KR100372934B1 - 형질 상보성 세포주에 의해 생성된 바이러스 결손 백신 - Google Patents

형질 상보성 세포주에 의해 생성된 바이러스 결손 백신 Download PDF

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마이클 에드워드 그리피쓰 부언스넬
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Abstract

본 발명은 감염성 비루스의 생성에 필수적인 유전자와 관련하여 결손되어 있는 비루스의 게놈을 함유하는 백신으로서 사용하기 인한 돌연변이 비루스에 관한 것이다. 한가지 특징으로서, 상기 돌연변이 비루스는 이것으로 면역화된 감응성 종을 그에 상응하는 야생형 비루스의 감염에 대하여 방어할 수 있다. 또다른 특징으로서, 상기 돌연변이 비루스는 병원체로부터 유도되고 돌연변이 비루스내에 병입된 이종 DNA에 의해 암호되는 면역원성 단백질을 위한 벡터 처럼 작용한다. 이 돌연변이 비루스는 상기 결손에 상보적인 유전자를 형질 발현하는 재조합 숙주 세포내에서 생성될 수 있다. 이 돌연변이 비루스는 감염에 대해 방어 되어야만 하는 숙주에 대해 감염성인 것이 바람직하나, 그 결손 유전자는 그 비루스 유전자의 적어도 일부분을 가진 감염된 숙주내에서 형질 발현될 수 있으므로 세포-매개 면역 반응을 자극시킬 수 있다.

Description

형질 상보성 세포주에 의해 생성된 바이러스 결손 백신
본 발명은 바이러스 백신에 관한 것이다. 특히 본 발명은 백신으로서 사용하기 위한 유전자 조작된 돌연변이 바이러스, 그 돌연변이 바이러스를 함유하는 백신, 재조합 세포, 및 백신 제조에 관한 방법에 관한 것이다.
바이러스 백신은 통상적으로 2종류이다. 제1 종류는 '사(死)' 백신으로서 이것은 베타-프로피오락톤과 같은 적합한 화학 약품으로 처리하여 사멸시킨 바이러스 제조물이다. 제2 종류는 '약독성' 생 백신으로서, 이것은 바이러스 게놈의 특이적인 유전자 조작이나, 또는 보다 일반적으로는 일부 조직 배양계를 통해 전파시킴으로써 숙주에 대한 병원성을 저하시킨 바이러스이다. 이와 같은 2종류의 백신은 각각 단점을 갖고 있다. 즉, 사백신은 숙주내에서 복제할 수 없으므로 주사로 투여해야만 하며, 따라서 부적합한 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리오바이러스의 사백신 제제인 소오크(Salk) 백신은 면역글로불린(Ig)G 항체 반응을 생성하나, 천연의 1차 감염 부위인 장내에서 IgA의 생성을 자극하지는 못한다. 따라서, 이 백신은 폴리오회백수염의 신경계 합병증에 대해 개체를 방어할 수 있으나 1차 감염을 차단하지 못하므로 "군집 면역"을 제공하지는 못한다. 또한, 사바이러스는 숙주 세포 중으로 들어가지 못하므로 숙주 세포내에서 복제되지 못한다. 따라서, 복제 중에 생성되는 비구조성 단백질에 대한 유리한 면역학적 반응을 전혀 이용할 수 없다. 또한, 바이러스 항원에 의해 유발되는 세포독성 T세포의 생성을 자극할수도 없다. "사균" 항원은 항원 제공 세포에 의해 선택되어 T세포에 제공될 수 있다. 그러나, 이와 같은 항원의 제공은 MHC II군 분자를 통해서 일어나며 T 조력 세포의 자극을 유도한다. 결과적으로 T 조력 세포는 B 세포가 항원에 대하여 특이적인 항체를 생성하도록 돕는다. 세포독성인 T세포의 생성을 자극하기 위해, 바이러스 항원은 감염 세포 중의 특정 경로를 통해 진행되어야만 하며, MHC 1군 분자상에 분절된 펩티드 단편으로서 제공되어야만 한다. 이 분해 경로는 감염된 세포 내에서 합성된 단백질에 대해 가장 효과적으로 작용하는 것으로 생각되며, 숙주 세포내로 들어가 면역원성 바이러스 단백질을 형질 발현하는 바이러스만이 바이러스 특이적인 세포독성 T세포를 생성할 수 있다. 그러므로, 사백신은 바이러스 감염에 대해 세포 면역성을 유발하는 유도인자로서는 좋지 않다. 이런 점에서 볼 때, 약독성 생 백신이 더욱 만족할만하다.
지금까지, 약독성 생 바이러스는 비필수 유전자를 결실시키거나 1개 이상의 필수 유전자를 부분적으로 손상(이 경우에, 손상은 그 유전자가 작용성을 유지하나 그다지 효과적으로 작동하지는 않는 상태임)시킴으로써 제조되었다. 그러나 약독성 생 바이러스는 종종 잔존 병원성을 보유하고 있어 숙주에게 해로운 효과를 미칠 수 있다. 또한, 약독화는 특이적인 결실에 의해 유발되지 않는다면 더욱 독성 형태로 전환될 가능성도 있다. 그럼에도 불구하고 숙주 중에서 일부 바이러스 단백질이 생성될 수 있다는 사실은 그러한 바이러스 단백질을 생성할 수 없는 사백신보다는 효과적임을 나타낸다.
약독성 생 바이러스는 그들의 작용 범위내에서 백신으로서 사용될 뿐만 아니라, 다른 유전자들에 대한 '백신 벡터'로서, 즉 다른 말로 하면 예방을 필요로 하는 제2 바이러스(또는 다른 병원체) 유래의 유전자를 운반하는 캐리어로서 사용될 수 있다. 일반적으로 종두 바이러스와 같은 마마 바이러스과의 군들은 백신 벡터로서 사용된다. 바이러스를 백신 벡터로 사용하는 경우에도 바이러스가 병원성 효과를 유발하지 않는 것이 중요하다. 즉, 단순 바이러스 백신을 약독화하는 것과 같은 방식으로 약독화할 필요가 있다. 그러므로 전술한 바와 같은 단점이 이 경우에도 적용된다.
또한, 바이러스 게놈으로부터 유전자를 결실시킨 다음, 그 결실된 유전자의 생성물을 상기 바이러스에게 제공하는 소위 '상보성' 세포를 제조하는 방법이 개발되었다. 이 방법은 특정 바이러스에서 실시되었고, 예를들면 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 레트로바이러스이다. 예컨대, 아데노바이러스의 경우, 아데노바이러스 타입 5 DNA의 단편으로 사람 세포주를 형질전환시켰다(Graham, Smiley, Russell & Nairn, J. Gen. Virol., 36, 59-72, 1977). 이 세포주는 특정 바이러스 유전자를 발현하였고, 결실되거나 불활성화된 상기 유전자를 가진 바이러스 돌연변이체의 증식을 지원할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Harrison, Graham & Williams, Virology 77, 319-329, 1977). 이와 같이 돌연변이 바이러스가 상기 세포주('상보성 세포주')에서 양호하게 증식하여 일반 바이러스 입자들을 생성할지라도, 정상인의 세포에서는 전혀 증식할 수 없었다. 또한, SV 40 바이러스 게놈(파포바바이러스)의 T-항원 암호 영역을 형질발현하는 세포 역시 이 영역이 특이적으로 결실된 바이러스의 복제를 지원할 수 있는 것으로 나타났다(Gluzman, Cell, 23, 182-195,1981). 헤르페스 단순바이러스의 경우에는, gB 당단백질(Cai 등, J. Virol. 62, 714-721, 1987), gD 당단백질(Ligas 및 Johnson, J. Virol 62, 1486, 1988) 및 인접 초기(Immediate Early) 단백질 ICP4(Deluca 등, J. Virol., 56, 558, 1985)를 형질 발현하는 세포주를 제조하였고, 이 세포주는 상기 해당 유전자의 특이적 불활성화 유전자 복제물을 가진 바이러스의 복제를 지원할 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 감염성 바이러스의 생성에 필수적인 단백질을 암호하는 바이러스 유전자가 결실되거나 불활성화되어 있지만, 결실되거나 불활성화된 바이러스 유전자가 암호하는 필수 단백질을 형질 발현할 수 있도록 이종의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 세포 중에서 증식할 수 있는 백신용 돌연변이 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 바이러스와 함께 1종 이상의 부형제 및 또는 보조제를 포함하는 백신을 제공한다. 이 바이러스의 게놈은 그 자체를 면역원으로 사용하거나, 또는 면역원성 단백질을 형질 발현하는 이종의 유전자 삽입물을 포함할 수 있다.
본 발명은 백신 제조에 사용하기 위한 전술한 바와 같은 약독성 바이러스로 형질 감염된 상보성 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 질병의 치료적 또는 예방적 처치에 사용하기 위한 백신 제조시 전술한 바와 같은 바이러스의 용도를 제공한다.
본 발명은 감염성 바이러스의 생성에 필수적인 단백질을 암호하는 결실되거나 불활성화된 바이러스 유전자를 가진 바이러스로 감염된 세포를 배양하되, 이 숙주 세포가 상기 바이러스 유전자를 포함하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 가지고있어 그 유전자가 암호하는 필수 단백질을 형질 발현할 수 있는 단계, 이와 같이 제조된 바이러스를 수거하는 단계 및 수거한 바이러스를 백신으로 사용하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 사용되는 바이러스는, 예컨대 당단백질 H(gH)를 암호하는 유전자를 불활성화시키거나 결실시킨 헤르페스 단순 바이러스(HSV)로부터 유도될 수 있다. 이 돌연변이 바이러스는 병원체 유래의 유도된 면역원을 암호하는 이종 서열을 포함할 수도 있다. 숙주 세포는 HSV 당단백질 H를 암호하는 유전자를 포함하는 재조합 진핵 세포주인 것이 적합하다. 또다른 예로서, 본 발명의 바이러스는 종두 바이러스와 같은 오르토마마 바이러스로부터 유도될 수 있는데, 이 역시 병원체 유래의 면역원을 암호하는 이종 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 사백신의 효능 및 안전성과 함께 약독성 백신의 생체내 바이러스 단백질 생성으로 유도된 과잉의 면역학적 반응을 병합시킨 유일한 방법을 제시한다. 이 방법의 바람직한 구체예는 다음과 같은 2가지 특징을 포함한다. 첫 번째 특징은, 바이러스 게놈 중 소정의 유전자를 보통 특정 결실 방법으로 불활성화시키는 것이다. 이 유전자는 감염성 바이러스의 생성과는 관련이 있으나, 바이러스 게놈의 복제를 방해하지는 않는 것이 바람직하다. 따라서, 감염된 세포는 복제된 유전자 물질로부터 더 많은 바이러스 단백질을 생성할 수 있고, 어떤 경우에는 비감염성인 새로운 바이러스 입자가 생성될 수도 있다. 이것은 바이러스 감염이 접종 부위로부터 전파될 수 없음을 의미한다.
본 발명의 두번째 특징은 결실된 유전자의 생성물을 바이러스에게 제공하여조직 배양으로 상기 바이러스를 증식시킬 수 있는 세포를 제공한다는 것이다. 그러므로 상기 바이러스에 필수 단백질을 암호하는 유전자가 결실되어 있을 지라도, 적당한 숙주 세포 중에서 증식시킨다면, 그 바이러스는 복제하여 본래의 바이러스와 구별할 수 없는 외관인 완전한 바이러스 입자를 생성할 것이다. 이 돌연변이 바이러스 제조물은 결손된 게놈을 가지고 있고 정상 숙주 중에서 감염성 바이러스를 생성할 수 없다는 점에서 불활성이며, 따라서 숙주중에 체액 반응을 직접 유발하는데 필요한 양으로 안전하게 투여될 수 있다. 그러므로, 그 돌연변이 바이러스는 보호되어야만 하는 숙주의 세포에 대해 감염성일 필요는 없고 단지 통상의 사바이러스 백신 이나 약독성 바이러스 백신과 같은 방식으로 조작하면 된다. 하지만, 상기 면역화 바이러스는 그것이 세포에 결합할 수 있고, 세포 중으로 유입되어, 바이러스 복제 사이클을 개시할 수 있다는 점에서 여전히 감염성인 상태로서, 보호되어야만 하는 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있고, 여기에서 약간의 바이러스 항원을 생성시킬 수 있다. 따라서, 숙주 면역계의 세포성 아암(arm)을 자극할 수 있는 기회를 더 제공한다.
결실되거나 불활성화되는 유전자는 바이러스 사이클 중 가능한 한 후기에 작용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 생체내에 가능한 많은 바이러스 단백질을 제공하여 면역원성 반응을 유발시킬 수 있도록 하기 위함이다. 예를 들면, 상기 유전자는 포장이나 임의의 다른 복제후 반응에 관련된 것, 예컨대 HSV의 gH 당단백질 유전자일 수 있다. 그러나, 선택되는 유전자는 바이러스 게놈 복제에 관여하는 것이어야 하고, 생체내에서 발현되는 단백질의 농도는 그 유전자가 정상적으로 발현되는 단계에 따라 결정될 것이다. 예컨대, 사람 시토메가로바이러스(HCMV)의 경우에 있어서, 선택되는 유전자(인접 초기 유전자 이외에)는 생체내에서 바이러스 게놈의 복제를 효과적으로 억제하는 유전자일 수 있는데, 그 이유는 바이러스 게놈 복제 전에 생성되는 인접 초기 유전자(특히 복제에 필수적임)가 고도로 면역원성이기 때문이다.
본 발명은 1종 이상의 필수 유전자(들)를 식별하여 바이러스 게놈으로부터 결실시키거나 불활성화시킨 모든 바이러스에 적용할 수 있다. 아데노, 헤르페스, 파포바, 파필로마 및 파르보 바이러스와 같은 DNA 바이러스의 경우에, 본 발명은 (i) 소정의 필수 유전자를 클로닝한 DNA 복사체를 시험관내 조작하여 특정 DNA를 변화시키고, (ii) 그 변형물을 재조합 및 표지인자 구축의 표준 방법을 통해 바이러스 게놈 중으로 재도입시킴으로써 직접 실시할 수 있다. 또한, 본 발명은 RNA 바이러스들에도 적용할 수 있다. 현재 RNA 바이러스 게놈의 상보성 DNA 복사체를 표준 유전자 기법으로 시험관내에서 조작한 다음, 시험관내 전사에 의해 RNA로 전환시키는 기법이 용이하게 이용되고 있다. 얻어지는 RNA는 그 다음 바이러스 게놈 중으로 재도입시킬 수 있다. 이 기술은 양성(+) 및 음성(-) 가닥을 가진 폴리오 바이러스(Racaniello 및 Baltimore, Science, 214, 916-919, 1981) 및 인플루엔자 바이러스(Lutyes 등, Cell, 59, 1107-1113, 1989)와 같은 RNA 바이러스들의 게놈내에 특정 변화를 만드는데 사용되었다.
이론적으로 필수 단백질을 암호하는 유전자는 모두 약독성 바이러스를 생성시키기 위한 상기 기법에 유력한 표적이다. 그러나, 실제로 상기 유전자는 다음과같은 많은 사항을 고려하여 선택해야 할 것이다.
1. 유전자는 감염시에 필요로 되는 시기가 보다 후기인 것이 바람직하다. 따라서, 약독성 바이러스의 복제는 초기 단계에서는 방해되지 않는다. 이것은 감염된 세포 중에서 대부분, 그리고 아마도 모든 기타 바이러스 항원들이 생성되며, 숙주 세포 MHC 1군 분자에 결합하여 숙주 면역계에 제공될 것이라는 것을 의미한다. 이와 같은 항원 제공은 바이러스 감염에 대하여 세포독성인 T 세포의 생성을 통해 세포 면역성을 발달시킨다. 세포독성인 T 세포들은 상기 항원들을 인식할 수 있고, 이에 따라 바이러스 감염된 세포를 사멸시킨다. 또한, 결실 유전자는 바이러스 조립에는 전혀 필요하지 않으나, 조립된 바이러스가 새로운 세포를 감염시키는 데에는 필수적인 유전자를 나타낼 수도 있다. 그런 단백질의 예로는 HSV gH 단백질이 있다. 이 단백질의 부재하에서는 HSV 비리온이 생성되나 이들은 비감염성이다.
2. 선택된 유전자의 생성물은 그 자체가 진핵세포에 대해 독성을 나타내지 않아야 하며, 따라서 상보성 세포가 비교적 용이하게 제조할 수 있는 것이 이상적이다. 그러나, 이것은 절대적인 필요 조건은 아닌데, 그 이유는 상기 유전자가 상보성 세포 중에 유도성 프로모터의 조절하에 배치될 수 있으므로, 그 유전자를 필요할 때만 전환 발현시킬 수 있기 때문이다.
또한, 표적 유전자 중에 형성할 돌연변이의 종류도 선택해야 할 문제이다. 비기능성의 유전자 생성물을 형성시키는 변화로서 야생형 구조로 복귀될 위험성이 최소화되는 한 어떤 변화라도 좋다. 그런 변화는 표적 중에 무관계 서열의 개재 및 특정 결실부의 형성을 포함한다. 치료제 및/또는 예방제로서 사용하기 위한 백신에대한 가장 만족할 만한 제조 전략은 상보성 세포내로 도입되는 전체 서열을 포함하는 결실부를 만드는 것이다. 이런 제조 방식은 상기 바이러스와 상보성 세포의 세포 DNA 사이 재조합을 통해 야생형 바이러스를 재생시킬 수 있는 위험성을 최소화한다.
현재까지 특이적으로 불활성화된 바이러스와 상보성 세포의 복합체에 대한 여러가지 실례가 있었지만(상기 참조), 이 예들은 바이러스에 대한 기본적인 연구나 또는 레트로바이러스의 경우에서와 같이 돌연변이성 동물의 생성용으로 더욱 안전한 벡터를 제조하는데에만 사용되었다. 즉, 백신용으로서 사용된 예는 없으며, 본 출원인들이 아는 바로는 이와 같은 용도에 대해서는 제안된 적도 없다.
야생형 바이러스에 대하여 안전한 백신을 생성하기 위해 상기 불활성 바이러스/상보성 세포 복합체를 사용하는 방법 뿐만 아니라, 본 발명은 또한 이종 병원체에 대한 백신용으로서 안전한 바이러스 벡터를 생성하기 위하여 상기와 동일한 복합체계를 사용하는 방법에 관한 것이다.
그런 벡터의 한 예는 HSV를 기본으로 한 것이다. HSV 게놈은 상당한 유전 정보를 더 수용하기에 충분할 정도로 크며, 이종 유전자 물질을 수반하고 발현하는 HSV 바이러스 재조합체의 여러가지 실례에 대해서는 개시되어 있다(예, Ligas 및 Johnson, J. Virol. 1988, 전술한 인용문헌). 따라서 전술한 필수 바이러스 유전자가 결실되고, 일정한 이종 유전자를 수반하고 발현하는 바이러스는 이종 단백질에 대하여 면역 반응을 생성하는 백신 접종에 안전한 벡터로서 사용될 수 있다.
HSV의 독특한 특징은 감염된 개체의 뉴런내에서 잠복 상태로 있을 수 있고,때때로 재활성화하여 국소적인 병소를 유발한다는 점이다. 따라서, 필수 바이러스 유전자 내에 결실부를 가지고 있고 이종유전자를 발현하는 HSV는 환자의 뉴런 내에 고의로 잠복 감염시키는데 사용될 수 있다. 그런 잠복 감염의 재활성화는 바이러스 벡터가 충분히 복제될 수 없기 때문에, 병소 생성을 유도하지는 않지만, 바이러스 복제 사이클의 초기 부분을 개시시킬 수는 있다. 이 때, 이종 항원의 발현이 일어날 수 있고, 이것은 면역 반응을 생성시킨다. 결실된 HSV 유전자가 바이러스 조립에는 필요하지 않으나 조립된 비리온의 감염성에 필요한 단백질을 발현하는 경우에는 상기 이종 항원이 조립된 바이러스 입자내로 병입되어 항원의 면역원성 효과를 상승시킬 것이다. 이러한 이종 유전자의 형질 발현 및 바이러스 입자내에 항원 단백질의 병입은 돌연변이 바이러스가 그것의 상보성 숙주내에서 처음 생성되는 단계에서도 물론 일어날 것이며, 이 경우에 돌연변이 바이러스를 백신으로 사용하면 치료받는 종에게 이종성인 단백질을 즉시 제공할 수 있다.
또 다른 예로서, 마마바이러스의 일종인 종두 바이러스는 다양한 병원체 유래의 유전자를 운반하고 발현할 수 있는 바, 동물 실험계에 사용했을 때 효과적인 백신으로 작용한다는 것이 증명되었다. 따라서, 인체에도 사용할 수 있을 것이라는 가능성은 컸지만, 천연두에 대한 백신으로서 널리 사용된 종두 바이러스와 관련이 있는 것으로 공지된 부작용 때문에, 사람에게 대량으로 미련형 종두 바이러스를 사용하기는 어려웠다. 이에 따라 종두 생육 인자 유전자와 같은 비필수 유전자를 결실시킴으로써 종두 바이러스를 약독화시키는 시도가 이루어졌다(Buller, Chakrabarti, Cooper, Twardzik & Moss, J. Virology 62, 866-874, 1988). 그러나,이와 같은 약독성 바이러스는 그 양이 적을지라도, 생체내에서 여전히 복제할 수 있다. 필수유전자가 결실된 종두바이러스는 지금까지 제조된 바 없으며, 전술한 바와 같은 필수 유전자가 결실된 상기 바이러스는 증식을 위한 그것의 상보성 세포와 함께 이 백신 벡터의 더욱 안전한 변형물을 제공할 것이다.
이종 단백질에 대한 면역화에 있어서 상기 일반적인 전략의 또 다른 장점은 통상적인 생 바이러스 벡터로는 가능하지 않은 방법으로서 동일한 바이러스 벡터를 사용하여 유효량의 백신 접종을 수회 실시할 수 있다는 점이다. 표준 생 바이러스 백신은 그것의 효능을 평가할 때, 아마도 많은 감염 사이클을 통해 숙주 동물내에서 복제하는 능력에 따라 좌우되므로 그 백신의 유용성은 그 바이러스에 대하여 면역성을 가진 개체에만 주로 한정될 것이다. 따라서 동일한 단백질에 대한 보조 면역화를 제공하든지, 또는 다른 단백질에 대하여 새로운 반응을 제공하든지간에 동일한 바이러스를 사용하는 제 2의 항원투여는 비효과적일 가능성이 크다. 다중 사이클의 복제가 필요치 않거나 바람직하지 않을 때는, 필수유전자가 결실된 바이러스 벡터를 사용하면 효과적인 면역화를 유도하는 반응이 면역화 후 즉시 일어날 것이다. 돌연변이 바이러스의 투여량은 비교적 다량일 수 있으며(그러므로 완전하게 안전해야 함), 따라서 이들 초기 반응이 숙주 면역 반응에 의해 차단될 가능성은 없으며, 완전하게 이동성이 되는데에는 약간의 시간이 필요할 것이다.
필수 유전자가 결손되고, 임의적으로 면역원성 병원체 단백질에 대한 유전자를 포함하는 돌연변이 바이러스에 대하여 전술하였으나, 그 돌연변이체는 1종 이상의 필수 유전자가 결손될 수 있고(또는) 1종 이상의 면역원성 병원체 단백질 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 그 돌연변이 바이러스는 전술한 방식에서와 같이 백신으로 작용하기 위해 HIV gp120의 유전자를 포함할 수 있고, 또한 백신 접종된 숙주내에서 형질 발현되고, 숙주 세포의 표면에 MHC-I과 결합하여 제공되어 그 숙주의 T-세포 반응을 자극하는 HIV gag 단백질의 유전자를 포함할 수도 있다.
본 발명을 더욱 명백히 이해할 수 있도록 하기 도면의 설명과 함께 실시예를 통해 보다 상세히 설명될 것이며, 이 실시예로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
제1도는 플라스미드 pGH1의 제조 방법을 도시한 것이다.
제2도는 플라스미드 pGH2의 제조 방법을 도시한 것이다.
제3a도는 플라스미드 pSP64Ta를 제조하는데 사용된 상보적인 올리고뉴클레오티드의 쌍을 도시한 것이다.
제3b도는 플라스미드 pSP647A의 제조 방법을 도시한 것이다.
제4a도는 플라스미드 pCMVIEP를 제조하는데 사용된 2개의 올리고뉴클레오티드를 도시한 것이다.
제4b도는 플라스미드 pCMVIEP를 도시한 것이다.
제5도는 플라스미드 pCMVlacZ를 도시한 것이다.
제6도는 플라스미드 pGH3을 도시한 것이다.
제7도는 플라스미드 pGH-120의 작제 방법을 도시한 것이다.
당단백질 H를 결실시킨 헤르페스 단순 바이러스(gH- HSV)
헤르페스 단순 바이러스(HSV)는 사람에게 재발성 안면 병소 및 생식기 병소와 같은 광범위한 병원성 증상 및 드물지만 종종 치명적인 뇌염을 일으키는 대형 DNA 바이러스이다. 이 바이러스에 의한 감염은 아사이클로비르 약제를 사용하여 화학 치료법으로 어느 정도까지 억제될 수는 있으나, 지금까지 1차 감염을 예방하는데 유용한 백신은 제공된 바 없다. HSV에 대한 백신 접종의 어려움은 바이러스가 일반적으로 세포에서 세포로 직접적인 전이를 통해 신체 내에 전파된다는 점이다. 따라서, 체액 면역은 순환 항체가 단지 세포외 바이러스만을 중화할 수 있기 때문에 효과적이지 못하다. 바이러스 감염 억제에 더욱 주요한 것은 세포 면역이고, 따라서 체액 면역과 세포 면역을 생성할 수 있으면서, 안전한 백신이 상당히 유리할 것이다.
HSV 게놈 중 불활성화에 적합한 표적 유전자는 당단백질 H의 유전자(gH)이다. 이 gH 단백질은 바이러스 엔벨로프(envelope)의 표면위에 존재하는 당 단백질이다. 이 단백질은 감염된 세포로 바이러스 유입시 막 융합 과정에 관련이 있는 것으로 생각된다. 그 이유는 상기 유전자내에 손상부가 있는 감온성 바이러스 돌연변이체가 비허용성 온도에서는 바이러스 감염 세포로부터 배출되지 못하기 때문이다(Desai 등, J. Gen. Virol. 69, 1147-1156, 1988). 이 단백질은 감염시 후기에 형질발현되고, 따라서 이 단백질의 부재하에서도 상당량의 바이러스 단백질은 여전히 합성될 것이다.
모든 유전자 조작 절차는 "분자 클로닝"(A Laboratory Manual, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis 편집, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 표준 방법에 따라 실행된다.
A. HSV gH 유전자를 형질발현하는 세포주의 제조
gH 유전자는 HSV 타입 1 게놈의 고유 장 영역(Unique Long region; UL) 내에, 즉 뉴클레오티드 46382와 43868 사이에 존재한다(McGeoch 등, J. Gen. Virol. 69, 1531-1574, 1988). 이 유전자의 클로닝 복사체는 플라스미드 pAF2내에서 이용할 수 있다. 이 플라스미드는 문헌(Gompels 및 Minson, J. Virol, 63, 4744-4755, 1989)에 기재된 바와 같이 플라스미드 pTZgH로부터 완전한 gH 암호 서열을 포함하는 BgIII-Xho I 단편을 절단한 뒤, 플라스미드 pSP64T의 BgIII 부위내로 클로닝시켜 제조하였다. 그 다음 플라스미드 pSVD4(Everett, Nucl. Acids Res., 11, 6647-6667, 1983)로부터 당단백질 D(gD) 유전자의 프로모터 서열을 포함하는 Hind III 단편(gD 유전자의 개시 부위에 대하여 뉴클레오티드 -392부터 +11까지 전개됨)을 절단하고, pAF2의 고유 Hind III 부위내로 클로닝시켜 그 프로모터 서열을 정확히 배향하여 gH 유전자의 발현을 진행시키는 pGH 1(제 1도)을 제조하였다. 따라서, 이 플라스미드는 HSV 타입 1 gD 유전자 프로모터 조절하에 완전한 gH 암호 서열을 포함한다. 그 다음이 플라스미드를 정제하고 표준 인산 칼슘 동시 침강 기법(Graham 및 Van der Eb. Virology 52, 456-467, 1973)을 사용하여 플라스미드 pNEO(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)와 함께 베로(Vero) 세포를 동시형질감염시켰다. 그 다음, G418 약제 중에서 세포를 전파시킴으로써 네오마이신에 대한 내성을 획득한 베로세포를 선택하고, 이들 세포의 콜로니들을 한계 희석법으로 클론화했다. 그 다음 이들 네오마이신 내성 세포들을 조직 배양으로 증폭시킨 후, 샘플을 HSV 타입 2 바이러스로 감염시켰다. 이와 같이 HSV 타입 2 바이러스로의 감염은 상보성 세포 게놈내에 존재하는 타입 1 gD 프로모터로부터의 전사를 유도하며, 그 결과 상보성 세포 중에서 타입 1 gH 단백질의 생성을 자극하는 효과를 나타내었다. 그 다음 타입 1 gH 단백질을 특이적으로 인식하는 것으로 공지된 폴리클론성 항혈청을 사용하여(Desai 등, 1988 상기 문헌 참조), 상기 감염된 세포의 용균물을 웨스턴 블롯팅하여 gH 단백질을 발현하는지 선별하였다. 필요한 단백질을 발현하는 세포는 선별하여 동결 저장물을 제조하였다. 이 물질을 gH+상보성 세포주로 표시하였다.
B. 중절된 gH유전자를 가지고 있는 HSV타입 1 바이러스의 제조
HSV 인접(flanking) 서열과 함께 gH의 암호 서열을 포함하는 6432 염기 쌍의 BgIII 단편을 플라스미드 pUG102(Gompels 및 Minson, Virology 153, 230-247, 1986)로부터 절단하여 플라스미드 pAT153(Twigg 및 Sherrat, Nature, 283, 216, 1980)내로 클로닝하여 pGH2(제 2도)를 생성한다. 그 다음 gH 암호서열 중 두 위치[McGeoch 등의 번호매김 도표에 따르면 뉴클레오티드 44955와 46065 (1988, 상기 문헌 참조)]만을 절단하는 PvuII로 상기 플라스미드를 절단하고, 두 단편중 더 큰 단편을 정제한다. 그 다음, 이. 콜리 유래의 완전한 β-갈락토시타제 유전자와 이것의 하류에 있는 시토메가로바이러스(CMV) 유래의 인접 초기 운전자 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 다음 절차에 따라 제조한다. 첫째, 상보성 올리고뉴클레오티드쌍(제 3a도에 나타냄)을 어닐링하고, BgIII-절단 및 포스파타제-처리된pSP64T(Krieg 및 Melton, Nucl. Acids Res. 12, 7057-7071, 1984)에 연결시켜 제 3B도에 나타낸 플라스미드 pSP64Ta를 생성한다. 첨가된 링커 역시 개시 코돈과 이. 콜리의 β-갈락토시다제 유전자(lacZ) 중 첫 3개 코돈을 포함한다. 그 다음, 제 4a도에 나타낸 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응 기술(PCR-Molecular Cloning, ed SamBrook 등, 상기 문헌 참조)로 플라스미드 pUG-H1(Gompels 및 Minson, 1989, 상기 문헌 참조)로부터 CMV의 인접 초기 유전자 프로모터의 "코어 영역"을 증폭시킨다. 이때 사용된 상기 2개의 올리고뉴클레오티드는 각각 -302부터 -288까지의 서열 및 -13부터 -36까지의 서열에 상응한다(CMV 인접 초기 유전자의 개시부 부터 번호 매김, Akrigg 등, Virus Research, 2, 107-121, 1985에 기술됨) 또한, 이들 올리고뉴클레오티드들은 5'말단에 제한 효소 Hind III 부위를 포함하며, 상기 프로모터의 상류에 어닐링된 올리고뉴클레오티드 어닐링 상류(upstream)인 경우에는 추가로 Sma I 부위를 더 포함한다. 이 PCR증폭된 생성물 DNA를 그 다음 Hind III로 절단하고, Hind III 절단된 pSP64Ta내로 클로닝시켜 플라스미드 pCMVIEP(제 4B도)를 생성한다. 마지막으로 이. 콜리의 β-갈락토시다제 유전자의 완전한 복사체를 포함하며 암호서열의 5' 최단부만이 결실된 DNA 단편을, 플라스미드 pSC8(ChakrsBarti 등, Mol. Cell. Biol., 5, 3403-3409, 1985)의 BamHI 절단으로 분리하고, 이것을 pCMVIEP의 고유 EgIII 부위 내로 클로닝시켜 pCMVlacZ(제 5도)를 생성한다. 그다음 pCMVlacZ를 SmaI으로 절단하여 CMV IE 프로모터의 조절하에 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 분리하고, 이것을 전술한 pGH2의 PvuII 단편 정제물과 연결시켜, 작용성 β-갈락토시다제 유전자에 의해 중절된 gH유전자 복사체를 포함하는 pGH3(제 6도)을 만든다. 다음 단계는 HSV 게놈내의 야생형 gH 유전자를 상기 중절된 변형물로 교체시키는 것인데, 이것은 HSV DNA와 플라스미드 pGH3을 재조합시킨 후, 작용성 β-갈락토시다제 유전자를 획득한 바이러스를 선택함으로써 실시한다. 그 다음, 표준 인산칼슘 침강 기술(Graham 및 Van der EB, 1973, 상기 문헌 참조)로 플라스 pGH3 DNA를 HSV 비리온 정제물로부터 분리된 HSV DNA 정제물[Killington 및 Powell, In "Techniques in Virology: A Practical Approach"(B.W.J.Mahy 편집)pp 207-236, IRL Press, Oxford(1985)]과 함께 사용하여 gH 유전자를 발현하는 세포(A항에서 기술한 gH+상보성 세포주)를 동시 형질감염시킨다. 이 형질감염 실험으로부터 제조된 후대 HSV 바이러스를 gH+상보성 세포의 단층 위에 도말하고, 효소 B-갈락토시다제에 의해 청색물질로 전환되는 발색성 기질인 5-브로모-클로로-3-인돌일-B-D-갈락토사이드(X-gal)의 존재하에 한천중층을 사용한 표준 플라크 검정법으로 검정한다. 그 결과, 바이러스 게놈이 감염되어 β-갈락토시다제 유전자를 포함하고 발현하는 플라크는 청색을 나타낼 것이다. 따라서, 이 바이러스 게놈들은 gH유전자의 중절된 변형물을 운반해야 한다. 평판 배지상의 적당한 부분의 한천 일부를 취해 이들 플라크들로부터 바이러스를 회수하고, gH+상보성 세포주내에서 바이러스를 증식시킴으로써 바이러스 저장물을 제조한다. 이 바이러스들은 gH 유전자의 비작용성 변형물을 갖고 있으므로 내인성 gH 유전자의 작용성 복사체를 포함하지 않아 발현하지 않는 세포 상에서는 플라크를 형성할 수 없어야 하여, 이를 확인하기 위해서 상기 바이러스 샘플을 가지고 야생형 베로 세포 단층 위에서 플라크를 형성할 수 있는 지를, gH-상보성 세포일 때와 비교하여 검정한다. 마지막으로, 상기 저장물로부터 바이러스 DNA를 제조하고, 서던 블롯팅으로 gH 유전자 주위에 존재하는 DNA의 예상 구조를 조사한다. 정확한 유전자 구조를 확인한 후, gH+상보성 세포주의 대규모 배양물(감염 다중성=0.01)에 상기 바이러스 샘플을 접종하여 gH 유전자-결손 바이러스의 다량 저장물을 제조하고 3일후 감염된 세포를 수거한다. 감염된 세포를 초음파 처리로 붕괴하여 세포에 결합된 바이러스를 해리시키고, 초음파 처리된 총 혼합물을 바이러스 모액으로서 -70℃에서 저장한다. 바이러스 모액의 역가를 gH+상보성 세포주 상에서 플라크 검정법으로 측정한다. 그 다음 이 바이러스 모액 샘플을 사용하여 전술한 것과 같이 작업 모액을 제조하고, 그 다음 이 작업 모액을 사용하여 하기 기재하는 바와 같이 실험실 동물을 감염시킨다.
C. 가열 사멸된 바이러스와 비교한 gH - HSV의 예방 효과에 관한 연구
이 바이러스에 대한 숙주의 면역학적 반응을 평가하기 위해, 하기 기재하는 실험 계획에 따라 마우스들에게 항원 투여 실험을 실행하였다.
gH-생 바이러스 제제의 예방 효과를 다음과 같이 야생형(WT) 바이러스(균주 SC16)의 불활성 제제와 비교하였다.
백신 접종을 위한 불활성 야생형 바이러스의 제조
HSV 타입 1(균주 SC16)을 낮은 감염 다중성(0.01 pfu/세포)의 베로 세포를통해 증식시켰다. 3일후, 바이러스를 수거한 다음, 세포질의 바이러스를 다운스(Dounce) 균질화로 회수했다. 500xg에서 15분동안 원심분리시켜 핵을 제거하고, 상청액을 40% 자당 쿠숀위에서 베크만 Sw27 로터를 사용하여 12K로 60 분 동안 원심분리시켜 수거했다. 밴드로 나타나는 바이러스를 수거하여 희석하고, 펠렛화하여 자당 구배 원심분리로 정제했다(Killington 및 Powell. 1985, 상기 문헌 참조). 그 구배로부터 바이러스 밴드를 수거하고, 원심분리시켜 바이러스를 회수하였다. 바이러스를 인산염 완충 식염수(PBS)내에 재현탁하고, 어린 햄스퍼 신장(BHK) 세포상에서의 플라크 역가 측정으로 감염도를 검정하였고, 그 입자수를 전자 현미경으로 측정했다. 그 제조물의 입자:감염도 비는 110 입자/pfu 였다. 그 바이러스를 PBS 내에 2.5 x 1010pfu/ml로 희석하고 B-프로피오락톤으로 20℃에서 60분간 처리하여 불활성화시켰다. 일정량을 -70℃에 보관했다.
백신 접종용 gH - 생바이러스 제조물
이 바이러스는 HSV 타입 1 gH유전자를 함유하여 이 유전자를 발현하는 gH+상보성 세포주내에서 증식시키며, β-프로피오락톤으로 처리하여 불활성화시킨다는 것을 제외하고는 야생형 바이러스에 대하여 기재한 바와 같이 제조하였다. 이 제조물의 입자:감염도 비는 150:1이었다. 이 제조물의 농도는 2.5 X 1010pfu/ml로 조정하고 일정량씩 PBS 중에서 -70℃로 보관했다.
백신접종 프로토콜
4주된 암컷 BalB/C 마우스(Tucks U.K. Ltd 시판품)에게 인산염 완충 식염수 2 ㎕ 중에 함유된 다음과 같은 다양한 투여량의 불활성화된 WT 바이러스나 gH-생바이러스를, 오른쪽 귀를 바늘로 난절하고 소적 적용하여 백신 접종시켰다.
A군 대조군 - 바이러스 무첨가
B군 5 x 104pfu 바이러스 백신
C군 5 x 105pfu 바이러스 백신
D군 5 x 106pfu 바이러스 백신
E군 5 x 107pfu 바이러스 백신
14일후, 모든 마우스에게 2 x 106pfu의 HSV-1 균주 SC16(야생형 바이러스)을 왼쪽 귀에 전술한 바와 유사한 접종 방식으로 항원 투여했다. 마우스들은 5일후 죽이고 왼쪽귀 및 왼쪽 경부신경절 cII, cIII 및 cIV(복합)내의 바이러스 감염도를 검정하였다. 잠복성에 대한 연구를 위해, 백신 접종되고 항원 투여된 다른 동물들은 1달 후 죽이고, cII, cIII 및 cIV 신경질을 해부함으로써 잠복감염에 대해 시험하였다. 이 조직들을 5일 동안 배지내에서 배양한 다음 균질화하여 표준 플라크 검정법으로 감염성 바이러스의 존재에 대하여 검정하였다. 다음 결과들은 모두 pfu 기관으로서 표시하였다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
[표 4]
상기 결과들은 급성 감염 단계동안 귀와 경부 신경절내에 존재하는 항원 바이러스인 wt SC16의 역가를 나타낸다. 따라서, 역가가 낮은 것은 gH-바이러스에 의한 백신접종 양생법이 우수한 효과를 나타내는 반면, 높은 역가는 좋지 않은 효과를 나타낸다. 상기 결과로부터 gH-HSV 생 바이러스의 백신접종이 동등량의 불활성 WT 바이러스 보다 훨씬 더 효과적이라는 것이 명백해졌다. 불활성 제조물을 사용한 경우에는, 귀에서 항원 바이러스 복제를 예방하는데 필요한 투여량이 5 x 107pfu인 반면, gH-생 바이러스 제조물을 사용한 경우에는 그 보다 100 내지 1000배 적은 양의 바이러스만이 필요로 되었다. 또한, gH-생바이러스는 5 x 105pfu이상의 백신접종을 통해 경부 신경절에서 급성 감염 단계인 항원 바이러스의 복제를 차단할 수 있었고, 더욱이 경부 신경절에서 나타나는 잠복 감염에 대한 예방 효과도 명백히 나타내었다.
이종항원에 대한 면역화용 벡터로서 gH유전자가 결실된 HSV: gH - HSV 바이리스 게놈내로 SIVmac 균주 142의 gp120유전자의 도입
필수 유전자가 결실된 바이러스는 전술한 바와 같이, 이종 항원을 면역계에 전달하기 위한 안전 벡터로서 사용할 수 있으며, 이와 같은 벡터의 예로서 전술한 gH-HSV 바이러스가 적합하다. 이 바이러스는 임의의 필요한 이종 항원을 발현시키는데 사용할 수 있으며, 특히 AIDS 바이러스인 사람 면역 결핍 바이러스(HIV)의 주요 항원 단백질 발현에 대한 이용가능성이 바람직하다. 따라서, 이들 서열은 재조합 바이러스가 정상 세포(즉, 비상보성 세포)를 감염시키는 동안 형질발현이 이루어질 수 있도록 gH-HSV 게놈에 삽입되어야 한다. 그런 바이러스에 의해 개체가 감염되면 잠복 감염이 될 수 있고, 때로 재활성화할 때 이종 항원을 급격히 생성시켜, 그 단백질에 대할 면역 반응을 자극한다.
현재는 인체내에서 이런 접근 방식을 직접적으로 시험하는 연구가 가능하지 않으므로, 초기 단계로서 시미안 AIDS 바이러스 SIVmac(짧은 꼬리 원숭이로부터 분리된 시미안 면역 결핍 바이러스)를 원숭이에게 사용하는 방식으로 시험하였다. 이런 목적에 적합한 SIV의 유전자는 이 바이러스의 주요 항원 표적부 중의 하나인 gp 120 단백질을 암호하는 유전자이다. 이 유전자를 gH-HSV 게놈내로 도입시키고, SIV 공격에 대하여 원숭이를 보호하는 백신으로서 상기 바이러스의 효력을 평가했다.
우선, 시토메가로바이러스 IE 코어 프로모터(Gompels 및 Minson, 1989, 상기 문헌 참조)다음에 SIV gp 120 유전자를 클로닝시키고 그 다음 gp120 유전자와 상류에 위치한 CMV 프로모터로 구성된 DNA 카셋트(cassette)를 플라스미드 pGH2(제 2도)내에 클로닝시켰다. 얻어진 플라스미드를 gH-HSV로부터 정제된 DNA와 함께 이용하여 gH+상보성 세포를 동시형질감염시키고, gH-HSV 바이러스내에 존재하는 β-갈락토시다제 유전자 대신에 gp120 유전자를 획득한 재조합 바이러스를 β-갈락토시다제 유전자의 중절에 대한 선별법으로 분리하였다.
A. HSV 게놈내로 SIV gp120 암호 서열을 재조합시키기 위한 플라스미드의 작제
이 절차의 총 계획도를 제7도에 나타내었다. SIV 게놈의 클로닝된 DNA 복사체[ChakraBarti 등, Nature 328, 543(1987)]로부터 Sac I 제한 효소 단편(염기5240-8721에 해당됨)을 절단하고, 플라스미드 pUC118(Viera 및 Messing, Methods in Enzymology, 153, 3, 1987)의 Sac I 부위내로 클로닝시켜, 부위 지시성 돌연변이 조작으로 일본쇄 DNA로 전환될 수 있는 플라스미드 pSIV1을 생성했다. 그 다음 SIV env 유전자(6090-8298 사이에 존재)를 포함하는 상기 DNA 영역을 합성 올리고뉴클레오티드 5'GAAGAAGGCTATAGCTAATACAT를 사용하여 부위 지시성 돌연변이(Brierley 등, Cell 57, 537, 1989)로 변이시켜 6053-6058 위치에 EcoRV 효소의 제한 효소 부위를 도입하였다.
그 다음 합성 올리고뉴클레오티드 5'CAAGAAATAAACTATAGGTCTTTGTGC를 사용하여, env 유전자 서열의 gp120과 gp40 도메인 사이의 절단부위에 해당하는 위치인 SIV env 유전자내의 7671 내지 7676에 제 2의 EcoRV 부위를 도입시켜 플라스미드 pSIV2를 생성했다. 그다음 SIV env 유전자의 gp120 부위에 해당하는 DNA 단편(1617 염기쌍)은 EcoRV로 SIV2를 절단시킴으로써 제조했다.
CMV 인접 초기 유전자 프로모터의 코어 영역은 하기 2가지 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 기술로 플라스미드 pUG-H1(Gompels 및 Minson, 1989, 상기 문헌 참조)으로부터 얻었다.
상류 프라이머
하류 프라이머
이 반응의 생성물을 효소 EcoRI 과 Hind III로 절단하여 생성된 DNA 단편을, EcoRI과 Hind III으로 절단한 플라스미드 pUC118 내로 클로닝시켜 플라스미드 pCMVIE2를 생성하였으며, 이 플라스미드는 CMV 프로모터 서열의 바로 하류에 위치하고 있는 유일한 SmaI 부위를 가지고 있다. 전술한 바와 같이 제조된 SIVmac gp120 암호서열을 포함하는 EcoRV 단편을 이 SmaI 부위내로 클로닝시키고, 프로모터로부터 암호서열을 형질발현할 수 있도록 정확하게 배향된 SIV 암호 영역을 가진 플라스미드 pSIV3을 선정한다. 이 플라스미드를 EcoRV로 절단하여, CMV 프로모터와 함께 SIV 서열을 포함하는 평활말단의 DNA 단편을 얻고, 이것을 PvuII-분해된 pGH2(제 2도)내로 클로닝시켜 pGH-120을 생성하였다.
B. gH - HSV 재조합체를 운반하는 SIV gp120의 작제
전항에서 전술한 바와 같이 작제된 gH-HSV 바이러스로부터 DNA를 정제하고 정제된 pGH-120 DNA와 함께 gH+상보성 세포내로 동시형질감염시켰다. 이 형질감염 절차로부터 분리된 후대 바이러스를 단층의 gH+상보성 세포주 위에 평판 도말하고 X-gal을 함유하는 한천 중층을 사용하여 전술한 바와 같이 표준 플라크 검정법을 실시한다. gH-모바이러스는 나머지 gH 암호서열내에 위치한 작용성 β-갈락토시다제 유전자를 운반하고, X-gal의 존재하에 청색 플라크를 형성할 것이다. 그러나, β-갈락토시다제 유전자 대신에 SIV gp120 암호서열을 획득한 재조합 바이러스들은 백색 플라크를 생성할 것이다. 그 백색 플라크가 위치한 한천 조각을 취해 바이러스를 수거하고 그 바이러스를 gH+상보성 세포주내에서 증식시켜 바이러스 저장물을 제조한다. 이 저장물로부터 바이러스 DNA를 제조하고, SIV 암호 서열로부터 유도된 적합한 프로브를 사용하는 시던 블롯팅으로 gH 유전자 주변의 정확한 DNA 구조의 존재를 검측한다. 마지막으로 이 바이러스 저장물을 동물에 대한 백신 접종 연구를 하기 위해 전술한 바와 같이 제조한다.
약독성 바이러스를 포함하는 백신은 본 기술분야에 공지된 표준 기술에 따라 제조하고 사용할 수 있다. 예를들면, 이 백신은 1종 이상의 부형제 및/또는 보조제를 포함할 수 있다. 백신으로서 제공되는 약독성 바이러스의 유효 투여량은 본 기술분야에 공지된 기술에 따라 결정할 수 있다.

Claims (16)

  1. 감염성 바이러스의 생성에 필요한 유전자가 결손된 게놈을 갖고 있는 돌연변이 헤르페스바이러스를 포함하며, 이 바이러스는 정상 세포를 감염시킬 수 있고, 그 세포내에서 복제하여, 그 세포로부터 비감염성의 바이러스 입자를 생성 및 방출시킬 수 있음을 특징으로 하는 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이 헤르페스바이러스로 면역화된 감수성 종을 면역화시킴으로써 이에 상응하는 야생형 바이러스에 의한 감염에 대하여 방어할 수 있음을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이 헤르페스바이러스가 헤르페스 단순 바이러스(HSV)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 결손이 당단백질 gH 유전자내에 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 돌연변이 헤르페스바이러스는 그 바이러스로 감염된 종내에서 주기적으로 재활성화되는 잠복 감염 상태를 형성하므로써, 그 바이러스가 암호하는 단백질을 상기 잠복 감염된 세포내에서 생성시킬 수 있음을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 감염성 바이러스를 생성하는데 필요한 유전자가 결손되어 있고, 그 바이러스에 대해 외인성인 병원체로부터 생성되는 면역원을 암호하는 유전자 물질을 운반하는 게놈을 가진 돌연변이 헤르페스바이러스를 포함하며, 그 바이러스는 정상 세포를 감염시킬 수 있고, 상기 면역원을 암호하는 유전자 물질을 일부 복제하고 형질 발현시킬 수 있으나, 감염성 바이러스 입자는 생성할 수 없음을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유전자 결손이 상기 세포로부터 비감염성의 바이러스 입자가 생성되고 방출되도록 함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 돌연변이 헤르페스바이러스로 면역화된 감수성 종내에 상기 병원체에 대한 면역성을 부여할 수 있음을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 돌연변이 헤르페스바이러스가 헤르페스 단순 바이러스(HSV)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제6항 또는 제9항에 있어서,
    상기 유전자 결손이 당단백질 gH 유전자내에 존재함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 돌연변이 헤르페스바이러스는 그 돌연변이 바이러스로 감염된 종내에서 주기적으로 재활성화되는 잠복 감염 상태를 형성하므로써, 그 바이러스가 암호하는 단백질을 상기 잠복 감염된 세포내에서 생성시킬 수 있음을 특징으로 백신 조성물.
  12. 돌연변이 헤르페스바이러스로 감염된 세포를 배양하고, 그리고 그 세포 배양물로부터 상기 돌연변이 헤르페스바이러스를 회수하는 것을 포함하는 제1항에 기재된 돌연변이 헤르페스바이러스의 제조 방법으로서, 상기 세포는 또한 헤르페스바이러스 결손 유전자에 상보적인 유전자를 발현하므로써 그 결손 게놈을 함유하는 감염성 헤르페스바이러스 입자를 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 제1항에 기재된 돌연변이 헤르페스바이러스로 감염된 피검체내에 면역 반응을 유발시키는 예방제 또는 치료제로서 사용하기 위한, 상기 돌연변이 헤르페스바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  14. 제1항에 기재된 돌연변이 헤르페스바이러스를 함유하는 백신을 제형화하는 것을 포함하는 치료용 또는 예방용 백신의 제조 방법.
  15. 감염성 헤르페스바이러스의 생성에 필요한 유전자가 결손된 게놈을 갖고 있는 돌연변이 헤르페스바이러스를 포함하며, 이 바이러스는 정상 세포를 감염시킬 수 있고, 그 세포내에서 바이러스 항원 유전자를 복제 및 형질 발현시킬 수 있으나, 정상의 감염성 바이러스는 생성할 수 없으며, 그 바이러스는 감염된 피검체내에 면역 반응을 유발시키는 예방제 또는 치료제로서 사용될 수 있음을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 유전자 결손이 상기 세포로부터 비감염성의 바이러스 입자가 생성되고 방출되도록 함을 특징으로 하는 백신 조성물.
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