JP2023038757A - マトリックスメタロプロテアーゼで開裂可能なペプチド基質 - Google Patents
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Abstract
【課題】種々のプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９）によって開裂可能なアミノ酸配列を有するペプチドを提供すること。【解決手段】一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列を含み、Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、ペプチド。【選択図】なし
Description
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼで開裂可能なペプチド基質に関する。
マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰ）は、細胞外マトリックスのリモデリングに機能する酵素群である。構造的・機能的観点から種々のファミリー及びサブファミリーに分類され、種々のＭＭＰが協奏して作用することによって、細胞外基質を構成するほぼすべての成分を分解することが可能である。また、ＭＭＰは生理学的・病理学的プロセスに深く関与しており、がん浸潤・転移ではゼラチナーゼ群（ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９）の活性化がトリガーとなり、また、自己免疫疾患である関節リウマチでは滑膜増殖時に発現・分泌されるＭＭＰ－３がトリガーとなることが知られている。ＭＭＰの活性化を素早く検出することは、例えば、こうした疾患の早期発見及び早期治療につながると考えられている。
ＭＭＰをターゲットにした材料開発は種々の分野で進められており、細胞移植や創傷被覆材に用いる微小孔性ゲル系（特許文献１）や３次元培養等の細胞担持体（特許文献２）、バイオセンサー（特許文献３）等と多様である。
特許文献１では、ポリ（エチレングリコール）骨格からなるミクロゲル粒子を有した創傷治癒材料について報告されている。上記ミクロゲル粒子間をＭＭＰ分解性架橋剤で架橋することによって、構造的支持に必要な機械強度及び組織再生に伴うマトリックス分解性の付与が期待されている。特許文献２では機械的特性及び生化学的特性といった種々のマトリックスパラメータを制御することによって、天然環境下における細胞挙動を再現可能な細胞培養微小環境アレイについて報告されている。特許文献３では、創傷被覆材であってかつ体液、分泌液又は滲出液といったサンプル中のバイオマーカーとなる酵素群（例えばＭＭＰ－２）をリアルタイムで検出することが可能なバイオセンサーについて報告されている。上記バイオセンサーでは、２つの電極を使用し、それぞれの電極表面をゼラチン等の天然又は合成基質で被覆し、創傷部位から放出される酵素によって化学的に分解されることで電極表面が露出し、電気抵抗を検出することで創傷治癒過程を把握することが可能である。
しかし、特許文献１～３に記載されるような基質は、１種類のＭＭＰに対して開裂することしか具体的には示されておらず、素早い開裂、ひいては疾患の早期発見を実現するには改良の余地があった。
本発明の目的は、種々のプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９）によって開裂可能なアミノ酸配列を有するペプチドを提供することにある。
本発明は、例えば、以下の［１］～［１４］に示す発明に関する。
［１］一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列を含み、Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、ペプチド。
［２］上記アミノ酸配列において、Ｐ２はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はアラニン残基（Ａｌａ）であり、Ｐ２がロイシン残基（Ｌｅｕ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）であって、且つ、Ｐ２’はアルギニン残基（Ａｒｇ）であり、Ｐ２がアラニン残基（Ａｌａ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はメチオニン残基（Ｍｅｔ）であって、且つ、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、［１］に記載のペプチド。
［３］上記アミノ酸配列が、配列番号１、４、５、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載のペプチド。
［４］一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表される、マトリックスメタロプロテアーゼ開裂部位を有するアミノ酸配列を含み、↓は上記マトリックスメタロプロテアーゼ開裂部位であり、Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、マトリックスメタロプロテアーゼに対する応答剤。
［５］上記アミノ酸配列において、Ｐ２はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はアラニン残基（Ａｌａ）であり、Ｐ２がロイシン残基（Ｌｅｕ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）であって、且つ、Ｐ２’はアルギニン残基（Ａｒｇ）であり、Ｐ２がアラニン残基（Ａｌａ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はメチオニン残基（Ｍｅｔ）であって、且つ、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、［４］に記載の応答剤。
［６］上記アミノ酸配列が、配列番号１、４、５、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列である、［４］又は［５］に記載の応答剤。
［７］上記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、［４］～［６］のいずれかに記載の応答剤。
［８］上記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ－２であり、上記ＭＭＰ－２の濃度が０．４５ｎＭ以上であるＭＭＰ－２含有液と反応させた場合に、上記マトリックスメタロプロテアーゼにより開裂される、［４］～［７］のいずれかに記載の応答剤。
［９］上記マトリックスメタロプロテアーゼに対する開裂反応が共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）現象によって観測されることを特徴とする、［４］～［８］のいずれかに記載の応答剤。
［１０］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、がんセンサー又はがんマーカ。
［１１］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、マトリックスメタロプロテアーゼの定量アッセイキット。
［１２］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、ドラッグデリバリーシステム。
［１３］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、細胞分離材。
［１４］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、３次元細胞培養用基材。
［１］一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列を含み、Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、ペプチド。
［２］上記アミノ酸配列において、Ｐ２はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はアラニン残基（Ａｌａ）であり、Ｐ２がロイシン残基（Ｌｅｕ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）であって、且つ、Ｐ２’はアルギニン残基（Ａｒｇ）であり、Ｐ２がアラニン残基（Ａｌａ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はメチオニン残基（Ｍｅｔ）であって、且つ、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、［１］に記載のペプチド。
［３］上記アミノ酸配列が、配列番号１、４、５、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列である、［１］又は［２］に記載のペプチド。
［４］一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表される、マトリックスメタロプロテアーゼ開裂部位を有するアミノ酸配列を含み、↓は上記マトリックスメタロプロテアーゼ開裂部位であり、Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、マトリックスメタロプロテアーゼに対する応答剤。
［５］上記アミノ酸配列において、Ｐ２はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はアラニン残基（Ａｌａ）であり、Ｐ２がロイシン残基（Ｌｅｕ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）であって、且つ、Ｐ２’はアルギニン残基（Ａｒｇ）であり、Ｐ２がアラニン残基（Ａｌａ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はメチオニン残基（Ｍｅｔ）であって、且つ、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、［４］に記載の応答剤。
［６］上記アミノ酸配列が、配列番号１、４、５、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列である、［４］又は［５］に記載の応答剤。
［７］上記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、［４］～［６］のいずれかに記載の応答剤。
［８］上記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ－２であり、上記ＭＭＰ－２の濃度が０．４５ｎＭ以上であるＭＭＰ－２含有液と反応させた場合に、上記マトリックスメタロプロテアーゼにより開裂される、［４］～［７］のいずれかに記載の応答剤。
［９］上記マトリックスメタロプロテアーゼに対する開裂反応が共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）現象によって観測されることを特徴とする、［４］～［８］のいずれかに記載の応答剤。
［１０］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、がんセンサー又はがんマーカ。
［１１］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、マトリックスメタロプロテアーゼの定量アッセイキット。
［１２］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、ドラッグデリバリーシステム。
［１３］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、細胞分離材。
［１４］［１］～［３］のいずれかに記載のペプチドを備える、３次元細胞培養用基材。
本発明によれば、種々のプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９）によって開裂可能であり、低濃度のＭＭＰ－２でも開裂可能なアミノ酸配列を有するペプチドを提供することができる。本発明のペプチドを用いることで、がんセンサー又はがんマーカ（既存がんマーカの補助、１次検査用）、ＭＭＰｓ定量アッセイキット、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、細胞分離材、細胞分取材、細胞の３次元培養用基材等の提供が期待される。また、本発明のペプチドを用いたがんセンサー等の評価系は、ゼラチン等の天然由来基質を用いた場合と異なり、ロット間差が生じにくいため、安定的な評価品質を有すると考えられる。
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
本明細書において、「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」とは、天然に存在するアミノ酸又は天然に存在しないアミノ酸両者を示す。２０種の天然アミノ酸については、アラニンがＡｌａ、システインがＣｙｓ、アスパラギン酸がＡｓｐ、グルタミン酸がＧｌｕ、フェニルアラニンがＰｈｅ、グリシンがＧｌｙ、ヒスチジンがＨｉｓ、イソロイシンがＩｌｅ、リジンがＬｙｓ、ロイシンがＬｅｕ、メチオニンがＭｅｔ、アスパラギンがＡｓｎ、プロリンがＰｒｏ、グルタミンがＧｌｎ、アルギニンがＡｒｇ、セリンがＳｅｒ、トレオニンがＴｈｒ、バリンがＶａｌ、トリプトファンがＴｒｐ、チロシンがＴｙｒと示される。また、上記アミノ酸は立体配置によってＤ体又はＬ体に大別されるが、本明細書におけるプロテアーゼ開裂部位を有するアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基はＬ体であることが好ましい。
「ペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド結合により脱水縮合した２つ以上のアミノ酸を含んだ物質を指し、本明細書に記載されるアミノ酸配列は左がＮ末端に対応し、右はＣ末端に対応する。
ペプチド及びタンパク質の合成方法に特に限定はなく、有機化学的合成方法でもよく微生物や培養細胞を用いた遺伝子工学的合成方法であってもよい。上記有機化学的合成方法の手法として、特に限定はなくＮ末アミノ基を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル；Ｆｍｏｃ基又はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル；Ｂｏｃ基で置換したＮ末保護アミノ酸によるＦｍｏｃ／Ｂｏｃ固相又は液相法、上記固相又は液相法によって合成した種々のペプチドセグメントを用いたネイティブケミカルライゲーション法等を用いてもよい。
本明細書において、「プロテアーゼ」は、ペプチド及びタンパク質のペプチド結合の加水分解を触媒する加水分解酵素を指し、「マトリックスメタロプロテアーゼ；ＭＭＰ」は活性中心に亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）が配位したプロテアーゼを示し、プロテアーゼ濃度は［Ｅ］で表される。
本明細書において、「プロテアーゼ開裂部位」及び「↓」とはプロテアーゼに特異的に認識されるアミノ酸配列を有し、活性状態のプロテアーゼが存在する環境下で特異的に認識され加水分解される部位又はドメインを指す。本発明のペプチド及びタンパク質は、上記部位又はドメインを少なくとも一つ以上有しており、また複数のプロテアーゼ開裂部位を有するものであってもよい。プロテアーゼ開裂部位は、２～２０アミノ酸残基、３～２０アミノ酸残基又は４～１５アミノ酸残基で構成されていてよい。酵素開裂するアミノ酸配列を示す場合、アミノ酸残基の開裂部位からＮ末端側に向かってＰ１部位、Ｐ２部位・・・、開裂部位からＣ末端側に向かってＰ１’部位、Ｐ２’部位・・・と呼ぶ。公知の通り、開裂部位であるＰ１及びＰ１’、開裂部位の隣接残基であるＰ２及びＰ２’は種々のプロテアーゼにおける基質特異性及び開裂効率に影響し得る。
開裂反応の観測方法に特に限定はなく、例えば電気化学ポテンシャル、蛍光、化学発光、燐光、吸光度、抗体結合又は質量の変化量によって観測してもよい。上記変化量の観測方法に特に限定はなく、例えばドナー蛍光分子とアクセプター蛍光分子間の双極子－双極子相互作用に基づいて起こる蛍光共鳴エネルギー移動；ＦＲＥＴ等を用いてよい。上記ＦＲＥＴ現象を起こす分子について、特に限定はなく５－（２－アミノエチルアミノ）－１－ナフタレンスルホン酸；ＥＤＡＮＳ／４－（（－４－（ジメチルアミノ）－フェニル）－アゾ）－安息香酸；ＤＡＢＣＹＬペア、７－メトキシクマリン－４－酢酸；Ｍｃａ／２，４－ジニトロフェニル；Ｄｎｐペア、７－アミノ－４－カルバモイルメチルクマリン；ＡＣＣ／Ｄｎｐペア、トリプトファン；Ｔｒｐ／５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホン酸；Ｄａｎｃｙｌペア等が例示される。上記ＦＲＥＴ現象を起こす分子及びその分子構造を含むユニットはペプチド主鎖に導入されてもよく、ペプチド側鎖に導入されてもよい。
本明細書において「基質」とは、酵素によって反応を触媒される化学物質を指し、本発明のペプチドは、ＭＭＰに対する「基質」に該当する。基質濃度は［Ｓ］と示される。「基質の反応性」及び「開裂能」は、種々の酵素に対する基質の反応特異性を示す用語として用いられる。基質の反応特異性は、標準的な反応速度論的解析によって数値化でき、公知の方法によれば例えば、基質濃度と反応速度の関係を示す酵素反応曲線又はラインウィーバー＝バークプロット等のミカエリス・メンテン式の線形プロットから導出可能である。一般的に、上記基質の反応特異性は触媒効率；ｋｃａｔ／Ｋｍ値を指標とし、ｋｃａｔは分子活性と呼ばれる単位時間当たりに酵素１分子が行う酵素回数を示し、Ｋｍはミカエリス定数と呼ばれる最大反応速度Ｖｍａｘの半分の速度に達するときの基質濃度を示す。本明細書において、触媒効率は５．０×１０３Ｍ－１ｓ－１以上が好ましく８．０×１０３Ｍ－１ｓ－１以上がより好ましく、１．０×１０４Ｍ－１ｓ－１以上がさらに好ましく、１．２×１０４Ｍ－１ｓ－１以上が特に好ましい。また、上記手順に従って触媒効率を導出する場合、基質濃度はＫｍ値よりも低値であることが好ましく、３０μＭ以下が好ましく２０μＭ以下がより好ましい。加えて、酵素開裂反応前後における上記変化量を観測する上で、基質濃度は５μＭ以上が好ましく、１０μＭ以上がより好ましい。同様の理由で、酵素濃度、例えばＭＭＰ－２含有液中のＭＭＰ－２の濃度は、０．１ｎＭ以上とすることができ、０．３ｎＭ以上が好ましく、０．６ｎＭ以上がより好ましく、１．０ｎＭ以上がさらに好ましい。
一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列又は一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列において、Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である。一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列において、↓はマトリックスメタロプロテアーゼ開裂部位である。
疎水性アミノ酸残基としては、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ等が挙げられる。
一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列又は一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列において、Ｐ２はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はアラニン残基（Ａｌａ）であってよく、Ｐ２がロイシン残基（Ｌｅｕ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）であってよく、且つ、Ｐ２’はアルギニン残基（Ａｒｇ）であってよく、Ｐ２がアラニン残基（Ａｌａ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はメチオニン残基（Ｍｅｔ）であってよく、且つ、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）であってよい。
一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’又は一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列の具体例として、配列番号１～１１で表されるアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明のペプチドは、配列番号１～１１で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される少なくとも１種を含むものであってもよい。配列番号１～１１で表されるアミノ酸配列は、少なくともＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９によって開裂され得る。また、配列番号１～１１で表されるアミノ酸配列は、低濃度（０．４５ｎＭ）のＭＭＰ－２を含有する液によっても開裂され得る。配列番号１～１１で表されるアミノ酸配列において、開裂部位は、Ｐ１及びＰ１’の間に存在する。本発明のペプチドを開裂し得るＭＭＰは他にも存在し、構造的・機能的観点からコラゲナーゼ群（ＭＭＰ－１，８，１３）、ゼラチナーゼ群（ＭＭＰ－２，９）、ストロムライシン群（ＭＭＰ－３，１０，１１）、細胞膜貫通型ＭＭＰ（ＭＭＰ－１４；ＭＴ１－ＭＭＰ，ＭＭＰ－１５；ＭＴ２－ＭＭＰ，ＭＭＰ－１６；ＭＴ３－ＭＭＰ，ＭＭＰ－１７；ＭＴ４－ＭＭＰ）等に分類される。上記ＭＭＰは単一で作用してもよく、２種類以上のＭＭＰが協奏して作用してもよい。本明細書においては、２種類以上のＭＭＰをまとめて「ＭＭＰｓ」ともいう。
本発明における、一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’又は一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列は、配列番号１，４，５，９，１０又は１１で表されるアミノ酸配列であることが好ましい。すなわち、本発明のペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、配列番号９で表されるアミノ酸配列、配列番号１０で表されるアミノ酸配列及び配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
本発明のペプチドは、一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’又は一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列を含むものであればよく、一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’又は一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の少なくとも一方又は両方に更なるアミノ酸配列が付加されていてもよい。付加されるアミノ酸配列に特に制限はない。
本発明のペプチドとしては、例えば、配列番号１２～２１又は２２のアミノ酸を含むペプチドが挙げられる。本発明のペプチドは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列、配列番号１５で表されるアミノ酸配列、配列番号１６で表されるアミノ酸配列、配列番号２０で表されるアミノ酸配列、配列番号２１で表されるアミノ酸配列及び配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
本発明のペプチドの長さは、４０アミノ酸残基以下、３０アミノ酸残基以下、２０アミノ酸残基以下、１０アミノ酸残基以下又は８アミノ酸残基以下とすることができる。ペプチドの長さがこの範囲にあると、３次元細胞培養基材、ＭＭＰ定量キット等に適用しやすくなる。
ペプチドは、アミノ酸のＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＬｙｓを含んでいることが好ましい。これらのアミノ酸を含むと、親水性が向上する。ペプチドは、アミノ酸Ｃｙｓ又はＬｙｓを含むことが好ましい。これらのアミノ酸を含むと、ペプチドを修飾することが可能である。
本発明のペプチドは、少なくともＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９によって開裂され得るため、プロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９）に対する応答剤として使用することができる。本明細書において、「応答剤」とは、プロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９）により部位特異的に加水分解されて開裂する（プロテアーゼに応答する）ペプチドを意味する。本発明の応答剤は、この開裂反応を利用することで、種々の用途へ応用することができる。
例えばＪｉｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｖｉａ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ， Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０１７， Ｖｏｌ． ７， Ｉｓｓｕｅ １１， ２８７８－２８８７、Ａｋｉｆｕｍｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｅｎｚｙｍｅ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ， Ｖｏｌｕｍｅ ６７， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１８， Ｐａｇｅｓ ３２－４１、Ｒｉｃａｒｄｏ ＣＡ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｉｃ ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９， １３２６－１３３５ （２０１７）等に記載されているように、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３又はＭＭＰ－９によって開裂されるアミノ酸配列を含むペプチドは、がんセンサー又はがんマーカ（既存がんマーカの補助、１次検査用）、ＭＭＰｓ定量アッセイキット、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、細胞分離材、細胞分取材、細胞の３次元培養用基材等に用いることができる。本発明のペプチドは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９によって開裂を受けるため、詳しくは後述するように、がんセンサー又はがんマーカ（既存がんマーカの補助、１次検査用）、ＭＭＰｓ定量アッセイキット、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、細胞分離材・分取、細胞の３次元培養用基材等に用いることができると考えられる。なお、本発明のペプチドを用いたがんセンサー等の評価系は、ゼラチン等の天然由来基質を用いた場合と異なり、ロット間差が生じにくいため、安定的な評価品質を有すると考えられる。
がんは増殖・転移するために、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９を大量に分泌し、血管の中に浸透し血液の流れに乗って転移することが分かっている。つまり、がんがあるとＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の血液中の濃度が増加するため、本発明のペプチドは、血液中のＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９のアッセイ・定量化をすることより、がんの１次検査剤として活用可能であると考えられる。これを利用して、本発明のペプチドを用いて、モニタリング用センサーや血糖値や酸素モニタリングなどと組み合わせたセンサーを開発することが可能である（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｓｅｎｓｏｒ、センサーのカートリッジ、消耗品）。また、本発明のペプチドは、ストロムライシン群に分類されるＭＭＰ－３に対しても開裂能を示すため、がんだけでなく、例えば関節リウマチに対する一次検査剤として使用することもできると考えられる。
本発明のペプチドはまた、ＭＭＰｓの発現量を定量化するキット（研究用）に応用することが可能である。本発明のペプチドはまた、関連する生理現象及び病態の評価アッセイへの応用も可能である。本発明のペプチドは高感度であるため、低いＬＯＤ値（ＬＯＤ：Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、検出下限）を有すると考えられる。よって、低濃度領域のアッセイにおいて、高正確率（Ｈｉｇｈ Ａｃｃｕｒａｃｙ）、高感度（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の結果が期待される。
本発明のペプチドは、ＭＭＰｓと反応し開裂される特徴を有するため、ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼ばれる分野への応用も考えられる（薬物＋ペプチドリンカー＋抗体）。例えば、下記構造式のような分子設計により、カテプシンという酵素により開裂されるペプチドリンカーを用いたＤＤＳ応用材料の開発をすることが可能である。下記構造式において、ペプチドリンカーを本発明のペプチドに変更することで、標的であるがん細胞に到達した後、がん細胞が放出するＭＭＰｓによって速やかにペプチドリンカーが開裂され、適切に薬物を放出することができるＡＤＣを開発することができると考えられる。
本発明のペプチドを、表面改質材、架橋剤、コーティング材等に固定し、これらの材料をカラムに充填することで、細胞の分離材又は分取材として利用することができる。さらに、ＭＭＰに応答し開裂される穴（孔隙）を制御できる技術があれば、サイズによる分離又は分取も可能である。
本発明のペプチドは、高分子マトリクスの架橋剤として使うことができるため、ＭＭＰを分泌する細胞の３次元培養に応用することが可能である。高分子マトリクスゲルの中に、ＭＭＰを分泌する細胞腫を培養すると、細胞から生産されたＭＭＰにより徐々にゲルマトリクスが分解されながら、細胞間の相互作用が強くなり、細胞の塊（スフェロイド）の形成を促進することができる。すなわち、本発明のペプチドは、細胞塊（スフェロイド）形成用、癌スフェロイド３次元培養モデル作製用等の用途に応用することが可能である。
本発明のペプチドは酵素により分解されるため、酵素分解性プラスチックの開発や手術後の縫合糸等への応用も可能であると考えられる。
以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り試薬は市販品を用いた。
＜反応溶液、緩衝液等の組成＞
・脱保護液：ピペリジン（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ジメチルホルムアミド；ＤＭＦ（富士フィルム和光純薬（株）、７５ｖｏｌ％）
・アミノ酸カクテル：Ｎ末Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨはメルク（株）製、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨはシグマ・アルドリッチ社製、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨはＣｈｅｍｓｃｅｎｅ社製を使用、反応点に対して６当量）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル；Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ（商標）（メルク（株）製、反応点に対して６当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（富士フィルム和光純薬（株）、反応点に対して６当量）、２，４，６－トリメチルピリジン（東京化成工業（株）、反応点に対して１２当量）、ＤＭＦ（溶媒量）
・不活性化液：無水酢酸（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ＤＭＦ（７５ｖｏｌ％）
・脱樹脂液：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡ（東京化成工業（株）、９５ｍａｓｓ％）、トリイソプロピルシラン（富士フィルム和光純薬（株）、２．５ｍａｓｓ％）、蒸留水（２．５ｍａｓｓ％）
・溶離液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／蒸留水
・溶離液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル（高速液体クロマトグラフ用、富士フィルム和光純薬（株））
・１．５ｍＭ ペプチド溶液：ＦＲＥＴ基質、ＤＭＳＯ
・トリス塩酸緩衝液：１００ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ 塩化カルシウム（ｐＨ ７．５）
・１Ｍ ４－アミノフェニル酢酸第二水銀；ＡＰＭＡストック溶液：ＡＰＭＡ、ジメチルスルホキシド；ＤＭＳＯ（富士フィルム和光純薬（株））
・１ｍＭ ＡＰＭＡ反応液：１Ｍ ＡＰＭＡストック溶液、トリス塩酸緩衝液
・３．６μＭ ＭＭＰ－２溶液：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＭＰ－２（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）、トリス塩酸緩衝液
・脱保護液：ピペリジン（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ジメチルホルムアミド；ＤＭＦ（富士フィルム和光純薬（株）、７５ｖｏｌ％）
・アミノ酸カクテル：Ｎ末Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨはメルク（株）製、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨはシグマ・アルドリッチ社製、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ，Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨはＣｈｅｍｓｃｅｎｅ社製を使用、反応点に対して６当量）、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル；Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ（商標）（メルク（株）製、反応点に対して６当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（富士フィルム和光純薬（株）、反応点に対して６当量）、２，４，６－トリメチルピリジン（東京化成工業（株）、反応点に対して１２当量）、ＤＭＦ（溶媒量）
・不活性化液：無水酢酸（富士フィルム和光純薬（株）、２５ｖｏｌ％）、ＤＭＦ（７５ｖｏｌ％）
・脱樹脂液：トリフルオロ酢酸；ＴＦＡ（東京化成工業（株）、９５ｍａｓｓ％）、トリイソプロピルシラン（富士フィルム和光純薬（株）、２．５ｍａｓｓ％）、蒸留水（２．５ｍａｓｓ％）
・溶離液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／蒸留水
・溶離液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／アセトニトリル（高速液体クロマトグラフ用、富士フィルム和光純薬（株））
・１．５ｍＭ ペプチド溶液：ＦＲＥＴ基質、ＤＭＳＯ
・トリス塩酸緩衝液：１００ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ 塩化カルシウム（ｐＨ ７．５）
・１Ｍ ４－アミノフェニル酢酸第二水銀；ＡＰＭＡストック溶液：ＡＰＭＡ、ジメチルスルホキシド；ＤＭＳＯ（富士フィルム和光純薬（株））
・１ｍＭ ＡＰＭＡ反応液：１Ｍ ＡＰＭＡストック溶液、トリス塩酸緩衝液
・３．６μＭ ＭＭＰ－２溶液：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＭＰ－２（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）、トリス塩酸緩衝液
＜Ｆｍｏｃペプチド固相合成＞
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質、及び、既存のＭＭＰ応答配列である配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質（Ｂｒｅｍｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖ７，７４３－７４８（２００１）．参照）として、それぞれ、配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列、及び、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド基質を、Ｆｍｏｃ固相合成法で合成した。既存のＭＭＰ応答配列である配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質（特許文献１）としては、配列番号２３で表されるアミノ酸配列に対してＣ末端にＤｎｐ基を側鎖に有するＬｙｓ残基を新たに導入し、合計９残基で構成されるペプチド基質を合成した。上記ペプチド基質はいずれも、Ｍｃａ基及びＤｎｐ基を導入したＦＲＥＴペプチド基質として合成した（以降、「ＦＲＥＴ基質」と示す、表１参照）。マルチ固相合成器（ＫＭＳ－３、国産化学（株））にエコノパックカラム（２０ｍＬ、ＢＩＯ ＲＡＤ製）をセットし、Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＡＭ ｒｅｓｉｎ（１００－２００ｍｅｓｈ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、メルク（株））を０．０５ｍｍｏｌスケールとなるように秤量した後、ジクロロメタン；ＤＣＭ（ペプチド合成用グレード、富士フィルム和光純薬（株））２ｍＬを添加し過流攪拌下で１２～２４時間膨潤した。膨潤液を除液後、脱保護液を２ｍＬ添加し樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護した（２ｍＬ×２回、各１０分処理）。脱保護液を除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した後にアミノ酸カクテルを添加し、過流攪拌下で２～３時間反応させることで樹脂担体上にアミノ酸をカップリングさせた。反応液の除液後、不活性化液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３０分間処理することで未反応点をキャッピングした。不活性化液の除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄してＦｍｏｃアミノ酸導入樹脂担体を得た。以降、上記脱保護、カップリング反応、未反応点の不活性化を繰り返し実施することで目的アミノ酸配列を有するペプチド基質を合成した。
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質、及び、既存のＭＭＰ応答配列である配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質（Ｂｒｅｍｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖ７，７４３－７４８（２００１）．参照）として、それぞれ、配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列、及び、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド基質を、Ｆｍｏｃ固相合成法で合成した。既存のＭＭＰ応答配列である配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質（特許文献１）としては、配列番号２３で表されるアミノ酸配列に対してＣ末端にＤｎｐ基を側鎖に有するＬｙｓ残基を新たに導入し、合計９残基で構成されるペプチド基質を合成した。上記ペプチド基質はいずれも、Ｍｃａ基及びＤｎｐ基を導入したＦＲＥＴペプチド基質として合成した（以降、「ＦＲＥＴ基質」と示す、表１参照）。マルチ固相合成器（ＫＭＳ－３、国産化学（株））にエコノパックカラム（２０ｍＬ、ＢＩＯ ＲＡＤ製）をセットし、Ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ＡＭ ｒｅｓｉｎ（１００－２００ｍｅｓｈ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、メルク（株））を０．０５ｍｍｏｌスケールとなるように秤量した後、ジクロロメタン；ＤＣＭ（ペプチド合成用グレード、富士フィルム和光純薬（株））２ｍＬを添加し過流攪拌下で１２～２４時間膨潤した。膨潤液を除液後、脱保護液を２ｍＬ添加し樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護した（２ｍＬ×２回、各１０分処理）。脱保護液を除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した後にアミノ酸カクテルを添加し、過流攪拌下で２～３時間反応させることで樹脂担体上にアミノ酸をカップリングさせた。反応液の除液後、不活性化液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３０分間処理することで未反応点をキャッピングした。不活性化液の除液後、ＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄してＦｍｏｃアミノ酸導入樹脂担体を得た。以降、上記脱保護、カップリング反応、未反応点の不活性化を繰り返し実施することで目的アミノ酸配列を有するペプチド基質を合成した。
＜粗精製、ＬＣ分離精製＞
所定のアミノ酸配列を有するペプチドを合成した後、Ｎ末に存在するＦｍｏｃ基を脱保護し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びメタノールで洗浄し、デシケータ内で２４時間静置することで乾燥樹脂担体を得た。上記乾燥樹脂担体に冷やした脱樹脂液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３～４時間処理することで脱樹脂及び側鎖保護基の脱保護を達成した。ペプチドを含む上澄み液を回収後、さらに上記脱樹脂液を２ｍＬ添加して樹脂担体を洗浄した。上記上澄み液及び洗浄液（計４ｍＬ）に冷ジエチルエーテルを１０倍量添加した後、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分）して沈殿物を回収した。沈殿物は再度冷ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥して粗ポリペプチドを得た。得られた粗ポリペプチドを溶離液Ａに溶解した後、溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用いて中圧液体クロマトグラフ（型式：ＥＰＣＬＣ－ＡＩ－５８０Ｓ、山善（株））によって目的成分を分画し、アセトニトリルを減圧留去した後、凍結乾燥して精製ペプチドを得た。
所定のアミノ酸配列を有するペプチドを合成した後、Ｎ末に存在するＦｍｏｃ基を脱保護し、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びメタノールで洗浄し、デシケータ内で２４時間静置することで乾燥樹脂担体を得た。上記乾燥樹脂担体に冷やした脱樹脂液を２ｍＬ添加し過流攪拌下で３～４時間処理することで脱樹脂及び側鎖保護基の脱保護を達成した。ペプチドを含む上澄み液を回収後、さらに上記脱樹脂液を２ｍＬ添加して樹脂担体を洗浄した。上記上澄み液及び洗浄液（計４ｍＬ）に冷ジエチルエーテルを１０倍量添加した後、遠心分離（２，０００×ｇ、１０分）して沈殿物を回収した。沈殿物は再度冷ジエチルエーテルで洗浄した後、減圧乾燥して粗ポリペプチドを得た。得られた粗ポリペプチドを溶離液Ａに溶解した後、溶離液Ａ及び溶離液Ｂを用いて中圧液体クロマトグラフ（型式：ＥＰＣＬＣ－ＡＩ－５８０Ｓ、山善（株））によって目的成分を分画し、アセトニトリルを減圧留去した後、凍結乾燥して精製ペプチドを得た。
［実施例１：配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＭＭＰ－２開裂検証］
ＭＭＰ－２開裂検証には、ＭＭＰ－２ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）を使用し、メーカー推奨プロトコルに則って開裂試験を実施した。配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドをそれぞれＤＭＳＯに溶解させて、６種類の１．５ｍＭペプチド溶液を得た。得られた１．５ｍＭペプチド溶液を、キットに付属するＭＭＰ－２ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ４０倍希釈して測定サンプルとした（基質濃度：［Ｓ］＝３７．５μＭ）。ＭＭＰ－２を、上記ＭＭＰ－２ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＭＰ－２溶液を得た（酵素濃度：［Ｅ］＝７μＭ）。得られたＭＭＰ－２溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（サーモフィッシャー製）に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることでＭＭＰ－２を活性化させた。上記プレートに測定サンプルをそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｓ］＝１８．７５μＭ、［Ｅ］＝３．５μＭ、３７℃、１２０分）。
ＭＭＰ－２開裂検証には、ＭＭＰ－２ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）を使用し、メーカー推奨プロトコルに則って開裂試験を実施した。配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドをそれぞれＤＭＳＯに溶解させて、６種類の１．５ｍＭペプチド溶液を得た。得られた１．５ｍＭペプチド溶液を、キットに付属するＭＭＰ－２ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ４０倍希釈して測定サンプルとした（基質濃度：［Ｓ］＝３７．５μＭ）。ＭＭＰ－２を、上記ＭＭＰ－２ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒに溶解し、ＭＭＰ－２溶液を得た（酵素濃度：［Ｅ］＝７μＭ）。得られたＭＭＰ－２溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（サーモフィッシャー製）に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることでＭＭＰ－２を活性化させた。上記プレートに測定サンプルをそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｓ］＝１８．７５μＭ、［Ｅ］＝３．５μＭ、３７℃、１２０分）。
蛍光測定を開始してから６０分間の結果を図１に示す。図１の横軸は、蛍光測定を開始してからの時間（分）を示し、縦軸は、測定開始時点の蛍光強度値に対する蛍光強度値の変化量（ΔＲＦＵ値）を示す。グラフの傾きが大きいほど、反応速度が大きいこと、すなわち開裂能が高いことを示す。図１から明らかなとおり、本評価系において、配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質は、ＭＭＰ－２に対して開裂能を有することが示された。
［比較例１：配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＭＭＰ－２開裂検証］
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＭＭＰ－２開裂性能を評価した。
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＭＭＰ－２開裂性能を評価した。
本評価系において、配列番号２３又は２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質は、ＭＭＰ－２に対して開裂能を示したが、実施例１と比較してＦＲＥＴ現象による単位時間当たりの蛍光強度値の変化量（ΔＲＦＵ値）が低かった。つまり、配列番号２３又は２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質は、反応速度が遅く、低開裂能であることが示唆された（図１）。
［実施例２：配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＭＭＰ－３開裂検証］
ＭＭＰ－３開裂検証には、ＭＭＰ－３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）を使用し、メーカー推奨プロトコルに則って開裂試験を実施した。実施例１と同様にして測定サンプルを得た。ＭＭＰ－２に替えてＭＭＰ－３を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＭＭＰ－３溶液を得た（酵素濃度：［Ｅ］＝１．６μＭ）。得られたＭＭＰ－３溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（サーモフィッシャー製）に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートすることでＭＭＰ－３を活性化させた。上記プレートに測定サンプルをそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｓ］＝１８．７５μＭ、［Ｅ］＝０．８μＭ、３７℃、１２０分）。
ＭＭＰ－３開裂検証には、ＭＭＰ－３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）を使用し、メーカー推奨プロトコルに則って開裂試験を実施した。実施例１と同様にして測定サンプルを得た。ＭＭＰ－２に替えてＭＭＰ－３を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＭＭＰ－３溶液を得た（酵素濃度：［Ｅ］＝１．６μＭ）。得られたＭＭＰ－３溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（サーモフィッシャー製）に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートすることでＭＭＰ－３を活性化させた。上記プレートに測定サンプルをそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｓ］＝１８．７５μＭ、［Ｅ］＝０．８μＭ、３７℃、１２０分）。
蛍光測定を開始してから６０分間の結果を図２に示す。図２の横軸は、蛍光測定を開始してからの時間（分）を示し、縦軸は測定開始時点の蛍光強度値に対する蛍光強度値の変化量（ΔＲＦＵ値）を示す。グラフの傾きが大きいほど、反応速度が大きいこと、すなわち開裂能が高いことを示す。図２から明らかなとおり、本評価系において、配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質は、ＭＭＰ－３に対して開裂能を有することが示された。
［比較例２：配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＭＭＰ－３開裂検証］
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例２と同様にして、ＭＭＰ－３開裂性能を評価した。
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例２と同様にして、ＭＭＰ－３開裂性能を評価した。
本評価系において、配列番号２３又は２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質は、両者ともにＭＭＰ－３に対して開裂能を示さなかった（図２）。
［実施例３：配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＭＭＰ－９開裂検証］
ＭＭＰ－９開裂検証には、ＭＭＰ－９ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）を使用し、メーカー推奨プロトコルに則って開裂試験を実施した。実施例１と同様にして測定サンプルを得た。ＭＭＰ－２に替えてＭＭＰ－９を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＭＭＰ－９溶液を得た（酵素濃度：［Ｅ］＝１０．４μＭ）。得られたＭＭＰ－９溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（サーモフィッシャー製）に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることでＭＭＰ－９を活性化させた。上記プレートに測定サンプルをそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｓ］＝１８．７５μＭ、［Ｅ］＝５．２μＭ、３７℃、１２０分）。
ＭＭＰ－９開裂検証には、ＭＭＰ－９ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．製）を使用し、メーカー推奨プロトコルに則って開裂試験を実施した。実施例１と同様にして測定サンプルを得た。ＭＭＰ－２に替えてＭＭＰ－９を用いたこと以外は実施例１と同様にして、ＭＭＰ－９溶液を得た（酵素濃度：［Ｅ］＝１０．４μＭ）。得られたＭＭＰ－９溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋ（サーモフィッシャー製）に５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることでＭＭＰ－９を活性化させた。上記プレートに測定サンプルをそれぞれ５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｓ］＝１８．７５μＭ、［Ｅ］＝５．２μＭ、３７℃、１２０分）。
蛍光測定を開始してから６０分間の結果を図３に示す。図３の横軸は、蛍光測定を開始してからの時間（分）を示し、縦軸は測定開始時点の蛍光強度値に対する蛍光強度値の変化量（ΔＲＦＵ値）を示す。グラフの傾きが大きいほど、反応速度が大きいこと、すなわち開裂能が高いことを示す。図３から明らかなとおり、本評価系において、配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する基質は、ＭＭＰ－９に対して開裂能を有することが示された。
［比較例３：配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＭＭＰ－９開裂検証］
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例３と同様にして、ＭＭＰ－９開裂性能を評価した。
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例３と同様にして、ＭＭＰ－９開裂性能を評価した。
本評価系において、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有する基質はＭＭＰ－９に対して開裂能を有することが確認された。一方で、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有する基質はＭＭＰ－９に対して開裂能を示さなかった（図３）。
［実施例４：配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対するＭＭＰ－２の酵素活性評価］
３．６μＭ ＭＭＰ－２溶液を１ｍＭ ＡＰＭＡ反応溶液で５００倍希釈した後、室温（２５℃）で１時間インキュベートすることで、ＭＭＰ－２を活性化させた。次に、実施例１と同様にして得られた１．５ｍＭ ペプチド溶液を、トリス塩酸緩衝液を用いて希釈し、基質濃度が５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ又は６．２５μＭとなる測定サンプルを調製した。上記手順で活性化させたＭＭＰ－２溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋに５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした後に測定サンプルを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｅ］＝３．６μＭ、［Ｓ］＝２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ又は３．１２５μＭ、３７℃、１２０分）。測定値より初期反応速度ｖ０（μＭ ｍｉｎ－１）を算出した後、公知であるラインウィーバー＝バークプロット（式（１））及び式（２）より触媒効率ｋｃａｔ／Ｋｍを導出した。本明細書において、式（２）における［Ｅ］０とは初期酵素濃度を指し、［Ｅ］と同義で使用した。
１／ｖ０＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）・（１／［Ｓ］）＋（１／Ｖｍａｘ） ―（１）
ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］０ ―（２）
（ｖ：反応速度（μＭ・ｍｉｎ－１）、Ｋｍ：ミカエリス・メンテン定数（μＭ）、Ｖｍａｘ：最大反応速度（μＭ・ｍｉｎ－１）、［Ｓ］：基質濃度（μＭ）、ｋｃａｔ：触媒定数（ｓ－１）、［Ｅ］０：初期酵素濃度（μＭ））
３．６μＭ ＭＭＰ－２溶液を１ｍＭ ＡＰＭＡ反応溶液で５００倍希釈した後、室温（２５℃）で１時間インキュベートすることで、ＭＭＰ－２を活性化させた。次に、実施例１と同様にして得られた１．５ｍＭ ペプチド溶液を、トリス塩酸緩衝液を用いて希釈し、基質濃度が５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ又は６．２５μＭとなる測定サンプルを調製した。上記手順で活性化させたＭＭＰ－２溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋに５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした後に測定サンプルを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｅ］＝３．６μＭ、［Ｓ］＝２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ又は３．１２５μＭ、３７℃、１２０分）。測定値より初期反応速度ｖ０（μＭ ｍｉｎ－１）を算出した後、公知であるラインウィーバー＝バークプロット（式（１））及び式（２）より触媒効率ｋｃａｔ／Ｋｍを導出した。本明細書において、式（２）における［Ｅ］０とは初期酵素濃度を指し、［Ｅ］と同義で使用した。
１／ｖ０＝（Ｋｍ／Ｖｍａｘ）・（１／［Ｓ］）＋（１／Ｖｍａｘ） ―（１）
ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］０ ―（２）
（ｖ：反応速度（μＭ・ｍｉｎ－１）、Ｋｍ：ミカエリス・メンテン定数（μＭ）、Ｖｍａｘ：最大反応速度（μＭ・ｍｉｎ－１）、［Ｓ］：基質濃度（μＭ）、ｋｃａｔ：触媒定数（ｓ－１）、［Ｅ］０：初期酵素濃度（μＭ））
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質の触媒効率は１．０×１０４（Ｍ－１・ｓ－１）以上であった。特に配列番号１５、１６又は２１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質は、１．５×１０４（Ｍ－１・ｓ－１）の触媒効率を有しており、後述する比較例４の２～４倍の数値を示した（図４）。
［比較例４：配列番号２３、２４に対するＭＭＰ－２の酵素活性評価］
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例４と同様にして、ＭＭＰ－２の酵素活性を評価した。
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例４と同様にして、ＭＭＰ－２の酵素活性を評価した。
本評価系において、配列番号２３又は２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質のＭＭＰ－２に対する触媒効率は実施例４と比較して低く、低酵素活性であることが確認された（図４）。
［実施例５：配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの、異なるＭＭＰ－２濃度における開裂性能評価］
実施例４と同様の方法でＭＭＰ－２を活性化させた後、酵素濃度が２．０μＭ、１．０μＭ又は０．９μＭとなるように、１ｍＭ ＡＰＭＡ反応液で希釈した。次に、実施例１と同様の方法で得られた１．５ｍＭ ペプチド溶液をトリス塩酸緩衝液で６０倍希釈し、２５μＭ 測定サンプルを調製した。希釈後に得られたＭＭＰ－２溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋに５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、２５μＭ 測定サンプルを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｅ］＝１．０ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．４５ｎＭ、［Ｓ］＝１２．５μＭ、３７℃、６０分又は１２０分）。
実施例４と同様の方法でＭＭＰ－２を活性化させた後、酵素濃度が２．０μＭ、１．０μＭ又は０．９μＭとなるように、１ｍＭ ＡＰＭＡ反応液で希釈した。次に、実施例１と同様の方法で得られた１．５ｍＭ ペプチド溶液をトリス塩酸緩衝液で６０倍希釈し、２５μＭ 測定サンプルを調製した。希釈後に得られたＭＭＰ－２溶液を９６ ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ， ｂｌａｃｋに５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、２５μＭ 測定サンプルを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、励起波長：３２５ｎｍ、検出波長：３９３ｎｍで蛍光測定した（１００μＬ／ｗｅｌｌ、［Ｅ］＝１．０ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．４５ｎＭ、［Ｓ］＝１２．５μＭ、３７℃、６０分又は１２０分）。
結果を図５～７に示す。図５～７の横軸は、蛍光測定を開始してからの時間（分）を示し、縦軸は測定開始時点の蛍光強度値に対する蛍光強度値の変化量（ΔＲＦＵ値）を示す。グラフの傾きが大きいほど、反応速度が大きいこと、すなわち開裂能が高いことを示す。図５～７から明らかなとおり、本評価系において、配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質については、検証したすべての酵素濃度条件（［Ｅ］＝１．０ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．４５ｎＭ）において開裂進行を確認できた。
［比較例５：配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの、異なるＭＭＰ－２濃度における開裂性能評価］
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例５と同様にして、異なるＭＭＰ－２濃度における開裂性能を評価した。
配列番号１２、１５、１６、２０、２１又は２２で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドに替えて、配列番号２３、２４で表されるアミノ酸配列を有する精製ペプチドを用いたこと以外は実施例５と同様にして、異なるＭＭＰ－２濃度における開裂性能を評価した。
本評価系において、配列番号２３又は２４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド基質は、酵素濃度が１．０ｎＭ及び０．５ｎＭである場合に開裂進行を確認できたが、実施例５と比較してＦＲＥＴ現象による単位時間当たりの蛍光強度値の変化量が小さかった（図５，６）。また、酵素濃度０．４５ｎＭ条件においては開裂進行を確認することができなかった（図７）。
Claims (14)
- 一般式：Ｐ２Ｐ１Ｐ１’Ｐ２’で表されるアミノ酸配列を含み、
Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、
Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、
Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、ペプチド。 - 前記アミノ酸配列において、
Ｐ２はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はアラニン残基（Ａｌａ）であり、
Ｐ２がロイシン残基（Ｌｅｕ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）であって、且つ、Ｐ２’はアルギニン残基（Ａｒｇ）であり、
Ｐ２がアラニン残基（Ａｌａ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はメチオニン残基（Ｍｅｔ）であって、且つ、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、請求項１に記載のペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号１、４、５、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のペプチド。
- 一般式：Ｐ２Ｐ１↓Ｐ１’Ｐ２’で表される、マトリックスメタロプロテアーゼ開裂部位を有するアミノ酸配列を含み、
↓は前記マトリックスメタロプロテアーゼ開裂部位であり、
Ｐ１はグリシン残基（Ｇｌｙ）であり、
Ｐ２及びＰ１’は疎水性アミノ酸残基であり、
Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、マトリックスメタロプロテアーゼに対する応答剤。 - 前記アミノ酸配列において、
Ｐ２はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はアラニン残基（Ａｌａ）であり、
Ｐ２がロイシン残基（Ｌｅｕ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）であって、且つ、Ｐ２’はアルギニン残基（Ａｒｇ）であり、
Ｐ２がアラニン残基（Ａｌａ）である場合、Ｐ１’はロイシン残基（Ｌｅｕ）又はメチオニン残基（Ｍｅｔ）であって、且つ、Ｐ２’はアラニン残基（Ａｌａ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）、バリン残基（Ｖａｌ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）又はトレオニン残基（Ｔｈｒ）である、請求項４に記載の応答剤。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号１、４、５、９、１０又は１１で表されるアミノ酸配列である、請求項４又は５に記載の応答剤。
- 前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９からなる群より選択される少なくとも一種を含有する、請求項４～６のいずれか一項に記載の応答剤。
- 前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ－２であり、
前記ＭＭＰ－２の濃度が０．４５ｎＭ以上であるＭＭＰ－２含有液と反応させた場合に、前記マトリックスメタロプロテアーゼにより開裂される、請求項４～７のいずれか一項に記載の応答剤。 - 前記マトリックスメタロプロテアーゼに対する開裂反応が共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）現象によって観測されることを特徴とする、請求項４～８のいずれか一項に記載の応答剤。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドを備える、がんセンサー又はがんマーカ。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドを備える、マトリックスメタロプロテアーゼの定量アッセイキット。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドを備える、ドラッグデリバリーシステム。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドを備える、細胞分離材。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドを備える、３次元細胞培養用基材。
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| JP2021145638A JP2023038757A (ja) | 2021-09-07 | 2021-09-07 | マトリックスメタロプロテアーゼで開裂可能なペプチド基質 |
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