AT405184B - Rekombinantes pockenvirus - Google Patents

Description

AT 405 184 B

Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Pockenvirus und Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das Genprodukte eines Herpesvirus-Gens exprimiert, und Vakzine, die eine schützende Immunität gegen Herpesvirus-Infektionen bereitstellen.

In der Anmeldung wird durch arabische Ziffern in Klammern auf eine Reihe von Publikationen Bezug genommen. Diese Druckschriften werden am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen vollständig zitiert. Diese Referenzen beschreiben den Stand der Technik, auf den sich die Anmeldung bezieht,

Vaccinia-Virus und in jüngerer Zeit andere Pockenviren sind zur Insertion und Expression fremder Gene verwendet worden. In die Basistechnik zur Insertion fremder Gene in ein lebendes infektiöses Pockenvirus ist die Rekombination zwischen Pocken-DNA-Sequenzen, die ein fremdes genetisches Element in einem Donor-Plasmid flankieren, und den im Rettungs-Pocken-virus homologen Sequenzen involviert (28).

Genauer gesagt, werden die rekombinanten Pockenviren in zwei Schritten konstruiert, die im Stand der Technik bekannt und analog zu den Verfahren zur Erzeugung synthetischer Rekombinanten des Vaccinia-Virus sind, die im der US 4,603,112 A beschrieben sind, auf dessen Offenbarungsgehalt hier Bezug genommen wird.

Zuerst wird die DNA-Gensequenz, die in das Virus inseriert werden soll, insbesondere ein offener Leserahmen aus einer Nicht-Pocken-Quelle, in eine E. coli-Plasmidkonstruktion gebracht, in die DNA inseriert worden war, die homolog zu einem Abschnitt nicht essentieller DNA des Pockenvirus ist. Getrennt davon wird die DNA-Gensequenz, die inseriert werden soll, mit einem Promotor ligiert. Die Promotor-Gen-Verbindung liegt so in der Plasmidkonstruktion, daß sie an beiden Enden von DNA flankiert wird, die homolog mit einer DNA-Sequenz ist, die einen Bereich von Pocken-DNA, der einen nicht essentiellen Ort enthält, flankiert. Die resultierende Plasmidkonstruktion wird dann durch Züchten in E_coli-Bakterien vermehrt (11) und isoliert (12, 20).

Zweitens wird eine Zellkultur, z.B. Hühnerembryofibroblasten, mit dem isolierten Plasmid, das die zu inserierende DNA-Sequenz enthält, zusammen mit dem Pockenvirus transfiziert. Rekombination zwischen homologer Pocken-DNA im Plasmid und dem viralen Genom ergibt ein Pockenvirus, das durch das Vorhandensein fremder DNA-Sequenzen in einem nicht essentiellen Bereich seines Genoms modifiziert ist. Der Begriff "fremde" DNA bezeichnet exogene DNA, insbesondere DNA aus einer Nicht-Pocken-Quelle, die Genprodukte codiert, die normalerweise von dem Genom, in das die exogene DNA gebracht wurde, nicht produziert wird.

Genetische Rekombination ist im allgemeinen der Austausch von homologen DNA-Abschnitten zwischen zwei DNA-Strängen. In gewissen Viren kann die DNA durch RNA ersetzt sein. Homologe Nucleinsäu-rebereiche sind Nucleinsäure-(DNA- oder RNA-) Bereiche, die die gleiche Sequenz von Nucleotidbasen aufweisen.

Genetische Rekombination kann natürlicherweise während der Replikation oder der Herstellung neuer viraler Genome in der infizierten Wirtszelle stattfinden. Somit kann die genetische Rekombination zwischen viralen Genen während des viralen Replikationszyklus Vorkommen, der in einer Zelle stattfindet, die mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Viren oder anderen genetischen Konstruktionen co-infiziert ist. Ein DNA-Bereich eines ersten Genoms wird austauschbar zum Konstruieren des Genom-Abschnittes eines zweiten co-infizierenden Virus verwendet, in dem die DNA homolog zu der des ersten viralen Genoms ist.

Rekombination kann aber auch zwischen DNA-Bereichen in unterschiedlichen Genomen stattfinden, die keine perfekte Homologie aufweisen. Wenn ein solcher Abschnitt aus einem ersten Genom homolog mit einem Abschnitt aus einem anderen Genom ist, außer daß im ersten Abschnitt beispielsweise ein genetischer Marker oder ein Gen, das eine antigene Determinante codiert, vorhanden und in einen Teil der homologen DNA inseriert ist, kann Rekombination noch stattfinden, und die Produkte dieser Rekombination lassen sich durch Vorhandensein dieses genetischen Markers oder Gens im rekombinanten viralen Genom nachweisen.

Eine erfolgreiche Expression der inserierten genetischen DNA-Sequenz durch das modifizierte infektiöse Virus erfordert zwei Bedingungen. Erstens muß die Insertion in einem nicht essentiellen Bereich des Virus erfolgen, damit das modifizierte Virus lebensfähig bleibt. Die zweite Bedingung zur Expression der inserierten DNA ist das Vorhandensein eines Promotors in einer geeigneten Beziehung zur inserierten DNA. Der Promotor muß so plaziert sein, daS er stromaufwärts der zu exprimierenden DNA-Sequenz liegt.

Es gibt zwei Subtypen von Pferde-Herpesvirus, die, obwohl sie kreuz-neutralisierende Epitope enthalten, sich durch ihre antigenen Profile, Restriktionsendonuclease-Fingerabdrücke und ihre Pathogenität für Pferde unterscheiden lassen (1). Pferde-Herpesvirus 1 (EHV-1) ist mit Atemwegserkrankungen, Störungen des Zentralnervensystems und klassischen herpesbedingten Fehlgeburten assoziiert, während Pferde-Herpesvirus 4 (EHV-4) vorwiegend mit Atemwegserkrankungen (1,48) assoziiert ist. Pferde-Herpesviren sind Mitglie- 2

AT 405 184 B der der α-Herpesvirus-Subfamilie und zeigen viele der typischen biologischen und biochemischen Eigenschaften menschlicher Herpesviren, wie genomische Isomerisierung, Regulation der Genexpression, Etablierung latenter Infektionen, Erzeugung defekter störender Viruspartikel, Hervorrufen neurologischer Störungen und onkogene Transformation in vitro (1,4,23). Damit läßt sich EHV vorteilhaft zur Untersuchung der verschiedenen biologischen Konsequenzen von Herpesvirus-Infektionen untersuchen.

Durch Herpesvirus-Glykoproteine werden wesentliche virale Funktionen, wie die Anheftung und das Eindringen in die Zelle, das Ausbreiten des Virus von Zelle zu Zelle, und, wichtig, das Festlegen des Pathogenitätsprofils der Infektion, vermittelt. Herpesvirus-Glykoproteine sind entscheidende Bestandteile in der Wechselwirkung mit dem Immunsystem des Wirtes (36,37).

Die gut charakterisierten Glykoproteine von Herpes simplex-Virus schließen gB, gC, gD, gE, gG, gH und gl ein (36,37,49-55). Eine Anzahl von Studien haben die Wichtigkeit von Herpes simplex-Virus-Glykoprotei-nen beim Hervorrufen von Immunantworten gezeigt. Seither ist bekanntgeworden, das gB und gD wichtige Immunantworten hervorrufen können (6,8,13,18,21,22,26,27,30,44,46,47). gC kann die Klasse I einge-scbränkt-cytotoxischer Lymphozyten stimulieren (15,32), wohingegen gD die Klasse II cytotoxischer T-Zell-Antworten stimulieren kann (21,22,44,46,47). Von gG wurde gezeigt, daß es ein Ziel der komplementabhängigen Antikörper-gesteuerten Virusneutralisation ist (38,39). Von einer Anzahl anderer Glykoproteine von anderen Herpesviren ist ebenfalls gezeigt worden, daß sie wichtige Immunantworten hervorrufen (5, 10, 36, 56).

Beide Subtypen von EHV exprimieren sechs in größerer Menge vorhandene Glykoproteine (1,3,43). Die genomischen Teile der gp2, gp10, gp13, gp14, gp17/18 und gp2l/22a codierenden DNA-Sequenzen sind unter Verwendung von \gt11-Expressionsvektoren und monoclonalen Antikörpern bestimmt worden (3). Die Lage der Glykoproteine gp13 und gp14 wurde in denselben Orten innerhalb der L-Komponente des Genoms bestimmt, zu denen gC bzw. gB der Herpes simplex-Viruskarte homolog sind (3). EHV-1, dessen Glykoproteingene so kartiert worden sind, daß fünf seiner sechs Hauptglykoproteine durch Sequenzen innerhalb der L-Komponente des Genoms codiert sind, während nur eine (gp17/18 im Us-Bereich kartiert wurde, scheint unter den α-Herpesviren einzigartig zu sein. Aus der Analyse dieser Ergebnisse wurde vorausgesagt, daß einige der in kleiner Menge vorkommenden im EHV-1 Virion identifizierten Glykoproteine genauso wie noch nicht identifizierte EHV-1-Glykoproteine in der S.Komponente des Genoms kartieren (3). Die Hüll-Glykoproteine sind die Hauptimmunogene der Herpesviren, die sowohl ein Hervorrufen von humoralen als auch zellulären Wirts-Immunantworten eine Rolle spielen (5,8,73-75) und deshalb bei denen höchstes Interesse genießen, die versuchen, Vakzine zu entwickeln. Kürzlich wurde die Nucleotidsequenz der gp13 codierenden Transkriptionseinheit des EHV-1-Stammes Kentucky T431 mitgeteilt (2). Ein offener Leserahmen codiert ein aus 468 Aminosäuren bestehendes primäres Translationsprodukt von 51 kDa. Das Protein hat die charakteristischen Merkmale eines membran-überspannenden Proteins mit neun potentiellen, in der Oberflächendomäne zwischen vermuteten Signalund Transmembran-Anker-Anteilen des Proteins vorhandenen N-verknüpften Glykosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr) (2). Es wurde gezeigt, daß das Glykoprotein homolog mit Herpes simplex-Virus (HSV) gC-1 und gC-2, mit Pseudorabies-Virus (PRV) glll und dem Varicella zoster-Virus (VZV) gpV ist (2). EHV-1 gp13 ist somit das strukturelle Homologe des Herpesvirus gC-artigen Glykoproteins. Kürzlich wurde die Sequenz von EHV-1 gp14 (71,72) mitgeteilt. Eine Analyse der vorhergesagten Aminosäuresequenz des gp14-Glykoproteins ergab eine signifikante Homologie mit dem korrespondierenden Glykoprotein von HSV, gB.

Es wurde gezeigt, daß gegen einige EHV-1-Glykoproteine gerichtete monoclonale Antikörper neutralisierend wirken (76). Passive immunisierungsexperimente zeigten, daß gegen gp13 oder gp14 (77) oder gegen gpl3, gpl4 oder gpl7/18 (78) gerichtete monoclonale Antikörper Hamster gegen eine tödliche Infektion schützen konnten. Andere gB und gC-Glykoproteinanaloge sind ebenfalls in den Schutz gegen durch α-Herpesviren verursachte Krankheiten involviert (8,10,73). Vom EHV-1 gp17/l8-Glykoprotein ist, obwohl als weiteres potentielles schützendes Immunogen charakterisiert, bis jetzt kein weiteres strukturelles Gegenstück unter den verschiedenen von der S-Komponente in den anderen α-Herpesviren codierten Glykoproteinen (66,79,80) bekanntgeworden. Ausgehend von seiner genomischen Lage hat man spekuliert, daß gp17/l8 ein HSV gE-Analog sein könnte (2).

Pseudorabies Virus (PRV), ein α-Herpesvirus, ist der Verursacher von Aujesky’s-Krankheit. Die Krankheit ist hochinfektiös und führt zu ernstzunehmenden ökonomischen Verlusten in der Schweineindustrie. Die Krankheit ist mit einer hohen Morbidität und Mortalität bei Ferkeln assoziiert und ist charakterisiert durch schwere Atemwegskrankheiten, Fehlgeburten, verminderte Größe des Wurfes und herabgesetzten Wachstumsraten der Überlebenden. Eine häufige Konsequenz einer Infektion ist eine tödliche Encephalitis. Latente virale Infektionen, ein Charakteristikum von Herpesviren, können sich etablieren und damit dazu führen, daß gesundete erwachsene Schweine als chronische Virusträger dienen, vgl. Wittmann und Rziha 3

AT 405 184 B (81) bezüglich eines neueren umfassenden Überblicks.

Das PRV-Genom besteht aus einer 90 x 10® Dalton großen doppelsträngigen DNA (82), die durch invertierte, sich wiederholende Sequenzen in allein nicht vorkommende lange (UL) oder allein nicht vorkommende kurze (Us)-Abschnitte unterteilt ist (83,84). Das PRV-Genom codiert ungefähr 100 Polypeptide, deren Expression in einer kaskadeartigen Weise ähnlich der anderer Herpesviren (85,86) reguliert ist. Bis heute hat man gezeigt, daß die fünf Glykoproteine gpl, gpll, gplH. gp63 und gp50 mit der viralen Höhe und mit den verschiedenen membranartigen Strukturen von PRV-infizierten Zellen assoziiert sind (80,86-91). Ein sechstes PRV-codiertes Glykoprotein (gX) wird in das Kulturmedium freigesetzt (92). Die physikalische Lage dieser Glykoproteine im PHV-Genom und ihre DNA-Sequenz sind gegenwärtig bekannt (62,80,91-98). So wie die Glykoproteine anderer Herpesviren üben die PRV-Glykoproteine wesentliche virale Funktionen, wie das zelluläre Anheften und das Einbringen In und die Freisetzung aus den Zellen, aus. Die PRV-Glykoproteine sind für das Pathogenitätsprofil einer PRV-Infektion entscheidend und sind entscheidende Komponenten bei der Entwicklung der Krankheit und des Immunstatus. PRV gpl ist zur Replikation des Virus in vitro und in vivo nicht essentiell und ist bei den meisten attenuierten PRV-Stämmen nicht vorhanden (99). Die attenuierte Natur dieser Stämme, bei denen gl deletiert ist, gibt ebenfalls einen Hinweis auf eine mögliche Rolle von gl für die Virulenz (99,100). Andere PRV-Proteine scheinen jedoch in diese Funktion involviert zu sein, da die alleinige Expression von gl nicht ausreichend ist, um einen hohen Grad an Virulenz zu produzieren (100).

Die Rolle, die gl zum Erzeugen einer Immunantwort gegen PRV spielt, ist unklar. Monoclonale Antikörper gegen gl können in vitro das Virus neutralisieren (101) und immunisierte Mäuse passiv gegen eine letale PRV-Infektion schützen (81). Kost et al. (98) haben kürzlich die Expression von PRV-gpl in Vaccinia-Virus-Rekombinanten sowohl alleine als auch in Assoziation mit gp50 und gp63 beschrieben. Eine intracraniale Inoculation von Vaccinia-Rekombinanten in Mäuse ergab eine gesteigerte Virulenz, besonders dann, wenn PRV-gpl mit der Coexpression von gp50 und gp63 assoziiert war.

Im Schwein werden aber keine gegen gl gerichteten neutralisierenden Antikörper produziert (5). Außerdem schützt ein rekombinantes PRV gl-codierte Polypeptide exprimierendes Vaccinia-Virus (98) Mäuse nicht gegen eine tödliche PRV-Infektion (relativ zu dem durch die Wildtyp Vaccinia-Kontrolle gebotenem Schutz). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, daß sich PRV gpl eher dazu eignet, eine diagnostische Sonde als ein Bestandteil in einem Untereinheits-Vakzin zu sein. Das PRV-Glykoprotein gp63 liegt in Us-Bereich des PRV-Genoms benachbart zu gp50 (80). Die PRV gp63 codierende Sequenz beginnt mit drei aufeinanderfolgenden ATG-Codons ungefähr 20 Nucieotide stromabwärts des Stoppcodons von gp50. Es gibt kein erkennbares Transkriptionssignal-Motiv, und wahrscheinlich wird dasselbe Transkript wie für gp50 translatiert. PRV-gp63 ist in vitro nicht essentiell (88). Wie von Kost et al. (98) beschrieben, wurde PRV gp63 als eine sich fortsetzende DNA-Sequenz von PRV gp50 in Vaccinia-Virus exprimiert. Der Beitrag von PRV gp63 zum Schutz von Mäusen gegen eine PRV-Infektion läßt sich schwer zuordnen, da in den entsprechenden Untersuchungen die Beiträge von PRV gp50 und gp63 nicht voneinander getrennt wurden. Das PRV-Glykoprotein gX ist ein nicht strukturelles Glykoprotein, dessen Endprodukt in die extrazelluläre Flüssigkeit sekretiert wird (85,92). In vitro erhielt man eine Neutralisation von PRV weder mit polyclonalen, noch mit monoclonalen Seren gegen PRV gX (102,103), und Vakzine mit der Untereinheit gX ergaben keinen Schutz gegen einen Angriff (104).

Das PRV-Glykoprotein gp50 ist das gD-Analog von Herpes simplex Virus Typ 1 (HSV-1) (97). Der offene Leserahmen der DNA codiert 402 Aminosäuren (54). Die reife glykosylierte Form (50 bis 60 kDa) enthält O-verknüpfte Kohlenhydrate ohne N-verknüpfte Glykosylierung (95). Schweineserum reagiert mit PRV gp50 stark und legt damit seine Richtigkeit als Immunogen nahe. Monoclonale Antikörper gegen gP50 neutralisieren in vitro die PRV mit oder ohne Komplement (97,105,106) und schützen passiv Mäuse (102,105,106) und Schweine (102). Rekombinante PRV gp50 exprimierende Vaccinia-Viren induzierten serumneutralisierende Antikörper und schützten sowohl Maus als auch Schwein gegen einen tödlichen PRV-Infektion (98, 107, 108).

Das PRV gplll-Gen liegt im UL-Abschnitt des Genoms. Der 1437 bp-offene Leserahmen codiert ein Protein mit 479 Aminosäuren. Das abgeleitete 50,9 kDa-primäre Translationsprodukt besitzt acht potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen (96). PRV glll ist das HSV-1 gC-Analog (96). Ein funktioneller Ersatz von PRV glll durch HSV-1 gC wurde nicht beobachtet (109). Obwohl PRV glll für die Replikation in vitro nicht unabdingbar ist (110,111), ist die reife glykosylierte Form (98 kDa) ein reichlich vorkommender Bestandteil der PRV-Hülle. Monoclonale anti-gplll-Antikörper neutralisieren das Virus in vitro mit oder ohne Komplement (86,106,110) und können passiv Maus und Schwein schützen (102). Das PRV-Glykoprotein glll kann Maus und Schwein nach Immunisierung mit einem Cro/glll-Fusionsprotein gegen eine tödliche PRV-Infektion schützen, wenn es in E.coli exprimiert wird (Robbins, A„ R. Watson, L. Enquist, europäische Patentanmeldung 0 162 738A1) oder wenn es in einer Vaccinia-Rekombinanten exprimiert wird (Panicali, D., 4 ΑΤ 405 184 Β L. Gritz, G. Mazzara, EP 0 261 940A2).

Einer der Hauptbestandteile der PRV-Hülle ist ein Disulfidverknüpfter Komplex von drei Glykoproteinen (120 kDa, 67 kDa und 58 kDaj, der gemäß der Nomenklatur von Hampl (68) als PRV gpll bezeichnet wird. Die PRG gpll codierende DNA-Sequenz liegt am linken Ende von UL. Der offene Leserahmen von 2976 Nucleotiden codiert ein primäres Translationsprodukt mit 913 Aminosäuren oder 110 kDa. PRV gpll ist mit dem HSV-1 gB homolog (62). Es wurde gezeigt, daß gegen PRV gpll gerichtete monoclonale Antikörper das Virus in vitro (5) mit oder ohne Komplement (81) neutralisieren. Ferner zeigten Untersuchungen der passiven Immunisierung, daß die neutralisierenden monoclonalen Antikörper Schweine teilweise schützten, nicht aber in der Lage waren, Mäuse gegen den Angriff eines virulenten Virus zu schützen (102). Bisher ist noch nicht berichtet worden, daS es eine aktive Immunisierung vom Schwein mit PRV gpll Glykoprotein gibt. Während der letzten 20 Jahre hat sich das Auftreten von durch Herpes Simplex-Virus Typ 2 (HSV2) verursachten Genitalinfektionen signifikant erhöht. Neueste Schätzungen geben an, daß in den Vereinigten Staaten 5 bis 20 Millionen Menschen Genitalherpes haben (112). Obwohl gezeigt wurde, daß eine orale Behandlung mit Acyclovir die Schwere der primären Infektionen vermindert (113) und ein erneutes Auftreten verhindert (114), ist die Kontrolle und die Behandlung dieser Infektionen bei weitem nicht ideal. Man benötigt deshalb ein Vakzin, um primäre und wiederkehrende Infektionen zu verhindern.

Das Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSVI)-Genom codiert mindestens acht in ihren antigenen Eigenschaften verschiedene Glykoproteine: gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl und gJ (115). Homologe dieser Gene scheinen in HSV2 vorhanden zu sein (116-119). Da diese Glykoproteine sowohl in der Virion-Hülle als auch in der Plasmamembran der infizierten Zelle vorhanden sind, können sie humorale und zellvermittelte schützende Immunantworten hervorrufen (37), Die relative Wichtigkeit humoraler und zellulärer Immunität beim Schutz gegen Herpes simplex-Virus-lnfektionen ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Mit gereinigten HSV1 gB, gC oder gD immunisierte Mäuse sind gegen einen letalen HSV1-Angriff geschützt (120). Mäuse sind auch gegen einen letalen HSV1- oder HSV2-Angriff durch passive Immunisierung mit Antikörpern gegen GesamtHSVI (121) oder HSV2-(122)-Virus und mit Antikörpern gegen die individuellen HSV2-Glykoproteine gB, gC, gD oder gE (123) geschützt. Dieser Schutz scheint jedoch von der Antwort kompetenter T-Zellen abhängig zu sein, da Tiere, die durch Bestrahlung Cyclophosphamid oder anti-Thymocytenserum immun-supprimiert sind, wurden nicht geschützt (124).

Den Beitrag der individuellen Glykoproteine beim Hervorrufen einer schützenden Immunantwort hat man noch nicht vollständig verstanden. Die Expression dieser Glykoproteine in einem heterologen System wie Vaccinia hat es ermöglicht, daß sich einige dieser Parameter untersuchen lassen. Es wurde z.B. gezeigt, daß Vaccinia-Virus-Vektoren, die HSV1 gB (125) und HSV1 gC (32) exprimieren, als Antworten cytotoxische T-Zellen hervorrufen. Außerdem wurde gezeigt, daS mit rekombinanten Vaccinia-Viren, die entweder HSV1 gB (8), HSV1 gC (126) oder HSV1 gD (26) exprimieren, immunisierte Mäuse gegen einen letalen Angriff von HSV1 geschützt sind. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß ein rekombinantes HSV1 gD-exprimierendes Vaccinia-Virus in einem Meerschweinchen-Modellsystem schützend gegen HSV2 wirkt (44). Man weiß jedoch nicht, ob die Expression multipler HSV-Antigene zu einer Potenzierung dieser Schutzantwort führt.

Rinder-Herpesvirus I (BHV1) ist für eine Reihe von Krankheiten beim Vieh verantwortlich, einschließlich Conjunctivitis, Vulvovaginitis und Fehlgeburt (127). Es ist außerdem eines der wichtigsten Verursacher von Rinderatemwegserkrankungen, wobei es entweder direkt oder als empfindlich machender Faktor für eine bakterielle Infektion wirkt (128). BHV1 spezifiziert mehr als 30 strukturelle Polypeptide, von denen 11 glykosyliert sind (129). Vier dieser Glykoproteine, gl, gll, glll und glV, sind charakterisiert, und man hat gefunden, daß sie mit dem Herpes simplex-Virus (HSV) Glykoproteinen gB, gC, gD und gE homolog sind (130,131).

Es wurde gezeigt, daß Untereinheits-Vakzine, die aus gl, glll und/oder glV bestehen, Vieh vor Krankheiten schützen (bei Verwendung eines BHV1/Pasteurella haemolytica-Aerosol-Belastungsmodells), nicht aber vor Infektion (132). Diese Ergebnisse zeigen die Wichtigkeit dieser Glykoproteine beim Hervorrufen einer erfolgreichen Immunantwort gegen BHV1. gl und glll sind ebenfalls in Vaccinia-Virus cloniert, und es wurde gezeigt, daß mit diesen Rekombinanten immunisiertes Vieh neutralisierende Antikörper gegen BHV1 produziert (56,133).

Katzenrhinotracheitis ist eine allgemeine und weltweit verbreitete Katzenkrankheit, die durch ein a-Herpesvirus verursacht wird, das mit Katzen-Herpesvirus Typ 1 (FHV-1) bezeichnet wird. FHV-1 etabliert, wie andere Herpesviren, eine latente Infektion, die eine periodische Reaktivierung zur Folge hat (134). FHV-1-Infektionen in Brutkolonien sind durch eine hohe Todesrate bei jungen Katzen charakterisiert. Sekundärinfektionen der oberen Atemwege bewirken bei Erwachsenen eine ziemliche Schwächung. Diese Krankheit versucht man zur Zeit durch die Verwendung modifizierter lebender oder inaktivierter Vakzine zu kontrollie- 5

AT 405 184 B ren, die die Entwicklung klinischer Anzeichen unterdrücken können, nicht aber die Infektion verhindern, wodurch es zu einer Virusausscheidung kommt. Daher können vakzinierte Katzen ohne Symptome virulentes Virus verbreiten, und latente Infektionen können nicht vermieden werden durch die existierenden Vakzine (135) oder durch die sich in der Entwicklung befindenden sicheren gereinigten Untereinheits-Vakzine (136,137).

Herpesvirus-Glykoproteine sorgen für die Anheftung des Virions an die Wirtszelle und sind äußerst wichtig für die virale Infektivität (138,139). Sie bestimmen ebenfalls die Sub-Ty pen-Spezifität des Virus (140). Herpesvirus-Glykoprotein-Antigene werden sowohl durch das humorale als auch durch das zelluläre Immunsystem erkannt, und es wurde gezeigt, daß sie schützende Immunantworten in vakzinierten Wirten herbeiführen (44,107,141,142). Es wurde gezeigt, daß FHV-1 mindestens 23 verschiedene Proteine enthält (143,144). Mindestens 5 von ihnen mit angegebenen Molekulargewichten zwischen 120 kDa bis 60 kDa sind glykosyliert (144,145). Es wurde gezeigt, daß die FHV-1 -Glykoproteine immunogen sind (143,145). FHV-1 scheint, wie eine Reihe anderer β-Herpesviren, ein mit dem Glykoprotein B (gB) vom HSV-1 homologes Protein zu besitzen. Eine partielle Sequenz des FHV-1-gB-Gens wurde kürzlich mitgeteilt (146). HSV-1 gB wird für das Hineingelangen des Virus und zur Zellfusion benötigt (147-149). Es wurde gezeigt, daß HSV-1 gB und die gB-Analogen der anderen Herpesviren einen wichtigen zirkulierenden Antikörper ebenso hervorrufen wie zellvermittelte Immunantworten (8,10,37,47,73,150). Das FHV-1 gB Glykoprotein ist ein 134 kDa-Komplex, der mit ß-Mercaptoethanol in zwei Glykoproteine von 76 kDa und 60 kDa dissoziiert wird. Das FHV-1 DNA-Genom hat eine Größe von ungefähr 134 kb (153).

Epstein-Barr-Virus (EBV), ein menschliches B-lymphotropes Herpesvirus, ist ein Mitglied der Gattung Lymphocryptovirus, das zur Subfamilie gamma-Herpesvirus gehört (115). Es ist der Erreger von infektiöser Mononucleose (154) und von B-Zell-Lymphomen (156). EBV ist mit zwei menschlichen malignen Erkrankungen assoziiert: dem endemischen Burkitt's Lymphom, und dem undifferenzierten nasopharyngealen Karzinom (156).

Seit das EBV-Genom (207) wie auch die Genome von VZV (66) und HSV1 (158) vollständig sequenziert war, sind vielfältige Homologien zwischen diesen verschiedenen Herpesviren beschrieben worden (159). In einigen Fällen sind diese Homologien benutzt worden, um die potentiellen Funktionen von einigen offenen Leserahmen (ORFs) von EBV vorauszusagen. Die mit HSV1 homologen EBV-Gene, die bei der Immunität eine Rolle spielen, sind von besonderem Interesse. So weisen das EBV BALF4-Gen Homologien mit HSV1 gB (68) und das EBV BXLF2-Gen mit HSV1 gH (161) auf. Schließlich enthält das EBV BBRF3-Gen Homologien mit einem CMV-Membranprotein (162).

Unter den EBV-Proteinen sind die am besten charakterisierten potentiellen Vakzinierungsmittel die beiden Haupthüll-Glykoproteine gp340 und gp220. Sie sind durch Spleißen ohne eine Änderung des Leserahmens vom selben Gen abgeleitet (163,164). Gegen gp340 gerichtete monoclonale Antikörper und polyclonale Seren neutralisieren EBV in vitro (165). Der Cottontop-Tamarin, das einzig susceptible Tier, kann man durch eine Immunisierung mit dem gereinigten gp340 (166) und mit einem rekombinanten EBV gp340 Vaccinia-Virus (167) schützen. In diesem Fall wird der Schutz durch eine Rekombinante erreicht, die sich vom Vaccinia-Stamm WR ableitet, aber nicht durch eine Rekombinante, die sich vom Vaccinia-Stamm Wyeth ableitet. Der Wyeth-Stamm ist ein vielfach benutzter Vakzinstamm.

Monoclonale Antikörper, die gegen gp85, das EBV-Homologe, zu HSV1 gH, gerichtet sind, sind als in vitro neutralisierende Antikörper beschrieben worden (168,169).

Menschliches Cytomegalovirus (HCMV) ist ein Mitglied der beta-Herpesviridae-Subfamilie (Familie Herpesviridae). HCMV kann angesichts einer wirksamen spezifischen Immunität eine produktive persistierende Infektion hervorbringen. Sogar wenn HCMV für gewöhnlich eine niedrige Pathogenität besitzt, verursacht eine intrauterine Infektion Hirnschäden oder Taubheit bei ungefähr 0,15 % aller Neugeborenen und stellt die am meisten vorkommende infektiöse Komplikation bei Organtransplantationen dar (170). Obwohl die Wirksamkeit eines experimentellen lebend attenuierten (Stamm Towne) HCMV-Vakzins nachgewiesen wurde (171), haben Bedenken gegen lebende Vakzinstämme zu Anstrengungen geführt, die als Untereinheitsvakzine verwendbaren HCMV-Proteine zu identifizieren. In dieser Hinsicht ist die Identifizierung von Virion-Glykoproteinen und ihre Bewertung als Schutzstoffe ein wichtiger Schritt.

Drei mit der HCMV-Hülle assoziierte verschiedene Familien von Glykoproteinen sind beschrieben (172): gCI (gp55 und gp93-130); gCII (gp47-52) und gCIII (gp85-p145),

Das gCI codierende Gen ist homolog mit HSVI gB. Die gCII Glykoproteine werden von einer Familie von fünf Genen (HXLF) codiert, die tandemartig angeordnet sind und ein oder zwei homologe Bereiche miteinander teilen. Wahrscheinlicher wird gCII nur von einem dieser beiden Gene codiert (172, 173). Das gCII! codierende Gen ist mit HSVI gH homolog (174).

Es sind in vitro neutralisierende spezifisch gegen jede dieser Familien gerichtete Antikörper beschrieben worden (174-176). 6

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Geeignete modifizierte Pockenvirus-Mutanten, die exogene Pferde-Herpesvirus-Gene tragen, die in einem Wirtsorganismus als eine antigene Determinante die Produktion von Antikörpern gegen Herpesvirus-Antigene durch den Wirtsorganismus hervorrufen, stellen neue Vakzine dar, die die Nachteile der herkömmlichen Vakzine vermeiden, die abgetötete oder attenuierte Lebend-Organismen verwenden. So benötigt man 5 z.B. für die Herstellung von Vakzinen aus abgetöteten Organismen das Züchten einer großen Menge der Organismen mit einer anschließenden Behandlung, die selektiv ihre Infektiosität zerstört, ohne ihre Antigeni-tät zu beeinträchtigen. Andererseits besteht bei Vakzinen, die attenuierte Lebendorganismen enthalten, immer die Möglichkeit einer Reversion des attenuierten Organismus in einen pathogenen Zustand. Im Gegensatz dazu wird die Möglichkeit einer Reversion zu einem pathogenen Organismus vermieden, wenn 70 ein rekombinantes Pockenvirus in geeigneter Weise mit einem Pferde-Herpesvirus-Gen modifiziert ist, das eine antigene Determinante eines krankheitserregenden Herpesvirus codiert, da das Pockenvirus nur das Gen enthält, das die antigene Determinante des Krankheitserregers codiert und nicht die genetischen Anteile des Organismus, die zur Replikation des Pathogens verantwortlich sind. PRV infiziert viele Säugetierarten (Vieh, Hunde, usw.) tödlich. Erwachsene Schweine jedoch überleben 75 für gewöhnlich die Infektion und stellen damit ein wichtiges Virusreservoir dar. Da PRV ernsthafte ökonomische Verluste verursacht, wird eine Vakzinierung von Schweinen mit attenuierten oder abgetöteten Vakzinen in vielen Ländern vorgenommen.

Es sind Versuche unternommen worden, beim Schwein durch aktive Immunisierung mit modifizierten lebenden oder inaktivierten Vakzinen die PRV-Infektion zu kontrollieren und ökonomische Verluste zu 20 vermindern. Attenuierte Vakzine, die für gewöhnlich eine langandauernde Immunität induzieren und preisgünstig sind, weisen das Risiko einer ungenügenden Attenuierung oder genetische Instabilität auf. Inaktivierte Vakzine sind weniger effizient, benötigen mehrere Immunisierungen und enthalten normalerweise wirksame Adjuvantien. Diese letzteren Verabreichungsformen können nach der Vakzinierung allergische Reaktionen, wie Appetitlosigkeit, erhöhte Temperatur oder Fehlgeburt bei trächtigen Säuen hervorrufen. 25 Diese Vakzin-Typen leiden ebenfalls unter gewissen Nachteilen bezüglich der Vermeidung latenter Infektionen, der Überwindung der Wirkung maternaler Antikörper auf die Vakzinierungswirksamkeit und der Beseitigung der potentiellen Verwendung eines serologischen diagnostischen Tests zur Unterscheidung von vakzinierten Tieren von den vorher mit PRV infizierten. . Alternative Vakzinierungsstrategien, wie die Verwendung rekombinanter Pockenviren, die immunolo-30 gisch relevante PRV-Genprodukte exprimieren, würden gewisse Vorteile aufweisen. Sie würden: (a) lebend attenuierte PRV-Vakzinstämme aus dem Bereich beseitigen; und (b) die Unterscheidung zwischen vakzinierten und infizierten oder seropositiven Tieren erlauben. Das letztere ließe sich durch die Verwendung geeigneter Diagnosemittel erreichen, die vakzinierte Tiere genau von natürlich infizierten unterscheiden würden. Dies ist wegen der bestehenden Bestimmungen, die den Transport seropositiver Tiere kontrollie-35 ren, eine wichtige Überlegung. Ferner ist eine Vakzinierung ökonomischer und dem Testen und Aussondern infizierter Tiere von der Menge vorzuziehen. Zur Entwicklung solcher Vakzine muß man die Beiträge kennen, die die geeigneten PRV-Antigene zur Induktion der Schutz-Immunität leisten. Im Falle von PRV sind, wie bei anderen Mitgliedern der Herpesvirus-Familie, die Glykoproteine wichtige Kandidaten für Antigene in einem wirksamen rekombinanten Untereinheitsvakzin. 40 Die Technik zur Erzeugung von Vaccinia-Virus-Rekombinanten ist kürzlich auf andere Mitglieder der Pockenvirusfamilie ausgedehnt worden, die einen eingeschränkteren Wirtsbereich aufweisen. Insbesondere Vogelpockenviren, die in Vogelarten replizieren, sind so manipuliert worden, daß sie immunologisch relevante Genprodukte exprimieren. Die Inoculation von Vogel- (42,177) und Nicht-Vogelarten (41) mit rekombinanten Vogelpockenviren rief Immunschutzreaktionen gegen das korrespondierende Pathogen her-45 vor.

Attenuierte Lebendvakzine und inaktivierte Vakzine gegen BHV1 sind seit mehr als 30 Jahren verfügbar und haben erfolgreich das Auftreten von BHV1 verwandten Erkrankungen vermindert. Diese Vakzine verhindern jedoch nicht eine latente Infektion oder eine erneute Infektion mit dem Wildtypvirus. Außerdem machen sie die Unterscheidung zwischen infizierten und vakzinierten Tieren kompliziert. 5ö Beide Vakzintypen haben andere signifikante Nachteile. Eine Vakzinierung von trächtigen Kühen mit attenuierten Lebendvakzinen kann den Tod des Fötus verursachen und zu einer anschließenden Fehlgeburt führen (127). Außerdem ist gezeigt worden, daß vakzinierte Tiere Virus ausscheiden (178). Deshalb können vakzinierte Tiere, die mit trächtigen Kühen zusammengehalten werden, infektiöses Virus auf das trächtige Tier übertragen und einen Abort des Fötus verursachen. 55 Inaktivierte Vakzine induzieren weder Fehlgeburten noch rufen sie eine Virusausscheidung hervor. Sie verlangen jedoch die Verwendung von Adjuvantien und können tödliche hypersensitive Reaktionen (An-aphylaxe) und nicht-tödliche Entzündungen und Heber hervorrufen (179). 7

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Einer der wichtigeren Anhaltspunkte bei der Vakzinierung ist die Überwindung oder Vermeidung maternaler Immunität. In dieser Hinsicht wird, wenn ein Muttertier gegen ein bestimmtes Pathogen immun ist, die "Immunität” des Muttertiers mittels der im Kolostrum und/oder auf zusätzlichen Wegen auf das Neugeborene übertragen. Dennoch kann das Neugeborene nicht erfolgreich vakziniert werden, bis das Niveau der maternalen Immunität genügend zurückgegangen ist. Es gibt daher einen engen Bereich, in dem das Neugeborene in Gegenwart der zurückgehenden maternalen Immunität erfolgreich vakziniert werden kann.

Es läßt sich daher einsehen, daß die Bereitstellung von rekombinantem Herpesvirus-Pockenvirus oder von Vakzinen, die eine schützende Immunität gegen Herpesvirus-Infektionen liefern und die dem Stand der Technik die Vorteile einer Lebendvirusinokulation verleihen, die aber die vorstehend diskutierten Probleme vermindern oder beseitigen, einen sehr erwünschten Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik darstellen würde.

Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung, rekombinante Pockenviren, die Herpesvirus-Genprodukte exprimieren, und ein Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanten Pockenviren bereitzustellen.

Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung, die Clonierung und Expression von Herpesvirus codierenden Sequenzen in einem Pockenvirus-Vektor, insbesondere einem Vaccinia-Virus-, Geflügelpockenvirusoder Kanarienvirus-Vektor, bereitzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Vakzin bereitzustellen, das in der Lage ist, Herpesvirus neutralisierende Antikörper und eine schützende Immunität gegen einen tödlichen Herpesvirusangriff hervorzurufen.

Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden klarer unter Berücksichtigung des Folgenden.

Unter einem Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Pockenvirus, das in einem nicht essentiellen Bereich des Pockenvirus-Genoms und stromab von einer Promotorsequenz, die befähigt ist, die Expression des von dem DNA-Insert codierten Proteins durch das rekombinante Virus in einem Wirt zu fördern, ein DNA-Insert enthält, das für ein Herpesvirus-Glykoprotein codiert, ausgewählt unter dem Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gpl3, einem wirksamen Bereich des Pferde-Herpesvirus-Glyko-proteins gpl4, einem Pseudorabiesvirus-Glykoprotein gpll, dem Katzen-Herpesvirus-Glykoprotein gB und dem Epstein-Barr-Glykoprotein gp220, gB oder gH.

Das rekombinante Pockenvirus exprimiert erfindungsgemäß Genprodukte des fremden Herpesvirus-Gens. Insbesondere codiert die fremde DNA-Sequenz ein Herpesvirus-Glykoprotein, und die fremde DNA wird im Wirtsorganismus durch die Produktion des Herpesvirus-Glykoproteins exprimiert. Vorteilhafterweise werden durch das rekombinante Pockenvirus im Wirtsorganismus eine Vielzahl von Herpesvirus-Glykopro-teinen coexprimiert. Das Pockenvirus ist vorteilhafter Weise ein Vaccinia-Virus oder ein Vogelpockenvirus, wie Geflügelpocken- oder Kanarienpockenvirus.

Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein Vakzin zur Induktion einer Immunantwort in einem mit dem Vakzin inoculierten Wirtstier, wobei das Vakzin einen Träger und ein rekombinantes Pockenvirus einschließt, das in einem nicht essentiellen Bereich Herpesvirus-DNA enthält. Genauer gesagt, codiert und exprimiert die DNA ein Herpesvirus-Glykoprotein. Vorteilhafterweise werden durch das Pockenvirus in dem Wirt eine Vielzahl von Herpesvirus-Glykoproteinen coexprimiert. Das in dem Vakzin erfindungsgemäß verwendete Pockenvirus ist vorteilhafterweise ein Vaccinia-Virus oder Vogelpok-kenvirus, wie Geflügelpockenvirus oder Kanarienpockenvirus.

Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung Mechanismen zur Umgehung der Folge maternaler Immunität. Wenn die Barriere durch das Vorhandensein von Antikörpern gegen ein gegebenes Antigen(e) verursacht ist, kann die Barriere der maternalen Immunität überwunden oder vermieden werden durch die selektive Verwendung von Vektoren, die definierte Teilsätze von Antigenen exprimieren. Zum Beispiel kann das trächtige Tier mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus vakziniert werden, das das Pseudorabies-Virus-Glykoprotein gp50 exprimiert und die Nachkommenschaft kann bei der Geburt oder kurz danach mit rekombinanten Vaccinia vacciniert werden, das andere Pseudorabies-Virus-Glykoproteine, gpll oder gplll, oder eine Kombination von ihnen exprimiert. Wenn auf der anderen Seite die durch die maternafe Immunität vorhandene Barriere durch den Vektor verursacht wird, kann man das Muttertier unterscheidbar mit einem Vektor (Vaccinia oder Vogelpocken) und die Nachkommenschaft mit dem anderen Vektor vakzinieren. Dieses Verfahren bezieht sich natürlich nicht nur auf die Verwendung verschiedener Vektoren, sondern auch auf Vektoren, die eine unterschiedliche Konstellation von Glykopro-teinen exprimieren. Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Überwindung oder zum Vermeiden maternaler Immunität, die andernfalls eine erfolgreiche Immunisierung einer neugeborenen Nachkommenschaft verhindern würde. Erfindungsgemäß wird die neugeborene Nachkommenschaft mit einem rekombinanten Pockenvirus inoculiert, das in einem nicht essentiellen Bereich des Pockenvirusge- 8

AT 405 184 B noms DNA aus einer Nicht-Pockenquelle enthält, wobei diese DNA ein erstes Antigen eines Pathogens der neugeborenen Nachkommenschaft codiert, und dieses Antigen vom zweiten, zum selben Pathogen gehörenden Antigen verschieden ist, das verwendet wurde, um eine immunantwort gegen dasselbe Pathogen im Muttertier der neugeborenen Nachkommenschaft zu induzieren. Die neugeborene Nachkommenschaft wird erfindungsgemäß ebenfalls in einem ersten rekombinanten Pockenvirus inoculiert, der DNA aus einer Nicht-Pockenquelle in einen nicht essentiellen Bereich des ersten Pockenvirusgenoms enthält, wobei diese DNA als Antigen eines Pathogens der neugeborenen Nachkommenschaft codiert und dieses erste Pockenvirus verschieden ist von einem zweiten rekombinanten Pockenvirus, was zur Induktion einer Immunantwort im Muttertier der neugeborenen Nachkommenschaft verwendet wurde.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die begleitenden Zeichnungen verwiesen.

Fig. 1 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP425;

Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz eines 1,88 kb-Fragmentes von EHV-1, das die gp13 codierenden

Sequenzen enthält;

Fig. 3 Zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP483, das das EHV-1 gp13-Gen enthält;

Fig. 4 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP458;

Fig. 5 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP577, das das EHV-1 gp14-Gen enthält;

Fig. 6 zeigt die DNA-Sequenz eines 3,35 kb-Fragments von EHV-1, das die gp14 codierende Sequenz enthält;

Fig. 7 ist eine Darstellung der relativen Hydrophilizität der EHV-1 gpl4 codierenden Sequenzen;

Fig. 8 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Geflügelpockenvirus vFP44, das das EHV-1 gp13-Gen enthält;

Fig. 9 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Kanarienpockenvirus vCP48 zeigt, das das EHV-1 gp13-Gen enthält;

Fig. 10 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide pHES-MP63, pHES-MP1 und pHES-MP34, die modifizierte Versionen des EHV-1 gp14-Gens enthalten;

Fig. 11 ist eine Karte der BamHI-Spaltstellen des EHV-1-Stammes Kentucky D, in der die invertierten Wiederholungen des Genoms durch Kästchen gekennzeichnet ist, die die Lage der sechs Haupt-EHV-1 Glykoprotein-Gene zeigen und eine Erweiterung des genomischen Bereichs zeigt, die die Gene gD, gp63 und gE einschließt;

Fig. 12 zeigt die Nucfeotidsequenz eines 6402 Basenpaar-Fragments von EHV-1, das die gD, gp63 und gE codierenden Sequenzen enthält;

Fig. 13 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz von 402 Aminosäuren, aus denen sich EHV-1 gD zusammensetzt;

Fig. 14 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz von 413 Aminosäuren, aus denen sich EHV-1 gp63 zusammensetzt;

Fig. 15 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz von 522 Aminosäuren, aus denen sich EHV-1 gE zusammensetzt;

Fig. 16 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide pJCA006, pJCA007 und pJCAOOÖ, die das EHV-1 gD-Gen bzw. das EHV-1 gE-Gen oder das EHV-1 gp63-Gen enthalten und die Erzeugung eines rekombinanten Vaccinia-Virus, das diese Gene enthält;

Fig. 17 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide pJCA009 (das die EHV-1 gD und pg63 enthält) und pJCA010 (das die EHV-1-Gene gD, gp63 und gE enthält), und die Erzeugung eines diese Gene enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 18 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids PR18, das das PRV gpll-Gen enthält, und die Erzeugung des das PRV gpll-Gen exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 19 zeigt die DNA-Sequenz des PRV gpll offenen Leserahmens;

Fig. 20 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids pPR24, das das PRV gplll-Gen enthält, und die Erzeugung des das PRV gplll-Gen exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 21 zeigt die DNA-Sequenz des PRV gplll-offenen Leserahmens;

Fig. 22 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids pPR26, das das PRV gp50-Gen enthält und die Erzeugung des das PRV gp50-Gen exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Virus;

Fig. 23 zeigt die DNA-Sequenz des PRV gp50 offenen Leserahmens; 9

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Fig. 24 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pSD478VC und pSD479VCBG und zum Inserieren der /9-Galactosidase in Vaccinia-Virus;

Fig. 25 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pMP13PP;

Fig. 26 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pFPPRVII, das das PRV gpll-

Gen enthält;

Fig. 27 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Kanarienpockenvirus vCP55, das das PRV gpll-Gen exprimiert;

Fig. 28 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP717, das das PRV gl-Gen exprimiert;

Fig. 29 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP569 und vP734, die das HSV-2 gB-Gen exprimieren;

Fig. 30 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP579, vP748 und vP776, die das HSV-2 gC-Gen exprimieren;

Fig. 31 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP570, vP761. vP775 und vP777, die das HSV-2 gD-Gen exprimieren;

Fig. 32 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP637 und vP724, die das BHV-1 gl-Gen exprimieren;

Fig. 33 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Donorplasmids pJCAOOl, das das FHV-1-gB-Gen enthält, und zur Konstruktion des rekombinanten Vaccinia-Virus vP713, das das FHV-1 gB-Gen exprimiert;

Fig. 34 zeigt die Nucleotidsequenz des 3400 bp-Abschnittes der das Glykoprotein gB codierenden FHV-1 DNA;

Fig. 35 ist ein Hydrophobizitätsdiagramm der Sequenz der 947 Aminosäuren, aus denen sich FHV-1 gB zusammensetzt;

Fig. 36 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion der Donorplasmide 409gp220, das das EBV gp220-Gen enthält und 409gp340, das das EBV gp340-Gen enthält;

Fig. 37 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Vaccinia-Donorplasmids 409gB, das das EBV gB-Gen enthält;

Fig. 38 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Vaccinia-Donorplasmids 486gH, das das EBV gH-Gen enthält;

Fig. 39 Zeigt schematisch die Struktur des Vaccinia-Donorplasmids 5l3gHgBgp340, das die EBV-Gene gp340, gB und gH enthält;

Fig. 40 zeigt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion des Vaccinia-Donorplasmids 409CMVgB, das das CMV gB-Gen enthält;

Fig. 41 zeigt die Nucieotid- und Aminosäuresequenzen des HXLF1-Gens von HCMV (Stamm Towne); und

Fig. 42 zeigt die Nucieotid- und Aminosäuresequenz des HXLF2-Gens von HCMV (Stamm Towne).

Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer vielen Vorteile erhält man durch die folgenden, der Erläuterung dienenden Beispiele.

Beispiel 1

Konstruktion von Vaccinia-Virus-Rekomblnanten, die das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp13 exprlmierem

Substitution des HA-Gens von Vaccinia durch das E.coli fl-Galactosidasegen. In diesem Beispiel wurde der von Rhone Merieux, Inc. (Athens, Georgia) erhaltene Vaccinia-Stamm Copenhagen verwendet. Das Virus wurde ausgehend von einem gereinigten Plaque-Isolat entweder auf VERO- (ATCC# CCL81) oder MRC-5- (ATCC# CCL171) Zellen in Eagle's minimalen essentiellem Medium (MEM) mit zusätzlich 10 % fötalem Rinderserum (FBS) vermehrt. Ein Abkömmling des Wildtyp-Virus, bei dem die gesamte das Thymidinkinasegen codierende Sequenz nach Standard-Verfahren (25, 28) deletiert war, wurde isoliert und mit vP410 bezeichnet. Diese Thymidinkinase-Deletionsmutante wurde für weitere Manipulationen verwendet. Plasmide wurden konstruiert, abgesucht und nach Standardverfahren vermehrt (20,27,28).

Wie in Fig. 1 gezeigt, wurde das 13 kb Sali F-Fragment des Vaccinia-Virus, das sich über die Hindill A/B-Fragmentverbindung erstreckt, mit Sali gespaltenem pUC8 ligiert, wodurch pSD4l9VC erzeugt wurde. Der mit dem Hindlll B-Teil des Sali F-Fragments korrespondierende rechte Arm von pSD419VC wurde durch Spaltung mit Hindlll entfernt, und durch Re-Ligation wurde pSD456VC erzeugt. pSD456VC enthält somit das rechte Ende des Hindlll A-Fragments, indem sich auf jeder Seite durch ungefähr 0,4 kb 10

AT 405 184 B zusätzliche Vaccinia-Sequenzen flankiert, der vollständige codierende Bereich des Hämaglutinin (HA)-Gens (35) befindet.

Um einen Plasmidvektor, praktisch ohne HA-codierende Sequenzen zu erzeugen, wurde pSD456VC (in einer partiellen Spaltung) an der Rsal-Stelle stromaufwärts des HA-Gens und bei der Eagl-Stelle 80 bp vom 3'-Ende des HA-Gens gespalten. Das Rsal/Eagl-Fragment mit ungefähr 3,5 kb wurde aus einem Agarosegel isoliert.

Zum Ersetzen des Bereiches von Rsal-Stelle bis zur Position 2 stromaufwärts der HA-codierenden Sequenz, an die sich unmittelbar die Restriktionsstellen Bglll, Smal und Pstl und ein adhäsives Eagl-Ende anschließen, wurden die synthetischen Oligonucleotide MPSYN59-62 hergestellt. Die Sequenz von MPSYN59-62 mit den Restriktionsstellen wie angegeben, lautet wie folgt:

5 '’ACACSAAfGATTTTCTAAASTATTTGGAAACTTTTATAeSTACrTGATAGAACAA S'-TGTSCTTACTAAAA&ATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAACTATCTTGTT AATACATAATTTTGTAAAAATAAA?CACTTTTTATACTAACATCTCCCGC&CT6CAGC*3 1 TTATCTATTAAAACATTTTTATTTA6TCAAAAATAT6ATTCTAiiA6GSCCCSACCTCCCCB6»S ·

Bullt Val Pstl Eaal

Das aneinandergelagerte MPSYN59-62-Gemisch wurde mit dem 3,5 kb Rsal/Eagl-Fragment von pSD456VC ligiert, womit pSD466VC erzeugt wurde. Somit ist das HA-Gen in pSD466VC durch einen Polylinkerbereich ersetzt worden.

Ein 3,2 kb Bglll/BamHl (Partiellfragment), das das E. coli jö-Galactosidasegen von pMCi871 (34) unter der Transkriptionskontrolle des 11 kDa Vaccinia-Promotors (7) enthält, wurde in mit Bglll gespaltenes pSD466VC cloniert. Ein Plasmid, das die 11 kDa-Promotor/jS-Galactosidasegen-Kassette in einer Orientierung von links nach rechts bezüglich der flankierenden Vaccinia-Arme enthielt, wurde mit pSD466VCBGA bezeichnet und mit der Thymidinkinase-Deletionsmutante vP410 des Vaccinia-Virusstammes Copenhagen rekombiniert, wodurch die 0-Galactosidase exprimierende Vaccinia-Rekombinate vP425 erzeugt wurde. 80 Basenpaare am Carboxy-Terminus des HA-Gens wurden behalten, so daß ein kurzer von rechts nach links bezüglich des Vaccinia-Genoms transkribierter potentieller offener Leserahmen nicht auseinandergerissen wurde.

Das rekombinante Vaccinia-Virus vP425 (184) wurde wie von anderen beschrieben (9,24), aufgrund der Bildung neuer Plaques in Gegenwart des chromogenen Substrates X-gal identifiziert. Eine Substitution des /S-Galactosidasegens durch wiederum ein anderes fremdes Gen in folgenden Vaccinia-Rekombinanten ließe sich leicht auffinden durch Isolieren von farblosen Plaques anstelle blauer Plaques.

Zur Erleichterung zukünftiger Clonierungsschritte wurde die aus dem pUC8-Multiclonierungsbereich abgeleitete Smal-Stelle entfernt durch Spaltung von pSD466VC mit BamHI/EcoRI, Stumpfendigmachen mit dem Klenow-Fragment von E.coli-Polymerase und Re-Iigieren. Somit liegt die einzige in dem resultierenden Plasmid, pSD467VC, verbleibende Smal-Stelle im Polylinkerbereich der HA-Deletion.

Identifizierung der DNA-Sequenzen, die das EVH-1 gp13-Gen codieren. Die das Glykoprotein EHV-1 gp13 codierende DNA-Sequenz befindet sich in dem 7,3 kb BamHI-H-Fragment von EHV-1 (3). Nucleotid-sequenzdaten für beide Stränge wurden vom pUC (BamHI-H)-Bereich erhalten durch die Benutzung überlappender Subclone unter Verwendung des modifizierten T7-£nzyms SEQUENASE (40) (U.S. Bioche-micals, Cleveland, OH). Standard Didesoxy-Kettenabbruchreaktionen (33) wurden an doppelsträngigen Plasmidmatrizen vorgenommen, die in Alkali denaturiert worden waren. Um die Anfangssequenzen jedes Clones zu erhalten, wurden die Ml3-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer verwendet. Maßgeschneiderte 16 bis 17 mer-Primer, die unter Anwendung von Standardchemie synthetisiert wurden (Biosearch 8700, San Rafael, CA; Applied Biosystems 380B, Foster City, CA), wurden verwendet, um am übriggebliebenen Fragment entlangzuwandern. Bei allen Sequenzdatenanalysen (29) wurde das IBI-Pustell-Sequenzanalysen-programm verwendet.

Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß es einen offenen Leserahmen mit 1,404 bp gibt, der ein vorausgesagtes primäres Translationsprodukt von 50,9 kDa mit 468 Aminosäuren ergibt. Es wurde eine signifikante Aminosäurehomologie in der Carboxyhälfte des mutmaßlichen offenen Leserahmens gpl3 mit gC des Herpes simplex-Virus Typ 1 und Typ 2, mit glll des Pseudorabies-Virus und gbV von Varicella zoster-Virus beobachtet, woraus sich schließen läßt, daß gp13 ein Mitglied der gC-artigen Glykoproteine von Herpesviren ist. Eine weitere detaillierte Analyse des EHV-1 gb13 offenen Leserahmens wurde in einer früheren Veröffentlichung (2) vorgenommen. Zur Vereinfachung der Beschreibung der Clonierung und Expression 11

AT 405 184 B von EHV-1 gp13 in Vaccinia-Virus-Vektoren ist der offene Leserahmen gp13 mit zusätzlichen 5'- und 3’-Sequenzen in Fig. 2 gezeigt. In Figur 2 sind eine mutmaßliche TATA-Box und Aminosäuren, die mutmaßliche Signale und Membran-Anker-Bestandteile umfassen, unterstrichen. Die dem Spaltungssignal ASA (leere Kreise) folgende potentielle Spaltstelle der Signalsequenz ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Potentiell gibt es innerhalb der Signal- und Ankersequenzen neun durch das Asn-X-Ser/Thr-Motiv definierte N-verknüpfte Glykosylierungsstellen (Sterne).

Clonierung des EHV-1 qpl3-Gens in ein Vaccinia-Virus-Donorplasmid· Ein früh/später Vaccinia-Virus-Promotor, H6, wurde für die Expression fremder Gene in Geflügelpockenvirusvektoren verwendet (41,42). Dieses Promotorelement korrespondiert mit den DNA-Sequenzen unmittelbar stromaufwärts des offenen Leserahmens H6 im Vaccinia-Hindlll-H-Fragment (31).

Wie in Fig. 3 gezeigt, wurden zum Mutieren und zum Inserieren des H6-Promotors in pSD467VC die Oligonucleotide H6SYN Oligos A-D synthetisiert. Die Sequenz von H6SYN-Oligos A-D ist die folgende, wobei die modifizierten Basen unterstrichen und die Restriktionsstellen angegeben sind:

Bai»

5' -GAT CT CTTTATTCTATACTTAAAAAGTG AAAATAAATACAAAGGTTCTTG AGGGTT 3' -AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAA

GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAA

CACAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATT GTTTGTATCGTACCC-3· CAAACATAGCATGGG-5*

Sinai

Die unterstrichenen Basen geben eine Modifikation der nativen H6-Promotorsequenz an.

Die doppelsträngige DNA mit einer Gesamtlänge von 130 bp, die sich durch Aneinanderlagern der H6SYN-Oligos A-D bildete, wurde durch Elektroelution aus einem Agarosegel gereinigt und mit den 0,5 kb Smal/Hindlll- und 3,1 kb Bglll/Hindlll-Fragmenten, die aus pSD467VC abgeleitet waren, ligiert. Im resultierenden Plasmid, pTP15 (184) ist das Initiationscodon ATG in CCC als Teil der Smal-Stelle verändert, der sich unmittelbar eine Pstl-Stelle anschließt. Ein Nsil-Linker, 5’-TGCATGCATGCA-3', (New England Biolabs, Bebverly, Ma) wurde in die Smal-Stelle von pTP15 inseriert, um das Plasmid pNSl zu erzeugen.

Ein EHV-1 EcoRl/Narl-Fragment, in dem die EcoRI-Stelle 120 bp stromaufwärts des ATG-Initiationsco-dons liegt, und in dem die Narl-Stelle 23 bp stromaufwärts des TAG-Terminationscodons von EHV-1 gp13 liegt, wurde in den Phagen Ml3mp19 cloniert, um den rekombinanten Phagen Ml3EcoRNar zu erzeugen. Durch Anwendung Oligonucleotid-gerichteter Mutagenese (17) wurde eine Nsil-Stelle eingeführt durch Verändern ‘der Sequenz TTGCCT (Basen 130-135 in Fig. 2) im EHV-1 gp13-Gen in ATGCAT. Das EcoRl/Narl-Fragment des mutierten Phagen M13EcoRNar wurde in die EcoRI/Narl-Stellen in pUC8 cloniert, wodurch das Plasmid pNSIEN erzeugt wurde.

Zwei 42-mere Oligonucleotide wurden synthetisiert, die die nachstehend aufgeführte Sequenz besitzen, wobei Restriktionssteilen aufgeführt sind:

Narl gpl3 3'-Ende Ndel 5»-CGCCGTACAAGAAGTCTGACTTT1ASATTTTTATCTGCAGCA-3' 3' -GGCATGTTCTTCAGACTGAAAATCTAAAAATAGACGTCGTAT-g

In diesem Oligonucleotid schließt sich an das Terminationscodon (TAG) unmittelbar ein früher Vaccinia-TranskriptionsTerminator (ATTTTTAT) an. Das durch Aneinanderlagern des 42-mer Paares erhaltene 12

AT 405 184 B doppelsträngige DNA-Fragment enthält ein Narl adhäsives Ende, dem sich das 3’-Ende der das EHV-1 gp13 Gen codierenden Sequenz ebenso anschließt, wie ein frühes Vaccinia-Transkriptions-Terminationssi-gnal (45), eine Pstl-Stelle und ein adhäsives Ndel-Ende. Dieses Fragment wurde zwischen die Narl/Ndel-Stellen von pNSIEN inseriert, wodurch pNSIENPN erzeugt wurde (Fig. 3). 5 Das Nsil/Pstl-Fragment aus pNSIENPN wurde isoliert und in die Nsil/Pstl-Stellen des Plasmids pNSl cloniert, wodurch das Plasmid pVHA6g13Nsil erzeugt wurde (Fig. 3). pVHA6g13Nsil wurde gespalten in der EcoRV-Stelle des H6-Promotors und in der Nsil-Stelle, die nahe des Beginns des EHV-1 gp13-Gens eingeführt worden war. Dieses Vektorfragment wurde mit Mungobohnen-Nuclease stumpfendig gemacht. Es wurden zwei komplementäre 32-mer Oligonucleotide synthetisiert, die die Sequenz besitzen, die nachfol-70 gend zusammen mit Restriktionsstellen aufgeführt ist:

EcoRV 5 1 -ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTGGTTGCC-3 · 75 3 * -TAGGCAATTCAAACATAGCATTACACCAACGG-5 · H6 pronoter gpl3 5' -Ende 20 Diese Oligonucleotide wurden aneinandergelagert und mit dem Vektorfragment pVHA6g13Nsil ligiert, um das Plasmid pVHA6gl3 her2ustellen, das eine genaue Verbindung am ATG-Initiationscodon (in der 32-mer Sequenz unterstrichen) des H6-Promotors und des EHV-1 gp13-Gens enthält (Fig. 3).

Mit vP425 infizierte Zellen wurden mit pVHA6gl3 transfiziert, um die Vaccinia-Rekombinante vp4383 zu erzeugen, die das EHV-1 gp13-Gen enthält (Fig. 3). 25

Konstruktion von Vaccinia-Virus-Rekombinanten

Verfahren zur Transfektion von mit einem Rettungs-Vaccinia-Virus infizierten Gewebekulturzellen mit rekombinanten Donorplasmiden und die Identifizierung von Rekombinanten durch in situ-Hybridisierung auf 30 Nitrocellulosefiltern wurden, wie früher beschrieben, durchgeführt (25,28). Zur Konstruktion von vP425, in der das E. coli 0-Galactosidasegen die HA-codierenden Vaccinia-Sequenzen ersetzt, wurde die PlasmidDNA (25 ug pSD466VCBGA in HeBS (16)) in VERO-Zellen elektropuriert (BioRad Gene Pulser, Kapazitanz 960, 200 Volt). Zelleinzelschichten unterhalb der Konfluenz wurden mit 10 pfu/Zelle vP410 1 Stunde vor der Verwendung infiziert. Die infizierten Zellen wurden mit Trypsin geerntet und vor der Elektroporation mit 35 HeBS gewaschen. Die Zellen wurden 24 Stunden bei 37 *C in MEM + 5 % fötalem Rinderserum inkubiert, geerntet, und die Virusnachkommenschaft wurde auf VERO-Einzelzellschichten plattiert. Rekombinante jS-Galactosidase exprimierende Viren wurden als blaue Plaques in Gegenwart des Substrates X-gal aufgefunden (9,24). Um ein rekombinantes Vaccinia-Virus zu erzeugen, bei dem das EHV-1 gp13-Gen das ß-Galactosidasegen in vP425 ersetzte, wurde in ähnlicher Weise vorgegangen, außer daß das Donorplasmid 40 pVHA6gi3 und der Rettungs-Virus vP425 waren. Die Vaccinia-Rekombinante vP483, die EHV-1 gp13 enthielt, wurde als farbloser Plaque in Gegenwart von X-gal nachgewiesen und durch DNA-Hybridisierung nach der Plaquereinigung über drei Cyclen als die richtige Rekombinante bestätigt.

Expression des EHV-1 gp13-Gens auf der Oberfläche von Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-45 Virus vP483 infiziert waren. BSC-40-Zellen wurden auf 22 mm Glasdeckgläsern in 35 mm Schalen mit 5 x 105-Zellen/Schale ausgesät. Bei ungefähr 80 % Konfluenz wurden die Zellen mit 2 pfu/Zelle infiziert. Nach einer 1-stündigen Adsorptionszeit wurde das Virusinoculum entfernt und MEM + 2 % fötales Rinderserum zugegeben. 20 50 Stunden nach der Infektion wurden die Deckgläschen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, die 0,2 % BSA und 0,1 % NaN3 enthielt (PBS + ) und 0,1 ml des monoclonalen anti-gp13-Antikörpers, 14Hz (3) ausgesetzt, der eins zu tausend in PBS+ verdünnt war. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer feucht gehaltenen Kammer wurden die Zellen dreimal in PBS+ gewaschen. Diese Prozedur wurde mit Fluorescein-Isothiocyanat konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG wiederholt. Schließlich 55 wurden die Zellen 20 Minuten in 2%igem Paraformaldehyd in PBS fixiert. Die Deckgläschen wurden in 80 % Glycerin in PBS gebracht, die 3 % n-Propylgallat enthielt, und die Fluoreszenz wurde mit einem Mikroskop beobachtet. 13

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Das aus der DNA-Sequenz vorhergesagte Protein hat die typischen Eigenschaften, die charakteristisch für ein sich über die Membran erstreckendes Glykoprotein sind (14). In einer produktiven EHV-1-Infektion wird dieses gp13-Glykoprotein in die verschiedenen Membransysteme der Zelle eingebaut und wird in die cytoplasmatische Membran transportiert und ist auf der äußeren Oberfläche der infizierten Zelle nachweisbar. Zusätzlich ist EHV-1 gp13 ein Bestandteil des EHV-1 Virions. Es wurden deshalb Immunfluoreszenzuntersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob das durch die Vaccinia-Virus-Rekombinante vP483 exprimierte EHV-1 gp13 sich in ähnlicher Weise auf der cytoplasmatischen Membran der infizierten Zelle darstellt. Spezifische monoclonale anti-gp13-Antikörper, denen Fluorescein konjugierte Ziegen-anti-Maus-IgG nachfolgten, brachten eine starke Membran-Immunfluoreszenz in vP4S3-infizierten Zellen, nicht aber in mit dem Vaccinia-Virus vP410 infizierten Zellen. Dies legt nahe, daß das vom rekombinanten Vaccinia-Virus vP483 exprimierte EHV-1 gp13 sich so auf der cytoplasmatischen Membran präsentierte, wie man es für die authentische Synthese eines sich über die Membran erstreckenden Glykoproteins erwartet.

Immunpräzipitation von EHV-1 gpl3-Produkten, die von mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP483 infizierten Zellen synthetisiert wurden.

Zwei Millionen Zellen, die eine konfluente Einzelschicht in einer 60 mm Schale bildeten, wurden mit 10 pfu/Zelle infiziert. Die Inoculation wurde in methioninfreiem Medium vorgenommen. Nach der Adsorptionsperiode wurde das Inoculum entfernt und 2 ml methioninfreies Medium, das 20 uCi/ml 35S-Methionin enthielt, wurden zugegeben. Das Fortschreiten der Infektion wurde 24 Stunden zugelassen. Dann wurden die Zellen lysiert durch Zugabe von 1 ml 3x Puffer A, der 3 % NP-40, 30 mM Tris pH 7,4, 450 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,03 % Natriumazid und 0,6 mg/ml PMSF enthielt. Die lysierten Zellen und der Oberstand wurden geerntet, auf dem Vortex gemischt und durch 15 Minuten Zentrifugation bei 10 000 g geklärt.

Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Katalog Nr. 17.0780.01) wurde als eine 1:1-Aufschlämmung in 1X Puffer A zubereitet. Ein Ratten-anti-Maus-Konjugat (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 605 500) wurde 1:100 in der Aufschlämmung verdünnt und unter 4-stündigem vorsichtigen Schütteln bei Raumtemperatur an die Kügelchen gebunden. Die Kügelchen wurden dann sorgfältig 6 mal mit je 1 ml Puffer A gewaschen, um nicht gebundenes Konjugat zu entfernen. Dann wurde ein für gpi3 spezifischer monoclonaler Antikörper 4 Stunden bei Raumtemperatur an die Kügelchen gebunden. Die überschüssigen Antikörper wurden durch sorgfältiges Waschen entfernt. 1 ml des geklärten infizierten Zellysats wurde durch Inkubation mit Protein A-Sepharosekügelchen, an die normales Mausserum gebunden worden war, vorgereinigt. Diese Kügelchen wurden durch Zentrifugation entfernt. 1 ml des geklärten vorgereinigten Lysates wurden dann mit 100 ul der Kügelchen gemischt, an die der spezifische monoclonale Antikörper gebunden worden war. Dieses Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt. Die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation entfernt und viermal sorgfältig in 1X Puffer A und zweimal in 10 mM Tris-Puffer pH 7,4, der 0,2 M LiCI und 2 M Harnstoff enthielt, gewaschen. Der Antikörper-Antigen-Komplex wurde dann durch die Zugabe von 50 ul 2x Laemmli-Aufbrechlösung (60,195) von den Kügelchen abgelöst und auseinandergerissen. Vor der Elektrophorese wurde die Probe dann 5 Minuten gekocht.

Zwei Produkte mit ungefähr 44 und 47 kDa, die etwas kleiner als das vorhergesagte primäre Translationsprodukt (51 kDa) sind und ein größeres Produkt mit ungefähr 90 kDA, das im Einklang mit einer vollständig glykosylierten Form des EHV-1 gpl3-Genproduktes ist, lassen sich nachweisen. Aus mit Vaccinia-Virus infizierten Kontrollzellen wurden keine äquivalenten Polypeptide präzipitiert.

Beispiel 2

Konstruktion von Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp14 exprimieren

Ersatz des M2L-Gens in Vaccinia-Virus durch das E. coli /S-Galactosidasegen.

Um die EHV-1 gp14-codierenden Sequenzen in einen Vaccinia-Virus-Vektor zu inserieren, wurde das rekombinante Vaccinia-Virus vP485, das das E. coli LacZ-Gen exprimiert, konstruiert. Die Substitution der LacZ-codierenden Sequenzen im rekombinanten Virus vP458 durch EHV-1 gpl4 codierende Sequenzen erlaubt die Verwendung eines Blau-nach-Farblos-Plaque-Screening-Systems zur Identifizierung rekombinan-ter EHV-1 gpl4 enthaltender Viren (9,24) in Gegenwart von X-gal, einem chromogenen Substrat der ß· Galactosidase. Ferner wurde ein Insertionsort für EHV-1 gp14 neben dem in Beispiel 13 für die Insertion von EHV-1 gp13 in Beispiel 1 verwendeten deletierten Hämagglutinin-Ort im M2L-Ort von Hindlll M hergestellt, mit der Absicht, Vaccinia-Virus-Rekombinante zu konstruieren, die sowohl EHV-1 gp14 als auch 14

AT 405 184 B EHV-1 gpl3 exprimieren. Im Vaccinia Hindill M-Fragment wurde die gesamte codierende Sequenz des M2L-Gens entfernt und durch das die £-Galactosidase codierende E. coli LacZ-Gen ersetzt. Die Clonie-rungsschritte zur Konstruktion von vP458 sind in Fig. 4 schematisch dargestellt.

Wie in Fig. 4 gezeigt, liegt ein offener von rechts nach links bezüglich des Vaccinia-Genoms gelesener offener Leserahmen, der ein mutmaßliches Protein mit 220 Aminosäuren codiert, ganz innerhalb des Hindill M-Fragments des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen links der einzigen Bglll-Stelle. Der Konvention entsprechend (31) wurde dieses Gen, das unmittelbar rechts von M1L (58) liegt, mit M2L bezeichnet. Deletionsuntersuchungen am Vaccinia (WR)-Genom, die sich nach links von der einzigen Bglll-Stelle in das Hindlll-Fragment M erstrecken (57), zeigen, daß die im Hindill M links der Bglll-Stelle enthaltenen codierenden Vaccinia-Sequenzen für die Replikation des Virus in Gewebekultur nicht essentiell sind.

Um die Verwendung des M2L-Bereichs als Insertionsort für fremde Gene zu erleichtern, wurde der Plasmidvektor pMP409DVC, in dem die gesamte M2L-codierende Sequenz durch eine Bglll-Stelle ersetzt war, wie folgt hergestellt. pSD409VC, das aus dem in die Hindlll-Stelle von pUC8 clonierte Copenhagen Vaccinia Hindill M-Fragment besteht, wurde mit BamHI/Bglll gespalten und mit sich selbst ligiert, wodurch das rechte Ende von Hindill M entfernt und die Bglll-Stelle zerstört wurde. Das resultierende Plasmid, pMP409BVC, wurde mit Sohl linearisiert, das innerhalb des M2L-offenen Leserahmens schneidet, und 2 Minuten einem Bal-31 Exonucleaseverdau unterworfen. Unter Verwendung des synthetischen 49 mer (5' -TTTCTGTATATTTGCAACAATTTAGATCTTACTCAAAATATGTAACAAT-3 ·; die Bglll-Stelle ist unterstrichen) wurde eine Mutagenese mit der resultierenden DNA durchgeführt (19). In dem mutagenisierten Plasmid, pMP409DVC, sind die M2L-codierenden Sequenzen von der Position + 3 bis zum Ende des offenen Leserahmens deletiert. Das G des Initiationscodons ATG wurde zu einem C geändert, um eine einzig vorkommende Bglll-Stelle (AGATCT) an der Deletions-Verbindung zu schaffen. ln die einzig vorkommende Bglll-Stelle von pMP409DVC wurde ein 3,2 kb Bglll/BamHI (partiell)-Fragment cloniert, das 3,1 kb des E. coli /S-Galactosidasegens zwischen den BamHI-Stellen von pMV1871 (34) unter der Transkriptionskontrolle des späten 11 kDA- 0,1 kb Vaccinia-Promotors (7) steht. Ein rekombinantes Plasmid, das die 11 kDA-Promotor//8-Galactosidasegen-Kassette in einer Rechts-nach-links-Orientierung bezüglich der flankierenden Vaccinia-Arme und des -Genoms von Vaccinia enthält, wurde mit pMP409DVCBG bezeichnet. pMP409DVCBG wurde als Donorplasmid zur Rekombination mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Rettungs-Vaccinia-Virus vP410 verwendet. Die neue, mit vP458 bezeichnete Vaccinia-Rekombinante, die das in den M2L-Deletionsort inserierte /3-Galactosidasegen exprimiert, wurde unter Verwendung des chromogenen X-gal-Substrates entdeckt (9,24) und durch wiederholte Plaque-Clonierung gereinigt.

Clonierung des EHV-1 gp14-Gens.

Wie in Fig. 5 gezeigt, erstreckt sich die EHV-1 gp14 codierende Sequenz über die Verbindung zwischen den BamHI-Restriktionsfragmenten a und i (3). Die EHV-1-DNA-Fragmente BamHI-a (21,3 kb) und i (7,1 kb) (59) wurden aus Agarosegelen isoliert. Das Plasmid pUC (BamHI-i) wurde durch Inserieren des EHV-1 -BamHI-i-Fragmentes in die BamHI-Stelle des Plasmids pUC8 konstruiert. Das EHV-1-BamHI-a-Fragment wurde mit EcoRI gespalten und in pUC8, das mit EcoRI/BamHI gespalten worden war, ligiert. Das Plasmid pUC(BamHI-a/EcoRI) enthält eine 10 kb EHV-1 BamHI/EcoRI-lnsertion. Bei Zugrundelegung der berichteten Fragmentgrößebestimmungen (59) sind die DNA-Sequenzen in dieser Insertion denen des BamHI-i-Fragmentes im EHV-1-Genom benachbart.

Nucleotidsequenzanalyse.

Unter Verwendung der verschiedenen Subclone der Plasmide pUC (BamHI-a/EcoRI) und pUC (BamHI-i) wurde eine Nucleotidsequenzanalyse durchgeführt. Die Sequenzierung des Plasmids pUC (BamHI-a/EcoRI) wurde an der BamHI-Stelle begonnen, weil das EHV-1 gp14-Gen sich über die BamHI-a/i-Verbindung erstreckt (3). Die Orientierung des Plasmids pUC (BamHI-i) wurde durch Restriktionsenzymspaltung bestimmt. Da festgestellt wurde, daß der der EcoRI-Stelle in pUC (BamHI-i) nächstgelegene EHV-1-BamHI-Terminus die BamHI-Stelle an der BamHI-a/i-Verbindung ist, wurde die Sequenzierung des Fragments von diesem BamHI-Ende her begonnen. 15

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Sequenzdaten für beide Stränge wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Die die EHV-1 gp14 codierende Sequenz enthaltende Nucleotidsequenz des 3351 bp-Fragments ist in Fig. 6 gezeigt. Die Numerierung am linken und am rechten Rand bezieht sich auf die Aminosäure- bzw. auf die Nucleinsäure-sequenz. Die mutmaßlichen CAT- und TATA-Boxen sind unterstrichen. Aminosäuren im Signal- und im Membran-überspannenden Bereich sind ebenfalls unterstrichen, und ein Pfeil zeigt eine potentielle Signalpeptidspaltstelle an. Die dreizehn die Consensus-Sequenz (Asn-X-Ser/thr) verwendenden potentiellen Glykosylierungsstellen sind durch einen Stern gekennzeichnet.

Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen sich von den Nucleotidpositionen 300 bis 3239 erstreckenden von links nach rechts relativ zum EHV-1-Genom gelesenen offenen Leserahmen, d.h. das ATG-Startcodon befand sich im BamHI-a/EcoRI-Fragment und das Stopp-Codon TAA befand sich im BamHI-i-Fragment (3,59).

Mutmaßliche Transkriptions-Regulationssignale wurden im Bereich 5'-seitig des ATG-Initiationscodons in Position 300 gefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz AATATAT (Nucleotide 148 bis 155) wurde 70 Nucleotide stromabwärts von der mutmaßlichen CAT-Box in Position 71 bis 77, die die Sequenz GGTCAAT besaß, festgestellt. Ein Poiyadenylierungssignal, AATAAA (Nucleotide 3251 bis 3256) wurde 8 Nucleotide stromabwärts des TAA-Terminationscodons (Nucleotide 3240 bis 3242) festgestellt. Neun der elf Nucleotide in der Sequenz 5’-TCCTGCGCGCA-3’ (Nucleotide 218 bis 228) sind mit der 18S ribosomalen RNA-Sequenz 3'-AGGAAGGCGT-5’ (61) komplementär und können als Ribosomenbindungsstelle dienen.

Analyse der EHV-1 gp14-Struktur.

Der offene Leserahmen EHV-1 gp14 codiert 980 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 2109,8 kDa. Eine Analyse der Aminosäuresequenz enthüllt eine Anzahl membranassoziierten Glykopro-teinen gemeinsamer Merkmalen. Ein sich von den Aminosäuren 58 bis 99 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird vorgeschlagen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt (Fig. 6). Ein ungewöhnliches Merkmal des EHV-1 gp14-Genproduktes ist es, daß der langen hydrophoben Signalsequenz eine lange hydrophile Sequenz vorangeht. Dieses Charakteristikum ist ebenfalls für das Pseudorabies-Virus (PRV) gll- (62) und für das Rinder-Herpesvirus 1 (BHV-1) gl-Gen (63) beobachtet worden, die beide ebenfalls HSV gB-Homologe sind. Es wird angenommen, daß ein hydrophober, aus 45 Aminosäuren bestehender Bereich (Aminosäuren 826 bis 870) als transmembrane Ankerdomäne funktioniert. Die hydrophile Cytoplasmadomäne enthält 110 Aminosäuren.

Es gibt elf Asn-X-Thr/Ser- (wobei X jede Aminosäure außer Prolin sein kann) Stellen für potentielle N-verknüpfte Glykosylierung (64). Es ist ein ungewöhnliches Merkmal, daß es ebenfalls zwei potentielle Glykosylierungsstellen in der cytoplasmatischen Domäne gibt (Fig. 6).

Ein Hydrophilizitäts-Diagramm der EHV-1 gpl4 codierenden Sequenz ist in Fig. 7 gezeigt. Der hydrophobe Index von EHV-1 gp14 ist nach dem Verfahren von Kyte und Doolittle (65) mit einem Fenster von sieben Aminosäuren und ohne Angleichung berechnet worden. Punkte unterhalb der horizontalen Linie repräsentieren Gebiete einer höheren Hydrophobizität, und zeigen damit potentielle Signal- und/oder sich über Membran erstreckende Bereiche an. Die Charakteristika eines Membranüberspannenden Glykopro-teins einschließlich der Signal- und Ankerelemente und des langen, der Signalsequenz vorangehenden hydrophilen Bereichs finden sich bei der EHV-1 gp14 codierenden Sequenz.

Bestimmung der Lage der antigenen Determinante, die durch den monoclonalen anti-EHV-1 gpl4-Antikör-per, 3F6, erkannt wird. \gt11 -Expressionsvektoren und monoclonale Antikörper waren bei der Identifizierung der EHV-1-DNA-Sequenzen, die die Haupt-EHV-1-Glykoproteine (3) codieren, nützlich. Es wurde gezeigt, daß der Rekombi-nante \gt1l, 4al, ein EHV-1 gp14-Epitop exprimiert, das durch den spezifischen monoclonalen Antikörper 3F6 (3) erkannt wird. Um die Identität dieses Epitops zu bestimmen, wurde die EHV-1 -DNA-Sequenz, die in 4al enthalten war, sequenziert und mit der DNA-Sequenz der EHV-1 gpl 4 codierenden Sequenz verglichen (Fig. 6). Zur Sequenzierung des DNA-Fragments, das mit dem durch den monoclonalen anti-EHV-1 gp14-Antikörper 3F6 erkannte (3) EHV-1 gp14-Epitop im rekombinanten Xgtl 1, 4a1, korrespondiert, wurde 4a1 mit EcoRI gespalten und das EHV-1-Fragment auf Agarosegelen isoliert und in die EcoRI-Stelle von pUC8 ligiert. DNA-Sequenzierung wurde, wie vorstehend beschrieben, mit den universellen M13 Vorwärts- und Rückwärts-Primern durchgeführt.

Die Nucleotidsequenz-Anordnung zeigte, daß sich dieses Epitop innerhalb des 66 Aminosäurebereichs befand, der dem von 107 (Thr) bis 172 (Val) des abgeleiteten primären Translationsproduktes entsprach. Das Epitop befindet sich deshalb innerhalb des aminoterminalen Bereichs der abgeleiteten EHV-1 gpl4- 16

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Oberflächendomäne.

Vergleich der EHV-1 gpl 4-Aminosäuresequenz mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen. s Der Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des EHV-1-gp14-Gens enthüllt eine ausgedehnte Homologie mit den Glykoproteinen anderer Herpesviren. So ist EHV-1 gp14 homolog mit gll von PRV (62), gl von BHV-1 (63) gll von Varicella zoster-Virus (VZV) (66), gB von Herpes simplex-Virus (HSV) (67, 71, 72), genauso wie mit den Glykoproteinen in Epstein-Barr-Virus (EBV) (68) und menschlichem Cytomegalovi-rus (HCMV) (10). 10

Oligonucleotidgesteuerte Mutagenese des 5'-Terminus der EHV-1 gpl4 codierenden Sequenz.

Wie wiederum Fig. 5 zeigt, wurde das Plasmid Blue (Kpnl/BamHI) durch Inserieren eines Kpnl/BamHI-Fragments aus pUC (BamHl-a/EcoRI) in das Plasmid Bluescript SK + , das mit Kpnl/BamHI gespalten i5 worden war, erzeugt. Oligonucleotidgesteuerte Mutagenese wurde nach einem modifizierten Verfahren nach Kunkel (17) durchgeführt unter Verwendung Uracil enthaltender DNA-Matrizen des Plasmids Blue (KPNI/BamHI), das in dem dut" ung" Wirts E. coli-Stamm CJ236 produziert wurde. In dem mutagenisierten Plasmid wurde eine Nsil-Stelle in den Codons 1 und 2 des FHV-1 gp14-Gens erzeugt durch das Verändern der Sequenz ATG/TCC (Met/Ser) zu ATG/CAT (Met/His). Die mutierte Sequenz wurde durch DNA-20 Sequenzanalyse verifiziert. Das Kpnl/BamHI-Fragment aus der Mutante wurde in mit Kpnl/BamHI gespaltenes pUCl8 transferiert, wodurch das Plasmid pUC (Kpnl/BamHI) erzeugt wurde.

Das Plasmid pUCg14, das das gesamte EHV-1 gp14-Gen mit der Nsil-Stelle-Mutation enthielt, wurde konstruiert durch Inserieren des EcoRI/BamHI-Fragments aus pUC (Kpnl/BamHI in mit EcoRI/BamHI gespaltenes pUC (BamHl/Pstl), einem 3,9 kb Subclon von pUC (BamHI-i). 25

Konstruktion des Chimären Donorplasmids pVM2LH6gl4. pMP409DVC wurde mit Bglll gespalten und mit der synthetischen doppelsträngigen DNA ligiert, die den in Beispiel 1 beschriebenen, von Restriktionsstellen flankierten (früh/spät) Vaccinia-Promotor H6 30 enthielt. Restriktionsstellen für Nsil, Sacl, Pstl und EcoRI wurden unmittelbar stromabwärts durch endogene Initiationscodons im H6-Promotor erzeugt. Die Polylinkersequenz in pMG11 stromabwärts des H6-Promo-tors lautet ATG CAT GAG CTC TGC AGA ATT CGG ATC T. Der einzigen Nsil-Stelle, die das (unterstrichene) H6-Initiationscodon enthält, folgen unmittelbar einzig vorkommende Sacl-, Pstl- und EcoRI-Stellen.

Das dem EHV-1-DNA-Bereich stromaufwärts des EHV-1 gp14 Initiationscodons enthaltende EcoRI /Nsil-35 DNA-Fragment von pUCGl4 wurde das EcoRI/Nsil-Fragment des Plasmids pMGH ersetzt, wodurch das Plasmid pMRHg14 erzeugt wurde, das den rechten Arm von Vaccinia Hindill M, den H6-Promotor und die gesamte Länge des EHV-1 gp14-Gens enthält. Das Hpal/Pstl-EHV-1 -gpl 4 enthaltende Fragment aus dem Plasmid pMRHg14 wurde in das Vektorplasmid pMGH, das mit Hpal/Pstl gespalten war, transferiert, womit das Plasmid pVM2lH6g14 erzeugt wurde. pVM2LH6g14 enthält die gesamte EHV-1 gpi4 codierende 40 Sequenz (mit - wie angedeutet - dem zweiten von TCC (Ser) nach CAT (His) veränderten Codon und mit ungefähr 1,2 kb EHV-1 DNA stromabwärts des EHV-1 gp14-Gens) unter der Kontrolle des H6-Promotors, inseriert in einer Rechts-nach-Links-Orientierung relativ zu den bezüglich des Vaccinia-Genoms flankierenden Vaccinia-Sequenzen, die die Insertion des EHV-1 gp14-Gens in den M2L-Ort leiten.

Die Rekombination wurde unter Verwendung des Rettungs-Virus vP458 und des Donorplasmids 45 pVM2LH6g14 durchgeführt. Farblose Plaques wurden gepickt und auf die Anwesenheit von EHV-1 gpl4 codierenden Sequenzen hin untersucht unter Verwendung einer spezifischen “P-markierten EHV-1 gp14-Sonde. Nach wiederholter Plaque-Clonierung wurde die Vaccinia-Rekombinante mit vP577 bezeichnet.

Verkürzung der EHV-1 gp14 hydrophilen Leader-Sequenz. 50

Unter Verwendung von Varianten der vorstehend beschriebenen Mutagenese- und Clonierungsmanipu-lationen wurde das Chimäre Donorplasmid pVM2LH6g14-1 konstruiert. Zur Erzeugung von pVM2LH6gl4-1, bei dem die Codons 2 bis 34 von EHV-1 gp14 deletiert und vier Codons substituiert sind, wurde eine in vitro-Mutagenese (17) an Plasmid Blue (Kpnl/BamHI) durchgeführt, wodurch eine Nsil-Stelle in den Codons 55 32 bis 34 statt in den Codons 1 und 2 erzeugt wurde. Mit dem Nsil/BamHI-Fragment von dem eben erzeugten Blue (Kpnl/BamHI)-Plasmid wurde das Nsil/BamHI-Fragment in pVM2LH6g14 substituiert. Multiple Nsil-Linker (New England BioLabs, Beverly, MA) wurden in die Nsil-Stelle ligiert, um das Start-ATG in das richtige Raster mit der übrigen EHV-1 gp14 codierenden Sequenz zu bringen. Das schließlich erhaltene 17

I m

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Plasmid, pVM2LH6g14-1, enthält die Sequenz ATG/CAT/G CA/TG C/ATT/GCT.,.. die

Met/His/Ala/Cys/lle/Ala.... codiert, wobei GCT (Ala) das Codon 35 von EHV-1 gpl4 ist. Der Rest von pVM2LH6g14-1 ist mit dem in pVM2LH6g14 identisch.

Die Vaccinia-Rekombinante vP613 wurde durch Rekombination mit dem Rettungsvirus vP458 und dem 5 Donorplasmid pVM2LH6g14-l erhalten.

Beispiel 3

Konstruktion der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP633 und vP634, die jedes der beiden Herpesvi-70 rus-Glykoproteine gp13 und gp14 exprimieren

Um Vaccinia-Rekombinante zu exprimieren, die sowohl das gp13 als auch das gp14 EHV-1 -Glykopro-tein exprimieren, wurde eine Rekombination durchgeführt mit entweder vP577 oder vP613 als Rettungsvirus und dem Donorplasmid pVHA6gl3 (beschrieben in Beispiel 1), das das EHV-1 gp13-Gen unter der 75 Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors im HA-Deletionsort von Vaccinia inseriert enthält. Die Insertion von EHV-1 gp13-Sequenzen in rekombinante Viren wurde durch in situ DNA-Hybridisierung identifiziert (25,28). Die Rekombination von pVHA6g13 mit der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP577 (die EHV-1 gp14 in voller Länge enthält) erzeugt die Doppel-Vaccinia-Virus-Rekombinante vP633; Rekombination mit vP613 (die das verkürzte EHV-1 gp14 enthielt), erzeugte die Doppel-Vaccinia-Rekombinante vP634. Die Vaccinia-Virus-so Doppelrekombinanten vP633 und vP634 wurden Plaque-cloniert, und das Vorhandensein der beiden EHV-1 gp13 und gp14 codierenden Sequenzen wurde durch DNA-Hybridisierungsanalyse und durch Expressionstests bestätigt (siehe unten).

Immunpräzipitation der in Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimierten EHV-1 gp13- und gp14-Glykoprotei-25 ne.

Zur Beurteilung der EHV-1 gp13- und gp14-Glykoproteine, die durch die Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimiert wurden, wurden VERO-Zellen mit den Rekombinanten infiziert, die Proteine metabolisch 35S-Methionin markiert und, wie in Beispiel 1 beschrieben, immunopräzipitiert. Der spezifische monoclonale 30 Antikörper gegen EHV-1 gpl3 (4H7) oder gegen EHV-1 gp14 (3F6) (3) wurde in einer l:1000-fachen Verdünnung 4 Stunden bei Raumtemperatur gebunden. Die Proben wurden durch SDS-Polyacrylamidgel-elektrophorese auf einem 10%-igen Polymergel ungefähr 6 Stunden bei 30 mA (konstante Stromstärke) analysiert. Es wurden Autoradiogramme angefertigt.

Von entweder unifizierten VERO-Zellen oder VERO-Zellen, die mit dem Kontroll-Vaccinia-Virus vP452 35 (184), das Hämagglutinin minus ist, wurden durch den spezifischen monoclonalen anti-EHV-1 gp13-

Antikörper 14Hz (3) oder durch den spezifischen monoclonalen anti-EHV-1 gp14-Antikörper 3F6 (3) keine nennenswerten Produkte immunpräzipitiert. Radioaktiv markierte EHV-1 gp13-Produkte wurden durch den monoclonalen Antikörper 14H7 aus VERO-Zellen präzipitiert, die infiziert waren mit vP483, einer Vaccinia-Rekombinanten, die nur EHV-1 gpl3 exprimiert, oder den Vaccinia-Virus-Doppelrekombinanten, die sowohl 40 EHV-1 gp13 und entweder intaktes (vP633) oder verkürztes (vP634) gp14 exprimieren. Es lassen sich zwei Produkte mit ungefähr 44 und 47 kDa nachweisen, die etwas kleiner als das vorhergesagte primäre Translationsprodukt (51 kDa) sind und ein größeres Produkt mit ungefähr 90 kDA, das sich in Einklang mit einer vollständig glykosylierten Form des EHV-1 gp13 Genproduktes befindet. Es ist bemerkenswert, daß die Qualität und Quantität der Expression von EHV-1 gp13 durch die Coexpression einer der EHV-1 gpl4-46 Formen in den Vaccinia-Doppel-Rekombinanten vP633 und vP634 nicht beeinflußt wird. VERO-Zellen wurden mit vP633, vP634, vP613 bzw. vP577 infiziert und eine Immunpräzipitation wurde mit dem spezifischen monoclonalen anti-EHV-1 gp14-Antikörper 3F6 (3) durchgeführt. Mit vP633 (das gpl4 in voller Länge plus gp13 enthielt) und mit vP577 (das gp14 in voller Länge enthielt) wurden Hauptbanden bei ungefähr 34, 47, 60-64 und 90 kDa beobachtet; während mit vP634 (das das verkürzte gp14 plus gp13 so enthält) und mit vP613, das das verkürzte gp14 enthält, wurden Hauptbanden bei 34, 47, 57, 72-82 und 116 kDa beobachtet. Wieder ließen sich keine nennenswerten Unterschiede in der Synthese von irgendeiner Form von EHV-1 gpl4 während der Coexpression mit EHV-1 gpl3 beobachten.

Immunfluoreszenzanalyse der von den rekombinanten Vaccinia-Viren synthetisierten Produkte EHV-1 gpl3 55 und gp14.

Immunfluoreszenz von mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten VERO-Zellen wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt unter Benutzung von entweder EHV-1 gpl3- oder gp14-spezifischem monoclo- 18

AT 405 184 B nalen Antikörper. EHV-1 gp13 ließ sich genauso leicht auf der Oberfläche von VERO-Zellen nachweisen, die mit den Vaccinia-Rekombinanten vP483, vP633 und vP634 infiziert waren, wie auch intern nach Acetonfixierung. In vP410, vP577 oder vP613 infizierten Zellen war keine nennenswerte interne oder Oberflächen-Immunreakti-vitat gegen gp13-spezifischen Antikörper zu beobachten. Die Expression von EHV-1 gp14 ließ sich in Aceton fixierten VERO-Zellen leicht nachweisen, die mit den Vaccinia-Rekombinanten vP577, vP613, vP633 und vP634 infiziert waren. In vP410 oder vP483 infizierten Zellen ließ sich keine nennenswerte interne Immunfluoreszenz mit gp14 spezifischen Antikörpern beobachten. Unter Verwendung des gp14-spezifi-schen monoclonalen Antikörpers 3F6, wurde eine schwache Oberflächen-Immunfluoreszenz in Zellen beobachtet, die mit vP613 oder vP634 infiziert worden waren, die die verkürzte Form von EHV-1 gp14 exprimieren, und es wurde mit den rekombinanten Vaccinia-Viren vP577 und vP633, die das EHV-1 gp14-Gen in der vollen Länge exprimieren (vgl. ebenfalls Beispiel 89) keine nennenswerte Oberflächenantwort gegenüber der Kontrolle mit den Viren vP410 und vP483 erhalten.

Beispiel 4

Immunisierung von Meerschweinchen mit der Vaccinia-Rekombinante vP483

Um die Immunogenität des von der Vaccinia-Rekombinanten vP483 exprimierten Pferde-Herpesvirus gpl3-Gens zu bestimmen, wurden Meerschweinchen mit dem Virus inoculiert, und es wurde auf die Anwesenheit von serumneutralisierenden Anti-körpern sowohl gegen das Vaccinia-Virus als auch das Pferde-Herpesvirus getestet. 15 Meerschweinchen mit einem Gewicht von ungefähr 450 g wurden in fünf Gruppen unterteilt. Eine Gruppe erhielt 1 ml der Vaccinia-Rekombinanten (K^TClDso/ml) am Tag 0, denen am Tag 21 ein 1 ml Booster durch subkutane Inoculation folgte. Die zweite Gruppe erhielt ähnliche Inoculationen, aber mit dem Vaccinia vP452 (lO^CIDso/ml). Die dritte Gruppe blieb unvakziniert. Allen Meerschweinchen wurde vor der ersten Vakzinierung und an den Tagen 21 und 35 Blut entnommen. Es wurden Seren bereitet und auf die Anwesenheit von neutralisierenden Antikörpern sowohl gegen Vaccinia als auch gegen EHV-1 (Stamm Kentucky) unter Verwendung von 50 TCIDso des Virus auf Schweinehodenzellen getestet.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, ruft die ENV-1 gp13- Vaccinia-Rekombinante vP483 eine offensichtliche Serokonversion in Meerschweinchen hervor. Mit Vaccinia-Virus erhaltene serumneutralisierende Titer sind in Klammern in Tabelle 1 aufgeführt. Sowohl Vaccinia als auch EHV-1-Serum neutralisierende Antikörper sind 21 Tage nach der primären Inoculation nachweisbar, und eine signifikante Zunahme des Titers der serumneutralisierenden Antikörper erhält man 2 Wochen nach einer zweiten Inoculation des Virus am Tag 21. Es wird darauf hingewiesen, daß die Vaccinia-neutralisierenden Serumtiter, die in Meerschweinchen erhalten wurden, die mit dem EHV-1 gp13 exprimierenden rekombinanten Virus inoculiert waren, signifikant höher lagen (t = 7,2) als die aus dem mit dem Vaccinia-Virus vP452 inoculierten Meerschweinchen. 19

AT 405 184 B

Tabelle _1 fierumneutralisierende Antikörper, die in Meerschweinchen vorhanden waren, die entweder mit einer Vaccinia-Rekoobinan-ten, die EHV-1 gp!3 expriaiert, oder mit dem Kontroll-Vaeci- nia-Virus ▼P452 inoculiert waren 10 .Serumneutralisierender Titer nn«. >n) an d. Taoen Virus-Inoculum Tier Nr £ 21 - 25 15 Unvakzinierte 26 0.24 (0.35) — 0.24 (0.70) Kontrollen 27 0.24 (0.35) — 0.56 (1.05) 28 0.24 (0.35) — 0.80 (0.70) 20 29 0.24 (0.35) — 0.40 (0.70) 30 0.24 (0.35) —— 0.32 (0.35) 25 Kontrolle 191 0.24 (0.35) 0.36 (0.47) 0.72 (1.75) Vaccinia-Virus 192 0.24 (0.35) 0.21 (0.93) 0.24 (2.30) VP452 193 0.24 (0.35) 0.48 (0.58) — 194 0.24 (0.35) 0.24 (0.82) 0.24 (2.10) 30 195 0.24 (0.35) Rekombinantes 186 0.24 (0.35) 0.48 (1.28) 1.20 (2.57) 35 Vaccinia 187 0.24 (0.35) 0.72 (1.63) 1.68 (2.57) Virus vP483 188 0.24 (0.35) 0.24 (1.52) 1.68 (2.57) 189 0.24 (0.35) 0.36 (1.40) 1.56 (2.22) 40 190 0.24 (0.35) 0.48 (1.63) 1.56 (3.00)

Beispiel 5 <5

Immunisierung von Meerschweinchen mit den Vaccinia-Rekombinanten vP577 und vP613

Zur Beurteilung ihrer Immunantwort gegen das durch die Vaccinia-Rekombinanten vP577 und vP613 exprimierte EHV-1 gpl4 wurden Meerschweinchen immunisiert. Meerschweinchen, die ungefähr 450 g so wogen, erhielten auf subkutanem Weg am Tag 0 und am Tag 21 je 1 ml 105 TCID50 der Vaccinia-Rekombinanten vP577 oder, alternativ, vP613. Es wurde an den Tagen 0, 21 und 35 Meerschweinchen Blut entnommen, Seren bereitet und auf EHV-1 -Antikörper hin getestet. Neutralisationstests wurden mit Schweinehodenzellen gegen 50 TCID50 des EHV-1-Virus, Stamm Kentucky, vorgenommen. Unter Verwendung eines antilgG-(H&L) Peroxydasekonjugats wurden die Vaccinia-Antikörper mittels ELISA getitert. 55 Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Es wurde keine serumneutralisierende Aktivität gegen EHV-1 in Meerschweinchen erhalten, die mit der Vaccinia-Rekombinanten vP577 immunisiert waren, die die volle Länge des EHV-1 gpl4-Gens enthielt (Ergebnisse nicht gezeigt). Andererseits wurden Meerschweinchen, die mit der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP613 inoculiert waren, die ein verkürztes EHV-1 gpl4- 20 ΑΤ 405 184 Β

Gen exprimierte, ähnliche Spiegel EHV-1 serumneutralisierender Antikörper induziert (Tabelle 2) wie es die Vaccinia-Rekombinante vP483 tat, die EHV-1 gpl3 exprimierte (Tabelle 1). Obwohl die EHV-1 serumneutralisierenden Antikörper 3 Wochen nach der ersten Vakzinierung nachweisbar waren, wurde ein signifikant höherer Spiegel 2 Wochen nach der zweiten Immunisierung beobachtet (Tabelle 2). In allen immunisierten Tieren wurde eine Immunantwort beobachtet, wenn man durch ELISA auf Vaccinia-Antikörper testete.

Tabelle 2

Serumneutralisierende Antikörper, die in Meerschweinchen vorhanden sind, die mit einer Vaccinia-Rekombinanten, die EHV-1 gpl4 exprimfert, inoculiert sind Serumneutralisierender Titer (logi0) an den Tagen Virus-Inoculum 0 21 35 Rekombinantes 0.4 0.7 1.3 Vaccinia-Virus vP613 0.2 0.7 1.2 0.2 0.7 1.7 0.2 1.1 1.6 0.2 1.0 1.6 Unvakzinierte Kontrollen 0.2 — 0.4 0.6 ... 0.4 0.7 — 0.8 0.6 — 0.2 0.4 — 0.4

Beispiel 6

Schutz vakzinierter Hamster gegen EHV-1-Infektion

Um die Wirksamkeit der EHV-1 gp13 exprimierenden Vaccinia-Rekombinanten vP483 zu beurteilen, wurde Hamstern eine primäre oder eine primäre plus Hilfs-Vakzinierung verabreicht, und sie wurden parallel mit einer nicht-inoculierten Kontrollgruppe oder einer Gruppe, die zweimal mit dem Kontroll-Vaccinia-Virus vP452 inoculiert war, einer Infektion durch einen intraperitoneal verabreichten Hamster-adaptierten Kentuk-ky-Stamm von EHV-1 ausgesetzt.

Vierzig syrische Hamster (40 Tage alt, Gewicht zwischen 55 und 65 g) wurden in vier Gruppen unterteilt. Gruppe A erhielt eine einzige subkutane (1 ml) Inoculation mit der Vaccinia-Rekombinanten vP483 von 10®, 10® oder 104 TCIDso mit fünf Tieren pro Dosis. Gruppe B wurde mit vP483 am Tag 0 vakziniert, dem ein Booster am Tag 14 nachfolgte. Die (1 ml) primären- und Booster-Dosen wurden den Gruppen von 5 Tieren subkutan verabreicht, wobei 10®, 10® oder 104 TCIDso verwendet wurden. Gruppe C bestand aus 5 Hamstern und erhielt 2 subkutane Injektionen von Vaccinia vP452 (10® TCIDso pro Injektion) an den Tagen 0 und 14. Fünf Hamster in Gruppe D wurden als unvakzinierte Kontrollen belassen. Allen Hamstern wurde auf intraperitonealem Weg 14 Tage nach der letzten Immunisierung 200 LDso eines Hamster-adaptierten Kentucky-Stammes von EHV-1 verabreicht. Überlebende wurden 7 Tage nach der Behandlung mit dem Erreger gezählt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Alle unvakzinierten und mit dem Vaccinia vP452-Virus vakzinierten Hamster verendeten innerhalb von 5 Tagen nach der Behandlung mit dem Erreger. 21

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Tabelle 3

Schutz von Hamstern# die mit EHV-1 gpl3 exprimierendem re· Icombinantem Vaccinia vakziniert sind# gegen EHV-l-lnfektion

Vakzinierendes Virus

Rekombinantes Vaccinia vP483 Kontroll-Vaccinia vP452 Nr. Virus Primär Booster Booster

Vakzinierungs· 864 864 8 dosis log10 tcidm & Sl 5 5

Verhältnis £12 5. 2 Q Überlebende 5 5 5 5 5 5

Eine signifikante Höhe des Schutzes gegen EHV-1-Erreger wurde in Hamstern beobachtet, die mit dem rekombinanten Vaccinia vP483, das EHV-1 gp13 exprimiert, vakziniert waren. In der Stärke des Schutzes wurden keine signifikanten Unterschiede bei Hamster beobachtet, die entweder mit einer primären Dosis oder mit einer primären und einer zusätzlichen Booster-Dosis immunisiert waren. Die Schutzdosis (PDso) war ähnlich; PDso = 6,32 log-i0 für die primäre und 6,12 logio für die primäre plus Booster-Dosis. Nichtsdestoweniger wurde ein 100%-iger Schutz nur in der Gruppe beobachtet, die zweimal die Dosis von 108 TCIDso vom rekombinanten Virus erhielt.

Zur Bestimmung der Wirksamkeit des Schutzes eines rekombinanten Vaccinia-Virus, das EHV-1 gp14 alleine oder in Kombination mit EHV-1 gp13 exprimiert, wurden Untersuchungen durchgeführt, bei denen vakzinierte Hamster einem Erreger ausgesetzt wurden. Zwanzig 1 Tage alte syrische Hamster, von denen jeder ungefähr 60 g wog, wurden subkutan mit 1 ml eines Kontroll-Vaccinia-Virus oder mit den rekombinanten Vaccinia-Viren vP483, vP577, vP613, vP633 und vP634 inoculiert, die EHV-1 gp13 und/oder gp14 exprimieren. Einer primären Vakzinierung folgte am Tag 14 eine Vakzinierung mit einer identischen Vakzinierungsdosis (pfu/ml (logio))- Alle Hamster, einschließlich der nicht-inoculierten Kontrollen, wurden 14 Tage nach der letzten Immunisierung mit einer intraperitonealen Injektion von 200 LDs0 des EHV-1 Hamsteradaptierten Kentucky-Stamms infiziert. Die Überlebenden von einer Gruppe aus fünf wurden 14 Tage nach der Infektion, dem Tag, an dem das Experiment beendet wurde, bestimmt. Die Inoculums-Dosis, die einen 50%-igen Schutz der Hamster ergibt, berechnet sich als logio TCIDso/ml Inoculum.

Wie in Tabelle 4 gezeigt, war die Vaccinia-Virus-Rekombinante vP577, die EHV-1 gp14 in voller Länge exprimiert, nicht in der Lage, Hamster mit einer berechneten PD50 £ 9,0logio gegen eine Infektion zu schützen. Andererseits gab das durch die Vaccinia-Rekombinante vP613 exprimierte verkürzte EHV-1 gp14-Gen einen guten Schutz gegen die Infektion (Tabelle 4). Der berechnete PD50 ist etwas besser (5,2) als der mit der EHV-1 gp13 exprimierenden Vaccinia-Rekombinante vP483 (6,1) erhaltene. Die Coexpression von EHV-1 gpl3 und gpl4, gleichgültig, ob es sich um das gp14-Gen mit voller Länge oder um das verkürzte gpl4-Gen im Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP633 bzw. vP634 handelte, ergab überraschenderweise eine signifikant gesteigerte schützende Wirkung verglichen mit der Wirksamkeit der einzeln exprimierten EHV-1-Glykoproteine. Somit war die Menge des Virusinoculums zur Erreichung eines 50%igen Schutzes der vakzinierten Hamster signifikant verringert, wenn EHV-1 gp13 und gp14 in derselben Vaccinia-Virus-Rekombinanten coexprimiert wurden. 22

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Tabelle 4

Schutz von Hamstern, die mit den Vaccinia-Rekombinanten vakziniert sind, die EHV-1 gpi3 und/oder gpi4 exprimieren, gegen eine EHV-1-Infektion Inoculum EHV-1 -Proteinens VakzinierungsdosiSiO berlebende PDS0 vP483 gp13 8/5 6/2 4/0 6.1 Keine — 0/0 ... — — vP577 gp14 8/1 6/0 4/0 *9.0 Keine — 0/0 ... -- — vP613 gpi4* 8.4/5 6.4/5 4.4/1 5.2 vP633 gp13 + gpl4 8/5 6/3 4/4 4.3 vP634 gpi3 + gpi4* 7.6/5 5.6/5 3.6/5 £3.6 Vaccinia ... 8/0 — — *9.0 Keine — 0/1 — ... — VP613 und vP634 exprimieren die verkürzte Version von EHV-1 gpl4.

Beispiel 7

Konstruktion von Vogel-Pockenvirus-Rekombinanten, die das Pferde-Herpesvirus gp13-Glykopro-tein exprimieren

Wie in Fig. 8 gezeigt, wurde pVHA6g13 als Quelle für das EHV-1 gp13-Gen verwendet. Um den DNA-Abschnitt, der das gesamte EHV-1 gp13-Gen enthält, zu isolieren, wurde pVHA6g13 mit Nrul und Hindili gespalten. Durch diese Spaltung wurde ein Fragment mit ungefähr 1,8 kb erzeugt, das 28 bp des 3'-Endes des Vaccinia-Virus H6-Promotors, das gesamte EHV-1 gp13-Gen und ungefähr 410 bp Vaccinia-Virus-Sequenzen enthält. Das 1,8 kb Nrul/Hindlll-Fragment wurde isoliert zum Inserieren in die Vogelpockeninsertionsvektoren pFPCV2 und pCPCVI.

Der Geflügelpocken-Virus(FP)-lnsertionsvektor pFPCV2 liefert ein Vehikel zur Erzeugung von Rekombinanten, die fremde Gene in einem nicht essentiellen Bereich des FP-Genoms beherbergen, der mit f7-Ort bezeichnet wird. pFPCV2 wurde von pRW731.13 abgeleitet. Das Plasmid pRW731.13 enthält ein FP-genomisches Pvull-Fragment mit ungefähr 5,5 kb, das zwischen die beiden Pvull-Stellen von pUC9 inseriert ist. Zuerst wurde eine multiple Clonierungssequenz (MCS) in die einzige Hincll-Insertionsstelle innerhalb dieses genomischen 5,5 kb Pvull FP-Fragments ligiert. Die MSC wurde durch Aneinanderlagern der Oligonucleotide CE4 (5 ’ -TCGC GAGAATTCGAGCTCGGTACCGGGGATCCTCTGAGTCGACC TGCAGGCATGCAAGCTTGTT-3*) und CE5

(5f - AACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTTAGAGGA TCCCCGGTACCGAGCTCGAATTCTCGCGA-3 *) · erhalten. Das die MCS enthaltende Plasmid wurde mit pCEl 1 bezeichnet. pFeLVIA ist ein Abkömmling des Vaccinia-Insertionsvektors pTPl5 (184) (Hg. 3), in dem das Katzen-Leukämievirus (FeLV)-env-Gen (192) in die Pstl-Stelle stromabwärts des H6-Promotors inseriert ist. Um die 2,4 kb Expressions-Kassette in einem FP-Vektor zu transferieren (Fig. 8) wurden die H6/FeLV env-Sequenzen durch Spaltung mit Bglll und partielle Spaltung mit Pstl aus pFeLVIA ausgeschnitten. Die Bglll-Stelle befindet sich an der 5'-Grenze der H6-Promotorsequenz. Die Pstl-Stelle liegt 420 bp stromabwärts des Translations-Terminationssignals des offenen Leserahmens für das FeLV-Hüllglykoprotein. 23

AT 405 184 B

Die 2,4 kb H6/FeLV env-Sequenz wurde in mit BamHI und Pstl gespaltenes pCE11 inseriert. Dieses Plasmid wurde mit pFeLVFl bezeichnet. Das Plasmid pFeLVFt wurde dann mit Pstl gespalten, um die FeLV env-Sequenzen zu entfernen. Das resultierende Plasmid, das den Vaccinia-Virus H6-Promotor innerhalb von pCE11 enthält, wurde mit pFPCVI bezeichnet. Zur Entfernung von nicht-relevanten Sequenzen wurden unter Verwendung des Oligonucleotids FPCV1 (5 '-CAGTAATACACGTTATTGCAGAGAGGACCATTCTTTATTCTATACTTAAAAA6T-3') die Sequenzen 5'-seitig des Promotors mutagenisiert (19), um das Plasmid pFPCVI herzustellen. Zur Entfernung der Sphl-Stelle, die ein ATG enthält, wurde der Bereich 3'-seitig des Promotors (multiple Clonierungsstelle) mit dem Oligonucleotid FPCV3 (5 · -TAGAGT CGACCTGCAGGCATCCAAGCTTGTTAACGAC-3 ·) mutagenisiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pFPCV2 bezeichnet.

Das vorstehend definierte 1,8 kb Nrul/Hindlll EHV-1 gpl3-Fragment wurde in das durch Spaltung aus pFPCV2 abgeleitete 8,0 kb Nrul/Hindlll-Fragment inseriert. Dieses 8,0 kb Nrul/Hindlll-Fragment enthielt den 5'-Teil des Vaccinia-Virus-H6-Promotors (100 bp), die FP-flankierenden Sequenzen (4,8 kb stromaufwärts und 1,5 kb stromabwärts von der Insertionsstelle) und 2,4 kb von pUC (BRL, Bethesda, MD). Eine Ligation dieser beiden Fragmente ergab die Bildung eines 9,8 kb-Plasmids, das mit pFPEHV13A bezeichnet wurde.

Das Plasmid pFPEHV13A wurde dann mit Kpnl und Hindlll gespalten, um ein ungefähr 600 bp-Fragment zu entfernen. Dieses Fragment enthielt den am meisten 3'-seitig gelegenen Bereich des EHV-1 gpl3-Gens (200 bp) und den.410 bp Vaccinia-Virus-DNA-Abschnitt. Das 600 bp Kpnl/Hindlll-Fragment wurde durch ein aus pNSIENPN (Fig. 3) abgeleitetes 200 bp-Fragment wie folgt ersetzt. Eine Pstl-Spaltung von pNSIENPN linearisierte das Plasmid. Die Pstl-Termini wurden durch T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, Ma) in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) stumpfendig gemacht. Das stumpfendige Fragment wurde dann mit Hindlll-Linkern (BRL, Bethesda, MD) ligiert. Nach einer Spaltung mit Hindlll wurde das linearisierte Plasmid mit Kpnl gespalten, wodurch sich ein 200 bp-Fragment ergab, das den 3'-Teil des EHV-1 gp13-Gens, die mit dem Terminationscodon (TAG) korrespondierende Sequenz und das Sequenzmotiv I II I I NT, das als ein frühes Vaccinia-Virus-Transkriptions-Terminationssignal bekannt ist (45), enthielt. Das rekombinante Plasmid wurde mit pFPEHVl3B bezeichnet, und wurde bei der in vitro-Rekombination zur Insertion des unter dem H6-Promotor stehenden EHV gpl3-Gens in den f7-Ort des FP-Genoms verwendet. Das rekombinante Geflügelpockenvirus wurde als vFP44 bezeichnet.

Wie aus Fig. 9 hervorgeht, wurde pFPEHV13B ebenfalls zur Erzeugung eines 1,4 kb Nrul/Hindlll-Fragments zum Inserieren in pCPCVI verwendet. Das Plasmid pCPCVI enthält den Vaccinia-Virus H6-Promotor in der einzigen EcoRI-Stelle des genomischen 3,3 kb Pvull-Kanarienpockenvirus-Fragments. Dieses Insertionsplasmid erlaubt die Insertion fremder Gene in den C3-Ort des CP-Genoms. pCPCVI war von pRW764.2 abgeleitet, das ein genomisches 3,3 kb Pvull CP-Fragment in dem pUC-Vektor inseriert, enthielt. pRW764.2 wurde durch Spaltung mit EcoRI linearisiert. Dieses Fragment wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) stumpfendig gemacht. Die Vaccinia-Virus H6-Promotorsequenzen und ein 3'-seitig des Promotors gelegener multipler Clonierungsbereich wurden durch Spaltung mit Kpnl/Hpal aus pFBCVI ausgeschnitten. Dieses 200 bp-Fragment wurde mit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) stumpfendig gemacht und in das linearisierte stumpfendige Plasmid pRW764.2 inseriert. Das resultierende Piasmid wurde mit pCPCVI bezeichnet. Das Plasmid pCPCVI wurde mit Nrul und Hindlll gespalten, und das 5,8 kb-Fragment wurde isoliert, um es mit dem oben beschriebenen EHV gp13 enthaltenden 1,4 kb-Fragment zu ligieren. Das resultierende Plasmid wurde mit pCPEHVl3A bezeichnet. Dieses Plasmid wurde in in vitro-Rekombinationsexperimenten zur Insertion des unter der Kontrolle des H6-Promotors stehenden EHV gp13-Gens in den C3-Ort des CP-Genoms verwendet Das rekombinante Kanarienpockenvirus wurde mit vCP48 bezeichnet.

Anschließend an die in vitro-Rekombination wurde das das EHV-1 gpl3-Gen enthaltende rekombinante Vogelpockenvirus durch einen Standardplaque-Hybridisierungstest identifiziert. Positive Plaques wurden durch 3 Runden Plaque-Isolierung gereinigt und anschließend einer Hybridisierungsanalyse unterworfen. Die Rekombinanten wurden als vFP44 und vCP48 für die FP- bzw. die CP-Rekombinanten bezeichnet. Beide Rekombinanten wurden mit einem monoclonalen Antiserum gegen EHV-1 gp13 unter Verwendung eines Protein A-jS-Galactosidase-lmmun-Screening-Tests analysiert. Die Ergebnisse bewiesen, daß entweder mit 24

AT 405 184 B vFP44 oder vCP48 infizierte CEF- und VERO-Zelleinzelschichten das EHV-1 gp13 an der Oberfläche der virusinfizierten Zellen exprimieren.

Beispiel 8

Beurteilung weiterer Vaccinla-Virus-Rekombinanter, die unmodifizierte und modifizierte Versionen des Gens von Pferde-Herpesvirus 1 exprimieren, das das Glykoprotein gp14 codiert

Konstruktion und Beurteilung eines weiteren rekombinanten Vaccinia-Virus, das ENV-1 gp14 exprimiert. Die EHV-1 gp14 enthaltenden Konstruktionen (Beispiel 2) wurden auf dreierlei Weise modifiziert: (a) Verändern der Länge der EHV-1 gp14 Leader-Sequenz; (b) Entfernung überschüssiger EHV-1 DNA 3'-seitig des Gens und (c) für die Auswertung ein Inserieren der modifizierten Versionen des EHV-1 gp14-Gens in ein Vaccinia-Virus-vP293-Wirtsbereichs-Selektionssystem (69).

Das EHV-1 gpl4-Genprodukt enthält eine ungewöhnlich lange Leader-Sequenz. Es wird vermutet, daß die lange hydrophobe Sequenz, die sich von Aminosäure 58 bis 99 erstreckt, die Signalsequenz ist. Diesem Bereich geht eine lange hydrophile Sequenz voran. Eine ähnlich lange Leader-Sequenz ist auch für die beiden anderen Homologen, Pseudorabies-Virus gll (62) und Rinder-Herpesvirus 1 gi (63), festgestellt worden.

Modifikation des 5'-Endes von EHV-1 gpl4.

Um den Einfluß der Länge der Leader-Sequenz von EHV-1 gp14 auf die weitere Verarbeitung, das Auftreten und die immunologische Wirksamkeit des im rekombinanten Vaccinia-Virus exprimierten gp14-Produktes zu untersuchen, wurden durch ein Modifizieren der früheren EHV-1 gp14 enthaltenden Konstruktionen Plasmide in der nachfolgenden Weise konstruiert, die das EHV-1 gp14-Gen mit drei unterschiedlichen Längen der Leader-Sequenz enthielten.

Wie aus Fig. 10 hervorgeht, enthält das Plasmid pVM2LH6gl4 (Beispiel 2) die gesamte EBV-1 gp14 codierende Sequenz unter der Kontrolle des H6-Promotors, inseriert in dem M2L-Deletionsort von Vaccinia Copenhagen. In pVM2LH6g14 ist die Aminosäure Nr. 2 des EHV-1 gp14-Gens ein His statt des nativen Ser. Um die Aminosäure 2 in Ser zu ändern, wurde pVM2LH6g14 in den Codons 1 - 2 (Met/His) mit Nsil (Erkennungssequenz ATGCAT) gespalten. Eine Mutagenese wurde durchgeführt (19) unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN240 ( 5 * ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCCTCTGGTTGCCGTTCTGTC 3 · )

Das resultierende Plasmid pMP14M enthält das gesamte EHV-1 gp14-Gen mit dem nativen Codon (Ser) in Position 2.

Abgesehen von einer Verkürzung der Leader-Sequenz und einer Einführung von vier aus den synthetischen Nsil-Linkem hergeleiteten Codons ist das Plasmid pVM2LH6g14*1 (Beispiel 2) identisch mit pVM2LH6g14. In pVM2LH6g14-1 lautet die Sequenz des 5'-verkürzten Endes des EHV-1 gp14-Gens ATG/CAT/GCA/TGC/ATT/GCT... die Met/His/Ala/Cys/Ile/Ala ... codiert, wobei GCT (Ala) Codon 35 von EHV-1 gp14 ist. pVM2LH6g14-1 wurde auf zweierlei Weise durch Mutagenese modifiziert (19). Um eine Version des gpl4-Gens herzustellen, die ungefähr auf dasselbe Ausmaß verkleinert ist wie pVM2LH6g14-1, die der nativen gpl4-Sequenz aber mehr gleicht, wurde pVM2LH6g14-l in den Codons 1 - 2 mit Nsil gespalten. Eine Mutagenese wurde durchgeführt unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN241 (5‘ ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGAGTGTCCCAGCAGCTGGCTCCTGGATC 3*). ln dem resultierenden Plasmid ΡΜΡ14Μ-34 beginnt die EHV-1 gp14 codierende Sequenz mit ATG/AGT/GTC/CCA ...Met/Ser/Val/Pro .... wobei CCA (Pro) die Aminosäure 36 von EHV-1 gp11 ist. Das EHV-1 gp14-Gen enthält eine Nael-Stelle (GCCGGC) bei den Codons 61 - 63 (Lys/Pro/Ala). Um eine stärker verkleinerte Version des EHV-1 gp14-Gens herzustellen, wurde pVM2LH6g14-1 mit Nael linearisiert, anschließend mit Nsil gespalten und das Vektorfragment aus einem Agarosegel isoliert. Eine Mutagenese wurde durchgeführt unter Verwendung des synthetischen Oligonucleotids MPSYN243 25

AT 405 184 B (5' ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCATCATCGAGGGTGGGCACAATAGTT 3'). ln dem resultierenden Plasmid pMP14M-63 beginnt die EHV-1 gp14-codierende Sequenz mit ATG/GCA ... Met/Ala..., wobei GCA (Ala) die Aminosäure 63 des nativen EHV-1 gp14 ist.

Entfernung irrelevanter ENV-1-DNA.

In allen vorstehend diskutierten EHV-1 gp14 enthaltenden Plasmiden folgen den EHV-gp14 codierenden Sequenzen ungefähr 1200 bp EHV-1-DNA. Das Terminationscodon (TAA) für das gp14-Gen liegt innerhalb einer Dral-Stelle (TTTAAA). Zum Entfernen überschüssiger EHV-1-DNA wurde pMP14M-63 einer partiellen Dral-Spaltung unterworfen. Anschließend wurde die linearisierte DNA aus einem Agarosegel isoliert und mit Pstl gespalten, das an der Verbindung von EHV-1-DNA und dem stromabwärts liegenden flankierenden Vaccinia-Arm schneidet. Aus dem Agarosegel wurde eine'6,5 kb Dral/Pstl-DNA-Bande isoliert. Die synthetischen Oligonucleotide MPSYN247 (5' AAATTTTTGTTAACTCGAGCTGCA 3') und MPSYN248 (5’ GCTCGAGTTAACAAAAATTT 3') wurden aneinandergelagert und mit dem 6,5 kb-Fragment ligiert. In dem resultierenden Plasmid pMP14M-63P folgt den EHV-1 gpl4 codierenden Sequenzen unmittelbar eine die Termination der frühen Vaccinia-Transkription spezifizierende Sequenz (45), der ein Polylinkerbereich (die Restriktionsstellen Hpal, Xhol, Pstl enthaltend) und der linke aus Hindill M abgeleitete flankierende Vaccinia-Arm folgt.

Insertion des H6-Promotor/EHV-1 gp14-Gens in ein pHES/vP293-Selektionssystem. ln allen vorstehend diskutierten, das EHV-1 gpi4 enthaltenden Plasmiden steht das EHV-1 gp14-Gen unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors, und ist in dem M2L-Deletionsort des Vaccinia-Virus-Stammes Copenhagen inseriert. Da der M2L-lnsertionsort innerhalb eines größeren Bereichs des Genoms liegt, der sich deletieren läßt (69), wurde die Verlegung der H6-Promotor/EHV-1 gp14-Expressions-Kassette in eine potentiell stabilere Insertionsstelle untersucht. Als vorbereitender Schritt wurden die EHV-1 gp14-Genkonstruktionen, die unterschiedliche Längen der Leadersequenz enthielten, in das auf WR pHES/vP293 basierende Wirtsbereichs-Selektionssystem (69) überführt, um eine schnelle Erzeugung von Vaccinia-Rekombinanten für die vergleichende Auswertung zu ermöglichen.

Das Plasmid pHES-4 enthält den Vaccinia H6-Promotor, dem ein Polylinkerbereich und das Human-Wirtsbereichsgen K1L (70) folgt, wobei sie alle zwischen die WR-Vaccinia-Arme, die eine 21,7 kb Deletion (69) flankieren, inseriert sind. pHES-4 enthält zwei Nrul-Stellen, eine innerhalb des H6-Promotors und eine innerhalb der flankierenden Vaccinia-Sequenzen. pHES-4 wurde durch eine partielle Spaltung mit Nrul linearisiert, und die Bande, die eine linearisierte DNA mit voller Länge enthielt, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Diese linearisierte DNA wurde im Polylinkerbereich in der Xhol-Stelle gespalten. pMP14M-63P enthält Zwei Nrul-Stellen, eine innerhalb des H6-Promotors und die andere innerhalb der EHV-1 gp14 codierenden Sequenzen, 0,2 kb vom 3'-Ende des Gens. pMPl4M-63P wurde mit Nrul linearisiert und anschließend mit Xhol gespalten. Ein 2,8 kb Nrul (partiell)/Xhol-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment enthält einen Teil des H6-Promotors, dem die Form des modifizierten EHV-1 gpl4-Gens folgt, die die kürzeste Version der Leader-Sequenz enthält. Das aus pMP14-63P abgeleitete, den H6-Promotor/EHV-1 gp14 enthaltende 2,8 kb-Fragment wurde mit dem aus pHES-4 abgeleiteten Nrul (partiell)/Xhol-Vektorfragment ligiert. Das resultierende Plasmid pHES-MP63 enthält die H6-Promotor/EHV-1 gp14-Gen-Kassette, ohne nicht relevante EHV-1-DNA. Um die H6-Promotor/EHV-1 gp14 5'-Enden, die Leader-Sequenzen mit voller Länge oder mit einer mäßigen Verkürzung enthielten, wurden die Plasmide pMP14M und pMP14M-34 mit Nrul gespalten und die 2,8 kb bzw. 2,7 kb-Bande wurde aus Agarosegelen isoliert. pHES-MP63 wurde einer partiellen Nrul-Spaltung unterzogen und ein 7,2 kb-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das 7,2 kb-Vektorfragment entspricht pHES-MP63, von dem das dem H6-Promotor/EHV-1 gp14 5'-Ende enthaltende 2,6 kb Nrul-Fragment entfernt worden war. Das aus pHES-MP63 abgeleitete 7,2 kb Nrul (partiell)-Vektorfragment wurde mit dem 2,8 kb Nrul-Fragment aus pMP14M ligiert, wodurch pHES-MPl erzeugt wurde. Das aus pHES-MP63 abgeleitete 7,2 kb Nrul (partiell)-Vektorfragment wurde ebenfalls mit dem 2,7 kb Nrul-Fragment aus pMPl4M-34 ligiert, womit pHES-MP34 erzeugt wurde. Die zur Erzeugung der Plasmide pHES-MP63, pHES-MP1 und pHES-MP34 führenden Clonierungsschritte sind schematisch in Fig. 10 dargestellt.

Die Plasmide pHES-MP1, pHES-MP34 und pHES-MP63 wurden als Donorplasmide zur Rekombination mit vP293 (69) verwendet, um die rekombinanten Vaccinia-Viren vP753 bzw. vP765 oder vP721 zu 26

AT 405 184 B erzeugen. Die rekombinante Nachkommenschaft wurde auf menschlichen MRC-5-Zellen selektioniert.

Auswertung der auf vP293 basierenden Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die das EHV-1 gp14-Gen exprimie-ren.

Um zu bestimmen, ob die drei Formen des EHV-1 gp14 Genproduktes, das in den rekombinanten Vaccinia-Viren vP753, vP765 und vP721 exprimiert wurde, auf der Oberfläche von infizierten Zellen vorhanden waren, wurden VERO-Zelleinzelschichten mit den drei EHV-1 gp14 enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Viren infiziert. Infizierte Zelleinzelschichten wurden auf Oberflächenimmunfluoreszenz unter Verwendung des monoclonalen EHV-1 gp14 spezifischen Antikörpers 3F6 analysiert. Es ergab sich eine positive Oberflächenimmunfluoreszenz für Zellen, die mit allen drei Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP753, vP765 und vP721 infiziert worden waren. Dies zeigt, daß das korrekte Transportieren des EHV-1 gp14-Genprodukts in Vaccinia-infizierten Zellen durch ein Variieren der Länge der Leader-Sequenz nicht beeinflußt wird.

Um die von den drei EHV-1 gpl4 enthaltenden Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimierten EHV-1 gp14-Genprodukte zu vergleichen, wurden MRC-5-Zellen mit vP753, vP765 und vP721 infiziert, und die Proteine wurden metabolisch mit 3SS-Methionin markiert. Mit den radioaktiv markierten Zellysaten wurden unter Verwendung des monoclonalen EBV-1 gpl4 spezifischen Antikörpers 3F6-lmmunpräzipitationen durchgeführt.

Die immunpräzipitierten Proteine aus Zellen, die mit vP753, vP765 und vP721 infiziert worden waren, ließen sich voneinander nicht unterscheiden und waren äquivalent zu den immunpräzipitierten Proteinen von vP613, der EHV-1 gp14 enthaltenden Vaccinia-Rekombinanten, die aus dem Plasmid pVM2LH6g14-1 hergestellt war. Diese Ergebnisse zeigen, daß die in diesen rekombinanten getesteten Variationen in der Länge der EHV-1 gp14-Leader-Sequenz die korrekte Weiterverarbeitung des Genproduktes weder verbesserten noch behinderten.

Um die Wirksamkeit des Schutzes durch Vaccinia-Virus, das die verschiedenen Formen von EHV-1 gp14 exprimiert, auszuwerten, wurden Hamster mit unterschiedlichen Dosierungen von vP753, vP765 und vP721 inoculiert und mit dem Hamster-adaptierten EHV-1 Stamm-Kentucky infiziert. Alle drei EHV-1 gp14 enthaltenden Vaccinia-Rekombinanten haben eine Schutzwirkung mit einem logic PDso von 6,2 oder besser. Unterschiede des Schutzes unter den drei Vaccinia-Virus-Rekombinanten sind statistisch nicht signifikant

Im Gegensatz zu vP577 zeigt eine nachfolgende Vaccinia-Virus-Rekombinante, die ebenfalls durch Rekombination zwischen pVM2LH6g14 und vP458 erzeugt war, ein identisches EHV-1 gp14 Immunpräzipitationsmuster zu dem mit vP613, vP753, vP765 und vP721 beobachteten und exprimierte des EHV-1 gp14-Protein auf der Oberfläche der infizierten Zellen genauso wie diese EHV-1 gpi4 exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Viren.

Die genannten Ergebnisse legen nahe, daß das in der Vaccinia-Virus-RekombinantenvP577 exprimierte EHV-1 gp14 defekt ist und der Defekt wahrscheinlich während der Rekombination zwischen dem Donorplasmid pVM2LH6g14 und dem Vaccinia-Virus vP458 auftrat.

Beispiel 9

Nucleotidsequenz von drei neuen Genen von Pferde-Herpesvirus Typ 1 und Expression in Vaccinia-Virus-Rekombinanten

Um das gp17/18 codierende EHV-1-Gen zu identifizieren und zu isolieren, wurde vor seiner Expression in einem rekombinanten Vaccinia-Virus der größte Teil des Us-Bereiches des EHV-1-Genoms sequenziert, und die verschiedenen auf diesem DNA-Fragment gefundenen offenen Leserahmen wurden exprimiert. Drei neue von der S-Komponente codierte EHV-1-Gene wurden identifiziert und analysiert: EHV-1 gD, das gemäß der Sequenzierung Homologie mit den Produkte der HSV gD- und PRV gp50-Gene aufwies, EHV-1 gp63, das Homologie mit den Produkten der HSV US7- und PRV gp63-Gene aufwies und EHV-1 gE, das Homologie mit den Produkten der HSV gE- und PRV gl-Gene aufwies. Alle drei Gene wurden einzeln oder zusammen in ein Wirtsbereichs-Selektionssystem des Vaccinia-Stammes Copenhagen für schnelle Expressionsuntersuchungen cioniert. Die mit einem anti-EHV-1-Kaninchenserum erhaltene Immunfluoreszenz zeigte die Expression von spezifischen EHV-1-Produkten auf. 27

AT 405 184 B

Clonierung des EHV-1 BamHI D-Fragments.

Da das EHV-1 gpl7/18-Gen auf der S-Komponente des EHV-1-Genoms lag (3), wurde das BamHI D-Fragment, das den größten Teil des Us-Bereichs ausmachte (59) isoliert und cloniert. Genomische EHV-1 DNA des Stammes Kentucky D wurde mit BamHI gespalten. Das 11,0 kb BamHI D-Fragment wurde aus einem Agarosegel (Geneclean, Biol01, Inc., La Jolla, CA) isoliert und in das Plasmid plBI24 cloniert, wodurch sich das Plasmid pEHVBamHID ergab. Von diesem Fragment wurde eine Restriktionskarte abgeleitet (Fig. 11).

Identifizierung der DNA-Sequenzen, die EHV-1 gD, gp63 und gE codieren.

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden für beide Stränge Nucleotidsequenzdaten aus einer Reihe von Subclonen des in plBI24 subclonierten BamHI D-Fragments erhalten. Die Sequenzen der Verbindungen zwischen aufeinanderfolgenden Fragmenten wurden auf dem Ausgangsclon pEHVBamHID überprüft. Bei allen Sequenzdatenanalysen wurde das Softwarepaket PC/GENE (Intelligenetics Inc., Mountain View, CA) verwendet. DNA-Sequenzanalyse der EHV-1 gD-, gp63- und gE-Gene.

Die DNA-Sequenzanalyse des 6402 bp-Bereichs, der vom (den größten Teil des einzigen kurzen Bereichs darstellenden) BamHI D-Fragments sequenziert worden war, offenbarte das Vorhandensein von mindestens drei vollständigen alle auf dem gleichen Strang zu lesenden offenen Leserahmen. Diese Sequenz ist in Fig. 12 als nach rechts gerichteter 5’-nach-3'-Strang angegeben. Die Basen-Zusammenset-zung ist 50,44 % G + C.

Der erste offene Leserahmen (ORF1) erstreckt sich von den Nucleotidpositionen 971 bis 2176. Mutmaßliche Transkriptions-Regulationssignale wurden in dem Bereich 5’-seitig des höchstwahrscheinlichen ATG-Initiationscodons in Position 971 aufgefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz TATATTAA (Nucleoti-de 871 bis 878) wurde 60 Nucleotide stromabwärts einer mutmaßlichen CAT-Box mit der Sequenz TGACAAT in den Positionen 811 bis 817 aufgefunden. Ein Polyadenylierungssignal (AATAAA) wurde stromabwärts des TAA-Terminationscodons (Nucleotide 2177 bis 2179) nicht gefunden. Sieben von zehn Nucleotiden in der Sequenz 5' TCCCTTCGCC 3' (Nucleotide 890 bis 899) sind zur ribosomalen 18S RNA-Sequenz 3’ AGGAAGGCGT 5’ (61) komplementär und können als Ribosomenbindungsstelle dienen. Es ist ein Abtast-Modell vorgeschlagen worden, nach dem eukaryontische mRNAs die Translation initiieren (151). Die Hauptregel dieses Modells ist die, daß Ribosomen an das 5'-Ende der mRNA binden und das mRNA-Molekül linear abtasten. Eine Festlegung auf die Translationsinitiation findet normalerweise am ersten 5’-proximalen ATG-Codon statt, obwohl Ausnahmen gefunden wurden (152). Ein Purin in der Position -3 ist für die Translationsinitiation essentiell, und die Translation wird durch ein C in den Positionen -1 und -2 stimuliert, wenn der Rest der Sequenz suboptimal ist (155). Der Sequenzzusammenhang um das angenommene Initiationscodon AGCATGT (Nucleotide 968 bis 974) weist sich als ein funktioneller Sequenzzusammenhang für die Translationsinitiation eukaryontischer mRNA aus. Es gibt zwei weitere mögliche ATG-Initiationscodons, die sich in den Positionen 989 bis 991 bzw. 992 bis 994 befinden. Die Umgebung dieser beiden Codons CTTATGATGG weist sich nicht als funktionsfähig zur Translationsinitiation aus. Der EHV-1-ORF1 codiert 402 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 45239 Dalton.

Analyse der Proteinstruktur des EHV-1-ORF1.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz offenbart eine Reihe membranassoziierten Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich von Aminosäure 1 bis 26 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird angenommen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt. Es wird vorausgesagt, daS ein hydrophober aus 24 Aminosäuren (Aminosäuren 351 bis 374) bestehender hydrophober Bereich als transmembrane Anker-Domäne funktioniert. Es gibt vier Asn-X-Thr/Ser- (wobei X jeder Aminosäure außer Prolin sein kann) Stellen für eine potentielle N-verknüpfte Glykosylierung (157). Das Hydrophobizitätsprofil der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF1 ist in Fig. 13 gezeigt. Die Charakteristiken eines Membran-überspannenden Glykoproteins, einschließlich der Signal- und Anker-Elemente, sind klar bestimmt. Es wird vorausgesagt, daß die am meisten hydrophoben Bereiche am N- und nahe des C-Terminus die Signalsequenz bzw. den Transmembran überspannenden Bereich des Glykoproteinmoleküls darstellen. 28

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Vergleich der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF1 mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des mutmaßlichen EHV-1-ORF1 -Proteins offenbart eine signifikante Homologie mit Glykoproteinen anderer Herpesviren. So weist das EHV-1-ORF1 -Protein eine Ähnlichkeit mit PRV gp50 (95) und HSV-1 gD (79,160) auf.

Der zweite offene Leserahmen (ORF2) erstreckt sich von der Nucleotidposition 2287 bis zur Nucleotid-position 3525. In dem Bereich 5'-seitig des ATG-Initiationscodons in der Position 2287 wurde keine mutmaßliche Transkriptions-Regulationssequenz gefunden. Ein AATAAA-Polyadenylierungssignal wurde stromabwärts des TGA-Terminationscodons (Nucleotide 3526 bis 3528) nicht gefunden, es liegen aber zwei potentielle YGTGTTYY-Polyadenylierungssignale (180) ungefähr 40 und 70 bp stromabwärts von diesem Terminationscodon. Diese Sequenzumgebung und das vermutete Initiationscodon GCTATGG befindet sich in Übereinstimmung mit Kozak's Regeln (151, 155). Es gibt mindestens zwei weitere mögliche ATG-Initiationscodons in den Positionen 2305 bis 2307 und 2332 bis 2334, aber die Sequenzumgebung dieser beiden Codons (GGGATGT und TCTATGG) weist sie nicht als funktionsfähig zur Translationsinitiation aus. Der EHV-1-ORF2 codiert ein 413 Aminosäure-Polypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht von 45431 Dalton.

Analyse der Proteinstruktur von EHV-1-ORF2.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz offenbart eine Anzahl membranassoziierter Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich von den Aminosäuren 1 bis 22 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird vermutet, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt (obwohl die Computertrefferzahl für die mutmaßliche Score-Spaltstelle niedrig war). Es wird vorausgesagt, daß ein aus 32 Aminosäuren bestehender hydrophober Bereich (Positionen 315 bis 346) als transmembrane Anker-Domäne funktioniert. Es gibt sieben Asn-X-Thr/Ser-Stellen für die potentielle N-verknüpfte Glykosylierung. Eine Hydrophobizitätsgrafik der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF2 ist in Fig. 14 gezeigt. Die Charakteristiken eines membranüberspannenden Glykoproteins einschließlich der Signal- und Ankerelemente sind klar definiert. Es wird vorausgesagt, daß die beiden am meisten hydrophoben Bereiche am N- und nahe des C-Terminus die Signalsequenz bzw. den transmembranüberspannenden Bereich des Glykopro-teinmoleküls darstellen.

Vergleich der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF2 mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des EHV-1-ORF2 offenbart eine signifikante Homologie mit den Glykoproteinen anderer Herpesviren. So ist das EHV-1-ORF2-Protein homolog mit PRV gp63 (80), VZV gplV (181) und HSV-1 US7 (79).

Der dritte offene Leserahmen (ORF3) erstreckt sich von den Nucleotidpositionen 3796 bis 5451. Mutmaßliche Transkriptions-Regulationssignale wurden im Bereich 5'-seitig des ATG-Initiationscodons in der Position 3796 gefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz GTTTAAA (Nucleotide 3705 bis 3711) lag 50 Nucleotide stromabwärts der mutmaßlichen CAT-Box in den Positionen 3649 bis 3654, die die Sequenz GCAATG aufwies. Stromabwärts des TGA-Terminationscodons (Nucleotide 5452 bis 5454) wurde kein eindeutiges Polyadenylierungssignal gefunden. Der Sequenzzusammenhang um das vorgeschlagene Initiationscodon herum, ACAATGG, ist in Übereinstimmung mit Kozak's Regeln (151, 155). Der EHV-1-ORF3 codiert ein 552 Aminosäure-Polypeptid mit einem berechneten Molekulargewicht von 61493 Dalton.

Analyse der Proteinstruktur des EHV-1-ORF3.

Eine Analyse der Aminosäuresequenz offenbarte eine Anzahl membranassoziierter Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich über die Aminosäuren 1 bis 23 erstreckender Bereich weist ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil auf, und es wird angenommen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt. Es wird vorausgesagt, daß ein hydrophober aus 38 Aminosäuren bestehender Bereich (Positionen 404 bis 437) als transmembrane Amker-Domäne funktioniert. Es gibt fünf Asn-X-Thr/Ser-Stellenfür die potentielle N-verknüpfte Glykosylierung. Ein Hydrophobizitätsdiagramm der Aminosäuresequenz des EHV-1 ORF3 ist in Fig. 15 gezeigt. Die Charakteristiken eines Membran-überspannenden Glykoproteins einschließlich der Signal- und Ankerelemente sind klar definiert. Es wird vorausgesagt, daß die beiden am meisten hydrophoben Bereiche am N- und nahe des C-Terminus die Signalsequenz bzw. den Transmembran-überspannenden Bereich des Glykoproteinmoleküls darstellen. 29

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Vergleich der Aminosäuresequenz des EHV-1-ORF3 mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäure-Zusammensetzung des EHV-1-ORF3-Proteins enthüllt eine signifikante Homologie mit den Glykoproteinen anderer Herpesviren. So ist das EHV-1-ORF3-Protein homolog mit PRV gl (80), VZV gE (181) und HSV-1 gE (79).

Konstruktion eines auf dem Vaccinia-Virus Copenhagen basierenden Wirtsbereichs-Selektionssystems.

Es wurde ein auf dem Vaccinia-Virus Copenhagen basierendes Wirtsbereichs-Selektionssystem ähnlich dem WR-pHES/vP293 Wirtsbereichs-Selektionssystem (69) konstruiert.

Bei der Copenhagen-Vaccinia-Virus-Deletionsmutante vP668 werden 12 Gene vom Bereich, der sich von Hindill C bis Hindill K erstreckt, deletiert, einschließlich der beiden Human-Wirtsbereichsgene KIL (70) und C7L, einem Gen, das auf Hindlll C kartiert. vP668 ist nicht in der Lage, auf menschlichen MRC-5-Zellen zu wachsen. Mitglieder der COPCS-Plasmidserien enthalten das C7L-Gen innerhalb der flankierenden Vaccinia-Arme, was die Rekombination mit vP668 und die Wiederherstellung der Fähigkeit des Virus, wieder auf MRC-5-Zellen zu wachsen, ermöglicht. Die Fähigkeit der rekombinanten Vaccinia-Nachkom-menschaft, die durch Rekombination unter Verwendung des vP668/COPCS-Wirtsbereichs-Selektionssy-stems erzeugt wurde, auf menschlichen MRC-5-Zellen Plaques zu bilden, stellte ein Verfahren zur schnellen Identifizierung dieser Rekombinanten bereit. Das Plasmid pCOPCS657 enthält einen synthetischen H6-Vaccinia-Promotor, dem ein Polylinker-Clonierungsbereich zur Insertion fremder Gene folgt. Dem Polylinkerbereich folgen Stoppcodons und ein Vaccinia-Transkriptions-Terminationssignal (45).

Clonierung des EHV-1 gD-Gens in pCOPCS657.

Wie in Fig. 16 gezeigt, wurde das Plasmid pEHVBamHID mit Hindlll gespalten, und ein EHV-1 gD enthaltendes 1240 bp Hindlll-DNA-Fragment wurde aus einem Agarosegel (Geneclean, Bio10, Inc., La Jolla, CA) isoliert und unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase repariert. Das reparierte Fragment wurde dann mit dem mit Smal gespaltenen Plasmid pCOPCS657 ligiert. Das resultierende Plasmid, pJCA006, besitzt ein ATG-Initiationscodon ungefähr 10 bp vom H6-Promotor entfernt (Fig. 16).

Clonierung des EHV-1 gp63-Gens in pCOPCS657.

Das Plasmid pEHVBamHID wurde mit Hindlll, EcoRI und Pvull gespalten und das 1300 bp Hindlll-Pvull-DNA-Fragment, das EHV-1 gp63 enthielt, wurde aus einem Agarosegel isoliert und mit Klenow repariert. Das reparierte Fragment wurde dann mit dem mit Smal gespaltenen Plasmid pCOPCS657 ligiert. Das resultierende Plasmid mit EHV-1 gp63 in der korrekten Orientierung relativ zum H6-Promotor wurde mit pJCA008 bezeichnet (Fig. 16).

Clonierung des EHV-1 gE-Gens in pCOPCS657.

Das Plasmid pEHVBamHID wurde mit Aatll und Apal gespalten, und ein EHV-1 gE enthaltendes 2630 bp Aatll-Apal-DNA-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und mit Klenow repariert. Das reparierte Fragment wurde dann in das mit Smal gespaltene Plasmid pCOPCS657 inseriert. Das resultierende Plasmid mit dem EHV-1 gE-Gen in der richtigen Orientierung relativ zum H6-Promotor wurde mit pJCA007 bezeichnet (Fig. 16).

Clonierung des EHV-1 gd-gp63-Fragments in pCOPCS657.

Wie aus Fig. 17 hervorgeht, wurde pEHVBamHID mit EcoRI und Pvull gespalten, und das 1832 bp EcoRI-Pvull-DNA-Fragment (A) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pJCA006 wurde mit Clal und EcoRI gespalten und das 1450 bp Clal-EcoRI-DNA-Fragment (B) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pCOPCS657 wurde mit Clal und Smal gespalten und das 3700 bp Clal-Smal-DNA-Fragment (C) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Die Fragmente A, B und C wurden dann miteinander ligiert und das resultierende Plasmid wurde mit pJCA009 bezeichnet (Fig. 17). 30

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Clonierung des EHV-1 gD-gp63-gE-Fragments in pCOPCS657.

Das Plasmid pEHVBamHID wurde mit EcoRI und Sacll gespalten und das 4240 bp EcoRI-Sacll-DNA-Fragment (D) wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Fragment D wurde dann mit den Fragmenten B und C ligiert (s. oben) unter Zugabe von dNTPs, um die Reparatur der Verbindung Sacll-Smal zu gewährleisten. Das resultierende Plasmid wurde mit pJCA010 bezeichnet (Fig. 17).

Konstruktion der rekombinanten Vaccinia-Viren vP773, vP803, vP809, vP810 und vP822, die die EHV-1 Us-offenen Leserahmen exprimieren.

Um schnell die Expression der vorstehend beschriebenen offenen Leseranmen zu überprüfen, wurde unter Verwendung des COPCS-Wirtsbereichs-Selektionssystems eine Reihe von rekombinanten Vaccinia-Viren konstruiert. Die drei durch die Sequenzanalyse identifizierten offenen Leserahmen wurden entweder einzeln oder zusammen ("doppelt" und "dreifach") in das Plasmid pCOPCS657 cloniert (Figuren 16, 17). Die resultierenden Plasmide wurden dann verwendet für die Rekombination mit der Vaccinia-Rekombinante vP668 als Rettungsvirus.

Die aus diesen Rekombinationen erhaltenen verschiedenen rekombinanten Vaccinia-Viren sind in Tabelle 5 aufgeführt.

Die Vaccinia-Rekombinante vP773 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem Donorplasmid PÜCA006, das das EHV-1 gD-Gen enthielt, durchgeführt wurde. Die Vaccinia-Rekombinante vP822 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem das EHV-1 gp63-Gen enthaltenden Donorplasmid pJCA008 durchgeführt wurde. Die Vaccinia-Rekombinante vP803 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem das EHV-1 gE-Gen enthaltenden Donorplasmid pJCA007 durchgeführt wurde. Die Vaccinia-Rekombinante vP809 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem das EHV-1 gD-gp63-Fragment enthaltenden Donorplasmid pJCA009 durchgeführt wurde, und die Vaccinia-Rekombinante vP810 wurde aus einer Rekombination erhalten, die mit dem das EHV-1 gD-gp63-gE-Fragment enthaltenden Donorplasmid pJCAOlO durchgeführt wurde (Tabelle 5).

Immunfluoreszenzanalyse der EHV-1-ORFl-(gD), 0RF2- (gp63) und ORF3- (gE) Produkte, die durch einzel-oder vielfachrekombinante Vaccinia-Viren synthetisiert waren.

Immunfluoreszenz von mit rekombinanten Vaccinia-Virus-infizierten VERO- und MRC-5-Zellen wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung des polyclonalen anti-EHV-1 -spezifischen Kaninchenserums R5935 (1:200) durchgeführt (Tabelle 6).

Tabelle 5

Bezeichnung der Vacclnia-Virus-Rekombinanten, die EHV-1 gD-, gE- und gp63-Gene exprimieren Donorplasmid EHV-1-Insertion Rettungs-Virus Rekombinante PJCA006 go vP668 vP773 PJCA007 gE vP668 vP803 PJLA008 gp63 vP668 vP822 PJCA009 gD-gp63 vP668 vP809 pJCAOlO gD-gp63-gE vP668 vP810 31

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Tabelle 6

Immunfluoreszenz von mit rekombinanten Vaccinia-Virus-infizierten Zellen, die unter Verwendung des anti-EHV-1-Kaninchenserums R5935 durchgeführt wurde EHV-1 -Rekombinante R5935 intern Oberfläche gD positiv negativ gp63 positiv negativ gE negativ negativ gD-gp63 positiv negativ gD-gp63-gE positiv negativ

Beispiel 10

Immunologische Beurteilung der einzelnen oder im Kombination von Vaccinia-Virus-Rekombinan-ten exprimierten Pseudorabies-Virus-Glykoproteinen gpli, gplll und gp50 in Mäusen und Schweinen

In diesem Beispiel wurden der Vaccinia-Virus-Stamm Copenhagen und seine Derivate vP419, vP415 und vP456 (184) verwendet.

Clonieren der PRV-Gene, die gpll, gplll und gp50 codieren.

Das PRV NIAj-Virus (182) wurde auf NIL2-Zellkulturen (183) vermehrt. Die Zelltrümmer wurden durch 30 Minuten Zentrifugation bei 3000 xg aus dem Überstand entfernt. Die Virions wurden durch 60 Minuten Zentrifugation in einem 45 Ti Beckman-Rotor bei 40 000 UpM durch ein 40 % (Gew./Vol.) Saccharosekissen gereinigt. Anschließend wurde eine Zentrifugation durch einen diskontinuierlichen 30-50%igen (Gew./Vol.) Saccharose-Gradienten vorgenommen (SW25 Beckman-Rotor 5 Stunden bei 23 000 UpM). Bandierte Virions wurden gesammelt, mit TNE-Puffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,8, 150 mM NaCI und 10 mM EDTA) verdünnt und 1 Stunde bei 30 000 UpM in einem SW40 Beckman-Rotor sedimentiert. Das virale Sediment wurde in TE-Puffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,8, 10 mM EDTA) resuspendiert und durch die Zugabe von Natriumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % (Gew./Vol.) und Proteinase K bis 100 mg/ml lysiert. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37 *C wurde; das Lysat einmal mit Phenol.Chloroform (1:1) und einmal mit Chloroform:lsoamyla!kohol (24:1) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in Wasser aufgenommen. Nach der vollständigen Spaltung mit BamHI wurden die Fragmente in die BamHl-Stelle von pBR322, das zuvor mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (CIAP) behandelt worden war, cloniert. Das Ugationsgemisch wurde zur Transformation des kompetenten E.coli-Stammes NM522 (20) verwendet.

Wie aus den Figuren 18 und 20 zu ersehen ist, liegt die das gpll-Gen codierende DNA-Sequenz im BamHI-Fragment 1 und in den Sall-Subfragmenten 1A und 1B des PRV-Genoms (62,94). Das mit pPR9.25 bezeichnete Plasmid, das das PRV-BamHI-Fragment 1 in der BamHI-Stelle von pBR322 inseriert, enthielt, wurde mit Ncol gespalten. Die resultierende DNA-Spaltung wurde auf einem 0,8 % Agarosegel fraktioniert, und ein 6,2 kb Ncol-DNA-Fragment wurde unter Anwendung des Gene Clean®-Verfahrens (Bio101, Inc. La Jolla, CA) gereinigt und anschließend in die Ncol-Stelle von mit CIAP behandelten pBR328 (Boehringer Mannheim, Biochemicals, Indianapolis, IN) inseriert. Das resultierende Plasmid pPR2.15 wurde mit Sphl gespalten und auf einem Agarosegel fraktioniert. Die 2,7 und 1,8 kb-Fragmente wurden gereinigt und zur Herstellung der Plasmide pPRl und pPR2 (Fig. 18) in die mit Phosphatase behandelte Sphl-Stelle von pUCl8 und in den M13-Phagen inseriert. Die Nucleotidsequenz wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen offenen Leserahmen mit 2742 bp, der 913 Aminosäuren codierte. Wie erwartet (62), war eine signifikante Aminosäurehomologie mit HSV-1 gB zu beobachten. Zur Vereinfachung der Beschreibung der Clonierungsmanipulation zur Expression von PRV gpll in Vaccinia-Virus-Vektoren sind die DNA-Sequenz des PRV gpll-offenen Leserahmens mit zusätzlichen 5'- und 3'-nicht-codierenden Sequenzen in Fig. 19 gezeigt.

Wie aus den Figuren 20 und 21 hervorgeht, liegt die das PRV-Glykoprotein gplll codierende DNA-Sequenz in den BamHI-Fragmenten 2 und 9 des PRV-Genoms (96). Das Plasmid pPR9.9, das das BamHI- 32

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Fragment 2 inseriert in die BamHI-Stelle von pBR322 enthält (Fig. 20). wurde mit BamHI und Sphl gespalten. Das Plasmid pPR7.5, das das BamHI-Fragment 9 inseriert in die BamHI-Stelle von pBR322 enthielt, wurde mit Ncol und BamHI gespalten. Die aus beiden Spaltungen resultierende DNA wurde auf einem Agarosegel fraktioniert. Das 2,35 kb Sphl-BamHI-Fragment und das 1,1 kb Ncol-BamHI-Fragment wurden gereinigt und in die mit Phosphatase behandelten EcoRI-Sphl-Stellen von IBI25 (Fig. 20) unter Verwendung des phosphorylierten Ncol-EcoRI-Linkers MRSYN21/MRSYN22 ligiert.

Neol EeoRI MRSYN21 5' CATGGGTCTGCAGTCG 3' MRSYN22 3' CCAGACGTCAGCTTAA 5'

Ein mit pPRl 7 bezeichnetes Plasmid wurden isoliert, das ein 3450 bp Sphl-Ncol-Fragment enthielt, das das vollständige PRV gplll-Gen enthielt (Fig. 20). Die Nucleotidsequen2 wurde aus doppelsträngigen mit Alkali denaturierten Plasmidmatrizen und aus einzelsträngigen Matrizen nach der Clonierung in den Phagen M13 erhalten. Die DNA-Sequenzanalyse enthüllte einen offenen Leserahmen von 1440 bp, der 479 Aminosäuren codierte (Fig. 21). Wie früher berichtet (96), wurde eine signifikante Homologie mit HSV gC beobachtet.

Figuren 22 und 23 entsprechend liegt die das PRV-Glykoprotein gp50 codierende DNA-Sequenz in dem BamHI-Fragment 7 des PRV-Genoms (95). Das Plasmid pPR7.1 (Fig. 22), das das PRV-BamHI-Fragment 7 inseriert in die BamHI-Stelle von pBR322 enthielt, wurde mit Stul und Ndel gespalten und mit Mungobohnen-Nuclease behandelt. Das 1,7 kb-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert, und in die Hincll-Stelle von mit Phosphatase behandeltem IBI25 inseriert. Dieses Plasmid, pPR22 (Fig. 22), enthält das gesamte pRV gp50-Gen. Die Bestimmung der Nucleotidsequenz offenbarte einen 1215 bp-offenen Leserahmen, der 404 Aminosäuren codierte (Fig. 23). Wie früher berichtet (95), wurde eine signifikante Homologie mit HSV-1 gD beobachtet.

Clonierung der gpll, gplll und gp50 codierenden PRB-Gene in Vaccinia-Virus-Insertionsdonor-Plasmide.

Das 1060 bp PRV Sphl-Nhel-Fragment von pPRl (Fig. 18A) wurde aus einem Agarosegel isoliert und in die BamHI-Sphl-Stellen von plBI25 nach Behandlung mit CIAP zur Erzeugung des Plasmids pPR6 (Fig. 18A) inseriert unter Verwendung des phosphorylierten BamHI-Nhel-Linkers MRSYN1/MRSYN2 laßHI Hhel KRSYM1 5' GATCCATTCCATGCTTG 3’ HR5YN2 3' GTAAGGTACCAACGATC 5' pPR6 wurde mit Hindlll und Apal gespalten und mit CIAP behandelt. Die Apal-Stelle liegt 32 bp stromabwärts des ATG-Initiationscodons von PRV gpll (Fig. 19). Ein doppelsträngiges DNA-Fragment wurde durch Aneinanderlagern des Paares synthetischer phosphorylierter Oligonucleotide MESYN3/MRSYN4 erhalten. Dieses Fragment enthält die den Vaccinia-H6-Promotor von der EcoRV-Stelle bis zum unterstrichenen ATG spezifizierende DNA, an die sich unmittelbar PRV gpll codierende Sequenzen anschließen.

HindiIlgCORV frnaT HRSYN3 5* AGCTTGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTA^IGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGCGCC 3’ tCTSIH4 3' ACTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACGGGCGACCACCGCCAGAAACCGCGC 5*

Die synthetische DNA wurde mit dem 3920 bp Hindlll-Apal-Fragment, das aus pPR6 abgeleitet war, ligiert, um das Plasmid pPR9 zu erzeugen (Fig. 18A).

Das Plasmid pPR9 wurde mit BamHI und Nhel gespalten, mit CIAP behandelt und unter Verwendung eines phosphorylierten BamHI-Sphl-'Linkers 33

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Sohl BaaHI MRSYN7 5' CCCAGATCTCCTTG 3' KRSYN8 3‘ CTACGGGTCTAGAGGAACCTAG 5’ mit einem aus pPR1 erhaltenen 1640 bp SpHI-Nhel-Fragment ligiert, um das Plasmid pBR12 zu erhalten (Figuren 18A, 18B).

Das 1030 bp Hincll-Sphl-Fragment aus pPR2 (Fig. 18A) wurde aus einem Agarosegel isoliert und in die mit Phosphatase behandelten Hincll-Sphl-Stellen von pUCl8 inseriert. Das resultierende Plasmid pPR10 wurde mit Hindlll und Nael gespalten und mit CIAP behandelt. Die Nael-Stelle liegt 44 bp stromaufwärts des TAG-Terminationscodons (Rg. 19). Ein durch Aneinanderlagern des Paares der phosphorylierten synthetischen Oligonucleotide MRSYN9/MRSYN10

Nael Xmalll Hindlll K&SYN9 5* ggcactaccaccgcctcgacagcoagcaccccgaccccctctagaatttttatccgccga 3’ HRSTNIO 3’ CCGTGATGGTCGCGGAGCTCTCGCTCCTGGGGCTGCGGGACATCTTAAAAAtAGCCGGCTTCGA 5’ erhaltene doppelsträngige DNA wurde mit dem aus pPR10 abgeleiteten 3720 bp Nael-Hindlll-Fragment ligiert, um das Plasmid pPRH zu erzeugen.

Die unterstrichenen Sequenzen beziehen sich auf das PRV gpll-Terminationscodon und auf ein frühes Vaccinia-Transkriptions-Terminationssignal (45). Das 770 bp Sphl-Hincll-Fragment aus pPR2 wurde aus einem Agarosegel gereinigt und unter Verwendung des phosphorylierten BamHI-Sphi-Linkers (MRSYN7/MRSYN8 in die BamHI-Hincll-Stelle von mit CIAP behandeltem pPR11 inseriert, um pPRl3 zu erzeugen (Figuren 18A, 18B). Das mit EcoRI und Sphl gespaltene und mit CIAP behandelte pPR12 wurde unter Verwendung des phosphorylierten Hindlll-EcoRI-Linkers (MRSYN19/MRSYN20

Hindlll BcoRI KRSYH19 5 ’ AGCTTCTCCAGCCATGGCCATCGG 3* KRSTR20 3* AGACGTCGGTACCGCTAGCCTTAA 5’ mit einem isolierten aus pPR13 abgeleiteten 990 bp Hindlll-Sphl-Fragment ligiert, um das Plasmid pPR15 zu erzeugen (Fig. 18B).

Das mit Hindlll-EcoRV gespaltene 2780 bp-Fragment aus pPRl5 wurde mit Mungobohnen-Nuclease behandelt, aus einem Agarosegel gereinigt und zur Erzeugung des Plasmids pPRl8 (Fig. 18B) inseriert in das Plasmid pTP15 (184) (Fig. 3), das mit Xmatll-EcoRV gespalten und mit Mungobohnen-Nuclease und CIAP behandelt worden war. In pPRl8 ist PRV gpll mit dem synthetischen Vaccinia-H6-Promotor im Vaccinia-Hämagglutinin-Deletionsort verknüpft. Dieses Plasmid wurde zur Transfektion von Vaccinia-Virus-infizierten Zellen verwendet, um die Vaccinia-Rekombinanten vP534, vP644, vP621 und vP692 zu erhalten, die das PRV gpll-Gen enthalten (siehe unten).

Das PRV gplll-Gen wurde so manipuliert, daß es unter der Kontrolle des frühen Vaccinia-Viruspromo-tors u (siehe unten) steht, der im Vaccinia Hindlll-B-Fragment liegt. Unter Anwendung ortsspezifischer Mutagenese wurde in PRV gplll durch Änderung der Sequenz CGC (Basen 192-194) (Rg. 21) zu ATG eine Nsil-Stelle und durch Ändern der Sequenz GTGACGT zu TTCTAGA (Basen 1632-1638) (Fig. 21) eine Xbal-Stelle eingeführt. Dazu wurde vom Plasmid pPRl7 unter Verwendung des Helfer-Phagen R408 (Stratagene, La Jolla, CA) (185) eine einzelsträngige DNA erzeugt. Die ortsgerichtete Mutagenese wurde unter Verwendung der beiden gereinigten phosphorylierten synthetischen Oligonucleotide MRSYN5 und MRSYN6 34 ΑΤ 405 184 Β >'ail HRSYN5 5*CCGACCGACGCCATSCATCCTGCGAATGCCCCC 3'

Xbal KRSYN6 5* GGGGGGACGCGCCeCTCrACAAGGCCCCGCCTGGCGG 3* und die Selektion in dem E. coli dur' ung'-Stamm CJ236 (IBI, New Haven, CT) (17,186) durchgeführt.

Durch diese Mutationen wurde das Plasmid pPR28 erzeugt. Das Plasmid pPR28 wurde mit Nsil und Xbal gespalten und mit Mungobohnen-Nuclease behandelt. Ein 1440 bp-Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt und in die Bglll-Hpal-Stellen von pSD478VC (Figuren 20, 24) nach Behandlung mit Mungobohnen-Nuclease und CIAP inseriert. Mit Vaccinia-Virus infizierte Zellen wurden mit dem Plasmid pPR24 transfiziert, um die Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP604, vP644, vP691 und vP692 zu erzeugen, die das PRV gplll-Gen enthalten (siehe unten), PRV gp50 wurde so behandelt, daß es unter der Kontrolle des frühen/mittleren Vaccinia-Viruspromotors I3L (187) steht. Unter Anwendung ortsspezifischer Mutagenese wurde in gp50 durch Ändern der Sequenz CCTGCCAGCGC (Basen 177-187) (Fig. 23) zu ATGCATTTAAT eine Nsil-Stelle und durch Ändern der Sequenz CCTCCGCAGTACCGG bei den Basen 1404-1418 (Fig. 23) zu AA1 Γ1 ITATAGATCT eine Bglll-Stelle eingeführt. Früher beschriebene Mutageneseverfahren (17, 185, 186) wurden zur Erzeugung des Plasmids pPR29 aus pPB22 angewandt unter Verwendung der gereinigten phosphorylierten synthetischen Oligonucleotide MRSYN12 und MRSYN13 (Fig. 22).

Will KRSYN12 5 ’ GGTTCCCATACACTCAATGCATTTAATCATGCTCCTCGCAGCGC 3*

Saizi XRSYN13 S * GCAGCCCgC T C CGTAGAATTT ΓΤATACArCTCGTCGATGATGAtGCT 3’ pPR29 wurde mit Nsil gespalten, mit Mungobohnen-Nuclease behandelt und partiell mit Bglll gespalten, um ein 1290 bp Fragment zu erzeugen. Das Plasmid pMPl3PP (Figuren 22, 25) wurde mit EcoRI gespalten, mit Mungobohnen-Nuclease und dann mit BamHI behandelt, um ein den Vaccinia l3L-Promotor enthaltendes 140 bp-Fragment zu erzeugen. Die 1290 und 140 bp-Fragmente wurden aus Agarosegelen gereinigt und in die mit Phosphatase behandelte Bgjll-Stelle von pMP409DVC (Figuren 4, 22) ligiert. Das resultierende Plasmid pPR26 wurde in eine Rekombination zur Herstellung der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP591, vP621, vP691 und vP692 verwendet, die das gp50-Gen enthalten (siehe unten).

Konstruktion der Vaccinia-Rekombinanten, die die PRV-Glykoproteine gpll, gplll und gp50 einzeln oder in Kombinationen exprimieren.

Um die Immunogenität und den relativen Betrag dieser drei PRV-Glykoproteine (gpll, gplll und gP50) zum Schutz immunisierter Tiere gegen eine Infektion mit virulentem PRV abzuschätzen, wurde eine Serie von Vaccinia-Rekombinanten konstruiert, die die drei PRV-Glykoproteine alleine oder in Kombination exprimieren.

Wie aus Fig. 24 ersichtlich, wurde das rekombinante Vaccinia-Virus vP533, das das l-Galactosidasegen exprimiert, wie folgt konstruiert: Ein 1 kb-Bereich innerhalb des Vaccinia Hindlll-Fragments B, der die Sali F/I-Verknüpfung des Copenhagen-Genoms überspannt, enthält, wie durch "Southern blot"-Analyse (189) gezeigt, eine DNA-Homologie mit dem hämorrhagischen (u)-Gen des Kuhpockenvirus (188). Das u-Gen codiert ein Polypeptid, das eine Ähnlichkeit mit Serinprotease-Inhibitoren aufweist und das biologisch verantwortlich für die hämorrhagische Pockenbildung durch das Virus auf der chorioallantoinen Membran ist. Die DNA-Sequenz des Copenhagen-Genoms offenbarte, daß das u-Gen-Äquivalent vielfache Rasterver-schiebungs-Mutationen enthielt und biologisch nicht funktionsfähig war. Das Plasmid pSD419VC (184) (Fig. 24) enthält den linken Anteil des u-Bereichs. Das Plasmid pSD422VC, das das Copenhagen-Sall-Fragment I in pUC8 cloniert enthält, enthält den Rest des u-Bereichs. Um links liegende unerwünschte Vaccinia-Sequenzen zu beseitigen, wurden pSD4l9VC mit Ncol und Smal gespalten, mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase stumpfendig gemacht und re-ligiert, woraus sich das Plasmid pSD476VC ergab (Fig. 24). Das Plasmid pSD422VC wurde mit Hpal und Nrul gespalten, und ein ungefähr 0,3 kb-Fragment, das 35

AT 405 184 B unmittelbar rechts des u-Bereichs liegt, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde in mit Hincll (das Sall-Stellen erkennt) gespaltenes pSD476VC ligiert, wodurch sich das Plasmid pSD477VC ergab. Um die 0-Galactosidase unter der Kontrolle des u-Promotorbereichs des Vaccinia-Virus Copenhagen zu exprimieren, wurden synthetische 22mere/20mere Oligonucleotide hergestellt. Die Sequenz des 22me-ren/20meren mit den angegebenen Restriktionsstellen und dem unterstrichenen ATG-Initiationscodon lauten wie folgt: S2& i flEäi 22aer 5* CGATTACTATCAACCATCCGTT 3* 2 Oster 3' TAATGATACTTCCTACGCAA 5'

Das aneinandergelagerte 22mere/20mere Gemisch wurde in mit Clal und Hincll gespaltenes pSD477VC ligiert, wodurch sich das neue Plasmid pSD479VC (Fig. 24) ergab. Ein 3,1 kb BamHI-Fragment, das die E. coli-j3-Galactosidase codierende Sequenz aus pMC1871 (34) ohne das Initiationscodon und den Promotor enthielt, wurde in mit BamHI gespaltenes pSD479VC ligiert. Das resultierende Plasmid, das das LacZ-Gen in der korrekten Orientierung unter der Kontrolle des Copenhagen u-Promotors enthielt, wurde mit pSD479VCBG bezeichnet. Dieses Insertions-Donor-Plasmid wurde in Vaccinia-Virus vP410 (184) rekombi-niert. Ein rekombinantes Vaccinia-Virus wurde auf der Basis der Bildung blauer Plaques in Gegenwart des chromogenen Substrates X-gal (9,24) identifiziert, Plaque-cloniert und mit vP533 bezeichnet (Fig. 24).

Zur Konstruktion eines Vektorplasmids für die Insertion von fremden Genen wurden die synthetischen 42mere/40mere Oligonucleotide hergestellt.

Clal BolII Sael Swal Xhol BamHI Hoal 42iaer 5' CGATrACTACATCTCACCTCCCCCCGCTOCACCGCATCCGTT 3’ 4Omer 3* TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCCAGCTCCCCTAGGCAA 5*

Das aneinandergelagerte 42mere/40mere-Gemisch wurde in mit Clal und Hincll gespaltenes pSD477VC ligiert, wodurch sich das neue Plasmid pSD478VC ergab (Fig. 24). Dieses Plasmid enthält ungefähr 0,3 kb Vaccinia-Sequenzen auf jeder Seite des Multiclonierungsbereichs, der den u-codierenden Bereich des Vaccinia-Stammes Copenhagen vollständig ersetzt. pSD478VC wurde zur Erzeugung von pPR24 (Fig. 20), das die PRV gplll-codierenden Sequenzen enthält und von den Vaccinia-Rekombinanten vP604, vP644, vP691 und vP692 verwendet.

Entsprechend Fig. 25 enthält das Plasmid pMP4l9 ein aus dem Vaccinia Hindlll-Fragment I stammendes den I3L-Promotor enthaltendes 850 bp BamHI-Fragment inseriert in die BamHI-Stelle von pUC8 (Fig. 25). Das l3L-Promotorelement entspricht DNA-Sequenzen stromaufwärts des l3L-offenen Leserahmens im Vaccinia Hindlll-Fragment I (187) und ist früher verwendet worden, um fremde Gene in Vaccinia-Virus-Rekombinanten zu exprimieren (27, 190). pMP419 wurde in seiner einzigen Clal-Stelle innerhalb der I3L-codierenden Sequenzen linearisiert und einem Bal31-Verdau unterworfen. Anschließend wurde mit EcoRI gespalten und durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase stumpfe Enden erzeugt. Das resultierende Plasmid pMP419-5 (Fig. 25) enthält verknüpft mit einer EcoRI-Stelle die I3L-Promotorsequenzen stromaufwärts des Nucleotids -8. Das Promotorelement wurde als ein EcoRI-Mspl-Fragment aus pMP419-5 isoliert, in das mit EcoRI-CIal gespaltete pUC13C, einem pUCl3-Derivat, das Clal-Linker in der Smal-Stelle enthält, inseriert. Das resultierende Plasmid pMPl3PP (Rguren 22, 25) enthält die l3L-Promotorsequenzen von Position -126 bis Position -8, denen eine EcoRI-Stelle in Position -8 folgt.

Das durch den Vaccinia l3L-Promotor angetriebene PRV gp50 wurde in dem M2L-Deletions-Plasmid-vektor pMP409DVC inseriert (Fig. 4), wodurch sich pPR26 ergab (Rg. 22). pPR26 wurde zur Erzeugung der Vaccinia-Rekombinanten vP591, vP621, vP691 und vP692 verwendet.

Isolieren rekombinanter Vaccinia-Viren.

Rekombinante Vaccinia-Viren, die die PRV-Gene enthielten, wurden wie vorstehend beschrieben identifiziert und gereinigt. Rekombinante Vaccinia-Viren, die die drei PRV-Glykoproteine gpll, gplll und gp50 allein oder in Kombination exprimieren, sind in Tabelle 7 aufgeführt. 36 5

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Tabelle 7 70

Bezeichnung der Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die die PRV-Glykoproteine gpll, gplll und gp50 exprimieren Rekombinante Eiternvirus Donor-Plasmid PRV-Glykoproteine vP534 vP425 pPR18 9»| VP591 vP458 pPR26 gpso vP604 vP533 pPR24 glil vP621 vP534 pPR26 gll + gp50 vP644 vP604 pPR18 gll + gilt vP691 vP604 pPR26 glll + gp50 vP692 vP644 pPR26 gll + glll + gp50 75

In vitro-Beurteilung der PRV-Glykoproteine, die durch die Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimiert werden.

Die PRV-Glykoproteine gpll, gplll und gp50 sind typische mit den membranartigen Strukturen von PRV-20 infizierten Zellen assoziierte Glykoproteine und sind außerdem Bestandteile des Virus, anti-gpll, anti-gplll und anti-gp50 spezifische monoclonale Antikörper, denen Fluorescein-konjugierte Ziegenanti-Maus-lgG folgten, ergaben eine starke Oberflächenimmunofluoreszenz auf mit rekombinanten Vaccinia-Viren infizierten Zellen, nicht aber in mit Wildtyp-Vaccinia-Virus infizierten Zellen. 25 In vivo-Einschätzung des immunogenen Potentials der PRV-Glykoproteine gpll, gplll und gp50, die durch Vaccinia-Virus-Rekombinanten in Maus und Schwein exprimiert wurden.

Um die relative Immunogenität der drei durch Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimierten PRV-Glykoproteine abzuschätzen, wurden in die Pfote von Mäusen 50 bis 100 ul verschiedener Dosen rekombinanter 30 Viren inoculiert. 14 Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse auf intraperitonealem Wege mit 10 LD50 des virulenten PRV-Kojnock-Stammes infiziert. In vorbereitenden Experimenten war gezeigt worden, daß jedes der PRV-Glykoproteine wirksam im Schutz inoculierter Mäuse gegen eine virulente PRV-Infektion ist. In einer ausgedehnteren Serie von Experimenten, bei denen Ober 500 Mäuse verwendet wurden, wurde die Wirksamkeit der PRV-Glykoproteine exprimierenden Vaccinia-Rekombinanten abgeschätzt. Die Vakzi-35 nierungsdosis, die zu einem Schutz von 50 % der infizierten Mäuse führte (PD50) wurde errechnet und die Ergebnisse dieser Studien sind in Tabelle 8 gezeigt. Die rekombinanten Vaccinia-Viren, die die PRV-Glykoproteine gpll, gp50 und gplll einzeln exprimieren, erzeugen errechnete PDso-Werte von 6,4 bzw. 5,4 und 5,8 (logio). Wenn die Glykoproteine in Kombination exprimiert werden, errechnen sich bessere PDso-Werte. Die PRV gpll plus gp50 exprimierenden Vaccinia-Rekombinante erzeugte einen PDso-Wert von 3,3, 40 während die PRV gp50 plus gplll exprimierende Vaccinia-Rekombinante einen im wesentlichen ähnlichen PDso-Wert (3,6) ergab. Offensichtlich wirksamer ist die die PRV-Glykoproteine gpll plus gplll exprimierende Rekombinante, bei der man einen PD50 von 1,5 erhält. Die Coexpression aller drei PRV-Glykoproteine gpll, gplll und gp50 in einem rekombinanten Vaccinia-Virus liefert keinen PDso-Wert, der signifikant niedriger liegt als die Werte, die mit den rekombinanten Viren erhalten wurden, die die drei PRV-Glykoproteine 45 einzeln exprimieren. Die erhöhte Wirksamkeit, die man mit der Vaccinia-Rekombinanten, die gpll und gplll exprimiert, erhält, ist im Vergleich mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus, das die Gene einzeln exprimiert, ähnlich den Ergebnissen, die in Beispiel 6 für die Coexpression der Pferde-Herpesvirus-Glykoproteine gp13 und gp14 beschrieben wurden. 50 37 55

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Tabelle 8

Potenz der Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die die Pseudorabies-Virus-Glykoproteine gp50, gpll und gplll exprimieren Rekombinantes Virus exprimierte PRV-Gene PDso vP534 gpn 6,4 vP591 gp50 5,4 vP604 gplll 5,8 vP621 gpll + gp50 3,3 vP644 gpll + gplll 1,5 vP691 gp50 + gplll 3,6 vP692 gp50 + gpll + gplll 5,1

Obwohl die Maus ein interessantes Modellsystem zur Bewertung der PRV-Glykoprotein-Immunogenität bereitstellen kann, ist die Haupt-Zielart für das PRV-Vakzin das Schwein. Deshalb wurde zur Beurteilung der Gültigkeit des rekombinanten Vaccinia-Virus-Verfahrensim Schwein das folgende Experiment durchgeführt. Ferkel mit ungefähr 25 kg wurden mit 2 ml der Kombinationen der PRV-Glykoprotelne gpll, gplll und gp50 exprimierenden Vaccinia-Rekombinanten intramuskulär inoculiert. Das Virus-Inoculum wurde in PBS verdünnt. 35 Tage nach dieser Inoculation wurden die Ferkel durch eine intranasale Injektion (1 ml in jedes Nasenloch) einer Suspension mit dem virulenten PRV-Isolat NIA3 infiziert. Die Wirksamkeit der Vakzinierung wurde durch vergleichende Messung der Gewichtszunahme von vakzinierten und Kontroll-Ferkeln 7 Tage nach der Infektion bewertet. Der relative Gewichtszuwachs errechnet sich aus dem täglichen mittleren prozentualen Gewichtszuwachses, der in vakzinierten Schweinen zu beobachten war, abzüglich des täglichen mittleren prozentualen Gewichtszuwachses unvakzinierter Kontrollschweine. Der normale Gewichtszuwachs von Schweinen unter ungestörten Bedingungen ist größer als 1,1 kg. Wie durch die Ergebnisse in Tabelle 9 gezeigt, ist die Gewichtsentwicklung während der 7-tägigen Periode nach der PRV-Infektion in vakzinierten Ferkeln stark gesteigert gegenüber dem mit Wildtyp-Virus inoculierten Kontrollsatz. Eine einzige Inoculation mit den Vaccinia-Virus-Rekombinanten ergibt einen signifikanten Schutz gegen einen Gewichtsverlust nach einer Infektion mit virulentem PRV.

Tabelle 9

Bewertung der Vaccinia-Rekombinanten, die Kombinationen der PRV-Glykoproteine gp50, gpll und gplll in Ferkeln exprimieren Virus-Inoculum Exprimierte PRV-Gene Vakzinierungsdosis logio TCIDso/ml relativer Gewichtszuwachs vP452 keine 107·7 -0,31 vP621 gpll + gp50 107·7 2,89 vP644 gpll + gplll 107·7 2,15 vP691 gp50 + gplll 107·3 1,21 vP692 gp50 + gpll + gplll 107·3 2,67

Die Verfügbarkeit von Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die die drei Haupt-PRV-Glykoproteine einzeln oder in Kombination exprimieren, bieten eine Reihe von Vorteilen, PRV-Infektionen zu kontrollieren: (a) Ein nennenswerter Vorteil ist es, daß die rekombinanteen Vaccinia-Viren als Vakzinierungsmittel lediglich eine begrenzte Anzahl der PRV-Gene exprimieren und es deshalb kein begleitendes Risiko einer Reversion eines attenuierten PRV-Vakzinstammes in eine virulente Form gibt und deshalb keine fortlaufende Einführung von PRV-Virus in die Umgebung stattfindet; (b) da durch die rekombinanten Vaccinia-Virus-PRV-Vakzinkandidaten nur eine begrenzte Anzahl von PRV-Antigenen exprimiert wird, gestattet dies die Unterscheidung von vakzinierten gegenüber natürlich infizierten Tieren, da aus anderen PRV-Antigenen bestehende Diagnosemittel zur Unterscheidung zwischen vakzinierten und natürlicherweise infizierten Tieren zusammengestellt werden könnten; und (c) solche rekombinanten Vakzine könnten nützlich sein für das Durchbrechen der natürlichen vertikalen Transmission von PRV von der Muttersau zur Nachkommenschaft. Dies ließe sich erreichen durch die Vakzinierung der trächtigen Sau mit einer Vaccinia-Virus-Rekombinan- 38

AT 405 184 B ten, die einen diskreten Satz von PRV-Glykoproteinen exprimiert. Maternale Immunität sollte die Nachkommenschaft gegen PRV-Infektion schützen. Die Nachkommenschaft ihrerseits könnte dann mit einer Vacci-nia-Virus-Rekombinanten vakziniert werden, die noch eine ändere von der zur Vakzinierung der Sau verwendeten verschiedene Konfiguration von PRV-Antigenen exprimiert. Dies ist ein möglicher Weg, um die matemale Immunität zu durchbrechen. Ein anderes Vorgehen bezüglich des Sachverhalts der maternalen Immunität würde es sein, die PRV-Glykoproteine, in welcher Kombination auch immer, in einem vollständig heterologen Vektor zu exprimieren. Dies wird erreicht durch die Konstruktion von Vogelpockenvirus-Rekombinanten, die PRV-Glykoproteine exprimieren. Die Nützlichkeit von Vogelpockenvirus-Rekombinanten, deren natürlicher Wirtsbereich auf Vogelarten beschränkt ist, bei der Vakzinierung von Nicht-Vogelarten ist beschrieben (41). Somit sind zwei Vorgehensweisen bezüglich des Sachverhalts einer durch die maternale Immunität herbeigeführten Barriere verfügbar: (1) Die Vektoren und (2) die Konstellation der von diesen Vektoren exprimierten Antigene.

Beispiel 11

Vogelpockenvektoren, die das Pseudorabies-Virus Glykoprotein gpll exprimieren

Unter früher beschriebenen Bedingungen (41, 42) wurden Kanarienpockenviren vermehrt auf primären Hühnerembryofibroblasten (CEF), die aus 10 bis 11 Tage alten Embryo enthaltenden Eiern abgeleitet waren, die von SPAFAS, Inc. (Norwich, CT) bezogen wurden. Nach dem Verfahren von Joklik (191) wurde das Virus von Wirtszellverunreinigungen durch Saccharose-Gradienten-Zentrifugation gereinigt. Schweine-nieren-(PK-l-) Zellen wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC #CL101) bezogen.

Konstruktion einer Kanarienpocken-Virusrekombinanten, die das Pseudorabies-Virus gpll-Glykoprotein expri- miert.

Fig. 26 entsprechend wurde das Plasmid pPRl5 (Fig. 18) als Quelle des PRVgpll-Gens verwendet. Zum Isolieren des DNA-Abschnittes, der das gesamte PRVgpll-Gen enthält, wurde pPRl5 mit EcoRV und Hindlll gespalten. Durch diese Spaltung wurde ein Fragment mit ungefähr 2,8 kb erzeugt, das 21 bp des 3'-Endes des Vaccinia-Virus-(W) H6-Promotors und das gesamte PRVgpli-Gen enthält. Das 2,8 kb EcoRV/Hindlli-Fragment wurde für die Insertion in pFPCV2 (Figuren 8, 26) isoliert.

Das (vorstehend definierte) 2,8 kb EcoRV/Hindlll-Fragment wurde in das 8,0 kb pFPCV2-Fragment inseriert, das sich aus der vollständigen Spaltung mit Hindlll und einer partiellen Spaltung mit EcoRV herleitet. Die Ligation dieser beiden Fragmente ergab die Bildung eines 10,8 kb-Plasmids, das mit pFPPRVII bezeichnet wurde.

Das Plasmid pFPPRVII wurde gemäß Fig. 27 verwendet, um ein 2,8 kb Nrul/Hindlll-Fragment für die Insertion in pCPCVI (Fig. 9) zu erzeugen. Das pCPCVI-Plasmid enthält den W H6-Promotor in der einzigen EcoRI-Stelle innerhalb des genomischen 3,3 kb Pvull-CP-Fragments. Dieses lnsertionsplasmid erlaubt die Insertion fremder Gene in den C3-Ort des CP-Genoms. Das Plasmid pCPCVI wurde mit Nrul und Hindlll gespalten, und das 5,8 kb-Fragment wurde für die Ligation mit dem vorstehend definierten 2,8 kb-Fragment isoliert. Das resultierende Plasmid wurde mit pCPPRVII bezeichnet.

Der Hauptselektionsmarker, E. coli-Xanthinguanin-Phosphoribosyltransferase (Eco gpt) wurde in pCPPRVII als Wachstumsselektionsmittel für CP/PRVgpll-Rekombinante inseriert. Frühere Berichte haben die Verwendung von Eco gpt als selektierbaren Marker bei der Erzeugung rekombinanter Pockenviren beschrieben (193,194). Das Eco gpt-Gen wurde aus dem Plasmid pSV2gpt (ATCC #37145) erhalten. Das 670 bp Bglll/Dral-Fragment, das das Eco gpt-Gen enthält, wurde von diesem Plasmid isoliert und in die Bglll/Smal-Stelle von pSD486VC inseriert. Das resultierende Plasmid pGPT-1 enthält das Eco gpt-Gen zwischen den flankierenden Armen des W u-Gens und unter der Transkriptionsregulation des n-Promotors. Das Plasmid pSD486VC wurde aus pSD478VC (Fig. 24) auf folgende Weise abgeleitet. pSD478VC wurde mit EcoRI im MCR gespalten, in einer Klenow-Standard-Reaktion in Gegenwart von dNTPs (je 0,5 mM) aufgefüllt und re-ligiert, um pSD478 E~ VC herzustellen. Dieses Plasmid wurde mit Hpal und BamHI gespalten und die aneinandergelagerten Oligonucleotide HEM 5 (5’-GATCCGATTCTAGCT-3') und HEM 6 (5'-AGCTAGAATCG-3') wurden zur Herstellung von pSD486VC inseriert.

Die Spaltung von pGPT-1 mit Ncol und EcoRI setzte ein 1,0 kb-Fragment frei, das das Eco gpt-Gen (670 bp) und den W-w-Promotor (330 bp) enthielt. Die Ncol- und EcoRI-Enden wurden in Gegenwart von 0,5 mM dNTPs unter Verwendung des Klenow-Fragmentes der E. coli DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. An das stumpfendige Fragment wurden Hindlll-Linker (Bethesda Research Laboratories, Bethes- 39

AT 405 184 B da, MD) angeheftet. Die DNA wurde mit Hindlll gespalten und das 1,0 kb-Fragment aus einem Agarosegel wiedergewonnen. Dieses 1,0 kb Hindlll-Fragment wurde dann in die Hindlll-Stelle von pCPPRVII inseriert. Das resultierende Plasmid, das die Eco gpt- und PRVgpll-Gene, in einer Schwanz-zu-Schwanz-Konfigura-tion miteinander verknüpft, enthielt, wurde mit pCPPRVII gpt bezeichnet. Dieses Plasmid wurde in in vitro-Rekombinationsexperimenten zur Insertion in den C3-Ort des CP-Genoms verwendet. Die Selektionierung von Rekombinanten, die das Eco gpt-Gen enthielten, wurde in Gegenwart von 100 ug/ml Mycophenolsäure vorgenommen, und die Eco gpt-positiven Rekombinanten wurden anschließend durch Plaque-Hybridisierungsanalyse auf die Anwesenheit des PRVgpll-Gens abgesucht. Eco gpt- und PRV gpll-positive Plaques wurden über drei Cyclen einer Plaque-Isolierung gereinigt, und saubere Populationen wurden mit einem hohen Titer aufgezogen und mit pCP55 bezeichnet. "Southern blot"-Analysen bestätigten, daß diese beiden Gene tatsächlich genetisch in diesen CP-Rekombinanten miteinander verknüpft sind. Die CP-Rekombinante wurde mit vCP55 bezeichnet.

Immunfluoreszenz von vCP55-infizierten Zellen.

Es wurden Immunfluoreszenz-Untersuchungen durchgeführt, um die zelluläre Lokalisierung des in vCP55-infizierten Zellen exprimierten PRV gpll-Gens zu zeigen. CEF- oder PK-1-Zellen wurden auf 22 mm Glasdeckgläschen in 35 mm Schalen mit 5 x 105-Zellen pro Schale ausgesät. CEF- und PK-1-Zellen wurden entweder mit vCP55 oder mit dem CP-Elternvirus infiziert. Infektionen und Inkubationen für den Immunfluoreszenztest wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt unter Verwendung des 1:100 in PBS +-verdünnten monoclonalen Antikörpers 75N10.

Die infizierten Zellen wurden sowohl auf interne als auch auf Oberflächenexpression hin analysiert. In keinem der mit vCP55-infizierten Zellsysteme wurde eine signifikante Oberflächenexpression von gpll beobachtet. Eine interne Expression des gpll-Genproduktes ließ sich jedoch sowohl im vCP55-infizierten CEF- als auch in PK-1-Zellen beweisen. Die internen Fluoreszenzsignale in beiden Zelltypen wurden in Granula im perinuclearen Bereich der infizierten Zellen lokalisiert. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das durch CP exprimierte PRVgpll in den Golgi-Komplex, nicht aber in die Plasmamembran transportiert wird. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von den Ergebnissen, die erhalten wurden mit dem von Vaccinia-Virus exprimierten gpll, das auf der Oberfläche infizierter Zellen nachgewiesen wurde.

Immunpräzipitation von PRVgpll aus CEF- und PK-1 -infizierten Zellen.

Die Expression des PRVgpll-Genprodukts durch vCP55 wurde durch Immunpräzipitation von Lysaten der infizierten Zellen analysiert. Zelleinzelschichten wurden mit 5 pfu/Zelle infiziert. Der Immunpräzipitationstest wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers 75N10 durchgeführt.

Die mit Kaninchen-anti-PRV-Serum gefällten Hauptpolypeptidarten von infizierten CEF- und PK-1-Zellen wandern mit apparenten Molekulargewichten von ungefähr 120 kDa, 67 kDa und 58 kDa. Diese Polypeptide stellen die Vorstufe bzw. proteolytisch prozessierte Formen des in PRV infizierten Zellen nachgewiesenen PRVgpll dar, die über Disulfidverknüpfungen komplexiert sind (86,101,196). In kleinerer Menge vorhandene Arten mit apparenten Molekulargewichten von ungefähr 26 kDa wurden ebenfalls beobachtet, und sie könnten weitere proteolytische Prozessierungsereignisse bei gpll in diesen mit der CP/PRV-Rekombinanten infizierten Zellen widerspiegeln. Aus Lysaten von Kontroll-CP-Virus-infizierten Zellen und unifizierten Zellen wurden keine äquivalenten Polypeptide präzipitiert.

Untersuchung der Schutzwirkung·

Die Fähigkeit von vCP55, eine Schutz-Immunantwort gegen eine Infektion mit lebendem PRV hervorzurufen, wurde im Maus-System analysiert. Mäuse wurden in der Pfote mit 50 bis 100 ul-Proben, die verschiedene in Tabelle 10 aufgeführte Mengen von vCP55 enthielten, inoculiert. 14 Tage nach der Immunisierung erhielten die Mäuse eine 16fache LD50 des PRV-Kojnock-Stammes auf intraperitonealem Wege. 14 Tage nach der Infektion, als das Experiment beendet wurde, wurden die Überlebenden ausgezählt. Wie in Tabelle 10 gezeigt, schützte die Inoculation von Mäusen mit einer einzigen Dosis von 1q6,85 xcidjo acht von zehn Mäusen vor einer tödlichen PRV-Infektion. Die niedrigeren getesteten vCP55-Mengen gewährten keinerlei Schutz. Eine Infektion mit lebendem PRV tötete sieben von acht nicht-vakzinierten Mäusen. Aus den in Tabelle 10 gezeigten Ergebnissen wurde eine PDso (50 % Schutzdosis) von 106·16 für die vCP55-Rekombinante berechnet. 40 ΑΤ 405 184 Β

Die Wirksamkeit von vCP55 als Immunisierungsmittel gegen eine Infektion mit lebendem PRV wurde ebenfalls in der Zielart, dem Ferkel, bewertet. Fünfzehn, beinahe 25 kg wiegende Ferkel wurden in drei Gruppen unterteilt. Sowohl die vCP55-Gruppe als auch die CP-Elternvirusgruppe erhielten je zwei Inocula-tionen (2 ml entsprechend 2x10® TCID50) an den Tagen 0 und 28 auf intramuskulären Weg. Fünf Ferkel wurden als nicht-vakzinierte Kontrolle behalten. Allen Ferkeln wurde über den intranasalen Weg am Tag 35 der pathogene PRV-Stamm NIA3 verabreicht. Die Wirksamkeit wurde durch Vergleichen der Gewichtsentwicklung der vCP55-vakzinierten und der Kontrollschweine während der sieben Tage nach der Infektion verfolgt. Die Gewichtsentwicklung werden als Delta GMQR-Werte (in Kilogramm) = mittlerer prozentualer GMQR der vaccinierten Ferkel - mittlerer prozentualer GMQR der unvakzinierten Ferkel berechnet.

In der unvakzinierten Gruppe verendeten alle Ferkel der PRV-Virus-Infektion (zwei am Tag fünf, zwei am Tag sechs und eines am Tag sieben). In der mit Wildtyp-Virus (CP) inoculierten Gruppe verendeten vier der fünf Ferkel der Infektion (drei am Tag sechs, eins am Tag sieben). Alle Ferkel der vCP55 vakzinierten Gruppe überlebten die PRV-Infektion und gediehen.

Bei den Ferkeln, die mit dem das PRVgpll-Glykoprotein exprimierenden vCP55 inoculiert worden waren, wurde ein nennenswertes AusmaS des Schutzes gegen eine Infektion mit lebendem PRV beobachtet (Tabelle 11). vCP55-vakzinierte Tiere wiesen einen signifikanten Nettogewichtszuwachs während der Zeit des Experiments auf, während die beiden Kontrollgruppen einen signifikanten Gewichtsverlust in dem der PRV-Infektion folgenden Zeitraum aufwiesen. Außerdem wurden in der vCP55-vakzinierten Gruppe keine Todesfälle beobachtet, während eine 80%ige bis I00%ige Mortalitätsrate nach der Infektion mit lebendem PRV mit den Kontrollgruppen festgestellt wurde.

Tabelle 10

Wirksamkeit von vCP55 in Mäusen Dosis logio TCIDso Schutz 6,85 8/10 4,85 0/10 2,80 0/10 0,85 0/10

Tabelle 11

Schutz vakzinierter (vCP55)-Ferkel gegen eine PRV-Infektion, der durch Mortalitätsrate und Gewichtszuwachs bestimmt wurde Behandlung Mortalität Gewichtszuwachs nicht vakziniert 5/5 -2,12 Wildtyp (CP) 4/5 + 0,61 Rekombinante (vCP55) 0/5 + 2,51

Beispiel 12 PRV gl-Glykoproteine exprimierende Vaccinla-Rekombinanten

Der Copenhagen-Stamm von Vaccinia-Virus und die davon abgeleiteten Rekombinanten wurden in dem vorliegenden Beispiel verwendet.

Clonierung des PRVgl-Gens in Donorplasmide von Kanarienpocken und Vaccinia-Virus.

Es wird auf Fig. 28 Bezug genommen. Das das PRVgl-Gen (NIA3-Stamm) enthaltende Plasmid pGPI wurde von Rhone Merieux, Lyon, Frankreich, erhalten. Das gl-Gen (Bezug 2ur Sequenz (80)) wurde aus diesem Plasmid isoliert und stromabwärts des synthetischen Vaccinia H6-Promotors (69) cloniert. Dies wurde durch die Clonierung des 2330 bp Xhol-Ncol (partiell)-Fragments von pGPI in das 6400 bp Xhol- 41

AT 405 184 B

Ncol-Fragment von pGBC2 erreicht. (pGBC2 wurde durch Clonierung des HSV2-gB-Gens in das 3200 bp Bglll-Fragment von pRW764.5 erzeugt. pRW764.5 wurde durch Clonierung eines 0,8 kb PvuH-Fragments der Kanarienpocken-DNA in das 2360 bp Pvull-Fragment von pUCl8 konstruiert.) Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pPGI2 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gl-Gens ausgerichtet. Dies wurde erreicht durch Clonierung der Oligonucleotide PRVL5 5 ’ - ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTC-3 1 und PRVL6 5 ' - CTGCGCGGCGCGCAGCAGAAAGGGCCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3 » in das 5900 bp EcoRV-AlwNI (partiell)-Fragment von pPGI2. Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pPGI3 bezeichnet.

Nicht relevante PRV gl 3'-nicht-codierende Sequenzen wurden dann entfernt. Dies wurde durch Clonierung der Oligonucleotide PRVL3 5 *- CTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGGCCCAACTATGGCGTG ACCGCCAGCCGCCTGTTGAATGCCCGCCCCGCTTAACTGC AGAATTCGGATCCGAGCT-3 · und PRVL4 5 · - CGGATCCGAATTCTGCAGTTAAGCGGGGC GGGCATTCAACAGGCGGCTGGCGGTCA CGCCATAGTTGGGCCCATTCGTCACTTCCGGTTTCTCCGGATCGCGGAACCAGACGT-3 * in das 5200 bp Sacl-Aatll (partiell)-Fragment von pPGI3 erreicht. Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pPGI6 bezeichnet.

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gl-Gen wurde dann in ein Vaccinia-Virus-Donor-plasmid cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonierung des 1750 bp Nrul-BamHI-Fragments von pPGI6 in das 5000 bp Nrul-BamHI-Fragment von pBPl4. (pBP14 enthält das Rinder-Leukämie-Virus-gag-Gen unter der Kontrolle des synthetischen Vaccinia H6-Promotors im Vaccinia-Vektorplasmid pSD494VC. pSD494VC ist ein Subclon des Vaccinia-Virus Copenhagen Hindlll-A-Fragmentes, in dem die Vaccinia-Gen codierende Sequenz, die eine Homologie mit Kuhpocken ATI-Gen aufweist (210), durch einen Polylinkerbereich ersetzt ist.) Das setzt das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gl-Gen zwischen die Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Sequenzen, die das ATI-Gen flankieren. Das durch diese Manipulation erzeugte Piasmid wird mit pPGI7 bezeichnet.

Das rekombinante Vaccinia-Virus vP717 wurde durch Transfektion von mit vP410 infizierten Zellen mit pPGI7 erzeugt.

Konstruktion von vP717.

Das gl-Gen von PRV wurde in einem Vaccinia-Virus-Vektor cloniert. Die zur Konstruktion dieser vP717-Vaccinia-Virus-Rekombinanten verwendete Strategie ist in Fig. 28 skizziert. Das in vP717 enthaltene PRV gl-Gen ist zwischen die Vaccinia-Virussequenzen cloniert, die das ATI-Gen flankieren, und es verwendet 42

AT 405 184 B den frühen/späten Vaccinia-Virus-Promotor H6 (41, 42, 69).

Immunfluoreszenz der PRV-codierten Polypeptide auf vP717-infizierten Zellen.

In PRV-infizierten Zellen wird gl auf der Plasmamembran exprimiert. Immunfluoreszenzuntersuchungen von vP717-infizierten Zellen mit dem PRV gl-spezifischen monoclonalen Antikörper 42M17 zeigt, daß das in diesen Zellen produzierte PRV-codierte Polypeptid auch auf der Plasmamembran exprimiert wird.

Bewertung von vP717 in Mäusen.

Eine in vivo-Bewertung von vP717 in Mäusen erbrachte unter Verwendung von Standardverfahren einen Schutz gegen PRV-Infektion (Tabelle 12).

Tabelle 12

Bewertung der Vaccinia-Virus-Rekombinanten vP717, die PRV gpl in Mäusen exprimiert vP717 Inoculationsdosis logio TCID50 Überlebende nach PRV-Infektion 7,3 4/10 5,3 5/10 3,3 0/10 1,3 2/10

Beispiel 13

Expression der Herpes simplex-Virus Typ 2-Glykoproteine gB, gC und gD in Vaccinia-Virus-Rekombinanten entweder einzeln oder in Kombinationen

Das in diesem Beispiel verwendete HSV2 (Stamm g) (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) (ATCC #VR734) wurde in VERO-Zellen (ATCC #CCL81) vermehrt und durch Zentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten (197) gereinigt.

Clonieren des HSV2 gB-Gens in Vaccinia-Vjrus-Donorplasmide.

Die Nucleotidsequenz des HSV2 gB-Gens ist früher beschrieben worden (116). Bezug nehmend auf Fig. 29 wurde ein 12 kb Bglll-Fragment, das das HSV2 gB-Gen enthielt, aus genomischer HSV2 (Stamm G)-DNA isoliert und in die BamHI-Stelle von pUCl9 inseriert, wodurch das Plasmid pJ4 erzeugt wurde.

Das gB-Gen wurde dann zwischen flankierende Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Arme cloniert. Das wurde durch die Clonierung des 2700 bp Sstll-Sacl (partiell)-Fragmentes von pJ4 in das Sstll-Sacl-Fragment von pMP409DVC3 cloniert. (pMP409DVC3 ist ein Abkömmling von pMP409DVC (184) (Fig. 4), in dem die Bglll-Stelle durch einen Polylinkerbereich ersetzt ist.) Dies setzt das gB-Gen zwischen die Vaccinia-Sequenzen, die das M2L-Gen flankieren. Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pGB1 bezeichnet.

An das 3'-Ende des gB-Gens wurde dann im Raster ein Terminationscodon hinzugefügt. Dies wurde durch das Clonieren der Oligonucleotide GBL3 5'-CTAATAG-3' und GBL4 5'-GATCCTATTAGAGCT-3' in das 6300 bp BamHI-SacI (partiell)-Fragment von pGBl erreicht. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGB2 bezeichnet.

Der H6-Promotor wurde dann stromaufwärts des gB-Gens cloniert. Dies wurde durch die Clonierung des 370 bp BgIII-Fragments von pBLVH14 erreicht, das den H6-Promotor in der Bglll-Stelle von pGB2 enthielt (pBLVH14 enthält das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende Rinderleukämievirus-Hüllgen im Vaccinia HA-Deletionsort). Das durch diese Manipulation erzeugte Plasmid wird mit pGB3 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gB-Gens ausgerichtet. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide GBL1 43

AT 405 184 B 5' - ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCGCGGGGGGGGCTTGATTTGCGCGCT GGTCGTGGGG GCGCTGGTGGCCGC-3 ' und GBL2 5' - GGCCACCAGCGCCCCCACGACCAGCGCGCAAATCA AGCCCCCCCCGCGCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' in das 6300 bp Sstll-EcoRV (partiell)-Fragment von pGB3. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGB5 bezeichnet. Im Plasmid pGB5 ist das HSV gB-Gen unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors in den M2L-Deletionsort von Vaccinia inseriert. Da der M2L-lnsertionsort innerhalb eines größeren Bereichs des Genoms, den man deletieren kann, liegt, wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gB-Gen in eine andere Deletionsstelle in einem anderen Vaccinia-Virus-Donorplasmid cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 2800 bp Bglll-BamHI-Fragments von pGB5 in die Bglll-Stlle von pSD513VCVQ erreicht. (pSD5l3VCVQ ist ein Subclon des Copenhagen-Vaccinia-Virus Hindill J-Fragments, in dem die das Thymidinkinase (TK)-Gen codierende Sequenz durch einen Polylinkerbereich ersetzt ist.) Damit ist das unter der H6-Promotorkontrolle stehende gB-Gen zwischen die Vaccinia-Virus-Sequenzen gesetzt, die das TK-Gen flankieren. Das auf diesem Weg erzeugte Plasmid wird mit pGB6 bezeichnet.

Clonieren des HSV2 gC-Gens in Vaccinia-Virus-Donorplasmide.

Die Nucleotidsequenz des HSV2 gC-Gens ist früher bestimmt worden (117). Fig. 30 entsprechend wurde aus der genomischen HSV2 (Stamm G)-DNA ein das HSV2 gC-Gen enthaltendes 2900 bp Sall-Fragment isoliert und in die Sall-Stelle von plBI25 inseriert, um das Plasmid pGC3 zu erzeugen.

Das gC-Gen wurde dann zwischen die flankierenden Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Arme cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 2900 bp Xhol-BamHI-Fragments von pGC3 in die Xhol-BamHI-Stelle von pGC2. pGC2 wurde durch Clonieren des 370 bp Bglll-Fragments von pBLVH14 erzeugt, das den Vaccinia-Virus H6-Promotor in der Bglll-Stelle von pSD486VC enthielt. pSD486VC ist ein Subclon des Copenhagen-Vaccinia-Virus-Hindlll-B-Fragments, in dem die codierende Sequenz des u-Gens durch einen Polylinkerbereich ersetzt ist. Damit ist das gV-Gen zwischen die Vaccinia-Virus-Sequenz, die das u-Gen flankiert, gesetzt. Das auf diesem Weg erzeugte Plasmid wird mit pGC5 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gC-Gens ausgerichtet. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide GCL1

5' - ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCCTTGGACG GGTGGGCCTAGCCGTGGGCCTGTG- 3 1 und GCL2 5·1 - AGGCCCACGGCTAGGCCCACCCGTCCAAGGGCCAT TACGATACAAACTTAACGGAT-3' in das 5400 bp Nrul-Sfil-Fragment von pGC5. Das auf diesem Wege erzeugte Plasmid wird mit pGClO bezeichnet.

Die nicht relevante 3'-nicht-codierende Sequenz wurde dann aus pGClO beseitigt. Dies wurde erreicht durch Rezirkularisierung des mit E. coli DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) behandelten 4900 bp Sall-Smal (partiell)-Fragments von pGClO. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGC11 bezeichnet. 44

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Von pGC11 wurde dann zusätzlich 3'-nicht-codierende Sequenz beseitigt. Dies wurde erreicht durch Clonieren des Oligonucleotids GCL3 5'-CTAGGGCC-3’ in das 4900 bp Xbal-Apal (partiell)-Fragment von pGCH. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit pGCl2 bezeichnet, im Plasmid pGC12 ist das HSV gC-Gen unter der Kontrolle des H6-Promotors in den u-Deletionsort von Vaccinia inseriert. Da der u-Insertionsort innerhalb eines größeren deletierbaren Bereiches des Genoms liegt, wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gC-Gen in die ATMnsertionsstelle in einem Vaccinia-Virus-Donorplas-mid cloniert. Das wurde erreicht durch Clonieren des 1550 bp Nrul-BamHI-Fragments von pGC12 in das 5000 bp Nrul-BamHI-Fragment von pBPl4. Damit wird das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gC-Gen zwischen die Vaccinia-Virus (Copenhagen)-Sequenzen, die das ATI-Gen flankieren, gesetzt. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGCl3 bezeichnet.

Clonieren des HSV2 gD-Gens in Vaccinia-Virus-Donorplasmide·

Die Nucleotidsequenz des HSV2 gD-Gens ist früher bestimmt worden (118). Fig. 31 entsprechend wurde aus der genomischen DNA von HSV2 (Stamm G) ein das HSV2 gD-Gen enthaltendes 7,5 kb Xbal-Fragment isoliert und in die Xbal-Stelle von plBI25 inseriert, womit das Plasmid pGD1 erzeugt wurde.

Das gD-Gen wurde dann stromabwärts des H6-Promotors zwischen flankierende Vaccinia-Virus (Copen-hagen)-Arme cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 1500 bp Dral-Pstl-Fragments von pGD1 in die Smal-Pstl-Stelle von pTPl5 (184) (Fig. 3). Damit wird das gD-Gen stromabwärts des H6-Promotors und zwischen die Vacciniasequenzen, die das HA-Gen flankieren, gesetzt. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGD2 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem Initiationscodon des gD-Gens ausgerichtet. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide GDL1 5 ’ - ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGGCGTTTGACCTCCGG-3 · und GDL2

t> ’-CGCCGGAGGTCAAACGCCCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3 V in das 5100 bp EcoRV-Ahall(partiell)-Fragments von pGD2. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGD5 bezeichnet.

Dann wurde nicht relevante 3'-nicht-codierende Sequenz entfernt. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide GDL3 5'- GGCÄGTACCCTGGCGGCGCTGGTCATCGGCGGTATTGCGTTTTGGGTACGCCGCCGGCGC TCAGTGGCCCCCAAGCGCCTACGTCTCCCCCACATCCGGGATGACGACGCGCCCCCCTCG CACCAGCCATTGTTTTACTAGCTGCA-3· und GOL4 5 GCTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAGGGGGGCGCGTCGTCATCCCGGATGTGGGGGAGAC GTAGGCGCTTGGGGGCCACTGAGCGCCGGCGGCGTACCCAAAACGCAATACCGCCGATGA^ CCAGCGCCGCCAGGGTACTGCC-3' in das 4800 bp Nael-Pstl-Fragment von pGD5. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGD7 bezeichnet. 5’-seitig des H6-Promotors wurde dann eine zusätzliche Sequenz hinzugefügt. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 150 bp Bqlll-EcoRV-Fragments von pGB6 (Fig. 30) in das 4800 bp Bglll-EcoRV-Fragment von pGD7. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit pGD8 bezeichnet. 45

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Konstruktion rekombinanter Vaccinia-Viren.

Die zum Clonieren der HSV2 gß-, gc- und gD-Gene in Vaccinia-Virus verwendete Strategie ist in den Figuren 29 bzw. 30 und 31 skizziert. Alle Konstruktionen verwenden den frühen/späten Vaccinia-Virus-Promotor H6 (41, 42, 184). Jedes HSV2-Gen ist jedoch in einer unterschiedlichen Stelle des Vaccina-Virus-Genoms codiert. Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gB-Gen ist zwischen die das M2L-Gen flankierende Sequenz (vP5699 oder die Sequenz, die das TK-Gen flankiert (vP734, vP775 und vP776) cloniert. Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gC-Gen ist zwischen die das u-Gen flankierende Sequenz (vP579) oder die das ATI-Gen flankierende Sequenz (vP748, vP776 und vP777) cloniert. Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gD-Gen ist zwischen die das HA-Gen flankierende Sequenz (vP570, vP761, vP775 und vP777 cloniert. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP569 wurde durch Transfektion von vP458-infizierten Zellen mit pGD5 erzeugt. vP734 wurde durch Transfektion von vP618-infizierten Zellen mit pGB6 erzeugt. vP579 wurde durch Transfektion von vP533-infizierten Zellen mit pGC11 erzeugt. vP748 wurde durch Transfektion von vP618-infizierten Zellen mit pGC13 erzeugt. vP570 wurde durch Transfektion von vP425-infizierten Zellen mit pGB5 erzeugt. vP761 wurde durch Transfektion von vP618-infizierten Zellen mit pGD8 erzeugt. vP425 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus (Copenhagen), aus dem das TK-Gen deletiert und das HA-Gen durch £-Galactosidase (Beispiel 1) (184) ersetzt worden war. vP458 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus (aus dem das TK-Gen deletiert und das M2L-Gen durch ß-Galactosidase (Beispiel 2) ersetzt worden war. vP533 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus, bei dem das TK-Gen deletiert und das u-Gen durch /S-Galactosidase ersetzt worden ist. vP618 ist eine Variante des Wildtyp-Vaccinia-Virus, bei dem die TK-u-und ATI-Gene deletiert worden sind.

Rekombinantes Vaccinia-Virus, das zwei HSV2-Glykoprotein-Gene enthielt, wurden ebenfalls konstruiert. vP775 enthält die gB- und gD-Gene, vP776 enthält die gB- und gC-Gene und vP777 enthält die gC- und gD-Gene. vP775 wurde durch Transfektion von vP734-infizierten Zellen mit pGD8 erzeugt. vP776 wurde durch Transfektion von vP734-infizierten Zellen mit pGCl3 erzeugt. vP777 wurde durch Transfektion von vP748-infizierten Zellen mit pGD8 erzeugt.

Ein drei HSV2-Glykoproteingene enthaltendes rekombinantes Vaccinia-Virus wurde ebenfalls konstruiert. vP812 enthält die gB-, gC- und gD-Gene von HSV-2. vP812 wurde durch Transfektion von vP776-infizierten Zellen mit pGD8 erzeugt.

Immunfluoreszenz von HSV2-Glykoproteinen in mit rekombinanten Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

In HSV2-infizierten Zellen werden gB, gC und gD (genauso wie andere HSV2-codierte Glykoproteine) in der Plasmamembran exprimiert. Immunfluoreszenzuntersuchungen, die an Zellen, die mit HSV2-Gene enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Viren durchgeführt wurden, zeigen, daß die HSV2-Polypeptide, die in den mit diesen rekombinanten Vaccinia-Viren infizierten Zellen produziert wurden, ebenfalls auf der Plasmamembran exprimiert werden.

Immunpräzipitation von HSV2-Glykoproteinen in Zellen, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus infiziert waren.

Das in HSV2-infizierten Zellen produzierte HSV2 gB-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 117 kDa (198,199). Zellen, die mit rekombinanten Vaccinia-Viren, die das HSV2 gB-Gen enthalten (vP569, vP734, vP775 und vP776) produzieren ebenfalls ein HSV2-codiertes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 117 kDa. Eine Immunpräzipitation von vP569-infizierten Zellen mit Antiseren gegen das gesamte HSV2-Virus präzipitiert zwei Hauptproteine mit Molekulargewichten von ungefähr 117 kDa und 110 kDa und in geringeren Mengen drei Proteine mit Molekulargewichten von 50 kDa, 45 kDa und 30 kDa. Eine Immunpräzipitation von vP734-, vP775- und vP776-infizierten Zellen präzipitiert zwei Hauptproteine mit ungefähren Molekulargewichten von 110 kDa und 90 kDa und fünf Proteine in geringeren Mengen mit Molekulargewichten von ungefähr 117 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 45 kDa und 30 kDa.

Das in HSV2-infizierten Zellen produzierte HSV2 gC-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 63 kDa (199,200). Zellen, die mit den das HSV2 gC-Gen enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Viren vP579, vP748, vP776 und vP777) infiziert waren, produzierten ebenfalls ein HSV2-codiertes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 63 kDa. Eine Immunpräzipitation von vP579-, vP748-, vP776-und vP777-infizierten Zellen mit Antiseren gegen Gesamt-HSV2-Virus präzipitiert ein Hauptprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 65 kDA und ein Protein in kleinerer Menge mit einem Molekulargewicht von ungefähr 85 kDa. Kaninchenantiseren gegen Gesamt-HSV2-Virus wurden von DAKO Corporation 46 ΑΤ 405 184 Β (Santa Barbara, CA; Code Nr. B116) bezogen und in einer Verdünnung von 1:100 verwendet.

Das in HSV2-infizierten Zellen produzierte HSV2-gD-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 51 kDa (198, 199). Zellen, die mit den das HSV2 gd-Gen enthaltenden rekombinanten Vaccinia-Viren (vP570, vP761, vP775 und vP777) infiziert waren, produzierten ebenfalls ein HSV2-codiertes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 51 kDa. Eine Immunpräzipitation von mit vP570-, vP761-, vP775- und vP777-infizierten Zellen mit Antiseren gegen das Gesamt-HSV2-Virus präzipitiert ein Hauptprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 48 kDa und zwei Nebenproteine mit Molekulargewichten von ungefähr 40 und 31 kDa.

In-vivo-Bewertung.

Alle die die verschiedenen HSV-Glykoprotein-Konstruktionen exprimierenden rekombinanten Vaccinia-Viren schützen bei Experimenten, die denen von Paoletti et al. (26) beschriebenen ähnlich sind, immunisierte Mäuse gegen eine anschließende letale HSV-lnfektion.

Beispiel 14

Expression des Rinder-Herpesvirus 1 eines Glykoproteins gl in Vaccinia-Virus-Rekombinanten

Clonieren des BHV1 gl-Gens in Vaccinia-Virus-Donorplasmide.

Die Nucleotidsequenz des pHV1 gl-Gens ist früher veröffentlicht worden (63). Im folgenden wird auf Fig. 32 Bezug genommen. Das das BHV1 gl-Gen (Straub-Stamm) enthaltende Plasmid plBRS6 wurde von Rhöne Merieux, Lyon, Frankreich, bezogen. Das 5'-Ende des gl-Gens wurde stromabwärts des H6-Promotors (41, 42, 69) und zwischen die flankierenden Vaccinia-Virus (Copenhagen) Arme cloniert. Dies wurde durch Clonieren des 540 bp Sall-Pstl-Fragments von plBRS6 in das 4400 bp Sall-Pstl-Fragment von pGD5 erreicht (pGDB wurde durch Clonieren des HSV2-gD-Gens in pTP15 (184) erzeugt (Fig. 3)). Damit wird das gl-Gen stromaufwärts des H6-Promotors und zwischen die HA-flankierenden Vaccinia-Arme gesetzt. Das auf diesem Wege erzeugte Plasmid wird mit plBR2 bezeichnet.

Das Initiationscodon des H6-Promotors wurde dann nach dem lnitiationscodon des gl-Gens ausgerichtet. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide IBRL1 5'- ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCTCGCGGCGGTGCTGAACGCGCCGC-3 ·. und IBRL2 5 GGCGCGTTCAGCACCGCCGCGAGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3' in das 3800 bp Nrul-Sstll-Fragment von plBR2. Das auf diesem Wege erzeugte Plasmid wird mit plBR4 bezeichnet.

Dann wurde eine für die weiteren Manipulationen notwendige Ncol-Stelle erzeugt. Dies wurde durch Clonieren der Oligonucleotide IBRL3 5'-CCATGG Π TAATGCA-3' und IBRL4 5'-TTAAACCATGGTGCA-3' in die Pstl-Stelle von plBR4 erreicht. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit plBR5 bezeichnet.

Das 3'-Ende des gl-Gens wurde dann in plBR5 cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 1740 bp Tth1111-Ncol-Fragments von plBRS6 in das 3700 bp Tth 1111-Ncol-Fragment von plBR5. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit plBR7 bezeichnet.

Dann wurde eine für zukünftige Manipulationen notwendige Bglll-Stelle erzeugt. Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide IBRL5 5'-CATGGTTTAAGATCTC-3' und IBRL6 5'-CATGGAGATCT-TAAAC-3' in die Ncol-Stelle von plBR7. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit plBR8 bezeichnet.

Ein Teil der langen hydrophilen Leader-Sequenz des gl-Gens wurde dann deletiert (63). Dies wurde erreicht durch Clonieren der Oligonucleotide, IBRL7 5'- 47

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ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCCGCGCTAGCCGCTGCCCTGCTATGGGCGACGTGG GCC-3* und IBRL8 5'- CACGTCGCCCATAGCAGGGCAGCGGCTAGCGCGGCCATTACGATACAAACTTAACGGAT-3’ in das 4400 bp Nrul-Apal (partiell)-Fragment von plBR8. Dadurch werden 132 bp der hydrophilen Leader-Sequenz eliminiert. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit plBR9 bezeichnet.

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende, verkürzte gl-Gen wurde dann in ein anderes Vaccinia-Virus-Donorplasmid cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des 1700 bp Nrul-Bglll-Frag-ments von plBR9 in das 4900 bp Nrul-BamHI-Fragment von pBPl4 (211). Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird mit plBRlO bezeichnet.

Konstruktion rekombinanter Vaccinia-Viren.

Die zum Clonieren des BHV1 gl-Gens in Vaccinia-Virus verwendete Strategie ist in Fig. 32 skizziert. Das rekombinante Vaccinia-Virus vP637 wurde durch Transfektion von vP410-infizierten Zellen mit plBR7 erzeugt. vP724 wurde durch Transfektion vP410-infizierter Zellen mit plBR10 erzeugt. vP637 enthält das gesamte BHV1 gl-Gen. vP724 enthält ein gl-Gen, bei dem 132 bp der 5'-Signalsequenz (63) deletiert sind. Beide Konstruktionen verwenden den frühen/späten Vaccinia-Virus-Promotor H6 (41,42,184). Das gl-Gen in vP637 ist zwischen die das HA-Gen flankierenden Sequenzen cloniert. Das gl-Gen in vP724 ist zwischen die das ATI-Gen flankierenden Sequenzen cloniert.

Immunfluoreszenz und Nachweis eines BHV1-codierten Polypeptids in mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

In BHV1-infizierten Zellen wird gl auf der Plasmamembran exprimiert. Die Immunfluoreszenzuntersuchungen von Zellen, die mit vP637 oder vP724 infiziert sind, zeigen, daß das in diesen Zellen produzierte BHV1-codierte Polypeptid auch auf der Plasmamembran exprimiert wird. Immunfluoreszenzuntersuchungen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die monoclonalen BBV1-g[-spezifischen Antikörper 4203 und 5106 wurden verwendet (201).

Beispiel 15

Expression des Katzen-Herpesvirus-Glykoproteins gB in einer Vaccinia-Virus-Rekombinanten

In diesem Beispiel wurde der WR-Stamm von Vaccinia-Virus (202) verwendet. Das vom WR-Stamm abgeleitete rekombinante Vaccinia-Virus vP293 wurde als Rettungs-Virus verwendet (69).

Extraktion der FHV-1 -DNA und Clonieren des FNV-1 3,2 kb Sacl-Sacl-Fragments FHV-1-DNA wurde aus dem C O-Stamm extrahiert und gereinigt. Das FHV-1-DNA-Genom wurde mit EcoRI gespalten und in das Plasmid pBR322 nach Standardverfahren ligiert (20) Diese FHV-1-Bank wurde mit aus dem PRVgll- (62) und BHV-1 gB-(203) Genen abgeleiteten DNA-Sonden abgesucht. Nachfolgende Hybridisierungen mit Subclonen, die sich aus zwei in der Hybridisierung als positiv gefundenen EcoRI-Clonen ableiteten, ermöglichten eine genauere Kartierung des FHV-1 gB-Gens. Ein 3,2 kb Saci-Sacl-Fragment, das das FHV-1 gB-Gen enthielt, wurde in pUC18 cloniert, wodurch das Plasmid pFHVgBC erzeugt wurde. 48

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Sequenzieren des FHV-1 gB-codierenden Sacl-Sacl-Fragments.

Nucleotidsequenzdaten für beide Stränge wurden von pFHVgBC und pFHVgBC abgeleiteten Subclonen unter Verwendung der modifizierten T7-Sequenase wie vorstehend beschrieben erhalten. 5

Clonieren des FHV-1 gB-Gens in ein Vaccinia-Virus-Donorplasmid.

Wie aus Fig. 33 hervorgeht, wurde das FHV-1 gB-Gen cloniert in pHES4, einem der Plasmide, die für das Wirtsbereichs-Selektionssystem im Vaccinia-Virusstamm WR entworfen waren (69) (Fig. 10). Dieses jo Plasmid enthält das Wirtsbereichsgen K1L, das der Deletionsmutante vP293 gestattet, auf menschlichen Zellen zu replizieren. Das FHV-1 gB-Gen wurde unmittelbar stromabwärts des synthetischen Vaccinia H6-Promotors (69) inseriert. Das Plasmid pFHVgBC wurde mit KpNI und Sacl gespalten und das das FHV-1 gB enthaltende 3150 bp-Restriktionsfragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und dann in das vorher mit Kpnl und Sacl gespaltene Plasmid pHES4 ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pJCAOOl bezeichnet /5 (Fig. 33). DNA-Sequenzanalyse des FHV-1 gB-Gens.

Wie aus Fig. 34 hervorgeht, offenbarte die DNA-Sequenzanalyse einen sich von den Nucleotidpositio-20 nen 337 bis 3177 erstreckenden offenen Leserahmen. Im Bereich 5'-$eitig des ATG-Initiationscodons in der Position 337 wurden mutmaßliche Transkriptions-Regulationssignale gefunden. Eine TATA-Box mit der Sequenz AAATATAT (Nucleotide 184 bis 191) wurde 80 Nucleotide stromabwärts einer mutmaßlichen CAT-Box mit der Sequenz GGTGAGTA gefunden. 50 Nucleotide stromabwärts des TAA-Terminationscodons (Nucleotide 3178 bis 3180) lag ein Polyadenylierungssignal AATAAA (Nucleotide 3251 bis 3256). Acht von 25 elf Nucleotiden der Sequenz 5'-TCATTCTAGCA-3' (Nucleotide 200 bis 210) sind zu der 185 ribosomalen RNA-Sequenz 3'-AGGAAGGCGT-5' (61) komplementär und können als Ribosomen-Bindungsstelle dienen. Es wurde ein Abtastmodell vorgeschlagen, nach dem eukaryontische mRNAs die Translation initiieren (151, 155). Die Sequenzumgebung um das angenommene Initiationscodon ATCATGT (Nucleotide 334 bis 340) weist sich als ein funktionsfähiger Sequenzzusammenhang für die Initiation der Translation eukaryontischer 30 mRNA aus. Der FHV-1 gB-offene Leserahmen codiert 947 Aminosäuren mit einem errechneten Molekulargewicht von 106,2 kDA. Der G- + C-Gehalt ist 45,8 %.

Analyse der Struktur des FHV-1 gB-Proteins. 35 Die Analyse der Aminosäuresequenz offenbarte eine Reihe membranassoziierten Glykoproteinen gemeinsamer Merkmale. Ein sich von den Aminosäuren 23 bis 73 erstreckender Bereich besitzt ein charakteristisches Hydrophobizitätsprofil, und es wird angenommen, daß es sich bei ihm um die Signalsequenz handelt (Fig. 34). Wie aus Fig. 35 hervorgeht, gibt es eine der langen hydrophoben Signalsequenz vorangehende 22 Aminosäure lange hydrophile Sequenz. Dieses Charakteristikum ist ebenfalls für das 40 Pseudorabies (PRV) gll-Gen (62), für das Rinder-Herpesvirus-1 (BHV-1) gl-Gen (63) und für die Pferde-Herpesvirus-1 (EHV-1) (71) und Pferde-Herpesvirus-4 (EHV-4) (72) gp14-Gene, die alle ebenfalls Homologe von HSV gB sind, festgestellt worden. Es wird vorhergesagt, daß ein aus 42 Aminosäuren (Aminosäuren 789 bis 831) bestehender hydrophober Bereich als transmembrane Anker-Domäne funktioniert. Die hydrophile cytoplasmatische Domäne enthält 116 Aminosäuren. Es gibt 10 Asn-X-Thr/Ser-Stellen (wobei X jede 45 Aminosäure außer Prolin sein kann) für die potentielle N-verknüpfte Glykosylierung (64), wobei eine Stelle in der Signalsequenz liegt. Es gibt zwei aufeinanderfolgende und nahe zusammenliegende potentielle proteolytische Spaltstellen (Arg-Arg-Ser) (Positionen 504 bis 506 und 515 bis 518), die mit denen in PRVgll (94), VZV gPII und HCMV gB (71) und EHV-1 gP14 (71,72) identisch sind. Das Hydrophobizitätsprofil der FHV-1 gB-Aminosäuresequenz ist in Fig. 35 gezeigt. 50

Vergleich der FHV-1 gB-Aminosäuresequenz mit anderen Herpesvirus-Glykoproteinen.

Ein Vergleich der Aminosäurezusammensetzung des FHV-1 gB-Gens offenbart eine ausgedehnte Homologie mit Glykoproteinen anderer Herpesviren. So ist das FHV-1 gB mit PRVGII (62), BHV-1 gl (63), 55 Varicella zoster-Virus (VZV) gll (66, 204), HSV-1 gB (67), HSV-2 gB (205), EHV-1 gp14 (71) genauso homolog wie mit Glykoproteinen im Epstein-Barr-Virus (EBV) (68, 206) und im menschlichen Cytomegalovi-rus (HCMV) (10). 49

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Konstruktion der Vaccinia-Rekombinanten vP713, die das FHV-1 gB-Glykoprotein exprimiert.

Die FHV-1 gB-codierenden Sequenzen wurden in einem Vaccinia-Virus-Vektor inseriert, wobei das WR-Vaccinia-Virus-Wirtsbereichs-Selektionssystem pHES4/vP293 (69) verwendet wurde. Die Fähigkeit der re-kombinanten Vaccinianachkommenschaft, die durch Rekombination unter Verwendung des WR-Vaccinia-Virus vP293/pHES-Wirtsbereichs-Selektionssystems erzeugt wurde, auf menschlichen MRC-5-Stellen Plaques zu bilden, erlaubt eine schnelle Identifizierung dieser Rekombinanten (69). Die Vaccinia-Virus-Rekombinante vP713 wurde durch mit dem Plasmid pJCAOOl als Donorplasmid und vP293 als Rettungs-Virus durchgeführte Rekombination erhalten (Fig. 33).

Immunfluoreszenz des durch vP713 synthetisierten FHV-1 gB-Glykoproteins.

Immunfluoreszenz von durch das rekombinante Vaccinia-Virus vP713 infizierten VERO- oder MRC-5-Zellen wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt unter Verwendung des spezifischen anti-FHV-1 gB-Schafserums #2854. Es wurde eine Multiplizität der Infektion von zwei pfu pro Zelle verwendet. Als zweiter Antikörper wurde Esel-FITC-anti-Schafs-IgG verwendet. FHV-1 gB war auf der Oberfläche von mit der Vaccinia-Rekombinanten vP713 infizierten Zellen genauso nachweisbar wie intern nach Acetonfixierung. In vP4tO-infizierten Kontrollzellen wurde keine nennenswerte interne oder Oberflächen-Immunreaktivität gegen FHV-1 gB beobachtet.

Immunpräzipitation des durch vP713 synthetisierten FHV-1 gB-Glykoproteins.

Zur Beurteilung des durch vP713 exprimierten FHV-1 gB-Glykoproteins wurden VERO-Zellen mit vP713 infiziert und die Proteine metabolisch mit35 S-Methionin markiert. Unter Verwendung des spezifischen anti-FHV-1 gB-Schafserums #2854 wurden Immunpräzipitationen mit den radioaktiv markierten Zellysaten durchgeführt.

Mit 2 x 106-Zellen pro 60 mm Schalen ausgesäte VERO-Zell-Einzelschichten wurden mit einer niedrigen Infektionsmultiplizität von 0,1 pfu pro Zelle des Kontroll-(vP4l0) oder des rekombinanten Vaccinia-Virus vP713 infiziert. Die Immunpräzipitationen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Mit dem spezifischen anti-FHV-1 gB-Serum wurden weder aus den unifizierten VERO-Zellen noch aus VERO-Zellen, die mit dem Kontroll-Vaccinia-Virus vP410 infiziert worden waren, nennenswerte Produkte immunpräzipitiert. FHV-1 gB-radioaktiv markierte Produkte wurden durch das Serum #2854 aus mit vP713-infizierten VERO-Zellen präzipitiert. Es wurden fünf vorherrschende metabolisch radioaktiv markierte Polypeptide spezifisch präzipitiert. Die beiden größeren Polypeptide mit apparenten Molekulargewichten von 115 kDa und 110 kDa könnten mit den nicht-glykosylierten Vorläufer- und reifen Proteinen (theoretische Größen 106 kDa bzw. 98 kDa) korrespondieren. Eine große Bande mit 68 kDa könnte die beiden glykosylierten Untereinheiten (69 kDa + 66 kDa) repräsentieren, die sich aus einer proteolytischen Spaltung einer glykosylierten, hier fehlenden Vorstufe (163 kDa) ergeben. Drei kleinere präzipitierte Produkte (59, 53 und 48 kDa) korrespondieren mit keinem bekannten FHV-1 gB-Produkt und können Abbauprodukte darstellen.

Beispiel 16

Clonierung und Expression von Epstein-Barr-Virus-Giykoprotein In Pockenvirusvektoren

Clonieren der EBV gp340- und gp220-Gene in das Vaccinia-Donorplasmid pMP409DVC.

In diesem Beispiel wurden die EBV-Gene aus dem EBV-Stamm B95-8 isoliert (207), die gp340- und gp220-Gene waren cDNA-Clone (die Plasmide pMLPgp340 bzw. pMLPgp220) und die gB-, gH- und BBRF3-Gene wurden aus einer BamHI-Genbank isoliert. Wie aus Fig. 36 hervorgeht, wurde ein 2100 bp Xmal-Clal-Fragment auf dem Plasmid pMLPgp220 in mit Xmal-Accl gespaltenes Ml3mp18 cloniert. Der auf diese Weise erhaltene Phage wurde mit mp18gp220 bezeichnet (Fig. 36). Durch in vitro-Mutagenese (17) unter Verwendung der Oligonucleotide CM4 50

AT 405 184 B (TAAAGTCAATAAATTTTTATTGCGGCCGCTACCGAGCTCGAATTCG) und CM5 (GCTTGCATGCCTGCAGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGCAGCCTTGC) wurde das gp220-Gen modifiziert, um unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors exprimiert zu werden. Das das modifizierte gp220-Gen enthaltende Plasmid wurde mit mp18gp220(5 + 4) bezeichnet (Fig. 36).

Das modifizierte gp220-Gen wurde in das Plasmid SP131Notl cloniert, das den vollständigen synthetischen H6-Promotor enthält (69). Dies wurde erreicht durch Clonieren des 2300 bp Narl-EcoRV-Fragments von mp18gp220(5 + 4) in das 2940 bp EcoRV-Narl-Fragment des Plasmids SP131Notl. Das resultierende Plasmid wurde mit SPl3lgp220 bezeichnet (Fig. 36).

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende gp340-Gen wurde durch Clonieren eines 2360 bp Scal-Xhol-Fragments aus pMLPgp340 in das Xhol-Scal (partiell)-gespaltene Plasmid SPl3lgp220 erhalten. Das resultierende Plasmid wurde mit SP131gp340 (Fig. 36) bezeichnet.

Die unter der Kontrolle des H6-Promotors stehenden gp340- und gp220-Gene wurden in das Vaccinia-Virus-M2L-lnsertionsort-Plasmid pMP409DVC cloniert (Fig. 4; in Fig. 36, 40 wird dieses Plasmid mit MP409 bezeichnet). Dies wurde erreicht durch Clonieren des mit Mungobohnen-Nuclease behandelten 2800 bp Notl-Fragments aus dem Plasmid SP13lgp340 und des mit Mungobohnen-Nuclease behandelten 2100 bp Notl-Fragments aus dem Plasmid SP131gp220 in die mit Mungobohnen-Nuclease behandelte Bglll-Stelle des Plasmids pMP409DVC. Die resultierenden Plasmide wurden mit 409H6340 bzw. mit 409H6220 bezeichnet (Fig. 36).

Clonieren des EBV gB-Gens in das Vaccinia-Virus-Donorplasmid pMP409DVC.

Mit Bezugnahme auf Fig. 37 wurde ein 3500 bp EcoRI-Xmnl-Fragment des EBV-DNA-BamHI-A-Fragments (207), das das EBV gB-Gen enthielt, aus einer genomischen EBV-Bank isoliert und in das 2837 bp Hincll-EcoRI-Fragment von plBI25 cloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit p25gB bezeichnet (Fig. 37).

Durch in vitro-Mutagenese (17, 185) wurde unter Verwendung der Oligonucleotide EBVBM5 (CCCTACG CCGAGTCATTACG ATACAAACTTAACGGATATCAGAGTCGTACGTAGG) und EBVBM3 ( CTGGAAACACTTGGGAATTCAAGCTTCATAAAAAGGGTTATAGAAGAGTCC) das gB-Gen adaptiert, damit es unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors exprimiert wird. Das resultierende Plasmid wurde mit p25gB(5 + 3) bezeichnet.

Das 2600 bp EcoRV-EcoRI-Fragment von p25gB(5 + 3) wurde in das 3300 bp EcoRV-EcoRI-Fragment von SP131 cloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit SPl3lgB bezeichnet (Fig. 37).

Das H6-Promotor-gB-Gen wurde dann in das Vaccinia-Virus-Donorplasmid pMP409DVC cloniert. Dies wurde erreicht durch Clonieren des mit Mungobohnen-Nuclease behandelten 2700 bp-Hindlll-Fragments von SPl3lgB in die mit Mungobohnen-Nuclease behandelte Bglll-Stelle von pMP409DVC. Das resultierende Plasmid wurde mit 409H6gB bezeichnet (Fig. 37).

Clonieren des EBV gH-Gens in das Vaccinia-Donorplasmid pSD486VC. ln der EBV-Bank der clonierten BamHI-Restriktionsfragmente ist der offene Leserahmen BXLF2 in den Fragmenten Barn Hl X und Barn Hl T enthalten (207). Wie in Fig. 38 gezeigt, wurde der vollständige offene Leserahmen BXLF2 durch Clonieren des 830 bp Smal-BamHI-Fragments von BamHI X in das 2880 bp Smal-BamHI von plBI24 rekonstituiert; das resultierende Plasmid wurde mit 24gH5 bezeichnet. Das 1850 bp BamHI-Hindlll-Fragment von BamHI T wurde in das 3660 bp BamHI-Hindlll-Fragment von 24gH5 cloniert. 51

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Das resultierende Plasmid, das das vollständige gH-Gen enthält, wurde mit 24gH bezeichnet (Fig. 38).

Durch in vitro-Mutagenese (17, 185) wurde unter Verwendung der Oligonucleotide HM5- (ACACAGAGCAACTGCAGATCTCCCGATTTCCCCTCT), HM4- (GGGCAAAGCCACAAAATATGCAGGATTTCTGCG) und HM3- (GCCAGGGTTTTCCCAG AG AT CT GAT AAAAACGACGGCCAGTG) das gH-Gen modifiziert, um unter der Kontrolle des frühen hämorrhagischen (u) Vaccinia-Promotors exprimiert zu werden. Das Oligonucleotid HM4 wurde verwendet, um ein im gH-Gen enthaltendes frühes Vaccinia-Transkriptionsstoppsignal (45) zu entfernen. Das das modifizierte gH-Gen enthaltende Plasmid wurde mit 24gH(5 + 4 + 3) bezeichnet.

Wie aus Fig. 38 hervorgeht, ist der Vaccinia u-Promotor in dem Plasmid pSD486 VC enthalten (Fig. 30). (In Fig. 38 wird das Plasmid mit SD486 bezeichnet. Das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 2130 bp Bglll-Fragment von 24gH(5 + 4 + 3) wurde in die Bglll-Stelle des mit Mungobohnen-Nuclease behandelten pSD486VC cloniert. Dieser letzte Clonierungsschritt stellt das gH-Gen unter die Kontrolle des Vaccinia-u-Promotors. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit 486gH bezeichnet (Fig. 38).

Clonieren des offenen Leserahmens BBRF3 in das Vaccinia-Virus-Donorplasmid pCOPSC-5H.

Der vollständige offene Leserahmen BBRF3 ist im BamHl B-Fragment der EBV-DNA enthalten. Dieses Fragment wurde mit BspHI gespalten, mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) behandelt und mit Bglll gespalten. Die Bglll-Stelle innerhalb des BamHl A-Fragments liegt 10 Basen vor dem Stoppcodon von BBRF3. Das 1230 bp BspHI-Bglll-Fragment wurde isoliert und in das 4200 bp Smal-Bglll-Fragment des Plasmids pCOPSC-5H cloniert. (Das Plasmid pCOPCS-5H ist identisch mit dem Plasmid pCOPCS657 (Fig. 16).) Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit COPSCEBVX bezeichnet.

Clonieren der EBV gp340-, gB- und gH-Gene in das Vaccinia-Virus-Donorplasmid pSD5l3VCVO.

Das zur Erzeugung der Dreifach-EBV-Rekombinanten verwendete Vaccinia-Virus-Donorplasmid war das Plasmid pSD513VCVQ (Fig. 29). Dieses Plasmid enthält einen Subclon des Vaccinia-Virus-Copenhagen-Hindlll-J-Fragmentes, in dem die das Thymidinkinase-Gen codierende Sequenz durch einen Polylinkerbereich ersetzt ist.

Im ersten Schritt wurde das vom u-Promotor kontrollierte EBV gH-Gen in pSD513VCVQ cloniert. Genauer gesagt, wurde das 2300 bp SnaBI-Bglll-Fragment von 486gH in das 4000 bp Smal-Bglll-Fragment von pSD513VCVQ cloniert. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit 513 UgH bezeichnet.

Danach wurde das vom H6-Promotor kontrollierte EBV gp340-Gen in 513gH cloniert. Genauer gesagt, wurde das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 2800 bp Notl-Fragment von SP131gp340 in das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 6300 bp Xhol-Pstl-Fragment von 513 UgH cloniert. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wurde mit 513UgH340H6 bezeichnet.

Dann wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende EBV gB-Gen in 510 UgH340H6 cloniert. Genauer gesagt, wurde das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 2700 bp Hindlll-Fragment von SP131gp340 in das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 9100 bp Bglll-Fragment von 513UgH340H6 cloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit 513gHgbgp340 bezeichnet (Fig. 39).

Konstruktion von rekombinantem Vaccinia-Virus. EBV gp340 (Donorplasmid 409H6340), EBV gp220 (Donorplasmid 409H6220) und EBV gB (Donorplasmid 409H6gB) wurden in das Vaccinia-Virus vP458 (M2L-Stelle) hineinrekombiniert: Diese Einfach-Vaccinia-Virus-Rekombinanten werden mit vP474 bzw. mit vP480 und vP561 bezeichnet. EBV gH (Donorplasmid 486gH) wurde in das Vaccinia-Virus vP533 (u-lnsertionsstelle) hineinrekombiniert: Diese Einfach-Vaccinia-Virus-Rekombinante wird mit vP611 bezeichnet.

Schließlich wurde die gp340-, gb- und gH-enthaltende Dreifach-Vaccinia-Virus-Rekombinante durch Hineinrekombinieren des Donorplasmids 513gHgBgp340 in das Vaccinia-Virus vP617 in die Thymidinkina-se-lnsertionsstelle erhalten. Dieses rekombinante Virus wird mit vP712 bezeichnet. vP617 ist ein Copenha-gen-Vaccinia-Virus, bei dem die Gene für TK, HA und ATI deletiert sind.

Immunfluoreszenz von EBV-Proteinen in mit rekombinanten Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

Immunfluoreszenzuntersuchungen, die mit vP474- (gp340) und vP480- (gp220) infizierten Zellen unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers F29-89 (165) durchgeführt wurden, zeigten, daß EBV gp340-und EBV gp220-Proteine auf der Plasmamembran exprimiert sind. 52

AT 405 184 B

Mit vP611 <gH) infizierte Zellen zeigen bei Verwendung eines Human-Serums ein schwaches positives Signal auf der Plasmamembran.

Schließlich wurde dasselbe Experiment mit vP712- (Dreifäch-EBV-Vaccinia-Rekombinante) infizierten Zellen durchgeführt: Ein positives Signal auf der Plasmamembran wurde erhalten mit den monoclonalen Antikörpern F29-89 und NEA 9247 (gB-Spezifität, erhalten von DuPont).

Immunpräzipitation von EBV-Proteinen in mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

Das in EBV-infizierten Zellen produzierte EBV gp340-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 340 kDa (165). Zellen, die mit den rekombinanten Vaccina-Viren vP474 oder vP712 infiziert worden waren, produzieren ebenfalls ein EBV-codiertes Protein mit ungefähr 340 kDa (Immunpräzipitation war mit dem monoclonalen Antikörper F29-89 durchgeführt worden). Das EBV gp220-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von 220 kDa (165). Zellen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vP480 infiziert worden waren, produzieren ein EBV-codiertes Protein mit ungefähr 220 kDa.

Das in EBV-infizierten Zellen produzierte EBV gB-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von 110 kDa bis 125 kDa mit einer Form der Vorstufe mit 93 kDa (206, 208). Zellen, die mit den rekombinanten Vaccinia-Viren vP561 oder vP712 infiziert worden waren, produzieren ein EBV-codiertes Hauptprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 125 kDa und vier Nebenproteine mit Molekulargewichten von ungefähr 80 kDa, 60 kDa, 50 kDa und 45 kDa.

Das in EBV-infizierten Zellen produzierte EBV gH-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von 85 kDa mit einer Form der Vorstufe von 70 kDa (209). Zellen, die mit dem rekombinanten Virus vP611 infiziert worden waren, produzieren ein EBV-codiertes Protein mit ungefähr 85 kDa.

Immunisierung von Kaninchen mit EBV-Glykoproteine exprimierenden Vaccinia-Rekombinanten.

Kaninchen wurden mit vP474 (gp340) oder vP480 (gp220) oder vP561 (gB) oder vP611 (gH) oder vP712 (dreifach) immunisiert. Nach einer Nachimmunisierung wurden die Seren durch Immunfluoreszenz auf TPA-behandelten B95-8-Zellen getestet. Positive Signale wurden in jedem Fall erhalten. Eine in vitro neutralisierende Aktivität wurde bei Verwendung der gegen vP474 (gp340) verwendeten Seren gezeigt.

Beispiel 17

Clonlerung und Expression von menschlichen Cytomegalovirus-Glykoprotein-Antigenen in Pok-kenvirus-Vektoren

Clonieren des HCMV gB-Gens in das Vaccinia-Donorplasmid pMP409DVC.

Wie aus Fig. 40 hervorgeht, wurde das 4800 bp Hindlll-BamHI-Fragment des Hindill D-Fragmentes der HCMV-DNA in das 2800 bp Hindill D-BamHI-Fragment des Plasmids plBI24 cloniert. Durch in vitro-Mutagenese (17, 185) wurde unter Verwendung der Oligonucleotide CMVM5 (GCCTCATCGCTGCTGGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAATCCAGGATCTG) und CMVM3 (GACAGATTGTGA'JTTTTATAAG CATCGTAAG CTGTCA ) das HCMV gB-Gen modifiziert, damit es unter der Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors exprimiert wird. Das modifizierte HCMV gB-Gen enthaltende Plasmid wurde mit 24CMVgB(5 + 3) bezeichnet (Fig. 40).

Als nächstes wurde das 2900 bp EcoRV-BamHI-Fragment von 24CMVgB(5 + 3) in das 3100 bp EcoRV-Bglll-Fragment des Plasmids pSP131, das den synthetischen H6-Promotor (69) enthält, cloniert. Dieser Clonierungsschritt brachte das HCMV gB-Gen unter die Kontrolle des Vaccinia H6-Promotors. Das resultierende Plasmid wurde mit SP131gB bezeichnet.

Schließlich wurde das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende HCMV gB-Gen in das Vaccinia-Donorplasmid pMP409DVC cloniert. Das mit Mungobohnen-Nuclease behandelte 3000 bp Hindlll-Fragment von SP13lgB wurde in die mit Mungobohnen-Nuclease behandelte Bglll-Stelle von pMP409DVC cloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit 409CMVgB bezeichnet (Fig. 40). 53

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Konstruktion von rekombinantem Vaccinia-Virus.

Das unter der Kontrolle des H6-Promotors stehende CMV gB-Gen im Plasmid 409CMVgB wurde in die M2L-Stelle des Rettungs-Virus vP458 inseriert. Das rekombinante Vaccinia-Virus wurde mit vP525 bezeichnet.

Immunfluoreszenz des CMV gB-Proteins in mit rekombinanten Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

Immunfluoreszenzuntersuchungen an mit vP525 infizierten Zellen zeigten bei Verwendung eines monoclonalen Antikörpers oder eines polyclonalen Meerschweinchen-Serums, daß HCMV gB auf der Plasmamembran exprimiert wird.

Immunpräzipitation von CMV gB in mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen.

Das in CMV-infizierten Zellen produzierte CMV gB-Glykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von 55 kDa mit einer Form der Vorstufe von 130 kDa (172). Zellen, die mit vP525 infiziert worden waren, produzieren zwei CMV gB-codierte Proteine mit ungefähr 130 kDa und 55 kDa.

Nucleotidsequenzen von HXLF1 und HXLF2.

Die HXLF-Genfamilie liegt auf dem Hindill X-Fragment der genomischen HCMV-DNA (172). Unter Verwendung spezifischer Oligonucleotidprimer wurde die Nucleotidsequenz von HXLF1 und HXLF2 bestimmt (Figuren 41, 42). HXLF1 ist 648 Nucleotide lang und codiert ein Protein mit 215 Aminosäuren. HXLF2 ist 558 Nucleotide lang und codiert ein Protein mit 185 Aminosäuren. Die Nucleotidsequenzen derselben Gene (HCMV-Stamm AD169) sind publiziert in (173) und Vergleichsstudien zeigen eine 99%-ige Homologie bezüglich HXLF1 und eine 96%-ige Homologie bezüglich HXLF2.

Immunisierung von Meerschweinchen mit Vaccinia-Rekombinanten, die HCMV-Antigene exprimieren.

Drei Meerschweinchen wurden mit vP525 immunisiert. Nach einer Nachimmunisierung entwickelten die Tiere HCMV-neutralisierende Antikörper (Haupttiter: 518). Interessanterweise lassen sich 50 bis 87 % der neutralisierenden Aktivität von HCMV-seropositiven Humanseren durch vP525-infizierte Zellen durch Absorption entfernen. Dieses Ergebnis zeigt die potentielle Wichtigkeit von HCMV gB als Untereinheits-Vakzin.

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Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als DNA-Insert die für einen wirksamen Bereich des Pferde-Herpesvirus-Glykoproteins gp14 codierende DNA enthält und zur Expression dieses Glykoproteins in einem Wirt befähigt ist. 4. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als DNA-Insert eine sowohl für das Pferde-Herpesvirus-Glykoprotein gp13 als auch für einen wirksamen Teil des Pferde-Herpesvirus-Glykoproteins gp14 codierende DNA enthält und zur Expression dieser Glykoproteine in einem Wirt befähigt ist. 5. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als DNA-Insert ein für das Pseudorabiesvirus II codierendes Insert enthält und zur Expression dieses Glykoproteins in einem Wirt befähigt ist. 6. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als DNA-Insert ein für das Katzen-Herpesvirus-Glykoprotein gB codierendes Insert enthält und zur Expression dieses Glykoproteins in einem Wirt befähigt ist. 7. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als DNA-Insert ein für das Epstein-Barr-Virus-Glykoprotein gp220 codierendes Insert enthält und zur Expression dieses Glykoproteins in einem Wirt befähigt ist. a Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als DNA-Insert ein für das Epstein-Barr-Virus-Glykoprotein gB codierendes Insert enthält und zur Expression dieses Glykoproteins in einem Wirt befähigt ist. 9. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als DNA-Insert ein für das Epstein-Barr-Virus-Glykoprotein gH codierendes Insert enthält und zur Expression dieses 59 AT 405 184 B Glykoproteins in einem Wirt befähigt ist. 10. Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein rekombinantes Vaccinia-Virus ist. 11. Rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein rekombinantes Vogelpockenvirus ist. 12. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ein rekombinantes Geflügelpockenvirus oder ein rekombinantes Kanarienpockenvirus ist. 13. Zum Induzieren einer antigenen und/oder immunologischen Antwort in einem Wirtstier befähigte Zusammensetzung, wenn das Wirtstier mit der Zusammensetzung inokuliert ist, dadurch gekennzeichnet, daß diese Zusammensetzung ein rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 im Gemisch mit einem inokulierten Träger umfaßt. 14. Verfahren zur Herstellung eines Herpesvirus-Glykoproteins durch in vitro-lnfektion einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Virus, das zum Exprimieren des Glykoproteins in dieser Wrtszelle befähigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 eingesetzt wird. 15. Herpesvirus-Glykoprotein, erhalten durch Exprimieren eines rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12, ausgenommen in vivo. 16. Herpesvirus-Glykoprotein nach Anspruch 15, erhalten durch die in vivo-Expression des rekombinanten Virus in einer Wrtszelle. 17. Inokulationskit zum Inokulieren des neugeborenen Nachkommen und der Mutter dieses Nachkommen zur Vermeidung einer maternalen Immunität im Nachkommen, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Kit eine erste Vakzine zum Inokulieren der Mutter vor der Niederkunft des Nachkommen und eine zweite Vakzine zum Inokulieren des neugeborenen Nachkommen umfaßt, wobei die erste Vakzine ein rekombinantes Pockenvirus enthält, das als ein Insert in einem nicht essentiellen Bereich des viralen Genoms und stromab von einer geeigneten Promotorsequenz ein DNA-Insert aus einer Nicht-Pockenvi-rus-Quelle enthält und das für ein Antigen eines für die Mutter pathogenen Pathogens codiert, welche Rekombinante befähigt ist, dieses Antigen beim Inokulieren in die Mutter zu exprimieren, und welche zweite Vakzine ein rekombinantes Pockenvirus enthält, das als Insert in einem nicht essentiellen Bereich des viralen Genoms und stromab von einer geeigneten Promotorsequenz ein DNA-Insert aus einer Nicht-Pockenvirus-Quelle enthält und das für ein Antigen zu einem für den Nachkommen pathogenen Pathogen codiert, wobei die beiden Pathogene gleich sind und die zweite Rekombinante befähigt ist, ihr entsprechendes Antigen beim Inokulieren in dem Nachkommen zu exprimieren, wobei die beiden Rekombinanten entweder verschiedene rekombinante Pockenviren sind, jedes aber befähigt ist, eine Immunantwort auf das gleiche Pathogen zu induzieren, das eine in der Mutter und das andere im Nachkommen, oder beide das gleiche rekombinante Pockenvirus sind und befähigt sind, eine Immunantwort auf das gleiche Pathogen zu induzieren, sowohl in der Mutter als auch im Nachkommen, wobei aber in diesem Falle die Immunantwort in der Mutter und im Nachkommen durch die Verwendung der beiden Rekombinanten, eine in der Mutter und die andere im Nachkommen, ausgelöst werden, wobei jeweils ein Antigen gegenüber dem gleichen Pathogen exprimiert wird, wobei diese beiden Antigene verschieden sind. 18. Inokulationskit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Pockenvirus-Inserts in jedem rekombinanten Virus Herpesvirus-Inserts sind. 19. Inokulationskit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der beiden Rekombinanten ein rekombinantes Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 ist. 20. Verwendung eines rekombinanten Pockenvirus mit einem Gehalt in einem nicht essentiellen Bereich des viralen Genoms und stromab von einer Promotorsequenz oder von Promotorsequenzen, die zum Exprimieren des Antigens in der Mutter eines neugeborenen Nachkommen befähigt ist bzw. sind, an 60 AT 405 184 B einem DNA-Insert aus einer Nicht-Pockenvirus-Quelle, das für ein Antigen zu einem für die Mutter pathogenen Pathogen codiert und das entweder ein rekombinantes Pockenvirus ist, das von jenem verschieden ist, das in der zweiten Komponente des Kits zum Induzieren einer Immunantwort im Nachkommen gegenüber dem gleichen Pathogen verwendet werden soll oder das ein rekombinantes Pockenvirus ist, das das gleiche wie das in der zweiten Komponente des Kits zu verwendende ist, das aber ein anderes Antigen gegenüber dem Pathogen in der Mutter exprimiert als jenes, das von der zweiten Rekombinante im Nachkommen exprimiert wird, zur Herstellung eines Kits nach Anspruch 17. 21. Verwendung eines rekombinanten Pockenvirus mit einem Gehalt in einem nicht essentiellen Bereich des viralen Genoms und stromab von einer Promotorsequenz oder von Promotorsequenzen, die zum Exprimieren des Antigens in einem neugeborenen Nachkommen befähigt ist bzw. sind, an einem DNA-Insert aus einer Nicht-Pockenvirus-Quelle, das für ein Antigen zu einem für den Nachkommen pathogenen Pathogen codiert und das entweder ein rekombinantes Pockenvirus ist, das von jenem verschieden ist, das in der ersten Komponente des Kits zum Induzieren einer Immunantwort in der Mutter des Nachkommen gegenüber dem gleichen Pathogen verwendet werden soll oder das ein rekombinantes Pockenvirus ist, das das gleiche wie das in der ersten Komponente des Kits zu verwendende ist, das aber ein anderes Antigen gegenüber dem Pathogen im Nachkommen exprimiert als jenes, das von der ersten Rekombinante in der Mutter exprimiert wird, zur Herstellung eines Kits nach Anspruch 17. 22. Rekombinantes Pockenvirus zur Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, worin das Nicht-Pockenvirus-Insert im rekombinanten Pockenvirus ein Herpesvirus-Insert ist. 23. Rekombinantes Pockenvirus zur Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, welches ein rekombinantes Pockenvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 ist. Hiezu 79 Blatt Zeichnungen 61