KR20050034642A - 펩티드 화합물 및 프로테아제 기질로서의 그의 용도 - Google Patents

펩티드 화합물 및 프로테아제 기질로서의 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로는 펩티드 화합물 및 염, 및 특히 프로테아제 기질, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테아제 ("MMP") 기질로서 유용한 펩티드 화합물 및 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물 및 염의 제조 방법 뿐만 아니라, 예를 들어 상기 방법에 사용될 수 있는 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 상기 화합물 및 염을 잠재적인 프로테아제 저해제의 유효성 평가 및 프로테아제 활성과 연관된 질환의 탐지 또는 모니터링을 위한 방법에 관한 것이다.

Description

펩티드 화합물 및 프로테아제 기질로서의 그의 용도{PEPTIDE COMPOUNDS AND THEIR USE AS PROTEASE SUBSTRATES}
본 발명은 일반적으로는 펩티드 화합물 및 염, 및 특히 프로테아제 기질, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테아제 ("MMP") 기질로서 유용한 펩티드 화합물 및 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물 및 염의 제조 방법 뿐만 아니라, 예를 들어 상기 방법에 사용될 수 있는 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 상기 화합물 및 염을 잠재적인 프로테아제 저해제의 유효성 평가 및 프로테아제 활성과 연관된 질환의 탐지 또는 모니터링을 위한 방법에 관한 것이다.
매트릭스 메탈로프로테이나제, 아연-의존성 프로테이나제의 한 패밀리는 연결 조직 분해에 수반되는 효소의 주요 클래스를 이룬다. 매트릭스 메탈로프로네이나제는 여러 개의 클래스로 나뉘어지며, 일부 구성원들은 일반적으로 사용에서 다중적인 명칭을 갖는다. 매트릭스 메탈로프로테이나제에는 하기가 포함된다: MMP-1 (콜라게나아제 1, 피블로블라스트 콜라게나아제, 또는 EC 3.4.24.3 로도 공지되어 있음), MMP-2 (젤라티나아제 A, 72kDa 젤라티나아제, 기저막 콜라게나아제, 또는 EC 3.4.24.24 로도 공지되어 있음), MMP-3 (스트로멜리신 1 또는 EC 3.4.24.17 로도 공지되어 있음), 프로테오글라이카나아제, MMP-7 (매트릴리신으로도 공지되어 있음), MMP-8 (콜라게나아제 II, 뉴트로필 콜라게나아제, 또는 EC 3.4.24.34 로도 공지되어 있음), MMP-9 (젤라티나아제 B, 92kDa 젤라티나아제, 또는 EC 3.4.24.35 로도 공지되어 있음), MMP-10 (스트로멜리신 2 또는 EC 3.4.24.22 로도 공지되어 있음), MMP-11 (스트로멜리신 3 로도 공지되어 있음), MMP-12 (메탈로엘라스타아제, 인간 마크로파지 엘라스타아제 또는 HME 로도 공지되어 있음), MMP- 13 (콜라게나아제 111 로도 공지되어 있음), MMP-14 (MT1-MMP 또는 멤브레인 MMP 로도 공지되어 있음), 및 MMP-26. 또한, 일반적으로 문헌 [Woessner, J.F., "The Matrix Metallopreteinase Family" in Matrix Metalloproteinases, pp.1-14 (Edited by Parks, W.C. & Mecham, R.P., Academic Press, San Diego, CA 1998)] 참조. 또한, 문헌 [Marchenko, G.N., et al., "Characterization of matrix metalloproteinase-26, a novel metalloproteinase widely expressed in cancer cells of epithelial origin" Biochem. J., 356:705-718 (2001)] 참조.
각각의 MMP 는 특이적인 아미노산 서열을 포함하며, 특이적인 세포 및 조직 분포를 나타내며, 표적 기질 단백질의 특이적인 서브세트를 가수분해한다. 일반적으로, MMP 의 정상적인 기질은 세포외 또는 세포 표면 단백질이다. 기질에 따라서, MMP 에 의한 절단은 기질을 불활성화시키거나 또는 활성화시킨다 (기질이 불활성 단백질 전구체인 경우). MMP 가 기타 단백질을 활성화 및 불활성화할 수 있으므로, MMP 는 종종 세포외 신호전달, 세포외 매트릭스 리모델링 및 대사의 조절에 중요한 역할을 한다. 따라서, MMP 의 활성의 적절한 조절은 세포 및 조직의 정상적인 발생 및 유지에 중요한다.
각각의 MMP 기질은 MMP 가 인식 및 결합할 수 있는 하나 이상의 특이적인 아미노산 서열 ("인식 부위") 를 포함한다. 각각의 상기 인식 부위와의 회합은 "절단되기 쉬운 결합 (절단이 용이한 결합)" 이다. 이는 MMP 에 의해 절단되는 결합이다. 절단되기 쉬운 결합의 절단은 2 개의 절단 생성물의 형성을 초래한다. 예를 들어, MMP 콜라게나아제는 특이적인 글리신-류신 또는 글리신-이소류신 서열에서 단일 펩티드 결합에서 단백질 콜라겐을 절단한다. 참고 문헌은, 예를 들어 [Weingarten, H., et al., "Synthetic Substrates of Vertebrate Collagenase, Biochemistry," 24:6730-6734 (1985)]. 특이적인 인식 부위 서열은 종종 하나 이상의 세포외 펩티드에서 발견된다. 따라서, 1 개의 MMP 는 다중의 세포외 펩티드 기질을 절단할 수 있다.
MMP 활성은 잘못조절될 수 있다. MMP 에 의한 연결 조직의 과도한 분해는 다수의 병리학적 상태의 특징이다. 상기 병리학적 상태는 일반적으로, 예를 들어 조직 붕괴 (tissue destruction), 섬유종 질환 (fibrotic disease), 병리학적 매트릭스 약화, 결함 상처 수복 (defective injury repair), 심혈관계 질환, 호흡기 질환, 신장 질환, 간장 질환, 및 중추 신경계 질환이 포함된다. 상기 상태의 구체적인 예에는, 예를 들어, 류마티스 관절염, 골관절염, 화농성 관절염, 다발경화증, 욕창성 궤양, 각막 궤양, 표피 궤양 (epidermal ulceration), 소화관 궤양 (gastric ulceration), 종양 전이, 종양 침입, 종양 혈관형성, 치주 질환, 간 경화, 섬유성 폐질환 (fibrotic lung disease), 폐기종, 이 경화증 (otosclerosis), 죽상동맥경화, 단백뇨, 심근경색, 확장성 심근증 (dilated cardiomyopathy), 울혈성 심부전, 대동맥류, 수포성 표피박리증 (epidermolysis bullosa), 골 질환, 알츠하이머병, 결함 상처 수복 (예를 들어, 약한 수복 (weak repair), 협착증, 예컨대 수술후 협착증, 및 스케어링 (scarring)), 만성 폐쇄성 폐질환, 및 관류후 심근 경색 (post myocardial infarction) 이 포함된다. MMP (특히 MMP-9) 는 또한 질화 및 산화 스트레스와 연관된 병리학적 상태와 관련된다고 보고되었다. 참고 문헌은 [Gu, Zezong, et al., "S-Nitrosylation of Matrix Metalloproteinases: Signaling Pathway to Neuronal Cell Death," Science, 297:1186-90 (2002)].
비정상적인 MMP 활성은 일부 질환 상태를 유발하거나, 촉진하거나 또는 필요조건이므로, MMP 저해제는 치료적으로 유익할 수 있다. 상기 저해제 개발시, 진단 마커 및 MMP 저해제의 유효성을 모니터링하기 위해 혈액, 혈청 및/또는 조직 중의 특이적인 MMP 의 활성 수준을 정확하게 측정하는 것이 유용하다. 상기 능력은, 이어서 임상의 및 연구자들이 MMP 효소의 반응속도, 예컨대 Km, Vmax 및 kcat /Km 뿐만 아니라 MMP 저해제 화합물의 Ki 값의 파라미터를 정확하게 결정하게 해 준다. 참고 문헌은, 예를 들어 [Lehninger, A.L., Biochemistry, pp. 147-168, Worth Publishers, Inc. (1970)].
MMP 활성은 표지된 펩티드 기질을 통해 측정될 수 있다. 참고 문헌은, 예를 들어, [Quesada, A.R., et al., Evaluation of fluorometric and zymographic methods as activity assays for stromelysins and gelatinases, Clinical Experimental Metastasis, 15:339-340 (1997)]. 상기 검정에서, MMP 인식 부위, 절단이 용이한 결합 및 탐지가능한 표지, 예컨대 형광발색단 (예를 들어, 플루오레신 또는 쿠마린) 을 포함하는 기질 펩티드는 MMP 를 포함하는 것으로 의심되는 시료와 혼합시킨다. 시료를 형광으로 표지된 기질과 인큐베이션한 후, 혼합물을 형광 단백질 분해성 분해 생성물의 존재성 및 정량에 대해 분석한다. 시료 분석은 절단된 생성물을 절단되지 않은 기질로부터 분리하는 임의의 정량가능한 방법, 예컨대 겔 전기영동 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 일 수 있다. 유용하면서도, 상기 검정법은 반응생성물로부터 절단되지 않은 기질을 분리해야 하는 필요조건으로 제한된다. 추가로, 광범위한 기질 농도에 걸친 활성 수준 정량 (일반적으로, 효소 반응속도 파라미터, 예컨대 매트릭스 메탈로프로테아제의 Km, Vmax 및 kcat/Km, 및 저해제 Ki 의 정확한 측정을 필요로 한다 ) 은, 다수의 메탈로프로테아제 기질 펩티드의 제한된 용해도로 인해 어렵거나 또는 불가능할 수 있다.
MMP 활성의 탐지 및 측정을 위한 대안적인 방법은 시험용 시료와 MMP 에 의한 가수분해시 형광 신호를 생성 또는 증강시키는 기질을 접촉시키는 것이다. 예를 들어, 시료는 트립토판 잔기 (내재적으로 형광성임), MMP 절단 부위 및 트립토판 형광에 대한 감쇄물질 (quencher) 을 포함하며, 트립토판 및 그의 감쇄물질이 절단 부위의 반대 측면에 위치하도록 합성 펩티드와 접촉시킬 수 있다. 참고 문헌으로는, 예를 들어, [Stack, M.S., et al., Comparison of vertebrate collagenase and gelatinase using a new fluorogenic substrate peptide, The Journal of Biological Chemistry 264:4277-4281 (1989)]. 또한, [Netzel-Arnett, S., et al., "Continuously recording fluorescent assays optimized for five human matrix metalloproteinases," Analytical Biochemistry 195:86-92 (1991)]. 메탈로프로테아제에 의한 상기 펩티드의 절단은 트립토판을 형광 감쇄물질로부터 분리함으로써, 비절단 기질보다 더욱 형광성인 반응 생성물을 제공한다. 결과적으로, MMP 활성은 펩티드가 절단될 때 시료의 내재적 형광에서의 증가를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 소광된 트립토판을 함유하는 펩티드 기질의 사용은, 예컨대 하기의 이유때문에 유리하지 않은 경향이 있다: (1) 트립토판 형광이 약함 (즉, 열악한 양자 수율을 가짐), (2) 시료 내의 다른 펩티드 중 트립토판의 존재성은 효소 활성의 측정을 방해함, 및 (3) 펩티드 내의 트립토판 이용은 합성 펩티드의 고안을 어렵게 함.
소광되는 트립토판 펩티드의 가수분해에 대한 더욱 감응성인 대안은 매우 형광성인 형광발색단 및 상기 형광발색단에 대한 감쇄물질을 포함하며, 형광발색단 및 그의 감쇄물질이 절단이 용이한 결합의 반대 측면에 위치한 기질 펩티드의 가수분해이다. 참고 문헌은, 예를 들어, [Knight, C.G., et al., "Fluorometric assays of proteolytic enzymes," Methods in Enzymology, 248:18-34 (1995)]. 상기 펩티드는, 형광발색단과 동일한 분자 내의 감쇄물질의 존재로 인해 열악하게 형광성이다. 그러나, 절단이 용이한 결합에서의 펩티드의 가수분해시, 형광발색단은 형광 감쇄물질이 더 이상 동일한 분자의 구성요소가 아니므로 그의 높은 형광 성 (즉, 높은 양자 수율) 을 재획득한다. 따라서, MMP 활성은 형광 감응성 (fluorogenic) 기질과 접촉된 시료 내의 형광 증가를 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 형광 감응성 펩티드 기질의 사용은 고감도의 장점을 제공하며; 기질과 절단 생성물을 분리해야 할 필요성을 제거한다. 이는 MMP 활성 측정의 과제를 단순화한다. 참고 문헌은, 예를 들어, [Knight, C.G., et al., "A novel coumarine-labeled peptide for sensitive continuous assays of the matrix metalloproteinases," FEBS Lett., 296: 263-266 (1992)].
MMP 활성 측정을 위한 또다른 대안은 형광발색단 또는 발색군 (chromophore) 및 기질을 고체 표면에 부착시키기 위한 리간드를 포함하는 기질 펩티드를 사용하는 것이다. 여기서, 형광발색단 또는 발색군은 기질을 부착하기 위한 리간드로부터 절단이 용이한 결합의 반대 측면 상에 위치한다. 상기 기질이 고체 표면에 부착되는 경우, 이들은 고정되며, 따라서 용액 중에 있지 않게 된다. MMP 에 의한 기질의 절단시, 형광성 또는 발색된 절단 생성물은 용액으로 방출된다. 이에 따라, 상기 방출된 절단 생성물의 농도는 표준 분광광도측정 기법 또는 형광 기법을 이용하여 용이하게 측정된다.
다수의 이용가능한 형광 감응성 기질은, 연구자로 하여금 MMP 활성을 매트릭스 메탈로프로테아제의 Km, Vmax 및 kcat/Km 또는 매트릭스 메탈로프로테아제의 저해제 화합물의 Ki 값을 정확하게 측정에 충분히 광범위한 기질 농도 상에서 측정하는 것을 가능하게 하기에 적합한 용해도가 결핍되었다.
매트릭스 메탈로프로테아제 기질, 특히 예를 들어, 관심대상인 특이적인 매트릭스 메탈로프로테아제에 의해 선택적으로 절단되는 기질에 대한 지속적인 필요성 (또는 관심대상인 매트릭스 메탈로프로테아제의 선택된 군) 은 특별한 매트릭스 메탈로프로테아제(들) 의 Km 값보다 더 큰 용해도를 가지며, 예를 들어, 혈액, 혈청 및/또는 조직 시료에 존재하는 기타 구성 요소의 효소들 (기타 매트릭스 메탈로프로테아제를 포함) 의 존재 하에 안정하다.
발명의 개요
본 발명은 특이적인 매트릭스 메탈로프로테아제 (또는 매트릭스 메탈로프로테아제의 선택된 군) 에 의해 선택적으로 절단되는 경향이 있으며, 특이적인 매트릭스 메탈로프로테아제(들) 의 Km 값보다 더 큰 용해도를 가지며/갖거나 예를 들어 혈액, 혈청 및/또는 조직 시료 중에 존재하는 기타 구성 효소의 존재 하에 안정한 화합물 및 그의 염을 제공한다.
간단하게, 본 발명은, 부분적으로는, 펩티드를 포함하며 화학식 I 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다:
aa(i)-X-Y-aa(j)-Z (I).
여기서:
aa(i) 는 펩티드의 N-말단에 i 개의 아미노산의 서열을 포함하며,
aa(j) 는 펩티드의 C-말단에 j 개의 아미노산의 서열을 포함한다.
i 는 0 내지 5 의 정수이다.
j 는 1 내지 6 의 정수이다.
형광발색단은 X-Y 결합의 한 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있고, 하나 이상의 형광 감쇄물질 및 리간드가 X-Y 결합의 다른 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있다.
Z 는 펩티드의 C-말단에서의 히드록실기이다. 대안적으로, Z 는 펩티드의 C-말단에서의 보호기이다.
상기 일부 구현예에서, X 는 MMP 인식 서열을 포함하며, Y 는 아미노산을 포함한다. 상기 구현예에서, X 는 Pro-Gln-Gln, Pro-Tyr-Ala 또는 Pro-Val-Glu 가 아니다.
다른 상기 구현예에서, X 는 MMP 인식 서열을 포함하며, Y 는 결합 또는 아미노산을 포함한다. 상기 구현예에서, 펩티드는 D-아미노산을 포함한다.
본 발명은 또한, 부분적으로는 순서대로 페닐옥시노르류신 및 벤질옥시노르류신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 부분적으로는 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성 결정 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 기재된 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제를 조합하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 부분적으로는 병리학적 매트릭스 메탈로프로테아제 수준에 관련된 질환의 생체외 탐지 또는 모니터링을 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 기재된 화합물 또는 그의 염의 절단 측정을 포함한다.
본 발명은 또한, 부분적으로는 생물학적 시료 중의 매트릭스 메탈로프로테아제 활성 측정 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 기재된 화합물 또는 그의 염과 생물학적 시료를 조합하여 혼합물을 형성하는 단계 및 매트릭스 메탈로프로테아제와 상기 화합물 또는 그의 염의 반응 생성물의 존재성에 대해 상기 혼합물을 분석하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 부분적으로는 매트릭스 메탈로프로테아제의 예비 저해제의 저해 활성 측정 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하기를 조합하여 혼합물을 형성하는 단계를 포함한다:
상기 기재된 화합물 또는 그의 염,
예비 저해제, 및
매트릭스 메탈로프로테아제.
이어서, 상기 혼합물은, 상기 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제의 반응 생성물의 존재성에 대해 분석된다. .
본 발명은 또한, 매트릭스 메탈로프로테아제의 병리학적 활성과 연관된 질환의 탐지 또는 모니터링을 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 상기 기재된 화합물 또는 그의 염을 포함한다.
본 발명은 또한, 부분적으로는 예비 MMP 저해제의 유효성을 평가하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 상기 기재된 화합물 또는 그의 염을 포함한다.
본 발명은 또한, 부분적으로는 화학식 II 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다:
여기서:
n 은 0 또는 1 이다.
R1 및 R2 는 수소 및 질소 보호기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
본 출원인의 발명의 추가적인 장점들은 본 출원을 독해함으로써 당업자에게 명확할 것이다.
바람직한 구현예의 본 발명의 상세한 설명은 당업자에게 본 출원, 그의 원지 및 그의 실시 적용예를 이해시키기 위한 것이므로, 당업자는 본 발명을 특정 용도의 필요조건에 가장 적합한 각종 형태로 적합화 및 적용시킬 수 있다. 본 발명의 상세한 설명 및 그의 특이적인 실시예는, 본 발명의 바람직한 구현예를 알리면서, 단지 설명의 목적을 의도로 한다. 따라서, 본 발명은 본 출원에 기재된 바람직한 구현예로 한정되지 않으며, 여러가지로 개질될 수 있다.
A. 본 발명의 화합물
본 발명의 화합물은 일반적으로 화학식 I 의 구조에 상응하며 펩티드를 포함한다:
[화학식 I]
aa(i)-X-Y-aa(j)-Z
여기서, aa(i) 는 펩티드의 N-말단에 i 개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이며; i 는 1 내지 약 5 의 정수이며; aa(j) 는 펩티드의 C-말단에 j 개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이며; j 는 1 내지 약 6 의 정수이다.
일부 바람직한 구현예에서, i 는 0 내지 2 의 정수이며, 종종 0 내지 1 의 정수이다.
일부 바람직한 구현예에서, j 는 3 내지 6 의 정수이며, 종종 3 내지 5 의 정수이다.
일부 바람직한 구현예에서, i 는 0 이며, j 는 3 이다. 일부 다른 바람직한 구현예에서, i 는 1 이며, j 는 5 이다.
아미노산 서열 aa(i) 및 aa(j) 은 D- 및 L- 아미노산 뿐만 아니라 알파-, 베타- 및 감마-아미노산을 포함하는, 천연발생 아미노산 또는 비-천연발생 합성 아미노산을 포함할 수 있다 .
D-아미노산 및/또는 기타 비-천연 발생 아미노산이 있는 화합물은, 생물학적 시료 (예를 들어, 혈액, 혈청 및 조직 등) 에 존재할 수 있는, 구성 효소 (예를 들어, 비특이적인 펩티다아제) 에 의한 절단에 더욱 저항성인 경향이 있다. 상기 효소에 의한 절단에 저항성인 화합물은 종종 절단 결과의 분석을 간소화하여 유리하다. 비천연 발생 아미노산에는, 예를 들어 N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-글리신, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 히드록시라이신, 알로-히드록시라이신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, 6-N-메틸라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 3-(2-나프틸)-L-알라닌, O-벤질-L-타이로신, 6-(벤질옥시)-L-노르류신, S-(3-페닐프로필)-L-시스테인, 6-페녹시-L-노르류신, S-(4-메톡시벤질)-L-시스테인 및 L-메르캅토이소카프로산 ("Mia") 등이 포함된다. 상기 실시예는 상기 아미노산을 함유하는 화합물을 설명한다.
일부 바람직한 구현예에서, aa(i) 및 aa(j) 은 알파-아미노산을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, aa(i) 및 aa(j) 베타- 및 감마-아미노산을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, aa(j) 는 aa(j) 의 C-말단에서 약 3 개의 D-아미노산의 서열을 포함한다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 MMP 에 특이적인 효소 활성 및 효소 반응속도의 파라미터 (예를 들어, Km, Vmax 및 kcat/Km) 및 MMP 에 특이적인 예비 저해제의 Ki 값의 정확한 측정을 가능케 하는 충분한 수용성이다. 바람직하게는, pH 7.5 의 1% DMSO 수용액 중 화합물의 용해도는 약 20 μM 이상, 더욱 바람직하게는 약 50 μM 이상, 더욱더 바람직하게는 약 100 μM 이상이다.
일부 구현예에서, aa(i) 또는 aa(j) 의 하나 이상의 아미노산은 화합물의 수용성에 기여한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산이 화합물에 수용성에 기여하며, 더욱 바람직하게는 대부분 (또는 전부) 의 aa(i) 및 aa(j) 아미노산은 화합물의 수용성에 기여한다.
수용성을 증가시키는 아미노산은 일반적으로 약 0 미만의 분배 계수 분포 (log D) 를 제공하는 아미노산이다. 참고 문헌은, 일반적으로 [Tao et al., "Calculating Partition Coefficients of Peptides by the Addition Method," Journal of Molecular Modeling 5:189-195 (1999)]. Log D 는 옥탄올과 물 사이의 화합물의 "실제" 분배 계수의 로그값이다. Log D 는 이온화된 종을 포함하는 화합물의 모든 형태를 설명하며, 분배 계수의 로그값 (log P) 및 해리 상수(들)의 로그값 (pKa) 으로부터 계산된다. 펩티드 내에서 약 0 미만의 log D 를 제공하는 아미노산 (및 그의 보고된 Log D 분포) 에는 예를 들어, 오르니틴 (-2.17), 아르기닌 (-1.65), 아스파르트산 (-2.06), 글루탐산 (-2.19), 히스티딘 (-0.44), 아스파라긴 (-0.98), 글루타민 (-1.00), 라이신 (-2.27), 세린 (-0.45), 트레오닌 (-0.26), 글리신 (-0.22) 및 알라닌 (-0.27) 이 포함된다. 참고 문헌으로는, [Tao, P., et al., J. Mol. Model., 189-195 (1999)]. 펩티드 내에서 약 0 미만의 log D 를 제공하는 기타 비제한적 예의 아미노산에는 베타-알라닌, N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-알라닌 및 N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-글리신이 포함된다.
바람직한 구현예에서, aa(i) 및 aa(j) 의 하나 이상의 아미노산은 약 0 미만의 log D 를 제공한다. 일부 구현예에서, 각각의 aa(i) 및 aa(j) 중의 하나 이상의 아미노산은 약 0 미만의 log D 를 제공한다. 바람직하게는, aa(i) 및 aa(j) 는 각각 아르기닌, 글루탐산, 아스파르트산 및 라이신으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 특별한 구현예에서, aa(i) 및 aa(j) 중의 모든 아미노산은 약 0 미만의 log D 를 제공한다.
Z 는 aa(j).의 C-말단의 카르보닐에 결합되어 있다. 일부 구현예에서, Z 는카르보닐기 및 Z 가 카르복시기를 형성하도록 하는 히드록실기이다. 다른 구현예에서, Z 는 보호기이다. 상기 보호기는 바람직하게는 예를 들어, 생물학적 시료 (예를 들어, 혈액, 혈청 또는 조직) 내에 존재할 수 있는 비-MMP 프로테아제 (특히 카르복시펩티다아제) 에 대한 펩티드의 저항성을 부여한다. 보호기는 당업계에 공지되어 있는 펩티드 화학에 준한다. 참고 문헌은, 일반적으로 [Greene, T.W., et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., Wiley: New York (1999) (본 특허에 참고 문헌으로 포함됨)]. 일부 구현예에서, 예를 들어 Z 는 C-말단에서 -카르복실기보다는- 아미드기를 형성하는, 카르보닐기에 결합된 임의치환된 아미노기이다. 상기의 경우, Z 가 -NH2, -NHR' 및 -NHR'R" 이다. 여기서, R' 및 R" 은 전형적으로는 광범위한 비-수소 치환기일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 예를 들어, R' 및 R" 는 독립적으로 선택되는 C1-C6-알킬이다.
X 는 프로테아제 인식 서열을 포함한다. 전형적으로는, 프로테아제 인식 서열은 관심대상의 프로테아제에 의해 특이적으로 인식되는 아미노산 서열이다. 전형적으로는, 화합물과 적합한 프로테아제의 반응시, 인식 서열의 카르복시 측면 바로 위에 위치한 화합물의 결합 (즉, X 및 Y 사이의 결합) 은 단절 (또는 절단) 된다. 상기 단절은 전형적으로는 가수분해 반응을 통해 발생한다. 프로테아제에 의해 절단되는 결합은 절단이 용이한 결합이며, X 의 카르복시 측면 바로 위에 위치한다.
본 발명에서, 인식 서열을 인식하는 프로테아제는 전형적으로는 매트릭스 메탈로프로테아제이다. 다수의 구현예에서, 상기 인식 서열은 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 에 의해 인식된다.
종종 적합한 MMP 인식 서열의 예에는, Ala-Gln-Gly, Ala-Met-His, Asn-Gln-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-Gln-Gly, Dnp-Leu-Gly, Ile-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-Gln-Tyr, Pro-Gln-Ala, Pro-Gln-Gln, Pro-Gln-Glu, Pro-Gln-Gly, Pro-Gln-His, Pro-Gln-Leu, Pro-Gln-Met, Pro-Gln-Phe, Pro-Gln-Pro, Pro-Gln-Val, Pro-Glu-Asn, Pro-Glu-Gly, Pro-His-Gly, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro-Met-Gly, Pro-Tyr-Ala, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Val-Glu, Pro-Ser-Glu-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-Ile-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser 및 Pro-Leu-MeCys 이 포함된다. 여기서, MeCys 는 S-메틸 시스테인이다.
일부 바람직한 구현예에서, MMP 인식 서열은 Ala-Gln-Gly, Ala-Met-His, Asn-Gln-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-Gln-Gly, Dnp-Leu-Gly, Ile-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-Gln-Tyr, Pro-Gln-Ala, Pro-Gln-Glu, Pro-Gln-Gly, Pro-Gln-His, Pro-Gln-Leu, Pro-Gln-Met, Pro-Gln-Phe, Pro-Gln-Pro, Pro-Gln-Val, Pro-Glu-Asn, Pro-Glu-Gly, Pro-His-Gly, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro-Met-Gly, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Ser-Glu-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-Ile-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser 또는 Pro-Leu-MeCys 이다.
일부 바람직한 구현예에서, MMP 인식 서열은 Pro-Leu-Gly 이다.
일부 바람직한 구현예에서, MMP 인식 서열은 Pro-Gln-Gly 이다.
일부 바람직한 구현예에서, MMP 인식 서열은 Pro-Gln-Glu 이다.
일부 바람직한 구현예에서, MMP 인식 서열은 Pro-Leu-Glu 이다.
일부 바람직한 구현예에서, MMP 인식 서열은 Pro-Leu-MeCys 이다.
일부 구현예에서, Y 는 결합이다. 상기의 경우, X 는 aa(j) 에 직접 결합되며, Y 는 관심대상의 특별한 프로테아제에 의해 절단가능한 절단이 용이한 결합이다.
다른 구현예에서, Y 는 천연발생의 아미노산을 포함한다. 바람직한 천연발생 아미노산에는, 예를 들어, 아르기닌 (Arg), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린 (Val) 이 포함된다.
다른 구현예에서, Y 는 비-천연발생 아미노산, 예컨대 aa(i) 및 aa(j) 에 대해 상기 나열된 것을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, Y 는 3-(2-나프틸)-L-알라닌, O-벤질-L-타이로신, 6-(벤질옥시)-L-노르류신, S-(3-페닐프로필)-L-시스테인, 6-페녹시-L-노르류신, S-(4-메톡시벤질)-L-시스테인, 노르발린 (Nva) 또는 L-메르캅토이소카프로산 (Mia) 이 포함된다.
일부 바람직한 구현예에서, Y 는 약 6 개 이상 (더욱 바람직하게는 약 8 개 이상) 의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 가진 비-천연발생 아미노산이다. 상기 측쇄는 (종종 바람직하게는) 하나 이상의 벌키 구조 (예를 들어, 고리 구조) 를 포함할 수 있다. 그러나, 적어도 사슬의 첫번째 원자 (및 종종 더욱 바람직하게는 적어도 사슬의 첫번째 두 개의 원자) 가 임의의 벌키 치환기가 없는 링커이다. 상기 링커는, 예를 들어, -C(H)2-, -O-, -S- 및 -N(H)- 일 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, Y 의 측쇄는, 펩티드 주쇄로부터 더 먼 곳에 있는 알킬, 알케닐 또는 알키닐의 지점에 벌키한 치환기 (예를 들어, 페닐옥시 또는 벤질옥시) 로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 (바람직하게는 알킬) 이다.
Y 의 아미노산 상의 벌키한 측쇄는 종종, MMP 관련 병리학적 활성 및 정상적인 신체 기능과 더 많이 관련된 기타 효소들 (기타 MMP 포함) 을 모두 포함하는 시료 중의 병리학적 MMP 활성을 탐지하기 위해 기질이 사용된다는 맥락에서 유리하다. 예를 들어, MMP-1 및 MMP-14 는, 전형적으로는 정상적인 신체 기능과 연관되어 있는, 얇은-포켓 효소이다. 대조적으로, MMP-2, MMP-9 및 MMP-13 는, 종종 병리학적 상태와 연관된 것으로, 비교적 깊은, 장애물이 없는 포켓이다. 포켓 깊이는 각종 인자에 의존적이다. 예를 들어, MMP-1 는 P1 의 결합 부위에 아르기닌을 갖는다. 상기 아르기닌은 MMP-1 에 비교적 얕은 포켓을 부여하는 것으로 여겨진다. 깊은 포켓의 MMP 는, 그와 대조적으로, 예를 들어 동일한 위치에 발린을 가질 수 있다. 발린은 포켓에 대하여 장애를 덜 주는 것으로 여겨진다. 출원인들은 Y 위치 (즉, P1 의 위치) 에서 벌키 측쇄를 가진 아미노산을 함유하는 기질이 얕은 포켓을 가진 MMP (예를 들어, MMP-1, MMP-7 및 MMP-14) 에 열악하게 결합하는 경향이 있으며, 깊은 포켓을 가진 MMP (예를 들어, MMP-2, MMP-9 및 MMP-13) 은 비교적 수월하게 결합한다는 것을 발견했다. 결과적으로, Y 의 아미노산 상에 상기 벌키한 측쇄를 가진 기질은 깊은 포켓을 가진 MMP 에 의해 선택적으로 절단되는 경향이 있으며, 따라서, 생물학적 시료 (예를 들어, 혈액, 혈청 및/또는 조직) 중 병리학적 깊은-포켓 MMP 활성을 검출하기 위해 유리하게 사용될 수 있으며, 이는 전형적으로는 깊은-포켓 및 얕은 포켓 MMP 를 모두 포함할 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, Y 는 11 개의 비-수소 원자의 측쇄를 포함하는 비천연 발생 아미노산이다. 측쇄의 예에는 하기가 포함된다:
및
상기 측쇄를 가진 Y 를 포함하는 구체적인 화합물의 예에는 하기가 포함된다:
및
일부 바람직한 구현예에서, Y 는 12 개 이상의 비-수소 원자의 측쇄를 포함하는 비천연 발생 아미노산이다. 상기 측쇄의 예에는 하기가 포함된다:
상기 측쇄를 가진 Y 를 포함하는 예시적인 화합물의 예에는 하기가 포함된다:
및
또다른 바람직한 구현예에서, Y 는 15 개 이상의 비-수소 원자의 측쇄를 포함하는 비-천연 발생 아미노산이다. 상기 측쇄의 예에는 하기가 포함된다:
상기 측쇄를 가진 Y 를 포함하는 예시적인 화합물의 예에는 하기가 포함된다:
P1 의 위치에 위치되는 경우 종종 바람직한 특이성을 나타내는 경향이 있는 (즉, MMP-1 를 "면하게 함"), 아미노산의 두 예는 6-(벤질옥시)-노르류신 및 6-페녹시-노르류신이다. 상기 아미노산은 화학식 II 의 구조에 상응한다:
[화학식 II]
D- 형 뿐만 아니라 L- 형도 사용될 수 있으며 (그러나, L-형이 종종 특히 바람직하다), n 은 0 또는 1 이며, R1 및 R2 는 수소 및 질소 보호기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 질소 보호기는 당업계에 공지되어 있다. 참고 문헌으로는, 일반적으로 [Greene, T.W., et al., Protective Groups in Organic Synthesis (3rd Ed., Wiley: New York (1999)) (본원에 참고 문헌으로 포함)]. 일부 구현예에서, R1 및 R2 는 질소와 5- 내지 7-원 고리를 형성할 수 있다. 다른 구현예에서, R1 는 보호기 (예를 들어, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (-"Fmoc") 또는 t-부틸옥시카르보닐 ("Boc") 이며, R2 은 수소이다:
노르류신은 상기 아미노 보호기의 존재 또는 부재 하에 펩티드 서열의 일부를 형성할 수 있다.
6-(벤질옥시)-노르류신 및 6-페녹시-노르류신 유래의 측쇄를 포함하는 펩티드 화합물은 공지된 고체 상태 또는 유기 합성 방법으로 합성될 수 있다. 고체 상태 합성에서는, 아미노산이 아미노 보호기와 커플링되어 수지 상의 성장하는 펩티드 사슬에 부착될 수 있다. 고체 상태 합성에서의 일반적인 보호기에는 Fmoc 및 Boc 이 포함된다. Fmoc-보호 노르류신의 합성 실시예는 하기 실시예 8 및 25 에 기재되어 있다. 바람직한 구현예에서, 히드록실 노르류신은 예를 들어 Fmoc 유도체의 합성에 의한 제 1 의 아미노-보호성이다. 이어서, 아미노-보호 히드록실 노르류신은 하기 예시된 바와 같이 벤질 또는 페닐기로 알킬화될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 MMP-1 및 MMP-7 이 있는 화합물의 kcat/Km 는 약 0.5 x 10-4 M-1s-1 를 초과하지 않으며, 하나 이상의 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13 이 있는 화합물의 kcat/Km 는 약 5 x 10-4 M-1s-1 이상이다. 일부 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 MMP-1 및 MMP-7 이 있는 화합물의 kcat/Km 는 약 10-5 M-1s-1, 를 초과하지 않으며, 하나 이상의 MMP2, MMP-9 및 MMP-13 이 있는 화합물의 kcat/Km 는 약 50 x 10-4 M-1s-1 이상이다.
하기 표 1 에 나타낸 바와 같이, 6-(벤질옥시)-L-노르류신 (즉, 하기 실시예 20 및 21 의 화합물) 또는 6-페녹시-L-노르류신 (즉, 하기 실시예 25 의 화합물)은 MMP-1 및 MMP-7 과 낮은 kcat 또는 0 인 kcat 를 나타냈다. 기질이 다른 MMP 에 의해 절단되더라도, MMP-1 및 MMP-7 를 면하게 한다는 것을 표 1 로부터 알 수 있다. 표 1 에서, kcat/Km 는 M-1s-1 x 104 로 주어졌으며, Km 은 μM 이다.
일부 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 MMP-2 에 대한 kcat 가 MMP-1 또는 MMP-7 에 대한 kcat 보다 약 10 배 이상 더 크다 (더욱 바람직하게는, 약 100 배 이상 더 크다). 더욱더 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 MMP-2 에 대한 kcat 가 MMP-1 및 MMP-7 의 kcat 보다 약 10 배 이상 더 크다 (더욱 바람직하게는, 약 100 배 이상 더 크다).
일부 바람직한 구현예에서, MMP-9 에 대한 kcat 가 MMP-1 또는 MMP-7 에 대한 kcat 보다 약 10 배 이상 더 크다 (더욱 바람직하게는, 약 100 배 이상 더 크다). 더욱더 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 MMP-9 에 대한 kcat 가 MMP-1 및 MMP-7 에 대한 kcat 보다 약 10 배 이상 더 크다 (더욱 바람직하게는, 약 100 배 이상 더 크다). 상기 선택성 정도는 눈의 질환 상태를 진단 또는 모니터링하기 위해 생물학적 시료 (눈 유래의 유체 또는 조직) 에 화합물을 첨가하는 구현예에서 특히 유용할 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 상기 화합물의 MMP-13 에 대한 kcat 는 MMP-1 또는 MMP-7 에 대한 kcat 보다 약 10 배 이상 더 크다 (더욱 바람직하게는, 100 배 이상 더 크다). 더욱더 바람직한 구현예에서, MMP-13 에 대한 화합물의 kcat 는 MMP-1 및 MMP-7 에 대한 kcat 보다 약 10 배 이상 더 크다 (더욱 바람직하게는, 약 100 배 이상 더 크다).
하기 표 2 에서, 매트릭스 메탈로프로테아제에 의해 절단되는 것으로 보고된 각종 서열이 기재되어 있다. 상기 설명에서의 인식 서열은 P3-P2-P1 로 명명된다. 상기 P1 의 아미노산은 절단이 용이한 결합 (즉, 결합 중 인 및 나열된 MMP 들에 의해 절단되는 것으로 보고된 결합) 을 통해 인식 서열에 결합되는 아미노산이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 상기 절단 부위를 갖는다. 상기 구현예에서, 화학식 I 은, 상기 구현예에서, 화학식 I 은 표 2 에서 X 가 P3-P2-P1 를 나타내며, Y 는 표 2 의 P1 에 상응하며, Y 에 결합된 aa(j) 의 아미노산이 표 2 의 P2 에 상응하는 것으로 정의된다.
표 2 에서, "D" 로 특정화하지 않는 한 모든 아미노산은 L-아미노산이며, Dnp 는 2,4-디니트로페닐이며, Dpa 는 3-[2,4-디니트로페닐]-L-2,3-디아미노프로피온산이며, Mia 는 L-메르캅토이소카프로산 (절단이 용이한 결합은 "티오펩토라이드" 임) 이며, Nva 는 노르발린이며, Cys(Fl) 는 Cys(플루오레신) 이다.
표 2 에서의 참고문헌은 하기와 같다:
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본 발명의 화합물은 하나 이상의 마커 부분을 포함한다. 상기 마커 부분은 일반적으로 형광발색단을 포함한다. 상기 형광발색단은 화합물의 아미노산에 결합되어 있다 (전형적으로는 공유 결합을 통해).
일반적으로, 형광발색단은 천연 형광 부분일 수 있다. 더욱 전형적으로는, 상기 형광발색단은 (일반적으로는 전자기 조사로) 여기되는 경우 발광하는 화학기이다. 형광발색단은 종종 콘쥬게이션된 2 중 결합 시스템이며, 가장 흔하게는 고리 시스템이거나 또는 콘쥬게이션된 고리 시스템이다. 형광발색단은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 플루오레신, 로다민, 루시퍼 옐로우 (Lucifer yellow) 및 인도시아닌이 포함된다. 일부 특별한 바람직한 구현예에서, 형광발색단은 (7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸 부분이다. 일부 상기 구현예에서, 상기 형광발색단은 아르기닌 잔기의 N 원자에 결합되어 N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸-L-아르기닌을 제공한다. 형광발색단에 결합된, 일반적으로 적합한 아미노산의 다른 예에는, N-6-(4{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)-L-라이신 및 N-6-(4{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-[(2-히드록시에틸)티오]-1,3,5-트리아진-2-일)-L-라이신이 포함된다.
일부 구현예에서, 형광발색단은 서열 aa(i) 및 aa(j).의 아미노산에 공유결합되어 있다. 일부 구현예에서, 형광발색단은 화학식 I 의 펩티드의 N-말단 아미노기에 공유결합될 수 있다. 일부 상기 구현예에서, 예를 들어 i 는 0 이고, X 는 프로테아제 인식 서열의 N-말단에 형광발색단을 포함한다. 기타 상기 구현예에서, i 는 0 이외의 것이며, 형광발색단은 aa(i) 의 N-말단에 결합한다.
일부 바람직한 구현예에서, Y 는 형광발색단에 공유결합된 아미노산을 포함한다. 본 발명의 화합물은 추가로, 형광발색단이 결합된 아미노산으로부터 X-Y 결합의 반대 측면 상에 있는 아미노산에 (일반적으로 공유 결합으로 통해) 결합된 형광 감쇄물질 또는 리간드를 포함한다. 이는, X-Y 결합이 프로테아제에 의해 절단되는 경우, 형광발색단이 감쇄물질 또는 리간드로부터 반응생성물을 분리하도록 하는 결과를 초래한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 형광발색단은 X-Y 결합의 아미노 측면 상의 아미노산 (즉, X 의 아미노산 또는 aa(i)) 에 공유결합되어 있으며, 리간드 또는 형광 감쇄물질이 X-Y 결합의 카르복시 측면의 아미노산 (즉, Y 의 아미노산, 종종 더욱 바람직하게는 aa(j)) 에 공유결합되어 있다. 다른 구현예에서, 예를 들어, 형광발색단은 X-Y 결합의 카르복시 측면 상의 아미노산 (즉, Y 의 아미노산 또는 종종 바람직하게는 aa(j)) 에 공유 결합되어 있으며, 리간드 또는 형광 감쇄물질은 X-Y 결합의 아미노 측면 (즉, X 의 아미노산 또는 aa(i)) 에 공유결합되어 있다.
본 발명은 하나 이상의 형광발색단을 포함하는 화합물에 관한 것임을 주지해야 한다. 본 발명은 또한 형광발색단으로부터 X-Y 결합의 반대 편에 하나 이상의 형광 감쇄물질 또는 리간드를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 하나 이상의 형광 감쇄물질 및 하나 이상의 리간드를 형광발색단의 X-Y 결합의 반대 측면에 포함하는 화합물에 관한 것이다.
형광 감쇄물질은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 감쇄물질은, 형광성 기에 기하학적으로 근접하여 위치하는 경우, 에너지를 소산시켜 형광이 여기된 상태에 머무르도록 하는 유기기이다. 상기는 결과는, 켄칭 분자 또는 기가 상기와 같이 근접하는 한 형광성 기의 형광이 감쇠되거나 또는 제거되도록 하는 것이다. 따라서, 형광발색단 또는 그의 상응하는 감쇄물질은 절단이 용이한 결합의 반대 측면에 위치하며, 프로테아제에 의한 절단이 용이한 결합의 절단은 형광발색단 및 감쇄물질이 그의 근접성을 상실하도록 함으로써, 형광발색단이 발광하도록 한다. 따라서, 화합물 절단은 형광의 변화를 측정함으로써 탐지될 수 있다.
화합물이 감쇄물질을 포함하는 일부 바람직한 구현예에서, 감쇄물질은 디니트로페닐기를 포함한다. 상기 기들은, 본 발명의 펩티드를 아미노산의 측쇄에 공유결합시켜 본 발명의 펩티드에 편리하게 혼입시킨다. 형광 감쇄물질 기들은, 기질 펩티드를 아미노산에 먼저 결합시킨 후, 상기 아미노산을 펩티드에 혼입시켜 기질 펩티드에 혼입될 수 있다. 대안적으로는, 감쇄물질 기는 펩티드가 형성된 후 펩티드의 아미노산에 공유결합될 수 있다. 디니트로페닐기를 포함하는 적합한 아미노산의 예에는 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닌이 포함된다.
본 발명의 화합물이 리간드를 포함하는 다른 구현예에서, 리간드는 일반적으로 고체 지지체에 결합할 수 있다. 고체 지지체의 형태는 매우 광범위하게 다양하다. 고체 지지체는, 예를 들어 필름, 비드, 나노입자 또는 리간드의 결합 파트너로 결합형인 검정 플레이트일 수 있다. 리간드 및 고체 지지체의 사용은 당업계에 공지되어 있다.
화합물이 리간드를 포함하는 다수의 구현예에서, 리간드 및 형광발색단은 절단이 용이한 결합과 반대 측면에 위치한다. 따라서, 프로테아제에 의한 절단이 용이한 결합의 절단은 형광 발색단을 포함하는 절단 생성물을 제공한다. 상기 절단 생성물은 유리되어 용액에 포함된다. 용액 형광에서의 증가를 측정하여 화합물의 절단을 탐지할 수 있다. 상기 화합물의 구현예에서, 감쇄물질은 화합물의 동측에 리간드로서 임의로 존재할 수 있다.
화합물이 리간드를 포함하는 다른 구현예에서, 리간드 및 형광발색단은 절단이 용이한 결합과 동일한 측면에 있으며, 감쇄물질은 절단이 용이한 결합의 반대 측면에 있다. 여기서, 프로테아제에 의한 절단이 용이한 결합의 절단은 감쇄물질을 포함한 절단 생성물을 제공한다. 따라서, 상기 감쇄물질은 유리되어 용액에 포함됨으로써, 형광발색단이 발광하도록 한다. 이어서, 지지체 상의 형광 증가 측정은 화합물의 절단을 탐지하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 리간드는 비오틴 부분을 포함한다. 상기 리간드의 예에는, N-2-[(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일] 또는 이미노비오틴이 포함된다. 상기의 경우, 결합 파트너 (즉, 고체 지지체의 표면 상의 결합 구성원) 는, 예를 들어 아비딘, 스트렙타비딘, 단량체 아비딘 또는 항-비오틴 항체일 수 있다.
결합 파트너로 이용가능한 기타 리간드가 대안적으로 (또는 추가적으로) 사용될 수 있다. 리간드 및 그의 결합 파트너의 예에는, 합텐 및 항-합텐 항체, 예컨대 디곡시게닌 및 항-디곡시게닌, 폴리히스티딘 및 고정된 니켈 이온, 및 FLAG 서열 및 항-FLAG 항체가 포함된다.
일부 구현예에서, 리간드는 펩티드의 고체 지지체에 대한 공유 결합을 위한 반응성 기를 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 예를 들어, 상기 리간드는 아미노기를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 리간드는 1 차 아미노기를 포함한다.일부 상기 구현예에서, 예를 들어 상기 리간드는 엡실론-아미노 카프로산기를 포함한다.
본 발명의 다수의 구현예에서, aa(i) 및 aa(j) 중 하나는 형광발색단에 공유결합된 아미노기를 포함하며, aa(i) 및 aa(j) 의 다른 하나는 고체 지지체에 결합할 수 있는 리간드 또는 형광발색단에 공유결합된 아미노산을 포함한다. 여기서, 형광발색단은 감쇄물질 또는 리간드로부터 절단이 용이한 결합 (즉, X-Y 결합) 의 반대 측면 상에 있다.
일부 상기 구현예에서, aa(i) 및 aa(j) 중 하나는 형광발색단에 공유결합된 아미노산을 포함하며, aa(i) 및 aa(j) 중 다른 하나는 (1) 형광 감쇄물질에 공유결합된 아미노산, 및 (2) 고체 지지체에 결합할 리간드에 공유결합된 아미노산을 포함한다. 여기서, 형광발색단은 감쇄물질 및 리간드로부터 절단이 용이한 결합 (즉, X-Y 결합) 의 반대 측면 상에 있다.
본 발명은 또한 aa(i) 및 aa(j) 중 하나가 감쇄물질에 공유결합된 아미노산을 포함하며, aa(i) 및 aa(j) 중 다른 하나는 (1) 형광발색단에 결합된 아미노산 및 (2) 고체 지지체에 결합할 수 있는 리간드에 결합된 아미노산을 포함하는 화합물에 관한 것이다. 여기서, 형광발색단 및 리간드는 감쇄물질로부터 절단이 용이한 결합 (즉, X-Y 결합) 의 반대 측면 상에 있다. 하기 실시예 16 은 상기 구조를 설명한다. 전형적으로는, 상기 구조에서, 감쇄물질을 포함하는 화합물의 측면 상에는 리간드가 없다.
일부 구현예에서, 리간드, 형광발색단 또는 형광 감쇄물질은 인식 서열 X 에 결합된다. 상기 구현예에는, i 가 0 인 경우가 포함된다. 상기의 경우, 리간드, 형광발색단 또는 형광 감쇄물질은 바람직하게는 인식 서열 X 의 N-말단에 결합되어 있다. 하기 실시예 6-9 는 상기 구조를 설명한다. 상기 설명에서, 형광발색단은 X 의 N-말단에 공유결합되어 있으며, 감쇄물질은 아미노산 서열 aa(j) 에 공유결합되어 있다.
표 1 에 나열된 화합물 및 본 발명에 따른 물질의 다른 비제한적 예는 표 3 (서열 번호 1 내지 서열 번호 29) 및 하기 실시예 1-29 에 제시되어 있다. 표 3 에서, 상기 구조는 통상적인 그의 3 문자 약자로 제시된 천연 발생 아미노산을 가진 펩티드로서 기재되어 있다. 천연 발생의 것 중 D- 버젼을 포함하는 비-천연 발생 아미노산은, Xaan 로서 제시된 구조에서 나타냈으며, 표 3 의 오른쪽의 칼럼 및 각주에서 추가로 정의했다.
표 3 에서, R1 내지 R14 는 하기와 같다:
R1 = N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-.
R2 = N-2-[(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-.
R3 = 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닌.
R4 = N-6-(4{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6- 클로로-1,3,5-트리아진-2-일)-L-라이신.
R5 = N-6-(4{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-[(2-히드록시에틸)티오]-1,3,5-트리아진-2-일)-L-라이신.
R6 = 3-(2-나프틸)-L-알라닌.
R7 = O-벤질-L-타이로신.
R8 = 6-(벤질옥시)-L-노르류신.
R9 = S-(3-페닐프로필)-L-시스테인.
R10 = 6-페녹시-L-노르류신.
R11 = S-(4-메톡시벤질)-L-시스테인.
R12 = N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-글리신.
R13 = N-6-[6-({5-[(4S)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일} 아미노)-헥사노일]-D-라이신 .
R14 = S-메틸-L-시스테인.
B. 본 발명의 화합물의 염
본원에 기재된 화합물에 추가하여, 본 발명은 상기 화합물의 염에 관한 것이다. 효소 화학에서는, 펩티드 또는 단백질 상에 산/염기 관능기의 특별한 형태가, 펩티드가 발견되는 매질의 pH 및 산성기 또는 염기성기 각각의 pKa 또는 pKb 에 대해 결정된다는 것이 공지되어 있다. 7.0 부근의 생리학적 pH 에서, 글루탐산 및 아스파르트산과 같은 아미노산의 카르복실기는 염 또는 카르복실레이트 형태로 천연적으로 존재한다. 한편, 라이신 및 아르기닌의 관능기는 일반적으로 상기 pH 에서는 양성자화된 질소를 포함한다. 달리 기재하지 않는 경우, 펩티드, 아미노산 또는 아미노산 서열을 청구하는 명세서 및 청구의 범위 내의 모든 참고문헌은 개별적인 펩티드, 아미노산 및 서열의 중성 및 염 형태 모두를 포함한다.
C. 본 발명의 화합물의 용도
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 특정 프로네이나제의 활성 결정에 유용한 경향이 있다. 상기 화합물들이 특이적인 매트릭스 메탈로프로테아제에 의해 선택적으로 절단되는 경향이 있으므로, 이들은 시료 내에 존재하는 관심대상의 것이 아닌 기타 프로테아제 (예를 들어, 기타 MMP 및/또는 구성 효소) 활성과 상호작용없이 상기 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 결정함에 있어서 특히 유용하다.
일부 구현예에서, 관심대상의 특별한 매트릭스 메탈로프로테아제 (예를 들어, MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13) 에 의해 특이적으로 절단되는 본 발명의 화합물이, 상기 매트릭스 메탈로프로테아제 (예를 들어, MMP-1 또는 MMP-7) 및 관심대상이 아닌 하나 이상의 기타 매트릭스 메탈로프로테아제를 잠재적으로 포함하는 생물학적 시료 (예를 들어, 혈액, 혈청, 조직, 등) 와 혼합한다. 상기 구현예에서, 관심대상의 메탈로프로테아제만이 기질을 (매트릭스 메탈로프로테아제가 존재하는 정도까지) 절단할 것이다. 그러나, 상기 기질은 시료 내에 존재하는 기타 메탈로프로테아제에 의해 절단되지 않는다. 따라서, 임의의 측정된 MMP 활성 (예를 들어, 시료 내의 형광 증가 측정으로 검출됨) 은 화합물이 특이적인 효소로부터 우세하게 (또는 전적으로) 존재하게 될 것이다.
일부 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 뿐만 아니라 관심대상이 아닌 하나 이상의 기타 프로테아제 (예를 들어, MMP-1 및 MMP-7 중 하나 또는 모두) 를 잠재적으로 포함하는 생물학적 시료 내에서 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 의 활성을 결정하기 위해 사용된다. 여기서, 본 발명의 화합물은, MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 에 특이적이며 (또한 MMP-1 및/또는 MMP-7 에 대해 면하게 하는), 시료에 첨가된다. 이어서, 시료 내 형광의 변화를 측정한다. 상기 화합물이 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 에 대해 특이적이므로, 시료의 형광에서의 임의의 증가는 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 의 존재성을 우세하게 (또는 전적으로) 반영한다. 따라서, 상기 측정은, 예를 들어 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 와 관련된 질환의 상태를 진단 또는 모니터링 (전형적으로는 생체 외에서) 하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 상기 질환 상태의 모니터링은, 예를 들어 적잘한 투여량 또는 치료의 유효성을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 상기 구현예에서, 생물학적 시료는 MMP-9 이 관련된 질환을 진단 또는 모니터링하기 위해 분석된다. 상기 질환에는, 예를 들어 질화 (nitrosative) 또는 산화 스트레스와 관련된 중추 신경계의 병리학적 상태를 포함한다. 상기 병리학적 상태의 특이적인 예는, 예를 들어, 뇌경색, 중풍 또는 기타 퇴행성 신경질환일 수 있다. MMP-9 와 관련된 것으로 여겨지는 기타 질환에는, 예를 들어 안질환, 예컨대 녹내장, 황반변성 및 당뇨병성 황색반 부종이 포함된다. MMP-9 는, 예를 들어, 망막 신경절 세포의 사멸에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
다른 구현예에서, 생물학적 시료는 MMP-2 및 MMP-9 와 관련된 질환을 진단 또는 모니터링하기 위해 분석된다. 상기 질환은, 예를 들어 암, 심혈관 상태 및 안과학적 상태를 포함하는 것으로 여겨진다.
다른 구현예에서, 생물학적 시료는 MMP-13 와 관련된 질환을 진단 또는 모니터링하기 위해 분석된다. 상기 질환에는, 예를 들어 심혈관 상태 및 관절염이 포함되는 것으로 여겨진다.
본 발명은 질환의 상태를 진단 또는 모니터링하기 위해 사용되는 키트 (전형적으로는 포장된 형태) 로 본 발명의 화합물을 혼입시키는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 예비 프로테아제 저해제의 유효성을 평가하기 위한 본 발명의 화합물의 이용에 관한 것이다. 상기의 경우, 본 발명의 화합물은 프로테아제 (전형적으로는, MMP, 더 전형적으로는 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13) 및 프로테아제의 예비 저해제를 포함하는 시료로 본 발명의 화합물을 도입한다. 형광 변화의 결핍은 예비 저해제에 의한 프로테아제의 저해를 나타낸다. 대조적으로, 형광의 변화는 저해되지 않은 프로테아제 활성을 나타낸다. 하기 실시예 30 이 상기 용도를 증명한다.
본 발명은 또한 예비 프로테아제 저해제의 유효성을 분석하기 위해 사용되는 키트 (전형적으로는 포장된 형태) 에 본 발명의 화합물을 혼입시키는 것에 관한 것이다.
D. 본 발명의 화합물의 제조
본 발명에 따라 유용한 화합물은, 당업계에 공지된 기술을 단독으로 또는 조합하여 본 문헌의 기재 사항을 이용한 펩티드 합성법으로 제조될 수 있다. MMP 저해 상수의 결정에서 기질의 사용 (실시예 30) 은 하기에 제시했으며, 화합물 1-29 (실시예 1-29) 의 제조를 위한 합성 경로도 기재되어 있다.
하기의 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어떤 식으로든 본 개시의 나머지 부분으로 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프로필-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]알라닌의 제조.
3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]알라닌을 하기의 Knight, et al., FEBS Letters, 296:263-266 (1992)의 방법에 따라 제조하였다. Fmoc-L-Asn-OH (25.08 g, 71 mmol) (Bachem catalog #B-1045, lot SM511)를 175 ml 디메틸포름아미드에 용해하였다. 물(35 ml), 피리딘(13.2 ml, 143 mmol), 및 [비스(트리플루오로아세톡시)요오도]벤젠 (46.95 g, 105.9 mmol) (Aldrich 23, 213-0, 97% 순도)을 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 밤새 교반하였다. 상기 혼합물을 Whatman 여과지를 통해 여과하여 입자를 제거하였다. 50℃의 진공하에서 상기 부피를 감소시켰다. 농축된 혼합물을 교반하면서 1175 ml 1.8 N HCl에 천천히 부어 넣었다. 상기 플라스크를 750 ml의 추가의 물로 헹구어 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액을 15분간 교반하고 2400 ml의 디에틸 에테르로 4 부로 추출하였다. 상기 수용액에 Na2CO3 (111.5 g, 1052 mmol)를 점진적으로 첨가하여 pH 7로 서서히 맞추었다. NaHCO3 (11.86g, 141 mmol), 에탄올 (1788 ml), 및 2,4-디니트로플루오로-벤젠 (13.139g, 70.6 mmol) (Aldrich D19,680-0)을 첨가하고 상기 혼합물을 20℃ 에서 밤새 교반하였다. 농축된 HCl (190 ml)을 교반하면서 첨가하여 pH를 pH 1로 맞추었다. 어두운 붉은 갈색의 침전물을 소결 유리 필터상에 수집하고 대략 100ml의 0.1 N HCl, 에탄올, 및 디에틸 에테르 각각으로 세척하였다. 상기 잔류물을 진공하에서 건조하였다. 수율은 분석용 역상 HPLC로 76% (26.5g, 53.9 mmol), 순도는 98% 이었다. 전자분무 질량분석기는 M+H 493.4 및 M+Na 515.4를 나타내었다.
파트 B. L-알라닐-L-아르기닐-L-글루타밀-L-아르기닐-수지의 제조.
L-알라닐-L-아르기닐-L-글루타밀-L-아르기닐-수지를 Applied Biosystems Fmoc-Amide-Resin (Product number 401435)에 부착하여 Applied Biosystems model 433A 펩티드 합성기 및 제조사의 시약 및 0.25mM 합성 용량용으로 고안된 반응기를 사용하여 제조하였다. 각각의 주기 반응 시간을 30분 늘려 제조자의 미리 프로그램된 주기를 변형하였다.
파트 C. 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]알라닌-L-알라닐-아르기닐-L-글루타밀-L-아르기닐- 수지의 제조.
파트 A의 산물 (1 mmol, 0.492 g)을 2 ml 디메틸포름아미드에 용해하였다. 1 mmol 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 1mmol O-(7-아자벤조트리아졸-1일)-N,N,N'N'- 테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트(HATU, Aldrich, Product 44,545-0) 및 2.5 ml CH2Cl2에서 팽윤되고 5 ml 디메틸포름아미드 용매에 희석된 0.25 mmol의 파트 B로 부터의 산물을 상기 용액에 첨가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민(4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)을 첨가하고, 상기 현탁액을 최종 10ml 부피로 희석하고 밤새 휘저었다. 수지를 거친 유리 소결 필터에서 디메틸포름아미드(20 ml x 2) 및 CH2Cl2 (20 ml x 2)와 교대로 2 사이클 세척하였다. 이어서 거친 유리 소결 필터상에서 10 ml 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml N,N-디이소프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 디에틸포름아미드를 포함하는 용액을 수지를 통하여 드립핑하여 수지에 남아 있는 반응하지 않은 아미노기를 캡핑하였다. 상기 수지를 기술한 대로 다시 세척하고 Fmoc 제거 및 사슬 신장을 위해 자동 합성 반응 용기에 되돌려 놓았다.
파트 D. L-아르기닐-L-프로필-L-류실-글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐) 아미노]-알라닐- L-알라닐-L-아르기닐-L-글루타밀-L-아르기닐-수지의 제조.
상기 파트 C의 산물을 상기 수지에 여전히 부착된 상태에서 Applied Biosystems Model 433A 합성기 및 제조사의 시약 및 0.25 mM 합성 용량용으로 고안된 반응기를 사용하여 합성하였다. 각각의 주기 반응 시간을 30분 늘려 제조자의 미리 프로그램된 주기를 변형하였다. 아미노산 L-루이신, 글리신, L-루이신, L-프롤린, 및 L-아르기닌을 순서대로 첨가하였다. 아미노 말단 Fmoc은 기계로부터 수지의 제거전에 제거하였다.
파트 E. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프로필-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드 (C 66 H 99 N 23 O 20 ).
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약(1 mmol, 0.234 g) (Aldrich, Product 23,519-9)을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁하였다. 상기 현탁액에 1 mmol 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 1mmol O-(7-아자벤조트리아졸-1일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트(HATU, Aldrich, Product 44,545-0)를 첨가하였다. 상기 현탁액을 이어서 2.5 ml CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol의 파트 D로 부터의 산물에 첨가하고, 이 현탁액을 디메틸-포름아미드 용매로 10ml로 희석하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (2 mmol, 0.35 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)을 30분에 걸쳐 2개의 동등한 분취물로 히여첨가하고, 상기 현탁액을 밤새 휘저었다. 수지를 거친 유리 소결 필터에서 디메틸포름아미드(20 ml x 2) 및 CH2Cl2 (20 ml x 2)와 교대로 2 사이클 세척하였다. 상기 수지를 진공하에서 건조하고 트리플루오로아세트산: H20: 트리이소프로필실란 1: 18: 1의 5 ml 용액으로 2-3 시간 동안 절단하였다. 상기 펩티드를 포함하는 용액을 총부피 100ml의 디에틸에테르로 유리 프릿을 통하여 여과하고 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 에테르로 한번 세척하고 공기 중에서 건조하였다. 상기 펠렛을 이어서 디메틸술폭시드에 용해하여 펩티드를 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 의 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 동결건조로 건조시켰다. 분석용 역상 HPLC에 의한 전체적 수율은 74% (0.285 g, 0.186 mmol), 순도는 99% 이었다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1533.74에 해당하는 M+2H 768.4, M+3H 512.8 및 M+H+Na 779.5를 나타내었다.
실시예 2. N-2-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-N-6-(4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)-L-리실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-아르기닐-수지의 제조.
L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-아르기닐-수지를 Applied Biosystems Fmoc-Amide-Resin (Product number 401435)에 부착하여 Applied Biosystems model 433A 펩티드 합성기를 사용하여 제조하였다. 각각의 주기 반응 시간을 30분 늘려 제조자의 미리 프로그램된 주기를 변형하였다.
파트 B. N-2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜타노일}-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-수지의 제조.
5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산 (1 mmol, 0.244 g)을 10 ml 디메틸포름아미드에 용해하였다. 1 mmol (0.135 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1일옥시)tr(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503), 및 CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol의 파트 A로 부터의 산물을 상기 용액에 첨가하였다 . N,N-디오프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)을 첨가하고 상기 현탁액을 밤새 휘저었다. 수지를 거친 유리 소결 필터에서 디메틸포름아미드(20 ml x 2) 및 CH2Cl2 (20 ml x 2)와 교대로 2 사이클 세척하였다. 상기 프로토콜을 양적인 커플링을 담보하기 위해 반복하였다.
파트 C. N-2-{5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜타노일}-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르긴아미드 (C 61 H 109 N 23 O 14 S)의 제조
파트 B 로부터의 비오틴화된 펩티드를 감압하에서 건조하고 트리플루오로아세트산 (4.6 ml), 에탄디티올 (0.125 ml), 티오아놀 (0.25 ml), 및 H2O (0.25 ml)의 용액 5ml로 6시간 동안 실온에서 절단하였다. 상기 펩티드를 포함하는 용액을 유리 프릿을 통하여 총부피 100ml의 디에틸에테르로 여과하고 5000 rpm 에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 에테르로 2회 세척하고 진공하에서 건조하였다. 상기 펠렛을 이어서 디메틸술폭시드에 용해하고 펩티드를 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 풀링하고 동결건조로 건조시켰다. 분석용 역상 HPLC에 의한 전체적 수율은 70% (0.25 g, 0.176 mmol), 순도는 99% 이었다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1419.82에 해당하는 M+2H 710.9 및 M+3H 474.3을 나타내었다.
파트 D. N-2-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-N-6-(4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)-L-리실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드 (C 84 H 120 ClN 27 O 19 S ).
5-(4,6-디클로로트리아지닐)아미노플루오르신, 히드로클로리드 시약 (0.94 mmol, 0.5g) (Molecular Probes, Eugene, OR, Product D-16)을 10 mmol (1.24 g) N,N-디오프로필에틸아민(DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)로 디메틸포름아미드에 용해된 파트 C로부터의 산물(1 g, 0.70 mmol) 10 ml 용액에 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 온화하게 진탕시켜 밤새 진행하였다. 상기 반응 혼합물을 이어서 400 ml 디에틸에테르로 드립핑시켜 넣고 5000 rpm 에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 에테르로 2회 세척하고 진공하에서 건조하였다. 상기 펠렛을 이어서 50% 아세트산에 용해하고 동결건조하여 건조시켰다(1.628 g). 상기 분말을 디메틸술폭시드에 용해하고, 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 풀링하고 동결건조로 건조시켰다. 분석용 역상 HPLC에 의한 전체적 수율은 40% (0.53 g, 0.28 mmol), 순도는 99% 이었다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1877.8663에 해당하는 M+2H 940.4379을 나타내었다.
실시예 3. N-2-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-아르기닐-L-프로필-L-류실글리실-L-류실-N-6-{4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-[(2-히드록시에틸) 티오]-1,3,5-트리아진-2-일}-L-리실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드 (C 86 H 125 N 27 O 20 S 2 ).
4.5 ml 테트라히드로퓨란 중의 실시예 2, 파트 D로 부터의 산물 (0.031 g, 0.016 mmol)의 현탁액에 0.871 mmol (0.108 g) N,N-디오프로필에틸아민 (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 및 2.96 mmol (0.231 g) 2-메르캅토에탄올을 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. 1 ml (총량의 22%)를 10ml의 에테르에서 침전하고 5000 rpm 에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해하여 펩티드를 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 동결건조로 건조시켰다. 전체적 수율은 75% (0.006 g, 0.003 mmol)이었다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1919.9036에 해당하는 M+2H 961.5 및 M+3H 641.3을 나타내었다. 형광 여기(excitation) 스캔을 고정된 방출 파장 515 nM에서 수행하였고, 방출 스캔을 고정된 여기 파장 495 nM에서 수행하였다. 적정값은 실시예2, 파트 D로 부터의 산물의 값으로부터 변화가 없는 것으로 나타났다.
실시예 4. N-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-알파-글루타밀-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실- N-6 -(4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)-L-리실-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-L-알파-글루타민의 제조.
파트 A. L-알파-글루타밀-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-수지의 제조.
L-알파-글루타밀-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-수지를 Applied Biosystems Fmoc-Amide-Resin (Product number 401435)에 부착하여 Applied Biosystems model 433A 펩티드 합성기를 사용하여 제조하였다. 각각의 주기 반응 시간을 30분 늘려 제조자의 미리 프로그램된 주기를 변형하였다.
파트 B. N-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-알파-글루타밀-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-수지의 제조
5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄산(d-Biotin, Sigma, Product B-4501)을 실시예 2의 파트 B에 기술된 방법을 사용하여 수동으로 파트 A로 부터의 수지 결합된 산물에 콘쥬게이트하였다.
파트 C. N-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-알파-글루타밀-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-L-리실-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-L-알파-글루타민(C 59 H 99 N 17 O 18 S)의 제조.
파트 B로부터의 비오틴화된 산물을 감압하에서 건조하고 트리플루오로아세트산 (4.6 ml), 에탄디티올 (0.125 ml), 씨오아놀 (0.25 ml), 및 H2O (0.25 ml)의 용액 5ml로 6시간 동안 실온에서 절단하였다. 상기 펩티드를 포함하는 용액을 유리 프릿을 통하여 총부피 100ml의 디에틸에테르로 여과하고 5000 rpm 에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 에테르로 2회 세척하고 진공하에서 건조하였다. 상기 펠렛을 이어서 디메틸술폭시드에 용해하고 펩티드를 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 풀링하고 동결건조로 건조시켰다. 분석용 역상 HPLC에 의한 전체적 수율은 65% (0.22 g, 0.163 mmol), 순도는 95% 이었다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1365에 해당하는 M+2H 683.8을 나타내었다.
파트 D. N-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-알파-글루타밀-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실- N-6 -(4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일)-L-리실-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-L-알파-글루타민(C 82 H 110 N 21 O 23 S)의 제조.
5-(4,6-디클로로트리아지닐)아미노플루오르신, 히드로클로리드 시약 (0.2 mmol, 0.106g) (Molecular Probes, Eugene, OR, Product D-16)을 2 mmol (0.25 g) N,N-디오프로필에틸아민(DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)로 디메틸포름아미드에 용해된 파트 C로부터의 산물(0.223g, 0.163 mMoles) 5 ml 용액에 첨가하였다. 상기 반응을 온화하게 진탕시켜 실온에서 밤새 진행하였다. 상기 반응 혼합물을 이어서 100 ml 디에틸에테르로 드립핑시켜 넣고 5000 rpm 에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 에테르로 2회 세척하고 진공하에서 건조하였다. 상기 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해하고, 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 풀링하고 동결건조로 건조시켰다. 분석용 역상 HPLC에 의한 전체적 수율은 72% (0.215 g, 0.12 mmol), 순도는 99% 이었다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1823.00에 해당하는 M+2H 913.9을 나타내었다.
실시예 5. N-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-알파-글루타밀-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-N-6-{4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-[(2-히드록시에틸) 씨오]-1,3,5-트리아진-2-일}-L-리실-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-L-알파-글루타민(C 84 H 115 N 21 O 24 S 2 )의 제조.
5 ml 디메틸포름아미드 중의 실시예 4 로부터의 산물(0.070 g, 0.039 mmol)의 현탁액에 0.11 mmol (0.015 g) K2CO3 및 5.1 mmol (0.4 g) 2-메르캅토에탄올을 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 ~40시간 교반하였다. 상기 시료를 45ml의 에테르에 드립핑시켜 넣고 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해하고, 펩티드를 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 동결건조로 건조시켰다. 전체적 수율은 74% (0.054 g, 0.029 mmol)이었다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1865.00에 해당하는 M+2H 933.9을 나타내었다. 형광 여기 스캔을 고정된 방출 파장 515 nM에서 수행하였다. 방출 스캔을 고정된 여기 파장 495 nM에서 수행하였다. 적정값은 실시예2의 것으로부터 변화가 없는 것으로 나타났다. 분자량 1867.11. 정확한 질량 1865. 분자식 C84H115N21O24S2. 분자 조성 C 54.04% H 6.21% N15.75% O 20.57% S 3.43%.
실시예 6.
1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-3-(2-나프틸)-L-알라닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. L-알라닐-L-아르기닐-수지의 제조.
L-알라닐-L- 아르기닐-수지를 Applied Biosystems Fmoc-Amide-Resin (Product number 401435)에 부착하여 제조사의 시약 및 0.25mM 합성용량용으로 고안된 반응용기 및 Applied Biosystems model 433A 펩티드 합성기를 사용하여 제조하였다. 각각의 주기 반응 시간을 30분 늘려 제조자의 미리 프로그램된 주기를 변형하였다.
파트 B. 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-수지의 제조.
실시예 1, 파트 A의 산물(1 mmole, 0.492 g)을 2 ml 디메틸포름아미드에 용해하였다. 1 mmol 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 1 mmol O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N' 테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트(HATU, Aldrich, Product 44,545-0), 및 2.5 ml CH2Cl2에서 팽윤되고 디메틸포름아미드 용매 5ml로 희석된 0.25 mmol의 파트 A 의 산물을 상기 용액에 첨가하였다. N,N,-디이소프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)을 첨가하고, 상기 현탁액을 10ml의 최종 부피로 희석하고 밤새 휘저었다. 상기 수지를 거친 유리 소결 필터에서 디메틸포름아미드(20 ml x 2) 및 CH2Cl2 (20 ml x 2)와 교대로 2 사이클 세척하였다. 이어서 거친 유리 소결 필터상에서 10 ml 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml N,N-디이소프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 디에틸포름아미드를 포함하는 용액을 수지를 통하여 드립핑하여 수지에 남아 있는 반응하지 않은 아미노기를 캡핑하였다. 상기 수지를 기술한 대로 다시 세척하고 Fmoc 제거 및 사슬 신장을 위해 자동 합성 반응용기에 되돌려 놓았다.
파트 C. L-프롤릴-L-류실글리실-3-(2-나프틸)-L-알라닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-수지의 합성
상기 파트 B의 산물을 상기 수지에 여전히 부착된 상태에서 Applied Biosystems Model 433A 합성기 및 제조사의 시약 및 0.25 mM 합성 용량용으로 고안된 반응 용기를 사용하여 합성하였다. 각각의 주기 반응 시간을 30분 늘려 제조자의 미리 프로그램된 주기를 변형하였다. 아미노산 L-3-(2-나프틸)-알라닌, 글리신, L-루이신 및 L-프롤린을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc은 기계로부터 수지의 제거전에 제거하였다.
파트 D. 1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-3-(2-나프틸)-L-알라닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드(C 56 H 68 N 14 O 15 )의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.105g, 0.45mmol) (Aldrich, Product 23,519-9)을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁하였다. 0.45 mmol(0.061 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트(HOAT, Aldrich, Product 15726-0), 0.45 mmol(0.234 g) 벤조트리아졸-1-일옥시-tr-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP, Novabiochem, Product 01-62-0016), 및 CH2Cl2로 팽윤된 0.25 mmol의 파트 C의 산물을 상기 현탁액에 첨가하였다. N,N-디오프로필에틸아민 (1 mmol, 0.174 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)을 첨가하고 상기 현탁액을 밤새 휘저었다. 상기 수지를 거친 유리 소결 필터에서 디메틸포름아미드(20 ml x 2) 및 CH2Cl2 (20 ml x 2)와 교대로 2 사이클 세척하였다. 상기의 프로토콜을 양적 커플링을 담보하기 위해 두번 반복하였다. 상기 수지를 진공하에서 건조하고 트리플루오로아세트산: H20: 트리이소프로필실란의 1: 18: 1 인 용액 5 ml 로 2-3 시간 동안 절단하였다. 상기 펩티드를 포함하는 용액을 총부피 100ml의 디에틸에테르로 유리 프릿을 통하여 여과하고 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 에테르로 한번 세척하고 공기 중에서 건조하였다. 상기 펠렛을 이어서 디메틸술폭시드에 용해하고, 펩티드를 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 풀링하고 동결건조로 건조시켰다. 분석용 역상 HPLC에 의한 전체적 수율은 5% (0.013 g, 0.011 mMoles), 순도는 98% 이었다. 낮은 수율은 불완전하게 보호된 아르기닌 시약이 다수 잔기의 혼입을 초래하기 때문인 것으로 밝혀졌다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1176.4987에 해당하는 M+H 1177.5를 나타내었다.
실시예 7. 1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-O-벤질-L-타이로실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. L-프롤릴-L-류실글리실-O-벤질-L-타이로실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-수지의 제조.
실시예 6, 파트 B의 산물을 상기 수지에 여전히 부착된 상태에서 Applied Biosystems Model 433A 합성기 및 제조사의 시약 및 0.25 mM 합성 용량용으로 고안된 반응기를 사용하여 합성하였다. 각각의 주기 반응 시간을 30분 늘려 제조자의 미리 프로그램된 주기를 변형하였다. 아미노산 O-벤질-L-티로신, 글리신, L-루이신 및 L-프롤린을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc은 기계로부터 수지의 제거전에 제거하였다.
파트 B. 1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-O-벤질-L-타이로실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드 (C 59 H 72 N 14 O 16 )의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약(0.105g, 0.45mmol) (Aldrich, Product 23,519-9)을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁하였다. 0.45 mmol(0.061 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOAT, Aldrich, Product 15726-0), 0.45 mmol(0.234 g) 벤조트리아졸-1-일옥시-tr-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP, Novabiochem, Product 01-62-0016), 및 CH2Cl2로 팽윤된 0.25 mmol의 파트 A의 산물을 상기 현탁액에 첨가하였다. N,N-디오프로필에틸아민 (1 mmol, 0.174 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136)을 첨가하고 상기 현탁액을 밤새 휘저었다. 상기 수지를 거친 유리 소결 필터에서 디메틸포름아미드(20 ml x 2) 및 CH2Cl2 (20 ml x 2)와 교대로 2 사이클 세척하였다. 상기의 프로토콜을 양적 커플링을 담보하기 위해 두번 반복하였다. 상기 수지를 진공하에서 건조하고 트리플루오로아세트산: H20: 트리이소프로필실란 1: 18: 1의 5 ml 용액으로 2-3 시간 동안 절단하였다. 상기 펩티드를 포함하는 용액을 총부피 100ml의 디에틸에테르로 유리 프릿을 통하여 여과하고 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 펠렛을 에테르로 한번 세척하고 공기 중에서 건조하였다. 상기 펠렛을 이어서 디메틸술폭시드에 용해하고, 펩티드를 수중에서 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 컬럼에서 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 포함하는 분획을 풀링하고 동결건조로 건조시켰다. 분석용 역상 HPLC에 의한 전체적 수율은 5% (0.013 g, 0.011 mMoles), 순도는 98% 이었다. 낮은 수율은 불완전하게 보호된 아르기닌 시약이 다수 잔기의 혼입을 초래하기 때문인 것으로 밝혀졌다. 전자분무 질량분석은 예측된 정확한 질량 1232.5249 에 해당하는 M+H 1235.5 를 나타내었다.
실시예 8. 1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-6-히드록시-L-노르류신의 제조.
L-6-히드록시노르류신 (Chemsampco, Gray Court, SC) (5 g, 34 mmol) 를 90 ml 의 H2O 중 10% Na2CO3 의 용액에 용해시켰다. 디옥산 (51 ml) 을 첨가하고, 혼합물을 빙조에서 4℃ 로 냉각시켰다. 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트 (Sigma Chemical, St. Lou, MO) (8.925 g, 34.5 mmol) 를 소량 첨가하고, 4℃ 에서 3 시간 동안 교반을 지속했다. 상기 반응을 실온으로 평형화시키고, 교반을 밤새 지속했다. 반응 혼합물에 1700 ml H2O, 의 물을 붓고, 6 회 300 ml 의 에테르 분취물로 추출했다. 이어서, 수용액을 빙수 조에서 냉각시키고, 진한 HCl 로 pH 2 까지 산성화시켰다. 혼합물을 밤새 냉장시켜서 생성물의 침전을 촉진시켰다. 침전을
거친 유리 소결 필터 상에서 수집하고, H2O 로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 10.89 g (29.5 mmol) 의 오프화이트 고체를 87% 수율로 수득했다. 전자분사 질량분석은, 생성물은 표적과 일치하는 M+H 370 및 M+NH4 387 을 나타냈다. 순도는 HPLC 로 분석해 94% 였다.
파트 B. 6-(벤질옥시)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-노르류신 및 1-벤질 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-6-히드록시노르류시네이트의 제조.
파트 A 의 생성물 (2 g, 5.4 mmol) 의 디에틸에테르 (40 ml) 중 현탁액에 1.3 ml (1.76 g, 7 mmol, 1.28 당량) 의 벤질 2,2,2-트리클로로아세트이미데이트 (Aldrich, Milwaukee, WI) 를 첨가한 후, 0.4 ml 의 붕소 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트 BF3 Et2O (Aldrich, Milwaukee, WI) 를 첨가했다. 반응물을 0℃ 에서 2 시간 동안 교반했다. 침전이 용해될 때까지 에테르층을 H2O 로 희석했다. 수층을 포화 NaHCO3 로 2 회 세척했다. 진한 HCl 을 사용해 수층을 pH 2 까지 산성화하고, 에틸아세테이트 (500 ml) 로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 감압 하에 건조시켰다. 생성물을 역상 HPLC 에 적용하고, 드라이 아이스로 냉각시키고, 동결건조시켜 건조시켰다. 모두 C28H29NO5 인 회수된 0.475 g 의 고순도 출발 재료 (24%) 및 잘 용해된 2 가지의 주 종류는, 모두 전자분사 질량분석은 M+H 460.3 및 M+NH4 477.3 를 제공했다. 벤질 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-6-히드록시-L-노르류시네이트 (0.227 g, 0.495 mmol, 9.2% 수율) 를 용출시키고, 6-(벤질옥시)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-노르류신 (0.478 g, 1.04 mmol, 19.3% 수율) 를 용출시켰다. 에스테르는 동결건조 상에서 백색 분말이었고, 에테르는 흐린 황색 헤비 오일이었다.
파트 C. 6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐) 아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-수지의 제조.
파트 B 로부터의 생성물 (0.473 mmol, 0.217 g) 을 2 ml 의 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 상기 용액에 0.473 mmol (0.064 g) 의 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 0.473 mmol (0.180 g) 의 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, Aldrich, Product 44,545-0), 및 2.5 ml 의 CH2Cl2 로 팽윤되고 디메틸포름아미드 용매를 사용해 2 ml 로 희석된 0.1 mmol 의 실시예 6, 파트 B 의 수지 결합 생성물을 첨가했다. N,N,-디프로필에틸아민 (2.3 mmol, 0.4 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 5 ml 의 최종 부피로 희석하고, 밤새 진탕시켰다. 수지를 거친 유리 소결 필터 상에서 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 및 CH2Cl2 (20 ml x 2) 를 교대로 2 싸이클 세척했다. 이어서, 수지 상에 잔류하는 미반응 아미노기를, 거친 유리 소결 필터 상의 수지를 통해 10 ml 의 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml N,N,-디프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 디메틸포름아미드를 함유하는 용액을 드립핑시켜 캡핑했다. 상기 수지를 상기 기재된 바와 같이 다시 세척하고, Fmoc 제거 및 사슬 연장을 위한 자동화된 합성 반응 용기로 되돌렸다.
파트 D. L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-수지의 제조.
파트 C 로부터의 생성물 (0.1 mmol) 을, 수지에 여전히 부착시킨 상태에서 Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.1 mmol 스케일로 고안된 반응 용기를 이용해 연신시켰다. 제조사의 프로그램된 싸이클을 변형시켜, 각각의 반응 시간을 30 분 증가시켰다. 아미노산 글리신, L-류신 및 L-프롤린을 차례로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 제거하고, 기계에서 수지를 제거했다.
파트 E. 1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드 (C 56 H 74 N 14 O 16 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 의 디메틸포름아미드에 현탁액시켰다. 상기 현탁액에 1.0 mmol (0.135 g) 의 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503) 및 CH2Cl2 로 팽윤시킨 0.25 mmol 의 파트 D 생성물을 첨가했다. N,N-디프로필에틸아민 (2.3 mmol, 0.4 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕시켰다. 상기 수지를 거친 유리 소결 필터 상에서 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 와 CH2Cl2 (20 ml x 2) 를 교대로 2 싸이클 세척했다. 상기 프로토콜을 2 회 반복하여, 정량적 커플링을 보장했다. 수지를 진공 하에 건조시키고, 트리플루오로아세트산: H2O:트리프로필실란의 18:1:1 용액 5 ml 를 사용해 2-3 시간 동안 절단했다. 펩티드 함유 용액을 유리 프릿 (glass frit) 을 통해 총 부피 100 ml 의 디에틸에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5 분 동안 펠렛화했다. 상기 펠렛을 에테르로 1 회 세척하고, 공기로 건조시켰다. 이어서, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 펩티드를 수중 5-95% 의 아세토니트릴 구배로 전개한 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 95% 초과 순도의 표적 펩티드 기질을 함유한 분획을 모으고, 동결건조로 건조시켰다. 전체 수율은 16% (0.019 g, 0.016 mmol) 였으며, 분석용 역상 HPLC 로 98% 순도를 수득했다. 전자분사 질량분석으로, 예상한 정확한 질량 1198.54 에 해당하는 M+H 1119.5 를 수득했다.
실시예 9. 1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-S-(3-페닐프로필)-L-시스테닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-S-(3-페닐프로필)-L-시스테인의 합성.
트리오프로필실란 (2.5 ml) 을 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)-S-카르보닐]-S-트리틸-L-시스테인 (3.6 mmolm, 2.1 g) (Aldrich, Product 45,932-1) 의 25 ml 트리플루오로아세트산 중 용액에 첨가하고, 용기를 실온에서 1 시간 동안 교반하여 시스테인 측쇄를 탈보호했다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 에틸렌 및 10% Na2CO3 로 분배했다. 트리틸 부산물을 유기층에 분배히키고, 제거했다. 1-브로모-3-페닐프로판 (8 mmol, 1.59 g, 1.2 ml) (Aldrich, B7,740-1) 을 수성 혼합물에 첨가하고, 반응물을 질소 하에 실온에서 1 주일에 걸쳐 교반했다. 용액을 진한 HCl 로 pH 2 까지 산성화하고, 침전을 중간 공극 유리 소결 필터 상에서 수집했다. 잔사를 에테르로 추출하고, 감압 하에 증발시켰으며, 메탄올 중에 용해시키고, 수중 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개한 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유한 분획을 수집하고, 동결건조로 건조시켰다. 전체 수율은 8.3% (0.138 g, 0.3 mMoles) 였으며, 99% 의 순도가 분석용 역상 HPLC 로 수득되었다. 디설파이드 형성은 열악한 수율을 설명한다. 전자분사 질량분석으로 M+H 462.2 및 M+NH4 479.2 을 수득했으며, 이는 이론적인 정확한 질량 461 에 해당한다.
파트 B. S-(3-페닐프로필)-L-시스테닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐 -L-아르기닐-수지의 제조.
파트 A 로부터의 생성물 (0.29 mMole, 0.138 g) 을 2 ml 의 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 상기 용액에 0.3 mMole (0.041 g) 의 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 0.3 mMole (0.114 g) O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, Aldrich, Product 44,545-0) 및 2.5 ml 의 CH2Cl2 로 팽윤된 실시예 6, 파트 B 의 수지 결합 생성물 0.1 mMole 을 첨가하고, 디메틸포름아미드 용매를 사용해 2 mL 로 희석했다. N,N,-디프로필에틸아민 (1.1 mMoles, 0.2 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 희석하여 최종 부피를 5 ml 로 하여, 밤새 진탕했다. 상기 수지를 거친 유리 소결 필터 상에서 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 와 CH2Cl2 (20 ml x 2) 를 교대로 사용하여 2 싸이클 세척했다. 이어서, 수지 상에 잔류하는 미반응 아미노기를, 10 ml 의 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml 의 N,N,-디프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 의 디메틸포름아미드를 함유하는 용액을 거친 유리 소결 필터 상에서 수지를 통해 드립핑함으로써 캡핑했다. 상기 기재된 바와 같이 수지를 다시 세척하고, Fmoc 제거 및 사슬 연신용 자동화 합성 반응 용기에 되돌렸다.
파트 C. L-프롤릴-L-류실글리실-S-(3-페닐프로필)-L-시스테닐 -3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-수지의 제조.
파트 B 의 생성물 (0.1 mmol) 을 수지에 여전히 부착시킨 채로 Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.1 mmol 스케일로 고안된 반응 용기를 이용하여 연신시켰다. 제조사의 프로그램된 싸이클을 변형시켜, 각각의 싸이클 시간을 30 분씩 증가시켰다. 아미노산 글리신, L-류신 및 L-프롤린을 차례로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 제거한 후, 기계에서 수지를 제거했다.
파트 D. 1-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-프롤릴-L-류실글리실-S-(3-페닐프로필)-L-시스테닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닌아미드 (C 55 H 72 N 14 O 15 S) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.117 g, 0.5 mMole) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 의 디메틸포름아미드에 현탁액시켰다. 상기 현탁액에 0.5 mmol (0.068 g) 의 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 0.5 mmol (0.221 g)(벤조트리아졸-1-일옥시)트리(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503) 및 CH2Cl2 로 팽윤시킨 0.1 mmol 의 파트 C 생성물을 첨가했다. N,N-디프로필에틸아민 (1.1 mmol, 0.2 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕했다. 거친 유리 소결 필터 상에서 수지를 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 와 CH2Cl2 (20 ml x 2) 를 교대로 사용하여 2 싸이클 세척했다. 상기 프로토콜을 반복하여, 정량적 커플링을 보장했다. 수지를 진공 하에 건조시키고, 트리플루오로아세트산: H2O:트리오프로필실란의 18:1:1 용액 5 ml 로 2-3 시간 동안 절단시켰다. 펩티드 함유 용액을 총 부피 100 ml 의 디에틸에테르로 유리 프릿을 통해 여과하고, 5000 rpm 에서 5 분 동안 펠렛화했다. 펠렛을 에테르로 세척하고, 공기 건조시켰다. 이어서, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 펩티드를 수중 5-95% 아세토니트릴로 전개한 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 95% 초과 순도의 표적 펩티드 기질을 함유한 분획을 모으고, 동결건조로 건조시켰다. 전체 수율은 14% (0.019 g, 0.016 mmol) 였으며, 97% 순도가 분석용 역상 HPLC 로 수득되었다. 전기분사 질량 분광법으로 M+H 1201.5 을 수득했으며, 이는 예상한 정확한 질량 1200.5022 에 상응했다.
실시예 10. N-2 -[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파 글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. L-알라닐-L-아르기닐-L-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지를, Applied Biosystems model 433A Peptide Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.25 mM 합성 스케일로 고안된 반응 용기를 이용하여, Applied Biosystems Fmoc-Amide-수지 (Product number 401435) 에 부착시켜 합성했다. D-아르기닌은 Novabiochem (Product 04-13-1045) 에서 판매한다. 제조사의 프로그램된 싸이클을 변형하여 각각의 반응 싸이클을 30 분씩 증가시켰다.
파트 B. 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 1, 파트 A 의 생성물(1 mmol, 0.492 g) 을 2 ml 의 디메틸포름아미드에 용해시킨다. 상기 용액에 1 mmol (0.135 g) 의 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 1 mmol (0.380 g) O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, Aldrich, Product 44,545-0), 및 2.5 ml 의 CH2Cl2 로 팽윤시키고, 5 ml 의 디메틸포름아미드 용매로 희석한 0.25 mmol 의 파트 A 의 수지를 첨가했다. N,N,-디프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 10 ml 의 최종 부피로 희석하고, 밤새 진탕했다. 수지를 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 와 CH2Cl2 (20 ml x 2) 를 교대로 사용해 2 싸이클 세척한 거친 유리 소결 필터 상에서 세척했다. 이어서, 수지 상에 잔류한 미반응 아미노기는 10 ml 의 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml N,N,-디프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 의 디메틸포름아미드를 함유하는 용액으로 거친 유리 소결 필터 상의 수지를 통해 드립핑하여 캡핑시켰다. 상기 수지를 상기 기재된 바와 같이 세척하고, Fmoc 제거 및 사슬 연신을 위해 자동화된 한성 반응 용기로 되돌렸다.
파트 C. L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-3-(2-나프틸)-L-알라닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
파트 B 의 생성물을 Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.25 mMole 스케일로 고안된 반응 용기를 이용하여 수지에 여전히 부착시켜 연신시켰다. 제조사의 프로그래밍된 싸이클을 변형하여 각각의 반응 시간을 30 분씩 증가시켰다. 아미노산 L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린 및 L-아르기닌을 차례로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 제거한 후, 기계에서 수지를 제거했다.
파트 D. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 66 H 99 N 23 O 20 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.117 g, 0.5 mmol) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 의 디메틸포름아미드에 현탁액시켰다. 상기 현탁액에 0.5 mmol (0. 068 g) 의 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 0.5 mmol (0.221 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)트리(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503) 및 CH2Cl2 로 팽윤시킨 0.25 mmol 의 파트 C 생성물을 첨가했다. N,N-디프로필에틸아민 (1 mmol, 0.174 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 2 회분으로 첨가하고, 상기 현탁액을 밤새 진탕시켰다. 상기 수지를 거친 유리 소결 필터 상에서 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 와 CH2Cl2 (20 ml x 2) 를 교대로 사용해 2 싸이클 세척했다. 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 커플링을 보장했다. 상기 수지를 진공 하에 건조시키고, 트리플루오로아세트산:H2O:트리오프로필실란의 18:1:1 용액 5 ml 로 2-3 시간 동안 절단했다. 펩티드 함유 용액을 총 부피 100 ml 의 디에틸에테르로 유리 프릿을 통해 여과하고, 5000 rpm 에서 5 분 동안 펠렛화했다. 펠렛을 에테르로 세척하고, 공기 건조했다. 이어서, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 상기 펩티드를 수중 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개시킨 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 95% 초과 순도의 표적 펩티드 기질을 함유한 분획을 모아서, 동결건조로 건조시켰다. 전체 수율은 70% (0.270 g, 0.176 mmol) 였으며, 98% 의 순도를 분석용 역상 HPLC 로 수득했다. 전자분사 질량분광법으로 M+2H 768.7 를 수득했으며, 이는 예상된 질량 1533.7437 에 상응한다.
실시예 11. N-2 -[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
Applied Biosystems model 433A Peptide Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.25 mM 합성 규모로 설계된 반응 용기를 사용하여 Applied Biosystems Fmoc-Amide-수지 (제품 번호 401435) 에 부착된 L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지를 합성하였다. Novabiochem 사로부터 D-아르기닌 (제품 04-13-1045) 및 D-글루탐산 (제품 04-13-1051) 을 구입하였다. 제조자의 미리계획된 주기를 변형시켜 각 주기 반응 시간을 30 분씩 증가시켰다.
파트 B. 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 1, 파트 A 의 생성물 (1 mmol, 0.492 g) 을 2 ml 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 이 용액에 1 mmol (0.135 g) 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, 제품 44,545-2), 1 mmol (0.380 g) O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, Aldrich, 제품 44,545-0), 및 2.5 ml CH2Cl2 로 팽윤시키고 디메틸포름아미드 용매로 5 ml 까지 희석시킨 파트 A 로부터의 생성물 0.25 mmol 을 첨가하였다. N,N,-디프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, 제품 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 최종 부피가 10 ml 가 되도록 희석시키고 하룻밤 동안 교반하였다. 2 번의 주기 동안 CH2Cl2 (20 ml x 2) 와 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 를 교대로 사용하여 수지를 거친 유리 소결 필터에서 세척하였다. 이어서, 10 ml 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml N,N,-디프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 디메틸포름아미드를 함유하는 조 유리 소결 필터 상의 수지를 통해 용액을 드립핑하여 수지 상에 남아 있는 미반응된 아미노기를 캡핑하였다. 수지를 상술한 바와 같이 재세척하고, Fmoc 제거 및 사슬 연장을 위해 자동화된 합성 반응 용기로 반송하였다.
파트 C. L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.25 mMole 규모로 설계된 반응 용기를 사용하여 여전히 수지에 부착되어 있는 파트 B 로부터의 생성물을 연장하였다. 제조자의 미리계획된 주기를 변형시켜 각 주기 반응 시간을 30 분씩 증가시켰다. 아미노산 L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 L-아르기닌을 순서대로 첨가하고, 아미노-말단 Fmoc 을 제거한 후, 기계로부터 수지를 제거하였다.
파트 D. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 66 H 99 N 23 O 20 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.117 g, 0.5 mmol) (Aldrich, 제품 23,519-9) 을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁시켰다. 현탁액에 0.5 mmol (0. 068 g) 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, Aldrich, 제품 15726-0), 0.5 mmol (0.221 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, 제품 GEN076503), 및 CH 2 Cl 2 로 팽창시킨 파트 C 로부터의 생성물 0.25 mmol 을 첨가하였다. N,N-디프로필에틸아민 (1 mmol, 0.174 ml) (DIEA, Applied Biosystems, 제품 400136) 을 두 번의 분량으로 첨가하고, 현탁액을 하룻밤 동안 교반하였다. 2 번의 주기 동안 CH2Cl2 (20 ml x 2) 와 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 를 교대로 사용하여 수지를 거친 유리 소결 필터에서 세척하였다. 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 커플링을 보장하였다. 2 번의 주기 동안 CH2Cl2 (20 ml x 2) 및 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 를 교대로 사용하여 수지를 거친 유리 소결 필터에서 세척하였다. 수지를 진공 하에 건조시키고, 트리플루오로아세트산: H2O:트리오프로필실란 18:1:1 의 용액 5 ml 로 2-3 시간 동안 분해하였다. 펩티드 함유 용액을 유리 프릿 (frit) 을 통해 총 부피 100 ml 의 디에틸 에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5 분간 펠렛화하였다. 펠렛을 에테르로 세척하고 공기 건조하였다. 이어서, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 물 중의 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 펩티드를 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유한 단편을 풀링하고, 동결건조하여 건조시켰다. 전체 수율은 70% (0.270 g, 0.176 mmol) 였고, 분석 역상 HPLC 에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분광법은 M+2H 768.9 및 M+3H 513 을 나타냈으며, 이는 1533.7437 의 예측된 정확한 질량에 해당하였다.
실시예 12. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. L-알라닐-L-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
Applied Biosystems model 433A Peptide Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.25 mM 합성 규모로 설계된 반응 용기를 사용하여 Applied Biosystems Fmoc-Amide-수지 (제품 번호 401435) 에 부착된 L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지를 합성하였다. D-아르기닌 (제품 04-13-1045) 및 D-글루탐산 (제품 04-13-1051) 을 Novabiochem 사로부터 구입하였다. 제조자의 미리계획된 주기를 변형시켜 각 주기 반응 시간을 30 분씩 증가시켰다.
파트 B. 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 1, 파트 A 로부터의 생성물 (1 mmol, 0.492 g) 을 2 ml 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 이 용액에 1 mmol (0.135 g) 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, 제품 44,545-2), 1 mmol (0.380 g) O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, Aldrich, 제품 44,545-0), 및 2.5 ml CH2Cl2 로 팽윤시키고 디메틸포름아미드 용매로 5 ml 까지 희석시킨 파트 A 로부터의 생성물 0.25 mmol 을 첨가하였다. N,N,-디프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, 제품 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 최종 부피가 10 ml 가 되도록 희석시키고 하룻밤 동안 교반하였다. 2 번의 주기 동안 CH2Cl2 (20 ml x 2) 로 대체된 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 를 사용하여 수지를 거친 유리 소결 필터에서 세척하였다. 이어서, 10 ml 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml N,N,-디프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 디메틸포름아미드를 함유하는 조 유리 소결 필터 상의 수지를 통해 용액을 드립핑하여 수지에 남아 있는 미반응된 아미노기를 캡핑하였다. 수지를 상술한 바와 같이 재세척하고, Fmoc 제거 및 사슬 연장을 위해 자동화된 합성 반응 용기로 반송하였다.
파트 C. D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-3-(2-나프틸)-L-알라닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조사의 시약 및 0.25 mmole 규모로 설계된 반응 용기를 사용하여 여전히 수지에 부착되어 있는 파트 B 로부터의 생성물을 연장하였다. 제조자의 미리계획된 주기를 변형시켜 각 주기 반응 시간을 30 분씩 증가시켰다. L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 D-아르기닌 (Novabiochem, 제품 04-13-1045) 을 순서대로 첨가하고, 아미노-말단 Fmoc 을 제거한 후, 기계로부터 수지를 제거하였다.
파트 D. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 66 H 99 N 23 O 20 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.117 g, 0.5 mmol) (Aldrich, 제품 23,519-9) 을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁시켰다. 현탁액에 0.5 mmol (0. 068 g) 1-히드록시벤조트리아졸 수화물 (HOBT, Aldrich, 제품 15726-0), 0.5 mmol (0.221 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, 제품 GEN076503), 및 CH2Cl2 로 팽창시킨 파트 C 로부터의 생성물 0.25 mmol 을 첨가하였다. N,N-디프로필에틸아민 (1 mmol, 0.174 ml) (DIEA, Applied Biosystems, 제품 400136) 을 두 번의 분량으로 첨가하고, 현탁액을 하룻밤 동안 교반하였다. 2 번의 주기 동안 CH2Cl2 (20 ml x 2) 로 대체된 디메틸포름아미드 (20 ml x 2) 를 사용하여 수지를 거친 유리 소결 필터에서 세척하였다. 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 커플링을 보장하였다. 수지를 진공 하에 건조시키고, 트리플루오로아세트산: H2O:트리오프로필실란 18:1:1 의 용액 5 ml 로 2-3 시간 동안 분해하였다. 펩티드 함유 용액을 유리 프릿을 통해 총 부피 100 ml 의 디에틸 에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5 분간 펠렛화하였다. 펠렛을 에테르로 세척하고 공기 건조하였다. 이어서, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 물 중의 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 펩티드를 정제하였다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유하는 단편을 풀링하고, 동결건조하여 건조시켰다. 전체 수율은 70% (0.270 g, 0.176 mmol) 였고, 분석 역상 HPLC 에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분광법은 M+2H 768.7 을 나타냈으며, 이는 1533.7437 의 예측된 정확한 질량에 해당하였다.
실시예 13. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 66 H 99 N 23 O 20 ) 의 제조.
파트 A. D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 11, 파트 B 로부터의 생성물을, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 부착된 채로 신장했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30 분 증가시켰다. L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 D-아르기닌 (Novabiochem, Product 04-13-1045) 을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다.
파트 B. N-2 -[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 66 H 99 N 23 O 20 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁시켰다. 현탁액에 1.0 mmol (0.136 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503) 및 CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol 의 파트 C 의 생성물을 첨가했다. N,N-디오프로필에틸아민 (2 mmol, 0.350 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 를 두 번에 걸쳐 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕했다. 수지를, 거친 유리 소결 필터 상에서 CH2Cl2 (20 ml ×2) 로 교대하며 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 로 2 싸이클 동안 세정했다. 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 결합을 보장했다. 수지를 진공 하에서 건조하고, 트리플루오로아세트산 : H2O : 트리오프로필실란 18:1:1 의 용액 5 ml 로 2-3시간 동안 절단했다. 펩티드 함유 용액을 유리 원료를 통해 총 체적 100 ml 의 디에틸에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5 분 동안 펠렛화했다. 펠렛을 에테르로 세정하고, 공기로 건조했다. 그 다음, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 펩티드를, 물 중 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조했다. 총 수율은 56% (0.213 g, 0.139 mmol) 이고, 분석용 역상 HPLC 에 의해 순도는 98 % 였다. 전자분사 질량분석을 수행하여 M+2H 768.7 을 얻는데, 이는 기대한 정확한 질량 1533.7437 에 해당한다.
실시예 14. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. D-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 11, 파트 B 로부터의 생성물을, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 0.25 mMole 로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 부착된 채로 신장했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30 분 증가시켰다. L-류신, 글리신, L-글루타민, L-프롤린, 및 D-아르기닌 (Novabiochem, Product 04-13-1045) 을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다.
파트 B. N-2 -[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 65 H 96 N 24 O 21 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁시켰다. 현탁액에 1.0 mmol (0.136 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503), 및 CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol 의 파트 C 로부터의 생성물을 첨가했다. N,N-디오프로필에틸아민 (2 mmol, 0.350 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 두 번에 걸쳐 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕했다. 수지를, 2싸이클 동안 CH2Cl2 (20 ml ×2) 로 교대하여 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 으로 거친 유리 소결 필터 상에서 세정했다. 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 결합을 보장했다. 수지를 진공 하에서 건조하고, 2-3시간 동안 트리플루오로아세트산 : H2O : 트리오프로필실란 18:1:1 의 용액 5 ml 로 절단했다. 펩티드 함유 용액을 유리 원료를 통해 총 체적 100 ml 의 디에틸에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5분 동안 펠렛화했다. 펠렛을 에테르로 세정하고, 공기로 건조했다. 그 다음, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 펩티드를, 물 중 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조했다. 총 수율은 35% (0.135 g, 0.139 mmol) 이고, 분석용 역상 HPLC 에 의해 순도는 97 % 였다. 전자분사 질량분석으로 M+2H 775.4, M+2Na 797.6, M+H+Na 786.4, M+3H 517.5, 및 M+2H+Na 524.8 을 수득했고, 이는 기대한 정확한 질량 1548.7182 에 해당한다.
실시예 15. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 11, 파트 B 로부터의 생성물 (0.25 mmol) 을, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 0.25 mmol 규모로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 부착된 채로 신장했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30분까지 증가시켰다. L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 D-라이신 (Novabiochem, Product 04-13-1026) 을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다.
파트 B. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 66 H 99 N 21 O 20 ㆍC 2 HF 3 O) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁시켰다. 현탁액에 1.0 mmol (0.136 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503), 및 CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol 의 파트 C 로부터의 생성물을 첨가했다. N,N-디오프로필에틸아민 (2 mmol, 0.350 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 두 번에 걸쳐 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕했다. 수지를, CH2Cl2 (20 ml ×2) 및 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 로 교대하여 2 싸이클 동안 거친 유리 소결 필터 상에서 세정했다 . 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 결합을 보장했다. 수지를 진공 하에서 건조하고, 트리플루오로아세트산 : H2O : 트리오프로필실란 18:1:1 의 용액 5 ml 로 2-3시간 동안 절단했다. 펩티드 함유 용액을 유리 원료를 통해 총 체적 100 ml 의 디에틸에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5분 동안 펠렛화했다. 펠렛을 에테르로 세정하고, 공기로 건조했다. 그 다음, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 펩티드를, 물 중 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조했다. 총 수율은 53% (0.214 g, 0.132 mmol) 이고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 98 % 였다. 전자분사 질량분석으로 M+H+Na+TFA 820.6 을 수득하였는데, 이는 기대한 정확한 질량 1505.7375 에 해당한다.
실시예 16. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-N-6-[6-({5-[(4S)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜타노일}아미노)헥사노일]-D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르긴아미드의 제조.
파트 A. D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 11, 파트 B 로부터의 생성물 (0.25 mmol) 를, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 규모 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 접착된 채로 신장했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30분까지 증가시켰다. L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 D-라이신을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다. 그러나, 선택적 측쇄 탈보호를 위해, N-알파-Fmoc-N-엡실론-4-메틸트리틸-D-라이신이었다 (Bachem, Product B-2620).
파트 B. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁시켰다. 현탁액에 1.0 mmol (0.136 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503) 및 CH2Cl2 로 팽윤한 0.25 mmol 의 파트 C 로부터의 생성물을 첨가했다. N,N-디오프로필에틸아민 (2 mmol, 0.350 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 두 번에 걸쳐 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕했다. 수지를, CH2Cl2 (20 ml ×2) 및 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 을 교대로 2 싸이클 동안 거친 유리 소결 필터 상에서 세정했다. 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 결합을 보장했다.
파트 C. N-6- (6-아미노헥사노일)- N-2 -[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
CH2Cl2 (100 ml) 중 2% 트리플루오로아세트산 및 5% 트리오프로필실란을 함유하는 용액을 파트 B 로부터 수지를 통과시켜 라이신 측쇄를, 수지로부터 용출한 분획이 더 이상 황색이 되지 않을 때까지, 선택적으로 탈보호했다. 수지를 CH2Cl2 (20 ml ×2) 으로 세정한 다음, 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 으로 2싸이클 동안 세정했다. 6-{[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]아미노}헥산산 (1 mmol, 0.353 g) 을 2 ml 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 이 용액에 1 mmol 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 1 mmol O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, Aldrich, Product 44,545-0), 및 2.5 ml CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol 의 파트 B 로부터의 생성물을 첨가하고, 디메틸포름아미드 용매로 5 ml 로 희석했다. N,N,-디오프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 10 ml 최종 체적으로 희석하고, 밤새 교반했다. 수지를, CH2Cl2 (20 ml ×2) 및 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 을 교대하여 2 싸이클 동안 거친 유리 소결 필터 상에서 세정했다. Fmoc 기를 Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 표준 탈보호 싸이클 및 제조자의 시약 및 규모 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 제거했다.
파트 D. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]- N-6 -[6-({5-[(4S)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜타노일}아미노)헥사노일]-D-리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르긴아미드의 제조.
5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산 (1 mmol, 0.244 g) 을 10 ml 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 이 용액에 1 mmol (0.135 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503) 및 CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol 의 파트 C 로부터의 생성물을 첨가했다. N,N-디오프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕했다. 수지를, CH2Cl2 (20 ml ×2) 및 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 를 교대하여 2 싸이클 동안 거친 유리 소결 필터 상에서 세정했다. 상기 프로토콜을 반복하여 정량적 결합을 보장했다. 수지를 진공 하에서 건조하고, 트리플루오로아세트산 : H2O : 트리오프로필실란 18:1:1 의 용액 5 ml 로 2-3시간 동안 절단했다. 펩티드 함유 용액을 유리 원료를 통해 총 체적 100 ml 의 디에틸에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5분 동안 펠렛화했다. 펠렛을 에테르로 세정하고, 공기로 건조했다. 그 다음, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 펩티드를, 물 중 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조했다. 총 수율은 30% (0.139 g, 0.075 mmol) 이고, 분석용 역상 HPLC 에 의해 순도는 98% 였다. 전자분사 질량분석으로 M+2H 924 를 수득했는데, 이는 기대한 정확한 질량 1844.8992 에 해당한다.
실시예 17. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-베타-알라닐-D-아르기닐-베타-알라닐-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. 베타-알라닐-D-아르기닐-베타-알라닐-D-아르기닐-수지의 제조.
베타-알라닐-D-아르기닐-베타-알라닐-D-아르기닐-수지를 합성하여, Applied Biosystems model 433A Peptide Synthesizer 및 제조자의 시약 및 0.25 mM 합성 규모로 고안된 반응 용기를 사용하여 Applied Biosystems Fmoc-Amide-Resin (Product number 401435) 에 접착했다. 베타-알라닌 (Product 04-12-1044) 및 D-아르기닌 (Product 04-13-1045) 을 Novabiochem 로부터 구매했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30분까지 증가시켰다.
파트 B. 3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-베타-알라닐-D-아르기닐-베타-알라닐-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 1, 파트 A 로부터의 생성물 (1 mmol, 0.492 g) 을 2 ml 디메틸포름아미드에 용해시켰다. 이 용액에 1 mmol (0.135 g) 1-히드록시-7-아자벤조-트리아졸 (HOAT, Aldrich, Product 44,545-2), 1 mmol (0.380 g) O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, Aldrich, Product 44,545-0), 및 2.5 ml CH2Cl2 로 팽윤한 0.25 mmol 의 파트 A 로부터의 생성물을 첨가하고, 디메틸포름아미드 용매로 5 ml 로 희석했다. N,N,-디오프로필에틸아민 (4 mmol, 0.7 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 을 첨가하고, 현탁액을 10 ml 최종 체적으로 희석하고, 밤새 진탕했다. 수지를, CH2Cl2 (20 ml ×2) 및 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 을 교대로 2싸이클 동안 거친 유리 소결 필터 상에서 세정했다. 그 다음, 수지 상에 잔류하는 미반응 아미노기는 10 ml 아세트산 무수물 (106 mmol), 10 ml N,N,-디오프로필에틸아민 (57 mmol) 및 30 ml 디메틸포름아미드를 함유하는 용액을 거친 유리 소결 필터 상에서 수지를 통해 드립핑하여 캡핑했다. 수지를 상기와 같이 다시 세정하고, Fmoc 제거 및 사슬 신장을 위해 자동 합성 반응 용기에 반송했다.
파트 C. D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-베타-알라닐-D-아르기닐-베타-알라닐-D-아르기닐-수지의 합성.
파트 B 의 생성물을, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 규모 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 부착한 채로 신장했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30분까지 증가시켰다. L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 D-아르기닌을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다.
파트 D. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-베타-알라닐-D-아르기닐-베타-알라닐-D-아르기닌아미드 (C 64 H 97 N 23 O 18 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 시약 (0.234 g, 1.0 mmol) (Aldrich, Product 23,519-9) 을 5 ml 디메틸포름아미드에 현탁시켰다. 현탁액에 1.0 mmol (0.136 g) 1-히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (HOBT, Aldrich, Product 15726-0), 1.0 mmol (0.442 g) (벤조트리아졸-1-일옥시)tr(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (BOP, Castros Reagent, Perseptive Biosystems, Product GEN076503), 및 CH2Cl2 로 팽윤된 0.25 mmol 의 파트 C 로부터의 생성물을 첨가했다. N,N-디오프로필에틸아민 (2 mmol, 0.174 ml) (DIEA, Applied Biosystems, Product 400136) 를 첨가하고, 현탁액을 밤새 진탕했다. 수지를, CH2Cl2 (20 ml ×2) 로 대체된 디메틸포름아미드 (20 ml ×2) 으로 2싸이클 동안 거친 유리 소결 필터 상에서 세정했다. 수지를 진공 하에서 건조하고, 트리플루오로아세트산 : H2O : 트리오프로필실란 18:1:1 의 용액 5 ml 로 2-3시간 동안 절단했다. 펩티드 함유 용액을 유리 원료를 통해 총 체적 100 ml 의 디에틸 에테르로 여과하고, 5000 rpm 에서 5분 동안 펠렛화했다. 펠렛을 에테르로 세정하고, 공기로 건조했다. 그 다음, 펠렛을 디메틸술폭시드에 용해시키고, 펩티드를, 물 중 5-95% 아세토니트릴 구배로 전개된 C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제했다. 순도 95% 초과의 표적 펩티드 기질을 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조했다. 총수율은 30% (0.139 g, 0.075 mmol) 이고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 98 % 였다. 전자분사 질량분석으로 M+H 1476.7 및 M+2H 738.9 을 수득했는데, 이는 기대한 정확한 질량 1476.61 에 해당한다.
실시예 18. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실-S-메틸-L-시스테이닐-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실-S-메틸-L-시스테이닐-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닐-수지의 제조.
실시예 11, 파트 B 로부터의 생성물을, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 규모 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 부착된 채 신장했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30분까지 증가시켰다. L-류신, S-메틸-L-시스틴 (Bachem, Product B-2510), L-류신, L-프롤린, 및 D-아르기닌 (Novabiochem, Product 04-13-1045) 를 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다.
파트 B. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실-S-메틸-L-시스테이닐-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 68 H 103 N 23 O 20 S) 의 제조 .
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 (MCA) 을 파트 A 의 수지 상의 펩티드에 접합하고, 펩티드를 수지로부터 절단하고, 실시예 1, 파트 E. 에 기재된 바와 같이 정제했다. 총 수율은 40% (0.158 g, 0.099 mmol) 이고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 93 % 였다. 전자분사 질량분석으로 M+2H 798.18 를 수득했는데, 이는 기대한 정확한 질량 1593.7470 에 해당한다.
실시예 19. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-알파-글루타밀-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-글리실아미드의 제조.
파트 A. N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-L-알라닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-알라닐-수지의 제조.
L-알라닐-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-알라닐-수지를 (실시예 1, 파트 B 에 기재된 바와 같이) 합성하고, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 규모 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 Applied Biosystems Fmoc-Amide Resin (Product number 401435) 에 부착 합성했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30분까지 증가시켰다. L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-알라닌 (RSP Amino Acid Analogues, Inc., Hopkinton, MA, Product #6066-fp), L-글루타민산, L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-알라닌, 및 L-알라닌을 수지에 순서대로 첨가하고, 그 다음, 실시예 1, 파트 C. 에 기재되어 있는 바와 같이 실시예 1, 파트 A, 의 생성물을 접합했다. 수득한 생성물을, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 규모 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 부착된 채로 신장했다. L-류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-알라닌을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다.
파트 B. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-알파-글루타밀-L-N-(이미다미딜)-피페리딘-3-일-글리실아미드 (C 72 H 105 N 23 O 20 ) 의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 (MCA) 을 파트 A 로부터의 수지 상의 펩티드에 접합하고, 펩티드를 수지로부터 절단하고, 실시예 1, 파트 E 에 기재되어 있는 바와 같이 정제했다. 총 수율은 15% (0.060 g, 0.037 mmol) 이고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 96 % 였다. 전자분사 질량분석으로 M+2H 806.5 를 수득했는데, 이는 기대한 정확한 질량 1611 에 해당한다.
실시예 20. N-2 -[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닐-수지의 제조.
실시예 8, 파트 B 로부터의 6-(벤질옥시)-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-노르류신을, 실시예 8, 파트 C 에 기재된 바와 같이 실시예 1, 파트 C 로부터의 수지에 접합했다. 수지 결합 생성물을, Applied Biosystems Model 433A Synthesizer 및 제조자의 시약 및 규모 0.25 mmol 로 고안된 반응 용기를 사용하여 수지에 부착된 채로 신장했다. 제조자의 미리 프로그램된 싸이클을 변형시켜 각 싸이클 반응 시간을 30분까지 증가시켰다. 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 L-아르기닌 (Novabiochem, Product 04-13-1045) 을 순서대로 첨가하고, 아미노 말단 Fmoc 을 기계로부터의 수지의 제거 전에 제거했다.
파트 B. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드 (C 73 H 105 N 23 O 21 )의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 (MCA)을 파트 A로부터의 생성물에 콘쥬게이션시키고, 펩타이드를 수지로부터 절단하고 실시예 1, 파트 E에 기재된 바와 같이 정제하였다. 전체 수율은 39% (0.160 g, 0.098 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 821.1 이었고, 이는 예측한 정확한 질량 1639.7855 에 해당한다.
실시예 21. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 73 H 105 N 23 O 21 )의 제조.
D-아르기닌을 L-아르기닌으로 대체하고, D-글루탐산을 L-글루탐산으로 대체한 것을 제외하고는, N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드를 실시예 20에 기재된 바와 같이 제조하였다. 전체 수율은 37% (0.150 g, 0.092 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 821.3 이었고, 이는 예측한 정확한 질량 1639.7855 에 해당한다.
실시예 22. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐-L-알파-글루타밀-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 75 H 106 N 24 O 24 )의 제조.
L-류신을 L-글루타민으로 대체하고, 글리신을 L-글루탐산으로 대체한 것을 제외하고는, N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐-L-알파-글루타밀-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드를 실시예 21에 기재된 바와 같이 제조하였다. 전체 수율은 28% (0.121 g, 0.070 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 864.4 이었고, 이는 예측한 정확한 질량 1726.7812 에 해당한다.
실시예 23. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실-L-알파-글루타밀-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
글리신을 L-글루탐산으로 대체한 것을 제외하고는, N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실-L-알파-글루타밀-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드를 실시예 21에 기재된 바와 같이 제조하였다. 전체 수율은 22% (0.096 g, 0.056 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 856.9 이었고, 이는 예측한 정확한 질량 1711.8067 에 해당한다.
실시예 24. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 72 H 102 N 24 O 22 )의 제조.
L-류신을 L-글루타민으로 대체한 것을 제외하고는, N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드를 실시예 21에 기재된 바와 같이 제조하였다. 전체 수율은 31% (0.128 g, 0.077 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 828.4 이었고, 이는 예측한 정확한 질량 1654.7601 에 해당한다.
실시예 25. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-페녹시-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드의 제조.
파트 A. 벤질-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-6-페녹시노르류시네이트의 제조.
톨루엔 (5 ml) 중 실시예 8, Part B 로부터의 생성물 (1.0 g, 2.2 mmol) 및 페놀 (300mg, 3.2 mmol)의 용액에 디에틸 아조디카르복실레이트(DEAD) (0.4 g, 2.3 mmol) 및 트리페닐포스핀 (0.6 g, 2.3 mmol)을 첨가하였다. 수득한 혼합물을 주위 온도에서 12-15 시간 동안 교반하였다 (반응 과정은 RPHPLC 로 관찰하였다). 반응 완료 후, 용액을 회전증발기로써 농축시킨 후, SiO2 상에서 정제하여 맑은 오일 (2 g, 98%)을 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분광법은 목적하는 구조와 일치하였다. 질량 분광법은 하기 결과를 나타내었다:
C34H33NO5 -M+Na+H 실측치 = 558.20 (M+H 계산치 = 558).
파트 B. 1-N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-6-페녹시노르류신의 제조.
파트 A로부터의 생성물 (1.2 g)의 메탄올 (50 ml) 용액에 탄소상의 10% Pd (600 mg, Degussa 형 촉매)를 첨가하였다. 검은 혼합물을 Parr 장비에서 50 psi에서 2.5 시간 동안 진탕하였다. 반응 완료 후, 혼합물을 셀라이트(celite) 패드를 통해 여과하였다. 용매를 감압 하에서 제거하여, 800 mg의 N-FMOC 아미노산을 수득하였다. 1H NMR 및 질량 분광법은 목적하는 구조와 일치하였다. 질량 분광법은 하기 결과를 나타내었다: C23H27NO5 -M+Na+H 실측치 = 556.20 (M+Na+H 계산치 = 556).
파트 C. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-페녹시-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 72 H 103 N 23 O 21 )의 제조.
상기 파트 B 로부터의 생성물을, 실시예 8, 파트 C에 기재된 수동 커플링 프로토콜에 따라, 실시예 11, 파트 B로부터의 생성물의 1.0 mmol 제제에 수동으로 콘쥬게이션시켰다. 기질을 추가로 연장시키고, 실시예 21에 기재된 바와 같이 정제하였다. 전체 수율은 41% (0.0.662 g, 0.407 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC에 의한 순도는 96% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 813.8, M+H+Na 824.8, M+3H 543.1 이었고, 이는 예측된 정확한 질량 1625.7699 에 해당한다.
실시예 26. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-S-(4-메톡시벤질)-L-시스테이닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드 (C 71 H 101 N 23 O 21 S)의 제조.
S-(4-메톡시벤질)-L-시스틴을 6-(벤질옥시)-L-노르류신으로 대체한 것을 제외하고는, N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-D-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-S-(4-메톡시벤질)-L-시스테이닐-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-D-아르기닐-D-알파-글루타밀-D-아르기닌아미드를 실시예 21에 기재된 바와 같이 제조하였다. 전체 수율은 29% (0.120 g, 0.092 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 98% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 823.6 이었고, 이는 예측된 정확한 질량 1644.7263 에 해당한다.
실시예 27. N-2 -[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-알파-글루타밀-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-글리실아미드의 제조.
파트 A. N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-알라닐-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-알라닐-수지의 제조.
L-알라닐-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-알라닐-L-알파-글루타밀-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-알라닐-수지를, Applied Biosystems 모델 433A 합성기, 및 실시예 1, 파트 B에 기재된 바와 같이 0.25 mmol 스케일에 맞춰 고안된 제작자의 시약 및 반응용기를 사용하여, Applied Biosystems Fmoc-아미드 수지 (제품번호 401435)에 부착시켜 합성하였다. 제작자의 미리 프로그램된 사이클을 변형시켜, 각각의 사이클 반응 시간을 30 분씩 증가시켰다. L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-알라닌 (RSP Amino Acid Analogues, Inc., Hopkinton, MA, 제품 #6066-fp), L-글루탐산, L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-알라닌, 및 L-알라닌을 상기 수지에 순서대로 첨가한 후, 실시예 1, 파트 C에 기재된 바와 같이 실시예 1, 파트 A로부터의 생성물을 콘쥬게이션시켰다. 수득한 생성물을, Applied Biosystems 모델 433A 합성기, 및 0.25 mmol 스케일에 맞춰 고안된 제작자의 시약 및 반응용기를 사용하여, 수지에 여전히 부착시킨 채로 연장시켰다. 6-(벤질옥시)-L-노르류신, 글리신, L-류신, L-프롤린, 및 L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-알라닌을 순서대로 첨가하고, 상기 기계로부터 수지를 제거하기 전에 아미노-말단을 갖는 Fmoc 를 제거하였다.
파트 B. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-프롤릴-L-류실글리실-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-L-글리실-L-알파-글루타밀-L-N-(이미드아미딜)-피페리딘-3-일-글리실아미드 (C 79 H 111 N 23 O 21 )의 제조.
7-메톡시쿠마린-4-아세트산 (MCA)을 파트 A로부터의 펩타이드에 콘쥬게이션시키고, 펩타이드를 수지로부터 절단하고 실시예 1, 파트 E에 기재된 바와 같이 정제하였다. 전체 수율은 2% (0.009 g, 0.005 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC 에 의한 순도는 94% 이었다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 859.89 이었고, 이는 예측된 정확한 질량 1717.8325 에 해당한다.
실시예 28. N-2-[5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-류실- N-6- (4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-히드록시-1,3,5-트리아진-2-일)-L-라이실-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드 (C 86 H 125 N 27 O 20 S)의 제조.
부탄올 중 1 몰의 포타슘 tert-부톡사이드의 분취량 (0.25 ml)을 실시예 3으로부터의 미정제 반응 용액 3.5 ml 에 첨가하고, 반응물을 50℃에서 30 분간 환류시켰다. 용액은 가수분해가 진행됨에 따라 강렬한 오렌지색으로 변하였다. 생성물을 50 ml의 에테르에서 침전시키고, 5000 rpm에서 5 분간 펠렛화하였다. 펠렛을 디메틸설폭사이드에 용해시키고, 물에서 5-95%의 아세토니트릴 구배를 갖도록 한 C18 역상 칼럼 상에서 정제하였다. 95% 초과의 순수한 목표 펩타이드 기질을 함유하는 분획을 동결건조하여 건조시켰다. 가수분해는 10%만 완료되었다. 수율은 9% (0.002 g, 0.001 mmol)이었다. 전자분무 질량분석에 의하면. M+2H 931.0 M+3H 621.3이었고, 이는 예측된 정확한 질량 1859.9002 이었다. 형광 여기 스캔 (Fluorescence excitation scan)을 515 nm의 고정 방출 파장에서 수행하였고, 방출 스캔을 495 nm의 고정 여기 파장에서 수행하였다. 최적값은 실시예 2와 변함없는 것으로 나타났다.
실시예 29. N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐-L-알파-글루타밀-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐)아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드 (C 75 H 106 N 24 O 24 )의 제조.
L-아르기닌을 D-아르기닌으로 대체하고, L-글루탐산을 D-글루탐산으로 대체한 것을 제외하고는, N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸]-L-아르기닐-L-프롤릴-L-글루타미닐-L-알파-글루타밀-6-(벤질옥시)-L-노르류실-3-[(2,4-디니트로페닐) 아미노]-L-알라닐-L-알라닐-L-아르기닐-L-알파-글루타밀-L-아르기닌아미드를 실시예 22에 기재된 바와 같이 제조하였다. 전체 수율은 32% (0.140 g, 0.081 mmol)이었고, 분석용 역상 HPLC에 의한 순도는 99.9% 였다. 전자분무 질량분석에 의하면, M+2H 864.41, M+3H 576.95 이었고, 이는 예측된 정확한 질량 1726.7812 에 해당한다.
실시예 30. 시험관내 MMP 억제 분석.
몇 가지 히드록사메이트 화합물을 시험관내 검정으로 분석하여, 펩타이드 기질의 MMP 절단 억제능을 측정하였다. 억제 상수 (Ki)는 검정한 히드록사메이트-MMP 상호작용으로부터 계산하였다.
인간 재조합 MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13 및 MMP-14를 상기 검정에 사용하였다. 효소를 공지의 실험실 절차에 따라 제조하였다. 이들 효소의 제조 및 사용에 대한 프로토콜은 과학 문헌에서 입수가능하다. 예를 들면, Enzyme Nomenclature (Academic Press, San Diego, CA, 1992) (및 그 인용문)를 참조. 또한, Frije 등, J Biol. Chem., 26(24), 16766-73 (1994)를 참조.
또한, 다수의 MMP가 공급자로부터 구매가능하다. 예를 들면, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-12 및 MMP-13 은 R&D Systems로부터 상기 회사 2003년 카탈로그를 통해 시판된다.
MMP-1 전구효소는 MMP-1으로 트랜스펙션된 HT-1080 세포의 사용된 배지로부터 정제할 수 있고, 단백질은 아연 킬레이트화 칼럼 상에서 정제될 수 있다. MMP-2 전구효소는 MMP-2로 트랜스펙션된 p2AHT2 세포로부터 젤라틴 세파로즈 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. MMP-9 전구효소는 MMP-9로 트랜스펙션된 HT1080 세포의 사용된 배지로부터 젤라틴 세파로즈 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
MMP-13은, [V.A. Luckow 저, "Insect Cell Expression TEchnology," Protein Engineering: Principles and Practice, pp. 183-218 (J.L. Cleland 등 편저, Wiley-Liss, Inc., 1996)]에 기술된 바와 같이, 바큘로바이러스 (baculovirus)를 사용하여 전장 cDNA 클론으로부터 전구효소로서 수득할 수 있다. 발현된 전구효소는 먼저 헤파린 아가로즈 칼럼 상에서 정제한 후, 킬레이트화 염화아연 칼럼 상에서 정제하였다. 바큘로바이러스 발현 시스템에 대한 세부사항은, 예를 들면 [Luckow 등, J. Virol., 67, 4566-79 (1993)]에서 찾을 수 있다. 또한, [O'Reilly 등, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (W.H. Freeman and Co., New York, NY, 1992)]를 참조. 또한, [King 등, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London, England, 1992)]를 참조.
전장 MMP-14 cDNA 는 대장균 (E. coli) 응집체 (inclusion body) 내 촉매 영역 효소를 발현하는 데 사용할 수 있다. 이어서, 상기 효소는 우레아에 용해시키고, 분취용 C-14 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제하고, 아세트산아연의 존재 하에서 되접기(refolding) 시키고, 사용하기 위해 정제한다.
모든 MMP는 4-아미노페닐수은 아세테이트 ("APMA", Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 트립신을 사용하여 활성화시켰다. MMP-9 또한 표준 클론제조 및 정제 기법에 따라 인간 재조합 MMP-3를 사용하여 활성화시켰다.
형광 감응성(fluorogenic)의 메톡시쿠마린 함유 폴리펩타이드 기질인 MCA-ArgProLeuGlyLeuDpaAlaArgGluArgNH2 (표 4의 화합물 1)을 MMP 억제 검정에서 MMP 기질로서 사용하였다. 여기서, "MCA"는 7-메톡시쿠마린-4-일 아세틸이고, "Dpa"는 3-(2,4-디니트로페닐)-L-2,3-디아미노프로피오닐 기이다. MMP 억제 활성이 없는 상태로, 기질을 Gly-Leu 펩타이드 결합에서 절단한다. 상기 절단으로 인해, 2,4-디니트로페닐 감쇄물질(quencher)로부터 형광원성이 높은 펩타이드가 분리되어, 형광 강도의 증가를 초래한다.
히드록사메이트 억제제 (또는 그의 염)의 저장용액을 1% 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 중에서 제조하였다. 저장용액을 완충액 A (100 mM Tris-HCL, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% 폴리옥시에틸렌 23 라우릴 에테르, pH 7.5)로 희석하여, 다양한 히드록사메이트 농도를 갖는 용액, 즉 검정된 MMP 억제성 화합물을 다양한 농도로 갖는 검정 용액을 수득하였다. 실험 대조군은 검정용 시료로서 동일한 양의 완충액 A/DMSO를 함유하였으나, 히드록사메이트 억제제는 함유하지 않았다.
Ki 를 구하기 위해, 억제제 시료를 4 M의 MMP 기질의 존재 하에서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, Tecan SpectraFlour Plus 플레이트 판독기로 분석한다. 여기 파장은 330 nm 이고, 방출 (형광) 파장은 420 nm 이다. MMP 억제 활성이 없는 상태로, 기질을 Gly-Leu 결합에서 절단하여, 상대적 형광을 증가시킨다. 억제를, 상대적 형광의 감소된 증가율로서 관찰한다.
억제제는, 단일 기질 농도가 Km 이하로 고정된 단일 저 효소 농도를 사용하여 분석하다. 상기 프로토콜은 [Knight 등, FEBS Lett., 296(3), 263-266 (1992)]의 방법의 변형예이다. [Kuzmic, Anal. Biochem. 286, 45-50 (2000)]에 기재된 바와 같이, Morrison 등식을 사용하여, 반응 속도의 비선형 회귀 분석에 의해, 겉보기 억제 상수를 억제제 및 효소 농도의 함수로서 구한다. 변형예는, 비선형 회귀분석 방법에 있어서 공동 대조 반응속도 및 효과적인 효소 농도가 주어진 검정 플레이트 상의 모든 투여량-반응 관계 사이에서 공유될 수 있도록 고안되었다. 기질 농도가 Km 이하가 되도록 선택하였으므로, 상기 검정에서 겉보기 Ki 는 기질의 영형에 대한 보정이 없는 Ki 로 보고하였다.
하기 표 4는, MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13 및 MMP-14를 이용한 상기 검정을 사용한 몇 가지 억제제의 Ki 값을 나타낸다. 표 4의 모든 수치는 nM 단위로 나타내었다.
상기 바람직한 구현예의 상세한 설명은, 단지 당업자에게 본 발명, 이의 원칙 및 실제 응용분야에 대해 소개하여, 당업자로 하여금 본 발명을 특정 용도의 요구조건에 가장 잘 맞을 수 있는 다양한 형태로 순응시키고 적용할 수 있게 할 것을 의도로 한다. 따라서, 본 발명은 상기 구현예에만 한정되는 것이 아니며, 다양하게 변형될 수 있다.
본 출원 (청구범위 포함) 내 "포함하다"란 용어의 사용에 대하여, 출원인은, 본문 맥락이 달리 의미하지 않는 한, 이들 용어가 제외하는 것이 아니라 포함하는 것으로 해석되어야 한다는 명확한 이해를 근거로 사용되어야 함에 주목하며, 출원인은 이들 용어는 각각 하기 청구범위를 포함한 본 출원을 이해함에 있어 상기와 같이 해석되기를 의도한다.
본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 본원에 참고문헌으로서 포함된다. 본원의 참고문헌의 대한 거론은 단순히 각 저자의 주장을 요약하기 위함이며, 어떤 참고문헌도 선행기술을 구성하지는 않는다.
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<223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-L-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-(benzoxy)-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> AMIDATION, <400> 20 Xaa Pro Leu Gly Xaa Xaa Ala Arg Glu Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-D-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-(benzyloxy)-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> SITE <222> (8) <223> D-arginine <220> <221> SITE <222> (9) <223> D-alpha-glutamic acid <220> <221> SITE <222> (10) <223> D-arginine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 21 Xaa Pro Leu Gly Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-D-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-(benzyloxy)-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> SITE <222> (8) <223> D-arginine <220> <221> SITE <222> (9) <223> D-alpha-glutamic acid <220> <221> SITE <222> (10) <223> D-arginine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 22 Xaa Pro Gln Glu Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-D-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-(benzyloxy)-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> SITE <222> (8) <223> D-arginine <220> <221> SITE <222> (9) <223> D-alpha-glutamic acid <220> <221> SITE <222> (10) <223> D-arginine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 23 Xaa Pro Leu Glu Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-D-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-(benzyloxy)-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> SITE <222> (8) <223> D-arginine <220> <221> SITE <222> (9) <223> D-alpha-glutamic acid <220> <221> SITE <222> (10) <223> D-arginine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 24 Xaa Pro Gln Gly Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-D-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-phenoxy-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> SITE <222> (8) <223> D-arginine <220> <221> SITE <222> (9) <223> D-alpha-glutamic acid <220> <221> SITE <222> (10) <223> D-arginine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 25 Xaa Pro Leu Gly Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-D-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> S-(4-methoxybenzyl)-L-cysteine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> SITE <222> (8) <223> D-arginine <220> <221> SITE <222> (9) <223> D-alpha-glutamic acid <220> <221> SITE <222> (10) <223> D-arginine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 26 Xaa Pro Leu Gly Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-N-(imidamidyl)-pipe ridin-3-yl-L-alanine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-(benzyloxy)-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> SITE <222> (8) <223> N-(imidamidyl)-piperidin-3-yl-L-glycine <220> <221> SITE <222> (10) <223> N-(imidamidyl)-piperidin-3-yl-L-glycine <400> 27 Xaa Pro Leu Gly Xaa Xaa Ala Xaa Glu Xaa 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(5-(2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoyl]- L-arginine <220> <221> SITE <222> (6) <223> N-6-(4{[3-carboxy-4-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)phenyl]amino }-6-chloro-1,3,5-triazin-2-yl)-L-lysine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 28 Xaa Pro Leu Gly Leu Xaa Ala Arg Glu Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptiden compound <220> <221> SITE <222> (1) <223> N-2-[(7-methoxy-2-oxo-2H-chromen-4-yl)acetyl]-L-arginine <220> <221> SITE <222> (5) <223> 6-(benzyloxy)-L-norleucine <220> <221> SITE <222> (6) <223> 3-[(2,4-dinitrophenyl)amino]-L-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION, <400> 29 Xaa Pro Gln Glu Xaa Xaa Ala Arg Glu Arg 1 5 10

Claims (150)

  1. 화합물 또는 그의 염으로서:
    상기 화합물이 펩티드를 포함하며, 화학식 I 의 구조에 상응하는 하는 화합물 또는 그의 염:
    aa(i)-X-Y-aa(j)-Z (I);
    aa(i) 는 펩티드의 N-말단에서 i 개의 아미노산의 서열을 포함하며;
    aa(j) 는 펩티드의 C-말단에서 j 개의 아미노산의 서열을 포함하며;
    i 는 0 내지 5 의 정수이고;
    j 는 1 내지 6 의 정수이고;
    형광발색단이 X-Y 결합의 한 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있고, 하나 이상의 형광 감쇄물질 (quencher) 및 리간드가 X-Y 결합의 다른 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있으며;
    X 는 MMP 인식 서열을 포함하며;
    X 는 Pro-Gln-Gln, Pro-Tyr-Ala 또는 Pro-Val-Glu 이 아니며;
    Y 는 아미노산을 포함하며;
    Z 는 하기이다:
    펩티드의 C-말단에서의 히드록실기, 또는
    펩티드의 C-말단에서의 보호기.
  2. 제 1 항에 있어서, Y 가 8 개 이상의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  3. 제 2 항에 있어서, Y 가 10 개 이상의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  4. 제 3 항에 있어서, Y 가 11 개 이상의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  5. 제 4 항에 있어서, Y 가 11 내지 15 개의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  6. 제 4 항에 있어서, Y 가 12 개 이상의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  7. 제 1 항에 있어서, MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 가 상기 화합물 또는 그의 염과 반응하여, 상기 화합물 또는 그의 염이 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 과 조합되는 경우, X 및 Y 사이의 결합에서 상기 화합물 또는 그의 염을 절단하는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 염.
  8. 제 7 항에 있어서:
    하나 이상의 MMP-1 및 MMP-7 을 가진 상기 화합물 또는 그의 염의 kcat/Km 가 약 0.5 x 10-4 M-1s-1 이하이며,
    하나 이상의 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13 를 가진 상기 화합물 또는 그의 염의 kcat/Km 가 약 5 x 10-4 M-1s-1 인 화합물 또는 그의 염.
  9. 제 8 항에 있어서:
    하나 이상의 MMP-1 및 MMP-7 를 가진 상기 화합물 또는 그의 염의 kcat/Km 가 약 10-5 M-1s-1 이하이며,
    하나 이상의 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13 를 가진 상기 화합물 또는 그의 염의kcat/Km 가 약 50 x 10-4 M-1s-1 이상인 화합물 또는 그의 염.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염과 MMP-1 또는 MMP-7 의 반응 속도가 약 0 인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 염.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염과 MMP-1 및 MMP-7 의 반응 속도가 약 0 인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 염.
  12. 제 7 항에 있어서, Y 가 3-(2-나프틸)-L-알라닌, O-벤질-L-타이로신, 6-(벤질옥시)-L-노르류신, S-(3-페닐프로필)-L-시스테인, 6-페녹시-L-노르류신 및 S-(4-메톡시벤질)-L-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염.
  13. 제 7 항에 있어서, Y 가 6-(벤질옥시)-L-노르류신 및 6-페녹시-L-노르류신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염.
  14. 제 7 항에 있어서, X 의 인식 서열이 Ala-Gln-Gly, Ala-Met-His, Asn-Gln-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-Gln-Gly, Dnp-Leu-Gly, Ile-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-Gln-Tyr, Pro-Gln-Ala, Pro-Gln-Glu, Pro-Gln-Gly, Pro-Gln-His, Pro-Gln-Leu, Pro-Gln-Met, Pro-Gln-Phe, Pro-Gln-Pro, Pro-Gln-Val, Pro-Glu-Asn, Pro-Glu-Gly, Pro-His-Gly, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro-Met-Gly, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Ser-Glu-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-Ile-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser 및 Pro-Leu-MeCys 로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염.
  15. 제 7 항에 있어서, Y 가 8 개 이상의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  16. 제 15 항에 있어서, Y 가 11 개 이상의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 측쇄가 화학식 (17-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  18. 제 16 항에 있어서, 측쇄가 화학식 (18-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  19. 제 16 항에 있어서, 측쇄가 화학식 (19-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  20. 제 16 항에 있어서, 측쇄가 화학식 (20-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  21. 제 15 항에 있어서, Y 가 12 개 이상의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  22. 제 21 항에 있어서, 측쇄가 화학식 (22-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  23. 제 22 항에 있어서, 화학식 (23-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  24. 제 22 항에 있어서, 화학식 (24-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  25. 제 15 항에 있어서, Y 가 15 개의 비-수소 원자를 포함하는 측쇄를 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  26. 제 25 항에 있어서, 측쇄가 화학식 (26-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  27. 제 7 항에 있어서, i 가 0 인 화합물 또는 그의 염.
  28. 제 7 항에 있어서, i 가 1 인 화합물 또는 그의 염.
  29. 제 7 항에 있어서, j 가 3 내지 5 인 화합물 또는 그의 염.
  30. 제 29 항에 있어서, i 가 0 또는 1 인 화합물 또는 그의 염.
  31. 제 7 항에 있어서, aa(i) 또는 aa(j) 가 아르기닌, 라이신, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  32. 제 31 항에 있어서:
    aa(i) 가 아르기닌, 라이신, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하며;
    aa(j) 가 아르기닌, 라이신, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 화합물 또는 그의 염.
  33. 제 7 항에 있어서, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13, MMP-14 또는 MMP-26 의 Km 보다 더 큰 수용성을 갖는 화합물 또는 그의 염.
  34. 제 7 항에 있어서, 1% DMSO 중 pH 7.5 에서 약 20 μM 이상의 수용성을 갖는 화합물 또는 그의 염.
  35. 제 34 항에 있어서, 1% DMSO 중 pH 7.5 에서 약 100 μM 이상의 수용성을 갖는 화합물 또는 그의 염.
  36. 제 7 항에 있어서, log D 분산이 약 0 미만인 하나 이상의 아미노산을 함유하는 화합물 또는 그의 염.
  37. 제 7 항에 있어서, log D 분산이 약 0 미만인 아미노산이 D-아르기닌, L-아르기닌, D-아스파라긴, L-아스파라긴, D-글루탐산, L-글루탐산, D-히스티딘, L-히스티딘, D-글루타민, L-글루타민, D-라이신, L-라이신, D-세린, L-세린, D-트레오닌, L-트레오닌, 글리신, D-알라닌, L-알라닌, D-시트룰린, L-시트룰린, D-오르니틴 및 L-오르니틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염.
  38. 제 7 항에 있어서, 형광발색단이 쿠마린인 화합물 또는 그의 염.
  39. 제 38 항에 있어서, 쿠마린이 치환된 N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸] 인 화합물 또는 그의 염.
  40. 제 38 항에 있어서, 쿠마린이 N-2-[(7-메톡시-2-옥소-2H-크로멘-4-일)아세틸] 인 화합물 또는 그의 염.
  41. 제 7 항에 있어서, 형광발색단이 플루오레신인 화합물 또는 그의 염.
  42. 제 41 항에 있어서, 플루오레신이 치환된 N-6-(4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일) 인 화합물 또는 그의 염.
  43. 제 41 항에 있어서, 플루오레신이 N-6-(4-{[3-카르복시-4-(6-히드록시-3-옥소-3H-잔텐-9-일)페닐]아미노}-6-클로로-1,3,5-트리아진-2-일) 인 화합물 또는 그의 염.
  44. 제 7 항에 있어서, 형광발색단이 X-Y 결합의 한 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있으며, 형광 감쇄물질이 X-Y 결합의 다른 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있는 화합물 또는 그의 염.
  45. 제 44 항에 있어서, 형광 감쇄물질이 치환된 (2,4-디니트로페닐)아미노인 화합물 또는 그의 염.
  46. 제 44 항에 있어서, 형광 감쇄물질이 (2,4-디니트로페닐)아미노인 화합물 또는 그의 염.
  47. 제 7 항에 있어서, 형광발색단이 X-Y 결합의 한 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있으며, 리간드가 X-Y 결합의 다른 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있는 화합물 또는 그의 염.
  48. 제 47 항에 있어서, 리간드가 고체 지지체에 비공유로 결합되어 있는 화합물 또는 그의 염.
  49. 제 47 항에 있어서, 리간드가 치환된 비오틴인 화합물 또는 그의 염.
  50. 제 47 항에 있어서, 리간드가 비오틴인 화합물 또는 그의 염.
  51. 제 47 항에 있어서, 리간드가 치환된 N-2-[(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일] 인 화합물 또는 그의 염.
  52. 제 47 항에 있어서, 리간드가 N-2-[(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜타노일] 인 화합물 또는 그의 염.
  53. 제 47 항에 있어서, 리간드가 치환된 엡실론 아미노 카프로산인 화합물 또는 그의 염.
  54. 제 47 항에 있어서, 리간드가 엡실론 아미노 카프로산인 화합물 또는 그의 염.
  55. 제 7 항에 있어서, 하나 이상의 D-아미노산을 함유하는 화합물 또는 그의 염.
  56. 제 7 항에 있어서, 베타-아미노산 및 감마-아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 함유하는 화합물 또는 그의 염.
  57. 제 7 항에 있어서, Z 가 보호기인 화합물 또는 그의 염.
  58. 제 57 항에 있어서, Z 가 임의치환된 아민인 화합물 또는 그의 염.
  59. 제 1 항에 있어서, 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
    및
  60. 제 1 항에 있어서, 서열 번호 제 8 번, 서열 번호 제 20 번, 서열 번호 제 21 번, 서열 번호 제 22 번, 서열 번호 제 23 번, 서열 번호 제 24 번 및 서열 번호 제 25 번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염.
  61. 화합물 또는 그의 염으로서:
    상기 화합물이 펩티드를 포함하며, 화학식 I 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
    aa(i)-X-Y-aa(j)-Z (I);
    aa(i) 는 펩티드의 N-말단에서 i 개의 아미노산의 서열을 가지며;
    aa(j) 는 펩티드의 C-말단에서 j 개의 아미노산의 서열을 가지며;
    상기 펩티드는 D-아미노산을 포함하며;
    i 는 0 내지 5 의 정수이며;
    j 는 1 내지 6 의 정수이며;
    형광발색단이 X-Y 결합의 한 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있으며, 하나 이상의 형광 감쇄물질 및 리간드가 X-Y 결합의 다른 측면 상의 펩티드에 공유결합되어 있으며;
    X 는 MMP 인식 서열을 포함하며;
    Y 는 결합이거나 또는 아미노산이며;
    Z 는 하기이다:
    펩티드의 C-말단에서의 히드록실기, 또는
    펩티드의 C-말단에서의 보호기.
  62. 제 61 항에 있어서, X 의 인식 서열이 Ala-Gln-Gly, Ala-Met-His, Asn-Gln-Gly, Asp-Lys-Glu, Dnp-Gln-Gly, Dnp-Leu-Gly, Ile-Gly-Phe, Lys-Pro-Asn, Pro-Arg-Gly, Pro-Asp-Gly, Pro-Gln-Tyr, Pro-Gln-Ala, Pro-Gln-Gln, Pro-Gln-Glu, Pro-Gln-Gly, Pro-Gln-His, Pro-Gln-Leu, Pro-Gln-Met, Pro-Gln-Phe, Pro-Gln-Pro, Pro-Gln-Val, Pro-Glu-Asn, Pro-Glu-Gly, Pro-His-Gly, Pro-Leu-Ala, Pro-Leu-Gly, Pro-Met-Gly, Pro-Tyr-Ala, Pro-Tyr-Gly, Pro-Val-Ala, Pro-Val-Glu, Pro-Ser-Glu-Asn, Ser-Gly-Asn, Ser-His-Ser, Ser-Ile-Pro, Thr-Glu-Lys, Tyr-Arg-Trp, Tyr-His-Ser 및 Pro-Leu-MeCys 로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염.
  63. 제 61 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식에 대한 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
    및
  64. 화합물 또는 그의 염으로서:
    상기 화합물이 펩티드를 함유하며,
    상기 펩티드가 페닐옥시노르류신 및 벤질옥시노르류신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 함유하는 화합물 또는 그의 염.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 과 조합되는 경우, MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 가 상기 화합물 또는 그의 염과 반응하여 2 개의 아미노산 사이의 결합에서 상기 화합물 또는 그의 염이 절단되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 염.
  66. 제 65 항에 있어서, 페닐옥시노르류신을 함유하는 화합물 또는 그의 염.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 화합물이 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 와 조합되는 경우, MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 가 상기 화합물 또는 그의 염과 반응하여 페닐옥시노르류신과 또다른 아미노산 사이의 결합에서 상기 화합물 또는 그의 염이 절단되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 염.
  68. 제 66 항에 있어서, 화학식 (68-1) 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
  69. 제 65 항에 있어서, 벤질옥시노르류신을 함유하는 화합물 또는 그의 염.
  70. 제 69 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 과 조합되는 경우, MMP-2, MMP-9 또는 MMP-13 가 상기 화합물 또는 그의 염과 반응하여 벤질옥시노르류신과 또다른 아미노산 사이의 결합에서 상기 화합물 및 그의 염이 절단되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 염.
  71. 제 69 항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
    및
  72. 매트릭스 메탈로프로테아제를 제 1 항의 화합물 또는 그의 염과 조합하는 것을 포함하는 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성 측정 방법.
  73. 제 72 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 59 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  74. 제 72 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  75. 제 72 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  76. 제 72 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  77. 제 72 항에 있어서, 하기를 조합하는 것을 포함하는 방법:
    하나 이상의 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13;
    하나 이상의 MMP-1 및 MMP-7; 및
    제 1 항의 화합물 또는 그의 염.
  78. 병리학적 매트릭스 메탈로프로테아제 수준과 연관된 질환의 생체외 탐지 또는 모니터링 방법에 있어서, X 와 Y 사이의 결합에서의 제 1 항의 화합물 또는 그의 염의 절단을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 59 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  80. 제 78 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  81. 제 78 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  82. 제 78 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  83. 생물학적 시료 중의 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 측정하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    생물학적 시료와 제 1 항의 화합물 또는 그의 염을 조합하여 혼합물을 형성하는 단계, 및
    상기 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제의 반응 생성물의 존재성에 대해 혼합물을 분석하는 단계.
  84. 제 83 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 59 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  85. 제 83 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  86. 제 83 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  87. 제 83 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  88. 매트릭스 메탈로프로테아제의 예비 저해제의 저해 활성 측정 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    하기의 것을 조합하여 혼합물을 형성하는 단계:
    제 1 항의 화합물 또는 그의 염,
    예비 저해제, 및
    매트릭스 메탈로프로테아제; 및
    상기 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제의 반응 생성물의 존재성에 대해 상기 혼합물을 분석하는 단계.
  89. 제 88 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 59 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  90. 제 88 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  91. 제 88 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  92. 제 88 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  93. 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성 측정 방법으로서, 매트릭스 메탈로프로테아제와 제 61 항의 화합물 또는 그의 염을 조합하는 것을 포함하는 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 63 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  95. 제 93 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  96. 제 93 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  97. 제 93 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  98. 제 93 항에 있어서, 상기 방법이 하기를 조합하는 것을 포함하는 방법:
    하나 이상의 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13;
    하나 이상의 MMP-1 또는 MMP-7; 및
    제 61 항의 화합물 또는 그의 염.
  99. 병리학적 매트릭스 메탈로프로테아제 수준과 연관된 질환의 생체외 탐지 또는 모니터링 방법으로서, X 와 Y 사이의 결합에서의 제 61 항의 화합물 또는 그의 염의 절단을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  100. 제 99 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 63 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  101. 제 99 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  102. 제 99 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  103. 제 99 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  104. 생물학적 시료 중의 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 측정하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    생물학적 시료와 제 61 항의 화합물 또는 그의 염을 조합하는 단계, 및
    상기 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제의 반응 생성물의 존재성에 대해 상기 혼합물을 분석하는 단계.
  105. 제 104 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 63 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  106. 제 104 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  107. 제 104 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  108. 제 104 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  109. 매트릭스 메탈로프로테아제의 예비 저해제의 저해 활성을 측정하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    하기를 조합하여 혼합물을 형성하는 단계:
    제 61 항의 화합물 또는 그의 염,
    예비 저해제, 및
    매트릭스 메탈로프로테아제; 및
    상기 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제의 반응 생성물의 존재성에 대해 상기 혼합물을 분석하는 단계.
  110. 제 109 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 63 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  111. 제 109 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  112. 제 109 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  113. 제 109 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  114. 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 측정하는 방법으로서, 매트릭스 메탈로프로테아제와 제 64 항의 화합물 또는 그의 염을 조합하는 것을 포함하는 방법.
  115. 제 114 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 68 항 또는 제 71 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  116. 제 114 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  117. 제 114 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  118. 제 114 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  119. 제 114 항에 있어서, 상기 방법이 하기를 조합하는 것을 포함하는 방법:
    하나 이상의 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13;
    하나 이상의 MMP-1 및 MMP-7; 및
    제 64 항의 화합물 또는 그의 염.
  120. 병리학적 매트릭스 메탈로프로테아제 수준과 연관된 질환의 생체외 탐지 또는 모니터링 방법으로서, 제 64 항의 화합물 또는 그의 염의 절단을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  121. 제 120 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 68 항 또는 제 71 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  122. 제 120 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  123. 제 120 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  124. 제 123 항에 있어서, 상기 질환이 안질환인 방법.
  125. 제 124 항에 있어서, 상기 질환이 녹내장인 방법.
  126. 제 124 항에 있어서, 상기 질환이 황반변성 및 당뇨병성 황색반 부종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  127. 제 120 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  128. 생물학적 시료 중의 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 측정하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    생물학적 시료와 제 64 항의 화합물 또는 그의 염을 조합하여 혼합물을 형성하는 단계, 및
    상기 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제의 반응 생성물의 존재성에 대해 상기 혼합물을 분석하는 단계.
  129. 제 128 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 68 항 또는 제 71 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  130. 제 128 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  131. 제 128 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  132. 제 131 항에 있어서, 생물학적 시료가 눈 유래의 체액 또는 조직을 포함하는 방법.
  133. 제 128 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  134. 매트릭스 메탈로프로테아제의 예비 저해제의 저해 활성을 측정하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    하기를 조합하여 혼합물을 형성하는 단계:
    제 64 항의 화합물 또는 그의 염,
    예비 저해제, 및
    매트릭스 메탈로프로테아제; 및
    상기 화합물 또는 그의 염과 매트릭스 메탈로프로테아제의 반응 생성물의 존재성에 대해 상기 혼합물을 분석하는 단계.
  135. 제 134 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 68 항 또는 제 71 항의 화합물 또는 그의 염인 방법.
  136. 제 134 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-2 인 방법.
  137. 제 134 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-9 인 방법.
  138. 제 134 항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP-13 인 방법.
  139. 매트릭스 메탈로프로테아제의 병리학적 활성과 연관된 질환의 탐지 또는 모니터링을 위한 키트로서, 제 1 항의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 키트.
  140. 제 139 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 59 항의 화합물 또는 그의 염인 키트.
  141. 매트릭스 메탈로프로테아제의 병리학적 활성과 연관된 질환의 탐지 또는 모니터링을 위한 키트로서, 제 61 항의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 키트.
  142. 제 141 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 63 항의 화합물 또는 그의 염인 키트.
  143. 매트릭스 메탈로프로테아제의 병리학적 활성과 연관된 질환의 탐지 또는 모니터링을 위한 키트로서, 제 64 항의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 키트.
  144. 제 143 항에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 염이 제 68 항 또는 제 71 항의 화합물 또는 그의 염인 키트.
  145. 매트릭스 메탈로프로테아제의 예비 저해제의 유효성을 평가하기 위한 키트로서, 제 1 항의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 키트.
  146. 매트릭스 메탈로프로테아제의 예비 저해제의 유효성을 평가하기 위한 키트로서, 제 61 항의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 키트.
  147. 매트릭스 메탈로프로테아제의 예비 저해제의 유효성을 평가하기 위한 키트로서, 제 64 항의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 키트.
  148. 화합물 또는 그의 염으로서:
    상기 화합물이 화학식 II 의 구조에 상응하며:
    [화학식 II]
    n 은 0 또는 1 이며,
    R1 및 R2 는 수소 및 질소 보호기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 화합물 또는 그의 염.
  149. 제 148 항에 있어서, 상기 화합물이 화학식 IIA 의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
    [화학식 IIA]
  150. 제 149 항에 있어서, 상기 화합물이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학식의 구조에 상응하는 화합물 또는 그의 염:
    및
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