KR20200135505A - 면역원성 조성물의 제조방법 - Google Patents

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엘리다 바우티스타
캐시 슐레진저
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Abstract

본 발명은, 특히 감소된 바이러스 박멸 활성을 나타내는 면역원성 조성물을 제조하는 방법 뿐만 아니라 상기 면역원성 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상기 방법은 특히 하기의 단계들을 포함한다: (a) 혼합물에 제1 액체 및 재조합 단백질을 제공하는 단계, (b) 상기 혼합물로부터 제1 액체의 일부를 제거하여 상기 혼합물 중의 재조합 단백질을 농축시키는 단계, 및 (c) 단계 (b)에서 생성된 용액을 연속 정용여과에 의해 가공처리하는 단계.

Description

면역원성 조성물의 제조방법
본 발명은 감소된 바이러스 박멸 활성을 나타내는 면역원성 조성물 및 이러한 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
돼지 서코바이러스 2형 (PCV2)은 소형 (직경 17-22 nm)의 외피가 없는 정20면체형 DNA 바이러스로, 단일 가닥 원형 유전체를 함유하고 있다. PCV2는 돼지 서코바이러스 1형 (PCV1)과 대략 80%의 서열 동일성을 공유하고 있다. 그러나, 일반적으로 병독성이 없는 PCV1과는 대조적으로, PCV2로 감염된 돼지는 흔히 이유 후 전신성 소모성 증후군 (Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)이라고 부르는 증상을 보인다. PMWS는 쇠약, 피부의 창백함, 수척, 호흡 곤란, 설사, 황달(icterus 또는 jaundice)의 임상적 증상을 특징으로 한다. 감염된 일부 돼지에서는, 모든 증상들이 복합적으로 나타나는 반면, 다른 돼지에서는 이러한 증상들 중 한두 가지만 나타난다. 부검이 이루어지는 동안, 미시적 및 거시적 병소들도 여러 조직과 장기에서 볼 수 있는데, 림프 기관이 가장 흔한 병소 부위이다. PCV2 핵산 또는 항원의 양과 미시적 림프계 병소의 중증도 간에 밀접한 상관관계가 있음이 관찰된 바 있다. PCV2로 감염된 돼지의 치사율은 80%에 육박할 수 있다. PMWS 이외에도, PCV2는 가성광견병, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 (PRRS), 글래써병(Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염, 살모넬라균증, 이유 후 대장균증(postweaning colibacillosis), 식이요법성 간기능장애, 화농성 기관지폐렴을 비롯한 여러가지 다른 감염증들과도 관련이 있다.
여러가지 백신들을 이용하여 돼지에서 PCV2 감염의 영향을 줄일 수 있다. 미국 특허 6,703,023호는 돼지의 PMWS 예방용 DNA 기반 백신을 제시하고 있다. WO 03/049703호에는 비병원성 PCV1 바이러스를 포함하는 키메라 생백신의 제조에 대해 기술되어 있으나, ORF2 단백질이 병원성 PCV2의 ORF2 단백질로 대체되어 있다. WO 99/18214호 및 WO 99/29717호는 사멸 PVC2 백신의 제조를 위한 여러가지 PCV2 균주들과 절차를 제시하였다. 또한, WO 99/18214호 및 WO 99/29717호에는 소단위 백신의 제조에 대해서도 기술되어 있다. 효과적인 ORF2 기반의 소단위 백신으로는 WO 06/072065호에 보고된 바 있다. 추가의 ORF2 기반 소단위 백신은 WO 07/28823호에도 설명되어 있다.
SDS-PAGE 겔 상에서 가동하였을 때 분자량이 약 30 kDa인 PCV2의 오픈 리딩 프레임 2 (ORF2) 단백질은 과거 PCV2용 백신과 면역원성 조성물에서 항원 성분으로 이용되었던 바 있다. 이러한 백신과 조성물에 사용되는 ORF2를 수득하는 전형적인 방법은, 일반적으로 ORF2를 암호화하는 PCV2 DNA를 증폭시키는 단계, 숙주 세포 내에서 상기 ORF2 단백질을 발현시키는 단계, 및 세포 용해를 통해 상기 숙주 세포로부터 상기 ORF2 단백질을 추출하는 단계로 이루어진다. 이후, 상기 회수한 ORF2 세포 용해물을 면역원성 조성물 또는 백신의 항원 부분으로 사용한다. 경우에 따라서는, 세포 용해물을 함유하는 ORF2가 세포 잔해물로부터 분리되기도 한다.
PCV2에 대한 면역원성 조성물 및 기타 다른 병원체들에 대한 다양한 면역원성 조성물들은 다른 항원들에 대해 바이러스 박멸 효과를 나타내는 경우가 많다. 예를 들어, 미국의 현행 규제 표준 (9 CFR 113.35)은 다가 조성물에서 일부의 바이러스 박멸 활성을 허용하고는 있지만, 이러한 바이러스 박멸 활성으로는 해당 면역원성 조성물 중의 다른 성분들과 혼합되었을 때 0.7 log/mL 이상의 생바이러스 손실 또는 0.7 log/mL CFU 미만의 생박테리아 손실을 유도할 수는 없다. 허용치보다 더 많은 바이러스 박멸 활성을 보유하는 조성물은 다른 항원들과 혼합하여 다가 백신을 제조할 수 없다.
이러한 목적을 위해, WO 11/28888호는 PCV2 항원을 포함하는 조성물의 바이러스 박멸 활성을 감소시키는 방법 뿐만 아니라, 바이러스 박멸 활성을 감소시킨 PCV2 항원을 포함하는 항원 제제 및 면역원성 조성물을 제시하고 있다. 보다 구체적으로, WO 11/28888호는 이러한 PCV2 항원 조성물을 대량 제조 방법을 교시하는데, 상기 방법은
i) ORF2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함하는 PCV2 항원을 포함하는 제1 액체를 수득하는 단계; 및
ii) 필터를 사용하는 여과 단계에 의해 ORF2 단백질의 바이러스 유사 입자를 포함하는 PCV2 항원으로부터 상기 제1 액체의 적어도 일부를 제거하는 단계를 포함하고,
이 경우, 상기 필터는 PCV-2 항원보다 작은 평균 공극 크기를 갖는 반투과성 막을 포함함으로써, 상기 반투과성 막 공극들을 통해 PCV2 항원 중 적어도 90%의 투과를 방지하여 해당 필터 내에 PCV2 항원을 보유하게 되며,
여기서, 상기 제1 액체의 일부는 상기 제1 액체와는 상이한 제2 액체로 교환함으로써 상기 PCV2 항원으로부터 제거되는 것이고,
상기 제1 액체의 일부를 상기 제2 액체로 교환하는 작업은
a) PCV-2 항원을 함유하는 제1 액체에 제2 액체를 첨가하는 것을 포함하는 액체 첨가 단계;
b) 제1 및 제2 액체의 일부를 제거함으로써 PCV-2 항원을 제1 액체의 부피에 비해 3X 내지 50X로 농축하는 단계를 포함한다.
그러나, 바람직하게는 제2 액체를 초과량의 부피로 제1 액체에 첨가하는 것을 포함하는 상기 액체 첨가 단계 a)는, 생성되는 제1 및 제2 액체의 부피를 일반적으로 농축 단계 b) 전에 제1 액체의 부피에 비해 몇배로 증가시키기 때문에, 총 생산 규모의 부피에 제약을 가져올 수 있다.
따라서, 감소된 바이러스 박멸 효과를 갖는 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 더 큰 규모, 심지어 매우 대규모로 제조하는 방법들이 더 필요한 실정이다.
따라서, 상술한 기술적 과제들은 상세한 설명과 청구범위에 본 발명의 특징을 나타낸 실시양태들에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태들은 청구범위에 따라서 구현된다.
본 발명은 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법이 원하는 목적상 충분하다는 놀라운 발견을 바탕으로 하는데, 여기서 상기 방법은, 바람직하게는 하기의 순서로 하기의 단계들로 이루어지거나 하기의 단계들을 포함한다:
(a) - 제1 액체, 및
- 재조합 단백질 및/또는 다수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 4차 구조를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거함으로써, 상기 혼합물 중의 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 농축시키는 단계, 및
(c) 연속 정용여과, 특히 제2 액체에 대한 연속 정용여과에 의해 단계 (b)에서 생성된 용액을 가공처리하는 단계 (여기서, 제2 액체는 제1 액체와 상이함).
본원에 사용된 "제1 액체"라는 용어는 각각 "초기 액체" 또는 "액체 (1)"이라는 용어와 동일한 것으로 이해한다. 따라서, "제1 액체"라는 용어는 "액체 (1)"이라는 용어 또는 "초기 액체"라는 용어와 서로 교환할 수 있다.
또한, 본원에 사용된 "제2 액체"라는 용어는 각각 "추가의 액체" 또는 "액체 (2)"라는 용어와 동일한 것으로 이해한다. 따라서, "제2 액체"라는 용어는 "액체 (2)"라는 용어 또는 "추가의 액체"라는 용어와 서로 교환할 수 있다.
한 바람직한 양태에서, 단계 (a)의 혼합물은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 함유하는데, 여기서는 상기 벡터를 불활성화제에 의해 불활성화시켰다. 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 단계 (a)의 혼합물은 중화제에 의해 중화시킨 불활성화제를 추가로 함유한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 단계 (a)의 혼합물은 중화제를 추가로 함유한다.
본원에 언급된 바와 같이, 특히 "단계 (a)의 혼합물"이라는 용어는 "단계 (a)에서 제공된 혼합물"과 동의어인 것으로 이해한다. 본원에 사용된 "단계에서 제공되는"이라는 용어는 특히 "단계에 의해 제공되는"과 동일한 것으로 이해한다.
또한, 본 발명은, 상기 단계 (a)의 혼합물이 추가로
- 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 불활성화제에 의해 불활성화시킨 벡터, 및/또는
- 중화제에 의해 중화시킨 불활성화제, 및/또는
- 중화제를 포함하고,
상기 단계 (a)의 혼합물이 바람직하게는 상기 벡터, 상기 중화된 불활성화제 및 중화제를 추가로 함유하는 것인, 본원에 설명 및/또는 청구된 방법에 관한 것이다.
또한, 단계 (c)에서는, 단계 (b)에서 생성된 용액은 바람직하게는 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 공정 용액 중에서 감소하도록 연속 정용여과에 의해 가공처리한다.
본 발명의 양태들을 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 해당 문맥에서 명백하게 달리 설명하지 않는 한 복수에 대한 언급도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어 "항원"에 대한 언급은 복수의 바이러스를 포함하며, "바이러스"에 대한 언급은 당업자의 숙련자들에게 공지된 하나 이상의 바이러스 및 이의 균등물에 대해 언급하는 것 등이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 출원이 속한 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법과 물질들을 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있지만, 바람직인 방법, 장치 및 물질들을 이제 기재한다. 본원에 언급된 모든 간행물들은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물들에 보고된 세포주, 벡터 및 방법들을 기재 및 개시할 목적으로 본원에 참조로 인용된다. 본원에서 그 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 개시내용보다 앞서지 않는다는 것을 허용하는 것으로 이해되어서는 안된다.
한 양태에서, 본 발명은 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은, 바람직하게는 하기 순서로 하기의 단계들로 이루어지거나 하기의 단계들을 포함한다:
(a) (i) - 제1 액체,
- 재조합 단백질 및/또는 다수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 4차 구조, 및
- 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
(ii) 단계 (i)의 혼합물에 불활성화제를 첨가하여 상기 벡터를 불활성화시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 생성된 혼합물에 중화제를 첨가하여 불활성화제를 중화시키는 단계;
(b) 단계 (a)(iii)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거함으로써 상기 혼합물 중의 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 농축시키는 단계, 및
(c) 단계 (b)에서 생성된 용액을 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 공정 용액 중에서 감소하도록 연속 정용여과에 의해 가공처리하는 단계.
특히, 상기 단계 (c)의 연속 정용여과는 제2 액체에 대한 연속 정용여과로서, 상기 제2 액체는 제1 액체와 상이하다.
본 발명의 내용상, 특히 "(i)", "(ii)" 및 "(iii)"은 각각 단계 (a)의 하위단계를 나타내거나, 또는 단계 (a)는 하위단계 "(i)", "(ii)" 및 "(iii)"으로 이루어지거나 이들을 포함하므로, "(i)"는 "(a)(i)"와 동일하고, "(ii)"는 "(a)(ii)"와 동일하며, "(iii)"은 "(a)(iii)"과 동일하다.
본원에 언급된 바와 같이, 특히 "단계 (i)의 혼합물" 및 "단계 (a)(i)의 혼합물"이라는 용어는 각각 "단계 (i)에서 제공된 혼합물" 및 "단계 (a)(i)에서 제공된 혼합물"과 동의어인 것으로 이해한다.
본 발명의 목적상, "제1 액체"는 통상적으로 세포, 항원, 면역원성 조성물, 백신 등과 조합하여 사용되는 액체, 수성 또는 유체 매질을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 제1 액체는 항원성 조성물의 배지를 포함하고; 보다 바람직하게는, 상기 제1 액체는 배양된 숙주 세포 중에서 재조합 단백질의 제조에 사용되는 세포 배양 배지를 포함하거나, 바람직하게는 이러한 배지로 이루어진다. 상기 배양된 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 및 포유동물 세포일 수 있으며, 곤충 및 포유동물 세포가 특히 바람직하다. 따라서, 상기 제1 액체는 박테리아, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 또는 포유동물 세포의 배양을 위한 배지를 포함하거나 이러한 배지로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포 배지는 무혈청 세포 배지이고, 가장 바람직하게는 상기 배양 배지는 곤충 세포를 사용하는 경우 Excell 420 무혈청 배지이다.
또 다른 양태에서, 따라서 본 발명은, 상기 제1 액체가 세포 배양 배지의 일부를 포함하거나 세포 배양 배지로 이루어지며, 상기 세포 배양 배지가 바람직하게는 곤충 세포 배양 배지인, 본원에 설명되어 청구된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적상, "일부"는 전량을 포함하지 않는 임의의 양을 지칭한다. 예를 들어, 액체의 일부라고 하면, 해당 액체 부피의 100% 미만인 임의의 부피, 예컨대 해당 액체의 90%, 해당 액체의 80%, 해당 액체의 70% 및 0% 이상과 100% 미만 사이의 모든 양이 해당될 것이다.
본원에 사용된 "재조합 단백질"이라는 용어는, 특히 재조합 DNA 기법에 의해 제조되는 단백질을 가리키는데, 일반적으로 발현된 단백질을 암호화하는 DNA를 형질전환에 사용되는 적절한 발현 벡터에 삽입하거나, 또는 바이러스 벡터의 경우에는 숙주 세포를 감염시켜 이종성 단백질을 제조한다. 따라서, 본원에 사용된 "재조합 단백질"이라는 용어는, 특히 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 기법을 사용하여 함께 결합된 DNA의 세그먼트들로 이루어진 DNA 분자를 가리킨다. 재조합 단백질의 생산에 적합한 시스템으로는, 이에 제한되지는 않지만, 곤충 세포 (예컨대, 바큘로바이러스), 원핵성 시스템 (예컨대, 에쉐리키아 콜라이), 효모 (예컨대, 사카로마이세스 세레비시아에, 피치아 파스토리스), 포유동물 세포 (예컨대, 중국 햄스터 난소, HEK293), 식물 (예컨대, 홍화), 조류 세포, 양서류 세포, 어류 세포 및 무세포 시스템 (예컨대, 토끼 망상적혈구 용해물)을 포함한다.
본 발명의 내용상, 재조합 단백질은 바람직하게는 재조합 PCV2 ORF2 단백질이다.
본 발명의 내용에서 사용되는 "4차 구조"라는 용어는 특히, 다수의 서브유닛으로 된 복합체에서 다수의 폴딩된 단백질 분자들의 조립에 대한 것으로서, 특히 바이러스 유사 입자에 관한 것이다.
본 발명의 목적상, "복수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 4차 구조"는 복수의 재조합 단백질의 3차원 배열, 예컨대 복수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 가리킨다. 이와 관련하여, 특히 "복수의 상기 재조합 단백질"이라는 용어는 "복수의 재조합 단백질"과 동등한 것으로 이해한다. 특히, 상기 용어는 수개의 특정 재조합 단백질 분자들, 예를 들어 수개의 재조합 PCV2 ORF2 단백질 분자들을 포함하는 바이러스 유사 입자를 의미하는 것으로 이해한다. 본 발명의 내용상 "벡터를 불활성화시킨다는 것"은, 특히 통상적으로 복제가능한 벡터가 복제할 수 없게 되는 것을 의미한다. 특히 "불활성화"는 벡터를 불활성화시키는 과정을 의미한다.
본 발명의 목적상, "불활성화제"는 임의의 통상적인 불활성화 방법에 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 불활성화는 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있는 화학적 및/또는 물리적 처리법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 불활성화 제제로는, 이원성 에틸렌이민 (BEI)으로 고리화시킨, 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드 (BEA) 용액을 포함하는 고리화된 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 포함한다. 추가의 바람직한 화학적 불활성화 제제로는 트리톤 X-100, 디옥시콜산나트륨, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, β-프로피올락톤, 티메로 살, 페놀 및 포름알데히드 (포르말린)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본원에서 사용되는 "불활성화제"라는 용어는 특히 벡터가 복제할 수 없게 되도록 화학 반응에 의해 해당 벡터를 변형시킬 수 있는 화학 작용제에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 불활성화제는 아지리딘 화합물, 특히 이원성 에틸렌이민 (BEI)이고/이거나, 상기 불활성화제는 벡터에 대하여 몰 초과량으로, 특히 BEI와 반응하는 해당 벡터 DNA 염기쌍의 질소 염기에 대하여 몰 초과량으로 첨가된다.
본 발명의 목적상 "중화제"란 상기 불활성화제가 더 이상 벡터를 불활성화시킬 수 없도록 하는 본원에 기재된 불활성화제를 중화할 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 아지리딘 화합물이 불활성화에 사용되는 경우라면, 바람직하게는 3원 고리를 개방하는 친핵체를 중화에 사용한다. 불활성화제를 중화시키는 제제로는 바람직하게는 티오황산나트륨, 중아황산나트륨 등을 들 수 있다.
상기 중화제는 티오황산나트륨이고/이거나, 상기 중화제는 상기 불활성화제에 대하여 몰 초과량으로 첨가되는 것이 특히 바람직하다.
본원에 기재된 바와 같은 "중화된 불활성화제"란 특히 불활성화제와 중화제의 화학 반응으로부터 생성된 생성물(들), 예컨대 BEI와 티오황산염 또는 다른 친핵체와의 화학 반응의 생성물에 대한 것이다.
벡터를 불활성화시키 위해 임의의 통상적인 화학적 불활성화 방법을 사용할 수 있다. 바람직한 형태에서, 화학적 처리를 위한 온도는 약 32℃-42℃, 보다 바람직하게는 약 34℃-40℃, 가장 바람직하게는 약 35℃-39℃가 된다. 바람직한 불활성화 방법으로는, 바람직하게는 약 1 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 2 내지 약 10 mM, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8 mM, 보다 더 바람직하게는 약 3 내지 약 7 mM, 가장 바람직하게는 약 5 mM의 농도로 고리화된 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 첨가하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 불활성화는 0.3 N의 NaOH 중에서 0.2M의 이원성 에틸렌이민 (BEI)에 고리화시킨, 바람직하게는 약 0.4 M의 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드 (BEA) 용액을 해당 유체에 첨가하는 것을 포함하여, 최종 농도 약 5 mM의 BEI를 수득한다. 바람직하게는, 이후 상기 유체를 2 내지 96시간 동안 연속적으로 교반한다. 불활성화가 완료된 후, 바람직하게는 1.0 M의 티오황산나트륨 용액을 첨가하여 임의의 잔류 BEI를 중화하고, 상기 불활성화/중화된 수확물을 -40℃ 이하 또는 약 1℃-7℃에서 냉동 보관할 수 있다. 바람직하게는, 상기 티오황산나트륨을 불활성화 전에 첨가된 BEI와 동등한 양으로 첨가한다. 예를 들어, BEI가 5 mM의 최종 농도로 첨가되는 경우, 1.0 M의 티오황산나트륨 용액을 첨가해 5 mM의 최종 최소 농도를 제공하여 잔류 BEI를 중화시킨다.
따라서, 단계 (iii)에서 상기 중화제는 바람직하게는 단계 (ii)에 첨가된 불활성화제의 양과 동등한 양으로 첨가된다.본원에 기재된 범위와 관련하여, 특히 "y - z"는 "y-z"와 같은 것으로서, 모두 각각 "y 내지 z"와 같아서, 예를 들어 "0.1 - 1.0"은 "0.1-1.0"과 같다.
본 발명의 목적상, "벡터" 및 "상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터"는 적절한 발현 벡터, 바람직하게는 바큘로바이러스 발현 벡터를 지칭하는데, 이는 형질감염에 사용되거나, 또는 바큘로바이러스 발현 벡터의 경우에는 DNA에 의해 암호화된 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 숙주 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 발현용 벡터 (또는 재조합체)의 제조 및/또는 사용 방법을 위한 벡터와 방법들은 하기 문헌들에 개시된 방법들에 의해 또는 이와 유사한 방법으로 수행될 수 있다: 미국 특허 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235 및 382,425, PCT 국제공개공보 WO 94/16716, WO 96/39491 및 WO 95/30018; 문헌 [Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996], 스미스 등의 미국 특허 4,745,051 (재조합 바큘로바이러스), 문헌 [Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)], [Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165], [Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406], 유럽 공개특허 EPA 0 370 573, 1986년 10월 16일자로 출원된 미국 특허 출원 920,197, 유럽 공개특허 265 785; 미국 특허 4,769,331 (재조합 헤르페스바이러스), 문헌 [Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996], [Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996], [Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996], [Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996], [Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991], 미국 특허 5,591,439 및 5,552,143; 국제공개공보 WO 98/00166; 1996년 7월 3일자로 출원되고 특허결정된 미국 출원 08/675,556 및 08/675,566 (재조합 아데노바이러스); 문헌 [Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993], [Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434], PCT 국제공개공보 WO 91/11525, 문헌 [Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993] 및 [McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996] 및 미국 특허 5,591,639, 5,589,466 및 5,580,859, 및 국제공개공보 WO 90/11092, WO 93/19183, WO 94/21797, WO 95/11307 및 WO 95/20660; 문헌 [Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors]. 또한, 국제공개공보 WO 98/33510; 문헌 [Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)], 스탠포드 등의 미국 특허 4,945,050; 문헌 [Fischbachet al. (Intracel)]; 국제공개공보 WO 90/01543; 문헌 [Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)], 스조카 등의 미국 특허 4,394,448 (DNA를 생세포에 삽입하는 방법); 맥코믹 등의 미국 특허 5,677,178 (세포병변 바이러스의 용도) 및 미국 특허 5,928,913 (유전자 전달용 벡터); 및 본 명세서에 인용된 기타 문헌들을 참조한다.
바람직한 바이러스 벡터로는 특히, 생산 세포가 곤충 세포인 경우에, BaculoGold [미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 BD 바이오사이언시즈 파르밍겐(BD Biosciences Pharmingen) 제조]와 같은 바큘로바이러스이다. 바큘로바이러스 발현 시스템이 바람직하긴 하지만, 당업자라면 누구나 상기 기술한 것들을 비롯한 다른 발현 시스템들 역시 본 발명의 목적, 즉 재조합 단백질의 발현에 이용될 수 있을 것임을 이해할 수 있다.
따라서, 본 발명의 내용에서, "벡터"는 바람직하게는 재조합 바이러스, 바람직하게는 바큘로바이러스이고/이거나, "핵산 서열"은 바람직하게는 DNA 서열이다.
본원에 설명하여 청구한 방법의 단계 (b)에서, 상기 혼합물로부터 제1 액체의 일부를 제거하는 작업은 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터로 여과하는 단계로 이루어지거나 또는 이러한 단계를 포함하고, 이 경우 상기 적어도 하나의 필터가 바람직하게는 필터막을 포함한다.
다른 바람직한 양태에 따르면, 단계 (b)에서 상기 농축은
- 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터는, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 중에서도 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계, 및
- 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 투과물을 배출시키는 단계를 포함한다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 단계 (c)에서 상기 연속 정용여과는
- 상기 용액을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터는, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 중에서도 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계,
- 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 투과물을 배출시키는 단계, 및
- 대량 유동에 제2 액체를 투과물 유동과 동일한 속도로 첨가하는 단계로서, 상기 제2 액체는 제1 액체와는 상이한 것인, 단계를 포함한다.
본 발명의 목적상 "제2 액체"는 제1 액체와 서로 다른 임의의 액체를 가리키는 말로서, 통상적으로 세포, 항원, 면역원성 조성물, 백신 등과 조합하여 사용한다. 바람직하게는, 제2 액체는 수용액, 보다 더 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 용액, 보다 더 바람직하게는 완충제, 가장 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 식염수 또는 인산염 완충제 등, 예를 들어 P-식염수 또는 PBS이다. 가장 바람직하게는, 제2 액체는, 생바이러스 또는 생박테리아를 상기 제2 액체에서 배양하거나 저장할 경우에 임의의 해당 생바이러스 또는 생박테리아에 대하여 바이러스 박멸 특성이 없는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 상기 적어도 하나의 필터는 적어도 하나의 평판 필터 및/또는 적어도 하나의 중공 섬유 필터이고, 상기 적어도 하나의 필터는 가장 바람직하게는 적어도 하나의 평판 필터이다. 상기 적어도 하나의 평판 필터는 바람직하게는 적어도 하나의 카세트 필터이다.
특히, 상기 적어도 하나의 필터는 2-8개의 필터, 바람직하게는 5-7개의 필터, 가장 바람직하게는 6개의 필터이고/이거나, 상기 적어도 하나의 필터의 각 총 필터 면적은 특히 약 16-26 m2, 바람직하게는 약 20-22 m2, 가장 바람직하게는 약 21 m2이다.
본원에 기술된 필터막의 평균 공극 크기는, 바람직하게는 재조합 단백질보다 작고/작거나 상기 4차 구조보다 작고/작거나, 상기 필터막의 분자량 절사값은 바람직하게는 약 200 kDa 내지 약 500 kDa, 특히 약 300 kDa이다.
바람직하게는, 상기 필터막은 폴리에테르설폰, 셀룰로스 수화물, 재생 셀룰로스, 안정화된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스 수화물, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리이미드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어지거나 이를 포함하고/포함하거나,
상기 필터막은 바람직하게는 폴리에테르설폰으로 이루어지거나 이를 포함하거나, 또는 상기 필터막은 임의로, 안정화된 셀룰로스 기반의 막이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 단계 (b) 및 단계 (c)에서 동일한 필터 시스템을 이용한다. 따라서, 이러한 바람직한 양태에 따르면, 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과에 모두, 단 하나의 필터 시스템을 사용한다.
바람직하게는, 단계 (c) 이후에 잔류하는 혼합물은 단계 (iii)에서 생성된 중화제 농도의 1000분의 1 미만인 불활성화제 농도를 포함한다.
또한, 본 발명의 내용상, 하기의 경우가 특히 바람직한 것으로 나타났다:
- 단계 (iii)을 제1 용기에서 수행하되, 이 경우 불활성화제를 중화시켜 생성된 혼합물을 제1 용기로부터 필터 시스템과 연결된 제2 용기로 이송하고, 상기 혼합물을 제1 용기에서 제2 용기로 이송한 후 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 닫고, 빈 제1 용기를 제2 액체로 채우며,
- 단계 (b)에서 상기 혼합물을 농축이 완료될 때까지 제2 용기와 필터 시스템을 통해 순환시키고,
- 단계 (c)에서 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 개방하여 제2 액체를 제1 용기로부터 제2 용기로 연속적으로 흘러가도록 유도하는 한편, 상기 혼합물은 필터 시스템과 제2 용기를 통해 순환시키는 것인, 방법.
추가의 양태에서, 본 발명은 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피가 1000 L 내지 10000 L, 바람직하게는 2000 L 내지 8000 L, 가장 바람직하게는 3000 L 내지 5000 L인, 본원에 설명하여 청구한 방법에 대한 것이다.
본원에 언급한 "단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피"는 특히 "상기 농축 전에 단계 (b) 혼합물의 초기 부피"와 동일한 것으로 이해한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 단계 (b)에서 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조가, 단계 (a)에서 생성된 혼합물 부피에 비해서 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 8X, 보다 바람직하게는 9X 내지 11X, 가장 바람직하게는 약 10X로 최종 농축되는, 본원에 설명하여 청구한 방법에 대한 것이다.
본원에 제공된 방법의 농축 단계 (b)는, 재조합 단백질 또는 상기 4차 구조가, 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 또는 단계 (iii)에서 생성된 혼합물의 부피에 비해 각각 3X 내지 50X로 농축되도록 수행될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 농축 단계는, 재조합 단백질 또는 상기 4차 구조가 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 또는 단계 (iii)에서 생성된 혼합물의 부피에 비해 각각 적어도 5X, 예컨대 5X 내지 20X로 농축되도록 수행할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 상기 농축 단계는, 재조합 단백질 또는 상기 4차 구조가 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 또는 단계 (iii)에서 생성된 혼합물의 부피에 비해 각각 적어도 8X, 예컨대 8X 내지 14X로 농축되도록 수행할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 농축 단계는, 재조합 단백질 또는 상기 4차 구조가 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 또는 단계 (iii)에서 생성된 혼합물의 부피에 비해 각각 적어도 10X, 예컨대 10X 내지 12X로 농축되도록 수행된다.
바람직하게는, 단계 (c)에서 대량 유동에 첨가되는 제2 액체의 총 부피가 단계 (b)에서 생성된 용액 부피의 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 7X, 보다 바람직하게는 적어도 9X, 가장 바람직하게는 10X이고/이거나, 대량 유동에 첨가되는 제2 액체의 총 부피는 가장 바람직하게는 대략 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 정도가 된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 추가로 포함하는, 본원에 기술하여 청구한 방법에 관한 것이다:
(d) 단계 (c) 이후에 잔류하는 혼합물을 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 성분과 혼합하는 단계로서, 상기 혼합으로 생성된 용액 중의 상기 재조합 단백질의 농도 및/또는 상기 4차 구조의 농도가 바람직하게는 대략 단계 (a)로부터 생성된 혼합물 중의 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조의 농도쯤이나 그 이하 (예컨대, 0.2X-0.5X)인 것인, 단계.
본원에 언급한 "단계 (a)에서 생성된 혼합물 중의 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조의 농도"는 특히 "상기 농축 전에 단계 (b) 중의 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조의 초기 농도"와 동일한 것으로 이해한다.
본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한 담체"로는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등이 포함된다.
본원에 사용된 "보조제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예컨대 Quil A, QS-21 [미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 캠브리지 바이오테크 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.) 제조], GPI-0100 [미국 알라바마주 버밍햄 소재의 갈레니카 파마슈티컬즈 인코포레이티드(Galenica Pharmaceuticals, Inc.) 제조], 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 수중유중수 에멀젼을 포함할 수 있다. 에멀젼은 특히 경질 액체 파라핀 오일 (유럽 약전 유형); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화에 의해 생성된 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 보다 구체적으로는, 식물 오일, 에틸 올리에이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레에이트; 분지형 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다. 상기 오일은 유화제와 함께 사용되어 에멀젼을 형성한다. 상기 유화제로는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄의 에스테르, 만나이드의 에스테르 (예컨대, 안하이드로만니톨 올레에이트), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르 및 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르 (이들은 임의로 에톡시화됨), 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 플루로닉 (Pluronic) 제품, 특히 L121을 들 수 있다. 문헌 [Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp.51-94 (1995)] 및 [Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)]을 참조한다. 예를 들어, 문헌 ["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995]의 147쪽에 기술된 SPT 에멀젼 및 같은 문헌의 183쪽에 기술된 에멀젼 MF59를 사용할 수 있다. 추가의 적절한 보조제들로는, 이에 제한되지는 않지만, 특히 RIBI 보조제 시스템 (Ribi Inc.), 블록 공중합체 (미국 조지아주 애틀란타 소재의 CytRx), SAF-M [미국 캘리포니아주 에머리빌 소재의 케이론(Chiron) 제조], 모노포스포릴 지질 A, 아비리딘 지질-아민 보조제, 이. 콜라이 유래의 열-불안정성 장독소 (재조합체 또는 기타), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 뮤라밀 디펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 특히, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA (Monsanto)를 들 수 있다. 이러한 중합체들이 물에 용해되면 산 용액을 만들게 되는데, 상기 용액은 면역원성 조성물, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물 자체를 혼입시킬 보조제 용액을 얻기 위해 바람직하게는 생리학적 환경의 pH로 중화시키게 될 것이다.
보조제의 추가의 예로는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물을 들 수 있다. 유리한 보조제 화합물로는 특히 당류 또는 다가 알코올의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체를 들 수 있다. 이들 화합물은 카보머라는 용어로 공지되어 있다 (문헌 [Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996]). 당해 분야의 통상의 기술자는 또한 적어도 3개, 바람직하게는 8개 이하의 하이드록실기를 가지며 적어도 3개의 하이드록실기의 수소 원자가 적어도 2개의 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 대체되어 있는 폴리하이드록실화 화합물과 가교된 이러한 아크릴계 중합체를 기술하는 미국 특허 2,909,462를 참조할 수 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것들, 예를 들어, 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화기이다. 불포화 라디칼은 자체에 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. Carbopol [미국 오하이오주 소재의 BF 굿리치 (BF Goodrich) 제조]이라는 명칭으로 시판되는 제품이 특히 적절하다. 이들은 알릴 수크로스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교되어 있다. 이들 중에서, Carbopol 974P, 934P 및 971P가 언급될 수 있다. Carbopol 971P가 가장 바람직하다.
"희석제"는 물, 식염수, 덱스트로오스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다.
"등장화제"는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다.
"안정화제"는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리염을 포함한다.
본원에 사용된 "보존제"라는 것은 예를 들어 젠타마이신, 메르티올레이트 등과 같은 항미생물성 활성제를 지칭한다. 특히 보존제의 첨가는 다회 용량 조성물의 제조에 가장 바람직하다. 이러한 항미생물성 활성제는, 관심대상 조성물을 임의의 미생물 오염으로부터 방지하거나, 또는 관심대상 조성물 내의 임의의 미생물 증식을 억제하는데 효과적인 농도로 첨가된다.
바람직하게는, 단계 (d)에서 상기 추가의 성분은 보조제, 물 및 염화나트륨의 조합, 특히 보조제 용액과 P-식염수의 조합이며, 이 경우 상기 보조제는 바람직하게는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이고, 보다 더 바람직하게는 카보머이다.
본원에 언급한 "P-식염수"라는 용어는 특히, 물에 용해시켜 pH를 6.8-7.0으로 조정한, 0.8-0.9% (w/v)의 NaCl, 예컨대 0.85% (w/v)의 NaCl으로 이루어진 완충 용액에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 단계 (a)에 사용된 혼합물이 하기의 단계들을 포함하는 절차에 의해 수득가능한 것인, 본원에 기술하여 청구한 방법에 관한 것이다:
(1) 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 배양물 중의 감수성 세포들을 감염시키는 단계로서, 상기 재조합 단백질이 상기 벡터에 의해 발현되는 것인, 단계,
(2) 이후, 상기 세포 배양물로부터 상기 재조합 단백질 및/또는 복수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 상기 4차 구조를 회수하는 단계로서, 이 경우 바람직하게는 세포 잔해물이 분리 단계, 바람직하게는 예컨대 적어도 하나의 필터, 바람직하게는 2개의 필터를 통한 정밀여과를 통해 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조로부터 분리되고, 여기서 상기 적어도 하나의 필터의 공극 크기는 바람직하게는 상기 재조합 단백질 및/또는 복수의 상기 재조합 단백질을 함유하는 4차 구조보다 크며, 특히 약 1 내지 약 20 ㎛ 및/또는 약 0.1 ㎛ 내지 약 4 ㎛의 공극 크기를 가지는 것인, 단계.
바람직하게는, 상기 방법에서 분리 단계는 하기를 포함하거나, 또는 하기로 이루어진다:
- 약 2 ㎛ 내지 약 15 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 필터를 통한 정밀여과, 및/또는
- 약 0.8 ㎛ 내지 약 1.0 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 필터를 통한 정밀여과.
바람직한 세포로는 재조합 단백질 DNA를 함유하여 상기 재조합 단백질을 발현하는 적절한 재조합 바이러스 벡터로 감염되기 쉬운 세포들을 들 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 곤충 세포이고, 보다 바람직하게는 SF+ 곤충 세포 [미국 코네티컷주 메리든 소재의 프로틴 사이언시즈 코포레이션 (Protein Sciences Corporation) 제조]라는 상표명으로 시판되는 곤충 세포를 포함한다. 바람직한 세포 배양물은 약 0.3 - 2.0×106 개의 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.35 - 1.9×106 개의 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.4 - 1.8×106 개의 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 - 1.7×106 개의 세포/mL, 가장 바람직하게는 약 0.5 - 1.5×106 개의 세포/mL의 세포수를 가진다.
상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 바람직한 감염 다중도 (multiplicity of infection; MOI)는, 감수성 세포의 감염에 사용되는 경우, 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0이다. 바람직하게는 상기 언급한 MOI는 세포 배양 유체 1 mL에 대한 것이다. 바람직하게는, 본원에 기술한 방법은 재조합 단백질 DNA를 함유하여 MOI(감염 다중도)가 약 0.03 내지 1.5, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 1.3, 보다 더 바람직하게는 약 0.09 내지 1.1, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0인 상기 재조합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 사용하여 0.35 내지 1.9×106 개의 세포/mL, 보다 바람직하게는 약 0.4 내지 1.8 × 106 개의 세포/mL, 보다 더 바람직하게는 약 0.45 내지 1.7 × 106 개의 세포/mL, 가장 바람직하게는 0.5 - 1.5×106 개의 세포/mL를 감염시키는 것을 포함한다.
또한, 적절한 증식 배지는 당업계의 숙련자라면 누구나 결정할 수 있지만, 바람직한 증식 배지는 무혈청 곤충 세포 배지, 예를 들면, Excell 420 [미국 캔자스주 르넥사 소재의 JRH 바이오사이언시즈 인코포레이티드 (JRH Biosciences, Inc.) 제조] 등을 들 수 있다.
상기 방법에서, 단계 (1)의 세포 배양물은, 바람직하게는 재조합 단백질이 상기 벡터에 의해 발현되는 동안에 22-32℃, 보다 바람직하게는 약 24-30℃, 보다 더 바람직하게는 약 25-29℃, 보다 더 바람직하게는 약 26-28℃, 가장 바람직하게는 27℃로 유지되는 것이 바람직하고/하거나, 단계 (2)의 회수는 벡터로 해당 세포를 접종한 후 및/또는 세포 생존력이 10% 미만으로 감소하는 경우 이후 5 내지 8일, 가장 바람직하게는 8일차에 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 재조합 단백질이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본원에 기술하여 청구한 방법에 관한 것이다:
- 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 재조합 PCV2 ORF2 단백질.
본원에 사용된 "100% 서열 동일성을 갖는"이라는 용어는 "동일하다"라는 용어와 동등한 것으로 이해한다.
서열 동일성 비율(%)은 당업계에서 인식하고 있는 의미를 가지며, 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 동일성을 측정하는 여러가지 방법들이 존재한다. 예를 들어, 문헌 [Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988)]; [Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993)]; [Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994)]; [von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987)]; 및 [Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991)]을 참고한다. 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 배열하는 방법은 컴퓨터 프로그램으로 체계화되어 있는데, 예를 들면 GCG 프로그램 패키지 (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)) 및 스미스와 워터맨 (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))의 국소 상동성 알고리즘을 이용하는 최적적합 (Bestfit) 프로그램 [위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스용 버전 8, 미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group) 개발]을 들 수 있다. 예를 들어, FASTA 알고리즘을 이용하는 컴퓨터 프로그램 ALIGN을, 갭 개시 벌점 (gap open penalty)이 -12이고 갭 확장 벌점 (gap extension penalty)이 -2로 설정한 아핀 갭 검색 (affine gap search)과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 프로그램 [Gonnet 시리즈의 단백질 가중치 매트릭스 (protein weight matrix), 갭 벌점 = 10.0, 갭 길이 벌점 = 0.2, 지연 발산 (delay divergent) 서열(%) = 30%]에 설정된 다수의 디폴트 정렬 파라미터들을 사용하는, MegAlign 소프트웨어 버전 11.1.0 (59), 419 (DNASTAR Inc.)의 Clustal W 방법을 사용하여 단백질/아미노산 서열을 정렬한다.
본원에 사용된 바와 같이, "서열번호 X의 서열과 서열 동일성"이라는 용어는 각각 "서열번호 X의 길이에 대하여 서열번호 X의 서열과 서열 동일성"이라는 용어 또는 "서열번호 X의 전체 길이에 대하여 서열번호 X의 서열과 서열 동일성"이라는 용어와 같다. 이러한 맥락에서, "X"는 1 내지 2로부터 선택되는 임의의 정수로서, "서열번호 X"라는 것은 본원에 언급한 임의의 서열번호를 나타내는 것이다.
추가로, "어떠한 서열로 이루어진 재조합 단백질"이라는 용어는 특히, 해당 폴리펩타이드가 발현되는 세포에 의해 발생하는 서열의 임의의 공동해독 및/또는 해독후 변형(들)에 대한 것으로 이해한다. 따라서, 본원에 기재된 "어떠한 서열로 이루어진 재조합 단백질"이라는 용어도 역시 해당 폴리펩타이드가 발현되는 세포에 의해 발생하는 하나 이상의 변형, 특히 바람직하게는 글리코실화, 인산화 및 아세틸화로 이루어진 군으로부터 선택되는 생합성 및/또는 단백질 가공처리과정에서 발생하는 아미노산 잔기들의 변형들을 갖는 서열에 대한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 복수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 상기 4차 구조가 복수의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자인, 본원에 기술하여 청구한 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술하여 청구한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법으로 생성된 혼합물의 바이러스 박멸 활성은 상기 방법의 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과를 거치지 않은 혼합물에 비해 적어도 20% 감소되고/감소되거나, 상기 방법에 의해 생성된 면역원성 조성물은, 특히 실온에서 4시간 이상 동안 생바이러스를 상기 면역원성 조성물과 혼합하는 경우, 생바이러스 1 mL당 1 log TCID50 미만의 손실을 야기한다. 본원에 언급한 "실온"은 특히, 20 내지 25℃, 보다 구체적으로는 (평균) 23℃이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 생바이러스가 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스인, 본원에 기술하여 청구한 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 이후에 잔류하는 혼합물을 적어도 하나의 추가의 항원과 혼합하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 추가의 항원은 바람직하게는 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스인, 본원에 기술하여 청구한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 내용상, 특히 "단계 이후에 잔류하는"이라는 용어는 "단계로부터 생성된"이라는 말과 동일한 것으로 이해한다.
본 출원은 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공할 뿐만 아니라, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물에 관한 것이기도 하다.
또 다른 양태에서, 따라서, 본 발명은 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 상기 면역원성 조성물은 1-10 μM의 L-아르기닌 및/또는 1-10 μM의 L-리신을 포함하는 용액이고, 가장 바람직하게는 상기 면역원성 조성물은 1-10 μM의 L-아르기닌 및 1-10 μM의 L-리신을 포함하는 용액이다.
따라서, 본 발명은
- 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 재조합 PCV2 ORF2 단백질, 및
- 1-10 μM의 L-아르기닌 및/또는 1-10 μM의 L-리신을 포함하는 면역원성 조성물로서,
임의로는 상기 면역원성 조성물이 중화된 불활성화제를 실질적으로 함유하지 않고/않거나 중화제를 실질적으로 함유하지 않는 것인, 면역원성 조성물도 제공한다.
본원에 사용된 "1-10 μM"은 특히 "1 μM에서 최대 10 μM까지"와 동일한 것으로 이해한다.
특히, 단계 (d)에서 생성된 면역원성 조성물 또는 혼합물은 1 mL당 4-400 ㎍의 재조합 PCV2 ORF2 단백질 또는 바람직하게는 1 mL당 8-200 ㎍의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함한다.
"실질적으로 중화제를 함유하지 않는"이라는 말은 특히, 해당 면역원성 조성물이 150 nM 미만의 중화제를 포함함을 의미하는 것으로 이해한다. 따라서, 예를 들어, "면역원성 조성물이 실질적으로 티오황산나트륨을 함유하지 않는다"라는 말은 특히 "면역원성 조성물이 150 nM 미만의 티오황산나트륨을 포함한다"는 설명과 동일한 것으로 이해한다.
추가의 양태에 따르면, 따라서, 본 발명은 단계 (d)로부터 생성된 면역원성 조성물 또는 혼합물이 실질적으로 티오황산나트륨을 함유하지 않거나 150 nM 미만의 티오황산나트륨을 포함하는, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또한, 면역원성 조성물, 특히 본원에 기술하여 청구한 방법, 바람직하게는 단계 (d)를 포함하는 임의의 상기 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물이 제공되는데, 이 경우 상기 면역원성 조성물은
바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 재조합 PCV2 ORF2 단백질, 및
0.1-1 μM의 L-트립토판; 및/또는
0.1-3 μM의 L-글루타민; 및/또는
0.2-4 μM의 L-메티오닌; 및/또는
1-10 μM의 L-아르기닌; 및/또는
1-10 μM의 L-트레오닌; 및/또는
1-15 μM의 L-리신을 포함한다.
바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물은
0.1-0.7 μM의 L-트립토판; 및/또는
0.7-2.4 μM의 L-글루타민; 및/또는
0.5-3.2 μM의 L-메티오닌; 및/또는
1.4-4.7 μM의 L-아르기닌; 및/또는
1.6-8.0 μM의 L-트레오닌; 및/또는
4.0-12.2 μM의 L-리신을 포함한다.
보다 바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물은
0.2-0.6 μM의 L-트립토판; 및/또는
0.8-2.2 μM의 L-글루타민; 및/또는
0.8-2.2 μM의 L-메티오닌; 및/또는
1.6-4.3 μM의 L-아르기닌; 및/또는
2.4-6.3 μM의 L-트레오닌; 및/또는
4.4-11.2 μM의 L-리신을 포함한다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물은 0.7-2.4 μM의 L-글루타민 및 4.0-12.2 μM의 L-리신을 포함하거나, 또는 바람직하게는 0.8-2.2 μM의 L-글루타민 및 4.4-11.2 μM의 L-리신을 포함한다.
바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물은 티오황산나트륨을 실질적으로 함유하지 않는다.
추가의 바람직한 양태에 따르면, 면역원성 조성물, 특히 본원에 기술하여 청구한 방법, 바람직하게는 단계 (d)를 포함하는 임의의 상기 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물에 실온에서 2부 (2D)로 구성된 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 가동시키는 경우 0.2-0.4의 피크 B 면적에 대한 피크 A 면적의 비율 및/또는 0.5-0.9의 피크 B 면적에 대한 피크 C 면적의 비율을 나타내며, 상기 2D UPLC가 1부 및 2부 크로마토그래피를 포함하되,
상기 1부 크로마토그래피는 시스템 부피가 400 μL이고,
- 상기 면역원성 조성물을 포함하는 샘플을 바이러스 유사 입자를 결합시키기에 적절한 4차 아민 작용성 물질로 패킹한 0.1 mL의 컬럼 부피를 갖는 음이온 교환 컬럼에 주입하고,
- 처음 0분째에 100% 50 mM Tris (pH 8)에서, 1분째에 97.5% 50 mM Tris (pH 8) 및 2.5% 50 mM Tris, 2M NaCl (pH 8) 및 최종 2분째에 10% 50 mM Tris (pH 8) 및 90% 50 mM Tris, 2M NaCl (pH 8)으로 구성된 다단계 구배법을 음이온 교환 컬럼을 통해 0.6 mL/분의 유속으로 구동시키며,
2.67분의 머무름 시간에 상기 1부 크로마토그래피에서 2부 크로마토그래피로 전환시키고,
상기 2부 크로마토그래피에서는, 상기 1부 크로마토그래피의 50 μL의 용출액을 공극 크기가 450 Å인 1.75 mL의 컬럼 부피를 갖는 크기 배제 컬럼을 통해 0.3 mL/분의 유속으로 구동시키며,
이 때, 330 nm의 파장 및 280 nm의 여기 파장에서 형광 방출을 모니터링함으로써 크로마토그램을 기록하되, 이 경우
피크 A 면적은 상기 크로마토그램에서 0-1분의 머무름 시간에서 가장 높은 피크의 피크 면적이고;
피크 B 면적은 상기 크로마토그램에서 7-8분의 머무름 시간에서 가장 높은 피크의 피크 면적이며;
피크 C 면적은 상기 크로마토그램에서 8.5-9.5분의 머무름 시간에서 가장 높은 피크의 피크 면적인 것인, 면역원성 조성물이 제공된다.
한 바람직한 양태에 따르면, 상기 샘플은 50 mM의 Tris (pH 8) 중에 희석된 면역원성 조성물을 포함한다. 예를 들어, 상기 샘플이 단계 (c) 이후에 잔류하는 면역원성 조성물을 포함하는 경우라면, 상기 샘플은 바람직하게는 50 mM의 Tris (pH 8) 중에 1:10으로 희석된 면역원성 조성물을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
바이러스 유사 입자를 결합시키는데 적절한 4차 아민 작용성 물질은 바람직하게는 거대 공극 및/또는 비다공성 물질이다.
실시예 5는 당업계의 숙련자에 의해 사용될 수 있는 상기 2D UPLC 방법에 대하여 설명한다. 결과가 논란이 있을 수 있거나 의심의 여지가 있는 경우, 본원에 언급한 피크 면적의 비율은 실시예 5에 기술된 방법에 의해 추산되거나/추산될 수 있는 비율을 가리키는 것으로 한다.
"면역원성 조성물"이라는 용어는, 관심대상 항원에 대하여 숙주에서 세포 및/또는 항체 매개성 면역 반응을 유도하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 물질의 조성물을 의미하기는 하나, 그로만 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, "면역 반응"은, 이에 제한되지는 않지만, 하기의 효과들 중 하나 이상을 포함한다: 해당 조성물 또는 백신에 포함된 항원(들)에 대하여 특이적으로 유도되는 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게는, 상기 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증가되고/되거나 해당 질환의 임상적 중증도가 감소되도록 치료적 또는 예방적 면역 반응을 나타내게 될 것이다. 이러한 경우, 상기 면역원성 조성물은 "백신"이다. 이러한 예방은, 감염된 숙주에 의해 통상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 결여, 상기 감염된 숙주에서 보다 빠른 회복 시간 및/또는 감소된 바이러스 역가에 의해 입증될 것이다. 본원에 기술한 숙주는, 특히 포유동물, 바람직하게는 돼지이다.
추가의 양태에서, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물의 바이러스 박멸 활성은, 상기 방법의 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과를 거치지 않은 해당 면역원성 조성물과 비교하였을 때, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20% 감소된다. 보다 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물의 바이러스 박멸 활성은, 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과를 거치지 않은 해당 면역원성 조성물과 비교하였을 때, 적어도 50% 감소된다. 보다 더 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물의 바이러스 박멸 활성은, 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과를 거치지 않은 해당 면역원성 조성물과 비교하였을 때, 적어도 70% 감소된다. 보다 더 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물의 바이러스 박멸 활성은, 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과를 거치지 않은 해당 면역원성 조성물과 비교하였을 때, 적어도 90% 감소된다.
본 발명의 목적을 위해, "바이러스 박멸 활성"이라는 용어는 액체, 유체, 용액 또는 조성물 등이 생바이러스 또는 생박테리아와 혼합되는 경우, 상기 액체, 유체, 용액 또는 조성물등 이 상기 생바이러스 또는 생박테리아를 어느 정도까지 불활성화 또는 사멸시키는 것을 의미한다. 따라서, 액체, 유체, 용액 또는 조성물 등의 바이러스 박멸 활성을 적어도 10% 감소시킨다는 것은, 본원에 기재된 방법을 거치지 않은 액체, 유체, 용액 또는 조성물 등과 비교하였을 때, 본원에 기재된 임의의 제조 방법을 거친 액체, 유체, 용액 또는 조성물 등에서 생바이러스 또는 생박테리아의 생존률이 90% 이상임을 의미한다. 본 발명의 내용에서 "생존율"이란 특히 숙주에서의 복제 역량을 유지하고 있는 바이러스 또는 박테리아의 비율에 관한 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물은, 생바이러스 또는 생박테리아를 상기 면역원성 조성물과 혼합하여 적어도 4시간 동안 배양하는 경우, 상기 생바이러스 1 mL당 1 log TCID50 미만의 생바이러스의 손실, 또는 생박테리아 1 mL당 1 log CFU 미만의 생박테리아의 손실을 야기한다. 보다 바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물은, 생바이러스 또는 생박테리아를 상기 면역원성 조성물과 혼합하여 적어도 4시간 동안 배양하는 경우, 상기 생바이러스 1 mL당 0.9 log TCID50 미만의 생바이러스의 손실, 또는 생박테리아 1 mL당 0.9 log CFU 미만의 생박테리아의 손실을 야기한다. 보다 더 바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물은, 생바이러스 또는 생박테리아를 상기 면역원성 조성물과 혼합하여 적어도 4시간 동안 배양하는 경우, 상기 생바이러스 1 mL당 0.7 log TCID50 미만의 생바이러스의 손실, 또는 생박테리아 1 mL당 0.7 log CFU 미만의 생박테리아의 손실을 야기한다. 보다 더 바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물은, 생바이러스 또는 생박테리아를 상기 면역원성 조성물과 혼합하여 적어도 4시간 동안 배양하는 경우, 상기 생바이러스 1 mL당 0.5 log TCID50 미만의 생바이러스의 손실, 또는 생박테리아 1 mL당 0.5 log CFU 미만의 생박테리아의 손실을 야기한다. 보다 더 바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물은, 생바이러스 또는 생박테리아를 상기 면역원성 조성물과 혼합하여 적어도 4시간 동안 배양하는 경우, 상기 생바이러스 1 mL당 0.3 log TCID50 미만의 생바이러스의 손실, 또는 생박테리아 1 mL당 0.3 log CFU 미만의 생박테리아의 손실을 야기한다.
1 mL당 TCID50은 생바이러스의 양을 추산할 수 있는 표준 시험관내 역가 분석으로 측정될 수 있다. 1 mL당 CFU는 생박테리아의 양을 추산할 수 있는 표준 시험관내 역가 분석으로도 측정될 수 있다. "1 mL당"이라는 용어는 바람직하게는 1 mL의 유체를 지칭한다.
또한, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물이 특히나 안정한 것으로 나타났다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본원에 기술하여 청구한 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물의 보존 기간은 적어도 2년, 바람직하게는 적어도 3년이며, 이 경우 "보존 기간"이라는 용어는 제품의 품질을 특정한 최소 허용 수준 이하로 떨어뜨리지 않고 보관할 수 있는 기간을 의미한다.
특히, 본 발명은, 바람직하게는 돼지에서, 재조합 단백질의 아미노산 서열이 유래되는 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물로서, 상기 병원체가 1회 용량의 상기 면역원성 조성물의 투여 후 바람직하게는 PCV2이고, 상기 투여가 바람직하게는 1회 용량의 상기 면역원성 조성물의 돼지에 대한 투여인, 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 또는 약독화된 생박테리아를 추가로 포함하는, 본원에 기술하여 청구된 면역원성 조성물에 대한 것이다.
"생(live)" 바이러스 또는 박테리아는, 본 발명의 목적상, 숙주에서 복제가능한 바이러스 또는 박테리아를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 생바이러스 및 바람직한 생박테리아는 각각 PRRS 바이러스 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumonia) 박테리아이다. 그러나, 생바이러스 또는 생박테리아는 각각 PRRS 바이러스 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니아로만 한정되지는 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스를 추가로 포함하는, 본원에 기술하여 청구된 면역원성 조성물에 대한 것이다.
"약독화된"이라는 용어는 특히 바이러스 또는 박테리아의 병독성을 감소시켜 이들을 백신으로 사용하기에 적합하게 만드는 방식으로 배양시킨 상기 바이러스 또는 박테리아에 관련된 것이다. 따라서, 보다 구체적으로, "약독화된"이라는 말은, 생바이러스 또는 생박테리아이기는 하지만, 바람직하게는 그러한 특수한 배양에 의한 병독성 또는 독성의 감소로 인해서 더 이상 질병을 야기할 수 없는 바이러스 또는 박테리아를 말하는 것이다.
바람직하게는, 상기 면역원성 조성물은, 특히 돼지에서, 1회 용량의 면역원성 조성물을 투여한 후 PRRS 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하며, 이 경우 상기 투여는 바람직하게는 1회 용량의 면역원성 조성물을 돼지에 투여하는 것을 말한다.
보다 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물은, 특히 돼지에서, 1회 용량의 면역원성 조성물을 투여한 후 PCV2 및 PRRS 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하며, 이 경우 상기 투여는 바람직하게는 1회 용량의 면역원성 조성물을 돼지에 투여하는 것을 말한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트를 제공하는데, 이 경우 상기 키트는 바람직하게는 약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 PRRS 바이러스 및 약독화된 생박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 항원을 함유하는 적어도 하나의 추가의 용기를 추가로 포함한다.
추가의 양태에 따르면, 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트가 제공된다.
본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물 및/또는 본원에 기술하여 청구한 키트는, 적어도 하나의 추가의 항원, 바람직하게는 바이러스 또는 박테리아 항원, 보다 더 바람직하게는 돼지에서 질병을 유발하는 적어도 하나의 다른 병원체 유래의 바이러스 또는 박테리아 항원을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가의 항원은 국제 특허출원 WO 2007/094893호(본 출원의 내용과 교시는 본원에서 참고로 포함됨)에 개시된 것들 중의 어느 하나일 수 있다. 요약하면, 상기 추가의 항원들은 돼지에서 질병을 유발하는 임의의 다른 병원체의 항원일 수 있다. 바람직하게는, "돼지에서 질병을 유발하는 임의의 다른 병원체" 즉 돼지에서 질병을 유발하는 적어도 하나의 다른 병원체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 액티노바실루스 플레우로뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumonia) (1); 아데노바이러스 (2); 알파바이러스, 예컨대 동부 말뇌척수염 바이러스 (Eastern equine encephalomyelitis viruses) (3); 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica) (4); 브라키스피라 종 (Brachyspira spp.) (5), 바람직하게는 B. 하이오디센테리아에 (B. hyodysentheriae) (6); B. 피오시콜라이 (B. piosicoli) (7), 브루셀라 수이스 (Brucella suis), 바람직하게는 비오바르 (biovar) 1, 2 및 3 (8); 전형적인 돼지 열병 바이러스 (9); 클로스트리디움 종 (Clostridium spp.) (10), 바람직하게는 Cl. 디피사일 (Cl. difficile) (11), Cl. 퍼프린겐스 (Cl. perfringens) 유형 A, B 및 C (12), Cl. 노비이 (Cl. novyi) (13), Cl. 셉티쿰 (Cl.septicum) (14), Cl. 테타니 (Cl. tetani) (15); 코로나바이러스 (16), 바람직하게는 돼지 호흡기 코로나 바이러스 (17); 에페리트로주노시스 수이스 (Eperythrozoonosis suis) (18); 에리시펠로트릭스 르시오파티아에 (Erysipelothrix rhsiopathiae) (19), 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli) (20); 해모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis), 바람직하게는 아형 1, 7 및 14 (21), 혈구응집성 뇌척수염 바이러스 (22); 일본 뇌염 바이러스 (23); 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis) (24); 렙토스피라 종 (Leptospira spp.) (25), 바람직하게는 렙토스피라 오스트랄리스 (Leptospira australis) (26); 렙토스피라 카니콜라 (Leptospira canicola) (27); 렙토스피라 그립포타이포사 (Leptospira grippotyphosa) (28); 렙토스피라 익테로해모라지카에 (Leptospira icterohaemorrhagicae) (29); 및 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans) (30); 렙토스피라 포모나 (Leptospira pomona) (31); 렙토스피라 타라쏘비 (Leptospira tarassovi) (32); 마이코박테리움 종 (Mycobacterium spp.) (33), 바람직하게는 M. 아비움 (M. avium) (34), M. 인트라셀룰라레 (M. intracellulare) (35) 및 M. 보비스 (M.bovis) (36); 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 (Mycoplasma hyopneumoniae) (37); 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) (38); 돼지 사이토메갈로바이러스 (39); 돼지 파보바이러스 (40); 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (41); 가성광견병 바이러스 (42); 로타바이러스 (43); 살모넬라 종 (44), 바람직하게는 S. 티히무리움 (S. thyhimurium) (45) 및 S. 콜레라에수이스 (S. choleraesuis) (46); 스타필로코쿠스 히이쿠스 (47); 스타필로코쿠스 종 (48), 바람직하게는 스트렙토코쿠스 종 (49), 바람직하게는 스트렙토코쿠스 수이스 (50); 돼지 헤르페스 바이러스 (51); 돼지 인플루엔자 바이러스 (52); 돼지 수두 바이러스 (53); 돼지 수두 바이러스 (54); 수포성 구내염 바이러스 (55); 돼지의 수포성 발진 바이러스 (56); 렙토스피라 하르조 (Leptospira Hardjo) (57) 및/또는 마이코플라즈마 하이오시노비아에 (Mycoplasma hyosynoviae) (58); 및/또는 이들의 조합.
가장 바람직하게는, 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물 및/또는 본원에 기술하여 청구한 키트는 적어도 하나의 약독화되거나 불활성화된 비-PRRSV 병원체 또는 이의 항원성 물질을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의약으로서, 바람직하게는 백신으로서 사용하기 위해 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물 및/또는 본원에 기술하여 청구한 키트에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 하기의 방법에 사용하기 위해, 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물 및/또는 본원에 기술하여 청구한 키트에 관한 것이다:
- 동물, 바람직하게는 돼지에 있어서 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/유도하거나
- 동물, 바람직하게는 돼지에 있어서 적어도 하나의 병원체 감염에 대한 하나 이상의 임상 증상을 감소시키는 방법.
본 발명은 추가로 하기의 방법을 제공한다:
- 동물에서 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/유도하거나
- 동물에서 적어도 하나의 병원체 감염에 대한 하나 이상의 임상 증상을 감소시키는 방법으로서,
본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물을 동물, 특히 돼지에게 투여하는 것인, 방법.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기를 위한 의약의 제조를 위해 본원에 기술하여 청구한 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다:
- 동물, 바람직하게는 돼지에 있어서 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/유도하거나
- 동물, 바람직하게는 돼지에 있어서 적어도 하나의 병원체 감염에 대한 하나 이상의 임상 증상을 감소시키는 방법.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 병원체는 PCV2, PRRSV, 비-PRRSV 병원체 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 "비-PRRSV 병원체"라는 용어는 특히 마이코플라스마 하이오뉴모니아에, 가성광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파보바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 에쉐리키아 콜라이, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에, 보르데텔라 브론키셉티카, 살모넬라 콜레라수이스, 해모필루스 파라수이스, 파스퇴렐라 멀토시다, 스트렙토코쿠스 수이스 및 액티노바실루스 플루로뉴모니아에로부터 선택되는 병원체에 대한 것이다.
"하나 이상의 임상 증상을 감소시키는"이라는 용어는 특히, 해당 면역원성 조성물 중의 면역학적 활성 성분(들)이 유도되는 병원체로, 상기 면역원성 조성물을 투여받은 동물과 상기 면역원성 조성물을 투여받지 않은 "대조군" 동물 모두를 감염시키거나 이들에 대하여 면역유발시켰을 경우, 동물의 대조군에 비해 상기 면역원성 조성물을 투여받은 동물에서의 이러한 임의의 징후가 발병률 또는 중증도 면에서 감소되는 것을 의미한다. 이와 관련하여, "감소된"이라는 용어는 대조군에 비해 면역원성 조성물을 투여받은 군에서 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 보다 바람직하게는 50%, 가장 바람직하게는 100%의 감소를 의미한다.
본원에 사용된 "임상 증상"은 살아 있는 동물에서 직접 관찰가능한 병원체의 감염 징후, 예컨대 증상을 지칭한다. 대표적인 예는 선택된 병원체에 따라 달라질 수는 있지만, 콧물, 무기력, 기침, 고열, 체중 증가 감소 또는 체중 손실, 탈수증, 설사, 부기, 절뚝거림 등의 것들을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "보호 면역 반응"이라는 것은, 관심대상 병원체 감염의 임상적, 병리학적 또는 조직병리학적 징후 또는 증상의 감소된 발병률 또는 감소된 중증도 뿐만 아니라, 이러한 징후 또는 증상의 완전한 예방까지도 아울러서 가리킨다.
실시예
실시예 1:
PCV2 ORF2 단백질의 제조 - 상위 처리공정
PCV2 ORF2 단백질은 WO 2006/072065 A2호의 실시예 1 내지 3에 기재된 공정에 상응하는 공정으로 바큘로바이러스에 감염된 SF+ 세포 중에서 제조한다. 아래에 본 공정을 요약한다:
PCV2 ORF2 바큘로바이러스-벡터를 생물반응기에서 제조한다. 배지를 사전에 멸균시키거나 멸균 여과시켜 생물반응기에 첨가한다. 상기 배지는 증식 배양물에서 유래한 SF+ 세포와 함께 첨가한다. 상기 세포들을 PCV2 ORF2 종자를 분주함과 동시에 접종 (동시 감염)시킨다. 바이러스 증식을 진행하는 동안, 온도는 27±2℃로 유지하고 pH를 모니터링한다. 용존 산소량 (DO)은 청정 압축 공기와 산소 (O2)를 살포하여 조절한다. 수확 기간은 바이러스 감염 후 6 내지 8일간 수행하고, ≤ 20% 세포 생존율의 수확 기준을 달성한다. 수확시, PCV2 ORF2 항원 유체를 2세트의 필터, 즉 공극 크기가 2.0-15.0 ㎛인 전치 필터와 공극 크기가 0.8-1.0 ㎛인 최종 필터를 사용하여 정제한다. 상기 여과된 수확 유체를 탱크에 수집한다. 바큘로바이러스의 불활성화를 위해, 중화 전에 5 mM의 BEI를 최대 96시간 동안 첨가한다. 잔류 BEI의 중화를 위해, 5 mM의 티오황산나트륨을 첨가하여 BEI를 중화시킨다. 티오황산나트륨의 첨가는 불활성화 후 72-96시간에 수행한다.
PCV2 ORF2 단백질의 제조 - 후속 처리공정
실험실 규모
상술한 상위 공정에서 수득한 3L의 샘플을 실험실로 가져와 300 mL (부피 기준)로 농축하여 10배의 농도를 달성하였다. 농축 후, 물에 용해시킨 0.85% NaCl로 구성되고 pH를 6.8-7.0으로 조정한 완충액인 3L의 P-식염수를 사용하여 항원을 정용여과하였다.
실험실 규모의 농도 및 연속 정용여과는, 하기로 구성된 접선 유동 필터 (TFF) 시스템을 사용하여 실온 (27±2℃)에서 생물안전작업대 (Biosafety Cabinet, BSC)에서 수행하였다: 1개의 Sartoslice Ultrafilter (UF) 카세트 필터 (PES, 200 cm2의 여과 면적, 300 kD의 절사값)와 함께 조립된, TFF 시스템 Sartoflow Slice 200 벤치탑 시스템.
한외여과/정용여과 전에, 상기 TFF 시스템을 1 M의 NaOH로 (적어도 1시간 동안)로 헹궈, 상기 카세트를 0.1 NaOH로 밤새 화학적으로 멸균시켰다. 이후, 상기 멸균된 시스템과 필터를 BSC에 배치하여 무균 상태에서 조립한 후, 주입, 배출 및 투과물 라인을 연결하였다. 투과물 라인을 폐기물 병에 연결하는 한편, 주입 라인은 농축시킬 불활성화된 항원에 연결하였다. 여과 유닛으로부터 나온 배출 라인은 다시 보유용 병으로 들어간다. 상기 필터는 멸균 PBS (필터당 10L)를 사용하여 평형상태로 만들었다.
상기 생성물을 한외여과에 의해 부피 기준으로 원래 항원 부피의 10배로 농축시켰다. 상기 필터를 통과하는 유속은 농축을 통해 가공처리된 항원에 따라 다르게 하였다. 소규모 수준에서는, 유속을 범위로 설정하여 해당 시스템에 배압을 가하여 유지하였다. 정용여과는, 한외여과에서 사용했던 부피의 10배 부피의 P-식염수를 이용하여 수행하였으며, 이 경우 P-식염수는 투과물 유속과 동일한 속도로 첨가하였다. 최종적으로 농축 및 정용여과된 항원을 2-8℃로 보관하였다.
HPLC 정량법을 통해, 본 공정이, 임의의 잔류 곤충 세포 배지 (ExCell 420 배지)의 ≥ 99%를 제거하였고, 중화된 BEI 및 잔류 티오황산나트륨을 검출불가한 수준으로 감소 시켰던 것으로 나타났다.
또한, 초기 실험을 통해, 본원에 기술된 면역원성 조성물의 제조에 있어서 TFF 시스템에서 중공 섬유 필터보다는 평판 필터를 사용하는 것이, 보관용 백/배럴 (200L)을 사용할 필요가 적어지므로 보관 비용으 크게 줄일 수 있는 유리한 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한, 평판 필터를 사용함으로써 수확 인력과 제조 시간이 크게 감소되는 것으로 나타났다.
공업적 규모
공업적 규모 또는 대규모 처리공정 (도 1 참조)에서, 전술한 상위 공정에서 생성된 약 4000 L를 사용한다. 본 시스템은, 불활성화 탱크의 항원 함유 용액을 연속 공급 속도로 후속 처리공정 (DSP) 탱크로 직접 보내어, 상기 불활성화 탱크가 비워질 수 있도록 설계되었다.
상기 DSP 탱크는 처리 중인 항원과 최종 항원의 제공을 위한 저장소이다. 상기 탱크의 설정된 중량은, 설정된 해당 특정 중량에 도달하게 되면 본 공정이 진행된다는 점에서, 전체 시스템을 제어하게 된다. 또한, 상기 탱크는 최종 항원 생성물이 수집되어 200 L의 보관용 배럴로 수확되는 곳이다.
상기 DSP 탱크는 정밀여과 (MF) 유닛에 연결되어 있다. 상기 DSP 탱크로부터 항원 함유 용액을 MF 유닛으로 이송한 후, 상기 항원을 농축시킨 후 상기 농축물을 상기 DSP 탱크로 다시 이송하는 한편, 투과물은 폐기물이 있는 곳으로 이송한다.
본 공정은 상위 공정에서 생성된 (중간) 생성물을 함유하고 있는 불활성화 탱크의 중량을 재는 것으로부터 시작된다. 상기 탱크의 초기 중량을 기준으로 10배 농도를 계산하여 MF 유닛의 시스템 작동 유닛에 설정하여 둔다. 일단 농축이 시작되면, 본 시스템은 불활성화 탱크와 DSP 탱크 간의 이송 라인을 작동시켜 탱크 중량에 따라 이를 개방하거나 폐쇄시킨다. 상기 불활성화 탱크가 비워지게 되면, 본 시스템은 상기 탱크를 작동시켜 DSP 탱크로의 이송 라인을 폐쇄시킨다. 상기 불활성화 탱크가 비워진 후에는, 별도의 이송 라인이 활성화되어 최근 비워진 불활성화 탱크에 식염수를 추가할 수 있게 된다. 식염수도 중량으로 모니터링하는데, 그 이유는 DSP 탱크로 이송시키고자 하는 원하는 식염수의 양이 상기 농도 계산에서 취하여 사용한 원래의 중량과 같기 때문이다. 상기 농축물을 DSP 탱크로 다시 공급하여, 상기 농축물의 중량이 목적한 농도를 나타내는 설정치로 감소할 때까지 해당 농축물을 MF 유닛을 다시 통과시켜 더 농축시킨다.
상기 MF 유닛은 미세필터 카세트와 초미세필터 카세트를 모두 지원할 수 있다는 점에서 독특하다. 상기 절차를 위해, 총 6개의 초미세필터 사르토큐브 (sartocube) (입방체당 21 m2)를 MF 유닛에 장착한다. 상기 표면적은 본 시스템에 대한 광범위한 평가 후에 선택하였다. 여기에는 DSP 탱크에서 MF 장치로 유입되는 공급 라인, 상기 DSP 탱크로 재공급되는 농축물 라인 및 투과물-폐기물 이송 라인이 존재한다. 본 유닛은 0 psi의 투과물 압력으로 작동하도록 설정되어 있는 한편, 29 psi의 막관통 압력 (TMP)의 목표로 하여 20-35 psi의 재순환 압력을 유지한다. 재순환 펌프는 중지 모드가 활성화될 때까지 100% 용량으로 가동된다. 이러한 파라미터들을 농축 및 정용여과 공정 중의 목표로 삼는다. 일단 DSP 탱크가 설정된 중량이 되면 상기 MF 유닛이 활성화되어 농축 단계를 시작하고, 상기 설정한 10배 농도에 도달할 때까지 항원을 순환 상태로 유지한다. 일단 10배의 농도가 완료되면, 상기 MF 유닛은 중지 모드로 전환되어 감소된 압력과 속도로 항원을 순환시키는 한편, 상기 불활성화 탱크는 P-식염수로 채워지게 된다. P-식염수가 원래의 개시 중량이었던 불활성화 탱크에서의 목적하는 부피에 도달한 후에는, 본 시스템은 P-식염수의 DSP 탱크로의 유입을 개시하여 정용여과 공정을 시작할 것이며, 상기 MF 유닛도 다시 목표 범위로 상승하게 될 것이다.
일단 불활성화 탱크가 비워지게 되면, 상기 불활성화 탱크와 DSP 탱크 사이의 밸브가 폐쇄되고, 상기 항원은 10배의 정용여과가 달성될 때까지 상기 MF 유닛을 통해서 추가로 처리된다. 상기 농축 및 정용여과를 거친 항원은 상기 DSP 탱크에 있다가 최종 저장소를 위한 항원 수확 배럴로 펌핑된다. 상기 배럴들은 백신 배합때까지 4±2℃로 보관된다.
이후, 상기 상위 공정과 하위 공정에서 생성된 생성물을 카보머 용액 (보조제) 및 생리식염수 (P-식염수)와 최종적으로 혼합하였다. 상기 임상시험용 수의학 제품을 이하에서 각각 1번 임상시험용 수의학 제품 (IVP) 또는 "IVP1"이라고도 한다.
결론적으로, 본원에 설명한 신규한 공정과 관련하여 나타난 특별한 이점들로는 시간 절약, 조작 운용의 축소 및 냉각기 중 보관소/공간의 절감을 들 수 있다.
실시예 2:
사용 안전성 연구
개요
실시예 1의 1번 임상시험용 수의학 제품 (IVP) (IVP1)으로 재구성한 후 변형된 PRRS 생바이러스를 포함하는 임상시험용 수의학 제품 (동결건조물) (이하, "IVP2"라고도 칭함)의 사용 안정성에 대하여 조사하기 위하여 최적화된 프로토콜을 사용하여 본 연구를 설계하였다.
사용한 임상시험용 수의학 제품 (IVP)들에 대해서는 표 1에 간략히 설명을 제공하였다.
본 평가는 2개 뱃치의 IVP1 (하나는 고효능을 갖도록 제조되고, 다른 하나는 통상/표준 방출 효능으로 제조됨)과 2개 뱃치의 IVP2를 포함하였다.
시험한 모든 임상시험용 수의학 제품 (IVP)들 (표 1 참조)은 본 연구에서 사용이 될 때까지 5℃±3℃로 보관하였다.
본 연구에서, IVP2 백신의 각 뱃치는 IVP1로 재구성하였고, PRRS 바이러스 역가는 재구성 후 0, 2 및 4시간째에 시험하였다.
각 IVP2 뱃치에서, 0시간째에 재구성한 후의 PRRS 바이러스 역가는, 상기 동결건조물이 WPBS [세척용 인산염 완충 식염수 (= 인산염 완충 식염수 세척액)] 또는 IVP1로 재구성되었는가와 연구자들이 누구였는가와는 상관없이 유사하였다. 또한, 실온에서 항온배양하고 2시간 및 4시간 후의 시험 결과들에서는 바이러스 역가의 변화가 없었거나 무시할 수 있는 정도였다.
본 연구의 결과는 IVP1과 IVP2의 조합된 사용을 뒷받침한다.
1. 서론
본 연구는 IVP1로 재구성한 후 IVP2의 사용 안정성을 입증하기 위해 고안되었다. IVP2는 동결건조시킨 변형된 생백신 (MLV)이며, IVP1은 상술한 대로 제조하였다.
아래에, IVP1로 재구성한 후의 IVP2의 사용 안정성 평가에 대한 결과를 나타내었다.
2. 본 연구의 목적/취지
사용 안정성에 관한 본 연구의 목적은 IVP1로 재구성한 후 IVP2 백신의 안정성을 조사하는 것이었다.
3. 재료
평가된 두 백신 각각에 대한 2개의 뱃치와 연구에 사용된 1개의 희석제 대조군 뱃치를 사용하였으며, 시험 재료의 조성은 표 1에 나열하였다.
Figure pct00001
4. 연구 설계
IVP2 백신의 각 뱃치는, 가능한 모든 조합의 각각의 소단위 백신 (IVP1) 뱃치와 함께 시험하였다. 표 2.1은 본 연구에서 평가된 8가지의 백신 조합들을 모두 열거한다.
Figure pct00002
상기 샘플들을 완전한 재구성 및 0시간째 (T0)로 풀링(pooling)한 직후에 PRRS 바이러스 역가에 대해 시험하였다. 상기 풀링한 샘플들을 암실에서 실온으로 보관하여 2시간째 (T2) 및 4시간째 (T4)에 재차 시험하였다. 샘플들은 시험과 동일자로 준비하였다. 각 샘플을 2개의 서로 다른 세션에서 시험하였고 각 세션은 서로 다른 날에 이루어졌다.
시험은 2명의 연구자들에 의해 수행되었다. 1번 연구자는 IVP2 뱃치 #1로 샘플 1번 내지 4번에 대하여 시험하였고, 2번 연구자는 IVP2 뱃치 #2로 샘플 5번 내지 8번에 대하여 시험하였다. 각 연구자들은 세션당 2개의 샘플과 사용 안정성 대조군에 대하여 시험하였다. 상기 대조군은 해당 시험 샘플들에 대해 표시된 것과 동일한 부피와 시간 간격을 사용하여 멸균 세척용 인산염 완충 식염수 (WPBS)로 재구성된 IVP2로 이루어져 있다.
5. 방법
5.1 재구성 방법
(표 2.1에 설명한) 각 샘플에 있어서, IVP2의 3개 바이알 각각을 10 mL의 IVP1로 재구성하였다. 각 대조군에 있어서는, IVP2의 3개의 바이알 각각을 10 mL의 WPBS로 재구성하였다. 재구성을 완료한 후, 상술한 바와 같이, 3개의 바이알 각각의 내용물을 시험 개시 전에 풀링하였다.
5.2 시험 방법
3일차
AK-MA104 세포의 세포 배양 현탁액을 10% FBS와 젠타마이신 설페이트가 보충된 MEM 중에서 제조하였다. 100 μL의 세포 배양액을 96-웰 미량역가측정판 (microtiter plate)의 각 웰에 분주하였다. 상기 측정판을 뚜껑을 닫아 항온배양기에서 3일간 보관하였다.
0일차
샘플 제조
IVP1 및 양성 대조군의 샘플들은 감압동결건조된 IVP2의 샘플들을 재현탁시키는데 사용하였다. 상기 3개의 바이알을 풀링하고 상기 군집을 3회 역가측정하였다.
역가측정
2% FBS와 젠타마이신 설페이트가 보충된 희석 배지 MEM은 상기 샘플들의 희석을 위해 사용하였다.
접종
상기 샘플들의 웰에는 100 μL의 희석된 샘플을 접종하고, 음성 대조군의 웰에는 100 μL의 배지를 접종하였다.
항온배양
항온배양기에서 8일간 항온배양하였다.
+8일차
판독 및 계산
상기 측정판의 최종적 세포 변성 효과 (CPE) 판독은 도립(inverse) 현미경 하에서 행하였으며, 원 데이터는 1.0 log를 추가하여 1 mL 용량당 역가로 변환하였다.
역가는 리드와 무엔크 방법 (Reed and Muench method)에 따라 계산하여 (Reed, L. J.; H. Muench, (1938). "A simple method of estimating fifty per cent endpoints." Am. J. Hygiene, 27: 493 - 497), 1 mL 용량당 log10 TCID50으로 나타내었다. 각 시험 구간에서 각 샘플의 역가는, 세션당 3번의 독립적인 역가측정을 하는 2번의 연속적인 유효 시험 세션의 독립적 역가측정들의 용량당 산술 평균 역가로 나타내었다.
6. 허용 기준
WPBS 희석제 대조군으로 재구성 후 0 (T0), 2 (T2) 및 4 (T4) 시간에 수득한 IVP2의 바이러스 역가는 사전에 측정된/이전에 측정된 최소 면역 용량 (MID) 이상이다.
7. 결과
각 항온배양 시간 (T0, T2 및 T4)에서의 시험 샘플들과 각 대조군들에 대해 수득된 평균 역가 및 시간 0 (T0-T0, T2-T0 및 T4-T0)에 대한 해당 역가의 차이를 표 3과 표 4에 각각 나타내었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
8. 논의
본 연구에서 수득한 데이터는, 표준 희석제 (WPBS)로 재수화된 IVP2의 바이러스 역가들이 모두 MID를 상회하였으며, 실온에서 4시간의 항온배양 동안 안정적으로 유지되었음을 입증하였다. 이러한 결과들은 이전에 측정된 IVP2의 공지된 제품 특성들과 일치하며, IVP1과 조합하여 사용하는 변형된 PRRS 생바이러스 백신 IVP2의 사용 안정성 평가의 유효성을 확인시켜주는 것이다.
T0에서 IVP1의 두 뱃치들 중 하나로 시험한 IVP2의 뱃치들 모두에 대해 수득된 결과는, 각각의 대조군들에서 얻은 것에 필적하는 바이러스 역가를 보여주고 있다. 대조군과 시험 샘플들 간에 관찰된 변동성은 각 분석 유효성 연구에서 볼 수 있는 분석의 변동성 이내이다.
T2 및 T4에서 IVP1의 두 뱃치들 중 하나로 재구성한 후 IVP2의 뱃치들 모두에 대해 수득된 결과는, 역가의 감소가 없거나 또는 최소한의 감소 (≤0.12 log10 TCID50)만이 있는 안정적인 바이러스 역가를 보여주었다.
9. 결론
본 연구의 결과는 IVP1 및 IVP2의 조합 사용과, IVP1과 혼합했을 경우 IVP2의 4시간의 사용 안정성을 뒷받침하는 것이다.
실시예 3:
a) PRRSv 면역유발에 대한 면역성의 개시
본 연구의 목적은 백신접종 후 3주차에 IVP2에 대한 면역성의 개시가 IVP1과 조합하여 사용되는 경우에 영향을 받는지의 여부를 알아보는 것이었다. 이러한 목적을 위해, IVP2 백신을 고효능으로 제조된 IVP1을 이용하여 최소 면역 용량 (MID)으로 재구성하였는데, 이러한 IVP1과 IVP2의 조합을 아래에서는 "IVP1/IVP2"로도 칭한다. 본 연구에는 독일의 시판용 가축집단에서 받은 3주령의 새끼 돼지 52마리가 포함되었다. 본 연구의 1차 파라미터는 면역유발 후 10-12일차에 부검했을 때 폐 병변이 있는지의 여부였다.
상기 동물들을 포함시킬때 어떤 동물들도 PRRSV에 대해 항체 또는 항원 양성이 아니었다. PRRSV로 면역유발시키기 전까지는 (백신접종 후 21일차), 대조군의 어떤 동물들도 혈청전환을 나타내지 않거나 PRRSV 항원에 대해 양성으로 판정되었다.
IVP1/IVP2로 백신접종한 동물들은 대조군의 동물과 비교하였을 때 중앙값 폐 병변 지수 (median lung lesion score)가 52.1% 감소하였다. 또한, IVP1/IVP2 백신접종한 동물들은, 대조군에 비해 면역유발 후 1일당 164 g의 통계적으로 유의하게 높은 ADWG를 나타냈으므로, 상기 ADWG 결과는 IVP1과 IVP2 조합의 효능을 뒷받침하는 것이다.
IVP1/IVP2로 백신접종한 동물들에서, 첫 PRRSV 항체가 백신접종 후 14일차 (D14)에 검출되었다. PRRSV 항체 양성 동물의 수는 면역유발 후 1주차에 두 군들 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었으나, 항체 수준은 대조군에 비해 백신접종군에서 유의하게 높았다. 면역유발 후 10-12일차에, 모든 동물들은 PRRSV 항체에 대해 양성이었고 양 군들 간의 항체 수준에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
결론적으로, 백신접종 후 3주차에 IVP2에 대한 면역성의 개시는 IVP1과 조합하여 사용하는 경우에 부정적인 영향을 미치지 않았던 것으로 나타났다.
B) PCV2 면역유발에 대한 면역성의 개시
본 연구의 목적은 IVP2와 조합하여 사용되는 경우의 IVP1에 대한 면역성의 개시를 평가하는 것이었다. 이러한 목적을 위해, IVP2 백신을, 최소 효능을 목표로 제조된 IVP1을 첨가하여 최대 면역 용량을 목표로 재구성하였는데, 이러한 IVP1과 IVP2의 혼합물을 이하에서는 "IVP2/IVP1"로도 칭한다.
본 연구에는 PCV2에 대해 혈청반응이 음성인 제왕절개한 후 초유를 먹이지 않은 (CDCD) 돼지 60마리가 포함되었으며, 이 중 30마리는 IVP2/IVP1로 백신접종하였고 나머지 30마리 (대조군)는 3주령 (즉, 연구 0일차(D0))에 멸균 희석제 (주사용수)를 투여받은 후, D15에 병독성 PCV2로 면역유발시켰다.
IVP2/IVP1 백신접종을 통해 PCV2 혈청반응에 양성인 돼지가 크게 증가하는 결과가 나타났다. 면역유발 후 1주 내에, IVP2/IVP1 군 중 28마리 (93%)가 양성 수준으로 혈청전환되었던 반면, 대조군 중에서는 0/30마리 (0%)가 양성이었다. 대조군의 동물들은 면역유발 후 13일차에 양성 수준으로 혈청이 전환되기 시작하였다. D21, D28 및 D35에, IVP2/IVP1 군은 PCV2 역가가 양성인 돼지들의 비율이 대조군에 비해 상당히 높았다. D42까지, IVP2/IVP1 군은 PVC2에 대하여 100% 혈청 양성 반응을 보였던 반면, 대조군은 92% 양성이었다.
1차 결과 파라미터들을 평가해 본 결과, IVP2/IVP1을 이용한 백신접종은, 대조군에 비해 림프구 고갈, 림프구 염증 및 PCV2 림프구 콜로니생성을 현저히 감소시켰다. 게다가, 전반적인 조직 병변의 수준은 대조군에서 더욱 심각해서 23/30마리의 돼지 (76.7%)가 적어도 한 범주의 림프구성 병변 평가에서 중등도 내지 중증의 점수를 나타내었던 반면, 백신접종한 돼지들 중에서는 단 2/30마리 (6.7%)만이 중등도의 림프구성 병변 점수를 나타냈으며 중증은 아예 없었다.
결론적으로, 최소 효능으로 제조되어 IVP2와 조합하여 사용하는 IVP1은, 백신접종 후 15일차에 병독성 PCV2를 사용한 면역유발시 3주령의 CDCD 돼지의 효과적인 활성 면역화를 유발시켰다.
이외에도, 실시예 1에 따른 후속 가공처리 공정을 거치지 않은 각 제품 (상기 제품을 본원에서는 "IVP0"으로 칭함)과 1가의 IVP1을 비교하는 추가의 백신접종-PCV2 면역유발 연구에서, IVP1은 적어도 상기 확립된 IVP0만큼 효율적이었다.
C) PCV2 면역유발에 대한 면역성의 지속기간
본 연구의 목적은 IVP2와 조합하여 사용되는 경우의 IVP1에 대한 면역성의 지속기간을 평가하는 것이었다. 이러한 목적을 위해, IVP2 백신을, 최소 효능을 목표로 제조된 IVP1을 첨가하여 최대 면역 용량을 목표로 재구성하였다. 상기 (B에서) 언급한 바와 같이, IVP1과 IVP2의 혼합물은 본원에서 "IVP2/IVP1"로도 칭한다.
본 연구에는 PCV2에 대해 혈청반응이 음성인 제왕절개한 후 초유를 먹이지 않은 (CDCD) 돼지 60마리가 포함되었으며, 이 중 30마리는 IVP2/IVP1로 백신접종하였고 나머지 30마리 (대조군)는 3주령 (즉, 연구 0일차(D0))에 멸균 희석제 (주사용수)를 투여받은 후, D119 (17주의 면역성 지속기간)에 병독성 PCV2로 면역유발시켰다.
그 결과, IVP2/IVP1로 백신접종한 동물들은, PCV2 면역유발 후 대조군 동물들에 비해, 림프구 고갈, 림프구 콜로니형성 및 바이러스 혈증의 빈도가 크게 감소하였다. 또한, IVP2/IVP1로 백신접종한 동물들은 모든 샘플채취일에 PCV2 바이러스 부하량이 크게 감소했으며, 어떤 샘플채취 시점에서도 질병을 유발하는 바이러스 혈증으로 간주되는 바이러스 수준 [(rt-PCR) 시험 ≥ 1.0×104 개의 PCV2 유전체 당량]이 없었던 반면, 대조군 동물들은 PCV2로 면역유발 후 중위값인 28일간 바이러스 혈증을 나타내었다.
IVP2/IVP1을 이용한 백신접종으로 해당 백신접종 (D0)으로부터 D133 (PCV2로 면역유발 후 2주)에 이르기까지 PCV2 혈청반응검사에 양성인 돼지들이 크게 증가하였는데, 이는 역사상 매우 강력한 효능을 나타낸 것이었다. 대조군의 대부분 (81%)은 D140 (PCV2로 면역유발 3주)까지 PCV2 혈청반응검사에 대해 양성을 나타내지 않았다.
이러한 결과는 백신접종 후 17주차에 IVP1에 대한 면역성의 지속기간이 IVP2과 조합하여 사용하는 경우에 부정적인 영향을 미치지 않았던 것을 보여주는 것이다.
D) PRRSv 면역유발에 대한 면역성의 지속기간
본 연구의 목적은 백신접종 후 6개월차에 IVP2에 대한 면역성의 지속기간이 IVP1과 조합하여 사용되는 경우에 영향을 받는지의 여부를 알아보는 것이다. 이러한 목적을 위해, IVP2 백신을, 고효능으로 제조된 IVP1을 이용하여 최소 면역 용량 (MID)으로 재구성하였다. 상기 (A에서) 언급한 바와 같이, IVP1과 IVP2의 이러한 조합은 "IVP1/IVP2"로도 칭한다. 본 연구에는 독일의 시판용 가축집단에서 받은 3주령의 새끼 돼지 70마리가 포함되었는데, 상기 포함된 동물들 중 어떤 동물도 PRRSV에 대해 항체 또는 항원 양성이 아니었다. 면역유발은 백신접종 후 182일차 (6개월의 면역성 지속기간)에 수행된다. 본 연구의 1차 파라미터는 면역유발 후 10-12일차에 부검했을 때 폐 병변이 있는지의 여부이다.
그 결과, IVP1/IVP2로 백신접종한 동물들은 PRRSV 면역유발 후 대조군의 동물들에 비해 폐 병변이 감소하였는데, 이는 백신접종 후 6개월의 IVP2의 면역성 지속 기간이, IVP1과 조합하여 사용되는 경우에도 부정적인 영향을 받지 않음을 보여주는 것이다.
실시예 4:
티오황산염 농도의 분석
개요
실시예 1에 기술된 바와 같이, 이원성 에틸렌이민 (BEI)을 바큘로바이러스 재조합 백신의 제조에서 불활성화제로 사용하였다. BEI로 불활성화한 후, 티오황산나트륨을 첨가하여 잔류 BEI를 중화시켰다.
5 mM의 BEI로 PCV2 항원 유체를 불활성화시킨 후에도, 저농도 (일반적으로 0.3 mM 정도)의 BEI는 검출가능한 상태로 남아있다. EU 약전은 불활성화 후 항원에 BEI가 잔류해서는 안된다고 기술하고 있다. EU 약전은, 독성 수준의 BEI가 항원에 남아있지 않음이 확인되는 경우에 한해 불활성화 후 잔류 티오황산나트륨의 검출을 허용하고 있다. 따라서, 5 mM의 티오황산염을 활성화 단계에서 BEI를 중화하는데 사용하였는데, 그 이유는 불활성화 단계를 시작할 때 처음에 5 mM의 BEI를 첨가하였기 때문이다. 상당량의 BEI가 불활성화 동안 핵산과의 반응에서 소비되고, 티오황산염과 BEI가 1:1의 화학량론적으로 반응하기 때문에, 중화 후에도 초과량의 잔류 티오황산염은 남아 있다.
실시예 1에 따라 제조된 항원 유체에 대하여, 후술하는 바와 같이, 티오황산염 시험을 수행하였다.
본 실험의 데이터를 통해서, 실시예 1에 기술된 방법이 예상외로 티오황산염 수준을 이미 10배 농축하여 정용여과시킨 항원 유체에서 방법-검출가능 한계 미만으로 감소시킴을 알 수 있었다.
재료 및 방법
고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의한 항원 유체 중의 티오황산나트륨의 정량적 측정
A. 시약과 재료
1. 티오황산나트륨 5수화물, 공지된 순도의 시약 등급
2. 정제수 - 18 MΩcm의 고유저항 또는 그 이상을 사용함
3. 아세토니트릴 (ACN), HPLC 등급
4. 빙초산, HPLC 등급
5. 수산화테트라부틸암모늄 (TBA), 시약 등급
6. HPLC 컬럼/가드 - 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific), ODS-2 Hypersil, 150×4.6 mm, 5 마이크론, 적절한 가드, ODS-2 Hypersil-2, 10×4.6 mm, 5 마이크론, 또는 동등물.
B. 용액
1. 20%의 아세트산 용액
10 mL의 빙초산과 40 mL의 정제수를 혼합하고 완전히 섞어준다.
2. 용리제
750 mL의 정제수와 20 mL의 TBA를 혼합하고 완전히 섞어준다. 20 mL의 20% 아세트산 용액을 첨가하여 상기 용액의 pH를 4.5 - 5.0으로 조정한 후, 250 mL의 아세토니트릴과 혼합한다. 사용 전에 완전히 섞어주고 0.2 ㎛의 나일론 필터를 통해 여과한다.
3. 희석제
800 mL의 정제수와 200 mL의 아세토니트릴을 혼합하고; 완전히 섞어 주위 조건에서 보관한다.
C. 티오황산염 참조 표준 용액
1. 티오황산나트륨 저장용 농축 용액 (5mM)
1.2 g의 티오황산나트륨 5수화물 기준 물질을 칭량하여 정제수와 함께 1000 mL의 클래스 A 부피 측정용 플라스크로 옮기고; 거꾸로 뒤집어 완전히 혼합한다.
2. 100% 표준 작업 용액 (100% WS)
2 mL의 티오황산나트륨 저장용 농축 용액을 50 mL의 클래스 A 부피 측정용 플라스크로 옮긴다. 희석제로 해당 부피로 희석하고 거꾸로 뒤집어 완전히 혼합한다.
3. 50% 선형성 표준 용액 (50% LS)
1 mL의 티오황산나트륨 저장용 농축 용액을 50 mL의 클래스 A 부피 측정용 플라스크로 옮긴다. 희석제로 해당 부피로 희석하고 거꾸로 뒤집어 완전히 혼합한다.
4. 150% 선형성 표준 용액 (150% LS)
3 mL의 티오황산나트륨 저장용 농축 용액을 50 mL의 클래스 A 부피 측정용 플라스크로 옮긴다. 희석제로 해당 부피로 희석하고 거꾸로 뒤집어 완전히 혼합한다.
5. 정량 한계 용액 (LOQ)
1 mL의 50% LS를 20 mL의 클래스 A 부피 측정용 플라스크로 옮긴다. 희석제로 해당 부피로 희석하고 거꾸로 뒤집어 완전히 혼합한다.
D. PCV2 불활성화된 항원 유체 시험 용액
500 μL의 불활성화된 항원 유체를 10 mL의 클래스 A 부피 측정용 플라스크로 옮긴다. 희석제로 해당 부피로 희석하고 거꾸로 뒤집어 완전히 혼합한다. 0.2 ㎛의 나일론 주사기 필터를 통해 샘플을 여과하여 HPLC 바이알에 넣고, 첫 2 내지 3 mL를 버린다. 이것이 해당 항원의 20배 희석 유체이다.
E. HPLC 크로마토그래피 장비 및 조건
1. 유속: 1.2 mL/분
2. 주입 부피: 10 μL
3. 컬럼: 써모 사이언티픽, ODS-2 Hypersil, 150×4.6 mm, 5 마이크론, 적절한 가드, ODS-2 Hypersil-2, 10×4.6 mm, 5 마이크론.
4. 온도: 20 ± 2℃ 샘플 트레이 온도
25 ± 2℃ 샘플 트레이 온도
5. 검출: 230 nm
6. 통상적인 분석 순서
ㆍ 폐기물용 희석제
ㆍ 희석제; 1회 주입
ㆍ 공시험액; 1회 주입 (기준치 모니터링, 비주사형)
ㆍ 교정 표준시편; 100% WS 6회 주입
ㆍ 선형성 표준시편; 50, 100 및 150% 용액을 각각 2회 주입
ㆍ LOQ 표준시편; 2회 주입
ㆍ 시험 용액 및 표준시편 확인; 각 시험 용액당 2회 주입 및 최대 16회 샘플 주입과 분석 종료 사이에 표준시편 검사로서 100% WS 2회 주입
7. 티오황산염 머무름 시간: 약 7분.
F. 티오황산나트륨 함량 계산 - 티오황산염 함량 (mM)은 아래의 공식을 사용하여 계산한다:
티오황산염 (mM) = TS / WS×C×20
상기 식에서:
TS - 2개의 시험 용액 제제 주입에 대한 티오황산염 피크 면적의 평균.
WS - 6개의 100% WS 주입에 대한 티오황산염 면적 반응의 평균.
C - 작업 표준 용액의 농도 (mM) (0.2 mM).
20 - 시험 용액의 희석 배율
결과
실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 수개의 항원 유체들을 분석하였는데, 여기서 샘플 쌍은
(i) 티오황산나트륨으로 BEI를 중화한 후 후속 처리 공정 전, 및
(ii) 후속 처리 공정 (즉, 10배 농축 및 연속 정용여과) 후 보조제 및 P-식염수와 혼합하기 전에 취하여 티오황산나트륨의 농도를 측정하였다.
BEI 중화 후 후속 처리공정 전에 채취한 샘플 (i)은 여전히 mM 범위의 티오황산나트륨 농도를 가지고 있었던 반면, 후속 처리공정 후 보조제 및 P-식염수와 혼합하기 전에 채취한 샘플 (ii)에서는 예상외로 검출 한계 (3 μM) 또는 그 이상에서 검출가능한 티오황산나트륨이 없었던 것으로 밝혀졌다.
실시예 5:
2부로 구성된 UPLC에 의한 항원 유체의 분석
음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 분리에 기반한 2부로 구성된 UPLC 방법을 사용하여, 실시예 1에 기술된 처리공정에서 생성된 바이러스 유사 입자 (VLP)를 함유하는 항원 유체를 분석하였다.
사용된 크로마토그래피의 제1 단계는 음이온 교환 크로마토그래피인데, 음으로 하전된 화학종들을 컬럼에 결합시킨 후 (크로마토그램에서 0 - 2.67분), 구배 상의 염화나트륨 농도를 증가시켜 용출시킨다.
사용된 크로마토그래피의 제2 단계는 크기 배제인데 (크로마토그램에서 2.67 - 15 분), 이 경우는 밸브를 전환하여 상기 1부의 음이온 교환을 크기 배제 컬럼 상에서 수행한다. 상기 크기 배제 컬럼은 음이온 교환 용리제들의 혼합물을 용리시킨다.
재료 및 방법
A. 시약과 재료
1. 1 M Tris (물 중에서 pH 7.4), 분자 생물학 등급
2. 물 중의 5 M NaCl, 분자 생물학 등급
3. 정제수 - 18 MΩcm의 고유저항 또는 그 이상을 사용함
4. 음이온 교환 컬럼 - VLP (거대 공극 또는 비다공성 물질)를 결합시키는데 적절한 4차 아민 작용성이 있는, 0.1 mL 부피의 컬럼
5. 크기 배제 컬럼 - 공극 크기가 450 Å인 1.75 mL 부피의 컬럼
6. 10 N NaOH, 시약 등급
B. 용액
1. 50 mM Tris, pH 8: 50 mL의 1 M Tris (pH 7.4)와 900 mL의 물을 혼합한다. 10 N NaOH로 pH를 8로 조정하고, 1000 mL로 희석한 다음, 0.22 ㎛의 필터를 통해 여과한다.
2. 50 mM Tris, 2M NaCl, pH 8: 50 mL의 1 M Tris (pH 7.4)와 400 mL의 5 M NaCl을 300 mL의 물과 혼합한다. 10 N NaOH로 pH를 8로 조정하고, 1000 mL로 희석한 다음, 0.22 ㎛의 필터를 통해 여과한다.
C. PCV2 공정 중 참조 용액
1. 0.22 ㎛의 PES 필터를 통해 불활성화 이전에 수득한 항원 유체를 여과한다.
D. PCV2 사전 불활성화 또는 불활성화된 항원 유체 시험 용액
1. 0.22 ㎛의 PES 필터를 통해 항원 유체를 여과한다.
E. 2D - UPLC 크로마토그래피 장비 및 조건
1. 제1부 크로마토그래피
a. 유속: 0.6 mL/분
b. 주입 부피: 20 μL
c. 시스템 부피: 400 μL
d. 컬럼: 0.1 mL의 컬럼 부피의 4차 아민 컬럼
e. 온도: 실온
f. 검출: 형광 방출 (여기 280 nm 및 방출 330 nm)
g. 구배: 처음 0분째에 100% 50 mM Tris (pH 8)에서, 1분째에 97.5% 50 mM Tris (pH 8) 및 2.5% 50 mM Tris, 2M NaCl (pH 8) 및 최종 2분째에 10% 50 mM Tris (pH 8) 및 90% 50 mM Tris, 2M NaCl (pH 8)으로 구성된 다단계 구배법을 음이온 교환 컬럼을 통해 0.6 mL/분의 유속으로 구동시킨다.
2. 제2부 크로마토그래피
a. 유속: 0.3 mL/분
b. 제1부로부터 주입: 50 μL
c. 컬럼: 공극 크기가 450
Figure pct00005
인 1.75 mL의 컬럼 부피를 갖는 크기 배제 컬럼
d. 검출: 형광 방출 (여기 280 nm 및 방출 330 nm)
e. 등용매 구배: 95% 50 mM Tris, pH 8: 5% 50 mM Tris, pH 8, 2M NaCl
3. 통상적인 분석 순서
a. PCV2 기준 용액의 2배 연속 희석액을 5번 주입한다
b. 1 - 15개의 샘플들을 주입한다
c. PCV2 기준 용액의 2배 연속 희석액을 5번 주입한다
4. 1부에서 2부로 전환하는 시간: 2.67분 (이 전환 시간은 시스템 부피에 따라 다르겠지만, 이 경우 400 μL임)
5. 하기 열거한 피크 비율들은 피크 면적을 적분하여 상기 피크 면적들의 비율을 취하여 계산하였다.
바큘로바이러스 발현 시스템에서 생성된 VLP (ORF2) 생성물을 분석하기 위해 상기 2부로 구성된 UPLC를 이용하였더니, 생성된 크로마토그램에서 서로 다른 두드러진 피크들이 나타났다:
- 크로마토그램에서 0-1분의 피크 (이하, "피크 A"라고도 칭함)는 pH 8에서 음이온 교환 컬럼에 결합하지 않는 구성성분들을 나타낸다 (즉, pH 8에서 중성 또는 양이온성인 구성성분들, 예를 들어 양으로 하전된 단백질 및/또는 세포 배양 구성성분들)
- 크로마토그램에서 7-8분의 피크 (이하, "피크 B"라고도 칭함)는 관심대상인 VLP (ORF2) 항원을 나타낸다
- 크로마토그램에서 8.5-9.5분의 피크 (이하 "피크 C"라고도 칭함)는 그 크기 범위가 IgG (150 kDa)에서 우라실 (0.1 kDa)에 이르는 구성성분들을 나타낸다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 후속 처리공정 (즉, 10배 농축 및 연속 정용여과) 후 취해진 샘플들의 10배 희석액은, 상위 공정 샘플들과 비교하였을 때, 평균적으로 피크 A에서 99.2% 감소 및 피크 C에서 42% 감소를 나타내었음이 확인되었다. 또한, 피크 A와 C의 감소가 확인되었지만, 피크 B의 증가도 나타났다.
예상외로, 실시예 1에 기술된 바와 같이 후속 처리공정 후 취해진 샘플들의 피크 비율 (피크 A/B 및 피크 C/B)은, 피크 A/B의 경우 0.3 (3회 반복, 표준 편차 0.1) 및 피크 C/B의 경우는 0.7 (3회 반복, 표준 편차 0.2)에 불과한 것으로 나타났다.
추가로, 실시예 1에 기술된 바와 같이 후속 처리공정 (즉, 10배 농축 및 연속 정용여과) 후 취해진 샘플들에서는 응집이 증가하지 않았거나 용액 중 크기가 더 큰 화학종들이 존재하지 않았음도 확인되었다. 상기 관찰은, 예상대로 응집이 농도에 의존하기 때문에, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 상에서 상기 농축 샘플들에서 더 큰 화학종들의 현저한 증가를 확인하는 놀라운 결과였다.
실시예 6:
유리 아미노산의 정량
곤충 세포 배양 배지 및 사용한 배지에서 유리 아미노산을 정량하는 통상적인 방법을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 항원 유체 중의 아미노산 농도를 측정하였다.
간략히 설명하면, 샘플들 중의 단백질을 트리클로로아세트산 (TCA)으로 침전시켜 원심분리로 제거한다. TCA 침전에서 생긴 상청액을 수산화나트륨으로 중화시키고 노르발린을 내부 표준 물질로 첨가한다. 그 다음, 상기 샘플들을, 338 nm의 UV 흡광도에 의한 정량을 위해 역상 컬럼 상에 주입하기 전에 UHPLC의 주입 루프에서 o-프탈디알데하이드 (OPA) 및 머캅토프로피온산 (MPA)을 사용하여 유도체화시킨다. 표준 참조 샘플 (외부 표준물)에 대한 크로마토그램을 기초로, 항원 유체에 포함된 20개의 공통 아미노산 (즉, 유전자 암호화된 20개의 아미노산)의 농도를 측정하였다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 후속 처리공정 (즉, 10배 농축 및 연속 정용여과) 후 취해진 여러 샘플들의 아미노산 농도를 측정하고, 보조제 및 P-식염수를 첨가하여 상기 샘플들의 통상적인 후속 희석을 고려하여, 최종 제품 (백신) 중의 특정 아미노산들의 특징적인 농도가 하기의 범위에 있는 것으로 확인/측정되었다:
트립토판: 0.1-0.7 μM;
글루타민: 0.7-2.4 μM;
메티오닌: 0.5-3.2 μM;
아르기닌: 1.4-4.7 μM;
트레오닌: 1.6-8.0 μM;
리신: 4.0-12.2 μM.
이와 관련하여, 최종 제품 (백신) 중의 상기 아미노산의 통상적인 평균 농도 역시 하기의 범위로 결정하였다:
트립토판: 0.2-0.6 μM;
글루타민: 0.8-2.2 μM;
메티오닌: 0.8-2.2 μM;
아르기닌: 1.6-4.3 μM;
트레오닌: 2.4-6.3 μM;
리신: 4.4-11.2 μM.
결론적으로, 실시예 4-6에 기술된 분석 결과를 통해, 실시예 1에 기술된 방법이 분명한 고유의 특성을 갖는 제품을 제공함을 알 수 있는데, 이러한 각 특성들이 실시예 2 및 3에 설명한 바와 같은 시험과 연구의 유익한 결과에 대한 원인일 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 특정 양태들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제공되는 특정 실시양태들에대한 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조하면 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 대표적인 방법에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
[서열목록에 관한 설명]
서열번호 1은 PCV2a ORF2 단백질의 서열에 해당하고,
서열번호 2는 PCV2b ORF2 단백질의 서열에 해당하며; 본원에 언급된 "PCV2b ORF2 단백질"은 특히 유전자형 d에 속하는 것으로 간주되기도 하는 소위 "돌연변이 PCV2b"의 ORF2 단백질에 대한 것이다.
본 발명은 특히, 하기의 항목을 포함한다:
1. 하기의 단계들을 포함하는, 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
(a) - 제1 액체, 및
- 재조합 단백질 및/또는 다수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 4차 구조를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거함으로써, 상기 혼합물 중의 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 농축시키는 단계, 및
(c) 연속 정용여과에 의해 단계 (b)에서 생성된 용액을 가공처리하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 연속 정용여과가 제2 액체에 대한 연속 정용여과이고, 여기서 상기 제2 액체는 제1 액체와 상이한 것인, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 혼합물이 추가로
- 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 불활성화제에 의해 불활성화시킨 벡터, 및/또는
- 중화제에 의해 중화시킨 불활성화제, 및/또는
- 중화제를 포함하는 것인, 방법.
4. 제3항에 있어서, 단계 (c)에서, 단계 (b)로부터 생성된 용액을, 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 공정 용액 중에서 감소하도록, 연속 정용여과에 의해 가공처리하는 것인, 방법.
5. 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법, 특히 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는 것인, 방법:
(a) (i) - 제1 액체,
- 재조합 단백질 및/또는 다수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 4차 구조, 및
- 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
(ii) 단계 (i)의 혼합물에 불활성화제를 첨가하여 상기 벡터를 불활성화시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 생성된 혼합물에 중화제를 첨가하여 불활성화제를 중화시키는 단계;
(b) 단계 (a)(iii)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거함으로써 상기 혼합물 중의 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 농축시키는 단계, 및
(c) 단계 (b)에서 생성된 용액을 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 공정 용액 중에서 감소하도록 연속 정용여과에 의해 가공처리하는 단계.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 혼합물로부터 제1 액체의 일부를 제거하는 작업이 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터로 여과하는 단계로 이루어지거나 또는 이러한 단계를 포함하고, 이 경우 상기 적어도 하나의 필터가 바람직하게는 필터막을 포함하는 것인, 방법.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 농축이
- 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터는, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 중에서도 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계,
- 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 투과물을 배출시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 연속 정용여과가
- 상기 용액을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터는, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 중에서도 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조를 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계,
- 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 투과물을 배출시키는 단계,
- 대량 유동에 제2 액체를 투과물 유동과 동일한 속도로 첨가하는 단계로서, 상기 제2 액체는 제1 액체와는 상이한 것인, 단계를 포함하는 것인, 방법.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 필터가 적어도 하나의 평판 필터 및/또는 적어도 하나의 중공 섬유 필터이고, 상기 적어도 하나의 평판 필터는 바람직하게 적어도 하나의 카세트 필터인 것인, 방법.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 필터가 2-8개의 필터, 바람직하게는 5-7개의 필터이고/이거나,
상기 적어도 하나의 필터 각각이 약 16-26 m2, 바람직하게는 약 20-22 m2의 총 필터 면적을 갖는 것인, 방법.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터막의 평균 공극 크기가 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조보다 작고/작거나, 상기 필터막의 분자량 절사값(cut off)이 약 200 kDa 내지 약 500 kDa인 것인, 방법.
12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 필터막이 폴리에테르설폰, 셀룰로스 수화물, 재생 셀룰로스, 안정화된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스 수화물, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리이미드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어지거나 이를 포함하고/포함하거나,
상기 필터막이 바람직하게는 폴리에테르설폰으로 이루어지거나 이를 포함하거나, 또는 상기 필터막이 임의로, 안정화된 셀룰로스 기반의 막인 것인, 방법.
13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 단계 (c)에서 동일한 필터 시스템이 사용되는 것인, 방법.
14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
- 단계 (iii)을 제1 용기에서 수행하되, 이 경우 불활성화제를 중화시켜 생성된 혼합물을 제1 용기로부터 필터 시스템과 연결된 제2 용기로 이송하고, 상기 혼합물을 제1 용기에서 제2 용기로 이송한 후 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 닫고, 빈 제1 용기를 제2 액체로 채우며,
- 단계 (b)에서 상기 혼합물을 농축이 완료될 때까지 제2 용기와 필터 시스템을 통해 순환시키고,
- 단계 (c)에서 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 개방하여 제2 액체를 제1 용기로부터 제2 용기로 연속적으로 흘러가도록 유도하는 한편, 상기 혼합물은 필터 시스템과 제2 용기를 통해 순환시키는 것인, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 액체가 세포 배양 배지의 일부를 포함하거나 세포 배양 배지로 이루어지고, 상기 세포 배양 배지가 바람직하게는 곤충 세포 배양 배지인 것인, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피가 1000 L 내지 10000 L, 바람직하게는 2000 L 내지 8000 L, 가장 바람직하게는 3000 L 내지 5000 L인 것인, 방법.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조가, 단계 (a)에서 생성된 혼합물 부피에 비해서 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 8X, 보다 바람직하게는 9X 내지 11X로 최종 농축되는 것인, 방법.
18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 액체가 완충 용액, 바람직하게는 P-식염수 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)인 것인, 방법.
19. 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 대량 유동에 첨가되는 제2 액체의 총 부피가 단계 (b)에서 생성된 용액 부피의 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 7X, 보다 바람직하게는 적어도 9X이고/이거나, 대량 유동에 첨가되는 제2 액체의 총 부피는 가장 바람직하게는 대략 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 정도가 되는 것인, 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하기의 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법:
(d) 단계 (c) 이후에 잔류하는 혼합물을 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 성분과 혼합하는 단계로서, 상기 혼합으로 생성된 용액 중의 상기 재조합 단백질의 농도 및/또는 상기 4차 구조의 농도가 바람직하게는 대략 단계 (a)로부터 생성된 혼합물 중의 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조의 농도 정도가 되는 것인, 단계.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에 사용된 혼합물이 하기의 단계들을 포함하는 절차에 의해 수득가능한 것인, 방법:
(1) 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 배양물 중의 감수성 세포들을 감염시키는 단계로서, 상기 재조합 단백질이 상기 벡터에 의해 발현되는 것인, 단계,
(2) 이후, 상기 세포 배양물로부터 상기 재조합 단백질 및/또는 복수의 상기 재조합 단백질을 포함하는 상기 4차 구조를 회수하는 단계로서, 이 경우 바람직하게는 세포 잔해물이 분리 단계, 바람직하게는 예컨대 적어도 하나의 필터, 바람직하게는 2개의 필터를 통한 정밀여과를 통해 상기 재조합 단백질 및/또는 상기 4차 구조로부터 분리되고, 여기서 상기 적어도 하나의 필터의 공극 크기는 바람직하게는 상기 재조합 단백질 및/또는 복수의 상기 재조합 단백질을 함유하는 4차 구조보다 크며, 특히 약 1 내지 약 20 ㎛ 및/또는 약 0.1 ㎛ 내지 약 4 ㎛의 공극 크기를 가지는 것인, 단계.
22. 제21항에 있어서, 상기 분리 단계가 하기를 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 방법:
- 약 2 ㎛ 내지 약 15 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 필터를 통한 정밀여과, 및/또는
- 약 0.8 ㎛ 내지 약 1.0 ㎛의 공극 크기를 갖는 하나 이상의 필터를 통한 정밀여과.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 단계 (1)의 세포 배양물을, 바람직하게는 상기 재조합 단백질을 상기 벡터에 의해 발현시키면서 22-32℃로 유지하고/유지하거나, 단계 (2)의 회수는 상기 벡터로 상기 세포들을 접종한 후 5 내지 8일, 바람직하게는 8일차에 이루어지는 것인, 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 PCV2 ORF2 단백질인 것인, 방법.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4차 구조가 바이러스 유사 입자인 것인, 방법.
26. 제3항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 재조합 바이러스, 바람직하게는 바큘로바이러스이고/이거나, 상기 핵산 서열이 DNA 서열인 것인, 방법.
27. 제3항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화제가 아지리딘 화합물, 바람직하게는 이원성 에틸렌이민 (BEI)이고/이거나, 상기 불활성화제가 상기 벡터에 대하여 몰 초과량으로 첨가되는 것인, 방법.
28. 제3항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중화제가 티오황산나트륨이고/이거나, 상기 중화제가 상기 불활성화제에 대하여 몰 초과량으로 첨가되는 것인, 방법.
29. 제5항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)에서 상기 중화제는 단계 (ii)에 첨가된 불활성화제의 양과 비교하였을 때 동등한 양으로 첨가되는 것인, 방법.
30. 제5항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 이후에 잔류하는 혼합물이 단계 (iii)에서 생성된 중화제 농도의 1000분의 1 미만인 불활성화제 농도를 포함하는 것인, 방법.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법으로 생성된 면역원성 조성물의 바이러스 박멸 활성이 상기 방법의 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과를 거치지 않은 면역원성 조성물 혼합물에 비해 적어도 20% 감소되고/감소되거나, 상기 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물이, 특히 실온에서 4시간 이상 동안 생바이러스를 상기 면역원성 조성물과 혼합하는 경우, 생바이러스 1 mL당 1 log TCID50 미만, 바람직하게는 생바이러스 1 mL당 0.7 log TCID50 미만의 손실을 야기하는 것인, 방법.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 이후에 잔류하는 혼합물을 적어도 하나의 추가의 항원과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 생바이러스 또는 상기 적어도 하나의 추가의 항원이 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스인 것인, 방법.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물.
35. 제34항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하고, 단계 (c) 이후에 잔류하는 혼합물이 3 μM 미만의 티오황산나트륨을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
36. 제34항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능하고, 단계 (d)에서 생성된 면역원성 조성물이 티오황산나트륨을 실질적으로 함유하지 않는 것인, 면역원성 조성물.
37. 면역원성 조성물, 특히 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물로서,
- 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 재조합 PCV2 ORF2 단백질, 및
- 1-10 μM의 L-아르기닌 및/또는 1-10 μM의 L-리신을 포함하고,
바람직하게는 상기 면역원성 조성물이 중화된 불활성화제를 실질적으로 함유하지 않고/않거나 중화제를 실질적으로 함유하지 않는 것인, 면역원성 조성물.
38. 면역원성 조성물, 특히 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 바람직하게는 단계 (d)를 포함하는 임의의 상기 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물이
바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 재조합 PCV2 ORF2 단백질,
및
0.1-1 μM의 L-트립토판; 및/또는
0.1-3 μM의 L-글루타민; 및/또는
0.2-4 μM의 L-메티오닌; 및/또는
1-10 μM의 L-아르기닌; 및/또는
1-10 μM의 L-트레오닌; 및/또는
1-15 μM의 L-리신을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이
0.1-0.7 μM의 L-트립토판; 및/또는
0.7-2.4 μM의 L-글루타민; 및/또는
0.5-3.2 μM의 L-메티오닌; 및/또는
1.4-4.7 μM의 L-아르기닌; 및/또는
1.6-8.0 μM의 L-트레오닌; 및/또는
4.0-12.2 μM의 L-리신을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
40. 제39항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이
0.2-0.6 μM의 L-트립토판; 및/또는
0.8-2.2 μM의 L-글루타민; 및/또는
0.8-2.2 μM의 L-메티오닌; 및/또는
1.6-4.3 μM의 L-아르기닌; 및/또는
2.4-6.3 μM의 L-트레오닌; 및/또는
4.4-11.2 μM의 L-리신을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이
0.7-2.4 μM의 L-글루타민 및/또는 4.0-12.2 μM의 L-리신을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물이 0.8-2.2 μM의 L-글루타민 및/또는 4.4-11.2 μM의 L-리신을 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
43. 면역원성 조성물, 특히 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물, 바람직하게는 단계 (d)를 포함하는 임의의 상기 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물에 실온에서 2부 (2D)로 구성된 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 가동시키는 경우 0.2-0.4의 피크 B 면적에 대한 피크 A 면적의 비율 및/또는 0.5-0.9의 피크 B 면적에 대한 피크 C 면적의 비율을 나타내며, 상기 2D UPLC가 1부 및 2부 크로마토그래피를 포함하되,
상기 1부 크로마토그래피는 시스템 부피가 400 μL이고,
- 상기 면역원성 조성물을 포함하는 샘플을 바이러스 유사 입자를 결합시키기에 적절한 4차 아민 작용성 물질로 패킹한 0.1 mL의 컬럼 부피를 갖는 음이온 교환 컬럼에 주입하고,
- 처음 0분째에 100% 50 mM Tris (pH 8)에서, 1분째에 97.5% 50 mM Tris (pH 8) 및 2.5% 50 mM Tris, 2M NaCl (pH 8) 및 최종 2분째에 10% 50 mM Tris (pH 8) 및 90% 50 mM Tris, 2M NaCl (pH 8)으로 구성된 다단계 구배법을 음이온 교환 컬럼을 통해 0.6 mL/분의 유속으로 구동시키며,
2.67분의 머무름 시간에 상기 1부 크로마토그래피에서 2부 크로마토그래피로 전환시키고,
상기 2부 크로마토그래피에서는, 상기 1부 크로마토그래피의 50 μL의 용출액을 공극 크기가 450 Å인 1.75 mL의 컬럼 부피를 갖는 크기 배제 컬럼을 통해 0.3 mL/분의 유속으로 구동시키며,
이 때, 330 nm의 파장 및 280 nm의 여기 파장에서 형광 방출을 모니터링함으로써 크로마토그램을 기록하되, 이 경우
피크 A 면적은 상기 크로마토그램에서 0-1분의 머무름 시간에서 가장 높은 피크의 피크 면적이고;
피크 B 면적은 상기 크로마토그램에서 7-8분의 머무름 시간에서 가장 높은 피크의 피크 면적이며;
피크 C 면적은 상기 크로마토그램에서 8.5-9.5분의 머무름 시간에서 가장 높은 피크의 피크 면적인 것인, 면역원성 조성물.
44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 중화제를 실질적으로 함유하지 않고, 바람직하게는 티오황산나트륨을 실질적으로 함유하지 않는 것인, 면역원성 조성물.
45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 또는 약독화된 생박테리아를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
46. 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물의 1회 용량 투여 후, 상기 재조합 단백질의 아미노산 서열이 유래하는 병원체, 바람직하게는 PCV2에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 면역원성 조성물의 1회 용량 투여 후, PRRS 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하는, 면역원성 조성물.
48. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트.
49. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트.
50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 PRRS 바이러스 및 약독화된 생박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 항원을 함유하는 적어도 하나의 추가의 용기를 추가로 포함하는, 키트.
51. 하나 이상의 약독화 또는 불활성화 비-PRRSV 병원체 또는 이의 항원성 물질을 추가로 포함하는, 제34항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및/또는 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 키트.
52. 의약, 바람직하게는 백신으로 사용하기 위한, 제34항 내지 제47항 및 제51항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및/또는 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 키트.
53. 하기의 방법에 사용하기 위한, 제34항 내지 제47항, 제51항 및 제52항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및/또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 키트:
- 동물에 있어서 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/유도하거나
- 동물에 있어서 적어도 하나의 병원체 감염에 대한 하나 이상의 임상 증상을 감소시키는 방법으로서,
상기 적어도 하나의 병원체가 바람직하게는 PCV2, PRRSV, 비-PRRSV 병원체 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
54. 제51항, 특히 제52항 또는 제53항에 따라 사용하기 위한 면역원성 조성물 및/또는 키트로서, 상기 비-PRRSV 병원체가 마이코플라스마 하이오뉴모니아에, 가성광견병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파보바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 에쉐리키아 콜라이, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스, 헤모필루스 파라수이스, 파스퇴렐라 멀토시다, 스트렙토코커스 수이스 및 악티노바실러스 풀루로뉴모니아에로부터 선택되는 것인, 면역원성 조성물 및/또는 키트.
55. 하기의 단계들을 포함하는, 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
(a) - 제1 액체, 및
- 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 복수의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,
(b) 단계 (a)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거하여 상기 혼합물 중의 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 농축시킴으로써 대량 유동 용액을 형성하는 단계, 및
(c) 단계 (b)에서 생성된 용액을 연속 정용여과에 의해 가공처리하여 공정 용액을 형성하는 단계.
56. 제55항에 있어서, 상기 단계 (a)의 혼합물이 추가로
- 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 불활성화제에 의해 불활성화시킨 상기 벡터, 및/또는
- 중화제에 의해 중화시킨 불활성화제, 및/또는
- 중화제를 포함하고/포함하거나,
단계 (c)에서, 단계 (b)에서 생성된 대량 유동 용액을, 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 공정 용액 중에서 감소하도록 연속 정용여과에 의해 가공처리하는 것인, 방법.
57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 방법이 하기의 단계들을 포함하는 것인, 방법:
(a) (i) - 제1 액체,
- 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 복수의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자, 및
- 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
(ii) 단계 (i)의 혼합물에 불활성화제를 첨가하여 상기 벡터를 불활성화시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 생성된 혼합물에 중화제를 첨가하여 불활성화제를 중화시키는 단계;
(b) 단계 (a)(iii)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거하여 상기 혼합물 중의 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 농축시킴으로써 대량 유동 용액을 형성하는 단계, 및
(c) 단계 (b)에서 생성된 대량 유동 용액을 연속 정용여과에 의해 가공처리하여 공정 용액을 형성함으로써, 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 상기 공정 용액 중에서 감소하도록 공정 용액을 형성하는 단계.
58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 혼합물로부터 제1 액체의 일부를 제거하는 작업이 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터로 여과하는 단계로 이루어지거나 또는 이러한 단계를 포함하고, 이 경우 상기 적어도 하나의 필터가 바람직하게는 필터막을 포함하는 것인, 방법.
59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 혼합물이
- 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하여 투과물을 형성하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터는, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 용액 중에서도 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계,
- 상기 투과물이 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 것인, 단계, 및
- 상기 투과물을 배출시키는 단계에 의해 농축되고/되거나,
상기 단계 (c)의 연속 정용여과가
- 상기 단계 (b)의 대량 유동 용액을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하여 투과물을 형성하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터는, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 용액 중에서도 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계,
- 상기 투과물이 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 것인, 단계,
- 상기 투과물을 배출시키는 단계, 및
- 제2 액체를, 상기 투과물이 배출되는 속도와 동일한 속도로 상기 대량 유동 용액에 첨가하는 단계로서, 상기 제2 액체는 상기 제1 액체와는 상이한, 단계를 포함하는 것인, 방법.
60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 적어도 하나의 필터가 적어도 하나의 평판 필터 및/또는 적어도 하나의 중공 섬유 필터이고, 상기 적어도 하나의 평판 필터는 바람직하게 적어도 하나의 카세트 필터이고/이거나,
상기 적어도 하나의 필터가 2-8개의 필터, 바람직하게는 5-7개의 필터이고/이거나,
상기 적어도 하나의 필터 각각이 약 16-26 m2, 바람직하게는 약 20-22 m2의 총 필터 면적을 갖고/갖거나,
상기 필터막의 평균 공극 크기가 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들보다 작고/작거나, 상기 필터막의 분자량 절사값(cut off)이 약 200 kDa 내지 약 500 kDa이고/이거나,
상기 필터막이 폴리에테르설폰, 셀룰로스 수화물, 재생 셀룰로스, 안정화된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스 수화물, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리이미드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어지거나 이를 포함하고/포함하거나,
상기 필터막이 바람직하게는 폴리에테르설폰으로 이루어지거나 이를 포함하거나, 또는 상기 필터막이 임의로, 안정화된 셀룰로스 기반의 막인 것인, 방법.
61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 단계 (b)와 단계 (c)에서 동일한 필터 시스템을 이용하는 것인, 방법.
62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
- 단계 (iii)을 제1 용기에서 수행하되, 이 경우 불활성화제를 중화시켜 생성된 단계 (a)의 혼합물을 제1 용기로부터 필터 시스템과 연결된 제2 용기로 이송하고, 상기 단계 (a)의 혼합물을 제1 용기에서 제2 용기로 이송한 후 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 닫고, 빈 제1 용기를 제2 액체로 채우며,
- 단계 (b)에서, 단계 (a)의 혼합물의 농축이 완료될 때까지 제2 용기와 필터 시스템을 통해 상기 단계 (a)의 혼합물을 순환시킴으로써, 단계 (b)의 대량 유동 용액을 형성시키고;
- 단계 (c)에서, 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 개방하여 제2 액체를 제1 용기로부터 제2 용기로 연속적으로 흘러가도록 유도하는 한편, 상기 대량 유동 용액은 공정 용액이 형성될 때까지 필터 시스템과 제2 용기를 통해 순환시키는 것인, 방법.
63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 액체가 세포 배양 배지의 일부를 포함하거나 세포 배양 배지로 이루어지고, 상기 세포 배양 배지가 바람직하게는 곤충 세포 배양 배지이고/이거나,
단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피가 1000 L 내지 10000 L, 바람직하게는 2000 L 내지 8000 L, 가장 바람직하게는 3000 L 내지 5000 L이고/이거나,
단계 (b)에서, 대량 유동 용액의 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 바이러스 유사 입자들이, 단계 (a)에서 생성된 혼합물 부피 중의 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 바이러스 유사 입자들에 비해서 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 8X, 보다 바람직하게는 9X 내지 11X로 존재할 때까지 상기 단계 (a)의 혼합물을 상기 대량 유동 용액으로 농축시키는 것인, 방법.
64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 액체가 완충 용액, 바람직하게는 P-식염수 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)이고/이거나,
단계 (c)에서 대량 유동 용액에 첨가되는 제2 액체의 총 부피가 단계 (b)에서 생성된 대량 유동 용액 부피의 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 7X, 보다 바람직하게는 적어도 9X이고/이거나, 대량 유동 용액에 첨가되는 제2 액체의 총 부피는 가장 바람직하게는 대략 농축시킨 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 정도가 되는 것인, 방법.
65. 제55항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하기의 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법:
(d) 단계 (c) 이후에 잔류하는 공정 용액을 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 성분과 혼합하여 용액 D를 형성하는 단계로서, 상기 혼합으로 생성된 용액 D 중의 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질의 농도 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들의 농도가 바람직하게는 대략 단계 (a)로부터 생성된 혼합물 중의 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들의 농도 정도가 되는 것인, 단계.
66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질이 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 것인, 방법.
67. 제56항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 재조합 바이러스, 바람직하게는 바큘로바이러스이고/이거나, 상기 핵산 서열이 DNA 서열이고/이거나,
상기 불활성화제가 아지리딘 화합물, 바람직하게는 이원성 에틸렌이민 (BEI)이고/이거나, 상기 불활성화제가 상기 벡터에 대하여 몰 초과량으로 첨가되고/되거나,
상기 중화제가 티오황산나트륨이고/이거나, 상기 중화제가 상기 불활성화제에 대하여 몰 초과량으로 첨가되는 것인, 방법.
68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 D 중의 면역원성 조성물이 바이러스 박멸 활성을 가지며, 상기 방법으로 생성된 면역원성 조성물의 바이러스 박멸 활성이 상기 방법의 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과에 의해 제조되지 않은 면역원성 조성물에 비해 적어도 20% 감소되고/감소되거나, 상기 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물이, 4시간 이상 동안 생바이러스를 상기 면역원성 조성물과 혼합하는 경우, 생바이러스 1 mL당 1 log TCID50 미만, 바람직하게는 생바이러스 1 mL당 0.7 log TCID50 미만의 손실을 야기하는 것인, 방법.
69. 제68항에 있어서, 상기 생바이러스를 실온에서 4시간 이상 동안 상기 면역원성 조성물과 혼합시키는 것인, 방법.
70. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 이후에 잔류하는 공정 용액 및/또는 단계 (d) 이후에 잔류하는 용액 D를 적어도 하나의 추가의 항원과 혼합하는 단계를 추가로 포함하고/하거나,
상기 적어도 하나의 추가의 항원은 바람직하게는 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스인 것인, 방법.
71. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물.
72. 제71항에 있어서,
- 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 재조합 PCV2 ORF2 단백질, 및
- 1-10 μM의 L-아르기닌 및/또는 1-10 μM의 L-리신을 포함하고,
바람직하게는 상기 면역원성 조성물이 중화된 불활성화제를 실질적으로 함유하지 않고/않거나 중화제를 실질적으로 함유하지 않는 것인, 면역원성 조성물.
73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 또는 약독화된 생박테리아를 추가로 포함하고/하거나,
상기 면역원성 조성물의 1회 용량 투여 후, PCV2에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/하거나,
상기 면역원성 조성물의 1회 용량 투여 후, PRRS 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 것인, 면역원성 조성물.
74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트로서, 상기 키트가 바람직하게는
약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 PRRS 바이러스 및 약독화된 생박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 항원을 함유하는 적어도 하나의 추가의 용기를 포함하는, 키트.
75. 의약, 바람직하게는 백신으로 사용하기 위한, 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및/또는 제74항에 따른 키트.
76. 하기의 방법에 사용하기 위한, 제71항 내지 제73항 및 제75항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및/또는 제74항 또는 제75항에 따른 키트:
- 동물에 있어서 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/유도하거나
- 동물에 있어서 적어도 하나의 병원체 감염에 대한 하나 이상의 임상 증상을 감소시키는 방법으로서,
상기 적어도 하나의 병원체가 바람직하게는 PCV2, PRRSV, 비-PRRSV 병원체 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
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Claims (21)

  1. 하기의 단계들을 포함하는, 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법:
    (a) - 제1 액체, 및
    - 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 복수의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계,
    (b) 단계 (a)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거함으로써, 상기 혼합물 중의 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 농축시키는 단계, 및
    (c) 연속 정용여과 (diafiltration)에 의해 단계 (b)에서 생성된 용액을 가공처리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 혼합물이 추가로
    - 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서, 불활성화제에 의해 불활성화시킨 상기 벡터, 및/또는
    - 중화제에 의해 중화시킨 불활성화제, 및/또는
    - 중화제를 포함하고/포함하거나,
    단계 (c)에서, 단계 (b)에서 생성된 용액을, 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 공정 용액 중에서 감소하도록 연속 정용여과에 의해 가공처리하는 것인, 방법.
  3. 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법, 특히 제2항의 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계들을 포함하는 것인, 방법:
    (a) (i) - 제1 액체,
    - 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 복수의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자, 및
    - 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;
    (ii) 단계 (i)의 혼합물에 불활성화제를 첨가하여 상기 벡터를 불활성화시키는 단계;
    (iii) 단계 (ii)에서 생성된 혼합물에 중화제를 첨가하여 상기 불활성화제를 중화시키는 단계;
    (b) 단계 (a)(iii)에서 생성된 혼합물로부터 상기 제1 액체의 일부를 제거함으로써, 상기 혼합물 중의 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 농축시키는 단계, 및
    (c) 단계 (b)에서 생성된 용액을, 상기 중화된 불활성화제의 농도 및/또는 상기 중화제의 농도가 공정 용액 중에서 감소하도록 연속 정용여과에 의해 가공처리하는 단계.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 혼합물로부터 제1 액체의 일부를 제거하는 작업이, 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터로 여과하는 단계로 이루어지거나 또는 이러한 단계를 포함하고, 이 경우 상기 적어도 하나의 필터가 바람직하게는 필터막을 포함하는 것인, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 농축이
    - 상기 혼합물을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터가, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 중에서도 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계,
    - 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 투과물을 배출시키는 단계를 포함하고/하거나,
    단계 (c)에서 상기 연속 정용여과가
    - 상기 용액을 적어도 하나의 필터를 포함하는 필터 시스템으로 공급하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 필터가, 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제가 대량 유동 중에서도 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들을 유지하면서 통과할 수 있게 해주는 막 공극 크기를 갖는 필터막을 포함하는 것인, 단계,
    - 상기 중화된 불활성화제 및/또는 중화제를 포함하는 투과물을 배출시키는 단계,
    - 상기 대량 유동에 상기 제1 액체와는 상이한 제2 액체를 투과물 유동과 동일한 속도로 첨가하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 적어도 하나의 필터가 적어도 하나의 평판 필터 및/또는 적어도 하나의 중공 섬유 필터이고, 상기 적어도 하나의 평판 필터는 바람직하게 적어도 하나의 카세트 필터이고/이거나,
    상기 적어도 하나의 필터가 2-8개의 필터, 바람직하게는 5-7개의 필터이고/이거나,
    상기 적어도 하나의 필터 각각이 약 16-26 m2, 바람직하게는 약 20-22 m2의 총 필터 면적을 갖고/갖거나,
    상기 필터막의 평균 공극 크기가 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들보다 작고/작거나, 상기 필터막의 분자량 절사값(cut off)이 약 200 kDa 내지 약 500 kDa이고/이거나,
    상기 필터막이 폴리에테르설폰, 셀룰로스 수화물, 재생 셀룰로스, 안정화된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스, 가교결합된 셀룰로스 수화물, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리프로필렌, 폴리설폰, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리이미드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어지거나 이를 포함하고/포함하거나,
    상기 필터막이 바람직하게는 폴리에테르설폰으로 이루어지거나 이를 포함하거나, 또는 상기 필터막이 임의로, 안정화된 셀룰로스 기반의 막인 것인, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 단계 (b) 및 단계 (c)에서 동일한 필터 시스템이 사용되는 것인, 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 단계 (iii)을 제1 용기에서 수행하되, 이 경우 불활성화제를 중화시켜 생성된 혼합물을 제1 용기로부터 필터 시스템과 연결된 제2 용기로 이송하고, 상기 혼합물을 제1 용기에서 제2 용기로 이송한 후, 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 닫고, 빈 제1 용기를 제2 액체로 채우며,
    - 단계 (b)에서 농축이 완료될 때까지 상기 혼합물을 제2 용기와 필터 시스템을 통해 순환시키고,
    - 단계 (c)에서 제1 용기와 제2 용기 사이의 밸브를 개방하여 제2 액체를 제1 용기로부터 제2 용기로 연속적으로 흘러가도록 유도하는 한편, 상기 혼합물을 필터 시스템과 제2 용기를 통해 순환시키는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 액체가 세포 배양 배지의 일부를 포함하거나 세포 배양 배지로 이루어지고, 상기 세포 배양 배지가 바람직하게는 곤충 세포 배양 배지이고/이거나,
    단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피가 1000 L 내지 10000 L, 바람직하게는 2000 L 내지 8000 L, 가장 바람직하게는 3000 L 내지 5000 L이고/이거나,
    단계 (b)에서 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들이, 단계 (a)에서 생성된 혼합물 부피에 비해서 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 8X, 보다 바람직하게는 9X 내지 11X로 최종 농축되는 것인, 방법.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 액체가 완충 용액, 바람직하게는 P-식염수 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)이고/이거나,
    단계 (c)에서 대량 유동에 첨가되는 제2 액체의 총 부피가, 단계 (b)에서 생성된 용액 부피의 적어도 5X, 바람직하게는 적어도 7X, 보다 바람직하게는 적어도 9X이고/이거나, 대량 유동에 첨가되는 제2 액체의 총 부피는 가장 바람직하게는 대략 단계 (a)에서 생성된 혼합물의 부피 정도가 되는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 하기의 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법:
    (d) 단계 (c) 이후에 잔류하는 혼합물을, 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가의 성분과 혼합하는 단계로서, 상기 혼합으로 생성된 용액 중의 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질의 농도 및/또는 상기 바이러스 유사 입자 구조물의 농도가 바람직하게는 대략 단계 (a)로부터 생성된 혼합물 중의 재조합 PCV2 ORF2 단백질 및/또는 상기 바이러스 유사 입자들의 농도 정도가 되는 것인, 단계.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 PCV2 ORF2 단백질이 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 것인, 방법.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 재조합 바이러스, 바람직하게는 바큘로바이러스이고/이거나, 상기 핵산 서열이 DNA 서열이고/이거나, 상기 불활성화제가 아지리딘 화합물, 바람직하게는 이원성 에틸렌이민 (BEI)이고/이거나, 상기 불활성화제가 상기 벡터에 대하여 몰 초과량으로 첨가되고/되거나,
    상기 중화제가 티오황산나트륨이고/이거나, 상기 중화제가 상기 불활성화제에 대하여 몰 초과량으로 첨가되는 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법으로 생성된 면역원성 조성물의 바이러스 박멸 활성이, 상기 방법의 단계 (b)의 농축 및 단계 (c)의 연속 정용여과를 거치지 않은 면역원성 조성물 혼합물에 비해 적어도 20% 감소되고/감소되거나, 상기 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물은, 특히 실온에서, 4시간 이상 동안 생바이러스를 상기 면역원성 조성물과 혼합하는 경우, 생바이러스 1 mL당 1 log TCID50 미만, 바람직하게는 생바이러스 1 mL당 0.7 log TCID50 미만의 손실을 야기하는 것인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 이후에 잔류하는 혼합물을 적어도 하나의 추가의 항원과 혼합하는 단계를 추가로 포함하고/하거나,
    상기 적어도 하나의 추가의 항원은 바람직하게는 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스인 것인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 면역원성 조성물.
  17. 면역원성 조성물, 특히 제16항의 면역원성 조성물로서,
    - 바람직하게는 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.5% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어지는 재조합 PCV2 ORF2 단백질, 및
    - 1-10 μM의 L-아르기닌 및/또는 1-10 μM의 L-리신을 포함하고,
    바람직하게는 상기 면역원성 조성물이 중화된 불활성화제를 실질적으로 함유하지 않고/않거나 중화제를 실질적으로 함유하지 않는 것인, 면역원성 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 돼지 생식기 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 또는 약독화된 생박테리아를 추가로 포함하고/하거나,
    상기 면역원성 조성물의 1회 용량 투여 후, PCV2에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/하거나,
    상기 면역원성 조성물의 1회 용량 투여 후, PRRS 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 것인, 면역원성 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 키트로서, 상기 키트가 바람직하게는
    약독화된 생바이러스, 바람직하게는 약독화된 PRRS 바이러스, 및 약독화된 생박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 항원을 함유하는 적어도 하나의 추가의 용기를 포함하는 것인, 키트.
  20. 의약, 바람직하게는 백신으로 사용하기 위한, 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및/또는 제19항에 따른 키트.
  21. 하기의 방법에 사용하기 위한, 제16항 내지 제18항 및 제20항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물 및/또는 제19항 또는 제20항에 따른 키트:
    - 동물에 있어서 적어도 하나의 병원체에 대한 보호 면역 반응을 유도하고/유도하거나
    - 동물에 있어서 적어도 하나의 병원체 감염에 대한 하나 이상의 임상 증상을 감소시키는 방법으로서,
    상기 적어도 하나의 병원체가 바람직하게는 PCV2, PRRSV, 비-PRRSV 병원체 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
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