KR20220035279A - 인간 파필로마 바이러스에 대한 백신 및 이것을 사용하는 방법 - Google Patents

인간 파필로마 바이러스에 대한 백신 및 이것을 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

개선된 항-HPV 면역원 및 이를 암호화하는 핵산 분자를 개시한다. 개시된 면역원은 공통 HPV 6, HPV 11, HPV 33 및 HPV58 E6 및 E7을 갖는 것을 포함한다. 약제학적 조성물, 재조합 백신 및 생약독화 백신을 개시하고, 또한 HPV에 대응하여 개체의 면역반응을 유도하는 방법을 개시한다.

Description

인간 파필로마 바이러스에 대한 백신 및 이것을 사용하는 방법{VACCINES FOR HUMAN PAPILLOMA VIRUS AND METHODS FOR USING THE SAME}
본 발명은 개선된 인간 파필로마 바이러스 (papilloma virus) (HPV) 백신, 면역반응을 유도하는 개선된 방법, 및 개체를 HPV에 대해서 예방적 및/또는 치료학적으로 면역화시키는 개선된 방법에 관한 것이다.
파필로마 바이러스는 7개의 조기 유전자 (early genes) 및 2개의 후기 유전자 (late genes)까지로 이루어진 작은 DNA 바이러스이다. 일반적으로, 파필로마 바이러스 조기 유전자는 E1-E7로 지정되며, 파필로마 바이러스 후기 유전자는 L1 및 L2로 지정된다. 몇 가지의 동물 종이 파필로마 바이러스 패밀리의 구성원에 의해서 감염될 수 있다.
인간 파필로마 바이러스 (HPV) 감염은 통상적이며, 성행위에 의해서 전파될 수 있다. HPV는 DNA 서열 상동성을 기초로 하여 56 개 또는 그 이상의 타입으로 구분된다. 상피 이형성증 및 그 밖의 다른 병변을 야기하는 HPV 타입 16 및 18은 종종 암, 특히 경부, 질, 외음부 및 도관 (canal)의 제자리 및 침습성 암의 증가한 위험과 연관된다. 세계적으로 88%에 가까운 자궁경부암들이 HPV 서브타입들 16, 18, 45, 31, 33, 52 및 58의 결과이다. 또한, 다양한 연구들은 재발성 호흡기 유두종증의 대부분의 발생들에서 HPV6 및 HPV11의 존재를 드러냈다. 비록 이들의 생식기 무사마귀들과의 연관이 알려져 있고 적은 비율의 자궁경부암 사례들에서만 발견되었지만, HPV6 및 HPV11은 낮은 기수의 자궁경부 병변들의 모든 사례들의 2.6-5.2%에서 확인되었다. 또한, HPV6 및 HPV11는 이제 2기 및 3기 자궁경부 상피내 전암병변 및 경증 자궁경부 이형상피증을 포함하는 자궁경부암의 전구체들로 이제 간주되는 낮은 기수의 편평 상피내 병변들의 약 20%와 연관되어 있다. 점점 많은 연구들에서 두 혈청형들과 생식기 무사마귀들, 재발성 호흡기 유두종증, 폐암종, 편도암종, 후두암종, 및 두부와 경부의 양성 신생물들 및 이형상피증의 다른 악성 전환들을 포함하는 다양한 형태들의 이비인후과 발병들의 연관이 드러나고 있다. 본 연구의 발견들은 HPV6 및 HPV11에 대한 공통 서열 DNA 백신들의 사용을 강조하고 미래의 전망을 밝힌다.
DNA 백신은 생약독화 바이러스 및 재조합 단백질-기본 백신과 같은 더 전통적인 백신접종 방법에 비해서 다수 개념적 이점을 갖는다. DNA 백신은 안전하고, 안정하며, 쉽게 생산되고, 인간에게서 잘 허용되는데, 전임상 실험은 플라스미드 통합의 증거를 거의 나타내지 않는다 [Martin, T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. 또한, DNA 백신은 백신의 효능이 벡터에 대한 기존의 항체 역가에 의해서 영향을 받지 않는다는 사실로 인하여 반복 투여하는데 꽤 적합하다 [Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. 그러나, DNA 백신의 임상적 적용에 관한 한가지 주된 장애는 더 큰 동물에게 이동시키는 경우에 플랫폼 면역원성 (platforms immunogenicity)에 있어서의 감소였다 [Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. 코돈 최적화, RNA 최적화 및 면역글로불린 리더 (leader) 서열의 부가와 같은 DNA 백신 면역원의 조작에 있어서의 최근의 기술적 진보는 DNA 백신의 발현 및 면역원성을 개선시켰으며 [Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml, L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], 뿐만 아니라 전기천공과 같은 플라스미드 송달 시스템에서 있어서의 기술이 최근에 개발되었다 [Hirao, L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53]. 또한, 연구들은 공통 면역원의 사용이 천연 항원 단독에 비해서 세포성 면역반응의 폭을 증가시킬 수 있음을 시사하였다 [Yan., J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14].
HPV 감염, 특히 폐, 편도, 및 후두의 자궁경부암 및/또는 암종으로 되는 감염을 예방 및 치료하는 개선된 백신 및 방법에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 측면은 서열번호:1; 서열번호:3, 서열번호:5, 서열번호:7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 HPV 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 90% 상동성을 갖는 그의 단편; 및 이들의 조합을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 핵산 분자는 서열번호:2; 서열번호:4, 서열번호:6, 또는 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:2; 서열번호:4, 서열번호:6, 또는 서열번호:8에 대해 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 서열번호:2; 서열번호:4, 서열번호:6, 또는 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편; 및 서열번호:2; 서열번호:4, 서열번호:6, 또는 서열번호:8에 대해 적어도 90% 상동성을 갖는 아미노산 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에서 기재된 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물이 있다.
다른 측면에서, HPV에 대항하여 개체의 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 개체에게 본원에서 기재된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명 또한 본원에서 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 백신을 또한 포함한다. 재조합 백신은 재조합 우두 백신, 약독화 생백신, 및 DNA 플라스미드를 포함한다.
본 발명의 일부 측면은 서열번호:2; 서열번호:4, 서열번호:6, 또는 서열번호:8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열; 및 서열번호:2; 서열번호:4, 서열번호:6, 또는 서열번호:8에 대해 적어도 90% 상동성을 갖는 서열의 단편을 포함하는 단백질을 포함한다.
HPV에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 상기 개체에게 본원에서 제공된 재조합 백신을 투여하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, HPV 항원 서열번호:1 및 서열번호:3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 그의 단편; 또는 그의 90% 상동성을 갖는 단편을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. HPV 하위유형 6 또는 11에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 있고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 언급된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, HPV 항원 서열번호:5 및 서열번호:7을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 그의 단편; 그의 90% 상동성을 갖는 단편을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. HPV 하위유형 33 또는 58에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 있고, 상기 방법은 상기 개체에게 상기 언급된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
도 1. E6 및 E7 정렬들의 인접 결합 평가에 근거한 계통수들(각각 A 및 B). 별표들은 각 트리에서 공통 서열들의 위치를 나타낸다.
도 2. p6E6E7 및 p11E6E7의 생체 내 발현. 유전자 산물들을 용해된 형질감염 293-T 세포들로부터 단리하고, SDS-PAGE 겔을 걸고, 방사선 사진촬영을 이용해서 검출하였다. HPV 6 및 HPV 11 E6/E7 단백질들은 모두 각각 약 32kDa이다(A). 인간 횡문근육종(RD) 세포들도 p6E6E7 및 p11E6E7로 형질감염시키고, 이후에 면역형광 염색 후 고정하였다. FITC 형광으로 p6E6E7 및 p11E6E7의 발현을 확인하였다(B). DAPI 형광으로 Hoescht 염색 결과 핵들의 편재를 확인하였다.
도 3. IFN-γ ELISpot 분석들은 C57BL/6 마우스들에서 p6E6E7(A) 및 p11E6E7(B)에 의한 강력한 세포 매개 반응들의 유도를 나타낸다. 분석들은 3회의 2주 1회 면역접종들 후 각각의 해당 군의 마우스들(1군 당 5마리 마우스들)에서 단리된 비장세포들로 수행하였다. 각각의 면역접종은 구축물 당 20㎍으로 구성되었다. 콤보군의 마우스들은 구축물 당 20㎍의 p6E6E7 및 p11E6E7을 둘 다, 면역접종 당 총 40㎍의 DNA를 수여받았다. DNA는 IM 주사 후 전기천공으로 투여하였다(*은 p < 0.0001 을 나타내며; †는 p = 0.0001 을 나타낸다).
도 4. 우성 에피토프들을 분석하기 위해 개별 펩티드들을 이용해서 추가적인 IFN-γ ELISpot 분석들을 수행하였다. 백신접종한 마우스들 및 음성 대조군에서 단리한 비장세포들을 전체 HPV 6 E6/E7 융합 단백질(A) 또는 HPV 11 E6/E7 융합 단백질(B)에 걸친 겹치는 펩티드들로 자극하였다.
도 5. 세포내 시토카인 염색으로 분석되는 항원-특이적 T-세포들에 의한 시토카인 생산. p6E6E7(A) 및 p11E6E7(B)로 백신접종한 마우스들에서 단리한 비장세포들을 표면 마커 및 세포내 염색 전에 4시간 동안 R10 성장 배지, PMA, 또는 공통 유전자 펩티드들로 자극하였다. 상기의 점 그래프들은 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α를 생산하는 총 CD4+ 또는 CD8+ 세포들의 배경 차감 백분율들에서의 차이들을 나타낸다. 음성 대조군의 평균이 0이었으므로, 별표들을 갖는 그래프들에 대한 P-값들은 결정할 수 없었다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 문구 "스트린전트 (stringent) 하이브리드화 조건" 또는 "스트린전트 조건"은 핵산 분자가 또 다른 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있지만, 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는 조건을 나타낸다. 스트린전트 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서는 상이할 수 있다. 더 긴 서열은 더 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 일반적으로, 스트린전트 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열에 대해서 상보적인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 온도 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이다. 표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서 프로브의 50%가 평형상태에서 점유된다. 전형적으로, 스트린전트 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오타이드)의 경우에는 적어도 약 30℃, 및 더 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오타이드)의 경우에는 적어도 약 60℃인 것이다. 스트린전트 조건은 또한, 포름아미드와 같은 불안정화제를 첨가함으로써 달성될 수도 있다.
뉴클레오타이드 및 아미노산에 대한 서열 상동성은 FASTA, BLAST 및 갭드 (Gapped) BLAST [Altschul et al., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다] 및 PAUP* 4.0b10 소프트웨어 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 결정될 수 있다. "유사성의 백분율"은 PAUP* 4.0b10 소프트웨어 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 계산된다. 공통 서열의 평균 유사성은 계통수 (phylogenic tree) 내의 모든 서열과 비교하여 계산된다.
간략하면, 기본적 국소 정렬 탐색도구 (Basic Local Alignment Search Tool)를 의미하는 BLAST 알고리즘이 서열 유사성을 결정하는데 적합하다 [Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다]. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)으로부터 공공연히 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 우선, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬하는 경우에 일부의 양의 값을 갖는 역치 스코어 T와 부합하거나, 그를 충족시키는 문제의 서열 내의 길이 W인 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍 (HSPs)을 확인하는 것을 포함한다. T는 근접 단어 스코어 역치 (neighborhood word score threshold)로 불린다 [Altschul et al., supra]. 이들 초기 근접 단어 히트 (hits)는 이들을 함유하는 HSPs를 찾기 위한 탐색을 개시하기 위한 근원으로 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한은 각각의 서열을 따라서 양 방향으로 연장된다. 각 방향에서 단어 히트에 대한 연장은 다음의 경우에 중단된다: 1) 누적 정렬 스코어가 그의 도달된 최대값으로부터 양 X만큼 떨어지는 경우; 2) 누적 스코어가 하나 또는 그 이상의 음의 스코어를 갖는 잔기 정렬의 축적으로 인하여 0 또는 그 이하가 되는 경우; 또는 3) 각 서열의 말단에 도달한 경우. Blast 알고리즘 파라메터 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. Blast 프로그램은 디폴트 (defaults)로서 11의 단어 길이 (W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 [참조: Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다] 얼라인먼트 (B), 10의 기대값 (E), M=5, N=4, 및 양 스트랜드의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘 [Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다] 및 갭드 BLAST는 두개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다. BLAST 알고리즘에 의해서 제공된 유사성의 한가지 척도는 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 부합이 우연히 나타날 수 있는 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (smallest sum probability; P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산과 다른 핵산의 비교 시에 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 또 다른 것과 유사한 것으로 생각된다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "유전자 구조물"은 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다. 코드화 서열은 프로모터를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 시그날, 및 핵산 분자가 투여된 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "발현가능한 형태"는 개체의 세포에 존재하는 경우에 코드화 서열이 발현될 수 있도록 단백질을 코드화한 코드화 서열에 작동가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 구조물을 나타낸다.
면역원에 의해서 유도된 세포성 면역반응을 증진시키는 다중-상 전략 (multi-phase strategy)으로부터 발생하는 개선된 백신이 기술되어 있다. 변형된 공통 서열이 생성되었다. 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 고효율 면역글로불린 리더 서열의 부가를 포함하는 유전자 변형이 또한 기술된다. 신규 구조물은 상응하는 코돈 최적화 면역원보다 더 강하고 더 광범한 세포성 면역반응을 야기하도록 고안되었다.
개선된 HPV 백신은 그에 대한 항-HPV가 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이도록 만드는 에피토프를 갖는 단백질을 코드화한 유전자 구조물 및 단백질을 기초로 한다. 따라서, 백신은 치료학적 또는 예방적 면역반응을 유도할 수 있다. 일부의 구체예에서, 면역원을 송달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 일부의 구체예에서, 백신은 하나 또는 그 이상의 DNA 백신, 하나 또는 그 이상의 재조합 백신, 하나 또는 그 이상의 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 조성물, 하나 또는 그 이상의 약독화 백신 및 하나 또는 그 이상의 사멸 백신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합물을 포함한다.
일부의 구체예에 따르면, 백신을 개체에게 송달하여 개체의 면역 시스템의 활성을 변조시키고, 이에 의해서 HPV에 대한 면역반응을 증진시킨다. 단백질을 코드화한 핵산 분자가 개체의 세포에 의해서 흡수되면, 뉴클레오타이드 서열이 세포 내에서 발현되며, 이에 의해서 단백질이 개체에게 송달된다. 재조합 백신의 일부분으로서, 및 약독화 백신의 일부분으로서, 벡터의 분리된 단백질 또는 단백질 부분으로서 플라스미드와 같은 핵산 분자 상에 단백질의 코드화 서열을 송달하는 방법이 제공된다.
HPV에 대해서 개체를 예방적으로 및/또는 치료학적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다.
면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 송달하는 조성물은 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 조성물은 면역원을 코드화한 플라스미드, 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백신, 본 발명의 단백질을 코드화하고/하거나 본 발명의 단백질을 포함하는 생약독화 병원체; 본 발명의 단백질을 포함하는 사멸 병원체; 또는 본 발명의 단백질을 포함하는 리포좀 또는 서브유니트 백신과 같은 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 조성물을 포함하는 주사용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
서열번호:1은 HPV 6 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:1은 서열번호:1의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9을 포함한다. 서열번호:2는 HPV 6 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호: 2는 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호: 9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:2, 또는 서열번호:2를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편은 786 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 830 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 856 개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 865 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편 예컨대 본원에 제시된 것은 추가로 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:2의 단편은 252 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 266 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 275 개 이상의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 278 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:3은 HPV 11 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:3은 서열번호:3의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에서 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:4는 HPV 11 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:4는 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:4, 또는 서열번호:4를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호:3의 단편은 786 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 830 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 856 개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 865 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:3의 단편 예컨대 본원에 제시된 것은 추가로 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:3의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:4의 단편은 252 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 266 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 275 개 이상의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 278 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:5는 HPV 33 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:5는 서열번호:5의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:6은 HPV 33 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:6은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:6, 또는 서열번호:6을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호:5의 단편은 746 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 787 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 812 개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 820 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:5의 단편 예컨대 본원에 제시된 것은 추가로 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:5의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:6의 단편은 235 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 248 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 256 개 이상의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 259 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호:7은 HPV 58 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원의 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:7은 서열번호:7의 5' 말단에서 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열 서열번호:9를 포함한다. 서열번호:8은 HPV 58 E6 및 E7 단백질의 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:8은 공통 면역원 서열의 N-말단에서 IgE 선도 서열 서열번호:10을 포함한다. IgE 선도 서열은 서열번호:10이고 서열번호:9에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 서열번호:8, 또는 서열번호:8을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호:7의 단편은 752 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 794 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 819 개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 827 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:7의 단편 예컨대 본원에 제시된 것은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:7의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 서열번호:8의 단편은 235 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 249 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 257 개 이상의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 260 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따라, 면역원에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법은 HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대한 아미노산 서열, 그의 기능적 단편, 및 그의 발현성 코딩 서열을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, 및 그의 단편 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대해 아미노산 서열을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예는 HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, 및 그의 단편 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대해 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 백신을 포함한다. 일부 구현예는 HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, HPV 58 E6 및 E7, 및 그의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대해 아미노산 서열을 포함하는 서브유닛 백신을 포함한다. 일부 구현예는 HPV 6 E6 및 E7, HPV 11 E6 및 E7, HPV 33 E6 및 E7, 및 HPV 58 E6 및 E7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공통 면역원에 대해 아미노산 서열을 포함하는 약독화 생백신 및/또는 불활화 백신을 포함한다.
일 측면에서, 본원의 백신은 두경부암의 형태, 및 이비인후과 질환의 다른 형태와 연관된 것으로 주로 발견된 HPV 하위유형에 대항하여 면역 반응을 유도하는 것이고, 특히 백신은 HPV 6 E6 및 E7 및 HPV 11 E6 및 E7, 및 바람직하게는 둘 모두를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 본원의 백신은 미국 외의 환자 및 더욱 특히 아시아의 환자에서 자궁경부암의 형태와 연관되는 것으로 주로 발견된 HPV 하위유형에 대항하여 면역 반응을 유도하는 것이고, 특히 백신은 HPV 33 E6 및 E7 및 HPV 58 E6 및 E7, 및 바람직하게는 둘 모두를 포함한다.
개선된 백신은 그에 대한 항-HPV 면역반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이도록 만드는 에피토프를 갖는 단백질을 코드화한 유전자 구조물 및 단백질을 포함한다. 따라서, 백신은 치료학적 또는 예방적 면역반응을 유도하도록 제공될 수 있다. 일부의 구체예에서, 면역원을 송달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 일부의 구체예에서, 백신은 하나 또는 그 이상의 DNA 백신, 하나 또는 그 이상의 재조합 백신, 하나 또는 그 이상의 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 조성물, 하나 또는 그 이상의 약독화 백신 및 하나 또는 그 이상의 사멸 백신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합물을 포함한다.
본 발명의 관점은 재조합 백신의 일부분으로서, 및 약독화 백신의 일부분으로서, 벡터의 분리된 단백질 또는 단백질 부분으로서 플라스미드와 같은 핵산 분자 상에 단백질의 코드화 서열을 송달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부의 관점에 따르면, 개체를 예방적으로 및/또는 치료학적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다.
DNA 백신은 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 5,676,594호, 및 여기에 인용된 선행 출원에 기술되어 있다. 이들 출원에 기술된 송달 프로토콜 이외에도, DNA를 송달하는 대체 방법은 모두 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제4,945,050 및 5,036,006호에 기술되어 있다.
본 발명은 개선된 생약독화 백신, 개선된 사멸 백신, 및 항원을 코드화한 외래 유전자를 송달하기 위해서 재조합 벡터를 사용하는 개선된 백신뿐만 아니라 서브유니트 및 당단백 백신에 관한 것이다. 생약독화 백신, 외래 유전자를 송달하기 위해서 재조합 벡터를 사용하는 것, 서브유니트 백신 및 당단백 백신의 예는 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,364; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 및 6,589,529호에 기술되어 있다.
세포에 의해서 흡수되면, 유전자 구조물(들)은 세포 내에 기능적 염색체외 분자로 존재할 수 있고/있거나 세포 내의 염색체 DNA 내에 통합될 수 있다. DNA는 세포 내에 도입될 수 있으며, 여기에서 이것은 플라스미드 또는 플라스미드들의 형태의 별개의 유전자 물질로서 존재한다. 대신으로, 염색체 내로 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포 내로 도입될 수 있다. DNA를 세포 내로 도입시키는 경우에는, 염색체 내로의 DNA 통합을 촉진시키는 시약이 첨가될 수 있다. 통합을 촉진시키는데 유용한 DNA 서열이 또한 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 대신으로, RNA가 세포에 투여될 수 있다. 또한, 동원체 (centromere), 말단소체 (telomeres) 및 복제 기점을 포함하는 선형 미니염색체로서 유전자 구조물을 제공하는 것도 고려된다. 유전자 구조물은 세포 내에서 생존하는 약독화된 생미생물 또는 재조합 미생물 벡터 내에 유전자 물질의 일부분으로서 잔류할 수 있다. 유전자 구조물은 유전자 물질이 세포의 염색체에 통합하거나 염색체외에 잔류하는 재조합 바이러스 백신의 게놈의 일부분일 수 있다. 유전자 구조물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기의 요소에는 다음이 포함된다: 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 시그날. 또한, 인핸서 (enhancers)는 종종, 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 코드화한 서열의 유전자 발현을 위해서 필요하다. 이들 요소는 원하는 단백질을 코드화한 서열에 작동가능하게 연결되며, 조절 요소는 이들이 투여되는 개체에게서 작동가능한 것이 필요하다.
개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로, 원하는 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열의 일부분인 것으로 간주된다. 그러나, 이들 요소는 유전자 구조물이 투여되는 개체에게서 기능성인 것이 필요하다. 개시 및 정지 코돈은 코드화 서열과 함께 골격 내에 존재하여야 한다.
사용된 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포 내에서 반드시 기능성이어야 한다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 생산에 유용한 프로모터의 예로는 시미안 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40), 마우스 유선종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, BIV 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터와 같은 인간 면역결핍 바이러스 (MV), 몰로니 (Moloney) 바이러스, ALV, CMV 즉시 초기 프로모터 (immediate early promoter)와 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV), 로우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus; RSV)로부터의 프로모터뿐만 아니라 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 생산에 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예로는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날로 불리는, pCEP4 플라스미드 (Invitrogen, San Diego CA) 내에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 시그날이 사용된다.
DNA 발현에 필요한 조절 요소 이외에도, 다른 요소가 또한 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 이러한 추가의 요소는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 CMV, RSV 및 EBV로부터 유래하는 것과 같은 바이러스 인핸서를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 그룹으로부터 선택될 수 있다.
유전자 구조물에는 구조물을 염색체외적으로 유지시키고, 세포 내에서 구조물의 다수의 카피를 생산시키기 위해서 복제의 포유동물 기점이 제공될 수 있다. Invitrogen (San Diego, CA)으로부터의 플라스미드 pVAX1, pCEP4 및 pREP4는 복제의 엡스타인 바르 바이러스 기점 및 통합이 없이 높은 카피의 에피좀성 복제를 제공하는 핵 항원 EBNA-1 코드화 부분을 함유한다.
면역화 적용과 관련된 일부의 바람직한 구체예에서는, 본 발명의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 추가로, 이러한 표적 단백질에 대한 면역반응을 더 증진시키는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 핵산 분자(들)이 유도된다. 이러한 유전자의 예는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피성장인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MHC, CD80, CD86, 및 결실된 시그날 서열을 갖는 IL-15를 포함하며, 임의로 IgE로부터의 시그날 펩타이드를 포함하는 IL-15와 같은 다른 사이토킨 및 림포킨을 코드화한 것이다. 유용할 수 있는 다른 유전자에는 다음을 코드화한 것이 포함된다: MCP-1, MIP-lα, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관성장인자, IL-7, 신경성장인자, 혈관내피성장인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능적 단편.
어떤 이유로든 유전자 구조물을 수용하는 세포를 제거하는 것이 바람직하다면, 세포 파괴에 대한 표적으로 작용하는 추가의 요소가 첨가될 수 있다. 발현가능한 형태의 헤르페스 티미딘 키나제 (tk) 유전자가 유전자 구조물 내에 포함될 수 있다. 약물 간사이클로비르가 개체에 투여될 수 있으며, 이 약물은 tk를 생산하는 모든 세포의 선택적 사멸을 야기할 수 있으며, 따라서 유전자 구조물에 의한 세포의 선택적 파괴를 위한 수단을 제공할 수 있다.
단백질 생산을 최대화시키기 위해서, 구조물이 투여되는 세포 내에서의 유전자 발현에 매우 적합한 조절 서열이 선택될 수 있다. 더구나, 세포 내에서 가장 효율적으로 전사되는 코돈이 선택될 수 있다. 본 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가는 세포 내에서 기능성인 DNA 구조물을 생산할 수 있다.
일부의 구체예에서는, 본 발명에 기술된 단백질에 대한 코드화 서열이 IgE 시그날 펩타이드에 연결된 유전자 구조물이 제공될 수 있다. 일부의 구체예에서, 본 발명에 기술된 단백질은 IgE 시그날 펩타이드에 연결된다.
단백질이 사용되는 일부의 구체예에서, 예를 들어, 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여 본 발명의 단백질을 생산하고 분리시킬 수 있다. 단백질이 사용되는 일부의 구체예에서, 예를 들어, 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여. 잘 알려진 발현 시스템에서 사용하기 위한 상업적으로 이용할 수 있는 발현 벡터 내로 본 발명의 단백질을 코드화한 DNA 분자를 삽입할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)이 이. 콜라이 내에서 단백질의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)는 예를 들어, 효모의 사카로마이세스 세레비지아에 (S. cerevisiae) 스트레인 내에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 MAXBAC™ 완전 바큘로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, Calif.)은 예를 들어, 곤충 세포에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)은 예를 들어, 차이니즈 햄스터 (Chinese Hamster) 난소 세포와 같은 포유동물 세포에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 이들 상업적 발현 벡터 및 시스템 또는 그 밖의 것을 사용하여 일상적인 기술 및 쉽게 이용할 수 있는 출발물질에 의해서 단백질을 생산할 수 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989); 이것은 본 발명에 참고로 포함된다]. 따라서, 바람직한 단백질은 원핵 및 진핵 시스템 둘 다에서 제조될 수 있어서 광범한 스펙트럼의 단백질의 가공된 형태를 제공할 수 있다.
본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 그 밖의 다른 상업적으로 이용할 수 있는 발현 벡터 및 시스템을 사용할 수 있거나, 잘 알려진 방법 및 쉽게 이용할 수 있는 출발물질을 사용하여 벡터를 생산할 수 있다. 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날, 및 바람직하게는 인핸서와 같은 필요한 조절 서열을 함유하는 발현 시스템은 다양한 숙주에 관해서 본 기술분야에서 쉽게 이용할 수 있으며, 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)]. 유전자 구조물은 구조물이 형질감염되는 세포주 내에서 기능성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질 코드화 서열을 포함한다. 구성적 프로모터의 예로는 사이토메갈로바이러스 또는 SV40로부터의 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터의 예로는 마우스 유방 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 쉽게 이용할 수 있는 출발물질로부터 본 발명의 단백질을 코드화한 DNA로 세포를 형질감염시키는데 유용한 유전자 구조물을 쉽게 생산할 수 있다. 단백질을 코드화한 DNA를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 허용되는 숙주를 형질전환시킨 다음에, 이것을 외래 DNA의 발현이 일어나는 조건 하에서 배양 및 유지시킨다.
생산된 단백질은 세포를 용해시키거나 본 기술분야의 전문가에게 공지되고 적절한 배양 배지로부터 분리시킴으로써 배양물로부터 회수된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여, 이러한 발현시스템을 사용하여 생산된 단백질을 분리시킬 수 있다. 상술한 바와 같은 특정의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연 공급원으로부터 단백질을 정제하는 방법이 재조합 DNA 방법에 의해서 생산된 단백질을 정제하는데 동등하게 적용될 수 있다.
재조합 기술에 의해서 단백질을 생산하는 이외에도, 자동화된 펩타이드 합성기를 또한 사용하여 분리되고 본질적으로 순수한 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 기술은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 치환을 갖는 유도체가 DNA-코드화된 단백질 생산 시에 제공되지 않는 경우에 유용하다.
핵산 분자는 DNA 주사 (또한, DNA 백신접종으로도 불림), 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아와 같은 재조합 벡터를 포함하는 몇 가지 잘 알려진 기술 중의 어떤 것을 사용하여서도 송달될 수 있다.
투여의 경로에는 근육내, 비내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 경구뿐만 아니라 국소적으로, 경피적으로, 흡입 또는 좌제에 의해서, 또는 질, 직장, 요도, 협측 및 설하 조직에 대한 세척에 의한 것과 같은 점막 조직이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 투여의 경로에는 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사가 포함된다. 유전자 구조물은 전기천공 방법 및 장치, 전통적인 시린지, 무침 주사장치, 또는 "마이크로프로젝틸 봄바드먼트 곤건즈 (microprojectile bombardment gone guns)"를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 수단에 의해서 투여될 수 있다.
DNA 백신의 송달을 용이하게 하는데 바람직한 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 제7,245,963호 (Draghia-Akli, et al.), 미국 특허공개 제2005/0052630호 (Smith, et al.) (이들의 내용은 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다)에 기술된 것을 포함한다. 또한, 35 USC 119(e)에 따라 2006년 10월 17일자 미국 임시출원 제60/852,149호 및 2007년 10월 10일자 제60/978,982호를 우선권으로 주장하는, 2007년 10월 17일에 출원된 공동 계류 중이고 공동-소유된 미국 특허출원 제11/874072호 (이들은 모두 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다)에 제시된 DNA 백신의 송달을 용이하게 하는 전기천공 장치 및 전기천공 방법이 바람직하다.
다음은 전기천공 기술을 사용한 구체예의 예이며, 상기 검토된 특허문헌에서 더 상세하게 거론된다: 전기천공 장치를 포유동물의 원하는 조직에 사용자에 의해서 미리 설정된 전류 입력과 유사한 정전류를 생성하는 에너지의 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 송달하도록 배열될 수 있다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함한다. 전기천공 성분은 다음을 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소 중의 하나 또는 그 이상을 포함하고 통합할 수 있다: 조절기, 전류 파형 생성기, 임피던스 (impedance) 시험기, 파형 로거 (logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 성분, 동력원 및 동력 스위치. 전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나의 요소로서 작용할 수 있으며, 다른 요소들은 전기천공 성분과 연결되는 별개의 요소 (또는 성분)이다. 일부의 구체예에서, 전기천공 성분은 전기천공 성분과는 별개의 전기천공 장치의 또 다른 요소와 연결될 수 있는 전기천공 장치의 하나 이상의 요소로서 작용할 수 있다. 요소들은 하나의 장치로서 또는 또 다른 것과 연결되는 별개의 요소로서 작용할 수 있기 때문에, 개선된 HPV 백신을 송달하기 위한 전기천공 기술의 사용은 하나의 전기기계 또는 기계 장치의 일부분으로 존재하는 전기천공 장치의 요소에 의해서 제한되지 않는다. 전기천공 성분은 원하는 조직에서 정전류를 발생시키는 에너지의 펄스를 송달할 수 있으며, 피드백 기전을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간적 배열로 다수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함하며, 여기에서 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지의 펄스를 수용하고, 이것을 전극을 통해서 원하는 조직에 송달한다. 다수의 전극 중의 적어도 하나는 에너지의 펄스의 송달 중에 중성이며, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 임피던스를 전기천공 성분에 전달한다. 피드백 기전은 측정된 임피던스를 수용할 수 있으며, 전기천공 성분에 의해서 송달된 에너지의 펄스를 조정하여 정전류를 유지시킬 수 있다.
일부의 구체예에서, 다수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 송달할 수 있다. 일부의 구체예에서, 다수의 전극은 프로그래밍된 순서로 전극의 제어 하에서 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 송달할 수 있으며, 프로그래밍된 순서는 전기천공 성분에 대한 사용자에 의한 입력이다. 일부의 구체예에서, 프로그래밍된 순서는 순서대로 송달된 다수의 펄스를 포함하며, 여기에서 다수의 펄스 중의 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해서 송달되며, 다수의 펄스 중의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중의 다른 하나에 의해서 송달된다.
일부의 구체예에서, 피드백 기전은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 피드백 기전은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 이 피드백은 매 50 ㎲, 20 ㎲, 10 ㎲ 또는 1 ㎲마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백이거나 순간적이다 (즉, 응답시간을 측정하기 위해서 이용할 수 있는 기술에 의해서 측정되는 것으로서 실질적으로 순간적이다). 일부의 구체예에서, 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 피드백 기전에 전달하며, 피드백 기전은 임피던스에 응답하여 정전류가 미리 설정된 전류와 유사한 값으로 유지되도록 에너지의 펄스를 조정한다. 일부의 구체예에서, 피드백 기전은 에너지의 펄스의 송달 중에 정전류를 연속적으로 및 순간적으로 유지시킨다.
일부의 구체예에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서 또는 유전자 백신 촉진제의 투여와 함께 세포에 송달된다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972 및 5,962,428호 및 1994년 1월 26일에 출원된 국제출원 제PCT/US94/00899호에 기술되어 있다. 유전자 백신 촉진제는 본 발명에 참고로 포함된 1994년 4월 1일자 미국 특허출원 제021,579호에 기술되어 있다. 핵산 분자와 함께 투여되는 공동-약제는 핵산 분자와의 혼합물로 투여될 수 있거나, 별도로 핵산 분자의 투여와 동시에, 또는 그 전 또는 후에 투여될 수 있다. 또한, 형질감염제 및/또는 복제성 약제 및/또는 염증성 성분으로 작용할 수 있으며, GVF와 공동-투여될 수 있는 다른 약제에는 성장인자, 사이토킨 및 림포킨, 예를 들어, a-인터페론, 감마-인터페론, GM-CSF, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), TNF, 표피성장인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-15뿐만 아니라 섬유아세포 성장인자, 표면활성제, 예를 들어, 면역-자극성 컴플렉스 (ISCOMS), 프로인드 (Freunds) 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A (WL)를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌 및 스쿠알렌과 같은 소포체가 포함되며, 히알우론산이 또한 유전자 구조물과 함께 투여될 수 있다. 일부의 구체예에서는, 면역조절성 단백질이 GVF로 사용될 수 있다. 일부의 구체예에서, 핵산 분자는 송달/흡수를 증진시키기 위해서 PLG와 함께 제공된다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 1 나노그램 내지 약 2000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 DNA를 함유한다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 사용될 투여의 모드에 따라 제제화된다. 약제학적 조성물이 주사용 약제학적 조성물인 경우에, 이들은 멸균되고, 발열성 물질을 함유하지 않으며, 미립자를 함유하지 않는다. 등장성 제제가 바람직하게 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제에는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈가 포함될 수 있다. 일부의 경우에, 포스페이트 완충된 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 일부의 구체예에서는, 혈관수축제가 제제에 첨가된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 면역반응을 유도하는 방법이 제공된다. 백신은 단백질 기본, 생약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 일부의 구체예에서, 점막 면역반응을 유도하는 방법을 포함하는, 개체에게서 면역원에 대한 면역반응을 유도하는 방법은 개체에게 CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능적 단편 또는 그의 발현가능한 코드화 서열 중의 하나 또는 그 이상을 본 발명의 단백질을 코드화한 분리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 코드화한 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질의 서브유니트 백신 및/또는 생약독화 백신 및/또는 사멸 백신을 함께 투여하는 것을 포함한다. CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능적 단편 중의 하나 또는 그 이상은 면역원을 코드화한 분리된 핵산 분자; 및/또는 면역원을 코드화한 재조합 백신 및/또는 면역원을 포함하는 서브유니트 백신 및/또는 생약독화 백신 및/또는 사멸 백신의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부의 구체예에서는, CTACK, TECK, MEC 및 그의 기능적 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 코드화한 분리된 핵산 분자가 개체에게 투여된다.
본 발명은 이하의 실시예에서 더 설명된다. 이 실시예는 본 발명의 구체예를 나타내지만 단지 설명을 목적으로 제시된 것으로 이해되어야 한다. 상기한 검토 및 이 실시예로부터, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있으며, 그의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 발명이 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명에 나타내고 기술된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 특허청구의 범위의 범위 내에 포함시키고자 한다.
본 발명 전체에 걸쳐서 인용된 미국 특허, 미국 특허출원 및 참고문헌은 각각 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다.
실시예
본 발명을 하기 실시예에서 더 예시한다. 이 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예들을 나타내지만 단지 예로서 제공되는 것임이 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이 실시예로부터, 당분야 숙련자는 본 발명의 본질적 특징들을 확인할 수 있고, 이들의 정수 및 범위에서 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도들 및 조건들에 맞도록 그 다양한 변화들 및 개질들을 만들 수 있다. 따라서 본원에 나타내고 기재한 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 개질들은 상기 기재로부터 당분야 숙련자들에게 자명할 것이다. 이러한 개질들도 첨부되는 특허청구범위들의 범위 내에 속하는 것이다.
실시예 1
HPV6 및 HPV11 E6/E7 백신 설계 및 발현
HPV6 및 11 E6/E7 공통-기반 융합 면역원들의 구축
HPV 타입 6 또는 11 E6 및 E7 유전자 서열들을 GeneBank에서 수집하고, 다중 정렬을 수행한 후 공통 E6 및 E7 뉴클레오티드 서열들을 수득하였다. 각각 HPV 6 E6 또는 E7 단백질들의 공통 서열은 각각 98 또는 20 서열들로부터 생성된 반면, HPV 11 E6 또는 E7 단백질들의 공통 서열은 76 또는 13 서열들로부터 생성되었다. 계통학적 연구에 적용된 다중 정렬 절차에는 Clustal X(2.0 버전)의 적용이 포함되었다. 도 1a 및 b에 나타낸 바와 같이, E6 및 E7 단백질들에서 동일한 타입에 속하는 HPV 균주들 간에 약 0-2%의 서열 편차가 있었다. 그러나 HPV 6 및 11 간 유전적 거리들은 E6 단백질에서 19.3%까지 그리고 E7 단백질에서 16.3%일 수 있었다. 계통학적 분석들의 이러한 결과들에 근거하여, 2개의 유형 특이적 E6/E7 공통 DNA 백신들을 개발하였다.
공통 E6/E7 융합 서열을 생성한 후 몇몇 개질들을 수행하였다(도 1C). 발현을 촉진하기 위해 고효율 리더 서열을 시작 코돈의 상류에 프레임에 맞게 융합시켰다. 전술된 바와 같이 코돈 및 RNA 최적화도 수행하였다(J. Yan 등, Cellular immunity induced by a novel HPV18 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion consensus protein in mice and rhesus macaques, Vaccine. 26 (2008) 5210-5215; 및 J. Yan 등, Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen, Vaccine. 27 (2009) 431-440). 적절한 단백질 폴딩 및 더 우수한 CTL 처리를 위해 내단백분해 절단 부위를 E6 및 E7 단백질 사이에 도입하였다. 엔지니어링된 두 합성 6E6E7 유전자 및 11E6E7 유전자들은 840bp 길이였다. 서열 확인된 합성 유전자들을 추가 연구를 위해 각각 BamHI 및 XhoI 부위들에서 pVAX 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 공통 뉴클레오티드 서열들을 번역하여 공통 아미노산 서열들을 수득하였다.
HPV 6 및 11 공통 E6 및 E7 서열들을 수득한 뒤, 전술된 바와 같이 코돈 최적화 및 RNA 최적화를 수행하였다(J. Yan 등, Vaccine. 26 (2008) 5210-5215; 및 J. Yan 등, Induction, Vaccine. 27 (2009) 431-440). HPV 타입 6 또는 11 공통 E6/E7 융합 단백질(6E6E7 또는 11E6E7)을 인코딩하는 융합 유전자들을 합성하고 서열을 확인하였다. 합성한 6E6E7 또는 11E6E7을 BamHI 및 XhoI으로 소화시키고, 사이토메갈로바이러스 전초기 프로모터의 조절 하에 발현 벡터 pVAX(Invitrogen) 내로 클로닝하고, 이들 구축물들을 p6E6E7 또는 p11E6E7로 명명하였다.
293-T 세포들을 6웰 플레이트들에서 배양하고 FuGENE6 형질감염 시약(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 이용해서 pVAX, p6E6E7, 또는 p11E6E7로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포들을 개질된 RIPA 세포 용해 완충액으로 용해시키고, 세포 용해액을 수집하였다. 항-HA 단일클론 항체(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 웨스턴 블롯 분석들을 수행하고, ECLTM 웨스턴 블롯 분석 시스템(Amersham, Piscataway, NJ)을 이용해서 홀스래디쉬 페록시다아제-접합 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)로 가시화하였다.
인간 횡문근육종 세포들(RD 세포들)을 이용하여 간접 면역형광 분석들을 수행하여 p6E6E7 및 p11E6E7의 발현을 확인하였다. 챔버 슬라이드들에서 배양한 RD 세포들을 Turbofectin 8.0(Origene, Rockville, MD)을 이용해서 pVAX, p6E6E7, 또는 p11E6E7로 형질감염시켰다. 이후, 세포들을 PFA로 고정하고 PBS 중 0.1% Triton-X로 투과성으로 만들었다. 세포들을 일차 및 이차 항체들과 함께 1-2회 인큐베이션하였고, 인큐베이션들 간에 글리신 및 BSA가 보강된 PBS로 세척하였다. 사용한 일차 및 이차 항체들은 각각 단일클론 마우스 항-HA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 FITC-접합 항-마우스 IgG(Abcam, Cambridge, MA)였다. Hoechst 염색도 수행하여 세포 핵들을 확인하고 RD 세포들의 위치를 파악하였다. 모든 인큐베이션들을 완료한 후, 세포들을 플루오로마운트-G(Southern Biotech, Birmingham, AL)로 고정된 유리 슬라이드로 실장하였다. 표본들을 공초점 현미경(CDB Microscopy Core, University of Pennsylvania Cell and Developmental Biology, Philadelphia, PA)을 이용하여 보고 이미지를 얻었다.
실시예 2
마우스들 및 처리군들의 백신접종들
6 내지 8주령의 자성 C57BL/6 마우스들을 이 실험에 사용하였다. 마우스들은 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 입수하였다. 마우스들을 국립보건원(National Institutes of Health) 및 펜실베니아 대학 동물 케어 및 사용 위원회(IACUC)의 정책들을 준수하여 펜실베니아 대학(Philadelphia, PA)의 대학교 실험 동물 자원실에서 수용하고 유지하였다. 이 실험들에 사용한 마우스들을 4개 면역접종군들로 나누었다. 마우스들에 p6E6E7, p11E6E7, 또는 두 구축물들을 모두 그리고 음성 대조군 pVAX군을 면역접종하였다.
DNA 백신접종 및 전기천공
각각의 마우스는 14일 간격들로 각각의 DNA 플라스미드 20㎍의 3회 용량들을 수여받았다. p6E6E7 및 p11E6E7를 모두 수여받는 군의 마우스들은 백신접종 당 두 플라스미드들을 20㎍씩 총 40㎍의 DNA를 수여받았다. DNA 구축물들을 우측 사두근들의 근육내 주사 후 CELLECTRA™ 전기천공기(Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)에 의해 생성되는 방형파 펄스들을 통해 투여하였다. 전기천공기는 1초씩 지연 분리된 간격으로 52ms/펄스에서 0.2Amps의 2회 전기 펄스들을 전달하도록 구성되었다. 전기천공 절차를 전술된 바와 같이 수행하였다[12,13].
IFN-γ ELISpot 분석
치료군 및 대조군들의 마우스들을 모두 3번째 면역접종 1주 후에 희생시켰다. 각각의 마우스로부터 비장들을 수확하여 10% FBS 및 항생제들(R10)을 포함하는 RPMI-1640 배지로 옮겼다. Stomacher(Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY)를 이용하여 비장들을 분쇄한 뒤 세포 여과기를 통해 옮기고 ACK 용해 완충액 중에 현탁하였다. 적혈구들을 제거한 후, 비장세포들을 단리하고 R10 배지 중에 현탁하였다. 고단백질 IP 96-웰 Multiscreen™ 플레이트들(Millipore, Bedford, MA)을 단일클론 마우스 IFN-γ 포획 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 사전 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 1 X PBS로 3회 세척한 후, 플레이트들을 상온에서 2시간 동안 1 x PBS 중 1% BSA 및 5% 수크로오스로 차단하였다. R10 배지 중 단리된 비장세포들을 계수하고, 웰 당 2 x 105개 세포들로 3개씩의 웰들에 추가하였다. HPV6 및 HPV11에 대한 공통 E6/E7 서열에 걸친 2개 세트들의 펩티드들을 DMSO(GenScript USA, Piscataway, NJ) 중에 재구성하였다. 펩티드들은 15개 아미노산 서열들을 포함하였고, 그 중 8개 잔기들이 각각의 순차적 펩티드와 겹쳤다. HPV6 및 11에 대한 펩티드들을 각각 DMSO 중 2㎍/mL의 농도인 2개 풀들-E6을 위한 1개 풀 및 E7을 위한 또 다른 풀-로 나누었다. 양성 및 음성 대조군으로 사용될 웰들에는 각각 펩티드들 대신에 Concavalin A(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 R10 배양 배지를 넣었다. 이어서 플레이트들을 5% CO2 분위기 인큐베이터에 넣었다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 후, 웰들을 1 x PBS로 세척하였다. 바이오틴화 항-마우스 IFN-γ 검출 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 각 웰에 첨가한 뒤 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트들을 세척하고, Streptavidin-AP 및 BCIP/NBT Plus(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 R&D Systems에서 제공하는 발색 프로토콜에 따라 처리하였다. 웰들을 하룻밤 동안 대기 건조하고, 웰들 내부의 스팟들을 ImmunoSpot®3 및 ImmunoSpot®4 소프트웨어(Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, OH)를 이용하여 ELISpot 플레이트 리더 시스템으로 스캐닝하고 계수하였다. 보고된 스팟 형성 세포 계수값들을 산술을 이용해서 1 x 106개 비장세포들 당의 스팟 형성 단위들을 나타내도록 변환하였다.
감도 및 T-세포 활성을 나타내는 능력에 근거하여, IFN-γ ELISpot 분석들을 이용해서 HPV 6 또는 11 E6 및 E7 펩티드들로의 자극에 반응하는 항원-특이적 IFN-감마 분비 세포들의 수를 결정하였다.
도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, p6E6E7로 백신접종한 마우스들에 있어서 SFU/106개 비장세포들의 평균 개수는 1442.8인 반면 p11E6E7로 백신접종한 마우스들에 있어서 SFU/106개 비장세포들의 평균 수는 2845로, 모두 음성 대조군보다 훨씬 더 높았다. 따라서 p6E6E7 및 p11E6E7은 모두 마우스들에서 강력한 타입-특이적 E6 및 E7-특이적 면역 반응을 일으키는데 효과적이었다.
흥미롭게도 교차반응성 세포 면역 반응들도 p6E6E7 또는 p11E6E7을 이용한 백신접종으로 유도되었다. HPV 6 E6/E7 펩티드들에 대해 p11E6E7 면역접종 마우스들에서의 SFU/106개 비장세포들의 추가 빈도는 552.8 SFU/106개 비장세포들이었고, p6E6E7 면역접종 마우스들에서의 HPV 11 E6/E7-특이적 면역 반응들은 888.3 SFU/106개 비장세포들이었다. HPV 6 또는 11의 E6 단백질들은 약 80%의 동일성을 공유하는 반면 HPV6 또는 11의 E7 단백질들은 약 84%의 동일성을 공유하였다. HPV 6 또는 11 E6 및 E7 항원들 간에는 일부 공유된 면역 에피토프들이 존재할 수 있다. IFN-감마 ELISpot 분석에서 관찰된 교차반응성은 HPV 6 및 11 E6 및 E7 항원들 간에 공유된 면역 에피토프들이 존재함을 나타내었다.
p6E6E7 및 p11E6E7 모두를 수여받은 마우스들(콤보군)의 비장세포들도 이들 두 구축물들을 함께 백신접종할 때 임의의 면역 간섭이 존재하는지를 조사하기 위해 상기 ELISpot 분석들을 수행하였다(도 3a 및 b). 콤보군은 HPV6 E6 및 E7 펩티드들에 대해 평균 1670 SFU/106개 비장세포들을 나타내었다(σ = 55.7, p < 0.001). HPV11 E6 및 E7 펩티드들에 대해서는 동일한 군의 비장세포들에서 2010 SFU/106개 비장세포들을 나타내었다(σ = 247.8, p = 0.002). 데이터는 두 구축물들을 이용한 동시적 백신접종이 HPV6 및 HPV11에 대해 통계적으로 유의미한 E6 및 E7-특이적 세포 반응을 일으킬 수 있으며, 이들 반응들이 서로를 간섭하지 않음을 제시한다.
에피토프 맵핑
E6/E7 공통 항원들 내의 면역 우성 펩티드들을 결정하기 위해, 에피토프 맵핑 연구들을 수행하여 펩티드 풀들 내에서 우성 에피토프들을 결정하였다(도 4a 및 4b). 연구들은 앞서 언급된 IFN-γ ELISpot 분석과 유사하게 수행하였다. 풀들 대신에 개별 펩티드들을 사용하여 비장세포들을 자극하였다.
이 단일 펩티드 분석에서 사용된 각각의 펩티드는 HPV6 또는 HPV11의 E6 및 E7 항원들의 부분적으로 겹치는 단편을 나타내었다. 맵핑 데이터는 펩티드 7(TAEIYSYAYKQLKVL) 서열 목록 번호 11이 HPV6 E6 및 E7 면역원들에 대한 우성 에피토프임을 나타내었다(도 4a). TAEIYSYAYKQLKVL 서열 목록 번호 11은 NIH BIMAS에서 이용 가능해진 HLA 결합 예측 소프트웨어에 의해 제한된 H2-Kb인 것으로 확인된 8, 9, 10-머 아미노산 에피토프들을 포함하였다. HPV11 E6 및 E7-특이적 T-세포 면역 반응을 추가 설명하기 위해(도 4b). HPV11 E6 및 E7의 겹치는 단편들로 펩티드 분석을 또한 수행하였다. 에피토프 맵핑은 HPV 11 E6 및 E7 항원들에 대한 우성 에피토프들이 펩티드들 7(TAEIYAYAYKNLKVV) 서열 목록 번호 12 및 27(HCYEQLEDSSEDEVD) 서열 목록 번호 13임을 나타내었다. HPV6 에피토프 맵핑 분석에서의 펩티드 7과 마찬가지로, BIMAS HLA-결합 예측 소프트웨어에서는 TAEIYAYAYKNLKVV 서열 목록 번호 12가 H2-Kb 제한 에피토프임을 확인하였다. 또 다른 HLA-결합 펩티드 데이터베이스인 면역 에피토프 데이터베이스 및 NIH NIAID에서 제공하는 분석 자원으로 HCYEQLEDSSEDEVD 서열 목록 번호 13이 H2-Kb 제한 에피토프임을 확인하였다. 3개의 면역 서브우성 펩티드들 번호 6(FCKNALTTAEIYSYA) 서열 목록 번호 14, 9(LFRGGYPYAACACCL) 서열 목록 번호 15, 및 13(YAGYATTVEEETKQD) 서열 목록 번호 16이 이 에피토프 맵핑 연구를 통해 확인되었다.
세포내 시토카인 염색
IFN-γ ELISpot 분석들로 나타내는 높은 면역 반응의 견지에서, p6E6E7 및 p11E6E7에 의해 유도되는 세포 반응의 보다 전체적인 개요를 제공하기 위해 세포내 시토카인 염색 분석들을 수행하였다. 백신접종 및 접종하지 않은 마우스 군들로부터 비장세포들을 단리하고, 37℃, 5% CO2 환경에서 4시간 동안 HPV6 및 HPV11의 E6 및 E7 영역들에 걸친 펩티드들로 자극하였다. 세포들을 각각 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 R10 세포 배지에 넣어서 양성 및 음성 대조군들로 분석에서 사용하였다. 인큐베이션 후, 세포들을 먼저 ViViD 염료(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 염색하여 살아 있는 세포들과 죽은 세포들을 구분한 뒤 모든 세포들을 하기 표면 마커 항체들로 염색하였다: APC-Cy7 햄스터 항-마우스 CD3e, PerCP-Cy5.5 래트 항-마우스 CD4, 및 APC 래트 항-마우스 CD8a(BD Biosciences, San Diego, CA). 이어서 세포들을 Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences, San Diego, CA)를 이용해서 고정하였다. 제작자의 프로토콜에 따라 고정 후, 세포들을 하기 세포내 마커 항체들로 염색하였다: Alexa Fluor 700 래트 항-마우스 IFN-γ, PE-Cy7 래트 항-마우스 TNF Clone, 및 PE 래트 항-마우스 IL-2(BD Biosciences, San Diego, CA). 염색 후, 세포들을 2% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 용액으로 고정하였다. 제조된 세포들을 BD FACSDiva 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)가 장착된 LSR II 유세포 측정기를 이용해서 입수하였다. 입수한 데이터를 최신 버전의 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR)를 이용해서 분석하였다. CD4+ 및 CD8+ 사건들을 다음 순서의 관문들을 이용해서 단리하였다: FSC-A vs FSC-H로부터 단일선, FSC-A vs SSC-A로부터 모든 비장세포들, ViViD 염료(Pacific Blue) vs SSC-A로부터 살아있는 세포들, CD3(APC-Cy7) vs SSC-A로부터 CD3+ 세포들, 및 CD4(PerCP-Cy5.5: 양성-CD4+, 음성-CD8+) vs SSC-A로부터 CD4+ 또는 CD8+. 마지막 두 모집단들을 Alexa Fluor 700, PE-Cy7, 및 PE에 대해 관문화하여 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α 생산에서의 변화들을 각각 관찰하였다.
세포내 시토카인 염색 데이터를 CD4+ 및 CD8+ 세포 반응들로 구분할 수 있도록 세포들을 관문화하였다. HPV6 E6 및 E7-특이적 펩티드들로 자극할 때, p6E6E7로 백신접종한 마우스들은 각각 평균들 0.163%(σ = 0.09), 0.003%(σ = 0.07), 및 0.188%(σ = 0.20)의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 생산하는 총 CD4+ 세포들을 나타내었다(도 5a). 동일한 군의 마우스들은 각각 평균들 3.323%(σ = 1.39), 0.838%(σ = 0.32), 및 1.172%(σ = 1.81)의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 생산하는 총 CD8+ 세포들을 가졌다. HPV11 E6 및 E7 항원들과 함께 인큐베이션 후 p11E6E7로 백신접종된 마우스들로부터의 비장세포들을 이용하여 동일한 세포내 시토카인 데이터를 수집하였다(도 5b). p11E6E7 백신접종 마우스들의 모든 CD4+ 세포들 가운데 평균 0.051%(σ = 0.04)가 IFN-γ를 생산하였고, 0.068%(σ = 0.09)가 TNF-α를 생산하였고, 0.026%(σ = 0.037)가 IL-2를 생산하였다. 또한, p11E6E7 백신접종 마우스들에서 모든 CD8+ 세포들의 평균 4.52%(σ = 2.53), 2.08%(σ = 1.56), 및 0.21%(σ = 0.22)가 각각 IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2를 생산하였다. 몇 개 패널들을 예외로 하고, 처리군 대 대응 미처리군에서의 시토카인 생산 세포들의 백분율은 신뢰도 수준 89% 이상으로 통계적 유의성을 가졌다. CD4+ 세포들 대 CD8+ T-세포들의 시토카인 생산 크기 관찰로부터, p6E6E7 및 p11E6E7에 의해 야기되는 면역 반응들이 모든 모델들에서 이들의 세포 제거와 연관되는 CD8+ 림프구들을 유도하는 쪽으로 크게 편향된다고 결론지을 수 있다.
통계적 분석
Student t 검정들을 수행하여 이 연구에서 생성한 모든 정량적 데이터의 통계적 유의성을 분석하였다. 달리 나타내지 않으면, p-값들을 계산하여 다양한 신뢰도 수준들에서 통계적 유의성을 결정하였다.
이 연구는 DNA 백신들이 다른 유명한 그리고 전통적인 백신 플랫폼들을 이용하는 실험들에서 확인되는 면역원성 수준을 획득할 수 있다는 강력한 증거를 나타내었다. 다른 유사한 E6 및 E7-특이적 HPV DNA 백신 연구들에서 측정되는 높은 수준의 세포 반응들은 예방적인 및 치료적인 항종양 유효성을 시사하는 데이터와 연관되었다. 대부분의 HPV-관련 연구 및 질병 시험 모델들은 자궁경부암에 초점을 맞추고 있다. HPV6 및 HPV11은 다른 HPV 혈청형들만큼 자궁경부암에 관련되어 있지 않으므로, p6E6E7 및 p11E6E7의 치료적 유효성은 통상적인 HPV 질병 시험 모델들을 이용해서는 완전히 평가할 수 없다. 적절한 질병 시험 모델들을 이용할 수 있게 될 때 p6E6E7 및 p11E6E7의 예방적 및 치료적 잠재력을 결정하는 것이 통찰력있을 것이다. 따라서 ELISpot 분석들 및 세포내 시토카인 염색으로 정량한 높은 수준들의 IFN-γ 및 시토카인 생산을 살펴봄으로써 p6E6E7 및 p11E6E7의 면역원성 유효성을 추론할 수 있을 뿐이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 수준들은 크기가 매우 큰 것으로 확인되었고 상당한 수준들의 세포 면역 반응들을 일으킬 전망을 보여준다. HPV-관련 암들은 일반적으로 다중 혈청형들의 동시적 감염에 이차적인 것이므로, 바이러스의 상이한 혈청형들을 표적으로 하는 백신들의 조합 타당성을 더 살펴볼 필요성이 매우 높다. 두 플라스미드들의 동시적 백신접종 효과들을 추가 분석하기 위해 T-세포 역학들 및 백신 경쟁을 살피는 추가 연구가 타당하다.
세포내 시토카인 염색은 p6E6E7 및 p11E6E7을 이용한 백신접종이 상당한 백분율의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 생산 T-세포들을 일으킬 수 있음을 나타내었다. 면역계에서 현재 알려진 기능에 따르면, IFN-γ는 역사적으로 세포 면역 반응들의 계측으로 사용되었다. 일부 중요 역할들에는 선천성 및 적응 면역성을 조정하고 자극하는 능력이 포함된다. 또한, IFN-γ의 주요 생산자들이 T-세포들이라는 것이 널리 받아들여져서, IFN-γ 생산을 항원들에 대한 노출 후 주어진 백신의 세포성 면역원성을 측정하는 허용 가능한 모드가 되게 한다. TNF-α는 면역계 조절에 관여하는 또 다른 시토카인이다. 아폽토시스를 유도하고 종양 증식을 조절하는 그 알려진 능력은 이것이 백신접종 후 면역 반응들을 분석할 때 고려할 중요 파라미터가 되게끔 한다. TNF-α 생산은 HPV6 및 HPV11의 잠재적 종양 증식 특성들에 따라 추가 관심의 대상이 될 수 있다. IL-2는 면역계에서 T-세포들의 증식과 분화에 중추적 역할을 담당하는 것으로 관찰되어온 또 다른 신호전달 분자이다. 공통적으로 IL-2는 종종 특정 면역 반응의 크기 및 질에 대한 추가 관점을 얻기 위해 다른 시토카인들과 함께 검사된다. 상기에 따라, p6E6E7을 이용한 백신접종 후 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 생산하는 CD4+ 및 CD8+ 세포들의 상당한 백분율들은 백신이 강력한 면역 반응을 유도하는데 성공적이었음을 제시한다. IL-2 분비 CD4+ 세포들은 예외로 하고, p11E6E7로 백신접종한 마우스들로부터 단리된 세포들에 대해서도 동일한 경향성이 나타난다. 또한, CD8+ 세포들이 백신접종한 마우스들에서 면역 반응들을 강력히 유도함-두 플라스미드들의 항종양 유효성 평가에 중요한 특성임-을 관찰하는 것을 주목할만 하다.
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Leu Thr Gln His 210 215 220 Tyr Gln Ile Leu Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn Val Arg Leu 225 230 235 240 Val Val Glu Cys Thr Asp Gly Asp Ile Arg Gln Leu Gln Asp Leu Leu 245 250 255 Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro Lys Pro Tyr 260 265 270 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 275 280 <210> 5 <211> 828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV33 E6E7 DNA sequence <400> 5 ggtaccgtcg acggatccgc caccatggac tggacctgga ttctgttcct ggtggccgct 60 gctacccggg tgcacagctt ccaggacacc gaggaaagcg gccggaccct gcacgatctg 120 tgccaggccc tggaaaccac catccacaac atcgagctgc agtgcgtgga atgcaagaag 180 cccctgcagc ggagcgaggt gtacgacgcc gacctgaccg tggtgtacag agagggcaac 240 cccttcggca tctgcaagct gtgcctgcgg ttcctgagca agatcagcga gtaccggcac 300 tacaactaca gcgtgtacgg caacaccctg gaacagaccg tgaagaagcc tctgaacgag 360 atcctgatcc ggtgcatcat ctgccagcgg cccctgaagc ggcacgtgga cctgaacaag 420 cggttccaca atatcagcgg cagatgggcc ggcagatgcg ccgcctgttg gagaagccgg 480 cggagagaga cagccctgcg gggcagaaag cggcggagca gaggccacaa gcccaccctg 540 aaagaatacg tgctggacct gtaccccgag cccaccgacc tgtacggcta cggccagctg 600 agcgacagca gcgacgagga cgagggcctg gacagacctg atggacaggc ccagcccgcc 660 accgccgact actacatcgt gacctgctgc cacacctgta acaccaccgt gcggctgtgc 720 gtgaacagca ccgccagcga cctgcggaca atccagcagc tcctgatggg caccgtgaac 780 atcgtgtgcc ctacctgcgc ccagctgtga ctcgagacgc gtgagctc 828 <210> 6 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV33 E6E7 protein sequence <400> 6 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Phe Gln Asp Thr Glu Glu Ser Gly Arg Thr Leu His Asp Leu 20 25 30 Cys Gln Ala Leu Glu Thr Thr Ile His Asn Ile Glu Leu Gln Cys Val 35 40 45 Glu Cys Lys Lys Pro Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Ala Asp Leu 50 55 60 Thr Val Val Tyr Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Ile Cys Lys Leu Cys 65 70 75 80 Leu Arg Phe Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser 85 90 95 Val Tyr Gly Asn Thr Leu Glu Gln Thr Val Lys Lys Pro Leu Asn Glu 100 105 110 Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Lys Arg His Val 115 120 125 Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Ser Gly Arg Trp Ala Gly Arg 130 135 140 Cys Ala Ala Cys Trp Arg Ser Arg Arg Arg Glu Thr Ala Leu Arg Gly 145 150 155 160 Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly His Lys Pro Thr Leu Lys Glu Tyr Val 165 170 175 Leu Asp Leu Tyr Pro Glu Pro Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu 180 185 190 Ser Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu Gly Leu Asp Arg Pro Asp Gly Gln 195 200 205 Ala Gln Pro Ala Thr Ala Asp Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys His Thr 210 215 220 Cys Asn Thr Thr Val Arg Leu Cys Val Asn Ser Thr Ala Ser Asp Leu 225 230 235 240 Arg Thr Ile Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Val Asn Ile Val Cys Pro 245 250 255 Thr Cys Ala Gln Leu 260 <210> 7 <211> 835 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV58 E6E7 DNA sequence <400> 7 ggtaccgttt aaacggatcc gccaccatgg actggacctg gattctgttc ctggtggccg 60 ctgctacccg ggtgcacagc ttccaggatg ccgaggaaag cggccggacc ctgcacgatc 120 tgtgccaggc cctggaaacc agcgtgcacg agatcgagct gaagtgcgtg gaatgcaaga 180 aaaccctgca gcggagcgag gtgtacgacg ccgacctgcg gatcgtgtac cgggacggca 240 accccttcgc cgtgtgcaaa gtgtgcctgc ggctgctgag caagatcagc gagtaccggc 300 actacaacta cagcctgtac ggcgacaccc tggaacagac cctgaagaag tgcctgaacg 360 agatcctgat ccggtgcatc atctgccagc ggcccctgaa gcggcacgtg gacctgaaca 420 agcggttcca caacatcagc ggccggtgga ccggcagatg cgccgtgtgt tggaggccca 480 ggcggagaca gacccaggtg cgcggcagaa agcggcggag cagaggcaac aaccccaccc 540 tgagagagta catcctggac ctgcaccccg agcccaccga cctgtttggc tacggccagc 600 tgtgcgacag cagcgacgag gacgagatcg gcctggacgg ccctgatgga caggcccagc 660 ccgccaccgc caactactac atcgtgacct gctgctacac ctgtggcacc accgtgcggc 720 tgtgcatcaa cagcaccacc accgacgtgc gcaccctgca gcagctcctg atgggcacct 780 gtaccatcgt gtgccccagc tgcgcccagc agtgactcga ggcggccgcg agctc 835 <210> 8 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV58 E6E7 protein sequence <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Phe Gln Asp Ala Glu Glu Ser Gly Arg Thr Leu His Asp Leu 20 25 30 Cys Gln Ala Leu Glu Thr Ser Val His Glu Ile Glu Leu Lys Cys Val 35 40 45 Glu Cys Lys Lys Thr Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Ala Asp Leu 50 55 60 Arg Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Val Cys Lys Val Cys 65 70 75 80 Leu Arg Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser 85 90 95 Leu Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Gln Thr Leu Lys Lys Cys Leu Asn Glu 100 105 110 Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Lys Arg His Val 115 120 125 Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Ser Gly Arg Trp Thr Gly Arg 130 135 140 Cys Ala Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg Arg Gln Thr Gln Val Arg Gly 145 150 155 160 Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly Asn Asn Pro Thr Leu Arg Glu Tyr Ile 165 170 175 Leu Asp Leu His Pro Glu Pro Thr Asp Leu Phe Gly Tyr Gly Gln Leu 180 185 190 Cys Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu Ile Gly Leu Asp Gly Pro Asp Gly 195 200 205 Gln Ala Gln Pro Ala Thr Ala Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys Tyr 210 215 220 Thr Cys Gly Thr Thr Val Arg Leu Cys Ile Asn Ser Thr Thr Thr Asp 225 230 235 240 Val Arg Thr Leu Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Cys Thr Ile Val Cys 245 250 255 Pro Ser Cys Ala Gln Gln 260 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE Leader DNA sequence <400> 9 atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagc 54 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE leader protein <400> 10 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV6 peptide 7 <400> 11 Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Gln Leu Lys Val Leu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV11 peptide 7 <400> 12 Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr Ala Tyr Lys Asn Leu Lys Val Val 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV11 peptide 27 <400> 13 His Cys Tyr Glu Gln Leu Glu Asp Ser Ser Glu Asp Glu Val Asp 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV subdominant peptide 6 <400> 14 Phe Cys Lys Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV subdominant peptide 9 <400> 15 Leu Phe Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Leu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV subdominant peptide 13 <400> 16 Tyr Ala Gly Tyr Ala Thr Thr Val Glu Glu Glu Thr Lys Gln Asp 1 5 10 15

Claims (19)

  1. 서열번호:3, 서열번호:5, 서열번호:7, 서열번호:3의 적어도 786개의 뉴클레오타이드를 포함하고 서열번호:9의 IgE 선도 서열을 포함하지 않는 단편, 서열번호:5의 적어도 746개의 뉴클레오타이드를 포함하고 서열번호:9의 IgE 선도 서열을 포함하지 않는 단편, 서열번호:7의 적어도 752개의 뉴클레오타이드를 포함하고 서열번호:9의 IgE 선도 서열을 포함하지 않는 단편, 및 이들의 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된, HPV 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열
    을 포함하는, 핵산분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호:3, 서열번호:5, 서열번호:7, 또는 이들의 조합을 포함하는, 핵산 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 분자는 플라스미드인, 핵산 분자.
  4. 서열번호:4, 서열번호:6, 및 서열번호:8로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열,
    서열번호:4의 적어도 252 개의 잔기를 포함하고 서열번호:10의 IgE 펩타이드 서열을 포함하지 않는 아미노산 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열,
    서열번호:6의 적어도 235 개의 잔기를 포함하고 서열번호:10의 IgE 펩타이드 서열을 포함하지 않는 아미노산 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및
    서열번호:8의 적어도 235 개의 잔기를 포함하고 서열번호:10의 IgE 펩타이드 서열을 포함하지 않는 아미노산 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열
    로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자로서,
    상기 단편들은 HPV에 대한 면역 반응을 향상시키는 면역원들을 포함하는 것인,
    핵산 분자.
  5. 청구항 4에 있어서, 서열번호:4, 서열번호:6 또는 서열번호:8을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 분자는 플라스미드인, 핵산 분자.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항의 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항의 핵산 분자를 포함하는, HPV에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한, 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 핵산 분자는 전기천공에 의하여 상기 개체에게 도입되는 것인, 조성물.
  10. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 백신.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 재조합 백신은 재조합 우두 백신인, 재조합 백신.
  12. 청구항 10의 재조합 백신을 포함하는, HPV에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한, 조성물.
  13. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항의 핵산 분자를 포함하는, 생약독화 백신.
  14. 청구항 13의 생약독화 백신을 포함하는, HPV에 대항하여 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한, 조성물.
  15. 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 상기 개체의 HPV 감염 여부를 진단하기 위한 것인, 조성물.
  16. HPV 항원을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약제학적 조성물로서,
    상기 HPV 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호:1, 서열번호:3, 서열번호:1의 적어도 786개의 뉴클레오타이드를 포함하고 서열번호:9의 IgE 선도 서열을 포함하지 않는 단편, 및 서열번호:3의 적어도 786개의 뉴클레오타이드를 포함하고 서열번호:9의 IgE 선도 서열을 포함하지 않는 단편 중 적어도 하나의 서열로 이루어진 것이고,
    상기 단편들은 HPV에 대한 면역 반응을 향상시키는 면역원들을 인코딩하는 것인, 약제학적 조성물.
  17. 청구항 16의 약제학적 조성물을 포함하는, HPV 하위유형 6 또는 11에 대응하여 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  18. HPV 항원을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약제학적 조성물로서,
    상기 HPV 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호:5, 서열번호:7, 서열번호:5의 적어도 746개의 뉴클레오타이드를 포함하고 서열번호:9의 IgE 선도 서열을 포함하지 않는 단편, 및 서열번호:7의 적어도 752개의 뉴클레오타이드를 포함하고 서열번호:9의 IgE 선도 서열을 포함하지 않는 단편에서 적어도 하나의 서열로 이루어진 것이고,
    상기 단편들은 HPV에 대한 면역 반응을 향상시키는 면역원들을 인코딩하는 것인, 약제학적 조성물.
  19. 청구항 18의 약제학적 조성물을 포함하는, HPV 하위유형 33 또는 58에 대응하여 개체에서 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
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