MXPA04011142A

MXPA04011142A - Compuestos peptidicos y su uso como sustratos de proteasa.

Info

Publication number: MXPA04011142A
Application number: MXPA04011142A
Authority: MX
Inventors: Kun Zhang
Original assignee: Pharmacia Corp
Priority date: 2002-05-10
Filing date: 2003-05-10
Publication date: 2005-02-17
Also published as: AU2003263736A1; JP2005538946A; EP1504094A2; WO2003095475A2; CA2485437A1; BR0310003A; IL165084A0; WO2003095475A8; KR20050034642A; AU2003263736A2; US20040018561A1; WO2003095475A3; PL374438A1

Abstract

Esta invencion esta dirigida en general a los compuestos peptidicos y a las sales, y particularmente a los compuestos peptidicos y sales que son utiles como sustratos de proteasa, tales como sustratos de metaloproteinasa de matriz ("MMP"); esta invencion esta tambien dirigida a los metodos para la elaboracion de tales compuestos y sales, asi como los aminoacidos que pueden, por ejemplo, ser utilizados en tales metodos; esta invencion esta ademas dirigida a los metodos para utilizar tales compuestos y sales, por ejemplo, para evaluar la efectividad de los potenciales inhibidores de proteasa y para detectar o monitorizar una enfermedad asociada con la actividad de proteasa.

Description

COMPUESTOS PEPTIDICOS Y SU USO COMO SUSTRATOS DE PROTEASA CAMPO DE LA INVENCION Esta invención está dirigida en general a los compuestos peptídicos y a las sales, y particularmente a los compuestos peptídicos y sales que son útiles como sustratos de proteasa, tales como sustratos de metaloproteinasa de la matriz ("MMP"). Esta invención está también dirigida a los métodos para la elaboración de tales compuestos y sales, así como los aminoácidos que pueden, por ejemplo, ser utilizados en tales métodos. Esta invención está además dirigida a los métodos para utilizar tales compuestos y sales, por ejemplo, para evaluar la efectividad de los potenciales inhibidores de proteasa y para detectar o monitorizar una enfermedad asociada con la actividad de proteasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las metaloproteinasas de la matriz, una familia de proteinasas dependientes del zinc, constituyen una clase mayor de enzimas involucras en la degradación del tejido conectivo. Las metaloproteinasas de la matriz son divididas en varias clases, con algunos miembros que tienen múltiples nombres en el uso común. Las metaloproteinasas de la matriz incluyen: MMP-1 (también conocida como colagenasa 1 , colagenasa de fibroblastos, o EC 3.4.24.3), MP-2 (también conocida como gelatinasa A, gelatinasa de 72 kDa, colagenasa de la membrana basal, o EC 3.4.24.24), M P-3 (también conocida como estromelisina 1 o EC 3.4.24.17), proteoglicanasa, MMP-7 (también conocida como matrilisin), MMP-8 (también conocida como colagenasa II, colagenasa de neutrófilos, o EC 3.4.24.34), MMP-9 (también conocida como gelatinasa B, gelatinasa de 92 kDa, o EC 3.4.24.35), MMP-10 (también conocida como estromelisina 2 o EC 3.4.24.22), MMP- 1 (también conocida como estromelisina 3), MMP-12 (también conocida como metaloelastasa, elastasa de macrófagos humanos' o HME), MMP-13 (también conocida como colagenasa 11), MMP- 4 (también conocida como MTI-MMP o MMP membranal), y MMP-26. Ver en general, Woessner, J.F., "The Matix Metalloprotease Family" en Matrix metalloproteinases, p. 1-14 (Editado por Parks, W.C. & Mecham, R.P., Academic Press, San Diego, CA 1998). Ver también, Marchenko, G.N., et al., "Characterization of matriz metalloproteinase-26, a novel metalloproteinsase widely expressed in cáncer cells of epithelial origin", Biochem. J, 356: 705-718 (2001 ). Cada MMP comprende una secuencia específica de aminoácidos, muestra una distribución específica de células y de tejidos, y rompe catalíticamente un subgrupo específico de proteínas de sustrato objetivo. En general, los sustratos normales de las MMPs son otras proteínas extracelulares o de la superficie celular. Dependiendo del sustrato, la escisión por una MMP inactiva o bien activa el sustrato (si el sustrato es un precursor de proteína inactiva). Debido a que las MMPs pueden activar e inactivar otras proteínas, las MMPs frecuentemente juegan papeles clave en la regulación de la señalización extracelular, la remodelación de la matriz extracelular y el metabolismo. La regulación adecuada de la actividad de MMP es de este modo crítica para el desarrollo y mantenimiento normal de las células y los tejidos. Cada sustrato de MMP comprende al menos una secuencia específica de aminoácidos que la MMP reconoce y a la que se enlaza (el "sitio de reconocimiento"). Asociado con cada sitio de reconocimiento tal, está un "enlace hendible". Este es un enlace que es escindido por la MMP. La escisión del enlace hendible da como resultado la formación de dos productos de escisión. Por ejemplo, la colagenasa MMP rompe el colágeno proteico en un enlace peptídico simple en una secuencia específica de glicina-leucina o glicina-isoleucina. Ver, por ejemplo, Weingarten, H., et al., "Synthetic Substrates of Vertébrate Collagenase" Biochemistry, 24: 6730-6734 (1985). Las secuencias específicas del sitio de reconocimiento son frecuentemente encontradas en más de un péptido extracelular. Por lo tanto, una MMP puede escindir múltiples sustratos peptídicos extracelulares. La actividad de MMP puede llegar a ser mal regulada. La desintegración excesiva del tejido conectivo por las MMPs es una característica de muchas condiciones patológicas. Tales condiciones patológicas incluyen en general, por ejemplo, destrucción tisular, enfermedades fibróticas, debilitamiento patológico de la matriz, reparación defectuosa de daños, enfermedades cardiovasculares, enfermedades pulmonares, enfermedades renales, enfermedades hepáticas, y enfermedades del sistema nervioso central. Los ejemplos específicos de tales condiciones incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis séptica, esclerosis múltiple, úlcera decubitis, ulceración corneal, ulceración epidérmica, ulceración gástrica, metástasis tumoral, invasión de tumores, angiogénesis de tumores, enfermedad periodontal, cirrosis hepática, enfermedad fibrótica del pulmón, enfisema, otosclerosis, ateroesclerosis, proteinuria, trombosis coronaria, cardiomiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca congestiva, aneurisma aórtico, epidermolisis bulosa, enfermedad ósea, enfermedad de Alzheimer, reparación defectuosa de heridas (por ejemplo, reparaciones débiles, adhesiones tales como adhesiones post-quirúrgicas y cicatrización), enfermedad pulmonar obstructiva crónica, e infarto post-miocardio. También se ha reportado que las MMPs (particularmente MMP-9) están asociadas con condiciones patológicas relacionadas a la tensión nitrosante y oxidante. Ver Gu, Zezong, et al., "S-Nitrosylation of Matrix Metalloproteinases: Signaling Pathway to Neuronal Cell Death", Science, 297: 1186-90 (2002). Debido a que la actividad anormal de MMP provoca, promueve o es necesaria para algunos estados de enfermedad, los inhibidores de MMP pueden ser terapéuticamente benéficos. Cuando se desarrollan tales inhibidores, es útil ser capaz de medir de manera precisa los niveles de actividad de las MMPs específicas en la sangre, en el suero y/o los tejidos, para marcadores de diagnóstico y para monitorizar la efectividad de los inhibidores de MMP. Tal habilidad, a su vez, permite que los clínicos e investigadores determinen de manera precisa los parámetros de la cinética enzimática de MMP, tal como la Km, Vmax, y kcat Km, así como los valores de K¡ de los compuestos inhibidores de MMP. Ver, por ejemplo, Lehninger, A.L., Biochemistry, p. 147-168, Worth Publishers, Inc. (1970). La actividad de MMP puede ser medida a través del uso de sustratos peptídicos marcados. Ver, por ejemplo, Quesada, A.R., et al., "Evaluation of fluorometric and zymographic methods as activity assays for stromelysins and gelatinases", Clinical Experimental Metástasis, 15: 339-340 (1997). En estos ensayos, un péptido sustrato que comprende un sitio de reconocimiento de MMP, un enlace hendible, y un marcador detectable tal como un fluoróforo (por ejemplo, una fluoresceína o una cumarina) se mezcla con una muestra sospechosa de contener una MMP. Después de la incubación de la muestra con el sustrato fluorescentemente marcado, la mezcla es analizada para la presencia y cantidad del producto de degradación proteolítica fluorescente. El análisis de la muestra puede ser mediante cualquier método cuantificable que separe el producto de escisión del sustrato no escindido, tal como la electroforesis en gel o la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Mientras que son útiles, estos ensayos son limitados por el requerimiento para separar el sustrato no escindido del producto de reacción. Además, la cuantificación de los niveles de actividad sobre una amplia gama de concentraciones de sustrato (en general requeridas para la determinación precisa de los parámetros cinéticos enzimáticos, tales como Km, Vmax y kcat/Km de las metaloproteinasas de la matriz, así como la K¡ del inhibidor) pueden ser difíciles o imposibles debido a la solubilidad limitada de muchos péptidos sustratos de la metaloproteinasa. Un método alternativo para detectar y medir la actividad de MMP es poner en contacto una muestra de prueba con un sustrato que genere o aumente una señal fluorescente después de la hidrólisis por una MMP. Por ejemplo, una muestra puede ser puesta en contacto con un péptido sintético que comprende un residuo de triptofano (el cual es intrínsecamente fluorescente), un sitio de escisión de MMP, y un apagador para la fluorescencia del triptofano, en donde el triptofano y su apagador están situados sobre lados opuestos de un sitio de escisión. Ver, por ejemplo, Stack, M.S. et al., "Comparison of vertébrate collagenase and gelatinase using a new fluorogenic substrate peptide", The Journal of Biologlcal Chemistry 264: 4277-4281 (1989). Ver, también, Netzel-Arnett, S., et al., "Continuously recording fluorescent assays optimized for five human matrix metalloproteinases", Analytical Biochemistry 195: 86-92 (1991). La escisión de tal péptido por una metaloproteinasa separa al triptofano del apagador de fluorescencia, con lo cual se produce un producto de reacción que es más fluorescente que el sustrato no escindido. La actividad de MMP consecuentemente puede ser medida mediante la observación de un incremento en la fluorescencia intrínseca de la muestra conforme el péptido es escindido. El uso de sustratos peptídicos que comprenden triptofano apagado, tiende a ser desventajoso debido a que, por ejemplo: (1) la fluorescencia del triptofano es débil (por ejemplo, tiene un pobre rendimiento cuántico), (2) la presencia de triptofano en otros péptidos en una muestra interfiere con la medición de la actividad de la enzima, y (3) el uso de un triptofano dentro de un péptido constriñe el diseño de los péptidos sintéticos. Una alternativa más sensible a la hidrólisis de un péptido de triptofano apagado es la hidrólisis de un péptido sustrato que comprende un fluoróforo altamente fluorescente y un apagador para el fiuoróforo, en donde el fluoróforo y su apagador están situados en lados opuestos de un enlace hendible. Ver, por ejemplo, Knight, C.G. et al., "Fluorometric assays of proteolytic enzymes", Methods in Enzymology, 248: 18-34 (1995). Tal péptido es pobremente fluorescente debido a la presencia del apagador dentro de la misma molécula que el fluoróforo. Pero después de la hidrólisis del péptido en el enlace hendible, el fluoróforo reobtiene su alta fluorescencia (por ejemplo, alto rendimiento cuántico) debido a que el apagador de fluorescencia ya no es un componente de la misma molécula. De este modo, la actividad de MMP puede ser medida mediante el monitoreo de un incremento en la fluorescencia en una muestra puesta en contacto con un sustrato fluorogénico. El uso de un sustrato peptídico fluorogénico proporciona la ventaja de alta sensibilidad; y evita la necesidad para separar el sustrato del producto de escisión. Esto simplifica la tarea de medir la actividad de MMP. Ver, por ejemplo, Knight, C.G., et al., "A novel coumarin-labeled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinases", FEBS Lett., 296: 263-266 (1992).

Otra alternativa más para medir la actividad de MP es utilizar un péptido sustrato que comprenda un fluoróforo o un cromóforo y un ligando para enlazar el sustrato a una superficie sólida. Aquí, el fluoróforo o el cromóforo están situados sobre el lado opuesto de un enlace hendible proveniente del ligando, para enlazar el sustrato. Cuando tales sustratos son enlazados a una superficie sólida, éstos se llegan a inmovilizar y por lo tanto no están en solución. Después de la escisión del sustrato por una MMP, un producto de escisión fluorescente o coloreado es liberado hacia la solución. La concentración del producto de escisión liberado es con esto fácilmente medida utilizando técnicas estándares espectrofotométricas o fluorescentes. Muchos sustratos fluorogénicos disponibles carecen de solubilidad adecuada para hacer posible que un investigador mida la actividad de MMP sobre una gama suficientemente amplia de concentraciones de sustrato para realizar mediciones precisas de Km, Vmax y koat/ m de las metaloproteinasas de la matriz, o los valores de K¡ de los compuestos inhibidores de las metaloproteinasas de la matriz. Continúa existiendo una necesidad para los sustratos de metaloprateinasa de la matriz, particularmente sustratos que, por ejemplo, sean selectivamente escindidos por una metaloprateinasa de la matriz específica de interés (o un grupo seleccionado de metaloproteinasas de la matriz de interés), tienen una solubilidad que es mayor que el valor de Km de las metaloproteinasas de la matriz particulares, y son estables en presencia de otras enzimas constitutivas (incluyendo otras metaloproteinasas de la matriz), presentes en, por ejemplo, muestras de sangre, suero y/o de tejidos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta invención proporciona los compuestos y las sales que tienden a ser selectivamente escindidos por una metaloproteinasa de la matriz específica (o un grupo selecto de metaloproteinasas de la matriz), que tienen una solubilidad que es mayor que el valor de Km de las metaloproteinasas de la matriz específicas, y/o son estables en presencia de otras enzimas constitutivas, presentes en, por ejemplo, muestras de sangre, de suero y/o de tejidos. En resumen, esta invención está dirigida, en parte, a un compuesto o sal del mismo, en donde el compuesto comprende un péptido y corresponde en estructura a la Fórmula (I): aaorX-Y-aaflrZ (I) Aquí: aa(j) comprende una secuencia de i aminoácidos en el extremo N del péptido. aay) comprende una secuencia de j aminoácidos en el extremo C del péptido. i es un número entero de 0 a 5. j es un número entero de 1 a 6.

Un fluoróforo está covalentemente enlazado al péptido sobre un lado del enlace X-Y, y al menos uno de un apagador de fluorescencia y un ligando está covalentemente enlazado al péptido sobre el otro lado del enlace X-Y. Z es un grupo hidroxilo en el extremo C del péptido. Alternativamente, Z es un grupo protector en el extremo C del péptido. En algunas de tales modalidades, X comprende una secuencia de reconocimiento de MMP, e Y comprende un aminoácido. En estas modalidades, X no es Pro-GIn-GIn, Pro-Tyr-Ala o Pro-Val-Glu. En otras de tales modalidades, X comprende una secuencia de reconocimiento de MMP, e Y comprende un enlace o un aminoácido. En estas modalidades, el péptido comprende un D-aminoácido. Esta invención está también dirigida, en parte, a un compuesto o sal del mismo, en donde el compuesto comprende un péptido que, a su vez, comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de feniloxinorleucina y benciloxinorleucina. Esta invención está también dirigida, en parte, a un método para determinar la actividad de una metaloproteinasa de la matriz. Este método comprende la combinación de la metaloproteinasa de la matriz con un compuesto o sal descritos anteriormente. Esta invención también está dirigida, en parte, a un método para la detección ex vivo o el monitoreo de una enfermedad asociada con un nivel patológico de la metaloproteinasa de la matriz. Este método comprende la medición de la escisión de un compuesto o sal descrita anteriormente. Esta invención está dirigida también, en parte, a un método para determinar la actividad de una metaloproteinasa de la matriz en una muestra biológica. Este método comprende la combinación de la muestra biológica con un compuesto o sal descritos anteriormente, para formar una mezcla, y analizando la mezcla para la presencia de un producto de reacción de un compuesto o sal con la metaloproteinasa de la matriz. Esta invención también está dirigida, en parte, a un método para medir la actividad inhibitoria de un inhibidor prospecto de una metaloproteinasa de la matriz. Este método comprende la combinación de los siguientes para formar una mezcla: un compuesto o sal anteriormente descritos, el inhibidor prospecto, y la metaloproteinasa de la matriz. Esta mezcla, a su vez, es analizada para la presencia de un producto de reacción del compuesto o sal con la metaloproteinasa de la matriz. Esta invención está también dirigida, en parte, a un equipo para la detección o monitoreo de una enfermedad asociada con la actividad patológica de una metaloproteinasa de la matriz. Este equipo comprende un compuesto o sal anteriormente descrito.

Esta invención está también dirigida, en parte, a un equipo para evaluar la efectividad de un inhibidor prospecto de MMP. Este equipo comprende un compuesto o sal descritos anteriormente. Esta invención también está dirigida, en parte, a un compuesto o sal del mismo, en donde el compuesto corresponde en estructura a la Fórmula n es cero ó . R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector de nitrógeno. Los beneficios adicionales de la invención de los Solicitantes serán aparentes para una persona de experiencia ordinaria en la técnica después de la lectura de esta patente.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Esta descripción detallada de las modalidades preferidas está destinada únicamente a familiarizar a otros expertos en la técnica con la invención de los Solicitantes, sus principios y su aplicación práctica, de modo que otras personas de experiencia en la técnica puedan adaptar y aplicar la invención en sus numerosas formas como éstas puedan ser mejor adecuadas para los requerimientos de un uso particular. Esta descripción detallada y sus ejemplos específicos, mientras que indican las modalidades preferidas de esta invención, están destinados para propósitos de ilustración únicamente. Esta invención, por lo tanto, no está limitada a las modalidades preferidas descritas en esta patente, y pueden ser variadamente modificadas.

A. Compuestos de la Invención Los compuestos de esta invención comprenden en general un péptido correspondiente en estructura a la Fórmula (I): aa(¡)-X-Y-aa(j)-Z (I) Aquí, aa(¡) es una secuencia de aminoácidos que contiene i residuos de aminoácidos en el extremo N del péptido; i es un número entero de cero a aproximadamente 5; aa© es una secuencia de aminoácidos que contiene j residuos de aminoácidos en el extremo C del péptido; y j es un número entero de 1 a aproximadamente 6.

En algunas modalidades preferidas, i es un número entero de cero a 2, y frecuentemente es un número entero de cero a 1. En algunas modalidades preferidas, j es un número entero de 3 a 6, y frecuentemente de 3 a 5. En algunas modalidades preferidas, i es cero, y j es 3. En algunas otras modalidades preferidas, i es uno, y j es 5. Las secuencias de aminoácidos aa(¡) y aa® pueden contener aminoácidos de origen natural o aminoácidos sintéticos no de origen natural, incluyendo D- y L-aminoácidos, así como los alfa-, beta-, y gamma-aminoácidos. Los compuestos con D-aminoácidos y/o otros aminoácidos de origen no natural tienden a ser más resistentes a la escisión por las enzimas constitutivas (por ejemplo, peptidasas no específicas) que pueden estar presentes en las muestras biológicas (por ejemplo, sangre, suero, tejido, etc.). La resistencia del compuesto a la escisión por tales enzimas frecuentemente es una ventaja ya que simplifica el análisis de los resultados de escisión. Los aminoácidos no de origen natural incluyen, por ejemplo, N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-glicina, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metil-Iisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina, 3-(2-naftil)-L-alanina, O-bencil-L-tirosina, 6-(benciloxi)-L-norleucina, S-(3-fenilpropil)-L-cisteina, 6-fenoxi-L-norleucina, S-(4-metoxibencil)-L-cisteína, y ácido L-mercaptoisocaproico ("Mia"). Los Ejemplos siguientes ilustran los compuestos que comprenden tales aminoácidos. En algunas modalidades preferidas aa<¡) y aa(¡) contienen alfa-aminoácidos. En algunas modalidades preferidas, aa(¡) y aa{¡) contienen beta-y gamma-aminoácidos. En algunas modalidades preferidas, aa(¡) contiene una secuencia de aproximadamente tres D-aminoácidos en el extremo C de aa<¡). Los compuestos de esta invención son preferentemente suficientemente solubles en agua para hacer posible la medición precisa de la actividad de la enzima y los parámetros de la cinética enzimática (por ejemplo, m, Vmax y kcatfKm ) para las M Ps específicas, así como los valores de K¡ de los inhibidores prospecto de MMPs específicas. Preferentemente, la solubilidad del compuesto es al menos aproximadamente 20 µ?, más preferentemente al menos aproximadamente 50 µ?, y aún más preferentemente al menos aproximadamente 100 µ? en una solución al 1% de DMSO en agua a pH 7.5. En algunas modalidades, al menos un aminoácido de aa^ o aaQ) contribuye a la solubilidad acuosa del compuesto. Preferentemente más de un aminoácido contribuye a la solubilidad acuosa del compuesto, y más preferentemente, la mayoría (o todos) los aminoácidos aa(i) y aa^ contribuyen a la solubilidad acuosa del compuesto.

Los aminoácidos que incrementan la solubilidad en agua son en general aminoácidos que proporcionan una contribución del coeficiente de distribución (log D) menor de aproximadamente cero. Ver, en general, Tao et al., "Calculating Partition Coefficients of Peptides by the Addition Method", Journal of Molecular Modeling 5: 189-195 (1999). Log D es el logaritmo del coeficiente de partición "verdadero" de un compuesto entre el control y agua. Log D explica todas las formas del compuesto, incluyendo las especies ionizadas, y es calculado a partir del logaritmo del coeficiente de partición (log P) y el logaritmo de la o las constantes de disociación (pKa). Los aminoácidos (y sus contribuciones de log D reportadas) que contribuyen en general a un log D menor de aproximadamente cero en un péptido incluyen, por ejemplo, ornitina (-2.17), arginina (-1.65), ácido aspártico (-2.06), ácido glutámico (-2.19), histidina (-0.44), asparagina (-0.98), glutamina (-1.00), lisina (-2.27), serina (-0.45), treonina (-0.26), glicina (-0.22), y alanina (-0.27). Ver Tao, P., et al., J. Mol. Model., 189-195 (1999)). Otros ejemplos no limitantes de aminoácidos que contribuyen en general a log D de menos de aproximadamente cero en un péptido incluyen beta-alanina, N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-alanina, y N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-glicina. En una modalidad preferida, al menos un aminoácido de aa(¡) y aa(¡) contribuye a un log D menor de aproximadamente cero. En algunas de tales modalidades, al menos un aminoácido en cada uno de aa(¡) y aafl) contribuye a un log D menor de aproximadamente cero. Preferentemente, aa(¡) y aa^ contiene cada uno al menos un aminoácido independientemente seleccionado del grupo que consiste de arginina, ácido giutámico, ácido aspártico y lisina. En algunas modalidades particularmente preferidas, todos los aminoácidos aa ¡) y aag) contribuyen a un log D menor de aproximadamente cero. Z es enlazado al carbonilo del extremo C de aa^. En algunas modalidades, Z es un grupo hidroxilo tal que el grupo carbonilo y Z forman un grupo carboxilo. En otras modalidades, Z es un grupo protector. Este grupo protector confiere preferentemente resistencia del péptido a las proteasas no MMP (particularmente carboxipeptídasas) que pueden estar presentes en, por ejemplo, muestras biológicas (por ejemplo, sangre, suero o tejido). Los grupos protectores relacionados a la química de los péptidos son bien conocidos en la técnica. Ver en general, Greene, T.W., et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., Wiley: New York (1999) (incorporada por referencia en esta patente). En algunas modalidades, por ejemplo, Z es un grupo amino opcionalmente sustituido que está enlazado al grupo carbonilo del extremo C formando un grupo amida — en vez de un grupo carboxilo— en el extremo C. En tales casos, Z es -NH2, -NHR', y -NHR'R". Aquí, R' y R" pueden ser típicamente una amplia gama de sustituyentes no hidrógeno. En algunas modalidades preferidas, por ejemplo, R' y R" se seleccionan independientemente de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. X comprende una secuencia de reconocimiento de 'proteasa. Típicamente, una secuencia de reconocimiento de proteasa es una secuencia de aminoácidos que es específicamente reconocida por una proteasa de interés. Típicamente, después de la reacción del compuesto con la proteasa adecuada, el enlace del compuesto que se sitúa inmediatamente sobre el lado carboxilo de la secuencia de reconocimiento (por ejemplo, el enlace entre X y Y) se divide (o se "rompe"). Esta división ocurre típicamente vía una reacción de hidrólisis. El enlace escindido por una proteasa es el enlace hendible, y está situado inmediatamente sobre el lado carboxilo de X. En esta invención, la proteasa que reconoce la secuencia de reconocimiento es típicamente una metaloproteinasa de la matriz. En muchas modalidades, la secuencia de reconocimiento es reconocida por MMP-2, MMP-9 o MMP-13. Los ejemplos de las secuencias de reconocimiento de MP, frecuentemente adecuadas, incluyen Ala-GIn-Gly, Ala- et-His, Asn-Gln-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-GIn-Gly, Dnp-Leu-Gly, lle-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-Gln-Tyr, Pro-Gln-Ala, Pro-GIn-GIn, Pro-Gln-Glu, ProGln-Gly, Pro-Gln-His, Pro-GIn-Leu, Pro-GIn-Met, Pro-GIn-Phe, Pro-GIn-Pro, Pro-GIn-Val, Pro-Glu-Asn, Pro-Glu-Gly, Pro-His-Gly, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro- et-Gly, Pro-Tyr-Ala, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Val-Glu, Pro-Ser-Glu-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-lle-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser y Pro-Leu-MeCys. Aquí, MeCys es S-metilcisteína. En algunas modalidades preferidas, la secuencia de reconocimiento de MMP es Ala-GIn-Gly, Ala-Met-His, Asn-Gln-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-GIn-Gly, Dnp-Leu-Gly, lle-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-Gln-Tyr, Pro-Gln-Ala, Pro-Gln-Glu, Pro-Gin-Gly, Pro-Gln-His, Pro-Gln-Leu, Pro-Gln-Met, Pro-G!n-Phe, Pro-Gln-Pro, Pro-Gln-Val, Pro-GIu-Asn, Pro-Glu-Gly, Pro-His-G!y, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro-Met-Gly, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Ser-Glu-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-lle-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser, o Pro-Leu-MeCys. En algunas modalidades preferidas, la secuencia de reconocimiento de MMP es Pro-Leu-Gly. En algunas modalidades preferidas, la secuencia de reconocimiento de MMP es Pro-GIn-Gly. En algunas modalidades preferidas, la secuencia de reconocimiento de MMP es Pro-GIn-Glu. En algunas modalidades preferidas, la secuencia de reconocimiento de MMP es Pro-Leu-Glu. En algunas modalidades preferidas, la secuencia de reconocimiento de MMP es Pro-Leu-MeCys. En algunas modalidades preferidas, Y es un enlace. En este caso, X está enlazado directamente a aa(¡), e Y es el enlace hendible que es escindible por la proteasa particular de interés. En otras modalidades, Y comprende un aminoácido de origen natural. Los aminoácidos de origen natural preferidos incluyen, por ejemplo, arginina (Arg), glutamina (Gln), ácido giutámico (Glu), isoleucina (He), leucina (Leu), metionina (Met), fenilaianina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val).

En otras modalidades, Y comprende un aminoácido de origen no natural, tales como aquellos listados anteriormente para aa(¡) y aa(j). en algunas modalidades preferidas, Y es 3-(2-naftil)-L-alanina, O-bencil-L-tirosina, 6-(benciloxi)-L-norleucina, S-(3-fenilpropil)-L-cisteína, 6-fenoxi-L-norleucina, S-(4-metoxibencil)-L-cisteina, norvalina (Nva), o ácido L-mercaptoisocaproico (Mia). En algunas modalidades preferidas, Y es un aminoácido de origen no natural que tiene una cadena lateral que tiene al menos aproximadamente 6 (y más preferentemente al menos aproximadamente ocho) átomos no de hidrógeno. Tales cadenas laterales pueden (y frecuentemente de manera preferida) comprender una o más estructuras voluminosas (por ejemplo, estructuras de anillo). No obstante, al menos el primer átomo de la cadena (y algunas veces más preferentemente al menos los primeros dos átomos de la cadena) son enlazadores que carecen de cualesquiera sustituyentes voluminosos. Tales enlazadores pueden ser, por ejemplo, -C(H)2-, -O-, -S-, y -N(H)-. En algunas modalidades, por ejemplo, la cadena lateral de Y comprende un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo (preferentemente un alquilo) sustituido con un sustituyente voluminoso (por ejemplo, feniloxi o benciloxi) en el punto sobre el alquilo, alquenilo o alquinilo que está más alejado de la cadena peptídica principal. Una cadena lateral voluminosa sobre el aminoácido de Y es frecuentemente ventajosa en contextos donde el sustrato es utilizado para detectar la actividad patológica de MMP en muestras que contienen actividad patológica asociada a MMPs, y otras enzimas (incluyendo otras MMPs) que están más asociadas con funciones corporalmente normales. Por ejemplo, MMP-1 y MMP-14 que están típicamente asociadas con funciones corporalmente normales, son enzimas con bolsa poco profunda. En contraste, 5 MMP-2, MMP-9 y MMP-13, que están frecuentemente asociadas con condiciones patológicas, tienen bolsas no obstruidas, relativamente profundas. La profundidad de la bolsa es dependiente de diversos factores. MMP-1 , por ejemplo, tiene una arginina en el sitio de enlace a P . Se cree que esta arginina contribuye a MMP-1 para tener una bolsa relativamente poco í o profunda. Las MMPs con bolsa profunda, por otra parte, pueden tener, por ejemplo, una valina en la misma posición. Se cree que una valina es menos obstructiva para la bolsa. Los solicitantes han descubierto que los sustratos que comprenden un aminoácido con una cadena lateral voluminosa en la posición Y (por ejemplo, la posición Pi') tienden a enlazarse pobremente a las 15 MMPs que tienen una bolsa poco profunda (por ejemplo, MMP-1 , MMP-7 y MMP-14), mientras que se enlazan relativamente bien a las MMPs que tiene bolsas profundas (por ejemplo, MMP-2, MMP-9 y MMP-13). Los sustratos con tales cadenas laterales voluminosas sobre el aminoácido de Y consecuentemente tienden a ser selectivamente escindidos por las MMPs con 20 bolsas profundas, y por lo tanto pueden ser ventajosamente utilizadas para detectar actividad patológica de MMP de bolsa profunda en muestras biológicas (por ejemplo, sangre, suero y/o tejidos), que típicamente pueden contener MMPs de bolsa profunda y de bolsa poco profunda.

En algunas modalidades preferidas, Y es un aminoácido no de origen natural que comprende una cadena lateral de al menos 11 átomos no de hidrógeno. Los ejemplos de las cadenas laterales incluyen: Los ejemplos de los compuestos contemplados que comprenden una Y que tiene tal cadena lateral incluyen: y En algunas modalidades preferidas, Y es un aminoácido no de origen natural que comprende una cadena lateral de al menos 12 átomos no de hidrógeno. Los ejemplos de tales cadenas laterales incluyen: Los ejemplos de los compuestos contemplados que comprenden una Y que tiene tal cadena lateral incluyen: ?? ?? En otras modalidades preferidas, Y es un aminoácido de origen no natural que comprende una cadena lateral de al menos 15 átomos no de hidrógeno. Los ejemplos de tales cadenas laterales incluyen: Los ejemplos de los compuestos contemplados que comprenden una Y que tiene tal cadena lateral incluyen: Dos ejemplos de aminoácidos que, cuando están localizados en la posición ?-?', tienden a conferir frecuentemente especificidad deseable (por ejemplo, que "ahorra" M P-1 ) son la 6-(benciloxi)-norleucina y 6-fenoxi-norleucina. Estos aminoácidos corresponden en estructura a la Fórmula (II): La forma D así como la forma L pueden ser utilizadas (pero la forma L es a menudo particularmente preferida), n es cero ó 1, y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector de nitrógeno. Los grupos protectores de nitrógeno son bien conocidos en la técnica. Ver en general, Greene, T.W. et al., Protective Groups ¡n Organic Synthesis (3a Ed., Wiley: New York (1999)) (incorporada por referencia en esta patente). En algunas modalidades, R1 y R2 forman un anillo de 5 a 7 miembros con el nitrógeno. En otras modalidades, R1 es un grupo protector (p. ej, 9-fluorenilmetoxicarbonilo ("Fmoc") o t-but¡loxicarbonilo ("Boc"), y R2 es hidrógeno: La norleucina puede formar parte de una secuencia peptídica con o sin tal grupo protector de amino. Los compuestos peptídicos que comprenden cadenas laterales derivadas de 6-(benciloxi)-norleucina y 6-fenoxi-norleucina pueden ser sintetizados mediante métodos sintéticos conocidos en estado sólido o métodos orgánicos. Para la síntesis en estado sólido, el aminoácido puede estar acoplado a un grupo protector de amino y acoplado a una cadena peptídica en crecimiento, sobre la resina. Los grupos protectores comunes en la síntesis en estado sólido incluyen Fmoc y Boc. Los ejemplos de síntesis de las norleucinas protegidas con Fmoc, son ilustradas más adelante en los Ejemplos 8 y 25. En una modalidad preferida, una hidroxil-norleucina es primeramente protegida del grupo amino, por ejemplo mediante síntesis del derivado de Fmoc. La hidroxil-norleucina amino protegida puede ser luego alquilada con un grupo bencilo o fenilo, como se ejemplifica más adelante. En algunas modalidades preferidas, kcat/Km del compuesto con al menos uno de MMP-1 y MMP-7 es no mayor de aproximadamente 0.5 x 10"4 M"V1, y la kCat/Km del compuesto con al menos una de MMP-2, MMP-9 y MMP-13 es al menos de 5 x 10~4 M"1s"1. En algunas modalidades a menudo más preferidas, kcat Km del compuesto con al menos de MMP-1 y MMP-7, es no mayor de aproximadamente 0"5 m~V1, y el kcat/Km del compuesto con al menos una de MMP-2, MMP-9 y MMP-13 es al menos de aproximadamente 50 x 1fJ4 "1s'1. Como se puede observar en el Cuadro 1 siguiente, los compuestos que comprenden 6-(benciloxi)-L-norleucina (p. ej, los compuestos de los Ejemplos 20 y 21 siguientes) o 6-fenoxi-L-norleucina (por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 25 siguiente) mostraron una baja k^t o kcat de cero con MMP-1 y MMP-7. Se puede también observar a partir del Cuadro 1 que los sustratos que ahorran MMP-1 y MMP-7 no obstante fueron escindidos por las otras MMPs. En el Cuadro 1 , kcat/Km es dada como M"1s"1 x 104, y Km es µ?.

CUADRO 1 Km y kgat/Km para Diversos Sustratos con Diversas Metaloproteinasas de la matriz En algunas modalidades preferidas, el compuesto tiene una kcat para MMP-2 que es al menos aproximadamente 10 veces mayor (y más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces mayor) que lo que es kcat para MMP-1 o MMP-7. En modalidades aún más preferidas, el compuesto tiene una kcat para MMP-2 que es al menos aproximadamente 10 veces mayor (y más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces mayor) que sus kcat's para MMP-1 y MMP-7. En algunas modalidades preferidas, el compuesto tiene una kcat para MMP-9 que es al menos aproximadamente 10 veces mayor (y más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces mayor) que su kcat para MMP-1 o MMP-7. En modalidades aún más preferidas, el compuesto tiene una para MMP-9 que es al menos aproximadamente 10 veces mayor (y más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces mayor) que sus kcat's para MMP-1 y MMP-7. Tal selectividad puede ser particularmente útil en modalidades en donde el compuesto es agregado a una muestra biológica (fluido o tejido proveniente de un ojo) para diagnosticar o monitorizar el estado de una enfermedad del ojo. En algunas modalidades preferidas, el compuesto tiene una kcat para MMP-13 que es al menos aproximadamente 10 veces mayor (y más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces mayor) que su kcat para MMP-1 o MMP-7. En modalidades aún más preferidas, el compuesto tiene una kcat para MMP-13 que es al menos aproximadamente 10 veces mayor (y más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces mayor) que sus kcat's para MMP1 y MMP-7. El Cuadro 2 siguiente ¡lustra varias secuencias que han sido reportadas para ser escindidas por las metaloproteinasas de la matriz. La secuencia de reconocimiento en esas ilustraciones es denotada como P3-P2-P-i. El aminoácido P-i es el aminoácido que está enlazado a la secuencia de reconocimiento vía el enlace hendible (por ejemplo, el enlace ?-?-?- es el enlace que al parecer ha sido escindido por las MMP(s) listadas). En algunas modalidades, los compuestos de esta invención comprenden tales sitios de escisión. En esas modalidades, la Fórmula (I) es definida tal que X es P3-P2-P1 en el Cuadro 2, Y es el P1' correspondiente en el Cuadro 2 y el aminoácido de aa^ enlazado a Y es el P2' correspondiente en el Cuadro 2.

CUADRO 2 Secuencias Peptídicas que se Sabe son Escindidas por Metaloproteinasas de la matriz « En el Cuadro 2, todos los aminoácidos son L-aminoácidos a no ser que se especifique "D", Dnp es 2,4-dinitrofenilo, Dpa es ácido 3-[2,4-dinitrofenil]-L-2,3-diaminopropiónico, Mia es ácido L-mercatoisocaproico (el enlace hendibe es "tiopeptólido"), Nva es norvalina, y Cys(FI) es Cys(fluoresceína). Las referencias en el Cuadro 2 son como sigue: 1. Marchenko, G.N., et al., "Characterization of matrix metalloproteinase-26, a nvoel metalloproteinase widely expressed in cáncer cells of epithelial origin", Biochem. J., 356: 705-718 (2001). 2. Nagase, H., et al., "Design and Characterization of a Fluorogenic Substrate Selectively Hydrolyzed by Stomelysin 1 (Matrix Metalloproteinase-3)", J. Biol. Chem., 269: 20952-7 ( 994). 3. Knight, C.G., et al., "A novel coumarin-labeled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinases", FEBS Lett., 296: 263-266 (1992). 4. Bickett, D.M., et al., "A High Throughput Fluorogenic Substrate for Stromelysin (MMP-3), Ann. New York Acad. Sci., 732: 351-355 (1994). 5. Masui, Y., et al., "Synthetic Substrates for Vertébrate Collagenase", Biochem. Med., 17: 215-221 (1977). 6. Teahan, J., et al., "Substrate specificity of human fibroblast stromelysins. Hydrolysis of substance P and its analogues", Biochem., 28: 8497-8501 (1989). 7. Netzel-Amett, S., et al., "Comparative sequence specificities of human 72- and 92-kDa geiatinases (type IV collagenases) and PUMP (matrilysin)", Biochemistry, 32(25): 6427-32 (1993). 8. Kridel, S.J., et al., "A unique substrate binding mode discriminates membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) from other matrix matalloproteinases", J. Biol. Chem., Manuscript in Press M 11574200 (pub. 4-16-2002). 9. Weingarten, H., et al., "Synthetic Substrates of Vertébrate Collagenase", Biochem., 24: 6730-6734 (1985). 10. Beekman, B., et al., "Fluorogenic MMP activity assay for plasma including MMPs complexed to a2-macroglobulin", Ann. New York Acad. Sci., 878: 150- 58 (1999). Los compuestos de la presente invención comprenden al menos una porción marcadora. La porción marcadora comprende en general un fluoróforo. El fluoróforo es enlazado (típicamente vía un enlace covalente) a un aminoácido del compuesto. En general, el fluoróforo puede ser una porción de fluorescencia natural. Más típicamente, el fluoróforo es un grupo químico que fluoresce cuando es excitado (en general con radiación electromagnética). Los fluoróforos frecuentemente son sistemas de dobles enlaces conjugados, más frecuentemente en sistemas de anillo o sistemas de anillo conjugado. Los fluoróforos son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, cumarinas, fluoresceínas, rodaminas, amarrillos de Luciferina e indocianinas.

En algunas modalidades particularmente preferidas, el fluoróforo es una porción (7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetilo. En muchas de tales modalidades, este fluoróforo está enlazado al átomo N de un residuo de arginina para dar la N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil-L-arginina. Otros ejemplos de aminoácidos en general adecuados para los fluoróforos incluyen N-6-(4-{[3-carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)fenil]amino}-6-cloro-1 ,3,5-triazin-2-il)-L-lisina, y N-6-(4{[3-carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)fenil]amino}-6-[(2-hidroxietil)tio]-1,3,5-triaz¡n-2-¡l)-L-lisina. En algunas modalidades, el fluoróforo está covalentemente enlazado a un aminoácido de las secuencias aa<¡) y aa^. en algunas modalidades, el fluoróforo puede estar covalentemente enlazado al grupo amino del extremo N del péptido de la Fórmula (I). En algunas de tales modalidades, por ejemplo, i es cero, y X comprende un fluoróforo en el extremo N de la secuencia de reconocimiento de la proteasa. En otras de tales modalidades, i es diferente de cero, y el fluoróforo está enlazado al extremo N de aa(j). En algunas modalidades preferidas, Y comprende un aminoácido covalentemente enlazado al fluoróforo. Los compuestos de esta invención comprenden además un apagador de fluorescencia o un ligando enlazado (en general vía un enlace covalente) a un aminoácido que está sobre el lado opuesto del enlace X-Y desde el aminoácido al cual se enlaza el fluoróforo. Esto da como resultado que el fluoróforo esté sobre el producto de reacción separado, diferente del apagador o el ligando si el enlace X-Y es escindido por alguna proteasa.. En algunas modalidades, por ejemplo, el fluoróforo esta covalentemente enlazado a un aminoácido sobre el lado amino del enlace X-Y (por ejemplo, a un aminoácido de X o aa(¡)), mientras que un ligando o un apagador de fluorescencia está covalentemente enlazado al lado carboxilo del enlace X-Y (por ejemplo, a un aminoácido de Y o, a menudo más preferentemente, aa^). En otras modalidades, por ejemplo, el fluoróforo está covalentemente enlazado a un aminoácido sobre el lado carboxilo del enlace X-Y (por ejemplo, a un aminoácido de Y o, a menudo más preferentemente aao)), mientras que un ligando o un apagador de fluorescencia está covalentemente enlazado al lado amino del enlace X-Y (por ejemplo, a un aminoácido de X o aa(¡)). Se debe reconocer que esta invención contempla los compuestos que comprenden más de un fluoróforo. Esta invención también contempla los compuestos que comprenden más de un apagador de fluorescencia o ligando opuesto al enlace X-Y del o de ios fluoróforos. Esta invención contempla además los compuestos que comprenden una combinación de uno o más apagadores de fluorescencia y uno o más ligandos sobre el lado opuesto, opuesto al enlace X-Y proveniente del o de los fluoróforos. Los apagadores de fluorescencia son bien conocidos en la técnica. En general, los apagadores son grupos orgánicos que, cuando son colocados en proximidad geométrica estrecha a un grupo fluorescente, son capaces de proporcionar vías no radioactivas alternadas para disipar la energía mantenida en el estado excitado del fluorescedor. El resultado es que la fluorescencia del grupo fluorescente es atenuada o eliminada, siempre y cuando la molécula o grupo apagador esté en tal proximidad estrecha. De este modo, donde el fluoróforo y su apagador correspondiente son colocados sobre lados opuestos del enlace hendible, la escisión del enlace hendible por una proteasa provoca que el fluoróforo y el apagador pierdan su proximidad estrecha, con lo cual se permite que el fluoróforo fluoresca. De este modo, la escisión del compuesto puede ser detectada mediante la medición del cambio en la fluorescencia. En algunas modalidades preferidas en donde el compuesto comprende un apagador, el compuesto comprende un grupo dinitrofenilo. Tales grupos son convenientemente incorporados dentro de los péptidos de la invención enlazándolos covalentemente a la cadena lateral de un aminoácido. Los grupos apagadores de fluorescencia pueden ser incorporados en los péptidos de sustrato primeramente enlazándolos a un aminoácido, seguido por la incorporación del aminoácido dentro del péptido. Alternativamente, el grupo apagador puede ser covalentemente enlazado a un aminoácido de un péptido después de que se forma el péptido. Los ejemplos de aminoácidos adecuados que comprenden un grupo de nitrofenilo incluyen 3-[(2,4-dinitrofenil)amino]-L-alanina. En modalidades en donde los compuestos de esta invención comprenden un ligando, el ligando es típicamente capaz de enlazarse a un soporte sólido. La forma del soporte sólido puede variar ampliamente. El soporte sólido puede, por ejemplo, ser una película, esferas, nanopartículas, o una placa de ensayo derivatizada con un socio de enlace del ligando. El uso de los ligandos y los soportes sólidos es bien conocido en la técnica. En muchas modalidades donde el compuesto comprende un ligando, el ligando y el fluoróforo están sobre lados opuestos del enlace hendible. De este modo, la escisión del enlace hendible por una proteasa produce un producto de escisión que contiene el fluoróforo. Este producto de escisión está libre para entrar en solución. La medición del incremento en la fluorescencia de la solución, puede ser luego utilizada para detectar la escisión del compuesto. En estas modalidades, un apagador puede opcionalmente estar presente sobre el mismo lado del compuesto que el ligando. En otras modalidades, donde el compuesto comprende un ligando, el ligando y el fluoróforo están en el mismo lado que el enlace hendible, y un apagador está sobre el lado opuesto del enlace hendible. Aquí, la escisión del enlace hendible por una proteasa produce un producto de escisión que contiene el apagador. Este apagador por lo tanto está libre de entrar en solución, con lo cual se permite que el fluoróforo fluoresca. La medición del incremento en la fluorescencia sobre el soporte puede ser luego utilizada para detectar la escisión del compuesto. En algunas modalidades, el ligando comprende una porción biotina. Los ejemplos de tales ligandos incluyen N-2-[(5-(2-oxohexahidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoilo o iminobiotina. En tales casos, el socio de enlace (por ejemplo, el componente de enlace sobre la superficie del soporte sólido) puede ser, por ejemplo, avidina, estreptavidina, avidina monomérica, o un anticuerpo anti-biotina. Otros ligandos para los cuales un socio de enlace está disponible, pueden ser utilizados alternativamente (o adicionalmente). Los ejemplos de ligandos y sus socios de enlace incluyen haptenos y anticuerpos anti-hapteno tales como digoxigenina y anti-digoxigenina, polihistidina y iones níquel inmovilizados, y secuencias BANDERA (FLAG) y anticuerpos anti-FLAG. En algunas modalidades, el ligando comprende un grupo reactivo para el enlace covalente del péptido a un soporte sólido. En algunas de tales modalidades, por ejemplo, el ligando contiene un grupo amino. En algunas modalidades preferidas, el ligando comprende un grupo amino primario. En algunas de tales modalidades, por ejemplo, el ligando comprende un grupo ácido épsilon-aminocaproico. En muchas modalidades de esta invención, uno de aa(¡) y aa© comprende un aminoácido covalentemente enlazado a un fluoróforo, mientras que el otro de aa(¡) y aa^ comprende un aminoácido covalentemente enlazado ya sea a un ligando capaz de enlazarse a un soporte sólido o a un apagador de fluorescencia del fluoróforo. Aquí, el fluoróforo está sobre el lado opuesto del enlace hendible (por ejemplo, el enlace X-Y) a partir de un apagador o un ligando). Los Ejemplos 2-5 siguientes ilustran tales configuraciones.

En algunas de tales modalidades, uno de aa(¡> y aa(¡) comprende un aminoácido covalentemente enlazado a un fluoroforo, mientras que el otro de aa<¡) y aa^ comprende (1) un aminoácido covalentemente enlazado a un apagador de fluorescencia, y (2) un aminoácido covalentemente enlazado a un ligando capaz de enlazarse a un soporte sólido. Aquí, el fluoróforo está sobre el lado opuesto del enlace hendible (por ejemplo, el enlace X-Y) a partir de un apagador y un ligando. Esta invención también contempla los compuestos en donde uno de aa(¡) y aao> comprende un aminoácido covalentemente enlazado a un apagador, mientras que el otro de aa(i) y aa^ comprende (1) un aminoácido enlazado a un fluoróforo, y (2) un aminoácido enlazado a un ligando capaz de enlazarse a un soporte sólido. Aquí, el fluoróforo y el ligando están sobre el lado opuesto del enlace hendible (por ejemplo, el enlace X-Y) a partir del apagador. El Ejemplo 16 más adelante ilustra tal configuración. Típicamente, en tal configuración, no existe ligando presente sobre el lado del compuesto que comprende el apagador. En algunas modalidades, un ligando, fluoróforo o apagador de fluorescencia está enlazado a la secuencia de reconocimiento X. Tales modalidades incluyen los casos en donde i es cero. En esos casos, el ligando, el fluoróforo o el apagador de fluorescencia está enlazado preferentemente al extremo N de la secuencia de reconocimiento X. Los Ejemplos 6-9 siguientes ilustran tal configuración. En esas ilustraciones, un fluoróforo está covalentemente enlazado al extremo N de X, y un apagador está covalentemente enlazado a una secuencia de aminoácidos aag). - Los compuestos listados en el Cuadro 1 y otros ejemplos no limitantes de los sustratos de acuerdo a la invención son listados en el Cuadro 3 (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 29), y los Ejemplos 1-29 siguientes. En el Cuadro 3, las estructuras son escritas como péptidos, con los aminoácidos de origen natural a los que se les da su abreviatura convencional de tres letras. Los aminoácidos de origen no natural, incluyendo la versión D de los de origen natural, son indicados en el listado de estructuras como Xaa(n) y adicionalmente definidos en las columnas a la derecha del Cuadro 3 y en las notas al pié.

En el Cuadro 3, Ri a Ru son como sigue: R-i = N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil]-. R2 = N-2-[(5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoil]-. R3 = 3-[(2,4-dinitrofenil)amino]-L-alanina. R4 = N-6-(4-{[3-carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-¡ fenilJaminoJ-e-cloro-I .S.S-triazin^-i -L-lisina. R5 = N-6-(4{[3-carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)fenil]amino}-6-[(2-hidroxietil)tio]-1 ,3,5-triazin-2-il)-L-lisina. Rs = 3-(2-naftil)-L-alanina. R7 = O-bencil-L-tirosina. RB = 6-(benciloxi)-L-norleucina. R9 = S-(3-fenilpropil)-L-cisteína. R10 = 6-fenoxi-L-norleucina. R11 = S-(4-metoxibencil)-L-cisteína. R12 = N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-glicina. R13 = N-6-[6-({5-[(4S)-2-oxohexahidro-1 H-tieno[3,4-d]im¡dazol-4-il)pentanoil}amino)-hexanoil]-D-lisina. RH = S-metil-L-cisteína.

B. Sales de los Compuestos de la Invención Además de los compuestos descritos en la presente, esta invención también contempla las sales de tales compuestos. Es bien comprendido en la química de las enzimas que la forma particular de los grupos funcionales ácido/base sobre un péptido o proteína es determinada por el pH del medio en el cual se encuentra el péptido, y el pKa o pKb respectivos del grupo ácido o básico. A un pH fisiológico de alrededor de 7.0, los grupos carboxilo de los aminoácidos tales como los ácidos glutámico y aspártico existen naturalmente en la forma de sal o de carboxilato. Los grupos funcionales de la lisina y de la arginina, por otra parte, contienen en general un nitrógeno protonado a tal pH. A no ser que se describa de otro modo, todas las referencias en la especificación y en las reivindicaciones a un péptido, un aminoácido, o una secuencia de aminoácidos, incluyen las formas neutras y de sal de los péptidos individuales, anteriormente mencionadas, y las secuencias.

C. Uso de los Compuestos de esta Invención Como se indica anteriormente, los compuestos de esta invención tienden a ser útiles para determinar la actividad de ciertas proteinasas. Y debido a que estos compuestos tienden a ser selectivamente escindidos por las metaloproteinasas de la matriz específicas, éstos son particularmente útiles ya que permiten la determinación de la actividad de esas metaloproteinasas de la matriz sin interferencia proveniente de otra actividad de proteasa (por ejemplo, otra MMP y/o enzima constitutiva) de las proteinasas no de interés presentes en una muestra.

En algunas modalidades, un compuesto de esta invención que es específicamente escindido por una metaloproteinasa de la matriz particular de interés (por ejemplo, MMP-2, MMP-9 o MMP-13) es agregada a una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, tejido, etc.) que contiene potencialmente esa metaloproteinasa de la matriz y una o más metaloproteinasas de la matriz (por ejemplo, MMP-1 o MMP-7) no de interés. En tal modalidad, únicamente la metaloproteinasa de la matriz de interés escindirá el sustrato (al grado en que la metaloproteinasa de la matriz esté presente). El sustrato, no obstante, no será escindido por las otras metaloproteinasas presentes en la muestra. De este modo, cualquier actividad medida de MMP (detectada, por ejemplo, mediante la medición de un incremento en la fluorescencia de la muestra) será predominantemente (o completamente) proveniente de la enzima para la cual el compuesto es específico. En algunas modalidades particularmente preferidas, un compuesto de esta invención es utilizado para determinar la actividad de MMP-2, MMP-9 o MMP-13 en una muestra biológica que contiene potencialmente MMP-2, MMP-9 o MMP-13, así como una o más de otras proteasas no de interés (una o ambas de MMP-1 y MMP-7). Aquí, un compuesto de esta invención, que es específico para MMP-2, MMP-9 o MMP-13 (y ahorrando MMP-1 y/o MMP-7) se agrega a la muestra. El cambio de la fluorescencia en la muestra es luego medido. Debido a que el compuesto es específico para MMP-2, MMP-9 o MMP-13, cualquier incremento en la fluorescencia de la muestra será predominantemente (o enteramente) reflejo de la presencia de MP-2, MMP-9 o MMP-13. Tal medición puede por lo tanto ser utilizada para, por ejemplo, diagnosticar o monitorizar (típicamente ex vivo) el estado de una enfermedad asociada con MMP-2, MMP-9 o MMP-13. El monitoreo del estado de tal enfermedad puede, a su vez, ser utilizado para, por ejemplo, determinar la dosificación adecuada o la efectividad de un tratamiento. En algunas de tales modalidades, la muestra biológica está siendo analizada para diagnosticar o monitorizar una enfermedad asociada con MMP-9. Se cree que tales enfermedades incluyen, por ejemplo, condiciones patológicas del sistema nervioso central asociadas con el estrés nitrosante u oxidante. Los ejemplos específicos de tales condiciones patológicas pueden ser, por ejemplo, isquemia cerebral, apoplejía, u otras enfermedades neurodegenerativas. Otras enfermedades que se cree están asociadas con MMP-9 incluyen, por ejemplo, enfermedades de los ojos, tales como glaucoma, degeneración macular, y edema macular diabético. MMP-9, por ejemplo, ha estado implicada como poseedora de un papel clave en la muerte de las células de los ganglios retínales. En otras modalidades, la muestra biológica está siendo analizada para diagnosticar o monitorizar una enfermedad asociada con MMP-2 y MMP-9. Se cree que tales enfermedades incluyen, por ejemplo, cáncer, condiciones cardiovasculares y condiciones oftalmológicas.

En otras modalidades, la muestra biológica está siendo analizada para diagnosticar o monitorizar una enfermedad asociada con MMP-13. Se cree que tales enfermedades incluyen, por ejemplo, condiciones cardiovasculares y artritis. Esta invención contempla la incorporación de un compuesto de esta invención dentro de un equipo (típicamente en una forma empaquetada) para ser utilizado para diagnosticar o monitorizar el estado de una enfermedad. Esta invención también contempla el uso de los compuestos de esta invención para evaluar la efectividad de un inhibidor de proteasa prospecto. En esta instancia, el compuesto es introducido dentro de una muestra que comprende la proteasa (típicamente una MMP, y más típicamente MMP-2, MMP-9 o MMP-13) y el inhibidor prospecto de la proteasa. Una falta de cambio en la fluorescencia podría indicar la inhibición de la proteasa por el inhibidor prospecto. Un cambio en la fluorescencia, en contraste, indicaría actividad de proteasa no inhibida. El Ejemplo 30 más adelante demuestra tal uso. Esta invención contempla además la incorporación de un compuesto de esta invención en un equipo (típicamente en una forma empaquetada) para ser utilizado para analizar la efectividad de un inhibidor de proteasa prospecto.

D. Preparación de los Compuestos de esta Invención Los compuestos útiles de acuerdo con esta invención pueden ser preparados mediante métodos convencionales de síntesis de péptidos utilizando la descripción de esta patente, ya sea sola o en combinación con las técnicas en general conocidas en la materia. El uso de los sustratos en la determinación de las constantes de inhibición de MMP (Ejemplo 30) se presenta más adelante, así como las rutas sintéticas para la preparación de los compuestos 1-29 (Ejemplos 1-29).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no limitantes para el resto de esta descripción en ningún modo.

EJEMPL0 1 Preparación de la N-2-rf7-metox¡-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-L-arqinil-L- prolil-L-leucilglicil-L-leucil-3-f(2.4-dinitrofeninamino1-L-alanil-L-alanil-L arginil-L-alfa-qlutamil-L-arqininamida Parte A. Preparación de la 3-r(2,4-dinitrofen¡l)amino1-Nf(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbonil alanina La 3-[(2,4-dinitrofenil)amino]-N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonii]alanina se preparó siguiendo el procedimiento de Knight, et al., FEBS Letters, 296: 263-266 (1992). Se disolvió Fmoc-L-Asn-OH (25.08 g, 71 mmol) (Bachem catálogo #B-1045, lot SM511) en 175 mi de dimetilformamida. Se agregaron luego 35 mi de agua, piridina (13.2 mi, 143 mmol), y [bis(trifluoroacetoxi)yodo]benceno (46.95 g, 105.9 mmol) (Aldrich 23, 213-9, pureza 97%) y la mezcla se agitó a 20°C toda la noche. La mezcla se filtró a través de un papel filtro Whatman para eliminar los materiales particulados. El volumen se redujo a vacío a 50°C. La mezcla concentrada se vació lentamente en 1175 mi de HCI 1.8 N con agitación. El matraz se enjuagó con 750 mi adicionales de agua, que se agregaron a la mezcla. Esta solución se agitó 15 minutos, y se extrajo con 2400 mi de éter dietílico en 4 porciones. La solución acuosa se ajustó lentamente a pH 7 por adición gradual de carbonato de sodio (111.5 g, 052 mmol). Se agregaron carbonato ácido de sodio (11.86 g, 141 mmol), 1788 mi de etanol, y 2,4-dinitrafluoro-benceno (13.139 g, 70.6 mmol) (Aldrich D19,680-0), y la mezcla se agitó a 20°C toda la noche. Se agregaron 190 mi de HCI concentrado con agitación, para ajustar el pH a pH 1. Se recolectó un precipitado de color café rojizo oscuro en un filtro de vidrio sinterizado, y se lavó con aproximadamente 00 mi de cada uno de ácido clorhídrico 0.1 N, etanol, y éter dietílico. El residuo se secó a vacío. El rendimiento fue de 76% (26.5 g, 53.9 mmol), 98% de pureza mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa por electrorrocío dio M+H 493.4 y M+Na 515.4.

Parte B. Preparación de la L-alanil-L-arginil-L-qlutamil-L-arginil-resina La L-alanil-L-arginil-L-glutamil-L-arginil-resina se preparó acoplada a Fmoc-Amida-Resina de Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante, y el recipiente de reacción diseñado para la escala de síntesis a 0.25 mM. Los ciclos preprogramados por el fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos.

Parte C. Preparación de la 3-r(2.4-dinitrofeninaminol-N-f(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbon¡nalanil-L-alanil-L-arginil-L-glutamil-L-arginil-resina El producto de la Parte A (1 mmol, 0.492 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregó 1 mol de 1-hidrox¡-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 1 mmol de hexafluorofosfato de O-ÍT-azabenzotriazol-l-i -N.N.N'.N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0) y 0.25 mmol del producto de la Parte B que había sido hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno y diluido a 5 mi con solvente dimetilformamida. Se agregó HN-diisopropiletilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), la suspensión se diluyó a un volumen final de 10 mi, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con dos porciones de 20 mi de dimetilformamida alternado con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar que permanecieron sobre la resina fueron luego rematados por el goteo de una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi de anhídrido acético (106 mmol), 10 mi de N,N-diisopropiletilamina (57 mmol) y 30 mi de dimetilformamida. La resina se lavó nuevamente como se describió, y se regresó al recipiente de reacción de síntesis automatizada para la eliminación de Fmoc y el alargamiento de la cadena.

Parte D. Preparación de la L-arqinil-L-prolil-L-leucil-glicil-L-leucil-3-r(2.4-dinitrofenil)aminol-alanil-L-alanil-L-arginil-L-glutamil-L-arginil-resina El producto de la Parte C anterior fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala de síntesis a 0.25 mM. Los ciclos preprogramados por el fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Los aminoácidos L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y L-arginina fueron agregados en orden. El Fmoc amino-terminal fue eliminado antes de la eliminación de la resina de la máquina.

Parte E. Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-¡nacetin-L-arginil-L-prol¡l-L-leucilqlicil-L-leucil-3-r(2.4-din¡trofeninaminol-L-alanil-L-alanil-L-arqinil-L-alfa-glutamil-L-argininamida (CBgHgg ½Ogg) El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (1 mmol, 0.234 g) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A esta suspensión se agregó 1 mmol de 1-hidroxi-7-azabenzo-triazoI (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2) 1 mmol del hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-l-iIJ-N.N.N'.N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0). Esta suspensión fue luego agregada a 0.25 mmol del producto de la Parte D que había sido hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno, y la suspensión se diluyó a 10 mi con solvente de dimetilformamida. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (2 mmol, 0.35 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) en 2 alícuotas iguales en 30 minutos, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. La resina se secó luego a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:H20:triisoprop¡lsilano 1 :18:1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido fue luego filtrada a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter una vez y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5-95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían >95% del sustrato peptídico objetivo puro fueron liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 74% (0.285 g, 0.186 mmol), pureza de 99% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 768.4, +3H 512.8 y M+H+Na 779.5, correspondiente a la masa exacta esperada de 1533.74.

EJEMPLO 2 Preparación de la N-2-r5-(2-oxohexahidro-1 H-tienor3,4-dtimidazo -4-it)pentanoin-L-arginil-L-prolil-L-leucHgiicil-L-leucil-N-6-(4-ff3-carboxí- -f6- hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)fen¡namino>-6-cloro-1,3,5-tr¡azin-2-il)-L-lisiI- L-alanil-L-arginil-L-alfa-glutamil-L-argininamida Parte A, Preparación de la L-arginil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-L-lisil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-L-glutamil-arqinil-resina La L-arginil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-L-lisil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-L-glutamil-arginil-resina se preparó enlazada a la Fmoc-Amida-Resina de Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 433A. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada ciclo del tiempo de reacción por 30 minutos.

Parte B. Preparación de la N-2-í5-r(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno|"3,4-dlimidazol-4-inpentanoil)-L-arqinil-L-pro il-L-leucilglicil-L-leucil-L-lisil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-qlutamil-L-arginil-resina Se disolvió el ácido 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro~1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]pentanoico (1 mmol, 0.244 g) en 10 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregó 1 mmol (0.135 g) de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 1 mmol (0.442 g) hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503), y 0.25 mmol del producto de la Parte A que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro siníerizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternada con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior fue repetido para asegurar el acoplamiento cuantitativo.

Parte C. > Preparación de la N-2-(5-r(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tienor3,4-dTimidazol-4-inpentanoil}-L-arqin¡l-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-L-tisil^ El péptido biotinilado de la Parte B fue secado bajo presión reducida, y escindido con 5 mi de una solución de 4.6 mi de ácido trifluoroacético, 0.125 mi de etanoditiol, 0.25 mi de tioanol, y 0.25 mi de agua por 6 horas a temperatura ambiente. La solución que contenía el agua fue filtrada a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón fue lavado con éter dos veces, y secado a vacío. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de acetonitrilo de 5 a 95% en agua. Las fracciones que contenían >95% del sustrato peptídico objetivo puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 70% (0.25 g, 0.176 mmol), la pureza fue de 99% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 710.9 y M+3H 474.3, correspondiente a la masa exacta esperada de 1419.82.

Parte D. Preparación de la N-2-f5-(2-oxohexahidro-1 H-tienof3,4-d1im¡dazol-4-il)pentanoil]-L-arginil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leuc¡l-N-6-(4-(r3-carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)feninam¡no)-6-cloro-1.3,5-triazin-2-il)- El reactivo clorhidrato de 5-(4,6-diclorotriaz¡nil)aminofluoresceina (0.94 mmol, 0.5 g) (Molecular Probes, Eugene, OR, Producto D-16) se agregó a una solución de 10 mi del producto de la Parte C (1 g, 0.70 mmol) disuelto en dimetilformamida con 10 mmol (1.24 g) de ?,?-diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136). La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente toda la noche con agitación suave. La mezcla de reacción se sumergió luego en 400 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter dos veces, y se secó a vacío. El botón se disolvió luego en ácido acético al 50%, y se liofilizó hasta sequedad (1.628 g). El polvo se disolvió en sulfóxido de dimetilo y se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo puro >95% se combinaron, y se liofilizaron hasta sequedad. El rendimiento fue de 40% (0.53 g, 0.28 mmol), la pureza fue de 99% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 940.4379, correspondiente a la masa exacta esperada de 1877.8663.

EJEMPLO 3 Preparación de la N-2-r5-(2-oxohexahidro-1H-tienor3,4-d1imidazol-4-il)pentanoU1-L-arqinil-L-prolU-L-leucilgHcil-L-leuc¡l-N-6-f4"ff3-carboxi-4-(6- hidroxi-S-oxo-SH-xanten-g-infenillaminoy-e-^- idroxietintíol-l^^- triazin-2-il>-L-lisil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-glutamil-L-arqininamida A una suspensión del producto del Ejemplo 2, Parte D (0.031 g, 0.016 mmol) en 4.5 mi de tetrahidrofurano se agregaron 0.871 mmol (0.108 g) de ?,?-diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) y 2.96 mmol (0.231 g) de 2-mercaptoetanol. La reacción se agitó toda la noche a temperatura ambiente. Se precipitó 1 mi (22% del total) en 10 mi de éter, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se disolvió en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían >95% del sustrato peptídico objetivo puro se liofilizaron hasta sequedad. El rendimiento total fue de 75% (0.006 g, 0.003 mmol). La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 961.5 y +3H 641.3, correspondiente a la masa exacta esperada de 1919.9036. Las exploraciones de excitación de fluorescencia fueron realizadas a una emisión fija de 515 nM, y las exploraciones de emisión fueron realizadas a una excitación fija de 495 nM. Se encontró que el óptimo no cambiaba de aquel del producto del Ejemplo 2, Parte D.

EJEMPLO 4 Preparación de la N-r5-(2-oxohexahídro-1H-tienof3,4-cnimidazol-4- il)pentanoin-L-alfa-qlutamil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-N-6-(4-(f3- carboxí-4-(e-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)feninamino>-6-cloro-1,3,5- triazin-2-il)-L-lisil-L-alanil-L-alfa-g>utamH-L-arqinil-L-alfa-qlutamina Parte A. Preparación de la L-alfa-glutamil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-L-lisil-L-alanil-L-alfa-glutamil-L-arginil-L-alfa-qlutamil-resina La L-alfa-glutamil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-L-lisil-L-alanil-L-alfa-glutamil-L-arginil-L-alfa-glutamil-resina se sintetizó enlazada a la Fmoc-Amida-Resina de Applied Biosystems (Producto Número 401435) utilizando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 433A. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos.

Parte B. Preparación de la N-[5-(2-oxohexahidrQ-1H-tienof3.4-d1imidazol-4-il)pentanoil]-L-alfa-qlutam¡l-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-L-lisil-L-alanil-L-alfa-qlutamil-L-arginil-L-alfa-qlutamil-resina El ácido S- aS^S^aR^-oxohexahidro-IH-tienop^-d]imidazol-4-il)pentanoico (d-biotina, Sigma, Producto,, B-4501) se conjugó manualmente al producto enlazado a la resina de la Parte A utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, Parte B.

Parte C. Preparación de la N-f5-(2-oxohexahidro-1 H-tieno-3,4-'¾l]imidazol-4-il)pentanoin-L-alfa-alutamil-L-prolil-L-léucilqlicil-L-leucil-L-lisil-L-alanil-L-alfa-qlutamil-L-arginil-L-alfa-qlutamina (CmHfl NirOigS) El producto biotinilado de la Parte B se secó bajo presión reducida, y escindido con 5 mi de una solución de 4.6 mi de ácido trifluoroacético, 0.125 mi de etanoditiol, 0.25 mi de tioanol y 0.25 mi de agua por 6 horas a temperatura ambiente. La solución que contenía el péptido fue filtrada a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón fue lavado con éter dos veces, y secado a vacío. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de acetonitrilo de 5 a 95% en agua. Las fracciones que contenían >95% del sustrato peptídico objetivo puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 65% (0.22 g, 0.163 mmol), la pureza fue de 95% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 683.8, correspondiente a la masa exacta esperada de 1365.

Parte D. Preparación de la N-5-(2-oxohexahidro-1 H-tienor3,4-d1imidazol-4-il)pentanoin-L-alfa-L-qlutamil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-N-6-(4-(r3-carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-¡l fen¡namino>-6-cloro-1 ,3.5-triazin- El reactivo clorhidrato de 5-(4,6-diclorotriazinil)aminofluoresceina (0.2 mmol, 0.106 g) (Molecular Probes, Eugene, OR, Producto D-16) se agregó a una solución de 5 mi del producto de la Parte C (0.223 g, 0.163 mMoles) disuelta en dimetilformamida con 2 mmol (0.25 g) de N,N-diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136). La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente toda la noche con agitación suave. La mezcla de reacción se sumergió luego en 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter dos veces, y se secó a vacío. El botón fue disuelto en sulfóxido de dimetilo, y se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de acetonitrilo de 5 a 95% en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo > 95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento fue de 72% (0.215 g, 0.12 mmol), pureza de 99% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 913.9, correspondiente a la masa exacta esperada de 1823.00.

EJEMPLO 5 Preparación de la N-r5-(2-oxohexahidro-1H-tíenor3,4-cnimídazol-4- il)pentanoin-L«alfa-glutamil-L-proHl-^ carboxM-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il^ 1,3,5 r¡azin-2-il)-L-i¡sil-L-alanil-L-alfa-glutamil-L-arginil-L-alfa-qiutami A una suspensión del producto del ejemplo 4 (0.070 g, 0.0390 mmol) en 5 mi de dimetilformamida se agregaron 0.11 mmol (0.015 g) de carbonato de potasio y 5.1 mmol (0.4 g) de 2-mercaptoetanol. La reacción se agitó a aproximadamente 40 horas a temperatura ambiente. La muestra se sumergió en 45 mi de éter, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de acetonitrilo de 5 a 95% en agua. Las fracciones que contenían >95% del sustrato peptídico objetivo puro fueron liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 74% (0.054 g, 0.029 mmol). La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 933.9, correspondiente a la masa exacta esperada de 1865.00. Las exploraciones de excitación de fluorescencia fueron realizadas a emisión fija de 515 nM. Las exploraciones de emisión fueron realizadas a una excitación de 495 nM. El óptimo fue encontrado sin cambio de aquel del Ejemplo 2. Peso molecular 1867.11. Masa exacta 1865. Fórmula molecular C84H115N21O24S2. Composición molecular C 54.04% H 6.21% N 15.75% O 20.57% S 3.43%.

EJEMPLO 6 Preparación de la 1 -r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acet¡n-L-prolil-L- leucilglicil-3-(2-naftil)-L-alanil-3-f(2,4-dinitrofeninamino1-L-alanil-L-alanil- L-argininamida Parte A. Preparación de la L-alanil-L-arqinil-resina La L-alanil-L-arginil-resina fue sintetizada enlazada a la Fmoc-Amida-Resina de Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala de síntesis de 0.25 mM. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción de ciclo por 30 minutos.

Parte B. Preparación de la 3-f(2,4-d¡nitrofenil)am¡no1-L-alanil-L-alanil-L-arginil-resina El producto del Ejemplo 1, Parte A (1 mmol, 0.492 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregó 1 mmol de 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 1 mmol del hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0) y 0.25 mmol del producto de la Parte A que se había hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno, y se diluyó hasta 5 mi con solvente dimetilformamida. Se agregó ?,?-diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se diluyó a un. volumen final de 10 mi, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un. filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar que permanecieron sobre la resina fueron luego encasquetados mediante inmersión de una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi de anhídrido acético (106 mmol), 10 mi de N,N-diisoprbpiletilamina (57 mmol) y 30 mi de dimetilformamida. La resina fue nuevamente lavada como se describe, y devuelta al recipiente de reacción de síntesis automatizado para la eliminación del Fmoc y el alargamiento de la cadenaj Parte C. Síntesis de la L-prolil-L-leuc¡lglicil-3-(2-naftin-L-alanil-3-r(2,4-dinitrofen¡0amino1-L-alan¡l-L-alanil-L-arginil-resina El producto de la Parte B fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñados para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Los aminoácidos L-3-(2-naftil)-alanina, glicina, L-leucina y L-prolina fueron agregados en orden, y el Fmoc amino-terminal fue removido antes de la eliminación de la resina de la máquina.

Parte D. Preparación de la 1-í(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-L-prolil-L-leuc¡lqlicil-3-(2-naftil)-L-alanil-3-f(2,4-dinitrofenil)amino1-L- El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.105 g, 0.45 mmol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 0.45 mmol (0.061 g) de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 0.45 mmol (0.234 g) de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tr-pirrolidino-fosfonio (PyBOP, Novabiochem, Producto 01-62-0016), y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N.N-diisopropiletilamina (1 mmol, 0.174 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Se repitió el protocolo anterior dos veces para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:agua:tripropils¡iano 18:1:1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rmp por 5 minutos. El botón se lavó con éter una vez, y se secó al aire. El botón se disolvió luego en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento completo fue de 5% (0.013 g, 0.011 mMoles), 98% de pureza mediante HPLC analítica de fase inversa. Se encontró que el pobre rendimiento era debido a la incorporación de un reactivo de arginina incompletamente protegido, que condujo a la incorporación de residuos múltiples. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+H 177.5, correspondiente a la masa exacta esperada de 1176.4987.

EJEMPLO 7 Preparación de la 1 -r(7-metox»-2-oxo-2H-cromen-4-U)acetin-L-prolH-L-leucilglícíl-0-bencil-L írosil-3-r(2 -dinitrofenil)arninol-L-alanH-L-alanil-L argininamida Parte A. Preparación de la L-prolil-L-leucilqlicil-O-bencil-L-tirosil- 3-r(2,4-dinitrofeninamino1-L-alanil-L-alanil-L-arginil-resina El producto del Ejemplo 6, Parte B fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador de Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñados para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Los aminoácidos O-bencil-L-tirosina, glicina, L-leucina y L-prolina fueron agregados en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte B. Preparación de la 1 -f(7-metox¡-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil1-L-prolil-L-leucilqicH-0-bencil-^^ L-alanil-L-arqininamida ( C^^N-uO ) El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.105 g, 0.45 mmol) (Aldrich, Producto 23,519-9) fue suspendido en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 0.45 mmol (0.061 g) del hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 0.45 mmol (0.234 g) de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi-tr-pirrolidino-fosfonio (PyBOP, Novabiochem, Producto 01-62-0016) y 0.25 mi del producto de la Parte A que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N.N-diisopropiletilamina (1 mmol, 0.174 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Se repitió el protocolo anterior dos veces para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter una vez, y se secó al aire. El botón fue disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% -de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro se combinaron, y se liofilizaron hasta sequedad. El rendimiento total fue de 5% (0.013 g, 0.01 mMoles), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. Se encontró un pobre rendimiento que fue debido a la incorporación de un reactivo de arginina incompletamente protegido, conducente a la incorporación de residuos múltiples. La espectrometría de masa de electrorrocío dio -M+H 1235.5, correspondiente a la masa exacta esperada de 1232.5249.

EJEMPLO 8 Preparación de la 1-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-ü)acetin-L-prolil-L- leucilglicil-6-(benciloxn-L-norleuc¡l-3-[(2,4-dmitrofenil amino1-L-alanil-L alanil-L-argininamida Parte A. Preparación de la N-f(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carboni i-6-hidroxi-L-norleucina La L-6-hidroxinorleucina (Chemsampco, Gray Court, SC) (5 g, 34 mmol) se disolvió en 90 mi de una solución al 10% de carbonato de sodio en agua. Se agregaron 51 mi de dioxano, y la mezcla se enfrió a 4°C en un baño de hielo. Se agregó cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (Sigma Chemical, St. Lou, MO) (8.925 g, 34.5 mmol) en pequeñas porciones, y la agitación continuó a 4°C por 3 horas. La reacción se dejó equilibrar a temperatura ambiente, y la agitación se continuó toda la noche. La mezcla de reacción se vació en 1700 mi de agua y se extrajo con seis alícuotas de 300 mi de éter. La solución acuosa se enfrió luego en un baño de agua con hielo y se acidificó con HCI concentrado a pH 2. La mezcla se mantuvo refrigerada toda la noche para facilitar la precipitación del producto. El precipitado se recolectó sobre un filtro de vidrio sinterizado, se lavó con agua, y se secó a vacío para proporcionar 10.89 g (29.5 mmol) de un sólido blanquecino para un rendimiento de 87%. Mediante espectroscopia de masa de electrorrocío, el producto dio M+H 370 y M+NH4 387, consistente con el objetivo. La pureza fue de 94% por HPLC analítica.

Parte B. Preparación de la 6-(benciloxi)-N-f(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonill-L-norleucina y el N-r(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-6- A una suspensión del producto de la Parte A (2 g, 5.4 mmol) en 40 mi de éter dietílico anhidro se agregó 1.3 mi (1.76 g, 7 mmol, 1.28 equivalentes) de 2,2,2-tricloroacetimidato de bencilo (Aldrich, Milwaukee, Wl) seguido por 0.4 mi de dietileterato de trifluoruro de boro BF3Et20 (Aldrich, Milwaukee, Wl). La reacción se agitó a 0°C por 2 horas. La capa de éter se diluyó con agua hasta que el precipitado se disolvió, y se lavó dos veces con carbonato ácido de sodio saturado. La capa acuosa se acidificó a pH 2 con ácido clorhídrico concentrado, se extrajo con 500 mi de acetato de etilo, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó hasta sequedad bajo presión reducida. Los productos se resolvieron sobre HPLC de fase inversa, se congelaron sobre hielo seco, y se liofilizaron hasta sequedad. Se recuperaron 0.475 g del material inicial altamente purificado (24%) y dos especies mayores bien resueltas, ambas C28H29NO5 que dieron M+H 460.3 y M+NH4 477.3 mediante espectrometría de masa de electrorrocío. El N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-6-hidroxi-L-norleucinato de bencilo (0.227 g, 0.495 mmol, 9.2% de rendimiento) eluyó antes de la 6-(benciloxi)-N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-norleucina (0.478 g, 1.04 mmol, 19.3% de rendimiento). Es éster fue un polvo blanco después de la liofilización, mientras que el éter fue un aceite espeso amarillo pálido.

Parte C. Preparación de la 6-(benciloxi)-L-norleucil-3-f(214-dinitrofeninaminoj-L-alanil-L-alanil-L-arginil-resina El producto de la Parte B (0.473 mmol, 0.217 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregaron 0.473 mmol (0.064 g) de 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 0.473 mmol (0.180 g) de hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0), y 0.1 mmol del producto enlazado a la resina del Ejemplo 6, Parte B que había sido hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno y diluido a 2 mi con solvente dimetiiformamida. Se agregó ?,?-diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), la suspensión se diluyó a un volumen final de 5 mi, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetiiformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar que permanecieron sobre la resina fueron luego encasquetados mediante el goteo en una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi de anhídrido acético (106 mmol), 10 mi de N,N-düsopropiletilamina (57 mmol) y 30 mi de dimetiiformamida. La resina se lavó nuevamente como se describe, y se regresó al recipiente de reacción de síntesis automatizada para la eliminación del Fmoc y el alargamiento de la cadena.

Parte D. Preparación de la L-prolil-L-leucilqlicil-e-fbenciloxD-L-norleucil-3-r(2,4-d¡nitrofen¡l)amino1-L-alanil-L-alanil-L-arginil-resina. El producto de la Parte C (0.1 mmol) se alargó todavía acoplado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñados para la escala a 0.1 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Los aminoácidos glicina, L-leucina y L-prolina fueron agregados en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte E. Preparación de la 1-f7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-inacet¡n-L-prolil-L-leuc¡lqlicil-6-(benciloxi)-L-norleucil-3-r(2.4-dinitrofeninaminol- El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 1.0 mmol (0.135 g) del hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 1 mmol (0.442 g) del hexafiuorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503), y 0.25 mmol del producto de la Parte D que han sido hinchados con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (2.3 mmol, 0.4 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Se repitió el protocolo anterior dos veces para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:agua:triopropilsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 00 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter una vez, y se secó al aire. El botón fue disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 16% (0.019 g, 0.016 mmol), pureza de 98%o mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de eiectrorrocío dio M+H 1 19.5, correspondiente a la masa exacta esperada de 1198.54.

EJEMPLO 9 Preparación de la 1-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il¾acetín-L-protil-L- leucilglicil-S-(3-fenilpropil)-L-cisteini^ L-alanil-L-argininamida Parte A. Síntesis de la N-í(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonin-S-(3-fenilpropiO-L-cisteína Se agregaron 2.5 mi de tripropilsilano a una solución de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-S-tritil-L-cisteína (3.6 mmol, 2.1 g) (Aldrich, Producto 45,932-1) disuelta en 25 mi de ácido trifluoroacético, y el recipiente se agitó a temperatura ambiente por 1 hora para desproteger la cadena lateral de cisteína. El solvente se evaporó bajo presión reducida. El residuo se dividió en acetato de etilo y carbonato de sodio al 10%. El subproducto de tritilo se dividió en la capa orgánica y se desechó. Se agregó 1-bromo-3- fenilpropano (8 mmol, 1.59 g, 1.2 ml) (Aldrich, B7.740-1) a la mezcla acuosa, y la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno todo el fin de semana. La solución se acidificó con HCI concentrado a pH 2, y el precipitado se recolectó en un filtro sinterizado de vidrio de poro mediano. El residuo se extrajo con éter, se evaporó bajo presión reducida, se disolvió en metanol, y se purificó sobre una columna de HPLC inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 8.3% (0.138 g, 0.3 mMoles), pureza de 99% mediante HPLC analítica de fase inversa. La formación del disulfuro explicó el pobre rendimiento. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+H 462.2 y M+NH4 479.2, correspondiente a la masa exacta teórica de 461.

Parte B. De la S-(3-fenilDropil)-L-cisteinil-3-f(2.4-dinitrofenil)am¡no]-L-alanil-L-alanil-L-arqinil-resina El producto de la Parte A (0.29 mMol, 0.138 g) se disolvió en 2 ml de dimetilformamida. A esta solución se agregó 0.3 mMol (0.041 g) 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 0.3 mMol (0.114 g) de hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazo!-1-il)-N,N,N'N'~ tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0) y 0.1 mMol del producto enlazado a la resina del Ejemplo 6, Parte B que había sido hinchado con 2.5 ml de cloruro de metileno y diluido a 2 ml con dimetilformamida como solvente. Se agregó ?,?-düsopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), la suspensión se diluyó a un volumen final de 5 mi y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar que permanecieron sobre la resina fueron encasquetados mediante inmersión de una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi de anhídrido acético (106 mmol), 10 mi de N,N-diisopropilet¡lamina (57 mmol) y 30 mi de dimetilformamida. La resina se lavó nuevamente como se describe, y se regresó al recipiente de reacción de síntesis automatizada para la eliminación del Fmoc y el alargamiento de la cadena.

Parte C. Preparación de la L-prolil-L-leucilgl¡cil-S-(3-fenilprop¡n-L-cisteinil-3-r(2,4-dinitrofeninaminol-L-alanil-L-alanil-L-arqinil-resina El producto de la Parte B (0.1 mmol) se alargó todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñados para la escala a 0.1 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Los aminoácidos glicina, L-leucina y L-prolina fueron agregados en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

, Parte D. Preparación de la 1-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil -L-prolil-L-leucilqlicil-S-(3-fenilpropil>L-cisteinil-3-f(2,4- El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.117 g, 0.5 m ol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 0.5 mmol (0.068 g) de hidrato de 1 -hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 0.5 mmol (0.221 g) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503), y 0.1 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 14% (0.019 g, 0.016 mmol), la pureza de 97% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+H 1201.5, correspondiente a la masa exacta esperada de 200.5022.

EJEMPLO 10 Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-L-arginil-L- prolil-L-leuc¡lqlicil-L-leucil-3-r(2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-alan¡l-L- arqinil-L-alfa-qlutamil-D-arqininamida Parte A. Preparación de la L-alanil-L-arqinil-L-qlutamil-D-arqintl-resina La L-alanil-L-arginil-L-alfa-glutamil-D-arginil-resina se sintetizó enlazada al Fmoc-Amida-Resina de Applied Biosystems (producto número 401435) utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la síntesis a escala de 0.25 mM. La D-argínina fue adquirida de Novabiochem (Producto 04-13-1045). Los ciclos preprogramados por el fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos.

Parte B. Preparación de la 3 (2 -dtnitrofem amino"l-L-alanil-L-alanil-L-arqinil-L-alfa-glutamil-D-arginil-resina El producto del Ejemplo 1 , Parte A (1 mmol, 0.492 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregó 1 mmol (0.135 g) 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 1 mmol (0.380 g) de hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0) y 0.25 mmol de la resina de la Parte A que había sido hinchada con 2.5 mi de cloruro de metileno y diluida a 5 mi con dimetilformamida. Se agregó N,N-diisoprop¡letilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), la suspensión se diluyó a un volumen final de 10 mi, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar que permanecieron sobre la resina fueron luego encasquetados mediante inmersión de una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi de anhídrido acético (106 mmol), 10 mi de N,N-diisopropiletilamina (57 mmol) y 30 mi de dimetilformamida. La resina se lavó nuevamente como se describe, y se regresó al recipiente de reacción de síntesis automatizada para la eliminación del Fmoc y el alargamiento de la cadena.

Parte C. Preparación de la L-arginil-L-prolil-L-leuc¡lqlicil-3-(2-naftil)-L-alanil-3-r(2,4-dinitrofenil)aminol-L-alanil-L-alan¡l-L-arqinil-L-alfa-glutamil-D-arginil-resina El producto de la Parte B se alargó todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Los aminoácidos L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y L-arginina fueron agregados en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte D. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-¡nacetin-L-arginil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-S-^^-dinitrofeninaminol-L-alanil- El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.117 g, 0.5 mMol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 0.5 mmol (0.068 g) de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 0.5 mmol (0.221 g) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(d¡met¡lamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503) y 0.25 mmol del producto de la Parte C que ha sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N- düsopropiletilamina (1 mmol, 0.174 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 5 400136) en dos porciones, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución í o de ácido trifluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1:1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de 15 HPLC de fase inversa C 8 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 70% (0.270 g, 0.176 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de 20 electrorrocío dio M+2H 768.7, correspondiente a la masa exacta esperada de 1533.7437.

EJEMPLO 11 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acet¡n-L-arg¡nil-L- prolií-L-leucilqücil-L-leucíi-3 f2.4-dinitrofenii)amino1-L-alan¡l-L-aíanil-D- argin¡l-D-alfa-qlutamil-D-argininamida Parte A. Preparación de la L-alanil-D-arqinil-D-alfa-qlutamil-D-arqinil-resina La L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-arginil-resina se sintetizó enlazada a la Fmoc-Amida-Resina de Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñados para la síntesis a escala de 0.25 mM. La D-arginina (Producto 04-13-1045) y el ácido D-glutámico (Producto 04-13-1051) fueron adquiridos de Novabiochem. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos.

Parte B. Preparación de la 3-f(2,4-dinitrofenil)amino]-L-alanil-L-alanil-D-arqinil-D-alfa-qlutamil-D-arqinil-resina El producto del Ejemplo 1 , Parte A (1 mmol, 0.492 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregó 1 mmol (0.135 g) de 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 1 mmol (0.380 g), de hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotr¡azol-1-¡l)-N,N,N'N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0), y 0.25 mmol del producto de la Parte A que había sido hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno y diluido a 5 mi de dimetilformamida. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400 36), la suspensión se diluyó a un volumen final de 10 mi, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar que permanecieron sobre la resina fueron luego encasquetados mediante inmersión de una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi de anhídrido acético (106 mmol), 10 mi de N,N-düsopropilet¡lamina (57 mmol) y 30 mi de dimetilformamida. La resina se lavó nuevamente como se describe, se regresó al recipiente de reacción de síntesis automatizada para la eliminación del Fmoc y el alargamiento de la cadena.

Parte C. Preparación de la L-arqinil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-3-r(2T4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-alanil-D-arqinil-D-alfa-qlutamil-D-arginil-resina El producto de la Parte B se alargó todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñados para la escala de 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Los aminoácidos L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y L-arginina fueron agregados en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte D. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil-L-arqinil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-3-r(2,4-dinitrofeninaminof-L-alanil-L-alanil-D-arqinil-D-alfa-qlutamil-D-arqininamida (CsgHgg 23Q?n) El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.117 g, 0.5 mMol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de cloruro de metileno. A la suspensión se agregaron 0.5 mmol (0.068 g) de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 0.5 mmol (0.221 g) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castres Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503), y 0.25 mmol del producto de la Parte C que ha sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó ?,?-diisopropiletilamina (1 mmol, 0.174 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) en dos porciones, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacét¡co:agua:tripropilsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 70% (0.270 g, 0.176 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 768.9 y M+3H 513, correspondiente a la masa exacta esperada de 1533.7437.

EJEMPLO 12 Preparación de la N-2-r(7-metoxí-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-D-arginH-L- proUI-L-leucilq >cil-L-leucn-3 (2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-aianil-L- arqinil-P-alfa-glutamil-D-argininamida Parte A. Preparación de la L-alanil-L-arqinil-D-alfa-glutamil-D-arqinil-resina La L-alanil-L-arginil-D-alfa-glutamil-D-arginil-resina se sintetizó enlazada a la Fmoc-Amida-Resina de Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñados para la escala de 0.25 m . La D-arginina (producto 04-13-1045) y el ácido D-glutámico (Producto 04-13-1051 ) fueron adquiridas de Novabiochem. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos.

Parte B. Preparación de la 3-r(2,4-dinitrofenil)am¡no1-L-alanil-L-alanil-L-arqinil-D-alfa-glutamil-D-arginil-resina El producto del Ejemplo 1 , Parte A (1 mmol, 0.492 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregó 1 mmol (0.135 g) de 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 1 mol (0.380 g) de hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0), y 0.25 mmol del producto de la Parte A que había sido hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno y diluido a 5 mi con dimetilformamida. Se agregó ?,?-diisopropiletilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), la suspensión se diluyó a un volumen final de 10 mi, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar que permanecieron sobre la resina fueron luego encasquetados mediante inmersión de una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi de anhídrido acético (106 mmol), 10 mi de N,N-diisopropiletilamina (57 mmol) y 30 mi de dimetilformamida. La resina se lavó nuevamente como se describe, y se devolvió al recipiente de reacción de síntesis automatizada para la eliminación de Fmoc y el alargamiento de la cadena.

Parte C. Preparación de la D-arqin¡l-L-prolil-L-leucilqlicil-3-(2-naftil)-L-alan¡l-3-rf2,4-dinitrofenil)amino1-L-alan¡l-L-alanil-L-arq¡nil-D-alfa-glutamil-D-arginil-resina El producto de la Parte B se alargó todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala de 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron la L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y D-arginina (Novabiochem, producto 04-13-1045) en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte D. Preparación de la N-2-|"(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-D-arqinil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leuc¡l-3-rf2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-alanil-L-arqinil-D-alfa-glutamil-D-arqininamida (C^HggN^Ogo) El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.117 g, 0.5 mMol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregaron 0.5 mmol (0.068 g) de hidrato de 1- hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 0.5 ml (0.221 g) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503) y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó ?,?-diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) en dos porciones, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 ml de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 ml de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 ml de una solución de ácido trifluoroacético:agua:triprop¡lsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 ml de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 70% (0.270 g, 0.176 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 768.7, correspondiente a la masa exacta esperada de 1533.7437.

EJEMPLO 13 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-¡ te^ prolil-L-leucilglicil-L-leucH-3-r(2,4-din¡trofeníí)amino1-L-aianil-L-alan¡N Parte A. Preparación de la D-arqinil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-3-f(2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-ala^ resina El producto del Ejemplo 11, Parte B fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y D-arginina (Novabiochem, Producto 04-13-1045) en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte B. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-inacet¡n-D-arqinil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-3-f(2,4-d¡nitrofenil)amino1-L-alanil-L-alanil-D-arqinil-D-alfa-glutamil-D-arqininamida (C-RBHaaNgaOgn) El reactivo ácido 7-metoxicumar¡n-4-acético (0.234 g, 1.0 mMol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 1.0 mmol (0.136 g) de hidrato de 1 -hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 1.0 mmol (0.442) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503) y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (2 mmol, 0.350 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) en dos porciones, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido tr¡fluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en suífóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 56% (0.213 g, 0.139 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 768.7, correspondiente a la masa exacta esperada de 1533.7437.

EJEMPLO 14 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen- -il)acetin-D-arginH-L- prolil-L-qlutaminilqlicil-L-leucil-3 (2^dinitrofenil)amino1-L-alanil-L- alanil-D-arqinil-D-alfa-qlutamil-D-arqininamida Parte A. Preparación de la D-arqinil-L-prolil-L-qlutaminilqlicil-L-leuc¡l-3-[(2,4-dinitrofeninamino1-L-alanil-L-alanil-D-arqinil-D-alfa-qlutamil-D-arqinil-resina El producto del Ejemplo 11, Parte B fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sinteíizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mMol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron L-leucina, glicina, L-glutamina, L-prolina y D-arginina (Novabiochem, Producto 04-13-1045) en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte B. Preparación de la N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-¡Oacetill-D-arginil-L-prolil-L-glutaminito El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.234 g, 1 .0 mmol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 1.0 mmol (0.136 g) de hidrato de 1 -hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503) y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (2 mmol, 0.350 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) en dos porciones, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en suifóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 35% (0.135 g, 0.139 mmol), la pureza de 97% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 775.4, M+2Na 797.6, M+H+Na 786.4, M+3H 517.5 y M+2H+Na 524.8 correspondiente a la masa exacta esperada de 1548.7182.

EJEMPLO 15 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-ÍI)acetín-D-lisü-L- prolil-L-leucilglicil-L eucil-3-r(2,4-din¡trofenil)aminol-L-alanii-L-alanil-D' arginíl-D-aífa-glutamíl-D-argininamida Parte A. Preparación de la D-lisil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-3-f(2^-dinitrofenil)aminQl-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-qlutamil-D-argini resina El producto del Ejemplo 11 , Parte B (0.25 mmol) fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Síntetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y D-lisina (Novabiochem, Producto 04-13-1026) en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte B. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-¡l)acetin-D-lis¡l-L-proHl-L-leucilglicil-L-leucil-3-[(2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L- El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 1.0 mmol (0.136 g) de hidrato de 1 -hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 5726-0), 1.0 mmol (0.442 g) de hexafluorofosfato de (benzotr¡azol-1-iloxi)tr(dimetiIamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503), y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (2 mmol, 0.350 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) en dos porciones, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido tr¡fluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1 :1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase Inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 53% (0.214 g, 0.132 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+H+Na+TFA 820.6, correspondiente a la masa exacta esperada de 1505.7375.

EJEMPLO 16 Preparación de la ?-2-G(7-??6????-2-???-2?-?G?G???-4-?1)3?ß!??-?-6-G6-(·G5- f(4S)-2-oxohexahidro-1H-tíenor3,4-cnímidazon-4- iHpentanoil>amino)hexanoin-D-lisíl-L-prolil-L eucilqlicil-L-leucil-3-r(2.4- dinitrofen¡l)amino1-L-aíanil-L-alanii-D-arqinil-D-alfa-glutamil-D- arqininamida Parte A. Preparación de la D-lisil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-3-[(2,4-dinitrofenil)aminol-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-arginil-resina El producto del Ejemplo 11 , Parte B (0.25 mmol) fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y D- lisina en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina. No obstante, para hacer posible la desprotección selectiva de la cadena lateral, se utilizó la N-alfa-Fmoc-N-epsilon-4-metiltritil-D-lisina (Bachem, Producto B-2620).

Parte B. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-iOacetin-D-lisil-L-proni-L-leucilalicil-^ alanil-D-arqinil-D-alfa-qlutamil-D-arginil-resina El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Producto 23,519-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 1.0 mmol (0.136 g) del hidrato de -hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) del hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503) y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiietilamina (2 mmol, 0.350 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136) en dos porciones, y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento Parte C. Preparación de la N-6-(6-aminohexanoil)-N-2-|"(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetill-D-lisil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-3-[(2,4-dinitrofeninamino]-L-alanil-L-alan¡l-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-arginil-resina Una solución que contenía 2% de ácido trifluoroacético y 5% de trirjropilsilano en 100 mi de cloruro de metileno se hizo pasar a través de la resina de la Parte B con el fin de desproteger selectivamente la cadena lateral de lisina hasta que las fracciones que eluyen de la resina ya no fueron amarillas. La resina se lavó con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno seguidas con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida para dos ciclos. El ácido 6-{[(9H-fluoren-9-iImetoxi)carbonil]amino}hexanoico (1 mmol, 0.353 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregó 1 mmol de 1 -hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 1 mmol de hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1 -il)-N,N,N'N'-tetrametiluron!o (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0), y 0.25 mmol del producto de la Parte B que había sido hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno, y se diluyó a 5 mi con dimetilformamida. Se agregó ?,?-diisopropiletilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), la suspensión se diluyó a 10 mi de volumen final, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El grupo Fmoc fue eliminado utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A, el ciclo de desprotección estándar y los reactivos del fabricante ' y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mMol.

Parte D. Preparación de la N-2-r(7-metox¡-2-oxo-2H-cromen-4-il)acet¡n-N-6-f6-((5-í(4SV2-oxohexahidro-1H-tienor3,4-dlimida2ol-4-inpentanoil am¡no)hexano¡l1-D-lisil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-3-r(214-dinitrofen¡l)amino1-L-alanil-L-alanil-D-argin¡l-D-alfa-glutamil-D-arqininamida El ácido 5[(3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il]pentanoico (1 mmol, 0.244 g) se disolvió en 10 mi de dimetiiformamida. A esta solución se agregó 1 mmol (0.135 g) de hidrato de 1 -hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 5726-0), 1 mmol (0.442 g) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503) y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-düsopropiletilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetiiformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. El protocolo anterior se repitió para asegurar el acoplamiento cuantitativo. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1:1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 30% (0.139 g, 0.075 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 924, correspondiente a la masa exacta esperada de 1844.8992.

EJEMPLO 17 Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-ll)acetin-D-arginíl-L- prolil-L-teucilqlicil-L-leucil-3-r(2,4-dinitrofenillamirol-L-aianil-beta-alani>- D-arqinil-beta-alanil-D-argininamida Parte A. Preparación de la beta-alanil-D-arqinil-beta-alanil-D-ar inil-resina La beta-alanil-D-arginil-beta-alanil-D-arginil-resina se sintetizó enlazada a la Fmoc-Amida-Resina Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la síntesis a escala de 0.25 mM. La beta-alanina (Producto 04-12-1044) y la D-arginina (Producto 04-13-1045) se adquirieron de Novabiochem. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos.

Parte B. Preparación de la 3-[f2,4-dinitrofenil)amino"l-L-alanil-beta-alanil-D-arqinil-beta-alanil-D-arginil-resina El producto del Ejemplo 1, Parte A (1 mmol, 0.492 g) se disolvió en 2 mi de dimetilformamida. A esta solución se agregaron 1 mol (0.135 g) de 1-hidroxi-7-azabenzo-triazol (HOAT, Aldrich, Producto 44,545-2), 1 mmol (0.380 g) de hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N'N'-tetrametiluronio (HATU, Aldrich, Producto 44,545-0), y 0.25 mmol del producto de la Parte A que había sido hinchado con 2.5 mi de cloruro de metileno, y se diluyó a 5 mi con dimetilformamida. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (4 mmol, 0.7 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), la suspensión se diluyó a un volumen final de 10 mi, y se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. Los grupos amino sin reaccionar fueron luego encasquetados mediante goteo de una solución a través de la resina sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso que contenía 10 mi (106 mmol) de anhídrido acético, 10 mi de N,N-diisopropiletilamina (57 mmol) y 30 mi de dimetilformamida. La resina se lavó nuevamente como se describe, y se devolvió al recipiente de reacción de síntesis automatizada para la eliminación del Fmoc y el alargamiento de la cadena.

Parte C. Síntesis de la D-arginil-L-prolil-L-leucilqlicil-L-leucil-3-r(2,4-din¡trofenil)am¡nol-L-alanil-beta-alanil-D-arqinil-beta-alanil-D-arginil-resina El producto de la Parte B fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y D-arginina en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte D. Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-iOacetil]-D-arginil-L-prolil-L-leucilglicH^^ El reactivo ácido 7-metoxicumarin-4-acético (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Producto 23,5 9-9) se suspendió en 5 mi de dimetilformamida. A la suspensión se agregó 1.0 mmol (0.136 g) de hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT, Aldrich, Producto 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tr(dimetilamino)fosfonio (BOP, Castras Reagent, Perseptive Biosystems, Producto GEN076503), y 0.25 mmol del producto de la Parte C que había sido hinchado con cloruro de metileno. Se agregó N,N-diisopropiletilamina (2 mmol, 0.174 mi) (DIEA, Applied Biosystems, Producto 400136), y la suspensión se agitó toda la noche. La resina se lavó sobre un filtro sinterizado de vidrio grueso con 2 porciones de 20 mi de dimetilformamida alternadas con 2 porciones de 20 mi de cloruro de metileno por 2 ciclos. La resina se secó a vacío, y se escindió con 5 mi de una solución de ácido trifluoroacético:agua:tripropilsilano 18:1:1 por 2 a 3 horas. La solución que contenía el péptido se filtró a través de una frita de vidrio en un volumen total de 100 mi de éter dietílico, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se lavó con éter, y se secó al aire. El botón fue luego disuelto en sulfóxido de dimetilo, y el péptido se purificó sobre una columna de HPLC de fase inversa C18 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% de acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo >95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. El rendimiento total fue de 30% (0.139 g, 0.075 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+H 1476.7 y M+2H 738.9, correspondiente a la masa exacta esperada de 1476.61.

EJEMPLO 18 Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-D-arginil-L- prolil-L-leucil-S-metil-L-cisteinil-^ alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-arqininamida Parte A. Preparación de la D-arginil-L-prolil-L-leucil-S-metil-L-cisteinil-L-leucil-3-r(2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-arginil-resina El producto del Ejemplo 11, Parte B fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron L-leucina, S-metil-L-cistina (Bachem, Producto B-2510), L-leucina, L-prolina y D-arginina (Novabiochem, Producto 04-13-1045) en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parta B. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetill-D-arginil-L-prolil-L-leucil-S-metil-L-c¡steinil-L-leucil-3-f(2,4-d¡nitrofenil)amino1-L-alanil-L-alan¡l-D-arq¡nil-D-alfa-qlutamil-D-argininamida El ácido 7-metoxicumarin-4-acético (MCA) fue conjugado al péptido sobre la resina de la Parte A, y el péptido fue escindido de la resina,, y purificado como se describe en el Ejemplo , Parte E. El rendimiento total fue de 40% (0.158 g, 0.099 mmol), la pureza de 93% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 798.18, correspondiente a la masa exacta esperada de 593.7470.

EJEMPLO 19 Preparación de la N-2-r(7-metoxí-2-oxo-2H-cromen-4-il)acet¡n-N- (¡midamidn)-piperidin-3-il-L-gHc¡N^^ dínitrofeníl)aminol-L-aianH-L-alanil-N-(ímidam¡díl)-piperidi alfa-glutamil-L-N-(¡midamidil)-piperid¡n-3-il-glicilamida Parte A. Preparación de la N-fimidamidil)-piperidin-3-il-L-alanil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-3-f(2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-alan¡l-L-N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-alanil-L-alfa-qlutamil-L-N-(imidamidilV alanil-resina La L-alanil-L-N-(¡midam¡dil)-piperidin-3-il-L-alaniI-L-alfa-glutamil-L-N-(imídamidil)-piperidin-3-il-alanil-resina se sintetizó enlazada a la Fmoc-Amida-Resina Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol, como se describe en el Ejemplo 1 , Parte B. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron La L-N-(imidamidil)-piperidin-3-il-alanina (RSP Amino Acid Analogues, Inc., Hopkinton, MA, Producto #6066-fp), el ácido L- glutámico, La L-N-(imidamidil)-piperidin-3-il-alanina, y la L-alanina en orden, seguidos por la conjugación del producto del Ejemplo 1 , Parte A, como se describe en el Ejemplo , Parte C. El producto resultante se alargó todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Se agregaron L-leucina, glicina, L-leucina, L-prolina y L- N-(imidamid¡l)-piperidin-3-il-alanina en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte B. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2l-l-cromen-4- il)acetin-N-(midamidin-piperidin-3-il-L-glicil-L-propil-L-leucilglicil-L-leucil-3-f(2,^ dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-alanil-L-N-(imidamidin-piperidin-3-il-L-glicil-L-alfa- qlutamil-L-N-u"midamidin-piperidin-3-il-glicilamida (CypHinsNbsOpn) El ácido 7-metoxicumarin-4-acético (MCA) fue conjugado al péptido sobre la resina de la Parte A, y el péptido fue escindido de la resina, y purificado como se describe en el Ejemplo 1, Parte E. El rendimiento total fue de 15% (0.060 g, 0.037 mmol), la pureza de 96% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 806.5, correspondiente a la masa exacta esperada de 1611.

EJEMPLO 20 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-L-argínil-L- prolil-L-leucilglicil-B^benciloxl -L-norleucil-S-^^-dinitrofeninaminol-L- alanil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-glutamil-L-arqininamida Parte A. Preparación de la L-arginil-L-prDlil-L-leucilglicil-6-(bencilox¡)-L-norleucil-3-r(2,4-dinitrofeninamino1-L-alanil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-glutamil-L-arqinil-resina La 6-(benciloxi)-N-[(9H-fluoren-9-¡lmetoxi)carbonil]-L-norleucina del Ejemplo 8, Parte B se conjugó a la resina del Ejemplo 1 , Parte C como se describe en el Ejemplo 8, Parte C. El producto enlazado a la resina fue alargado todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron glicina, L-leucina, L-prolina y L-arginina (Novabiochem, Producto 04-13-1045) en orden, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte B. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-inacetin-L-arg¡nil-L-prolil-L-leuc¡lql¡cil-6-(benciloxi)-L-norleucil-3-f(2,4-dinitrofen¡l)amino1-L-alanil-L-alanil-L-arqinil-L-alfa-qlutamil-L-argininamida El ácido 7-metoxicumarin-4-acético (MCA) fue conjugado al producto de la Parte A, y el péptido fue escindido de la resina, y purificado como se describe en el Ejemplo , Parte E. El rendimiento total fue de 39% (0.160 g, 0.098 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 821.1, correspondiente a la masa exacta esperada de 1639.7855.

EJEMPLO 21 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-i[)acetin-D-arqinil-L- proli>-L-leucHgHci 6-(benciloxi)-L-norleucil-3-r(2,4-dinitrofeninarnino1-L- alanil-L-alanil-D-arginil-D-aifa-qlutamii-D-arqininamida (C7aH-ingr½02i) La N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil]-D-arginil-L-prolil-L-Ieudlglicil-6-(benciloxi)-L-norleucil-3-[(2,4-dinitrofenil)amino]-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-argininamida se preparó como se describe en el Ejemplo 20, excepto que la D-arginina se sustituyó por L-arginina, y el ácido D-glutámico fue sustituido por el ácido L-glutámico. El rendimiento total fue de 37% (0.150 g, 0.092 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 821.3, correspondiente a la masa exacta esperada de 639.7855.

EJEMPLO 22 Preparación de la N-2-fí7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-íQacetin-D-arginil-L- prolH-L-qlutaminH-L-alfa-giutami -6-(benciloxí)-L-norleucil-3-f(2,4- dinitrofenU)aminol-L-alanil-L-alanil-D-argini>-D-alfa-qlutamil-D- arqininamida (CreHiog atOgA) La N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-¡l)acetil]-D-arginiI-L-prolil-L-glutaminil-L-alfa-glutamil-6-(benciloxi)-L-norleucil-3-[(2,4-dinitrofeni1)amino]-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-argininamida se preparó como se describe en el Ejemplo 21 , excepto que la L-leucina se reemplazó por L-glutamina, y la glicina fue reemplazada por el ácido L-glutámico. El rendimiento total fue de 28% (0.121 g, 0.070 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 864.4, correspondiente a la masa exacta esperada de 1726.7812.

EJEMPLO 23 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-D-arqinil-L prolil-L-leucil-L-alfa-alutamH-6-fbenciloxn-L-norieucii«3-r(2.4- dinitrofeni!)amino1-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-qlutamil-D- >- argininamida La N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil]-D-arginil-L-prolil-L-leucil-L-alfa-glutamil-6-(benciloxi)-L-norleucil-3-[(2,4-dinitrofen¡l)amino]-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-argininamida se preparó como se describe en el Ejemplo 21 , excepto que la glicina se reemplazó por ácido L-glutámico. El rendimiento total fue de 22% (0.096 g, 0.056 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 856.9, correspondiente a la masa exacta esperada de 1711.8067.

EJEMPLO 24 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-D-arginil-L- prolN-L-glutam¡nilqlicil-6-(benciloxi)-L-norleucH-3-r(2,4- dinitrofeninaminol-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D- La N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil]-D-arginil-L-prolil-L-glutamilglic¡l-6-(benc¡loxi)-L-norleucil-3-[(2,4-d¡nitrofen¡I)amino]-L-alan¡l-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-argininamida se preparó como se describe en el Ejemplo 21, excepto que la L-leucina se reemplazó por L-glutamina. El rendimiento total fue de 31% (0.128 g, 0.077 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio +2H 828.4, correspondiente a la masa exacta esperada de 1654.7601 EJEMPLO 25 Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-D-arginíl-L-prolil-L-leucilglicil-6-fenoxi-L-noH^ L-alanil-D-arqinil-D-alfa-glutamii-D-arciininamida Parte A. Preparación del N-f(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carboniri-6-fenoxinorleucinato de bencilo A una solución del producto del Ejemplo 8, Parte B (1.0 g, 2.2 mmol) y fenol (300 mg, 3.2 mmol) en 5 mi de tolueno se agregaron azodicarboxilato de dietilo (DEAD) (0.4 g, 2.3 mmol) y trifenilfosfina (0.6 g, 2.3 mmol). La mezcla de reacción se dejó agitar a temperatura ambiente por 12 a 15 horas (el curso de la reacción se monitorizó mediante RPHPLC). Después de la terminación de la reacción, la solución se concentró por medio de un evaporador rotatorio, luego se purificó sobre Si02 para dar como resultado un aceite claro (2 g, 98%). La espectroscopia de R N 1H y de Masa fueron consistentes con la estructura deseada. La espectroscopia de masa mostró: Parte B. Preparación de la 1-N-f(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonin- 6-fenoxinorleucina A una solución de 50 mi de metanol del producto de la Parte A (1.2 g) se agregó 10% de Pd sobre carbono (600 mg, catalizador tipo Degussa). La mezcla negra se agitó sobre un aparato Parr por 2.5 horas a 3.5 kg/cm2 (50 psi). Después de la terminación de la reacción, la mezcla se filtró a través de un lecho de celite. El solvente se eliminó bajo presión reducida para dar 800 mg del N-FMOC-aminoácido. La espectroscopia de RMN 1H y de Masa fueron consistentes con la estructura deseada. La espectroscopia de masa mostró: C23H27NO5-M+Na+Hen8ntrado=556.20 (M+Na+Hcalculado=556).

Parte C. Preparación de la N-2-f(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-D-arginil-L-prolil-L-leucilglícil-6-fenoxi-L-norleucil-3-r(2,4-dinitrofeninaminoyL-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-glutamil-D-arqininamida El producto de la Parte B anterior fue manualmente conjugado a una preparación de 1.0 mmol del producto del Ejemplo 11 , Parte B, siguiendo el protocolo de acoplamiento manual descrito en el Ejemplo 8, Parte C. El sustrato fue adicionalmente alargado, y purificado como se describe para el Ejemplo 21. El rendimiento total fue de 41% (0.0662 g, 0.407 mmol), la pureza de 96% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de eiectrorrocío dio M+2H 813.8, M+H+Na 824.8, M+3H 543.1, correspondiente a la masa exacta esperada de 1625.7699.

EJEMPLO 26 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen- -il)acetin-D-arqinil-L- prolil-L-leucilglicil-S-(4-metoxibencil)-L-ciste¡nil-3-r(2,4- dinitrofenH)amino1-L-alanil-L-alanil-D-arginil-D-alfa-g utamil-D- argininamida (CTiHioi gaOgiS) La N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-crornen-4-iI)acetil]-D-arginil-L-pro!il-L-leucilglicil-S-(4-metoxibencil)-L-ciste¡nil-3-[(2,4-dinitrofenil)amino]-L-a^ alan¡l-D-argin¡l-D-alfa-glutamil-D-argininamida se preparó como se describe en el Ejemplo 21, excepto que la S-(4-metoxibencil)-L-cisteína se sustituyó por la 6-(benciloxi)-L-norleucina. El rendimiento total fue de 29% (0.120 g, 0.092 mmol), la pureza de 98% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 823.6, correspondiente a la masa exacta esperada de 1644.7263.

EJEMPLO 27 Preparación de la N-2-r(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen- -H)ac (imidamidil)-piperidin-3-H-L-gliciU^ norleucil-3-r(2,4-dinitrofenil)aminol-L-alanil-L-alanil-L-N-(imidamidil)- piperidin-3-il-L-g icil-L-alfa-glutamil-L-N-(imidamidil)-piperidin-3-il- glicilamida Parte A. Preparación de la N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-alanil-L-prolil-L-leucilqlicil-6-(benciloxi)-L-norleucil-3-f(2,4-dinitrofenil)amino1-L-alanil-L-alanil-L-N-(imidamidil)-piperídin-3-il-L-alanil-L-alfa-qlutamil-L-N-nmidamid¡l)-piperidin-3-il-alanil-resina La L-alanil-L-N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-alanil-L-alfa-glutamil-L-N-(im¡damidil)-piperidin-3-il-alanil-resina se sintetizó enlazada a la Fmoc-Amida-Resina Applied Biosystems (Producto número 401435) utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol como se describe en el Ejemplo 1 , Parte B. Los ciclos preprogramados del fabricante fueron modificados para incrementar cada tiempo de reacción del ciclo por 30 minutos. Se agregaron a la resina en orden, la L-N-(imidamidil)-piperidin-3-¡l-alanina (RSP Amino Acid Analogues, Inc., Hopkinton, MA, Producto #6066-fp), el ácido L-glutárnico, la L-N-(imidamidil)-p¡peridin-3-il-alanina, y la L-alanina, seguido por la conjugación del producto del Ejemplo 1 , Parte A, como se describe en el Ejemplo 1, Parte C. El producto resultante se alargó todavía enlazado a la resina utilizando el Sintetizador Applied Biosystems Modelo 433A y los reactivos del fabricante y el recipiente de reacción diseñado para la escala a 0.25 mmol. Se agregaron en orden la 6-(benciloxi)-L-norIeucina, glicina, L-leucina, L-prolina y L-N-(imidamidil)-piper¡din-3-il-alanina, y el Fmoc amino-terminal fue eliminado antes del retiro de la resina de la máquina.

Parte B. Preparación de la N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)aceti11-N-(imidamidil)-piperidin-3-il-L-glicil-L-prolil-L-leucilqlicil-6-(benciloxi)-L-norleucil-3-r(2.4-dinitrofenil)amino ^ 3-il-L-ql¡cil-L-alfa-qlutamil-L-N-(imidamidil)-piperidin-3-il-glicilamida El ácido 7-metoxicumarin-4-acético (MCA) fue conjugado al péptido sobre la resina de la Parte A, y el péptido fue escindido de la resina, y purificado como se describe en el Ejemplo 1, Parte E. El rendimiento total fue de 2% (0.009 g, 0.005 mmol), la pureza de 94% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 858.89, correspondiente a la masa exacta esperada de 1717.8325.

EJEMPLO 28 Preparación de la N-2"r5 2-oxohexahidro-1 H-tienof3,4-dtimida2ol- -il)pentanoin-L-arqinil-L-prolil-L-leucilglicil-L-leucil-N-6-(4-{f3-carboxi-4-(6- hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9 I)fen¡nam¡no}-6-riidroxí-1 ,3,5-triaz¡n-2-íl)-L- lisil-L-alanil-L-arqinil-L-alfa-glutamil-L-argininamida fCgfiHj25 27Q2oSl Una alícuota de 0.25 mi de ter-butóxido de potasio 1 molar en butanol se agregó a 3.5 mi de la solución de reacción cruda del Ejemplo 3, y la reacción se calentó a reflujo a 50°C por 30 minutos. La solución se volvió anaranjada vivida conforme procedió la hidrólisis. El producto fue precipitado en 50 mi de éter, y se concentró a 5000 rpm por 5 minutos. El botón se disolvió en sulfóxido de dimetilo y el péptido se purificó sobre una columna de fase inversa C 8 desarrollada con un gradiente de 5 a 95% acetonitrilo en agua. Las fracciones que contenían el sustrato peptídico objetivo > 95% puro fueron combinadas, y liofilizadas hasta sequedad. La hidrólisis fue únicamente 10% completa. El rendimiento fue de 9% (0.002 g, 0.001 mmo!). La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 931.0, correspondiente a la masa exacta esperada de 1859.9002. Las exploraciones de excitación de fluorescencia fueron realizadas a emisión fija de 515 nM, y las exploraciones de emisión fueron realizadas a excitación fija de 495 nM. Se encontró que el óptimo no cambiaba de aquel del Ejemplo 2.

EJEMPLO 29 Preparación de la N-2-ff7-metoxí-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetin-L-arqínil-L- prolil-L-glutaminil-L-alfa-qlutaminil-6-(bencnoxi)-L-norieucil-3-r(2,4- dinHrofenil)amíno1-L-alanil-L-alanH-L-arqinil-L-alfa-qlutamíl-L- argininamida (C75H 06N2 Q2 I La N-2-[(7-metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetil]-L-arginil-L-prolil-L- glutaminil-L-alfa-glutamil-6-(benciloxi)-L-norIeucil-3-[(2,4-dinitrofenil)amino]-L- alanil-L-alanil-L-arginil-L-alfa-glutamil-L-argininamida se preparó como se describe en el ejemplo 22, excepto que la L-arginlna se sustituyó por la D-arginina, y el ácido L-glutámico se sustituyó por el ácido D-glutámico. El rendimiento total fue de 32% (0.140 g, 0.081 mmol), pureza de 99.9% mediante HPLC analítica de fase inversa. La espectrometría de masa de electrorrocío dio M+2H 864.41 , M+3H 576.95, correspondiente a la masa exacta esperada de 1726.7812.

EJEMPLO 30 Análisis de Inhibición de MMP In Vítro Se analizaron varios compuestos de hidroxamato en ensayos in vitro para determinar su habilidad para inhibir la escisión del MMP de los sustratos peptídicos. Las constantes de inhibición (K¡) fueron calculadas a partir de las interacciones evaluadas de hidroxamato-MMP. Se utilizaron en este ensayo MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP- 3 y MMP-14 recombinantes humanas. Las enzimas son preparadas siguiendo los procedimientos conocidos de laboratorio. Los protocolos para la preparación y el uso de estas enzimas son disponibles en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Enzyme Nomenclature (Academic Press, San Diego, CA, 1992) (y las citas en la presente). Ver también, Frije et al., J. Bioí. Chem., 26(24), 16766-73 (1994). Además, muchas MMPs pueden ser adquiridas de los proveedores. Por ejemplo, MMP-1 , MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-12, y MMP-13 son comercial mente disponibles de R&D Systems en su catálogo del 2003. La proenzima MP-1 puede ser purificada del medio gastado de las células HT-1080 transfectadas con MMP-1 y la proteína purificada sobre una columna de quelación de zinc. La proenzima MMP-2 puede ser purificada mediante cromatografía de gelatina Sepharose a partir de las células p2AHT2 transfectadas con MMP-2. La proenzima MMP-9 puede ser purificada mediante cromatografía de gelatina Sepharose a partir del medio gastado de las células HT1080 transfectadas con MMP-9. La MMP-13 puede ser obtenida como una proenzima a partir de un clon de ADNc de longitud completa utilizando baculovirus, como se describe por V.A. Luckow, "Insect Cell Expression Technology", Protein Engineering: Principies and Practice, p. 183-218 (editado por J.L. Cleland et al., Wiley-Liss, Inc., 1996). La proenzima expresada fue primeramente purificada sobre una columna de heparina-agarosa, y luego sobre una columna de quelación de cloruro de zinc. Los detalles adicionales sobre los sistemas de expresión de baculovirus pueden ser encontrados en, por ejemplo, Luckow et al., J. Virol., 67, 4566-79 (1993). Ver también, O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual ( \l . . Freeman and Co., New York, NY, 1992). Ver también, King et al., The Baculovirus Expression Systems: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, Londres, Inglaterra, 1992).

El ADNc de MMP-14 de longitud completa puede ser utilizado para expresar la enzima del dominio catalítico en cuerpos de inclusión de E. coli. Luego, la enzima es solubilizada en urea, purificada sobre una columna de HPLC preparativa de fase inversa C-14, y replegada en presencia de acetato de zinc y purificada para el uso. Todas las MMPs fueron activadas utilizando el acetato 4-aminofenilmercúrico ("APMA", Sigma Chemical, St. Louis, MO) o tripsina. M P-9 fue también activada utilizando MMP-3 recombinante humana siguiendo las técnicas estándares de clonación y purificación. El sustrato polipeptídico que contiene la metoxicumarina, fluorogénica MCA-ArgProLeuGlyLeuDpaAlaArgGluArgNH2 (compuesto 1 del Cuadro 3) se utilizó como el sustrato de MP en el ensayo de inhibición de MMP. Aquí, "MCA" es 7-metoxicumarin-4-il-acetilo y Opa" es el grupo 3-(2,4-d¡nitrofenil)-L-2,3-diaminopropionilo. En ausencia de la actividad inhibitoria de MMP, el sustrato es escindido en el enlace peptídico Gly-Leu. La escisión separa el péptido altamente fluorogénico del apagador 2,4-dinitrofenilo, dando como resultado un incremento de la intensidad fluorescente. Las soluciones de reserva de los inhibidores de hidroxamato (o sales de los mismos) fueron preparadas en sulfóxido de dimetilo al 1 % (DMSO). Las soluciones de reserva fueron diluidas en Amortiguador A (Tris-HCI 100 mM, cloruro de sodio 100 mM, cloruro de calcio 10 mM, 0.05% de éter laurílico de polioxietileno 23, pH 7.5) para obtener las soluciones con diferentes concentraciones de hidroxamato, por ejemplo, las soluciones de ensayo con diferentes concentraciones del compuesto inhibidor de M P evaluado. Los controles experimentados contenían la misma cantidad de Amortiguador A/DMSO que la muestra evaluada, pero no contenía inhibidor de hidroxamato. Para determinar la K¡, las muestras de inhibidor son incubadas a temperatura ambiente por 1 hora en presencia de 4 µ? del sustrato MMP, y analizadas sobre un lector de placas Tecan SpectraFlour Plus. La longitud de onda de excitación es de 330 nm, y la longitud de onda de emisión (fluorescencia), es de 420 nm. En ausencia de la actividad inhibitoria de MMP, el sustrato es escindido en el enlace Gly-Leu dando como resultado un incremento de la fluorescencia relativa. La inhibición es observada como una velocidad reducida del incremento en la fluorescencia relativa. Los inhibidores son analizados utilizando una baja concentración de enzima simple con una concentración simple del sustrato, fijada a o por debajo de la Km. Este protocolo es una modificación del método descrito por Knight et al., FEBS Letí., 296(3), 263-266 (1992). Las constantes inhibitorias aparentes son determinadas mediante regresión no lineal de la velocidad de reacción, como una función de la concentración del inhibidor y de la enzima utilizando la ecuación de Morrison, como se describe por Kuzmic, Anal. Biochem. 286, 45-50 (2000). Fueron realizadas modificaciones en el método de regresión no lineal para permitir una velocidad de reacción de control común y una concentración efectiva de la enzima para ser compartida entre todas las relaciones de dosis-respuesta en una placa de ensayo dada. Ya que la concentración del sustrato fue elegida para estar en o por debajo de la Km, las K|'s aparentes de este análisis fueron reportadas como K¡'s sin corrección para la influencia del sustrato. El Cuadro 4 siguiente muestra los valores de K¡ de varios inhibidores utilizando el ensayo anterior con MMP-1 , MMP-2, MMP-9, MMP-13, y MMP-14. Todos los valores en el Cuadro 4 son dados son dados en unidades de nM.

CUADRO 4 Resultados del Ensayo de Inhibición de MMP La descripción detallada anterior de las modalidades preferidas está destinada únicamente a familiarizar a otras personas expertas en la técnica con la invención, sus principios y su aplicación práctica, de modo que otras personas de experiencia en la técnica pueden adaptar y aplicar la invención en sus numerosas formas, como éstas pueden ser mejor adecuadas para los requerimientos de un uso particular. Esta invención, por lo tanto, no está limitada a las modalidades anteriores, y puede ser variadamente modificada. Con referencia al uso de las palabras "comprenden" o "comprende" o "que comprende" en esta patente (incluyendo las reivindicaciones), los Solicitantes notan que a no ser que el contexto lo requiera de otro modo, esas palabras son utilizadas con base y con el entendimiento claro de que éstas han de ser interpretadas inclusivamente, en vez de exclusivamente, y que los Solicitantes pretenden que cada una de esas palabras sea interpretada así en la construcción de esta patente, incluyendo las reivindicaciones siguientes. Todas las referencias citadas en esta especificación son incorporadas por referencia en la presente. La discusión de las referencias en la presente está destinada meramente a resumir las aserciones realizadas por sus autores, y no se hace ninguna admisión de que cualquier referencia constituya técnica anterior.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto o una sal del mismo, en donde: el compuesto comprende un péptido y corresponde en estructura a la Fórmula (I): aaer -Y-aatB-Z (i); aa(¡) comprende una secuencia de i aminoácidos en el extremo N del péptido; aa(j) comprende una secuencia de j aminoácidos en el extremo C del péptido; i es un número entero de 0 a 5; j es un número entero de 1 a 6; un fluoróforo está covalentemente enlazado al péptido sobre un lado del enlace X-Y, y al menos uno de un apagador de fluorescencia y un ligando está covalentemente enlazado al péptido sobre el otro lado del enlace X-Y; X comprende una secuencia de reconocimiento de MMP; X no es Pro-GIn-GIn, Pro-Tyr-Ala, o Pro-Val-Glu; Y comprende un aminoácido; y Z es un grupo hidroxilo en el extremo C del péptido, o un grupo protector en el extremo C del péptido.

2. - El compuesto o la sal del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 8 átomos no de hidrógeno.

3. - El compuesto o la sal del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 10 átomos no de hidrógeno.

4. - El compuesto o la sal del mismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 1 átomos no de hidrógeno.

5. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende de 11 a 15 átomos no de hidrógeno.

6. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 12 átomos no de hidrógeno.

7.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto o la sal está caracterizado además porque MMP-2, M P-9 o MMP- 3 reacciona con el compuesto o la sal para escindir el compuesto o la sal en el enlace entre X e Y, cuando el compuesto o la sal se combina con MMP-2, MMP-9 o MMP- 3.

8.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque: kcat m del compuesto o la sal con al menos uno de MMP-1 y MMP-7 no es mayor de aproximadamente 0.5 x 10"4 M'V; y kcat/Km del compuesto o sal con al menos uno de MMP-2, MMP-9 y MMP-13 es al menos de aproximadamente 5 x 10"4 M'V1.

9.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque: kcat m del compuesto o la sal con al menos uno de MMP-1 y MMP-7 no es mayor de aproximadamente 0"5 M'V1; y kCat/Km del compuesto o sal con al menos uno de MMP-2, M P-9 y MMP-13 es al menos de aproximadamente 5 x 10~4 M'V1.

10. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, en donde el compuesto o la sal se caracteriza además porque la velocidad de reacción del compuesto o la sal con MMP-1 o MMP-7 es aproximadamente cero.

11. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 10, en donde el compuesto o la sal se caracteriza además porque la velocidad de reacción del compuesto o la sal con MMP-1 y MMP-7 es aproximadamente cero.

12. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque Y se selecciona del grupo que consiste de 3-(2~naftil)-L-alanina, O-bencil-L-tirosina, 6-(benciloxi)-L-norleucina, S-(3-fenilpropil)-L-cisteína, 6-fenoxi-L-norleucina y S-(4-metoxibencil)-L-cisteína.

13. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque Y se selecciona del grupo que consiste de 6-(benciloxi)-L-norleucina y 6-fenoxi-L-norleucina.

14. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la secuencia de reconocimiento de X se selecciona del grupo que consiste de Ala-GIn-Gly, Ala-Met-His, Asn-GIn-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-GIn-Gly, Dnp-Leu-Gly, lle-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-GIn-Tyr, Pro-GIn-Ala, Pro- Gln-Gln, Pro-Gln-Glu, Pro-G!n-Gly, Pro-Gln-His, Pro-Gln-Leu, Pro-Gln-Met, Pro-Gln-Phe, Pro-Gln-Pro, Pro-Gln-Val, Pro-Glu-Asn, Pro-Glu-G!y, Pro-His-Gly, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro-Met-Gly, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Ser-G!u-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-lle-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser y Pro-Leu-MeCys.

15. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 8 átomos no de hidrógeno.

16. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 11 átomos no de hidrógeno.

17. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (17-1):

18.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (18-1):

19.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (19-1):

20.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (20-1):

21. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 12 átomos no de hidrógeno.

22. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (22-1):

23.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (23-1 ):

24.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (24-1 ): (24-1).

25. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque Y comprende una cadena lateral que comprende al menos 15 átomos no de hidrógeno.

26. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la cadena lateral corresponde en estructura a la Fórmula (26-1 ):

27. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque i es cero.

28. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque i es 1.

29.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque j es de 3 a 5.

30. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque i es cero o 1.

31. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque aa(i) o aa(j) comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de arginina, lisina, ácido aspártico, y ácido glutámico.

32. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque: aa(i) comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de arginina, lisina, ácido aspártico, y ácido glutámico; y aa(j) comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de arginina, lisina, ácido aspártico, y ácido glutámico.

33. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el compuesto o la sal tienen una solubilidad en agua que es mayor que un Km de MMP-1 , MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13, M P-14 o M P-26.

34.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el compuesto o sal tiene una solubilidad en agua de al menos aproximadamente 20 µ? en 1% de DMSO a pH 7.5.

35. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el compuesto o la sal tiene una solubilidad en agua de al menos aproximadamente 100 µ? en 1% de DMSO a pH 7.5.

36. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el compuesto o sal comprende al menos un aminoácido que tiene una distribución de log D menor de aproximadamente cero.

37. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el aminoácido que tiene una distribución de log D menor de aproximadamente cero se selecciona del grupo que consiste de D-arginina, L-arginina, D-asparagina, L-asparagina, D-ácido glutámico, L-ácido glutámico, D-histidina, L-histidina, D-glutamina, L- glutamina, D-lisina, L-lisina, D-serina, L-serina, D-treonina, L-treonina, glicina, 5 D-alanina, L-alanina, D-citrulina, L-citrulina, D-ornitina y L-ornitina.

38. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el fluoróforo es una cumarina.

39. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque la cumarina es N-2-[(7-0 metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetilo] sustituido.

40. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque la cumarina es N-2-[(7- metoxi-2-oxo-2H-cromen-4-il)acetilo].

41. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la 5 reivindicación 7, caracterizado además porque el fluoróforo es una fluoresceína.

42. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque la fluoresceína es N-6-(4-{[3- carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)fenil]amino}-6-cloro-1 ,3,5-triazin-2-o ilo) sustituido.

43. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado además porque la fluoresceína es N-6-(4-{[3- , carboxi-4-(6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-¡l)fenil]amino}-6-cloro-1 ,3,5-triazin-2- ¡lo).

44. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque un fluoróforo está 5 covalentemente enlazado al péptido sobre un lado del enlace X-Y, y un apagador de fluorescencia está covalentemente enlazado al péptido sobre el otro lado del enlace X-Y.

45. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el apagador de fluorescencia l o es (2,4-dinitrofenil)amino sustituido.

46. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el apagador de fluorescencia es (2,4-dinitrofenil)amino.

47. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la 15 reivindicación 7, caracterizado además porque un fluoróforo está covalentemente enlazado al péptido sobre un lado del enlace X-Y, y un ligando está covalentemente enlazado al péptido sobre el otro lado del enlace X-Y.

48. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la 20 reivindicación 47, caracterizado además porque el ligando está enlazado no covalentemente a un soporte sólido.

49. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el ligando es biotina sustituida. 50. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el ligando es biotina. 51. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el ligando es N-2-[(5-(2-oxohexahidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoilo] sustituido. 52. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el ligando es N-2-[(5-(2-oxohexahidro-1 H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanoilo]. 53. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el ligando es ácido epsilon-aminocaproico sustituido. 54.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado además porque el ligando es ácido epsilon-aminocaproico. 55. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el compuesto o sal comprende al menos un D-aminoácido. 56. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el compuesto o sal comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de un beta-aminoácido o un gamma-aminoácido. 57.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque Z es un grupo protector. 58.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque Z es una amina opcionalmente sustituida. 59.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto corresponde en estructura a una fórmula seleccionada del grupo que consiste de: 150 151 * i53 20 i55 ??? 60.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 25. 61.- Un compuesto o una sal del mismo, en donde: el compuesto comprende un péptido y corresponde en estructura a la Fórmula (I): aa(i)-X-Yaa(j)-Z (I); aa<¡) comprende una secuencia de i aminoácidos en el extremo N del péptido; aa(j) comprende una secuencia de j aminoácidos en el extremo C del péptido; i es un número entero de 0 a 5; j es un número entero de 1 a 6; un fluoróforo está covalentemente enlazado al péptido sobre un lado del enlace X-Y, y al menos uno de un apagador de fluorescencia y un ligando está covalentemente enlazado al péptido sobre el otro lado del enlace X-Y; X comprende una secuencia de reconocimiento de MMP; y comprende un enlace o un aminoácido; y Z es: un grupo hidroxilo en el extremo C del péptido, o un grupo protector en el extremo C del péptido. 62.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque la secuencia de reconocimiento de X se selecciona del grupo que consiste de Ala-GIn-Gly, Ala- et-His, Asn-GIn-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-GIn-Gly, Dnp-Leu-Gly, lle-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-GIn-Tyr, Pro-GIn-Ala, Pro-Gln-GIn, Pro-GIn-Glu, Pro-GIn-Gly, Pro-GIn-His, Pro-GIn-Leu, Pro-GIn-Met, Pro-GIn-Phe, Pro-GIn-Pro, Pro-GIn-Val, Pro-Glu-Asn, Pro-Glu-Gly, Pro-His- Gly, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro-Met-Gly, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Ser-Glu-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-lle-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser y Pro-Leu- eCys. 63.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado además porque el compuesto corresponde en estructura a una fórmula seleccionada del grupo que consiste de: ??? 160 64.- Un compuesto o la sal del mismo, en donde: el compuesto comprende un péptido, y el péptido comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de feniloxinorleucina y benciloxinorleucina. 65.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque el compuesto o la sal se caracteriza porque MMP-2, MMP-9 o MMP-13 reacciona con el compuesto o la sal para escindir el compuesto o la sal en un enlace entre dos aminoácidos cuando el compuesto o la sal se combina con M P-2, MMP-9 o MMP-13. 66. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque el compuesto o la sal comprende feniloxinorleucina. 67. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 66, en donde el compuesto o la sal se caracteriza además porque MMP-2, MMP-9 o MMP-13 reacciona con el compuesto o la sal pata escindir el compuesto o la sal en un enlace entre la feniloxinorleucina y otro aminoácido cuando el compuesto o la sal se combina con MMP-2, MMP-9 o MMP-13. 68. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque el compuesto corresponde en estructura a la Fórmula (68-1 ):t 69.- El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque el compuesto o la sal comprende benciloxinorleucina. 70. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 69, en donde el compuesto o la sal se caracteriza además porque MMP-2, MMP-9 o MMP-13 reacciona con el compuesto o la sal para escindir el compuesto o la sal en un enlace entre la feniloxinorleucina y otro aminoácido cuando el compuesto o la sal se combina con MMP-2, MMP-9 o MMP-13. 71. - El compuesto o sal del mismo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el compuesto corresponde en estructura a la fórmula seleccionada del grupo que consiste de: i64 72.- Un método para determinar la actividad de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende la combinación de la metaloproteinasa de la matriz con un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1. o 73.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 59. 74.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 5 75.- El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-9. 76. - El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 77. - El método de conformidad con la reivindicación 72, o caracterizado además porque el método comprende la combinación de: uno o más de MMP-2, MMP-9 y MMP-13; uno o más de MMP-1 y MMP-7; y el compuesto o la sal de conformidad con la reivindicación 1. 78. - Un método para ia detección ex vivo o monitoreo de una enfermedad asociada con un nivel patológico de la metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende la medición de una escisión de un compuesto o la sal de conformidad con la reivindicación 1 , en el enlace entre 5 X e Y. 79. - El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado además porque el compuesto o sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 59. 80. - El método de conformidad con la reivindicación 78, o caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 81. - El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado además porque la metaloproteinasa es MMP-9. 82. - El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado además porque la metaloproteinasa es MMP-13. 5 83.- Un método para determinar la actividad de una metaloproteinasa de la matriz en una muestra biológica, en donde el método comprende: la combinación de la muestra biológica con un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1 , para formar una mezcla, y el análisis de la mezcla para la presencia de un producto de reacción del compuesto o la o sal con la metaloproteinasa de la matriz. 84.- El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 59. 85. - El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 86. - El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-9. 5 87.- El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 88. - Un método para medir la actividad inhibitoria de un inhibidor prospecto de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende: la combinación de los siguientes para formar una mezcla: un o compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1 , el inhibidor prospecto, y la metaloproteinasa de la matriz; y el análisis de la mezcla para la presencia de un producto de reacción del compuesto o la sal con la metaloproteinasa de la matriz. 89. - El método de conformidad con la reivindicación 88, 5 caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 59. 90. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado además porque la metaloproteinasa es MMP-2. 91. - El método de conformidad con la reivindicación 88, o caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-9. 92. - El método de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 93. - Un método para determinar la actividad de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende la combinación de la metaloproteinasa de la matriz con un compuesto o la sal de conformidad con la reivindicación 61. 94. - El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 63. 95. - El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 96. - El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es M P-9. 97. - El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 98. - El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado además porque el método comprende la combinación de: uno o más de MMP-2, MMP-9 y MMP-13; uno o más de MMP-1 y MMP-7; y el compuesto o la sal de conformidad con la reivindicación 6 . 99. - Un método para la detección ex vivo o monitoreo de una enfermedad asociada con un nivel patológico de la metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende la medición de una escisión de un compuesto o la sal de conformidad con la reivindicación 61 , en el enlace entre X e Y. 100. - El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 63. 101. - El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 102. - El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-9. 103. - El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 104.- Un método para determinar la actividad de una metaloproteinasa de la matriz en una muestra biológica, en donde el método comprende: la combinación de la muestra biológica con un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 61 , para formar una mezcla; y el análisis de la mezcla para la presencia de un producto de reacción del compuesto o la sal con la metaloproteinasa de la matriz. 105. - El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 63. 106. - El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 107. - El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-9. 108. - El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP- 3. 109. - Un método para medir la actividad inhibitoria de un inhibidor prospecto de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el método 5 comprende: combinar los siguientes para formar una mezcla: un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 61 , el inhibidor prospecto, y la metaloproteinasa de la matriz; y el análisis de la mezcla para la presencia de un producto de reacción del compuesto o la sal con una metaloproteinasa de la matriz. o 110.- El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 63. 1 .- El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 5 112.- El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-9. 1 3. - El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 114. - Un método para determinar la actividad de una o metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende la combinación de la metaloproteinasa de la matriz con un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 64. 115. - El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado además porque el compuesto o sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 68 ó 71. 116. - El método de conformidad con la reivindicación 114, 5 caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 117. - El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MP-9. 118. - El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. o 119.- El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado además porque comprende la combinación de: uno o más de MMP-2, MMP-9 y MMP-13; uno o más de MMP-1 y MMP-7; y el compuesto o la sal de conformidad con la reivindicación 64. 120. - Un método para la detección ex vivo o monitoreo de una 5 enfermedad asociada con un nivel patológico de la metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende la medición de una escisión de un compuesto o la sal de conformidad con la reivindicación 64. 121. - El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de o conformidad con la reivindicación 68 ó 71. 122. - El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 123. - El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MP-9. 124. - El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado además porque la enfermedad es una enfermedad de los ojos. 5 125.- El método de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado además porque la enfermedad es glaucoma. 126.- El método de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado además porque la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de degeneración macular y edema macular diabética, o 127.- El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MP-13. 128. - Un método para determinar la actividad de una metaloproteinasa de la matriz en una muestra biológica, en donde el método comprende: la combinación de la muestra biológica con un compuesto o sal 5 de conformidad con la reivindicación 64, para formar una mezcla, y el análisis de la mezcla para la presencia de un producto de reacción del compuesto o la sal con la metaloproteinasa de la matriz. 129. - El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de o conformidad con la reivindicación 68 ó 71. 130. - El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 131. - El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MP-9. 132. - El método de conformidad con la reivindicación 131 , caracterizado además porque la muestra biológica comprende un fluido o tejido de un ojo. 133. - El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 134. - Un método para medir la actividad inhibitoria de un inhibidor prospecto de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el método comprende: combinar los siguientes para formar una mezcla: un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 64, el inhibidor prospecto, y la metaloproteinasa de la matriz; y el análisis de la mezcla para la presencia de un producto de reacción del compuesto o la sal con una metaloproteinasa de la matriz. 135.- El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 68 ó 71. 136.- El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-2. 137.- El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-9. 138.- El método de conformidad con la reivindicación 134, caracterizado además porque la metaloproteinasa de la matriz es MMP-13. 139.- Un equipo para detectar o monitorizar una enfermedad asociada con actividad patológica de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el equipo comprende un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1. 5 140.- El equipo de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 59. 141. - Un equipo para detectar o monitorizar una enfermedad asociada con actividad patológica de una metaloproteinasa de la matriz, en o donde el equipo comprende un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 61. 142. - El equipo de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 63. 5 143.- Un equipo para detectar o monitorizar una enfermedad asociada con actividad patológica de una metaloproteinasa de la matriz, en donde e el equipo comprende un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 64. 144.- El método de conformidad con la reivindicación 143, o caracterizado además porque el compuesto o la sal es un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 68 ó 71. 145. - Un equipo para evaluar la efectividad de un inhibidor prospecto de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el equipo comprende un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1. 146. - Un equipo para evaluar la efectividad de un inhibidor prospecto de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el equipo comprende un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 6 . 147. - Un equipo para evaluar la efectividad de un inhibidor prospecto de una metaloproteinasa de la matriz, en donde el equipo comprende un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 64. 148.- Un compuesto o una sal del mismo, en donde: el compuesto corresponde en estructura a la Fórmula (II): n es cero ó 1, y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector de nitrógeno. 149.- El compuesto o la sal del mismo de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado además porque el compuesto corresponde en estructura a la Fórmula (HA):

50.- El compuesto o la sal del mismo de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado además porque el compuesto corresponde en estructura a una fórmula seleccionada del grupo que consiste de: