JPH0616719B2 - 酵素の検出および測定用色原体基質 - Google Patents
酵素の検出および測定用色原体基質Info
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- JPH0616719B2 JPH0616719B2 JP58220822A JP22082283A JPH0616719B2 JP H0616719 B2 JPH0616719 B2 JP H0616719B2 JP 58220822 A JP58220822 A JP 58220822A JP 22082283 A JP22082283 A JP 22082283A JP H0616719 B2 JPH0616719 B2 JP H0616719B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、下記の一般式IIを有する化合物またはその酸
付加塩からなる酵素の検出および測定用色原体基質に関
する。
付加塩からなる酵素の検出および測定用色原体基質に関
する。
上記式中、Ｘは水素原子、ペプチド化学に慣用の保護基
または末端アミノ基を不可逆的に保護する基であり、Ａ
はその側鎖機能が遊離であるかまたはは置換されてあり
うるAla、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、P
he、Pro、Pyr、Thr、TyrおよびValからなる群から選択
されるアミノ酸であり、Ｃは結合であるかまたはその側
鎖官能分が遊離であるかまたは置換されていてもよいAl
a、Asp、Glu、Gly、Leu、Lys、SerおよびValからなる群
から選択されるアミノ酸であり、Ｄはその側鎖官能分が
遊離であるかまたは置換されていてもよいAla、Asp、Gl
u、Gly、His、Leu、Phe、Pip、Pro、Ser、Thr、Tyrおよ
びValからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｂは
Ｌ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ
−ホモリジン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−ヒスチジンで
あり、そしてＲは４−ニトロアニリンの３位におけるCO
OR1、CONR2R3、CONH−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（CH3）２、CO
−Ｙ−OR1またはCO−Ｙ−NR2R3であるかまたは２位にお
けるＯＲ１であり、ここでＲ１は１〜６個の炭素原子を
有する脂肪族炭化水素基、６または10個の炭素原子を有
する芳香族炭化水素基、７〜11個の炭素原子を有する芳
香族脂肪炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有する
脂環式炭化水素基であり、R2は水素原子であるかまたは
R1で定義されたと同じ基であり、R3は１〜10個の炭素原
子を有する脂肪族炭化水素基、６または10個の炭素原子
を有する芳香族炭化水素基、７〜11個の炭素原子を有す
る芳香脂肪族炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有
する脂環式炭化水素基であり、Ｙはその側鎖官能分が遊
離であるかまたは置換されていてもよいAla、Asn、As
p、β−Ala、γ−But、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Ly
s、Met、Arg、Phe、Pro、Ser、Thr、TyrおよびValから
なる群から選択されるα−、β−またはγ−アミノ酸で
あり、そしてｎは１〜10である。
または末端アミノ基を不可逆的に保護する基であり、Ａ
はその側鎖機能が遊離であるかまたはは置換されてあり
うるAla、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、P
he、Pro、Pyr、Thr、TyrおよびValからなる群から選択
されるアミノ酸であり、Ｃは結合であるかまたはその側
鎖官能分が遊離であるかまたは置換されていてもよいAl
a、Asp、Glu、Gly、Leu、Lys、SerおよびValからなる群
から選択されるアミノ酸であり、Ｄはその側鎖官能分が
遊離であるかまたは置換されていてもよいAla、Asp、Gl
u、Gly、His、Leu、Phe、Pip、Pro、Ser、Thr、Tyrおよ
びValからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｂは
Ｌ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ
−ホモリジン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−ヒスチジンで
あり、そしてＲは４−ニトロアニリンの３位におけるCO
OR1、CONR2R3、CONH−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（CH3）２、CO
−Ｙ−OR1またはCO−Ｙ−NR2R3であるかまたは２位にお
けるＯＲ１であり、ここでＲ１は１〜６個の炭素原子を
有する脂肪族炭化水素基、６または10個の炭素原子を有
する芳香族炭化水素基、７〜11個の炭素原子を有する芳
香族脂肪炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有する
脂環式炭化水素基であり、R2は水素原子であるかまたは
R1で定義されたと同じ基であり、R3は１〜10個の炭素原
子を有する脂肪族炭化水素基、６または10個の炭素原子
を有する芳香族炭化水素基、７〜11個の炭素原子を有す
る芳香脂肪族炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有
する脂環式炭化水素基であり、Ｙはその側鎖官能分が遊
離であるかまたは置換されていてもよいAla、Asn、As
p、β−Ala、γ−But、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Ly
s、Met、Arg、Phe、Pro、Ser、Thr、TyrおよびValから
なる群から選択されるα−、β−またはγ−アミノ酸で
あり、そしてｎは１〜10である。
本発明の色原体基質は、酵素種類3.4.21の加水分解的に
作用する酵素の証明および定量的測定に使用される。
作用する酵素の証明および定量的測定に使用される。
プロテアーゼ測定用の色原体化合物はドイツ特許出願公
開第2527932号、同第2552570号、同第2629067号、同第2
436543号および同第2629198号各公報およびヨーロッパ
特許出願第0019589号および同第0034122号各明細書から
知られている。
開第2527932号、同第2552570号、同第2629067号、同第2
436543号および同第2629198号各公報およびヨーロッパ
特許出願第0019589号および同第0034122号各明細書から
知られている。
しかしながらプロテアーゼの測定に使用される現在技術
水準によるこれらの基質はそれらの特異性に関してかな
りの欠点がある。従って例えばTos−Gly−Pro−Arg−pN
A（後掲の略語参照）およびＨ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−pN
Aのようなトロンビンの測定に使用される色原体基質は
血漿カリクレイン、第XIIａ因子（胎盤から得られる、
分子量28000）、プラズミンおよび第Ｘａ因子のような
他の凝固および線維素溶解カスケードのプロテアーゼな
らびにまたトリプシンおよびウロキキナーゼから広範囲
に解裂される。基質−酵素非特異性に関する同様の所見
は、血漿カリクレイン、プラズミン、第Ｘａ因子および
ウロキナーゼのような他のプロテアーゼについてそうで
あるように色原体化合物についても生ずる。比較的高い
酵素特異性を有するドイツ特許出願公開第2436543号公
報記載の基質はそれぞれの酵素による解裂後に発色団を
後から遊離させるのにアミノペプチダーゼ作用を有する
助酵素を必要とするという欠点を有する。
水準によるこれらの基質はそれらの特異性に関してかな
りの欠点がある。従って例えばTos−Gly−Pro−Arg−pN
A（後掲の略語参照）およびＨ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−pN
Aのようなトロンビンの測定に使用される色原体基質は
血漿カリクレイン、第XIIａ因子（胎盤から得られる、
分子量28000）、プラズミンおよび第Ｘａ因子のような
他の凝固および線維素溶解カスケードのプロテアーゼな
らびにまたトリプシンおよびウロキキナーゼから広範囲
に解裂される。基質−酵素非特異性に関する同様の所見
は、血漿カリクレイン、プラズミン、第Ｘａ因子および
ウロキナーゼのような他のプロテアーゼについてそうで
あるように色原体化合物についても生ずる。比較的高い
酵素特異性を有するドイツ特許出願公開第2436543号公
報記載の基質はそれぞれの酵素による解裂後に発色団を
後から遊離させるのにアミノペプチダーゼ作用を有する
助酵素を必要とするという欠点を有する。
本発明の目的は助酵素なしで使用されうる比較的高い酵
素特異性を有する色原体化合物を生成させることであ
る。
素特異性を有する色原体化合物を生成させることであ
る。
本発明は一般式IIを有する化合物に関するものでありそ
して前記定義については以下の説明のとおりである。
して前記定義については以下の説明のとおりである。
Ac アセチル Ala アラニン β−Ala β−アラニン ANBS ５−アミノ−２−ニトロ安息香酸 Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Boc 第３ブチルオキシカルボニル But アミノ酪酸 γ−But γ−アミノ酪酸 Bz ベンゾイル Bzl ベンジル CHA シクロヘキシルアミン Cys システイン DCCI ジシクロヘキシルカルボジイミド DCH ジシクロヘキシル尿素 Ddm ４，４′−ジメトキシベンズヒドリル DMF ジメチルホルムアミド EE 酢酸エチルエステル Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン HAc 酢 酸 His ヒスチジン HOBt ヒドロキシベンゾトリアゾール Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Me メチル Met メチオニン MM モル塊 Msc メチルスルホエチルオキシカルボニル MMM Ｎ−メチルモルホリン Orn オルニチン PE 石油エーテル Pip ピペコリン酸 pNA ｐ−ニトロアニリン（４−ニトロアニリン） Pro プロリン Pyr ピログルタミン酸 Ser セリン RT 室 温 tBu 第３ブチル TCP ２，４，５−トリクロロフエニル Thr スレオニン TDM ４，４′−ビス（ジメチルアミノ）ジフエニル
メタン Tos トルエンスルホニル Tyr チロシン Val バリン Ｚ ベンジルオキシカルボニル ZTE ベンジルオキシカルボニル−アミノ−２，２，
２−トリフルオロエチル 別に記載がなければアミノ酸はＬ形で存在するものとす
る。
メタン Tos トルエンスルホニル Tyr チロシン Val バリン Ｚ ベンジルオキシカルボニル ZTE ベンジルオキシカルボニル−アミノ−２，２，
２−トリフルオロエチル 別に記載がなければアミノ酸はＬ形で存在するものとす
る。
「アミノ酸」なる表現は本発明においては常に３個まで
の窒素原子、２個の硫黄原子および６個の酸素原子を有
する２〜15個の炭素原子から構成されるα−、β−また
はγ−アミノ酸を意味するものとする。
の窒素原子、２個の硫黄原子および６個の酸素原子を有
する２〜15個の炭素原子から構成されるα−、β−また
はγ−アミノ酸を意味するものとする。
Ａが偏光アミノ酸である場合、これはＸが水素原子であ
る場合は好ましくはＤ形で存在する。
る場合は好ましくはＤ形で存在する。
上記一般式IIにおいて、Ｘは水素原子、ペプチド化学に
慣用の保護基または末端アミノ基を不可逆的に保護する
基である。ペプチド化学に慣用の保護基は例えば「Hoib
en-Weyl」第XV／１巻および「The PePtides」第３巻の
「Protection ｏｆ Functional Groups ｉｎ Pept
ide Synthesis」（アカデミックプレス１９８１年版）
に記載されたようなものである。ベンジルオキシカルボ
ニル、第３ブチルオキシカルボニル、アダマンチルオキ
シカルボニル、メチルスルホエチルオキシカルボニルお
よび９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを使用す
るのが好ましい。不可逆的な保護基はアシルまたはスル
ホニル基、好ましくはR4-CO-基（ここで式中R4は１〜３
個のハロゲン原子によって置換されていることができる
１〜６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基である
か、または６〜１０個の炭素原子を有するアルカリール
基である）またはベンゼンスルホニル基または７〜１０
個の炭素原子を有するアルカリールスルホニル基であ
り、特別にはホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフ
ルオロアセチル、トルエンスルホニル、メシル、メトキ
シ、ベンゼンスルホニル、スクシノイルまたはマレオイ
ルであり、Ａはその側鎖官能分が遊離であるかまたは置
換されていてもよいAla、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Il
e、Leu、Lys、Phe、Rro、Pyr、Thr、TyrおよびValから
なる群から選択されるアミノ酸であり、Ｃは結合である
かまたはその側鎖官能分が遊離であるかまたは置換され
ていてもよいAla、Asp、Glu、Gly、Leu、Lys、Serおよ
びValからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｄは
その側鎖官能分が遊離であるかまたは置換されていても
よいAla、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Pip、Pro、S
er、Thr、TyrおよびValからなる群から選択されるアミ
ノ酸であり、ＢはＬ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニ
ン、Ｌ−リジン、Ｌ−ホモリジン、Ｌ−オルニチンまた
はＬ−ヒスチジンであり、Ｒは４−ニトロアニリンの３
位におけるCOOR1、CONR2R3、CONH−（CH2）ｎ−Ｎ（C
H3）２、CO-Y-OR1またはCO-Y-NR2R3であるかまたは２位
におけるOR1である。Ｒには付加的に他の置換基が存在
しうる。ここでR1は１〜６個の炭素原子を有する脂肪族
炭化水素基、６または１０個の炭素原子を有する芳香族
炭化水素基、７〜１１個の炭素原子を有する芳香脂肪族
炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有する脂環式炭
化水素基であり、R2は水素原子であるかまたはR1で定義
されたと同じ基であり、R3は１〜１０個の炭素原子を有
する脂肪族炭化水素基、６または１０個の炭素原子を有
する芳香族炭化水素基、７〜１１個の炭素原子を有する
芳香脂肪族炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有す
る脂環式炭化水素基であり、Ｙはその側鎖官能分が遊離
であるかまたは置換されていてもよいAla、Asn、Asp、
β−Ala、γ−But、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Me
t、Arg、Phe、Pro、Ser、Thr、TyrおよびValからなる群
から選択されるα−、β−またはγ−アミノ酸でありそ
してｎは１〜１０である。
慣用の保護基または末端アミノ基を不可逆的に保護する
基である。ペプチド化学に慣用の保護基は例えば「Hoib
en-Weyl」第XV／１巻および「The PePtides」第３巻の
「Protection ｏｆ Functional Groups ｉｎ Pept
ide Synthesis」（アカデミックプレス１９８１年版）
に記載されたようなものである。ベンジルオキシカルボ
ニル、第３ブチルオキシカルボニル、アダマンチルオキ
シカルボニル、メチルスルホエチルオキシカルボニルお
よび９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを使用す
るのが好ましい。不可逆的な保護基はアシルまたはスル
ホニル基、好ましくはR4-CO-基（ここで式中R4は１〜３
個のハロゲン原子によって置換されていることができる
１〜６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基である
か、または６〜１０個の炭素原子を有するアルカリール
基である）またはベンゼンスルホニル基または７〜１０
個の炭素原子を有するアルカリールスルホニル基であ
り、特別にはホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフ
ルオロアセチル、トルエンスルホニル、メシル、メトキ
シ、ベンゼンスルホニル、スクシノイルまたはマレオイ
ルであり、Ａはその側鎖官能分が遊離であるかまたは置
換されていてもよいAla、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Il
e、Leu、Lys、Phe、Rro、Pyr、Thr、TyrおよびValから
なる群から選択されるアミノ酸であり、Ｃは結合である
かまたはその側鎖官能分が遊離であるかまたは置換され
ていてもよいAla、Asp、Glu、Gly、Leu、Lys、Serおよ
びValからなる群から選択されるアミノ酸であり、Ｄは
その側鎖官能分が遊離であるかまたは置換されていても
よいAla、Asp、Glu、Gly、His、Leu、Phe、Pip、Pro、S
er、Thr、TyrおよびValからなる群から選択されるアミ
ノ酸であり、ＢはＬ−アルギニン、Ｌ−ホモアルギニ
ン、Ｌ−リジン、Ｌ−ホモリジン、Ｌ−オルニチンまた
はＬ−ヒスチジンであり、Ｒは４−ニトロアニリンの３
位におけるCOOR1、CONR2R3、CONH−（CH2）ｎ−Ｎ（C
H3）２、CO-Y-OR1またはCO-Y-NR2R3であるかまたは２位
におけるOR1である。Ｒには付加的に他の置換基が存在
しうる。ここでR1は１〜６個の炭素原子を有する脂肪族
炭化水素基、６または１０個の炭素原子を有する芳香族
炭化水素基、７〜１１個の炭素原子を有する芳香脂肪族
炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有する脂環式炭
化水素基であり、R2は水素原子であるかまたはR1で定義
されたと同じ基であり、R3は１〜１０個の炭素原子を有
する脂肪族炭化水素基、６または１０個の炭素原子を有
する芳香族炭化水素基、７〜１１個の炭素原子を有する
芳香脂肪族炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有す
る脂環式炭化水素基であり、Ｙはその側鎖官能分が遊離
であるかまたは置換されていてもよいAla、Asn、Asp、
β−Ala、γ−But、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Me
t、Arg、Phe、Pro、Ser、Thr、TyrおよびValからなる群
から選択されるα−、β−またはγ−アミノ酸でありそ
してｎは１〜１０である。
Ａ、Ｃ、ＤおよびＹに相当するアミノ酸の側鎖官能分と
してはカルボキシル、ヒドロキシル、メルカプト、イミ
ダゾール、アミノおよびアミド基があげられる。これら
はその反応性に応じてペプチド化学に慣用の保護基で置
換されうる。
してはカルボキシル、ヒドロキシル、メルカプト、イミ
ダゾール、アミノおよびアミド基があげられる。これら
はその反応性に応じてペプチド化学に慣用の保護基で置
換されうる。
GlnおよびAsn中の酸アミド官能分の保護には４，４′−
ジメトキシベンズヒドリルおよび４，４′−ジメチルベ
ンズヒドリルの使用が好ましい。His中のイミダゾール
官能分の保護にはベンジルオキシカルボニルアミノ−2,
2,2−トリフルオロエチル（ZTE）、第３ブチルオキシカ
ルボニルおよびトシルの使用が好ましい。アルギニンの
グアニジノ官能分の保護にはプロトン化するかまたはは
NG−トシル、NG−ニトロ、NG−アダマンチルオキシカル
ボニルおよびNG−ベンジルオキシカルボニルによって置
換されうる。リジンのε−アミノ官能分の保護にはベン
ジルオキシカルボニル、第３ブチルオキシカルボニル、
メチルスルホエチルオキシカルボニルまたはトシルの使
用が好ましい。AspおよびGlu中のカルボキシル官能分の
保護には例えばメタノール、第３ブタノール、フエノー
ルおよびベンジルアルコールのような脂肪族、芳香族ま
たは芳香脂肪族アルコールでのエステル化を用いるのが
好ましい。システイン中のSH官能分は好ましくはＳ−ベ
ンジルまたはＳ−アルキルスルフエニルとして保護され
る。チロシン、セリンおよびスレオニン中のヒドロキシ
官能分の保護にはベンジルまたは第３ブチルを用いるエ
ーテル化が好ましい。
ジメトキシベンズヒドリルおよび４，４′−ジメチルベ
ンズヒドリルの使用が好ましい。His中のイミダゾール
官能分の保護にはベンジルオキシカルボニルアミノ−2,
2,2−トリフルオロエチル（ZTE）、第３ブチルオキシカ
ルボニルおよびトシルの使用が好ましい。アルギニンの
グアニジノ官能分の保護にはプロトン化するかまたはは
NG−トシル、NG−ニトロ、NG−アダマンチルオキシカル
ボニルおよびNG−ベンジルオキシカルボニルによって置
換されうる。リジンのε−アミノ官能分の保護にはベン
ジルオキシカルボニル、第３ブチルオキシカルボニル、
メチルスルホエチルオキシカルボニルまたはトシルの使
用が好ましい。AspおよびGlu中のカルボキシル官能分の
保護には例えばメタノール、第３ブタノール、フエノー
ルおよびベンジルアルコールのような脂肪族、芳香族ま
たは芳香脂肪族アルコールでのエステル化を用いるのが
好ましい。システイン中のSH官能分は好ましくはＳ−ベ
ンジルまたはＳ−アルキルスルフエニルとして保護され
る。チロシン、セリンおよびスレオニン中のヒドロキシ
官能分の保護にはベンジルまたは第３ブチルを用いるエ
ーテル化が好ましい。
本発明による基質の親規性はｐ−ニトロアニリド基の誘
導体形成にある。これら新規な誘導体の分光測光的性質
はその４−ニトロアニリンのそれと相異しないかまたは
極めてわずかしか相異しない。
導体形成にある。これら新規な誘導体の分光測光的性質
はその４−ニトロアニリンのそれと相異しないかまたは
極めてわずかしか相異しない。
本発明による新規な化合物は酵素基質として使用する場
合に非特異性の欠点を全く示さないかまたは現在技術水
準の基質よりはるかに少ない程度にしか示さない。新規
な基質は色原体基、この場合４−ニトロアニリンの誘導
体形成において卓越している。種々の置換基を導入する
ことにより発色団の占める立体的空間が強く変化され
る。このことが特定の酵素、特にトロンビン、プラズミ
ン、カリクレイン、第Ｘａ因子、ウロキナーゼおよびC1
−エステラーゼにおける多大なる特異性の取得を生ず
る。
合に非特異性の欠点を全く示さないかまたは現在技術水
準の基質よりはるかに少ない程度にしか示さない。新規
な基質は色原体基、この場合４−ニトロアニリンの誘導
体形成において卓越している。種々の置換基を導入する
ことにより発色団の占める立体的空間が強く変化され
る。このことが特定の酵素、特にトロンビン、プラズミ
ン、カリクレイン、第Ｘａ因子、ウロキナーゼおよびC1
−エステラーゼにおける多大なる特異性の取得を生ず
る。
本発明はさらに、一般式III Ｘ−Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ （III） （式中、Ｘ、ＡおよびＰは前記した意味を有しそしてOH
ははヒドロキシ基であるがしかしＸは水素原子ではなく
そしてアミノ酸側鎖中の付加的な官能基は保護基で置換
されているものとする）を有するペプチド誘導体を一般
式IV （式中、Ｂは前記の意味を有するがしかしアミノ酸の側
鎖中の付加的な官能基は保護基で置換されておりそして
Ｒは一般式IIに示された定義を有する）を有するアミノ
酸誘導体と縮合させることからなる式IIを有する化合物
の製法にも関する。次に保護基を場合により解裂除去す
る。
ははヒドロキシ基であるがしかしＸは水素原子ではなく
そしてアミノ酸側鎖中の付加的な官能基は保護基で置換
されているものとする）を有するペプチド誘導体を一般
式IV （式中、Ｂは前記の意味を有するがしかしアミノ酸の側
鎖中の付加的な官能基は保護基で置換されておりそして
Ｒは一般式IIに示された定義を有する）を有するアミノ
酸誘導体と縮合させることからなる式IIを有する化合物
の製法にも関する。次に保護基を場合により解裂除去す
る。
縮合にはペプチド化学に慣用の方法、例えばアジド法、
混合無水法または活性化エステル（トリクロロフエニル
エステル、ペンタクロロフエニルエステル、ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、ニトロフエニルエステル）法
が使用される。場合により「CHem.Ber.」第１０３巻第
７８８頁（１９７０年）の記載によりヒドロキシベンゾ
トリアゾールを添加してカルボジイミド法を使用するの
が好ましい。
混合無水法または活性化エステル（トリクロロフエニル
エステル、ペンタクロロフエニルエステル、ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、ニトロフエニルエステル）法
が使用される。場合により「CHem.Ber.」第１０３巻第
７８８頁（１９７０年）の記載によりヒドロキシベンゾ
トリアゾールを添加してカルボジイミド法を使用するの
が好ましい。
本発明で使用される５−アミノ−２−ニトロ安息香酸誘
導体（ANBS誘導体）は既知のエステル化およびアミド形
成反応により入手しうる。ANBSエステルの好都合な製法
はチオニルクロリド、三塩化燐または五塩化燐を用いる
酸クロリド法である。相当するアルコールと共にチオニ
ルクロリドを使用するのが好ましい。ANBSエステルは大
抵クロロホルムまたは酢酸エチルエステル中に溶解す
る。
導体（ANBS誘導体）は既知のエステル化およびアミド形
成反応により入手しうる。ANBSエステルの好都合な製法
はチオニルクロリド、三塩化燐または五塩化燐を用いる
酸クロリド法である。相当するアルコールと共にチオニ
ルクロリドを使用するのが好ましい。ANBSエステルは大
抵クロロホルムまたは酢酸エチルエステル中に溶解す
る。
ANBSアミド、ANBSアミノ酸エステル、ANBSアミノ酸アミ
ドおよびANBSジメチルアミノアルキルアミドの好ましい
製法はペプチド化学に慣用の方法による縮合、例えば混
合無水物法、酸クロリド法またはカルボジイミド法によ
る縮合である。ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加し
たカルボジイミド法を用いるのが好ましい。生成物は酢
酸エチルエステル中に部分的にしか溶解しないが、かか
ししばしばその中で再結晶することにより精製されう
る。ANBS中の遊離アミノ基の保護は必要でない。
ドおよびANBSジメチルアミノアルキルアミドの好ましい
製法はペプチド化学に慣用の方法による縮合、例えば混
合無水物法、酸クロリド法またはカルボジイミド法によ
る縮合である。ヒドロキシベンゾトリアゾールを添加し
たカルボジイミド法を用いるのが好ましい。生成物は酢
酸エチルエステル中に部分的にしか溶解しないが、かか
ししばしばその中で再結晶することにより精製されう
る。ANBS中の遊離アミノ基の保護は必要でない。
ANBS誘導体と一般式II中においてもＢで表示されるアミ
ノ酸の１種との反応はANBS誘導体のイソシアネートを経
て遂行される。同様にアミノ酸誘導体はアジド法または
オキシ塩化燐法により活性化されうる。オキシ塩化燐法
を用いるのが好ましい。アミノ酸のカルボキシル基に至
るまですべての官能基はペプチド化学に慣用の保護基で
保護されるべきである。アルギニンのグアニジノ官能分
の保護にはプロトン化されうる。
ノ酸の１種との反応はANBS誘導体のイソシアネートを経
て遂行される。同様にアミノ酸誘導体はアジド法または
オキシ塩化燐法により活性化されうる。オキシ塩化燐法
を用いるのが好ましい。アミノ酸のカルボキシル基に至
るまですべての官能基はペプチド化学に慣用の保護基で
保護されるべきである。アルギニンのグアニジノ官能分
の保護にはプロトン化されうる。
本発明はさらにプロテイナーゼの証明および測定のため
の本発明による化合物の使用にも関する。プロテイナー
ゼを作用させることによりＢと４−ニトロアニリド誘導
体との間の結合が解裂され、それにより発色団ニトロア
ニリン誘導体が生じ、これが測光的に測定されうる。
の本発明による化合物の使用にも関する。プロテイナー
ゼを作用させることによりＢと４−ニトロアニリド誘導
体との間の結合が解裂され、それにより発色団ニトロア
ニリン誘導体が生じ、これが測光的に測定されうる。
酵素の証明および測定のために一般式IIの化合物を使用
することは特に本発明の目的とするものである。
することは特に本発明の目的とするものである。
加水分解的にに作用する酵素の測定法は、その中の酵素
を測定すべき溶液に式IIの化合物を加えそして加水分解
的に作用する酵素の活性についての直接的な尺度である
解離されたニトロアニリン誘導体の量またはその形成速
度を測定することを特徴とする。
を測定すべき溶液に式IIの化合物を加えそして加水分解
的に作用する酵素の活性についての直接的な尺度である
解離されたニトロアニリン誘導体の量またはその形成速
度を測定することを特徴とする。
下記第１表には本発明による化合物および式IIIおよびI
Vによるそれらの出発発物質の例ならびに最後の反応段
階（数字は第IX表のあとの「新規化合物の製造」を参照
されたい）が記載される。
Vによるそれらの出発発物質の例ならびに最後の反応段
階（数字は第IX表のあとの「新規化合物の製造」を参照
されたい）が記載される。
式IIIのペプチド誘導体は「Houben-Weyl」第XV／１＋２
巻および「The PePtides」第１巻（1979年）による既
知製法により調製された。
巻および「The PePtides」第１巻（1979年）による既
知製法により調製された。
一般式IVの色原体アミノ酸誘導体の調製は以下に記載す
る。
る。
すべての新規化合物は元素分析、アミノ酸分析および薄
層クロマトグラフィーにより特性化された。化学的純度
は種々の溶媒混合物中での薄層クロマトグラフィーによ
り確認された。ラセミ化は「Ｊ．Chromatogr.Sci.」第
１５巻第174頁（1977年）の記載により「Chirasil-Val
」で被覆したガラス毛管カラム上でのガスクロマトグ
ラフィーにより検査しそして常に２％以下であった。
層クロマトグラフィーにより特性化された。化学的純度
は種々の溶媒混合物中での薄層クロマトグラフィーによ
り確認された。ラセミ化は「Ｊ．Chromatogr.Sci.」第
１５巻第174頁（1977年）の記載により「Chirasil-Val
」で被覆したガラス毛管カラム上でのガスクロマトグ
ラフィーにより検査しそして常に２％以下であった。
以下の第II表ないし第IX表には酵素測定の結果を示す。
これらは特に現在の技術水準による化合物と比較した新
規な化合物の利点を示す。
これらは特に現在の技術水準による化合物と比較した新
規な化合物の利点を示す。
酵素についての濃度記載は使用された原溶液に基く。こ
れら原溶液は試験においては緩衝液で１：１０の割合で
希釈される。緩衝液のＰＨ値は相当する酵素の活性にあ
る。
れら原溶液は試験においては緩衝液で１：１０の割合で
希釈される。緩衝液のＰＨ値は相当する酵素の活性にあ
る。
使用されたすべての酵素はトリプシンを除いてベーリン
グウエルケ社の製品である。トリプシンはＳｅｒｖａ社
から得られる。活性剤はヒトプラズミノーゲンとストレ
プトキナゼとの1:1複合物である。
グウエルケ社の製品である。トリプシンはＳｅｒｖａ社
から得られる。活性剤はヒトプラズミノーゲンとストレ
プトキナゼとの1:1複合物である。
ヒトのクエン酸塩血漿を燐脂質およびカルシウムの不存
在下に硫酸デキストランで活性化すると、プロテアーゼ
第XII因子、第XI因子ならびに血漿カリクレインのみが
活性化される。この試験システムにおいて商業上入手し
うるトロンビン基質を本発明によるトロンビン用基質と
比較すると、従来技術による基質は新規な基質の数倍の
速度で解裂されることが示される。
在下に硫酸デキストランで活性化すると、プロテアーゼ
第XII因子、第XI因子ならびに血漿カリクレインのみが
活性化される。この試験システムにおいて商業上入手し
うるトロンビン基質を本発明によるトロンビン用基質と
比較すると、従来技術による基質は新規な基質の数倍の
速度で解裂されることが示される。
第IV〜第IX表は従来技術水準による基質および本発明に
よる化合物のいくつかの種々の蛋白分解酵素による解裂
速度の比較を示す。これらの表から本発明による酵素基
質の優越性が明らかである。すなわち所定の酵素に対す
る個々の基質の感度は充分でありそして従来技術水準の
基質におけると同じ程度である。血漿中に同様に存在し
うる他のプロテアーゼに対する本発明による化合物の感
受性の無さはペプチド−ANBS誘導体中における置換基の
種類および大きさに応じて増大する。従って酵素試験に
本発明の新規な化合物を使用する場合には測定エラーは
減少されるかまたは排除されさえする。
よる化合物のいくつかの種々の蛋白分解酵素による解裂
速度の比較を示す。これらの表から本発明による酵素基
質の優越性が明らかである。すなわち所定の酵素に対す
る個々の基質の感度は充分でありそして従来技術水準の
基質におけると同じ程度である。血漿中に同様に存在し
うる他のプロテアーゼに対する本発明による化合物の感
受性の無さはペプチド−ANBS誘導体中における置換基の
種類および大きさに応じて増大する。従って酵素試験に
本発明の新規な化合物を使用する場合には測定エラーは
減少されるかまたは排除されさえする。
新規化合物の製造 第Ｉ表に掲げられた新規化合物の合成においては個々の
反応段階はすべて同様の方法で実施された。各合成段階
に対して一般的記述をあげる。
反応段階はすべて同様の方法で実施された。各合成段階
に対して一般的記述をあげる。
１．色原体ANBSエステル の合成 ａ）相当するアルコール１モルに−５℃で水分を排除し
てチオニルクロライド7.９ml（0.１１モル）を加えた。
この溶液中に−５℃ANBS18.2ｇ（0.１モル）を加えた。
添加終了後、徐々に５０℃まで加温しそしてこの温度で
４時間撹拌した。溶媒を真空下に留去しそして油状の残
留物をクロロホルム中に溶解させた。有機相を1M KTCO
3、水、５％クエン酸として再び水で洗浄した。Na2SO4
で乾燥した。過後溶媒を真空下に留去した。生成物は
適当な溶媒から再結晶するかまたはシリカゲルクロマト
グラフィーにより精製できた。収量は約６０％であっ
た。
てチオニルクロライド7.９ml（0.１１モル）を加えた。
この溶液中に−５℃ANBS18.2ｇ（0.１モル）を加えた。
添加終了後、徐々に５０℃まで加温しそしてこの温度で
４時間撹拌した。溶媒を真空下に留去しそして油状の残
留物をクロロホルム中に溶解させた。有機相を1M KTCO
3、水、５％クエン酸として再び水で洗浄した。Na2SO4
で乾燥した。過後溶媒を真空下に留去した。生成物は
適当な溶媒から再結晶するかまたはシリカゲルクロマト
グラフィーにより精製できた。収量は約６０％であっ
た。
ｂ）炭素原子６個またはそれ以下の脂肪族アルコールま
たは炭素原子７個またはそれ以下の芳香脂肪族アルコ
ル、ならびに前記した反応条件下に安定であるフエノー
ルまたはナフトールのようなアルコールのようなチオニ
ルクロライドに対するその反応性が低いアルコールをカ
リウム塩に変換した。ANBS0.１モルおよびHOBt0.１モル
をDMF１００ml中に溶解させそしてDMF１００ml中のDCCI
0.1モルの溶液を３０分間で滴下した。室温で１時間撹
拌後、相当するカリウムアルコラート0.１モルを加えそ
して室温で１６時間撹拌した。後処理は前記のようにし
て実施した。収量は約４０％であった。
たは炭素原子７個またはそれ以下の芳香脂肪族アルコ
ル、ならびに前記した反応条件下に安定であるフエノー
ルまたはナフトールのようなアルコールのようなチオニ
ルクロライドに対するその反応性が低いアルコールをカ
リウム塩に変換した。ANBS0.１モルおよびHOBt0.１モル
をDMF１００ml中に溶解させそしてDMF１００ml中のDCCI
0.1モルの溶液を３０分間で滴下した。室温で１時間撹
拌後、相当するカリウムアルコラート0.１モルを加えそ
して室温で１６時間撹拌した。後処理は前記のようにし
て実施した。収量は約４０％であった。
２．色原体ANBS−アミド（ CONH−（CH2）ｎ−Ｎ（CH3）２、CO-Y-OR1、CO-Y-NR
2R3）の合成 ５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ANBS）18.２ｇ（１
００ミリモル）およびHOBt×H2O15.3ｇ（１００ミリモ
ル）をDMF１００ml中に溶解させそしてDMF１００ml中の
DCCI20.6ｇ（１００ミリモル）の溶液を３０分間かけて
滴下した。室温で１時間撹拌後アミン成分0.１モルを加
えた。アミン成分がその塩として存在する場合はNMM0.
１モルを補足して加えた。室温で１６時間撹拌後析出し
たDCHを過しそして溶媒を真空下に除去した。残る油
状の残留物をEE中に溶解させてして５％（w/v）クエン
酸、水、1M KHCO3溶液そして水で数回ずつ洗った。Na2S
O4で乾燥後溶媒を真空下に留去した。結晶性の生成物を
適当な溶媒から再結晶した。収量は約８０〜９０％であ
った。
2R3）の合成 ５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ANBS）18.２ｇ（１
００ミリモル）およびHOBt×H2O15.3ｇ（１００ミリモ
ル）をDMF１００ml中に溶解させそしてDMF１００ml中の
DCCI20.6ｇ（１００ミリモル）の溶液を３０分間かけて
滴下した。室温で１時間撹拌後アミン成分0.１モルを加
えた。アミン成分がその塩として存在する場合はNMM0.
１モルを補足して加えた。室温で１６時間撹拌後析出し
たDCHを過しそして溶媒を真空下に除去した。残る油
状の残留物をEE中に溶解させてして５％（w/v）クエン
酸、水、1M KHCO3溶液そして水で数回ずつ洗った。Na2S
O4で乾燥後溶媒を真空下に留去した。結晶性の生成物を
適当な溶媒から再結晶した。収量は約８０〜９０％であ
った。
３．色原体２−アルコキシ−pNA−誘導体 の合成 ２−アミノ−５−ニトロフエノール7.７ｇ（５０ミリモ
ル）をアセトン１００ml中に溶解させ、窒素で気体を一
掃してそしてK2CO37.０ｇ（５０ミリモル）およびアル
キルブロマイド５０ミリモルを加えた。これを撹拌下に
８時間還流煮沸した。０℃に冷却後過しそして溶媒を
真空下に留去した。残留物をエーテル中に溶解させそし
てPE（４０／６０）で結晶化させた。収量は約５０％で
あった。
ル）をアセトン１００ml中に溶解させ、窒素で気体を一
掃してそしてK2CO37.０ｇ（５０ミリモル）およびアル
キルブロマイド５０ミリモルを加えた。これを撹拌下に
８時間還流煮沸した。０℃に冷却後過しそして溶媒を
真空下に留去した。残留物をエーテル中に溶解させそし
てPE（４０／６０）で結晶化させた。収量は約５０％で
あった。
４．色原体成分のカップリング Nα，NG−保護されたアルギニンまたはNα，Nω−保護
されたリジンまたはオルニチン５０ミリモル、前記１、
２または３項記載の色原体アミン５０ミリモルおよびイ
ミダゾール6.８ｇ（100ミリモル）をピリジン２５０ml
中に溶解させそしてこの溶液を−２０℃に冷却した。次
にこの温度に保持してPOCl37.５ml（８０ミリモル）を
滴下した。添加終了後徐々に室温まで加温せしめた。溶
媒を真空下に除去しそして得られる油状物を1M KHCO3中
にとった。水相をEEで３回抽出した。有機相を1M KHCO3
溶液、水、５％クエン酸そして再び水で洗いそしてNa2S
O4で乾燥した。過した後溶媒を留去しそして化合物を
エーテルで結晶化した。収量は約４０〜６０％であっ
た。
されたリジンまたはオルニチン５０ミリモル、前記１、
２または３項記載の色原体アミン５０ミリモルおよびイ
ミダゾール6.８ｇ（100ミリモル）をピリジン２５０ml
中に溶解させそしてこの溶液を−２０℃に冷却した。次
にこの温度に保持してPOCl37.５ml（８０ミリモル）を
滴下した。添加終了後徐々に室温まで加温せしめた。溶
媒を真空下に除去しそして得られる油状物を1M KHCO3中
にとった。水相をEEで３回抽出した。有機相を1M KHCO3
溶液、水、５％クエン酸そして再び水で洗いそしてNa2S
O4で乾燥した。過した後溶媒を留去しそして化合物を
エーテルで結晶化した。収量は約４０〜６０％であっ
た。
５．保護基の解裂 ａ）ベンジルオキシカルボニル基（Z-）の解裂 前記４項記載の保護された色原体アミノ酸誘導体１０ミ
リモルをHAc２０ml中に溶解させそしてHAc中の３３％HB
r３０mlを水分を排除して室温で添加した。室温で４０
分間撹拌後溶媒を真空下に蒸発除去しそして生成物をエ
ーテルで結晶化させた。エーテルで数回洗ったのち物質
を真空下に固体KOHで２０時間乾燥させた。収量は約０
％であった。
リモルをHAc２０ml中に溶解させそしてHAc中の３３％HB
r３０mlを水分を排除して室温で添加した。室温で４０
分間撹拌後溶媒を真空下に蒸発除去しそして生成物をエ
ーテルで結晶化させた。エーテルで数回洗ったのち物質
を真空下に固体KOHで２０時間乾燥させた。収量は約０
％であった。
ｂ）第３ブチルオキシカルボニル基（Boc-）の解裂 前記４項記載の保護された色原体アミノ酸誘導体１０ミ
リモルをHAc中の1.２Ｎ HCl５０ml中に溶解させそして
室温で２０分間撹拌した。溶媒を真空下に除去しそして
生成物をエーテルで結晶化させた。エーテルで数回洗っ
たのち物質を真空下に固体KOHで２０時間乾燥した。収
量は約９５％であった。
リモルをHAc中の1.２Ｎ HCl５０ml中に溶解させそして
室温で２０分間撹拌した。溶媒を真空下に除去しそして
生成物をエーテルで結晶化させた。エーテルで数回洗っ
たのち物質を真空下に固体KOHで２０時間乾燥した。収
量は約９５％であった。
６．カップリング反応 その末端カルボキシル基が遊離である保護されたジ−ま
たはトリ−ペプチド誘導体５ミリモルをDMF２０ml中に
溶解させそして０℃でDCCI５ミリモルおよびHOBt５ミリ
モルを加えた。０℃で３０分間撹拌後室温まで加温しそ
して前記５ａまたは５ｂ項記載の色原体アミノ酸誘導体
５ミリモルならびにNMM5.５ミリモルを加えた。室温で
１６時間撹拌後DCHを去しそして溶媒を真空下に蒸発
させた。黄色の残留物をMeOH中に溶解させそして「セフ
アデックス（Sephadex ）」LH−20のカラムでクロマト
グラフィーした。純粋な物質のフラクションを合しそし
て溶媒を真空下に除去した。得られた無定形の固体物質
をエーテルでで数回洗いそして真空下にP4O10で乾燥し
た。収量はは約７０％であった。
たはトリ−ペプチド誘導体５ミリモルをDMF２０ml中に
溶解させそして０℃でDCCI５ミリモルおよびHOBt５ミリ
モルを加えた。０℃で３０分間撹拌後室温まで加温しそ
して前記５ａまたは５ｂ項記載の色原体アミノ酸誘導体
５ミリモルならびにNMM5.５ミリモルを加えた。室温で
１６時間撹拌後DCHを去しそして溶媒を真空下に蒸発
させた。黄色の残留物をMeOH中に溶解させそして「セフ
アデックス（Sephadex ）」LH−20のカラムでクロマト
グラフィーした。純粋な物質のフラクションを合しそし
て溶媒を真空下に除去した。得られた無定形の固体物質
をエーテルでで数回洗いそして真空下にP4O10で乾燥し
た。収量はは約７０％であった。
７．保護基の解裂 ａ）CluおよびAspの側鎖中における第３ブチルオキシカ
ルボニル基（Boc）および場合により第３ブチルエステ
ル基の解裂 保護された色原体ペプチド誘導体２ミリモルを1.２Ｎ
HCl/HAc３０ml中に溶解させそして室温で２０分間撹拌
した。溶媒を真空下に除去しそして生成物をエーテルで
結晶化した。エーテルで数回洗ったのち物質を高真空下
に固体KOHで乾燥した。
ルボニル基（Boc）および場合により第３ブチルエステ
ル基の解裂 保護された色原体ペプチド誘導体２ミリモルを1.２Ｎ
HCl/HAc３０ml中に溶解させそして室温で２０分間撹拌
した。溶媒を真空下に除去しそして生成物をエーテルで
結晶化した。エーテルで数回洗ったのち物質を高真空下
に固体KOHで乾燥した。
ｂ）ベンジルオキシカルボニル基(Z)の解裂 保護された色原体ペプチド誘導体２ミリモルをHAc１０m
l中に溶解させそしてHAc中の３３％HBr１５mlを水分を
排除して室温で添加した。室温で１時間撹拌後溶媒を真
空下に蒸発させそして生成物をエーテルで結晶化させ
た。エーテルで数回洗ったのち物質を水に溶解させ、イ
オン交換体を用いて塩酸塩に変換しそして凍結乾燥し
た。
l中に溶解させそしてHAc中の３３％HBr１５mlを水分を
排除して室温で添加した。室温で１時間撹拌後溶媒を真
空下に蒸発させそして生成物をエーテルで結晶化させ
た。エーテルで数回洗ったのち物質を水に溶解させ、イ
オン交換体を用いて塩酸塩に変換しそして凍結乾燥し
た。
ｃ）すべての保護基の解裂 保護された色原体ペプチド誘導体２ミリモルをアニソー
ル1.０mlの存在下HF１０ml中に溶解させそして０℃で１
時間撹拌した。HFを乾燥窒素気流を用いて除去しそして
物質を固体KOH上高真空下に乾燥した。生成物を数回エ
ーテルで洗い、水中に溶解させ、イオン交換体を用いて
塩酸塩に変換しそして凍結乾燥した。
ル1.０mlの存在下HF１０ml中に溶解させそして０℃で１
時間撹拌した。HFを乾燥窒素気流を用いて除去しそして
物質を固体KOH上高真空下に乾燥した。生成物を数回エ
ーテルで洗い、水中に溶解させ、イオン交換体を用いて
塩酸塩に変換しそして凍結乾燥した。
前記第II表〜第IX表に示された一般式IIを有する化合物
の元素分析値を示すと次のとおりである。
の元素分析値を示すと次のとおりである。
新規化合物を酵素および抑制剤の測定に使用した例を以
下に掲げる。
下に掲げる。
例 １ トロンビン測定 基質：H-D-Phe-Pro-Arg-ANBS-ネオペンチルアミド 試験混合物： 生理的NaCl溶液で予め１：５１に希釈した血漿20μを
活性化試薬（下記参照）５００μと３７℃で４分間培
養した。次に基質溶液（３ミリモル／）１００μを
添加しそして△E／分を４０５nmで測光的に定測した。
標準物としては標準ヒト血漿で得られた基準曲線が使用
された。
活性化試薬（下記参照）５００μと３７℃で４分間培
養した。次に基質溶液（３ミリモル／）１００μを
添加しそして△E／分を４０５nmで測光的に定測した。
標準物としては標準ヒト血漿で得られた基準曲線が使用
された。
活性化試験： ベーリングウエルケ社製品であるPTT試薬（部分的トロ
ンビン時間測定用試薬）を規定に従い蒸留水中に溶解さ
せそしてRVV（Russel viper venom、Sigma社製品）５
０μｇ／ml、トリス５０ミリモル／、NaCl７５ミリモ
ル／、Ca 7.５ミリモル／およびヒトアルブミン0.
１ｇ／１００mlを含有する溶液を用いて1:4希釈した。
ンビン時間測定用試薬）を規定に従い蒸留水中に溶解さ
せそしてRVV（Russel viper venom、Sigma社製品）５
０μｇ／ml、トリス５０ミリモル／、NaCl７５ミリモ
ル／、Ca 7.５ミリモル／およびヒトアルブミン0.
１ｇ／１００mlを含有する溶液を用いて1:4希釈した。
例 ２ アンチトロンビンIII測定 基質：H-D-Phe-Pro-Arg-ANBG-Ile-メチルエステル 試験混合物： 生理的Nacl溶液で予め１：５１に希釈した血漿５０μ
をヒトα−トロンビン溶液（0.３IU／ml、トリス１００
ミリモル／、NaCl１００ミリモル／、ＰＨ＝8.２）
1.０mlと共に３７℃で５分間予め培養した。次に基質溶
液（２ミリモル／）１００μを添加しそして△E／
分を４０５nmで測定した。標準物としては標準ヒト血漿
で得られた基準曲線が用いられた。
をヒトα−トロンビン溶液（0.３IU／ml、トリス１００
ミリモル／、NaCl１００ミリモル／、ＰＨ＝8.２）
1.０mlと共に３７℃で５分間予め培養した。次に基質溶
液（２ミリモル／）１００μを添加しそして△E／
分を４０５nmで測定した。標準物としては標準ヒト血漿
で得られた基準曲線が用いられた。
例 ３ プラズミノーゲン測定 基質：H-D-Val-Leu-Lys-ANBS-メチルエステル 試験混合物： 血漿２０μをストレプトキナーゼ試薬（Fibr1000Ｅ／
ml、KH2Po4１００ミリモル／、NaCl１００ミリモル／
、ＰＨ＝7.２）1.０mlと３７℃で１０分間培養した。
次に基質試薬（３ミリモル／）１００μを添加しそ
して△E／分を４０５nmで測光測定した。標準物として
は標準ヒト血漿で得られた基準曲線が用いられた。
ml、KH2Po4１００ミリモル／、NaCl１００ミリモル／
、ＰＨ＝7.２）1.０mlと３７℃で１０分間培養した。
次に基質試薬（３ミリモル／）１００μを添加しそ
して△E／分を４０５nmで測光測定した。標準物として
は標準ヒト血漿で得られた基準曲線が用いられた。
例 ４ α２−アンチプラズミン測定 基質：H-D-Val-LeuLys-ANBS-メチルアミド 試験混合物： ａ）血漿２０μをプラズミン（ヒト）試薬（CTA0.１
Ｕ／ml、KH2PO4１００ミリモル／、NaCl１５０ミリモ
ル／、グリセリン２５％、ＰＨ＝7.２）1.０mlと３７
℃で１分間予め培養した。次に基質試薬（３ミリモル／
）１００μを添加しそして△E／分を４０５nmで測
光測定した。標準物としては標準ヒト血漿で得られた基
準曲線が用いられた。
Ｕ／ml、KH2PO4１００ミリモル／、NaCl１５０ミリモ
ル／、グリセリン２５％、ＰＨ＝7.２）1.０mlと３７
℃で１分間予め培養した。次に基質試薬（３ミリモル／
）１００μを添加しそして△E／分を４０５nmで測
光測定した。標準物としては標準ヒト血漿で得られた基
準曲線が用いられた。
ｂ）血漿２０μを基質試薬（0.３ミリモル／、KH2P
O4１００ミリモル／、NaCl１５０ミリモル／、ＰＨ
＝7.２）1.０mlおよびプラズミン試薬（CTA１Ｉ／ml、
グリセリン２５〜５０％、HCl２ミリモル／、ＰＨ＝
2.５）１００μと３７℃で混合した。１分後に△E／
分を測定した。標準物として標準ヒト血漿で得られた基
準曲線が用いられた。
O4１００ミリモル／、NaCl１５０ミリモル／、ＰＨ
＝7.２）1.０mlおよびプラズミン試薬（CTA１Ｉ／ml、
グリセリン２５〜５０％、HCl２ミリモル／、ＰＨ＝
2.５）１００μと３７℃で混合した。１分後に△E／
分を測定した。標準物として標準ヒト血漿で得られた基
準曲線が用いられた。
例 ５ 第Ｘａ因子測定 基質：Z-D-Leu-Gly-Arg-2-メトキシ-pNA 試験混合物： 血漿２０μを活性化試薬１mlと３７℃で１分間予め培
養した。次に基質試薬（３ミリモル／）１００μを
添加しそして△E／分を測定した。標準物としては標準
ヒト血漿で得られた基準曲線が用いられた。
養した。次に基質試薬（３ミリモル／）１００μを
添加しそして△E／分を測定した。標準物としては標準
ヒト血漿で得られた基準曲線が用いられた。
活性化試薬： RVV２５μｇ／ml、トリス５０ミリモル／、CaCl2２５
ミリモル／、NaCl２００ミリモル／、ＰＨ8.３。
ミリモル／、NaCl２００ミリモル／、ＰＨ8.３。
例 ６ プレカリクレイン測定 基質：H-D-Pro-Phe-Arg-ANBS-イソプロピルアミド 試験混合物： 血漿１０μを活性化試薬１mlと３７℃で１分間培養し
た。次に基質試薬（３ミリモル／）１００μを添加
しそして△E／分を測定した。標準物としては標準ヒト
血漿で得られた基準曲線が用いられた。
た。次に基質試薬（３ミリモル／）１００μを添加
しそして△E／分を測定した。標準物としては標準ヒト
血漿で得られた基準曲線が用いられた。
光学的に透明なベーリングウエルケ社PTT試薬を規定に
従い蒸留水中に溶解させそして蒸留水で１：６に希釈し
た。トリス５０ミリモル／、NaCl１２ミリモル／
（ＰＨ＝7.８）の溶液を用いてさらに１：９に希釈し
た。
従い蒸留水中に溶解させそして蒸留水で１：６に希釈し
た。トリス５０ミリモル／、NaCl１２ミリモル／
（ＰＨ＝7.８）の溶液を用いてさらに１：９に希釈し
た。
例 ７ ウロキナーゼ測定 基質：Pyr-Gly-Arg-ANBS-ベンジルアミド 試験混合物： ウロキナーゼ（１００〜３０００ＩＵ／ml）１０μに
トリエタノールアミン緩衝液（トリエタノールアミン
（THA）0.１モル／、NaCl0.２ミリモル／、ＰＨ＝
8.４）１mlおよび基質試薬（２ミリモル／）１mlを３
７℃で加えそして次に△E／分を測定した。基準曲線を
用いて評価した。尿中のウロキナーゼ測定 尿５００μにトリエタノールアミン緩衝液（THA0.５
ミリモル／、NaCl１モル／、ＰＨ＝8.４）５００μ
および基質試薬（２ミリモル／）0.１mlを加えそし
て△E／分を測定した。基準曲線を用い評価を行った。
トリエタノールアミン緩衝液（トリエタノールアミン
（THA）0.１モル／、NaCl0.２ミリモル／、ＰＨ＝
8.４）１mlおよび基質試薬（２ミリモル／）１mlを３
７℃で加えそして次に△E／分を測定した。基準曲線を
用いて評価した。尿中のウロキナーゼ測定 尿５００μにトリエタノールアミン緩衝液（THA0.５
ミリモル／、NaCl１モル／、ＰＨ＝8.４）５００μ
および基質試薬（２ミリモル／）0.１mlを加えそし
て△E／分を測定した。基準曲線を用い評価を行った。
例 ８ C1不活性化剤測定 基質：H-D-Val-Leu-Arg-2-ブトキシ-pNA 試験混合物： 血漿２０μをC1−エステラゼ試薬（１０mU/ml、NaH2P
O4１００ミリモル／、NaN30.０５％、ヘマクセル（Ha
emaccel）0.２％、ＰＨ＝7.５）１mlと３０で１５分間
培養した。次に基質試薬（６ミリモル／）１００μ
を加えそして△E／分を４０５nmで測光測定した。標準
物としては標準ヒト血漿で得られた基準曲線が用いられ
た。
O4１００ミリモル／、NaN30.０５％、ヘマクセル（Ha
emaccel）0.２％、ＰＨ＝7.５）１mlと３０で１５分間
培養した。次に基質試薬（６ミリモル／）１００μ
を加えそして△E／分を４０５nmで測光測定した。標準
物としては標準ヒト血漿で得られた基準曲線が用いられ
た。
Claims (4)
- 【請求項１】下記の一般式（II）を有する化合物または
その酸付加塩からなるプロテアーゼの検出および測定用
色原体基質。 式中、Ｘは水素原子、ペプチド化学に慣用の保護基また
は末端アミノ基を不可逆的に保護する基であり、Ａはそ
の側鎖機能が遊離であるかまたは置換されてありうるAl
a、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pr
o、Pyr、Thr、TyrおよびValからなる群から選択される
アミノ酸であり、Ｃは結合であるかまたはその側鎖官能
分が遊離であるかまたは置換されていてもよいAla、As
p、Glu、Gly、Leu、Lys、SerおよびValからなる群から
選択されるアミノ酸であり、Ｄはその側鎖官能分が遊離
であるかまたは置換されていてもよいAla、Asp、Glu、G
ly、His、Leu、Phe、Pip、Pro、Ser、Thr、TyrおよびVa
lからなる群から選択されるアミノ酸であり、ＢはＬ−
アルギニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ホ
モリジン、Ｌ−オルニチンまたはＬ−ヒスチジンであ
り、そしてＲは４−ニトロアニリンの３位におけるCOOR
1、CONR2R3、CONH−（CH2）ｎ−Ｎ（CH3）２、ＣＯ−Ｙ
−OR1またはＣＯ−Ｙ−NR2R3であるかまたは２位におけ
るOR1であり、ここでR1は１〜６個の炭素原子を有する
脂肪族炭化水素基、６または10個の炭素原子を有する芳
香脂肪族炭化水素基、７〜11個の炭素原子を有する芳香
族炭化水素基または３〜８個の炭素原子を有する脂環式
炭化水素基であり、R2は水素原子であるかまたはR1で定
義されたと同じ基であり、R3は１〜10個の炭素原子を有
する脂肪族炭化水素基、６または10個の炭素原子を有す
る芳香族炭化水素基、７〜11個の炭素原子を有する芳香
脂肪族炭化水素基たは３〜８個の炭素原子を有する脂環
式炭化水素基であり、Ｙはその側鎖官能分が遊離である
かまたは置換されていてもよいAla、Asn、Asp、β−Al
a、γ−But、Cys、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Ar
g、Phe、Pro、Ser、Thr、TyrおよびValからなる群から
選択されるα−、β−またはγ−アミノ酸であり、そし
てｎは１〜10である。 - 【請求項２】化合物（II）において、Ａが偏光アミノ酸
であり、Ｘは水素原子である場合はＤ−形であることか
らなる前記特許請求の範囲第１項記載の色原体基質。 - 【請求項３】化合物（II）において、Ｘは水素原子、ベ
ンジルオキシカルボニル、第３ブチルオキシカルボニ
ル、アダマンチルオキシカルボニル、メチルスルホエチ
ルオキシカルボニルまたは９−フルオレニルメチルオキ
シカルボニルであるかまたはR4-CO-基（ここでR4は１〜
３個のハロゲン原子で置換されていることができる１〜
６個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基であるかまた
は６〜10個の炭素原子を有するアルカリール基であるか
またはベンゼンスルホニル基であるかまたは７〜10個の
炭素原子を有するアルカリールスルホニル基である）で
ありそしてＡ、Ｃ、Ｄ、ＢおよびＲは前記特許請求の範
囲第１項に定義されたとおりであることからなる前記特
許請求の範囲第１項記載の色原体基質。 - 【請求項４】化合物（II）において、Ｘはホルミル、ア
セチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、トルエン
スルホニル、メシル、メトキシベンゼンスルホニル、ス
クシノイルまたははマレオイルでありそしてＡ、Ｃ、
Ｄ、ＢおよびＲは前記特許請求の範囲第１項に定義され
たとおりであることからなる前記特許請求の範囲第１項
記載の色原体基質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3244030.8 | 1982-11-27 | ||
| DE19823244030 DE3244030A1 (de) | 1982-11-27 | 1982-11-27 | Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59106446A JPS59106446A (ja) | 1984-06-20 |
| JPH0616719B2 true JPH0616719B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=6179281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58220822A Expired - Lifetime JPH0616719B2 (ja) | 1982-11-27 | 1983-11-25 | 酵素の検出および測定用色原体基質 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4508644A (ja) |
| EP (1) | EP0110306B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0616719B2 (ja) |
| AT (1) | ATE51627T1 (ja) |
| AU (1) | AU563001B2 (ja) |
| CA (1) | CA1268299A (ja) |
| DE (2) | DE3244030A1 (ja) |
| DK (1) | DK171136B1 (ja) |
| ES (1) | ES8407014A1 (ja) |
| IE (1) | IE56344B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ206394A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DE3244030A1 (de) * | 1982-11-27 | 1984-05-30 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
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| DE3413311A1 (de) * | 1984-04-09 | 1985-10-17 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Reagenz zur bestimmung der thromboplastinzeit |
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| JPS62126196A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-06-08 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なα１−アンチトリプシン測定用化合物 |
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| SE461494B (sv) * | 1986-03-21 | 1990-02-19 | Thorsman & Co Ab | Faestanordning foer en elektrisk kopplingsdosa |
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