BE1004369A5 - Poxvirus recombinant et vaccin contre le virus de l'herpes contenant ce poxvirus. - Google Patents

Poxvirus recombinant et vaccin contre le virus de l'herpes contenant ce poxvirus. Download PDF

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Abstract

L'invention a pour objet un poxvirus recombinant, tel qu'un virus de la vaccine, un poxvirus des volailles, un poxvirus du canari, contenant de l'ADN étranger est exprimé chez un hôte par la production d'une glycoprotéine du virus de l'herpès. Dans un autre mode de réalisation, l'ADN étranger est exprimé chez un hôte par la production d'au moins deux (en particulier deux ou trois) glycoprotéines du virus de l'herpès. Un autre objet est un vaccin contenant le poxvirus recombinant pour induire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec le vaccin. La présente invention permet entre autre de surmonter ou éviter la barrière constituée par l'immunité maternelle chez un descendant nouveau-né.

Description


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  Poxvirus recombinant et vaccin contre le virus de l'herpès contenant ce poxvirus
La présente invention est relative à un poxvirus modifié et à des procédés pour produire et utiliser celuici. Plus particulièrement, l'invention est relative à un poxvirus recombinant, qui exprime des produits de gène d'un gène du virus de   l'herpès,   et à des vaccins qui impartissent une immunité protectrice contre des infections provoquées par le virus de l'herpès. 



   On se réfère à plusieurs publications dans la présente demande de brevet ; celles-ci sont désignées par des nombres en chiffres arabes entre parenthèses. La citation complète de ces publications antérieures se trouve à la fin de la présente description immédiatement avant les revendications. Ces publications antérieures décrivent l'état de l'art auquel l'invention appartient. 



   Le virus de la vaccine et plus récemment d'autre poxvirus ont été utilisés pour l'insertion et l'expression de gènes étrangers. La technique de base pour insérer des gènes étrangers dans des poxvirus infectieux vivants implique la recombinaison entre les séquences d'ADN du pox qui flanquent un élément génétique étranger dans un plasmide donneur et de séquences homologues présentes dans le poxvirus de sauvetage (28). 



   Spécifiquement, les poxvirus recombinants sont construits en deux étapes connues, dans la technique et qui sont analogues aux procédés pour créer des recombinants synthétiques du virus de la vaccine décrits dans le brevet US   n  4.   603.112, l'enseignement de ce brevet étant incorporé dans la présente par référence. 



   Tout d'abord, dans une première étape, la séquence   d'ADN   du gène à être insérée dans le virus, particulièrement un cadre de lecture ouvert provenant d'une source qui n'est pas un pox, est placée dans la structure ou construction de plasmide d'E. Coli dans lequel de l'ADN homologue à une section d'ADN du poxvirus a été inséré. Séparément, la séquence de l'ADN du gène à insérer est liée à un promoteur. 

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 Le groupe de liaison ou linkage promoteur-gène est positionné dans la structure du plasmide de sorte que le linkage promoteur-gène soit flanqué aux deux extrémitées par de   l'ADN   homologue à une séquence d'ADN qui flanque une région de   l'ADN   du pox contenant un locus non essentiel.

   La structure du plasmide résultant est ensuite amplifiée par croissance dans la bactérie E. Coli (11) puis isolée (12,20). 



   Ensuite, dans une seconde étape, le plasmide isolé, contenant la séquence d'ADN du gène à être inséré, est transfecté dans une culture de cellules, par exemple des fibroblastes d'embryons de poulet, en même temps que le poxvirus. La recombinaison entre   l'ADN   du pox homologue dans le plasmide et le génome viral respectivement donne un poxvirus modifié par la présence, dans une région non essentielle de son génome, de séquences d'ADN étranger. Le qualificatif"étranger"appliqué à   l'ADN   désigne un ADN exogène, en particulier de   l'ADN   à partir d'une source qui n'est pas un pox, qui code pour des produits de gène qui ne sont ordinairement pas produits par le génome dans lequel   l'ADN   exogène est placé. 



   La recombinaison génétique est en   général l'échange   de sections homologues d'ADN entre deux brins d'ADN. Dans certains virus,   l'ARN   peut remplacer l'ADN. Des sections homologues d'acide nucléique sont des sections d'acide nucléique (ADN, ARN) qui ont la même séquence de bases de nucléotide. 



   La recombinaison génétique peut avoir lieu naturellement pendant la réplication ou la fabrication de génomes viraux nouveaux à l'intérieur de la cellule hôte infectée. 



  Ainsi, la recombinaison génétique entre des gènes viraux peut se produire pendant le cycle de réplication virale qui se produit dans une cellule hôte qui est co-infectée par deux ou plusieurs virus différents ou autres structures génétiques. 



  Une section   d'ADN   d'un premier génome est utilisée d'une manière interchangeable dans la construction de la section du 

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 génome d'un second virus co-infectant dans lequel   l'ADN   es homologue à celui du premier génome viral. 



   Toutefois, la recombinaison peut également avoir lieu entre des sections d'ADN dans des génomes différents, qui ne sont pas parfaitement homologues. Si une telle section provient d'un premier génome homologue à une section d'une autre génome à part la présence dans la première section de, par exemple, un marqueur génétique ou d'un gène codant pour un déterminant antigénique inséré dans une portion de   l'ADN   homologue, la recombinaison peut encore avoir lieu et les produits de cette recombinaison sont alors détectables par la présence de ce marqueur génétique ou gène dans le génome viral recombinant. 



   L'expression réussie de la séquence génétique de   l'ADN   inséré par le virus infectieux modifié exige deux conditions. La première est que l'insertion doit être faite dans une région non essentielle du virus afin que le virus modifié reste viable. La seconde condition pour l'expression de   l'ADN   inséré est la présence d'un promoteur en relation correcte avec   l'ADN   inséré. Le promoteur doit être placé de sorte qu'il soit localisé en amont de la séquence d'ADN à exprimer. 



   Il existe deux sous-types de virus de l'herpès chevalin, qui, bien qu'ils contiennent des épitopes se neutralisant l'un l'autre, peuvent être distingués par leurs profils antigéniques, leurs empreintes digitales d'endonucléase de restriction et leur action pathogène à l'égard des chevaux (1). Le virus de l'herpès chevalin 1 (EHV-1) est associé à une maladie de la voie respiratoire, des désordres du système nerveux central et des avortements herpétiques classiques, alors que le virus de l'herpès chevalin 4 (EHV-
4) est associé d'une manière prédominante à une maladie de la voie respiratoire (1,48).

   Les virus de l'herpès chevalin font partie de la sous-famille des alphaherpèsvirus et manifestent un grand nombre des caractéristiques biologiques 

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 et biochimiques typiques des virus de l'herpès humain, tels que l'isomérisation génomique, la régulation de l'expression des gènes, l'établissement d'infections latentes, la production de particules de virus interférantes défectueuses, l'induction de désordres neurologiques et la transformation oncogénique in vitro (1,4, 23). Ainsi, le EHV peut être avantageusement utilisé pour étudier les conséquences biologiques variées des infections par le virus de l'herpès. 



   Les glycoprotéines du virus de l'herpès interviennent dans des fonctions virales essentielles, telles que l'attachement et la pénétration cellulaires, l'extension de cellule à cellule du virus et, d'une manière importante, déterminent le profil de pathogènicité de l'infection. Les glycoproteines du virus de l'herpès sont des composants critiques dans l'interaction avec le système immunitaire de l'hôte (36,37). 



   Les glycoprotéines bien caractérisées du virus de l'herpès simplex comprennent gB, gC, gD, gE, gG, gH et   gI   (36,37, 49-55). Un certain nombre d'études ont montré l'importance des glycoprotéines du virus de l'herpès simplex pour provoquer des réponses immunitaires. C'est pourquoi, il a été rapporté que gB et gD peuvent provoquer des réponses immunitaires importantes (6,8, 13,18, 21,22, 26,27, 30, 44,46, 47). gC peut stimuler des lymphocytes cytotoxiques à restriction de la classe 1 (15,32), alors que   gD peut   stimuler des réponses de cellules T cytotoxiques de la classe II (21,22, 44,46, 47). gG s'est révélé être une cible pour la neutralisation de virus sous la direction d'anticorps compléments dépendants (38,39).

   Plusieurs glycoprotéines en provenance d'autres virus de l'herpès sont également connues pour provoquer des réponses immunitaires importantes (5,10, 36,56). 



   Chacun des deux sous-types de EHV exprime six glycoprotéines abondantes (1,3, 43). Les portions génomiques des séquences d'ADN codant pour gp2, gplO, gpl3, gpl4, 

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 gpl7/18 et   gp2l/22a   ont été déterminés en utilisant des vecteurs d'expression lamba gtll et des anticorps monoclonaux (3). Les glycoprotéines gpl3 et gpl4 ont été localisées dans les mêmes emplacements dans le composant L du génome auquel sont homologues gC et gD, respectivement, de la carte du virus de l'herpès simplex (3).

   L'EHV-1 semble se singulariser parmi les virusalphaherpès dont les gènes de glycoprotéine ont été cartographiés, en ce que cinq de ses six glycoprotéines principales ont été codées à partir de séquences dans le composant de génome L, alors que seulement une glycoprotéine (gpl7/18) est   cartographiée   dans la région   Us. En   analysant ces données, on a prédit que certaines des glycoprotéines en 
 EMI5.1 
 faible abondance identifiées dans les virions EHV-1, aussi bien que les glycoprotéines EHV-1 non encore identifiées, s'appliquent en carte sur le composant S du génome (3).

   Les glycoprotéines d'enveloppe sont les immunogènes principaux des virus de l'herpès impliqués pour provoquer des réponses immunitaires chez l'hôte, à la fois humorales et cellulaires (5,8, 73-75) et sont donc du plus grand intérêt pour ceux qui tentent de réaliser des vaccins. 



   Récemment, la séquence de nucléotides de la souche Kentucky T431 de l'unité transcriptionnelle de EHV-1 qui code gpl3 a été rapportée (2). Un cadre de lecture ouvert code un produit de traduction primaire de 468 acides aminés, de 51 kDa. La protéine a les traits caractéristiques d'une protéine enjambant la membrane avec neuf sites potentiels de glycosylation à liaison par l'azote (Asn-X-Ser/Thr) présents dans le domaine de surface entre le signal putatif et les portions d'ancrage trans-membrane de la protéine (2). La glycoprotéine s'est révélée être homologue à (HSV)   gC-l   et gC-2 du virus de l'herpès simplex, à (PRV) gIII du virus de la pseudo-rage et à (VZV) gpV du virus de la varicelle zoster (2).   EHV-1   gpl3 est donc l'homologue structural des glycoprotéines, analogues à gC, du virus de l'herpès. 



   La séquence des nucléotides de EHV-1 gpl4 (71,72) 

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 a été rapportée récemment. L'analyse de la séquence prédite des acides aminés de la glycoprotéine gpl4 a révélé une homologie significative avec la glycoprotéine correspondante de HSV, à savoir gp. 



   Les anticorps monoclonaux dirigés contre certaines glycoprotéines EHV-1 sont neutralisant d'après ce qui a été montré (76). Des expériences d'immunisation passive ont démontré que les anticorps monoclonaux dirigés contre gpl3 ou gpl4 (77) ou contre   gpl3,   gpl4 ou gpl7/18 (78) pourraient protéger les hamsters contre une attaque mortelle. D'autres analogues des glycoprotéines gB et gC sont également impliqués dans la protection contre des maladies causées par des alphaherpèsvirus (8,10, 73).

   La glycoprotéine   EHV-1   gpl7/18, bien que caractérisée comme un autre immunogène protecteur potentiel, n'a pas jusqu'à présent de contre-partie structurelle connue parmi les plusieurs protéines codées par le composant S dans les autres alphaherpèsvirus (66,79, 80). du fait de sa position génomique, on a spéculé que   gpl7/l8   pourrait être l'analogue de HSV gE (2). 



   Le virus de la pseudo-rage (PRV), qui est un alphaherpèsvirus, est l'agent qui provoque la maladie d'Aujesky. La maladie est hautement infectieuse en provoquant des pertes économiques importantes dans l'industrie porcine. 



  La maladie est associée à une morbidité et une mortalité élevées parmi les porcelets et elle est caractérisée par des maladies respiratoires sévères, des avortements, une dimension réduite de la litière et des taux de croissance diminués chez les survivants. Une encéphalite fatale est une conséquence fréquente de l'infection. Des infections virales latentes, une caractéristique des virus de l'herpès, peuvent s'établir, ce qui permet aux cochons adultes s'étant rétabli de la maladie de servir comme porteurs chroniques du virus. Pour une revue extensive récente de la question, voir Wittman et Rziha (81). 



   Le génome de PRC consiste en ADN double brin de 90 

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 X 106 daltons (82) séparé par des séquences répétées inversées en un segment long unique (UL) ou en un segment court unique (Us) (83,84). Le génome PRV code approximativement 100 polypeptides dont l'expression est réglée d'une manière en cascade semblable aux autres virus de l'herpès (85,86). 



  A l'heure présente, cinq glycoprotéines gpI, gpII, gpIII, gp63 et gp50 ont été montrées comme associées à l'enveloppe virale et associées aux diverses structures membraneuses des cellules infectées par PRV (80,86-91). Une sixième protéine codée par PRV (gX) est libérée dans le milieu de culture (92). L'emplacement ou localisation physique de ces glycoprotéines du génome de PRV et leurs séquences d'ADN sont bien connus (62,80, 91-98). Comme pour les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès, les glycoprotéines de PRV contrôlent des fonctions virales essentielles, telles que l'attachement aux cellules, la pénétration dans les cellules et/ou la libération à partir des cellules.

   Les glycoprotéines de PRV sont critiques dans le profil de pathogénicité de l'infection par PRV et sont des constituants critiques dans la résolution de la maladie et l'état immunitaire. 



   PRV pgI est non-essentiel pour la réplication du virus in vitro et in vivo et est absent de la plupart des souches de PRV atténuées (99). La nature atténuée de ces souches daont on a supprimé   gI   indique également un rôle possible de   gI   dans la virulence (99,100). D'autres protéines de PRV semblent toutefois être impliquées dans cette fonction étant donné que l'expression de   gI   seul n'est pas suffisante pour produire de hauts niveaux de virulence (100). 



   Le rôle que joue   gI   dans la provocation de la réponse immunitaire contre PRV n'est pas claire. Des anticorps monoclonaux contre   gI   peuvent neutraliser le virus in vitro (101) et protéger passivement des souris immunisées contre une attaque mortelle par PRV (81). Kost et al. (98) ont récemment décrit l'expression de PRV   gpI   dans les recombinants du virus de la vaccine, soit seul soit en 

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 association avec   gp50   et gp63. L'inoculation intracraniale des recombinants de la vaccine dans des souris a produit une virulence accrue, particulièrement lorsque PRV gpI était associé à la co-expression de   gp50   et gp63. 



   Chez les cochons, toutefois, des anticorps neutrali- 
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 sant contre gI ne sont pas produits (5). En outre, un virus recombinant de la vaccine exprimant des polypeptides codés par PRV   gI   (98) ne protègent pas les souris contre une attaque mortelle par PRV (relativement à la protection impartie par le virus de la vaccine de souche sauvage de contrôle). Ces données, prises ensemble, suggèrent que PRV gpI est plus approprié pour constituer une sonde de diagnostic que comme composant d'un vaccin subunitaire. 



   La glycoprotéine gp63 de PRV est localisée adjacente à gp50 dans la région Us du génome de PRV (80). La séquence de codage pour PRV gp63 commence avec trois codons ATG consécutifs, environ 20 nucléotides en aval du codon d'arrêt de   gp50.   Il n'y a pas de motif de signal transcriptionnel reconnaissable et la traduction ou transcription se produit probablement à partir du même transcripteur que gp50. PRV gp63 est non essentiel in vitro. PRV gp63, en tant que séquence d'ADN continue avec PRV   gp50,   a été exprimé dans le virus de la vaccine comme rapporté par Kost et al. (98). La contribution de PRV gp63 à la protection des souris contre l'attaque par PRV est difficile à établir étant donné que ces études n'ont pas disséqué les contributions de PRV   gp50   et gp63. 



   La glycoprotéine gx de PRV est une glycoprotéine non structurale dont le produit final est secrété dans le fluide extra-cellulaire (85,92). Aucune neutralisation in vitro de PRV n'a été obtenue ni avec les sérums polygonaux ni avec les sérums monoclonaux vis-à-vis de PRV gX (102,103) et les vaccins gX   subunitaires n'étaient   pas protecteurs contre l'attaque (104). 



   La glycoprotéine gp50 de PRV est l'analogue de (HSV- 

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 1) gD du virus de l'herpès simplex type 1. Le cadre de lecture ouvert d'ADN code 402 acides aminés (95). La forme glycosylatée mature (50-60 kDa) contient des carbohydrates à liaison par l'oxygène sans glycosylation à liaison par l'azote (95). Le sérum porcin est hautement réactif avec PRV gp50, ce qui suggère son importance comme immunogène. Les anticorps monoclonaux pour gp50 neutralisent PRV in vitro avec ou sans complément (97,105, 106) et protègent passivement les souris (102,105, 106) et les cochons (102). Les recombinants du virus de la vaccine exprimant PRV   gp50   induisent des anticorps neutralisant le sérum et protègent à la fois les souris et les cochons contre l'attaque mortelle par le PRV (98,107, 108). 



   Le gène de PRV gpIII est localisé dans la région Ut du génome. Le cadre de lecture ouvert de 1437 bp code une protéine de 479 acides aminés. Le produit de traduction primaire déduit de 50,9 kDa comporte huit sites potentiels de glycosylation à liaison par l'azote (87). PRV gIII est l'analogue du   HSV-1   gC (96). Le remplacement fonctionnel de PRV gIII par HSVgC n'a pas été observé (109). Bien que PRV gIII soit non essentiel pour la réplication in vitro (110, 111), la forme glycosylatée mature (98 kDa) est un constituant abondant de l'enveloppe de PRV. Des anticorps monoclonaux anti-gpIII neutralisent le virus in vitro avec ou sans complément (86,106, 110) et peuvent protéger passivement les souris et les cochons (102).

   La glycoprotéine gIII de PRV peut protéger les souris et les cochons contre l'attaque mortelle par PRV après immunisation avec une protéine de fusion Cro/gIII exprimée dans E. Coli (Robbins, A., R. 



  Watson, L. Enquist, demande de brevet européen 0. 162. 738Al) ou exprimée dans une vaccine recombinante (Panicali, D., L. 



  Gritz, G. Mazzara, demande de brevet européen 0. 261 ?   940A2).   



   Un des constituants principaux de l'enveloppe de PRV est complexe à liaison disulfure de trois glycoprotéines (120 kDa, 67 kDa et 58 kDa) désigné PRV gpII suivant la nomencla- 

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 ture de Hampl (86). La séquence d'ADN codant PRV gII est localisée à l'extrémité gauche de UL. Le cadre de lecture ouvert de 2976 nucléotides code un produit de traduction primaire de 913 acides aminés de 110 kDA. PRV gpII est l'homologue de HSV-1 gB (62). Il a été montré que les anticorps monoclonaux dirigés contre PRV gpII neutralisent le virus in vitro (5) avec ou sans complément (81). En outre, les études d'immunisation passive ont démontré que les anticorps monoclonaux neutralisants protégeaient partiellement les cochons mais ne protégeaient pas les souris contre l'attaque du virus virulent (102).

   A ce jour, l'immunisation active des cochons avec la glycoprotéines PRV gpII n'a pas été rapportée. 



   Pendant les 20 dernières années, l'incidence des infections génitales provoquées par le virus type 2 de l'herpès simplex (HSV2) a augmenté d'une manière significative. Des estimations récentes indiquent qu'aux Etats-Unis 5-20 millions de personnes ont l'herpès génital (112). Bien que l'on ait montré que le traitement oral avec   l'ayclovir   réduit la sévérité des infections primaires (113) et supprime les épisodes récurants   ( (114),   le contrôle et le traitement de ces infections est loin d'être idéal. On a donc besoin d'un vaccin pour empêcher les infections primaires et récurantes. 



   Le génome du virus type   1 de l'herpès   simplex   (HSV1)   code au moins huit glycoprotéines antigénétiquement distinctes gB, gC, gD, gE, gG, gH,   gI   et   gJ   (115). Les homologues de ces gènes semblent être présents dans HSV2 (116-119). Etant donné que ces glycloprotéines sont présentes à la fois dans l'enveloppe du virion et la membrane du plasma de la cellule infectée, ils peuvent induire des réponses immunitaires protectrices humorales et via les cellules (37). 



   L'importance relative de l'immunité humorale et cellulaire dans la protection contre les infections du virus de l'herpès simplex n'a pas été complètement élucidée. Des 

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 souris immunisées avec HSV1 gB, gC ou gD purifié sont protégées contre l'attaque mortelle par HSV1 (120). Des souris ont été également protégées contre l'attaque mortelle par HSV1 ou HSV2 par immunisation passive avec des anticorps vis-à-vis du virus total HSV1 (121) ou HSV2 (122) total et avec des anticorps vis-à-vis des glycoprotéines individuelles HSV2 gB, gC, gD ou gE (123). Cette protection semble toutefois être dépendante d'une réponse des cellules T compétentes étant donné que les animaux immuno-supprimés par irradiation, la cyclophosphamide ou le sérum anti-thymocyte n'étaient pas protégés (124). 



   La contribution des glycoprotéines individuelles pour provoquer une réponse immunitaire protectrice n'est pas complètement comprise. L'expression de ces glycoprotéines dans un système hétérologue, telle que la vaccine, a permis l'analyse de certains de ces paramètres. Par exemple, on a montré que les vecteurs du virus de la vaccine exprimant HSV1 gB (125) et HSV1 gC (32) induisent des réponses de cellules T cytotoxiques. En outre, il a été montré que des souris immunisées avec le virus recombinant de la vaccine exprimant HSV1 gB (8), HSV1 gC (126) ou HSV1 gD (26) sont protégées contre une attaque mortelle par HSV1. Un virus recombinant de la vaccine exprimant HSV1 gD s'est révélé également être protecteur contre HSV2 dans un système modèle de cochon d'Inde (cobaye).

   On ne sait pas cependant si l'expression d'antigènes (HSV) multiples résulte dans la potentialisation (effet de synergie) de cette réponse protectrice. 



   Le virus 1 de l'herpès bovin   (Bh'Vl)   est responsable d'une variété de maladies du bétail, y compris la conjonctivite, la vulvo-vaginite et l'avortement (127). Il est également l'un des agents les plus importants de la maladie respiratoire bovine, en agissant soit directement, soit comme facteur prédisposant dans l'infection bactérienne (128). 



   BHV1 spécifie plus de 30 polypeptides structuraux, dont 11 sont glycosylatés (129). Quatre de ces glycoprotéines 

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   gI,     gII,   gIII et gIV ont été caractérisées et on a montré qu'elles sont homologues aux glycoprotéines gB, gC, gD et gE du virus (HSV) de l'herpès simplex (130,131). 



   Les vaccins subunitaires consistant en gI, gIII et/ou gIV se sont révélés protéger le bétail de la maladie (en utilisant un modèle d'attaque par aérosol hémolytique   BHVl/Pasteurella),   mais non pas de l'infection. Ces résultats indiquent l'importance de ces glycoprotéines pour provoquer une réponse immunitaire réussie contre BHV1.   gI   et gIII ont également été   clonés   dans le virus de la vaccine et du bétail immunisé avec ces recombinants se sont révélés produire des anticorps neutralisant   vis-à-vis   du BHV1 (56,133). 



   La rhinotrachéite féline est une maladie, commune et mondialement répandue, des chats ; elle est provoquée par un alphaherpèsvirus désigné comme virus de l'herpès félin type 1 (FHV-1). Comme d'autres virus de l'herpès, FHV-1 établit une infection latente qui résulte dans une réactivation périodique (134). Les infections de FHV-1 dans les colonies ou stations d'élevage sont caractérisées par un taux élevé de mortalité chez les chatons. Des infections secondaires de la voie respiratoire supérieure sont très débilitantes pour les adultes. Le contrôle de cette maladie est tenté actuellement en utilisant des vaccins vivants modifiés ou des vaccins inactivés qui peuvent supprimer le développement des signes cliniques, mais n'empêchent pas l'infection qui produit la dissémination du virus.

   Ainsi, des chats vaccinés sans   symptomes   peuvent disséminer le virus virulent et des infections latentes ne peuvent pas être empêchées par les vaccins existants (135) ou par des vaccins subunitaires purifiés, plus sûrs, en cours de développement (136,137). 



   Les glycoprotéines du virus de l'herpès interviennent dans la fixation du virion à la cellule hôte et sont extrêmement importantes dans l'infectivité virale (138,139). Elles déterminent également la spécificité de sous-type du 

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 virus (140). Les antigènes des glycoprotéines du virus de l'herpès sont reconnues à la fois par les sytèmes immunitaires humoraux et les systèmes immunitaires cellulaires et se sont révélés provoquer des réponses immunitaires protectrices chez les hôtes vaccinés (44,107, 141,132). On a montré que FHV-1 contient au moins 23 protéines différentes (143,144). 



  Parmi celles-ci, au moins 5 sont glycosylatées (144,145) avec des masses moléculaires rapportées s'étalant de 120 kDa à 60 kDa. On a montré que les glycoprotéines de FHV-1 sont immunogènes (143,145). 



   Comme plusieurs autres alphaherpèsvirus, FHV-1 apparaît comme ayant un homologue de la glycoprotéine B (gB) de   HSV-1,   et une séquence partielle du gène FHV-1 gB a été récemment rapportée (146). Le   FHV-1   gB est exigé pour l'entrée du virus et la fusion cellulaire (147,149). Le HSV- 1 gB et les analogues de gB d'autres virus de l'herpès ont, comme on l'a montré, provoqué un anticorps circulant important, aussi bien que des réponses immunitaires induites via les cellules (8,10, 37,47, 73,150). La glycoprotéine FHV- 1 gB est un complexe de 134 kDa qui est dissocié par le Bmercaptoéthanol en deux glycoprotéines de 66 kDa et de 60 kDa. Le génome d'ADN de FHV-1 a une taille d'environ 134 kb (153). 



   Le virus d'Epstein-Barr (EBV), un virus de l'herpès lymphotropique humain B, est un membre du genre lymphocryptovirus qui appartient à la sous-famille des gammaherpèsvirus. Il constitue l'agent qui provoque la mononucléose infectieuse (154) et la   lymphomase   des cellules B. EBV est associé à deux affections malignes humaines : le lymphome endémique de Burkitt et le carcinome nasopharyngien non différencié. 



   Etant donné que le génome de   l'EBV   a été complètement   séquencé   (207) comme les génomes de VZV (66) et HSV1 (158), on a décrit de nombreuses homologies entre ces différents virus de l'herpès (159). Dans certains cas, ces homologies ont été utilisées pour prédire des fonctions 

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 potentielles de certains cadres de lecture ouverts (ORF) de EBV. Les gènes de EBV homologues aux gènes de HSV1 impliqués dans l'immunité ont un intérêt particulier. Ainsi, le gène de EBV BALF4 a des homologies avec HSV1 gB (68) et le gène d'EBV BXLF2 a des homologies avec HSV1 gH (161). Finalement, le gène de EBV BBRF3 comporte des homologies avec une protéine de membrane de CMV (162). 



   Parmi les protéines de EBV, les deux principales glycoprotéines de l'enveloppe, à savoir gp340 et gp220, sont les antigènes de vaccination potentiels les mieux caractérisés. Elles sont dérivées du même gène par épissage ou splicing sans changement dans le cadre de lecture (163, 164). 



  Des anticorps monoclonaux et des sérums polyclonaux dirigés contre gp340 neutralisent   l'EBV   in vitro (165).   Le"cotton-   top tamarind" (marmouset ou ouistiti sud-américain doté de griffes), le seul animal susceptible, peut être protégé par une immunisation avec du gp340 purifié (166) et avec un virus recombinant de la vaccine EBV gp340 (167). Dans ce cas, la protection a été obtenue avec un recombinant dérivé de la souche de vaccine   WR,   mais non avec un recombinant dérivé de la souche de la vaccine Wyeth. La souche Wyeth a été largement utilisée en tant que souche de vaccin. 



   Les anticorps monoclonaux dirigés contre le gp85, l'homologue de EBV au HSV1 gH, ont été décrits comme des anticorps neutralisant in vitro (168,169). 



   Le cytomégalovirus humain (HCMV) est un membre de la sous-famille des bétaherpèsvirus (famille des herpès viridés). HCMV peut provoquer une infection productrice persistante en face de l'immunité spécifique substantielle. Même si HCMV possède une pathogènicité faible, en général, une infection intra-utérine provoque des dommages au cerveau ou la surdité dans environ 0,15 % des nouveaux-nés et est la complication infectieuse la plus habituelle de la transplantation d'organes (170). Bien que l'efficacité d'un vaccin HCMV (souche Towne) atténué vivant expérimental a été démon- 

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 tré, des préoccupations à propos des souches de vaccins vivants a entraîné des efforts d'identification des protéines de HCMV utilisables comme vaccin subunitaire.

   Dans cette perspective, l'identification des glycoprotéines du virion et leur évaluation comme agents protecteurs est une étape importante. 



   On a décrit (172) trois familles immunologiquement distinctes de glycoprotéines associées à l'enveloppe de 
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 HCMV : gCI (gp55 et gp93-130) ; gCII (gp47-52) ; et gCIII (pg55-pl45). 



   Le gène codant pour gCI est homologue à HSVI gB. Les glycoprotéines gcII sont codées par une famille de cinq gènes (XHLF) disposés en tandem et partageant une ou deux régions d'homologie. Plus probablement gCII est codée par seulement deux de ces gènes (172,173). Le gène qui code pour gCIII est homologue à HSVI   gH   (174). 



   On a décrit   (174,   176) des anticorps neutralisant in vitro spécifiquement dirigés contre chacune de ces familles. 



   Des mutants de poxvirus convenablement modifiés portant des gènes de virus de l'herpès chevalin exogène, qui ont été. exprimés dans un hôte en tant que déterminant antigénique provoquant la production par l'hôte d'anticorps vis-à-vis des antigènes du virus de l'herpès, représentent des vaccins nouveaux qui évitent les inconvénients des vaccins classiques utilisant des organismes tués ou des organismes vivants atténués. Ainsi, par exemple, la production de vaccins à partir d'organismes tués exige la culture de grandes quantités d'organismes suivie par un traitement qui détruit sélectivement leur pouvoir infectieux sans affecter leur antigénicité. D'un autre côté, des vaccins contenant des organismes vivants atténués présentent toujours la possibilité d'une réversion de l'organisme atténué pour passer à un état pathogène.

   Au contraire, lorsque un poxvirus recombinant, convenablement modififé avec un gène du virus de l'herpès chevalin codant pour un déterminant antigénique d'un 

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 virus de l'herpès produisant une maladie, est utilisé comme vaccin, la possibilité de réversion pour donner un organismes pathogène est évitée, étant donné que le poxvirus contient seulement le gène qui code pour le déterminant antigénique de l'organisme produisant la maladie et non pas ces portions génétiques de l'organisme responsables pour la réplication de l'agent pathogène. 



   PRV infecte d'une manière mortelle de nombreuses espèces de mammifères (bétail, chiens, etc...). Les cochons adultes, cependant, survivent   généralement à   l'infection et représentent de ce fait un réservoir de virus important. 



  Etant donné que le PRV provoque des pertes économiques importantes, la vaccination des porcs avec des vaccins atténués ou tués est pratiquée dans de nombreux pays. 



   Des tentatives pour contrôler l'infection par le PRV chez les cochons et pour réduire les pertes économiques ont été effectuées par immunisation active au moyen de vaccins vivants modifiés ou de vaccins inactivés. Les vaccins atténués, qui induisent généralement une immunité de longue durée et sont intéressants au point de vue prix, présentent le risque d'une atténuation insuffisante ou d'une instabilité génétique. Les vaccins inactivés sont moins efficaces, exigent plusieurs immunisations et contiennent généralement des adjuvants puissants. Ces dernières formulations peuvent induire des réactions allergiques après vaccination telles que le manque d'appétit, l'hyperthermie ou l'avortement chez les truies enceintes.

   Ces types de vaccin souffrent également de certains inconvénients en ce qui concerne l'empêchement d'infections latentes, la lutte contre les effets des anticorps maternels sur l'efficacité de la vaccination et l'élimination de l'utilisation potentielle d'un test de diagnostic sérologique pour distinguer les animaux vaccinés de ceux précédemment infectés par le PRV. 



   Des stratégies de vaccination alternatives, par exemple l'utilisation de poxvirus recombinants qui expriment 

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 des produits de gène de PRV immunologiquement pertinents auraient certains avantages : (a) éliminer les souches de vaccin du PRV atténué vivant hors du champ ; et (b) permettre la distinction des animaux vaccinés d'une part et des animaux infectés ou séropositifs d'autre part. Ce dernier avantage pourrait être accompli par l'utilisation de réactifs de diagnostic appropriés qui distingueraient d'une manière précise les animaux vaccinés des animaux naturellement infectés. Ceci est une considération importante étant donné les réglement existants qui contrôlent le déplacement des animaux séro-positifs.

   En outre, la vaccination est plus économique et préférable au test et à l'élimination des animaux infectés dans les lots d'animaux. Le développement de tels vaccins exige une connaissance des contributions faites par les antigènes de PRV, appropriés, à l'induction d'une immunité protectrice. Dans le cas du PRV, comme des autres membres de la famille du virus de l'herpès, les glycoprotéines sont des candidats importants pour constituer les antigènes destinés à être présents dans un vaccin recombinant subunitaire effectif. 



   La technologie de production de recombinants du virus de la vaccine a récemment été étendue à d'autres membres de la famille des poxvirus qui ont un domaine de réception par l'hôte plus restreint. En particulier, des poxvirus aviaires, qui se répliquent dans les espèces aviaires (oiseaux), ont été bâtis pour exprimer des produits de gène immunologiquement pertinents. L'inoculation d'espèces aviaires (42,177) et non aviaires (41) avec des recombinants du poxvirus aviaire a provoqué des réponses immunitaires protectrices contre l'agent pathogène correspondant. 



   Des vaccins vivants atténués et des vaccins inactivés   vis-à-vis   du BHV1 sont disponibles depuis plus de 30 ans et ont réduit avec succès l'incidence des maladies liées au BHV1. Ces vaccins toutefois n'empêchent pas l'infection latente ou la réinfection avec des virus de souche sauvage. 

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  Ils compliquent également la différenciation entre les animaux infectés et les animaux vaccinés. 



   Les deux types de vaccin ont d'autres inconvénients importants. La vaccination de vaches enceintes avec des vaccins vivants atténués peut provoquer la mort de foetus et un avortement subséquent (127). En outre, on a montré que les animaux vaccinés pouvaient disséminer le virus (178). 



  C'est pourquoi les animaux vaccinés maintenus avec des vaches enceintes peuvent répandre le virus infectieux à un animal qui est en gestation et provoquer l'avortement du foetus. 



   Les vaccins inactivés n'induisent pas des avortements ni ne provoquent une excrétion virale. Toutefois, ils exigent l'utilisation d'adjuvants et peuvent provoquer des réactions d'hypersensibilisation ayant une issue fatale (anaphylaxie) et une inflammation et une fièvre non fatales (179). 



   Un des problèmes les plus importants de la vaccination est de surmonter ou d'éviter l'immunité maternelle. A cet égard, si une mère est immune vis-à-vis d'un agent pathogène particulier,   l'l'immunité"de   la mère passe au nouveau-né par l'intermédiaire des anticorps présents dans le colostrum et/ou par des voies additionnelles. Toutefois, le nouveau-né ne peut pas être vacciné avec succès tant que le niveau d'immunité maternelle n'a diminué d'une manière suffisante. C'est pourquoi il existe une fenêtre étroite permettant la vaccination avec succès du nouveau-né en présence de l'immunité maternelle qui diminue. 



   On peut ainsi apprécier que la mise à disposition d'un poxvirus recombinant du virus de l'herpès et de vaccins qui produisent une immunité protectrice contre les infections de l'herpès virus, qui confèrent les avantages, par rapport à la technique antérieure, de l'inoculation de virus vivants, mais qui réduisent ou éliminent les problèmes qui viennent d'être discutés, serait un progrès hautement désirable par rapport à l'état actuel de la technologie. 

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   C'est pourquoi, la présente invention a pour objet de produire des poxvirus recombinants qui expriment des produits de gène du virus de l'herpès et de fournir un procédé pour fabriquer de tels poxvirus recombinants. 



   Un objet supplémentaire de l'invention consiste à réaliser le clonage et l'expression de séquences de codage du virus de l'herpès dans un vecteur de poxvirus, particulièrement un vecteur de virus de la vaccine, un vecteur de poxvirus des volailles ou un vecteur de poxvirus du canari. 



   C'est un autre objet de l'invention de mettre à disposition un vaccin qui est capable de provoquer des anticorps neutralisant le virus de l'herpès et une immunité protectrice contre une attaque mortelle par le virus de l'herpès. 



   Ces objets et avantages ainsi que d'autres objets et avantages, de la présente invention apparaîtront aisément après considération de ce qui suit. 



   Suivant un premier aspect, la présente invention est relative à un poxvirus recombinant contenant une séquence d'ADN du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome du poxvirus. Avantageusement, le virus de l'herpès est un membre de la sous-famille des alphaherpèsvirus, bétaherpèsvirus et gammaherpèsvirus. En particulier, la séquence d'ADN du virus de l'herpès code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès.

   PLus particulièrement encore, la glycoprotéine du virus de l'herpès est choisie dans le groupe constitué par le gpl3 du virus de l'herpès chevalin, gpl4 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gE duvirus de l'herpès chevalin,   gp50   du virus de la pseudo-rage, gpII du virus de la pseudo-rage, gpIII du virus de la pseudo-rage, gpI du virus de la pseudo-rage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, gD du virus de l'herpès simplex,   gI   du virus de l'herpès bovin, gB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, gp340 du virus 

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   d'Epstein-Barr,   gB du virus   d'Epstein-Barr,   gH du virus d'Epstein-Barr et gB du cytomégalovirus humain. 



   Conformément à la présente invention, le poxvirus recombinant exprime des produits de gènes du gène du virus de l'herpès étranger. En particulier, la séquence d'ADN étrangère code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès et   l'ADN   étranger est exprimé dans un hôte par la production de la glycoprotéine du virus de l'herpès. Avantageusement, plusieurs glycoprotéines du virus de l'herpès sont co-exprimées dans l'hôte par le poxvirus recombinant. Le poxvirus est avantageusement un virus de la vaccine ou un poxvirus aviaire, tel que le poxvirus des volailles ou le poxvirus du canari. 



   Sous un deuxième aspect, la présente invention est relative à un vaccin pour induire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec le vaccin, ce vaccin comprenant un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de   l'ADN   du virus de l'herpès. Plus particulièrement,   l'ADN   code et exprime une glycoprotéine du virus de l'herpès. Avantageusement, plusieurs glycoprotéines du virus de l'herpès sont coexprimées chez l'hôte par le poxvirus. Le poxvirus utilisé dans le vaccin selon la présente invention est avantageusement un virus de la vaccine ou un poxvirus aviaire tel que le poxvirus des volailles ou le poxvirus du canari. 



   Sous un troisième aspect, la présente invention est relative aux mécanismes pour contourner le problème de l'immunité maternelle. Si la barrière est due à la présence d'anticorps vis-à-vis d'un antigène donné ou d'antigènes donnés, alors la barrière d'immunité maternelle peut être surmontée ou évitée en utilisant, sélectivement, des vecteurs exprimant des sous-ensembles définis d'antigènes. Par exemple, l'animal en gestation peut être vacciné avec un virus recombinant de la vaccine exprimant la glycoprotéine   gp50   du virus de la pseudo-rage et le descendant peut être 

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 vacciné à la naissance, ou peu de temps après, avec les recombinants de la vaccine exprimant d'autres glycloprotéines gpII ou gpIII, ou des combinaisons de celles-ci, du virus de la pseudo-rage.

   D'un autre côté, si la barrière présentée par l'immunité maternelle est due au vecteur, alors on peut vacciner d'une manière différencielle la mère avec un vecteur (vaccine ou poxaviaire) et vacciner la progéniture avec l'autre vecteur. Ce procédé prend en considération bien entendu non seulement l'utilisation de vecteurs différents, mais également de vecteurs exprimant une constellation différente de glycoprotéines. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé pour surmonter ou éviter l'immunité maternelle qui, autrement, empêcherait une immunisation réussie chez une progéniture nouvellement née.

   Par la présente invention, la progéniture nouvellement née est inoculée avec un poxvirus recombinant contenant de   l'ADN   provenant d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du poxvirus, ledit ADN codant pour un premier antigène d'un agent pathogène de la progéniture nouvellement née, et ledit antigène est différent d'un second antigène du même agent pathogène utilisé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis du même agent pathogène chez la mère de la progéniture nouvellement née.

   Egalement par la présente invention, la progéniture nouvellement née est inoculée avec un premier poxvirus recombinant contenant   l'ADN   d'une source non-pox dans une région non essentielle du génome du premier poxvirus, cet ADN codant pour un antigène d'un agent pathogène de la progéniture nouvellement née, et ledit premier poxvirus étant différent d'un second poxvirus recombinant utilisé pour induire une réponse immunologique au même agent pathogène chez la mère de la progéniture nouvellement née. 



   Une meilleure compréhension de la présente invention sera obtenue à l'examen des dessins annexés, sur lesquels :
La Figure 1 représente schématiquement un procédé 

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 pour la construction ou formation du virus recombinant de la vaccine, vP425 ;
La Figure 2 illustre la séquence d'ADN d'un fragment de 1,88 Kb de EHV-1 contenant les séquences de codage de gpl3 ;
La Figure 3 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant de la vaccine, vP483, contenant le gène de EHV-1 gpl3 ;
La Figure 4 illustre schématiquement un procédé pour former le virus recombinant de la vaccine, vP458 ;
La Figure 5 illustre schématiquement un procédé pour construire le virus recombinant de la vaccine, vP577, contenant le gène de   EHV-1   gpl4 ;

  
La Figure 6 illustre la séquence d'ADN d'un fragment de 3,35 kb de EHV-1 contenant la séquence de codage de gpl4 ;
La Figure 7 est un graphique de   l'hydrophilicité   relative pour les séquences de codage de   EHV-1   gpl4 ;
La Figure 8 illustre schématiquement un procédé pour la construction ou la formation du virus recombinant du pox aviaire, vFP44, contenant le gène de EHV-1 gpl3 ;
La Figure 9 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant du poxvirus du canari, vCP48, contenant le gène de   EHV-1   gpl3 ;
La Figure 10 illustre schématiquement un procédé pour la construction ou la préparation des plasmides donneurs pHES-MP63, pHES-MPl et pHES-MP34 contenant des versions modifiées du gène de   EHV-1   gpl4 ;

  
La Figure 11 est une carte des sites de coupure par BamHI de la souche Kentucky D de   EHV-1,   indiquant les répétitions inversées du génome par des boites, montrant l'emplacement des six gènes principaux de glycoprotéines de EHV-1 et montrant également une expansion de la région du génome qui inclut les gènes gD, gp63 et gE ;
La Figure 12 illustre la séquence de nucléotides d'un fragment de 6402 paires de bases de   EHV-1   contenant les 

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 séquences de codage de gD, gp63 et gEe ;
La Figure 13 est une représentation hydropathique de la séquence de 402 acides aminés composant EHV-1 gD ;
La Figure 14 est une représentation hydropathique de la séquence de 413 acides aminés composant EHV-1 gp63 ;

  
La Figure 15 est une représentation hydropathique de la séquence de 552 acides aminés composant   EHV-1     gE   ;
La Figure 16 illustre schématiquement un procédé pour la construction de plasmides donneurs pJCA006,   pJCA0007   et pJCAOOS contenant le gène de   EHV-1   gD, de   EHV-1   gE et de EHV-1 gp63, respectivement, et la formation du virus recombinant de la vaccine contenant ces gènes ;
La Figure 17 illustre schématiquement un procédé pour la construction de plasmides donneurs pJCAOO9 (contenant les gènes de   EHV-1   gD et gp63) et pJCA010 (contenant les gènes de EHV-1 gD, gp63 et gE), et la production du virus recombinant de vaccine contenant ces gènes ;

  
La figure 18 représente schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur PR18 contenant le gène de PRV gpII, et la formation du virus recombinant de la vaccine exprimant le gène de PRV gpII   ;  
La Figure 19 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpII ;
La Figure 20 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pPR24 contenant le gène de PRV gpIII, et la production du virus recombinant de la vaccine exprimant le gène de PRV gpIII ;
La Figure 21 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpIII ;
La Figure 22 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur pPR26 contenant le gène de PRV gp50, et la production du virus recombinant de la vaccine exprimant le gènede PRV   gp50   ;

  
La Figure 23 illustre la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gp50 ; 

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La Figure 24 illustre schématiquement un procédé pour la construction des plasmides pSD478VC et pSD479VCBG et l'insertion de beta-galactoside dans le virus de la vaccine ;
La Figure 25 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pMP13PP ;
La figure 26 illustre schématiquement un procédé 
 EMI24.1 
 pour la construction du plasmide pFPPRVII contenant le gène de PRV gpII ;

   
La Figure 27 illustre schématiquement un procédé pour la construction du recombinant du poxvirus du canari, vCP55, exprimant le gène de PRV gpII ;
La Figure 28 illustre schématiquement un procédé pour la construction du virus recombinant de la vaccine, VP717, exprimant le gène de PRV   gI   ;
La Figure 29 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP569 et vP734, exprimant le gène de HSV-2 gB ;
La Figure 30 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP579, vP748 et vP776, exprimant le gène de HSV-2 gC ;
La Figure 31 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP570,   vP761,   vP775 et vP777, exprimant le gène de HSV-2 gD ;

  
La Figure 32 illustre schématiquement un procédé pour la construction des virus recombinants de la vaccine, vP637 et vP724, exprimant le gène de   BHV-1     gI   ;
La Figure 33 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur   pJCA001   contenant le gène de FHV-1 gB et pour la construction du virus recombinant de la vaccine,   vP717,   exprimant le gène de FHV-1 gB ;
La Figure 34 illustre la séquence de nucléotides du segment, de 3400 bp, de   l'ADN   de FHV-1 codant pour la glycoprotéine gB ;
La Figure 35 est une représentation hydropahique de la séquence de 947 acides aminés composant FHV-1 gB ;

   

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La Figure 36 illustre schématiquement un procédé pour la construction des plasmides donneurs 409gp220 contenant le gène de EBV gp220, et 409gp340, contenant le gène de EBV gp340 ;
La Figure 37 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 409 gB contenant le gène de EBV gB ;
La Figure 38 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 486gH contenant le gène de EBV gH ;
La Figure 39 illustre schématiquement la structure du plasmide donneur de la vaccine 513gHgBgp340 contenant les gènes d'EBV gp340, gB et gH ;
La Figure 40 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide donneur de la vaccine 409CMVgB contenant le gène de CMV gB ;

  
La Figure 41 illustre les séquences de nucléotides et d'acides aminés du gène de HCMV (souche de Towne)   HXLF1 ;   et enfin
La Figure 42 montre les séquences de nucléotides et d'acides aminés du gène de HCMV (souche de Towne) HXLF2. 



   Les exemples qui suivent sont destinés à mieux faire comprendre l'invention et ses nombreux avantages, ces exemples étant uniquement illustratifs et non limitatifs. Exemple 1-CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DU VIRUS DE LA
VACCINE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE   crpl3   DU
VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN
Remplacement du   gène   HA de la vaccine par le gène de l'E. Coli beta-galactosidase
La souche de Copenhague du virus de la vaccine obtenue de Rhone Mérieux, Inc.   (Athens 1 Georgie)   a été utilisée dans cet exemple. Le virus a été propagé à partir d'un isolat de plaque purifié soit sur cellules de VERO (ATCC n  CCL81) ou de MRC-5 (ATCC nO CCL171) dans un milieu essentiel minimal d'Eagle (MEM) avec 10 % de sérum foetal 

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 bovin (FBS).

   Un dérivé du virus de souche sauvage, dont toute la séquence de codage pour le gène de la thymidine kinase a été supprimée par des méthodes classiques (25,28), a été isolé et désigné VP410. Ce mutant à suppression de la thymidine kinase a été utilisé pour des manipulations ultérieures. On a construit des plasmides qui ont été sélectionnés et qu'on a cultivé par des procédures classiques (27,28). 



   En se référant maintenant à la Figure 1, le fragment SalIF de 13 kb du virus de la vaccine qui recouvre la jonction du fragment HindIII A/B a été lié à pUC8 digéré par Sali, en engendrant pSD419VC. Le bras droit de pSD419VC correspondant à la portion HindIII B du fragment SalI F a été enlevé par digestion avec HindIII et re-ligation, engendrant pSF456VC. pSD456VC contient ainsi l'extrémité de droite du fragment par HindIII A dans lequel se trouve toute la région de codage pour le gène   (HA)   de l'hémaglutinine (35) flanqué par approximativement des séquences supplémentaires de vaccine de 0,4 kb Ode chaque   côté.   



   Pour engendrer un vecteur plasmidique virtuellement privé de séquences de codage de HA, pSD456VC a été coupé (partiellement digéré) au site RsaI en amont du gène HA et au site EaqI 80 bp à partir de l'extrémité   3'du   gène   HA.   Le fragment   RsaI/EaoI d'environ   3,5 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose. 



   Des oligonucléotides synthétiques MPSYN59-62 ont été préparés pour remplacer la région depuis le site RsaI jusqu'à la position 2 en amont de la séquence de codage de HA, immédiatement suivi par les sites de restriction   BQIII,   Smal et PstI et une extrémité cohesive EaaI.

   La séquence de   MPSYN59-62,   avec les sites de restriction comme indiqué est la suivante : 
 EMI26.1 
 5'-ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGATAGÀACAA 3'-TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAACTATCT7GTT 
 EMI26.2 
 AATACATAATTTTGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCTCCCGGGCTGCAGC-3' TTATGTATTAÀAACATTTTTATTTAGTGAAAAA'rATGAI'rC7AGAGGGCCCGACGTCGCCGG-5' Boll! Sma ! Pstl Eacl 

 <Desc/Clms Page number 27> 

 
Le mélange MPSYN59-62 ayant subi un traitement de réforme ou dénaturation (anneding) a été lié au fragment   RsaI/EaaI   de 3,5 kb provenant de pSD456VC, en engendrant pSD466VC. Ainsi, dans le pSD466VC, le gène HA a été remplacé par une région de polyliaison (polylinker). 



   A fragment BalII/BamHI (partiel) de 3,2 kb contenant le gène E. Coli beta-galactosidase provenant de   pMC1871   (34) sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de vaccine de 11 kDa (7), a été   cloné   en pSD466VC qui a été digéré avec   Balle.   Un plasmide contenant la cassette promoteur de 11   kDa/gène   de béta-galactosidase dans une orientation de la gauche vers la droite par rapport aux bras de vaccine sur les flancs a été désigné pSD466VCBGA et recombiné en un mutant à suppression de thimidine kinase, vP410, de la souche Copenhague du virus de la vaccine, en engendrant le recombinant de la vaccine vP425 exprimant la betagalactosidase.

   On a retenu 80 paires de bases à l'extrémité carboxy du gène HA de manière à ne pas rompre un court cadre de lecture ouvert potentiel transcrit de la droite vers la gauche par rapport au génome de la vaccine. 



   Le virus recombinant de la vaccine, vP425 (184), a été identifié sur la base de la formation de plaques bleues en présence du substrat chromogène X-gal, comme décrit par d'autres (9,24). La substitution du gène de   beta-galactosi-   dase par encore un autre gène étranger dans des recombinants subséquents de la vaccine pourrait être déterminée facilement en isolant des plaques incolores au lieu de plaques bleues. 



   Pour faciliter les phases futures de clonage, le site SmaI dérivé de la région de multiclonage de pUC8 a été éliminé par digestion de pSD466VC par BamHI/EcoRI, la formation d'une extrémité franche avec le fragment de Klenow de l'E. Coli polymérase et re-ligation. Ainsi, le seul site 

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 SmaI restant dans le plasmide résultant, pSD467VC, est dans la région de polyliaison de la suppression de HA. 



   Identification des séquences d'ADN codant le   aène  
EHV-1 qpl3
La séquence d'ADN codant la glycoprotéine EHV-1 gpl3 réside dans le fragment BamHI-H de 7,3 kb de EHV-1 (3). Les données concernant la séquence de nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de la région pUC   (BamHI-H)   en utilisant des sous-clones chevauchants par utilisation de l'enzyme T7 modifiée SEQUENASE (40) provenant de U. S.   Bicche-   micals, Cleveland, Ohio. Les réactions classiques de terminaison de chaîne didéoxy (33) ont été réalisées sur des modèles ou matrices de plasmides à double brin qui ont été dénaturés dans un alcali. Les amorces M13, avant et arrière, ont été utilisées pour obtenir la séquence initiale de chaque clone.

   Les amorces sur mesure 16-17-mer, synthétisées en utilisant la technique chimique classique (Biosearch 8700, San Rafael, CA : Applied Riosystems 380B, Foster City, CA), ont été utilisées pour se déplacer le long du fragment restant. Le programme d'analyse de séquences IBI Pustell a été utilisé dans toutes les analyses de données de séquences (29). 



   L'analyse de séquences   d'ADN   a révélé un cadre de lecture ouvert de 1 404 bp codant 468 acides aminés avec un produit de traduction primaire prédit de 50,9 kDa. Une homologie significative des acides aminés dans la moitié carboxy du cadre de lecture ouvert de gpl3 putatif a été observée avec Gc des virus de l'herpes simplex type 1 et type 2, gIII du virus de la pseudo-rage et gpV du virus de la varicelle-zoster ce qui suggère que gpl3 est un membre des glycoprotéines du type gC des virus de l'herpès. En outre, 
 EMI28.1 
 une analyse détaillée du cadre de lecture ouvert de EHV-1 gpl3 a été présentée dans une publication antérieure (2).

   Pour faciliter la description du clonage et de l'expression de   EHV-1   gpl3 dans les vecteurs du virus de la vaccine, le 

 <Desc/Clms Page number 29> 

 cadre de lecture ouvert de apl3 plus des séquences additionnelles   5'et 3'sont   illustrés sur la Figure 2. Sur cette Figure, une boîte TATA présumée et des acides aminés comprenant des signaux putatifs et des éléments d'ancrage de membrane sont soulignés. Le site de coupure potentiel de la séquence de signal est noté avec une flèche suivant le signal de coupure ASA (cercles ouverts). Potentiellement, neuf sites de glycosylation à liaison par l'azote existent à l'intérieur des séquences de signal et d'ancrage, comme défini par le motif Asn-X-Ser/Thr (astérisques). 



   Clonaae du   aène   de   EHV-1     opl3   dans un plasmide donneur du virus de la vaccine
Un promoteur du virus de la vaccine   précoce/tardif,   H6, a été utilisé pour l'expression de gènes étrangers dans des vecteurs du virus de pox aviaire (41,42). Cet élément de promoteur correspond aux séquences d'ADN immédiatement en amont du cadre de lecture ouvert de H6 dans le fragment de vaccine HindIII-H (31). 



   En se référant maintenant à la Figure 3, pour faire muter et insérer le promoteur H6 dans pSD467VC, on a synthétisé des oligonucléotides   H6SYN. oligos   A-D. La séquence de H6SYN oligos A-D, avec les bases modifiées comme souligné et 
 EMI29.1 
 les sites de restriction comme indiqué est la suivante : BALAI 5'-GATCTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTT 3'-AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAA GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA CACAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATT   GTTTGTATCGTACCC-3' CAAACATAGCATGGG=. 5' SmaI  
Les bases soulignées dénotent une modification de la 

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 séquence du promoteur natif H6. 



   L'ADN double brin de longueur totale 130 bp, formé par le traitement de réforme (annealing) de H6SYN oligos AD a été purifié par électro-élution à partir d'un gel d'agarose et lié à des fragments SmaI/HindIII de 0,5 kb et BalII/HindIII de 3,1 kb, dérivés de pSD467VC. Le plasmide résultant, pTP15 (184), possède le codon d'initiation ou d'amorçage ATG modifié en   CCC   comme partie du site SmaI qui 
 EMI30.1 
 est immédiatement suivi par un site PstI. Un agent de liaison (linker) de NsiI, à savoir 5'-TGCATGCATGCA-3' (New England Biolabs, Beverly,   KA)   a été inséré au site SmaI de pTP15 pour engendrer le plasmide pNSI. 
 EMI30.2 
 



  Un fragment EHV-1 EcoRI/NarI, dans lequel le site EcoRI se trouve 120 bp en amont du codon d'iniation ou d'amorçage ATG et dans lequel le site NarI se trouve 23 bp en amont du codon de terminaison TAG de EHV-1   gpl3,   a été   cloné   dans le phage M13mpl9 en engendrant le phage recombinant M13EcoRnar. En utilisant la mutagénèse dirigée par oligonucléotide (17) un site NsiI a été introduit en changeant la séquence TTGCCT (bases 130-135 sur la Figure 2) dans le gène de EhV-1 gpl3 en ATGCAT. Le fragment EcoRI/NarI provenant du phage mutant M13EcoRnar a été   cloné   en pUC8 au site   EcoRI/N-   arI en engendrant le plasmide pNSIEN. 



   Deux 42-mer oligonucléotides ont été synthétisé ayant la séquence, avec des sites de restriction comme indiqué, ci-après :   Narl 9 ? 13 Extrémité 3'Ndel  
5'-CGCCGTACAAGAAGTCTGACTTTTAGATTTTTATCTGCAGCA-3'
3'-GGCATGTTCTTCAGACTGAAAATCTAAAAATAGACGTCGTAT-5'
PstI 
Dans cet oligonucléotide, le codon de terminaison (TAG) est suivi immédiatement par un agent de terminaison de transcription précoce de la vaccine (ATTTTTAT). Le fragment d'ADN double brin obtenu par traitement de réforme (annea- 

 <Desc/Clms Page number 31> 

 ling) de la paire de   42-mers   contient une extrémité cohesive NarI, suivie par l'extrémité 3'de la séquence de codage pour le gène de EHV-1   gpl3,   aussi bien qu'un signal de terminaison de transcription précoce de la vaccine (45), un site PstI et une extrémité cohesive NdeI.

   Ce fragment a été inséré entre les sites NarI/NdeI de pNSIEN, en engendrant pNSIENPN (Figure 3). 



   Le fragment de NsiI/PstI de pNSIENPN a été isolé et   cloné   aux sites NsiI/PstI du plasmide pNSI, en engendrant le plasmide   pVHA6gl3NsiI   (Figure 3).   pVHA6crl3NsiI   a été coupé au site EcoRV dans le promoteur HG et le site NsiI qui a été introduit au voisinage du commencement du gène de   EHV-1   gpl3. 



  Ce fragment de vecteur comportait une extrémité franche avec la nucléase de fève de   Kung   (Mung bean). Deux 32-mer oligonucléotides complémentaires ont été synthétisés ayant la séquence, avec le site de restriction comme indiqué, ciaprès : 
EcoRV 
 EMI31.1 
 5'-ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAS.

   TGTGGTTGCC-3' 31¯TAGGCAATTCCATAGCATTACACCAACGG-51 
H6 promoteur gpl3 extrémité 5'
Ces oligonucléotides ont été traités pour réforme (annealing) et liés dans le fragment de vecteur   pVHA6gl3NsiI,   en produisant le plasmide   pVHA6gl3,   qui contient une jonction précise au codon d'initiation ou d'amorçage ATG (souligné 
 EMI31.2 
 dans la séquence du 32-mer) du promoteur II6 et du gène de EHV-1 gpl3. pVHA6gl3 a été transfecté en des cellules infectées par vP425 pour engendrer un recombinant de la vaccine, vP483, contenant le gène de   EHV-1   gpl3 (Figure 3). 



  Construction formation de recombinants du virus de la vaccine
Les procédés de transfection des plasmides donneurs recombinants dans des cellules de culture de tissu infectés 

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 avec un virus de la vaccine de sauvetage et d'identification de recombinants par hybridation in situ sur des filtres de nitrocellulose ont été effectués comme décrit précédemment (25,28). Pour construire vP425 dans lequel le gène E. Coli de béta-galactosidase remplace les séquences de codage HA de la vaccine,   l'ADN   du plasmide [25ug de pSD466VCBGA dans HeBS (16)] a été   électroporé   (BioRad Gene Pulser, capacitance de 960,200 volts) dans des cellules de VERO. Des monocouches subconfluentes de cellules ont été infectées à 10 pfu par cellule avec vP410 une heure avant l'utilisation.

   Les cellules infectées ont été collectées avec de la trypsine et lavées avec HeBS avant électroporation. Les cellules ont été soumises à une incubation dans MEM + 5 % de sérum foetal bovin à   370C   pendant 24 heures, récoltées, et le virus constituant la progéniture plaqué sur des monocouches de VERO. Le virus recombinant exprimant la beta-galactosidase a été détecté sous forme de plaques bleues en présence du substrat X-gal (9,24). Pour engendrer le virus recombinant de la vaccine dans lequel le gène de   EHV-1   gpl3 remplaçait le gène de béta-galactosidase dans vP425, on a suivi un protocole similaire excepté que le plasmide donneur   était pvhA6g13   et le virus de sauvetage vP425.

   Le recombinant de la vaccine vP483, contenant   EHV-1   gpl3 a été détecté en tant que plaque incolore en présence de   X-gal   et confirmé en tant que recombinant véritable par hybridation d'ADN après trois cycles de purification sur plaque. 



   Expression du   gène   de EHV-1 ap13 sur la surface de cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP483
Des cellules de BSC-40 ont été ensemencées sur des plaquettes en verre de 22 mm dans des boîtes de 35 mm à 5 X 105 cellules par boîte. Avec une confluence d'environ 80 %, les cellules ont été infectées à 2 pfu par cellule. Après une période d'adsorption d'une heure, l'inoculum de virus a été enlevé et on a ajouté MEM plus 2 % de sérum foetal bovin. 20 

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 heures après l'infection, les plaquettes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,2 % de BSA et 0,1 % de NaN3 (PBS+) et exposées à 0,1 ml d'anticorps monoclonal   anti-gpl3,   14H7 (3) dilué à   li/,,.,   dans pBS+.

   Après 1 heure dans une chambre humidifiée à la température ambiante, les cellules ont été lavées trois fois dans du PBS+. Ce procédé a été répété avec IgG caprin anti-souris de l'isothiocyanate de fluoresceine. Finalement, les cellules ont été fixées pendant 20 minutes dans la formaldéhyde à 2 % dans PBS. Les plaquettes ont été montées dans du glycérol à 20 % dans PBS contenant 3 % de n-propul gallate et on a observé la fluorescence au moyen d'un microscope. 



   La protéine prédite d'après la séquence d'ADN présente les traits typiques caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane (14). Dans une infection productrice de   EHV-1,   cette glycoprotéine gpl3 est incorporée dans différents systèmes de membrane de la cellule et elle est transportée dans la membrane cytoplasmique et est détectable sur la surface externe de la cellule infectée.   EHV-1   gpl3 est additionnellement un composant du virion de EHV-1. C'est pourquoi des études d'immunofluorescence ont   été réalisées   pour déterminer si EHV-1   gpl3,   exprimé par le virus recombinant de la vaccine, vP483, est de manière similaire présent sur la membrane cytoplasmique des cellules infectées.

   L'anticorps monoclonal spécifique anti-gpl3 suivi par l'IgG anti-souris caprin conjugué à la fluoresceine a révélé une immunofluorescence forte de la membrane dans les cellules infectées par vP483 mais non pas dans les cellules infectées 
 EMI33.1 
 par le virus de la vaccine vP410. Ceci suggère que la EHV-1 gpl3 exprimé par le virus recombinant de la vaccine vP483 est présente sur la membrane cytoplasmique comme attendu pour la synthèse authentique de la glycoprotéine enjambant la membrane. 



   Immunoprécipitation des produits de EHV-1   qp13   synthétisés à partir de cellules infectées par le 

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 virus recombinant de la vaccine vP483
Deux millions de cellules formant une monocouche confluente dans une boîte de 60 mm ont été infectées au taux de 10 pfu par cellule. L'inoculation a été réalisée dans un milieu exempt de méthionine. Après la période d'adsorption, l'inoculum a été enlevé et on ajouté 2 ml de milieu exempt de méthionine contenant 20   p.   Ci/ml de 35S-méthionine ajoutés. On a laissé se poursuivre l'infection pendant 24 heures et alors les cellules ont été lysées par l'addition de 1 ml de 3x tampon A contenant 3 % de NP-40,30 mM Tris pH 7,4, 450 mL NaCl, 3 mM EDTA, 0,03 % d'azide de sodium et 0,6 mg/ml de PMSF.

   Les cellules lysées et le produit surnageant ont été récoltés, soumis à un vortex et clarifiés par centrifugation à 10 000 g pendant 15 minutes. 



   On a préparé la protéine A-Sépharose CL-4B (Pharmacia, Cat. nO 17.0780. 01) en tant qu'un coulis 1 : 1 dans le   lx   tampon A. Un conjugué de rat anti-souris (Boehringer Mannheim, Cat. nO 605.500) a été dilué au centième dans le coulis et lié à des perles à la température ambiante pendant 4 heures avec balancement. Les perles ont été ensuite lavées complètement avec six lavements de 1 ml dans le tampon A pour éliminer le conjugué non lié. On a ensuite lié aux perles un anticorps monoclonal spécifique à gpl3, à température ambiante, pendant 4 heures. L'anticorps en excès a été éliminé par lavage poussé. 1 ml de lysat de cellules infectées, clarifié, a été préclarifié par incubation avec des perles ou billes de protéine A-Sepharose auquel du sérum de souris normal a été lié.

   Ces perles ont été éliminées par centrifugation. 1 ml du lysat préclarifié, clarifié, a été ensuite mélangé à   100 gel   des perles auquel a été lié l'anticorps monoclonal spécifique. Ce mélange a été oscillé à température ambiante pendant 4 heures. Les perles ont été éliminées par centrifugation et lavées complètement par 4 lavages dans   lx   tampon A et deux lavages dans 10 mM Tris pH 7,4 contenant 0,2 M LiCl et d'urée 2M. Le complexe anticorps- 

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 antigène est ensuite éliminé des perles et rompu par l'addition de 50   ul   de 2 X solution de rupture Laemmli (60,195). On a ensuite fait bouillir l'échantillon pendant 5 minutes avant électrophorèse. 



   Deux produits d'approximativement 44 et 47 kDa sont détectables et ils sont quelque peu plus petits que le produit de traduction primaire prédit (51 kDa) et un produit plus grand d'approximativement 90 kDa qui est consistant avec une forme complètement glycosylatée du produit de gène de EHV-1 gpl3. Aucun polypeptide équivalent n'a été précipité à partir des cellules infectées du virus de la vaccine qui sont servi de contrôle. 



  Exemple 2-CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DE VIRUS DE LA
VACCINE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE   ap14   DU
VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN
Remplacement du   aène   M2L dans le virus de la vaccine par le gène d'E. Coli   beta-aalactosidase  
Pour insérer les séquences de codage de EHV-1 gpl4 dans un vecteur du virus de la vaccine, un virus recombinant de la vaccine, vP458, exprimant le gène   d'E.   Coli LacZ a été fabriqué. La substitution des séquences de codage de LacZ dans le virus recombinant, vP458, avec les séquences codant EHV-1 gpl4 permet un système de sélection par plaques bleues ou incolores afin d'identifier EHV-1 gpl4 contenant des virus recombinants (9,24) en présence de X-gal, un substrat de béta-galactosidase chromogénique.

   En outre, dans le but de construire des virus recombinants de la vaccine exprimant à la fois   EHV-1   gpl4 et EH-1   gpl3,   un locus d'insertion pour   EHV-1   gpl4 unique, à partir du locus supprimé de l'hémaglutinine, utilisé pour l'insertion de   EHV-1   gpl3 dans l'Exemple 1, a été préparé au locus M2L de HindIII M. La séquence de codage complète du gène de M2L dans le fragment de vaccine HindIII M a été éliminée et remplacée par le gène   d'E.   Coli LacZ codant la beta-galactosidase. Les étapes de clonage pour la construction de vp458 sont représentées schématiquement 

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 sur la Figure 4. 



   En se référant maintenant à la Figure 4, un cadre de lecture ouvert, lu de la droite vers la gauche par rapport au génome de la vaccine et codant une protéine putative de 220 acides aminés est logé entièrement à l'intérieur du fragment HindIII M de la souche Copenhague du virus de la vaccine à la gauche du site unique BalII. Conformément à la convention (31), ce gène, qui est situé immédiatement à droite de M1L (58) a été désigné M2L. Des études de suppression appliquées au génome de la vaccine   (nif)   s'étendant à gauche à partir du site unique BalII dans le fragment M de HindIII   (57)   indiquent que les séquences de codage de la vaccine contenues dans HindIII M à gauche du site   BALAI   ne sont pas essentielles pour la réplication du virus dans les cultures de tissu. 



   Pour faciliter l'utilisation de la région M2L en tant que endroit ou locus d'insertion pour des gènes étran-   gers,   un vecteur de plasmide, pMP409DVC, a été créé dans lequel toute la séquence de codage de M2L a été remplacée par un site BqlII comme suit. pSD409VC, qui consiste en un fragment de HindIII M de la vaccine de Copenhague clonée dans le site HindIII de pUC8, a été digéré avec   BamHI/BcrIII   et auto-lié, éliminant   ainsi l'extrémité   droite de HindIII M et détruisant le site   BqlII.   Le plasmide résultant pMP409BVC, a été linéarisé au moyen de SphI qui coupe à l'intérieur du cadre de lecture ouvert de M2L et a été soumis à une digestion par l'hexonucléase Bal-31 pendant 2 minutes.

   Une mutagénèse a été réalisée sur   l'ADN   résultant (19) en utilisant un 49 mer   (5'-TTTCTGTATATTTGCAACAATTTAGATCTTACTCAAAATATGTAACAAT-     3' ;   le site   BqlII   étant souligné) synthétique. Dans le plasmide ayant subi la mutagénèse, pMP409DVC, les séquences de codage de M2L ont été supprimées depuis la position +3 jusqu'à l'extrémité du cadre de lecture ouvert. Le G du codon d'amorçage ou d'initiation ATG a été changé en un C pour créer un site   BcrlII   unique (AGATCT) à la jonction de suppression. 

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   Un fragment   de BglII/BamHI partiel   de 3,2 kb contenant 3,1 kb du gène de béta-galactosidase   d'E.   Coli entre les sites BamHI, de pMC1871 (34) sous le contrôle transcriptionnel du promoteur tardif de 11 kDa de la vaccine de 0,1 kb a été   cloné   au site BalII unique de pMA409DVC. Un plasmide recombinant contenant la cassette de promoteur de 11 kDa/gène de beta-galactosidase dans l'orientation de la droite vers la gauche par rapport aux bras de vaccine de flanc et le génome a été désigné pMP409DVCBG.   pMP409DVCBG   a été utilisé comme plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de la vaccine de sauvetage, vP410, décrit dans l'Exemple 1.

   Le nouveau recombinant de la vaccine, désigné vP458, exprimant le gène de béta-galactosidase inséré dans le locus de suppression de M2L a été détecté en utilisant un substrat X-gal chromogénique (9,24) et purifié par clonage sur plaque répété. 



   Clonage du   aène   de EHV-1    < ? pl4  
En se référant maintenant à la Figure 5, la séquence de codage de EHV-1 gpl4 chevauche la jonction entre des fragments de restriction BamHI, a et i (3). Les fragments d'ADN de EHV-1, BamHI-a (21,3 kb) et i (7,1 kb (59) ont été isolés à partir de gels d'agarose. On a construit le plasmide pUC (BamHI-i) en insérant le fragment EHV-1 BamHI-i dans le plasmide pUC8 au site BamHI. Le fragment BamHI-i de EHV-1 a été digéré au moyen d'EcoRi et lié en dans le pUC8 digéré par EcoRI/BamHI. Le plasmide pUC   (BamHI-a/EcoRI)   contient une insertion de EHV-1 BamHI/EcoRI de 10 kb. En se basant sur les déterminations de dimensions de fragments rapportées (59), les séquences d'ADN dans cette insertion sont contiguës à celle du fragment de BamHi-i dans le génome de EHV-1. 



   Analyse de la séquence de nucléotides
L'analyse de la séquence de nucléotides a été obtenue en utilisant différents sous-clones à partir de plasmides de pUC   (BamHI-a/EcoRI)   et pUC   (BamHI-i).   La détermination de la séquence du plasmide pUC   fBamHI-a/EcoRI)   

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 a été commencée au site BamHI du fait que le gène de EhV-1 gpl4 enjambe la jonction   BamHI-a/i   (3). L'orientation du plasmide pUC   ( (BamHI-i)   a été déterminée par digestion au moyen d'enzyme de restriction.

   Etant donné que la terminaison de EHV-1 BamHI la plus voisine du site EcoRI dans   pUC (BamHI-   i) a été trouvée comme étant le site BamHi à la jonction   BamHI-a/i,   on a commencé la détermination de la séquence du fragment à partir de cette extrémité BamHI. 



   Les données de séquence pour les deux brins ont été obtenues comme décrit dans l'Exemple 1. La séquence de nucléotides du fragment de 3 351 bp contenant la séquence de codage de EHV-1 gp 14 est illustrée sur la Figure 6. La numérotation dans les marges de gauche et de droite concerne les séquences d'acides aminés et d'acides nucléiques, respectivement. Les boites CAT et TATA putatives sont soulignées. Les acides aminés dans la région de signal et enjambant la membrane sont également soulignés avec une flèche indiquant un site potentiel de coupure de peptide de signal. Les treize sites de glycosylation potentiels en utilisant la séquence de concensus (Asn-X-Ser/Thr) ont été indiqués par un astérisque. 



   L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert s'étendant à partir des positions de clunéotides 300 à 3 239 en lisant de la gauche vers la droite par 
 EMI38.1 
 rapport au génome de EHV-1, c'est-à-dire que le codon de départ ATG était contenu dans le fragment BamHI-a/EcoRI et le codon d'arrêt TAA était contenu dans le fragment BamHI-i (3,59). 



   Des signaux putatifs réglant la transcription ont été trouvés dans la région 5'du codon d'initiation ATG en position 300. Une boîte TATA ayant la séquence AAATATAT (nucléotides 148 à 155) a été localisé 70 nucléotides en aval d'une boîte CAT putative aux positions 71 à 77 ayant la séquence GGTCAAT. Un signal de polyadénylation AATAAA (nucléotides 3251 à 3256) a été localisé 8 nucléotides en 

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 aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 3240 à 3242). 



  Neuf des onze nucléotides dans la séquence 5'-TCCTGCGCGCA-3' (nucléotides 218 à 228) sont complémentaires de la séquence d'ARN ribosomal   (18S)   à savoir 3'AGGAZGGCGT-5' (61) et peuvent servir comme site de liaison du ribosome. 



   Analyse de la structure de EHV-1 crpl4
Le cadre de lecture ouvert de EHV-1 gpl4 code 980 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 109,8 kDa. L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 58 à 69 a un profil   d'hydrophobicité   caractéristique et on l'a propose comme étant la séquence de signal (Figure 6). Une caractéristique inhabituelle du produit de gène de   EHV-1   gpl4 est que la longue séquence de signal hydrophobe est précédée par une longue séquence hydrophyle.

   Cette caractéristique a également été notée pour les gènes du virus de la pseudo-rage (PRV) gII 
 EMI39.1 
 (62) et pour le virus de l'herpès bovin 1 (BHV-1) gI (63) ces deux gènes étant également des homologues de HSV gB. Une région hydrophobe constituée par 45 acides aminés (acides aminés 826 à 870) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Le domaine cytoplasmique hydrophile contient 110 acides aminés. 



   Il existe onze sites Asn-X-Thr/Ser (X pouvant être tout acide aminé exepté la proline) pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote (64). Une caractéristique inhabituelle est constituée par le fait qu'il y a également deux sites potentiels de glycosylation dans le domaine cytoplasmique (Figure 6). 



   Une représentation d'hydrophilicité de la séquence 
 EMI39.2 
 de codage de EHV-1 gpl4 est illustrée sur la Figure 7. L'index hydropathique de EHV-1 gpl4 est calculé par la méthode de Kyte et Doolittle (65) avec une fenêtre de sept acides aminés et pas de lissage. Les points sous la ligne horizontale représentent des zones   d'hydrophobicité   plus 

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 élevée ce qui indique donc des régions de signal potentiel et/ou d'enjambement de membrane. Les caractéristiques de glycoprotéines qui enjambent la membrane comprennent des éléments de signal et d'ancrage et la longue région hydrophile qui précède la séquence de signal sont trouvées pour la séquence de codage de EHV-1 gpl4. 



   Localisation du déterminant   antiaènique   reconnu par l'anticorps monoclonal   anti-EHV-l     ap14,   à savoir 3F6
Les vecteurs d'expression de lambda gtll et les anticorps monoclonaux ont été utilisés pour identifier les séquences d'ADN de   EHV-1   codant les principales glycoprotéines de EHV-1 (3). Un recombinant lambda gtll, à savoir 4 à 1 a montré qu'il exprimait   l'épitope   de EHV-1 gpl4 reconnu par l'anticorps monoclonal spécifique 3F6 (3). En vue de déterminer l'identité de cet épitope,   l'ADN   de EHV-1 contenu à 
 EMI40.1 
 l'intérieur de 4 à 1 a été séquencé et comparé avec la séquence d'ADN de la séquence de codage de EHV-1 gpl4 (Figure 6).

   Pour séquencer le fragment d'ADN correspondant à l'épitope de   EHV-1   gpl4 dans le recombinant lambda gtll, à savoir 4 à 1 reconnu par l'agent monoclonal anti-EHV-1 gpl4, à savoir 3F6 (3), on a digéré 4 à 1 avec EcoRI, le fragment de EHV-1 a été isolé sur des gels d'agarose et lié au site EcoRi de pUC8. Le   séquençage   d'ADN a été réalisé comme décrit cidessus avec les promoteurs avant et arrière universels M13. 



   L'alignement de la séquence de nucléotides à indiqué que cet épitope était contenu dans la région des 66 acides aminés correspondant à 107 (Thr) à 172 (Val) du produit de traduction primaire déduit. L'épitope est donc localisé à l'intérieur de la région amino-terminale du domaine de surface déduit de EHV-1 gpl4. 



   Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1   cr14   avec d'autres   glycloprotéines   du virus de l'herpès
La comparaison de la composition des acides aminés du gène de EHV-1 gpl4 a révélé une homologie étendue avec les 

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 glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, EHV-l. gpl4 est homologue à gII de PRV (62),   gI   de BHV-1 (63), gII du virus de la varicelle-zoster (VZV) (66), gB du virus de l'herpès simplex (HSV) (67,71, 72), aussi bien qu'à des glycoprotéines du virus d'Epstein-Barr (EBV) et du cytomégalovirus humain (HCMV) (10). 



   Mutagénèse   dirigée   car les   oliqonucléotides   de la terminaison   5'de   la séquence de codage de EHV-1   crid 14  
En se référant maintenant de nouveau à la Figure 5, le plasmide bleu   (KpniI/BamHI)   a été engendré en insérant un fragment de   KpnI/BamHi   provenant de pUC   (BamHI-a/EcoRI)   dans la transcription du plasmide Bluescript SK+ digéré par   KDnI/   BamHI. La mutagénèse dirigée par les oligonucléotides a été réalisée par une modification du procédé de Kunkel (17) en utilisant des modèles d'ADN contenant de l'uracile à partir du plasmide bleu   (KpnI/BamHI)   produit chez l'hote "dut ung" E. Coli souche CJ236.

   Dans le plasmide mutagéné, on a créé un site NsiI aux codons 1 et 2 du gène de EHV-1 gpl4 en changeant la séquence   ATG/TCC   (Met/Ser) en ATG/CAT   (Met/His).   La séquence ayant subi la mutation a été vérifiée par analyse de la séquence d'ADN. Le fragment KnpI/BamHI du mutant a été transféré au pUC18 digéré   par KpnI/BamHI   en engendrant le plasmide   (KpnI/BamHI).   



   Un plasmide, à savoir   pUCgl4,   contenant le gène complet de EHV-1 gpl4 avec la mutation de site NsiI a été construit en insérant le fragment   EcoRI/BamHI   à partir de pUC 
 EMI41.1 
 (Kpn. I/BamHI) en pUC (BamHI/PstI) digéré par EcoRI/BamHI, un (KnnI/BamH !) en pUC (jàariH !/ sous-clone de 3,9 kb de pUC (BamHI-i). 



   Construction de plasmide donneur chimère   pVM2LH6q14   pMP409DVC a été coupé au moyen de BalII et lié avec de l'ADN double brin synthétique contenant le promoteur (précoce/tardif) H6 de la vaccine modifié, décrit dans l'Exempple I, flanqué par des sites de restriction. Les sites de restriction pour NsiI, SacI, PstI et EcoRI ont été créé 

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 immédiatement en aval du codon d'initiation endogène dans le promoteur H6. Dans pMGl1, la séquence de polyliaison en aval du promoteur H6 est ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. Le site unique NsiI contenant le codon d'initiation H6 (souligné) est immédiatement suivi par les sites uniques SacI, PstI et EcoRI. 



   Le fragment d'ADN EcoRI/NsiI de   pUCgl4   contenant la région d'ADN de EHV-1 en amont du codon d'initiation de EHV- 1 gpl4 a été remplacé par le fragment EcoRI/NsiI à partir du plasmide pMGll, en engendrant ainsi le plasmide   pMRHgl4   qui contient le bras droit de HINDIII M de la vaccine, le 
 EMI42.1 
 promoteur H6 et toute la longueur du gène de EHV-1 gpl4.

   Le fragment HpaI/PstI contenant EHV-1 gpl4 en provenance du plasmide pMRHgl4 a été transféré au plasmide vecteur pMGll - coupé au moyen de   HpaI/PstI   en créant le plasmide   pVM2LH6gl4.   pVM2LH6gl4 contient la totalité de la séquence de codage de 
 EMI42.2 
 EHV-1 gpl4 (avec le codon 2 changé de TCC (Ser) en CAT (His) comme indiqué et approximativement 1, 2 kb d'ADN de EHV-1 en aval du gène de EHV-1   gpl4)   sous le contrôle du promoteur H6, inséré dans une orientation de la droite vers la gauche par rapport aux séquences flanquantes de vaccine par rapport au génome de vaccine dirigeant au but l'insertion du gène de EHV-1 gpl4 au locus M2L. 



   On a réalisé la recombinaison en utilisant vP458 comme virus de sauvetage et pVM2LH6gl4 comme plasmide donneur. Des plaques incolores ont été prélevées et analysées 
 EMI42.3 
 pour la présence de séquences de codage de EHV-1 gpl4 en utilisant une sonde spécifique de EHV-1 gpl4 marquée au moyen de 32p. Après clonage sur plaque répété, le recombinant de la vaccine a été désigné vP577. 



  Troncature des séquences leader   hydrophilique   de EHV-1   qpl4  
En utilisant des variantes des manipulations de mutagénèse et de clonage décrites ci-dessus, on a construit un plasmide donneur chimère pVM2LH6gl4-1. Pour créer   pVM2LH6-   gl4. 1, qui contient une suppression des codons 2 à 34 de EHV- 

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 1 gpl4 avec la substitution de 4 codons, on a réalisé une mutagénèse in vitro (17) sur le plasmide bleu (KpnI/BamHI) en créant un   site NsiI   aux codons 32 à 36 plutôt qu'aux codons 1 et 2. Le fragment NsiI/BamHI à partir du plasmide bleu   (KpnI/BamHI)   nouvellement mutagéné a été substitué au fragment   NsiI/BamHI   dans pVM2LH6gl4.

   Des agents de liaison NsiI multiples (New England BioLabs, Beverly, MA) ont été liés dans le site NsiI pour amener   l'ATG   initial dans le cadre du restant de la séquence de codage de EHV-1 gpl4. Le 
 EMI43.1 
 plasmide final pVM2LH6gl4-l contient la séquence ATG/CAT/ GCA/TGC/ATT/GCT.... qui code Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala... où GCT (Ala) est le codon 35 de EHV-1   gpl4.   Le restant de pVM2LH6gl4. 1 est identique à celui dans pVM2LH6gl4. 



   La vaccine recombinante vP613 a été obtenue par recombinaison avec le virus de sauvetage vP458 et le plasmide donneur   pVM2LH6g14-1.   
 EMI43.2 
 



  Exemple 3-CONSTRUCTION DE VIRUS RECOMBINANTS DE LA VACCINE vP633 et vP634 EXPRIMANT CHACUNE DES GLYCOPROTEINES aD13 et qu14 DU VIRUS DE 
L'HERPES CHEVALIN
En vue de construire des recombinants de vaccine exprimant à la fois des glycoprotéines gpl3 et gpl4 de EHV- 1, on a réalisé la recombinaison avec soit vP577 soit vP613 comme virus de sauvetage et le plasmide donneur pVHA6gl3 (décrit dans l'Exemple 1) qui contient le gène de   EHV-1   gpl3 sous le contrôle du promoteur H6 de LA vaccine inséré au locus de suppression HA de la vaccine. L'insertion des séquences de EHV-1 gpl3 dans des virus recombinants a été identifiée par hybridation   d'ADN   in situ (25,28).

   La recombinaison de   pVHA6gl3   avec le recombinant vP577 du virus de la vaccine (contenant   EHV-1   gpl4 de longueur complète) a engendré le double virus recombinant de la vaccine vP633 ; la recombinaison avec vP613 (contenant   EHV-1   gpl4 tronqué) a engendré le recombinant vP634 double de la vaccine. Les recombinants doubles du virus de la vaccine vP633 et vP634 

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 ont été clones sur plaques et la présence simultanée des séquences de   EHV-1   gpl3 et gpl4 a été confirmée par analyse d'hybridation d'ADN et par des essais d'expression (voir cidessous). 



   Immunoprécipitation des   glycoprotéines     sol3   et   ap14   de EHV-1 exprimées dans les virus recombinants de la vaccine 
 EMI44.1 
 En vue d'établir les glycoprotéines gpl3 et gpl4 de EHV-1 exprimées par les virus recombinants de la vaccine, on a infecté des cellules de VERO avec les recombinants et on a marqué métaboliquement les protéines au moyen de   S-méthio-   nine et on a réalisé une immuno-précipitation comme décrit dans l'Exemple 1. L'anticorps monoclonal spécifique vis-à- 
 EMI44.2 
 vis de EHV-1 gpl3 (14H7) ou EHV-1 gpl4 (3F6) (3) a été lié dans une dilution à l /oo pendant 4 heures à la température ambiante.

   On a analysé des exemples au moyen d'électrophorèse par gel de SDS polyacrylamide sur un gel polymère à 10 % à 30mA (courant d'intensité constante) pendant approximativement 6 heures. On a préparé des autoradiogrammes. 



   On n'a pas immuno-précipité de produit significatif par le produit monoclonal spécifique   anti-EHV-l     gpl3,   désigné 14H7 (3) ou par l'agent monoclonal spécifique   anti-EHV-l   gpl4 désigné 3F6 (3) ni des cellules de VERO non infectées, ni des cellules de VERO infectées au moyen du virus de la vaccine d'hémaglutinine minus de contrôle, à savoir vP452 (184). Les produits marqués radioactivement de EHV-1 gpl3 ont été précipités par le produit monoclonal 14H7 des cellules de VERO infectées au moyen de vP483, une vaccine recombinante exprimant seulement le EHV-1   gpl3,   ou les recombinants 
 EMI44.3 
 doubles du virus de la vaccine exprimant à la fois EHV-1 gpl3 avec soit du gpl4 intact, à savoir vP633, soit du gpl4 tronqué, à savoir vP634.

   Il existe deux produits d'approximativement 44 et 47 kDa détectables qui sont quelque peu plus petits que le produit de traduction primaire prédit (de 51 kDa) et un produit plus grand d'approximativement 90 kDa, ce 

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 qui est consistant avec une forme complètement glycosylatée du produit de gène de   EHV-1   gpl3. D'une manière significative, la qualité et la quantité de l'expression de   EHV-1   gpl3 n'est pas affectée par la co-expression de l'une ou l'autre forme de EHV-1 gpl4 dans les recombinants doubles de la vaccine vP633 et vP634. 



   Des cellules de VERO ont été infectées au moyen de vP633, vP634, vP613 et vP577, respectivement, et ont subi une immuno-précipitation par le produit monoclonal 3F6 spécifi- 
 EMI45.1 
 quement anti-EHV-1 gpl4 (3). Avec vP633 (contenant gpl4 de longueur complète + gpl3) et avec vP577 (contenant gpl4 de longueur complète), on a observé des bandes principales à environ 34,47, 60-64 et 90 kDa ; alors qu'avec vP634 (contenant gpl4 tronqué +   gpl3)   et avec vP613 (contenant gpl4 tronqué), on a observé des bandes principales à 34,47, 57, 72-82 et 116 kDa. Une fois encore, on n'a pas observé de 
 EMI45.2 
 différence significative dans la synthèse de EHV-1 gpl4 de l'une ou l'autre des formes pendant la co-expression avec EHV-1 gpl3. 



   Analyse car immuno-fluorescence des produits de EHV-
1   qp13   et   qD14   synthétisés par des virus recombi- nants de la vaccine
L'immunofluorescence de cellules de VERO infectées par le virus recombinant de la vaccine a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant l'anticorps monoclonal spécifique soit de   EHV-1   gpl3 soit gpl4. 



   EHV-1 gpl3 était facilement détectable sur la surface des cellules de VERO infectées avec les recombinants de la vaccine vP483, vP633 et vP634 aussi bien qu'intérieurement après fixation au moyen d'acétone. Aucune immunoréactivité significative interne ou de surface vis-à-vis de l'anticorps gpl3-spécifique n'a été observée dans les cellules infectées par   vP410,   vP577 ou vP613. L'expression de   EHV-1   gpl4 a été facilement détectable dans des cellules de VERO fixées à l'acétone infectées avec des recombinants de la 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 vaccine vP577, vP613, vP633 et vP634. Aucune immuno-fluorescence interne significative vis-à-vis de l'anticorps gpl4 spécifique n'a été observée dans les cellules infectées par vP410 ou vP483.

   En utilisant un anticorps monoclonal spécifique vis-à-vis de gP14, à savoir 3F6, on a observé une faible immuno-fluorescence de surface dans les cellules infectées 
 EMI46.1 
 par vP613 ou vP634 qui expriment la forme tronquée de EHV-1 gpl4 et aucune réponse de surface significative au-dessus des virus de contrôle vP410 et vP483 n'a été obtenue avec les virus recombinants de la vaccine vP577 et vP633 qui expriment le gène   EHV-1   gpl4 de longueur complète (voir également l'Exemple 8). 



    Exemple 4-IMMUNISATION   DE COCHONS D'INDE   (COBAYES ! AU  
MOYEN DE VACCINE RECOMBINANTE vP483
En vue de déterminer l'immunogénécité du produit de gène du virus de l'herpès chevalin gpl3 exprimé par la vaccine recombinante vP483, on a inoculé des cochons d'Inde au moyen du virus et la présence d'anticorps neutralisant du sérum actif contre le virus de la vaccine et le virus de l'herpès chevalin a été testée. 



   Quinze cochons d'Inde (cobayes) pesant environ 450 grammes ont été divisés en groupes de cinq. Un groupe a reçu 1 ml de la vaccine recombinante   (lOTGIDo/ml)   au jour 0 suivi par une dose de rappel de 1 ml au jour 21 par inoculation sous-cutanée. Le second groupe a reçu des inoculations similaires mais avec la vaccine vP452 (108TCID50/ml). Le troisième groupe n'a pas été vacciné. Tous les cobayes ont été saignés avant la vaccination primaire et aux jours 21 et 35. Des sérums ont été préparés et essayés pour déterminer la présence d'anticorps neutralisants   vis-à-vis   à la fois de la vaccine et de EHV-1 (souche Kentucky) en utilisant 50   TCIDo   de virus essayé sur des cellules de testicules porcins. 



   Comme montré sur le Tableau I, la vaccine recombinante d'EHV-1 gpl3, à savoir vP483, provoque une séroconversion évidente chez les cochons   d'Inde.   Les titres de 

 <Desc/Clms Page number 47> 

 neutralisation du sérum obtenus avec le virus de la vaccine sont indiqués entre parenthèses dans le Tableau I. Les anticorps neutralisant le sérum à la fois de la vaccine et de EHV-1 sont détectables 21 jours après l'inoculation primaire et une augmentation significative du titre des anticorps neutralisant du sérum est obtenue deux semaines après une seconde inoculation du virus au jour 21.

   On doit noter que les titres de neutralisation de la vaccine du sérum obtenus chez les cochons d'Inde inoculés avec le virus recombinant exprimant EHV-1 gpl3 sont significativement plus élevés (t=7,2) que les titres obtenus à partir de cochons d'Indes ou cobayes inoculés avec le virus   vP452   de la vaccine. 

 <Desc/Clms Page number 48> 

 



  Anticorps neutralisant le sérum présent chez les cochons d'Inde inoculés soit avec la vaccine recombinante exprimant   EHV-1     QP13   ou un virus de la vaccine de contrôle vP452 
 EMI48.1 
 --------------------------------------------------------- 
 EMI48.2 
 
<tb> 
<tb> Titre <SEP> neutralisant <SEP> du <SEP> sérum <SEP> (loct,.

   <SEP> oj
<tb> sur <SEP> iours
<tb> Virus <SEP> d'inoculum <SEP> Animal <SEP> n'0 <SEP> 21 <SEP> 35
<tb> Animaux <SEP> de <SEP> 26 <SEP> 0,24 <SEP> (0, <SEP> 35)--0, <SEP> 24 <SEP> (0,70)
<tb> contrôle <SEP> 27 <SEP> 0,24 <SEP> (0, <SEP> 35)--0, <SEP> 56 <SEP> (1,05)
<tb> non <SEP> vaccinés <SEP> 28 <SEP> 0,24 <SEP> (0, <SEP> 35)--0, <SEP> 80 <SEP> (0,70)
<tb> 29 <SEP> 0,24 <SEP> (0, <SEP> 35)--0, <SEP> 40 <SEP> (0,70)
<tb> 30 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> -- <SEP> 0,32 <SEP> (0,35)
<tb> Virus <SEP> de <SEP> la <SEP> 191 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,36 <SEP> (0,47) <SEP> 0,72 <SEP> (1,75)
<tb> vaccine <SEP> de <SEP> 192 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,21 <SEP> (0,93) <SEP> 0,24 <SEP> (2,30)
<tb> contrôle <SEP> vP452 <SEP> 193 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,48 <SEP> (0, <SEP> 58)
<tb> 194 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,24 <SEP> (0,82) <SEP> 0,24 <SEP> (2,10)

  
<tb> 195 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> -- <SEP> -- <SEP> -- <SEP> -Virus <SEP> 186 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,48 <SEP> (1,28) <SEP> 1,20 <SEP> (2,57)
<tb> recombinant <SEP> de <SEP> 187 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,72 <SEP> (1,63) <SEP> 1,68 <SEP> (2,57)
<tb> la <SEP> vaccine <SEP> 188 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,24 <SEP> (1,52) <SEP> 1,68 <SEP> (2,57)
<tb> vP483 <SEP> 189 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,36 <SEP> (1,40) <SEP> 1,56 <SEP> (2,22)
<tb> 190 <SEP> 0,24 <SEP> (0,35) <SEP> 0,48 <SEP> (1,63) <SEP> 1,56 <SEP> (3,00)
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 49> 

 Exemple    5 - IMMUNISATION   DE COCHONS D'INDE AU MOYEN DE
VACCINE RECOMBINANTE vP577 et vP613
Des cochons d'Inde ont été immunisés pour évaluer leur réponse vis-à-vis de EHV-1 gpl4 exprimé par les vaccines recombinantes vP577 et vP613.

   Des cochons d'Inde pesant environ 450 grammes ont reçu 105 TCID50 de vaccine recombinante soit vP577, soit vP613 par la voie sous-cutanée, 1 ml les jours 0 et 21. Les cochons d'Inde ont été saignés aux jours 0,21 et 35, des sérums préparés et essayés au point de vue anticorps de   EHV-1.   Des essais de neutralisation ont été réalisés sur des cellules testiculaires porcines contre 50 TCID50 de virus EhN-l, souche Kentucky. Des anticorps de vaccine ont été titrés par ELISA en utilisant un conjugué de péroxydase anti-IgG (H & L). 



   Les résultats sont donnés dans le Tableau 2. On n'a pas obtenu d'activité de neutralisation du sérum contre EHV- 1 chez les cochons d'Inde immunisés avec la vaccine recombinante vP517, contenant le gène de   EHV-1   gpl4 de longueur complète (données non indiquées). D'un autre côté, des cochons d'Inde inoculés avec le virus recombinant de la vaccine vP613 exprimant un gène EHV-l gpl4 tronqué ont induit des niveaux similaires des anticorps de neutralisation du 
 EMI49.1 
 sérum EHV-1 (Tableau 2) que la vaccine recombinante vP483 exprimant EHV-1 gpl3 (Tableau 1). Bien que les anticorps de neutralisation du sérum EHV-1 sont détectables trois semaines après la vaccination primaire, un niveau plus significatif a été observé deux semaines après l'immunisation secondaire (Tableau 2).

   Dans tous les animaux immunisés, des réponses étaient obtenues lorsque les anticorps de la vaccine ont été testés par ELISA. 

 <Desc/Clms Page number 50> 

 



  Anticorps neutralisant le sérum présent dans les cochons d'Inde inoculés au moyen d'une vaccine recombinante exprimant eHV-l qpl4 
 EMI50.1 
 
<tb> 
<tb> Titre <SEP> de <SEP> neutralisation <SEP> du <SEP> sérum <SEP> (log10)
<tb> en <SEP> leurs
<tb> Virus <SEP> d'inoculum <SEP> 0 <SEP> 21 <SEP> 35
<tb> Virus <SEP> recombinant <SEP> 0,4 <SEP> 0,7 <SEP> 1,3
<tb> de <SEP> la <SEP> vaccine <SEP> vP613 <SEP> 0,2 <SEP> 0,7 <SEP> 1, <SEP> 2
<tb> 0,2 <SEP> 0,7 <SEP> 1, <SEP> 7
<tb> 0,2 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 6
<tb> 0,2 <SEP> 1,0 <SEP> 1,6
<tb> Animaux <SEP> de <SEP> controle <SEP> 0,2 <SEP> --- <SEP> 0,4
<tb> non <SEP> vaccinés <SEP> 0, <SEP> 6---0, <SEP> 4
<tb> 0, <SEP> 7---0, <SEP> 8
<tb> 0, <SEP> 6---0, <SEP> 2
<tb> 0,4 <SEP> --- <SEP> 0,

  4
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 51> 

 Exemple 6-PROTECTION DE   HAMSTERS   VACCINES CONTRE L'ATTA-
QUE PAR   EHV-1  
En vue d'établir l'efficacité de la vaccine recombinante vP483 exprimant   EhR-l     gpl3,   des hamsters ont reçu soit une vaccination primaire, soit une vaccination primaire suivie d'une vaccination de rappel et ils ont, en même temps qu'un groupe de contrôle non inoculé ou un groupe inoculé deux fois avec un virus de la vaccine de contrôle vP54, été soumis à une attaque inter-péritonéale avec une souche   Kentucky de EHV-1 adaptée   à l'hamster. 



   Quarante hamsters syriens (âgés de 40 jours et pesant entre 55 et 65 g) ont été séparés en quatre groupes. 



  Le groupe A a reçu une seule inoculation sous-cutanée (1 ml) soit de   1 (ls, 106 OU 104 TCID. 50   de la vaccine recombinante vP483, cinq animaux par dose. Le groupe B a été vacciné avec vP483 au jours 0 suivi par un rappel au jour 14. Les doses primaires et de rappel (1 ml) ont été administrées par voie sous-cutanée à des groupes de cinq animaux en utilisant 108, 106   ou 10" TCID50'Le groupe   C consistant en 5 hamsters a reçu deux injections sous-cutanées (108TCID50 par injection) aux jours 0 et 14 de vaccine vP452.5 hamsters du groupe D ont été laissés pour constituer des animaux de contrôle non vaccinés. Tous les hamsters ont reçu 200 LD50 d'une souche Kentucky, adaptée aux hamsters, de EHV-1 par la voie interpéritonéale 14 jours après la dernière immunisation.

   Les survivants ont été comptés 7 jours après l'attaque. 



   Les résultats sont montrés dans le Tableau 3. Tous les hamsters non vaccinés et les hamsters vaccinés par le virus vP452 de la vaccine sont morts dans les 5 jours de l'attaque. 



   Des niveaux significatifs de protection contre l'attaque par EHV-l ont été observés chez des hamsters vaccinés avec la vaccine recombinante vP483 exprimant EHV-1   gpl3.   Aucune différence significative dans les niveaux de protection n'a été observée chez des hamsters immunisés au 

 <Desc/Clms Page number 52> 

 moyen de doses soit primaires soit primaires et de rappel. La dose protectrice   (PD5o)   était similaire   PD.     = 6, 32 logo   primaire et 6,12   logio   primaire plus le rappel. Cependant une protection de 100 % n'a été observée que dans le groupe recevant deux doses de 108 TCID50 de virus recombinant. 

 <Desc/Clms Page number 53> 

 



  Tableau 3 Protection des hamsters vaccinés au moyen de la vaccine 
 EMI53.1 
 recombinante exprimant EHV-1 < ? pl3 contre l'attaque par EHV- 1 
 EMI53.2 
 
<tb> 
<tb> Virus <SEP> de <SEP> vaccination
<tb> Vaccine <SEP> recombinante <SEP> Vaccine <SEP> de <SEP> Pas
<tb> contrôle <SEP> de
<tb> vp452 <SEP> virus
<tb> Primaire <SEP> Rappel <SEP> Rappel
<tb> Dose <SEP> de <SEP> vaccin <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> 8
<tb> Log10 <SEP> TCID50
<tb> Proportion <SEP> de <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> survivants <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 54> 

 
En vue de déterminer l'efficacité protectrice d'un virus recombinant de la vaccine exprimant EHV-1 gpl4 seul ou en combinaison avec EHV-1   gpl3,

     des études d'attaque ont été réalisées sur des hamsters vaccinés. 20 hamsters syriens âgés de 21 jours, pesant environ 60 g chacun ont été inoculés par voie sous-cutanée par 1 ml de virus de la vaccine de contrôle ou avec les virus recombinants de la vaccine vP483, vp577, 
 EMI54.1 
 vP613, vP633 et vP634 exprimant EHV-l gpl3 et/ou gpl4. La vaccination primaire a été suivie par une dose de vaccination identique [pfu/ml   (10go   au jour 14. Tous les hamsters, y compris les animaux de contrôle non inoculés, ont été soumis 14 jours après la dernière immunisation à une injection interpéritonéale de 200 LDso de la souche Kentucky adaptée au hamster de   EHV-1.   Les survivants des groupes de 5 ont été calculés 14 jours après l'attaque au moment où l'expérience a été terminée.

   La dose d'inoculum donnant une protection de 50 % des hamsters est évaluée en tant que loglo   TCIDo/l   d'inoculant. 



   Comme montré sur le Tableau 4, le virus recombinant de la vaccine vP577 exprimant le gène   EHV-l   gpl4 de longueur complète n'a pas protégé les hamsters contre l'attaque par une dose de PD50 calculée   k   9,0   lOg10'D'un   autre côté, le gène EHV-1 gpl4 tronqué, tel qu'exprimé par la vaccine recombinante vP613, a donné une bonne protection en réponse à l'attaque (Tableau 4). Le   PDo   calculé est quelque peu meilleur (5,2) que celui obtenu avec la vaccine recombinante 
 EMI54.2 
 exprimant EHV-1 gpl3, à savoir vP483 (6, 1).

   D'une manière surprenante, la co-expression de EHV-l gpl3 et gpl4, que ce soit pour le gène gpl4 de longueur complète ou le gène gpl4 tronqué dans les virus recombinants de la vaccine vP633 et vP634, respectivement, ont fourni une efficacité protectrice notablement améliorée comparée à l'efficacité pour les glycoprotéines   d'EHV-l   exprimées séparément. Par conséquent, la quantité d'inoculum de virus pour obtenir une protection à 50 % des hamsters vaccinés a diminué d'une manière signifi- 

 <Desc/Clms Page number 55> 

 cative lorsque EHV-l gpl3 et gpl4 ont été coexprimés dans le même virus recombinant de la vaccine. 



  Tableau 4 Protection des hamsters vaccinés avec des recombinants de la vaccine, exprimant EHV-1   anal3   et/ou gp14 contre l'attaaue car   EHV-1   
 EMI55.1 
 
<tb> 
<tb> Inoculum <SEP> Protéine <SEP> de <SEP> EHV-1 <SEP> Dose <SEP> de <SEP> vaccin/ <SEP> PD50
<tb> Survivants
<tb> vP483 <SEP> gp13 <SEP> 8/5 <SEP> 6/2 <SEP> 4/0 <SEP> 6,1
<tb> Aucum <SEP> --- <SEP> 0/0 <SEP> --- <SEP> --- <SEP> --vP577 <SEP> gp14 <SEP> 8/1 <SEP> 6/0 <SEP> 4/0 <SEP> #9,0
<tb> Aucun <SEP> --- <SEP> 0/0 <SEP> --- <SEP> --- <SEP> --vP613 <SEP> gp14* <SEP> 8,4/5 <SEP> 6,4/5 <SEP> 4,4/1 <SEP> 5,2
<tb> vP633 <SEP> gp13 <SEP> + <SEP> gp14 <SEP> 8/5 <SEP> 6/3 <SEP> 4/4 <SEP> 4,3
<tb> vP634 <SEP> gp13 <SEP> + <SEP> gp14 <SEP> 7,6/5 <SEP> 5,6/5 <SEP> 3,6/5 <SEP> #3,6
<tb> Vaccin <SEP> --- <SEP> 8/0 <SEP> --- <SEP> --- <SEP> #9,

  0
<tb> Aucun <SEP> --- <SEP> 0/1 <SEP> --- <SEP> --- <SEP> ---
<tb> 
 
 EMI55.2 
 *vP613 et vP634 expriment la version tronquée de EHV-1 gpl4. 

 <Desc/Clms Page number 56> 

 



  Exemple 7-CONSTRUCTION DE RECOMBINANTS DE POXVIRUS
AVIAIRE EXPRIMANT LA GLYCOPROTEINE   opl3   DU
VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN
En se référant maintenant à la Figure 8, on a utilisé pVHA6G13 comme source de gène de EHV-1   gpl3.   Pour isoler le fragment d'ADN contenant tout le gène de EHV-1   gpl3,   on a digéré pVHA6gl3 par NruI et HindIII. Un fragment d'approximativement 1, 8 Kb contenant 28 bp de l'extrémité 3' du promoteur H6 du virus de la vaccine, la totalité du gène   Ehv-l gp13,   et approximativement 410 bp de séquences du virus de la vaccine ont été engendrés par cette digestion. Le fragment de 1,8 Kb NruI/HindIII a été isolé par insertion dans les vecteurs d'insertion de poxvirus aviaire pFPCV2 et   pCPCVl.   



   Le vecteur pFPCV2 d'insertion du poxvirus des volailles (FP) fournit un véhicule pour engendrer des recombinants qui abritent des gènes étrangers dans une région non essentielle du génome de FP qui désignait le locus F7. pFPCV2 a été dérivé de   pRW731.   13. Le plasmide pRW731.13 contient un fragment PvuII génomique de FP d'approximativement 5,5 Kb inséré entre les deux sites PvuII   de'pUC9.   



  Initialement, une séquence de clonage multiple (MCS) a été liée au site d'insertion unique HincII dans le fragment génomique PvuII de FP de 5,5 Kb. Le MCS a été dérivé par traitement de réforme des oligonucléotides CE4 (5'-TCGC GAGAATTCGAGCTCGGTACCGGGGATCCTCTGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGTT 63') et CE5 (5')AACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTAGAGGATCCCCGGTACCGAGCTCGAATTCTCGCGA-3'). Le plasmide contenant le MCS a été désigné pCEll.   pFeLV1A   est un dérivé du vecteur d'insertion de vaccine   pTP15   (184) (Figure 3) dans lequel le gène du virus de la leucose féline (FeLV) env (192) est inséré dans le site PstI en aval du promoteur H6.

   Pour transférer la cassette d'expression de 2,4 kb à un vecteur FP (Figure 8), les séquences de H6/FeLV env ont été excisées de   pPeLV1A   par 

 <Desc/Clms Page number 57> 

 digestion avec   BcflII   et digestion partielle avec PstI. Le site   BolII   se trouve à la limite   5'de   la séquence du promoteur H6. Le site PstI est situé 420 bp en aval du signal de terminaison de traduction pour le cadre de lecture ouverte de la glycoprotéine d'enveloppe de FeLV. 



   La séquence H6/FeLV env de 2,4 Kb a été insérée dans pCEll digéré par BamHI et PstI. Ce plasmide a été désigné pFeLVFl. Le plasmide pFeLVFl a été ensuite digéré par PstI pour enlever les séquence FeLV env. Le plasmide résultant contenant le promoteur H6 du virus de la vaccine dans   pCEll   a été désigné pFPCV1. Les séquences de 5'au promoteur ont été mutagénées (19) pour éliminer les séquences externes en utilisant l'oligonucléotide   FPCV1   (5'   CAGTAATACACGTTATTGCAGAGAGGACCATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3')   pour produire pFPCV1. La région   3'au   promoteur (site de clonage multiple) a subi une mutagénèse par l'oligonucléotide FPCV3 (5'-TAGAGT   CGACCTGCAGGCATCCAAGCTTGTTAACGAC-3')   pour éliminer le   site SohI,   qui contient un ATG.

   Le plasmide résultant a été désigné   pFPCF2.   



   Le fragment de   EHV-1   gpl3 NruI/HindIII de 1,8 kb, défini ci-dessus, a été inséré dans un fragment   NruI/HindIII   de 8,0 kb dérivé par digestion de pFPCV2. Ce fragment   NruI/HindIII   de 8,0 kb contenait la portion 5'du virus du promoteur H6 du virus de la vaccine (100   bp),   les séquences de flancs de FP (4,8 kb en amont et 1,5 kb en aval à partir du site d'insertion) et 2,4 kb de pUC   (BRL,   Bethesda, MD). La liaison ou ligation de ces deux fragments a résulté dans la formation d'un plasmide de 9, 8 kb désigné pFPEhV13A. 



   Le plasmide pFPEHV13A a été ensuite digéré par KpnI et HindIII pour enlever un fragment d'environ 600 bp. Ce fragment contenait la plus grande partie de région 3'du gène de EHV-1 gpl3 (200 bp) et le segment d'ADN du virus de la vaccine de 410 bp. Le fragment   KpnI/HindIII   de 600 bp a été remplacé par un fragment de 200 bp dérivé de pNSIENPN (Figure 3) comme suit. Une digestion par PstI de pNSIENPN a linéarisé 

 <Desc/Clms Page number 58> 

 le plasmide. Les terminaisons de PstI ont été affectées d'une coupure franche au moyen de T4 ADN polymérase (New England Biolabs, Beverly, MA) en présence de dNTPS   (0,   5 mM chacun). 



  Les agents de liaison HindIII (BRL, Bethesa, Med) ont été ensuite liés au fragment à coupure franche. Après digestion par HindIII, le plasmide linéarisé a été digéré par   KpnI   pour 
 EMI58.1 
 donner un fragment de 200 bp contenant la portion 3'du gène de EHV-1 gpl3, la séquence correspondant au codon de termi- naison (TAG) et le motif de séquence TTTTTNT qui est connu pour être le signal de terminaison de la transcription précoce du virus de la vaccine (45). Le plasmide recombinant a été désigné pFPEHV13B et a été utilisé dans une recombinaison in vitro pour l'insertion du gène de EHV gpl3 promu par H6 dans le locus f7 du génome de FP. Le poxvirus de volaille recombinant a été désigné vFP44. 



   En se référant maintenant à la Figure 9, on a également utilisé pFPEHV13B pour engendrer un fragment   NriI/HindIII   de 1,4 kb pour insertion dans pCPCV1. Le plasmide   pCPCVl   contient le promoteur H6 du virus de la vaccine dans le site unique EcoRI dans le fragment génomique du poxvirus du canari (CP) PvuII de 3,3 kb. Ce plasmide d'insertion permet l'insertion de gènes étrangers au locus C3 du génome CP. pCPCVl a été dérivé de pRW764,2, qui contient un fragment génomique   PvuII   CP de 3,3 kb inséré dans un vecteur pUC. pRW764, 2 a été linéarisé par digestion par EcoRI. Ce fragment a été doté d'une coupure franche en utilisant un fragment de Klenow de l'ADN polymérase de l'E. 



  Coli (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) en présence de dNTPs (0,5 mM chacun). Les séquences du promoteur H6 du virus de la vaccine et une région de clonage multiple située en   3'par   rapport au promoteur ont été excisées de   pFPCVl   par digestion avec KDnI/HDaI. Ce fragment de 200 bp a été doté d'une coupure franche au moyen de la T4 ADN polymérase en présence de dNTPS (0,5 mM chacun) et inséré dans le plasmide   pRW764.   2, à coupure franche, et linéarisé. Le 

 <Desc/Clms Page number 59> 

 plasmide résultant a été appelé   pCPCV1.   Le plasmide pCPCVl a été digéré par NruI et HindIII et le fragment de 5,8 kb a été isolé pour ligation au fragment de 1,4 kb contenant EHV gpl3 décrit ci-dessus. Le plasmide résultant a été appelé pCPEHV13A.

   Ce plasmide a été utilisé dans des expériences de recombinaison in vitro pour insertion du gène de EHV gpl3 promu par H6 au locus C3 du génome CP. Le poxvirus du canari recombinant a été appelé vCP48. 



   Suivant la recombinaison in vitro, le poxvirus aviaire recombinant contenant le gène   EHV-1   gpl3 a été identifié par un essai d'hybridation classique sur plaques. Les plaques positives ont été purifiées par 3 cycles d'isolation de plaques suivis par des analyses d'hybridation. Les recombinants ont été désignés vFP44 et vFP48 pour les recombinants FP et CP respectivement. Les deux recombinants ont été analysés en utilisant un test immunotriage par la protéine A-B-galactosidase avec un anti-sérum monoclonal vis- à-vis de   EHV-l     gpl3.   Les résultats ont montré que les monocouches de cellules de CEF et VERO infectées soit par vFP44 soit par vFP48 expriment   EHV-1   gpl3 à la surface des cellules infectées par le virus. 



  Exemple 8-EVALUATION DE VIRUS RECOMBINANTS ADDITIONNELS
DE LA VACCINE EXPRIMANT DES VERSIONS MODIFIEES
ET NON MODIFIEES DU GENE DU VIRUS DE L'HERPES
CHEVALIN 1 CODANT LA GLYCOPROTEINE   qPl4  
Construction et évaluation de virus recombinants additionnels de la vaccine exprimant   EHV-1   qpl4
Des produits construits contenant   EHV-l   gpl4 (Exemple 2) ont été modifiés de trois manières : (a) en 
 EMI59.1 
 faisant varier la longueur de la séquence leader ou de tête de EHV-l gpl4 ; (b) en éliminant l'excès d'ADN 3'EHV-1 du gène ; et (e) en insérant les versions modifiées du gène EHV- 1 gpl4 dans un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte du virus de la vaccine vP293 (69) pour évaluation. 

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   Le produit de gène de EHV-1 gpl4 contient une séquence leader ou de tête inhabituellement longue. Une séquence hydrophobe longue s'étendant des acides aminés 59 jusqu'à 99 est proposée pour être la séquence de signal. 



  Cette région est précédée par une longue séquence hydrophile. 



  Une séquence leader ou de tête également longue a été également notée chez deux autres homologues de gB, à savoir le virus de la pseudo-rage gII (62) et le virus de l'herpès bovin 1 gI (63). 



   Modification de l'extrémité   5'de EHV-1 aol4  
Pour étudier l'effet de la longueur de la séquence leader de EHV-1 gpl4 sur le traitement, la présentation et l'efficacité immunologique du produit gpl4 exprimé dans un virus recombinant de la vaccine, des plasmides contenant le 
 EMI60.1 
 gène de EHV-1 gpl4 avec trois longueurs différentes pour la séquences leader ont été construits en modifiant le EHV-1 gpl4 précédent, qui contient des constructions, des manières suivantes. 



   En se référant maintenant à la FIgure 10, le plasmide pVM2LH6gl4 (Exemple 2) contient toute la séquence de codage de EHV-1 gpl4 sous le contrôle du promoteur H6 inséré dans le locus de suppression M2L de la vaccine de Copenhague. 



  Dans pVM2LH6gl4, l'acide aminé   n 2   du gène de   EHV-l   gpl4 est présent plutôt comme His que comme Ser natif. Pour changer l'acide aminé   n02   en Ser, on a coupé pVM2LH6gl4 au moyen de NsiI (séquence de reconnaissance ATGCAT) aux codons 1-2 (Met/His). La mutagénèse a été réalisée (19) en utilisant le nucléotide synthétique MPSYN240   (5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCTGTC3').   



   Le plasmide résultant, pMP14M, contient la totalité du gène de   EHV-1   gpl4 avec le codon natif (Ser) en position 2. 



   Le plasmide pVM2LH6gl4-1 (Exemple 2) est identique à pVM2LH6gl4 exepté pour une troncature de la séquence leader et introduction de quatre codons dérivés des agents de 

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 liaison NsiI synthétiques. Dans   pV112LH6g14-1,   la séquence de l'extrémité tronquée 5'du gène de   EHV-1   gpl4 est ATG/CAT/ 
 EMI61.1 
 GCA/TGC/ATT/GCT... codant Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala... où GCT (Ala) est le codon 35 de EHV-1 gpl4. pVM2LH6gl4-l a été modifié par mutagénèse (19) de deux manières. Pour produire une version du gène de gpl4 tronqué approximativement au même degré que   pVM2LH6gl4-l,   mais de manière à s'approcher davantage de la séquence de gpl4 natif, on a coupé   pVM2LH6gl4-l   au moyen de NsiI aux codons 1-2.

   La mutagénèse a été réalisée en utilisant l'oligonucléotide synthétique MPSYN241   (5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTGTCCCAGCAGCTGGCTCCTGGATC 3').   



  Dans le plasmide résultant, pMP14M-34, la séquence de codage de EHV-1 gpl4 commence avec ATG/AGT/GTC/CCA... Met/Ser/Val   /Pro...   où CCA (Pro) est l'acide aminé   n  36   de EHV-l gpl4. 



  Le gène de   EHV-1   gpl4 contient un site NaeI (GCCGGC) aux codons 61-63 (Lys/Pro/Ala). Pour produire une version plus sévèrement tronquée du gène de EHV-1   gpl4,   on a linéarisé   pVM2LH6g14-1   au moyen de NaeI puis digestion par NsiI et isolement du fragment de vecteur à partir d'un gel d'agarose. 



  La mutagénèse a été réalisée en utilisant l'oligonucléotide synthétique MPSYN243 (5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCATCATCGAGGGTGGGCACAATAGTT 3'). Dans le plasmide résultant, pMP14M-63, la séquence de codage 
 EMI61.2 
 de EHV-1 gpl4 commence avec ATG/GCA... MEt/Ala... où GCA (Ala) est l'acide aminé n  63 du EHV-1 gp 14natif. 



  Elimination de l'ADN de EHV-1 étranger Dans tous les plasmides contenant EHV-1 gpl4 discutés ci-dessus, les séquences de codage de EHV-gpl4 sont suivies par approximativement 1200 bp d'ADN de   EHV-1.   Le codon de terminaison (TAA) pour le gène gpl4 se produit dans le site   Dral   (TTTAAA). Pour éliminer l'excès   d'ADN   de   EHV-l,   on a soumis pMP14M-63 à une digestion partielle par DraI suivie par l'isolement de l'ADN linéaire à partir d'un gel d'agarose et la digestion par PstI qui coupe à la jonction entre l'ADN de EHV-1 et le bras de flanc aval de la vaccine. 

 <Desc/Clms Page number 62> 

 Une bande d'ADN DraI/PstI de 6,5 kb a été isolée à partir d'un gel d'agarose.

   Les oligonucléotides synthétiques MPSYN247   (5'AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA 3')   et MPSYN 248 (5'GCTCGAGTTAACAAAAATTT 3') ont été soumis à un traitement de réforme et liés avec un fragment de 6,5 kb. Dans le plasmide résultant, pMP14M-63P, les séquences de codage de EHV-1 gpl4 sont suivies immédiatement par une séquence spécifiant la terminaison de la transcription précoce de la 
 EMI62.1 
 vaccine (45), suivie par une région de polyliaison (contenant une suite de sites de restriction HpaI, XhoI, PstI) et le bras de flanc gauche de la vaccine dérivé de HindIII M. 



  Insertion du promoteur H6/qène de EHV-1 crpl4 dans un système de sélection pHES/vP293 Dans tous les plasmides contenant EHV-1 gpl4 discutés ci-dessus, le gène de EHV-1 gpl4 se trouve sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine inséré dans le locus de suppression M2L du virus de la vaccine, souche Copenhague. 



  Etant doné que le locus d'insertion M2L est disposé dans une large région du génome qui peut être supprimée, la remise en place de la cassette d'expression promoteur   H6/EHV-l   gpl4 en un site d'insertion potentiellement plus stable a été investiguée. A titre d'étape préliminaire, des structures de gène de EHV-1 gpl4 contenant différentes longueurs de la séquence leader ont été déplacées vers le système de sélection du domaine de réplication chez   l'hôte   basé sur WP pHES/vP293 (69) pour permettre la production rapide de vaccines recombinantes pour une évaluation comparative. 



   Le plasmide pHES-4 contient le promoteur H6 de la vaccine, suivi par une région de polyliaison et le gène du domaine de l'hôte humain KIL (70), tous insérés entre les bras de vaccine WR qui flanquent une suppression de 21,7 kb (69). pHES-4 contient deux sites NriI, à savoir l'un dans le promoteur H6 et l'autre dans les séquences de flanc de la vaccine. pHES-4 a été linéarisé par digestion partielle par 

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 NruI et la bande contenant l'ADN linéaire de longueur complète a été isolée à partir d'un gel d'agarose.

   Cet ADN linéaire a été coupé au site XhoI dans la région de polyliaison. pMP14M-63P contient deux sites NruI, à savoir l'un dans le promoteur H6 et l'autre dans les séquences de codage de EHV-1 gpl4, 0,2 kb à partir de   l'extrémité 3'du   gène. pMP14M-63P a été soumis à une linéarisation par NruI, suivie   d'une digestion par XhoI. Un fragment NruI (partiel) /XhoI de   2,8 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Ce fragment contient une partie du promoteur H6, suivie par la forme du gène de   EHV-1   gpl4 modifié contenant la version la plus courte de la séquence leader. Le fragment contenant promoteur H6/EHV-1 gpl4 de 2,8 kb dérivé de pMP14-63P a été lié avec le   fragment de vecteur NruI (partiel) /XhoI dérivé de pHES-4.

   Le   plasmide résultant, à savoir pHES-MP63, contient la cassette promoteur H6/gène de EHV-l gpl4 sans ADN de   EHV-1   étranger. 



  Pour transférer les extrémités   5'de   la cassette promoteur H6/EHV-1 gpl4 contenant des séquences leader de longueur totale ou modérément tronquées, on a coupé les plasmides pMP14M et pMP14M-34 par NruI et les bandes de. 2, 8 kb et 2,7 kb, respectivement, ont été isolées à partir de gels d'agarose. pHES-MP63 a été soumis à une digestion partielle par NruI et un fragment de 7,2 kb isolé à partir d'un gel d'agarose. Le fragment de vecteur de 7,2 kb correspond à pHES-MP63 dont le fragment NruI de 2,6 kb contenant l'extrémité   5'de   la cassette promoteur   H6/EHV-l   gpl4 a été éliminé. 
 EMI63.1 
 



  Nru Le fragment de vecteur NruI (partiel) de 7, 2 kb dérivé de pHES-MP63 a été lié avec un fragment NruI de 2, 8 kb à partir de pMP14M en engendrant pHES-MP1. Le fragment de vecteur NruI (partiel de 7,2 kb dérivé de pHES-MP63 a également été lié au fragment NruI de 2,7 kb provenant de pMP14M-34, engendrant pHES-MP34. Les étapes de clonage conduisant à la production des plasmides pHES-MP63,   pHES-MPl   et pHES-MP34 ont été représentées schématiquement sur la Figure 10. 



   On a utilisé des plasmides pHES-MP1, pHES-MP34 et 

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 pHES-MP63 comme plasmides donneurs pour recombinaison avec vP293 (69), en engendrant des virus recombinants de la vaccine vP753, vP765 et vP721, respectivement. La descendance recombinante a été sélectionnée sur des cellules MRC-5 humaines. 



   Evaluation de recombinants du virus de la vaccine basés sur vP293 exprimant le gène de   Ehr-l     cf-pl4  
Pour déterminer si les trois formes du produit de 
 EMI64.1 
 gène de EHV-1 gpl4 exprimées dans les virus recombinants de la vaccine VP753, vP765 et vP721 étaient présents à la surface des cellules infectées, on a infecté des monocouches de cellules de VERO avec les trois virus recombinants de la vaccine contenant   Ehe-1     gpl4.   Les monocouches cellulaires infectées ont été analysées pour connaître leur immunofluorescence de surface en utilisant l'anticorps monoclonal 3F6 spécifique à   EHV-1     gpl4.   L'immunofluorescence de surface était positive pour les cellules infectées avec tous les trois recombinants viraux de la vaccine, vP743,

   vp765 et vP721. Ceci indique qu'une circulation convenable du produit de gène de   EHV-l   gpl4 dans les cellules infectées de la vaccine n'est pas affectée par la longueur de la séquence leader. 



   Pour comparer les produits de gène de   EHV-1   gpl4 exprimés dans les trois recombinants du virus de la vaccine 
 EMI64.2 
 contenant EHV-1 gpl4, on a infecté des cellules de MRC-5 par vP753, vp765 et   vP721   et les protéines ont été métaboliquement marquées au moyen   de 35S-méthionine.   Des immuno-précipitations ont été réalisées avec les lysats de cellules radioactivement marquées en utilisant l'anticorps monoclonal 3F6 spécifique vis-à-vis de   EHV-1   gpl4. 



   Les protéines immuno-précipitées à partir de cellules infectées par vP753, vP765 et vP721 sont indistinguables l'une de l'autre et sont équivalentes aux protéi- 
 EMI64.3 
 nes irnmuno-précipitées à partir de vP613, la vaccine recombinante contenant EHV-1 gpl4 produite à partir du plasmide 

 <Desc/Clms Page number 65> 

 
 EMI65.1 
 pv2LH6gl4-l. Ces résultats indiquent que les variations de longueur de la séquence leader de EHV-1 gpl4 testées dans ces recombinants n'améliorent ni n'interviennent dans le traitement convenable du produit de gène. 



   Pour évaluer l'efficacité protectrice du virus recombinant de la vaccine exprimant les différentes formes de EHV-1   gpl4,   on a inoculé des hamsters au moyen de doses différentes de vP753, vP765 et vP721 et attaqué ceux-ci par 
 EMI65.2 
 la souche Kentucky adaptée à l'hamster de EHV-1. Les trois vaccines recombinantes contenant EHV-1 gpl4 ont été protec- trices, avec un loglo   PDode   6,2 ou meilleur. Les différences de protection entre les trois recombinants du virus de la vaccine ne sont pas statistiquement significatifs. 



  * Contraitement au vP577, un virus recombinant de la vaccine ultérieur qui a été également produit par recombinaison entre pVM2LH6gl4 et vP458 montre une structure d'immunoprécipitation vis-à-vis de EHV-1 gpl4 identique à celle avec vP753, vP765 et vP721 et, comme ces virus recombinants de la vaccine exprimant EHV-l   gpl4,   exprime la protéine de EHV-1 
 EMI65.3 
 gpl4 à la surface des cellules infectées. 



  Les données précitées suggèrent que le EHV-1 gpl4 exprimé dans le virus recombinant vP577 de la vaccine est défectueux et que le défaut s'est produit probablement pendant la recombinaison entre le plasmide donneur pVM2LH6gl4 et le virus de la vaccine vP458. 



  Exemple 9-SEQUENCE DE NUCLEOTIDES DE TROIS NOUVEAUX GENES
A PARTIR DU VIRUS DE L'HERPES CHEVALIN TYPE 1
ET EXPRESSION DANS DES VIRUS RECOMBINANTS DE LA
VACCINE
Pour identifier et isoler le gène de EHV-1 codant gpl7/18 avant de l'exprimer dans un virus recombinant de la vaccine, on a établi la séquence de la plus grande partie de la région Us du génome de EHV-1 et on a exprimé les différents cadres de lecture ouverts trouvés sur ce fragment d'ADN.

   On a identifié et analysé trois nouveaux gènes de EHV- 

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 1 codés par le composant S : EHV-1 gD qui, lorsqu'on en a établi la séquence, a montré une homologie avec les produits des gènes HSV gD et PRV   gp50   ; EHV-1 gp63 qui a montré une 
 EMI66.1 
 homologie avec les produits des gènes HSV US7 et PRV gap63 et EHV-1 gE qui a montré une homologie avec les produits des gènes de HSV gE et PRV   gI.   Tous ces trois gènes, soit individuellement, soit en association, ont été   clonés   dans un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte de la souche de vaccine de Copenhague pour des études d'expres- sion rapide. L'immunofluorescence obtenue avec un sérum de lapin anti-EHV-l a révélé l'expression de produits spécifi- ques de   EHV-1.   



     Clonaae   du fragment de EHV-l par BamHI D
Etant donné que le gène de   EHV-1     gpl7/18   a été localisé sur le composant S du génome de   EHV-1   (3), le fragment par BamHI D, qui représente la plus grande partie de la région Us (59), a été isolé et   cloné.   L'ADN génomique de
EHV-1 de la souche Kentucky D a été digéré par BamHI. Le fragment BamHI D de 11,0 kb a été isolé à partir d'un gel d'agarose (Geneclean,   Bio10l,   Inc., La Jolla, CA) et   cloné   dans le plasmide pIBI24 en tant que plasmide pEHVBamHID. Une carte de restriction de ce fragment en a été déduite (Figure
11). 



  Identification de séquences d'ADN codant   EHV-1     aD, crp63   et   crE  
Les données de séquence des nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de plusieurs sous-clones du fragment BamHI D   sous-cloné   dans pIBI24, comme décrit dans l'Exemple 1. Les séquences des jonctions entre fragments successifs ont été examinées sur le clone initial pEHVBamHID. 



   On a utilisé dans toutes les analyses de données de séquences le package de logiciel PC/GENE (Intelligenetics Inc.,
Mountain View, CA). 



  Analyse de la séquence d'ADN des gènes de   EHV-1     qD, qp63   et   ( ? E  
L'analyse de la séquence d'ADN de la région de 6402 bp séquencée du fragment BamHI D (représentant la plus grande 

 <Desc/Clms Page number 67> 

 partie de la région courte unique) a révélé l'existence d'au moins trois cadres de lecture ouverts complets lisant tous à partir du même brin. Cette séquence est présentée sur la Figure 12 en tant que brin 5'à   3'en   direction de la droite. 



  La composition des bases est 50,44 % G + C. 



   Le premier cadre de lecture ouvert (ORFl) s'étend des positions 971 à 2176 de nucléotides. On a trouvé des signaux putatifs de régulation transcriptionnelle dans la région depuis   5'jusqu'au   codon d'initiation ATG le plus probable en position 971. Une boite TATA ayant la séquence TATATTAA (nucléotides 871 à 878) a été localisée 60 nucléotides en aval à partir d'une boite CAT putative aux positions 811 à 817 ayant la séquence TGACAAT. On n'a trouvé aucun signal de polyadénylation (AATAAA) en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 2177 à 2179). Sept parmi les dix nucléotides dans la séquence   51 TCCCTTCGCC 3'   (nucléotides 890 à 899) sont complémentaires à la séquence d'ARN ribosomal 18S, à savoir 3'AGGAAGGCGT 5' (61) et peuvent servir comme site de liaison de ribosome.

   Un modèle de balayage a été proposé par lequel des mARN eukaryotiques amorcent ou initient la traduction (151). La règle fondamentale de ce modèle est que des ribosomes se lient à l'extrémité   5'du   mARN et balayent linéairement la molécule de mARN. L'engagement à l'amorçage ou initiation de la traduction est généralement au premier codon ATG proximal de 5', bien que des exceptions aient été notées (152). Une purine en position- 3 est essentielle pour l'amorçage de la traduction et la traduction est stimulée par C dans les positions-1 et-2 lorsque le reste de la séquence est suboptimal (155). Le contexte de la séquence autour du codon d'amorçage proposé AGCATGT (nucléotides 968 à 974) se qualifie comme un contexte de séquence fonctionnelle pour l'amorçage de la traduction de mARN eukariotique.

   Il y a deux autres codons d'amorçage ATG possibles localisés respectivement dans les positions 989 à 991 et 992 à 994. Le contexte de ces deux codons CTTATGATGG 

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 ne les qualifie pas en tant que fonctionnels pour l'amorçage de la traduction. Le EHV-1 ORFl code 402 acides aminés avec une masse moléculaire calculée de 45 239 daltons. 



   Analyse de la structure de la proteine de EHV-1 ORF1
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 26 a un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour reconstituer la séquence de signal. Une région hydrophobe consistant en 24 acides aminés (acides aminés 351 à 374) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Il y a quatre sites Asn-X-Thr/Ser (X pouvant être tout acide aminé excepté la proline) pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote (157). Le profil   d'hydrophobicité   de la séquence d'acides aminés de EHV-1 ORF1 est illustrée sur la Figure 13.

   Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane et comprenant des éléments de signal et d'ancrage sont clairement définis. 



  Les deux régions les plus hydrophobes à la terminaison   N-et   au voisinage des terminaisons C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la molécule de glycoprotéine. 



   Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-1
ORF1 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés de la protéine putative EHV-1 ORF1 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de EHV-1 ORF1 est semblable à PRV gp50 (95) et   HSV-1   gD (79,160). 



   Le second cadre de lecture ouvert (ORF2) s'étend des positions de nucléotide 2287 à 3525. Aucun signal putatif réglant la transcription n'a été trouvé dans la région depuis   5'jusqu'au   codon d'amorçage ATG en position 2287. Aucun 

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 signal de polyadénylation AATAAA n'a été trouvé en aval du codon de terminaison TGA (nucléotides 3526 à 3528), mais on a localisé deux signaux potentiels de polyadénylation YGTGTTYY (180) en aval de ce codon de terminaison à approximativement 40 et 70 bp. Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé GCTATGG est conforme aux règles de Kozak (151,155).

   Il y a au moins deux autres codons possibles d'amorçage ATG dans les positions 2305 à 2307 et 2332 à 2334, mais le contexte de séquence de ces deux codons (GGGATGT et TCTATGG) ne les qualifient pas comme fonctionnels pour l'initiation de la traduction. Le   EHV-1   ORF2 code un polypeptide de 413 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 45 431 daltons. 



   Analyse de la structure de la protéine de EHV-1 ORF2
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 22 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour constituer la séquence de signal (bien que le comptage par ordinateur pour le site de coupure putatif est faible). Une région hydrophobe consistant en 32 acides aminés (positions 315 à 346) a été prédite comme fonctionnant en domaine d'ancrage transmembrane. Il existe sept sites Asn-XThr/Ser pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote. Une détermination d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de la séquence EHV-1 ORF2 est illustrée sur la Figure 14.

   Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane, y compris des éléments de signal et d'ancrage sont clairement définies. Les deux régions les plus hydrophobes à l'extrémité   N-et   au voisinage de l'extrémité C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la molécule de glycoprotéine. 

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   Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-l
ORF2 avec d'autres   qlvcoprotéines   du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés de EHV-1 ORF2 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, la protéine de   EHV-1   ORF2 est homologue à PRV gp63 (80), VZV gpIV (181) et   HSV-1   US7 (79). 



   Le troisième cadre de lecture ouvert (ORF3) s'étend des positions de nucléotide   3736 à   5451. des signaux putatifs réglant la transcription ont été trouvés dans la région depuis   5'jusqu'au   codon d'amorçage ATG en position 3796. Une boîte TATA ayant la séquence GTTTAAA (nucléotides 3705 à 3711) est située 50 nucléotides en aval d'une boite CAT putative aux positions 3649 à 3654 ayant la séquence GCAATG. Aucun signal évident de polyadénylation n'a été découvert en aval du codon de terminaison TGA (nucléotides 5452 à 5454). 



  Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé ACAATGG est conforme aux règles de Kosak (151,155). Le EHV- 1 ORF3 code un polypeptide de 552 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 61 493 daltons. 



   Analyse de la structure de la protéine de EHV-1 ORF3
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 1 à 23 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour constituer la séquence de signal. Une région hydrophobe consistant en 38 acides aminés (positions 404 à 437) est prédite comme fonctionnant en domaine d'ancrage transmembrane. Il y a cinq sites Asn-X-Thr/Ser pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote. Un tracé d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de   EHV-1   ORF3 est représenté sur la Figure 15. Les caractéristiques d'une glycoprotéine enjambant la membrane, y compris les éléments de signal et d'ancrage, sont clairement définies.

   Les deux 

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 régions les plus hydrophobes à la terminaison N et au voisinage de la terminaison C sont prédites comme représentant la région de séquence de signal et la région d'enjambement transmembrane, respectivement, de la molécule de glycoprotéine. 



   Comparaison de la séquence d'acides aminés de EHV-l ORF3 avec d'autres glycoprotéines du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés de la protéine de EHV-1 ORF3 a révélé une homologie significative avec des glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. 



  Ainsi, la protéine de EHV-l ORF3 est homologue à PRV   gI   (80), VZV gE (191) et   HSV-1   gE (79). 



   Construction d'un virus de la vaccine   Copenhaaue   basé sur un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte
Un système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte basé sur le virus de la vaccine Copenhague, semblable au système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte WR pHES/vP293 (69), a été construit. 



   Le mutant vP668 de suppression du virus de la vaccine Copenhague est supprimé pour douze gènes dans la région de HindIII C à HindIII K, y compris les gènes KIL, du domaine de réplication chez l'hôte humain (70), et C7L, un gène qui donne la carte de HindIII C. vP668 est incapable de se développer sur des cellules humaines MRC-5. Les membres de la série de plasmides COPCS contiennent le gène C7L avec des bras de vaccine de flanc permettant la recombinaison avec vP668 et la restauration de la capacité du virus de se développer sur des cellules de MRC-5. La capacité de la descendance de vaccine recombinante engendrée par la recombinaison en utilisant le système de sélection de domaine de réplication chez l'hôte   vP668/copcs   pour constituer des plaques sur les cellules humaines MRC-5 fournit un moyen d'identification rapide de ces recombinants.

   Le plasmide pCOPCS657 contient le promoteur synthétique H6 pour la 

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 vaccine suivi par une région de clonage de polyliaison pour l'insertion de gènes étrangers. La restriction de polyliaison est suivie par des codons d'arrêt et un signal de terminaison transcriptionnel de la vaccine (45). 
 EMI72.1 
 



  Clonaqe du gène de EHV-1 qD dans pCOPCS657 En se référant maintenant à la Figure 16, on a digéré le plasmide pEHVBamHID par HindIII et on a isolé à partir de gel d'agarose un fragment   d'ADN   HindIII de 1240 bp contenant EHV-1 gD (Geneclean, BiolO, Inc., La Jolla, CA) et on a repairé celui-ci en utilisant le fragment de Klenow d'ADN polymérase. Le fragment repairé a été ensuite lié au plasmide pCOPOCS657 digéré par SmaI. Le plasmide résultant, à savoir   pJCA006,   a le codon d'initiation ATG approximativement à 10 bp du promoteur H6 (Figure 16). 
 EMI72.2 
 



  Clonage du gène de EHV-1 qp63 en pCOPCS657 Le plasmide pEHVBamHID est digéré par HindIII, EcoRI et PvuII et le fragment d'ADN HindIII-PvuII de 1300 bp, contenant EHV-1 gp63, a été isolé à partir d'un gel de sagarose et repairé avec Klenow. Le fragment repairé a été ensuite lié en plasmide pCOPCS657 et digéré par SmaI. Le plasmide résultant avec EHV-1 gp63 dans l'orientation convenable par rapport au promoteur H6 a été appelé   jPCA008   (Figure 16). 



   Clonage du   gène   de EHV-1   qE   en   pCOPCS657  
Le plasmide pEHVBamHID est digéré par   AatII-ApaI   et un fragment d'ADN AatII-ApaI de 2630 bp contenant EHV-1 gE a été isolé à partir d'un gel d'agarose et repairé avec Klenow. Le fragment repairé a été ensuite inséré dans le plasmide pCOPCS567 digéré par SmaI. Le plasmide résultant avec le gène 
 EMI72.3 
 de EHV-1 gE dans la bonne orientation relativement au promoteur H6 a été appelé pJCA007 (Figure 16). 



   Clonaqe du fragment de EHV-1 qD-qp63 en   PCOPCS657  
En se référant maintenant à la Figure 17, le plasmide pEHVBamHID a été digéré par EcoRI et PuvII et le fragment (A) d'ADN EcoRI/PuvII de 1832 bp a été isolé à 

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 partir d'un gel d'agarose. Le plasmide pJCA006 a été digéré par ClaI et EcoRI et le fragment (B)   d'ADN   ClaI-EcoRI de 1450 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le plasmide pCOPCS657 a été digéré par ClaI et SmaI et le fragment (C) d'ADN ClaI-SmaI de 3700 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Les fragments A, B et C ont été ensuite liés ensemble et le plasmide résultant a été appelé   pJCA009   (Figure 17). 



   Clonage du fragment de EhV-l   aD-qp63-qE   en   pCOPCS657  
Le plasmide pEHVBamHID a été digéré par EcoRI et SacII et le fragment (D)   d'ADN   EcoRI/SacII de 4240 bp a été isolé à partir d'un gel d'agarose. Le fragment (D) a été ensuite lié aux fragments B et C (voir au-dessus) avec addition de dNTP pour assurer le repairage de la jonction SacII-SmaI. Le plasmide résultant a été appelé pJCA010 (Figure 17). 



   Construction des virus recombinants de la vaccine vP773, vP803, vP809, vP810 et vP822 exprimant les cadres de lecture ouverts de EHV-1 U
En vue de vérifier rapidement l'expression des cadres de lecture ouverts de EHV-l décrits ci-dessus, on a construit un certain nombre de virus recombinants de la vaccine en utilisant le système de sélection de domaine de réplication chez l'hôte COPCS. Les trois cadres de lecture ouverts identifiés par l'analyse de séquence ont été   clonés   soit individuellement, soit en association ("double"et "triple) en plasmide pCOPCS657 (Figures 16 et 17). Les plasmides résultants ont alors été utilisés pour recombinaison avec le recombinant de la vaccine vP668 comme virus de sauvetage. Les différents virus recombinants de la vaccine issus de ces recombinaisons sont représentés dans le Tableau
5. 



   Le recombinant de la vaccine vP773 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA006 contenant le gène de EHV-1 gD. Le recombinant de la vaccine 

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 vP822 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur   pJCA008   contenant le gène   EHV-l   gp63. Le recombinant de la vaccine vP803 a été obtenu par recombinai- 
 EMI74.1 
 son réalisée avec le plasmide donneur pJCA007 contenant le gène EHV-1 gpE.

   Le recombinant de la vaccine vP809 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur pJCA009 contenant le fragment de   EHV-l   gp63 ; et on a obtenu le recombinant de la vaccine vP810 par recombinaison réalisée avec le plasmide donneur   pJCAOlO   contenant le fragment de EHV-1 gD-gp63-gE (Tableau 5). 

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  Tableau 5 Désignation des virus recombinants de la vaccine exprimant les cènes de EHV-1   qD, qE   et qp63 
 EMI75.1 
 
<tb> 
<tb> Plasmide <SEP> EHV-1 <SEP> Virus <SEP> de <SEP> recombinant
<tb> donneur <SEP> d'insertion <SEP> sauvetage
<tb> pJA006 <SEP> gD <SEP> vP668 <SEP> vP773
<tb> pJA007 <SEP> gE <SEP> vP668 <SEP> vP803
<tb> pJAOO8 <SEP> gp63 <SEP> vP668 <SEP> vP822
<tb> pJA009 <SEP> gD-gp63 <SEP> vP668 <SEP> vP809
<tb> pJAOlO <SEP> gD-gp63-gE <SEP> vP668 <SEP> vP810
<tb> 
 
Analyse par immuno-fluorescence des produits de EHV-
1 ORF1 (gD), ORF2 (crp63) et ORF3 (gE),

   synthétisés par les virus recombinants de la vaccine simples ou multiples
L'immuno-fluorescence de cellules de VERO et   de MRC-   5 infectées par des virus recombinants de la vaccine a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant un sérum de lapin polyclonal anti-EHV-1 spécifique, R5935 (1 : 200) (Tableau 6). 

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  Tableau 6 Immuno-fluorescence de cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine réalisée en utilisant du sérum de lapin   anti-EHV-l   R5935 
 EMI76.1 
 
<tb> 
<tb> EHV-1 <SEP> recombinant <SEP> R5935
<tb> interne <SEP> surface
<tb> gD <SEP> positif <SEP> négatif
<tb> gp63 <SEP> positif <SEP> négatif
<tb> gE <SEP> négatif <SEP> négatif
<tb> gD-gp63 <SEP> positif <SEP> négatif
<tb> gD-gp63-gE <SEP> positif <SEP> négatif
<tb> 
 

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 Exemple   10-EVALUATION IMMUNOLOGIOUE,   CHEZ LES SOURIS ET
LES COCHONS, DES GLYCOPROTEINES   oeil,   qpIII et qp50 DU VIRUS DE LA PSEUDO-RAGE, EXPRIMEES
INDIVIDUELLEMENT OU EN COMBINAISON, PAR DES
VIRUS RECOMBINANTS DE LA VACCINE
La souche Copenhague du virus de la vaccine et ses dérivés vP410, vP425 et vP458 (184) ont été utilisés dans cet exemple.

   



   Clonage des   gènes   PRV codant apII,   GPIII   et   oc50  
Le virus PRV NIA3 (182) a été propagé sur une culture de cellules NIL2 (183). Les débris cellulaires ont été éliminés de la fraction surnageante par centrifugation à 3000 g pendant 30 mn. On a purifié les virions par centrifugation à travers un coussin de sucrose à 40 % (en poids/volume) à 40 000 tours/mn pendant 60 mn dans un rotor Beckman 45 Ti suivi par un gradiant discontinu de sucrose à 30-50 % (en poids/volume) (rotor Beckman SW25 à 23 000 tours/mn pendant 5 heures). Des virions par bandes ont été collectés, dilués au moyen d'un tampon TNE (50 mM Tris-HCl, pH7,8, 150 mM NaCl et 10 mM EDTA) et on a fait un comprimé à 30 000 tours/mn pendant 1 heure dans un rotor Beckman SW40.

   Le comprimé viral a été remis en suspension dans un tampon TE (50 mM   Tris-HCl   pH7,8, 10 mM EDTA) et lysé par addition de dodécylsulfate de sodium jusqu'à une concentration finale de   0, 5   % (poids/volume) et de protéinase K à 100 mg/ml. Après incubation à   370C   pendant 2 heures, le lysat a été extrait une fois avec un mélange phénol-chloroforme (1 : 1) et une fois avec un mélange chloroforme : isomaylalcool (24 : 1). L'ADN a été précipité avec de l'éthanol et redissous dans H2O. Après digestion complète par BamHI, les fragments ont été   clonés   au site BamHI de pBR322 préalablement traité à la phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIAP). Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer la souche nM522   d'E.   Coli compétente (20). 



   En se référant maintenant aux Figures 18 et 19, la 

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 séquence d'ADN qui code le gène gpII réside dans le fragment 1 de BamHI et les sous-fragments 1A et lB de SalI du génome PRV (62,94). Le plasmide appelé pPR9.25 contenant le fragment 1 BamHI de PRV, inséré au site BamHI de pBR322 a été digéré par NcoI. Le résultat de digestion d'ADN a été fractionné sur gel d'agarose à 0,8 % et un fragment d'ADN par   Ncol   de 6,2 kb a été purifié en utilisant la procédure Gene Clean (marque déposée) (BiolOl, Inc., La Jolla, CA) puis inséré au site   Ncol   de pBR328 (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) traité avec CIAP. Le plasmide résultant, pPR2. 15, a été digéré par   SphI   et fractionné sur un gel d'agarose.

   Les fragments de 2,7 et 1, 8 kb ont   : été   purifiés et insérés au site   SphI   de pUC18 phosphatasé pour créer des plasmides pPRl et pPR2 (Figure 18) et dans le phage M13. On a déterminé la séquence de nucléotides comme décrit ci-dessus. L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 2742 bp codant 913 acides aminés. Une homologie significative des acides aminés avec le HSV-1 gB a été observée comme attendu (62). Pour faciliter la description des manipulations de clonage pour l'expression de PRV gpII dans les vecteurs de virus de la vaccine, la séquence d'ADN du cadre de lecture ouvert de PRV gpII avec en plus des séquences supplémentaires non codantes   5'et 3'est   illustrée sur la Figure 19. 



   En se référant maintenant aux Figures 20 et 21, la séquence d'ADN codant la glycoprotéine gpIII de PRV réside dans les fragments 2 et 9 par BamHI du génome de PRV (96). Le plasmide pPR9.9, contenant le fragment par BamHI inséré au 
 EMI78.1 
 site BamHI de pBR322 (Figure 20) a été digéré par BamHI et SphI. Le plasmide pPR7. 5 contenant le fragment 9 par BamHI inséré au site BamHI de pBR322 a été digéré par NcoI et par BamHI. L'ADN résultant des deux digestions a été fractionné sur un gel d'agarose. Le fragment   SphI-BamHI   de 2,35 kb et le fragment NcoI-BamHI de 1,1 kb ont été purifiés et liés aux sites EcoRI-SphI de IBI25 phosphatasé (Figure 20) en utili- 

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 sant un agent de liaison phosphorylaté NcoI-EcoRI à savoir MRSYN21/MRSYN22. 
 EMI79.1 
 
<tb> 
<tb> 



  NcoI <SEP> EcoRI
<tb> MRSYN21 <SEP> 5'CATGGGTCTGCAGTCG <SEP> 3'
<tb> MRSYN22 <SEP> 3'CCAGACGTCAGCTTAA <SEP> 5'
<tb> 
 
Un plasmide appelé pPR17 a été isolé et il contient un fragment SphI-NcoI de 3450 bp comprenant le gène complet de PRV gpIII (Figure 20). La séquence de nucléotides a été obtenue à partir de modèles ou matrices de plasmide double brin dénaturés au moyen d'un alcali et à partir de modèles ou matrice simple seul brin après clonage en phage M13. 



  L'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert de 1440 bp codant 479 acides aminés (Figure 21). On a observé une homologie significative avec HSV gC comme observé précédemment (96). 



   En se référant maintenant aux Figures 22 et 23, la séquence d'ADN codant la glycoprotéine   gp50   de PRV réside dans le fragment 7 par BamHI du génome de PRV (95). Le plasmide pPR7. 1 (Figure 22) contenant le fragment 7 par BamHI de PRV, inséré au site BamHI-de pBR322 a été digéré par StuI et NdeI et traité avec une nucléase de fève de Mung (Mung bean). Le fragment de 1,7 kb a été purifié à partir d'un gel d'agarose, inséré au site HincII de IBI25 phosphatasé. Ce plasmide, pPR22 (Figure 12), contient la totalité du gène de PRV gp50. La détermination de la séquence de nucléotide a révélé un cadre de lecture ouvert de 1215 bp codant 404 acides aminés (Figure 23). Une homologie significative avec le   HSV-1   gD a été observée comme rapporté précédemment (95). 



   Clonage des gènes de PRV codant   crpll,   qpIII et qp50 dans des plasmides donneurs d'insertion du virus de la vaccine
Le fragment SphI-NheI de PRV de 1060 bp à partir de   pPRl   (Figure 18A) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites BamHI-SphI de pIBI25 après traitement avec 

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 CIAP en utilisant un agent de liaison   phosphorilaté BamHI-     NheI,   à savoir MRSYN1/MRSYN2 
 EMI80.1 
 BarnHI NheI MRSYN1 S'GATCCATTCCATGGTTG 3' MRSYN2 3'GTAAGGTACCAACGATC 5' pour engendrer le plasmide pPR6 (Figure 18A). pPR6 a été digéré par HindIII et ADaI et traité par CIAP. Le site   Apal   est localisé 32 bp en aval du codon d'initiation ATG de   FRV gpll   (Figure 19).

   Un fragment d'ADN double brin a été obtenu par traitement de réforme (annealing) de la paire d'oligonucléotides phophorylatés synthétiques   KRSYN3/ RSYN4.   Ce fragment contient de l'ADN spécifiant le promoteur H6 de vaccine du site EcoRV jusqu'à l'ATG (souligné), suivi immédiatement par des séquences de codage de PRV   gpII.   
 EMI80.2 
 



  HindIIIEcoRV AlDai KRSYN3 5'AGCTTGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCC 3' MYSYN4 3'ACTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 5' L'ADN synthétique a été lié au fragment HindIII-bQäI de 3920 bp dérivé de pPR6 pour engendrer le plasmide pPR9 (Figure 18A). 



   Le plasmide pPR9 a été digéré par BamHI et   NheI,   traité avec CIAP et lié en utilisant un agent de liaison BamHI-SphI phosphorylaté 
 EMI80.3 
 Stahl Ba1r. EI HRSYN7 5'CCCAGATCTCCTTG 3' HRSYN8 3'GTACGGGTCTAGAGGAACCTAG 5' à un fragment SDhI-NheI de 1640 bp obtenu à partir de   pPR1,   en engendrant le plasmide pPR12 (Figures 18A, 18B). 
 EMI80.4 
 



  Le fragment HincII-SphI de 1030 bp provenant de pPR2 . ph (Figure 18A) a été isolé à partir d'un gel d'agarose et 

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 inséré aux sites   HincII et S-phI   de   pUC18   phosphatasé. Le plasmide résultant   pPRl0   a été digéré par HindIII et NaeI et traité avec CIAP. Le site NaeI est localisé 44 bp en aval du codon de terminaison TAG (Figure 19).

   Un fragment d'ADN double brin obtenu par traitement de réforme (annealing) de la paire d'oligonucléotides synthétiques phosphorisatés MRSYN9/MRSYN10 
NaeI XmaIII HindIII HRSYN9    S'GGCACTACCAGCGCCTCGAGAGCGAGGACCCCGACGCCCTGTAGAATTTTTATCGGCCGA     3'      HRSYN10 3'CCGTGATGGTCGCGGAGCTCTCGCTCCTGGGGCTGCGGGACATCTTAAAAATAGCCGGCTTCGA 5'   a été lié au fragment   NaeI-HindIII   de 3720 bp dérivé de pPR10 pour engendrer le plasmide pPRll. 



   Les séquences soulignées correspondent au codon de terminaison de PRV gpII et au signal de terminaison de transcription précoce de la vaccine (45). Le fragment SDhIHincII de 770 bp de pPR2 a été purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré, en utilisant un agent de liaison phosphorylaté BamHI-SphI   (KRSYN7/MRSYN8),   aux sites BamHI-HincII de   pPRIl   traité par CIAP, pour engendrer pPR13 (Figures   18A,   
 EMI81.1 
 18B). Le plasmide pPR12, digéré par EcoRI et SDhI et traité par CIAP, a été lié, en utilisant un agent de liaison HindIII-EcoRI phosphorylaté (MRSYN19/MRSYN20) HindIII EcoRI KRSYN19 S'AGCTTCTGCAGCCATGGCGATCGG 3' MRSYN20 3'AGACGTCGGTACCGCTAGCCTTAA 5' à un fragment isolé HindIII-SohI de 990 bp dérivé de pPR13, pour engendrer le plasmide pPR15 (Figure   18B).   



   Le fragment de 2780 bp   HincIII-EcoRV   de pPR15 a été traité avec la nucléase de la fève de Mung, purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré dans le plasmide   pTP15   (184) (Figure 3) digéré par   XmaIII-EcoRV,   la nucléase de la fève de Mung et CIAP, pour engendrer le plasmide pPR18 (Figure 18B). Dans   pPR18,   pRV gpII est connecté au promoteur H6 synthétique 

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 de la vaccine au locus de suppression de l'hémaglutinine de la vaccine. Ce plasmide a été transfecté dans des cellules infectées par le virus de la vaccine pour engendrer des recombinants de la vaccine vP534,   vP644,   vP621 et vP692 contenant le gène de PRV gpII (voir ci-dessous). 



   Le gène de PRV gpIII a été manipulé pour être exprimé sous le contrôle du promoteur précoce de virus de la vaccine, à savoir Il (voir ci-dessous) localisé dans le fragment HindIII B de la vaccine. En utilisant une mutagénèse spécifique au point de vue site, un site NsiI a été introduit en changeant la séquence CGC (bases 192-194) (Figure 21) dans pPRV gpIII en ATG et un site XbaI a été introduit en changeant la séquence GTGACGT en TTCTAGA (bases 1632-1638) (Figure 21). A cet effet, de l'ADN simple brin a été engendré à partir du plasmide pPR17 en utilisant un phage d'aide R408 (Stratagène, La Jolla, CA) (185). La mutagénèse digirée vers le site a été réalisée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques phosphorylatés purifiés, à savoir MRSYN5 et MRSYN6. 



   NsiI 
 EMI82.1 
 HRSYNS S'GCGAGCGAGGCCATGCATCGTGCGAATGGCCCC 3' Xbal MRSYN6 5'GGGGGGACGCGCGGGTCTAGAAGGCCCCGCCTGGCGG 3' puis on a effectué une sélection sur la souche CJ236 de E. 



  Coli dut ung (IBI, New Haven, CT) (17,186). 



   Ces mutations ont engendré le plasmide pPR28. Ce plasmide pPR28 a été digéré par NsiI et XbaI et traité avec un nucléase de fève de Mung. Un fragment de 1140 bp a été purifié à partir d'un gel d'agarose et inséré aux sites   BcrIII-HpaI   de pSDA78VC (Figures 20 et 24) après traitement avec la nucléase de fève de Mung et CIAP. Le plasmide pPR24 a été transfecté dans des cellules infectées par le virus de la vaccine pour engendrer les recombinants du virus de la 

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 vaccine vP604, vP644, vP681 et vP692 contenant le gène de PRV gpIII (voir ci-dessous). 



   PRV   gp50   a été manipulé pour être exprimé sous le contrôle d'un promoteur de virus de la vaccine précoce/ intermédiaire, à savoir I3L (187). En utilisant une mutagénèse spécifique quant au site, on a introduit un site NsiI en changeant la séquence CCTGCCAGCGC (bases 177-187) (Figure 23) dans   gp50   en ATGCATTTAAT et on a introduit un site BqlII en changeant la séquence CCTCCGCAGTACCGG aux bases 1404-1418 (Figure 23) en   AATTTTTATAGATCT.   Des procédures décrites précédemment (17,185, 186) de mutagénèse ont été utilisées pour engendrer le plasmide pPR29 à partir de   pPR22   en utilisant des oligonucléotides synthétiques phosphorylatés purifiés MRSYN13 et MRSYN 13 (Figure 22). 
 EMI83.1 
 



  NsiI MRSYN12 S'GGTTCCCATACACTCAATGCATTTAATCATGCTGCTCGCAGCGC 3' Bain MRSYN13 5'GCAGCCCGGTCCGTAGAATTTTTATAGATCTCGTCGÀTGATGATGGT 3' pPR29 a été digéré par NsiI, traité avec la nucléase de fève de Mung et partiellement digéré par BcrlII pour engendrer un fragment de 1290 bp. Le plasmide pMP13PP (Figures 22,25) a été digéré par EcoRI et traité par la nucléase de fève de Mung et ensuite par BamHI pour engendrer un fragment de 140 bp contenant le promoteur I3L de la vaccine. Les fragments de 1290 et 140 bp ont été purifiés à partir de gel d'agarose et liés au site   BQLII   phosphatasé de pMP409DVC (Figures 4,22). Le plasmide résultant pPR26 a été utilisé en recombinaison pour produire Les recombinants du virus de la vaccine vP591, vP621, vP691 et vP692 contenant le gène gp50 (voir ci-dessous). 



   ConstructiOn de recombinants de la vaccine exprimant les   qlvcoprotéines     crpll,   crpIII et   crp50   de PRV, individuellement ou en combinaisons 

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En vue d'établir l'immunogénéicité et la contribution relative des trois glycoprotéines de PRV (gpII, gpIII et gp50) pour la protection des animaux immunisés contre l'attaque par PRV virulent, on a construit une série de recombinants de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines de PRV seules ou en combinaison. 



   En se référant maintenant à la Figure 24, le virus recombinant de la vaccine, à savoir vP533, exprimant le gène de beta-galactosidase a été construit comme suit : Une région de 1 kb dans le fragment B par HindIII de la vaccine enjambant la jonction SalI F/I du génome de Copenhague contient une homologie d'ADN avec le gène hémorragique   (g)   du poxvirus de la vache (cow poxvirus) (188) comme déterminé par l'analyse par Southern blot (189). Le gène   g   code un polypeptide présentant une similarité avec les inhibiteurs de sérine protéase et est biologiquement responsable pour la formation de pustules hémorragiques par le virus sur la membrane chorioallantoique.

   La séquence d'ADN du génome de Copenhague a révélé que l'équivalent du gène   R   contient des mutations multiples de déplacement de cadre et était biologiquement non fonctionnel. Le plasmide pSD419VC (184) (Figure 24) contient la portion de gauche de la région   u.   Le plasmide pSD422VC, qui contient le fragment I par Sali de Copenhague coloné dans pUC8, contient le restant de la région   .   Pour éliminer les séquences de vaccine non désirées vers la gauche, pSD419VC a été digéré par NcoI et SmaI, doté d'une terminaison franche par un fragment de Klenow de E. Coli polymérase et re-lié, ce qui a donné le plasmide pSD476VC (Figure 24).

   Le plasmide pSD422VC a été digéré par   HpaI   et NruI et on a isolé à partir d'un gel d'agarose un fragment d'environ 0,3 kb localisé 
 EMI84.1 
 immédiatement à la droite de la région . Ce fragment a été lié en pSD476VC, coupé par HincII (qui reconnait les sites   SalI),   ce qui a donné le plasmide pSD477VC. Pour exprimer la béta-galactosidase sous le contrôle de la région de promoteur   g   de la vaccine de Copenhague, on a préparé des oligonucléo- 

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 tides synthétiques 22mer/20mer.

   La séquence de 22mer/20mer avec les sites de restriction indiqués etle codon d'initiation ATG souligné est la suivante : 
ClaI Hpal 
 EMI85.1 
 22mer 5'CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3'   20mer   3'TAATGATACTTCCTAGGCAA S' 
Le mélange 22mer/20mer ayant subi un traitement de réforme ("annealed") a été lié en pSD477VC, digéré par   ClaI   et HincII, ce qui a donné le nouveau plasmide   pSD479VC   (Figure 24). Un fragment BamHI de 3,1 kb contenant les séquences de codage pour la béta-galactosidase de E. Coli à partir de pMC1871 (34) exempt de codon d'initiation et de promoteur a été lié en pSD479VC et coupé par BamHI. Le plasmide résultant, contenant le gène   lacZ   dans l'orientation convenable sous le contrôle du promoteur g de Copenhague, a été appelé pSD479VCBG.

   Le plasmide donneur d'insertion a été recombiné en virus de la vaccine vP410 (184). Un virus recombinant de la vaccine a été identifié sur la base de la formation de plaque bleue en présence d'un substrat chromogène, X-gal (9,24)   cloné   sur plaque et appelé vP533 (Figure 24). 



   Pour construire un plasmide vecteur pour l'insertion de gènes étrangers, on a préparé des oligonucléotides synthétiques 42mer/40mer 
 EMI85.2 
 Clal BalII SacI Smal XhoI BamEI ID2sI 42mer 5'CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGGATCCGTT 3' 40mer 3'TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCCTAGGCAA 5' Le mélange 42mer/40mer soumis à un traitement de réforme (annealing) a été lié en pSD477VC coupé par Clal et HincIII, ce qui a donné le nouveau plasmide pSD478VC (Figure 24). Le plasmide contient environ 0,3 kb de séquences de la vaccine de chaque côté de la région de multiclonage qui remplace complètement la région de codage   g   de la souche Copenhague de 

 <Desc/Clms Page number 86> 

 la vaccine.

   On a utilisé pSD478VC pour engendrer pPR24 (Figure 20) contenant des séquences de codage de PRV gpIII et des recombinants de la vaccine vP604, vP644, vP691 et vP692. 



   En se référant maintenant à la Figure 25, le plasmide pMP419 contient un fragment BamHI de 850 bp du fragment I par HindIII de la vaccine contenant le promoteur I3L inséré dans le site BamHI de pUC8 (Figure 25). L'élément promoteur I3L correspond à des séquences d'ADN en amont du cadre de lecture ouvert I3L dans le fragment I par HindIII de la vaccine (187) et a été utilisé précédemment pour exprimer les gènes étrangers dans des recombinants du virus de la vaccine (27,190). On a linéarisé   pMP419   au site unique ClaI dans les séquences de codage I3L et on l'a soumis à une digestion par Bal 31 suivie d'une digestion par EcoRI et formation d'une extrémité franche par traitement avec le fragment de Klenow de la E. Coli polymérase.

   Le plasmide résultant, à savoir pMP419-5 (Figure 25), contient les séquences du promoteur I3L en amont du nucléotide-8 connecté à un site EcoRI. L'élément promoteur a été isolé en tant que fragment EcoRI-MsDI de pMP419-5 et inséré dans pUC13C digéré par EcoRI-ClaI, un dérivé de pUC13 contenant un agent de liaison ClaI au site SmaI. Le plasmide résultant, à savoir pMP13PP (Figures 22 et 25), contient les séquences du promoteur I3L de la position-126 jusqu'à la position-8 suivies par un site EcoRI en position-8. 



   On a inséré PRV gp50, entraîné par le promoteur I3L de la vaccine, dans le vecteur plasmide de suppression M2L, à savoir pMP409DVC (Figure 4), ce qui a donné pPR26 (Figure 22). On a utilisé pPR26 pour engendrer les recombinants de la vaccine vP591, vP621, vP691 et vP692. 



   Isolement de virus recombinant de la vaccine
Des virus recombinants de la vaccine contenant les gènes de PRV ont été identifiés et purifiés comme décrit cidessus. Les virus recombinants de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines gpII, gpIII et   gp50   de PRV, soit seules 

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 soit en combinaison sont énumérés dans le Tableau 7. 



   Tableau 7 
Désignation des virus recombinants de la vaccine exprimant les qlycoprotéines   qpII,   apIII et qp50 de PRV 
 EMI87.1 
 
<tb> 
<tb> Recombinant <SEP> Parent <SEP> Plasmide <SEP> Givcoprotéine
<tb> donneur <SEP> de <SEP> PRV
<tb> vP534 <SEP> vP425 <SEP> pPR18 <SEP> gII
<tb> vP591 <SEP> vP458 <SEP> pPR26 <SEP> gp50
<tb> vP604 <SEP> vP533 <SEP> pPR24 <SEP> gIII
<tb> vP621 <SEP> vP534 <SEP> pPR26 <SEP> gII <SEP> + <SEP> gp50
<tb> vP644 <SEP> vP604 <SEP> pPR18 <SEP> gII <SEP> + <SEP> gIII
<tb> vP691 <SEP> vP604 <SEP> pPR26 <SEP> gIII <SEP> + <SEP> gp50
<tb> vP692 <SEP> vP644 <SEP> pPR26 <SEP> gII <SEP> + <SEP> gIII <SEP> + <SEP> gp50
<tb> 
 
 EMI87.2 
 Evaluation in vitro des crlvcoorotéines de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine 
Les glycoprotéines gpII,

   gpIII et gp50 de PRV sont des glycoprotéines typiques associées à la structure membraneuse des cellules infectées par PRV et sont de plus des constituants du virus. Des anticorps monoclonaux spécifiques anti-gpII, anti-gpIII et anti-gp50 suivis par IgG anti-souris caprin, conjugué à la fluoresceine, ont donné une forte immuno-fluorescence de surface sur des cellules infectées par des virus recombinants de la vaccine, mais non sur des cellules infectées par le virus de souche sauvage de la vaccine. 

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   Evaluation in vivo du potentiel immunoqénique des   alycoprotéines     qpll,   apIII et   qp50   de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine chez les souris et les cochons
En vue d'établir l'immunogénicité relative des trois glycoprotéines de PRV exprimées par des recombinants du virus de la vaccine, on a inoculé des souris dans le coussinet de pied au moyen de 50 à 100 ul de doses différentes des virus recombinants. 14 jours après immunisation, les souris ont été soumises à une attaque avec 10 LD50 de la souche virulente de Kojnock de PRV par la route interpéritonéale. Dans des expériences préliminaires, chacune des glycoprotéines de PRV s'est révélée efficace pour protéger des souris inoculés contre une attaque par PRV virulent.

   Dans une série plus étendue d'expériences utilisant plus de 500 souris, on a établi l'efficacité des recombinants de la vaccine exprimant des glycoprotéines de PRV. La dose de vaccination capable de protéger 50 % des souris soumises à l'attaque   (PDo)   a été calculée et les résultats de cette étude sont donnés dans le Tableau 8. Le virus recombinant de la vaccine exprimant individuellement les protéines gpII, gp50 et gpIII de PRV engendre les valeurs calculées   PDo   de 6,4, 5,4 et 5,8   (logo),   respectivement.

   Lorsque les glycoprotéines sont exprimées en combinaison, on a calculé des valeurs nettement meilleures pour   PDo.   La vaccine recombinante exprimant gpII +   gp50   de PRV a donné une valeur PD50 de 3,3, et la vaccine 
 EMI88.1 
 recombinante exprimant gp50 + gpIII de PRV a donné une valeur PDo essentiellement similaire (3, 6). Apparemment, le recombi- nant exprimant les glycoprotéines gpII + gpIII de PRV est plus efficace, un PD50 de 1,5 étant obtenu. La coexpression de toutes les trois glycoprotéines gpII, gpIII et gp50 de PRV dans un virus recombinant de la vaccine ne donne pas une valeur   PDso plus   faible d'une manière significative que celles obtenues avec des virus recombinants exprimant les trois glycoprotéines de PRV individuellement.

   L'efficacité poten- 

 <Desc/Clms Page number 89> 

 tialisée obtenue avec la vaccine recombinante exprimant gpII et gpIII comparée au virus recombinant de la vaccine exprimant les gènes individuellement est similaire aux résultats rapportés dans l'Exemple 6 pour la coexpression des glycoprotéines gpl3 et gpl4 du virus de l'herpès chevalin. 



   Tableau 8 
Puissance des recombinants du virus de la vaccine exprimant les   criycoprotéines     qp50, qpII et apIII   du virus de la pseudo-rage 
 EMI89.1 
 
<tb> 
<tb> Virus <SEP> recombinant <SEP> Gènes <SEP> de <SEP> PRV <SEP> exprimés <SEP> PDn
<tb> vP534 <SEP> gpII <SEP> 6,4
<tb> vP591 <SEP> gp50 <SEP> 5,4
<tb> vP604 <SEP> gpIII <SEP> 5,8
<tb> vP621 <SEP> gpII <SEP> + <SEP> gp50 <SEP> 3,3
<tb> vP644 <SEP> gpII <SEP> +. <SEP> gpIII <SEP> 1,5
<tb> vP691 <SEP> gp50 <SEP> + <SEP> gpIII <SEP> 3,6
<tb> vP692 <SEP> gp50 <SEP> + <SEP> gpII <SEP> + <SEP> gpIII <SEP> 5, <SEP> 1
<tb> 
 
Bien que la souris puisse fournir un système modèle intéressant pour évaluer l'immunogénicité des glycoprotéines de PRV, principale espèce constituant une cible pour le vaccin contre PRV est le cochon.

   C'est pourquoi, en vue d'établir la validité de l'approche du virus recombinant de la vaccine chez le cochon, on a effectué l'expérience suivante. Des porcelets d'environ 25 kg ont été inoculés intra-musculairement au moyen de 2 ml de recombinant de la vaccine exprimant des combinaisons des glycoprotéines   gpII,   gpIII et   gp50   de PRV. L'inoculum de virus a été dilué dans 

 <Desc/Clms Page number 90> 

 PBS. 35 jours après cette inoculation, les porcelets ont été soumis à une attaque, par injection intranasale (1 ml dans chaque narine), d'une suspension d'isolat NIA3 de PRV virulent. L'efficacité de la vaccination a été évaluée en mesurant le gain de poids comparatif des porcelets vaccinés et des porcelets de contrôle pendant 7 jours après l'attaque. 



  Le gain de poids relatif est calculé en tant que gain en poids (en pourcentage) moyen journalier observé chez les cochons vaccinés moins le gain en poids (en pourcentage) moyen journalier des cochons de contrôle non vaccinés. Le gain normal en poids des cochons dans des conditions non perturbées est plus grand que 1,1 kg. Comme démontré par les données du Tableau 9, l'évolution du poids pendant la période de 7 jours suivant l'attaque par PRV est grandement améliorée chez les porcelets vaccinés par rapport au groupe de contrôle inoculé avec le virus de souche sauvage. Une seule inoculation avec les recombinants du virus de la vaccine donne une protection significative contre la perte de poids après l'attaque par PRV virulent. 



   Tableau 9 
Evaluation des recombinants de la vaccine exprimant des combinaisons de glycoprotéines   as50,     cfpll   et qpIII de PRV chez les porcelets 
 EMI90.1 
 
<tb> 
<tb> Virus <SEP> Gènes <SEP> de <SEP> PRV <SEP> Dose <SEP> de <SEP> Gain <SEP> de <SEP> poids
<tb> d'inoculum <SEP> exprimés <SEP> vaccination <SEP> relatif
<tb> logio <SEP> TCID50/ml
<tb> vP452 <SEP> Aucun <SEP> 107-0, <SEP> 31
<tb> vP621 <SEP> gpII <SEP> + <SEP> gp <SEP> 50 <SEP> 107. <SEP> 2, <SEP> 89
<tb> vP644 <SEP> gpII <SEP> + <SEP> gpIII <SEP> 107. <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 15
<tb> vP691 <SEP> gp50 <SEP> + <SEP> gpIII <SEP> 107. <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 21
<tb> vP692 <SEP> gp50 <SEP> + <SEP> gpII <SEP> + <SEP> gpIII <SEP> 107.

   <SEP> 7 <SEP> 2, <SEP> 67
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 91> 

 
La disponibilité de recombinants du virus de la vaccine exprimant les trois glycoprotéines dominantes de PRV, individuellement ou en combinaison, offre un certain nombre d'avantages pour le contrôle des infections par PRV sur le terrain : (a) un avantage important est le fait que les virus recombinants de la vaccine, en tant qu'agents de vaccination, expriment seulement un nombre limité de gènes de PRV et donc il n'y a pas de risque concommittant de réversion d'une souche de vaccin de PRV atténué vers une forme virulente et donc il n'y a pas d'introduction continue du virus PRV dans l'environnement ;

   (b)   épi-ana   donné que seulement un nombre limité d'antigènes de PRV sont exprimés par les candidats de vaccin de PRV à base des virus recombinants de la vaccine, ceci permet de discriminer les animaux vaccinés d'une part et les animaux naturellement infectés d'autre part, étant donné que les réactifs de diagnostic consistant en d'autres antigènes de PRV peuvent être réunis pour discriminer entre les animaux vaccinés et les animaux naturellement infectés ; (c) de tels vaccins recombinants pourraient être utiles pour rompre la transmission verticale naturelle de PRV de la truie à sa descendance. Ceci pourrait être réalisé par la vaccination de la truie enceinte par un virus recombinant de la vaccine exprimant un jeu discret de glycoprotéines de PRV. 



  L'immunité maternelle devrait protéger la descendance de l'infection par PRV. A son tour, la descendance pourrait être vaccinée avec un virus recombinant de la vaccine exprimant toutefois une configuration différente d'antigènes de PRV, distincts de ceux utilisés pour vacciner la truie. Ceci est un moyen potentiel de passer outre l'immunité maternelle. 



  Une autre approche pour traiter le problème de l'immunité maternelle consisterait à exprimer les glycoprotéines de PRV dans une combinaison quelconque dans un vecteur complètement hétérologue. Ceci est réalisé par la construction de recombinants du poxvirus aviaire exprimant les glycoprotéines de PRV. L'utilité des recombinants du poxvirus aviaire, dont le 

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 domaine de réplication chez l'hôte est (d'une manière naturelle) restreint à l'espèce aviaire (oiseaux), a été démontrée lors de la vaccination des espèces non-aviaires (41). Ainsi, deux approches sont disponibles pour traiter le problème de la barrière fournie par l'immunité maternelle : (1) les vecteurs et (2) la constellation des antigènes exprimés par ces vecteurs. 



  Exemple 11-VECTEURS DE POX AVIAIRE   (AVIPOX)   EXPRIMANT LA
GLYCOPROTEINE   croll   DU VIRUS DE LA PSEUDO-RAGE
Le poxvirus du canari a été propagé sur des fibroblastes primaires d'embryons de poulets (CEF) dérivés d'oeufs embryonnaires âgés de 10 à 11 jours obtenus de SPAFAS, Inc., (Norwich, CT) en utilisant les conditions décrites précédemment (41,42). Le virus a été purifié des contaminants de la cellule d'hôte par centrifugation sur un gradient de sucrose en utilisant la méthode décrite par Joklik (191). Les cellules de rein de cochon (PK-1) ont été obtenues de l'American Type Culture Collection, Rockville,   MD   (ATCC   n-CL101).   



   Construction d'un recombinant du poxvirus du canari exprimant la   qlycoprotéine   apII du virus de la pseudo-rage
En se référant maintenant à la Figure 26, on a utilisé le plasmide pPR15 (Figure 18) comme source de gène de PRVgpII. Pour isoler le segment d'ADN contenant tout le gène de PRVgpII, on a digéré pPR15 par EcoRV et HindIII. Un fragment d'approximativement 2,8 kb, contenant 21 bp d'extrémité 3'du promoteur H6 du virus de la vaccine (VV) et la totalité du gène de PRVgpII, a été engendré par cette digestion. On a isolé le fragment EcoRV/HindIII de 2,8 kb pour insertion dans pFPCV2 (Figures 8,26). 



   Le fragment EcoRV/HindIII de 2,8 kb (défini cidessus) a été inséré dans un fragment de pFPCV2 de 8,0 kb dérivé de la digestion complète par HindIII et de la digestion partielle par EcoRV. La ligation de ces deux fragments a résulté dans la formation d'un plasmide de 10,8 kb appelé 

 <Desc/Clms Page number 93> 

 pFPPRVII. 



   En se référant maintenant à la Figure   27,   on a utilisé le plasmide pFPPRVII pour engendrer un fragment NruI/HindIII de 2,8 kb pour insertion dans pCPCVl (Figure 9). 



  Le plasmide   pCPCVl   contient le promoteur H6 de W au site unique EcoRI dans le fragment génomique PvuII CP de 3,3 kb. 



  Ce plasmide d'insertion permet l'insertion de gènes étrangers au locus C3 du génome CP. Le plasmide pCPCVl a été digéré par NruI et HindIII et le fragment de 5,8 kb a été isolé pour ligation au fragment de 2,8 kb défini ci-dessus. Le plasmide résultant a été appelé pCPPRVII. 



   On a inséré le marqueur sélectable dominant, E. Coli xanthineguanine phosphoribosyl transferase (Eco   qat),   dans pCPPRVII comme moyen de sélection de croissance pour des recombinants de CP/PRVgpII. Des rapports antérieurs ont décrit l'utilisation de Eco   crpt   comme un marqueur sélectable dans la production de recombinants de poxvirus (193,194). Le gène Eco   qidt   a été obtenu à partir du plasmide pSV2gpt (ATCC   n 37145).   Le fragment BalII/DraI de 670 bp, contenant le gène Eco crpt, a été isolé de ce plasmide et inséré dans le site BqlII/SmaiI de pSD486VC.

   Le plasmide résultant, à savoir   pGPT-l,   contient le gène de Eco   grt   entre les bras de flanc du gène de VV   g   et sous la régulation transcriptionnelle du promoteur   .   Le plasmide pSD486VC a été dérivé de pSD478VC (Figure 24) de la manière suivante. On a digéré pSD478VC par EcoRI dans MCR, rempli par la réaction classique de Klenow en présence de dNTP (0,5 mM chacun) et re-lié pour produire pSD478EVC. Ce plasmide a été digéré par HpaI et BamHI et les oligonucléotides ayant subi un traitement de réforme (annea- led) HEM 5   (5'GATCCGATTCTAGCT-3')   et HEM 6 (5'-AGCTAGAATCG-3') ont été insérés pour produire pSD486VC. 



   La digestion de pGTP-1 par   Nicol   et EcoRI a libéré un fragment de 1, 0 kb contenant le gène de l'Eco gpt (670 bp) et le promoteur de VV   p.   (330 bp). Les extrémités NcoI et EcoRI 

 <Desc/Clms Page number 94> 

 ont été rendues franches en utilisant un fragment de Klenow de   l'E.   Coli ADN polymérase en présence de 0,5 mM dNTP. On a ajouté des agents de liaison ou adaptateurs de jonction (linkers) HindIII (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) aux fragments à extrémité franche. L'ADN a été digéré par HindIII et le fragment de 1,0 kb récupéré à partir d'un gel d'agarose. Ce fragment HindIII de 1, 0 kb a été ensuite inséré au site HindIII de pCPPRVII.

   Le plasmide résultant contenant les gènes de Eco   opt   et PRVgpII, lié en une configuration queue à queue, a été désigné pCPPRVII gpt. Ce plasmide a été utilisé dans des expériences de recombinaison in vitro pour insertion au locus C3 du génome CP. La sélection de recombinants contenant le gène de Eco   qpt   a été faite en présence de 
 EMI94.1 
 100 Rg/ml d'acide mycophénolique et les recombinants de Eco crut-positifs ont été ensuite liés pour détecter la présence du gène de PRVgpII par analyses d'hybridation sur plaques. 



  Les plaques positives Eco act et PRV gpII ont été purifiées dans trois cycles d'isolation de plaques et des populations pures cultivées pour obtenir un titre plus élevé et ont été appelées pCP55. Les analyses par Southern blot ont confirmé que ces deux gènes sont en vérité génètiquement connectés dans ces recombinants de CP. Le recombinant de CP a été désigné vCP55. 



   Immuno-fluorescence de cellules infectées par vCP55
Des études d'immuno-fluorescence ont été effectuées pour démontrer la localisation cellulaire de PRV gpII exprimé dans des cellules infectées par vCP55. Des cellules de CEF ou PK-1 ont été ensemencées sur des plaquettes en verre de 22 mm dans des boites de 35 mm à une densité de 5 x 105 cellules par boîte. Les cellules de CEF et PK-1 ont été infectées soit avec vCP55 soit avec le virus parental de CP et on a réalisé des infections et des incubations pour le   test d'immuno-fluorescence   comme décrit dans l'Exemple 1, en utilisant l'anticorps monoclonal 75N10, dilué à 1 % dans PBS+. 

 <Desc/Clms Page number 95> 

 



   Les cellules infectées ont été analysées pour l'expression à la fois interne et de surface. On n'a observé aucune expression de surface significative de gpII ni dans l'un ni dans l'autre des systèmes de cellules infectées par vCP55. L'expression interne du produit de gène de gpII s'est toutefois révélée à la fois dans les cellules de CEF infectées par vCP55 et dans les cellules de PK-1 infectées par vCP55. Les signaux de fluorescence interne dans les deux types de cellules étaient localisés dans des granules de la région périnucléaire des cellules infectées. Ces résultats suggèrent que le PRVgpII exprimé par CP est transmis au complexe de Golgi mais non pas à la membrane du plasma. Ce résultat diffère des résultats avec le gpII exprimé par le virus de la vaccine qui a été détecté sur la surface des cellules infectées. 



     Immuno-précipitation   de   PRVQPII   à partir de cellules infectées de CEF et   PK-l  
L'expression du produit de gène de PRVgpII par vCP55 a été analysée par immuno-précipitation à partir de lysats de cellules infectées. Des monocouches de cellules ont été infectées à 5 PFU/cellule. Le test   d'immuno-précipitation   a été réalisé comme décrit dans l'Exemple 1, en utilisant l'anticorps monoclonal 75N10. 



   L'espèce prédominante de polypeptide précipitée avec le sérum de lapin anti-PRV des cellules infectées de CEF et PK-l a migré avec des poids moléculaires apparents d'environ 120 kDa, 67 kDa et 58 kDa. Ces polypeptides représentent la forme de précurseur et la forme traitée protéolytiquement, respectivement, de PRVgpII dans les cellules infectées par PRV qui sont complexées par des liaisons disulfures (86,101, 196). Des espèces moins importantes avec des poids moléculaires apparents d'environ 26 kDa ont également été observées et peuvent refléter des événements de traitement protéolytique plus complet de gpII dans ces cellules infectées par CP/PRV recombinant. Aucun polypeptide équivalent n'a précipité de 

 <Desc/Clms Page number 96> 

 cellules infectées par le virus CP de contrôle et les lysats de cellules non infectées. 



   Etudes de protection
La capacité de vCP55 de provoquer une réponse immunitaire protectrice contre l'attaque de PRV vivant a été analysée dans le système de la souris. On a inoculé des souris dans leurs coussinets de pied au moyen d'échantillons de 50 ul à 100 ul contenant des doses variées de VCP55 indiquées dans le Tableau 10. Quatorze jours après l'immunisation, les souris ont reçu 16 LD50 de la souche Kojnock de PRV par la voie intrapéritonéale. On a compté les survivants 14 jours après l'attaque, moment auquel l'expérience a été arrêté. Comme montré dans le Tableau 10, l'inoculation de souris au moyen d'une seule dose de   106'8   TCID50 a protégé 8 souris sur 10 d'une attaque mortelle par PRV. Les doses inférieures de vCP55 qui ont été essayées n'ont fourni aucun niveau de protection.

   L'attaque avec PRV vivant a tué 7 souris non vaccinées sur 8. A partir des résultats présentés dans le Tableau   10,   on a calculé une PD50 (dose protectrice à 50 %) égale à   106, 16 pour   le vCP55 recombinant. 



  Tableau 10 Efficacité de vCP55 chez la souris 
 EMI96.1 
 
<tb> 
<tb> Dose <SEP> Protection
<tb> log10TCID50
<tb> 6,85 <SEP> 8/10
<tb> 4,85 <SEP> 0/10
<tb> 2,80 <SEP> 0/10
<tb> 0,85 <SEP> 0/10
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 97> 

 
L'efficacité de vCP55 comme agent immunisant contre l'attaque par PRV vivant a également été évaluée chez l'espèce cible, à savoir le porcelet. 15 porcelets pesant environ 25 kg ont été séparés en trois groupes. Le groupe vCP55 et le groupe de virus parental CP ont reçu chacun deux inoculations (2 ml égalant 2 x 108 TCIDso) aux jours 0 et 28 par la voie intramusculaire. 5 porcelets ont été laissés comme animaux de contrôle non vaccinés. On a administré à tous les porcelets la souche NIA3 pathogène de PRV par voie intra-nasale au jour 35.

   On a surveillé l'efficacité en comparant l'évolution du poids des cochons vaccinés au vCP55 et de contrôle pendant les 7 jours qui ont suivi l'attaque. 



  L'évolution en poids est calculée en tant que valeur Delta GMQR (en kilogrammes) = moyenne GMQR % des porcelets vaccinés - moyenne GMQR % des porcelets non vaccinés. 



   Dans le groupe non vacciné, tous les porcelets ont succombé à l'attaque par le virus PRV (deux le jour 5, deux le jour 6 et un le jour 7). Dans le groupe inoculé par le virus de souche sauvage (CP), quatre des cinq porcelets ont succombé à l'attaque (trois au jour 6, un au jour 7). Tous les porcelets dans le groupe vacciné par vCP55 ont survécu à l'attaque par PRV et ont prospéré. 



   On a observé des niveaux significatifs de protection chez les porcelets inoculés au moyen de vCP55 exprimant la glycoprotéine de PRVgpII contre l'attaque par PRV vivant (Tableau 11). Les animaux vaccinés par vCP55 ont montré un gain en poids net et significatif pendant toute la période expérimentale, alors que les deux groupes de contrôle ont manifesté une perte de poids significative pendant la période qui a suivi l'attaque par PRV. En outre, on n'a observé aucune mort dans le groupe vacciné par vCP55, alors que l'on a noté une mortalité de 80 % à 100 % dans les groupes de contrôle après l'attaque par PRV vivant. 

 <Desc/Clms Page number 98> 

 



  Tableau 11 
Protection des porcelets vaccinés (par vCP55) contre l'attaque par PRV, comme déterminée par la mortalité et le gain en poids 
 EMI98.1 
 
<tb> 
<tb> Traitement <SEP> Mortalité <SEP> Gain <SEP> en <SEP> poids
<tb> Non <SEP> vaccinés <SEP> 5/5-2, <SEP> 12
<tb> Souche <SEP> sauvage <SEP> (CP) <SEP> 4/5 <SEP> + <SEP> 0,61
<tb> Recombinant <SEP> (vCP55) <SEP> 0/5 <SEP> + <SEP> 2,51
<tb> 
 Exemple 12 - Recombinants de la vaccine exprimant les   olycoprotéines   PRV aI 
La souche de Copenhague du virus de la vaccine et les recombinants qui en dérivent ont été utilisés dans cet exemple. 



   Clonage du aène de   PRVaI   dans   les-plasmides   donneurs du pox du canari et du virus de la vaccine
En se référant maintenant à la Figure 28, un plasmide pGPI, contenant le gène   pRVgI   (souche NIA3) a été obtenu de Rhône-Mérieux, Lyon, France. Le gène   gI   [référence de la séquence (80)] a été isolé de ce plasmide et   cloné   en aval du promoteur H6 synthétique de la vaccine (69).

   Ceci a été réalisé en clonant le fragment XhoI-NcoI (partiel) de 2330 bp de pGPI dans le fragment XhoI-NcoI de 6400 bp de   pGBC2.     (pGBC2   a été obtenu en clouant le gène de HSV2 gb dans   le fragment BolII   de 3200 bp de   pRW764.   5, qui à son tour a été construit par clonage d'un fragment   Pvull   de 0,8 kb de l'ADN du pox du canari dans le fragment   PvuII   de 2360 bp de püC18). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPG12. 



   Le codon d'initiation ou d'amorçage   du   promoteur H6 

 <Desc/Clms Page number 99> 

 
 EMI99.1 
 a été alors aligné avec le codon d'amorçage du gène de gI. 



  Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides PRVL5 5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTC-3' et PRVL6 5'CTGCGCGGCGCGCAGCAGAAAGGGCCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' 
 EMI99.2 
 dans le fragment EcoRV-AlwNI (partiel) de 5900 bp de pPGI2. 



   Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPGI3. 



   On a ensuite éliminé les séquences étrangères PRV'gI
3'-non codantes. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucleotides, PRVL3 5'CTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGA    ATGGGCCCAACTATGGCGTGACCGCCAGCCGCCTGTTGAATGCCCGCCCCGCTTAACTGC   AGAATTCGGATCCGAGCT-3'et PRVL4 51CGGATCCGAATTCTGCAGTTAAGCGGGGC GGGCATTCAACAGGCGGCTGGCGGTCACGCCATAGTTGGGCCCATTCGTCACTTCCGGTT   TCTCCGGATCGCGGAACCAGACGT-3',   dans le fragment SacI-AatII (partiel) de 5200 bp   dë -pPGI3.   Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pPGI6. 



   Le gène de   gI   promu par H6. a été ensuite   cloné   dans le plasmide donneur du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment NruI-BamHI de 1750 bp de pPGI6 dans le fragment NruI-BamHI de 5000 bp de pBP14. (pBP14 contient le gène gag du virus de la leucémie bovine sous le contrôle du promoteur H6 synthétique de la vaccine dans le plasmide vecteur de la vaccine pSF494VC, ce dernier étant un sous-clone du fragment A par HindIII du virus de la vaccine de Copenhague, dans lequel la séquence de codage du gène de la vaccine contenant une homologie avec le gène ATI du cowpox (pox de la vache) (210) est remplacé par une région de polyliaison ou polyjonction). Ceci place le gène de   gI   promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine (de
Copenhague) qui flanquent le gène ATI.

   Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé   pPG17.   



   On a engendré le virus recombinant de la vaccine, 

 <Desc/Clms Page number 100> 

   vP717,   en transfectant   bpG17   dans des cellules infectées par vP410. 



   Construction de vP717
Le gène   gI   de PRV a été   cloné   dans un vecteur de virus de la vaccine. La statégie utilisée pour construire ce virus recombinant de la vaccine, vP717, est montré sur la Figure 28. Le gène de   PRVgl   contenu dans vP717 est   cloné   entre les séquences du virus de la vaccine qui flanquent le gène ATI et utilise le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41,42, 69). 



   Immuno-fluorescence   du oolvpe'ptide codé Dar   PRV sur les cellules infectées par vP717
Dans des cellules infectées par PRV,   gI   est exprimé sur la membrane du plasma. Des analyses par immuno-fluorescence de cellules infectées par vP717 avec un anticorps monoclonal spécifique du PRV   gI,   à savoir 42M17, indiquent que le polypeptide codé par PRV produit dans ces cellules est également exprimé sur la membrane de plasma. 



   Evaluation de vP717 chez les souris
L'évaluation in vivo de vP717 chez les souris a indiqué une certaine protection contre l'attaque par PRV (Tableau 12) en utilisant les procédures standard. 



   Tableau 12 
Evaluation du virus recombinant de la vaccine vP717 exprimant PRV apI chez les souris 
 EMI100.1 
 
<tb> 
<tb> Dose <SEP> d'inoculation <SEP> de <SEP> vP717 <SEP> Survivance <SEP> contre
<tb> lopin <SEP> TCIDn <SEP> l'attaque <SEP> par <SEP> PRV
<tb> 7, <SEP> 3 <SEP> 4/10
<tb> 5, <SEP> 3 <SEP> 5/10
<tb> 3, <SEP> 3 <SEP> 0/10
<tb> 1, <SEP> 3 <SEP> 2/10
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 101> 

 la leucémie bovine promu par H6 dans le locus de suppression HA de la vaccine). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGB3. 



   Le codon d'initiation ou amorçage du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gB. 



  Ceci a été réalisé en clonant les oligonucélotides GBL1 5'ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGCGGGGGGGGCTTGATTTGCGCGCTGGTCGTGGGG   GCGCTGGTGGCCGC-3'etGBL2 5'-   GGCCACCAGCGCCCCCACGACCAGCGCGCAAATCA AGCCCCCCCCGCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' dans le fragment SstII-EcoRV (partiel) de 6300 bp de pGB3. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pGB5. 



  Dans le plasmide pGB5, le gène HSV gB est sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine inséré au locus de suppression M2L de la vaccine. Etant donné que le locus d'insertion M2L est situé dans une plus grande région du génome qui peut être supprimé, le gène gB promu par H6 a été   cloné   dans un site d'insertion différent dans un plasmide donneur différent du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le   fragment BolII-BamHI   de 2800 bp de pGB5 au site BalII de pSD513VCVQ. (pSD513VCVQ est un sous-clone du fragment J par HindIII du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage pour le gène de thymidine kinase (TK) a été remplacé par une région de polyliaison). Ceci place le gène gB promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine qui flanquent le gène TK.

   Le plasmide produit par cette manipulation est appelé pGB6. 



     Clonaae   du aène de HSV2   aC   dans des plasmides donneurs du virus de la vaccine
La séquence de nucléotides du gène HSV2 gC a été déterminée précédemment (117). En se référant maintenant à la Figure 30, un fragment SalI de 2900 bp contenant le gène HSV2 gC a été isolé à partir de   l'ADN   génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site Sali de pIBI25 en engendrant le plasmide 

 <Desc/Clms Page number 102> 

 pGC3. 



   Le gène gC a été ensuite   cloné   entre les bras de flancs du virus de la vaccine (de Copenhague). Ceci a été réalisé en clonant le fragment XhoI-BamHI de 2900 bp de pGC3 au site   XhoII-BamHI   de pGC2. pGC2 a été produit en clonant le fragment   BqlII   de 370 bp de pBLVH14, contenant le promoteur H6 du virus de la vaccine, dans le site   BqlII   de pSD486VC. Ce dernier est un sous-clone du fragment B par HindIII du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage du gène   g   est remplacé par une région de polyliaison. Ceci place le gène gC entre la séquence du virus de la vaccine qui flanque le gène   g.   Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGC5. 



   Le codon d'initiation du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gC. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides GCL1 51ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCCTTGGACGGGTGGGCCTAGCCGTGGGCCTGTG-   3'et   GCL2 5'-   AGGCCCACGGCTAGGCCCACCCGTCCAAGGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3'.   dans le fragment NruI-SfiI de 5400 bp de pGC5. Le plasmide 
 EMI102.1 
 produit par cette manipulation est appelé pGC10. 



  La séquence étrangère 3'-non codante a été ensuite éliminée de pGC10. Ceci a été réalisé en recircularisant le fragment SalI-SmaI (partiel) de 4900 bp, traité par la E. Coli ADN polymérisase (fragment de Klenow), de pGClO. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGCll. 



   Une séquence supplémentaire   3'-non   codante a été ensuite éliminé de pGCll. Ceci a été réalisé en clonant l'oligonucléotide GCL3 5'-CTAGGGCC-3'dans le fragment XbaI-   ADaI   (partiel) de 4900 bp de pGCll. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pGC12. Dans ce plasmide pGC12, le gène HSV gC est sous le contrôle du promoteur H6 inséré au locus d'insertion   g   de la vaccine. Etant donné que 

 <Desc/Clms Page number 103> 

 le locus d'insertion   Il   est localisé à l'intérieur d'une région plus large du génome qui peut être supprimée, le gène gC promu par H6 a été   cloné   dans le site d'insertion ATI dans le plasmide donneur du virus de la vaccine.

   Ceci a été réalisé en clonant le fragment NruI-BamHI de 1550 bp de pGC12 dans le fragment NruI-BamHI de 5000 pb de pBP14. Ceci place le gène gC promu par H6 entre les séquences du virus de la vaccine (de Copenhague) qui flanquent le gène ATI. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé   pGC13.   



     Clonaae   du   cène   HSV2 qD dans les plasmides donneurs du virus de la vaccine
La séquence de nucléotides pour le gène HSV2 gD a été déterminée précédemment (118). En se référant maintenant à la Figure   31,   un fragment XbaI de 7, 5 kb contenant le gène HSV2 gD a été isolé de l'ADN génomique de HSV2 (souche G) et inséré au site XbaI de pIBI25 en engendrant le plasmide   pGD1.   



   On a ensuite   cloné   le gène gD en aval du promoteur H6 et entre les bras qui flanquent le virus de la vaccine (de Copenhague). Ceci a été accompli en clonant le fragment DraIPstI de 1500 bp de pGDl dans le site SmaI-PstI   de-pTP5   (184) (Figure 3). Ceci place le gène gD en aval du promoteur H6 et entre les séquences de virus de la vaccine qui flanquent le gène HA. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD2. 



   Le codon d'initiation ou amorçage du promoteur H6 a été ensuite aligné avec le codon d'initiation du gène gD. 



  Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides, GDL1 5'-   ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGGCGTTTGACCTCCGG-3'et   GDL2 5'-   CGCCGGAGGTCAAACGCCCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3'.   dans le fragment   EcoRV-AhaII   (partiel) de 5100 bp de pGD2. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD5. 



   On a ensuite éliminé la séquence étrangère   3'-non   codante. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides 

 <Desc/Clms Page number 104> 

 GDL3 5'GGCAGTACCCTGGCGGCGCTGGTCATCGGCGGTATTGCGTTTTGGGTACGCCGCCGGCGC TCAGTGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCCCCCTCG CACCAGCCATTGTTTTACTAGCTGCA-3'et GDL4 5'-   GCTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAGGGGGGCGCGTCGTCATCCCGGATGTGGGGGAGAC   GTAGGCGCTTGGGGGCCACTGAGCGCCGGCGGCGTACCCAAAACGCAATACCGCCGATGA   CCAGCGCCGCCAGGGTACTGCC-3'.   dans le fragment NaeI-PstI de 4800 bp de pGD5. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD7. 



   On a ensuite ajouté une séquence additionnelle   5'au   promoteur H6. Ceci a été réalisé en clonant le fragment   BglII-EcoRV   de 150 bp de pGBG (Figure 30) dans le fragment
BalII-EcoRV de 4800 bp de pGD7. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pGD8. 



   Construction de virus recombinants de la vaccine
La statégie utilisée pour cloner les gènes HSV2 gB, gC et gD dans le virus de la vaccine est illustrée sur les
Figures 29,30 et 31, respectivement. Toutes les construc- tions utilisent le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41,42, 184). Chaque gène HSV2 est cependant   cloné   dans un site différent dans le génome du virus de la vaccine. 
 EMI104.1 
 



  Le gène gB promu par H6 est cloné entre la séquence flanquant le gène M2L (vP569) ou la séquence flanquant le gène TK (vP734, vP775 et vP776). Le gène gC promu par H6 est   cloné   entre la séquence qui flanque le gène   kL   (vP579) ou la séquence flanquant le gène ATI (vP748, vP776 et vp777). Le gène gD promu par H6 est   cloné   entre la séquence qui flanque le gène HA (vP570, vP761, vP775 et vP777).

   Le virus recombinant de la vaccine   vP569   a été engendré en transfectant pGB5 dans des cellules infectées par   vP458.   vP734 a été produit en transfectant pGB6 dans des cellules infectées par vP618. vP579 a été produit en transfectant pGCll dans des cellules infectées par vP533. vP748 a été produit en transfectant   pGC13   dans des cellules infectées par vP618. vP570 a été 

 <Desc/Clms Page number 105> 

 produit en transfectant pGD5 dans des cellules infectées par vP425. vP761 a été produit en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP618. 



   VP425 est un variant du virus de la vaccine sauvage (de Copenhague) dont on a supprimé le gène TK et dont le gène HA a été remplacé par la béta-galactosidase (Exemple 1) (184). vP458 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont on a supprimé le gène TK et dont le gène M2L a été remplacé par la béta-galactosidase (Exemple 2). vP533 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont le gène TK a été supprimé et dont le gène   Il   a été remplacé par la bétagalactosidase. vP618 est un variant du virus de la vaccine sauvage dont les gènes TK,   Il   et ATI ont été supprimés. 



   Le virus recombinant de la vaccine contenant deux gènes de glycoprotéines HSV2 a été également construit. vP755 contient les gènes gB et gD,   vp776   contient les gènes gB et gC et vP777 contient les gènes gC et gD. vP775 a été produit en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP734. vP776 a été engendré en transfectant pGC13 dans des cellules infectées par vP734. vP777 a été engendré en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP748. 



   Un virus recombinant de la vaccine contenant trois gènes de glycoprotéines HSV2 a été également construit. vP812 contient les gènes gB, gC et gD de HSV2. vP812 a été engendré en transfectant pGD8 dans des cellules infectées par vP776. 



   Immuno-fluorescence des glycoprotéines de HSV2 dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
Dans des cellules infectées par HSV2, on a exprimé gB, gC et gD (aussi bien que d'autres glycoprotéines codées par HSV2) sur la membrane du plama. Des études d'immunofluorescence réalisées sur des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant des gènes de HSV2 indiquent que les polypeptides de HSV2 produits dans les cellules infectées par ces virus recombinants de la vaccine 

 <Desc/Clms Page number 106> 

 sont également exprimés sur la membrane du plama. 



     Immuno-orécipitation   des   c ? lvcoprotéines   de HSV2 dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
La glycoprotéine HSV2 gB produite dans des cellules infectées par HSV2 présente un poids moléculaire d'environ 117 kDa (198,199). Des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant le gène de HSV2 gB   (vP569,   vP734, vP775 et vP776) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 117 kDa.   L'immuno-précipitation   de cellules infectées par vP569 avec des anti-sérums vis-à-vis de virus HSV2 entier précipite deux protéines principales ou majeures avec des poids moléculaires d'environ 117 kDa et 110 kDa et trois protéines mineures avec des poids moléculaires de 50 kDa, 45 kDa et 30kDa.

   L'immuno-précipitation de cellules infectées par vP734, vP775 et vP776 précipite deux protéines majeures avec des poids moléculaires d'environ 110 kDa et 90 kDa et cinq protéines mineures avec des poids moléculaires d'environ 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa et 30 kDa. 



   La glycoprotéine HSV2 gC produite dans les cellules infectées par HSV2 a un poids moléculaire d'environ 63 kDa (199,200). Les cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant le gène HSV2 gC (vP579, vP748, vP776 et vP777) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 63 kDa. L'immunoprécipitation de cellules infectées par vP579, vP748, vP776 et vP777 au moyen d'anti-sérums au virus HSV2 entier précipite une protéine majeure avec un poids moléculaire d'environ 65 kDa et une protéine mineure avec un poids moléculaire d'environ 85 kDa. Les anti-sérums de lapin contre le virus HSV2 entier ont été obtenus de la DAKO Corporation (Santa Barbara, CA ; code nO B116) et utilisés à une dilution de 1 : 100. 



   La glycoprotéine HSV2 gD produite dans les cellules 

 <Desc/Clms Page number 107> 

 infectées par HSV2 ont un poids moléculaire d'environ 51 kDa (198,199). Des cellules infectées avec des virus recombinants de la vaccine contenant HSV2 gD (vP570, vP761, vP775 et vP777) produisent également un polypeptide codé par HSV2 avec un poids moléculaire d'environ 51 kDa. L'immuno-précipitation des cellules infectées par vP570,   vP761,   vP775 et vP777 au moyen d'anti-sérums du virus HSV2 entier précipite une protéine majeure ayant un poids moléculaire d'environ 48 kDa et deux protéines mineures avec des poids moléculaires d'environ 40 kDa et 31 kDA. 



   Evaluation in vivo
Tous les virus recombinants de la vaccine exprimant les différentes constructions des glycoprotéines de HSV2 protègent des souris immunisées contre l'attaque ultérieure de HSV mortel dans des expériences analogues à celles décrites par Paoletti et al. (26). 



    ExemDle   14-EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE crI DU VIRUS 1 DE
L'HERPES BOVIN DANS DES RECOMBINANTS DU VIRUS
DE LA VACCINE
Clonaae du   aène   BHV1 aI dans des plasmides donneurs du virus de la vaccine
La séquence de nucléotides du gène BHV1 gl a été publiée antérieurement (63). En se référant maintenant à la Figure 32, un plasmide pIBRS6 contenant le gène BHV1   gI   (souche de Straub) a été obtenu de Rhône Mérieux, Lyon, France. L'extrémité   5'du   gène   gI   a été clonée en aval du promoteur H6 (41, 42, 69) et entre les bras qui flanquent le virus de la vaccine (de Copenhague).

   Ceci a été réalisé en clonant le fragment SalI-PstI de 540 bp de pIBRS6 dans un fragment SalI-PstI de 4400 bp de pGD5 [pGD5 a été engendré en clonant le gène HSV2 gD dans pTP15 (184) (Figure 3)]. Ceci place le gène   gI   en aval du promoteur H6 et entre les bras qui flanquent le virus HA de la vaccine. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR2. 



   Le codon d'initiation du promoteur H6 a été ensuite 

 <Desc/Clms Page number 108> 

 aligné avec le codon d'initiation du gène   gI.   Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides,
IBRL1 5'-   ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTGAACGCGCCGC-3 et  
IBRL2 5'-
GGCGCGTTCAGCACCGCCGCGAGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3', dans le fragment   NruI-SstII   de 3800 bp de pIBR2. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé pIBR4. 



   Un site NcoI, nécessaire pour des manipulations futures, a été engendré. Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides IBRL3   5'-CCATGGTTTAATGCA-3'et   IBRL4 5'TTAAACCATGGTGCA-3'dans le site PstI de pIBR4. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR5. 



   L'extrémité 3'du gène   gI   a été ensuite clonée dans pIBR5. Ceci a été réalisé en clonant le fragment-TthlllI-NcoI de 1740 bp de pIBRS6 dans le fragment TthlllI-NcoI de 3700 bp de pIBR5. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR7. 



   Un site BalII, nécessaire pour de futures manipulations, a été ensuite engendré. Ceci a été accompli en clonant les oligonucléotides IBRL5   5'-CATGGTTTAAGATCTC-3'et   IBRL6   5'-CATGGAGATCTTAAAC-3'dans   le site NcoI de pIBR7. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR8. 



   Une portion de la séquence leader hydrophile de grande longueur du gène   gI   a été ensuite supprimée (63). Ceci a été réalisé en clonant les oligonucléotides,   IBRL7 5'-   
ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCGCTAGCCGCTGCCCTGCTATGGGCGACGTGG
GCC-3'et IBRL8 5'-
CACGTCGCCCATAGCAGGGCAGCGGCTAGCGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT- 3', dans le fragment   NruI-ApaI   (partiel) de 4400 bp de pIBR8. 



  Ceci a élimine 132 bp de la séquence de tête hydrophile. Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR9. 



   Le gène   gI   tronqué promu par H6 a été ensuite   cloné   

 <Desc/Clms Page number 109> 

 dans un plasmide donneur différent du virus de la vaccine. 



  Ceci a été réalisé en clonant le fragment   NruI-BglII   de 1700 bp de pIBR9 dans le fragment NruI-BamHI de 4900 bp de pBP14 (211). Le plasmide engendré par cette manipulation est appelé pIBR10. 



   Construction de virus recombinant de la vaccine
La statégie utilisée pour cloner le gène BHV1   gI   dans le virus de la vaccine est illustrée sur la Figure 32. Le virus recombinant de la vaccine vP637 a été engendré en transfectant pIBR7 dans des cellules infectées par vP410. vP724 a été engendré en transfectant pIBR10 dans des cellules infectées par vP410. vP637 contient la totalité du gène BHV1   gI.   vP724 contient un gène   gI   dont on a supprimé 132 bp de la séquence de signal 5' (63). Les deux constructions utilisent le promoteur H6 précoce-tardif du virus de la vaccine (41, 42, 184). Le gène   gI   dans vP637 est   cloné   entre les séquences qui flanquent le gène HA.

   Le gène   gI   dans vP724 est   cloné   entre les séquences qui flanquent le gène ATI. 



   Immuno-fluorescence et détection d'un polypeptide codé par BHV1 dans des cellules infectées par un virus recombinant de la vaccine 
 EMI109.1 
 Dans des cellules infectées par BHV1, gI est exprimé sur la membrane du plasma. Des études d'immuno-fluorescence de cellules infectées par vP637 ou vP724 indiquent que le polypeptide codé par BHV1 produit dans ces cellules est également exprimé sur la membrane du plasma. L'immunofluorescence a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1. 



  Les anticorps   monoclonauxde BHV1   spécifiques à   gI,   à savoir 4203 et 5106, ont été utilisés (210). 



  Exemple 15-EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE qB DU VIRUS DE
L'HERPES FELIN DANS UN VIRUS RECOMBINANT DE LA
VACCINE
La souche WR du virus de la vaccine (202) a été utilisée dans cet exemple. Le virus vP293 de la vaccine recombinante dérivé de la souche de WR a été utilisé comme 

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 virus de sauvetage   (69).   



   Extraction de l'ADN de   FHV-1   et clonaqe du fragment
SacI-SacI de 3,2 kb de FHV-1
On a extrait et purifié l'ADN de FHV-1 à partir de la souche C   O.   Le génome de   l'ADN   de   FHV-1   a été digéré par EcoRI et lié au plasmide pBR322 en utilisant les procédures classiques (20). On a trié cette banque de FHV-l au moyen de sondes d'ADN dérivées des gènes de PRVgII (62) et de BHV-1 gB (203). Des hybridations subséquentes, au moyen de sous-clones dérivés des deux clones EcoRI trouvés positifs par hybridation, ont permis d'établir une carte plus précise du gène FHV-1 gB. Un fragment SacI-SacI de 3,2 kb contenant le gène   FHV-1   gB a été   cloné   dans pUC18, ce qui a engendré le plasmide pFHVgBC. 



     Séquencaqe   du fracrment de   SacI-SacI   codant   FHV-1     qB  
Les données de la séquence de nucléotides pour les deux brins ont été obtenues à partir de pFHVgBC et de sousclones dérivés de pFHVgBC en utilisant une séquenase T7 modifiée comme décrit ci-dessus. 



   Clonaae du   aene de SHV-l   aB dans un plasmide donneur du virus de la vaccine
En se référant maintenant à la Figure 33, le gène de   FhV-1   gB a été   cloné   en   pHES4,   un des plasmides conçus pour le système de sélection du domaine de réplication chez l'hôte dans la souche WR du virus de la vaccine (69) (Figure 10). Ce plasmide porte le gène   K1L   du domaine de l'hôte, qui permet au mutant de suppression vP293 de se répliquer sur des cellules humaines. Le gène FHV-1 gB a été inséré immédiatement en aval du promoteur H6 synthétique de la vaccine (69).

   Le plasmide pFHVgBC a été digéré par   KonI   et SacI et le fragment de restriction de 3150 bp contenant FHV-l gB a été isolé à partir d'un gel d'agarose, puis lié dans le plasmide pHES4 préalablement digéré   par KonI   et SacI. Le plasmide résultant a été appelé pJCA001 (Figure 33). 

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   Analyse de la séquence d'ADN du gène de   FHV-1   qB
En se référant maintenant à la Figure 34, l'analyse de la séquence d'ADN a révélé un cadre de lecture ouvert s'étendant des positions de nucléotide 337 à 3177. Des signaux putatifs de régulation transcriptionnelle ont été trouvés dans la région depuis   5'jusqu'au   codon d'initiation ATG en position 337. Une boîte TATA ayant la séquence AAATATAT (nucléotides 184 à 191) a été localisée 80 nucléotides en aval d'une boîte putative CAT ayant la séquence GGTGAGTA. Un signal de polyadénylation AATAAA (nucléotides 3251 à 3256) a été localisé 50 nucléotides en aval du codon de terminaison TAA (nucléotides 3178 à 3180).

   Huit parmi les onze nucléotides de la séquence   5'TCATTCTAGCA 3'   (nucléotides 200 à 210) sont complémentaires de la séquence d'ARN ribosomal   18S, 3'AGGAAGGCGT 5'   (61), et peuvent servir comme site de. fixation pour le ribosome. Un modèle de balayage a été proposé par lequel mARN eukaryotique amorce la traduction   (151,   155). Le contexte de séquence autour du codon d'initiation proposé ATCATGT (nucléotides 334 à 340) qualifie celuici comme contexte de séquence fonctionnelle pour l'initiation de la traduction du mARN eukaryotique. Le cadre de lecture 
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 ouvert de FHV-l gB code 947 acides aminés avec un poids moléculaire de 106, 2 kDa. La teneur en G + C est de 45, 8 %. 



   Analyse de la structure de la   Drotéine   FHV-1 aB
L'analyse de la séquence d'acides aminés a révélé un certain nombre de traits communs aux glycoprotéines associées à la membrane. Une région s'étendant des acides aminés 23 à 73 présente un profil d'hydrophobicité caractéristique et est proposée pour être la séquence de signal (Figure 34). En se référant maintenant à la Figure 35, on constate qu'il y a une séquence hydrophile longue de 22 acides aminés qui précède la séquence de signal hydrophobe de grande longueur.

   Cette caractéristique a également été notée pour le gène gII de la pseudo-rage (PRV) (62), pour le gène   g1   du virus 1 de l'herpès bovin-l   (B. hR-l),   pour le virus de 

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 l'herpès chevalin-l (EHV-1) (71), et les gènes gp 14 du virus de l'herpès chevalin-4 (EHV-4) (72), tous étant également des homologues de HSV gB. Une région hydrophobe constituée par 42 acides aminés (acides aminés 789 à 831) est prédite comme fonctionnant en tant que domaine d'ancrage transmembrane. Le domaine cytoplasmique hydrophile contient 116 acides aminés. Il existe dix sites   Asn-X-Thr/Ser   (où X peut être tout acide aminé sauf la proline) pour une glycosylation potentielle à liaison par l'azote (64), un site étant localisé dans la séquence de signal.

   Il y a deux sites de coupure protéolytiques potentiels consécutifs et voisins (Arg-Arg-Ser) (positions 504 à 506 et 516 à 518) identiques à ceux présents dans PRVgII (94), VZV gpII et HCMV gB (71) et   EHV-1   gpl4 (71,72). Le profil d'hydrophobicité de la séquence d'acides aminés de FHV-l gB est illustré sur la Figure 35. 



   Comparaison de la séquence d'acides aminés de FHV-l   crB   avec les   alycoprotéines   d'autres cellules du virus de l'herpès
La comparaison de la composition en acides aminés du gène de FHV-1 gB a révélé une homologie étendue avec les glycoprotéines d'autres virus de l'herpès. Ainsi, FHV-1 gB est homologue à PRVgII (62), BHV-1 gl (63), gII du virus de la varicelle zoster (VZV) (66,204),   HSV-l   gB (67), HSV-2 gB (205), EHV-l gpl4 (71), aussi bien qu'avec les glycoprotéines du virus d'Epstein-Barr (EBV) (68,206) et du cytomégalovirus humain (HCMV) (10). 



   Construction du recombinant de la vaccine vP713 exprimant la   qlycoprotéine   de FHV-1   qB  
Les séquences codant FHV-l gB ont été insérées dans un vecteur du virus de la vaccine utilisant le système de sélection du domaine de réplicabilité chez l'hôte du virus de la vaccine WR, à savoir pHES4/vP293 (69). La capacité de la descendance de la vaccine recombinante engendrée par recombinaison, en utilisant le système de sélection du domaine de 

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 réplicabilité chez l'hôte vP293/pHES du virus de la vaccine WR, pour former des plaques sur des cellules MRC-5 humaines permet une identification rapide de ces recombinants (69).

   Le virus recombinant de la vaccine vP713 a été obtenu par recombinaison réalisée avec le plasmide   pJCAOOl   comme plasmide donneur et vP293 comme virus de sauvetage (Figure 33). 



   Immuno-fluorescence de la   glycoprotéine   FHV-1 aB synthétisée Dar   vP713  
L'immuno-fluorescence de cellules de VERO et MRC-5 infectées par le virus recombinant de la vaccine vP713 a été réalisée comme décrit dans l'Exemple 1 en utilisant du sérum de brebis spécifique anti-FHV-l gB, sérum   n 2854.   On a utilisé plusieurs infections de deux pfu par cellule. On a utilisé comme second anticorps IgG de mulet anti-ovins, FITC. 



   FHV-1 gB est détectable sur la surface des cellules de VERO infectées au moyen de la vaccine recombinante vP713, aussi bien qu'intérieurement après fixation par l'acétone. 



  Aucune immuno-réactivité, interne ou de surface, significative vis-à-vis de   FHV-1   gB n'a été constatée. dans les cellules de contrôle infectées par vP410. 



     Immuno-Drécipitation   de   qlycoprotéine     FHV-1     QB   synthétisée par vP713
En vue d'établir la glycoprotéine de FHV-1 gB exprimée par vP713, des cellules de VERO ont été infectées par vP713 et les protéines ont été marquées métaboliquement par la 35S méthionine. On a réalisé des immuno-précipitations au moyen de lysats de cellules marquées radio-activement en utilisant un sérum ovin n02854 spécifiquement anti-FHV-1 gB. 



   Des monocouches de cellules de VERO, ensemencées au taux de 2 x 106, par boites de 60 mm, ont été infectées, à une faible multiplicité d'infection de 0,1 pfu par cellule, avec le virus de contrôle (vP410) ou le virus recombinant de la vaccine vP713. Des immuno-précipitations ont été réalisées comme décrit dans l'Exemple 1. 

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   Aucun produit significatif n'a été immuno-précipité par le sérum spécifique anti-FHV-l gB soit chez les cellules de VERO non infectées, soit chez les cellules de VERO infectées avec le virus de la vaccine de contrôle vP410. Les produits marqués radio-activement de FHV-l gB ont été précipités par le sérum n02854 à partir de cellules de VERO infectées par vP713. Cinq polypeptides dominants, métaboliquement marqués, ont été spécifiquement précipités. Les deux plus grands polypeptides, de poids moléculaire apparent de 115 kDa et 110 kDa, pourraient correspondre au précurseur non-glycosylaté et aux protéines matures (dimensions théoriques respectivement de 106 kDa et 98 kDa).

   Une large bande de 68 kDa pourrait représenter les deux sous-unités glycosylatés (69 kDa   + 66   kDa) résultant de la coupure protéolytique d'un précurseur glycosylaté (136 kDa) qui manquent ici. Trois produits précipités de plus faible dimension (59,53 et 48 kDa) ne correspondent à aucun produit de FHV-1 gB et peuvent représenter des produits de dégradation. 



    ExemDle     16-CLONAGE   ET EXPRESSION DE LA GLYCOPROTEINE DU
VIRUS   D'EPSTEIN-BARR   DANS DES VECTEURS DE
POXVIRUS 
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 Clonage des qènes de EBV cru340 et crp220 dans un plasmide donneur de vaccine pMP409DVC 
Dans cet exemple, les gènes de EBV ont été isolés de la souche de B95-8 de EBV (207) ; les gènes gp340 et gp220 étaient des clones de cADN (plasmides pMLPgp340 et pMLPgp220, respectivement) et les gènes de gB, gH et BBRF3 ont été isolés à partir d'une banque de gènes BamHI. En se référant maintenant à la Figure 36, un fragment XmaI-ClaI de 2100 bp du plasmide pMLPgp220 a été   cloné   dans M13mpl8 digéré par 
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 XmaI-AccI. Le phage obtenu par cette manipulation a été appelé mpl8gp220 (Figure 36).

   Par mutagénèse in vitro (17) en utilisant les oligonucléotides CM4 (TAAAGTCAATAAATTTTTATTGCGGCCGCTACCGAGCTCGAATTCG) et CM5   (GCTTGCATGCCTGCAGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGCAGCCTTGC)   

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 le gène gp220 a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide contenant le gène gp220 modifié a été appelé mpl8gp220 (5+4) (Figure 36). 



   Le gène gp220 modifié a été   cloné   dans le plasmide SP131NotI qui contient la totalité du promoteur synthétique H6 (69). Ceci a été réalisé en clonant le fragment NarI-EcoRV de 2300 bp de   mpl8gp220   (5+4) dans le fragment EcoRI-NarI de 2940 bp du plasmide SP131NotI. Le plasmide résultant a été appelé SP131gp220 (Figure 36). 



   Le gène gp340 sous le contrôle du promoteur H6 a été obtenu en clonant un fragment ScaI-XhoI de 2360 bp de pMLPgp340 dans le plasmide SP131gp220 digéré par XhoI-ScaI (partiel). Le plasmide résultant a été appelé SP131gp340 (Figure 36). 



   Les gènes gp340 et gp220 promus par H6 ont été   clonés   dans le locus d'insertion M2L du virus de la vaccine du plasmide pMP409DVC (Figure 4 ; sur les Figures 36 et 40, ce plasmide est appelé MP409). Ceci a été réalisé en clonant le fragment NotI du plasmide   SP13lgp340,   fragment traité par la nucléase de fève de Mung et ayant 2800 bp, et le fragment NotI du plasmide   SP131gp220,   fragment traité par la nucléase de fève de Mung et ayant 2100 bp, dans le plasmide pMP409DVC au site   BqlII   traité par la nucléase de fève de Mung. Les plasmides résultants ont été appelés 409H6340 et 409H6220, respectivement (Figure 36). 



   Clonaqe du gène de EBV   qB   dans le plasmide donneur du virus de la vaccine   pMP409DVC  
En se référant maintenant à la Figure 37, un fragment EcoRI-XmnI de 3500 bp du fragment A d'ADN par BamHI, contenant le gène EBV gB, a été isolé à partir de la librairie génomique de EBV et   cloné   dans le fragment HincII-EcoRI de 2837 bp de pIBI25. Le plasmide résultant a été appelé p25gB (Figure 37). 



   Par mutagénèse in vitro (17,185) en utilisant les 

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 nucléotides EBVBM5 (CCCTACGCCGAGTCATTACGATACAAACTTAACGGATATCAGAGTCGTACGTAGG) et EBVBM3   (CTGGAAACACTTGGGAATTCAAGCTTCATAAAAAGGGTTATAGAAGAGTCC),   le gène gB a été adapté pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide résultant a été appelé p25gB (5+3). 



   Le fragment EcoRV-EcoRI de 2600 bp de p25gB (5+3) a été   cloné   dans le fragment EcoRV-EcoRI de 3300 bp de SP131. 



  Le plasmide résultant a été appelé SP131gB (Figure 37). 



   Le gène gB du promoteur H6 a été ensuite   cloné   dans le plasmide donneur   pl1P409DVC   du virus de la vaccine. Ceci a été réalisé en clonant le fragment HindIII de 2700 bp traité par la nucléase de fève de Mung, dans le site   BqlII   traité par la'nucléase de fève de Mung, de   pMP409DVC.   Le plasmide résultant a été appelé 409H6gB (Figure 37). 



   Clonaae du cène EBV aH dans le plasmide donneur de vaccine   pSD486VC  
Dans la librairie des fragments de restriction   clonés   de EBV BamHI, le cadre de lecture ouvert de BXLF2 est contenu dans les fragments BamHI X et BamHI T (207). Comme montré sur la Figure   38,   le cadre de lecture ouvert complet de BXLF2 a été reconstitué en clonant le fragment SmaI-BamHI de 830 bp de BamHI X dans le fragment SmaI-BamHI de 2880 bp de pIBI24 ; le plasmide résultant a été appelé 24gH5. Le 
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 fragment BamHI-HindIII de 1850 bp de BamHI T a été cloné dans le fragment BamHI-HindIII de 3360 bp de 24gH5. Le plasmide   résultant, contenant   le gène gH complet, a été appelé 24gH (Figure 38). 



   Par mutagénèse in vitro (17,185) en utilisant les nucléotides 
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 HM5 (ACACAGAGCAACTGCAGATCTCCCGATTTCCCCTCT), HM4 (GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCTGCG) et HM3 (GCCAGGGTTTTCCCAGAGATCTGATAAAAACGACGGCCAGTG) 

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 le gène gH a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur précoce hémorragique   (g)   de la vaccine. L'oligonucléotide HM4 a été utilisé pour enlever un signal d'arrêt de transcription précoce de la vaccine contenu dans le gène gH (45). Le plasmide contenant le gène gH modifié a été appelé 24gH (5+4+3). 



   En se référant maintenant à la Figure 38, le promoteur   g   de la vaccine est contenu dans le plasmide pSD486 VC (Figure 30). (Sur la Figure 38, ce plasmide est appelé SD486). Le fragment BalII de 2330 bp, traité par la nucléase de fève de Mung, de 24gH (5+4+3) a été   cloné   dans le fragment   BU IL   traité par la nucléase de fève de Mung, de pSD486VC. La dernière phase de clonage a mis le gène gH sous le contrôle du promoteur   p.   de la vaccine. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 486gH (Figure 38). 



   Clonaqe du cadre de lecture ouvert de BBRF3 dans le plasmide donneur du virus de la vaccine   PCOPSC-5H  
Le cadre de lecture ouvert complet BBRF3 est contenu dans le fragment BamHI B de l'ADN de EBV. Ce fragment a été digéré par   BspHI,   traité par la E. Coli ADN polymérase I (fragment de Klenow) et digéré par BqlII. Le site BalII dans le fragment BamHI A est disposé 10 bases avant le codon d'arrêt de BBRF3. Le fragment BspHI-BqlII de 1230 bp a été isolé et   cloné   dans le fragment   SmaI-BcrIII   de 4200 bp du plasmide pCOPCS-5H. [Le plasmide pCOPCS-5H est identique au plasmide pCOPCS657 (Figure 16)]. Le plasmide engendré par cette manipulation est désigné COPSCEBVX. 



   Clonage des   gènes   EBV   on340,   aB et qH dans le plasmide donneur du virus de la vaccine   pSD513VCVO  
Le plasmide donneur de virus de la vaccine utilisé pour engendrer le triple recombinant EBV est le plasmide pSD513VCVQ (Figure 29). Ce plasmide contient un sous-clone du fragment HindIII J du virus de la vaccine de Copenhague dans lequel la séquence de codage pour le gène de thymidine kinase est remplacée par une région de polyliaison. 

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   Dans cette première phase, le gène gH de EBV promu par   Il,   a été   cloné   dans pSD513VCVQ. En particulier, le fragment SmaBI-BqlII de 2300 bp a été   cloné   dans le fragment SmaBI-BalII de 4000 bp de pSD513VCVQ. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé 513UgH. 



   Ensuite, le gène EBV gp340 promu par H6 a été   cloné   dans   513gH.   En particulier, le fragment NotI de 2800 bp, traité par la nucléase de fève de Mung, de   SP13lgp340   a été   cloné   dans le fragment XhoI-PstI de 6300 bp, traité par la nucléase de fève de   Kung,   de 513UgH. Le plasmide engendré par cette manipulation a été appelé   513UgH340H6.   



   Puis, le gène gB de EBV promu par H6 a été   cloné   dans 513UgH340H6. En particulier le fragment HindIII de 2700 bp, traité par la nucléase de vève de Mung, de SP131gp340 a été   cloné   dans le fragment   BcflII   de 9100   bp,,   traité par la nucléase de fève de Mung, de 513UgH340H6. Le plasmide résultant a été appelé 513gHgBp340 (Figure 39). 



   Construction de virus recombinant de la vaccine
EBV gp340 (plasmide donneur 409H6340), EBV gp220 (plasmide donneur. 409H6220) et EBV gB (plasmide donneur 409H6gB) ont été recombinés dans le virus de la vaccine vP458 (site M2L) : ces virus recombinants simples (single) de la vaccine ont été appelés vP474, vP480 et vP561, respectivement. EBV gH (plasmide donneur 486gH) a été recombiné dans le virus de la vaccine vP533 (site d'insertion   Il)   : ce virus recombinant de la vaccine simple a été appelé vP611. 



   Finalement, le virus recombinant triple de la vaccine contenant gp340, gB et gH a été obtenu par recombinaison du plasmide donneur 513gHgBgp340 dans le virus de la vaccine vP617 au site d'insertion de thymidine kinase. Ce virus recombinant est appelé vP712. vP617 est un virus de la vaccine de Copenhague dont on a supprimé les gènes TK, HA et ATI. 

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     Immuno-fluorescence des proteines d'EBV   dans les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
Des études   d'immuno-fluorescence   réalisées sur des cellules infectées par vP474 (gp340) et vP480 (gp220), en utilisant l'anticorps monoclonal F29-89 (165), ont révélé des protéines de EBV gp340 et EBV gp220 exprimées sur la membrane du plasma. 



   Les cellules infectées par   vP611   (gH), en utilisant un sérum humain, ont révélé un faible signal positif sur la membrane du plasma. 



   Finalement, la même expérience a été réalisée avec des cellules infectées par vP712 (triple recombinant de la vaccine EBV) : un signal positif sur la membrane du plasma a été obtenu avec les anticorps monoclonaux F29-89 et NEA 9247 (spécificité gB obtenue de DuPont). 



     Immuno-précipitation   des protéines EBV dans les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
La glycoprotéine gp340 de EBV produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire d'approximativement 340 kDa (165). Les cellules infectées par les virus recombinants de la vaccine vP474 ou vP712 produisent également une protéine codée par EBV d'environ 340 kDa (immuno-précipitation réalisée avec l'anticorps monoclonal F29-89). La glycoprotéine gp220 de EBV a un poids moléculaire de 220 kDa (165). Les cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine vP480 produisent une protéine codée par EBV d'approximativement 220 kDa. 



   La glycoprotéine gH de EBV produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire de 110 kDa à 125 kDa avec une forme de précurseur de 93 kDa (206, 208). Les cellules infectées avec les virus recombinants de la vaccine vP561 ou vP712 produisent une protéine principale d'EBV avec un poids moléculaire d'approximativement 125 kDa 

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 et quatre protéines mineures avec des poids moléculaires d'approximativement 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa et 45 kDa. 



   La glycoprotéine EBV gH produite dans les cellules infectées par EBV a un poids moléculaire de 85 kDa avec une forme de précurseur de 70 kDa (209). Les cellules infectées par le virus recombinant   vP611   produisent une protéine codée par EBV d'approximativement 85 kDa. 



   Immunisation de lapins au moyen de recombinants de la vaccine exprimant les   glycoprotéines   de EBV
Des lapins ont été immunisés au moyen de vP474 (gp340) ou vP480 (gp220) ou   vP561   (gB) ou vP611 (gH) ou   vP712   (triple). Après un rappel, les sérums ont été testés par immuno-fluorescence sur des cellules B95-8 traitées par TPA. Des signaux positifs ont été obtenus dans chaque cas. Une   activité de neutralisation in a été démontrée en   utilisant des sérums dressés contre vp474 (gp340). 



  Exemple 17-CLONAGE ET EXPRESSION DES ANTIGENES DE GLYCO-
PROTEINE DU CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN DANS DES
VECTEURS DE POXVIRUS
Clonaqe du   cène HCMV aB   dans le plasmide donneur de la vaccine   DMP409DVC'  
En se référant maintenant à la Figure 40, le fragment HindIII-BamHI de 4800 bp du fragmenT HindIII D de HCMV ADN a été   cloné   dans le fragment HindIII-BamHI de 2800 bp du plasmide pIBI24. Par mutagénèse in vitro (17,185) en utilisant les nucléotides CMVM5 (GCCTCATCGCTGCTGGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAATCCAGGATCTG)
CMVM3 (GACAGATTGTGATTTTTATAAGCATCGTAAGCTGTCA), le gène HCMV gB a été modifié pour être exprimé sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide contenant le gène   K. CMV   gB modifié a été appelé 24CMVgB (5+3) (Figure 40).. 



   Ensuite, on a   cloné   le fragment EcoRV-BamHI de 2900 bp de 24CMVgB (5+3) dans le fragment   EcoRV-BcrlII   de 3100 bp du 

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 plasmide pSP131 qui contient le promoteur synthétique H6 (69). La phase de clonage a mis le gène HCMV gB sous le contrôle du promoteur H6 de la vaccine. Le plasmide résultant a été appelé SP131gB. 



   Finalement, le gène HCMV gB promu par H6 a été   cloné   dans le plasmide donneur de la vaccine pMP409DVC. Le fragment HindIII de 3000 bp, traité par la nucléase de la fève de Mung, de SP13lgB a été   cloné   dans le site   BQlIII   traité par la nucléase de fève de Mung, de pMP409DVC. Le plasmide résultant a été appelé   409CMVgB   (Figure 40). 



   Construction du virus recombinant de la vaccine
Le gène CMV gB, promu par H6, dans le plasmide 409CMVgB a été inséré dans le site de M2L du virus de sauvetage vP458. Le virus recombinant de la vaccine a été appelé vP525. 



   Immuno-fluorescence de la protéine CMV   qB   dans des cellules infectées par le virus recombinant de la vaccine
Des études d'immuno-fluorescence sur des cellules infectées par vP525, en utilisant un anticorps monoclonal ou un sérum polyclonal de cobaye, a révélé HCMV gB exprimé sur la membrane du plasma. 



     Immuno-précipitation   de CMV aB dans des cellules infectées par un recombinant de la vaccine
La glycoprotéine CMV gB produite dans des cellules infectées de CMV a un poids moléculaire de 55 kDa avec une forme de précurseur de 130 kDa (172). Des cellules infectées par vP525 produisent deux protéines codées par CMV gB d'approximativement 130 kDa et 55 kDa. 



   Séquences de nucléotides de HXLF1 et HXLF2
La famille des gènes HXLF est localisée dans le fragment HindIII X de l'ADN génomique HCMV (172). En utilisant des promoteurs d'oligonucléotide spécifiques, la séquence de nucléotide de HXLF1 et HXLF2 a été déterminée (Figures 41,42). HXLF1 est long de 648 nucléotides et code 

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 pour une protéine de 215 acides aminés. HXLF2 est long de 558 nucléotides et code pour une protéine de 185 acides aminés. 



  Les séquences de nucléotides des mêmes gènes (souche   lDl69-   HCMV) ont été publiées (173) et des études de comparaison montrent une homologie à 99 % pour HXLF1 et une homologie de 96 % pour HXLF2. 



   Immunisation de cobayes avec recombinants de la vaccine exprimant des antigènes de HCMV
Trois cobayes ont été immunisés par vP525. Après un rappel, les animaux ont développé des anticorps neutralisants de HCMV (titre moyen : 518). De manière intéressante, 50 à 87 % de l'activité neutralisante des sérums humains séropositifs HCMV peuvent être absorbés par des cellules infectées par vP525. Ce résultat indique l'importance potentielle de HCMV gB comme vaccin subunitaire. 



   Comme il va de soi, l'invention telle que revendiquée ci-après n'est pas limitée aux modes de réalisations décrits mais elle englobe toutes les variantes et modifications qui pourront apparaître à l'homme de l'art. 

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   REFERENCES 1. Allen, G. P. and J. T. Bryans, In : Progress in Veterinary
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Claims (52)

  1. EMI136.1
  2. 2. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin.
  3. 3. Poxvirus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin est la glyccprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin.
  4. 4. Poxvirus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de 1'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.
  5. 5. Poxvirus dite selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN code pour deux glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin.
  6. 6. Poxvirus recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdites glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin sont la glycoprotéine gpl3 et la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.
  7. 7. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé chez un hôte par la production d'une glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin.
  8. 8. Poxvirus recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin.
  9. 9. Poxvirus recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de 1'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.
  10. 10. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, <Desc/Clms Page number 137> caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé dans un hôte par la production de deux glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin.
  11. 11. Poxvirus recombinant selon la revendication 10, caractérisé en ce que lesdites glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin sont la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin et la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.
  12. 12. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pcxvirus est un virus de la vaccine.
  13. 13. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.
    13 REVECICATICKS R-v : ssr CATIONs 1. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant d'un virus de l'herpès chevalin dans une région non essentielle du génome du poxvirus.
  14. 14. Poxvirus recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe constitué par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.
  15. 15. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans ledit poxvirus par recombinaison.
  16. 16. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant du virus de l'herpès chevalin et un promoteur pour exprimer ledit ADN.
  17. 17. Vaccin pour introduire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec ledit vaccin, caractérisé en ce que ledit vaccin comprend un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de l'ADN provenant du virus de l'herpès chevalin.
  18. 18. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime une glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin.
  19. 19. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin est la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin.
  20. 20. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin est <Desc/Clms Page number 138> EMI138.1 la glyccprctéine cpl-du virus de l'herpès chevalin.
  21. 21. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime deux glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin.
  22. 22. Vaccin selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites glycoprotéines du virus de l'herpès chevalin sont la glycoprotéine gpl3 du virus de l'herpès chevalin et la glycoprotéine gpl4 du virus de l'herpès chevalin.
  23. 23. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que le poxvirus est un virus de la vaccine.
  24. 24. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.
  25. 25. Vaccin selon la revendication 24, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe consituté par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.
  26. 26. Vaccin selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans le poxvirus par recombinaison.
  27. 27. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome du poxvirus.
  28. 28. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce que ledit virus de l'herpès est un membre de la sous-famille des virus de l'herpès choisis dans le groupe constitué par l'alphaherpèsvirus, le betaherpèsvirus et le gammaherpèsvirus.
  29. 29. Poxvirus recombinant selon la revendication 28, caractérisé en ce que ledit virus de l'herpès est choisi dans le groupe constitué par le virus de l'herpès chevalin, le virus de la pseudo-rage, le virus de l'herpès simplex, le virus de l'herpès bovin, le virus de l'herpès félin, le virus d'Epstein-Barr et le cytomégalovirus humain.
  30. 30. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN code pour une glycoprotéine du virus de l'herpès. <Desc/Clms Page number 139>
  31. 31. Poxvirus reccbinant selon la revendication 30, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès est choisie dans le groupe constitué par gpl3 du virus de l'herpès chevalin, gpl4 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gE du virus de l'herpès chevalin, gp50 du virus de la pseudo-rage, gpII du virus de la pseudo-rage, gpIII du virus de la pseudo-rage, gpI du virus de la pseudorage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, gD du virus de l'herpès simplex, gl du virus de l'herpès bovin, g3 du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, g ? 340 du virus d'Epstein-Barr, gB du virus d'Epstein-Barr,
    gH du virus d'Epstein-Barr et gB du cytomégalovirus humain.
  32. 32. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN code pour au moins deux glycoprotéines du virus de l'herpès.
  33. 33. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé chez un hôte par la production d'une glycoprotéine du virus de l'herpès.
  34. 34. Poxvirus recombinant selon la revendication 33, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès chevalin est choisie dans le groupe constitué par gpl3 du virus de l'herpès chevalin, gpl4 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gE du virus de l'herpès chevalin, gp50 du virus de la pseudo-rage, gpII du virus de la pseudo-rage, gpIII du virus de la pseudo-rage, gpI du virus de la pseudorage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, gD du virus de l'herpès simplex, gI du virus de l'herpès bovin, gB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, gp340 du virus d'Epstein-Barr, gB du virus d'Epstein-Barr, gH du virus d'Epstein-Barr et gB du cytomégalovirus humain.
  35. 35. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, <Desc/Clms Page number 140> caractérisé en ce que ledit ADN est exprimé chez un hôte par la production d'au moins deux glycoprotéines du virus de l'herpès.
  36. 36. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que le poxvirus est un virus de la vaccine.
  37. 37. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.
  38. 38. Poxvirus recombinant selon la revendication 37, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe constitué par le pcxvirus des volailles et le poxvirus du canari.
  39. 39. Poxvirus recombinant selon la revendication 27, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans ledit poxvirus par recombinaison.
  40. 40. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN du virus de l'herpès et un promoteur pour exprimer ledit ADN.
  41. 41. Vaccin pour introduire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec ledit vaccin, caractérisé en ce que ledit vaccin comprend un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de l'ADN provenant du virus de l'herpès.
  42. 42. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que le virus de l'herpès est un membre de la sous-famille du virus de 1'herpès choisi dans le groupe constitué par l'alphaherpèsvirus, le betaherpèsvirus et le gammaherpèsvirus.
  43. 43. Vaccin selon la revendication 42, caractérisé en ce que le virus de 1'herpès est choisi dans le groupe consitué par le virus de l'herpès chevalin, le virus de la pseudo-rage, le virus de 1'herpès simplex, le virus de l'herpès bovin, le virus de l'herpès félin, le virus d'Epstein-Barr et le cytomégalovirus humain.
  44. 44. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime une glycoprotéine du <Desc/Clms Page number 141> virus de l'herpès.
  45. 45. Vaccin selon la revendication 44, caractérisé en ce que ladite glycoprotéine du virus de l'herpès est choisie dans le groupe constitué par gpl3 du virus de l'herpès chevalin, gpl4 du virus de l'herpès chevalin, gD du virus de l'herpès chevalin, gp63 du virus de l'herpès chevalin, gE du virus de l'herpès chevalin, gp50 du virus de la pseudo-rage, gpII du virus de la pseudo-rage, gpIII du virus de la pseudorage, gpI du virus de la pseudo-rage, gB du virus de l'herpès simplex, gC du virus de l'herpès simplex, gD du virus de l'herpès simplex, gI du virus de l'herpès bovin, gB du virus de l'herpès félin, gp220 du virus d'Epstein-Barr, gp340 du virus d'Epstein-Barr, gB du virus d'Epstein-Barr, gH du virus d'Epstein-Barr et gB du cytomégalovirus humain.
  46. 46. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit ADN code pour et exprime au moins deux glycoprotéines du virus de l'herpès.
  47. 47. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que le poxvirus est un virus de la vaccine.
  48. 48. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que le poxvirus est un poxvirus aviaire.
  49. 49. Vaccin selon la revendication 48, caractérisé en ce que le poxvirus aviaire est choisi dans le groupe constitué par le poxvirus des volailles et le poxvirus du canari.
  50. 50. Vaccin selon la revendication 41, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans ledit poxvirus par recombinaison.
  51. 51. Poxvirus recombinant destiné à être inocule à un nouveau-né pour éviter l'immunité maternelle chez celui-ci, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome du poxvirus, ledit ADN codant pour un premier antigène du virus de l'herpès d'un agent pathogène du nouveau-né, ledit premier antigène du virus de l'herpès étant différent d'un second antigène du virus de l'herpès utilisé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis du pathogène chez la mère du nouveau-né. <Desc/Clms Page number 142>
  52. 52. Poxvirus recombinant destiné à être inoculé à un nouveau-né pour éviter chez celui-ci l'immunité maternelle, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN du virus de l'herpès dans une région non essentielle du génome de ce premier poxvirus, ledit ADN codant pour un antigène du virus de l'herpès d'un pathogène du nouveau-né, ledit premier poxvirus étant différent d'un second poxvirus recombinant utilisé pour induire une réponse immunologique vis-à-vis d'un pathogène chez la mère du nouveau-né.
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