JPH06504194A - ウィルス ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス　ワーダ汗ス 本発明は、ウィルス　ワクチンに関する。特に、それはワクチンとしての使用の だめの遺伝的に構築された変異ウィルス；その変異ウィルスを含んで成るワクチ ン；組換え細胞：及びワクチンの製造方法に関する。

ウィルス　ワクチンは従来、２種の性質のものである。第１の性質は適切な化学 物質、たとえばβ−プロピオラクトンによる処理により殺害されたウィルス調製 物である゛殺害された”ワクチンである。第２のタイプは、ウィルスゲノムの特 定の遺伝子操作により又はより通常にはいくつかのタイプの組織培養システムへ の通過により、宿主に対してより低い病原性にされたウィルスである生存“弱毒 ゛ワクチンである。これらの２種のタイプのワクチンはそれぞれ、それら自体の 欠点を有する。殺害されたワクチンは宿主において複製しないので、それらは注 射により投与されるべきであり、そして従って、不適切な種類の免疫応答を生成 することができる。たとえば、ポリオウィルスの殺害された調製物である５ａｌ ｋワクチンは免疫グロブリン（Ｉｇ）　Ｇ抗体応答を生成するが、しかし−次感 染の天然部位である腸においてＩｇＡの生成を刺激しない。従って、このワクチ ンは、ポリオの神経学的合併症から個人を保護することができるが、−次感染を 阻止せず、そしてその結果、″集団免疫パを付与しない。さらに、殺害されたウ ィルスは、宿主細胞の内部に侵入せず、そして復製しない。従って、復製の間に 生成される非構造タンパク譬に対するいづれかの有益な免疫学的応答は利用でき ない。それら：よまだ、ウィルス抗原に対して向けられた細胞毒性Ｔ細胞の生成 を刺激することができない。°死んだ゛°抗原は、抗原を示す細胞により取られ 、そしてＴ細胞に向けられる。しかしながら、この表示は、１ＨＣクラス■分子 を通して生し、そしてＴヘルパー細胞の刺激を導びく。次に、Ｔヘルパー細胞は 、Ｂ細胞の抗原に対しての特異的抗体の生成を助ける。細胞毒性Ｔ細胞の生成を 刺激するためには、ウィルス抗原は、感染された細胞の内部の特定の通路を通し て進行し、そしてＭＨＣクラス■分子上で分裂されたペプチドフラグメントとし て示される。この変性路は、感染された細胞の内部で合成されるタンパク質のた めに最っとも効果的に作用すると思われ、そして従って、宿主細胞に侵入し、そ して免疫原性ウィルスタンパク譬を発現するウィルスのみが、ウィルス特異的細 胞毒性Ｔ細胞を生成することができる。従って、殺害されたワクチンは、ウィル ス感染に対する細胞免疫性の良好でないインデューサーである。この観点から、 生存弱毒ワクチンはより満足のいくものである。

今日まで、生存弱毒ウィルスは、非必須遺伝子の欠失又は１又は複数の必須遺伝 子の部分的な損傷（この場合、損傷は、遺伝子はまだ機能的であるが、しかしそ んなに効果的には作用しないようなものである）により製造されて来た。しかし ながら、生存弱毒ウィルスはしばしば、宿主に対して有害な効果を有することが できる残留病原性を保持する。さらに、その弱毒化が、特異的欠失により引き起 こされないならば、よりビルレントの形への復帰の可能性が保持される。それに もかかわらず、あるウィルスタンパク質生成は、宿主において存在する事実は、 それらがしばしば、そのようなウィルスタンパク質を生成しない殺害されたワク チンよりも、しばしばより効果的であることを意味する。

生存弱毒ウィルス、並びにそれら自体の能力でワクチンとして使用されることは また、他の遺伝子の°“ワクチンベクター′”、換言すれば保護が必要とされる 二次ウィルス（又は他の病原体）からの遺伝子のキャリヤーとしても使用され得 る。典型的には、ボンクスウィルス科のメンバー、たとえばワクシニアウィルス がワクチンヘクターとして使用される。ウィルスがワクチノ′ヘクターとして使 用される場合、それは病原性効果を引き起こさないことが重要である。

換言すれば、それは、単純なウィルス　ワクチンか弱毒化されるのと同し手段で 弱毒化される必要がある。従って、上記と同じ欠点が、この場合に存在する。

ウィルスゲノムからの遺伝子を欠失せしめ、そしてその欠失された遺伝子の生成 物をウィルスに供給する、いわゆる“相補的“細胞を供給することが可能である ことが見出された。これは、一定のウィルス、たとえばアデノウィルス、ヘルペ スウィルスおよびレトロうイルスのために達成されて来た。アデノウィルスのた めには、ヒト細胞系がアデノウィルスタイプ５　ＯＮＡのフラグメントにより形 質転換された（Ｇｒａｈａｍ、　Ｓｍ１ｌｅｙ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ　＆　Ｎａ１ ｒｎ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒａｌ、。

３６、５９〜７２．１９７７）　、その細胞系は一定のウィルス遺伝子を発現し 、そしてそれが欠失され又は不活性化されたそれらの遺伝子を有するウィルス変 異体の増殖を支持することが見出された（Ｈａｒｒｉｓｏｎ。

Ｇｒａｈａｓ　＆　４０目ａｓｓ、　Ｖｒｒｏｌｏｇｙ　７７、３１９〜３２９ ．１９７７）。ウィルスはこの細胞系（前記“相補的細胞系”）上で良く増殖し 、そして標準のウィルス粒子を生成したが、それは正常なヒト細胞上ではまった く増殖しなかった。　ＳＶ４０ウィルスゲノム（バポーバウィルス）のＴ−抗原 コード領域を発現する細胞はまた、この領域において特異的に欠失されたウィル スの複製を支持することができることが示された（Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１１ ．２３．１８２〜１９５．１９８１）、ヘルペス単純ウィルスツタめには、ｇＢ Ｉタフバク賞（Ｃａｉなど、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２．７１４〜７２Ｌ１９ ８７）　、　ｇＤ＊タンパク質（Ｌｉｇａｓ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌ、　６２＋　１４８６＋１９８８）及び即時初期タンパク質１ｃＰ ４　（Ｄｅｌｕｃａなど、、Ｊ、シ１ｒｏ１．，５６＋５５８、１９８５）を発 現する細胞系が、生成され、そしてそれらは、その対応する遺伝子の特異的に不 活性化されたコピーを有するウィルスの複製を支持できることが示された。

本発明は、ワクチンとしての使用のための変異ウィルスを供給し、ここで感染ウ ィルスの生成のために不可欠であるタンパク質をコードするウィルス遺伝子は欠 失され、又は不活性化されており；そして前記ウィルスは、前記欠失され又は不 活性化されたウィルス遺伝子によりコードされる必須タンパク質を前記細胞が発 現するのを可能にする非相同ヌクレオチド配列を有する細胞において増殖され得 る。

本発明はまた、上記のようなウィルス、及び１又は複数の賦形剤及び／又はアジ ュバントを含んで成るワクチンを供給する。そのウィルスゲノムは、それ自体、 免疫原を供給することができ、又はそれは免疫原性タンパク質を発現する非相同 遺伝子挿入体を含むことができる。

本発明はまた、ワクチンの調製に使用するために、上記のような弱毒化されたウ ィルスによりトランスフェクトされた相補的細胞を供給する。

本発明はまた、疾病の治療又は予防処置のためのワクチンの調製に上記のような ウィルスの使用を含んで成る方法を提供する。

本発明はまた、感染ウィルスの生成のために必須であるタンパク質をコードする 欠失され、又は不活性化されたウィルス遺伝子を有するウィルスにより感染され た細胞を培養し、そしてここで前記宿主細胞は前記ウィルス遺伝子を含んで成る 非相同ヌクレオチド配列を有し、そして前記遺伝子によりコードされる必須タン パク質を発現することができる；このようにして生成されたウィルスを収穫し； そしてそれをワクチンに使用することを含んで成るワクチンの製造のための方法 を提供する。

ウィルスはヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）に由来し、ここでたとえば塘タンパ クｆＨ（ｇ）Ｉ）をコードする遺伝子は不活性化され又は欠失されている。変異 ウィルスはまた、病原体に由来する免疫原をコードする非相同配列を含んで成る 。宿主細胞は適切には、ＨＳＶ　［タンパク質Ｈをコードする遺伝子を含む組換 え真核細胞系であろう。

もう１つの例として、ウィルスはオルトポックスウィルス、たとえばワクシニア ウィルスに由来し、ここで前記ウィルスは病原体に由来する免疫原をコードする 非相同配列を含んで成る。

本発明は、殺害されたワクチンの効能及び安全性と弱毒化されたワクチンによる ウィルスタンパク質のインビボ生成により誘発された特別の免疫学的応答とを組 合す独得の手段を示す。好ましい態様においては、それは２種の特徴を含む、第 １に、選択された遺伝子は、通常特定の欠失を創造することによってウィルスゲ ノム内で不活性化される。この遺伝子は感染性ウィルスの生成において包含され るが、しかし好ましくはウィルスゲノムの複製を妨害しない、従って、感染され た細胞は複製された遺伝子材料からよりウィルス性のタンパク質を生成すること ができ、そして多くの場合、新規ウィルス粒子が生成されるが、しかしこれらは 感染性ではない、これは、ウィルス感染が接種の部位から広がらないことを意味 する。

本発明の第２の特徴は、欠失された遺伝子の生成によりウィルスを供給する細胞 であり、従って組織培養におけるウィルスの増殖を可能にする。従って、ウィル スは、それが適切な宿主細胞において増殖される場合、必須タンパク質をコード する遺伝子を欠くけれども、それは増幅し、そして元のウィルスとは区別できな い外観である完全なウィルス粒子を生成するであろう。この変異ウィルス調製物 は、不完全なゲノムを有し、そして正常な宿主においては感染性ウィルスを生成 しないようなＩＩＪＩで不活性的であり、そしてその結果、宿主において体液性 応答を直接的に生成するために必要とされる量で安全に投与され得る。従って、 変異ウィルス又は、保護されるべき宿主の細胞のために感染性である必要はなく 、そして従来の殺害された又は弱毒化されたウィルス　ワクチンと同じ手段で単 に操用する。しかしながら、好ましくは、免疫化ウィルスは、それが細胞に結合 し、それに侵入し、そしてウィルス複製サイクルを開始せしめるような態様でそ れ自体まだ感染性であり、そして従って、保護されるべき種の宿主細胞内で感染 を開始せしめることができ、そしてその中であるウィルス抗原を生成することが できる。従って、宿主免疫システムの細胞武装を刺激する追加の機会が存在する 。

欠失された又は不活性化された遺伝子は、免疫原性応答を生成するためにインビ ボで、できるだけ多くのウィルスタンパク質を供給するために、好ましくはウィ ルスサイクルにおいて、できるだけ遅く関与する遺伝子である。たとえば、その 遺伝子は、たとえばＨＳＶのｇＨ塘タンパク質のパッケージング又はある他の後 −複製出来事に関与する遺伝子であり得る。しかしながら、選択された遺伝子は 、ウィルスゲノム複製に関与する遺伝子であり、そしてインビボで発現されるタ ンパク質の範囲は、その遺伝子が通常発現される段階に依存するであろう、ヒト サイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）の場合、選択された遺伝子は、ウィルスゲノ ム復製〔及び実際、そのために必須である）の前に生成される即時初期遺伝はひ しように免疫原性であるので、インビボでのウィルスゲノム複製を効果的に妨げ る遺伝子（即時初期遺伝子以外の）であり得る。

本発明は、１又は複数の必須遺伝子が同定され、そしてウィルスゲノムから欠失 され又はそのゲノム内で不活性化され得るいづれかのウィルスに適用され得る。

ＤＮＡウィルス、たとえばアデノ、ヘルペス、パボハ、パビロマ及びパルポウィ ルスのためには、これは、（１）特定のＤＮＡ変化を創造するために選択された 必須遺伝子のクローンされたＤＮＡコピーのヒイビトロ操作；及び（ｉｉ　）　 Ｍ換え及びマーカーレスキューの標準方法を通してウィルスゲノム中への変更さ れたｍ様の再導入により直接的に達成され得る。しかしながら、本発明はまた、 ＲＮＡウィルスにも適用できる。ＲＮＡウィルスゲノムの相補的ＤＮＡコピーの 、標準遺伝子技法によるインビトロでの操作、そして次にインビトロ転写による ＲＮ＾に転換を可能にする技法が現在利用できる。次に、その得られるＲＮＡは ウィルスゲノム中に再導入され得る。その技法は、陽性及び陰性標準ＲＮＡウィ ルス、たとえばポリオウィルス（Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ　ａｎｄ　Ｂａ１ｔｉ＋ ＊ｏｒｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４＋　９１６〜９１９．１９８１）及びイ ンフルエンザウィルス（Ｌｕｔｙｅｓなど、＋Ｃｅ１ｌ＋　５９＋１１０７〜１ １１３．１９８９）のゲノムに特定の変化を創造するために使用されて来た。

理論的には、必須タンパク質をコードするいづれかの遺伝子か弱毒化されたウィ ルスの創造へのこのアプローチのための可能性ある標的であるはずである。しか しながら、実際、その遺伝子の選択は、多くの考慮により推進されるであろう。

１、遺伝子は好ましくは、感染において後期で必要とされる遺伝子であるべきで ある。従って、弱毒化されたウィルスの複製は初期相においては妨害されない。

これは、はとんどの及び可能性あるすべての他のウィルス抗原が感染された細胞 に生成され、そして宿主細胞ＭＨＣクラス１分子と共に宿主免疫システムに表わ されるであろうことを意味する。そのような表示は、細胞毒性Ｔ細胞の生成を通 してウィルス感染に対しての細胞免疫性の進行を導びく。細胞毒性Ｔ細胞は、そ れらの抗原を認識することができ、そして従って、ウィルス感染された細胞を殺 害することができる。欠失された遺伝子は、ウィルスアセンブリーのためにはま ったく必要とされないが、しかし新規細胞を感染せしめることができる前記アセ ンブリーされたウィルスのためには必要である遺伝子を表わすことが可能である 。

そのようなタンパク質の例はＨ３Ｖ　ｇＨタンパク質である。このタンパク質の 不在下で、Ｈ５Ｖピリオンはまだ生成されるが、しかしそれらは非感染性である 。

２、理想的には、選択された遺伝子の生成物は、真核細胞に対して単独では毒性 であるべきでなく、その結果、相補的細胞が比較的容易に生成され得。しかしな がら、それは絶対的な必要条件ではない。なぜならば、前記遺伝子は、その発現 が必要とされる場合のみスイッチーオンされるように、相補的細胞における誘発 性プロモーターの制御下に配室され得るからである。

標的遺伝子に創造される変異の性質はまた、選択の出来事でもある。非機能的な 遺伝子生成物を生成するいづれかの変化は、野生型の構造体への転換の危険性が 最少化される限り、満足のい（ものである。そのような変化は、外部配列による 標的の妨害及び特異的欠失の創造を包含する。しかしながら、治療剤及び／又は 予防剤として使用されるべきワクチンのための最つとも満足のいく手段は、相補 的細胞中に導入されるべき全体の配列を包含する欠失が行なわれる場合の手段で あろう、そのアプローチは、相補的細胞におけるウィルスと細胞ＤＮＡとの間の 組換えを通して野生型ウィルスを生成する危険性を最少にする。

特異的に不活性化されたウィルス及び相補的細胞の組合せのいくつかの例が存在 するが（初期の論議を参照のこと）、今日まで、それらは、トランスジェニック 動物を生成するために安全なベクターを製造するために、前記ウィルスに対する 基本的な研究のために又はレトロウィルスの場合におけるように使用されて来た 。それらは、ワクチン生成のために使用されておらず、そして出願者の知識の限 り、この種の使用の提案はこれまで示差されていない。

野生型ウィルスに対する安全なワクチンを生成するためにそのような不活性化さ れたウィルス／相補的細胞の組合せの他に、本発明はまた、外来性病原体に対す るワクチンとしての使用のための安全なウィルスベクターを生成するために前記 間しシステムの使用を論じる。

そのようなベクターの例は、Ｈ５Ｖに基づくベクターである。Ｉｔｓνゲノムは 、相当の追加の遺伝子情報を収容するために十分に大きく、そして外来性遺伝子 材料を担持し、そして発現する組換えＨ３νウイルスのいくつかの例が記載され ている（たとえばＬｉｇａｓ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ。

Ｊ、ν１ｒｏ１．１９８８．　ｏｐ、　ｃｉｔ、）　。従って、上記のような必 須ウィルス遺伝子における欠失を有し、そしてまた、定義された外来性遺伝子を 担持し、そして発現するウィルスが、外来性タンパク質に対する免疫応答を生成 するためにワクチン化のための安全ベクターとして使用され得る。

Ｈ５Ｖの特定の特徴は、それが感染された個人のニューロンにおいて潜伏性にな り、そして時々、再活性化し、局部的な損傷を導びくことである。従って、必須 ウィルス遺伝子における欠失を有し、そして外来性遺伝子を発現するＨ５Ｖは、 処理された個人におけるニューロンの潜在的感染を故意に生成するために使用さ れ得る。そのような潜在的な感染の再活化は、ウィルスベクターは十分に複製で きないので損傷の生成を導びかないが、しかしウィルス複製サイクルの初期部分 の開始をもたらすであろう。この時間の間、外来性抗原の発現が生し、免疫応答 の生成も導びく。欠失されたＨ５Ｖ遺伝子がウィルスアセンブリーのためには必 要とされないが、巳かしアセンブリーされたピリオンの感染性のためにのみ必要 とされるタンパク質を特定する情況においては、そのような外来性抗原はそのア センブリーされたウィルス粒子中に組込まれ、その免疫原性効果の増強を導びか れる。ウィルス粒子における外来性遺伝子のこの発現及びそのタンパク質の組込 みはまた、変異ウィルスがその相補的宿主にまず生成される段階で生じ、この場 合、変異ウィルスは、ワクチンとして使用される場合、処理される種に対する外 来性タンパク質をすくに付与するであろう。

他の例においては、ワクシニアウィルス、たとえばポンクスウイルスが種々の病 原体からの遺伝子を担持し、そして発現し、そしてこれらは、動物実験システム に使用される場合、効果的なワクチンを形成することが示された。ヒトへの使用 のための可能性はばく大であるが、しかし天然痘に対するワクチンとしての広範 囲の使用に関連する既知の副作用のために、ヒトへの大規模での非変性ワクシニ アウィルスの使用には不適切である。非必須遺伝子、たとえばワタシニア増殖因 子遺伝子を欠失することによってワクシニアウィルスを弱毒化する試みが行なわ れて来た（Ｈｕｌｌｅｒ、　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ。

Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｔｗａｒｄｚｉｋ　＆　Ｍｏ５ｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 　６２＋　８６６〜８７４＋　１９８８）。しかしながら、そのような弱毒化さ れたウィルスは、減じられたレベルでではあるが、インビボでまた複製すること ができる。必須遺伝子における欠失を有するワクシニアウィルスは、まだ生成さ れてないが、しかし増殖のためのその相補的細胞を伴って、上記のような必須遺 伝子の欠失されたそのようなウィルスはこのワクチンベクターの安全な変種を提 供する。

非相同タンパク質に対しての免疫化のためのこの一般的な手段の追加の利点は、 従来の生存ウィルスベクターによれば、はとんど不可能であるが、同しウィルス ベクターによる多様な効果的なワクチン投与を行なうことが可能であることであ る。標準の生存ウィルスワクチンは、感染の多くのサイクルを通して宿主動物に おいて複製するその能力にその効能のためには依存するので、その有用性は、そ のウィルスに対する免疫性を有する個人においてきびしく削減されるであろう。

従って、同じウィルスによる第２挑戦は、同しタンパク質に対しての追加免疫化 を提供しても、又は異なったタンパク質に対しての新規応答を提供しても、たぶ ん効果的ではない。しかしながら、必須遺伝子の欠失を有するウィルスヘクター を用いれば、多様な復製サイクルが所望されず又は必要とされない場合、効果的 な免疫化を導びく出来事は、免疫化のすぐ後で生しるであろう。変異ウィルスの 用量は比較的多量であり（なぜならば、それは完全に安全であるはずであるから である）、そして従って、それらの初期出来事は、宿主免疫応答により阻止され そうもなく、そしてそれは時々、完全に変動性化される必要があろう。

必須遺伝子を欠いている及び場合によっては、免疫原性病原タンパク質のための 遺伝子を含む変異ウィルスについてこれまで言及されて来たが、その変異体は、 １つ以上の必須遺伝子を欠き、そして／又は１つ以上の免疫原性病原タンパク質 遺伝子を含むことができる。従って、変異ウィルスは、上記ｍ様でワクチンとし て作用する旧Ｖ　ｇｐ　１２０のための遺伝子、及びまた、ワクチン投与された 宿主内で発現され、そして宿主においてＴ−細胞応答を刺激するためにＭＩＩＣ −１と共に、宿主細胞の表面で表わされる旧Ｖ　ｇａｇタンパク質のための遺伝 子を含むことができる。

本発明をより明日に理解するために、さらに例が例示されるが、それらは本発明 を限定するものではない。

図１は、プラスミドｐＧＨ１の生成を例示する。

図２は、プラスミドｐＧＨ２の生成を例示する。

図３ａは、プラスミドｐＳＰ６４Ｔａを生成するために使用される相補的オリゴ ヌクレオチドの対を示す。

図３ａは、プラスミドｐＳＰ６４７Ａの生成を示す。

図４ａは、プラスミドｐｃＭＶＩＥＰを生成するために使用される２つのオリゴ ヌクレオチドを示す。

図４ｂは、プラスミドｐｃＭＶＩＥＰを例示する。

図５は、プラスミドｐＣＭＶ　１ａｃＺを例示する。

図６は、プラスミドｐＧＨ３を例示する。

図７は、プラスミドｐＧＨ−１２０の構成のための手段を例示する。

ンパク　Ｈれたヘルペス　′ウィルス　Ｈ−１１ｓシヘルペス単純ウイルス（Ｈ ５Ｖ）は、ヒトにおいて広範囲の病原性症状、たとえば再発性頭面及び生殖器損 傷及びまれであるが、致命的な脳炎を引き起こす大きなりＮＡ　ウィルスである 。このウィルスによる感染は、薬物アシクロバー（＾ｃｙｃｌｏｖｉｒ）を用い ての化学療法によりある程度まで制御され得るが、しかし今までのところは、− 次感染を妨ぐために利用できるワクチンは存在しない、　Ｈ５Ｖに対する予防接 種の困難性は、そのウィルスは一般的に細胞から細胞への直接的な移行により身 体内で広がることである。従って、体液性免疫は、循環抗体が細胞外ウィルスの みを中和できるので、効果的でありそうもない、ウィルス感染の制御のための一 層の重要性は、細胞免疫であり、そしてその結果、体液性免疫及び細胞免疫の両 者を生成でき、しかもまた完全であるワクチンが相当な利点を有する。

Ｈ５Ｖゲノム内での不活性化のための適切な標的遺伝子は、塘タンパク質Ｈ遺伝 子（ｇＨ）である。そのｇＨタンパク質は、ウィルスエンベロープの表面上に存 在する塘タンパク質である。このタンパク質は、感染された細胞中へのウィルス の侵入の間の膜融合の工程に関与されると思われる。これは、この遺伝子の欠失 を有する感温性ウィルス変異体が、許容できないｔ２度で、ウィルス感染された 細胞がら抽出されない理由からである（Ｄｅｓａｉなと、、Ｊ、　Ｇｅｎ、シ＋ ｒｏ１．６９＋１１４７〜１１５６．１９８８）。そのタンパク質は感染の後期 で発現され、そしてその結果、その不在下で、相当量のウィルスタンパク譬合成 がなお存在し得る。

すべての遺伝子操作工程は、’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”　、　 Ａ　ＬａｂｏｒａｔｕｒｙＭａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　 ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｂｏｒＬａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９に記載される標準方法に従って行なわれる 。

Ａ、　Ｈ５ｖ　Ｈ゛　−る　７、の ｇＨ遺伝子は、ヌクレオチド４６３８２と４３８６８との間のＨ５Ｖタイプ１ゲ ノムのユニークな長さの領域（Ｕｔ　）に存在する（ＭｃＧｅｏｃｈなど。

Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９．１５３１〜１５７４．１９８８）　、こ の遺伝子のクローンされたコピーは、プラスミドｐＡＦ２内で利用できる。この プラスミドは、プラスミドｐＴＺｇＨから完全なｇＨコード配列を包含するＢｇ ｌＩ［−Ｘｈｏ　Ｉを切り出し、そしてそれをプラスミドｐｓＰ６４ＴのＢｇｌ 　１１部位中に記載のようにしてクローニングすることによって生成された（Ｇ ｏｓｐｅｌｓ　ａｎｄ　Ｍｉｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、６３．４７４４ 〜４７５５．１９８９）　、次に、塘タンパクＷＤ（ｇＤ）遺伝子のためのプロ モーター配列を含むＨｉｎｄ■フラグメント（ｇＤ遺伝子の開始に関して、ヌク レオチド−３９５から−１１に延びる）が、プラスミドｐｓＶＤ４（Ｅｖｅｒｅ ｔｔ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、。

１１、６６４７〜６６６７、１９８３）から切断され、そしてｐＡＦ２のユニー ク旧ｎｄ■部位中にクローン化され、プロモーター配列がｇＨ遺伝子の発現を駆 動する正しい配向に存在するようなｐＧＩ（１（図１）が生成される。

従って、このプラスミドは、Ｈ５ＶタイプＩｇＤ遺伝子プロモーターの制御下で 完全なｇＨコード配列を含む。次に、このプラスミドは精製され、そして次に、 標準リン酸カルシウム同時沈殿技法（Ｇｒａｈａｍａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅ ｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２．４５６〜４６７、１９７３）を用いて、プラスミ ドｐＮＥＯ（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉ ｎｃ、）によりＶｅｒｏ細胞中に同時トランスフェクトされた。次に、耐ネオマ イシン性を得たＶｅｒｏ細胞が薬物６４１８へのその細胞の通過により選択され 、そしてそれらの細胞のコロニーが制御希釈法によりクローン化される。次に、 それらの耐ネオマイシン性細胞が組織培養中で増幅され、そして次に、サンプル がＨ５Ｖタイプ２ウィルスにより感染される。Ｈ３ｖタイプ２ウィルスによる感 染は、相補的細胞ゲノムに存在するタイプ１ｇＤプロモーターからの転写の誘発 及びその結果、相補的細胞におけるタイプＩｇ）ｌタンパク質の生成を刺激する 効果を存する。次に、感染された細胞の溶解物が、タイプＩｇＨタンパク譬を特 異的に認識することが知られているポリクローナル抗血清を用いて、ウェスター ンプロットによりｐＨタンパク質の発現についてスクリーンされる（Ｄｅｓａｉ 　など、、１９８８　ｏｐ　ｃｉｔ、）　、次に、必要トサレルタンハク質ヲ発 現する細胞が保持され、そして凍結貯蔵物が調製される。この材料は、ｇＨ”相 補的細胞系を表わす。

Ｂ　れたＨ′　−によるＨ５ｖ　イブ１ウイルスのＨ５Ｖフランキング配列と共 にｇＨのコード配列を含む６４３２塩基対のＢｇｌ　Ｕフラグメントを、プラス ミドｐＵＧ１０２　（Ｇｏｓｐｅｌｓ　ａｎｄ　Ｍｉｎｓｏｎ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５３．２３０〜２４７．１９８６）から切り出し、そしてプ ラスミドｐＡＴ１５３　（Ｔｗｉｇｇ　ａｎｄ　５ｈｅｒｒａｔ、　Ｎａｔｕｒ ｅ＋　２８３＋　２１６＋　１９８６）中にクローンし、ｐＧＨ２（図２）を生 成する。このプラスミドを、２つの位置（ＭｃＧｅｏｃｈなど、　１９８８．　 ｏｐ　ｃｉｔ、の番号付はスケムに従ってヌクレオチド４４９５５〜４６０６５ ）でのｇＨコード配列内のみを切断するＰｖｕ　ＩＩにより消化し、２つのフラ グメントの大きい方を精製する０次に、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）からの 即時初期遺伝子プロモーターの下流のＥ、コリからの完全なβ−ガラクトシダー ゼ遺伝子から成るＤＮＡのフラグメントを、次の方法により調製する。すべての 対の相補的オリゴヌクレオチド（図３ａに示される）の初めをアニールし、そし てｆｌａｌ　ＩＩ−消化されたホスファターゼ処理されたｐＳＰ６４Ｔ　（Ｋｒ ｉｅｇａｎｄ　Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．７ ０５７〜７０７１．１９８４）により連結し、図３ｂに示されるようなプラスミ ドｐＳＰ６４Ｔａを生成する。付加されたリンカ−はまた、開始コドン及びＥ、 コリのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ＩａｃＺ）の３つのコドンを含む。次に、 ＣＭＶの即時初期遺伝子プロモーターの“コア領域”を、それぞれ−３０２〜− ２８８及び−１３〜−３６の配列（Ａｋｒｉｇｇなど、、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ、　２．１０７＝１２１゜１９８５により記載されるようなＣＭＶ即時 初期遺伝子の開始から番号付けされた）に対応する、図４ａに示される２つのオ リゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ鎖反応技法（ＰＣＲ−Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、、ｏｐ　ｃｉｔ、）によりプラスミドｐＵＧ−）１１　 （Ｇｏｓｐｅｌｓ　ａｎｄＭｉｎｓｏｎ＋　１９８９．　ｏｐ　ｃｉｔ、　）か ら増幅する。これらのオリゴヌクレオチドはまた、それらの５′端で、制限酵素 旧ｎｄ［［［の、ための部位及びプロモーターの上流のオリゴヌクレオチドアニ ーリングの場合、追加のＳｍａ　１部位を含む。次に、ＰＣＲ−増幅された生成 物ＤＮＡをＨｉｎｄＩ［１により消化し、そして旧ｎｄ［Ｉ［−消化された１） ＳＰ６４Ｔａ中にクローン化し、プラスミドｐＣＭＶＴＥＰ（図４ｂ）を生成す る。最後に、コード配列の最５′端のみを欠＜Ｅ、コリβ−ガラクトシダーゼ遺 伝子の完全なコピーを含むＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨ［によるプラスミド ｐｓｃ８　（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ　など、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、、５．３４０３〜３４０９．１９８５）の消化により単離し、そしてｐＣＭ ＶＩＥＰのユニークＢｇｌ　１１部位中にクローン化し、ｐｃＭＶｌａｃＺ　（ 図５）を生成する。次に、側Ｖ　ＩＥプロモーターの制御下でのβ−ガラクトシ ダーゼ遺伝子を含むＤＮＡのフラグメントを、Ｓｓａ　ＩによるρＣＭＶＩａｃ Ｚの消化により単離し、そして上記ｐＧＨ２の精製されたＰｖｕ　ＩＩフラグメ ントにより連結し、官能的β−ガラクトシダーゼ遺伝子（図６）により中断され るｇｌｌ遺伝子のコピーから成るｐＧＨ３を生成する９次の段階は、Ｈ３Ｖゲノ ムにおける野生型ｇＨ遺伝子をこの中断された型と置換することであり、そして これはＨ５Ｖ　ＤＮＡとプラスミドｐＧ）１３との間の組換え、続いて、官能的 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を得たそれらのウィルスの選択により行なわれる。

従って、プラスミドｐＧＨ３ＤＮＡを、標準のリン酸カルシウム沈殿技法（Ｇｒ ａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ＋　１９７３＋　ｏｐ　ｃｉｔ、）に より、精製されたＨ５Ｖピリオン（Ｋｉｌｌｉｎｇｔｏｎ　ａｎｄ　Ｐｏｗｅ１ １＋　”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉ ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｂ、　Ｗ、　Ｊ、　Ｍａｈｙ版）　２０７〜２３ ６ページ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ　（１９８５）　）から単離され た精製Ｈ５Ｖ　ＤＮＡと共にｇＨ遺伝子（セクションＡに記載されるｇｌ（”相 補的細胞系）を発現する細胞中に同時トランスフェクトする。次に、このトラン スフエフシラン実験から生成された子孫■Ｓｖウィルスを、酵素β−ガラクトシ ダーゼにより青色物質に転換される色原体基質である５−プロモークロロ−３− インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）の存在下で、寒天層を用いて 、標準プラークアッセイによりｇＨ”相補的細胞の単層上にプレートする。β− ガラクトシダーゼ遺伝子を含み、そして発現するウィルスゲノムによる感染に起 因するプラークは、青色に見えるであろう。従って、これらのウィルスゲノムは 、ｇ）ｌ遺伝子の中断された型を担持すべきである。ウィルスを、プレートの適 切な部分からの寒天の突き刺しによりそのらのプラークから回収し、そしてウィ ルス貯蔵物をｇＨ”相補的細胞系におけるウィルスの増殖を通して調製する。そ れらのウィルスは、ｇＨ遺伝子の非官能型を担持するので、ｇＨ遺伝子の内因性 官能コピーを含まず、そして発現しない細胞上にプラークを形成できるべきでな く、そしてこれを確かめるために、ウィルスのサンプルを、ｇＨ相補的細胞と比 較して、野生型Ｖｅｒｏ細胞単層上にプラークを形成するその能力についてアッ セイする。最後に、ウィルスＤＮＡをそれらの貯蔵物から調製し、そしてサザン ブロノトによりｇ）ｌ遺伝子のまわりの予測されるＤＮＡ構造について調へる。

正しい遺伝子構造の確認の後、ｇＨ遺伝子を欠くウィルスの多量の貯蔵物を、ｇ Ｈ’相補的細胞系（感染の多重度−〇、０１）の大規模培養物中へのウィルスの サンプルの接種により調製し、そして３日後、感染された細胞を収穫する。感染 された細胞を、細胞関連ウィルスを放すために高波処理により破壊し、そして高 波処理された全混合物を、ウィルスマスター貯蔵物として一７０°Ｃで貯蔵する 。次に、ウィルス貯Ｒ物の力価を、ｇＨ”相補的細胞系に対するプラークアッセ イにより確立する。次に、このウィルス貯蔵物のサンプルを用いて、作業用貯蔵 物を調製し、そしてそれらの作業用貯蔵物を用いて、下記のようにして実験用動 物を感染せしめる。

ｍれたウィルスに　してのＨ−Ｈ５Ｖの　六　に・ゑ班λ このウィルスに対する宿主の免疫学的応答を評価するために、下記に記載される 実験計画に従って、挑戦的実験をマウスに行なった。

生存ｇトウィルス調製物の保護効果を、次のようにして野生型（ＷＴ）ウィルス （株５５１６　）の不活性化された調製物と比較した。

予防接種のだめの不活性化された野生型ウィルスの調製：Ｈ５ｖタイプ１（株５ Ｃ１６）を、Ｖｅｒｏ細胞の低多重度感染（０，０１ｐｆｕ／細胞）により増殖 した。３日後、ウィルスを収穫し、そして細胞質ウィルスをＤｏｕｎｃｅ均質化 により回収した。核を５００ｘｇで１５分間の遠心分離により回収し、そしてウ ィルスを、Ｂｅｃｋｍａｎ　５ｗ２７０−ターを用いて１２にで６０分間の４０ ％スクロースクノシゴンに対する遠心分離により上清液から回収した。ノλンド を形成したウィルスを希釈し、ペレット化し、そしてスクロースグラジェント遠 心分離（にｉｌｌｉｎｇｔｏｎａｎｄ　Ｐｏｗｅｌｌ、　１９８５．　ｏｐ、　 ｃｉｔ、）により精製した。ウイルスノ＼ンドをグラジェントから回収し、そし てウィルスを遠心分離により回収した。ウィルスをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に 再懸濁し、子供ノ＼ムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞に対するプラーク力価により 感染性についてアッセイし、そして粒子計数を電子顕微鏡により測定した。調製 物の粒子：感染性の比は１００粒子／ｐｆｕであった。ウィルスを２．５Ｘ１０ ”ｐｆｕ／ＩｄＰＢＳに希釈し、そして２０°Ｃで６０分間のβ−プロピオラク トンによる処理により不活性化した。次に、アリコートを一７０°Ｃで貯蔵した 。

予防接種のための生存ｇＨ−ウィルスの調製：この材料を野生型ウィルスについ て記載されるようにして調製した。但し、ウィルスは、ＨＳＶタイプＩｇＨ遺伝 子を含み、そして発現するｇＨ”相補的細胞系において増殖し、そしてそれをβ −プロピオラクトンによる処理により不活性化しなかった。この調製物の粒子： 感染性の比は１５０：１であった。この調製物の濃度を２．５　ＸＩＯ”ｐｆｕ ／ｄに調整し、そしてアリコートを一７０°ＣでＰＢＳに貯蔵した。

予防接種手段： 生後４週目の雌のｂａｌｂ／ｃマウス（Ｔｕｃｋｓ　Ｕ、　Ｋ、　Ｌｔｄから購 入された）を、リン酸緩衝溶液２μ！体積中、不活性化された一Ｔウィルス又は 生存ｇＨ−ウィルスの種々の用量により、滴下適用及び右耳の針による突き刺し により次の通りに予防接種したニゲループＡ　対照−ウィルスを含まないグルー プＢ　５　ｘｌＱ４　ｐｆｕウィルス　ワクチングループＣ５ＸＩＯ’　ｐｆｕ ウィルス　ワクチングループＤ　５　ＸＩＯ”　ｐｆｕウィルス　ワクチングル ープＥ　５　ｘｌｏ’　ｐｆｕウィルス　ワクチン１４日後、すべてのマウスを 、２　ＸＬＯ’　ｐｆｕ　ＨＳシー１株５Ｃ１６（野生型ウィルス）による左耳 の類似する接種により挑戦せしめた。５日後、マウスを殺し、そして左耳及び左 の頚部神経節ｃｎ、ｃｌｎ及びｃＩＶ（組合されている）におけるウィルス感染 性についてアッセイした。

潜在性研究のために、他の予防接種され、そして挑戦された動物を１力月後に殺 し、そしてｃＵ、ｃｍ及びｃｌＶ神経節を切開することによって潜在性感染につ いて試験した。これらを培地において５日間インキュベートし、次に均質化し、 そして標準のプラークアッセイにより感染性ウィルスの存在についてアッセイし た。すべての次の結果はｐｆｕ／器官として表わされる。

１−Ｈ−ウィルスによる　の′　、の５．　の日にる　ウィルスの ウィルス力価−１ｏＬｏ９ｆｕ　（’ＡＴ　５Ｃ１６）マウス番号　耳　平均　 頚部神経節率　平均承プールされた頚部神経ａｆｆｃｆｌ、ｃｌｌｌ及びｃｌＶ ２−　′　れたーＴ　Ｈ５Ｖ−１による　の′　、−Δλ１祖の日に　る　°ウ 　ルスの ウィルス力価−１ｏｇ＋ｏｌ）ｆｕ　（ＷＴ　５Ｃ１６）マウス番号　耳　平均 　頚部神経節率　平均ホブールされた頚部神経節　ａｌｌ、ｃｌ［［及びＣ■ｌ ↓ユニ輩註ユ竪Ｖ−ｔによる　の′・−−１ζに匹二着ウィルスとして　る　ウ ィルスの ＊プールされた頚部神経節　ｃＩＩ、ｃｍ及びｃｒＶ４−Ｘ゛　れた讐Ｔ　ＨＳ シー１による　の′　１・　に＊プールされた頚部神経節　ｃＵ、ｃｍ及びｃｒ Ｖ（ｐ、　ｆ、　ｕ　＝プラーク形成単位：ｇＨ−は欠損ｇＨ遺伝子を有するウ ィルスである）。

これらの結果は、感染の急性相の間、耳及び頚部神経節に存在する挑戦ウィルス −Ｔ　５Ｃ１６の力価を示す、従って、低い力価は、ｇＨ−ウィルスによる予防 接種の良好な有効性を示し、ところが高い力価は良好でない有効性を示す、生存 ｇＨ−Ｈ５Ｖウィルスによる予防接種は等量の不活性化された一丁ウィルスより もより一層可動であることが前記結果から明白である。不活性化された調製物に 関しては、５×１０７ρｆｕの用量が、耳における挑戦ウィルスの複製を妨げる ために必要とされ、ところが生存ｇＨ−ウィルスの用量はｌｏｏ　−１ｏｏｏ倍 、低い用量が必要とされる。　５　ＸＩＯ’　ｐｆｕ及びそれ以上での生存ｇＨ −ウィルスによる予防接種は、感染の急性相の間、頚部神経節における挑戦ウィ ルスの複製を阻止でき、そしてさらに、頚部神経節における潜在性感染の確立に 対して明白な保護効果を示した。

外米二皿１５月支ユ■　のためのベタ　−としての叱りえ五（＜ＨＳＶ　：　Ｈ −Ｈ５Ｖ　’ｙｘｔｂス（ＤゲノムへのＳＩＶ、　１４２の［Ｌ１猛予Ｌ１人 必須遺伝子を欠くウィルスは、上記のように、免疫システムに外来性抗原を運ぶ ための安全ヘクターとして使用され、そして上記ｇトＨ５νウィルスはそのよう なヘクターの適切な例を提供する。このウィルスは、いづれかの所望する外来性 抗原を発現するために使用され得るが、しかし特に好ましい可能性はＡＩＤＳウ ィルスヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍの主な抗原性タンパク質であろう、従って、 これらの配列は、組換えウィルスにより、正常細胞（すなわち非相補的細胞）の 感染の間、それらの発現を確保する手段でｇＨ−Ｈ５Ｖゲノム中に挿入されるで あろう。そのようなウィルスによる個人の感染は、再活性化に基づいて時間から 時間に、外来性抗原の多量の生成を導びき、そのタンパク質に対する免疫応答の 刺激をもたらす潜在性感染を導びくであろう。

ヒトへのこのアプローチを直接的に試験する研究は現在、可能ではないので、初 期段階として、そのアプローチはＳｉｍｊａｎ　ＡＩＤＳウィルスＳＴｖ□Ｃ（ 短連サルから単離された５１ｍ１ａｎ免疫不全ウイルス）を用いて、モンキーに おいて試験され得る。この目的のための適切なＳＩＶウィルスはｇｐ１２０タン パク質をコードする遺伝子、すなわちこのウィルスのための主要抗原標的の１つ である。従って、この遺伝子は、ｇＨ−Ｈ５シゲノム中に導入され、そしてＳＩ Ｖによる挑単に対してモンキーを保護するワクチンとしてのこのウィルスの効能 が評価される。

Ｓ［Ｖ　ｇｐ１２０遺伝子はまずサイトメガロウィルスＩＥコアプロモーターの 次にクローンされ、そして続いて、ｇｐ１２０遺伝子及び上流のＣＭＶプロモー ターから成るＤＮＡカ七ノドがプラスミドｐＧＨ２中にクローンされる（図２） ０次に、その得られるプラスミドが、ｇＨ−Ｈ５Ｖから精製されたＤＮＡと共に ｇＨ”相補的細胞系中に同時トランスフェクトされ、そしてｇｔｔ−Ｈ５Ｖウィ ルスに存在するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の代わりにｇｐ１２０遺伝子を得た 組換えウィルスが、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の中断のためにスクリーニング により単離される。

ＡＨ３ｖ゛ツム　へのＳ■ｖ１２０コード　１の　えのためのプラス土ヱ二盈双 この方法のための全体のスケムは図７に示される。５ａｃｌ制限酵素フラグメン ト（塩基５２４０−８７２１に対応する）を、ＳＩＶゲノムのクローンされた［ ｌＮ＾コピーから切り出しくＣｈａｋｒａｂａｒｔｉなど、、Ｎａｔｕｒｅ３２ ８、５４３　（１９８７）　）　、そして特定部位の突然変異誘発による操作の ために一本！１　Ｄ　Ｎ　Ａに転換され得るプラスミドｐｓＩＶ１を生成するた めに、プラスミドｐＵｃ１１８　（Ｖｉｅｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

１５３、３．１９８７）のＳａｃ　１部位中にクローンする。次に、そのＳＩＶ 　ｅｎｖ遺伝子（６０９０〜８２９８に対応する）を含むこのＤＮＡ５Ｉ域を特 定部位の突然変異誘発により変更しくＢｒ１ｅｒｌｅｙなど、、Ｃｅ１ｌ　５７ ．５３７．１９８９）　。

合成オリゴヌクレオチド： ５　’　ＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＴを用いて位置６０５ ３〜６０５８で酵素ＥｃｏＲＶのための制限酵素部位を導入する。

次に、第２のＥｃｏＲＶ部位を、合成オリゴヌクレオチド：５　’　ＣＡＡＧＡ ＡＡＴＡＡＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＣを用いて、ｅｎｖ遺伝子配列の ｇｐ１２０とｇＰ４０ドメインとの間の切断部位に対応するＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝 子内の位置７６７１〜７６７６で導入し、プラスミドｐｓＩＶ２を生成する。次 に、ＳＩＶ　ｅｎν遺伝子のｇｐ１２０部分に対応するＤＮＡ　７ラグメント（ １６１７個の塩基対）を、ＥｃｏＲＶ　ｌ、：よる５ＩＶ２の消化により調製す る。

Ｃ？ＩＶ即時初期遺伝子プロモーターのコア領域を、次の２種の合成オリゴヌク レオチドを用いてＰＣＲ技法によりプラスミドρυＧ−１（１（Ｇｏｓｐｅｌｓ 　ａｎｄ　Ｍｉｎｓｏｎ、１９８９＋　Ｏｐ　ｃｉｔ、）から得る：次に、この 反応の生成物を酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌ［により切断し、ＤＮＡフラグメ ントを得、それを次に、ＥｃｏＲＩ−及び）ｌｉｎｄＩ［［−消化されたプラス ミドｐＬｌｃ１１８中にクローン化し、ＣＭＶプロモーター配列のすぐ下流に位 １するユニークＳ＋ｓａ　１部位を有するプラスミドｐｃＭＶＩＥ２を生成する ０次に、上記のようにして調製されたＳＩＶ　ｓａｃ　ｇｐ１２０コード配列を 含むＥｃｏＲＶフラグメントを、この５Ｌｌａ　Ｉ部位中にクローン化し、そし てプロモーターからのコード配列の発現を可能にするために正しく配向されたＳ ＩＶコード領域を有するプラスミドｐｓＩＶ３を選択する２次に、このプラスミ ドをＥｃｏＲＶにより消化し、ＣＭＶプロモーターと共にＳＩＶ配列から成るプ ラント末端化されたＤＮＡフラグメントを生成し、次にこれをＰνｕＩ［−消化 されたｐＧＨ２（図２）中にクローン化し、ｐＧＨ−１２０を生成する。

Ｂ　えＨ−Ｈ３Ｖ　日　るＳ１ν　１２０のＤＮＡを、前記セクションに記載さ れるようにして構成されたｇＨ−ＨＳＶウィルスから精製し、そして精製された ｐＧＨ−１２０ＤＮＡと共にｇＨ”相補的細胞中に同時トランスフェクトする０ 次に、このトランスフエフシラン方法から単離された子孫ウィルスを、Ｘ−ｇａ ｌの存在下で寒天層を用いて前記のようにして標準プラークアッセイによりｇＨ ’相補的細胞系の単層上にプラークする。親ｇＨ−ウィルスは、残留ｇＨコード 配列内に位！する官能的β−ガラクトシダーゼ遺伝子を担持し、そしてＸ−ｇａ ｌの存在下で、青色プラークを形成するであろう。

しかしながら、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の代わりにＳＩＶ　ｇｐ１２０コー ド配列を得た組換えウィルスは白色プラークを形成するであろう、ウィルスをそ れらの白色プラークから寒天を突き刺すことにより回収し、そしてウィルス貯蔵 物をｇＨ”相補的細胞系におけるそのウィルスの増殖を通して調製する。ウィル スＤＮＡをそれらの貯蔵物から調製し、そしてＳＩＶコード配列に由来する適切 なプローブを用いて、サザンプロントによりＩＩ（遺伝子のまわりの正しいＤＮ Ａ構造体の存在について調べる。最後に、そのウィルスの貯蔵物を、動物におけ る予防接種のために前記のようにして調製する。

弱毒化されたウィルスを含んで成るワクチンを、当業界において知られている標 準技法に従って調製し、そして使用することができる。たとえば、ワクチンはま た、■又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントを含むことができる。ワクチン により供給される弱毒化されたウィルスの有効量は、当業界において良く知られ ている技法に従って決定され得る。

日ｇｕｒｅ　Ｉ Ｈｍｌｌｌ　）４ｎｄｌ１１ ０：二二二二＝＝＝コ Ｈ５Ｖ　ＧＩＯプロモーター Ｆｌｇｕｒｅ　２ ＶＯＮＡ Ｆｌｇｕｒｅ　３ ＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＣＴＡＧ　５’Ｆｉｇｕｒｅ　４ ｂ）　グ°ビ′遺伝子　グ０ビ′遺伝子５’ＵＴＲｒＬＪＴＲ Ｆｉｇｕｒｅ　Ｓ 日ｇｕｒｅ６ 補正寡の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　ダ年　３月２ｔ＋日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．変異ウィルスであって、そのゲノムが感染性ウィルスの生成のために必須で ある遺伝子を欠いており、そしてその対応する野生型ウィルスによる感染に対し て、それらにより免疫化された感受性種を保護できる変異ウィルス。
2. ２．それにより免疫化された感受性種の細胞のために感染性である請求の範囲第 １項記載の変異ウィルス。
3. ３．変異ウィルスであって、そのゲノムが感染性ウィルスの生成のために必須で ある遺伝子を欠いており、そしてそのゲノムが前記ウィルスに対して外因性であ る病原体からの免疫原性タンパク質を含む遺伝子物質を含む変異ウィルス。
4. ４．感染性種の細胞のために感染性であり、それによって前記外因性免疫原性タ ンパク質が前記変異ウィルスにより感染された前記種の細胞に発現される請求の 範囲第３項記載の変異ウィルス。
5. ５．前記免疫原性タンパク質が、通常、病原体に対して感受性である、感染され た種における前記病原体に対する免疫性を付与する請求の範囲第３又は第４項記 載の変異ウィルス。
6. ６．前記ウィルスが、定期的な再活性化により潜在的感染を、感染された種に確 立することができる請求の範囲第５項記載の変異ウィルス。
7. ７．前記外因性タンパク質が免疫不全ウィルスからである請求の範囲第３〜６の いづれか１項記載の変異ウィルス。
8. ８．前記外因性タンパク質が免疫不全ウィルス糖タンパク質である請求の範囲第 ７項記載の変異ウィルス。
9. ９．ヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）に由来する請求の範囲１〜８のいづれか１ 項記載の変異ウィルス。
10. １０．前記欠陥遺伝子がＨＳＶ糖タソバク質ｇＨ遺伝子である請求の範囲第９項 記載の変異ウィルス。
11. １１．ワクチンの調製への請求の範囲第１〜１０のいづれか１項記載の変異ウィ ルスの使用。
12. １２．請求の範囲１〜１０のいづれか１項記載の変異ウィルスを含んで成るワク チン。
13. １３．請求の範囲第１〜１０のいづれか１項記載の変異ウィルスを製造するため の方法であって、前記ゲノムを欠いているウィルスのゲノムを組換え宿主細胞に 発現せしめることを含んで成り、そして前記宿主細胞は前記変異ウィルスの生成 を可能にするために前記ウィルス遺伝子を補足する遺伝子をまた発現することを 特徴とする方法。