が、滅菌水、生理的食塩水、グルコース又はそ
の類似物のような、適当な担体、希釈剤、賦形剤ととも
に混合剤中に入っていてもよい。
【０１４２】抗原組成物、免疫組成物又はワクチン組成
物は、典型的に、補助剤と望ましい応答を生じるような
量の組換え体又は発現産物を含むことができる。ヒトへ
の適用においては、燐酸アルミニウム又は水酸化アルミ
ニウムのようなアルムが典型的な補助剤である。サポニ
ン及びその精製成分Ｑｕｉｌ Ａ、Ｆｒｅｕｎｄの完全
な補助剤と他の補助剤は、研究や獣医学の応用において
用いられている。ムラミルジペプチド、モノホスホリル
リピッドＡ、リン脂質の調製は化学的に定義されてお
り、それらは、Goodman-Snilkoff らによって、 J. Imm
unol.147:410-415(1991)に記載されており、ここに文献
として組み込んだ。また、Miller らによる J. EXP. Me
d.176:1739-1744(1992)に記載されたプロテオリポソー
ム中へのタンパク質のカプセル充填の文献があり、ここ
に文献として組み込んだ。さらに、NovasomeTM脂肪小胞
(Micro Vesicular Systams, Inc., Nashua,NH)のような
脂肪小胞中でのタンパク質のカプセル化もまた使用可能
である。
【０１４３】本発明の組成物は、非経口投与（すなわ
ち、筋肉内、皮内又は皮下）か、例えば舌経由（すなわ
ち、経口、）胃、口腔内、肛門内、膣内を含む粘膜及び
その類似体へのオリフィス投与によって免疫処置するた
めに、単一の剤形中にパッケージしてもよい。また、再
び、投与の有効薬量と経路は、その組成物の性質、発現
産物の性質、直接ベクターや組換え体を利用する場合は
その発現レベル、品種、種類、年齢、体重、状態及び宿
主の性質並びにＬＤ50及び公知で過度の実験を要しない
他のスクリーニング法などによって決定する。
【０１４４】発現産物の薬量は、例えば、５〜５００μ
ｇのように、微量から数百マイクログラムに及ぶことが
可能である。本発明のベクター又は組換え体は、これら
の薬量レベルで発現を達成するような適当量で投与する
ことができる。本発明のベクター又は組換え体は、少な
くとも約１０３．５ｐｆｕの投与量で、動物へ投与し、
感染させ、細胞に形質転換することが可能である。例え
ば、本発明のベクター又は組換え体は、好ましくは、少
なくとも１０4〜約１０6ｐｆｕで、動物へ投与し、感染
させ、細胞に形質転換することが可能である。しかしな
がら、下記の実施例に示すように、動物は少なくとも約
１０8ｐｆｕ投与しなければならない。さらに好ましい
投与量は、少なくとも約１０7ｐｆｕから約１０9ｐｆｕ
である。他の適当な担体又は希釈剤には、水、緩衝食塩
水を用いることができ、防腐剤を用いても用いなくても
よい。発現産物又はベクター又は組換え体は、投与時に
再懸濁するために凍結乾燥してもよく、溶液中に存在さ
せることもできる。
【０１４５】担体は、また、ポリマー性遅延遊離系統で
あってもよい。合成ポリマーは、制御された遊離を有す
る化合物と剤型において特に有用である。この初期の例
としては、いわゆるナノ粒子を形成するために１ミクロ
ン未満の直径を持っている球体へメタクリル酸メチルの
重合があり、それは、Kreuterによって、 J., Microcap
-sules and Nanoparticles in Madieine and Pharmaco
logy. (M. Donbrow, ed.) CRC Press, p. 125-148に報
告されている。
【０１４６】制御した遊離を行うために、マイクロカプ
セル化した薬剤の注射が適用された。マイクロカプセル
化のために特別のポリマーの選択に多くの因子が寄与す
る。ポリマー合成及びマイクロカプセル化工程の再現
性、マイクロカプセル化の原料と工程の費用、毒性学の
性質、可変解放動力学のための必要条件及びポリマーと
抗原の物理化学的な適合性が考慮されるべきすべての因
子である。有用なポリマーの実施例は、ポリカーボネー
ト、ポリエステル、ポリウレタンである。ポリオルトエ
ステルとポリアミドは、特に生物分解性のものである。
【０１４７】薬剤と最近の抗原に対する担体の頻繁な選
択は、ポリ（ｄ、ｌ−ラクチド-ｃｏ−グリコライド）
（ＰＬＧＡ）である。これは、生物分解性のポリエステ
ルであり、縫合、骨折治療用プレート、他の治療人口器
官において医薬用途の長い歴史があり、毒性は示されな
かった。ペプチド及び抗原を含む薬剤の幅広い種類は、
ＰＬＧＡマイクロカプセル中に調製した。例えば、Eldr
idge, J.H.らによるCurrent Topics in Microbiology a
nd Immunology. 1989, 146:59-65にあるように、抗原の
制御された遊離に対するＰＪＧＡの適応に関して、デー
タ主要部を蓄積した。経口で投与された場合、直径で１
〜１０ミクロンのＰＬＧＡ微粒子中の抗原の包括が、注
目すべき補助剤効果を持っていることが示された。ＰＬ
ＧＡマイクロカプセル化工程は、オイルの中の水のエマ
ルジョンの相分離を使用する。水溶液とＰＬＧＡで調製
した関心のある化合物を、塩化メチレン、酢酸エチルの
ような適当な有機溶媒に溶解した。これらの混合しない
２つの溶液を高速撹拌によって乳化した。その後、ポリ
マーに対し非溶剤を加え、未成熟のマイクロカプセルを
形成するため、水性小滴のまわりにポリマーの析出を生
じさせた。マイクロカプセルを収集し、ポリビニルアル
コール（ＰＶＡ）、ゼラチン、アルギナート、ポリビニ
ルピロリドン（ｐｖｐ）、メチルセルロースの様々な試
剤のうち１つで固定させ、溶媒を真空乾燥、溶媒抽出の
いずれかで除去した。その後、固体、液体含有の固体、
液体及びゲル（「ゲル・キャップ」を含む）組成物を組
成物）固形物含んでいる液体を含む固形物、液体および
ゲル（「ゲル・キャップ」を含む）組成物を形成した。
さらに、本発明のベクター又は組換え体及びそれらから
の発現産物は、動物中で免疫性又は抗体応答を刺激する
ことが可能である。公知の技術によって、それらの抗体
からモノクローナル抗体を調節し、それらのモノクロー
ナル抗体が抗原が存在するか否か、それらから抗原の天
然の原因因子が存在するか否かを判定する、あるいは、
試剤に対する免疫応答が刺激された抗原に対する免疫応
答かを判定する、よく知られている結合測定、診断キッ
ト又はテストに供することができる。
【０１４８】モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細
胞によって産生されたイムノグロブリンである。モノク
ローン抗体はシングルの抗原決定基抗原決定要素と反応
し、従来よりも特異的に大きい血清由来抗体を提供す
る。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニン
グすることによって、希望する特異性、結合活性及びア
イソタイプを伴う個々の抗体を選択することが可能であ
る。ハイブリドーマ細胞系は、化学上同一の抗体の恒常
的で低費用の源を提供し、容易にそのような抗体の調製
を標準化することが可能である。モノクローナル抗体を
産生する方法は従来技術において通常の技術として十分
に知られており、例えば、Koprowski, H.らの１９８９
年４月１日発行の米国特許第４，１９６，２６５号があ
り、ここに文献として組み込んだ。
【０１４９】モノクローナル抗体の利用はよく知られて
いる。そのような１つの利用は、診断方法である。例え
ば、David, G. と Greene, Kの１９８３年３月８日発行
の米国特許第４，３７６，１１０があり、ここに文献と
して組み込んだ。
【０１５０】モノクローナル抗体は免疫吸着クロマトグ
ラフィーによって物質を回収するのに用いられてきた。
例えば、Milstein, Cによる1980年発行の Scientific A
merican 243:66, 70の文献があり、ここに文献として組
み込んだ。
【０１５１】更に、本発明のベクター又はそれからの組
換え体発現産物は、患者への継続的な自家輸血法のため
のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの細胞に応答を
刺激することができる。もし、患者が血清陰性であれ
ば、時下輸血法は、例えば能動免疫のような免疫学的な
又は抗原応答免疫応答を刺激する。血清陽性の患者にお
いては、自家輸血法は、レンチウイルス、レトロウイル
ス又は免疫不全ウイルス（例えばＦＩＶ）に対する免疫
システムを刺激するか増加させる。
【０１５２】さらに、本発明のベクターあるいは組換え
体はいくつかの有用性を持っている。血清陰性の動物や
ヒト（ヒトを含む患者に加えて、獣医が動物に対して称
する患者を含める）に投与するような抗原組成物、免疫
組成物又はワクチン組成物。レンチウイルス、レトロウ
イルス又はネコ不全ウイルスのような免疫不全ウイルス
に対する免疫システムを刺激するか増加させる治療の要
求における血清陽性の動物又はヒトへの治療組成物。さ
らに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原組成物、免疫組成物、ワ
クチン組成物又は治療組成物を利用することができる、
抗原、免疫原、対象とするエピトープを産生する。さら
に利用することができる、直接投与によるか本発明のベ
クター又は組換え体の発現産物の投与による抗体の産
生。血清のような試料中に抗原又はエピト−プが存在す
るか否を確認するための診断、テスト又はキット。例え
ば、血清のような試料中の、レンチウイルス、レトロウ
イルス、又はネコ免疫不全ウイルスのような免疫不全ウ
イルスの存在有無の確認。あるいは、レンチウイルス、
レトロウイルス、又はネコ免疫不全ウイルスのような免
疫不全ウイルスに対し免疫応答が誘発されたかどうかを
検出するための、あるいは特定の抗原又はエピトープの
ための診断、テスト又はキット。あるいは、クムノクロ
マトグラフィー。ハイブリダイゼーションプローブとし
て利用するためのＤＮＡの産生又はＰＣＲプライマーの
調製又はＤＮＡ免疫処置。そして、本発明のベクター又
は組換え体、それらからの発現産物、免疫原、抗原ある
いは本発明のベクター又は組換え体からのエピトープ
は、刺激された命令を引き起こすために用いることがで
き、それは、さらに、免疫応答（抗原応答又は免疫学的
応答あるいは活動免疫）を刺激するか、免疫系（例え
ば、免疫無防備状態又血清陽性の動物又はヒトの免疫
系）を刺激するか増加させるために用いることが可能で
ある。他の有用性は、また本発明の実施例において説明
する。
【０１５３】本発明についてのさらなる理解と多くの有
用性が、下記の実施例によって実例を通じて得られるで
あろう。
【０１５４】
【実施例】（実施例）ＤＮＡのクローニングおよび合成 プラスミドは標準的手法により構築してスクリーニング
し、育成した（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８
２；Pｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐｉｃｃｉ
ｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７)。制限エンドヌクレアー
ゼは、ベセスダ・リサーチラボラトリー（Ｂｅｔｈｅｓ
ａｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびベーリ
ンガー・マンハイムバイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ．）より入手した。
Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのKlenow fragmentは、ベー
リンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社（Boehring
er Mannheim Biochemicals）より入手した。BAL-81エキ
ソヌクレアーゼおよびファージＴ４ＤＮＡリガーゼは、
New England Biolabsより入手した。使用した試薬は多
様な提供者から得たものをspecifiedした。
【０１５５】合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、
前述（Perkus et al.,1989)のようにBiosearch 8750ま
たはアプライド・バイオシステムズ社製（Applied Bios
ystems ）380B DNAシンセイサイザにより調製した。Ｄ
ＮＡの塩基配列決定は、後述（Guo et al.,1989)のよう
に、シーケナーゼ（Tabor et al.,1987)を使用してジデ
オキシ鎖ターミネーション法（Sanger et al.,1977)に
より実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)による塩基
配列補正（Engelke et al.,1988)を使ったＤＮＡの増幅
は、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよび
Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキン・エ
ルマー・シータス社（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔ
ｕｓ，ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を自動化パーキン・エル
マー・シータスＤＮＡサーマルサイクラー（Ａｕｔｏｍ
ａｔｅｄ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏ
ｒｗａｋ，ＣＴ））に入れて使用した。過剰のＤＮＡ配
列は、制限エンドヌクレアーゼ消化法によりプラスミド
から消化し、続いてＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼに
よる限定消化法にて消化し、合成オリゴヌクレオチドに
より突然変異生成（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）を起
こした。
【０１５６】細胞、ウイルスおよび形質転換 ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株の起源および培
養条件は前述のとおり（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８
９）とした。組み換えによる組み換えウイルスの発生、
ニトロセルロースフィルターを使用したｉｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーションおよびＢーガラクトシダーゼ活
性を指標とするスクリーニングは前述のとおり（Ｐｉｃ
ｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）である。ワクシニア
ウイルスのコペンハーゲン株、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶ
ＡＣの起源および培養条件は前述のとおり（Ｇｕｏ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２；米国特許第５，３６４，７７３号およ
び第５，４９４，８８７号）である。組み換えによる組
み換えウイルスの発生、ニトロセルロースフィルターを
使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび
Ｂーガラクトシダーゼ活性を指標とするスクリーニング
は前述のとおり（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９
８２，Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）である。
【０１５７】親株のカナリポックスウイルス（Ｒｅｎｔ
ｓｃｈｌｅｒ株）は、カナリアのワクチニアル株であ
る。ＡＬＶＡＣワクチン株は、前述のように、ニワトリ
胎児線維芽細胞を連続２００回経代して単離し弱毒化し
た野生株から得た、マスターのウイルス播種は、寒天上
で４回連続してプラーク精製にかけ、１つのプラークク
ローンを保存用ウイルスを親ウイルスとしてｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ組み換え試験にてさらに５回経代して増幅させ
た。プラーク精製によるカナリポックス単離体をＡＬＶ
ＡＣと命名した。
【０１５８】ＦＰ−１と命名したファウポックスウイル
ス（ＦＰＶ）株は前述のとおり（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８８ａ）である。これは、１日齢のニワトリ
においてワクチン接種をする場合に有用なアテニュエー
トされたワクチン株である。親ウイルス株であるＤｕｖ
ｅｔｔｅは、ニワトリからＦｏｗｌｐｏｘ ｓｃａｂと
してフランスより入手した。このウイルスは連続約５０
回の経代に続き、ニワトリ胎児線維芽細胞を２５回経代
してアテニュエートした。このウイルスを連続４回プラ
ーク精製にかけた。１個のプラーク単離体をさらに初代
ＣＥＦ細胞内で増幅させ、保存用ウイルス（ＴＲＯＶＡ
Ｃ）と命名し確立した。
【０１５９】ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡ
Ｃウイルスベクターとその単離体を、前述のように（Ｐ
ｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｔａｉｌｏｒ
ｅｔａｌ．，１９８８ａ，ｂ，米国特許第５，３６４，
７７３号および第５，４９４，８０７号）にて増殖させ
た。Ｖｅｒｏ細胞およびニワトリ胎児線維芽細胞（ＣＥ
Ｆ）を前述のように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９
８８ａ，ｂ）増殖させた。
【０１６０】実施例１−ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ（ｅｎｖ）
の構築 プラスミドｐｔｇ６１８４中にコードされた配列である
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｅｎｖと、ＦＩＶヌク
レオチド配列をＲｈｅｎｓ Ｍｅｒｉｃｕｘ（Ｌｙｅ
ｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。このｃＤＮＡクロー
ンをＦＩＶのＶｉｌｌｅｆｒａｎｃｈｅ株から誘導し
た。ＦＩＶｅｎｖヌクレオチド配列を図２（配列番号
１）に示す。
【０１６１】ＦＩＶｅｎｖコード配列を、初期／後期ワ
クシニアウイルスＨ６プロモーター（Ｐｅｒｋｕｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８９）の管理下においた。ＦＩＶｅｎ
ｖコード配列は、未成熟の初期転写終了用に提供される
２つのＴ５ＮＴ配列にモチーフを含有する（Ｙｕｅｎ
ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９８７）。Ｔ５ＮＴ配列は、予想
されるアミノ酸コード配列を変化させることなくＰＣＲ
誘導画分と置き換わることにより改変される。図２の２
０５９と２０６５の間の位置にあるＴＴＴＴＴＡＴは、
ＴＴＣＴＴＡＴに変化し、２１１０と２１１６の間に位
置するＴＴＴＴＴＣＴは、ＴＴＣＴＴＣＴに変化する。
【０１６２】重複する２つのＰＣＲ画分は、ｐｔｇ６１
８４テンプレートより誘導され、Ｔ ５ＮＴ配列の変化し
た画分が得られる。５８５ｂｐのＰＣＲ画分は、オリゴ
ヌクレオチドプライマーＭＭ０４０（配列番号５）
（５’−ＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣ
ＧＣＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡ−ＧＧＡＴＧＡＡＴＣ
ＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴ ＧＣＡＡＡＡＴＣＣ
ＣＴＣＣＴＧＧＧＴ−３’）と、ＭＭ０４２（配列番号
１０）（５’−ＣＣＣＡＴＧＧＡＧＴＧＣＧＧＣＴＡＣ
−３’）を使って発生させた。３’側が大半を占める配
列から得たＭＭ０４２は、５’側がほとんどを占める配
列に向かう。ＭＭ０４１（配列番号１１）を伴う２番目
のＰＣＲは、（５’−ＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴ
ＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＴＴ−３’）と
ＭＭ０４３（配列番号１２）（５’−ＡＡＧＴＴＣＴＧ
ＧＣＡＡＣＣＣＡＴＣ−３’）は、１８７ｂｐ画分を発
生させた。ＭＭ０４１は２１１８の位置に始まり、ｅｎ
ｖの５’側が大半を占める配列方向へ向かい、ＭＭ０４
３は、１９３１の位置（図２）から続くｅｎｖコード配
列の３’側が大半を占める配列へ向かう。二つのＰＣＲ
生成物をプールし、ＭＭ０４３とＭＭ０４２とでプライ
ムさせ、図２の２０２０のＦＩＶコード配列位置でＳｃ
ａＩにて消化し、ｅｎｖコード配列の３’部分をＥｃｏ
ＲＩで消化した。こうしてできた５６４ｂｐのＳｃａＩ
−ＥｃｏＲＩ−ＰＣＲ画分は、Ｔ５ＮＴモチーフの変化
したＦＩＶｅｎｖコード配列を含む。
【０１６３】プラスミドｐｔｇ６１８４をＥｃｏＲＩで
消化し、部分的にＳｃａＩで消化した。この、ＳｃａＩ
消化した（図２の２０２０の位置）５’−ＦＩＶｅｎｖ
からｅｎｖコード配列のＥｃｏＲＩ−３’までを含む
ｐｔｇ６１８４由来画分を、５６４ｂｐのＳｃａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩによるＰＣＲ誘導画分（前述）に結合させた。
こうしてできたプラスミドｐＭＮ１２０は、Ｔ５ＮＴモ
チーフの変化したＦＩＶｅｎｖを含む。このヌクレオチ
ド配列を、標準的手順（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１
９９０ａ）にて確認した。ＦＩＶｅｎｖコード配列を含
む２．６ｋｂｐのｐＭＮ１２０ ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ
画分を、ｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ＰｓｔＩとＥｃｏ
ＲＩ部位に挿入してｐＭＭ１２２を発生させた。
【０１６４】改変した初期／後期ワクシニアウイルスＨ
６プロモーター（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８
９）を、Ｈ６転写開始コドンとＦＩＶｅｎｖ転写開始コ
ドンの重複したｐＭＭ１２２に添加した。Ｈ６をプロモ
ートしたほぼ５’−側の配列からなるｅｎｖコード配列
を、プライマーＭＭ０３７（配列番号１３）（５’−Ａ
ＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴ
ＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴ−３’）、ＭＭ０３８
（配列番号１４）（５’−ＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣ
ＴＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣ−
３’）、ＭＭ０６５（配列番号１５）（５’−ＣＧＴＴ
ＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧ
ＡＴＴＴＧＣＡＧＣＣ−３’）、およびＭＭ０３６（配
列番号１６）（５’−ＣＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＣＧＴ
ＴＣＣ−３’）を使って発生させた。ｐＭＭ１０８は、
Ｈ６プロモーター配列を含み、ＭＭ０３７およびＭＭ０
３８のテンプレートとなり、Ｈ６プロモーターと５’−
側のほとんどからなるＦＩＶｅｎｖコード配列を含む１
６６ｂｐの画分を創出した。ｐＭＭ１２２は、ＭＭ０６
５とＭＭ００３６のテンプレートとなり、３’−Ｈ６プ
ロモーターおよび５’−ｅｎｖ末端部を伴う２３５ｂｐ
の画分を創出した。二つのＰＣＲ生成物をプールし、Ｍ
Ｍ０３６とＭＭ０３７でプライムし、こうしてできた画
分すなわちＦＩＶｅｎｖコード配列の５’側の大半から
成るｂｐに融合したＨ６プロモーターを、ＰｓｔＩおよ
びＫｐｎＩで消化して２６６ｂｐの画分を創出した。ｐ
ＭＭ１２２をＰｓｔＩで消化し、部分的にＫｐｎＩで消
化してＦＩＶｅｎｖコード領域の５’側の大半からなる
配列を消化し、前述のＰｓｔＩ−ＫｐｎＩによるＰＣＲ
由来画分を挿入した。こうしてできたプラスミドｐＭＭ
１２５は、pＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌ
ａ，Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のワクシニア
Ｈ６プロモーター の３’側に近接してＦＩＶｅｎｖを
含む。
【０１６５】ｐＭＭ１２５の配列解析により、Ｈ６プロ
モートＦＩＶｅｎｖ５’−側を大半とする配列が正しく
ＰＣＲによって構築されたことが示されたが、ＰＣＲ挿
入部の３’側にフレームシフト突然変異が認められた。
このフレームシフトはｐＭＭ１２２には認められなかっ
た。ｐＭＭ１２５のクローンはすべてフレームシフトを
含んでいた。これらフレームシフトは、おそらく最近記
述されたコピー数の多いプラスミド（Ｗａｍｇ ａｎｄ
Ｍｕｌｌｉｎｓ，１９９５）中にｅｎｖ配列が組み込ま
れたことによる。別個のｐＭＭ１２５クローンは、異な
るフレームシフトを有する。フレームシフトをもたない
Ｈ６プロモートＦＩＶｅｎｖを、次の方法により構築し
た。
【０１６６】簡単にいえば、これは、フレームシフトを
有しないＨ６プロモートＦＩＶｅｎｖについての詳細な
記述を要約したものである。フレームシフトを有しない
ＦＩＶｅｎｖコード配列の、Ｈ６プロモート５’側を大
半とするｐＭＭ１２５の１個のクローン由来の配列を、
別のｐＭＭ１２５クローンから得た３’側を大半とする
ＦＩＶｅｎｖ末端部のフレームシフトしていない残りの
ｂｐに結合させた。最初の画分は、Ｈ６プロモータの
５’側のＳｍａＩ部位からＦＩＶｅｎｖコード配列のＡ
ｆｌII部位までとした（図２の１７０７の位置）。２番
目の画分は、同一のＡｆｌII部位からｅｎｖコード配列
の３’側のＳｍａＩ部位であった。結合による生成物を
ＳｍａＩで消化し、３つの画分を遊離させた。一方の画
分は、２つの５’側を大半とする配列を含み、他方の画
分は、２つの３’側を大半とする配列を含んでいた。Ｆ
ＩＶｅｎｖ発現カセットを含む３つ目のＳｍａＩ消化画
分を単離して、Ｈ６プロモートベクターに挿入し、ｐＲ
Ｗ９４５を作った。フレームシフトの可能性を排除する
ために、ｐＲＷ９４５はバクテリア内で増幅させなかっ
た。ｐＲＷ９４５の構築については後で詳しく記す。
【０１６７】１個のｐＭＭ１２５クローンｐＭＭ１２５
＃１１は、Ｈ６プロモーターのＳｍａＩの５’側からＡ
ｆｌII部位を、１７０７の位置において正しい配列を有
していた。別のｐＭＭ１２５クローンであるｐＭＭ１２
５＃１０は、１７０７の位置におけるＡｆｌII部位から
ｅｎｖコード配列のＳｍａＩ３’までの正しい配列を含
んでいた。Ｈ６プロモート５’側を大半とするｅｎｖ配
列を含む１．８ｋｂｐのｐＭＭ１２５＃１１のＳｍａＩ
−ＡｌｆII画分を、０．９ｋｂｐのｐＭＭ１２５＃１０
のＳｍａＩ−部分的ＡｆｌII画分に結合した。結合によ
ってできた生成物を、ＳｍａＩで消化し、２．７ｋｂｐ
の画分を、Ｃ６ベクターｐＭＭ１１７に挿入し、ｐＲＷ
９４５を得た。
【０１６８】Ｃ６挿入プラスミドｐＭＭ１１７を以下の
方法で構築した。３ｋｂｐのＡＬＶＡＣ・ＨｉｎｄIII
クローンの塩基配列を決定し、オープン読取りフレーム
を定義した。オープン読取りフレームと、ＤＮＡ挿入に
おける制限部位とを置き換えるため、ＰＣＲ由来画分を
使用した。ＰＣＲ由来画分は、プライマＣ６Ａ１（配列
番号１７）（５’−ＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＶＶＣＶＶ
ＣＣＶＣＣＴＡＴＶＡＡＡＡＧＴＣＴＴＡＡＴＧＡＧＴ
Ｔ−３’）、Ｃ６Ｂ１（配列番号１８）（５’−ＧＡＡ
ＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＴＴＴＴ
ＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＧＴ
ＡＡＧＴＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡ−３’）、
Ｃ６Ｃ１（配列番号１９）（５’−ＣＣＣＧＧＧＣＴＧ
ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧ
ＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＡＡＴＧＡＧＴＡＴＡＴＡＴ
ＡＡＴＴＧＡ ＡＡＡＧＴＡＡ−３’）、およびＣ６Ｄ
１（配列番号２０）（５’−ＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣ
ＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＣ
ＴＴＡＡＧＴＴＧ−３’）を使用して作った。オリゴヌ
クレオチドＣ６Ａ１とＣ６Ｂ１を使ったＰＣＲのテンプ
レートにはＡＬＶＡＣを使用し、３８０ｂｐの画分を得
た。２回目のＰＣＲ反応では、ＡＬＶＡＣテンプレート
と、プライマーＣ６Ｃ１およびＣ６Ｄ１を使用し、１１
５５ｂｐの画分を得た。このＰＣＲ反応生成物をプール
し、最終ＰＣＲとしてプライマーＣ６Ａ１、Ｃ６Ｄ１に
プライムし、１６１３ｂｐの画分を得た。最終ＰＣＲ生
成物をＳａｃＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＢＳ−ＳＫのＳ
ａｃＩとＫｐｎＩ部位の間に挿入した（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
こうして生成したＣ６挿入プラスミドを、ｐＣ６Ｌと命
名した。このＣ６挿入プラスミドｐＭＭ１１７を、ｐＣ
６Ｌ（図５、配列番号３）のＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ部位
の間の配列ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡ
ＧＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡ
ＣＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＣＴ
ＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣ（配列番号２１）を添加すること
により構築した。
【０１６９】前述のプラスミドｐＲＷ９４５は、Ｃ６挿
入プラスミドにおいてＴ５ＮＴモチーフの変化したＨ６
プロモートＦＩＶｅｎｖコード配列を含む。ｐＲＷ９４
５を使用して、ウイルスのレスキュー用にＡＬＶＡＣを
使い、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組み換え実験を実施し、組み
換え体ＶＣＲ２４２を誘導した。図６は、ＶＣＰ２４２
（配列番号４）に挿入された予想されるヌクレオチド配
列を示す。
【０１７０】実施例２−ＦＩＶｇａｇおよびｐｒｏを発
現する組み換えＡＬＶＡＣの構築 プラスミドｐｔｇ８１３３中のネコ免疫不全ウイルス
（ＦＩＶ）ｇａｇおよびｐｏｌコード配列と、プラスミ
ドｐｔｇ６１８４内のＦＩＶｅｎｖコード配列を、Ｒｈ
ｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）よ
り入手した。このｃＤＮＡクローンは、ＦＩＶのＶｉｌ
ｌａｆｒａｎｃｈｅ株に由来した。図３および図４（配
列番号２）は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘから入手し
たＦＩＶｇａｇおよびｐｏｌコード配列に相当するヌク
レオチド配列を含む。
【０１７１】コア抗原をコードするＦＩＶｇａｇ配列、
そしてプロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラー
ゼをコードするｐｏｌ配列を、初期／中期ワクシニアＩ
３Ｌプロモータ（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｊ ａｎｄ Ｓｔｕｎ
ｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ，１９８８；Ｖｏｓ，Ｊ ａｎｄ Ｓ
ｔｕｎｎｅｕｂｅｒｇ Ｈ．，１９８８）の管理下にお
いた。Ｉ３Ｌプロモーターは、Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９０ａ，ｂでは、６５０７３から６４９７１
の位置に相当する。単一転写ユニット中で、ｇａｇおよ
びｐｏｌコード配列を合成した。ｇａｇとｐｏｌオープ
ン読取りフレーム（ＯＲＦＳ）はたがいに異なり、ｐｏ
ｌＯＲＦの翻訳は、通常、ＦＩＶ感染細胞中で行われる
ように、リボゾーム・フレームシフトメカニズム（Ｍｏ
ｒｉｋａｗａ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，１９９２）を介在
して起こる。
【０１７２】ＰＣＲ由来画分を使用し、Ｉ３Ｌプロモー
トＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌカセットを構築した。ＰＣＲ由
来画分はまた、未成熟の初期転写終了を提供するＴ５Ｎ
Ｔ配列モチーフを変化させる目的でも使用した（Ｙｕｅ
ｎ ａｎｄ Ｍｅａｓ，１９８７）。４６７から４７３
（図３および図４）の間に位置するＴＴＴＴＴＡＴは、
予想されるアミノ酸コード配列を変化させなくても、Ｔ
ＴＴＴＣＡＴに変化した。以下の方法により、Ｉ３Ｌプ
ロモートＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌ発現の構築をマニピュレ
ートした。
【０１７３】ＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード配列を含むｐ
ｔｇ８１３３をテンプレートに使い、プライマーとして
ＭＭ０２７（配列番号２２）（５’−ＣＡＡＡＡＴＧＧ
ＴＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＣＡＡＧ
ＡＧＡＡＧＧＡＣ−３’）とＭＭ０２８（配列番号２
３）（５’−ＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＡＧＧ−
３’）を使って、ＰＣＲを実施し、２４５ｂｐの画分を
作成した。ＭＭ０２７は、４５２の位置（図３および図
４）からプライムし、Ｔ５ＮＴ配列モチーフにヌクレオ
チドの変化を含んでいる３’側を大半とする配列へ向か
った。ＭＭ０２８は、ＨｉｎｄIIIより下流の６９７の
位置からプライムし、ｇａｇの５’側を大半とする配列
に向かった。２４５ｂｐのＰＣＲ由来画分は、４５２の
位置から、変化の生じたＴ５ＮＴモチーフの存在する６
９７の位置にあるＦＩＶｇａｇコード配列を含む。
【０１７４】２回目のＰＣＲでは、ｐｔｇ８１３３をテ
ンプレートとし、ＭＭ０２９（配列番号２４）（５’−
ＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴ
ＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＣ−３’）とＭＭ
０３０（配列番号２５）（５’−ＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡ
ＧＧＴＴＴＡＡＴＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧ
ＧＧＣ−３’）をプライマーに使用して、５０８ｂｐの
画分を作成した。ＭＭ０２９は４９０の位置（図３およ
び図４）からプライムして、ｇａｇコード配列の５’側
を大半とする配列に向かい、Ｔ５ＮＴ配列モチーフを変
化させる。ＭＭ０３０はＩ３Ｌプロモーターの３’側配
列をほとんど含み、ｇａｇ開始コドンからプライムし
て、ｇａｇコード配列の３’側を大半とする配列に向か
う。５０８ｂｐのＰＣＲ由来画分は、Ｉ３Ｌプロモータ
ーの３’側の大半と、４９０の位置まで続くＴ５ＮＴモ
チーフが変化したＦＩＶｇａｇコード配列とを含む。
【０１７５】Ｉ３Ｌプロモーター配列を含むプラスミド
テンプレートｐＭＭ１００を、ＭＭ０３１（配列番号２
６）（５’−ＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡ
ＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣ−
３’）とＭＭ０３２（配列番号２７）（５’−ＣＧＣＣ
ＣＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣ
ＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣ−３’）とをプライマーと
して１３７ｂｐのＰＣＲ由来画分を作成した。このＭＭ
０３１は、５’側を大半とし、続いてＩ３Ｌプロモータ
ーの３’側を大半とする配列からプライムして、Ｉ３Ｌ
プロモーターの５’側を大半とする配列へ続くｂｐを含
む。ＭＭ０３２はＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位を有し、
Ｉ３Ｌプロモーター５’側を大半とする配列がこれに続
き、３’側を大半とする配列に続く。１３７ｂｐのＰＣ
Ｒ由来画分は、Ｉ３ＬプロモートＦＩＶｇａｇの５’側
を大半とする画分を含む。
【０１７６】３つのＰＣＲ画分をプールし、ＭＭ０３２
とＭＭ０２８とをプライマーとしてプライムした。こう
してできた８１４ｂｐの画分を、ＨｉｎｄIIIとＳａｌ
Ｉで消化し、Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇの５’側
を大半とする配列にＴ５ＮＴモチーフが付加した配列を
含む７２６ｂｐの画分を作成した。
【０１７７】ｐｔｇ８１３３をＳａｃＩとＳａｌＩで消
化し、７．２ｋｂｐのプラスミド配列を除去して、４．
７ｂｐの画分を単離し、ＨｉｎｄIIIで部分的に消化し
た。ＦＩＶｇａｇコード配列を６１５の位置からＦＩＶ
ｐｏｌコード配列まで含む、４ｋｂｐのｐｔｇ８１３３
ＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII部分消化生成物を単離した。
【０１７８】ＳａｃＩ−ＳａｌＩ消化したｐＢＳ−ＳＫ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）を、７２６ｂｐのＨｉｎｄIII−Ｓａｌ
ＩによるＰＣＲ由来画分（前述）と、４ｋｂｐのｐｔｇ
８１３３・ＳａｃＩ−ＨｉｎｄIII画分と共に結合す
る。こうしてできたプラスミドｐＭＭ１１６は、ｐＢＳ
−ＳＫ中において、Ｉ３ＬプロモートＦＩＶｇａｇ／ｐ
ｏｌ発現カセットを含む。
【０１７９】Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌ
コード配列を含む４．７ｋｂｐのｐＭＭ１１６・Ａｓｐ
７１８−Ｅｃｌ１３６II画分を、 ２０ｍＭのｄＮＴＰ
ｓ存在下でＫｌｗｎｏｗ処理し、ＳｍａＩ消化したｐＭ
Ｍ１１７に挿入して、ｐＭＭ１２１を作成した。ｐＭＭ
１１７は前述したＣ６挿入プラスミドである。
【０１８０】Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌ
・５’側を大半とする領域を含む１．４ｋｂｐのｐＭＭ
１２１・ＥｃｏＲＩ画分を、ｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ｐＭＭ１２３を得
た。ＰＣＲ由来画分を使い、ｐｏｌのカルボキシル末端
に相当する部分を除去して、ｇａｇ−プロテアーゼ発現
のみを起こすようにした。ＰＣＲ由来画分は終末コドン
を誘導し、続いて１７０９の位置において（図３および
図４）プロテアーゼコード配列を誘導した。Ｉ３Ｌプロ
モーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列を
構築するマニピュレートを、以下の方法で構築した。
【０１８１】Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌ
コード配列を含有するテンプレートｐＭＭ１２１を、Ｍ
Ｍ０６３（配列番号２８）（５’−ＣＡＧＧＡＣＡＴＣ
ＴＡＧＣＡＡＧＡＣ−３’）と、ＭＭ０６４（配列番号
２９）（５’−ＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＡＡＡ
ＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＣＡＴＴＡＣＴＡＡＣＣＴ−
３’）とをプライマーとしてプライムし、５８０ｂｐの
ＰＣＲ由来画分を作成した。ＭＭ０６３は１１４８の位
置（図３および図４）からプライムして、３’側を大半
とする配列へ向かった。ＭＭ０６４は、１７０９の位置
からプライムして、５’側を大半とする配列へ向かっ
た。ＦＩＶプロテアーゼコード配列および１７０９の位
置（図３および図４）に停止コドンを含む５８０ｂｐの
ＰＣＲ由来画分を、ＥｃｏＲＩとＳｍａＩで消化して、
４７５ｂｐの画分を得た。
【０１８２】ｐＭＭ１２３をＦＩＶ挿入部位のＳｍａＩ
３’部位において直線状にし、続いてＥｃｏＲＩで部分
的に消化した。４７５ｂｐのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ・Ｐ
ＣＲ由来画分（前述）をｐＭＭ１２３・ＳｍａＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ部分消化生成物に挿入し、ＥｃｏＲＩ部位を図３
および図４における１２４６の位置で消化した。こうし
て得られたプラスミドｐＭＭ１２７はＦＩＶｇａｇおよ
びプロテアーゼコード配列を含み、続いて停止コドンを
ｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌ
ａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に含む。ｐＭＭ１２７にお
けるＰＣＲ由来画分のヌクレオチド配列を、標準的手順
（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ）にて確認し
た。ＦＩＶプロテアーゼコード配列の３’側における１
ｂｐのみの消化が観察された。ＭＭ０６４を、ＦＩＶプ
ロテアーゼ停止コドンの後にＴＴＴＴＴＡＴを添加する
よう設計した。 停止コドンの後ろにあるＴＴＴＴＴＡ
Ｔ配列のＴは、ｐＭＭ１２７から１個喪失し、その結果
として配列ＴＴＴＴＡＴとなった。
【０１８３】Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびプ
ロテアーゼコード配列を含む１．８ｋｂｐのｐＭＭ１２
７・ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ画分を、部分的に消化したｐ
ＭＭ１１７のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入した。Ｃ
６挿入プラスミドｐＭＭ１１７は前述のとおりである。
ＢａｍＨＩによる部分的消化は、ｐＭＭ１１７中のＳｍ
ａＩ部位に隣接するＢａｍＨＩ部位を消化する目的で行
った。結果として生じたＩ３ＬプロモーターＦＩＶｇａ
ｇおよびプロテアーゼコード配列をＣ６挿入部位に含む
プラスミドを、ｐＭＭ１２９と命名さいた。プラスミド
ｐＭＭ１２９は、ＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとし
て使用するｉｎ ｖｉｔｒｏの組み換え実験に使用し、
組み換え体ＶＣＰ２５３を誘導した。図７（配列番号
５）は、ＶＣＰ２５３におけるＩ３ＬプロモーターＦＩ
Ｖｇａｇ／プロテアーゼ発現カセットについて予想され
るヌクレオチド配列と、フランク領域を示す。
【０１８４】実施例３−ＦＩＶのｅｎｖ、ｇａｇおよび
ｐｒｏを発現する組み換えＡＬＶＡＣの構築 フレームシフト突然変異を起こしているＨ６プロモータ
ーＦＩＶｅｎｖのプラスミドｐＭＭ１２５は前述のとお
りである。ＦＩＶｅｎｖコード配列にフレームシフトを
含む計画的挿入を行った結果、バクテリア内部において
Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖ構築物の残留部分を安定
して維持できるようになった。バクテリアにおける増幅
後、挿入部を除去した。Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖ
コード配列を構築するマニピュレーションを、計画的フ
レームシフト挿入により以下の方法で実施した。
【０１８５】ｐＭＭ１２５＃１１（前述）を、フレーム
シフトを自発的に修復したＰＣＲ由来画分を挿入するこ
とによって修飾し、ＢｓｔＥII部位によりフランクにし
た計画的フレームシフトを誘導した。ＢｓｔＥII挿入部
は１９２０の位置（図２）にある。この挿入により、停
止コドンが誘導され、続いてフレームシフト、ＮｏｔＩ
およびＨｉｎｄIII部位が誘導される。ｐＭＭ１２５に
はＢｓｔＥII部位が一つもない。ＰＣＲ由来画分はま
た、図２における１９２０の位置で、ＡをＣに変化させ
る。ＡからＣへの変化は、予想されるアミノ酸コード配
列を変化させないが、この変化はＢｓｔＥII部位を誘導
する。ｐＭＭ１２５＃１０は１６０４の位置（図２）に
自発的フレームシフトを有する。ｐＭＭ１２５＃１０を
ＰＣＲのテンプレートに使い、オリゴヌクレオチドプラ
イマーＲＷ５４２（配列番号３０）（５’−ＧＴＡＧＣ
ＡＴＡＡＧＧＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＣＴ
ＴＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＣＡＧＴＡ−
３’）を使って、ＢｓｔＥII挿入部を含む３２６ｂｐの
画分を作成した。ＲＷ５４２は１６３２の位置からプラ
イムしてＦＩＶｅｎｖの３’側を大半とする配列へ向か
い、ＲＷ５４５は１９１９の位置からプライムしてＦＩ
Ｖｅｎｖ５’側を大半とする配列へ向かった（図２）。
ｐＭＭ１２５＃１０をＰＣＲのテンプレートに使い、Ｒ
Ｗ５４４（配列番号３２）（５’−ＧＴＡＧＣＡＴＡＡ
ＧＧＴＡＡＣＣＴＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧ
ＴＡＡＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣ
−３’）とＴ３（配列番号３３）（５’−ＡＴＴＡＡＣ
ＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’）をプライマーに使用し
て、ＢｓｔＥII挿入部とＦＩＶｅｎｖコード配列の３’
側の大半を含む配列を含む７９１ｂｐの画分を作成し
た。ＲＷ５４４は１９１４の位置からプライムしてｅｎ
ｖの３’側を大半とする配列に向かう。Ｔ３はｐＢＳ−
ＳＫプラスミドにおいて、ＦＩＶｅｎｖ停止コドンの下
流からプライムし、ＦＩＶｅｎｖの５’側を大半とする
配列に向かう。２つのＰＣＲ生成物をプールし、ＲＷ５
４２とＴ３でプライムして、結果として生じた１．１ｋ
ｂｐの生成物をＥｃｏＲＩで消化し、部分的にＡｆｌII
で消化して、次のｐＭＭ１２５＃１１ベクターへ挿入す
る８７６ｂｐの画分を作成した。ＰＣＲ由来画分とｐＭ
Ｍ１２５＃１１ベクターを、ＡｆｌIIによって１９０７
の位置（図２）で消化した。ｐＭＭ１２５＃１１をＥｃ
ｏＲＩとＥｃｏＲＩとで消化して、ＦＩＶｅｎｖコード
配列の３’側を大半とする、自発的フレームシフトを含
んだ配列を除去した。このＥｃｏＲＩ−ＡｆｌII・ＰＣ
Ｒ由来画分である３７６ｂｐの画分を、ｐＭＭ１２５＃
１１・ＥｃｏＲＩ−ＡｆｌIIベクターに挿入した。結果
として生じたプラスミドｐＭＭ１３４は、ｐＢＳ−ＳＫ
（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ）中においてＨ６プロモーターの３’に
近接するＦＩＶｅｎｖコード配列を含む。ｐＭＭ１３４
はまた、二つのＢｓｔＥII部位化に挿入した計画的フレ
ームシフト突然変異を含む。ｐＭＭ１３４におけるＨ６
プロモーターＦＩＶｅｎｖ配列全体は、ＢｓｔＥII挿入
部を含むことが確認された。期待されたとおり、Ｂｓｔ
ＥII挿入により、Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖ構築物
の残留物が安定して維持できることがわかった。
【０１８６】ｐＭＭ１３４からＨ６プロモーターＦＩＶ
ｅｎｖコード配列をポックスウイルス挿入プラスミドへ
クローンしたあと、ＢｓｔＥII挿入部を除去して、ＦＩ
Ｖｅｎｖコード配列全長が発現できるようにすること。
ＢｓｔＥII挿入部をＢｓｔＥII消化により除去し、続い
て分子内結合を促進するべく希釈結合反応を行う。分子
内結合生成物は、ＢｓｔＥII挿入を実施しなくても、Ｈ
６プロモーターＦＩＶｅｎｖを含むことになる。Ｂｓｔ
ＥII挿入部を除去したあと、Ｈ６プロモーターＦＩＶｅ
ｎｖコード配列はバクテリア内で安定して維持されると
は予測されず、このプラスミドがバクテリア内で増幅さ
れなかった。結合後、このプラスミドをＮｏｔＩで消化
した。ＢｓｔＥII挿入部を含む結合生成物を、ＢｓｔＥ
II挿入部において、ＮｏｔＩ部位において消化されたと
考えられる。ＢｓｔＥII挿入部内でのＮｏｔＩ消化によ
って、プラスミドが生きたままの組み換えポックスウイ
ルスを発生させる能力が予防されると考えられれる。Ｂ
ｓｔＥII挿入部のないＦＩＶｅｎｖの全長が、ＮｏｔＩ
消化によって増えるとは考えられず、ＦＩＶｅｎｖコー
ド配列は影響を受けないまま残ると考えられる。
【０１８７】実施例４−Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａ
ｇおよびプロテアーゼコード配列を伴うＣ６におけるＨ
６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列の構築Ｂｓｔ ＥII挿入部を伴ったＨ６プロモーターＦＩＶｅｎ
ｖコード配列を含むｐＭＭ１３４は前述のとおりであっ
た。ＢｓｔＥIIを伴うｐＭＭ１３４由来の、２．７ｋｂ
ｐのＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列を有する
ＳｍａＩ画分を、次のｐＭＭ１２９挿入プラスミドへク
ローン化した。
【０１８８】Ｃ６にＩ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇお
よびプロテアーゼコード配列を有するｐＭＭ１２９は前
述のとおりであった。ｐＭＭ１２９における、Ｉ３Ｌプ
ロモーターのＳａｌＩ５’部位を、３０ｍＭのｄＮＴＰ
ｓ存在下でＫｌｅｎｏｗ処理によりブラント化した末端
部とした。Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列を
含み、ＢｓｔＥII挿入部を伴う ２．７ｋｂｐのｐＭＭ
１３４ＳｍａＩ画分を、ｐＭＭ１２９のブラント末端化
したＳａｌＩ部位に挿入した。Ｈ６プロモーターＦＩＶ
ｅｎｖコード配列は、ｐＭＭ１３８において、Ｉ３Ｌプ
ロモーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列
の５’側に位置する。ＦＩＶコード配列は、同じ方向へ
転写される。
【０１８９】ｐＭＭ１３８における２つのＢｓｔＥII部
位は、フレームシフト部分を含む挿入部を取り囲んでい
る。ｐＭＭ１３８をＢｓｔＥIIで消化して、挿入部を除
去し、続いて結合させた。こうしてできたプラスミドｐ
ＭＭ１４６をバクテリア内で増幅させなかった。ｐＭＭ
１４６をｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換え試験実施前に、Ｎｏ
ｔＩで消化するよう設計した。ＮｏｔＩ消化には２つの
目的があった。一つ目は、ＢｓｔＥII挿入部を含まない
ようにしたいあらゆるプラスミドを、挿入部においてＮ
ｏｔＩで消化し、ドナープラスミドを排除して生きたま
まのＡＬＶＡＣ組み換え体を得ることであった。２つ目
は、ＮｏｔＩがｐＢＳ−ＳＫバックボーンにおいてｐＭ
Ｍ１４６を直線化し、所望するＡＬＶＡＣを効率よく得
ることであった。ＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとし
て使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み換え試験実施前
に、ｐＭＭ１４６をＮｏｔＩで消化して、組み換え体Ｖ
ＣＰ２５５を誘導した。図８および図９（配列番号６）
は、ＶＣＰ２５５におけるＨ６プロモーターＦＩＶｅｎ
ｖ／Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発
現カセットと、フランク領域を示す。
【０１９０】実施例５−ＦＩＶ ９７ＴＭ、ｇａｇ、お
よびｐｒｏを発現する組み換え体ＡＬＶＡＣの構築 ＦＩＶエンベロープグリコプロテインは断裂生成物ｇｐ
９７とｇｐ４０から構成される。ＦＩＶｅｎｖコード配
列を、ｇｐ４０とＦＩＶｅｎｖコード配列から得た膜透
過アンカードメインと交換することによって、続くＦＩ
Ｖ ９７ＴＭの構築において修飾した。ｇｐ９７を含有
するＦＩＶ ９７ＴＭを、以下の方法で構築した。
【０１９１】ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ−ＦＴＶ１（２４２
ｂｐ）を、ｐＭＭ１２５＃１０（前述のＦＩＶｅｎｖ
に、ＡｆｌＩＩ部位から３’側の大半からなる配列まで
の正確な配列を含む）をテンプレートとして使用し、プ
ライマーとしてオリゴヌクレオチドＭＷ１９６（配列番
号３４）（５’−ＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＣＡＴＧＧ
ＧＧＧ−３’）と、ＭＷ１９５Ａ（配列番号３５）
（５’−ＧＡＴＡＣＦＴＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴ
ＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣ−３’）
を使用して合成した。ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ−ＦＩＶ２
（１９３ｂｐ）は、ｐＭＭ１２５＃１０をテンプレート
として使い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＭＷ
２９４Ａ（配列番号３６）（５’−ＧＡＡＴＡＴＡＡＡ
ＣＣＴＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧ
ＡＧＧＴＡＴＣ−３’）とＭＷ１９７（配列番号３７）
（５’−ＡＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＴＣ
ＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣ−３’）を使
用して合成した。ＰＣＲ−ＦＩＶ３（３９３ｂｐ）は、
ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ−ＦＴＶ１とＰＣＲ−ＦＩＶ２
をテンプレートとし、オリゴヌクレオチドＭＷ１９６Ｍ
Ｗ１９７をプライマーとして合成した。ＰＣＲ−ＦＩＶ
３のＡｆｌII／ＥｃｏＲＩによる完全な消化を実施し、
２８４ｂｐの画分を単離した。この画分を、ｐＭＭ１２
５＃１１（前述のＦＩＶｅｎｖと、５’側を大半とする
配列から前述のＥｃｏＲＩ部位までを含む正確な配列を
含む）の４．８ｋｂｐからなるＡｆｌII／ＥｃｏＲＩ画
分に結合させた。こうして得られたプラスミドｐＭＡＷ
１０３は、Ｈ６プロモーターＦＩＶ９７ＴＭを含む。
【０１９２】ＰｓｔＩ部位をＨ６プロモーターの上流
へ、以下の方法により添加した。ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ
−ＦＩＶ４（３５９ｂｐ）を、ｐＭＡＷ１０３をテンプ
レートにし、オリゴヌクレオチドＭＷ２０９（配列番号
３８）（５’−ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧ
ＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡ−３’）とＭＭ
０３６（配列番号１６）（５’−ＣＣＴＣＴＴＧＡＡＴ
ＴＴＣＧＴＴＣＣ−３’）をプライマーとして合成し
た。ＰＣＲ−ＦＩＶ４のＨｉｎｄIII／ＮｒｕＩによる
完全消化を実施し、１１０ｂｐの画分をｐＭＡＷ１０３
の５．０ｋｂｐからなるＨｉｎｄIII／ＮｒｕＩ画分に
挿入し、プラスミドｐＭＡＷ１０３Ａを得た。この２１
２６ｂｐからなるｐＭＡＷ１０３の、Ｈ６プロモーター
ＦＩＶ ９７ＴＭを含むＰｓｔＩ画分を、ｐＭＷ１１７
（前述）のＰｓｔＩ部位へ挿入し、プラスミドｐＭＡＷ
１０４を得た。
【０１９３】２８５２ｂｐからなるｐＭＡＷ１０４をＢ
ａｍＨＩで部分的に消化して得た、Ｈ６プロモーターＦ
ＩＶ ９７ＴＭ含有の生成物を、ＢａｍＨＩ消化したｐ
ＭＷ１２９（Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびｐ
ｒｏが前述のようにＣ６に含まれる）に挿入した。こう
して得られたプラスミドｐＭＡＷ１０５は、Ｃ６におい
てＨ６プロモーターＦＩＶ ９７ＴＭおよびＩ３Ｌプロ
モーターＦＩＶｇａｇおよびｐｒｏを含む。プラスミド
ｐＭＡＷ１０５を使用して、ＡＬＶＡＣをレスキュー用
ウイルスとして使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み換え
実験において、組み換え体ＶＣＰ３２９を誘導した。図
１０および図１１（配列番号７）は、ＶＣＰ３２９を作
成する上で予測されるヌクレオチド配列を示す。
【０１９４】実施例６ ＡＬＶＡＣ ＦＩＶ 組換体発
現分析 ＡＬＶＡＣ組換体であるｖＣＰ２４２、ｖＣＰ２５３、
ｖＣＰ２５５やｖＣＰ３２９にコードされた適当なＦＩ
Ｖ−特異的遺伝子産物の発現を各種の分析より示した。
発現解析は、ＦＩＶ血清陽性のネコより得た適当なモノ
クローナル抗体または血清を用いて行った。これら抗
体、血清のＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ−感染した細胞中の発現
を確認する上での性能は同等であった。従って、特に記
載されていない限り、血清陽性の個体よりモノクローナ
ル抗体を得て、これを利用して発現を確認した。
【０１９５】ＶＣＰ２４２ ＦＩＶ Ｅｎｖの発現はＥ
ＬＩＳＡ（後述）により確認した。ＦＩＶ Ｅｎｖ特異
モノクローナル抗体（Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌ
ｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いたＦＡＣＳによる免疫蛍
光アッセーではＶＣＰ２４２は表面に発現していた。Ｆ
ＩＶに感染したネコから得たポリクローナル血清と２種
類のモノクローナル抗体（後述）を用いた免疫沈降で
は、ＶＣＰ２４２は沈降反応陽性であった。即ち、特別
な実験なしに発現確認のためのモノクローナル抗体を血
清陽性の個体から得ることができる。
【０１９６】ＦＡＣＳによりＶＣＰ２５３ではＧａｇは
内部発現していることが確認された。ＶＣＰ２５３は成
熟型Ｇａｇ ｐ２４の発現を調べる免疫沈降試験で陽性
であった。主要なＧａｇ前駆体は３７ｋＤａの大きさを
示す位置に検出された；Ｇａｇの開裂産物を示す別のシ
グナルが４９ｋＤａ、４０ｋＤａと３２ｋＤａの位置に
確認された。
【０１９７】Ｅｎｖ特異モノクローナル抗体（後述）を
用いたＦＡＣＳでは、ＥｎｖはＶＣＰ２５５の表面に発
現していた。Ｇａｇ特異抗体を用いたＦＡＣＳではＶＣ
Ｐ２５５ではＧａｇは内部で発現していことが示され
た。ＶＣＰ２５５を各遺伝子産物に対するモノクローナ
ル抗体で免疫沈降させて調べた；Ｇａｇはおよそ４９ｋ
Ｄａ、４０ｋＤａ、３７ｋＤａと２４ｋＤａの位置にシ
グナルを持っていた；ＦＩＶ Ｅｎｖの発現体は１３０
ｋＤａと９０ｋＤａの位置にシグナルを持っていた。
【０１９８】ＶＣＰ３２９による９７ＴＭとｇａｇの発
現はＦＩＶに感染したネコより集めたプール血清を用い
た免疫沈降法により検出した。
【０１９９】ＦＡＣＳ分析：ＶＣＰ２５５はＣ６座の中
にネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のｅｎｖ、ｇａｇな
らびにプロテアーゼをコードしている配列を含んでい
る。ｐＭＭ１４６をＡＬＶＡＣを用いたｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでの組換体発現実験にレスキューウイルスとして利用
し、組換体ＶＣＰ２５５を誘導した。ＶＣＰ２５５ Ｆ
ＩＶ−特異遺伝子産物の発現は蛍光活性化セルソーター
（ＦＡＣＳ）を用いて調べた。ＶＣＰ２５５感染細胞の
表面上のＦＩＶのＥｎｖ蛋白質産物を測定した。内部で
の発現解析のためにＦＩＶ ｐ２４を測定した。ＦＡＣ
Ｓ解析に用いた抗血清は次の通りである。
【０２００】１）モノクローナル抗−ＦＩＡ ｅｎｖ：
Ｒｏｈｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘより得た１２８Ｆ１０ Ｅ
Ｐ１１０５９２（１：２００希釈） ２）モノクローナル抗−ＦＩＡ ｐ２４：Ｒｏｈｎｅ
Ｍｅｒｉｅｕｘより得たプール１２５Ａ３、３１４Ｂ５
ＥＰ０７２０９２（１：１００希釈） ３）モノクローナル抗−狂犬病Ｇ：Ｃ，Ｔｒｉｍａｒｃ
ｈｉ、ＧｒｉｆｆｉｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎｔより得た２４−３Ｆ−１０ ０２１３８７
（１：２００希釈） ４）Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより得た
イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）が結合し
たポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇＧ、カタログ番号
６０５３４０、ロット番号２４０６４（１：１００希
釈）細胞表面での発現に関するＦＡＣＳ分析 ：１０％のウ
シ胎児血清、２０ｍＭグルタミンと０．５％ペニシリン
−ストレプトマイシンを加えた最低必須培地（Ｓ−ＭＥ
Ｍ：Ｇｉｂｃｏ＃３８０−２３８０ＡＪ）の中で１×１
０７のＨｅＬａ−Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ２．
２）に５×１０７ＦＦＵのＶＣＰ２５５を感染させた。
細胞を１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで洗浄した。洗浄後、細胞
をＢｅｃｋｍａｎ ＧＰＫＲ遠心分離装置で１０００Ｒ
ＰＭ、５分間遠心して沈殿した。感染細胞の沈殿を１ｍ
ｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁し、５ｍｌのサーシュタット
（Ｓａｒｓｔａｄｔ）チューブに移し、３７℃で一晩ゆ
っくりと回転した。
【０２０１】一晩反応させた後、この感染細胞の一部１
００μｌを５ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。
この細胞を３ｍｌの０．２％のＮａＮ３と０．２％のウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ−ＣＭＦ（１
３７ｍＭ、ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４、８ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）
で洗浄した。細胞を沈殿させ、上清を捨てた。次の様に
して特異抗体を第一のチューブに、そして非特異抗体
（抗狂犬病Ｇ）を第二のチューブに加えた。
【０２０２】０．２％ＮａＮ３と０．２％のＢＳＡを加
えたＰＢＳ−ＣＭＦで希釈された抗体（事前にＨｅＬａ
細胞で前吸収した）１００μｌを各沈殿細胞に加え、４
℃で３０分間反応させる。細胞を３ｍｌの０．２％Ｎａ
Ｎ３と０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ−ＣＭＦで２回洗
浄し、沈殿させた。０．２％ＮａＮ３と０．２％のＢＳ
Ａを含むＰＢＳ−ＣＭＦで１：５０に希釈したＦＩＴＣ
結合二次抗体（事前にＨｅＬａ細胞で前吸収した）１０
０μｌを加え、暗所４℃で３０分間反応させた。細胞を
３ｍｌの０．２％ＮａＮ３と０．２％のＢＳＡを含むＰ
ＢＳ−ＣＭＦで２回洗浄し、沈殿させた。沈殿した細胞
を０．２％ＮａＮ３と０．２％のＢＳＡを含む１ｍｌの
ＰＢＳ−ＣＭＦに再懸濁し、５ｍｌのポリスチレンチュ
ーブに移してからＦＡＣＳにかけて測定した。
【０２０３】内部発現に関するＦＡＣＳＣＡＮ分析 ：
１０％のウシ胎児血清、２０ｍＭグルタミンと０．５％
ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた最低必須培地
（Ｓ−ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ＃３８０−２３８０ＡＪ）の
中で１×１０７のＨｅＬａ−Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＃Ｃ
ＣＬ２．２）に５×１０７ＰＦＵのＶＣＰ２５５を感染
させた。感染した細胞は３７℃で３０分間時々混合を加
え、反応させた。細胞を１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで洗浄し
た。洗浄後、細胞をＢｅｃｋｍａｎ ＧＰＫＲ遠心分離
装置で１０００ＲＰＭ、５分間遠心して沈殿させた。感
染細胞の沈殿を１ｍｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁し、５ｍｌ
のサーシュタット（Ｓａｒｓｔａｄｔ）チューブに移
し、３７℃で一晩ゆっくりと回転した。
【０２０４】一晩反応させた後、この感染細胞の一部１
００μｌを５ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。
この細胞を３ｍｌの０．２％のＮａＮ３を含むＰＢＳ−
ＣＭＦで洗浄した。０．２％のＮａＮ３を含むＰＢＳ−
ＣＭＦの４％パラフォルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｉｅ
ｎｃｅｓ Ｉｎｃ。＃００３８０）液、ｐＨ７．４１０
０μｌを沈殿した細胞に加え、氷上で１０分間反応させ
た。次の様にして特異抗体を第一チューブに、そして非
特異抗体（抗狂犬病Ｇ）を２番目のチューブ加えた。
【０２０５】パラホルムアルデヒド処理された細胞を
０．２％のＮａＮ３を含む３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦで洗
浄した。洗浄後、０．２％ＮａＮ３と１％のサポニン
（ＳＩＧＭＡＳ−７９００）と２０％の加熱不活化した
ウシ新生児血清（Ｇｉｂｃｏ ＃２００−６０１０Ａ
Ｊ）を含むＰＢＳ−ＣＭＦ１００μｌを加えた。細胞を
氷上で２０分間反応させてから０．２％のＮａＮ３を含
む３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦで洗浄した。
【０２０６】０．１％サポニンと２０％の加熱不活化し
たウシ新生児血清を加えたＰＢＳ−ＣＭＦで希釈された
抗体（事前にＨｅＬａ細胞で前吸収した）１００μｌを
各沈殿細胞に加え、４℃で３０分間反応させた。細胞を
３ｍｌの０．２％ＮａＮ３と０．１％のサポニンを含む
ＰＢＳ−ＣＭＦで２回洗浄し、沈殿させた。
【０２０７】０．２％ＮａＮ３と０．１％のサポニンと
２０％の加熱不活化したウシ新生児血清を含むＰＢＳ−
ＣＭＦで１：５０に希釈したＦＩＴＣ結合二次抗体（事
前にＨｅＬａ細胞で前吸収した）１００μｌを加え、暗
所４℃で３０分間反応させた。細胞を３ｍｌの０．２％
ＮａＮ３と０．１％のサポニンを含むＰＢＳ−ＣＭＦで
２回洗浄し、沈殿させた。沈殿した細胞を０．２％Ｎａ
Ｎ３を含む１ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦに再懸濁し、５ｍｌ
のポリスチレンチューブに移してからＦＡＣＳにかけて
測定した。
【０２０８】ＶＣＰ２５５のＦＡＣＳ分析：抗血清／Ｈ
ｅＬａ懸濁液をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎモデ
ルＦＣ ＦＡＣＳｃａｎフローメーターにかけて測定し
た。データはＬｙｓｉｓＩＩソフトウエアー（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＫ）で分析した。抗血清
／ＨｅＬａ懸濁液は４８８ｎｍのアルゴンレーザーで励
起され、ＦＩＴＣ放射光スペクトラをＦＬ−１チャンネ
ル検出器で特定した。１０，０００細胞について非ゲー
トデータを集めた。
【０２０９】ＡＬＶＡＣ感染ＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳ分
析から得た放射蛍光スペクトラより狂犬病ＧとＦＩＶ−
特異遺伝子産物のバックグランドレベルが示された。ｒ
ａｂｉｅｓＧグリコタンパク質のバックグランドレベル
は、ＶＣＰ２５５感染ＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳ分析によ
って得られる。
【０２１０】ＦＩＶ特記モノクローナル抗体を用いて得
たＶＣＰ２５５が感染したＨｅＬａ細胞の放射蛍光スペ
クトラからは、ＦＩＶ−特異遺伝子産物の発現が示され
た。ＦＩＶ ｐ２４をコードする配列の産物はＶＣＰ２
５５感染ＨｅＬａ細胞の内部に検出された。ＦＩＶ Ｅ
ｎｖ産物はＶＣＰ２５５感染ＨｅＬａ細胞の表面に検出
された。
【０２１１】免疫沈降分析：ＣＥＦあるいはＶＥＲＯ細
胞にＡＬＶＡＣ（親ウイルス）、ＶＣＰ２４２，ＶＣＰ
２５３，ＶＣＰ２５５あるいはＶＣＰ３２９を１０ｐｆ
ｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで感染させた。１時間吸収させた
後、イノキュラムを除き、細胞に、２％の透析したウシ
胎児血清と［３５Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ， Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；
３０ｕＣｉ／ｍｌ）を含む２ｍｌの改良型イーグル培地
（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（システインとメチ
オニンを除いた）を重層した。感染後１８−２４時間目
に１ｍｌの３×緩衝液Ａ（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、３％
ＮＰ−４０、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），３
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ Ｎａ−アザイドと０．６
ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）を加えて融解物を集め、ＦＩＶ
ｅｎｖとｇａｇ遺伝子産物の発現について解析した。
上記のポリクローナルネコ血清あるいはＦＩＶ−特異モ
ノクローナル抗体を用い、次の様にして免疫沈降解析を
行った。
【０２１２】融解物を一晩４℃でＦＩＶ−特異抗血清−
プロテインＡ−セファロース複合体と反応させた。サン
プルを１×の緩衝液Ａで４回洗浄し、さらにＬｉＣｌ２
／尿素緩衝液（２００ｍＭ ＬｉＣｌ、２Ｍ 尿素と１
０ｍｍＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。２×Ｌ
ａｅｍｍｌｉ緩衝液（１２４ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．
８）、４％ ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２
−メルカプトエタノール）を加えて５分間煮沸し、沈殿
した蛋白質を解離させた。この蛋白質を１０％のＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルで分画してからメタノールで
固定し、１ＭのＮａ−サリチル酸で処理してフルオログ
ラフィーにかけた。ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組換体に感染し
た細胞からは適当な大きさを持つ蛋白質が沈殿してきた
が、感染していない細胞やＡＬＶＡＣ感染細胞では沈殿
してこなかった。この結果はＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組み換
え体ではＦＩＶ遺伝子産物が適切に発現していることを
示している。
【０２１３】ＥＬＩＳＡ 分析：一次ニワトリ胚繊維芽
（ＣＥＦ）細胞にＶＣＰ２１９，ＶＣＰ２４２，あるい
はＡＬＶＡＣを感染させた。感染細胞を次のＦＩＶ−特
異的モノクローナル抗体を用いて分析した（Ｒｈｏｎｅ
Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）。
【０２１４】 ＥＬＩＳＡにより試験した血清サンプル： １．ＦＩＶ−感染ネコの血清： Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘより得た。
【０２１５】ネコ番号＃３４と＃１０３ ２．正常ネコ血清：ネコ番号＃１２２９（Ｓｅｌｅｃｔ
Ｌａｂｓ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ） ３．ＶＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）で免疫し得たウサ
ギ血清： ウサギ番号Ａ０３９：前採血 １４週 感染細胞融解物は次のようにして調整した。ＣＥＦ細胞
のローラーボトルに、無血清培地中細胞当たり５ＰＦＵ
のＭＯＩでＡＬＶＡＣ，ＶＣＰ２１９、あるいはＶＣＰ
２４２を感染させた。感染２０時間後、細胞が完全に円
形になるが剥離していない状態で各ローラーボトルから
細胞を集めた。採取した細胞を培地中にそそぎ、ＰＢＳ
で１回洗浄してからアプロチニン（３．６ Ｔ．Ｉ．
Ｕ；Ｓｉｇｍａ ＃Ａ−６２７９）を添加された３ｍｌ
のＰＢＳを加えて細胞を解離させた。採取した細胞を氷
上で４分間超音波処理してから１０００×ｇで１０分間
遠心分離した。上清を集めたところ、各調整サンプルの
蛋白濃度はおよそ７ｍｇ／ｍｌであった。
【０２１６】カイネティックＥＬＩＳＡを次の様にして
行った。血清サンプル（前記）をサンドイッチカイネテ
ィックＥＬＩＳＡを用いて測定し、ＦＩＶｅｎｖとｇａ
ｇ遺伝子の産物を検出した。マイクロタイタープレート
は上記一覧したＦＩＶ ｅｎｖまたはＦＩＶｇａｇに特
異的なプールしたモノクローナル抗体を用いて２または
５μｇ／ウエルで固相化した。感染した細胞の融解物を
０．２、１または５μｇ／ウエルの割合で加え、モノク
ローナル抗体により補足させた。各血清サンプルは１：
１００に希釈して３重測定した。抗体は１：２００に希
釈された西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）標識抗ネコ血
清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
カタログ番号１０２−０３５−００３）あるいはＨＲ
Ｐ標識抗ウサギ血清（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｐ２１
７）と、ＨＲＰ基質であるｏ−フェニレンジアミン ジ
ヒチロクロライド（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉ
ｎｅｄｉｈｙｃｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＯＰＤ）を用
いて検出した。Ａ４５０の最適密度を15分間測定し、各
サンプルについて１分当たりのｍＯＤとして速度を計算
した。
【０２１７】これらＥＬＩＳＡの結果よりＦＩＶ Ｅｎ
ｖが感染したネコの血清ではＦＩＶがＥｎｖとＧａｇの
発現が検出できるが、正常ネコ血清では検出できないこ
とが明瞭に示された（データ未提示）。ＥｎｖはＥｎｖ
−特異的ＭＡｂで調整したプレートを利用した場合ＶＣ
Ｐ２４２に感染した細胞に由来する融解物には示された
が、ＡＬＶＡＣからの融解物またはＶＣＰ２１９に感染
した融解物については検出されなかった。同様にＧａｇ
はＧａｇ−特異Ｍａｂを用いたプレートを利用しＶＣＰ
２１９に感染した細胞を調べた場合には検出されたが、
ＡＬＶＡＣあるいはＶＣＰ２４２に感染した細胞につい
ては検出されなかった。
【０２１８】
【表２】
【表３】 実施例７−ネコに於けるＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組換体効率 グループ分けと免疫感作 ：週齢１２週のＳＰＦ動物を合
計３６種類Ｌｉｂｅｒｔｙ（Ｗａｖｅｒｌｙ，ＮＹ）よ
り得て、次の７つの群に分けた：
【表４】 免疫感作は以下の様に行った：Ａ群（ネコ６匹） 感作日（日） 一次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ（ＶＣＰ２４２） ０日目 二次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ ２８日目 三次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ ５６日目Ｂ群（ネコ６匹） 一次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ２５５） ０日目 二次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ ２８日目 三次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ ５６日目Ｃ群（ネコ６匹） 一次感作：ＡＬＶＡＣ−ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ２５３） ０日目 二次感作：ＡＬＶＡＣ−ｇａｇ／ｐｒｏ ２８日目 三次感作：ＡＬＶＡＣ−ｇａｇ／ｐｒｏ ５６日目Ｄ群（ネコ６匹） 一次感作：ＡＬＶＡＣ−９７ＴＭ ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ３２９）０日目 二次感作：ＡＬＶＡＣ−９７ＴＭ ｇａｇ／ｐｒｏ ２８日目 三次感作：ＡＬＶＡＣ−９７ＴＭ ｇａｇ／ｐｒｏ ５６日目Ｅ群（ネコ６匹／コントロール） 一次感作：ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ） ０日目 二次感作：ＡＬＶＡＣ ２８日目 三次感作：ＡＬＶＡＣ ５６日目Ｆ群（ネコ３匹／ブースト） 一次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ２５５） ０日目 二次感作：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ ２８日目 ブースト：不活性化ＦＩＶ細胞ワクチン（ＩＣＶ） ５６日目Ｇ群（ネコ３匹／コントロール） 一次感作：ＡＬＶＡＣ ０日目 二次感作：ＡＬＶＡＣ ２８日目 ブースト：不活性化ＦＩＶ細胞ワクチン ５６日目 全てのネコに筋注により１ｍｌの滅菌ＰＢＳ注に１×１
０８ＰＦＵのＡＬＶＡＣ組換体液を投与された。ＩＣＶ
ブーストは２．５×１０７固定同種ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌ
ｕｍａが感染したネコＴ−細胞（Ｆ１−４細胞株）に２
５０μｇのムラミルジペプチドが混合し調整された。Ｉ
ＣＶブーストは皮下投与された。
【０２１９】誘発：全てのネコには最終免疫感作終了４
週後に５０ＣＩＤ５０のＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａ（Ｆ
ＩＶ Ｐｅｔａｌｕｍａ株を感染させたＰＢＭＣ培養体
から得た無細胞上清）が投与され誘発された。
【０２２０】誘発を受けた動物のＦＩＶ−特異的ウイル
ス学的状態を調べるために次の検査を行った。これによ
りＡＬＶＡＣをベースにしたＦＩＶワクチン候補の予防
効果を直接測ることができる。
【０２２１】１）ウイルス分離：ＲＴアッセーによる感
染性ＦＩＶの検出。ウイルス分離のための誘発を行った
後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）、骨髄（ＢＭ）細胞
およびリンパ節（ＬＮ）細胞を分離した（Ｙａｍａｍｏ
ｔｏら、１９９１、１９９３；Ｏｋａｄａら、１９９
４）。ウイルス分離は培養上清中の逆転写酵素（ＲＴ）
活性をモニタリングして行った。分離した細胞をＩＬ−
２存在下に４週間培養した。通常の測定法（レンチウイ
ルス特異的な）に従いＭｇ＋＋−依存型ＲＴ活性を測定
するために上清の一部１００μｌを取った。
【０２２２】２）ＦＩＶ−特異的ＰＣＲ。ＰＢＭＣ，Ｂ
Ｍ，およびＬＮ細胞から抽出したＤＮＡについてプロウ
イルス配列を検出した。感度を上げるために４種類のコ
ンセサンスプライマーを利用して、ｅｎｖ−あるいはｇ
ａｇ−特異的コーディング域を増幅した（Ｙｍａｍｏｔ
ｏら、１９９１；Ｏｋａｄａら、１９９４）。
【０２２３】最初のPCR増幅に続けて、増幅産物の1/25
を取りネステッドプライマーペアーを利用して２回目の
増幅を行った。
【０２２４】誘発前後にサンプルについて行ったウイル
ス学的アッセーの結果を表３と４に示した。ＲＴ測定ま
たはＦＩＶ−特異的ＰＣＲ分析でも誘発前にＦＩＶウイ
ルス血症を示したネコはいなかった（表３）。誘発後８
週までにＡＬＶＡＣ親株ウイルスを３回投与された６匹
のネコのうち４匹が持続性のＦＩＶ−特異的血症を発症
した（表３）。これらのネコが感染していることは、誘
発後に採取した組織サンプルからウイルスが分離される
ことや、ＰＣＲの結果、そして誘発後に明瞭はＦＩＶ−
特異的なセロコンバージョンがみられることからも示さ
れた（表４と５）。コントロール群のその他の２匹のネ
コ（ＱＡ４とＱＥ３）については、感染を示す明確な徴
候は観察されなかった。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ
ｅｎｖ（ＶＣＰ２４２）、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ ｅｎｖ
／ｇａｇ−ｐｒ（ＶＣＰ２５５）、またはＡＬＶＡＣ−
ＦＩＶ ９７ＴＭＧ（ＶＣＰ３２９）のいずれかを３回
接種された（１０８ｐｆｕ／回）ネコの群と上記コント
ロール群との間に感染効率について差は認められなかっ
た。
【０２２５】ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ ｇａｇ−ｐｒ（ＶＣ
Ｐ２５３）を３回接種すると、明らかにＦＩＶ誘発の暴
露による感染から完全に防御された。対象となった６匹
のネコの全例で感染が防御されたことが、誘発後２９週
間にわたって行われた末梢およびリンパ組織を対象とし
たウイルス分離実験ならびにＦＩＶ−特異的ＰＣＲ測定
から明瞭にしめされた（表３と４）。さらに、ウエスタ
ンブロットあるいはＥＬＩＳＡによればこれらのネコで
はＦＩＶに対し血清反応性となるセロコンバージョンが
起きていなかった（表４と５）。ＶＣＰ２５３の感染効
率をさらに確認するために、この群の２匹の動物から細
胞（ＰＢＭＣｓ、リンパ節と骨髄）を取りＳＰＦ子ネコ
に移植した。しらべた限りではこれらのネコはウイルス
分離（ＲＴおよびＰＣＲ）ならびにＦＩＶ−特異ウエス
タンブロットについて陰性であったが、一方感染したコ
ントロールのネコ（Ｐｙ２）から得た同様の細胞を移植
されたＳＰＦネコについては、これら検査から明瞭に感
染していることが示された。
【０２２６】これらの結果は、Ｇａｇ−ｐｒはレンチウ
イルスの誘発暴露を十分に防御することを示している。
表６に見られる様に、これらの結果は統計的にも有意で
ある。またこの結果はＥｎｖの存在が防御的免疫反応の
確立に積極的に干渉する可能性があることも示してい
る。また、ＶＣＰ２５５（２×）を接種され、さらにＩ
ＣＶ免疫源を追加した実験のデータは、一次／ブースト
処理によりＥｎｖの干渉に打ち勝てることを示している
（表３と４）。ＡＬＶＡＣ親株ウイルスの投与を２回受
けてからＩＣＶを追加された群のネコは誘発暴露を受け
るとたやすく感染してしまうことから、ＶＣＰ２５５が
このプライミング活性を担っていることは明らかである
（表３と４）。
【０２２７】まとめると、本データはＦＩＶ Ｇａｇ−
ｐｒだけを含むサブユニット免疫源を利用することでネ
コをＦＩＶ感染から初めて防御したことを示している。
事実、Ｅｎｖは感染効率を低下させた。
【０２２８】これらデータの重要点はレンチウイルスワ
クチンの開発にとって一般的なものとも考えられる。Ｇ
ａｇ−Ｐｒだけを用いた防御はワクチンおよび診断方法
にとり重要ないくつかの要素を提供する。第一は、既存
のＥｎｖをベースとしたアッセーを行い、ワクチン接種
を受けた個体と感染した個体とをたやすく分けることが
できることである。第二に、Ｇａｇ−ｐｒはＥｎｖ種に
比べ各種のレンチウイルス分離株間で変異が少なく、従
ってこれら変異株をまたいだ防御反応が展望できること
である。
【０２２９】
【表５】
【表３】
【表６】
【表４】 実施例８ − ネコの体内における多様な亜類型FIV誘
発（攻撃）試験に対して、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組換え型
は防御免疫性を引き起こす 材料と方法 動物：特定の病原体フリー（ＳＰＦ）が、リバティー研
究所より購入された。
【０２３０】ワクチン調製：カナリポックスウイルス
（ＡＬＶＡＣ）−ＦＩＶ組換え型を、上記のように生成
した（ＶＣＰ２５５）。 ＡＬＶＡＣ ＶＣＰ２５５ワ
クチンは、感染したＣＥＦの溶解物フリー血清から調製
した。ＡＬＶＡＣ ＶＣＰ２５５免疫を、筋肉内に１×
１０８ＰＦＵで投与した。細胞不活性化ワクチン（ＩＣ
Ｖ）は、２５０μｇのＳＡＦ／ＭＤＰアジュバント（Hi
oseら、1995）と混合されたパラホルムアルデヒドで不
活性化されたＦｌ−４細胞（長期にわたってＦＩＶ Ｐ
ｅｔａｌｕｍａを感染させたネコのリンパ細胞系）２×
１０８からなり、これを皮下投与した。
【０２３１】グループ分けおよび免疫プロトコル：誘発
研究では６匹のネコを使った。すなわち、実施例７で記
載したＦＩＶ Ｐｅｔａｌｕｍａ誘発を受けた、ＡＬＶ
ＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ／ＩＣＶ免疫処置したグ
ループ（＃ＰＹ４、＃ＱＨ３、＃ＱＡ６）、およびＦＩ
Ｖ Ｂａｎｇｓｔｏｎのチャレンジの前に免疫処置を受
けていない、年齢を釣り合わせた３匹のＳＰＦネコ（＃
ＥＪ２、＃ＤＨ３、＃ＧＵ５）の制御（管理）グルー
プ。（表５を参照）。
【０２３２】チャレンジ（誘発）：第２の誘発接種源は
７５ ＩＤ５０細胞フリーＦＩＶＢａｎｇｓｔｏｎ（亜
類型Ｂ）からなっており、最初のＦＩＶ Ｐｅｔａｌｕ
ｍａ誘発後、８ヶ月後に投与された（実施例７を参
照）。
【０２３３】免疫原性監視：ＦＩＶ特殊抗体反応の誘導
を、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ 免疫ブロッ
ト）により確認した。ウイルス中和抗体反応（ＶＮＡ）
が、先に記載した分析検定を使って確認された（Ｙａｍ
ａｍｏｔｏら、1991)。
【０２３４】ウイルス伝染性監視：ウイルス感染はさま
ざまな方法で監視が行われた。これには、ＰＢＭＣ内の
ウイルス反転写酵素活性、先に記載した方法（Ｙａｍａ
ｍｏｔｏら、１９９１）により、誘発後、数回にわたり
採取された骨髄およびリンパ節細胞の評価が含まれる。
加えて、プロウイルスＤＮＡ（潜在感染）は、ＰＢＭＣ
から抽出されたＤＮＡ上のＦＩＶ−ｅｎｖプライマー、
ＲＴ活性用培養上の骨髄およびリンパ節細胞（Ｙａｍａ
ｍｏｔｏら、１９９１、Ｏｋａｄａら、１９９４）を使
った、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により監視され
た。さらに、ＦＩＶ感染は、誘発前後に採取された血清
中のＦＩＶ−特殊体液反応およびウイルス中和（ＶＮ）
抗体反応の特性を監視・比較して確認された。
【０２３５】結果および討論 ＡＬＶＡＣ 初回（一次）免疫／追加免疫プロトコルの
免疫原性および防御有効性が、明白な異種構造のＦＩＶ
分離株（Ｂａｎｇｓｔｏｎ株）を使った実験誘発に対し
て評価が行われた。まず、ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ
／ｐｏｌだけでの免疫処置の防御有効性が、ＡＬＶＡＣ
−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌとの初回（一次）免疫、さら
に不活性化されたＦＩＶ−感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）
による追加免疫との比較が行われた。すべてのネコに合
計３回の免疫処置を受けさせ、細胞フリーのＦＩＶ Ｐ
ｅｔａｌｕｍａ５０ ＩＤ５０による最終免疫処置の４
週間後に、誘発実験を行った（実施例７を参照）。ＡＬ
ＶＡＣ−ＦＩＶ組換え型ワクチンを生成するために使わ
れる、ＦＩＶ Ｖｉｌｌｅｆｒａｎｃｈｅ分離株と同
様、ＦＩＶ Ｐｅｔａｌｕｍａ分離株は亜類型Ａウイル
スとして分類され、ＦＩＶ Ｖｉｌｌｅｆｒａｎｃｈｅ
とは、Ｅｎｖにおいて３％、Ｇａｇ アミノ酸暗号部位
では１％異なっている。
【０２３６】次に、実施例７で記載したＦＩＶ Ｐｅｔ
ａｌｕｍａ 誘発に抵抗力のあるＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、
ｇａｇ／ｐｒｏ／ＩＣＶ免疫処置されたネコ（＃ＱＡ
６、＃ＱＨ３、＃ＰＹ４）が別の亜類型の明確な異種構
造を持つＦＩＶ分離株による第２の誘発から保護されう
るかどうかが評価された。第２誘発は、細胞フリーの７
５ ＩＤ５０ＦＩＶ Ｂａｎｇｓｔｏｎ（誘導ＰＢＭ
Ｃ）から成り、いかなる中間追加抗原も行わない最初の
誘発の８ヶ月後に投与された。ＦＩＶ Ｂａｎｇｓｔｏ
ｎは亜類型Ｂ分離株であり、ＦＩＶ Ｐｅｔａｌｕｍａ
（亜類型Ａ）とは、エンベロープ糖蛋白質暗号化部位に
おいて２１％異なっている。年齢が合わせられた３匹の
ＳＰＦネコ（＃ＥＪ２、＃ＧＵ５、＃ＤＨ３）は、ＦＩ
Ｖ Ｂａｎｇｓｔｏｎ誘発のために、コントロール（対
照用）ネコとして使用された。表７に示したように、す
べてのコントロールネコは誘発でたやすく感染した。対
照的に、ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ／ＩＣＶ
免疫処置したネコ＃ＱＨ３および＃ＱＡ６は、誘発後３
ヶ月まで、末梢血液のウイルス隔離（ＲＴ）およびＰＣ
Ｒで確認されたようにウイルス陰性のままであった。ネ
コ＃ＰＹ４は、末梢血液のウイルス隔離（ＲＴ）により
確認されたようにウイルス陰性のままであったが、誘発
後３ヶ月の時点でＰＣＲにより陽性という結果が出た。
ＰＣＲ生成物のヌクレオチド連鎖分析で、ＦＩＶ Ｂａ
ｎｓｇｔｏｎ特殊連鎖が明らかになった。このように、
ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ／ＩＣＶ免疫処置
されたネコは、部分的に、異種構造亜類型ＦＩＶ攻撃か
ら防御された。少なくとも、これらのネコには、すべて
の統制ネコが誘発後６週間までにウイルス血症になった
ように感染における遅延を証明し、ＡＬＶＡＣ−ｅｎ
ｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ／ＩＣＶ免疫処置された３匹のネコ
のうち一匹だけが、誘発後１２週間の時点で、ＰＣＲ分
析に基づいて、陽性になったことが明らかである。これ
は、Ｅｎｖ発現組換えに対する潜在的有益性を示すもの
である。
【０２３７】要約すると、ＡＬＶＡＣ組換え型の初回
（一次）免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）とそれに続く不活性化
ＦＩＶ−感染細胞ワクチンの追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎ
ｇ）を伴うを伴うｐｒｉｍｅ／ｂｏｏｓｔプロトコル
は、異種構造ＦＩＶ菌種による実験誘発に対して防御的
免疫性を引き出すことが可能である。この免疫性は長期
にわたって継続し、また他の亜類型の明確に異種構造を
したＦＩＶ−菌種に対して部分的防御性がある。データ
ーでは、ウイルス中和抗体反応やＦＩＶ−特殊抗体反応
よりもむしろ、仲介細胞に対する役割が裏付けされてい
る。これらの研究結果は、新しい亜類型が次々と出現
し、既存の亜類型がますます地理的に新しい範囲に広ま
っていいるように、多様な亜類型ＦＩＶ−ワクチンの開
発だけでなく、有効な多様亜類型ＨＩＶワクチン（他の
レンチウイルスおよびレトロウイルスのための多様な亜
類型ワクチンだけでなく）の開発にもつながるものであ
る。
【０２３８】フッシャーの精密なテストが行われた。こ
れは、カイ２乗テストを修正したものである。本テスト
は、２組の断続的な、２者択一（全か無の）データーを
比較するときに使われることになっている。分析は次の
ように準備が行われた。
【０２３９】
【表７】 単一末尾確率に対して、Ｐ値を次のように計算した。
【０２４０】 P(確率)＝(A+B)!(C+D)!(A+C)!(B+D)!/N!A!B!C!D! 各グループを、ＡＬＶＡＣ−コントロールグループ（ｎ
＝ ６）およびＡＬＶＡＣ−コントロールグループ＋
ＡＬＶＡＣ−コントロールおよびＩＣＶグループ（ｎ
＝ ９）と比較した。０．０５または０．０５以下のＰ
値は、有意であると見なされた。
【０２４１】
【表８】
【表９】
【表１０】 実施例９−付加的なＮＹＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ組換
え型の生成 プロモーターに連接したＤＮＡをコードするＦＩＶ生成
のために上記で述べた方策を用いること、米国特許第
５，４９４，８０７およびＵＳＳＮ ０８／４１７，２
１０における具体例に同様なものや、これらベクターの
部位に挿入するためのＮＹＶＡＶＣおよびＴＲＯＶＡＣ
用のＤＮＡを配置することが、ＮＹＶＡＣおよびＴＲＯ
ＶＡＣ ＦＩＶ組換え型生成のために使われた。分析に
より、ベクターへの外来性ＤＮＡおよびその発現の組み
込みが証明されている。このような付加的組換え型は、
同じように、上記のＡＬＶＡＣの具体化として有効であ
る。
【０２４２】実施例１０−付加的レンチウイルス、およ
び付加的ベクターシステム組換え型の生成 プロモーターに連接したＤＮＡ暗号化ＦＩＶ生成のため
に上記で述べたことに類似する方策、ここに引用した資
料中の、代替の、ポックスウイルス、バキュロウイル
ス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイ
ルス、ポリオウイルス、 エプスタイン−バーウイル
ス、細菌性およびＤＮＡベースシステムを生成するため
の方策、さらにレンチウイルス、レトロウイルスまたは
免疫不全ウイルス、たとえばＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩ
Ｖ、ＨＩＶまたはＳＩＶからＤＮＡを、ここに挙げた資
料からの代替ポックスウイルス、バキュロウイルス、ア
デノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、
ポリオウイルス、エプステイン−バーウイルス、細菌
性、およびレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫
不全ウイルス、たとえば、Ｅｎｖ、Ｇａｇおよびプロテ
アーゼのような、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶ、
またはＳＩＶからＤＮＡを含み、表現するＤＮＡベース
組換え型を、暗号化する知識を用いて、組換え型を生成
する。分析により、外来性ＤＮＡ およびそれからの発
現のベクターへの組み込みが証明された。このような付
加的組換え型は、同様に、上記ＡＬＶＡＣ具体化として
有効である。
【０２４３】このように、本発明の好ましい具体化を詳
細に記述することで追加請求により定義された本発明
は、そこからの多くの明白な変化形態が、その意図およ
び範囲を逸脱することなく可能であるように、上記で説
明した詳細事項で制限するべきでないことが理解される
必要がある。
【０２４４】参考文献を以下に示す。
【０２４５】
【表１１】
【０２４６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Virogenetics Corp. <120> Poxvirus-Based Expression Vectors Containing Heterologous Inserts Derived From Lentiviruses <130> 98231B <140> 97 94 6609.1 <141> 1999-06-14 <150> PCT/US97/20430 <151> 1997-11-07 <160> 38 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2571 <212> DNA <213> Feline immunodeficiency virus <400> 1 atggcagaag gatttgcagc caatagacaa tggataggac cagaagaagc tgaagagtta 60 ttagattttg atatagcaac acaaatgagt gaagaaggac cactaaatcc aggagtaaac 120 ccatttaggg tacctggaat aacagaaaaa gaaaagcaaa actactgtaa catattacaa 180 cctaagttac aagatctaag gaacgaaatt caagaggtaa aactggaaga aggaaatgca 240 ggtaagttta gaagagcaag atttttaagg tattctgatg aacaagtatt gtccctggtt 300 catgcgttca taggatattg tatatattta ggtaatcgaa ataagttagg atctttaaga 360 catgacattg atatagaagc accccaagaa gagtgttata ataatagaga gaagggtaca 420 actgacaata taaaatatgg tagacgatgt tgcctaggaa cggtgacttt gtacctgatt 480 ttatttatag gattaataat atattcacag acaaccaacg ctcaggtagt atggagactt 540 ccaccattag tagtcccagt agaagaatca 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vaccinia virus H6 promoter and FIV env in an expression vector. <400> 4 ttaaataaaa atacttactt acgaaaaatg actaattagc tataaaaacc cgggttcttt 60 attctatact taaaaagtga aaataaatac aaaggttctt gagggttgtg ttaaattgaa 120 agcgagaaat aatcataaat tatttcatta tcgcgatatc cgttaagttt gtatcgtaat 180 ggcagaagga tttgcagcca atagacaatg gataggacca gaagaagctg aagagttatt 240 agattttgat atagcaacac aaatgagtga agaaggacca ctaaatccag gagtaaaccc 300 atttagggta cctggaataa cagaaaaaga aaagcaaaac tactgtaaca tattacaacc 360 taagttacaa gatctaagga acgaaattca agaggtaaaa ctggaagaag gaaatgcagg 420 taagtttaga agagcaagat ttttaaggta ttctgatgaa caagtattgt ccctggttca 480 tgcgttcata ggatattgta tatatttagg taatcgaaat aagttaggat ctttaagaca 540 tgacattgat atagaagcac cccaagaaga gtgttataat aatagagaga agggtacaac 600 tgacaatata aaatatggta gacgatgttg cctaggaacg gtgactttgt acctgatttt 660 atttatagga ttaataatat attcacagac aaccaacgct caggtagtat ggagacttcc 720 accattagta gtcccagtag aagaatcaga aataattttt tgggactgtt gggcaccaga 780 agaacccgcc 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tgtcaaagaa cacagagtca gcctggatca tggcgtagag caatctcgtc atggaaacaa 1440 agaaatagat gggagtggag accagatttg gaaagtaaaa aggtgaaaat atctctacag 1500 tgcaatagca caaaaaacct aacctttgca atgagaagtt caggagatta tggagaagta 1560 acgggagctt ggatagagtt tggatgtcat agaaataaat caaaacatca ttctgaagca 1620 aggtttagaa ttagatgtag atggaatgta ggatccgata cctcgctcat tgatacatgt 1680 ggaaacactc gagatgtttc aggtgcgaat cctgtagatt gtaccatgta ttcaaataaa 1740 atgtacaatt gttctttaca aaatgggttt actatgaagg tagatgacct tattgtgcat 1800 ttcaatatga caaaagctgt agaaatgtat aatattgctg gaaattggtc ttgtacatct 1860 gacttgccat cgtcatgggg gtatatgaat tgtaattgta caaatagtag tagtagttat 1920 agtggtacta aaatggcatg tcctagcaat cgaggcatct taaggaattg gtataaccca 1980 gtagcaggat tacgacaatc cttagaacag tatcaagttg taaaacaacc agattactta 2040 gtggtcccag aggaagtcat ggaatataaa cctagaagga aaagggcagc tattcatgtt 2100 atgttggctc ttgcaacagt attatctatt gtcggtgcag ggacgggggc tactgctata 2160 gggatggtaa cccaatacca ccaagttctg gcaacccatc aagaagctat agaaaaggtg 2220 actgaagcct taaagataaa caacttaaga ttagttacat tagagcatca agtactagta 2280 ataggattaa aagtagaagc tatggaaaaa ttcttatata cagctttcgc tatgcaagaa 2340 ttaggatgta atcaaaatca attcttctgc aaaatccctc ctgggttgtg gacaaggtat 2400 aatatgacta taaatcaaac aatatggaat catggaaata taactttggg ggaatggtat 2460 aaccaaacaa aagatttaca acaaaagttt tatgaaataa taatggacat agaacaaaat 2520 aatgtacaag ggaaaacagg gatacaacaa ttacaaaagt gggaagattg ggtaggatgg 2580 atgggaaata ttccacaata tttaaaggga ctattgggag gtatcttggg aataggatta 2640 ggagtgttat tattgatttt atgtttacct acattggttg attgtataag aaattgtatc 2700 cacaagatac taggatacac agtaattgca atgcctgaag tagaaggaga agaaatacaa 2760 ccacaaatgg aattgaggag aaatggtagg caatgtggca tgtctgaaaa agaggaggaa 2820 tgaatcgata catcatgcag tggttaaaca aaaacatttt tattctcaaa tgagataaag 2880 tgaaaatata tatcattata ttacaaagta caattattta ggtttaatca tggggaatgg 2940 acaggggcga gattggaaaa tggccattaa gagatgtagt aatgttgctg taggagtagg 3000 ggggaagagt aaaaaatttg gagaagggaa tttcagatgg gccattagaa tggctaatgt 3060 atctacagga cgagaacctg gtgatatacc agagacttta gatcaactaa ggttggttat 3120 ttgcgattta caagaaagaa gagaaaaatt tggatctagc aaagaaattg atatggcaat 3180 tgtgacatta aaagtctttg cggtagcagg acttttgaat atgacggtgt ctactgctgc 3240 tgcagctgaa aatatgtatt ctcaaatggg attagacact aggccatcta tgaaagaagc 3300 aggtggaaaa gaggaaggcc ctccacaggc atatcctatt caaacagtaa atggagtacc 3360 acaatatgta gcacttgacc caaaaatggt gtccattttc atggaaaagg caagagaagg 3420 actaggaggg gaggaagttc aactatggtt tactgccttc tctgcaaatt taacacctac 3480 tgacatggcc acattaataa tggccgcacc agggtgcgct gcagataaag aaatattgga 3540 tgaaagctta aagcaactga cagcagaata tgatcgcaca catccccctg atgctcccag 3600 accattaccc tattttactg cagcagaaat tatgggtata ggattaactc aagaacaaca 3660 agcagaagca agatttgcac cagctaggat gcagtgtaga gcatggtatc tcgaggcatt 3720 aggaaaattg gctgccataa aagctaagtc tcctcgagct gtgcagttaa gacaaggagc 3780 taaggaagat tattcatcct ttatagacag attgtttgcc caaatagatc aagaacaaaa 3840 tacagctgaa gttaagttat atttaaaaca gtcattaagc atagctaatg ctaatgcaga 3900 ctgtaaaaag gcaatgagcc accttaagcc agaaagtacc ctagaagaaa agttgagagc 3960 ttgtcaagaa ataggctcac caggatataa aatgcaactc ttggcagaag ctcttacaaa 4020 agttcaagta gtgcaatcaa aaggatcagg accagtgtgt tttaattgta aaaaaccagg 4080 acatctagca agacaatgta gagaagtgaa aaaatgtaat aaatgtggaa aacctggtca 4140 tctagctgcc aaatgttggc aaggaaatag aaagaattcg ggaaactgga aggcggggcg 4200 agctgcagcc ccagtgaatc aaatgcagca agcagtaatg ccatctgcac ctccaatgga 4260 ggagaaacta ttggatttat aaattataat aaagtaggta cgactacaac attagaaaag 4320 aggccagaaa tacttatatt tgtaaatgga tatcctataa aatttttatt agatacagga 4380 gcagatataa caattttaaa taggagagat tttcaagtaa aaaattctat agaaaatgga 4440 aggcaaaata tgattggagt aggaggagga aagagaggaa caaattatat taatgtacat 4500 ttagagatta gagatgaaaa ttataagaca caatgtatat ttggtaatgt ttgtgtctta 4560 gaagataact cattaataca accattattg gggagagata atatgattaa attcaatatt 4620 aggttagtaa tggctcaata attttatccc gggtttttat agctaattag tcatttttcg 4680 taagtaagta tttttattta atacttttta ttgtacttat gttaaat 4727 <210> 7 <211> 4150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:predicted nucleotide sequence of vaccinia virus H6 promoter and altered FIV env, and vaccinia virus I3L promoter and FIV gag/pol in an expression cassette. <400> 7 ttaatcaata aaaagaattc ctgcaggaat tcataaaaat cattcttctc cttctacttc 60 aggcattgca attactgtgt atcctagtat cttgtggata caatttctta tacaatcaac 120 caatgtaggt aaacataaaa tcaataataa cactcctaat cctattccca agatacctcc 180 caatagtccc cttttccttc taggtttata ttccatgact tcctctggga ccactaagta 240 atctggttgt tttacaactt gatactgttc taaggattgt cgtaatcctg ctactgggtt 300 ataccaattc cttaagatgc ctcgattgct aggacatgcc attttagtac cactataact 360 actactacta tttgtacaat tacaattcat atacccccat gacgatggca agtcagatgt 420 acaagaccaa tttccagcaa tattatacat ttctacagct tttgtcatat tgaaatgcac 480 aataaggtca tctaccttca tagtaaaccc attttgtaaa gaacaattgt acattttatt 540 tgaatacatg gtacaatcta caggattcgc acctgaaaca tctcgagtgt ttccacatgt 600 atcaatgagc gaggtatcgg atcctacatt ccatctacat ctaattctaa accttgcttc 660 agaatgatgt tttgatttat ttctatgaca tccaaactct atccaagctc ccgttacttc 720 tccataatct cctgaacttc tcattgcaaa ggttaggttt tttgtgctat tgcactgtag 780 agatattttc acctttttac tttccaaatc tggtctccac tcccatctat ttctttgttt 840 ccatgacgag attgctctac gccatgatcc aggctgactc tgtgttcttt gacaatgaaa 900 ctttaccttt gcctcttccc atttacaact gttataatag gccatttgat tccaccatcc 960 acattttggt atttcagggt cctgaatttg tgaagtattc cacatacatg tttgattagg 1020 tccaaatgta taattgatca gtgggatttg taatgggtct gtacaatagc ttaattgttt 1080 tgtaacttta ttgtacaaca tttttcctcc tgttagacat aatgatatat ttattttccc 1140 ttgtaaccaa gtatctactc tatctaaata acactgataa tcaggtacta ttactgaaac 1200 attataacat gtgttattag cacatcctga tggtcctgtt atagtctcat tccatctttt 1260 ccatattctg cctcttctac attgtctagt agcctttttg aataatgttg cccatatttc 1320 tctagtccaa ttccccaagg taggtccctc tcgtatactt atatttgtct tagcttttag 1380 atgtatcatt gccccaagaa agtcctgaca ggcgggttct tctggtgccc aacagtccca 1440 aaaaattatt tctgattctt ctactgggac tactaatggt ggaagtctcc atactacctg 1500 agcgttggtt gtctgtgaat atattattaa tcctataaat aaaatcaggt acaaagtcac 1560 cgttcctagg caacatcgtc taccatattt tatattgtca gttgtaccct tctctctatt 1620 attataacac tcttcttggg gtgcttctat atcaatgtca tgtcttaaag atcctaactt 1680 atttcgatta cctaaatata tacaatatcc tatgaacgca tgaaccaggg acaatacttg 1740 ttcatcagaa taccttaaaa atcttgctct tctaaactta cctgcatttc cttcttccag 1800 ttttacctct tgaatttcgt tccttagatc ttgtaactta ggttgtaata tgttacagta 1860 gttttgcttt tctttttctg ttattccagg taccctaaat gggtttactc ctggatttag 1920 tggtccttct tcactcattt gtgttgctat atcaaaatct aataactctt cagcttcttc 1980 tggtcctatc cattgtctat tggctgcaaa tccttctgcc attacgatac aaacttaacg 2040 gatatcgcga taatgaaata atttatgatt atttctcgct ttcaatttaa cacaaccctc 2100 aagaaccttt gtatttattt tcacttttta agtatagaat aaagaactgc agctaattaa 2160 ttaagctaca aatagtttcg ttttcacctt gtctaataac taattaatta aggatccccc 2220 gtaccgggcc ccccctcgag gtcgacatcg atacatcatg cagtggttaa acaaaaacat 2280 ttttattctc aaatgagata aagtgaaaat atatatcatt atattacaaa gtacaattat 2340 ttaggtttaa tcatggggaa tggacagggg cgagattgga aaatggccat taagagatgt 2400 agtaatgttg ctgtaggagt aggggggaag agtaaaaaat ttggagaagg gaatttcaga 2460 tgggccatta gaatggctaa tgtatctaca ggacgagaac ctggtgatat accagagact 2520 ttagatcaac taaggttggt tatttgcgat ttacaagaaa gaagagaaaa atttggatct 2580 agcaaagaaa ttgatatggc aattgtgaca ttaaaagtct ttgcggtagc aggacttttg 2640 aatatgacgg tgtctactgc tgctgcagct gaaaatatgt attctcaaat gggattagac 2700 actaggccat ctatgaaaga agcaggtgga aaagaggaag gccctccaca ggcatatcct 2760 attcaaacag taaatggagt accacaatat gtagcacttg acccaaaaat ggtgtccatt 2820 ttcatggaaa aggcaagaga aggactagga ggggaggaag ttcaactatg gtttactgcc 2880 ttctctgcaa atttaacacc tactgacatg gccacattaa taatggccgc accagggtgc 2940 gctgcagata aagaaatatt ggatgaaagc ttaaagcaac tgacagcaga atatgatcgc 3000 acacatcccc ctgatgctcc cagaccatta ccctatttta ctgcagcaga aattatgggt 3060 ataggattaa ctcaagaaca acaagcagaa gcaagatttg caccagctag gatgcagtgt 3120 agagcatggt atctcgaggc attaggaaaa ttggctgcca taaaagctaa gtctcctcga 3180 gctgtgcagt taagacaagg agctaaggaa gattattcat cctttataga cagattgttt 3240 gcccaaatag atcaagaaca aaatacagct gaagttaagt tatatttaaa acagtcatta 3300 agcatagcta atgctaatgc agactgtaaa aaggcaatga gccaccttaa gccagaaagt 3360 accctagaag aaaagttgag agcttgtcaa gaaataggct caccaggata taaaatgcaa 3420 ctcttggcag aagctcttac aaaagttcaa gtagtgcaat caaaaggatc aggaccagtg 3480 tgttttaatt gtaaaaaacc aggacatcta gcaagacaat gtagagaagt gaaaaaatgt 3540 aataaatgtg gaaaacctgg tcatctagct gccaaatgtt ggcaaggaaa tagaaagaat 3600 tcgggaaact ggaaggcggg gcgagctgca gccccagtga atcaaatgca gcaagcagta 3660 atgccatctg cacctccaat ggaggagaaa ctattggatt tataaattat aataaagtag 3720 gtacgactac aacattagaa aagaggccag aaatacttat atttgtaaat ggatatccta 3780 taaaattttt attagataca ggagcagata taacaatttt aaataggaga gattttcaag 3840 taaaaaattc tatagaaaat ggaaggcaaa atatgattgg agtaggagga ggaaagagag 3900 gaacaaatta tattaatgta catttagaga ttagagatga aaattataag acacaatgta 3960 tatttggtaa tgtttgtgtc ttagaagata actcattaat acaaccatta ttggggagag 4020 ataatatgat taaattcaat attaggttag taatggctca ataattttat cccgggtttt 4080 tatagctaat tagtcatttt tcgtaagtaa gtatttttat ttaatacttt ttattgtact 4140 tatgttaaat 4150 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> sequence not described in specification <400> 8 atcatcaagc ttctgcagtt ctttattcta tactta 36 <210> 9 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 9 aaattcttat atacagcttt cgctatgcaa gaattaggat gtaatcaaaa tcaattcttc 60 tgcaaaatcc ctcctgggt 79 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 10 cccatcgagt gcggctac 18 <210> 11 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 11 gcagaagaat tgattttgat tacatcctaa ttcttgcata gcgaaagctg tatataagaa 60 tttttccata gcttc 75 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 12 aagttctggc aacccatc 18 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used to amplify vaccinia virus H6 promoter and part of FIV env. <400> 13 atcatcctgc agaagcttcc cgggttcttt attctatact t 41 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used to amplify vaccinia virus H6 promoter and part of FIV env. <400> 14 ctgcaaatcc ttctgccatt acgatacaaa cttaac 36 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used to amplify part of vaccinia virus H6 promoter and part of FIV env. <400> 15 cgttaagttt gtatcgtaat ggcagaagga tttgcagcc 39 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used to amplify part of vaccinia virus H6 promoter and part of FIV env. <400> 16 cctcttgaat ttcgttcc 18 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of an insertion plasmid. <400> 17 atcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 42 <210> 18 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of an insertion plasmid. <400> 18 gaattcctcg agctgcagcc cgggttttta tagctaatta gtcatttttt cgtaagtaag 60 tatttttatt taa 73 <210> 19 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of an insertion plasmid. <400> 19 cccgggctgc agctcgagga attcttttta ttgattaact agtcaaatga gtatatataa 60 ttgaaaaagt aa 72 <210> 20 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of an insertion plasmid. <400> 20 gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg 45 <210> 21 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sequence added to an insertion plasmid. <400> 21 gggggatcct taattaatta gttattagac aaggtgaaaa cgaaactatt tgtagcttaa 60 ttaattagct gcaggaattc 80 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify part of FIV gag. <400> 22 caaaaatggt gtccattttc atggaaaagg caagagaagg ac 42 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify part of FIV gag. <400> 23 ctgctgcagt aaaatagg 18 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify part of vaccinia virus I3L promoter and part of FIV gag. <400> 24 cttctcttgc cttttccatg aaaatggaca ccatttttgg gtc 43 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify part of vaccinia virus I3L promoter and part of FIV gag. <400> 25 caattattta ggtttaatca tggggaatgg acaggggc 38 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify part of vaccinia virus I3L promoter and part of FIV gag. <400> 26 cgcccctgtc cattccccat gattaaacct aaataattgt ac 42 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify part of vaccinia virus I3L promoter and part of FIV gag. <400> 27 atcatcgtcg acatcgatac atcatgcagt ggttaaac 38 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify FIV protease. <400> 28 caggacatct agcaagac 18 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify FIV protease. <400> 29 gatgatcccg ggataaaaat tattgagcca ttactaacct 40 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 30 tatgaattgt aattgtac 18 <210> 31 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 31 gtagcataag gttaccgcgg ccgctaagct taggttacca tccctatagc agta 54 <210> 32 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 32 gtagcataag gtaacctaag cttagcggcc gcggtaaccc aataccacca agttctggc 59 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer used to amplify part of FIV env. <400> 33 attaaccctc actaaag 17 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of a FIV expression plasmid. <400> 34 acttgccatc gtcatggggg 20 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of a FIV expression plasmid. <400> 35 gatacctccc aatagtcccc ttttccttct aggtttatat tc 42 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of a FIV expression plasmid. <400> 36 gaatataaac ctagaaggaa aaggggacta ttgggaggta tc 42 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of a FIV expression plasmid. <400> 37 atcatcgaat tcataaaaat cattcttctc cttctacttc 40 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer used in construction of a FIV expression plasmid. <400> 38 atcatcaagc ttctgcagtt ctttattcta tactta 36
【図面の簡単な説明】
実施例の方法によって示されるが、記述される実施態様
にのみ本発明を限定することが意図されない以下の詳細
な説明は、ここに参照して組込まれる付随の図面と関連
して理解するのが最もよい。ここで、
【図１】図１は、上に記述のとおりプラーク精製カナポ
ックスの結果を示す。
【図２】図２は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘから得た
ＦＩＶ ｅｎｖのヌクレオチド配列（配列番号：１）
（ＦＩＶ ｅｎｖ開始コドンは、位置１にあり、そして
停止コドンは位置２５６９にある。ＦＩＶ ｅｎｖのコ
ーディング配列を含有するプラスミドｐｔｇ６１８４
は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ（フランス国、リオン
（Lyon、France）から得た。ｐｔｇ６１８４にあるＦＩ
Ｖ ｅｎｖコーディング配列を、シーケンシングし、そ
して以下の配列を示す以下の差異を観察した。位置１２
１８Ｔは、ｐｈｅをｌｅｕに変えるｐｔｇ６１８４にあ
るＧである；位置１２２０ＧからＡを、ｇｌｙからｇｌ
ｕに変え；そして位置２２０１ＣからＡは、ａｌａから
ｇｌｕに変わる。）を示す。
【図３】図３は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘから得た
ＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列のヌクレオチド
配列（配列番号：２）（ｇａｇ開始コドンは、位置１に
あり、そしてｇａｇ停止コドンは、位置１４１４にあ
る。リボソーム枠シフト部位は、位置１２５５の近くに
ある。枠シフトは、ｇａｇ開放読取枠に対して−１であ
る。枠シフトは、ｐｏｌ開放読取枠に加わる。ｐｏｌ開
始コドンは、位置４６１４にある。Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒ
ｉｅｕｘから得たプラスミドｐｔｇ８１３３は、ＦＩＶ
ｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列を含有する。ｐｔｇ８
１３３の一部をシーケンシングした。そして以下の位置
５７７−５７８にあるＣＧは、ｐｔｇ８１３３中のＧＣ
であり、ａｒｇからａｌａまでのコドンを変化する。）
を示す。
【図４】図４は、図３の続きのヌクレオチド配列であ
る。
【図５】図５は、Ｃ６供与プラスミドｐＣ６Ｌ（配列番
号：３）（プラスミドｐＣ６Ｌは、Ｃ６挿入部位Ｓｍａ
Ｉ（位置４０９）およびＥｃｏＲＩ（位置４２５）を含
有する）に含まれるＡＬＶＡＣ−ヌクレオチド配列を示
す。
【図６】図６は、ｖＣＰ２４２挿入の推定ヌクレオチド
配列（配列番号：４）（Ｈ６プロモーターは、位置５５
で開始する。ＦＩＶｅｎｖ開始コドンは、位置１７９に
あり、そしてＦＩＶｅｎｖ停止コドンは、位置２７４９
にある。位置１から５４および位置２７５０から２８７
９は、Ｈ６／ＦＩＶｅｎｖ発現カセットの両端を挟む）
を示す。
【図７】図７は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現カセ
ットを促進し、ｖＣＰ２５３にある領域（配列番号：
５）を挟むＩ３Ｌの推定ヌクレオチド配列（Ｉ３Ｌプロ
モーターは、位置１３５で始まる。ｇａｇ開始コドン
は、位置２３５にあり、そしてプロテアーゼ停止コドン
は、位置１６４８にある）を示す。
【図８】図８は、ＦＩＶｅｎｖ／Ｉ３Ｌ促進ＦＩＶｇａ
ｇ／プロテアーゼ発現カセットを促進し、そしてｖＣＰ
２５５にある領域（配列番号：６）を挟むＨ６の推定ヌ
クレオチド配列（Ｈ６プロモーターは、位置１２９で開
始し、ＦＩＶｅｎｖ開始コドンは、位置２５３にあり、
そしてＦＩＶｅｎｖ停止コドンは、位置２８２３にあ
る。Ｉ３Ｌプロモーターは、位置２８３０で開始し、Ｆ
ＩＶｇａｇ開始コドンは、位置２９３０あり、そしてＦ
ＩＶｇａｇ停止コドンは、位置４２８２にある。リボソ
ーム枠シフト部位は、位置４１８４の近くにある。枠シ
フトは、ｇａｇ開放読取枠に対して−１である。枠シフ
トは、ｐｏｌ開放読取枠に加わる。プロテアーゼ遺伝子
のための停止コドンは、位置４６４１にある。位置１か
ら１２８および位置４６４２から４７２７は、Ｈ６ＦＩ
Ｖｅｎｖ／Ｉ３Ｌ ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現カ
セットを挟む）を示す。
【図９】図９は、図８の続きの推定ヌクレオチド配列で
ある。
【図１０】図１０は、ｖＣＰ３２９挿入物の推定ヌクレ
オチド配列（配列番号：７）（H6プロモーターは、位置
２１４６で開始する。ＦＩＶ９７ＴＭについてのコーデ
ィング配列は、位置２０２２から位置４２である。Ｉ３
Ｌプロモーターは、位置２２５３で開始する。ＦＩＶｇ
ａｇ開始コドンは、位置２３５３あり、そしてｐｏｌ停
止コドンは、位置３７６６にある。）を示す。
【図１１】図１１は、図１０の続きの推定ヌクレオチド
配列である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 39/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 エンゾ パオレッティ アメリカ合衆国 12054 ニューヨーク州 デルマー マレー アヴェニュー 297 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 BA51 BA61 CA01 CA03 CA06 DA02 DA03 EA04 FA02 FA10 GA11 GA18 HA15 4C084 AA13 NA10 ZB092 4C085 AA03 BA65 DD62 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA10 ZB09 4H045 AA11 AA30 BA10 CA01 DA75 DA76 DA86 EA20 EA31 FA72 FA74

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１個のＦＩＶエピトープをコ
    ードする外因性ＤＮＡを含むベクターであって、前記ベ
    クターがＪ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５
    ６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、および１４Ｌからなる群から選
    択されるオープンリーディングフレームの一つあるいは
    これらの組み合わせにおいて、オープンリーディングフ
    レームが欠失されたワクシニアウイルス、またはアビポ
    ックスウイルスであり、ヒトを除く動物に前記ベクター
    と適当な担体とを混合して投与した際に、前記動物に免
    疫応答を惹起することを特徴とするベクター。
  2. 【請求項２】 ベクターがワクシニアウイルスである請
    求項１に記載のベクター。
  3. 【請求項３】 ワクシニアウイルスがＮＹＶＡＣ株であ
    る請求項２に記載のベクター。
  4. 【請求項４】 アビポックスウイルスがカナリポックス
    ウイルスである請求項１に記載のベクター。
  5. 【請求項５】 カナリポックスウイルスがＡＬＶＡＣ株
    であるか、または、（ａ）ヒナ胚線維芽細胞で２００代
    以上の連続継代を通してレンツェラーワクチン株を弱毒
    化し、（ｂ）そのマスターシードを寒天下で４回連続的
    にプラーク精製して、（ｃ）そのプラーククローンを５
    代の追加継代を通して増幅することによって得られたレ
    ンツェラーワクチン株である、請求項４に記載のベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】 アビポックスウイルスがファウポックス
    ウイルスである請求項１に記載のベクター。
  7. 【請求項７】 ファウポックスウイルスがＴＲＯＶＡＣ
    株である請求項６に記載のベクター。
  8. 【請求項８】 ＤＮＡが、（ａ）Ｇａｇ−Ｐｏｌ、
    （ｂ）Ｇａｇ−プロテアーゼ、（ｃ）Ｅｎｖ，Ｇａｇ−
    Ｐｏｌ、または（ｄ）Ｅｎｖ，Ｇａｇ−プロテアーゼ、
    の全部もしくは一部をコードしている請求項１〜７のい
    ずれかに記載のベクター。
  9. 【請求項９】 ＤＮＡが、Ｇａｇ−Ｐｏｌ、または、Ｇ
    ａｇ−プロテアーゼ、の全部もしくは一部をコードして
    いる請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 ＤＮＡが、Ｅｎｖ，Ｇａｇ−Ｐｏｌ、
    または、Ｅｎｖ，Ｇａｇ−プロテアーゼ、の全部もしく
    は一部をコードしている請求項１〜７のいずれかに記載
    のベクター。
  11. 【請求項１１】 ｖＣＰ２４２、ｖＣＰ２５３、ｖＣＰ
    ２５５、あるいはｖＣＰ３２９である請求項１に記載の
    ベクター。
  12. 【請求項１２】 ネコにおいて免疫学的な治療あるいは
    免疫応答を誘発することを必要とするネコを処置するた
    めの方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のベ
    クターを含む組成物を適当な担体と混合して前記のネコ
    に投与することを含む方法。
  13. 【請求項１３】 ネコにおいて免疫学的な治療あるいは
    免疫応答を誘発することを必要とするネコを処置するた
    めの方法であって、請求項１０に記載のベクターを含む
    組成物を適当な担体と混合して前記のネコに投与するこ
    とを含む方法。
  14. 【請求項１４】 ネコにおいて免疫学的な治療あるいは
    免疫応答を誘発することが必要とするネコを処置するた
    めの方法であって、請求項１１に記載のベクターを含む
    組成物を適当な担体と混合して前記のネコに投与するこ
    とを含む方法。
  15. 【請求項１５】 さらに、前記組成物の投与前あるいは
    投与後のいずれかに、各々のＦＩＶのエピトープあるい
    は各々の不活性化したＦＩＶを追加的に投与することを
    含み、当該方法がプライム−ブースト処方である請求項
    １２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 さらに、当該組成物の投与前あるいは
    投与後のいずれかに、各々のＦＩＶのエピトープあるい
    は各々の不活性化したＦＩＶを追加的に投与することを
    含み、当該方法がプライム−ブースト処方である請求項
    １３に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 さらに、当該組成物の投与前あるいは
    投与後のいずれかに、各々のＦＩＶのエピトープあるい
    は各々の不活性化したＦＩＶを追加的に投与することを
    含み、当該方法がプライム−ブースト処方である請求項
    １４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜９のいずれかに記載のベク
    ターを適当な担体と混合して含む、免疫応答を誘発する
    ための組成物。
  19. 【請求項１９】 請求項１０に記載のベクターを適切な
    担体と混合して含む、免疫応答を誘発するための組成
    物。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のベクターを適切な
    担体と混合して含む、免疫応答を誘発するための組成
    物。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜１１のいずれかに記載のベ
    クターを細胞に導入することを含む、インビトロで培養
    した細胞において遺伝子産物を発現するための方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜１１のいずれかに記載のベ
    クターのインビトロでの発現により得られるＦＩＶ抗
    原。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜１１のいずれかに記載のベ
    クターからの抗原のインビボでの発現によって、あるい
    は当該ベクターのインビトロでの発現からのＦＩＶ関連
    抗原の投与によって誘発される（ただし、ヒトの場合を
    除く）抗体。
  24. 【請求項２４】 少なくとも１個のＦＩＶエピトープ
    が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、および
    プロテアーゼからなる群から選択されるＦＩＶタンパク
    質からのものである請求項１〜７のいずれかに記載のベ
    クター。
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