JPH10313896A - マトリックスメタロプロテアーゼに対する発色団又は蛍光団を有する新規な活性測定用合成基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 マトリックスメタロプロテアーゼのスクリー
ニングに必要な，迅速，簡便，高感度かつ多処理可能な
マトリックスメタロプロテアーゼの活性を測定する方法
を開発すること，及びその測定に用いることが出来る新
規な合成基質を提供すること。 【解決手段】下記式（Ｉ）で示される新規な合成基質。 （Ｎ末端）Ｚ−Ｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃ−Ｙ（Ｃ末端）
（Ｉ） （但し，ＺはＮ末端の保護基を，Ｙは発色団又は蛍光団
を，Ｂはアミノペプチダーゼで消化され難いアミノ酸残
基を少なくとも１つ含むペプチド残基を，Ｃはアミノペ
プチダーゼで消化され難いアミノ酸残基以外のアミノ酸
残基からなるペプチド残基を表す。） 並びに上記合成基質に対する，マトリックスメタロプロ
テアーゼ及びアミノペプチダーゼによる二重消化工程を
含むマトリックスメタロプロテアーゼの活性を測定する
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，細胞外マトリック
スの分解に関与する，マトリックスメタロプロテアーゼ
（ＭＭＰ）によって切断をうける新規な合成基質，及び
該合成基質を用いたＭＭＰの活性を測定する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭ
Ｐと略す）は主として細胞外マトリックスを分解する酵
素群であり，これまで１６種のサブタイプの存在が確認
されている。生理的には組織の代謝修復に寄与する酵素
であり，発生の諸段階や，生殖サイクルでその役割が重
要視されている。しかし，病的状態ではその発現が増大
し，種々の組織破壊を誘因する，特にＴｙｐｅ ＩＶコ
ラーゲンが主成分である基底膜の破壊にはゼラチナーゼ
系のＭＭＰが関与し，ガン細胞の浸潤や血管平滑筋細胞
の遊走が招来される。従ってＭＭＰ活性の増大が関与す
る疾患は非常に多岐に渡っており，慢性リウマチ関節
炎，変形性関節症，各種ガン細胞の転移，動脈硬化や経
皮的血管再建術（ＰＴＣＡ）での血管内膜肥厚，歯周病
での歯肉破壊，角膜潰瘍，大動脈瘤破綻，不安定狭心症
でのソフトプラークの破綻等が挙げられる。特に昨今老
齢人口の増大と共にその治療法の確立が望まれている変
形性関節症においてはＭＭＰはその軟骨破壊の主たる原
因酵素であることが知られている。変形性関節症は，関
節軟骨の変性を基盤とした非炎症性の疾患で，非可逆性
で緩徐な進行性の慢性疾患である。関節軟骨は大きくわ
けて軟骨細胞と軟骨マトリックスから成り，軟骨マトリ
ックスの内訳はコラーゲン繊維（Ｔｙｐｅ ＩＩが８０
〜９０％，他Ｔｙｐｅ ＩＸ，ＸＩ）とプロテオグリカ
ン（アグリカン）（コンドロイチン硫酸とケラタン硫
酸）である。コラーゲンの網目状ネットワークの中にプ
ロテオグリカンが封じ込められた構造をとることにより
衝撃吸収性や粘弾性を発揮する。

【０００３】変性性関節症は，この軟骨マトリックスの
ＭＭＰによる分解及び変性に起因しており，老齢化の進
む中，日本では４００万人の患者がいると言われてい
る。しかしながら，現在まで原因療法薬が存在せず，対
症療法薬として鎮痛薬が用いられている。従って，その
治療が臨床上の重大な問題となっており，その原因療法
薬の創製が切望されている。ＭＭＰには幾つかの種類が
あるが，その標的分子としてはＴｙｐｅ ＩＩコラーゲ
ン繊維が考えられている。ＭＭＰは天然の基質の特異的
な配列，即ちＰｒｏ−（Gly or Leu）−Ｇｌｙ−↓−Ｌ
ｅｕ (or Ile）の切断面の両側のＧｌｙとＬｅｕ（or I
le）を認識する［W. H. Johnson, Advances in the dia
gnosis and treatment of osteoarthritis (1993)］。
ＭＭＰにより切断されたコラーゲン繊維は，長期の間に
衝撃吸収性が低下し，非可逆的な変性をきたすと考えら
れている。通常ＭＭＰはＴＩＭＰ（tissue inhibitor o
f metalloproteinase）により，組織内での制御を受け
ている［R. Khokhar et al., Invasion Metastasis ９,
391-405 (1989)］。変形性関節症患者ではＭＭＰの発
現量がＴＩＭＰの発現量を上回るため，結果的に軟骨破
壊が進行することとなる。このようにＭＭＰは細胞外マ
トリックスを分解する酵素群であり，その活性の増大が
変形性関節症をはじめとする前記のような疾患に関与し
ており，ＭＭＰの活性を阻害する物質は，これらの疾患
の治療剤となり得るものと期待されている。例えば，前
記のようにＭＭＰはコラーゲン繊維を切断することによ
り変形性関節症の発症に大きく関与している事から，Ｍ
ＭＰ阻害剤は変形性関節症治療薬の有力な治療剤の一つ
と考えられている。以上のような状況から，変形性関節
症治療薬をはじめとする，ＭＭＰの活性増大が関与する
疾患の治療薬となりうる化合物を見出すためにＭＭＰの
阻害活性を測定することによるＭＭＰ阻害剤のスクリー
ニングが行われつつある。

【０００４】ところで，ＭＭＰ阻害剤をスクリーニング
するための活性測定法としては，従来から以下のような
方法が用いられている。 （１）コラーゲン等の天然物由来の配列を有する基質を
蛍光ラベルして，分解による蛍光強度の低下によりＭＭ
Ｐ活性の阻害能を測定する方法（Y. Nagai et al., Jp
n. J. Inflamm. ４, 123-130 (1984)）。 （２）切断部位を含み，分子内に蛍光団と消光団を併せ
持ち，目的の酵素による切断を受け蛍光団と消光団が分
離して初めて蛍光を発する合成基質（分子内消光型蛍光
合成基質）により，ＭＭＰ活性の阻害能を測定する方
法。この代表的な基質としては，ＭＣＡ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ₂
が挙げられる。ここでＭＣＡは蛍光団，Ｄｐａは消光団
であり，Ｇｌｙ−Ｌｅｕ間がＭＭＰで切断されることに
より蛍光を発し，その蛍光活性を測定することによりＭ
ＭＰ活性の阻害能を測定する方法である（L．niedzwiec
ki etal.，Biochemistry 31，12618-12623 (1992)，C.
G. Knight et al.，FEBS．296，263-266 (1992)）。 いずれの測定法においても，化合物自体が測定波長に自
家蛍光や消光作用を持つものは活性の測定が不可能であ
り，事実これらの測定波長（励起波長／蛍光波長；２９
０ｎｍ／３１５ｎｍ，３２８ｎｍ／３９３ｎｍ）では，
全化合物の約１割が自家蛍光若しくは消光作用を持つ事
から，全ての化合物をスクリーニングすることは不可能
であった。従って，従来の方法では，すべての被験化合
物を短時間で大量にアッセイして，これらの阻害活性を
測定する，いわゆるハイスループットスクリーニング
（High Throughput Screening）を行うことができなか
った。一方，本発明で用いた二段階法の手法については
古くから知られており，基質のＣ末端に蛍光団［例えば
７−アミノ−４−メチルクマリン（７−amino−４−met
hyl−coumarin）／以下「ＡＭＣ」と略称／なお，ペプ
チド又はアミノ酸と共有結合した場合は「ＭＣＡ」（４
−methyl−coumarine−７−yl−amido）と略称；７−ア
ミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（７−amino−
４−trifluoromethyl−coumarin）／以下「ＡＦＣ」と
略称／なお，前記と同様の場合は４−トリフルオロメチ
ルクマリン−７−イルアミド（４−trifluoromethyl−c
oumarine−７−yl−amido）；β−ナフチルアミン（β
−naphthylamine）／以下「βＮＡ」と略称／なお，前
記と同様の場合はβ−ナフチルアミド（β−naphthylam
ido)］や発色団［例えばパラニトロアニリン（para−ni
troaniline］／以下「ｐＮＡ」と略称／なお，同様にパ
ラニトロアニリド（para−nitroanilido）を付加した合
成基質を作製し，活性を測定したい酵素で切断したのち
（１次消化），その消化物を過剰量のアミノペプチダー
ゼ（以下「ＡＰ」と略称）で消化し（２次消化），遊離
する蛍光団又は発色団の量から１次消化物の量を測定す
る方法である。こうした基質を利用してレニンや大腸菌
リーダーペプチダーゼ等の酵素活性が測定されている
［A. Reinhaiz and M. Roth, European J. Biochem.,
7, 334-339 (1969)：K. Murakami et al., Anal. Bioch
em., 110, 232-239 (1981)：D. Kuo etal., Biochemist
ry, 33, 8347-8354 (1994)］。しかし，従来の二段階法
は基本的に，活性を測定したい酵素の切断部位を含む天
然の配列を含む基質を利用していた。また，ＭＭＰの活
性測定に二段階法基質を適用したという報告もなかっ
た。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は，ＭＭＰ阻害
剤のスクリーニングに必要な，迅速，簡便，高感度かつ
多処理可能な（High throughput）ＭＭＰのアッセイ系
を開発すること，特に核アッセイ系に用いられる新規な
合成基質を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは，二段階法
に着目し，鋭意努力し合成基質及びアッセイ系の改良を
行い，迅速，簡便，高感度かつ多処理可能なＭＭＰの新
規活性測定系を完成させた。即ち，本発明は，下記式
（Ｉ）で示される合成基質， （Ｎ末端）Ｚ−Ｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃ−Ｙ（Ｃ末端） （Ｉ） （但し，ＺはＮ末端の保護基を，Ｙは発色団又は蛍光団
を，Ｂはアミノペプチダーゼで消化され難いアミノ酸残
基を少なくとも１つ含むペプチド残基を，Ｃはアミノペ
プチダーゼで消化され難いアミノ酸残基以外のアミノ酸
残基からなるペプチド残基を表す。）に関する。また，
本発明は，前記合成基質に対するマトリックスメタロプ
ロテアーゼ及びアミノペプチダーゼによる二重消化工程
を含むマトリックスメタロプロテアーゼの活性を測定す
る方法に関するものである。以下，本発明につき詳述す
る。コラーゲンのポリプロテイン上の切断部位は既に報
告されている（M. S. Stack et al., Journal of Biolo
gical Chemistry, 264, 4277-4281 (1989)）。Ｐ３位の
Ｐｒｏ，Ｐ１位のＧｌｙ，Ｐ１’位のＬｅｕ又はＩｌ
ｅ，Ｐ２’位のＡｌａ又はＬｅｕの保存性が指摘されて
いる（advances in the diagnos is an treatment at o
steo arthritis. W. H. Johnson et al.,（1993)）（プ
ロテアーゼの基質中のアミノ酸残基を，切断点からＮ末
端に向かいＰ１，Ｐ２，Ｐ３・・・と，またＣ末端に向
かいＰ１’，Ｐ２’，Ｐ３’・・・と呼ぶ）。即ち，キ
モトリプシン，トリプシン，エラスターゼ等のセリンプ
ロテアーゼとは異なり，切断点よりＣ末側の配列も基質
認識に重要であると思われる。よって，切断点のＮ末側
の配列（例えばＰ４〜Ｐ１）のみを用いた基質，例えば
「Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ」なるアミノ酸配列
を有するペプチドのＣ末端に発色団を共有結合させた基
質」等はＭＭＰの基質としては適さないと考えられる。

【０００７】そこで，本発明者等は，Ｐ１’以下のＣ末
端側の配列について検討した。まず，二段階法基質を設
計するにあたって，本活性測定系においては簡便さの点
からＭＭＰとアミノペプチダーゼＭ（以下ＡＰＭと略称
する）は同一緩衝液中で反応することが好ましいことか
ら，ＭＭＰの至適緩衝液中に於いてＡＰＭの基質特異性
を検討した。その結果Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ａｒｇ
は極めて消化されやすいが，Ｔｙｒ，Ｇｌｙ，Ｐｈｅは
やや消化され難く，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，
Ｐｒｏは消化されにくいことがわかった。そこでＡＰＭ
で消化されやすいアミノ酸配列を考慮しＭＭＰとＡＰＭ
の両者の基質特異性を同時に満足するようＰ１’〜Ｐ
４’の改変を行った。その結果，Ｐ１’にＬｅｕを，Ｐ
２’以降にＡＰＭで消化されるアミノ酸残基からなるペ
プチド残基を採用することで，ＭＭＰで切断され，かつ
そのＣ末端側の切断断片がＡＰＭで消化可能な基質を見
い出した。次に，通常二段階法基質においては，１次消
化で未消化だった基質もアミノペプチダーゼによる２次
消化で分解され発色する可能性があるので，Ｎ末端のア
ミノ基をアセチル基，サクシニル基，Ｆｍｏｃ等で保護
を行った。更に本発明者らは，ＭＭＰ切断点よりＮ末側
にＡＰＭで消化されにくいＡｓｐ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｐ
ｒｏ及びＶａｌなどのアミノ酸残基を少なくとも１つ含
ませる事で，ＭＭＰにより分解したＣ末端側切断断片が
ＡＰＭによって２次消化される時間内に，未消化基質が
ＡＰＭで発色することはないことを確認した。そして，
基質のＣ末端にＡＭＣ等を付加した発色性及び蛍光性の
合成基質を用いれば，高感度かつ簡便にＭＭＰの活性測
定が可能であることを確認し（実施例参照），本発明を
完成した。

【０００８】即ち，本発明の合成基質は，ＭＭＰで切断
されやすく，また，ＭＭＰの切断部位からＮ末端側はア
ミノペプチダーゼで消化されにくくＣ末端側は消化され
やすいという，二段階法によるＭＭＰの活性測定に最も
適したペプチドを新たに設計し，該設計に基づく合成基
質を提供した点に最大の特長があり，従来の天然の配列
由来基質又は切断部位を含む合成基質を蛍光ラベルした
測定法とはその基本的な設計思想を異にしている。そし
て，上記特長によって，短時間で大量の化合物をアッセ
イする多処理可能なスクリーニング（High Throughput
Screening）が可能となった。また，本発明の蛍光基質
を用いることにより，ＭＭＰの検出感度が格段に上昇す
ると期待される。本発明の語句につき詳述する。「アミ
ノ酸」とは，同一分子内にカルボキシル基とアミノ基を
有する化合物を意味し，またプロリンのようなイミノ酸
もアミノ酸に含まれる。天然型及び非天然型も包含され
る（生化学辞典，東京化学同人，第２版，５８−６９，
１４６８−１４７４（１９９２）及び有機化学・生化学
命名法（下），南江堂，改訂第２版，５９−８２（１９
８９））。また，本発明において，合成基質の末端に存
在するアミノ酸も本定義に含まれる。具体的には，アラ
ニン（Ａｌａ），アルギニン（Ａｒｇ），アスパラギン
（Ａｓｎ），アスパラギン酸（Ａｓｐ），システイン
（Ｃｙｓ），グルタミン（Ｇｌｎ），グルタミン酸（Ｇ
ｌｕ），グリシン（Ｇｌｙ），ヒスチジン（Ｈｉｓ），
イソロイシン（Ｉｌｅ），ロイシン（Ｌｅｕ），リジン
（Ｌｙｓ），メチオニン（Ｍｅｔ），フェニルアラニン
（Ｐｈｅ），プロリン（Ｐｒｏ），セリン（Ｓｅｒ），
スレオニン（Ｔｈｒ），トリプトファン（Ｔｒｐ），チ
ロシン（Ｔｙｒ），バリン（Ｖａｌ），β−アラニン
（βＡｌａ），２−アミノ酪酸（Ａｂｕ），α−アミノ
イソブチリック酸（Ａｉｂ），α−アミノスベリック酸
（Ａｓｕ），４−クロロフェニルアラニン，シトルリン
（Ｃｉｔ），β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ），
３，４−デヒドロプロリン，２−，３−若しくは４−フ
ルオロフェニルアラニン，ホモセリン（ｈＳｅｒ），ヒ
ドロキシプロリン（Ｈｙｐ），β−ヒドロキシバリン，
４−ニトロフェニルアラニン，ノルロイシン（Ｎｌ
ｅ），ノルバリン（Ｎｖａ），オルニチン（Ｏｒｎ），
ペニシラミン（Ｐｅｎ），フェニルグリシン（Ｐｈ
ｇ），ピログルタミン，ザルコシン（Ｓａｒ），β−
（２−チェニル）アラニン（Ｔｈｉ），ピペコリン酸
（Ｐｉｐ），ナフチルアラニン，プロパルギルグリシン
（Ｐｒａ）等である。

【０００９】「アミノ酸残基」とはタンパク質又はペプ
チドの構成単位でペプチド結合を形成する際に除かれた
水素原子及び水酸基以外の上記アミノ酸部分の総称であ
る（日経バイオ最新用語辞典，日経バイオテク，第４
版，２３（１９９５）又は生化学辞典，東京化学同人，
第２版，６１−６２（１９９２）等参照）。「ペプチ
ド」とは，２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって
結合したものを意味する。また，「ペプチド残基」と
は，前記ペプチドの両末端のアミノ酸の一方若しくは両
方が，更にペプチド結合をとるために水素原子又は水酸
基が除かれたアミノ酸残基となっている基を意味する。
ＺのＮ末端の保護基とは，合成基質の分野でＮ末端のア
ミノ基の保護基として用いられる基であって，ＭＭＰに
よる基質の切断を阻害しないものであればいずれでもよ
く，具体的にはアセチル基，サクシニル基，Ｆｍｏｃ等
の基を意味する。好ましくはアセチル基及びサクシニル
基であり，特に好ましくはアセチル基である。Ｂの「ア
ミノペプチダーゼで消化され難いアミノ酸残基を少なく
とも１つ含むペプチド残基」とは，アミノペプチダーゼ
で消化され難いアミノ酸残基，具体的には，Ｉｌｅ，Ｖ
ａｌ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ及びＰｒｏ等のアミノペプチダー
ゼで消化され難いアミノ酸残基を少なくとも１つ含むペ
プチド残基である。Ｂがアミノペプチダーゼで消化され
難いアミノ酸残基を１つ有することにより，Ａ−Ｂの領
域内に存在するペプチド結合の少なくとも１つがアミノ
ペプチダーゼで消化され難くなり，ＭＭＰ未消化基質が
アミノペプチダーゼで発色し測定に影響を与えることを
防ぐことが出来る。このペプチド残基の長さは特に制限
されないが，好ましくはアミノ酸２〜５個からなり，よ
り好ましくはアミノ酸３個からなるものである。また，
基質の水溶性を増大させる点から，Ｎ末端がＬｙｓ，Ａ
ｒｇ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ等の親水性アミノ酸残基であるペ
プチド残基が好ましい。

【００１０】Ｃの「アミノペプチダーゼで消化され難い
アミノ酸残基以外のアミノ酸残基からなるペプチド残
基」とは，前記「アミノペプチダーゼで消化され難いア
ミノ酸残基」を含まないペプチド残基であり，従って，
Ｌｅｕ−Ｃ−Ｙの領域にあるペプチド結合はいずれもア
ミノペプチダーゼで消化されるものである。Ｃの「アミ
ノペプチダーゼで消化され難いアミノ酸残基以外のアミ
ノ酸残基からなるペプチド残基」の具体例としては，前
記，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ及びＰｒｏ等のア
ミノペプチダーゼで消化され難いアミノ酸残基を除くア
ミノ酸残基，例えば，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ａｒ
ｇ，Ｔｙｒ，Ｇｌｙ，Ｐｈｅ等のアミノ酸残基からなる
ペプチド残基が挙げられる。このペプチド残基の長さは
特に制限されないが，好ましくはアミノ酸２〜４個から
なり，より好ましくはアミノ酸３個からなるものであ
る。「発色団又は蛍光団」とは，従来，セリンプロテア
ーゼ，チオールプロテアーゼ又はアミノペプチダーゼ等
の活性測定に用いられているものであり，本発明の目的
を達成するいかなる発色団又は蛍光団をも意味し，具体
的には，本発明基質内で結合している状態では蛍光性又
は発光性を有さず，アミノペプチダーゼで消化されて遊
離された際に蛍光性又は発光性を有する基を意味し，更
に具体的には，ｐＮＡ，ＡＭＣ，ＡＦＣ又はβＮＡが挙
げられる。好ましくはＡＭＣである。本発明において，
ＭＭＰで切断を受けるアミノ酸配列に特に制限はない
が，効率良い切断のためには，好ましくはＰ４〜Ｐ４’
までの長さを持つとよい。Ｐ４〜Ｐ４’の配列として
は，コラーゲンをベースにした配列（M. S. Stack et a
l., Journal of Biological Chemistry, 264, 4277-428
1 (1989)）又はサブスタンスＰをベースにした配列（L.
Niedzwiecki et al., Biochemistry, 31, 12618-23 (1
992)）が挙げられる。より具体的には，Ｐ４はＬｙｓ，
Ａｒｇ，Ｇｌｎ，又はＡｓｎ，Ｐ３はＰｒｏ，Ａｓｐ，
Ｉｌｅ，Ｓｅｒ又はＶａｌ，Ｐ２はＧｌｎ又はＬｅｕが
好ましい。Ｐ２’はＰｈｅ又はＴｒｐ，Ｐ３’〜Ｐ４’
はＭｅｔ，Ａｒｇ，Ａｌａ又はＬｅｕであることが好ま
しい。

【００１１】好ましい基質の例として，例えば「Ｓｕｃ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ａｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡ」又は「Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−
ＭＣＡ」（配列番号：１）を挙げることができる。一般
に，本発明において使用される基質は，下記の実施例
（Ｖ）に記載の条件において，ＭＭＰによる切断率が２
０％以上のものが好適であるが，より好ましくは４０％
以上のもの，更に好ましくは６０％以上のものが用いら
れる。本発明の合成ペプチド基質は，「泉屋信夫等，ペ
プチド合成の基礎と実験（１９８５），丸善」，「Nova
biochem 社製のペプチド合成マニュアル（１９９
４）」，「矢島治明監修，ペプチド合成（続医薬品の開
発１４），広川書店（１９９１）」，「M. Bodanszky,
Peptide Chemistry, A Practical Textbook, Springer-
Verlag, Berlin (1988)」等を参考に合成することがで
きる。発色団又は蛍光団を含有する合成基質の製造法と
しては，常法により行われる。例えば「K. Murakami et
al., Anal. Biochem., 110, 232-239 (1981)」，「A.
Reinharz & M.Roth, European J. Biochem., 7, 334-33
9 (1969)」，「O. Kuo et al., Biochemistry, 33, 834
7-8354」，「Konig W. & R. Geiger, Chem. Ber., 103,
788-798 (1970)」，「T. Morita et al., J. Biochemi
stry, 82, 1495-1498 (1977)」，「M. Zimmerman et a
l., Anal. Biochem., 78, 41-51 (1977)」等の方法を参
考にして行われる。例えば，本発明の合成基質の製造法
として，液相法又は固相法による方法，またペプチドの
合成法であるアジド法，酸クロライド法，酸無水物法，
混合酸無水物法，Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド法，活性エステル法，カルボニルジイミダゾール
法，酸化還元法等が挙げられる。固相法によってペプチ
ドを合成するに当たっては，優れたペプチド自動合成
機，例えばアプライド・バイオシステム社製のペプチド
自動合成機４３０Ａ等が市販されており，このような装
置の標準的運転プログラムに従って行えばよい。なお，
本発明の合成基質の製法として現在市販品装置の適用の
みに限定されるものではない。

【００１２】このようにして得られた合成基質は，精製
するか，又はそのままで用いられる。単離・精製は，常
法で行われ，例えば抽出，分配，再沈澱，再結晶，又は
カラムクロマトグラフィー等によって行われる。本発明
はまた，本発明の合成基質に対するＭＭＰ及びアミノペ
プチダーゼによる二重消化工程を含むＭＭＰの活性を測
定する方法に関する。本発明に用いられるアミノペプチ
ダーゼはＭＭＰ消化により生じたＣ末断片を消化し発色
団又は蛍光団を遊離出来るものであれば何でも良いが，
好ましくはロイシンアミノペプチダーゼ；ＥＣ３．４．
１１．２が良い。更に好ましくはブタ腎臓のマイクロソ
ーム由来のＡＰＭが良い。また，酵素反応を行う際に使
用する緩衝液のｐＨは５．０から１０．０の範囲であれ
ばよく，好ましくは７．０から９．０である。塩化ナト
リウムは無添加であるか，又は２００ｍＭ以下の範囲で
あればよい。塩化カルシウムは無添加であるか，又は１
０ｍＭ以下の範囲であればよい。反応温度は１０から５
０℃の範囲であればよく，好ましくは２５から３７℃で
ある。２つのプロテアーゼによる消化は同一の９６穴プ
レート上で行うことが可能であり，そのまま吸光度又は
蛍光強度を測定できることから，大量のサンプルの測定
を迅速に行うことができる。ＡＰＭはＭＭＰ消化後添加
してもよいが，ＭＭＰと同時に添加しても良い。本発明
のＭＣＡ基質では，酵素濃度，基質濃度はそれぞれ終濃
度０．５〜５μｇ／ｍｌ，１〜２０μＭで充分である。
ＭＭＰは生体内では前駆体（ｐｒｏ体）で存在してお
り，トリプシンを添加することによりその活性を発現す
ることが報告されている（A．Sellers et al.，Bioche
m，J．167，353-360）。ＭＭＰの活性を測定する場合は
通常本法に従いｐｒｏＭＭＰを活性化して用いることが
行われている。本発明者等は活性化ＭＭＰの反応性を向
上させる為に検討を重ねた結果，反応液にウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）や免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）等の蛋
白質類を添加することにより，ＭＭＰ活性が格段に向上
する事を見出した。これは，これらの蛋白質類の添加に
より活性化ＭＭＰの安定性が良くなりＭＭＰの基質消化
作用が向上するとともに，基質などのプレートへの吸着
が防止されるためではないかと予想する。従って，本発
明のＭＭＰ活性の測定方法において，反応液に蛋白質類
を添加することが好ましい。ここで用いられる蛋白質類
としては，反応液に添加可能な性状（溶解性等）を有
し，ＭＭＰ及びアミノペプチダーゼの活性に悪影響を及
ぼさない物であればいずれでもよく，好ましくは，ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）や免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）等である。特に好ましくはウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）である。使用する蛋白質類の濃度は，選択した蛋
白質類の種類によっても異なるが，ほぼ０．１ｍｇ／ｍ
ｌから１ｍｇ／ｍｌ程度が好ましく，更に好ましくは
０．２５ｍｇ／ｍｌ程度である。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明を以下，実施例により説明
するが，本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。なお，本明細書における化合物の略号は以下の意味
である。「Ｂｏｃ」は三級ブトキシカルボニル（tert．
Butoxycarbonyl），「Ｃｌｔ」はクロロトリチル（Chlo
rotrithyl），「ＤＣＣ」はＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid
e），「ＤＩＥＡ」はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルア
ミン（N, N-diisopropyl ethylamine），「ＤＭＦ」は
ジメチルホルムアミド（Dimethylformamide），「Ｆｍ
ｏｃ」は９−フルオレニルメトキシカルボニル（９−Fl
uorenylmethoxycarbonyl），「ＨＢＴＵ」は２−（１Ｈ
−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，
−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロフォスフェ
ート（２−（１H-Benzotriazole-1-yl）−１，１，３，
３−tetra methyluronium hexafluorophosphate），
「ＨＯＢｔ」はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（N
−Hydroxybenzotriazole），「ｐｍｃ」は２，２，５，
７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（２，
２，５，７，８−pentamethylchroman−６−sulfony
l），「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸（Trifluoroacetic
acid）をそれぞれ表す。また，本明細書において，ア
ミノ酸の１文字表記及び３文字表記は，ＩＵＰＡＣ生化
学命名委員会（ＣＢＮ）の規則に従ったもので，例えば
「生化学辞典（第２版），東京化学同人，１９９０年，
第１４６８頁）」の記載が参照される。

【００１４】

【実施例】ＭＭＰ活性測定のための発色性及び蛍光性合成基質の製
造 （Ｉ）Ａｃ−ＫＰＬＧＬＦＡＲ−ＭＣＡ（以下Ａｃ−Ｍ
ＣＡと略記する）（配列番号：１）の合成（図１に合成
工程を示す） Ａｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（断
片１）（配列番号：３）は，Ｇｌｙ−２−Ｃｌｔレジン
を用いて，Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（断片
２）はＡｌａ−２−Ｃｌｔレジンを用いて常法により以
下のように合成した。なお，断片１については，下記操
作７の後，Ｆｍｏｃを２０％ピペリジン含有ＤＭＦによ
り脱離した後常法によりＮ末端をアセチル化した。 １．レジンをＤＭＦで膨潤させる。 ２．目的のｆ−ｍｏｃアミノ酸（２０ｍｍｏｌ）を２０
ｍｌのＤＭＦに溶かす。 ３．アミノ酸溶液に４０ｍｌのＤＭＦに溶解した０．４
５ＭのＨＢＴＵ／ＨＯＢＴと７ｍｌのＤＩＥＡを加えて
５分間攪拌する ４．３．の産物をレジンに加え１時間攪拌する。 ５．ＤＭＦでレジンを洗浄する。 ６．１００ｍｌの２０％ピペリジン（piperidine）を含
むＤＭＦをレジンに加え２０分間攪拌する。 ７．以上の操作を次に付加するｆ−ｍｏｃアミノ酸を用
いて繰り返す。 保護ペプチドの切り出しは酢酸：ＴＦＥ：ＤＣＭ＝１：
２：７の溶液で１時間処理することにより行った。溶媒
を留去後，エーテルによりペプチドを沈澱させた。

【００１５】Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ（ｐｍ
ｃ）−ＭＣＡ（配列番号：２）の合成は以下の通り行っ
た。 １．断片２（２．５３ｇ），Ａｒｇ（ｐｍｃ）−ＭＣＡ
・ＨＣｌ（３．４０ｇ），ＨＯＢＴ（０．６５ｇ），Ｄ
ＩＰＥＡ（０．７７４ｍｌ）を５０ｍｌのＤＭＦに溶か
す。 ２．ＤＭＦに溶かした１ｇのＤＣＣを０℃で加える。 ３．室温で一晩攪拌した後，ウレアをフィルターで除去
する。 ４．溶媒を留去の後，残渣を３００ｍｌの酢酸エチルに
懸濁する。 ５．０．５Ｎ ＨＣｌ，５％ＮａＨＣＯ₃及び飽和食塩水
でそれぞれ洗浄後，有機溶媒層を回収し，留去する。 ６．残渣に１００ｍｌの２０％ピペリジンを含むＤＭＦ
溶液を加え，２０分処理する。 ７．溶媒を留去の後，エーテルによりペプチドを沈澱さ
せる。 Ａｃ−ＭＣＡの合成は以下の通り行った。 １．断片１（１．４６ｇ）とＬｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−
Ａｒｇ（ｐｍｃ）−ＭＣＡ（２．２５ｇ），ＨＯＢＴ
（０．４ｇ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶かす。 ２．ＤＭＦに溶かした１ｇのＤＣＣを０℃で加える。 ３．室温で６時間攪拌した後，ウレアをフィルターで除
去する。 ４．濾液に１０ｍｌのピペリジンを加える。 ５．２０分処理後，溶媒を留去の後，エーテルによりペ
プチドを沈澱させる。 ６．ペプチドを４０ｍｌの切断溶液（reagent Ｋ）に溶
かし，室温で２時間処理する。 ７．エーテルによりペプチドを沈澱させる。

【００１６】（ＩＩ）Ｓｕｃ−ＫＰＬＧＬＦＡＲ−ＭＣ
Ａ（以下Ｓｕｃ−ＭＣＡと略記する）（配列番号：１）
の合成 Ｎ末端をサクシニル化した以外はＡｃ−ＭＣＡと同様の
方法で行った。 （III）ペプチドの合成と精製 ペプチドは，逆相のＨＰＬＣ（ＯＤＳ−８０Ｔｍ／東ソ
ー社製）により精製した。その際，Ａ液には０．１％Ｔ
ＦＡ含有水溶液，Ｂ液には０．１％ＴＦＡ含有アセトニ
トリルを使用し，分離はＢ液の直線勾配（０〜６０％）
で行った。 （ＩＶ）完成した合成基質の確認 １）マススペクトロメトリー マススペクトロメトリーにより該基質の分子量の確認を
行った。図２に示すようにＡｃ−ＭＣＡ及びＳｕｃ−Ｍ
ＣＡ共に目的の分子量と一致した。また，その純度も高
いものであった。 ２）アミノ酸組成分析 ピコタグワークステーション及びグラジエントシテスム
（共にウォーターズ社製）を用い，ピコタグアミノ酸分
析法により該基質のアミノ酸組成分析を行った。カッコ
内の値は合成基質中に含まれる数を示す。

【００１７】

【表１】 Ａｃ−ＭＣＡ及びＳｕｃ−ＭＣＡは共に，アミノ酸配列
から予想されるアミノ酸組成を有していた。 （Ｖ）ＭＭＰによるＡｃ−ＭＣＡ基質及びＳｕｃ−ＭＣ
Ａ基質の消化の確認 反応はエッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ，black）
を用いて行った。Ａｃ−ＭＣＡ基質はＤＭＳＯ（＝dime
thyl sulfoxide）に溶解し，分注後−２０℃のフリーザ
ーにて保管したものを使用した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ 緩
衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ₂含
有，ｐＨ７．４）に，活性化ＭＭＰ−１（終濃度３．３
μｇ／ｍｌ）及び本発明Ａｃ−ＭＣＡ又はＳｕｃ−ＭＣ
Ａ基質（終濃度１６．７μＭ）を加え１００μｌとし
た。３７℃で６０分間加温し，基質消化を行った後，
０．１％ＴＦＡ溶液を５０μｌ添加して反応を停止し
た。反応停止後，「ｓｍａｒｔ ｓｙｓｔｅｍ」（ファ
ルマシア社）で２５４ｎｍ等の波長の吸光度を測定し
た。測定には逆相のＨＰＬＣ（μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８
ＰＣ３．２／３／ファルマシア社製）を用いた。その際
Ａ液には０．１％ＴＦＡ含有水溶液，Ｂ液には０．１％
ＴＦＡ含有アセトニトリルを使用し，ペプチドの分離は
Ｂ液の直線勾配（０〜６０％）で行い，ピークを確認し
た。その結果，活性化ＭＭＰ−１により，Ａｃ−ＭＣＡ
基質は約１００％，Ｓｕｃ−ＭＣＡ基質は約５０％が消
化されることが確認された。尚，Ｓｕｃ−ＭＣＡ基質
は，活性化ＭＭＰ−１（４０μｇ／ｍｌ）存在下で同様
に処理すると約１００％消化された。

【００１８】（ＶＩ）Ａｃ−ＭＣＡ基質を用いたＭＭＰ
の活性測定 反応は９６穴型プレート（ELISA Plate（black），住友
ベークライト）を用いて行った。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ 緩
衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ₂含有）
にＢＳＡ（シグマ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）を
添加後活性化ＭＭＰ−１（終濃度；０．０１５〜１．５
μｇ／ｍｌ）及び本発明のＡｃ−ＭＣＡ（終濃度１２．
５μＭ）及び過剰量のアミノペプチダーゼ（シグマ社）
（終濃度０．０２５Ｕ）を加え２０μｌとした。３７℃
で１５分，３０分，４５分又は６０分間基質消化を行っ
た。反応終了後消化に伴う蛍光強度の増加をＭＴＰ−３
２マイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡ社）を用い
て励起波長３９０ｎｍ，蛍光波長４６０ｎｍで測定し
た。蛍光強度は基質消化時間に沿って経時的に上昇した
（図４）。更に，６０分間基質消化を行ったときの酵素
濃度依存性を図６に示す。また，アミノペプチダーゼを
添加した時（＋）と，しなかった時（−）の変化（ＭＭ
Ｐ−１ １．５μｇ／ｍｌ）を図５に示す。以上より，
本発明のＡｃ−ＭＣＡ基質とアミノペプチダーゼによる
二重消化を行うことによりＭＭＰの活性を迅速かつ簡便
に測定できることが確認された。 （ＶII）ＭＭＰの活性測定におけるＢＳＡ添加の効果 反応は９６穴型プレート（ELISA Plate（black），住友
ベークライト）を用いて行った。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩
衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ₂含
有）にＢＳＡ（シグマ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍ
ｌ）を添加若しくは未添加のまま，活性化ＭＭＰ−１
（終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌ），過剰量のアミノペ
プチダーゼ（シグマ社）（終濃度０．０２５Ｕ）及び本
発明のＡｃ−ＭＣＡ（終濃度１２．５μＭ）を加え２０
０μｌとした。３７℃で６０分間基質消化を行った後，
消化に伴う蛍光強度の増加をＭＴＰ−３２マクロプレー
トリーダー（ＣＯＲＯＮＡ社）を用いて，励起波長３９
０ｎｍ，蛍光波長４６０ｎｍで測定した。この結果，Ｂ
ＳＡ添加により，ＭＭＰの基質消化作用の増強が認めら
れた（図６）。

【００１９】

【発明の効果】本発明の合成基質を用いてＭＭＰの活性
測定を行うことによって，迅速，簡便かつ高い選択性
で，ＭＭＰの活性測定を行うことができるようになり，
短時間で大量の化合物をアッセイするハイスループット
スクリーニング（High Throughput Screening）が可能
となった。

【００２０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 存在位置：８ 他の特徴：Ａｒｇは発色団である７−アミノ−４−メチ
ルクマリン（ＡＭＣ）に結合している。 配列 Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｒｇ １ ５ 配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ 存在位置：４ 他の情報：Ａｒｇ＝Ａｒｇ（ｐｍｃ） 配列番号：３ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００２１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ａｃ−ＭＣＡ基質の合成工程を示す図であ
る。

【図２】 合成したＡｃ−ＭＣＡ基質及びＳｕｃ−ＭＣ
Ａ基質のマススペクトロメトリーの結果を示す図であ
る。

【図３】 各種濃度のＭＭＰ−１によるＡｃ−ＭＣＡ基
質消化の経時的変化を示す図である。

【図４】 Ａｃ−ＭＣＡ基質消化のＭＭＰ−１濃度依存
性を示す図である。

【図５】 Ａｃ−ＭＣＡ基質消化におけるアミノペプチ
ダーゼの作用を示す図である。

【図６】 ＭＭＰ−１によるＡｃ−ＭＣＡ基質消化にお
けるＢＳＡ添加の影響を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斉藤 茂樹 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 (72)発明者 松本 俊一郎 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 (72)発明者 相部 和彦 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式（Ｉ）で示される合成基質。 （Ｎ末端）Ｚ−Ｂ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃ−Ｙ（Ｃ末端） （Ｉ） （但し，ＺはＮ末端の保護基を，Ｙは発色団又は蛍光団
   を，Ｂはアミノペプチダーゼで消化され難いアミノ酸残
   基を少なくとも１つ含むペプチド残基を，Ｃはアミノペ
   プチダーゼで消化され難いアミノ酸残基以外のアミノ酸
   残基からなるペプチド残基を表す。）
2. 【請求項２】 請求項１記載の合成基質に対するマトリ
   ックスメタロプロテアーゼ及びアミノペプチダーゼによ
   る二重消化工程を含むマトリックスメタロプロテアーゼ
   の活性を測定する方法。