JP5022906B2 - カスパーゼ−2/−6二重阻害剤として有用な新規ペプチドおよびそれらの生物学的適用 - Google Patents
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Description
本発明は、分子モデリング、医薬生物学および化学の領域内にあり、プロアポトーシス性のカスパーゼ−2(Nedd−2;Ich−1)を阻害し、かつ/または、プロアポトーシス性のカスパーゼ−6(Mch2)を阻害し、カスパーゼ−2および/またはカスパーゼ−6の活性が関係する疾患および損傷を治療するために有用である、新規化合物およびこの化合物を含む医薬組成物に関する。
配列番号1:VDEAD
配列番号2:LDEGD
配列番号3:VDEGD
配列番号4:VDESD
配列番号5:LDEKD
配列番号6:FDESD
配列番号7:LDEAD
上記ペプチドは、有利には、N末端および/またはC末端の保護基を有する。
・n1=0〜20
・n1=0である時、MはHであり、
・Aは、C1−C20アルキル、1以上の縮合環および/またはヘテロ環であり、
・Aは、Hと異なる場合、かつ、n1が2より大きい場合、飽和または不飽和であり、場合によっては、H、OH、ORa、(CH2)n1OH、(CH2)n1ORa、COOH、COORa、(CH2)n1COOH、(CH2)n1COORa、C1−C3アルキルまたはシクロアルキル、(CH2)n1−アルキル、CO−NH−アルキル、Ar、(CH2)n1−Ar、CO−NH−Ar、ハロゲン、CF3、SO3H、(CH2)xPO3H2、B(OH)2、NO2、SO2NH2、SO2NHRa(x=0、1または2;RaはC1−C3アルキルであり、Arは置換されてもよいアリールまたはヘテロアリール基である)等の1以上の基によって置換されるか、または
・Aは、1以上のアミノ酸残基であるか、または
・Aは、発色団、蛍光性、発光性、吸収性(UVから近IRまで)の群、放射性、金属性の粒子、例えば、電子顕微鏡法に用いられるもの、比色分析の群、ビオチン/ストレプトアビジン/ニュートラアビジン・ラベリングシステム、または類似体を示す。
・低酸素虚血(H−I)(低酸素症/低血糖を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状態(脳、腎臓、心不全等)を含む病的状態;
・脳の低酸素虚血(H−I)(低酸素症/低血糖を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状態(脳、腎臓、心不全等)を含む病的状態;
・ニューロン死、特に全体性または限局性のH−I(低酸素症/低血糖を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様状況(脳、腎臓、心不全等)におけるもの;
・ニューロン死、特に、成人、胎児または周産期のH−I(低酸素症/低血糖を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状況(脳、腎臓、心不全等)におけるもの;
・ニューロン死、特に、一過性または永続性のH−I(低酸素症/低血糖を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様の状況(脳、腎臓、心不全等)におけるもの;
・ニューロン死、特に、再灌流の状況を伴うまたは伴わないH−I(低酸素症/低血糖を伴うまたは伴わない虚血)損傷および卒中様状況(脳、腎臓、心不全等)の脳損傷におけるもの;
・ニューロン死、特に、成人、胎児または周産期H−Iにおける中大脳動脈閉塞症(Middle Cerebral Artery Occlusion:MCAO)におけるもの;
・ニューロン死、特に、下記病的事象の少なくとも1つが結合した場合のもの;全体性または限局性の、一過性または永続性の、成人、胎児または周産期の、脳レベルまたは体全体のレベルにおける、再灌流を伴うまたは伴わない、H−I(低酸素/低血糖を伴うまたは伴わない虚血);
・ニューロン死、特に、下記脳損傷の少なくとも1つの場合のもの;
・ニューロン死、特に、下記周産期脳損傷の少なくとも1つの場合もの。
(a)本発明は、ペンタペプチド−カスパーゼ−2タンパク質複合体の分子ドッキングであって、(i)カスパーゼ−2との接触を提供するのに必要とされるアミノ酸残基を識別することおよび(ii)これらの配列とカスパーゼ−2との間の相互作用の性質を規定することを可能にするものに関する;
(b)本発明は、新規のペンタペプチド配列/ペンタペプチドをベースとする阻害剤であって、カスパーゼ−2との可逆的または不可逆的複合体(すなわち、より低い最少エネルギーを有する)の形成を誘導し、結果として、カスパーゼ−2活性の実験的な阻害をもたらすものの獲得に関する;
(c)本発明は、最初のペンタペプチド配列/ペンタペプチドをベースとする化合物であって、カスパーゼ−2およびカスパーゼ−6の両方の活性を阻害するが、他のカスパーゼまたはプロテアーゼ(カルパイン、グランザイムB)を阻害しないものの獲得に関する;
(d)本発明は、最初のペンタペプチド配列またはペンタペプチドをベースとする化合物であって、カスパーゼ−6の阻害をもたらすものの獲得に関する;
(e)本発明は、最初のペンタペプチド配列またはペンタペプチドをベースとする化合物であって、カスパーゼ−2およびカスパーゼ−6の両方の活性を同様の用量範囲で阻害するものの獲得に関する;
(f)新規カスパーゼ−2阻害剤の合理的な設計は、分子ドッキングとインビトロアッセイにおける機能的な切断とを組み合わせることによって達成され得る;
(g)限定的でない実施形態において、これらの配列は、N末端においてメチルマロニル誘導体、キノリニル誘導体に結合され得る;限定的でない実施形態において、2,6−ジフルオロフェニルエステル、2,6−ジフルオロフェノキシ、2−ブロモベンゾイロキシ、フッ素等の脱離基が、カルボキシ末端位に付加され得る;限定的でない実施形態において、アミノ酸側鎖は、細胞透過性および保持を向上させるためにメチル基等の保護基を含み得る;従前のデータに基づいて、このようなペンタペプチド配列/関連化合物は、インビトロの虚血性神経細胞死(特に、アポトーシス,Chauvierら,2005)、および脳(低酸素)虚血損傷(限局性一過性周産期H−IまたはMCAO(中大脳動脈閉塞症))を含むインビボの病的状態の阻害のための的確な鋳型である(テラプトシス SAの名の下の仏国特許出願03 06 190およびWO2004/103389);
(h)本発明は、新規カスパーゼ−2阻害剤が、心不全または心臓血管損傷の間の血流減少/低酸素症後の脳の全体的成人虚血を含めてインビボの病的状態にある脳細胞死を防止または減少させることを発見したことに関する;
(i)本発明は、血流および酸素圧が乱されている病的状態、すなわち、脳の(一過性または永続性の)限局性または全体性の虚血の間の脳細胞死を低減させるための局所(脳室内、海馬内等)送達または全身性(腹腔内、静脈内等)投与を含む新規カスパーゼ阻害剤の新しい適用に関する;
(j)本発明はまた、細胞死を伴う病状、特に、虚血および卒中様損傷を治療する方法であって、上記の医薬組成物の治療上の有効量を投与する工程を包含する方法に関する;
(k)本発明によるペプチドの有効量を含む医薬組成物は、細胞死を伴う病状、特に、H−I損傷および卒中様状況の脳損傷:例えば、全体性または限局性の、一過性または永続性の、成人、胎児、周産期の、脳または心臓レベルで発生する、再灌流を伴うまたは伴わない、H−I(低酸素/低血糖を伴うまたは伴わない虚血)またはMCAO(中大脳動脈閉塞症)を予防し、減少させかつ治療するのに特に有用である。
(II-1/方法論)
カスパーゼ−2−阻害剤の複合体は、Protein Data Bankの構造1pyoに対応する(Schweizerら,2003)。未変化体においておよび1の誘電定数で全モデルが研究された。阻害剤は、手作業的に、Biopolymer module of Accelrys(San Diego,CA)によって改変された。酵素の原子が固定され、阻害剤が、Discover moduleにより、2000ステップの共役勾配を用いてRMSが0.0001kcal/mol・Å未満になるまで最少にされた。非共有エネルギーの値(ファンデルワールス力およびクーロン力)は、Insight IIモジュールにより計算された。
図1は、上記方法論を用いた分子モデリングによって研究された一連の化合物を示す。カスパーゼ−2酵素を阻害するためのこれらの化合物の有効性は、対応する酵素−阻害剤複合体の最少エネルギー(E最少(kcal/mol))によって特徴付けられる(図1)。このエネルギーは、2つの構成要素からなる:
(i)水素結合および阻害剤と酵素残基との間の塩橋からもたらされる電気的またはクーロン的要素(Eクーロン);
(ii)阻害剤と酵素との間のファンデルワールス相互作用からもたらされる反発−誘引の要素(Eファンデルワールス)。
V1(Ac−VDESD−cho(7)、E最少=−101.2kcal/mol)によるL1の置換は、阻害剤−カスパーゼ−2複合体のより良好な安定性を可能にする。阻害剤の有効性は、S4が(i)K4(Ac−LDEKD−cho(27)、E最少=−101.2kcal/mol)、(ii)A4(Ac−LDEAD−cho、化合物(14)、E最少=−133.7kcal/mol)または(iii)G4(Ac−LDEGD−cho、化合物(26)、E最少=−135.0kcal/mol)によって置き換えられる場合に一層より大きかった。これらの観察は、それ故に、化合物(7)、(14)、(26)および(27)が、基準化合物(1)(Ac−LDESD−cho)より良好なカスパーゼ−2の阻害剤であることを示した。図4は、カスパーゼ−2の活性部位中の化合物(1)および(14)(Ac−LDEAD−cho)の重ね合わせを示す。
カスパーゼ−2酵素のより強い阻害剤を識別するために、1番目の残基のアミノ基のための異なる保護基の、阻害剤−酵素複合体の安定性に関する効果が研究された。この目的のために、異なる4つのペンタペプチド配列が用いられた:LDESD、VDVAD、LDEADおよびVDEAD。結果は、以下に示される(用いられた略語は、本明細書の末部に定義される)。
(i)スクシニル(Suc)およびマロニル(Mal)基は、アセチル基よりはるかに良好なカスパーゼ−2酵素の阻害を可能にする;
(ii)3−オキソ−3−キノリニルプロピオニル(Qop)、3−(2−キノリニル)マロニル(Qmal)およびオキサリル(Oxa)は、アセチル基より安定性に乏しい酵素−阻害剤複合体の形成をもたらす。
(i)スクシニル(Suc)およびマロニル(Mal)基は、アセチル基より安定な酵素−阻害剤複合体の形成をもたらし、それ故に、より良好なカスパーゼ−2の阻害をもたらす;
(ii)3−オキソ−3−キノリニルプロピオニル(Qop)、2−キノリニルマロニル(Qmal)、2−キノリニルカルボニル(Qco)、ベンゾイル(Bz)およびヘキサノイル(Hxa)基は、アセチル基より強力性に乏しい阻害剤をもたらす;保護されていないペンタペプチド(24)により示されるように、1番目の残基上の保護の欠如も、より安定性に乏しい酵素−阻害剤複合体の形成をもたらす;ドッキングは固定された酵素の原子により実現されることが留意されるべきである;これは、2−キノリニルカルボニル化合物(13)、(23)および(30)の最少エネルギーについて観察された正の値を説明し得る。
・1位のバリン(V1)とカスパーゼ−2の活性部位との間のより弱い相互作用;
・カルボニル(C=O)保護基と酵素との間のより弱い相互作用;
・立体的に込み合った2−キノリニルカルボニル基による不安定な酵素−阻害剤複合体。
カスパーゼ−2の阻害のD5残基の配置に関する影響を研究するために、化合物(30)(d5、E最少=+65.5kcal/mol)も研究された。そのように観察された最少エネルギー(E最少)の、化合物(13)(E最少=+38.0kcal/mol)および化合物(30)(d5、E最少=+65.5kcal/mol)の最少エネルギー(E最少)との比較は、5位のD配置が阻害剤の減少した強力性をもたらすことを明らかに示す。これは、酵素と化合物(20)(Ac−LDEAD−cho、E最少=−133.7kcal/min)および化合物(25)(Ac−LDEAD−cho、E最少=−107.8kcal/mol)との間で形成された複合体のエネルギーを比較することによって確認された。実際に、図6に示されるように、化合物(25)と酵素との間で形成された複合体は、D5カルボニルとカスパーゼ−2のシステインA155残基のチオール基との間のC−S共有結合性が奪われるだろう。さらに、このアスパラギン酸残基の側鎖と酵素との間の水素結合が失われるだろう。
化合物(22)(Z−VAD−cho、E最少=−7.6kcal/mol)および化合物(23)(Z−VD−cho、E最少=+66.6kcal/mol)により得られた結果は、これらの途切れたペプチドがより強力性に乏しいカスパーゼ−2阻害剤であることを示す。
(II-3.1/ペプチド配列)
新規カスパーゼ−2阻害剤についてのこの探索は、以下を示す。
(b)LDEAD、LDEGDおよびLDEKD配列は、VDVAD配列より大きい強力性のカスパーゼ−2阻害剤をもたらす(化合物(8)〜(14)、(10)〜(15)、(8)〜(26)および(8)〜(27)を比較して)
(c)VDESD(化合物(7)を参照)およびVDEAD(化合物(20)を参照)の配列は、VDVAD配列より良好なカスパーゼ−2酵素阻害剤を提供する。
この研究は、カスパーゼ−2の活性部位が、ペンタペプチド阻害剤の4位の種々の残基に適合し得ることを明らかに示す。例えば化合物(27)では、これは、図7に示されるように、酵素の活性部位の外側のリジン残基(K4)側鎖の位置調整によって達成される。
化合物(1)のアルデヒドまたはメチルケトン類似体(図1)の合成のための有用な手順は、しばしば、D5残基のエピマー化を引き起こす。形成された異性体の混合物は、しばしば、単離することが困難である。セクションII-2.3に示されるように、そのようにして形成されたD−エピマーは、この残基と酵素との間の水素結合および共有結合の両方の相互作用の喪失に起因してL−異性体よりも強力性に乏しい。
アセチル基の他の保護基による置換は、以下の結論および見解をもたらした:
(a)2−キノリニルカルボニル(Qco)基は、不安定な酵素−阻害剤複合体をもたらすようである(化合物(13)、(23)および(30)を参照);この観察は、厳密には、Qco−VD(Ome)VAD(Ome)−CH2O(2,6−ジフルオロフェニル)により得られた生物学的データと合致しておらず、これは、誘導された適合メカニズムが、阻害剤−カスパーゼ−2複合体の形成の間に作動しているかもしれないことを示している。アロステリックバインディングも、インシリコおよびインビトロの結果間のこの観察された相違を説明し得る;
(b)研究された保護基の中で、マロニル(Mal)が、他の基よりはるかに良好なカスパーゼ−2阻害もたらすようである(化合物(15)、E最少=−179.2kcal/molを参照)。さらに、3−メチルマロニル基(Memal、化合物(16)、E最少=−145.9kcal/mol)も、高度に安定化された酵素−ペンタペプチド複合体をもたらすようである。(16)のような化合物がエステラーゼによって対応する誘導体(15)に加水分解され、その後に、カスパーゼ−2の活性部位にバインディングし得るならば、一層より強力な阻害が観察されるだろう。それ故に、新規なカスパーゼ−2阻害剤を設計するために多くの注意はこのMemal基上に集中される。
これらの阻害剤の強力性に関する脱離基の影響を研究するために、D5残基上に種々の脱離基を有するペンタペプチドが合成され、種々の生物学的系において評価された。これらの脱離基は、それらの物理化学特性およびそれらの報告された生物学的特性(例えば、毒性、細胞透過性、保持)に従って選択された。
(i)GPは、Mに対して上記に定義された通りであり、特に、保護基、例えば、マロニル、メチルマロニル、2−キノリニルカルボニル、スクシニル、メチルスクシニル、アセチル、2−キノリニルマロニル、または、ヘテロ環、例えば、置換または無置換テトラヒドロキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロアクリジン、ベンズアゼピン、ピロリジン、モルホリン、チオモルトリン、ピペラジン、ピペリジン、ジヒドロピリジン、ベンズイミダゾール、イミダゾール、イミダゾリン、ピロール、ピロリジン、ピロリン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾール、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、ジヒドロフェナジン、ジヒドロシンノリン、ジヒドロキノキサリン、ジヒドロナフチリジン、テトラヒドロナフチリジン、ジヒドロアクリジン、インドール、イソインドール、ジヒドロインドール、インドリン、インダゾール、プリン、9,10−ジヒドロフェナントリジン、5H−ジベンゾ[b,f]アゼピン、10,11−ジヒドロ−5H−ジベンゾ[b,f]アゼピン、β−カルボリン、ピリド[4,3−b]インドール、2,3,9−トリアゾフルオレン、9−チア−2,10−ジアザアントラセン、チエノ[3,2b]ピロール、ジヒドロフェナントリン、ベンジロキシカルボニル等、水素原子、C1−20脂肪族基、アリール、置換アリール(例:4−ニトロフェニル、クマリン誘導体)、ヘテロアリール(例:2−ピリジン)、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、(CH2)nシクロアルキル、(CH2)nフェニル、(CH2)n置換フェニル(例:2,6−ジハロフェニル)、(CH2)n(1−または2−ナフチル)、(CH2)nヘテロアリールまたは(無)置換(2−、3−、4−、5−、6−、7−または8−)キノリニル、フルオレンメチルであり、
GPはまた、R、U、CO(CH2)nNH(U)、CO(CH2)nS(U)であってよく、ここで、
Uは、(無)置換(2−、3−、4−、5−、6−、7−または8−)キノリニル、C1−20直鎖または分枝鎖アルキル、(CH2)nシクロアルキル、(CH2)nフェニル、(CH2)n置換フェニル、(CH2)n(1−または2−ナフチル)、(CH2)nヘテロアリール、ビオチン、ジニトロフェニル(DNP)、ヨードアセトアミド、DTNB、COR(例:2−キノリニルカルボニル)、COOR、CO(CH2)nNH(Z)、アクリジン誘導体(赤色、黄色、オレンジ色等)、フルオレセイン誘導体(フルオレセイン、FITC、FAM(カルボキシフルオレセイン)、5−(および−6)−カルボキシナフトフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、BCECF、ナフトフルオレセイン等)、オレゴングリーン(登録商標)(2’,7’−ジフルオロフルオレセイン)染料(オレゴングリーン(登録商標)488、オレゴングリーン(登録商標)514等)、BODIPY(登録商標)(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸)染料(BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 630/665等)、Bimane、クマリン誘導体(アミノメチルクマリン(AMC)、AMCA、アミノクマリン、ジエチルアミノクマリン、ヒドロキシメチルクマリン、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、AFC等)、シアニン誘導体(フィコシアニン、アロフィコシアニン(APC)、CY3.18、CY5.18、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等)、エリトリン/フィコエリトリン誘導体(R−フィコエリトリン(PE)、B−フィコエリトリン等)、APC/PE−Cy接合体(PE−Cy5接合体、PE−Cy7接合体、APC−Cy7接合体等)、カルセイン誘導体(カルセイン、SNAFLカルセイン等)、DANS、DANSA、カスケードブルー、ルシファーイエロー、NBD、Red 613、FluorX、ローダミン誘導体(ローダミン123、ローダミン110、ローダミンB、ローダミン6A、ローダミン6G、TRITC、X−ローダミン、スルホローダミン、ローダミン Red−X、リッサミン(登録商標)ローダミンB、DHR、ローダミングリーン等)、PerCP、テキサスレッド、TruRed、Alexa Fluo(登録商標)(Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750等)、Q−DOTs(登録商標)誘導体(655、605、585、525等)、SNARF、Zenon(登録商標)誘導体(Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)350、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)488、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)555、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)594、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)647、Zenon(登録商標)アロフィコシアニン、Zenon(登録商標)ビオチン−XX、Zenon(登録商標)R−フィコエリトリン等);NBD、テキサスレッド(登録商標)、QSY(登録商標)染料(QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)35、QSY(登録商標)21)、ヘキスト(33342、33258)、DAPI、クロモマイシンA3、ミトラマイシン、SYTOX(ブルー、グリーン、オレンジ)、エチジウム、臭化エチジウム、7−AAD、TOTO染料、YOYO染料、TO−PRO染料、BOBO染料、JO−PRO染料、LO−PRO染料、PO−PRO染料、YO−PRO染料、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム(PI)、LDS751、Indo(登録商標)染料(Indo−1等)、Fluo(登録商標)染料(Fluo−3等)、DCFH、pNA、SYBRグリーンII、SyPro(オレンジ、ルビー)、EDANS、IR800、DiI、DiO、DiD、SNARF(登録商標)誘導体、Fura染料、QUIN染料、NANOGOLD粒子、NANOGOLDマレイミド、AlexaFluor FluoroNANOGOLD、AlexaFluor FluoroNANOGOLDストレプトアビジン、マラカイトグリーン、Dabcyl、Dabsyl、カスケードイエロー、ダンシル、Dapoxyl、PyMPO、ピレン、ベンゾオキサジアゾール誘導体、ストレプトアビジン−/ニュートラアビジン−ビオチン標識蛍光ミクロスフェア、ストレプトアビジンのCMNB−caged蛍光接合体、calcofluor white、ナイルレッド、Y66F、Y66H、EBFP、GFP野生型、QFP突然変異H9/P4/P9/P11/W、GFPuv、ECFP、Y66W、S65A、S65C、S65L、S65T、EGFP、EYFP、ECFP、DsRed1、DsRed2、NANOGOLD(登録商標)粒子、ストレプトアビジン−Nanogold(登録商標)、Monomaleido Nanogold(登録商標)、Mono−Sulfo−NHS−Nanogold(登録商標)、Monoamino Nanogold(登録商標)、陽/陰荷電Nanogold(登録商標)(NN、NHSN、NHSNA、NHSNS)、Non−Functionalized Nanogold(登録商標)、Monomaleido Nanogold(登録商標)、Mono−Sulfo−NHS−Nanogold(登録商標)、Monoamino Nanogold(登録商標)、Non−functional Nanogold(登録商標)、Nanogold(登録商標)接合体、Nanogold(登録商標)−ストレプトアビジン、脂質−Nanogold(登録商標)(Palmitoyl Nanogold(登録商標)、DPPE Nanogold(登録商標)、Palmitoyl Undecagold、DPPE Undecagold)、Ni−NTA−Nanogold(登録商標)、Alexa Fluor(登録商標)488 FluoroNanogold、Alexa Fluor(登録商標)594 FluoroNanogold、Fluorescein FluoroNanogold、HRP基質−Nanogold、比色分析群(pNA等)または生物発光基質、放射性同位体(例:I125、H3、S35、C14、P33、P32、Cr51、Ca45、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137、Eu152、Ra226、Xe133、テクネチウム99、タリウム201)である。制限的ではない態様において、発光する蛍光性部分は、電子を受容体(FRET)に移すか、または、切断後にクエンチされるか、または、FLIP、FLIM、FRAP技術の影響を受けやすい;
(ii)X=ハロゲン原子、OR、NHR、SR、CH2OR、CH2NHR、CH2SR、CH2ORおよびCH2Yであり、
ここで、R=アシル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、その中に、脂肪族基、アリール基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基、または、ヘテロ環基があり、Yはハロゲン原子(F、Cl、BrまたはI)またはN2であり;
Xはまた、C1−20脂肪族、置換または無置換アリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、2−ベンゾキサゾリル、置換2−オキサゾリル、(CH2)nシクロアルキル、(CH2)nフェニル、(CH2)n置換フェニル、(CH2)n(1−または2−ナフチル)、(CH2)nヘテロアリール、CH2N2、CH2Y、OH、OR、NH2、NHR、NR2、SR、COR、CO2R、CONR2、CH2OCOR、CH2O−COアリール、CH2O−C(O)置換アリール(例:2,6−ジメチルベンゾイルメチル)、CH2O−C(O)置換アリール、CH2O−C(O)ヘテロアリール、CH2O−C(O)置換ヘテロアリールまたはCH2OPOR2であってよく;
ここでR=水素原子、C1−20脂肪族基、アリール、置換アリール(例:4−ニトロフェニルまたはクマリン誘導体)、ヘテロアリール(例:2−ピリジン)、置換ヘテロアリール、シクロアルキル、ナフチル、置換ナフチル、(CH2)nシクロアルキル、(CH2)nフェニル、(CH2)n置換フェニル(例:2,6−ジハロフェニル)、(CH2)n(1−または2−ナフチル)、(CH2)nヘテロアリール、または(無)置換(2−、3−、4−、5−、6−、7−または8−)キノリニル、フルオレンメチルであり、
Yは、F、Cl、BrまたはI等のハロゲン、アリールまたはアルキルスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシを含む電気陰性脱離基、OR、SR、COOR、OP(O)R2であり、ここで、Rは、脂肪族基、アリール基、アラルキル基、カルボ環基、アルキルカルボ環基またはヘテロ環基であり、
X=Uとして、(無)置換(2−、3−、4−、5−、6−、7−または8−)キノリニル、C1−20直鎖または分枝アルキル、(CH2)nシクロアルキル、(CH2)nフェニル、(CH2)n置換フェニル、(CH2)n(1−または2−ナフチル)、(CH2)nヘテロアリール、ビオチン、ジニトロフェニル(DNP)、DTNB、アクリジン誘導体(赤色、黄色、オレンジ色等)、フルオレセイン誘導体(フルオレセイン、FITC、FAM(カルボキシフルオレセイン)、5−(および−6)−カルボキシナフトフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、BCECF、ナフトフルオレセイン等)、オレゴングリーン(登録商標)(2’,7’−ジフルオロフルオレセイン)染料(オレゴングリーン(登録商標)488、オレゴングリーン(登録商標)514等)、BODIPY(登録商標)(4,4−ジフルオロ−5,7−ジメチル−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−s−インダセン−3−プロピオン酸)染料(BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 630/650、BODIPY 630/665等)、Bimane、クマリン誘導体(アミノメチルクマリン(AMC)、AMCA、アミノクマリン、ジエチルアミノクマリン、ヒドロキシメチルクマリン、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、AFC等)、シアニン誘導体(フィコシアニン、アロフィコシアニン(APC)、CY3.18、CY5.18、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等)、エリトリン/フィコエリトリン誘導体(R−フィコエリトリン(PE)、B−フィコエリトリン等)、APC/PE−Cy接合体(PE−Cy5接合体、PE−Cy7接合体、APC−Cy7接合体等)、カルセイン誘導体(カルセイン、SNAFLカルセイン等)、DANS、DANSA、カスケードブルー、ルシファーイエロー、NBD、Red 613、FluorX、ローダミン誘導体(ローダミン123、ローダミン110、ローダミンB、ローダミン6A、ローダミン6G、TRITC、X−ローダミン、スルホローダミン、ローダミン Red−X、リッサミン(登録商標)ローダミンB、DHR、ローダミングリーン等)、PerCP、テキサスレッド、TruRed、Alexa Fluo(登録商標)(Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、Alexa Fluor750等)、Q−DOTs(登録商標)誘導体(655、605、585、525等)、SNARF、Zenon(登録商標)誘導体(Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)350、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)488、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)555、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)594、Zenon(登録商標)Alexa Fluor(登録商標)647、Zenon(登録商標)アロフィコシアニン、Zenon(登録商標)ビオチン−XX、Zenon(登録商標)R−フィコエリトリン等);NBD、テキサスレッド(登録商標)、QSY(登録商標)染料(QSY(登録商標)7、QSY(登録商標)9、QSY(登録商標)35、QSY(登録商標)21)、ヘキスト(33342、33258)、DAPI、クロモマイシンA3、ミトラマイシン、SYTOX(ブルー、グリーン、オレンジ)、エチジウム、臭化エチジウム、7−AAD、TOTO染料、YOYO染料、TO−PRO染料、BOBO染料、JO−PRO染料、LO−PRO染料、PO−PRO染料、YO−PRO染料、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム(PI)、LDS751、Indo(登録商標)染料(Indo−1等)、Fluo(登録商標)染料(Fluo−3等)、DCFH、pNA、SYBRグリーンII、SyPro(オレンジ、ルビー)、EDANS、IR800、DiI、DiO、DiD、SNARF(登録商標)誘導体、Fura染料、QUIN染料、NANOGOLD粒子、NANOGOLDマレイミド、AlexaFluor FluoroNANOGOLD、AlexaFluor FluoroNANOGOLDストレプトアビジン、マラカイトグリーン、Dabcyl、Dabsyl、カスケードイエロー、ダンシル、Dapoxyl、PyMPO、Pyrene、ベンゾオキサジアゾール誘導体比色分析群(pNA等)または生物発光基質、放射性同位体(例:I125、H3、S35、C14、P33、P32、Cr51、Ca45、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137、Eu152、Ra226、Xe133、テクネチウム99、タリウム201)である。制限的ではない態様において、発光する蛍光性部分は、電子を受容体(FREP)に移すか、または、切断後にクエンチされるか、または、FLIP、FLIM、FRAP技術の影響を受けやすい;
(iii)R1、R3およびR4=天然または非天然アミノ酸側鎖であり、各アミノ酸の絶対配置はLまたはDのいずれかであり;
(iv)R2およびR5=水素原子、アルキル、置換アルキル、アリール、または置換アリールであり、
(v)nは0〜20である。
・対応するアルデヒドより代謝的に安定であり;
・不可逆的カスパーゼ阻害をもたらす
ようである
(III/配列およびカスパーゼ−2阻害剤の機能検証)
(III-1/方法論)
新規に設計された阻害剤(Ac−LDEAD−cho、Ac−VDEAD−cho等)が、下記手順によるインビトロのカスパーゼ−2切断アッセイにおいてAc−VDVAD−choと比較された(図8)。ヒト組換えカスパーゼ(25〜50U;QuantiZyme(登録商標)Assay System,BIOMOL,Plymouth,Pennsylvania,米国)が、30分間にわたって阻害剤(0.005〜2μM)と共に、最終100μLの最終アッセイバッファ(50mM HEPES,pH7.4,100mM NaCl、0.1% CHAPS、10mM DTT、1mM EDTA、10% グリセロール)において予備的インキュベートされ、次いで、200 μmの蛍光発光カスパーゼ基質(BIOMOL)Ac−VDVAD−AMCと混合された。カスパーゼ活性の50%を阻害することができる濃度に相当するIC50値は、用量−応答シグモイド曲線から決定された。AMCをベースとする基質のヒト組換えカスパーゼ1−10による切断は、37℃で2時間後に蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、405nmで励起した時の510nmの発光をモニタリングすることにより測定された。
分子ドッキングおよびインビトロのカスパーゼアッセイによって測定されるように、LDEADおよびVDEADをベースとする化合物は、推定上有効なカスパーゼ−2阻害剤であり、通常のVDVADまたはLDESDをベースとする阻害剤によって提供されるよりもカスパーゼ−2に対してより高いE最少およびより低いIC50値を有する(図8;表1および4)。他の新規に設計されたペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−2阻害剤は、LDEADおよびVDEADをベースとする化合物より高いIC50値を有するが、(それらのIC50値に従って)中程度(VDESD、VDEGD、LDEKD)または弱い(LDEGD、FDESD)カスパーゼ−2阻害剤と考えられ得る(図8および表4)。それにもかかわらず、これらのペンタペプチドをベースとする化合物のカスパーゼ−2を阻害するための固有の阻害有効性はまた、それらのそれぞれの阻害曲線にしたがって規定され得(表4および図9);第2群はVDVADをベースとする阻害剤を示し、特徴的なシグモイド用量応答を有し;第1群は、より低い用量でカスパーゼ−2に対してVDVADをベースとする阻害剤より相対的に活性で、類似のIC50値を有する阻害剤(LDEADおよびVDEAD)を指す;第3群は、より低い用量でカスパーゼ−2に対してVDVADをベースとする阻害剤より活性が低く、より高いIC50値を呈するペンタペプチドをベースとする阻害剤を指す(LDEGD、FDESD、LDESD、LDEKD、VDESD、VDEGD)。それ故に、これらの実験データは、図9に示すようにカスパーゼ−2阻害剤の合理的な設計についての同意を提供する(P5P4P3P2P1の共通のペプチド性カスパーゼ阻害剤の命名に従う):(i)D1およびD4の必要条件;(ii)V3またはD3の必要条件;S2またはG2は、P2残基として許容されたが、V1はL1より好ましい。このような場合、LDEADおよびVDEADをベースとする化合物は、VDVADをベースとする阻害剤と比較してより低い用量で低IC50値および阻害有効性の両方を有するため、より興味のあるペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−2阻害剤として現れた。このような配列は、他の空想的(chimeric)分子に、細胞上およびインビボ目的のためにNおよびC末端において下記に記載されるような改変を提供するための非常に興味深いテンプレートである。
(IV-1/方法論)
新規に設計された阻害剤(Ac−LDEAD−cho、Ac−VDEAD−cho等)は、カスパーゼ(1〜10)の大パネルに対して、インビトロの切断アッセイの間に、下記手順に従って試験された。ヒト組換えカスパーゼ(25〜50U;Biomol)が、30分間にわたって阻害剤(0.005〜2μM)とともに、最終100μLの最終アッセイバッファ(50mM HEPES,pH7、100mM NaCl、0.1% CHAPS、10mM DTT、1mM EDTA、10% グリセロール)において予備インキュベートされ、次いで、200μMのそれらの特定の蛍光発光カスパーゼ基質(BIOMOL)(Ac−YVAD−AMC(カスパーゼ−1)、Ac−VDVAD−AMC(カスパーゼ−2)、Ac−DEVD−AMC(カスパーゼ−3/−7)、Ac−VEID−AMC(カスパーゼ−6)、Ac−IETD−AMC(カスパーゼ−8/−10)、Ac−LEHD−AMC(カスパーゼ−9)と混合された。ヒト組換えカスパーゼ1〜10によるAMCをベースとする基質の切断は、2時間後に37℃で、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、405nmで励起した時の510nmの発光をモニタリングすることにより測定された。
ペンタペプチド配列のカスパーゼ−2との分子ドッキングが他のカスパーゼの認識および阻害のために予言的でないので、大部分の強力なペンタペプチドをベースとするカスパーゼ−2阻害剤(Ac−LDEAD−choおよびAc−VDVEAD−cho)の阻害プロファイルが、ヒト組換えカスパーゼのパネルを用いて決定された(図14〜16)。
(V-1/方法論)
追加的に、新規に設計された阻害剤の特異性が、カルパインおよびグランザイムBに対してチェックされた。ヒト組換えカルパインI(0.8U)およびラット組換えカルパインII(20U)(双方、Biomolから)が、30分間にわたって、阻害剤とともに、最終100μLの最終アッセイバッファ(50mM HEPES,pH7.4、100mM NaCl、0.1% CHAPS、5mM CaCl2、1mM EDTA、10% グリセロール、2mM βメルカプトエタノール)において予備インキュベートされ、次いで、20μMの蛍光発生カルパイン基質IまたはII(Calbiochem)とそれぞれ混合された。ALLNおよびALLM(1μM)が阻害の内部対照であった。組換え酵素による基質の切断は、2時間後に37℃で蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、カルパインIについては380nmで励起した時の460nmの発光を、カルパインIIについては485nmで励起した時の530nmの発光をモニタリングすることにより測定された。ヒトグランザイムB(50U;Biomol)は、10分間にわたり、阻害剤とともに、最終100μlの最終グランザイムアッセイバッファ(Biomol)において予備インキュベートされ、次いで、400μMのAc−IEPD−pNA(Biomol)と混合された。3,4DCIC(1μM)が阻害の陽性対照として用いられた。基質の切断は、1時間後に37℃で、分光光度計を用いて360nmで測定された。
LDEADおよびVDEADをベースとする阻害剤(2μM)は、他のシステインプロテアーゼ・カルパインI/IIについて強い阻害剤ではなかった(図14)。LDEADおよびVDEADをベースとする阻害剤(2μM)は、他のプロテアーゼであるグランザイムBについて強い阻害剤ではなかった(図15)。
(VI-1/方法論)
新生ウィスターラット(Wistar rat)(寝わら当たり雌親プラスその9匹の仔ラット)が、仔ラットが3〜4日齢である時に、Janvier(Le Genest-St-Isle,フランス)から得られた。仔ラットは、食物および水が自由に利用可能な12:12時間の明暗サイクルの元でそれら雌親と共に収容された。動物実験は、実験動物の注意および使用のためのフランスおよび欧州共同体のガイドラインに従って行われた。仔ラットは、抱水クロラール(350mg/kg)の腹腔内注射により麻酔をかけられた。虚血は、既に記載される(Renolleauら,1998)ように7日齢のラット(17〜21g)に実施された。麻酔をかけられたラットは仰向けに置かれ、首に正中切開がなされて左総頸動脈を露出させた。次いで、ラットは、右側を下にする横向きに置かれ、耳と目との間に斜位(oblique)皮膚切開がなされた。側頭筋(temporal muscle)の切除の後、頭蓋骨(cranial bone)が額縫合線(frontal suture)から頬骨弓(zygomatic arch)より下の高さ位置にかけて除かれた。次いで、鼻の裂け目の上のその出現のすぐ後に露出される左中大脳動脈は、大脳静脈より下方の高さ位置で凝固させられた。この手順の後、左総頸動脈を塞ぐためにクリップが置かれた。次いで、ラットは、低体温を回避するためにインキュベータ内に置かれた。50分後、クリップが取り除かれた。頸動脈血流回復が顕微鏡を用いて検査された。次いで、首および頭蓋の皮膚が閉じられた。外科手順の間、体温は37〜38℃に維持された。仔ラットは、回復するまでインキュベータ(32℃)に移され、次いで、その後にそれらの雌親の元(dam)に移された。
(VII-1/方法論)
全体性の脳虚血は、完全脳虚血(four-vessel occlusion:4VO)によって、Pulsinelliの誘導法(PulsinelliおよびBuchman、1988)に従って、若齢成熟ラット(10〜12週齢の雄ウィスター,320g±10g;Janvier)において誘導された。第一日に、麻酔がかけれれたラットの頭部が脳定位イヤーバー(stereotaxic ear bar)内に置かれ、水平方向に対して約30°下に傾けられた。頸椎レベルでの正中切開の後、両方の椎骨動脈が顕微鏡下に露出させられ、次いで、翼状孔(alar foramina)を通して第一頸椎のレベルで電気灼熱ニードルによって凝固させられた。次いで、両方の総頸動脈が、24時間後に露出させられ、20〜30分にわたりクランプ固定された(両方の椎骨動脈の電気灼熱が首尾良く行われた時に、ラットは昏睡状態に陥った)。次いで、頸動脈は、血流の再灌流を可能とするようにクランプ固定が解かれた。賦形剤および配列8が、左の脳室のレベルに、虚血(頸動脈閉塞)の最初の15分内に投与された。ラットは、水および食餌が無制限に与えられるそれらのケージ内に置かれた。
図23〜25は、細胞死が、虚血後72時間成熟ラットの海馬のCA1のレベルで起こり;細胞の90〜100%が、それらのクレシルバイオレット染色を失い、異常な細胞の形態を有し(図19)、40〜60%が、虚血脳のC1において核変化および保持されたFluoroJadeBの両方を呈することを示す(図20)。
Claims (10)
- マロニル、メチルマロニル、スクシニルおよびメチルスクシニルからなる群から選択されるN末端保護基を有する、請求項1に記載のペプチド化合物。
- XはHである、請求項1または2に記載のペプチド化合物。
- 請求項1〜3のいずれか1つに記載の少なくとも1種のペプチド化合物の治療上の有効量を、製薬上許容される担体と共に含む医薬組成物。
- 全体性または限局性の、一過性または永続性の、成人、胎児または周産期の、低酸素/低血糖を伴うまたは伴わない虚血の治療のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1つに記載のペプチド化合物の使用。
- 低酸素/低血糖を伴うまたは伴わない脳虚血損傷または卒中様の状況の治療のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1つに記載のペプチド化合物の使用。
- 脳損傷の治療のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1つに記載のペプチド化合物の使用。
- 慢性変性疾患の間の細胞死の治療のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1つに記載のペプチド化合物の使用。
- 前記疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症または痴呆である、請求項7に記載のペプチド化合物の使用。
- てんかんの治療のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1つに記載のペプチド化合物の使用。
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