KR20090115944A - 영상 프로브 - Google Patents
영상 프로브 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20090115944A KR20090115944A KR1020097018084A KR20097018084A KR20090115944A KR 20090115944 A KR20090115944 A KR 20090115944A KR 1020097018084 A KR1020097018084 A KR 1020097018084A KR 20097018084 A KR20097018084 A KR 20097018084A KR 20090115944 A KR20090115944 A KR 20090115944A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- probe
- formula
- cathepsin
- group
- compound
- Prior art date
Links
- 0 *CCCN(CC1)CCN1c1nc(-c(cc2)ccc2C(O)=O)c[s]1 Chemical compound *CCCN(CC1)CCN1c1nc(-c(cc2)ccc2C(O)=O)c[s]1 0.000 description 4
- CUROHRPDTRNOOB-AREPFKJSSA-O CC[N+](c(c(C1(C)C)c2)ccc2S(O)(=O)=O)=C1/C=C/C=C(/C(C)(C)c1c2)\N(CCCCCC(NCCNC([C@H](CCNC(CCCC[C@H]3CC#CCCCC3)=O)NC([C@H](CC3CCCCC3)NC(N3CCOCC3)=O)=O)=O)=O)c1ccc2S(O)(=O)=O Chemical compound CC[N+](c(c(C1(C)C)c2)ccc2S(O)(=O)=O)=C1/C=C/C=C(/C(C)(C)c1c2)\N(CCCCCC(NCCNC([C@H](CCNC(CCCC[C@H]3CC#CCCCC3)=O)NC([C@H](CC3CCCCC3)NC(N3CCOCC3)=O)=O)=O)=O)c1ccc2S(O)(=O)=O CUROHRPDTRNOOB-AREPFKJSSA-O 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0827—Tripeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
본 발명은 시험관내 검정, 세포내 또는 다세포 유기체 중에서 선택된 카텝신의 촉매 활성을 관찰하도록 하는 본원에 정의된 바와 같은 화학식 I의 분자 프로브, 이의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.
화학식 I
{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2
카텝신, 분자 프로브, 단백질 분해, 기질, 시스테인 프로테아제
Description
본 발명은 시험관내 검정, 세포내 또는 다세포 유기체 중에서 개개 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 효소 그룹의 촉매 활성을 관찰하도록 하는 분자 프로브(기질)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 프로브(기질)의 합성 방법 및 도안에 관한 것이다.
단백질 분해 효소(프로테아제)는 살아있는 세포의 내부 및 외부에서 기타 효소 또는 펩타이드를 분열시키거나 열화시킨다. 프로테아제는 다수의 생명 과정에 관련되고, 이중 다수는 세포 신호화 및 조직 항상성에 중요하다. 비정상 또는 증가된 프로테아제의 활성은 암, 골관절염, 아테롬성 동맥경화증, 염증 및 다수의 기타를 포함하는 각종 질환과 관련된다(참조: M.J. Evans, B. F. Cravatt, Chem. Rev. 2006, 106, 3279-3301). 단백질 분해 활성이 살아있는 시스템에서 엄격한 조절하에 유지되어야 하기 때문에, 다수의 프로테아제는 조절된 단백질 분해 분열에 의해 활성화되는 불활성 전구체 단백질(효소원)로서 발현된다. 단백질 분해 활성의 추가의 조절은 효소의 촉매적 활성 형태에 결합함으로써 이를 불활성화시키는 내인성 억제제로부터 생성된다. 이러한 엄격한 조절과 관련하여, 세포상 또는 생 리학적 사건에서 프로테아제 기능의 연구는 프로테아제 발현 단독의 모니터링보다는 프로테아제 활성의 모니터링을 필요로 한다. 결과적으로, 각종 활성 기본 화학적 프로브가 문헌에 제안되어 있다. 통상적으로 적용된 프로테아제 프로브는 (i) 형광 소광제로부터 형광단의 공간적 분리를 유도하는 펩타이드 결합의 효소 분열을 통해 또는 (ii) 메카니즘계 억제제의 목적하는 프로테아제에의 공유결합에 의해 탐지가능한 신호를 생성한다. 특정 프로테아제 또는 프로테아제의 그룹(예: 세포계 검정 또는 전체 동물 영상 실험)의 활성 및 억제에 대한 국소적 및 정량적 연구는 (i) 프로테아제 작용의 생리학적 관련 위치(예: 전체 동물 영상에서 세포 또는 특정 기관의 세포질)에 도달하고, (ii) 목적하는 프로테아제 또는 프로테아제 그룹에 대해 선택적인 영상 프로브의 개발을 요구한다. 프로테아제 선택적 프로브의 생성은 당해 분야에 상당한 도전을 부과하였다. 본 발명은 (i) 바람직하게는 카텝신 아과로부터 시스테인 프로테아제를 위한 신규한 매우 선택적 프로브, (ii) 이들 프로브의 시험관내 검정, 세포내 또는 다세포 유기체 중에서의 적용(예: 분자 영상화에 의해) 및 (iii) 이러한 프로브의 합성 방법 및 도안에 관한 것이다.
최근 몇년 동안, 수개의 분자 영상 기술(광학적 및 비광학적)이 생체내에서 특정 분자 표적물 및 경로의 비침습성(non-invasive) 가시화를 위해 더욱 더 중요해지고 있다. 영상 신호의 정보 내용은 주로 내부 콘트라스트의 함수이기 때문에, 효소 반응시(예: 펩타이드 결합의 분열) 활성화가능한 내부적으로 소광된 영상 프로브의 개발을 통상적으로 적용하여 촉매적 활성 프로테아제를 영상화하고 국소화시켰다. 개개 프로테아제에 대해 선택적이고 생체내 프로테아제 작용 위치에 도달 하는 능력을 나타내는 프로브의 생성은 통상의 접근법으로는 거의 달성되지 않았다. 약제 산업에서의 의학자들은 제시된 표적물에 대해 적합한 약동학적 성질 및 적합한 특이성을 갖는 약물의 개발에 대한 관련 도전에 직면한다. 본 발명에서, 본 발명자들은 시스테인 프로테아제를 위한 선택적 활성 기본 프로테아제에 대해 새로운 경로를 고안했고, 이러 접근법을 시스테인 카텝신 아과로부터의 프로테아제에 적용하였다.
시스테인 프로테아제는 촉매 작용 동안 친핵체로서 작용하는 활성 위치에서의 시스테인 잔기를 특징으로 한다. 촉매적 시스테인은 적합한 인접 잔기와 통상적으로 수소 결합되어 티올레이트 이온이 형성되도록 할 수 있다. 기질이 프로테아제에 의해 인지될 경우, 끊어지기 쉬운 펩타이드 결합은 촉매적 시스테인 부근에 위치하고, 이는 옥소-음이온 중간체를 형성하는 카보닐 탄소를 공격한다. 이어서, 아미드 결합은 분열되어 C-말단 펩타이드를 아민으로서 유리시킨다. 끊어지기 쉬운 펩타이드의 N-말단 부분은 물에 의해 후속적으로 분열되는 공유 아실-효소 중간체에 잔류하여 효소의 재생을 유도한다. 기질의 N-말단 분열 생성물은 카복실산으로서 유리된다.
인간 게놈은 리소좀에서의 일반적 단백질 분해(하우스 유지 기능), 항원의 처리, 과립 프로테아제의 처리 및 매트릭스 콜라겐 분해를 포함하는 각종 기능과 연관되는 11개의 파파인-형 카텝신(인간 씨족 CA 프로테아제 또는 시스테인 카텝신: B, C, F, H, K, L, O, S, V, W, X)을 암호화한다. 시스테인 카텝신의 기능장애는 다수의 병리학적 사건, 예를 들어, 골관절염, 암 생리학(혈관형성 및 종양발 생), 신경학적 장애(예: 통증) 및 골다공증에 관련되고(참조: Y. Yasuda et al. Adv. Drug Delivery Rev. 2005, 57, 973-993), 결과적으로 시스테인 카텝신의 일부는 최근 치료법에 대한 관련 약물 표적으로서 확인되었다(참조: Turk, V.; Turk, B.; Turk, D. Embo J, 2001, 20, 4629-4633).
예를 들어, 카텝신 K 및 S는 골 및 연골 분해에 관련되고, 골다공증 및 관절염에 관련된다.
또한, 카텝신 K는 주로 파골세포에서 발견되고, 정상 골 리모델링(골 재흡수)에 결정적인 것으로 나타났다. 카텝신 K 활성의 결핍은 골 경화증 장애(피크노디스토시스(pycnodysosis))를 유도하는 반면, 카텝신 K의 과발현은 골다공증의 징후이기 때문에 골 재료의 회전을 가속화시킨다. 카텝신 K는 또한 강력한 콜라게나제 활성을 나타내어 이들의 나선형 도메인에서 삼중 나선형 콜라겐을 분열시킨다. 골관절염에서, 연골 매트릭스는 타입 II 콜라겐의 분해를 포함하여 광범위한 미란(erosion)을 경험한다(참조: Y. Yasuda et al. Adv. Drug Delivery Rev. 2005, 57, 973-993). 따라서, 카텝신 B 및 K의 억제는, 예를 들어, 퇴해성 관절 질환, 예를 들어, 골관절염의 치료에 유용한 방법이다. 카텝신 K 억제는, 예를 들어, 골의 억제를 유도한다. 카텝신 S는 항원에 대한 MHC 부류 II 관련 면역 반응을 개시하는데 주요 역할을 한다. 수지상 세포에서 주요 불변기 카인(cain) 처리 프로테아제인 카텝신 S는 면역 관련 질환에서 매력적인 약물 표적으로서 나타난다. 또한, 카텝신 S는 또한 세포외 매트릭스 분해에 중요하고, 또한 중요한 엘라스타제 및 프로테오글리칸 분해 활성을 나타낸다. 따라서, 카텝신 S는 과도한 엘라스틴분 해와 관련되는 장애, 예를 들어, 만성 폐색성 폐 질환(예: 기종), 세기관지염, 천식 및 기관지염에서의 과도한 기도 엘라스틴분해, 폐렴 및 심혈관 질환, 예를 들어, 플라크 파열 및 죽종에 관련된다.
카텝신 L은 표피 항상성, 모발 주기의 조절 및 또한 MHC 부류 II 매개된 항원 전달과 관련되는 것으로 나타난다.
카텝신 B는 췌장염 초기 단계에서 병리학적 트립신 활성화와 관련되고, TNF-α 유도된 간세포 아폽토시스의 원인이 된다.
단백질 분해 효소의 경우, 세포 생리학 및 병리학에서 이들의 기능적 역할을 지시하는, 단순한 발현 수준보다는 이들의 활성이다. 따라서, 카텝신 프로테아제의 활성을 억제하는 분자는 질환 치료에서 치료제로서 유용하고, 단백질 분해 활성 뿐만 아니라 약물 후보자를 통한 이들의 억제를 가시화하는 특정 영상 바이오마커의 개발은 표적 확인, 약물 개발 및 심지어 임상 시험을 촉진시킬 수 있다(참조: H. Pien, A.J. Fischman, J. H. Thrall, A.G. Sorensen, Drug Discovery Today, 2005, 10, 259-266). 활성 기본 영상 시약을 사용하여, 특정 단백질 또는 단백질 과는 복잡한 단백질 혼합물, 순수한 세포 및 심지어 생체내에서 용이하게 모니터할 수 있다. 또한, 효소 부류 특이적 프로브를 사용하여 기능적 연구를 위해 사용될 수 있는 소분자 억제제용 스크린을 개발할 수 있다(참조: D.A. Jeffery, M. Bogyo Curr.Opp.Biotech. 2003, 14, 87-95).
지금까지, 활성 기본 영상 프로브는 세포계 검정에서의 카텝신 B 및 L(참조: G. Blum et al. Nat. Chem.Biol, 2005, 1, 203-209), 수개의 카텝신(참조: R. Weissleder et al. Nat.Biotech. 1999, 17, 375-378) 및 종양 조직에서의 매트릭스 메탈로프로테이나제(참조: C. Bremer et al. Nat. Med. 2001, 7, 743-748)를 모니터하고 표지화하기 위해 개발되었다.
프로테아제 활성을 모니터하는 또다른 기구는 생체발광성 검정으로 이루어진다. 이 방법은 효소 활성 검정 또는 비효소 생물학적 검정에 루시페린의 유도체를 사용하게 하고, 여기서, 루시페린 유도체는 목적하는 효소의 기질로서 작용하고 루시페라제의 전기질이다. 제1 단백질 분해 분열은 루시퍼라제에 의해 후속적으로 전환되고 발광 신호로서 탐지가능한 루시페린을 방출시킨다. 이 2차 검정은 형광 프로브보다 유사한 적용 스펙트럼을 갖고, 추가로 노이즈 비에 대한 높은 신호의 이점을 제시한다.
시스테인 카텝신에 의해 사용된 효소 메카니즘은 충분히 연구되었고 잘 보호된다. 분열가능한 펩타이드의 연구 및 스크리닝 데이터로부터, 이러한 보호된 활성 위치와 관련하여 단지 반응하는 친전자성 기질 유사체가 개발되었다. 이러한 프로브에서 친전자성 중심은 일반적으로 이를 촉매적 시스테인 잔기와 반응시킬 경우, 이의 친전자성 특성에서 최적화되고, 이의 기하학적 위치를 시스테인 카텝신의 활성 위치로 완전히 적합하게 하는 분자체인 소위 "탄두"의 일부이다. 광범위한 종류의 이러한 친전자성 기질은, 예를 들어, 배타적이지 않지만, 디아조메틸 케톤, 플루오로메틸 케톤, 아실옥시메틸 케톤, O-아실하이드록실아민, 비닐 설폰 및 에폭시석신산 유도체를 포함하는 메카니즘계 시스테인 프로테아제 억제제로서 기재되었다(참조: S. Verhelst, M. Bogyo QSAR Comb. Sci. 2005, 24, 261-269).
생물학적 도구로서 효과적이기 위해, 프로테아제 억제제는 매우 강력할 뿐만 아니라 특정 프로테아제에 결합하는데 있어서 매우 선택적이어야 한다. 특정 프로테아제를 위한 소분자 억제제의 개발은 흔히 펩타이드 기질로부터 출발하였다. 펩타이드가 다양한 범위의 생물학적 특성을 나타내지만, 약물로서의 이들의 용도는 이들의 불안정성 및 이들의 낮은 경구 생체이용성에 의해 위태로워질 수 있다. 효과적인 약물이 되기 위해, 감소된 펩타이드형 특성, 비선택적 단백질 분해 열화에 대한 높은 안정성, 소정의 프로테아제에 대한 고선택도 및 프로테아제 작용 위치에 대한 우수한 생체이용성을 갖는 프로테아제 억제제가 바람직하다. 이들 요건은 비펩타이드성 화학적 골격 A를 갖는 시스테인-카텝신 억제제 A-B의 개발을 유도하고, 이는 친전자성 탄두 B와 공유결합된다. 시스테인-카텝신 B에 결합될 경우, 촉매적 시스테인(메카니즘계 억제제)과 공유적으로 반응한다. 다수의 경우에, 이러한 억제제의 선택도 및 약동학적 성질은 생의학적 연구와 관련하여 성공적으로 최적화되었다. 촉매적 시스테인에 의한 친핵체 공격이 효과적이도록 하기 위해, 이러한 억제제의 친전자성 중심은 효소의 활성 위치 내에 정밀하게 배치되어야 한다. 탄두의 친전자성 탄소원자로의 촉매적 시스테인의 특별한 배열은 촉매적 시스테인 및 끊어지기 쉬운 펩타이드 기질의 펩타이드 카보닐의 공간 배열에 잘 상응한다. 이러한 비교는 분열가능한 기질로의 최적화된 공유 억제제의 "재도안"(화학적 골격 A 및 친전자성 탄두 B를 포함)이 가능해야 한다는 생각을 갖도록 하였다. 화학적 골격 A가 억제제 선택성의 중요한 결정자로서 간주될 수 있기 때문에, 본 발명의 접근법은 최적화된 억제제의 선택성 또는 선택성의 일부가 활성 기본 화학적 프로브 로 이동하게 한다. 본 발명자들은 이 방법을 선택적 시스테인 카텝신 억제제로부터 선택적 활성 기본 프로브의 "역전된 도안"으로 언급한다.
본 발명은 화학식 I의 시스테인 프로테아제용 분자 프로브에 관한 것이다.
상기 화학식 I에서,
A는 카텝신에 의해 인지가능한 그룹이고;
R1은 링커이고;
R2는 결합 또는 링커이고;
L은 결합이거나 그룹 L1의 용이한 접합(facile conjugation)을 가능하게 하는 그룹이고;
L1 및 L2는 서로 독립적으로 고체 지지체에 임의로 결합된 하나 이상의 라벨이고;
n은 1이고;
또는
R2는 결합이고;
L2는 커플링된 생체발광성 검정에 적합한 기질이고;
n은 0이다.
본 발명의 추가의 양태는
n이 1이고;
A가 시스테인 카텝신에 의해 인지가능한 그룹이고;
R1 및 R2가 서로 독립적으로 링커이고;
L이 결합이거나 그룹 L1의 용이한 접합을 가능하게 하는 그룹이고;
L1 및 L2가 서로 독립적으로 고체 지지체에 임의로 결합된 하나 이상의 라벨인 화학식 I의 시스테인 프로테아제용 분자 프로브이다.
화학식 I의 화합물은 바람직하게는 시스테인 카텝신 아과로부터의 시스테인 프로테아제용 활성 기본 프로브(기질)이다.
이들의 가장 기본적인 형태에서, 화학적 프로브는 4개의 작용성 성분: a) 프로테아제의 작용에 의해 분열될 수 있는, 반응성 그룹으로서의 아미드 그룹 -CO-NH-, b) 소정의 프로테아제 표적에 대한 선택성을 규정하는 골격 A, c) 서로 아단위를 연결하는 링커 잔기 R1 및 R2 및 d) 탐지용 라벨 L1 및 L2의 세트로 이루어진다.
그룹 A는 바람직하게는, 예를 들어, 화합물 2 내지 114에 도시된 바와 같이, 소정의 시스테인 카텝신 또는 시스테인 카텝신의 그룹, 바람직하게는 카텝신 K 또는 S를 향한 특이성의 주요 결정자이다. 본 발명의 영상 프로브는 인자 1000 내지 1, 바람직하게는 인자 100 내지 1의 소정의 시스테인 카텝신에 대한 선택성을 나타내고, 선택성은 바람직한 기질 농도에서 상대적 회전 수(효소 1에 의한 회전 수 대 효소 2에 의한 회전 수)에 의해 정의된다. 상대적 회전 수는 목적하는 효소(효소 1)의 회전 수를 바람직한 선택성의 또다른 효소(효소 2)의 회전 수로 나눔으로써 각 효소 쌍에 대해 측정된다. 생체내 적용을 위해, 높은 선택성이 낮은(예: μmol 또는 서브 μmol) 기질 농도에서 목적시된다.
반응식 1은 A가 특이성 결정자이고, P가 티올 그룹 S를 포함하는 이의 반응성 시스테인을 갖는 프로테아제인 프로테아제 P의 반응을 나타낸다.
반응 속도는 기질의 구조에 좌우된다.
링커 그룹 R1 또는 R2는 바람직하게는 각각 라벨 L1 또는 L2에 또는 복수의 동일하거나 상이한 라벨 L2 또는 L1에 연결된 가요성 링커이다. 링커 그룹은 계획된 적용과 관련하여, 즉 특정 프로테아제에 대한 활성 기본 영상 프로브와 관련하여 선택된다. 링커는 또한 적합한 용매 중에서 기질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 사용된 링커는 실제 적용 조건하에 화학적으로 안정하다. 링커는 선택된 프로테아제 표적의 반응도, 라벨 L1 및/또는 L2의 탐지도 간섭하지 않고, 예를 들어, 때맞추어 특정 포인트에서 분열되도록 구성될 수 있다. 보다 구체적으로, 링커 그룹 R1 또는 R2는 탄소수 1 내지 300의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 그룹이고, 여기서, 임의로
(a) 하나 이상의 탄소원자는 산소로 대체되고, 특히 3번째 탄소원자마다 산소로 대체되고/되거나(예를 들어, 1 내지 100개의 에틸렌옥시 단위를 갖는 폴리에틸렌옥시 그룹);
(b) 하나 이상의 탄소원자는 수소원자를 동반하는 질소로 대체되고, 인접하는 탄소원자는 옥소에 의해 치환되고/되거나(이는 아미드 작용기 -NH-CO-를 나타냄);
(c) 하나 이상의 탄소원자는 에스테르 작용기 -O-CO-로 대체되고;
(d) 2개의 인접한 탄소원자 사이의 결합은 이중결합 또는 삼중결합이고/이거나;
(e) 2개의 인접한 탄소원자는 디설파이드 결합으로 대체된다.
기질의 라벨 L1 및 L2는 프로브의 목적하는 적용에 좌우되어 당해 기술 분야의 숙련가가 선택할 수 있다.
라벨 L1 및 L2는 서로 독립적으로 분광학적 프로브, 예를 들어, 형광단; 소광제 또는 발색단; 자기 프로브; 콘트라스트 시약; 특이적으로 파트너에 결합할 수 있는 특정 결합 쌍의 한 파트인 분자; 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 중합체성 지지체, 덴드리머, 유리 슬라이드, 미세역가 플레이트에 공유 결합된 분자; 또는 상기 나열된 특성의 조합물을 포함하는 분자이다.
본 발명의 바람직한 양태는 리포터 그룹으로서 개질된 아미노루시페린 또는 카복시 말단 보호된 이의 유도체의 용도이고, 이는 중심 골격 A로부터 분열시 루시페라제에 의한 이의 전환을 통해 발광 신호를 생성할 수 있다. 따라서, 라벨 L2는, 대안적으로 리포터 그룹으로서 개질된 아미노루시페린 또는 카복시 말단 보호된 이의 유도체를 특징으로 하는, 커플링된 생체발광성 검정에 적합한 기질일 수 있다.
미국 특허 제7,148,030호는 개질된 아미노루시페린에 결합된 카텝신 기질로서 펩타이드를 포함하는 생체발광성 프로테아제 검정의 예를 기술한다.
형광 소광을 유도하는 밀도에서 골격 A를 통해 주쇄에 공유 결합된 다수의 형광단 및 중합체성 골격을 포함하는 분자간 소광 형광성 프로브로 이루어진 프로브가 바람직하다. 본 발명의 또하나의 바람직한 양태는 2개 이상의 형광단이 형광 소광을 유도하는 밀도에서 골격 A를 통해 공유 결합된 수지상 거대분자의 용도이다. 중합체성 프로브의 사용은 동물 또는 사람의 혈류에서 편재된 프로브 전달(표적화) 및 연장된 순환 시간의 이점을 갖는다. 중합체 접합은 저분자량 물질의 생체분포를 변경하여 독성 부위에의 접근이 감소된 종양 특이적 표적화(향상된 투과성 및 보유 효과(EPR 효과)에 의해)를 가능하게 하고, 저분자량 영상 프로브를 사용하는 중합체 접합물의 조합은 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트 등을 포함하는 다세포 유기체의 영상화를 위한 본 발명의 가장 바람직한 양태이다. 중합체성 주쇄는 생체적합성 중합체로 이루어질 수 있고, 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 핵산 또는 합성 중합체를 포함할 수 있다. 본 발명에 관련하여 유용한 중합체의 포괄적인 요약은 문헌(참조: M.J. Vincent et al. Trends Biotech. 2006, 24, 39-47 and R. Duncan, Nature Reviews Cancer, 2006, 688-701)에서 찾을 수 있다. 본 발명에 관련하여 유용한 중합체의 추가 설명은 국제공개공보 제WO99/58161호에 기재되어 있다. 중합체성 또는 덴드리머성 프로브는 주쇄 또는 수지상 분자에 공유결합된 보호 쇄를 포함할 수 있다. 보호 쇄는 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌글리콜 및 추가로 에틸렌글리콜의 공중합체를 포함한다.
본 발명의 프로브는 추가로 표적화 잔기, 예를 들어, 항체, 항체 단편, 리포터 결합 리간드, 펩타이드 단편 또는 합성 단백질 억제제를 포함할 수 있다.
라벨 L1 및 L2는 또한 양으로 하전된 직쇄 또는 측쇄 중합체일 수 있다. 상기한 중합체는 살아있는 세포의 형질막 위에 부착된 분자의 이동을 촉진시키는 것으로 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지되었다. 이는 또한 낮은 세포막 투과성을 갖거나 살아있는 세포의 세포막에 사실상 불투과성 상태인 물질에 특히 바람직하다. 비세포 투과성 화학적 프로브는 이러한 그룹 L1 또는 L2에 접합시 세포막 투과성이 된다. 이러한 세포막 수송 향상제 그룹 L1 및 L2는, 예를 들어, 6 내지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌), 각각이 구아니디늄 그룹, 올리고머 또는 구아니디늄 그룹이 일부에 결합된 6 내지 50개 이하의 서브단위를 갖는 짧은 길이 중합체를 수반하는 6 내지 15개 서브단위를 갖는 선형 중합체 및/또는 HIV-tat 단백질 서열의 일부, 예를 들어, 서브단위 Tat49-Tat57(하나의 문자 아미노산 코드 중의 RKKRRQRRR)을 포함한다. 6 내지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌)은 바람직하게는 L1이 2개의 상호작용 분광학적 프로브 L1/L2, 예를 들어, FRET 쌍 중의 하나의 원이고, L2가 나머지 원인인 경우에서 중합체성 라벨로서 사용된다.
분광학적 프로브가 라벨 L1 및/또는 L2로서 가장 바람직하다. 라벨 L2로서 가장 바람직한 것은 L1을 갖는 분광학적 상호작용 쌍의 한 파트를 나타내는 분자, 또한 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 라벨 및 고체 지지체에 공유 결합된 분자이다.
L1이 2개의 상호작용 분광학적 프로브 L1/L2의 한 원(member)이고, L2가 나머지 원이 되는 라벨이 특히 바람직하고, 여기서 에너지는 역동적이거나 정적인 소광을 통해 공여체 및 수용체(소광제) 사이에 비방사성적으로 이전될 수 있다. 이러한 상기 라벨 L1/L2의 쌍은 상응하는 시스테인 카텝신 프로테아제로부터 반응/분열시 이의 분광학적 성질을 변화시킨다. 이러한 한쌍의 라벨 L1/L2의 예는 FRET(푀르스터 공명 에너지 전달(Forster resonance energy transfer)) 쌍이고, 예를 들어, 공여체(리포터)를 갖는 하나의 말단(예: L1) 및 수용체(소광제)를 갖는 또하나의 위치(L2)에서, 또는 이의 역으로 공유 결합으로 표지된 전-형광성 프로브이다.
특히, L1은 공여체(리포터)이고, L2는 수용체(소광제)이거나, L1은 소광제이고, L2는 리포터이다. 이 프로브를 사용하는데 있어, 시스테인 프로테아제와 프로브와의 반응은 형광성의 변화를 유도한다. 이중 표지된 기질 내의 리포터-소광제 거리는 프로테아제와의 반응시 변화되어 형광성의 출현 또는 방출 파장의 변화를 야기하는 리포터와 소광제의 공간 분리를 유도한다. 리포터 그룹의 광범위한 선택을, 예를 들어, 근적외선 방출 형광단을 포함하여, 각각 라벨 L1 또는 L2로서 사용할 수 있다. 리포터 및 소광제를 함유하는 기질은 프로테아제와 반응할 때까지 암흑 상태로 유지시키고, 그 결과 반응 혼합물은 형광단 방출시 "환하게(lit up)" 켜지는데, 이는 리포터 라벨 및 소광제 라벨이 현재 공간적으로 분리되기 때문이다. 형광 소광 및 에너지 전달은 두 라벨, 소광된 또는 에너지 공여체 라벨 중의 하나만의 방출로 측정될 수 있다. 에너지 전달이 발생하고, 에너지 수용 라벨이 또한 형광성일 경우, 수용체 라벨 형광도 또한 측정될 수 있다. 이들 두 상호작용 라벨 중 공여체 라벨은 여기 램프의 필요성을 제거하고, 수용체 배경 형광을 감소시키는 화학발광성 공여체 프로브로부터 선택될 수 있다. 이러한 이중 표지된 기질을 사용하는 언급된 특별한 방법은 형광 시간 측정에 기초하는 반응 동역학을 측정하는데 유용하고, 생체내 뿐만 아니라 시험관내 적용될 수 있다.
대안적으로, 기질의 라벨 L2는 고체 지지체일 수 있거나 고체 지지체에 추가로 부착될 수 있거나 또는 중합체/고체 지지체에 부착되거나 부착가능할 수 있다. 6 내지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌)은 바람직하게는 L1/L2 FRET 쌍의 중합체성 라벨로서 사용된다.
특히 바람직한 조합은 2개의 상이한 친화도 라벨, 특히 한쌍의 분광학적 상호작용 라벨 L1/L2, 예를 들어, FRET 쌍이다. 친화도 라벨은 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 특정 결합 쌍의 한 파트인 분자로서 정의된다. 고려되는 특정 결합 쌍은, 예를 들어, 비오틴과 아비딘 또는 스트렙타비딘 추가 메토트렉세이트이고, 이는 효소 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 긴밀한 결합 억제제이다.
리포터와 소광제의 적합한 쌍은 당해 기술 분야의 숙련가가 선택할 수 있다. 통상적으로 리포터와 소광제는, 예를 들어, 리포터로서의 플루오레세인 및 소광제로서의 로다민과 광범위한 스펙트럼 중첩을 갖는 형광성 염료이다. 기타 소광제는 금 클러스터 및 금속 크립테이트이다.
본 발명에 사용된 제2 부류의 소광제는 "흑색 소광제"(참조: Johansson, M. K. et al., Chem. Eur. J. 9:3466-3471, 2003), 즉 최대 FRET 소광을 유도하는 통 상의 리포터 염료의 방출 스펙트럼과 중첩되는 흡수 스펙트럼을 갖는 본래 형광성이 없는 염료이다. 또한, 염료 쌍은 바닥 상태 착물(정적 소광) 내에서 공명 쌍극자-쌍극자 상호작용 메카니즘을 촉진시키기 위해 이들의 흡수 밴드를 중첩시키도록 선택할 수 있다.
고려되는 특별한 형광단 및 소광제는 다음과 같다: Alexa 350, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 555, Alexa 635 및 Alexa 647을 포함하는 Alexa 염료(참조: Panchuk-Voloshina, N. et al., J. Histochem. & Cytochem. 47:1179-1188, 1999); 디메틸아미노쿠마린(Molecular Probes에 의해 제품 D374로서 공급된 7-디메틸아미노쿠마린-4-아세트산 석신이미딜 에스테르); 소광제 QSY 35, QSY 9 및 QSY 21(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402, USA); 시아닌-3(Cy 3), 시아닌 5(Cy 5) 및 시아닌 5.5(Cy 5.5)(Amersham - GE Healthcare, Solingen, Germany); BHQ-1, BHQ-2 및 BHQ-3(Black Hole QuencherTM of Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA 94949, USA); 형광단 ATTO 488, ATTO 532, ATTO 600 및 ATTO 655 및 소광제 ATTO 540Q 및 ATTO 612Q(Atto-Tec, D57076 Siegen, Germany); 형광단 DY-505, DY-547, DY-632 및 DY-647(Dyomics, Jena, Germany); 5/6-카복시플로오레세인, 테트라메틸로다민, 4-디메틸아미노아조벤젠-4'-설포닐 유도체(Dabsyl) 및 4-디메틸아미노아조벤젠-4'-카보닐 유도체(Dabcyl). 이들은 다음 조합물로 유리하게 배합될 수 있다:
형광단 소광제
·Alexa 350, 디메틸아미노쿠마린, 5/6- · Dabsyl, Dabcyl, BHQ 1,
카복시플루오레세인, Alexa 488, ATTO 488, QSY 35
DY-505
· 5/6-카복시플루오레세인, Alexa 488, Alexa 532, · BHQ 2, QSY 9,
Alexa 546, Alexa 555, ATTO 488, ATTO 532, ATTO 540Q
테트라메틸로다민, Cy 3, DY-505, DY-547,
· Alexa 635, Alexa 647, ATTO 600, ATTO 655, ·BHQ 3, ATTO 612Q,
DY-632, Cy 5, DY-647 Cy 5.5 QSY 21
효소 사건에 관련된 생체발광성 검정은 촉매작용의 순간 속도로 커플링된 빛을 수득한다. 당해 방법은 아미드 결합을 통해 중심 골격 A에 결합된 아미노루시페린의 아미노 그룹인 아미노 개질된 비틀 아미노-루시페린 또는 카복시 말단 보호된 이의 유도체를 포함하여 카텝신에 의해 인지되고 후속적으로 분열되는 기질을 수득한다. 카텝신의 효소 활성은 아미노루시페린을 골격 A에 결합하는 펩타이드 결합의 분열을 유도하여 루시페라제의 기질인 아미노루시페린을 유리시킨다. 다음 루시페라제와 이의 기질의 반응은 탐지가능한 신호(발광)를 생성한다. 따라서, 당해 방법은 판독 신호로서 발광을 생성하는 제2 효소 반응에 의한 카텝신 활성에 관한 것이다. 이러한 형태의 검정은 "프로-루시페린"("케이지드 루시페린")의 개발을 필요로 하고, 이는 선행 효소 사건, 예를 들어, 단백질 분해 분열로 루시페린으로 전환될 경우에만 기질로서 루시페라제에 의해 인지된다. 이러한 방식으로, 발광 신호는 직접적으로 선행 효소 사건에 좌우된다. 따라서, 이는 발광에 의해 카텝신의 단백질 분해 활성 탐지용 프로브를 제공하는 본 발명의 추가 양태이다.
특별한 양태에서, 당해 방법은 L2가 고체 지지체이거나. 리포터/소광제 쌍의 한 원을 추가로 동반하는 고체 지지체에 부착되거나, L2가 고체 지지체와 리포터/소광제 쌍의 한 원과의 배합물이고, L1이 이 쌍의 나머지 원인 기질을 포함한다. 이러한 방식으로, 흑색 고체 지지체는 적합한 프로테아제와의 반응시 형광성이 된다.
고체 지지체는 유리 슬라이드, 미세역가 플레이트 또는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 중합체, 예를 들어, 작용화 중합체(바람직하게는 비드 형태), 화학적으로 개질된 산성 표면, 예를 들어, 이산화규소, 오산화탄탈 또는 이산화티탄, 또는 화학적으로 개질된 금속 표면, 예를 들어, 귀금속 표면, 예를 들어, 금 또는 은 표면일 수 있다. 고체 지지체는 또한 적합한 센서 원일 수도 있다.
바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 카텝신 K의 억제제인 그룹 A를 포함한다. 국제 특허 출원 제WO06076796호, 제WO06076797호, 제WO06063762호 및 제WO05049028호는 사용되어 화학식 I의 프로브로 변형될 수 있는 선택적 카텝신 K 억제제의 예를 기술한다. 보다 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 다음 바람직한 골격 A를 포함하는 화합물을 특징으로 하는 카텝신 K용 프로브이다:
상기 화학식들에서,
X는 -CONH-R2-L2이고,
Y는 -{L-R1-L1}n이고,
R1, R2, L, L1, L2 및 n은 상기 정의된 바와 같고,
R은 H 또는 C1-C6-알킬이다.
화합물 1 내지 28은 S1 포켓에 L1을 갖는 카텝신 K용 기질이고, 화합물 29 내지 63은 S3 포켓에 또는 그 이상(외부)에 L1을 갖는 카텝신 K용 기질이다.
더욱 바람직하게, 화학식 I의 화합물은 카텝신 S의 억제제인 그룹 A를 포함하다. 국제 특허 출원 제WO04089395호, 제WO05040142호, 제WO0055144호, 제WO05074904호 및 제WO0069855호는 사용되어 화학식 I의 프로브로 변형될 수 있는 선택적 카텝신 S 억제제의 예를 기술한다. 보다 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 다음 바람직한 골격 A를 포함하는 화합물을 특징으로 하는 카텝신 S용 프로브이다:
상기 화학식들에서,
X는 -CONH-R2-L2이고,
Y는 -{L-R1-L1}n이고,
R1, R2, L, L1, L2 및 n은 상기 정의된 바와 같고,
R은 H 또는 C1-C6-알킬이다.
화합물 64 내지 85는 S1 포켓에 L1을 갖는 카텝신 S용 기질이고, 화합물 86 내지 119는 S3 포켓에 또는 그 이상(외부)에 L1을 갖는 카텝신 S용 기질이다.
본 발명의 영상 프로브는 중심 골격 A를 증강시키고, 그룹 L 및 그룹 -C(O)-NH-를 통해 이 단위에 링커 및 라벨 1 또는 2를 부착시키는 것으로 당해 기술 분야에 공지된 적합한 보호 그룹 화학을 사용하여 합성할 수 있다. 적합한 빌딩 블록 뿐만 아니라 FRET-쌍, 예를 들어, 시아닌-염료(예: Cy 3B, Cy 5.5, Cy 7)는 시판된다(예: Sigma-Aldrich, GE-Healthcare). 본 발명에 기술된 프로브의 서브세트의 경우, 고체-상 합성 방법이 특히 유용하다(참조: B. J. Merrifield, Methods in Enzymology 1997,289, 3-13). 합성 요구조건, 부착 링커, 소광제 또는 형광단에 따라, 고체 지지체 상에서 또는 용액 상 화학으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 중심 골격 A 상의 반응성 측쇄 잔기 및 임의로 그룹 L은 각각 서브단위 L1R1 및 L2R2를 사용하는 추가의 변형을 위해 보호되고 후속적으로 유리된다. 이들 서브단위의 접합은 공지된 화학적 합성 방법으로 달성될 수 있다. 두 단위를 아미드 결합을 통해 연결하는 골격 A의 염료 활성 에스테르와 1급 아민 그룹 사이의 반응이 특히 유용하다. 중간체 뿐만 아니라 최종 프로브 분자는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제시킬 수 있고, 이들이 표지화 및 영상화 실험에 사용되기 전에 질량 분광학 및 분석적 HPLC에 의해 특성화된다.
본 발명은 다수이지만 비제한 실시예에 의해 다음 단락에서 예시된다:
바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 상기 62번으로서 도시되고, P1 위 치 및 P1-감작 위치에 발색단을 포함하는 제WO2005/082876호에 기재된 디펩타이드 카텝신 S 억제제로부터 유도된 골격 A를 포함한다. 적합한 발색단은 이들의 스펙트럼 특성이 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 적합한 방식으로 선택된다. 발색단은 형광성이거나 비형광성일 수 있다. 원칙적으로, 펩타이드 결합의 단백질 분해 분열 후 스펙트럼 변화인 중추적 요구조건이 충족되는 한, 광범위한 종류의 발색단이 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 상호작용성 발색단과 중심 골격의 결합은 링커 단위를 통해 임의로 수행된다.
바람직하게는, 형광단은 크산텐- 또는 시아닌 염료 그룹으로부터 선택된다. 카바시아닌, 티아시아닌, 옥사시아닌 및 아자시아닌의 그룹으로부터의 시아닌 염료가 더욱 바람직하다. 본 발명과 관련하여 사용되기에 적합한 시아닌 염료는 미국 특허 제5,268,468호 및 제5,627,027호에 기재되어 있다. 이들은 상표명(Amersham, GE Healthcare) Cy 3, Cy 3B, Cy 3.5, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7 및 Cy 7.5의 염료를 포함한다.
바람직하게는, 소광제 단위는 2,4-디니트로페닐, 4-(4-디메틸아미노페닐)아조벤조산(DABCYL), 7-메톡시-쿠마린-4-일)아세틸을 포함하는 비형광성 발색단 및 국제공개공보 제WO 9964519호에 기술된 바와 같은 비형광성 시아닌 염료이다.
바람직한 양태에서, 소광제는 중요한 발광을 나타내지 않고, 보다 바람직하게는 비형광성 발색단이다. 이 양태에서, 영상화 시약은 형광단 및 비형광성 (흑색) 수용체 발색단을 포함한다. P1 위치에 BHQ3-소광제를 포함하고, P1-감작 위치에 CY 7 형광단(Abb.2)을 포함하는 카텝신 S 특이적 골격을 기본으로 하는 프로브 가 보다 바람직하다.
P1 위치에 QSY 21-소광제를 포함하고, P1-감작 위치에 CY 5.5 형광단을 포함하는 모르폴린 디펩타이드 골격을 기본으로 하는 화학식 I의 프로브가 더욱 바람직하다(반응식 2):
추가로 바람직한 양태는 P1에 흑색 소광제 BHQ 3을 포함하고, P1-감작 위치에 Cy 7 형광단을 포함하는 동일한 골격을 포함한다(반응식 3):
추가의 바람직한 양태에서, 국제공개공보 제WO9924460호에 기재된 카텝신 S용 벤즈아미드 디펩타이드성 골격 A는 소광제 분자 QSY 21을 P1에 위치시키고, 형광단 CY 5.5를 P1-감작 위치에 위치시킴으로써 영상 프로브로 전환시킨다(반응식 4):
추가의 바람직한 양태에서, 상기한 벤즈아미드 디펩타이드 골격을 개질시키고, 소광제 QSY 21을 P3에 상응하는 위치에 위치시킨다(반응식 5).
P1 위치에 비형광성 BHQ 3 소광제를 포함하고, P1' 위치에 CY7 형광단을 포함하는 카텝신 S 특이적 벤즈아미드 골격을 기본으로 하는 프로브가 추가로 바람직하다(반응식 6).
추가로 바람직한 양태에서, 상기 벤즈아미드 골격을 개질시키고, 비형광성 BHQ 3 소광제를 P3에 상응하는 위치에 위치시킨다(반응식 7).
카텝신 K용 특이적 영상 프로브는 상기한 카텝신 S 프로브보다 유사한 방식으로 증강시킨다.
추가의 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 그룹 A로서, P1 위치 및 P1-감작 위치에 발색단을 포함하는, 국제공개공보 제WO2005049028호에 기술되고 상기 제1번으로서 제시된 바와 같은 카텝신 K 억제제로부터 유도된 피페라진계 골격을 포함한다.
바람직한 양태에서, 플루오레세인 및 테트라메틸로다민이 상호작용성 FRET 쌍으로서 선택되고, 테트라메틸로다민은 골격의 P1 위치에 위치시키는 반면, 플루오레세인은 반응식 8에 도시된 바와 같이 P1-감작 위치를 통해 결합된다:
바람직한 양태에서, 소광제는 중요한 발광을 나타내지 않고, 보다 바람직하게는 비형광성 발색단이다. 이 양태에서, 영상화 시약은 형광단 및 비형광성 (흑색) 수용체 발색단을 포함한다. 반응식 9에 개요된 바와 같이 P1 위치에 BHQ 3 소광제를 포함하고, P1-감작 위치에 CY 7 형광단을 포함하는 카텝신 K 특이적 골격을 기본으로 하는 화학식 I의 프로브가 보다 바람직하다:
피페라진 골격을 기본으로 하여, 추가의 바람직한 양태는 소광제 분자를 골격의 P3 위치에 위치시킨 반면 상응하는 형광단 Cy 5.5는 P1-감작 위치에 잔류시킨 화학식 I의 카텝신 K 프로브를 포함한다(반응식 10):
추가의 바람직한 양태에서, 카텝신 K 프로브의 소광제 단위는 P3 위치에 비형광성 BHQ 3 소광제를 포함하고, P1-감작 위치에 상응하는 형광단 Cy 7을 포함한다(반응식 11):
추가의 바람직한 양태는 골격 A로서 티아졸을 포함하는 카텝신 K용 프로브[문헌(참조: U. Grabowska et al., Curr. Opin. Drug Disc. 2005, 8, 619-630)에 기술됨]이다. 따라서, 카텝신 K 활성의 영상화용으로 추가로 바람직한 화학식 I의 화합물은 티아졸 골격의 P1 위치에 소광제를, P1-감작 위치에 형광단 Cy 5.5를 포함한다(반응식 12):
비형광성 소광제 분자 BHQ 3이 P1 위치에 사용되고, 형광단 CY 7이 P1-감작 위치를 통해 부착된 카텝신 K 프로브에 동일한 고안 원리를 적용한다(반응식 13):
추가의 바람직한 양태에서, FRET-쌍의 하나의 상호작용 파트너는 나노입자를 포함한다. 본 발명과 관련하여 CdSe 나노입자(예: 양자-점) 및 란탄족 이온 도핑된 산화물 나노입자(예: Y0.6Eu0.4VO4)가 보다 바람직하다. 이러한 나노입자가 FRET 쌍에 공여체로서 사용될 경우, 이들은 수용체 흡수 파장보다 훨씬 짧은 파장에서 여기되어 직접 수용체 여기를 최소화시킬 수 있다. 또한, 협소한 공여체 발광은 수용체 발광과 중첩되지 않는다. 또한, 이러한 나노입자는 신속하게 광표백되는 유기 염료보다 훨씬 더 광안정성인 것으로 입증되었다. 활성화 양자점은 시 판되고(Invitrogen, Molecular probes), 이들의 방출 파장은 각종 생성물로부터 선택될 수 있다.
반응식 14 및 15는 시스테인 카텝신 S에 특이적인 화학식 I의 양자점계 프로브를 나타낸다. 따라서, 추가의 바람직한 화학식 I의 프로브에서, 양자점(QD605)은 적합한 링커를 통해 카텝신 S 프로브의 P1(반응식 14) 또는 P1-감작 위치(반응식 15)에 위치시킬 수 있다.
양자점은 회색 원으로서 제시되고, 적합한 수용체 분자는 시아닌 염료 CY 7로 제시된다.
추가의 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브 중의 양자점은 단백질 분해 분열가능한 서브단위를 통해 금-나노입자에 연결된다(반응식 16):
금 나노입자(AuNP)는 유기 형광성 염료 뿐만 아니라 양자점을 위한 효과적인 소광제로서 제시되어 왔다. AuNP와 함께 양자점의 적용은, 예를 들어, 국제공개공보 제WO2006126570호에 기재되어 있다.
추가의 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 2개의 특이적 프로테아제 프로브가 함께 공유 결합된 다수-FRET 시스템으로 이루어진다(반응식 17):
이러한 배열에서, 단일 파장에서 여기시킬 수 있고, 독특한 FRET 징후로서 상이한 발광 비율을 사용한다(참조: K.E Sapsford et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562 - 4588). 이 프로브는 카텝신 K용 골격 및 카텝신 S용 골격인 한 분자에 2개의 특이성을 결합한다.
2개의 서브그룹 A(카텝신 K에 특이적)가 흑색 소광제 BHQ-3을 사용하여 유도 되어 동일한 형광성 염료(예: Cy 7)에 공유결합된 화학식 I의 화합물과 관련하여 바람직하게 사용된 카텝신 K 프로브의 배열은 반응식 18에 도시된다:
추가의 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 긴 순환 시간을 갖고, 높은 종양 축적성을 가지며 효소 활성화 후 근적외선 스펙트럼에서 형광성으로 되는 소광된 형광성 마커를 함유하도록 고안된다. 이러한 프로브는 다수의 NIR 형광색소가 유리 폴리-리신 잔기에 결합된 합성 그래프트 공중합체[부분적으로 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 개질된 폴리-D 또는 L-리신]를 기초로 한다. 이들 거대분자의 형광성은, NIR-발색단의 고밀도 및 근접성에 의한 내부 소광에 기인하여 매우 감소 된다.
일례로서, 반응식 19는 A의 폴리-리신 주쇄에의 결합이 P1 위치에서 링커를 통해 달성되고 NIR-발색단 Cy 5.5가 P1-감작 위치에 부착된 중합체계 카텝신 K 프로브를 도시한다:
반대 상황은 도 20에 도시되고, 여기서 NIR-발색단 Cy 5.5는 P1 위치에 부착되는 반면, 폴리-리신 주쇄는 P1-감작 위치에서 링커를 통해 결합된다:
추가의 바람직한 양태에서, 화학식 I의 프로브는 균질한 효소 관련 발광성 검정에 사용되도록 고안된다. 다음 반응식은 상기한 작용 메카니즘을 총칭적으로 도시한다. 루시페린은 루시페라제용 기질이고, 발광성 신호는 제2 효소 반응에 의해 생성된다:
다음 반응식은 상기한 작용 메카니즘을 도시하고, 루시페린은 피리다지노디아제핀-유도체로 차폐되고, 상기 카텝신 K의 단백질 분해 활성을 통해 유리된다:
본 발명은 또한 개별적 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 효소 그룹용 억제제를 이들 개별적 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 효소 그룹, 바람직하게는 시스테인 카텝신 효소용 선택적 활성 기본 프로브로 변형시킴을 특징으로 하는, 시험관내 검정, 세포내 또는 다세포 유기체 중의 개개의 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 효소 그룹, 예를 들어, 시스테인 카텝신 또는 시스테인 카텝신들의 촉매 활성을 관찰하기 위한 분자 프로브의 고안 방법에 관한 것이다. 이를 달성하기 위해, 본 발명자들은 특정의 공지된 시스테인 카텝신 억제제의 친전자성 그룹을 끊어지기 쉬운 펩타이드 결합으로 대체시킨다. 바람직한 화합물은 탐지가능한 신호가 특정 표적의 효소(예: 단백질 분해) 활성에 의해 생성되는 방식으로 합성한다. 특히, 바람직한 프로브는 (i) 끊어지기 쉬운 결합의 N-말단 부분에서 특이성 결정자 A에 및 (ii) 끊어지기 쉬운 결합의 C-말단 부분에서 결합된 내부적으로 소광된 형광단(예: 적합한 FRET-쌍)을 포함한다. 본 발명은 공지된 억제제의 목적하고 이미 최적화된 특성의 전이 원소를 신규한 활성 기본 프로브로 허용한다.
종래 기술 분야에 기술된 카텝신 억제제는 니트릴 그룹을 사용한다. 본 발명의 영상 프로브는 상기한 공지된 골격을 사용하고, 먼저, 분열가능한 아미드 그룹에 의한 니트릴 그룹의 대채 및 두번째로 상호작용성 표지화 쌍 또는 특성 조절제를 아미드 그룹의 양 측면에 위치시키는 2개의 변형을 도입하게 한다.
시험관내에서, 프로테아제와 본 발명의 기질의 반응은 일반적으로 세포 추출물 중에서 또는 프로테아제의 정제되거나 풍부한 형태로 수행될 수 있다. 생체내 적용의 경우, 리포터는 바람직하게는 근적외선(NIR) 영역에서의 발광제인데, 이는 그 영역이 간섭성 생체형광성이 없기 때문이다. 이러한 요구조건을 충족시키는 공지된 시아닌 NIR 염료는 바람직하게는 본 발명의 기질에 도입된다.
화학식 I의 화합물의 분자 구조는 아미드 작용성 그룹을 포함하는 중심 골격 A와 각각 2개의 서브단위 L1R1 및 L2R2로 이루어진다. 화학식 I에 도시된 바와 같이, L2R2는 아미드 그룹이 카텝신 효소에 의해 분열될 수 있기 때문에, 항상 아미드 그룹을 통해 골격 A에 결합된다. 서브단위 L1R1을 골격 A에 부착시키기에 적합한 작용성 그룹은 당해 기술 분야의 숙련가가 선택할 수 있고, 예는 이하 제시된다. 전구체 화합물 중의 특정 작용성 그룹 L'는 합성 전략의 요구조건 및 활성 기본 영상 시약으로서의 이러한 기질의 최종 용도에 의해서만 제한되는 화학식 I의 화합물 내에서 그룹 L을 수득하기 위해 적합한 L1R1 서브단위를 부착시키기 위한 골격 A 상에 위치시킬 수 있다. 따라서, 이들의 선택은 목적하는 기질을 조립하기 위해 선택된 특정 시약에 좌우된다. A와 서브단위 R1L1을 결합시키기 위해 골격 A 상에 제공될 수 있는 작용성 그룹 L'의 예는 플루오로, 클로로, 브로모, 시아노, 니트로, 아미노, 아지도, 알킬카보닐아미노, 카복시, 카바모일, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 카브알데히드, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 탄소-탄소 이중결합, 탄소-탄소 삼중결합 등을 포함한다. 가장 바람직한 예는 아미노, 아지도, 하이드록시, 시아노, 카복시, 카바모일, 카브알데히드 또는 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-탄소 삼중결합을 포함한다. 따라서, L은 바람직하게는 직접 결합이거나, 
, -(NRx)-, -O-, -C=N-, -C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -C(=O)H, -CRx=CRy-, -C≡C- 및 페닐(여기서, Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬이다)로부터 선택된 그룹이다.
특히, 화학식 I의 화합물의 바람직한 합성은 직교로 보호된 작용성 그룹을 사용하게 한다. 이러한 보호 그룹의 선택은 각각 방출된 작용기가 또한 상응하는 서브단위의 골격 A에의 부착을 위해 추가로 화학적으로 처리될 수 있도록 개별적 탈보호를 허용한다. 계획된 작용기에 대한 적합한 보호 그룹은 당해 기술 분야의 숙련가가 선택할 수 있고, 예를 들어, 문헌(참조: T.W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 1991)에 요약된다.
화학식 L'-A-CO-OH의 화합물(골격)은, 예를 들어, 국제 특허 출원 제WO06076796호, 제WO06076797호, 제WO06063762호, 제WO05049028호, 제WO04089395호, 제WO05040142호, 제WO0055144호, 제WO05074904호 및 제WO0069855호에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명은 또한
(a) 화학식 II의 화합물을 숙련가에게 공지된 조건하에 화학식 L1-R1-H의 화합물(여기서, L1은 이의 총괄적 및 바람직한 의미로 상기 정의한 바와 같다)과 반응하여 화학식 III의 화합물을 수득하고,
(b) 화학식 III의 화합물을 화학식 H2N-R2-L2의 화합물과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득함을 특징으로 하는, n이 1인 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 화학식 II 및 III에서,
A는 이의 총괄적 및 바람직한 의미로 상기 정의된 바와 같고,
L'는 플루오로, 클로로, 브로모, 시아노, 니트로, 아미노, 아지도, 알킬카보닐아미노, 카복시, 카바모일, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 카브알데히드, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 탄소-탄소 이중결합, 탄소-탄소 삼중결합, 바람직하게는 아미노, 아지도, 하이드록시, 시아노, 카복시, 카바모일, 카브알데히드, 또는 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-탄소 삼중결합, 더욱 바람직하게는 아미노이다.
임의로, 화학식 I의 화합물의 합성은 직교로 보호된 작용성 그룹을 사용하게 한다. 이러한 보호 그룹의 선택은 각각 방출된 작용기가 라벨을 이에 부착시키거나 링커 R1 및/또는 R2의 추가의 연장 도입을 위해 또한 추가로 화학적으로 처리될 수 있도록 개별적 탈보호를 허용한다. 계획된 작용기에 적합한 보호 그룹은 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있고, 예를 들어, 문헌(참조: T.W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 1991)에 요약된다.
화학식 I의 프로브의 추가의 제조방법은
(a1) 숙련가에게 공지된 조건하에 화학식 II의 화합물과 화학식 IV의 화합물의 반응으로 화학식 V의 화합물을 수득하고,
(b) 이어서, 각 그룹에 대해 숙련가에게 공지된 조건하에 화학식 V의 화합물과 화학식 VI의 화합물을 반응시켜 PG1-R1-L-A-CO-NH-R2-PG2의 화학식 VI의 화합물을 수득하고,
(c1) 화학식 VI의 화합물의 그룹 PG2를 분열시키고, 생성되는 화합물을 라벨 L2와 반응시킨 다음, 보호 그룹 PG1을 분열시키고, 생성되는 화합물을 라벨 L1과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득하거나, 또는
(c2) 화학식 VI의 화합물의 그룹 PG1을 분열시키고, 생성되는 화합물을 라벨 L1과 반응시킨 다음, 보호 그룹 PG2를 분열시키고, 생성되는 화합물을 라벨 L2와 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득함을 포함한다.
상기 화학식 IV 내지 VI에서,
PG1 및 PG2는 서로 독립적으로 보호 그룹, 바람직하게는 직교 보호 그룹이고,
L"는 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 선택되는 L'를 위한 각각의 연결 그룹, 또는 결합이다.
단계 (b)에서, L' 및 L"의 바람직한 조합 및 반응 형태(괄호내)는 다음과 같다:
L'가 플로오로, 클로로, 브로모, 요오도이면, L"는 아미노(R-NH2), 하이드록시(R-OH), 삼중 결합(소노가시라 반응(Sonogashira Reaction)), 이중 결합(헤크 반응(Heck reaction)), 알킬 보란(스즈키 반응(Suzuki-reaction))이고;
L'가 시아노이면, L"는 아미노(R-NH2), 하이드록시(R-OH), 티올(R-SH)이고;
L'가 아미노이면, L"는 활성 카복실산(NHS-에스테르,...), 카브알데히드, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도이고;
L'가 아지도이면, L"는 삼중 결합, 포스핀 잔기(스타우딩거 리게이션(Staudinger ligation))이고;
L'가 카복시이면, L"는 아미노, 하이드록실, 하이드라지드이고;
L'가 알콕시카보닐이면, L"는 아미노, 하이드록실, 하이드라지드이고;
L'가 아릴옥시카보닐이면, L"는 아미노, 하이드록실, 하이드라지드이고;
L'가 하이드록시이면, L"는 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 하이드록시 (미쓰노부 반응(Mitsunobu-reaction)), 카복시이고;
L'가 카브알데히드이면, L"는 아미노, 하이드라진이고;
L'가 탄소-탄소 이중결합, 브로모, 클로로, 요오도(헤크 반응), 알킬 보란(스즈키 반응)이고;
L'가 탄소- 탄소 삼중결합이면, L"는 브로모, 클로로, 요오도(소노가시라 반응), 아지도이다.
바람직하게, 상이한 라벨로 작용화된 시스테인 프로테아제 기질은 고체 지지체 상에서 합성된다. 고체 상 합성용 라벨의 상용성에 따라, 고체 지지체와 용액 상 합성의 조합이 사용된다.
그룹 A가 카텝신 S 억제제로 이루어지고, L1이 6-((4,4-디플루오로-1,3-디메틸-5-(4-메톡시페닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-2-프로피오닐)아미노)헥산산, 잔기(상표명: BODIPY-TMR-X, Invitrogen)이고, L2가 소광제 QSY-7인 화학식 1의 화 합물의 제조방법은 추가로 실시예 5 내지 8에 기재된다: 측쇄의 Boc-보호된 아미노 그룹과 함께 C-말단 리신 잔기를 갖는 실시예 5의 골격은 클로로-트리틸 수지를 사용하여 고체 지지체 상에서 제조된다. 수득된 C-말단 카복실산을 모노-Fmoc-보호된 부탄-1,4-디아민과 커플링시키고, 이를 추가로 용액 중에서 변형시킨다. 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어, TFA와의 반응에 의해 리신 측쇄의 Boc-그룹을 제거한 후, 형광단(바람직하게는, 이의 N-하이드록시석신이미딜 에스테르로서 활성화됨)을 표준 조건하에 펩타이드에 커플링시켰다. 커플링된 중간체 화합물을, 예를 들어, 예비 HPLC로 임의로 정제시킬 수 있다. C-말단 Fmoc-그룹을 제거한 후, 소광제(바람직하게는 이의 N-하이드록시석신이미딜 에스테르로서 활성화됨)를 펩타이드에 커플링시키고, 최종 생성물을 예비 HPLC로 정제시켰다.
펩타이드모방체 구조를 갖는 다수의 시스테인 카텝신 기질의 합성을 위해, 비펩타이드성 빌딩 블록을 고체 상 합성용으로 사용할 수 있다. 빌딩 블록 합성은 각각 실시예 20 내지 22에서 화학식 II로, 실시예 23 및 24에서 화학식 III으로, 실시예 17에서 화학식 IV로 추가로 기술된다.
화학식 II
화학식 III
화학식 IV
화학식 II의 빌딩 블록은 바람직하게는 2개의 상이한 라벨이 프로브의 C 및 N-말단에서 결합된 화학식 I의 화합물의 합성에 사용된다.
화학식 III의 빌딩 블록은 바람직하게는 카텝신 K 프로브의 합성용으로 사용된다.
화학식 IV의 빌딩 블록은 바람직하게는 카텝신 B 프로브, 예를 들어, 실시예 18 및 19의 화합물의 합성용으로 사용된다.
본 발명의 프로브는 바람직하게는 카텝신 K, 카텝신 S 또는 카텝신 B용 프로브이다.
본 발명의 프로브는 시험관내, 세포-배양 실험, 생체외 실험 또는 살아있는 유기체(생체내)에서, 스크리닝 및 전체 동물 영상화를 포함하여 분자 영상화와 관련하여 사용된다. 영상화 양식, 예를 들어, 광학적 영상화 및 자기 공명 영상화(MRI)가 대부분 바람직하다.
본 발명의 프로브는 프로테아제 활성의 진단 영상화용으로 사용된다. 표적 프로테아제를 향한 약물 또는 약물 유사 물질의 효과를 모니터하는 방법을 제공하는 적용이 가장 바람직하다. 이러한 약물 또는 약물 유사 물질의 투여는 본 발명의 프로브로부터의 신호에 대한 측정가능한 효과를 가져야 한다.
본 발명의 프로브의 추가의 가장 바람직한 국면은 수술 가이던스(surgical guidance) 중의 영상화 시약으로서의 이들의 용도 및 의학 치료 효과를 모니터하는 것이다. 수술 가이던스는 종양 가장자리의 탐지 및 종양 전이 진행의 탐지를 포함한다.
따라서, 본 발명의 추가의 국면은
(a) 화학식 I의 프로브를 살아있는 유기체에 투여하고,
(b) 상기 유기체를 비소광된 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 탐지가능한 신호를 생성하고,
(c) 상기 신호를 탐지하고 이에 의해 영상을 생성함을 포함하는, 살아있는 유기체의 영상화 방법이다.
대안적으로, 살아있는 유기체의 영상화 방법은
(a) 화학식 I의 프로브를 상기 유기체에 투여하고,
(b) 상기 유기체를 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 탐지가능한 신호를 생성하고,
(c) 상기 신호를 탐지하고 이에 의해 영상을 생성함을 포함한다.
"살아있는 유기체"는 탐지되는 시스테인 프로테아제를 포함하는 살아있는 세포 또는 전체 유기체일 수 있고, 바람직하게는 살아있는 유기체는 포유동물, 예를 들어, 마우스 또는 래트이다.
본 발명의 프로브는 매우 선택적이고, 이에 의해 위양성(false positives) 위험을 피할 수 있다.
약어:
DMF = 디메틸포름아미드
DMSO = 디메틸설폭사이드
DCM = 디클로로메탄
equiv. = 당량
sat. = 포화됨
THF = 테트라하이드로푸란
DIPEA = 디이소프로필-에틸 아민
HOBt = 1-하이드록시벤조트리아졸
HBTU = O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄-헥사플루오로-포스페이트
NHS = N-하이드록시석신이미딜 에스테르
고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적 절차:
다음 프로브는 표준 고체 상 펩타이드 합성을 사용하여 합성하였다. 클로로-트리틸-수지를 고체 지지체로서 사용하였다. 수지를 적재시키기 위해, 2당량의 Fmoc-보호된 아미노산 및 3당량의 DIPEA를 DCM에 용해시키고, 반응 혼합물을 수지 에 첨가하였다(적재량: 1.4mmol/g). 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 수지를 DCM 및 DMF으로 세척하였다. Fmoc-탈보호를 위해, 수지를 15분 동안 30% 피페리딘/DMF 용액으로 2회 처리하였다. 고체 상 펩타이드 합성을 위해, 표준 프로토콜을 사용하였다: 4당량의 Fmoc-보호된 아미노산, 4당량의 HBTU, 4당량의 HOBt 및 8당량의 DIPEA를 DCM/DMF(1/1)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반시킨 다음, 수지에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 배양하였다. 고체 상으로부터의 분열을 위해, 수지를 DCM 중의 2% TFA로 처리하였다. 용매를 감압하에 톨루엔과 공증발시키고, 최종 생성물을 예비 HPLC(구배: H2O+0.05% TFA; 5 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다.
실시예 1 : 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1033.25, 실측치: [M+H]+ = 1033.40. 수율: 97%.
실시예 2: 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1042.26, 실측치: [M+H]+ = 1042.40. 수율: 82%.
실시예 3: 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1341.59, 실측치: [M+H]+ = 1341.45. 수율: 91%.
실시예 4: 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M/2]+ = 829.95, 실측치: [M/2]+ = 829.95. 수율: 62%.
실시예 5
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 정제하지 않고 추가로 사용하였다. 계산치: [M+H]+ = 513.7, 실측치: [M+H]+ = 513.3.
실시예 6
실시예 5의 생성물, 1.2당량의 HOBt, 1.3당량의 HBTU 및 2당량의 DIPEA를 DCM/DMF에 용해시키고, 실온에서 20분 동안 교반시켰다. 2당량의 모노-Fmoc-보호된 부탄-1,4-디아민 및 1.5당량의 DIPEA를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 이를 밤새 교반시켰다. 용매를 제거하고, 나머지 잔사를 실리카 겔(구배: DCM/1 내지 5% MeOH) 상에서 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 805.0, 실측치: [M+H]+ = 806.5. 수율: 55%.
실시예 7
Boc-그룹의 제거를 위해, 실시예 6의 화합물을 50% TFA/CH2Cl2에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 용매를 톨루엔과 함께 공증발시키고, 잔사를 DMF에 용해시켰다. 1당량의 BodipyTMR-X-OSu 및 6당량의 DIPEA를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 12시간 동안 실온에서 교반시켰다. 용매를 제거하고, 최종 생성물을 예비 HPLC(Plab)로 정제시켰다. 계산치: [M+Na]+ = 1221.3, 실측치: [M+Na]+ = 1221.6.
실시예 8
Fmoc-그룹의 제거를 위해, 실시예 7의 화합물을 Et2NH/DMF(1/4)에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔사를 DMF에 재용해시켰다. QSY 7OSu 및 6당량의 DIPEA를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반시켰다. 용매를 제거하고, 최종 생성물을 예비 HPLC(구배: H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M/2]+ = 808.4, 실측치: [M/2]+ = 808.5.
실시예 9: 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(구배: H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1114.3, 실측치: [M+H]+ = 1114.4.
실시예 10: 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 실시예 5 내지 실시예 8의 변형에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 추가로 변형시켰다. 당해 화합물을 HPLC(구배: H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1198.3, 실측치: [M+H]+ = 1198.3.
실시예 11 : 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 실시예 5 내지 실시예 8의 변형에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 추가로 변형시켰다. 당해 화합물을 HPLC(구배: H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+Na]+ = 1619.1 , 실측치: [M+Na]+ = 1619.9.
실시예 11a: 카텝신 S 프로브
당해 화합물을 고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 실시예 5 내지 실시예 8의 변형에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 추가로 변형시켰다. 당해 화합물을 HPLC(구배: H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다.
실시예 12: 카텝신 K 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1117.37, 실측치: [M+H]+ = 1117.50. 수율: 45%.
실시예 13: 카텝신 K 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1186.4, 실측치: [M+H]+ = 1186.3. 수율: 90%.
실시예 14: 카텝신 K 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1273.4, 실측치: [M+H]+ = 1273.4.
실시예 15: 카텝신 K 프로브
당해 화합물을 고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 실시예 5 내지 실시예 8의 변형에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 추가로 변형시켰다. 당해 화합물을 HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1301.5, 실측치: [M+H]+ = 1301.3.
실시예 16: 카텝신 K 프로브
당해 화합물을 고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 실시예 5 내지 실시예 8의 변형에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 추가로 변형시켰다. 당해 화합물을 HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M]+ = 1663.9, 실측치: [M]+ = 1663.7.
실시예 17: 카텝신 K 프로브
당해 화합물을 고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 실시예 5 내지 실시예 8의 변형에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 추가로 변형시켰다. 당해 화합물을 HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다.
실시예 18: 카텝신 K 프로브
당해 화합물을 고체 상 펩타이드 합성을 위한 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, 실시예 5 내지 실시예 8의 변형에 대해 기술된 바와 동일한 방식으로 추가로 변형시켰다. 당해 화합물을 HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다.
실시예 19
4-Fmoc-아미노 부투르산, 1.1당량의 HOBt, 1.1당량의 HBTU 및 2당량의 DIPEA를 DMF/DCM(1/1)에 용해시키고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 4-아미노-2-플루오로 벤조산 및 2당량의 DIPEA를 반응 혼합물에 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 나머지 잔사를 크로마토그래피하였다(구배: DCM/1 내지 3% MeOH). 계산치: [M+H]+ = 463.5, 실측치: [M+H]+ = 463.1. 수율: 60%.
실시예 20: 카텝신 B 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M+H]+ = 1615.8, 실측치: [M+H]+ = 1615.5. 수율: 42%.
실시예 21 : 카텝신 B 프로브
당해 화합물을 일반적인 절차에 따라 고체 지지체 상에서 제조하고, HPLC(H2O+0.05% TFA; 4 내지 95% CH3CN)로 정제시켰다. 계산치: [M/2]+ = 718.3, 실측치: [M/2]+ = 718.8. 수율: 10%
실시예 22: 1-Boc-4-(3-클로로프로필)-피페라진
15ml DMF(무수) 중의 4.94g의 3급-부틸-1-피페라진-카복실레이트 및 12.66g의 1-브로모-3-클로로프로판의 용액에 4.08g의 K2CO3를 첨가하고, 반응물을 1분 동안 50℃로 가열하고, 실온에서 추가로 3시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 200ml의 물에서 주시하고(pored), DCM으로 추출시켰다. 합한 유기 상을 물로 세척 하고, MgSO4로 건조시키고, 진공하에 증발시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트 1:1, RF = 0.3)로 정제시켰다. 수율: 3.9g.
실시예 23: 1-Boc-4-(3-아지도프로필)-피페라진
3급-부틸-4-(3-클로로프로필)-1-피페라진 카복실레이트 및 나트륨-아지드를 8ml의 무수 DMSO에 용해시키고(현탁시키고), 15시간 동안 90℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 50ml의 물에서 주시하였다. 생성물을 DCM으로 추출시키고, 합한 유기 상을 MgSO4로 건조시켰다. 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/에틸 아세테이트 1:1, RF = 0.34)로 정제시켰다. 수율: 3.5g.
실시예 24: (3-아지도프로필)-피페라진
3.5g의 1-Boc-4-(3-아지도프로필)-피페라진을 30ml MeOH/DCM(3/1)에 용해시키고, 10ml의 TFA를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반시키고, 생성물을 150ml의 3급-부틸-메틸 에테르를 첨가하여 침전시켰다. 수율: 2.3g.
실시예 25: 메틸-피페라지닐 티오우레아
티오카보닐디이미다졸 및 1당량의 N-메틸-피페라진을 THF에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안, 55℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매의 반을 제거하고, 동일량의 2.0M NH3/MeOH 용액을 반응 혼합물을 첨가한 다음, 이를 실온에 서 밤세 교반시키고, 최종적으로 55℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 생성물을 여과시키고, 에테르로 세척하였다. 수율: 57%.
실시예 26: 메틸-피페라지닐-티아질-벤조산
4-메틸-피페라지닐 티오우레아 및 4-(2-브로모아세틸)벤조산을 THF에 용해시켰다. 반응 혼합물을 3시간 동안 가열 환류시켰다. 생성물을 여과시키고, 에테르로 세척하였다.
실시예 27: 활성 검정
시험관내 검정을 위해, 20㎕의 AHNP-Puffer(150mM Acetat/HEPES, 300mM NaCl; 0.001% Pluronic pH 6.5 및 50㎕의 시스테인(300mM) 중의 1㎍의 프로테아제를 37℃에서 5분 동안 활성화시켰다. 기질을 DMSO에 용해시키고, 최종 농도 50μM로 효소 용액에 첨가하였다.
형광성을 Tecan SAFIRE II 분광계(여기 파장: 336㎚; 발광 파장: 490㎚; 여기 밴드: 10.0㎚; 발광 밴드: 10.0㎚; 배율(매뉴얼): 90)로 측정하였다.
(측정은 pH 7.5에서 수행됨)
(측정은 pH 5.5에서 수행됨)
Claims (20)
- 화학식 I의 시스테인 프로테아제용 분자 프로브.화학식 I{L1-R1-L}n-A-CO-NH-R2-L2상기 화학식 I에서,A는 카텝신에 의해 인지가능한 그룹이고;R1은 링커이고;R2는 결합 또는 링커이고;L은 결합이거나 그룹 L1의 용이한 접합(facile conjugation)을 가능하게 하는 그룹이고;L1 및 L2는 서로 독립적으로 고체 지지체에 임의로 결합된 하나 이상의 라벨이고;n은 1이고;또는R2는 결합이고;L2는 커플링된 생체발광성 검정에 적합한 기질이고;n은 0이다.
- 제1항에 있어서,n이 1이고;A가 시스테인 카텝신에 의해 인지가능한 그룹이고;R1 및 R2가 서로 독립적으로 링커이고;L이 결합이거나 그룹 L1의 용이한 접합을 가능하게 하는 그룹이고;L1 및 L2가 서로 독립적으로 고체 지지체에 임의로 결합된 하나 이상의 라벨인 분자 프로브.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 시스테인 프로테아제가 시스테인 카텝신 아과로부터 선택되는 프로브.
- 제3항에 있어서, 시스테인 카텝신이 카텝신 K, S 또는 B인 프로브.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, L이 직접 결합이거나,, -(NRx)-, -O-, -C=N-, -C(=O)-, -C(=O)-NH-, -NH-C(=O)-, -C(=O)H, CRx=CRy-, -C≡C- 및 페닐로부터 선택되는 그룹이고, 여기서 Rx 및 Ry는 독립적으로 H 또는 (C1-C6)알킬인 프로브.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, R1 또는 R2가 탄소수 1 내지 300의 직쇄 또는 측쇄 알킬렌 그룹이고, 여기서, 임의로(a) 하나 이상의 탄소원자는 산소로 대체되고, 특히 3번째 탄소원자마다 산소로 대체되고/되거나(예를 들어, 1 내지 100개의 에틸렌옥시 단위를 갖는 폴리에틸렌옥시 그룹);(b) 하나 이상의 탄소원자는 수소원자를 동반하는 질소로 대체되고, 인접하는 탄소원자는 옥소에 의해 치환되고/되거나(이는 아미드 작용기 -NH-CO-를 나타냄);(c) 하나 이상의 탄소원자는 에스테르 작용기 -O-CO-로 대체되고;(d) 2개의 인접한 탄소원자 사이의 결합은 이중결합 또는 삼중결합이고/이거나;(e) 2개의 인접한 탄소원자는 디설파이드 결합으로 대체되는 프로브.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 라벨 L1 및 L2가 서로 독립적으로 분광학적 프로브, 예를 들어, 형광단; 소광제 또는 발색단; 자기 프로브; 콘트라스트 시약; 특이적으로 파트너에 결합할 수 있는 특정 결합 쌍의 한 파트인 분자; 유리 슬라이드, 미세역가 플레이트 또는 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 중합체일 수 있는 고체 지지체에 공유 결합된 분자; 바람직한 효소적, 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 생분자; 또는 상기 나열된 특성의 조합을 포함하는 분자; 또는 양으로 하전된 직쇄 또는 측쇄 중합체인 프로브.
- 제7항에 있어서, 라벨 L1 및 L2가 서로 독립적으로 양으로 하전된 직쇄 또는 측쇄 중합체에 결합된 프로브.
- 제8항에 있어서, 하나의 라벨 L1 및 L2가 6 내지 15개의 아르기닌 잔기를 갖는 D- 및/또는 L-아르기닌의 선형 폴리(아르기닌)인 프로브.
- 제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, L1이 2개의 상호작용성 분광학적 프로브 L1/L2의 한 원(member)이고, L2가 나머지 원인 프로브.
- 제10항에 있어서, L1/L2가 FRET 쌍인 프로브.
- 제11항에 있어서, 하나의 L1/L2가 Alexa 350, 디메틸아미노쿠마린, 5/6-카복시플루오레세인, Alexa 488, ATTO 488, DY-505, 5/6-카복시플루오레세인, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 555, ATTO 488, ATTO 532, 테트라메틸로다민, Cy 3, DY-505, DY-547, Alexa 635, Alexa 647, ATTO 600, ATTO 655, DY-632, Cy 5, DY-647 Cy 5.5로부터 선택된 형광단이고, 나머지 라벨 L1/L2가 Dabsyl, Dabcyl, BHQ 1, QSY 35, BHQ 2, QSY 9, ATTO 540Q, BHQ 3, ATTO 612Q, QSY 21로부터 선택된 소광제인 프로브.
- 제1항에 있어서, 중심 골격 A로부터 분열시, 리포터 그룹으로서 개질된 아미 노루시페린 또는 카복시 말단 보호된 이의 유도체가 루시페라제에 의한 이의 전환을 통해 발광 신호를 생성할 수 있음을 특징으로 하는 커플링된 생체발광성 검정에 적합한, n이 0이고, R2가 결합이고, L2가 기질인 프로브.
- 제1항에 있어서, A가 다음으로부터 선택되는 선택적 카텝신 K 골격인 프로브.
상기 화학식들에서,X는 -CONH-R2-L2이고,Y는 -L-R1-L1이고,R은 H, C1-C6-알킬이다. - 제1항에 있어서, A가 다음으로부터 선택되는 선택적 카텝신 S 골격인 프로브.
상기 화학식들에서,X는 -CONH-R2-L2이고,Y는 -L-R1-L1이고,R은 H, C1-C6-알킬이다. - 제1항에 있어서, 다음 그룹으로부터 선택된 프로브.
상기 화학식들에서,는 양자 점이다.
- (a) 화학식 II의 화합물을 화학식 L1-R1-H의 화합물과 반응시켜 화학식 III의 화합물을 수득하고,(b) 화학식 III의 화합물을 화학식 H2N-R2-L2의 화합물과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 수득함을 특징으로 하는, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 I의 프로브의 제조방법.화학식 IIL'-A-CO-OH화학식 IIIL1-R1-L-A-CO-OH상기 화학식 II 및 III에서,L'는 플루오로, 클로로, 브로모, 시아노, 니트로, 아미노, 아지도, 알킬카보닐아미노, 카복시, 카바모일, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 카브알데히드, 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 탄소-탄소 이중결합, 탄소-탄소 삼중결합, 바람직하게는 아미노, 아지도, 하이드록시, 시아노, 카복시, 카바모일, 카브알데히드, 또는 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-탄소 삼중결합, 더욱 바람직하게는 아미노이고,R1 및/또는 R2는 적합한 직교 보호 그룹으로 보호된 후, 화학식 I의 화합물의 제조 동안 분열될 수 있다.
- 시험관내, 세포-배양 실험, 생체외 실험 또는 살아있는 유기체 중에서의 분자 영상화를 위한, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 I의 프로브의 용도.
- (a) 화학식 I의 프로브를 살아있는 유기체에 투여하고,(b) 상기 유기체를 비소광된 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 탐지가능한 신호를 생성하고,(c) 상기 신호를 탐지하고 이에 의해 영상을 생성함을 포함하는, 살아있는 유기체를 영상화하기 위한, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 프로브의 용도.
- (a) 화학식 I의 프로브를 살아있는 유기체에 투여하고,(b) 상기 유기체를 형광단을 여기시키는 전자기 방사선에 노출시켜 탐지가능한 신호를 생성하고,(c) 상기 신호를 탐지하고 이에 의해 영상을 생성함을 포함하는, 살아있는 유기체를 영상화하기 위한, 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 프로브의 용도.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP07004121 | 2007-02-28 | ||
| EP07004121.5 | 2007-02-28 | ||
| EP07291315 | 2007-10-30 | ||
| EP07291315.5 | 2007-10-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090115944A true KR20090115944A (ko) | 2009-11-10 |
Family
ID=39323713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020097018084A KR20090115944A (ko) | 2007-02-28 | 2008-02-08 | 영상 프로브 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8771644B2 (ko) |
| EP (1) | EP2117605B1 (ko) |
| JP (1) | JP2010519320A (ko) |
| KR (1) | KR20090115944A (ko) |
| AU (1) | AU2008221036B2 (ko) |
| BR (1) | BRPI0808046A2 (ko) |
| CA (1) | CA2678717A1 (ko) |
| HK (1) | HK1141243A1 (ko) |
| IL (1) | IL200566A0 (ko) |
| MX (1) | MX2009008560A (ko) |
| MY (1) | MY162041A (ko) |
| WO (1) | WO2008104271A2 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180010177A (ko) * | 2015-01-22 | 2018-01-30 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | 생체내 영상화를 위한 프로테아제 활성화 조영제 |
| KR20200002874A (ko) * | 2017-03-30 | 2020-01-08 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | 생체 내 이미징을 위한 프로테아제 활성화 조영제 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3335079B2 (ja) * | 1996-07-01 | 2002-10-15 | シャープ株式会社 | Ａｇｃ回路 |
| EP2262783A2 (en) * | 2008-02-21 | 2010-12-22 | Sanofi-Aventis | Covalently binding imaging probes |
| US9155471B2 (en) * | 2009-05-27 | 2015-10-13 | Lumicell, Inc'. | Methods and systems for spatially identifying abnormal cells |
| US9314304B2 (en) | 2010-12-08 | 2016-04-19 | Lumicell, Inc. | Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution |
| US20140113322A1 (en) * | 2012-10-22 | 2014-04-24 | The Johns Hopkins University | Supramolecular nanobeacon imaging agents as protease sensors |
| WO2014152389A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Lumicell, Inc. | Imaging agent for detection of diseased cells |
| CN112574227A (zh) * | 2020-12-15 | 2021-03-30 | 井冈山大学 | 一类具有螺内胺连接吗啉结构的pH探针及其合成方法和应用 |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5627027A (en) | 1986-04-18 | 1997-05-06 | Carnegie Mellon University | Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods |
| DE3700908A1 (de) * | 1987-01-14 | 1988-07-28 | Geiger Reinhard | Aminoluciferine, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung bei der bestimmung von enzymaktivitaeten |
| GB9024129D0 (en) * | 1990-11-06 | 1990-12-19 | Thrombosis Research Trust | Inhibitors and substrates of thrombin |
| US5268468A (en) | 1991-12-05 | 1993-12-07 | Hoechst-Roussel Pharmaceuticals Incorporated | N-nitrosophenoxybenzenepropanamine and N-1-chloroethyl carbamate intermediates |
| US6288037B1 (en) * | 1996-01-29 | 2001-09-11 | Basf Aktiengesellschaft | Substrates and inhibitors for cysteine protease ICH-1 |
| US6083486A (en) | 1998-05-14 | 2000-07-04 | The General Hospital Corporation | Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes |
| GB9812596D0 (en) | 1998-06-11 | 1998-08-12 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Energy transfer assay method |
| TW200404789A (en) * | 1999-03-15 | 2004-04-01 | Axys Pharm Inc | Novel compounds and compositions as protease inhibitors |
| GB9911417D0 (en) | 1999-05-18 | 1999-07-14 | Peptide Therapeutics Ltd | Furanone derivatives as inhibitors of cathepsin s |
| AU4906100A (en) | 1999-05-27 | 2000-12-18 | Merck Frosst Canada & Co. | Assays for caspase activity using green fluorescent proteins |
| AU2002232681A1 (en) * | 2000-11-10 | 2002-05-21 | The Regents Of The Univeristy Of California | Activity-dependent cysteine protease profiling reagent |
| EP1379284A4 (en) * | 2001-01-05 | 2007-07-25 | Gen Hospital | ACTIVE IMAGING PROBES |
| US7354735B2 (en) | 2001-05-24 | 2008-04-08 | Hong Kong University Of Science And Technology | Nucleic acid encoding fluorescent protein constructs and methods for detecting apoptosis |
| US20030059847A1 (en) * | 2001-08-27 | 2003-03-27 | Irm, Llc | Combinatorial protease substrate libraries |
| EP2388254B1 (en) | 2002-02-01 | 2016-08-10 | Promega Corporation | Bioluminescent protease assay |
| AU2003275055A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-04-19 | The General Hospital Corporation | Azulene dimer-quenched, near-infrared fluorescent probes |
| EP1613351A1 (en) * | 2003-03-10 | 2006-01-11 | MPA Technologies, Inc. | Targeted agents for both photodiagnosis and photodynamic therapy |
| WO2004089395A2 (en) * | 2003-04-01 | 2004-10-21 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Use of an inhibitor of cathepsin-s or -b to treat or prevent chronic obstructive pulmonary disease |
| WO2005040142A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Novel keto-oxadiazole derivatives as cathepsin inhibitors |
| KR20060107792A (ko) * | 2003-11-19 | 2006-10-16 | 노파르티스 아게 | 중증 골 소실 질환의 치료를 위한 카텝신 ｋ 억제제의 용도 |
| NO20035683D0 (no) * | 2003-12-18 | 2003-12-18 | Amersham Health As | Optisk avbildning av prostatakreft |
| JP2007519744A (ja) * | 2004-01-30 | 2007-07-19 | バイエル・シエーリング・ファーマ アクチエンゲゼルシャフト | システインプロテアーゼインヒビターとしてのシリナン化合物。 |
| WO2005082876A1 (en) | 2004-03-01 | 2005-09-09 | Medivir Uk Ltd | C-5 substituted furanone dipeptide cathepsin s inhibitors |
| US20060073529A1 (en) * | 2004-08-13 | 2006-04-06 | Contag Christopher H | Luciferyl peptide substrate |
| GB0427380D0 (en) * | 2004-12-14 | 2005-01-19 | Novartis Ag | Organic compounds |
| WO2006076797A1 (en) * | 2005-01-19 | 2006-07-27 | Merck Frosst Canada Ltd. | Cathepsin k inhibitors and atherosclerosis |
| EP1841419A4 (en) * | 2005-01-19 | 2009-02-25 | Merck Frosst Canada Ltd | INHIBITORS OF CATHEPSIN K AND OBESITY |
| EP1900822B1 (en) | 2005-05-24 | 2016-02-03 | Suzuki, Miho | Method for simultaneous analysis of multiple biological reactions or changes in in vivo conditions |
| US8968700B2 (en) * | 2005-08-11 | 2015-03-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Imaging of protease activity in live cells using activity based probes |
| WO2007027653A1 (en) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Promega Corporation | Cell-based luminogenic and nonluminogenic proteasome assays |
-
2008
- 2008-02-08 EP EP08715713A patent/EP2117605B1/en not_active Not-in-force
- 2008-02-08 AU AU2008221036A patent/AU2008221036B2/en not_active Ceased
- 2008-02-08 WO PCT/EP2008/000963 patent/WO2008104271A2/en active Application Filing
- 2008-02-08 KR KR1020097018084A patent/KR20090115944A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-02-08 CA CA002678717A patent/CA2678717A1/en not_active Abandoned
- 2008-02-08 MY MYPI20093431A patent/MY162041A/en unknown
- 2008-02-08 JP JP2009551109A patent/JP2010519320A/ja not_active Ceased
- 2008-02-08 MX MX2009008560A patent/MX2009008560A/es active IP Right Grant
- 2008-02-08 BR BRPI0808046-1A patent/BRPI0808046A2/pt not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-08-24 IL IL200566A patent/IL200566A0/en not_active IP Right Cessation
- 2009-08-27 US US12/549,017 patent/US8771644B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-08-13 HK HK10107740.6A patent/HK1141243A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180010177A (ko) * | 2015-01-22 | 2018-01-30 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | 생체내 영상화를 위한 프로테아제 활성화 조영제 |
| KR20200002874A (ko) * | 2017-03-30 | 2020-01-08 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | 생체 내 이미징을 위한 프로테아제 활성화 조영제 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2010519320A (ja) | 2010-06-03 |
| EP2117605A2 (en) | 2009-11-18 |
| WO2008104271A2 (en) | 2008-09-04 |
| US8771644B2 (en) | 2014-07-08 |
| MY162041A (en) | 2017-05-31 |
| EP2117605B1 (en) | 2012-09-26 |
| US20100189658A1 (en) | 2010-07-29 |
| WO2008104271A3 (en) | 2008-11-06 |
| AU2008221036B2 (en) | 2014-03-20 |
| MX2009008560A (es) | 2009-08-18 |
| BRPI0808046A2 (pt) | 2014-07-08 |
| CA2678717A1 (en) | 2008-09-04 |
| HK1141243A1 (en) | 2010-11-05 |
| AU2008221036A1 (en) | 2008-09-04 |
| IL200566A0 (en) | 2010-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2008221036B2 (en) | Imaging probes | |
| EP2185721B1 (en) | Caspase imaging probes | |
| Löser et al. | Interaction of papain-like cysteine proteases with dipeptide-derived nitriles | |
| Haedke et al. | Alkyne derivatives of isocoumarins as clickable activity-based probes for serine proteases | |
| Caglič et al. | Functional in vivo imaging of cysteine cathepsin activity in murine model of inflammation | |
| US20110059018A1 (en) | Covalently binding imaging probes | |
| US10383956B2 (en) | Fluorescent probe for detecting dipeptidyl peptidase IV | |
| Kohl et al. | Design, characterization and cellular uptake studies of fluorescence-labeled prototypic cathepsin inhibitors | |
| JP5709138B2 (ja) | 蛍光環状ペプチド、その製造方法およびプロテアーゼ酵素の酵素活性測定におけるこれらペプチドの使用 | |
| MXPA04011142A (es) | Compuestos peptidicos y su uso como sustratos de proteasa. | |
| US20110213124A1 (en) | Methods and systems for synthesis of a d-aminoluciferin precursor and related compounds | |
| CN101652149B (zh) | 成像探针 | |
| Pakkala et al. | Mimetics of the disulfide bridge between the N-and C-terminal cysteines of the KLK3-stimulating peptide B-2 | |
| Fernández‐Bachiller et al. | Alzheimer’s Disease: Identification and Development of β‐Secretase (BACE‐1) Binding Fragments and Inhibitors by Dynamic Ligation Screening (DLS) | |
| WO2016151297A1 (en) | Optical probe for thrombin | |
| US9605296B2 (en) | Fluorogenic peptidase substrate | |
| EP3974438A1 (en) | Fluorescent probe for use in detection of brain tumor | |
| EP2848696A1 (en) | Caspase-1 imaging probes | |
| WO2023219136A1 (ja) | ペプチド結合加水分解酵素検出用蛍光プローブ | |
| Evans | Synthesis of optical probes for the visualization of human neutrophil elastase | |
| Dodt et al. | Acomplete AND VERSATILE PROTOCOL: DECORATION OF CELL-DERIVED MATRICES WITH MASS | |
| Fernµndez-Bachiller et al. | M. Lisurek, J. Rademann* 1041–1056 Alzheimer’s Disease: Identification and Development of b-Secretase | |
| Wanga et al. | A combination of ACE inhibitor with other drugs may increase effects of these drugs, but also the risk of adverse effects. Menu | |
| Fagbure | Small Molecule Inhibitors of the Endoplasmic Reticulum Associated Degradation Pathway | |
| MINGYU | Chemical biology of metalloproteases and cysteine proteases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal |