TW202003027A

TW202003027A - 製造免疫原組合物之方法

Info

Publication number: TW202003027A
Application number: TW108110346A
Authority: TW
Inventors: 利威爾密斯; 馬修庫恩斯; 亞曼達布朗; 麥可喬漢斯蓋賽爾; 法蘭克斯賽維爾歐斐隆; 凱瑟琳娜黑德維格托特佛; 伊利達巴提斯塔; 凱西史列西恩格
Original assignee: 美商百靈佳殷格翰動物保健美國有限公司
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2020-01-16
Also published as: CN112088013A; JP7162072B2; CA3091982A1; WO2019191005A1; JP2021517580A; MX2020010018A; JP2022169505A; US20220409715A1; EP3672629A1; EA202092216A1; AU2019242601A1; KR20200135505A

Abstract

本發明特別關於製造展現降低之殺病毒活性之免疫原組合物的方法，以及該免疫原組合物，及其用途，其中該方法特別包含以下步驟：(a) 提供具有第一液體及重組蛋白之混合物，(b) 藉由自該混合物去除一部分該第一液體而濃縮該混合物中之重組蛋白，及(c) 藉由連續滲濾處理步驟(b)產生之溶液。

Description

製造免疫原組合物之方法

本發明係關於製造免疫原組合物之方法以及展現降低之殺病毒活性之該等免疫原組合物。

2型豬環狀病毒(PCV2)係小的(直徑17-22 nm)、二十面體、無包膜DNA病毒，其含有單鏈環狀基因體。PCV2與1型豬環狀病毒(PCV1)共享約80%序列一致性。然而，與通常無毒力之PCV1相反，經PCV2感染之豬展現一種通常稱為斷乳後全身多系統性消耗性症候群(PMWS)的症狀群。PMWS之臨床特徵在於消瘦、皮膚蒼白、不健康、呼吸窘迫、腹瀉、黃疸(icterus，jaundice)。在一些受影響之豬中，所有症狀之組合將係明顯的，而其他豬僅會具有一個或兩個該等症狀。在驗屍期間，微觀及宏觀之病灶亦出現在多個組織及器官上，其中淋巴器官係病灶之最常見位點。已觀察到PCV2核酸或抗原之量與微觀淋巴病灶之嚴重程度之間存在强烈之相關性。經PCV2感染之豬之死亡率可接近80%。除了PMWS外，PCV2亦與其他若干感染相關，包括僞狂犬病、豬生殖及呼吸症候群(PRRS)、格拉氏病(Glasser’s disease)、鏈球菌腦膜炎、沙門氏菌病、斷乳後大腸桿菌病、飲食性肝功能病及化膿性支氣管肺炎。

有若干疫苗可用於降低豬中PCV2感染之影響。美國專利第6,703,023號提供用於預防豬抵抗PMWS之基於DNA之疫苗。在WO 03/049703中，闡述活的嵌合疫苗之製造，該疫苗包含非病原體PCV1病毒，其中，然而，ORF2蛋白由病原體PCV2之ORF2蛋白替代。WO 99/18214及WO 99/29717已提供若干PCV2菌株及製備殺死之PVC2疫苗之方法。亞單位疫苗之製備亦闡述於WO 99/18214及WO 99/29717中。WO 06/072065中報導有效的基於ORF2之亞單位疫苗。另一基於ORF2之亞單位疫苗亦闡述於WO 07/28823中。

具有約30 kDa之分子量的PCV2之開放閱讀框2 (ORF2)蛋白，當在SDS-PAGE凝膠上運行時，過去曾用作PCV2之疫苗及免疫原組合物之抗原性組分。獲得用於該等疫苗及組合物之ORF2之典型方法通常由以下組成：擴增編碼ORF2之PCV2 DNA、在宿主細胞內表現ORF2蛋白及經由細胞裂解自宿主細胞提取ORF2蛋白。然後將回收之ORF2細胞裂解物用作免疫原組合物或疫苗之抗原性部分。在一些情形下，含有ORF2之細胞裂解物與細胞碎片分離。

針對PCV2之免疫原組合物及針對其他病原體之各種免疫原組合物通常對其他抗原具有殺病毒效應。例如，美國目前之監管標準(9 CFR 113.35)允許多價組合物中之一些殺病毒活性，但當與免疫原組合物之其他組分組合時，此殺病毒活性不可導致超過0.7 log/mL活病毒或小於0.7 log/mL CFU之活細菌的損失。具有比允許更大之殺病毒活性之組合物不能與其他抗原組合以產生多價疫苗。

為此，WO 11/28888提供降低包含PCV2抗原之組合物之殺病毒活性的方法以及包含PCV2抗原之抗原性製劑及免疫原組合物，其中殺病毒活性降低。更具體地，WO 11/28888教示大規模製造該PCV2抗原性組合物之方法，其中該方法包含以下步驟： i)獲得其中含有包含ORF2蛋白之類病毒顆粒的PCV2抗原之第一液體；及 ii)藉由利用過濾器之過濾步驟自包含ORF2蛋白之類病毒顆粒之PCV2抗原去除第一液體之至少一部分，其中該過濾器包括平均孔徑小於PCV-2抗原的半透膜，從而防止至少90%之PCV2抗原通過半透膜孔並將PCV2抗原保持在過濾器內，其中藉由交換第一液體與第二液體之部分自PCV2抗原去除第一液體之部分，其中第二液體與第一液體不同，且其中第一液體與第二液體之部分之交換包含以下步驟： a)液體添加，包含將第二液體添加至含有PCV-2抗原之第一液體中；及 b)藉由去除第一及第二液體之一部分，將PCV-2抗原濃縮至第一液體之體積的3X至50X。

然而，該液體添加步驟a)，包含將第二液體較佳以過量之體積添加至第一液體中，可能導致關於總製造規模之體積之限制，此乃因與第一液體之體積相比，在濃縮步驟b)之前，第一及第二液體之所得體積通常增加多倍。

因此，期望其他方法來製造包含重組蛋白之免疫原組合物，其以仍較大規模且甚至以極大規模具有降低之殺病毒效應。

藉由申請專利範圍中表徵之說明及實施例實現對上述技術問題之解決方案。

因此，本發明在其不同態樣中係根據申請專利範圍來實現。

本發明係基於以下令人驚訝之發現：製造包含重組蛋白之免疫原組合物之方法足以達到期望目的，其中該方法較佳以下順序由以下步驟組成或包含以下步驟： (a) 提供含有以下之混合物： - 第一液體，及 - 重組蛋白及/或包含複數個該重組蛋白之四級結構， (b) 藉由自混合物去除第一液體之一部分濃縮自步驟(a)產生之混合物中之重組蛋白及/或該等四級結構，及 (c) 藉由連續滲濾、特別地藉由以第二液體連續滲濾處理自步驟(b)產生之溶液，其中第二液體不同於第一液體。

應理解，如本文所用術語「第一液體」相當於分別術語「初始液體」或「液體(1)」。因此，術語「第一液體」與術語「液體(1)」或術語「初始液體」可互換。

進一步應理解，如本文所用術語「第二液體」相當於分別術語「又一液體」或「液體(2)」。因此，術語「第二液體」與術語「液體(2)」或術語「又一液體」可互換。

在一個較佳態樣中，步驟(a)之混合物另外含有包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體，其中該載體已由不活化劑不活化。根據另一較佳態樣，步驟(a)之混合物另外含有不活化劑，其由中和劑中和。

在又一較佳態樣中，步驟(a)之混合物另外含有中和劑。

如本文所提及，特別地應理解，術語「步驟(a)之混合物」與「步驟(a)中提供之混合物」同義。如本文所用術語「步驟中提供之」特別地應理解為相當於「由步驟提供之」。

本發明進一步係關於如本文中闡述及/或主張之方法，其中上文文獻之步驟(a)之混合物另外含有 - 包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體，其中該載體已由不活化劑不活化，及/或 - 不活化劑，其由中和劑中和，及/或 - 中和劑，且其中較佳地，步驟(a)之混合物另外含有該載體、該經中和之不活化劑及中和劑。

此外，在步驟(c)中，較佳藉由連續滲濾處理自步驟(b)產生之溶液，使得製程溶液中經中和之不活化劑之濃度及/或中和劑之濃度降低。

在闡述本發明之態樣之前，必須注意，如本文中且如在所附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，「抗原」之提及包括複數個抗原，「病毒」之提及係提及熟習此項技術者已知之一或多種病毒及其等效物，等等。除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之含義。儘管任何類似或等效於彼等本文所述者之方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但目前所述者係較佳之方法、裝置及材料。出於闡述及揭示如結合本發明使用之出版物中所報導之細胞系、載體及方法之目的，本文所提及之所有出版物以引用方式併入本文中。本文中沒有什麽內容應解釋為承認本發明沒有資格早於根據先前發明之此類揭示內容。

在一態樣中，本發明係關於製造包含重組蛋白之免疫原組合物的方法，其中該方法較佳以下順序由以下步驟組成或包含以下步驟： (a)(i) 提供含有以下之混合物： - 第一液體， - 重組蛋白及/或包含複數個該重組蛋白之四級結構，及 - 包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體； (ii) 藉由向步驟(i)之混合物中添加不活化劑不活化載體； (iii) 藉由向自步驟(ii)產生之混合物中添加中和劑中和不活化劑； (b) 藉由自由步驟(a)(iii)產生之混合物去除第一液體之一部分濃縮該混合物中之重組蛋白及/或該等四級結構， (c) 藉由連續滲濾處理自步驟(b)產生之溶液，使得製程溶液中經中和之不活化劑之濃度及/或中和劑之濃度降低。

特別地，步驟(c)之連續滲濾係以第二液體之連續滲濾，其中第二液體不同於第一液體。

在本發明之上下文中，特別地應理解，「(i)」、「(ii)」及「(iii)」分別表示步驟(a)之子步驟，步驟(a)由子步驟「(i)」、「(ii)」及「(iii)」組成或包含該等子步驟，且因此，「(i)」相當於「(a)(i)」，「(ii)」相當於「(a)(ii)」，且「(iii)」相當於「(a)(iii)」。

如本文所提及，特別地應理解，術語「步驟(i)之混合物」及「步驟(a)(i)之混合物」分別與分別「步驟(i)中提供之混合物」及「步驟(a)(i)中提供之混合物」同義。

出於本發明之目的，「第一液體」係指通常與細胞、抗原、免疫原組合物、疫苗及諸如此類組合使用之液體、水性或流體介質。較佳地，第一液體包含來自抗原組合物之介質；更佳地，第一液體包含用於在培養之宿主細胞中製造重組蛋白之細胞培養基或較佳由其組成。該等培養之宿主細胞可為細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞及哺乳動物細胞，其中昆蟲及哺乳動物細胞尤佳。因此，第一液體可包含用於培養細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或哺乳動物細胞之培養基或由其組成。較佳地，當使用昆蟲細胞時，細胞培養基係無血清細胞培養基，且最佳地，培養基係Excell 420無血清培養基。

在另一態樣中，本發明因此係關於如本文中闡述及主張之方法，其中該第一液體包含細胞培養基之部分或由細胞培養基組成，且其中細胞培養基較佳係昆蟲細胞培養基。

出於本發明之目的，「部分」係指任何不包括整個量之量。舉例而言，液體之一部分可為小於液體體積之100%、例如液體之90%、液體之80%、液體之70%的任何事物以及介於超過0%且小於100%之間之所有量。

如本文所用術語「重組蛋白」特別地係指藉由重組DNA技術製造之蛋白質，其中通常將編碼表現蛋白質之DNA插入適宜表現載體中，該載體進而用於轉變或在病毒載體之情形下感染宿主細胞以製造異源蛋白。因此，如本文所用術語「重組蛋白」特別係指自重組DNA分子表現之蛋白質分子。如本文所用「重組DNA分子」係指包括藉助分子生物學技術接合在一起之DNA片段的DNA分子。適用於製造重組蛋白之系統包括(但不限於)昆蟲細胞(例如桿狀病毒)、原核系統(例如大腸桿菌)、酵母(例如釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae )、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris ))、哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢，HEK293)、植物(例如紅花)、禽類細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞及無細胞系統(例如兔網狀紅血球裂解物)。

在本發明之上下文中，重組蛋白較佳係重組PCV2 ORF2蛋白。

如在本發明之上下文中所使用之術語「四級結構」特別地係關於多亞單位複合物中多個折疊蛋白質分子之組裝，且特別地係關於類病毒顆粒。

出於本發明之目的，「包含複數個該重組蛋白之四級結構」係指複數個該重組蛋白之三維布置，例如包含複數個該重組蛋白之類病毒顆粒。就此而言，特別地應理解，術語「複數個該重組蛋白」相當於「複數個重組蛋白」。特別應理解，該術語意指包含特定重組蛋白(例如，重組PCV2 ORF2蛋白)之若干分子之類病毒顆粒。「不活化載體」在本發明之上下文中特別地意指使得通常能够複製之載體不能複製。「不活化」特別地係指不活化載體之過程。

出於本發明之目的，「不活化劑」係指可用於任何習用不活化方法中之任何試劑。不活化可藉由熟習此項技術者已知之化學及/或物理處理來實施。較佳不活化劑包括環化二乙烯亞胺(BEI)，其包括2-溴乙烯胺氫溴酸鹽(BEA) (其環化成二乙烯亞胺(BEI))之溶液。較佳其他化學不活化劑包括(但不限於) Triton X-100、去氧膽酸鈉、鯨蠟基三甲基溴化銨、β-丙內酯、硫柳汞、酚及甲醛(福馬林(Formalin))。

較佳地，不活化劑係氮丙啶化合物，特別地二乙烯亞胺(BEI)，及/或不活化劑相對於載體以莫耳過量添加，且特別地相對於與BEI反應之載體DNA鹼基對之含氮鹼基以莫耳過量添加。

出於本發明之目的，「中和劑」係指任何能够中和如本文所述之不活化劑使得不活化劑不再能够使載體不活化的試劑。若使用氮丙啶化合物進行不活化，則較佳地，使用打開3員環之親核劑進行中和。中和不活化劑之試劑較佳係硫代硫酸鈉、亞硫酸氫鈉及諸如此類。

特別地較佳地，中和劑係硫代硫酸鈉及/或中和劑相對於不活化劑以莫耳過量添加。

如本文所用之「經中和之不活化劑」特別地係關於自不活化劑與中和劑之化學反應產生之一或多種產物，例如BEI與硫代硫酸鹽或其他親核劑之化學反應之產物。

可使用任何習用化學不活化方法來不活化載體。在較佳形式中，對於化學處理，使溫度介於約32℃ - 42℃、更佳介於約34℃ - 40℃、且最佳介於約35℃ - 39℃。較佳不活化方法包括添加環化二乙烯亞胺(BEI)，較佳濃度為約1至約20 mM、較佳約2至約10 mM、仍更佳約2至約8 mM、仍更佳約3至約7 mM、最佳約5 mM。舉例而言，不活化包括向流體中添加較佳約0.4 M之2-溴乙烯胺氫溴酸鹽(BEA)溶液(其在0.3 N NaOH中環化成0.2 M二乙烯亞胺(BEI))，以產生約5mM BEI之最終濃度。較佳地，然後將流體連續攪拌2 - 96小時。不活化完成後，添加較佳1.0 M之硫代硫酸鈉溶液以中和任何殘餘BEI，且可將不活化/中和之收穫流體冷凍儲存於-40℃或更低溫度或介於約1℃ - 7℃下。較佳地，與在用於不活化之前添加之BEI相比，添加等效量之硫代硫酸鈉。舉例而言，倘若添加BEI至5 mM之最終濃度，則添加1.0 M硫代硫酸鈉溶液以產生5 mM之最終最小濃度以中和任何殘餘BEI。

因此，在步驟(iii)中，與步驟(ii)中添加之不活化劑之量相比，較佳添加等效量之中和劑。在範圍之上下文內，如本文所述，特別地應理解，「y - z」相當於「y-z」，且二者分別皆相當於「y至z」，使得例如「0.1 - 1.0」相當於「0.1-1.0」。

出於本發明之目的，「載體」以及「包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體」係指適宜表現載體、較佳桿狀病毒表現載體，其進而用於轉染或在桿狀病毒表現載體之情形下感染宿主細胞以產生由DNA編碼之蛋白質或多肽。載體及用於製造及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法尤其可藉由以下中所揭示之方法或類似於以下中所揭示之方法進行或完成：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」, PNAS USA 93: 11349-11353，1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety」, PNAS USA 93: 11341-11348，1996年10月；Smith等人，美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編輯), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press Inc.)；Smith等人，「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology, 1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165頁；Pennock等人，「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology，1984年3月，第4卷，第3期，第406頁；EPA0 370 573；於1986年10月16日提出申請之美國申請案第920,197號；EP專利公開案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors」, PNAS USA 93:11307-11312, 1996年10月；Andreansky等人，「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors」, PNAS USA 93: 11313-11318, 1996年10月；Robertson等人，「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340, 1996年10月；Frolov等人，「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications」, PNAS USA 93: 11371-11377, 1996年10月；Kitson等人，J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；核準美國申請案系列第08/675,556號及第08/675,566號，二者皆於1996年7月3日提出申請(重組腺病毒)；Grunhaus等人，1992, 「Adenovirus as cloning vectors」, Seminars in Virology (第3卷)第237-52頁, 1993；Ballay等人 EMBO Journal, 第4卷，第3861-65頁, Graham, Tibtech 8, 85-87, 1990年4月；Prevec等人，J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人 (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；及McClements等人，「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420, 1996年10月及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號及第5,580,859號，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature，及Furth等人，Analytical Biochemistry，其係關於DNA表現載體。亦參見WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人，美國專利第4,945,050號；Fischbach等人 (Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology，第9卷，第 271-283頁(1997)，(DNA載體系統)；Szoka等人，美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞中之方法)；McCormick等人，美國專利第5,677,178號(細胞病變病毒之用途)；及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文中引用之其他文件。

較佳病毒載體包括桿狀病毒，BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)，特別地在生產細胞係昆蟲細胞之情況下。儘管桿狀病毒表現系統係較佳的，但熟習此項技術者應理解，其他表現系統(包括上述之彼等)將出於本發明之目的、即重組蛋白之表現而工作。

因此，在本發明之上下文中，「載體」較佳係重組載體、較佳桿狀病毒，及/或「核酸序列」較佳係DNA序列。

較佳地，在如本文中闡述及主張之方法之步驟(b)中，自該混合物去除第一液體之一部分包括或包含用至少一個過濾器過濾該混合物，其中該至少一個過濾器較佳包含濾膜。

根據另一較佳態樣，在步驟(b)中，該濃縮包含 - 將混合物進料至包含至少一個過濾器之過濾器系統中，其中至少一個過濾器包含濾膜，該濾膜具有允許經中和之不活化劑及/或中和劑穿過、同時保留總體流中之重組蛋白及/或該等四級結構的膜孔徑，及 - 排出包含經中和之不活化劑及/或中和劑之滲透物。

根據又一較佳態樣，在步驟(c)中，該連續滲濾包含 - 將溶液進料至包含至少一個過濾器之過濾器系統中，其中至少一個過濾器包含濾膜，該濾膜具有允許經中和之不活化劑及/或中和劑穿過、同時保留總體流中之重組蛋白及/或該等四級結構的膜孔徑，及 - 排出包含經中和之不活化劑及/或中和劑之滲透物，及 - 以等於滲透物流之速率向總體流添加第二液體，其中第二液體不同於第一液體。

出於本發明之目的，「第二液體」係指通常與細胞、抗原、免疫原組合物、疫苗及諸如此類組合使用之任何液體，其不同於第一液體。較佳地，第二液體係水溶液、甚至更佳醫藥上可接受之溶液、且甚至更佳緩衝液、最佳生理上可接受之緩衝液，例如鹽水或磷酸鹽緩衝液及諸如此類，例如P-鹽水或PBS。最佳地，當活病毒或活細菌在該液體中培養或儲存時，第二液體之特徵在於對任何活病毒或活細菌不殺病毒。

較佳地，本文所述之至少一個過濾器係至少一個平板過濾器及/或至少一個中空纖維過濾器，其中該至少一個過濾器最佳係至少一個平板過濾器。至少一個平板過濾器較佳係至少一個卡匣式過濾器。

特別地，至少一個過濾器係2-8個過濾器、較佳5-7個過濾器、且最佳6個過濾器，及/或至少一個過濾器中之每一者特別地具有約16-26 m² 、較佳約20-22 m² 、最佳約21 m² 之總過濾面積。

如本文所述之濾膜較佳具有比重組蛋白小及/或比該等四級結構小之平均孔徑，及/或濾膜較佳具有介於約200 kDa與約500 kDa之間、特別地約300 kDa之分子量截止值。

較佳地，濾膜由選自由以下組成之群之材料組成或包含該材料：聚醚碸、纖維素水合物、再生纖維素、穩定纖維素、交聯纖維素、交聯纖維素水合物、乙酸纖維素、聚醯胺、聚胺基甲酸酯、聚丙烯、聚碸、聚碳酸酯、耐綸、聚醯亞胺、及其組合，及/或濾膜較佳由聚醚碸組成或包含聚醚碸，或濾膜視情況係基於穩定纖維素之膜。

根據本發明之另一較佳態樣，在步驟(b)中及在步驟(c)中，利用相同過濾器系統。因此，根據此較佳態樣，使用僅一個過濾器系統進行步驟(b)之濃縮及步驟(c)之連續滲濾。

較佳地，步驟(c)後保留之混合物包含濃度小於自步驟(iii)產生之中和劑之濃度之一千倍的不活化劑。

此外，在本發明之上下文中，已發現，尤佳地， - 步驟(iii)係在第一容器中實施，且其中由中和不活化劑產生之混合物自第一容器轉移至與過濾器系統連接之第二容器，且其中混合物自第一容器轉移至第二容器後，關閉第一容器與第二容器之間之閥，且向空的第一容器充滿第二液體， - 在步驟(b)中，使混合物循環穿過第二容器及過濾器系統，直至濃縮完成，且 - 在步驟(c)中，打開第一容器與第二容器之間之閥，且將第二液體自第一容器連續地引導至第二容器，同時混合物循環穿過過濾器系統及第二容器。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中自步驟(a)產生之混合物的體積係1000 L至10000 L、較佳2000 L至8000 L、且最佳3000 L至5000 L。

如本文所提及，應理解，「自步驟(a)產生之混合物的體積」特別地相當於「在該濃縮之前步驟(b)中之混合物之初始體積」。在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中在步驟(b)中，與自步驟(a)產生之混合物之體積相比，該重組蛋白及/或該等四級結構最終濃縮至少5X、較佳至少8X、更佳9X至11X、且最佳約10X。

可實施本文提供之方法之濃縮步驟(b)，使得與自步驟(a)產生之混合物之體積或自步驟(iii)產生之混合物之體積相比，重組蛋白或該等四級結構分別濃縮3X至50X。更佳地，可進行該濃縮步驟，使得與自步驟(a)產生之混合物之體積或自步驟(iii)產生之混合物之體積相比，重組蛋白或該等四級結構分別濃縮至少5X、例如5X至20X。仍更佳地，可進行該濃縮步驟，使得與自步驟(a)產生之混合物之體積或自步驟(iii)產生之混合物之體積相比，重組蛋白或該等四級結構分別濃縮至少8X、例如8X至14X。最佳地，進行該濃縮步驟，使得與自步驟(a)產生之混合物之體積或自步驟(iii)產生之混合物之體積相比，重組蛋白或該等四級結構分別濃縮至少10X、例如10X至12X。

較佳地，在步驟(c)中，添加至總體流中之第二液體的總體積係自步驟(b)產生之溶液之體積的至少5X、較佳至少7X、更佳至少9X、且最佳至少10X，及/或添加至總體流中之第二液體的總體積最佳係大約自步驟(a)產生之混合物之體積。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中該方法進一步包含以下步驟： (d) 混合步驟(c)後保留之混合物與選自由醫藥上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群之又一組分，且其中自該混合產生之溶液中重組蛋白之濃度及/或該等四級結構之濃度較佳係大約自步驟(a)產生之混合物中重組蛋白及/或該等四級結構之濃度或低於自步驟(a)產生之混合物中重組蛋白及/或該等四級結構之濃度(例如0.2X-0.5X)。如本文所提及，應理解，「自步驟(a)產生之混合物中的重組蛋白及/或該等四級結構之濃度」特別地相當於「該濃縮之前步驟(b)中之混合物中重組蛋白及/或該等四級結構的初始濃度」。

如本文所用「醫藥上可接受之載劑」包括任何及全部溶劑、分散介質、包衣劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑及諸如此類。

如本文所用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁；皂苷，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL)；油包水乳液；水包油乳液；水包油包水乳液。乳液可特別地基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典類型(European Pharmacopea type))；類異戊二烯油，例如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(特別地異丁烯或癸烯)寡聚產生之油；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，更特別地植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；具支鏈脂肪酸或醇之酯，特別地異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳係非離子型表面活性劑，特別地為山梨醇酐、二縮甘露醇(例如無水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇與油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之視情況經乙氧基化之酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特別地Pluronic產品，尤其L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (編輯Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, 第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15:564-570 (1997)。舉例而言，可使用M. Powell及M. Newman編輯之「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」, Plenum Press, 1995之第147頁上闡述之SPT乳液以及該同一本書第183頁上闡述之乳液MF59。其他適宜佐劑尤其包括(但不限於) RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(重組的或其他性質的)之不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，包括共聚物EMA (Monsanto)，其為馬來酸酐與乙烯之共聚物。將該等聚合物溶解於水中會產生酸性溶液，較佳將其中和至生理pH以得到佐劑溶液，將免疫原性、免疫或疫苗組合物本身納入該佐劑溶液中。

佐劑之又一實例係選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。較佳之佐劑化合物係丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，其尤其與糖類或多元醇之聚烯基醚交聯。此等化合物由術語卡波姆(carbomer)已知(Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其闡述與聚羥基化化合物交聯之該等丙烯酸系聚合物，該聚羥基化化合物具有至少3個(較佳不超過8個)羥基，至少3個羥基之氫原子由具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團置換。較佳基團係含有2個至4個碳原子之彼等，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團自身可含有諸如甲基等其他取代基。以名稱Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA)出售之產品尤其適合。其與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其中可提及者係Carbopol 974P、934P及971P。最佳使用Cabopol 971P。

「稀釋劑」可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及諸如此類。

「等滲劑」可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。

「穩定劑」尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。

如本文所用之「防腐劑」係指抗微生物活性劑，例如慶大黴素(Gentamycin)、硫柳汞及諸如此類。特別地，添加防腐劑對於多劑量組合物之製備係最佳的。彼等抗微生物活性劑係以可有效地防止關注之組合物之任何微生物污染或抑制關注之組合物內之任何微生物生長。

較佳地，在步驟(d)中，該又一組分係佐劑、水及氯化鈉之組合，特別地佐劑溶液及P-鹽水之組合，其中該佐劑較佳係丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且仍更佳卡波姆。

本文提及之術語「P-鹽水」特別地係關於由溶解於水中之0.8-0.9% (w/v) NaCl (例如0.85% (w/v) NaCl)構成且pH調節至6.8-7.0的緩衝溶液。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中用於步驟(a)之混合物可藉由包含以下步驟之程序獲得： (1) 允許用包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體感染培養物中之易感細胞，其中該重組蛋白由該載體表現， (2) 其後自細胞培養基中回收重組蛋白及/或包含複數個該重組蛋白之四級結構，其中較佳經由分離步驟、較佳包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾將細胞碎片與重組蛋白及/或該等四級結構分離，其中至少一個過濾器較佳具有比重組蛋白及/或含有複數個該重組蛋白之四級結構大之孔徑，特別地具有約1至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm之孔徑。

較佳地，在該方法中，分離步驟包括以下或由以下組成： - 經由一或多個孔徑為約2 μm至約15 μm之過濾器之微過濾，及/或 - 經由一或多個孔徑為約0.8 μm至約1.0 μm之過濾器之微過濾。

較佳細胞係易受含有重組蛋白DNA並表現重組蛋白之適當重組病毒載體感染的彼等。較佳地，細胞係昆蟲細胞，且更佳地，其包括以商標SF+昆蟲細胞(Protein Sciences Corporation, Meriden, CT)出售之昆蟲細胞。較佳地，細胞培養物之細胞計數介於約0.3 - 2.0 × 10⁶ 個細胞/mL之間，更佳為約0.35 - 1.9 × 10⁶ 個細胞/mL、仍更佳約0.4 - 1.8 × 10⁶ 個細胞/mL、甚至更佳約0.45 - 1.7 × 10⁶ 個細胞/mL、且最佳約0.5 - 1.5 × 10⁶ 個細胞/mL。

當用於感染易感細胞時，包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體之感染複數(MOI)較佳介於約0.03 - 1.5之間、更佳為約0.05 - 1.3、仍更佳約0.09 - 1.1、且最佳約0.1 - 1.0。較佳地，上文提及之MOI係指1 mL細胞培養液。較佳地，本文所述方法包含用含有重組蛋白DNA且表現重組蛋白的重組病毒載體感染0.35 - 1.9 × 10⁶ 個細胞/mL、仍更佳約0.4 - 1.8 × 10⁶ 個細胞/mL、甚至更佳約0.45 - 1.7 × 10⁶ 個細胞/mL、且最佳約0.5 - 1.5 × 10⁶ 個細胞/mL，該重組病毒載體之MOI (感染複數)介於約0.03 - 1.5之間、更佳約0.05 - 1.3、仍更佳約0.09 - 1.1、且最佳約0.1 - 1.0。

適當生長培養基亦可由熟習此項技術者確定，其中較佳生長培養基為無血清之昆蟲細胞培養基，例如Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS)及諸如此類。

在該方法中，較佳地，較佳在重組蛋白由該載體表現時，將步驟(1)中之細胞培養物維持於22 - 32℃、更佳約24 - 30℃、仍更佳約25 - 29℃、甚至更佳約26 - 28℃、且最佳27℃，及/或步驟(2)中之回收係在用載體接種細胞後5至8天、最佳8天發生，及/或當細胞存活率降低至小於10%時發生。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中該重組蛋白係選自由以下組成之群： - 重組PCV2 ORF2蛋白，其較佳包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列或由該序列組成。

如本文所用術語「具有100%序列一致性」應理解為相當於術語「係相同的」。

序列一致性百分比具有業內公認之含義，且存在許多方法來量測兩個多肽或多核苷酸序列之間之一致性。參見(例如)Lesk編輯，Computational Molecular Biology , Oxford University Press, New York, (1988)；Smith編輯，Biocomputing: Informatics And Genome Projects , Academic Press, New York, (1993)；Griffin & Griffin編輯，Computer Analysis Of Sequence Data, Part I , Humana Press, New Jersey, (1994)；von Heinje,Sequence Analysis In Molecular Biology , Academic Press, (1987)；以及Gribskov及Devereux編輯，Sequence Analysis Primer , M Stockton Press, New York, (1991)。在電腦程式中編纂用於比對多核苷酸或多肽之方法，該等電腦程式包括GCG程式包(Devereux等人，Nuc.Acids Res.) 12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul等人，J. Molec. Biol. 215:403 (1990))、及Bestfit程式(Wisconsin序列分析包，Unix之第8版，Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)，其使用Smith及Waterman之局部同源性算法(Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))。舉例而言，可使用採用FASTA算法之電腦程式ALIGN，其中仿射空位搜索之空位開放罰分為-12且空位延伸罰分為-2。出於本發明之目的，使用Clustal W方法以DNASTAR Inc.之MegAlign軟體軟體版本11.1.0 (59)、419使用程式中設定之缺省多重比對參數(Gonnet系列蛋白質重量矩陣，其中空位罰分= 10.0、空位長度罰分= 0.2，且延遲發散序列(%)= 30%)比對蛋白質/胺基酸序列。

如本文所用，特別地應理解，術語「與SEQ ID NO:X之序列之序列一致性」相當於分別術語「在SEQ ID NO: X之長度內與SEQ ID NO:X之序列之序列一致性」或術語「在SEQ ID NO: X之整個長度內與SEQ ID NO:X之序列之序列一致性」。在此上下文中，「X」係選自1至2之任何整數，使得「SEQ ID NO: X」表示本文提及之SEQ ID NO中之任一者。

進一步應理解，術語「由序列組成之重組蛋白」特別地亦係關於受其中表現多肽之細胞影響之序列的任何一或多種共轉譯及/或轉譯後修飾。因此，如本文所述，術語「由序列組成之重組蛋白」亦係關於具有一或多個由其中表現多肽之細胞之實現之修飾、特別地在蛋白質生物合成及/或蛋白質處理(較佳選自由醣基化、磷酸化及乙醯化組成之群)中實現之胺基酸殘基之修飾的序列。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中包含複數個該重組蛋白之該等四級結構係包含複數個重組PCV2 ORF2蛋白之類病毒顆粒。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中與未經歷該方法之步驟(b)之濃縮及步驟(c)之連續滲濾的混合物相比，自該方法產生之混合物之殺病毒活性降低至少20%，及/或其中當活病毒與藉由該方法產生之免疫原組合物特別地於室溫下混合4小時或4小時以上時，該免疫原組合物導致小於1 log TCID₅₀ /mL活病毒之損失。如本文所提及之「室溫」特別地係關於20至25℃，且更特定而言(平均) 23℃。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中活病毒係豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之方法，其中該方法進一步包含組合步驟(c)及/或步驟(d)後保留之混合物與至少一種額外抗原的步驟，其中至少一種額外抗原較佳係豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒。在本發明之上下文中，特別地應理解，術語「步驟後保留」相當於「自步驟產生」。

本申請案不僅提供製造免疫原組合物之方法，其亦係關於由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物。

在另一態樣中，因此，本發明係關於可藉由如本文中闡述及主張之方法獲得的免疫原組合物。

根據特定較佳態樣，該免疫原組合物係包含1-10 µM L-精胺酸及/或1-10 µM L-離胺酸之溶液，且最佳地，該免疫原組合物係包含1-10 µM L-精胺酸及1-10 µM L-離胺酸之溶液。

因此，本發明亦提供免疫原組合物，其包含： - 重組PCV2 ORF2蛋白，較佳由與SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列組成或包含該序列，及 - 1-10 µM L-精胺酸及/或1-10 µM L-離胺酸，且其中視情況，該免疫原組合物實質上不含經中和之不活化劑及/或實質上不含中和劑。

應理解，如本文所用之「1-10 µM」特別等於「1 µM至10 µM」。

特別地，自步驟(d)產生之免疫原組合物或混合物每毫升包含4-400 µg重組PCV2 ORF2，或較佳每毫升包含8-200 µg重組PCV2 ORF2蛋白。

「實質上不含中和劑」特別應理解為意指免疫原組合物包含小於150 nM之中和劑。因此，例如，「免疫原組合物實質上不含硫代硫酸鈉」之指示特別應理解為與「免疫原組合物包含小於150 nM之硫代硫酸鈉」之說明相當。

根據又一態樣，因此，本發明係關於可藉由如本文中闡述及主張之方法獲得之免疫原組合物，其中自步驟(d)產生之免疫原組合物或混合物實質上不含硫代硫酸鈉或包含小於150 nM之硫代硫酸鈉。

此外，提供免疫原組合物，特別可藉由如本文中闡述及主張之方法獲得、較佳可藉由包含步驟(d)之任何該方法獲得的免疫原組合物，其中該免疫原組合物包含重組PCV2 ORF2蛋白，較佳包含與SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列或由該序列組成，及 0.1-1 µM L-色胺酸；及/或 0.1-3 µM L-麩醯胺酸；及/或 0.2-4 µM L-甲硫胺酸；及/或 1-10 µM L-精胺酸；及/或 1-10 µM L-蘇胺酸；及/或 1-15 µM L-離胺酸。

較佳地，如本文中闡述及主張之免疫原組合物包含 0.1-0.7 µM L- 色胺酸；及/或 0.7-2.4 µM L-麩醯胺酸；及/或 0.5-3.2 µM L-甲硫胺酸；及/或 1.4-4.7 µM L-精胺酸；及/或 1.6-8.0 µM L-蘇胺酸；及/或 4.0-12.2 µM L-離胺酸。

更佳地，如本文中闡述及主張之免疫原組合物包含 0.2-0.6 µM L-色胺酸；及/或 0.8-2.2 µM L-麩醯胺酸；及/或 0.8-2.2 µM L-甲硫胺酸；及/或 1.6-4.3 µM L-精胺酸；及/或 2.4-6.3 µM L-蘇胺酸；及/或 4.4-11.2 µM L-離胺酸。

根據尤佳態樣，如本文中闡述及主張之免疫原組合物包含0.7-2.4 µM L-麩醯胺酸及4.0-12.2 µM L-離胺酸，或較佳包含0.8-2.2 µM L-麩醯胺酸及4.4-11.2 µM L-離胺酸。

較佳地，如本文中闡述及主張之免疫原組合物實質上不含硫代硫酸鈉。

根據又一較佳態樣，提供免疫原組合物，特別地可藉由如本文中闡述及主張之方法獲得、較佳可藉由包含步驟(d)之任何該方法獲得的免疫原組合物，其中當於室溫下經受二維(2D)超性能液相層析(UPLC)時展現峰A面積對峰B面積之比率為0.2-0.4及/或峰C面積對峰B面積之比率為0.5-0.9，其中2 D UPLC包含系統體積為400 µL之層析之第一維，其中 - 將包含免疫原組合物之樣品注入陰離子交換管柱中，其中0.1 mL管柱體積填充有適於結合病毒樣顆粒之四級胺官能化材料，及 - 以0.6 mL/min之流速穿過陰離子交換管柱驅動0分鐘時初始100% 50 mM Tris (pH 8)至1分鐘時97.5% 50 mM Tris (pH 8)及2.5% 50 mM Tris、2 M NaCl (pH 8)且最終2分鐘時至10% 50 mM Tris (pH 8)及90% 50 mM Tris、2M NaCl (pH 8)的多步驟梯度方法，且其中在2.67 min之滯留時間時，其自層析之第一維切換至層析之第二維，其中以0.3 mL/min之流速驅動層析之第一維之50 µL溶析液穿過具有1.75 mL管柱體積與450 Å之孔徑的粒徑篩析管柱，且其中藉由監測330 nm之波長下之螢光發射及280 nm之激發波長下之發射記錄層析圖，且其中峰A面積係層析圖中0-1分鐘之滯留時間的最高峰之峰面積；峰B面積係層析圖中7-8分鐘之滯留時間的最高峰之峰面積；峰C面積係層析圖中8.5-9.5分鐘之滯留時間的最高峰之峰面積。

根據一個較佳態樣，該樣品包含稀釋於50 mM Tris (pH 8)中之免疫原組合物。例如，倘若該樣品包含步驟(c)後保留之免疫原組合物，則樣品較佳包含1:10稀釋於50 mM Tris (pH 8)中之免疫原組合物或由該免疫原組合物組成。

適於結合病毒樣顆粒之四級胺官能化材料較佳係大孔及/或非多孔材料。

實例5闡述可由熟習此項技術者使用之該2D UPLC方法。在有爭議之結果及任何疑問之情形下，如本文所提及之峰面積的比率係指藉由/可藉由如實例5中所述方法估計之彼等。

術語「免疫原組合物」意指但不限於包含至少一種抗原之物質組合物，其在宿主中引發針對關注之抗原之細胞及/或抗體介導的免疫反應。通常，「免疫反應」包括(但不限於)以下效應中之一或多者：產生或活化特異性地針對關注之組合物或疫苗中所包括之一或多種抗原之抗體、B細胞、輔助性T細胞、阻抑性T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或γ-δ T細胞。較佳地，宿主會呈現治療性或保護性免疫反應，使得將增强對新感染之抗性及/或降低疾病之臨床嚴重程度。在該情形下，免疫原組合物係「疫苗」。該保護將藉由感染宿主通常呈現之症狀減少或缺乏、更快恢復時間及/或感染宿主中之病毒效價降低來展現。如本文所述之宿主特別地係哺乳動物、較佳豬。

在另一態樣中，與未經歷該方法之步驟(b)之濃縮及步驟(c)之連續滲濾的相應免疫原組合物相比，藉由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物的殺病毒活性降低至少10%、較佳至少20%。更佳地，與未經歷步驟(b)之濃縮及步驟(c)之連續滲濾的相應免疫原組合物相比，該免疫原組合物之殺病毒活性降低至少50%。仍更佳地，與未經歷步驟(b)之濃縮及步驟(c)之連續滲濾的相應免疫原組合物相比，該免疫原組合物之殺病毒活性降低至少70%。甚至更佳地，與未經歷步驟(b)之濃縮及步驟(c)之連續滲濾的相應免疫原組合物相比，該免疫原組合物之殺病毒活性降低至少90%。

出於本發明之目的，術語「殺病毒活性」意指當液體、流體、溶液、組合物或諸如此類與活病毒或活細菌混合時，該液體、流體、溶液、組合物或諸如此類在一定程度上不活化或殺死該等活病毒或活細菌。因此，液體、流體、溶液、組合物或諸如此類之殺病毒活性減少至少10%意指，活體病毒或活細菌之存活率在已經歷本文所述製造方法中之任一者的液體、流體、溶液、組合物或諸如此類中比在未經歷該等製造方法中之任一者之液體、流體、溶液、組合物或諸如此類中高90%。在本上下文中，「存活率」特別地係關於維持在宿主中複製能力之病毒或細菌之百分比。

根據特定較佳態樣，當活病毒或活細菌與藉由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物混合且培育至少4小時時，該免疫原組合物導致小於1 log TCID₅₀ 之活病毒或小於1 log CFU/mL活細菌之損失。更佳地，當活病毒或活細菌與藉由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物混合且培育至少4小時時，該免疫原組合物導致小於0.9 log TCID₅₀ /mL活病毒或小於0.9 log CFU/mL活細菌之損失。甚至更佳地，當活病毒或活細菌與藉由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物混合且培育至少4小時時，該免疫原組合物導致小於0.7 log TCID₅₀ /mL活病毒或小於0.7 log CFU/mL活細菌之損失。仍更佳地，當活病毒或活細菌與藉由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物混合且培育至少4小時時，該免疫原組合物導致小於0.5 log TCID₅₀ /mL活病毒或小於0.5 log CFU/mL活細菌之損失。甚至更佳地，當活病毒或活細菌與藉由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物混合且培育至少4小時時，該免疫原組合物導致小於0.3 log TCID₅₀ /mL活病毒或小於0.3 log CFU/mL活細菌之損失。

可藉由允許估計活病毒之量的標準活體外滴定分析估計每毫升之TCID₅₀ 。亦可藉由允許估計活細菌之量的標準活體外滴定分析測定每毫升之CFU。術語「每毫升」較佳係指至少1 mL之流體。

此外，已發現，可藉由如本文中闡述及主張之方法獲得之免疫原組合物特別穩定。

根據特定較佳態樣，藉由如本文中闡述及主張之方法製造之免疫原組合物的儲放壽命係至少2年、較佳至少3年，其中如本文所用之術語「儲放壽命」意指產物可儲存且品質不會下降低於某一最小可接受程度的時段。

特別地，本發明係關於免疫原組合物，其中在投與一個劑量之免疫原組合物後，免疫原組合物較佳在豬中誘導針對衍生重組蛋白之胺基酸序列的病原體之保護性免疫反應，其中病原體較佳係PCV2，且其中該投與較佳係向豬投與一個劑量之免疫原組合物。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之免疫原組合物，其中免疫原組合物進一步包含減毒之活病毒、較佳減毒之豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒或減毒之活細菌。

出於本發明之目的，「活」病毒或細菌係指能够在宿主中複製之病毒或細菌。本發明之較佳活病毒及較佳活細菌分別係PRRS病毒(PRRSV)及豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumonia )細菌。然而，術語活病毒或活細菌分別並不限於PRRSV及豬肺炎黴漿菌。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之免疫原組合物，其中免疫原組合物進一步包含減毒之豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒。

術語「減毒」特別地係關於病毒或細菌以減少其毒力並使其適合用作疫苗的方式培養。因此，更具體而言，「減毒」係關於活的病毒或細菌，但由於藉助該特殊培養減少了毒力或毒性，其不再能產生疾病。

較佳地，在投與一個劑量之免疫原組合物後，該免疫原組合物特別地在豬中誘導針對PRRS病毒之保護性免疫反應，且其中該投與較佳係向豬中投與一個劑量之免疫原組合物。

更佳地，在投與一個劑量之免疫原組合物後，該免疫原組合物特別地在豬中誘導針對PCV2及PRRS病毒之保護性免疫反應，且其中該投與較佳係向豬中投與一個劑量之免疫原組合物。

在另一態樣中，本發明亦提供套組，其中套組包含含有如本文中闡述及主張之免疫原組合物的容器，且其中該套組較佳進一步包含至少一個含有至少一種選自由減毒之活病毒(較佳減毒之PRRS病毒)及減毒之活細菌組成之群之額外抗原的額外容器。

根據又一態樣，提供包含含有如本文中闡述及主張之免疫原組合物之容器的套組。

如本文中闡述及主張之免疫原組合物及/或如本文中闡述及主張之套組可進一步包含至少一種額外抗原、較佳病毒或細菌抗原、且甚至更佳來自在豬中引起疾病之至少一種其他病原體的病毒或細菌抗原。額外抗原可為國際專利申請案WO2007/094893 (其內容及教示以引用方式併入本文中)中揭示之彼等抗原中之任一者。簡言之，額外抗原可為在豬中引起疾病之任何其他病原體的抗原。較佳地，「在豬中引起疾病之任何其他病原體」或在豬中引起疾病之至少一種其他病原體係選自由以下組成之群：胸膜肺炎放綫桿菌(Actinobacillus pleuropneumonia ) (1)；腺病毒(2)；α病毒，例如東部馬腦脊髓炎病毒(3)；支氣管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica ) (4)；短螺菌屬(Brachyspira spp. ) (5)、較佳痢疾短螺菌(B. hyodysentheriae ) (6)；毛樣短螺菌(B. piosicoli ) (7)、豬布氏桿菌(Brucella suis )，較佳生物變型1、2及3 (8)；古典豬瘟病毒(9)；梭菌屬(Clostridium spp. ) (10)、較佳難辨梭菌(Cl. difficile ) (11)、A、B及C型產氣莢膜梭菌(Cl. perfringens )(12)、諾維梭菌(Cl. novyi ) (13)、敗血梭菌(Cl.septicum ) (14)、破傷風梭菌(Cl. tetani ) (15)；冠狀病毒(16)、較佳豬呼吸冠狀病毒(17)；附紅細胞體(Eperythrozoonosis suis ) (18)；丹麥桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae ) (19)；大腸桿菌(20)；副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis )，較佳亞型1、7及14 (21)；血凝性腦脊髓炎病毒(22)；日本腦炎病毒(23)；細胞內散沫花屬(Lawsonia intracellularis ) (24)；鈎端螺旋體屬(Leptospira spp. ) (25)，較佳澳洲鈎端螺旋體(Leptospira australis (26)；犬鈎端螺旋體(Leptospira canicola ) (27)；感冒傷寒型鈎端螺旋體(Leptospira grippotyphosa ) (28)；出血性黃疸鈎端螺旋體(Leptospira icterohaemorrhagicae ) (29)；及問號鈎端螺旋體(Leptospira interrogans ) (30)；波莫納鈎端螺旋體(Leptospira pomona ) (31)；塔拉索夫鈎端螺旋體(Leptospira tarassovi ) (32)；分枝桿菌屬(Mycobacterium spp. ) (33) 較佳鳥分枝桿菌(M. avium ) (34)、細胞內分枝桿菌(M. intracellulare )(35)及牛分枝桿菌(M. bovis ) (36)；豬肺炎黴漿菌(Mycoplasma hyopneumoniae) (37)；多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida ) (38)；豬巨細胞病毒(39)；豬小病毒(40)；豬生殖及呼吸症候群病毒(41)；僞狂犬病病毒(42)；輪狀病毒(43)；沙門桿菌屬(Salmonella spp. )(44)，較佳鼠傷寒沙門氏菌(S. thyhimurium ) (45)及豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis ) (46)；豬葡萄球菌(Staph. hyicus ) (47)；葡萄球菌屬(Staphylococcus spp. ) (48)，較佳鏈球菌屬(Streptococcus spp. ) (49)，較佳豬鏈球菌(Strep. suis ) (50)；豬疱疹病毒(51)；豬流行性感冒病毒(52)；豬痘病毒(53)；豬痘病毒(54)；水疱性口炎病毒(55)；豬水泡疹之病毒(56)；哈德焦鈎端螺旋體(Leptospira Hardjo )(57)；豬關節滑膜黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae ) (58)；及/或其組合。

最佳地，如本文中闡述及主張之免疫原組合物及/或如本文中闡述及主張之套組進一步包含一或多種減毒之或不活化之非PRRSV病原體或其抗原性物質。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之免疫原組合物及/或如本文中闡述及主張之套組，其用作藥劑、較佳用作疫苗。

在另一態樣中，本發明係關於如本文中闡述及主張之免疫原組合物及/或如本文中闡述及主張之套組，其用於以下之方法中： - 誘導針對至少一種病原體之保護性免疫反應及/或 - 減少至少一種病原體感染之一或多個臨床體徵其係在動物中、較佳在豬中。

本發明進一步提供以下之方法： - 誘導針對至少一種病原體之保護性免疫反應及/或 - 減少至少一種病原體感染之一或多個臨床體徵其係在動物中，其中向動物、特別地豬投與如本文中闡述及主張之免疫原組合物。

根據再一態樣，本發明係關於如本文中闡述及主張之免疫原組合物用於製備藥劑的用途，該藥劑用於 - 誘導針對至少一種病原體之保護性免疫反應及/或 - 減少至少一種病原體感染之一或多個臨床體徵其係在動物中、較佳在豬中。

較佳地，至少一種病原體係選自由以下組成之群：PCV2、PRRSV、非PRRSV病原體及其組合。

如本文所用之術語「非PRRSV病原體」特別地係關於選自以下之病原體：豬肺炎黴漿菌、僞狂犬病病毒、豬流行性感冒病毒、豬小病毒、傳染性胃腸炎病毒、大腸桿菌、丹麥桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌及胸膜肺炎放綫桿菌。

如本文所用術語「減少一或多個臨床症狀」特別地應意指當兩種動物皆經衍生免疫原組合物中之免疫活性組分的病原體感染或攻擊時，與「對照組」動物相比，接受免疫原組合物之投與之動物的該等體徵之發病率或嚴重程度中的任一者降低，且其中對照組未接受免疫原組合物之投與。在此上下文中，術語「降低」意指與對照組相比，接受免疫原組合物之組中降低至少10%、較佳25%、甚至更佳50%、最佳100%。

如本文所用之「臨床體徵」應指病原體感染之體徵，其可自活體動物直接觀察到，例如症狀。代表性實例將取決於所選擇之病原體，但可包括諸如流鼻涕、嗜睡、咳嗽、高燒、減少增重或體重損失、脫水、腹瀉、腫脹、跛足及諸如此類。

如本文所用，「保護性免疫反應」係指關注之病原體感染之臨床、病理或組織病理學體徵或症狀的發病率降低或嚴重程度減少直至且包括完全預防該等體徵或症狀。

實例實例1：PCV2 ORF2 蛋白之製造 - 上游處理 在對應於WO 2006/072065 A2、實例1至3中所述之製程中在桿狀病毒感染之SF+細胞中製造PCV2 ORF2蛋白。在下文中，概述此製程：在生物反應器中製造PCV2 ORF2桿狀病毒-載體。將培養基預滅菌或無菌過濾添加至生物反應器中。向培養基中添加源自擴增培養物之SF+細胞。在接種PCV2 ORF2種子時，同時接種細胞(同時感染)。在整個病毒傳播過程中，溫度維持於27±2℃且監測pH。藉由噴射清潔壓縮空氣及氧氣(O₂ )控制溶解氧(DO)。收穫窗在病毒感染後6至8天之間發生，且實現≤20%細胞存活率之收穫準則。收穫時，使用兩組過濾器(即孔徑為2.0-15.0 μm之預過濾器及孔徑為0.8-1.0 μm之最終過濾器)澄清PCV2 ORF2抗原流體。將過濾之收穫流體收集於罐中。對於桿狀病毒之不活化，在中和之前添加5 mM BEI達高達96小時。對於剩餘BEI之中和，添加5 mM硫代硫酸鈉以中和BEI。硫代硫酸鈉之添加在不活化後72-96小時發生。

PCV2 ORF2 蛋白之製造 - 下游處理 實驗室規模 將由上述上游製程產生之3 L樣品送至實驗室並基於體積濃縮至至少300 mL以達到10倍濃度。濃縮後，然後使用3 LP-鹽水對抗原進行滲濾，該P-鹽水係由溶解於水中之0.85% NaCl構成且pH調節至6.8-7.0的緩衝溶液。

實驗室規模之濃縮及連續滲濾係在生物安全性櫃或BSC下、在室溫(27±2℃)下使用切向流過濾器(TFF)系統實施，該系統由以下構成：TFF System Sartoflow Slice 200臺式系統，裝配有1個Sartoslice Ultrafilter (UF)卡匣式過濾器(PES，200 cm² 過濾面積，300 kD截止值)。

在超濾/滲濾之前，用1 M NaOH沖洗TFF系統(至少1小時)，且用0.1 N NaOH將盒化學滅菌過夜。然後，將經滅菌之系統及過濾器放入BSC中以便無菌組裝，且連接入口、出口及滲透物管綫。將滲透物管綫連接至廢液瓶，同時將入口管綫連接至欲濃縮之不活化之抗原。出口管綫自過濾單元開始返回至保留瓶中。使用無菌PBS (每個過濾器10 L)平衡過濾器。

藉由超濾將產物濃縮至基於體積之原始抗原體積的10倍。當藉由濃縮處理抗原時，穿過過濾器之流速變化。在小規模程度，流速係範圍且藉由將反壓放置在系統上來保持。用10倍體積之超濾體積以P-鹽水進行滲濾，其中P-鹽水以等於滲透物流速之速率添加。將最終濃縮及滲濾之抗原儲存於2-8℃。

利用HPLC量化方法，可以看出此支持消除≥99%之任何殘餘昆蟲細胞培養基(ExCell 420培養基)，且將經中和之BEI及殘餘之硫代硫酸鈉降低至不可檢測程度。

此外，初步實驗已顯示，在製造免疫原組合物之背景下，如本文所述，與中空纖維過濾器相比，對於TFF系統使用平板過濾器具有儲存成本將顯著降低之有利效應，此乃因需要利用較少之儲存袋/桶(200 L)。另外，可以看出，藉由使用平板過濾器，用於收穫之人力及製造時間顯著減少。

操作規模 在操作或大規模處理(參見圖1)中，使用由上述上製程產生之約4000 L。系統經設計使得不活化罐中含有抗原之溶液可以連續進料速率直接送至下游處理(DSP)罐，直至不活化罐係空的。

DSP關係用於製程中抗原及最終抗原呈遞之儲存庫。此罐之程式化重量控制整個系統，因為當達到某些程式化重量時，該過程將向前進行。另外，此罐係收集最終抗原產品且收集至200 L桶中進行儲存之地方。

DSP罐連接至微濾(MF)單元。在將含有抗原之溶液自DSP罐送至MF單元後，濃縮抗原且將滲餘物送回DSP罐，同時將滲透物轉移至廢液中。

該過程始於獲取含有由上游處理產生之(中間)產物的不活化槽之重量。基於罐之初始重量計算10倍濃度且程式化至MF單元之系統操作單元中。一旦濃縮開始，系統觸發不活化罐與DSP罐之間之輸送管綫，以基於罐重量打開或關閉。當不活化罐變空時，系統觸發罐以關閉至DSP罐之輸送管綫。在不活化罐為空後，啓動單獨之輸送管綫，以便將鹽水添加至最近抽空之不活化罐中。亦藉由重量監測鹽水，此乃因轉移至DSP罐之期望鹽水量係獲取之原始重量並用於濃度計算。將滲餘物反饋回DSP罐且進一步再次通過MF單元以進一步使濃縮滲餘物，直至滲餘物之重量降低至指示期望濃度之程式化值。

MF單元之獨特之處在於其既可支持微過濾器盒亦可支持超濾盒。對於此程序，總共6個超濾器sartocube (每立方21 m² )安置至MF單元中。在系統之廣泛評估之後選擇此表面積。存在自DSP罐進入MF單元之進料管綫、反饋回DSP罐之滲餘物管綫及滲透物至廢液輸送管綫。此單元經程式化以0 psi之滲透壓運行，同時維持20-35 psi之再循環，目標為29 psi之跨膜壓力(TMP)。再循環幫浦以100%之容量運行，直至激活保持模式。在濃縮及滲濾過程期間，靶向該等參數。一旦DSP罐處於設定重量，則激活MF單元以開始濃縮步驟，且將使抗原保持循環直至達到設定之10倍濃度。一旦10倍濃縮完成，將MF單元切換成保持模式，以便在減壓及降低之速度下循環抗原，同時不活化罐填充P-鹽水。在P-鹽水在不活化罐中達到作為開始時原始重量之期望體積後，系統將藉由開始P-鹽水流入DSP罐中啓動滲濾過程，且MF單元將斜坡上升回目標範圍。

一旦不活化槽為空，關閉不活化槽與DSP槽之間之閥，且經由MF單元進一步處理抗原，直至達成10倍滲透。經濃縮及滲濾之抗原在DSP罐中且泵入抗原收穫桶中用於最終儲存庫。該等桶儲存於4±2℃直至疫苗摻和。

然後將由上述上游及下游處理產生之產物最後與卡波姆溶液(佐劑)及生理鹽水(P-鹽水)混合。此研究性獸醫產品在下文中亦分別稱為1號研究性獸醫產品(IVP)或「IVP1」。

總之，關於此處闡述之新方法，觀察到之特定優點係節省時間、減少處理以及冷却器中之儲存/空間節省。

實例2：使用中穩定性研究 概述利用最佳化方案，設計一項研究，以研究在用實例1之1號研究性獸醫產品(IVP) (IVP1 )重構後研究性獸醫產品(凍乾物) (包括經改質之活的PRRS病毒) (該研究性疫苗產品在下文中亦稱作「IVP2 」)的使用中穩定性。

表1中提供關於所用研究性獸醫產品(IVP)之概述。

評估包括兩批IVP1 (一種以高功效製造，且一種以常規/標準釋放功效製造)及兩批IVP2 。

測試之所有研究性獸醫產品(IVP) (參見表1)儲存於5℃±3℃下直至用於研究。

在該研究中，將每批IVP2 疫苗用IVP1 重構，且在重構後0、2及4小時測試PRRS病毒效價。

對於每個IVP2 批次，時間0時重構後之PRRS病毒效價係類似的，與凍乾物用WPBS (洗滌磷酸鹽緩衝鹽水(=磷酸鹽緩衝鹽水洗滌溶液))或用IVP1 重構無關且與科學家無關。另外，於室溫下培育後2小時及4小時後，測試結果顯示病毒效價無變化至可忽略之變化。

研究之結果支持IVP1 與IVP2 之相關使用。

1. 介紹該研究經設計以展現用IVP1 重構後IVP2 之使用中穩定性。IVP2 係經冷凍乾燥之經改質之活疫苗(MLV)且如上所述製造IVP1。在下文中，顯示用IVP1 重構後IVP2 之使用中穩定性評估結果。

2. 研究之目標 / 目的此使用中穩定性研究之目的係研究用IVP1 重構後IVP2 疫苗之穩定性。

3. 材料使用研究中評估之兩批兩種疫苗中之每一者及所用之一批稀釋劑對照，其中測試材料之組成列於表1中。表 1. 測試材料組成

4. 研究之設計 用每批亞單位疫苗(IVP1 )以所有可能之組合測試每批IVP2 疫苗。表2.1列出本研究中評估之所有8種疫苗組合。表 2.1 評估之 IVP 之組合之清單

在完成重構並在零時間(T0)彙集後立即測試樣品之PRRS病毒效價。將合併樣品在室溫下在黑暗中儲存，且在2小時(T2)及4小時(T4)再次測試。在測試之同一天製備樣品。每一樣品以兩個不同時段測試，且在不同天實施時段。

測試由兩位科學家實施。科學家1用IVP2 批號1測試1號至4號樣品，且科學家2用IVP2 批號2測試5號至8號樣品。每位科學家每一時段測試兩個樣本及一個使用中穩定性對照。對照由IVP2 組成，該IVP2 使用與相應測試樣品所指示之體積及時間間隔相同之體積及時間間隔用無菌洗滌磷酸鹽緩衝鹽水(WPBS)重構。

5. 方法 5.1 重構方法 對於每一樣品(如表2.1中所述)，將三個IVP2 小瓶中之每一者用10 mLIVP1 重構。對於每一對照，將三個IVP2 小瓶中之每一者用10 mL WPBS重構。重構完成後，在開始測試之前彙集三個小瓶中之每一者之內容物，如上所述。

5.2 測試方法 第-3天在補充有10% FBS及硫酸慶大黴素之MEM中製備AK-MA104細胞之細胞培養懸浮液。將100 μL細胞培養物接種至96孔微量滴定板之每一孔中。用蓋子封閉板並在培育器中保持3天。

第0天樣品製備 IVP1 及陽性對照之樣品用於重新懸浮IVP2 之凍乾樣品。彙集三個小瓶且一式三份滴定該池。

滴定使用補充有2% FBS及硫酸慶大黴素之MEM作為稀釋培養基用於稀釋樣品。

接種用100 μL稀釋之樣品接種樣品之孔，且用100 μL培養基接種陰性對照之孔。

培育將其在培育器中培育8天。

第 +8 天 讀取及計算 在倒置顯微鏡下讀取板之最終細胞病變效應(CPE)讀數，且藉由添加1.0 log將原始數據轉換為每1 mL劑量之效價。

效價係根據Reed及Muench方法(Reed, L. J.；H. Muench, (1938). 「A simple method of estimating fifty per cent endpoints.」 Am. J. Hygiene, 27: 493 - 497)計算且表示為log10 TCID50/1 mL劑量。將每一測試間隔之每一樣品之效價報告為兩個連續有效測試時段之獨立滴定的每劑量之算術平均效價，其中每一時段進行三次獨立滴定。

6. 接受準則 在用WPBS稀釋劑對照重構後在0 (T0)、2 (T2)及4 (T4)小時獲得之IVP2 的病毒效價大於或等於預定/先前測定之最小免疫劑量(MID)。

7. 結果在每一培育時間(T0、T2及T4)獲得之測試樣品及各別對照之平均效價以及相對於時間0之相應效價差異(T0-T0、T2-T0及T4-T0)的概述分別示於表3及表4中。表 3. 平均病毒效價

表 4. 相對於 T0 之平均病毒效價差異

PRRS病毒效價表示為log₁₀ TCID₅₀ /1 mL劑量。每一效價值表示在兩個測試日獲得之結果之平均值，每個測試日進行三次獨立滴定。

8. 討論本研究中獲得之數據展現，用標準稀釋劑(WPBS)再水合之IVP2 的病毒效價皆高於MID且於室溫下培育之四小時期間保持穩定。該等結果與已知的先前測定之IVP2 產物特徵一致，且確認與IVP1 聯合使用之經改質之活PRRS病毒疫苗IVP2 的此使用中穩定性評估的有效性。

T0時用兩批IVP1 中之任一者測試之兩批IVP2 獲得的結果顯示與用各別對照獲得之彼等病毒效價相當的病毒效價。對照與測試樣品之間觀察到之可變性在各別分析驗證研究中所見之分析的可變性範圍內。

在T2及T4時用兩批IVP1 中之任一者重構後兩批IVP2 獲得之結果顯示穩定的病毒效價，效價未減低至最小(≤0.12 log10 TCID50)降低。

9. 推論本研究之結果支持IVP1 及IVP2 之聯合使用，以及當與IVP1 混合時IVP2 之使用中穩定性為4小時。

實例3： A) 針對PRRSV攻擊之免疫性的起始本研究之目的係研究在與IVP1 聯合使用時，疫苗接種後3周時IVP2 之免疫性的起始是否會受影響。出於此目的，將 IVP2 疫苗用以高功效製造之IVP1 重構至最小免疫劑量(MID)，其中IVP1 及IVP2 之此組合在下文中亦稱為「IVP1/IVP2 」。本研究包括52頭三週齡仔豬，其來自德國之商業畜群。研究之主要參數係驗屍時、攻擊後10至12天之肺病灶。

在包含時，無一動物對PRRSV呈抗體或抗原陽性。直至用PRRSV攻擊(在疫苗接種後第21天)，對照組之動物皆未顯示血清轉化或經測試PRRSV抗原呈陽性。

與對照組之動物相比，用IVP1 /IVP2 接種疫苗之動物的中值肺病灶評分降低52.1%。此外，由於與對照組相比，IVP1 /IVP2 接種疫苗之動物在攻擊後具有每天164克之統計學上顯著更高的ADWG，故ADWG結果支持IVP1 及IVP2 之組合的效能。

在用IVP1 /IVP2 接種疫苗之動物中，首先在疫苗接種後14天(第14天)檢測PRRSV抗體。儘管PRRSV抗體陽性動物之數量在攻擊後一周兩組之間無統計學上顯著之差異，但與對照組相比，接種疫苗之組中抗體含量顯著更高。攻擊後10至12天，所有動物皆呈PRRSV抗體陽性，且各組之間之抗體含量無統計學上顯著之差異。

總之，展現當與IVP1 聯合使用時，疫苗接種後3周時IVP2 之免疫性的起始未受到負面影響。

B) 針對PCV2攻擊之免疫性的起始本研究之目的係評估當與IVP2 聯合使用時IVP1 之免疫性的起始。出於此目的，藉由添加調配成靶向最小功效之IVP1 重構IVP2 疫苗以靶向最大免疫劑量，其中IVP1 及IVP2 之此混合物在下文中亦稱為「IVP2/IVP1 」。

本研究包括60頭對PCV2呈血清陰性之剖腹產源、初乳剝奪(CDCD)豬，其中30頭用IVP2/IVP1 疫苗接種，且30頭(對照組)在3週齡(即，在研究第0天(第0天))時接受無菌稀釋劑(注射用水)，之後在第15天對PCV2進行毒性攻擊。

用IVP2/IVP1 疫苗接種導致PCV2血清學呈陽性之豬顯著增加。在攻擊後一周內，來自IVP2/IVP1 組之28頭豬(93%)血清轉化至陽性程度，而來自對照組之0/30頭豬(0%)為陽性。來自對照組之動物在攻擊後13天開始血清轉化至陽性程度。在第21天、第28天及第35天，與對照組相比，IVP2/IVP1 組具有顯著更高比例之具有陽性PCV2效價之豬。截至第42天，IVP2/IVP1 組對於PVC2為100%血清學陽性，而對照組為92%陽性。

在評價主要結果參數時，與對照組相比，用IVP2/IVP1 疫苗接種顯著減少淋巴消耗、淋巴發炎及PCV2淋巴移生。此外，組織學病灶之整體程度在對照組中更為嚴重，其中23/30頭豬(76.7%)在至少一類淋巴病灶評估中具有中度至重度評分，而僅有2/30頭豬(6.7%)接種疫苗之豬具有中度淋巴病灶評分，皆不嚴重。

總之，在疫苗接種後第15天用毒力PCV2攻擊時，以最小功效調配物且與IVP2 聯合使用之IVP1 提供3週齡CDCD豬之有效活性免疫。

此外，在進一步之疫苗接種-PCV2攻擊研究中(其中比較單價IVP1 與未經受根據實例1之下游處理之各別產品(該產品在本文中稱為「IVP0 」))，觀察到IVP1 至少與已確立之IVP0 一樣有效。

C) 針對PCV2攻擊之免疫性的持續時間本研究之目的係評估當與IVP2 聯合使用時IVP1 之免疫性的持續時間。出於此目的，藉由添加經調配以靶向最小功效之IVP1 ，重構IVP2 疫苗以靶向最大免疫劑量。如上文所提及(在B下)，IVP1 及IVP2 之此混合物在本文中亦稱為「IVP2/IVP1 」。

本研究包括60頭對PCV2呈血清陰性之剖腹產源、初乳剝奪(CDCD)豬，其中30頭接種IVP2/IVP1 及30頭(對照組)接受無菌稀釋劑(注射用水)在3週齡(即在研究第0天(D0))時，之後在D119(免疫性之17週持續時間)進行PCV2之毒性攻擊。

因此，在PCV2攻擊後與對照動物相比，用IVP2 /IVP1 接種疫苗之動物具有淋巴消耗(lymphoid depletion)、淋巴移生(lymphoid colonization)及病毒血症之顯著降低頻率。另外，在用PCV2攻擊後中值28天，用IVP2 /IVP1 接種疫苗之動物在所有取樣天皆具有顯著降低之PCV2病毒負荷，在任何取樣點無病毒含量被視為病毒血症以引起疾病((rt-PCR)測試≥1.0 × 10⁴ PCV2基因體當量)，而對照動物為病毒血症。

用IVP2/IVP1 疫苗接種導致自疫苗接種(D0)至D133 (用PCV2攻擊後兩週)呈PCV2血清學陽性之豬顯著增加，此在歷史上已為效能之强力指標。大多數對照組(81%)直至D140 (用PCV2攻擊後3週)才呈PCV2血清學陽性。

該等結果顯示，當與IVP2 聯合使用時，在疫苗接種後17週IVP1 之免疫性的持續時間不受到負面影響。

D) 針對PRRSv攻擊之免疫性的持續時間本研究之目的係調查在與IVP1 聯合使用時，在疫苗接種後6個月時IVP2之免疫性的持續時間是否會受影響。出於此目的，用高功效製造之IVP1 ，將IVP2 疫苗重構至最小免疫劑量(MID)。如上文所提及(在A下)，IVP1 及IVP2 之組合亦稱為「IVP2/IVP1 」。此研究包括70頭源自德國商業畜群之三週齡仔豬，其中在包括時，無動物對PRRSV呈抗體或抗原陽性。在疫苗接種後182天(免疫性之六個月持續時間)實施攻擊。此研究之主要參數係在攻擊後10至12天，驗屍時之肺病灶。

因此，在PRRSV攻擊後，與對照組動物相比，用IVP1 /IVP2 接種疫苗之動物的肺病灶減少，此顯示當與IVP1 聯合使用時，在疫苗接種後6個月IVP2 之免疫性的持續時間未受到負面影響。

實例4：硫代硫酸鹽濃度之分析

概述如實例1中所述，二乙烯亞胺(BEI)用作桿狀病毒重組疫苗之製造中之不活化劑。用BEI不活化後，添加硫代硫酸鈉以中和殘餘BEI中。

在用5 mM BEI不活化PCV2抗原流體後，小濃度(通常約為0.3 mM)之BEI仍可檢測。歐洲藥典闡述不活化後抗原中不應保留BEI。歐洲藥典允許不活化後殘餘硫代硫酸鈉之檢測對於確保抗原中不會保留毒性含量之BEI係可接受的。因此，由於最初在不活化步驟開始時添加5 mM BEI，故在活化步驟中使用5 mM硫代硫酸鹽中和BEI。由於在不活化期間與核酸反應消耗相當大量之BEI，且由於硫代硫酸鹽及BEI以1:1之化學計量比反應，故在中和之後剩餘過量之殘餘硫代硫酸鹽。

如下所述，對根據實例1製造之抗原流體實施硫代硫酸鹽測試。

來自此實驗之數據指示，如實例1中所述之方法意外地已經在10倍之濃縮及滲濾之抗原流體中將硫代硫酸鹽含量降低至低於方法可檢測限值。

材料及方法藉由高壓液相層析 (HPLC) 定量測定抗原流體中之硫代硫酸鈉 A．試劑及材料 1. 硫代硫酸鈉五水合物，具有已知純度之試劑級 2. 純化水 - 使用18 MΩcm或更大電阻率 3. 乙腈(ACN)，HPLC級 4. 冰乙酸，HPLC級 5. 四丁基氫氧化銨(TBA)，試劑級 6. HPLC管柱/保護- Thermo Scientific，ODS-2 Hypersil，150 × 4.6 mm，5微米，具有適宜保護、ODS-2 Hypersil-2，10 × 4.6 mm，5微米，或等效物。

B．溶液 1. 20%乙酸溶液合併10 mL冰乙酸與40 mL純化水，且徹底混合。 2. 溶析液合併750 mL純化水與20 mL TBA，且徹底混合。藉由添加20 mL 20%乙酸溶液將此溶液之pH調節至4.5 - 5.0，且然後與250 mL乙腈合併。徹底混合且在使用之前經由0.2 µm耐綸過濾器過濾。 3. 稀釋劑合併800 mL純化水與200 mL乙腈；徹底混合且儲存於環境條件下。

C. 硫代硫酸鹽參考標準溶液 1. 硫代硫酸鈉原液(5 mM) 稱重1.2 g硫代硫酸鈉五水合物參考材料且轉移至具有純化水之1000 mL A類容量燒瓶中；藉由倒置徹底混合。 2. 100%工作標準溶液(100 % WS) 將2 mL硫代硫酸鈉原液轉移至50 mL A類容量燒瓶中。用稀釋劑 稀釋至一定體積且藉由倒置徹底混合。 3. 50 %綫性標準溶液(50 % LS) 將1 mL硫代硫酸鈉原液轉移至50 mL A類容量燒瓶中。用稀釋劑 稀釋至一定體積且藉由倒置徹底混合。 4. 150 %綫性標準溶液(150 % LS) 將3 mL硫代硫酸鈉原液轉移至50 mL A類容量燒瓶中。用稀釋劑 稀釋至一定體積且藉由倒置徹底混合。 5. 定量溶液之限值(LOQ) 將1 mL50% LS 轉移至20 mL A類容量燒瓶中。用稀釋劑 稀釋至一定體積且藉由倒置徹底混合。

D. PCV2不活化之抗原流體測試溶液將500 µL不活化之抗原流體轉移至10 mL A類容量燒瓶中。用稀釋劑 稀釋至一定體積且藉由倒置徹底混合。經由0.2 µm耐綸注射過濾器將過濾樣品過濾至HPLC小瓶中，消耗前2至3 mL。此係抗原流體之20倍稀釋物。

E. HPLC層析設備及條件 1. 流速：1.2 mL/min 2. 注入體積：10 µL 3. 管柱Thermo Scientific，ODS-2 Hypersil，150 × 4.6 mm，5微米，具有適宜保護，ODS-2 Hypersil-2，10 × 4.6 mm，5微米。 4. 溫度：20 ± 2℃樣品塔板溫度 25 ± 2℃管柱烘箱溫度 5. 檢測：230 nm 6. 典型分析次序 • 用於廢液之稀釋劑 • 稀釋劑；1次注入 • 空白；1次注入(基綫監測、非注入) • 校正標準物；6次注入100 % WS • 綫性標準物；2次注入50、100及150 %溶液中之每一者 • LOQ標準；2次注入 • 測試溶液及檢查標準物；在最大16次樣品注入與分析結束之間2次注入每一測試溶液及兩次注入作為檢查標準物之100%WS 7. 硫代硫酸鹽滯留時間：約7分鐘.

F. 硫代硫酸鈉含量之計算 - 使用以下等式計算硫代硫酸鹽之含量(以mM表示)：硫代硫酸鹽(mM) = TS / WS × C × 20 其中：TS - 兩次測試溶液製劑注入之硫代硫酸鹽峰面積的平均值。 WS - 六次100%WS注入之硫代硫酸鹽面積反應的平均值。 C - 工作標準溶液之濃度，以mM表示(0.2 mM)。 20 - 測試溶液之稀釋因子

結果分析如實例1中所述製造之若干抗原流體，其中獲取樣品對係 (i) 在用硫代硫酸鈉中和BEI之後但在下游處理之前 (ii)在下游處理(即，10倍濃縮及連續滲濾)之後但在與佐劑及P-鹽水混合之前，且測定硫代硫酸鈉之濃度。發現(i)在BEI中和之後但在下游處理之前獲取之樣品仍然具有在毫莫耳範圍內之硫代硫酸鈉濃度，而意外之無硫代硫酸鈉可以在極限值以上進行檢測。(ii)在下游處理之後但在與佐劑及P-鹽水混合之前獲取之樣品中在檢測限值(3 μM )或高於該檢測限值意外地不可檢測到硫代硫酸鈉。

實例5：藉由二維 UPLC 分析抗原流體 基於陰離子交換及粒徑篩析層析分離之二維UPLC方法用於分析含有由如實例1中所述之處理產生之抗原流體的類病毒顆粒(VLP)。

所用層析之第一階段係陰離子交換層析，且帶負電之物質與管柱結合(層析圖中之0-2.67分鐘)，且然後藉由增加梯度中之氯化鈉濃度溶析。

所用層析之第二階段係粒徑篩析(層析圖中之2.67-15分鐘)，其中切換閥且自第一維陰離子交換注入至粒徑篩析管柱上。粒徑篩析管柱溶析陰離子交換溶析液之混合物。

材料及方法 A．試劑及材料 1. 1 M Tris，pH 7.4，於水中，分子生物級 2. 5 M水中之NaCl，分子生物級 3. 純化水 - 使用18 M MΩcm或更大之電阻率 4. 陰離子交換管柱 - 管柱體積0.1 mL，具有適於結合VLP (大孔或非多孔材料)之四級胺官能基 5. 粒徑篩析管柱- 管柱體積1.75 mL，孔徑為450 Å 6. 10 N NaOH，試劑級

B．溶液 1. 50 mM Tris，pH 8：合併50 mL 1 M Tris (pH 7.4)與900 mL水。用10 N NaOH調節pH至8，稀釋至1000 mL，且經由0.22 µm過濾器過濾。 2. 50 mM Tris、2M NaCl，pH 8：合併50 mL 1 M Tris (pH 7.4)及400 mL 5 M NaCl與300 mL水。用10 N NaOH調節pH至8，稀釋至1000 mL，且經由0.22 µm過濾器過濾。

C. 製程參考溶液中之PCV2 1. 經由0.22 µm PES過濾器過濾在不活化之前獲得之抗原流體。

D. PCV2預不活化或不活化之抗原流體測試溶液 1. 經由0.22 µm PES過濾器過濾抗原流體。

E. 2D - UPLC層析設備及條件 1. 層析之第一維 a. 流速：0.6 mL/min b. 注入體積：20 µL c. 系統體積：400 µL d. 管柱：0.1 mL管柱體積，四級胺管柱 e. 溫度：室溫 f. 檢測：螢光發射(激發280 nm及發射330 nm) g. 梯度：以0.6 mL/min之流速穿過陰離子交換管柱驅動0分鐘時初始100% 50 mM Tris (pH 8)至1分鐘時97.5% 50 mM Tris (pH 8)及2.5% 50 mM Tris、2 M NaCl (pH 8)且最終2分鐘時至10% 50 mM Tris (pH 8)及90% 50 mM Tris、2M NaCl (pH 8)的多步驟梯度方法。 2. 層析之第二維 a. 流速：0.3 mL/min b. 來自第一維之注入：50 µL c. 管柱：粒徑篩析管柱，管柱體積為1.75 mL且孔徑為450 Å d. 檢測：螢光發射(激發280 nm及發射330 nm) e. 等度梯度：95% 50 mM Tris，pH 8：5% 50 mM Tris (pH 8)、2M NaCl 3. 典型分析次序 a. 注入5個PCV2參考溶液之2倍連續稀釋物 b. 注入1 - 15個樣品 c. 注入5個PCV2參考溶液之2倍連續稀釋物 4. 自第1維切換至第2維時間：2.67分鐘(此切換時間取決於系統體積，在此情形下其係400 µL) 5. 藉由對峰面積積分及取該等峰面積之比率來計算下文列出之峰比率。使用該2維UPLC分析由桿狀病毒表現系統產生之VLP (ORF2)產物，在所得層析圖中可看到不同之突出峰： - 層析圖中0-1分鐘之峰，在下文中亦稱為「峰A」，表示在pH 8下不與陰離子交換管柱結合之成分(即pH8下中性或陽離子成分，例如帶正電之蛋白質及/或細胞培養組分) - 層析圖中7-8分鐘之峰，下文亦稱為「峰B」，表示關注之VLP (ORF2)抗原 - 層析圖中8.5-9.5分鐘之峰，下文亦稱為「峰C」，表示IgG(150 kDa)至尿嘧啶(0.1 kDa)大小之範圍內的成分。

發現與上游製程樣品相比，如實例1中所述之下游處理(即10倍濃縮及連續滲濾)後獲取之樣品的10倍稀釋物顯示峰A平均減少99.2%，且峰C減少42%。此外，儘管發現峰A及C減少，但觀察到峰B增加。

令人驚訝的是，發現如實例1中所述之下游處理後獲取之樣品的峰比率(峰A/B及峰C/B)對於峰A/B僅為0.3 (對於3次重複，標準偏差為0.1)且對於峰C/B為0.7 (對於3次重複，標準偏差為0.2)。

進一步發現，在如實例1中所述之下游處理(即，10倍濃縮及連續滲濾)後獲取之樣品中，聚集中沒有增加或溶液中存在較大尺寸之物質。溶液中尺寸較大之物質的聚集或存在未增加。此觀察結果係令人驚訝的，由於聚集對濃度之依賴性，將預計在粒徑篩析層析(SEC)上觀察到該濃縮樣品中較大物質顯著增加。

實例6：游離胺基酸之量化 應用在昆蟲細胞培養基及用過之培養基中定量游離胺基酸之習用方法用於測定如實例1中所述製造之抗原流體中胺基酸的濃度。

簡言之，將樣品中之蛋白質用三氯乙酸(TCA)沈澱且用離心去除。將來自TCA沈澱之上清液用氫氧化鈉中和，且添加正纈胺酸作為內標準品。然後在UHPLC之注射迴路中用鄰苯二醛(OPA)及巰基丙酸(MPA)衍生樣品，然後將其注入反相管柱上，藉由338 nm下之UV吸光度定量。基於標準參照樣品(外標)之層析圖，測定抗原流體中包括之20種常見胺基酸(即20種遺傳編碼之胺基酸)的濃度。

量測在如實例1中所述之下游處理(即，10倍濃縮及連續滲濾)之後獲取之若干樣品的胺基酸濃度，並考慮藉由添加佐劑及P-鹽水通常隨後稀釋該等樣品，發現/確定最終產品(疫苗)中特定胺基酸之特徵濃度在以下範圍內：色胺酸：0.1-0.7 µM；麩醯胺酸：0.7-2.4 µM；甲硫胺酸：0.5-3.2 µM；精胺酸：1.4-4.7 µM；蘇胺酸： 1.6-8.0 µM；離胺酸：4.0-12.2 µM。

就此而言，最終產品(疫苗)中該等胺基酸之典型平均濃度亦經測定在以下範圍內：色胺酸：0.2-0.6 µM；麩醯胺酸：0.8-2.2 µM；甲硫胺酸：0.8-2.2 µM；精胺酸：1.6-4.3 µM；蘇胺酸： 2.4-6.3 µM；離胺酸：4.4-11.2 µM。

總之，自如實例4-6中闡述之分析獲得之結果顯示，如實例1中所述之方法提供具有特定固有性質之產品，其中每一者可有助於如實例2及3中所述之測試及研究的有益結果。在序列表中： SEQ ID NO: 1對應於PCV2a ORF2蛋白之序列，且 SEQ ID NO: 2對應於PCV2b ORF2蛋白之序列；如本文所提及之「PCV2b ORF2蛋白」特別地係關於所謂「突變PCV2b」之ORF2蛋白，其亦被視為屬基因型d。

本揭示內容尤其含有以下項目： 1. 一種製造包含重組蛋白之免疫原組合物的方法，其中該方法包含以下步驟： (a) 提供含有以下之混合物： - 第一液體，及 - 重組蛋白及/或包含複數個該重組蛋白之四級結構， (b) 藉由自由步驟(a)產生之該混合物去除該第一液體之一部分濃縮該混合物中之該重組蛋白及/或該等四級結構，及 (c) 藉由連續滲濾處理自步驟(b)產生之該溶液。

2. 如項目1之方法，其中該連續滲濾係以第二液體連續滲濾，其中該第二液體不同於該第一液體。

3. 如項目1或2之方法，其中步驟(a)之該混合物另外含有或進一步包含 - 包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體，其中該載體已由不活化劑不活化，及/或 - 不活化劑，其由中和劑中和，及/或 - 中和劑。

4. 如項目3之方法，其中在步驟(c)中，藉由連續滲濾處理自步驟(b)產生之該溶液，使得製程溶液中該經中和之不活化劑之濃度及/或該中和劑之濃度降低。

5. 一種製造包含重組蛋白之免疫原組合物的方法、特別地如項目1至4中任一項之方法，其中該方法包含以下步驟： (a)(i) 提供含有以下之混合物： - 第一液體， - 重組蛋白及/或包含複數個該重組蛋白之四級結構，及 - 包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體； (ii) 藉由向步驟(i)之該混合物中添加不活化劑不活化該載體； (iii) 藉由向自步驟(ii)產生之該混合物中添加中和劑中和該不活化劑； (b) 藉由自由步驟(a)(iii)產生之該混合物去除該第一液體之一部分濃縮該混合物中之該重組蛋白及/或該等四級結構，及 (c) 藉由連續滲濾處理自步驟(b)產生之該溶液，使得製程溶液中該經中和之不活化劑之濃度及/或該中和劑之濃度降低。

6. 如項目1至5中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該第一液體之一部分自該混合物之去除係由用至少一個過濾器過濾該混合物組成或包含用至少一個過濾器過濾該混合物，其中該至少一個過濾器較佳包含濾膜。

7. 如項目3至6中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該濃縮包含 - 將該混合物進料至包含至少一個過濾器之過濾器系統中，其中該至少一個過濾器包含濾膜，該濾膜具有允許該經中和之不活化劑及/或該中和劑穿過、同時保留總體流中之該重組蛋白及/或該等四級結構的膜孔徑，及 - 排出包含該經中和之不活化劑及/或該中和劑之滲透物。

8. 如項目3至7中任一項之方法，其中在步驟(c)中，該連續滲濾包含 - 將該溶液進料至包含至少一個過濾器之過濾器系統中，其中該至少一個過濾器包含濾膜，該濾膜具有允許該經中和之不活化劑及/或該中和劑穿過、同時保留總體流中之該重組蛋白及/或該等四級結構的膜孔徑，及 - 排出包含該經中和之不活化劑及/或該中和劑之滲透物， - 以等於該滲透物流之速率向該總體流添加第二液體，其中該第二液體不同於該第一液體。

9. 如項目6至8中任一項之方法，其中該至少一個過濾器係至少一個平板過濾器及/或至少一個中空纖維過濾器，且其中該至少一個平板過濾器較佳係至少一個卡匣式過濾器。

10. 如項目6至9中任一項之方法，其中該至少一個過濾器係2-8個過濾器、較佳5-7個過濾器，及/或其中該至少一個過濾器中之每一者具有約16-26 m² 、較佳約20-22 m² 之總過濾面積。

11. 如項目6至10中任一項之方法，其中該濾膜具有小於該重組蛋白及/或該等四級結構之平均孔徑，及/或其中該濾膜具有介於約200 kDa與約500 kDa之間之分子量截止值。

12. 如項目6至11中任一項之方法，其中該濾膜由選自由以下組成之群之材料組成或包含該材料：聚醚碸、纖維素水合物、再生纖維素、穩定纖維素、交聯纖維素、交聯纖維素水合物、乙酸纖維素、聚醯胺、聚胺基甲酸酯、聚丙烯、聚碸、聚碳酸酯、耐綸、聚醯亞胺及其組合，及/或其中該濾膜較佳由聚醚碸組成或包含聚醚碸，或其中該濾膜視情況係基於穩定纖維素之膜。

13. 如項目7至12中任一項之方法，其中在步驟(b)中及在步驟(c)中，採用相同過濾器系統。

14. 如項目5至13中任一項之方法，其中 - 步驟(iii)係在第一容器中實施，且其中由中和該不活化劑產生之該混合物自該第一容器轉移至與過濾器系統連接之第二容器，且其中該混合物自該第一容器轉移至該第二容器後，關閉該第一容器與該第二容器之間之閥，且向空的第一容器充滿該第二液體， - 在步驟(b)中，使該混合物循環穿過該第二容器及該過濾器系統，直至濃縮完成，且 - 在步驟(c)中，打開該第一容器與該第二容器之間之該閥，且將該第二液體自該第一容器連續地引導至該第二容器，同時該混合物循環穿過該過濾器系統及該第二容器。

15. 如項目1至14中任一項之方法，其中該第一液體包含細胞培養基之一部分或由細胞培養基組成，且其中該細胞培養基較佳係昆蟲細胞培養基。

16. 如項目1至15中任一項之方法，其中自步驟(a)產生之該混合物的體積係1000 L至10000 L、較佳2000 L至8000 L、且最佳3000 L至5000 L。

17. 如項目1至15中任一項之方法，其中在步驟(b)中，與自步驟(a)產生之該混合物之該體積相比，該重組蛋白及/或該等四級結構最終濃縮至少5X、較佳至少8X、更佳9X至11X。

18. 如項目2至17中任一項之方法，其中該第二液體係緩衝溶液、較佳P-鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。

19. 如項目8至18中任一項之方法，其中在步驟(c)中，添加至該總體流中之該第二液體的總體積係自步驟(b)產生之該溶液之體積的至少5X、較佳至少7X、更佳至少9X，及/或其中添加至該總體流中之該第二液體的總體積最佳係大約自步驟(a)產生之該混合物之該體積。

20. 如項目1至19中任一項之方法，其中該方法進一步包含以下步驟： (d) 混合步驟(c)後保留之該混合物與選自由醫藥上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群之又一組分，且其中自該混合產生之該溶液中該重組蛋白之濃度及/或該等四級結構之濃度較佳係大約自步驟(a)產生之該混合物中該重組蛋白及/或該等四級結構之濃度。

21. 如項目1至20中任一項之方法，其中用於步驟(a)之該混合物可藉由包含以下步驟之程序獲得： (1) 允許用包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體感染培養物中之易感細胞，其中該重組蛋白由該載體表現， (2)其後自該細胞培養基中回收該重組蛋白及/或包含複數個該重組蛋白之四級結構，其中較佳經由分離步驟、較佳包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾將細胞碎片與該重組蛋白及/或該等四級結構分離，其中該至少一個過濾器較佳具有比該重組蛋白及/或含有複數個該重組蛋白之四級結構大之孔徑，特別地具有約1至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm之孔徑。

22. 如項目21之方法，其中該分離步驟包括或由以下組成： - 經由一或多個孔徑為約2 μm至約15 μm之過濾器之微過濾，及/或 - 經由一或多個孔徑為約0.8 μm至約1.0 μm之過濾器之微過濾。

23. 如項目21或22之方法，其中較佳在該重組蛋白由該載體表現時，將步驟(1)中之該細胞培養物維持於22-32℃，及/或其中步驟(2)中之該回收係在用該載體接種該等細胞後5至8天、較佳8天發生。

24. 如項目1至23中任一項之方法，其中該重組蛋白係PCV2 ORF2蛋白，其較佳包含與SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列或由該序列組成。

25. 如項目1至24中任一項之方法，其中該等四級結構係類病毒顆粒。

26. 如項目3至25中任一項之方法，其中該載體係重組病毒、較佳桿狀病毒，及/或其中該核酸序列係DNA序列。

27. 如項目3至26中任一項之方法，其中該不活化劑係氮丙啶化合物、較佳二乙烯亞胺(BEI)，及/或其中該不活化劑相對於該載體以莫耳過量添加。

28. 如項目3至27中任一項之方法，其中該中和劑係硫代硫酸鈉及/或其中該中和劑相對於該不活化劑以莫耳過量添加。

29. 如項目5至28中任一項之方法，其中在步驟(iii)中，與步驟(ii)中添加之不活化劑之該量相比，添加等效量之該中和劑。

30. 如項5至29中任一項之方法，其中步驟(c)後保留之該混合物包含濃度小於自步驟(iii)產生之該中和劑之濃度之一千倍的該不活化劑。

31. 如項目1至30中任一項之方法，其中與未經歷該方法之步驟(b)之該濃縮及步驟(c)之該連續滲濾的免疫原組合物混合物相比，由該方法產生之該免疫原組合物的殺病毒活性降低至少20%，及/或其中當活病毒與藉由該方法製造之該免疫原組合物特別地於室溫下混合4小時或4小時以上時，該免疫原組合物導致小於1 log TCID₅₀ /mL活病毒、較佳小於0.7 log TCID₅₀ /mL活病毒之損失。

32. 如項目1至31中任一項之方法，其中該方法進一步包含組合步驟(c)及/或步驟(d)後保留之該混合物與至少一種額外抗原的步驟。

33. 如項目31或32之方法，其中該活病毒或該至少一種額外抗原係豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒。

34. 一種免疫原組合物，其可藉由如項目1至33中任一項之方法獲得。

35. 如項目34之免疫原組合物，其中該免疫原組合物可藉由如項目28至33中任一項之方法獲得，且其中步驟(c)後保留之該混合物包含小於3 µM硫代硫酸鈉。

36. 如項目34之免疫原組合物，其中該免疫原組合物可藉由如項目28至33中任一項之方法獲得，且其中自步驟(d)產生之該免疫原組合物實質上不含硫代硫酸鈉。

37. 一種免疫原組合物、特別地如項目34至36中任一項之免疫原組合物，其包含： - 重組PCV2 ORF2蛋白，其較佳包含與SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列或由該序列組成，及 - 1-10 µM L-精胺酸及/或1-10 µM L-離胺酸，且其中較佳地，該免疫原組合物實質上不含經中和之不活化劑及/或實質上不含中和劑。

38. 一種免疫原組合物、特別地如項目34至37中任一項之免疫原組合物，較佳可藉由包含步驟(d)之任何該方法獲得，其中該免疫原組合物包含重組PCV2 ORF2蛋白，其較佳包含與SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列或由該序列組成，及 0.1-1 µM L-色胺酸；及/或 0.1-3 µM L-麩醯胺酸；及/或 0.2-4 µM L-甲硫胺酸；及/或 1-10 µM L-精胺酸；及/或 1-10 µM L-蘇胺酸；及/或 1-15 µM L-離胺酸。

39. 如項目34至38中任一項之免疫原組合物，其中該免疫原組合物包含 0.1-0.7 µM L- 色胺酸；及/或 0.7-2.4 µM L-麩醯胺酸；及/或 0.5-3.2 µM L-甲硫胺酸；及/或 1.4-4.7 µM L-精胺酸；及/或 1.6-8.0 µM L-蘇胺酸；及/或 4.0-12.2 µM L-離胺酸。

40. 如項目39之免疫原組合物，其中該免疫原組合物包含 0.2-0.6 µM L-色胺酸；及/或 0.8-2.2 µM L-麩醯胺酸；及/或 0.8-2.2 µM L-甲硫胺酸；及/或 1.6-4.3 µM L-精胺酸；及/或 2.4-6.3 µM L-蘇胺酸；及/或 4.4-11.2 µM L-離胺酸。

41. 如項目34至40中任一項之免疫原組合物，其中該組合物包含 0.7-2.4 µM L-麩醯胺酸及4.0-12.2 µM L-離胺酸。

42. 如項目34至41中任一項之免疫原組合物，其中該組合物包含 0.8-2.2 µM L-麩醯胺酸及4.4-11.2 µM L-離胺酸。

43. 一種免疫原組合物、特別地如項目34至42中任一項之免疫原組合物，較佳可藉由包含步驟(d)之任何該方法獲得，其中該免疫原組合物當於室溫下經受二維(2D)超性能液相層析(UPLC)時展現峰A面積對峰B面積之比率為0.2-0.4及/或峰C面積對峰B面積之比率為0.5-0.9，其中該2 D UPLC包含系統體積為400 µL之層析之第一維，其中 - 將包含該免疫原組合物之樣品注入陰離子交換管柱中，其中0.1 mL管柱體積填充有適於結合病毒樣顆粒之四級胺官能化材料，及 - 以0.6 mL/min之流速穿過該陰離子交換管柱驅動0分鐘時初始100% 50 mM Tris (pH 8)至1分鐘時97.5% 50 mM Tris (pH 8)及2.5% 50 mM Tris、2 M NaCl (pH 8)且最終2分鐘時至10% 50 mM Tris (pH 8)及90% 50 mM Tris、2M NaCl (pH 8)的多步驟梯度方法，且其中在2.67 min之滯留時間時，其自層析之該第一維切換至層析之第二維，其中以0.3 mL/min之流速驅動層析之該第一維之50 µL溶析液穿過具有1.75 mL管柱體積與450 Å之孔徑的粒徑篩析管柱，且其中藉由監測330 nm之波長下之螢光發射及280 nm之激發波長下之發射記錄層析圖，且其中峰A面積係該層析圖中0-1分鐘之滯留時間的最高峰之峰面積；峰B面積係該層析圖中7-8分鐘之滯留時間的最高峰之峰面積；峰C面積係該層析圖中8.5-9.5分鐘之滯留時間的最高峰之峰面積。

44. 如項目34至43中任一項之免疫原組合物，其中該免疫原組合物實質上不含中和劑、較佳實質上不含硫代硫酸鈉。

45. 如項目34至44中任一項之免疫原組合物，其中該免疫原組合物進一步包含減毒之活病毒、較佳減毒之豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒或減毒之活細菌。

46. 如項目34至45中任一項之免疫原組合物，其中在投與一個劑量之該免疫原組合物後，該免疫原組合物誘導針對衍生該重組蛋白之胺基酸序列的病原體、較佳針對PCV2之保護性免疫反應。

47. 如項目45或46中任一項之免疫原組合物，其中在投與一個劑量之該免疫原組合物後，該免疫原組合物誘導針對PRRS之保護性免疫反應。

48. 一種套組，其包含含有如項目34至47中任一項之免疫原組合物的容器。

49. 一種套組，其包含含有藉由如項目1至33中任一項之方法製造之免疫原組合物的容器。

50. 如項目48或49之套組，其進一步包含至少一個額外容器，該容器含有至少一種選自由減毒之活病毒、較佳減毒之PRRS病毒以及減毒之活細菌組成之群的額外抗原。

51. 如項目34至50中任一項之免疫原組合物及/或如項目48至50中任一項之套組，其進一步包含一或多種經減毒或不活化之非PRRSV病原體或其抗原性物質。

52. 如項目34至47及51中任一項之免疫原組合物及/或如項目48至50中任一項之套組，其用作藥劑，較佳用作疫苗。

53. 如項目34至47及51至52中任一項之免疫原組合物及/或如項目48至52中任一項之套組，其用於動物中之以下之方法中 -誘導針對至少一種病原體之保護性免疫反應及/或 -減少至少一種病原體感染之一或多個臨床體徵其中該至少一種病原體較佳選自由PCV2、PRRSV、非PRRSV病原體及其組合組成之群。

54. 如項目51之免疫原組合物及/或套組，其特別地根據項目52或53使用，其中該等非PRRSV病原體係選自豬肺炎黴漿菌、僞狂犬病病毒、豬流行性感冒病毒、豬小病毒、傳染性胃腸炎病毒、大腸桿菌、丹麥桿菌、支氣管炎博德特菌、豬霍亂沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德菌、豬鏈球菌及胸膜肺炎放綫桿菌。

下列圖式形成本說明書之一部分且包括其以進一步闡釋本發明之某些態樣。可藉由參照該等圖式中之一或多者結合本文所示具體實施例之詳細說明來更好地理解本發明。圖1提供根據本發明之實例性方法的示意性概述。

Claims

一種製造包含重組蛋白之免疫原組合物的方法，其中該方法包含以下步驟： (a) 提供含有以下之混合物：第一液體，及重組PCV2 ORF2蛋白及/或包含複數重組PCV2 ORF2蛋白之類病毒顆粒， (b) 藉由自步驟(a)產生之混合物去除一部分該第一液體而濃縮該混合物中之該重組PCV2 ORF2蛋白及/或該等類病毒顆粒，及 (c) 藉由連續滲濾處理步驟(b)產生之溶液。
如請求項1之方法，其中步驟(a)之混合物另外含有或進一步包含包含編碼該重組PCV2 ORF2蛋白之核酸序列的載體，其中該載體已由不活化劑不活化，及/或不活化劑，其已由中和劑中和，及/或中和劑，及/或其中在步驟(c)中，藉由連續滲濾處理步驟(b)產生之溶液，使得製程溶液中該經中和之不活化劑之濃度及/或該中和劑之濃度降低。
一種製造包含重組PCV2 ORF2蛋白之免疫原組合物的方法，特別如請求項2之方法，其中該方法包含以下步驟： (a)(i) 提供含有以下之混合物：第一液體，重組PCV2 ORF2蛋白及/或包含複數重組PCV2 ORF2蛋白之類病毒顆粒，及包含編碼該重組蛋白之核酸序列的載體； (ii) 藉由向步驟(i)之混合物中添加不活化劑不活化該載體； (iii) 藉由向步驟(ii)產生之混合物中添加中和劑中和該不活化劑； (b) 藉由自步驟(a)(iii)產生之混合物去除一部分該第一液體而濃縮該混合物中之該重組PCV2 ORF2蛋白及/或該等類病毒顆粒，及 (c) 藉由連續滲濾處理步驟(b)產生之溶液，使得製程溶液中該經中和之不活化劑之濃度及/或該中和劑之濃度降低。
如請求項1至3中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該第一液體之一部分自該混合物去除係由用至少一個過濾器過濾該混合物組成或包含用至少一個過濾器過濾該混合物，其中該至少一個過濾器較佳包含濾膜。
如請求項2至4中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該濃縮包含將該混合物進料至包含至少一個過濾器之過濾器系統中，其中該至少一個過濾器包含濾膜，該濾膜具有膜孔徑允許該經中和之不活化劑及/或該中和劑穿過，而保留總體流中該重組PCV2 ORF2蛋白及/或該等類病毒顆粒，及排出包含該經中和之不活化劑及/或該中和劑之滲透物，及/或其中在步驟(c)中，該連續滲濾包含將該溶液進料至包含至少一個過濾器之過濾器系統中，其中該至少一個過濾器包含濾膜，該濾膜具有膜孔徑允許該經中和之不活化劑及/或該中和劑穿過，而保留總體流中該重組PCV2 ORF2蛋白及/或該等類病毒顆粒，及排出包含該經中和之不活化劑及/或該中和劑之滲透物，以等於該滲透物流之速率向該總體流添加第二液體，其中該第二液體不同於該第一液體。
如請求項4或5之方法，其中該至少一個過濾器係至少一個平板過濾器及/或至少一個中空纖維過濾器，且其中該至少一個平板過濾器較佳係至少一個卡匣式過濾器，及/或其中該至少一個過濾器係2-8個過濾器、較佳5-7個過濾器，及/或其中該至少一個過濾器各具有約16-26 m² 、較佳約20-22 m² 之總過濾面積，及/或其中該濾膜具有平均孔徑小於該重組PCV2 ORF2蛋白及/或該等類病毒顆粒，及/或其中該濾膜具有介於約200 kDa與約500 kDa之間之分子量截止值，及/或其中該濾膜由選自由以下組成之群之材料組成或包含選自由以下組成之群之材料：聚醚碸、纖維素水合物、再生纖維素、穩定纖維素、交聯纖維素、交聯纖維素水合物、乙酸纖維素、聚醯胺、聚胺基甲酸酯、聚丙烯、聚碸、聚碳酸酯、耐綸(nylon)、聚醯亞胺，及其組合，及/或其中該濾膜較佳由聚醚碸組成或包含聚醚碸，或其中該濾膜視情況係基於穩定纖維素之膜。
如請求項5或6之方法，其中在步驟(b)中及在步驟(c)中，利用相同過濾器系統。
如請求項3至7中任一項之方法，其中步驟(iii)係在第一容器中實施，且其中由中和該不活化劑產生之混合物自該第一容器轉移至與過濾器系統連接之第二容器，且其中該混合物自該第一容器轉移至該第二容器後，關閉該第一容器與該第二容器之間之閥，且向空的第一容器充滿該第二液體，在步驟(b)中，使該混合物循環穿過該第二容器及該過濾器系統，直至該濃縮完成，且在步驟(c)中，打開該第一容器與該第二容器之間之閥，且將該第二液體自該第一容器連續地引導至該第二容器，同時該混合物循環穿過該過濾器系統及該第二容器。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該第一液體包含細胞培養基之一部分或由細胞培養基組成，且其中該細胞培養基較佳係昆蟲細胞培養基，及/或其中步驟(a)產生之混合物的體積係由1000 L至10000 L、較佳由2000 L至8000 L、且最佳由3000 L至5000 L，及/或其中在步驟(b)中，與步驟(a)產生之該混合物的體積相比，該重組PCV2 ORF2蛋白及/或該等類病毒顆粒最終濃縮至少5X、較佳至少8X、更佳9X至11X。
如請求項5至9中任一項之方法，其中該第二液體係緩衝溶液、較佳P-鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，及/或其中在步驟(c)中，添加至該總體流中該第二液體的總體積係步驟(b)產生之溶液體積的至少5X、較佳至少7X、更佳至少9X，及/或其中添加至該總體流中該第二液體的總體積最佳係大約步驟(a)產生之混合物之體積。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該方法進一步包含以下步驟 (d) 混合步驟(c)後保留之混合物與另一選自由醫藥上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群之組分，且其中該混合產生之溶液中該重組PCV2 ORF2蛋白之濃度及/或該等類病毒顆粒之濃度較佳係大約步驟(a)產生之混合物中該重組PCV2 ORF2蛋白及/或該等類病毒顆粒之濃度。
如請求項1至11中任一項之方法，其中該重組PCV2 ORF2蛋白包含與SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列或由該序列組成。
如請求項2至12中任一項之方法，其中該載體係重組病毒，較佳為桿狀病毒，及/或其中該核酸序列係DNA序列，及/或其中該不活化劑係氮丙啶化合物，較佳為二乙烯亞胺(BEI)，及/或其中該不活化劑相對於該載體以莫耳過量添加，及/或其中該中和劑係硫代硫酸鈉及/或其中該中和劑相對於該不活化劑以莫耳過量添加。
如請求項1至13中任一項之方法，其中與未經歷該方法之步驟(b)之濃縮及步驟(c)之連續滲濾的免疫原組合物混合物相比，由該方法產生之免疫原組合物的殺病毒活性降低至少20%，及/或其中當活病毒與藉由該方法製造之免疫原組合物特別於室溫混合4小時或4小時以上時，該免疫原組合物導致小於1 log TCID₅₀ /mL活病毒、較佳小於0.7 log TCID₅₀ /mL活病毒之損失。
如請求項1至14中任一項之方法，其中該方法進一步包含組合步驟(c)及/或步驟(d)後保留之混合物與至少一種另外抗原的步驟，及/或其中該至少一種另外抗原較佳係豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒。
一種免疫原組合物，其可藉由如請求項1至15中任一項之方法獲得。
一種免疫原組合物，特別如請求項16之免疫原組合物，其包含：重組PCV2 ORF2蛋白，其較佳包含與SEQ ID NO:1及/或SEQ ID NO:2之序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.5%或100%序列一致性的序列或由該序列組成，及 1-10 µM L-精胺酸及/或1-10 µM L-離胺酸且其中較佳地，該免疫原組合物實質上不含經中和之不活化劑及/或實質上不含中和劑。
如請求項16或17之免疫原組合物，其中該免疫原組合物進一步包含減毒之活病毒、較佳減毒之豬生殖及呼吸症候群(PRRS)病毒、或減毒之活細菌，及/或其中在投與一個劑量之該免疫原組合物後，該免疫原組合物誘導針對PCV2之保護性免疫反應，及/或其中在投與一個劑量之該免疫原組合物後，該免疫原組合物誘導針對PRRS病毒之保護性免疫反應。
一種套組，其包含含有如請求項16至18中任一項之免疫原組合物的容器，且其中該套組較佳包含至少一個另外容器，該容器含有至少一種選自由減毒之活病毒、較佳減毒之PRRS病毒及減毒之活細菌組成之群的另外抗原。
如請求項16至18中任一項之免疫原組合物及/或如請求項19之套組，其用作藥劑、較佳用作疫苗。
如請求項16至18及20中任一項之免疫原組合物及/或如請求項19或20之套組，其用於動物之以下之方法中誘導針對至少一種病原體之保護性免疫反應及/或減少至少一種病原體感染之一或多個臨床體徵其中該至少一種病原體較佳選自由PCV2、PRRSV、非PRRSV病原體及其組合組成之群。