CN1163634A - 编码6a型人乳头瘤病毒的DNA - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码纯化的6a型人乳头瘤病毒的DNA分子及其衍生化合物。

Description

编码6a型人乳头瘤病毒的DNA

其它相关申请

本申请是1994年9月22日提交的尚未决定的美国申请登记号08/310,468的继续。

发明领域

本发明涉及编码纯化的6a型人乳头瘤病毒的DNA分子及其衍生物。

附图简述

图1.HPV6a核苷酸序列

发明背景

乳头瘤病毒(PV)感染发生于各种动物，包括人、绵羊、狗、猫、兔、猴、蛇和牛中。乳头瘤病毒感染上皮细胞，一般在感染位点诱导良性上皮或纤维上皮瘤。PV是种类特异性的感染原，人乳头瘤病毒不感染非人的动物。

根据乳头瘤病毒感染的宿主可将其分成不同的组。根据DNA序列同源性，人乳头瘤病毒(HPV)进一步可分类为70多型。PV看来是类型特异的免疫原，因为对一种类型的乳头瘤病毒感染的中和免疫不赋予对另外类型的乳头瘤病毒的免疫性。

在人中，不同型的HPV引起不同的疾病。HPV1、2、3、4、7、10和26-29型在正常和免疫损伤的个体中都引起良性疣。HPV5、8、8、9、12、14、15、17、19-25、36和46-50型在免疫损伤个体中造成扁平损伤。HPV6、11、34、39、41-44和51-55型在生殖和呼吸道粘膜引起良性湿疣。HPV16和18型引起生殖道粘膜的上皮发育不良并与大多数原位侵袭性子宫颈、阴道、外阴和肛管癌相关。

乳头瘤病毒是编码多达8个早期和2个晚期基因的小的(50-60nm)，非包被的，二十面体DNA病毒。病毒基因组的开放阅读框(ORF)被命名为E₁到E₇和L₁和L₂，其中“E”指早而“L”指晚。L₁和L₂编码病毒壳体蛋白。早期(E)基因与如病毒复制和细胞转化功能相关。

L₁蛋白是主要的壳体蛋白并且分子量为55-60kDa。L₂蛋白是次要的壳体蛋白，其推测分子量为55-60kDa并且其由聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的表观分子量为75-100kDa。免疫学数据表明大多数L₂蛋白位于L₁蛋白的内部。L₁ORF在不同的乳头瘤病毒中是高度保守的。L₂蛋白在不同的乳头瘤病毒中较少保守。

L₁和L₂基因已被鉴定为免疫预防的好的靶子。已证明一些早期基因是疫苗开发的潜在目标。对美洲产白尾棕色兔乳头瘤病毒(CRPV)和牛乳头瘤病毒(BPV)系统的研究表明应用在细菌中表达的这些蛋白进行免疫或证明疫苗载体的免疫可保护动物不受病毒感染。乳头瘤病毒L₁基因在杆状病毒表达系统中的表达或应用疫苗载体导致了病毒样颗粒(VLP)的组装，该颗粒已被用于诱导与保护不受病毒攻击相关的高滴度病毒中和抗体反应。

很少与恶性相关的HPV6和HPV11是～90％的尖锐湿疣，良性呼吸道和生殖道粘膜损伤的致病原。在这些损伤中检测到的HPV6比HPV11多3倍。

已确定了原始的HPV6分离体HPV6a的完整的核苷酸序列(Schwarz，E.等.，1983，欧洲分子生物学联合会杂志(EMBO.J)，2：2341-8)。在限制性酶切图谱的基础上也鉴定了其它的HPV6亚型(Gissmann，L，等，1983，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：560-3；Mounts，P.，等，1982，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79：5425-9)。

几个研究小组已证明在美国和欧洲尖锐湿疣病人组织活检中发现HPV6a是主要的亚型。最近的报道表明HPV6a是HPV6的原型(Kitasato，H.，等，1994普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.75：1157-1162))。据估计仅在美国就有大约1％的15-49年龄组的所有男人和妇女患尖锐湿疣。不幸地是，对HPV相关疾病尚未有有效的治疗。因此，很需要一种疫苗。但是为了开发预防或治疗疫苗，对最普通的HPV亚型的晚期和早期基因的序列确定是最重要的。

有关的HPV6a的有限的序列信息涉及长控制区(LCR)和E₆和E₇ORFs。本申请描述了来自尖锐湿疣的组织活检的HPV6a的克隆，对其完整的病毒DNA序列的确定以及对主要的HPV6a开放阅读框(ORF)相应的氨基酸序列的确定。

本发明涉及编码纯化的6a型人乳头瘤病毒(HPV6a型，HPV6a)的DNA分子和该DNA分子的应用。发明概述

本发明涉及编码纯化的6a型人乳头瘤病毒(HPV6a型，HPV6a)的DNA分子及其衍生物。发明详述

本发明涉及编码纯化的6a型人乳头瘤病毒(HPV6a型，HPV6a)的DNA分子及其衍生物。这类衍生物包括但并不限于由该DNA编码的肽或蛋白质，抗该DNA或该DNA编码的蛋白质的抗体，包括该DNA的疫苗或包含由该DNA编码的蛋白质的疫苗，包含该DNA或由该DNA编码的蛋白质的免疫组合物，包含该DNA或该DNA衍生的RNA或由该DNA编码的蛋白的试剂盒。

HPV6是尖锐湿疣(良性呼吸道和生殖道粘膜的损伤)的主要致病原。已确定了原始的HPV16分离体HPV6b的完整的核苷酸序列。在限制性酶切图谱的基础上鉴定了其它的HPV亚型。

几个小组已证明在美国和欧洲尖锐湿疣病人的组织活检中发现HPV6a是主要的亚型。据估计仅在美国的所有的15-49年龄组的男人和妇女就有1％患尖锐湿疣。不幸地是，对HPV相关疾病尚未有有效的治疗。因此，很需要一种疫苗。但是，开发预防或治疗性的疫苗，对最普通的HPV亚型的晚期和早期基因的序列确定是最重要的。

有关HPV6a的有限的序列信息涉及长控制区(LCR)和E₆和E₇ORFs。本申请描述了来自尖锐湿疣的组织活检的HPV6a的克隆，对其完整的病毒DNA序列以及主要的HPV6a开放阅读框(ORF)对应的氨基酸序列的确定。本发明涉及编码纯化的人乳头瘤病毒6型的DNA分子及该DNA分子的衍生物。

可根据已知方法制备包含该DNA或由该DNA编码的蛋白质的药用组合物，例如混入药学上可接受的载体。这类载体和制备方法的实例可见于雷明顿药物科学(Remington’s  Pharmaceutical Sciences)。为了形成适于有效施用的药学上可接受的组合物，这类组合物将包含有效量的蛋白或VLP。此类组合物可含有蛋白质或衍生自多于一种类型的HPV和VLP。

本发明的治疗或诊断组合物以足以治疗或诊断PV感染的量施给个体。有效的量可根据各种因素如个体的身体状况、体重、性别和年龄而变化。其它因素包括施用方式。一般说来，以大约1μg～1mg的剂量施用该组合物。

药物组合物可通过各种途径提供给个体，如皮下、局部、口服、粘膜、静脉内和肌内。

本发明的疫苗包含DNA、RNA或由该DNA编码的蛋白质，它们含有可在宿主中诱导中和抗体形成所必需的抗原决定簇。这类疫苗的施用还足够安全无临床感染的危险；没有毒副作用；可通过有效途径施用；是稳定的；与疫苗载体可匹配。

该疫苗可通过各种途径施用，例如口服、非胃肠道、皮下、粘膜、静脉或肌肉。施用的剂量可根据个体的身体状况、性别、体重和年龄；施用的途径；以及疫苗的PV型而变化。疫苗可通过例如胶囊、悬浮液、酏剂或液体溶液等药剂形式施用。疫苗可用免疫学上可接受的载体一起制备。

疫苗是以治疗有效的量施用的，即，足以产生免疫保护反应的量。治疗有效的量可根据PV型而变化。疫苗的施用可以是单剂量或多剂量的。

本发明的DNA和DNA衍生物可以以免疫原组合物的制剂的形式使用。当导入合适的宿主时，此类组合物能在宿主中诱导免疫反应。

该DNA或其衍生物可用于产生抗体。此处用的术语“抗体”包含多克隆和单克隆抗体，以及其片段，例如能结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)₂片段。

本发明的DNA和DNA衍生物可用于HPV感染的血清学鉴定和HPV筛选。该DNA、重组蛋白、VLP和抗体可适于HPV检测和血清学鉴定的试剂盒的制备。这样的试剂盒将包括至少一个适于紧密排列的容器的分隔的承载体(carrier)。该承载体可进一步包含例如HPV6a DNA，重组HPV蛋白或VLP或适于检测各种HPV型的抗HPV抗体等试剂。该承载体还可包含例如标记抗原或酶底物等检测用具。

该DNA和其衍生蛋白还可用作分子量和分子大小标准。

由于遗传密码的简并性，不止一种密码子可用于编码一个特定的氨基酸，并且因此，氨基酸序列可由一系列相似的DNA寡核苷酸中任一个编码。尽管在合适的条件下在有DNA寡核苷酸错配的存在还将与HPV6aDNA杂交，该系列中只有一个会与HPV6a序列一致。在可变的条件下，错配的DNA寡核苷酸仍可与HPV6a DNA杂交以允许对HPV编码DNA进行鉴定和分离。

本发明的纯化HPV6a DNA或其片段可用于分离和纯化其它来源的HPV6a的同源物和片段。为实现该目标，可在合适杂交条件下将第一个HPV6a DNA与含编码HPV6a同源物的样品混合。可分离该杂交DNA复合物并从其中纯化编码同源性DNA的DNA。

已知编码特定的氨基酸的各种密码子有大量的冗余性。因此，本发明还涉及那些含最终翻译相同氨基酸的替代密码子的DNA序列。为本说明书的目的，带有一种或多种替代密码子的序列定义为简并变异。在本发明的范围之内，还包括DNA序列突变或基本不改变表达蛋白最终的物理特性的翻译蛋白中的突变。例如，用缬氨酸替代亮氨酸、精氨酸代替赖氨酸，或天冬酰胺替代谷氨酰胺并不引起多肽的功能的改变。

已知可改变编码一种肽的DNA序列以用于编码具有与这些天然存在的肽不同的特征的肽。改变DNA序列的方法包括但不限于定点诱变。

本文所用HPV6a“功能性衍生物”是一种具有与HPV6a基本相同(或功能或结构)的生物活性的化合物，术语“功能性衍生物”意在包括HPV6a的“片段”，“变异体”，“简并变异体”，“类似物”和“同源物”或“化学衍生物”。术语“片段”意指HPV6a的任何多肽亚类。术语“变异体”意指在结构和功能上与整个HPV6a分子或其片段基本相同的分子。如果两个分子具有基本相同的结构或者如果两个分子具有相同的生物活性，该分子是与HPV6a“基本相同的”。因此，如果两个分子具有基本相同的活性，它们被认为是变异体，即使一个分子的结构在另一分子中没有发现或者即使两个氨基酸序列不一致。术语“功能性衍生物”不包括HPV6b。

术语“类似物”指在功能上与完整的HPV6a分子或其片段基本相同的分子。

各种方法可用于HPV6a DNA的分子克隆。这些方法包括但不限于在一个合适的表达载体系统中在含有HPV6a cDNA或基因组DNA的文库构建之后直接功能性表达HPV6a基因。另一种方法用设计自HPV6a氨基酸序列的标记寡核苷酸探针去筛选构建在噬菌体或质粒穿梭载体中的含HPV6a cDNA或基因组DNA的文库。另外一种方法是包括用编码HPV6a的部分DNA去筛选构建在噬菌体或质粒穿梭载体中的含HPV6a cDNA或基因组DNA的文库。该部分DNA是通过对纯化HPV6a氨基酸序列的简并寡核苷酸引物的设计由HPV6a DNA片段的特异的聚合酶链式反应(PCR)而获得的。另一个方法是从产生HPV6a的细胞中分离RNA并在体外或体内翻译系统中将RNA翻译成蛋白质。RNA翻译成肽或蛋白质将导致至少部分HPV6a蛋白的产生，HPV6a蛋白可由例如HPV6a蛋白的活性或与一种HPV6a抗体的免疫反应性所鉴定。在该方法中，可对分离自产HPV6a细胞的RNA的库分析编码至少一部分HPV6a的RNA的存在。可对RNA库进行进一步分级分离以从非HPV6a RNA中纯化HPV6a RNA。可对由这种方法产生的肽或蛋白进行分析以提供氨基酸序列接着可被用于提供产生HPV6a cDNA的引物，或者对用于翻译的RNA进行分析以提供编码HPV6a的核苷酸序列和产生筛选HPV6a cDNA文库的探针。这些方法是本领域已知的并可见例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.《分子克隆：实验操作指南》，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989。

很明显其它类型的文库，以及构自其它细胞或细胞类型的文库，可用于分离HPV6a编码DNA。其它类型的文库包括，但不限于含HPV6a型的衍生自其它细胞或细胞系的cDNA文库和基因组DNA文库。

可用各种技术制备cDNA文库。cDNA文库的构建技术可见例如上文，Sambrook，J.，等。很明显也可从合适的基因组DNA文库中分离HPV6a的DNA。可用各种技术构建基因组DNA文库。基因组DNA文库构建技术可见上文，Sambrook.J.等。

可将用本文介绍的方法获得的克隆HPV6a DNA或其片段分子克隆入含合适的启动子和其它合适的转录调节元件的表达载体中，并转入原核或真核宿主细胞中重组表达以产生重组的HPV6a。这类操作技术在上文，Sambrook，J.，等中有完整的描述，并且是本领域中已知的。

表达载体在本文中定义为在合适的宿主中克隆的基因拷贝的转录以及其mRNA的翻译所需的DNA序列。此类载体可用于在各种宿主如细菌、蓝绿藻、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和动物细胞中表达真核基因。特殊设计的载体可让DNA在宿主例如细菌-酵母或细菌-动物细胞或细菌-真菌细胞或细菌-无脊椎动物之间穿梭。一个构建合理的表达载体应该包含：在宿主细胞中的自我复制起点，选择标记，有限个数的限制酶切位点，高拷贝数的能力，和活性启动子。启动子定义为指导RNA聚合酶与DNA结合并启始RNA合成的DNA序列。强启动子是能高频率启始mRNA的启动子。表达载体包括但并不限于克隆载体，修饰克隆载体，特殊设计的质粒或病毒。

各种哺乳动物表达载体可用于在哺乳动物细胞中表达HPV6aDNA或其片段。商业上提供的适于重组HPV6a表达的哺乳动物表达载体包括但并不限于：pcDNA3(Invitrogen)，pMClneo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratagene)，EBO-pSV2-neo(ATCC37593)pBPV-1(8-2)(ATCC37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC37146)，pUCTag(ATCC37460)，和λZD35(ATCC37565)。

各种细菌表达载体可用于在细菌细胞中表达HPV6a DNA或其片段。商业上提供的可适用的细菌表达载体包括但并不限于：pET11a(Novagen)，λgt11(Invitrogen)，pcDNA II(InVitrogen)，pKK233-3(Pharmacia)。

各种真菌细胞表达载体可用于在真菌细胞中表达HPV6a或其片段。商业上提供的可适用的真菌细胞表达载体包括但不限于pYES2(Invitrogene)和Pichia表达载体(Invitrogen)。

各种昆虫细胞表达载体可用于在昆虫细胞中表达HPV6a DNA或其片段。商业供应的适用的昆虫细胞表达载体包括但并不限于pBlue BacIII(Invitrogen)。

一个含编码HPV6a或其片段的DNA的表达载体可用于在细胞，组织，器官或动物(包括人)中表达HPV6a蛋白或HPV6a蛋白片段。宿主细胞可以是原核或真核的，包括但并不限于细菌如大肠杆菌，真菌细胞如酵母，哺乳动物细胞包括但并不限于人、牛、猪、猴和啮齿动物来源的细胞系，以及昆虫细胞包括但不限于果蝇属和蚕来源的细胞系。来自哺乳动物种类的细胞系也可适用并可商业供应，包括但并不限于：L细胞L-M(TK-)(ATCC CCL1.3)，L细胞L-M(ATCC CCL1.2)，293(ATCC CRL1573)，Raji(ATCC CCL86)，CV-1(ATCC CCL70)，COS-1(ATCC CRL1650)，COS-7(ATCC CRL1651)，CHO-K1(ATCCCCL61)，3T3(ATCC CCL92)，NIH/3T3(ATCC CRL1658)，HeLa(ATCCCCL2)，C1271(ATCC CRL1616)，BS-C-1(ATCC CCL26)和MRC-5(ATCC CCL171)。

表达载体可通过数种技术中的任一导入宿主细胞中，包括但并不限于转化、转染、脂转染、原生质体融合、和电穿孔。含表达载体的细胞被克隆繁殖并独立分析以确定它们是否产生HPV6a蛋白。可用几种方法对HPV6a表达宿主细胞克隆进行鉴定，包括但并不限于抗HPV6a抗体的免疫反应性，和宿主细胞相关的HPV6a活性的存在，例如作为由HPV6a上HPV6a特异配体相互作用介导应答的HPV6a特异配体结合或信号转导。

也可应用体外产生的合成的mRNA或天然mRNA进行HPV DNA片段的表达。合成的mRNA或自产生HPV6a的细胞分离的mRNA可在各种无细胞体系中有效翻译，包括但并不限于小麦胚芽提取物和网状细胞提取物，以及可在以细胞为基础的系统中进行有效翻译，包括但不限于向蛙卵中进行显微注射，但优选对蛙卵的显微注射。

在于宿主细胞中表达HPV6a蛋白之后，可回收HPV6a蛋白以提供纯化形式的HPV6a。有几种HPV6a纯化方法并很适用。如本文所述，可用如下各种方法的组合或单独用从细胞裂解产物和提取物中对重组HPV6a蛋白进行纯化：盐析，离子交换层析，大小排阻层析，羟基磷灰石吸附层析和疏水相互作用层析。

另外，可用免疫亲和柱从其它细胞蛋白中分离出重组HPV6a，这柱子是用对全长的新生的HPV6a，或HPV6a多肽片段特异的单克隆或多克隆抗体制备的。可根据本领域已知的各种方法制备单克隆和多克隆抗体。本文所用单克隆或单特异性抗体定义为单一抗体种类或与HPV6a有同源性结合特征的多抗体种类。本文同源性结合指抗体与特定的抗原或表位结合的能力。

显而易见地产生单特异性抗体的方法可被用于产生对HPV6a多肽片段，或全长的新生HPV6a多肽特异的抗体。特别时，显而易见地可产生对完整功能的HPV6a或其片段特异的单特异性抗体。

本发明还涉及在体内调节编码HPV6a的DNA或RNA表达以及HPV6a蛋白功能的化合物的筛选方法。调节这类活性的化合物可以是DNA、RNA、肽、蛋白质，或非蛋白样有机分子。化合物可通过增强或减弱编码HPV6a的DNA或RNA的表达，或HPV6a蛋白的功能进行调节。可用各种测定方法对调节编码HPV6a的DNA或RNA表达或HPV6a蛋白的功能的化合物进行检测。该测定方法可以是确定是否有表达或功能变化的简单的“是/否”测定。该测定可通过将测试样品中的表达或功能与标准样品中的表达或功能水平进行比较而定量测定。

可制备含HPV6a DNA，HPV6a DNA片段，抗HPV6a DNA或HPV6a蛋白的抗体，HPV6a RNA或HPV6a蛋白的试剂盒。这样的试剂盒可用于检测与HPV6a DNA杂交的DNA或检测样品中HPV6a蛋白或肽片段的存在。此类特征可用于各种目的，包括但不限于法庭分析和流行病研究。

与HPV6a编码DNA序列互补的核苷酸中被合成用于反义疗法。这些反义分子可以是DNA，DNA的稳定衍生物如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，RNA，稳定的RNA衍生物如2′-O-烷基RNA，或其它HPV6a反义寡核苷酸类似物。HPV6a反义分子可通过显微注射，脂质体包被或携带反义序列的载体的表达而被导入细胞中。HPV6a反义疗法对减小HPV6a活性而复盖的疾病的治疗特别有用。

术语“化学衍生物”描述了含不是正常基本分子一部分的附加的化学部分的分子。这样的部分可增加基本分子的溶解性、半寿期、吸附性等。可选择地，该部分可减弱基本分子不需要的副作用或减少基本分子的毒性。此类部分的实例在各种教科书如Remington’s  PharmaceuticalScicences中有介绍。

根据本文公开的方法鉴定的化合物可以以通过常规测试确定的合适的剂量单独使用，以便获得对HPV6a或其活性的最佳抑制并使潜在的毒性最小化。另外，与其它药剂一起共同施用或顺序施用也是需要的。

最好是，本发明的化合物以每日的剂量一次施用或者每日的总的剂量被分成几次施用。而且，本发明的化合物可通过各种途径施用，包括但不限于鼻内、皮下、栓剂、口服等。

对不止一种活性药剂的组合治疗来说，其中的活性剂都是单独的药物制剂，活性药剂可同时施用或者它们可在不同的间隔时间上单独施用。

使用本发明的化合物的剂量制度根据各种因素选定，包括：病人的类型、种类、年龄、体重、性别和医疗条件；要治疗的疾病的严重性；施用路径；病人的肾脏和肝脏功能；及其所应用的特定的化合物。本领域的普通医师可很容易地确定和开出抑制，对抗或阻止该疾病发展药物的有效用量。达到能产生效果而无毒性的药物浓度范围的最佳精度需要一种基于药物对靶位点的有效性的动力学的施用制度。这包括对药物的分布、平衡和消除的考虑。

在本发明的方法中，本文所详细描述的化合物可做为活性组分，并且通常可与根据想要的施用方式而选定的合适的药用稀释剂、赋形剂或载体(本文通称为“载体”物质)一起混合施用；即根据口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆、栓剂、凝胶等而选定，并符合常规的药学实际。

例如，对片剂或胶囊形式的口服施用来说，活性药物成分可与一种口服的，非毒性的药学上可接受的惰性载体如乙醇、甘油、水等组合。而且，如果需要或必需，合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可被掺入到混合物中。合适的粘合剂包括但不限于：淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-半乳糖、玉米甜味剂(Sweeterners)，天然和合成树胶如阿拉伯胶、西黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。用于这些药剂形式的润滑剂包括但不限于：油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原增胶等。

对液体形式来说活性药物组合物可与合适的有香味的悬浮或分散剂如合成的和天然树胶如西黄蓍胶、阿拉伯胶、羧甲基纤维素等组合。其它可用的分散剂有甘油等。对非胃肠道施用，需要无菌悬浮液和溶液。当需要静脉内注射时，还应用了通常含有合适的防腐剂的等渗制剂。

含活性药物成分的局部制剂可与本领域熟知的各种载体混合，例如酒精、芦荟胶(aloe vera gel)、尿囊素、甘油、维生素A和E、油、矿物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等，以形成酒精溶液、局部清洁剂、清洁乳膏、皮肤凝胶、皮肤洗液和凝乳状香波乳膏或凝胶制剂。

本发明化合物还可以以脂质体运输系统的形式施用，例如小的单室颗粒，大的单室颗粒和多室颗粒。脂质体可从各种磷脂制得，例如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。

本发明的化合物还可通过使用将化合物分子和与之偶联的单克隆抗体作为独立的载体运送。本发明的化合物还可与可做为可靶向靶药物载体的可溶性聚合物偶联。该聚合物包括：聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或用棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。而且，本发明的化合物可与一类可用于药物的可控释放的生物上可降解的聚合物一起偶联，例如，聚乙酸、聚ε-己内酯、聚羟基丁酯、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚腈基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲的嵌段共聚物。

下面的实施例用于说明但不为了限制本发明。

实施例1

从组织活检中提取核酸

一个大的上外阴尖锐湿疣损伤得自一位25岁的产后女性病人。损伤的一部分被冻在液氮中，然后用Braun microdismembrator II(B.Braun Instrument melsungen，Germaary)处理。得到的物质溶于0.6％(w/v)十二烷基磺酸钠(SDS)中，用蛋白酶K(50μg/ml)处理，并用苯酚/氯仿/异戊醇抽提。DNA用乙醇沉淀并用紫外分光光度计测量。高分子量的DNA的确定是由琼脂糖凝胶电泳，接着用溴化乙锭染色。

实施例2

HPV DNA分型

HPV DNA的类型是用市售的Vira Type Plus(DigeneDiagnostics，Beltsville，MO)通过杂交捕获测定进行的。所用的HPV探针被分为两组(pool)，其组合物是以每一类型与生殖道恶性疾病的联系为基础。探针A组包含“低发”(“low-risk”)型HPV6、11、42、43和44而探针B组包含“高发”(“high-risk”)型16、18、31、33、35、45、51、52和56。总DNA用PstI、Bam HI和HindIII消化并在高严谨条件(Tm-15℃)做Southern印迹以确定HPV亚型。

实施例3

HPV6a基因组的克隆

从HPV6a阳性组织活检的样品提取的总DNA用Hind III核酸内切酶消化。接着通过0.8％低熔点琼脂糖制备凝胶进行大小分级分离，从凝胶上切下对应于8K碱基对(8kbp)DNA的区域并且用Gelose^TM酶(Epicentre Technologies，Inc.，Madison，WI)消化。该样品被与已用Hind III消化并脱磷酸化的pUC18(Pharmacia，Inc.，Piscataway，NJ)连接。接着转化大肠杆菌DH5细胞(Gibco，BRL，Gaitherburg，MD)，从质粒文库中筛选HPV6a阳性克隆，这是通过用与HPV6b L₁基因3′末端互补的反义³²P标记的寡核苷酸的克隆杂交进行的(5′-GAG AGATCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TAA C-3′；SEQ ID NO：1)。用限制性酶和Southern印迹分离和特征描述含8.1kbp HPV6a基因组的pUC18质粒。该质粒被命名为pUC18-HPV6a。质粒DNA是用Qiagen^TM质粒Maxi试剂盒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)制备的。

实施例4

pUC18-HPV6a的序列分析

为了确定完整的HPV6a序列，以发表的HPV6b序列为基础合成了测序引物。使用PRISM^TM试剂盒和Applied Biosystems(ABI)自动测序仪(#373A)根据生产商的说明(ABI，Inc.，Foster City，CA)以双脱氧链终止法对完整的8.1kpb HPV6a基因组的两条链进行了测序。在有义和反义序列不相匹配的情况下，合成了另外的HPV6a特异引物对有问题的区域从两个方向去再次测序以得到一致的结果。

图1示完整的HPV6a序列与发表的HPV6b序列的比较。HPV6a序列下所示的碱基对应于HPV6b序列。HPV6a和HPV6b中鉴定出229bp发生了改变。在LCR中发现了与HPV6b相比最明显地不同(nt7205～nt106)。除了HPV6a(LCR中几个单核苷酸(nt)的变化之外，还发现了在nt735094bp的插入和nt7804位19bp的插入。在nt7615位，从HPV6a基因组中删去了6个碱基对。

实施例5

与HPV6a相比HPV6a ORF的变异

确定了HPV6a序列中的开放阅读框以及主要的翻译成氨基酸序列的ORF并且分别与HPV6b序列进行了对比。

主要的壳体蛋白L₁是与HPV6b序列一致的唯一的ORF。在表1中总结了有氨基酸变化的所有其它的ORF。次要壳体蛋白L₂有5个氨基酸序列的变化；E₆和E₇各有一个氨基酸的变化。在E₁蛋白中6个氨基酸和在E₂蛋白中有11个氨基酸是不同的。在E₄蛋白中检测到了4个氨基酸的改变。E_5a ORF在4个位点，ORF E_5b在7个位点有改变。表1  与HPV6b相比HPV6a ORFs E₆、E₇、E₁、E₂、E₄、E₅和

 L₂的序列变异开放阅读框    位置(核苷酸)    位置(氨基酸)      氨基酸改变

 E6             252             50             His→Gln

 E7             792             88             Asp→Asn

 E1             1535，1536      235            Leu→Ala

                1670            280            Leu→Val

                1741            303            Glu→Asp

                2208            459            Thr→Ser

                2557            575            Asp→Glu

                2654            608            Thr→Ala

 E2             2802            27             His→Asp

                2974            94             Arg→Lvs

                3148            142            Asn→Thr

                3153            144            Thr→Ser

                3272            193            His→Gln

                3388            222            Leu→Pro

                3405            227            Lys→Gln

                3643            307            Arg→Lys

                3693            324            Ser→Pro

                3735            338            Asp→His

                3765            348            Asp→Asn

                3794            357            Ser→Arg

 E4             3272            6              Ile→Asn

                3388            60             Glv→Glu

                3461            69             Pro→His

                3552            99             Asp→Glu

 E5a            3935            16             Phe→Leu

                4004            40             Glu→Asp

                4137            84             Tyr→His

                4150            88             Thr→Asn

E5b     4235          25             Met→Val

        4297          45             Lys→Asn

        4314          51             Asn→Thr

        4323          54             Asp→Ala

        4343          61             Tyr→His

        4346，4347    62             Thr→Asp

        4353          64             Asp→Ala

L2      4646，4647    75             Gln→Gly

        4976          185            Val→Ile

        5021          200            Val→Ile

        5490          356            Gly→Asp

        5597          392            Leu→Ile

实施例6

将HPV6a cDNA亚克隆入表达载体中

编码HPV6a的cDNA被亚克隆入几个用于在转染的宿主细胞HPV6a蛋白的表达以及用于体外转录/转译的载体中。这些载体包括pBluescript II SK+(其中表达由T₇或T₃启动子驱动)pcDNA I/Amp(其中表达由肥大细胞病毒(CMV)启动子驱动)，pSZ9016-1(其中表达由HIV长末端重复(LTR)启动子驱动)和杆状病毒转移载体pVL1393(其中表达由多角蛋白(PH)启动子驱动)，以产生含HPV6a编码DNA序列的重组杆状病毒。

a)pBluescript II SK+：HPV6a

从限制性EcoRI消化的λ噬菌体回收全长HPV6a cDNA克隆并连接到CIP处理过的pBluescript II SK+的EcoRI切点上。回收不同的亚克隆，其中HPV6a的有义方向在T₇或T₃启动子之后。

b)pcDNA I/Amp：HPV6a

为了方便定向克隆，HPV6a被用EcoRV和XbaI从纯化的pBluescriptII SK+：HPV6a质粒制品中切下来，其中HPV6a DNA序列在T₇启动子的下游。得到的EcoRV，XbaI，HPV6a片段被纯化并连接到EcoRV，XbaI切割的CIP处理过的pcDNAI/Amp中，以使HPV6a编码DNA位于CMV启动子的下游。

c)pSZ9016-I：HPV6a

用限制性EcoRI消化将HPV6a从pBluescriptII SK+：HPV6a中切下来并接着从琼脂糖凝胶中纯化1.3kb的片段。得到的EcoRI HPV6a片段被连接到EcoRI切割，CIP处理过的pSZ9016-I中。选择HPV6a的有义方向在HIV LTR启动子下游的亚克隆。

d)pVL1393：HPV6a和pVL1393：T7HPV6a HA

HPV6a编码DNA向杆状病毒转移载体pVL1393中的定向克隆的介导是：用BamHI和XbaI从pcDNAI/Amp：HPV6a中切割下HPV6a然后得到1.3kb片段连接到产生pVL1393：HPV6a的BamHI，XbaI切割的，CIP处理的pVL1393中。同样地，HPV6a通过在HPV6a开放阅读框的5′氨基末端和3′羧基末端的FluHA表位构建一个T7标记(Tag)而被表位标记化。以这种方式修饰的HPV6a DNA被连接到pVL1393的BamHI/XbaI位点以产生pVL1393：T₇HPV6a HA。

实施例7

通过体外转录/翻译和转染入宿主细胞而对HPV6a多肽的表达

含HPV DNA序列的载体被用于驱动HPV6a多肽在兔网织细胞溶解物，哺乳动物宿主细胞，以及杆状病毒感染的昆虫细胞中的翻译。实验步骤基本上是生产商在说明书中所列出的。

a)体外转录/翻译

pBluescript III SK+：HPV6a质粒DNA(含T₇方向的HPV6a)被HPV6a插入下游的BamHI消化线性化。线性化的质粒被纯化并被做为模板用T₇RNA聚合酶在m7G(5′)ppp(5′)G的存在彻底(run-off)转录。用LiCl沉淀纯化得到的加帽的HPV6a转录体并被用于在L-〔³⁵S〕甲硫氨酸的存在下在核酸酶预处理的兔网织细胞裂解产物中驱动HPV6a的翻译。

b)在哺乳动物细胞中的表达

在用pcDNA I/Amp：HPV6a(在CMV启动子控制之下)或pSZ9016-1：HPV6a(在HIV LTR启动子控制之下)转染之后，HPV6a蛋白在哺乳动物宿主细胞中表达。在后者(pSZ9016-1：HPV6a)，细胞被TAT表达质粒pSZ9016-1：TAT共转染。对两个HPV6a表达质粒来说，COS-7细胞被DEAE-Dextran转染或用Lipofectamine(BRL)脂转染。

c)在昆虫细胞中的表达

含HPV6a的杆状病毒转移载体pVL1393：T7HPV6a HA被用于通过体内同源重组产生重组杆状病毒(Autographa Californica)。在用含HPV6a的重组杆状病毒感染之后，表位标记的HPV6a然后即被表达于悬浮培养的Sf9(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞中。

实施例8

影响HPV6a活性化合物可通过各种方法检测。鉴定影响HPV6a的化合物的方法包括：

(a)将测试化合物与含HPV6a的溶液形成混合物；

(b)测定混合物中HPV6a的活性；和

(c)将混合物中的HPV6a与标准进行比较。

影响HPV6a活性的化合物可配制成药用组合物。此类药用组合物可用于治疗以HPV6a感染为特征的疾病或病态。

实施例9

结构上与编码HPV6a的DNA相关的DNA被用探针检测。合适的探针可来自具有图1的全部或部分核苷酸序列的DNA，由具有图1的全部或部分核苷酸序列的DNA编码的RNA或来自图1的部分序列的简并的寡核苷酸。

                               序列表(1)一般信息：

(i)申请人：JANSEN，KATHRIN U.

           HOFMANN，KATHRYN J.

(ii)发明题目：编码6a型人乳头瘤病毒的DNA

(iii)序列数：2

(iv)通信地址：

   (A)收信人：CHRISTINE E.CARTY

   (B)街道：126E.LINCOLN AVENUE，P.O.BOX2000

   (C)城市：RAHWAY

   (D)州：NJ

   (E)国家：美国

   (F)邮区：07065-0907

(v)计算机可读形式：

   (A)介质类型：软盘

   (B)计算机：IBM PC兼容机

   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：PatertIn Release #1.0，Version #1.25

(vi)当前申请数据：

   (A)申请号：US08/310,468

   (B)提交日期：1994年9月22日

   (C)分类：

(viii)委托/代理人信息：

   (A)姓名：CARTY，CHRISTINE E.

   (B)登记号：36，099

   (C)参考/存档号：19307 PCT

(ix)电讯信息：

   (A)电话：(908)594-6734

   (B)传真：(908)594-4720(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：34个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单

   (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GAGAGATCTT  ACCTTTTAGT  TTTGGCGCGC  TTAC   34(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

   (A)长度：8010个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：单

   (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GTTAATAACA ATCTTGGTTT TAAAAAATAG GAGGGACCGA AAACGGTTCA ACCGAAAACG       60GTTGTATATA AACCAGCCCT AAAATTTAGC AAACGAGGCA TTATGGAAAG TGCAAATGCC      120TCCACGTCTG CAACGACCAT AGACCAGTTG TGCAAGACGT TTAATCTATC TATGCATACG      180TTGCAAATTA ATTGTGTGTT TTGCAAGAAT GCACTGACCA CTGCAGAGAT TTATTCATAT      240GCATATAAAC AGCTAAAGGT CCTGTTTCGA GGCGGCTATC CATATGCAGC CTGCGCGTGC      300TGCCTAGAAT TTCATGGAAA AATCAACCAA TATAGACACT TTGATTATGC TGGATATGCA      360ACAACTGTTG AAGAAGAAAC TAAACAAGAC ATTTTAGACG TGCTAATTCG GTGCTACCTG      420TGTCACAAAC CGCTGTGTGA AGTAGAAAAG GTAAAACATA TACTAACCAA GGCGCGGTTT      480ATAAAGCTAA ATTGTACGTG GAAGGGTCGC TGCCTACACT GCTGGACAAC ATGCATGGAA      540GACATGTTAC CCTAAAGGAT ATTGTATTAG ACCTGCAACC TCCAGACCCT GTAGGGTTAC      600ATTGCTATGA GCAATTAGTA GACAGCTCAG AAGATGAGGT GGACGAAGTG GACGGACAAG      660ATTCACAACC TTTAAAACAA CATTTCCAAA TAGTGACCTG TTGCTGTGGA TGTGACAGCA      720ACGTTCGACT GGTTGTGCAG TGTACAGAAA CAGACATCAG AGAAGTGCAA CAGCTTCTGT      780TGGGAACACT AGACATAGTG TGTCCCATCT GCGCACCGAA GACATAACAA CGATGGCGGA      840CGATTCAGGT ACAGAAAATG AGGGGTCTGG GTGTACAGGA TGGTTTATGG TAGAAGCTAT      900AGTGCAACAC CCAACAGGTA CACAAATATC AGACGATGAG GATGAGGAGG TGGAGGACAG      960TGGGTATGAC ATGGTGGACT TTATTGATGA CAGCAATATT ACACACAATT CCTTGGAAGC     1020ACAGGCATTG TTTAACAGGC AGGAGGCGGA CACCCATTAT GCGACTGTGC AGGACCTAAA     1080ACGAAAGTAT TTAGGTAGTC CATATGTTAG TCCTATAAAC ACTATAGCCG AGGCAGTGGA     1140AAGTGAAATA AGTCCACGAT TGGACGCCAT TAAACTTACA AGACAGCCAA AAAAGGTAAA     1200GCGACGGCTG TTTCAAACCA GGGAACTAAC GGACAGTGGA TATGGCTATT CTGAAGTGGA     1260AGCTGGAACG GGAACGCAGG TAGAGAAACA TGGCGTCCCG GAAAATGGGG GAGATGGTCA     1320GGAAAAGGAC ACAGGAAGGG ACATAGAGGG GGAGGAACAT ACAGAGGCGG AAGCGCCCAC     1380AAACAGTGTA CGGGAGCATG CAGGCACAGC AGGAATATTG GAATTGCTAA AATGTAAAGA     1440TTTACGGGCA GCATTACTTG GTAAGTTTAA AGAATGCTTT GGGCTGTCTT TTATTGATTT     1500AATTAGGCCA TTTAAAAGTG ATAAAACAAC ATGTGCAGAC TGGGTGGTAG CAGGATTTGG     1560TATACATCAT AGCATATCAG AGGCATTTCA AAAATTAATT GAGCCATTAA GTTTATATGC     1620ACATATACAA TGGCTAACAA ATGCATGGGG AATGGTATTG TTAGTATTAG TAAGATTTAA     1680AGTAAATAAA AGTAGAAGTA CCGTTGCACG TACACTTGCA ACGCTATTAA ATATACCTGA     1740CAATCAAATG TTAATAGAGC CACCAAAAAT ACAAAGTGGT GTTGCAGCCC TGTATTGGTT     1800TCGTACAGGT ATATCAAATG CCAGTACAGT TATAGGGGAA GCACCAGAAT GGATAACACG     1860CCAAACTGTT ATTGAACATG GGTTGGCAGA CAGTCAGTTT AAATTAACAG AAATGGTGCA     1920GTGGGCATAT GATAATGACA TATGCGAGGA GAGTGAAATT GCATTTGAAT ATGCACAAAG     1980GGGAGATTTT GATTCTAATG CACGAGCATT TTTAAATAGC AATATGCAGG CAAAATATGT     2040GAAAGATTGT GCAACTATGT GTAGACATTA TAAACATGCA GAAATGAGGA AGATGTCTAT     2100AAAACAATGG ATAAAACATA GGGGTTCTAA AATAGAAGGC ACAGGAAATT GGAAACCAAT     2160TGTACAATTC CTACGACATC AAAATATAGA ATTTATTCCA TTTTTAAGTA AATTTAAATT     2220ATGGCTGCAC GGTACGCCAA AAAAAAACTG CATAGCCATA GTAGGCCCTC CAGATACTGG     2280GAAATCGTAC TTTTGTATGA GTTTAATAAG CTTTTTAGGA GGTACAGTTA TTAGTCATGT     2340AAATTCCAGC AGCCATTTTT GGTTGCAACC GTTAGTAGAT GCTAAGGTAG CATTGTTAGA     2400TGATGCAACA CAGCCATGTT GGATATATAT GGATACATAT ATGAGAAATT TGTTAGATGG     2460TAATCCTATG AGTATTGACA GAAAGCATAA AGCATTGACA TTAATTAAAT GTCCACCTCT     2520GCTAGTAACG TCCAACATAG ATATTACTAA AGAAGAGAAA TATAAGTATT TACATACTAG     2580AGTAACAACA TTTACATTTC CAAATCCATT CCCTTTTGAC AGAAATGGGA ATGCAGTGTA     2640TGAACTGTCA AATGCAAACT GGAAATGTTT TTTTGAAAGA CTGTCGTCAA GCCTAGACAT     2700TCAGGATTCA GAGGACGAGG AAGATGGAAG CAATAGCCAA GCGTTTAGAT GCGTGCCAGG     2760AACAGTTGTT AGAACTTTAT GAAGAAAACA GTACTGACCT AAACAAACAT GTATTGCATT     2820GGAAATGCAT GAGACATGAA AGTGTATTAT TATATAAAGC AAAACAAATG GGCCTAAGCC     2880ACATAGGAAT GCAAGTAGTG CCACCATTAA AGGTGTCCGA AGCAAAAGGA CATAATGCCA     2940TTGAAATGCA AATGCATTTA GAATCATTAT TAAAGACTGA GTATAGTATG GAACCGTGGA     3000CATTACAAGA AACAAGTTAT GAAATGTGGC AAACACCACC TAAACGCTGT TTTAAAAAAC     3060GGGGCAAAAC TGTAGAAGTT AAATTTGATG GCTGTGCAAA CAATACAATG GATTATGTGG     3120TATGGACAGA TGTGTATGTG CAGGACACTG ACTCCTGGGT AAAGGTGCAT AGTATGGTAG     3180ATGCTAAGGG TATATATTAC ACATGTGGAC AATTTAAAAC ATATTATGTA AACTTTGTAA     3240AAGAGGCAGA AAAGTATGGG AGCACCAAAC AATGGGAAGT ATGTTATGGC AGCACAGTTA     3300TATGTTCTCC TGCATCTGTA TCTAGCACTA CACAAGAAGT ATCCATTCCT GAATCTACTA     3360CATACACCCC CGCACAGACC TCCACCCCTG TGTCCTCAAG CACCCAGGAA GACGCAGTGC     3420AAACGCCGCC TAGAAAACGA GCACGAGGAG TCCAACAGTC ACCTTGCAAC GCCTTGTGTG     3480TGGCCCACAT TGGACCCGTG GACAGTGGAA ACCACAACCT CATCACTAAC AATCACGACC     3540AGCACCAAAG AAGGAACAAC AGTAACAGTT CAGCTACGCC TATAGTGCAA TTTCAAGGTG     3600AATCTAATTG TTTAAAGTGT TTTAGATATA GGCTAAATGA CAAACACAGA CATTTATTTG     3660ATTTAATATC ATCAACGTGG CACTGGGCCT CCCCAAAGGC ACCACATAAA CATGCCATTG     3720TAACTGTAAC ATATCATAGT GAGGAACAAA GGCAACAGTT TTTAAATGTT GTAAAAATAC     3780CACCTACTAT TAGGCACAAA CTGGGGTTTA TGTCACTGCA CCTATTGTAA TTTGTATATA     3840TGTAAATGTG TAAATATATG GTATTGGTGT AATACAACTG TACATGTATG GAAGTGGTAC     3900CTGTACAAAT AGCTGCAGGA ACAACCAGCA CATTAATACT GCCTGTTATA ATTGCATTTG     3960TTGTATGTTT TGTTAGCATC ATACTTATTG TATGGATATC TGACTTTATT GTGTACACAT     4020CTGTGCTAGT ACTAACACTG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Claims (14)

1.编码6a型人乳头瘤病毒或其功能性衍生物的分离和纯化的DNA分子。

2.权利要求1的分离和纯化的DNA分子，它具有图1所示的核苷酸序列或其功能性衍生物。

3.用于在宿主中表达权利要求2的DNA分子的表达载体。

4.由权利要求1的DNA分子编码的基本纯化的蛋白质。

5.权利要求4的选自HPV6a L₂、HPV6a L₂、HPV6a E₁、HPV6a E₂、HPV6a E₄、HPV6a E_5a、HPV6a E_5b、HPV6a E₆和HPV6a E₇的蛋白或其功能性衍生物。

6.与选自权利要求1的DNA分子，与权利要求1的DNA分子互补的RNA或由权利要求1的DNA分子编码的蛋白质的化合物起免疫反应的单特异性(monospecific)抗体。

7.在宿主中表达6a型人乳头瘤病毒蛋白的方法，它包括：

(a)转移权利要求4的表达载体到合适的宿主中；和

(b)在可允许从表达载体中表达6a型人乳头瘤病毒蛋白的条件下培养步骤(a)的宿主。

8.鉴定可调节6a型人乳头瘤病毒活性的化合物的方法，它包括：

(a)将推测的6a型人乳头瘤病毒的活性的调节剂与权利要求1的DNA分子，与权利要求1的DNA分子互补的RNA或由权利要求1aDNA的DNA分子编码的蛋白质相组合；以及

(b)测定该调节剂对权利要求1的DNA分子，与权利要求1的DNA分子互补的RNA或由权利要求1的DNA分子编码的蛋白质的作用。

9.权利要求8方法中的活性化合物。

10.包含权利要求8方法中的活性化合物的药用组合物。

11.为有需要的病人治疗由6a型人乳头瘤病毒介导的疾病的方法，它包括向病人施用权利要求9的化合物。

12.在用该组合物治疗的病人中能诱导免疫反应的组合物，该组合物包含选自权利要求2的DNA分子，由权利要求1的DNA分子编码的肽，与权利要求1的DNA分子互补的RNA，或其组合的化合物。

13.预防或治疗人乳头瘤病毒感染的疫苗，该疫苗包含选自权利要求1的DNA分子，由权利要求1的DNA分子互补的RNA，或其组合的化合物

14.诱导针对由人乳头瘤病毒引起的感染或疾病的免疫反应的方法，它包括向动物中导入权利要求1的DNA分子，与权利要求1的DNA分子互补的RNA，由权利要求1的DNA分子编码的蛋白质，或其组合。

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