EA045015B1 - Усовершенствованные вакцины против вируса папилломы человека и способы их применения - Google Patents
Усовершенствованные вакцины против вируса папилломы человека и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA045015B1 EA045015B1 EA201992282 EA045015B1 EA 045015 B1 EA045015 B1 EA 045015B1 EA 201992282 EA201992282 EA 201992282 EA 045015 B1 EA045015 B1 EA 045015B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- hpv
- fragment
- nucleic acid
- homologous
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title description 245
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 53
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 305
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 252
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 251
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 136
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 104
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 73
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 73
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 73
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 35
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 209
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 178
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 130
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 94
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 72
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 72
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 67
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 60
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 53
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 50
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 31
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 28
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 28
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 28
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 26
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 26
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 22
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 12
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 12
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 12
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 12
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 9
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 9
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 8
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 8
- -1 TNFe Proteins 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 6
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 4
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 4
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 4
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100021942 C-C motif chemokine 28 Human genes 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000679903 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Proteins 0.000 description 3
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 3
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 239000012117 Alexa Fluor 700 Substances 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 2
- 102100021936 C-C motif chemokine 27 Human genes 0.000 description 2
- 101710112538 C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 description 2
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 2
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 101150071673 E6 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 2
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 101710111275 Non-structural 3 Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101150056647 TNFRSF4 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010026404 VGX-3100 Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 208000001307 recurrent respiratory papillomatosis Diseases 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100030346 Antigen peptide transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030343 Antigen peptide transporter 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010060999 Benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021933 C-C motif chemokine 25 Human genes 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 101710088341 Dermatopontin Proteins 0.000 description 1
- 101100347633 Drosophila melanogaster Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 1
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710130332 ETS domain-containing protein Elk-4 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000991061 Homo sapiens MHC class I polypeptide-related sequence B Proteins 0.000 description 1
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 101100100117 Homo sapiens TNFRSF10B gene Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 description 1
- 101000610609 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Proteins 0.000 description 1
- 101000679921 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701830 Human papillomavirus type 31 Species 0.000 description 1
- 241000701826 Human papillomavirus type 33 Species 0.000 description 1
- 241000701824 Human papillomavirus type 39 Species 0.000 description 1
- 241000701790 Human papillomavirus type 45 Species 0.000 description 1
- 241000701603 Human papillomavirus type 52 Species 0.000 description 1
- 241000701784 Human papillomavirus type 58 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 1
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 1
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710148794 Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100036342 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710199015 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 description 1
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000019145 JUN kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150069255 KLRC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074862 KLRC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150018199 KLRC4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030301 MHC class I polypeptide-related sequence A Human genes 0.000 description 1
- 102100030300 MHC class I polypeptide-related sequence B Human genes 0.000 description 1
- 101100404845 Macaca mulatta NKG2A gene Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 108010060408 Member 25 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101100372761 Mus musculus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 1
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 1
- 102100022682 NKG2-A/NKG2-B type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100022701 NKG2-E type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102100022700 NKG2-F type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 101150044441 PECAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028688 Putative glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 101001043830 Rattus norvegicus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100046535 Rattus norvegicus Tnf gene Proteins 0.000 description 1
- 101710138742 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase H Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102400000830 Saposin-B Human genes 0.000 description 1
- 208000032124 Squamous Intraepithelial Lesions Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101800000849 Tachykinin-associated peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010044002 Tonsil cancer Diseases 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 1
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 1
- 102100022205 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 229940032099 VGX3100 Drugs 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229940021704 adenovirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 1
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 1
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 201000005264 laryngeal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 108010012704 sulfated glycoprotein p50 Proteins 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 208000025093 tonsil carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к усовершенствованным вакцинам против вируса папилломы человека (ВПЧ), усовершенствованным способам стимуляции иммунного ответа и профилактической и/или терапевтической иммунизации индивидуумов против ВПЧ.
Уровень техники
Вирусы папилломы - это маленькие ДНК-вирусы, содержащие семь ранних генов и два поздних гена. Обычно ранние гены вируса папилломы обозначаются как Е1-Е7, а поздние гены - как L1 и L2. Некоторые виды животных могут инфицироваться представителями семейства вирусов папилломы.
Инфекция вирусом папилломы человека (ВПЧ) широко распространена и может передаваться половым путем. На основании гомологичных последовательностей ДНК различают 56 или более типов ВПЧ. ВПЧ 16 и 18 типов, вызывающие эпителиальную дисплазию и другие поражения, часто связаны с повышенным риском рака, особенно in situ и инвазивных карцином шейки матки, влагалища, вульвы и анального прохода. Примерно 88% случаев рака шейка матки по всему миру являются результатом подтипов ВПЧ 16, 18, 45, 31, 33, 52 и 58. Кроме того, различные исследования выявили присутствие ВПЧ 6 и ВПЧ 11 в большинстве случаев возникновения рецидивирующего респираторного папилломатоза. Однако будучи известными за свою взаимосвязь с остроконечными кондиломами и находясь только в небольшом проценте в случаях с раком шейки матки, ВПЧ 6 и ВПЧ 11 было выявлено в 2,6-5,2% всех случаев низкодифференцированных поражений шейки матки. Кроме того, была показана взаимосвязь ВПЧ 6 и ВПЧ 11 примерно с 20% низкодифференцированных сквамозных интраэпителиальных поражений, которые сейчас считают предшественниками рака шейки матки, включая интраэпителиальную неоплазию шейки 2 и 3 степени и цервикальную дисплазию легкой степени тяжести. Умножающиеся исследования выявили взаимосвязь двух серотипов с различными формами отоларингологических заболеваний, включая остроконечные кондиломы, рецидивирующий респираторный папилломатоз, карциному легких, тонзиллярную карциному, ларингеальную карциному и другие злокачественные трансформации других доброкачественных новообразований и дисплазию головы и шеи. Результаты данного исследования пролили свет и предоставили возможность использования вакцин консенсусной последовательности ДНК против ВПЧ 6 и ВПЧ 11.
ДНК-вакцины обладают многими концептуальными преимуществами перед более традиционными способами вакцинации, такими как живые аттенуированные вирусы и рекомбинантные вакцины на основе белка. ДНК-вакцины безопасны, стабильны, легко производятся и хорошо переносились людьми при доклинических исследованиях, выявивших мало доказательств плазмидной интеграции [Martin, Т., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. Кроме того, ДНК-вакцины хорошо подходят для повторных введений благодаря тому, что эффективность вакцины не зависит от титров предсуществующих антител к вектору [Chattergoon, M., J. Boyer, и D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. Однако одним из основных препятствий для клинического выбора ДНК-вакцин остается снижение платформы иммуногенности при переходе к более крупным животным [Liu, М.А. и J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 2540]. Последние технологические достижения в разработке иммуногенных ДНК-вакцин, такие как оптимизация кодонов, РНК-оптимизация и добавление лидерных последовательностей иммуноглобулина усиливают экспрессию и иммуногенность ДНК-вакцин [Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J. Virol., 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml, L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J. Virol., 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis С virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], а также недавно разработанная технология системы доставки плазмид, такая как электропорация [Hirao, L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J. Virol., 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis С virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J. Immunol., 2007. 179(7): p. 4741-53]. Кроме того, исследования подтверждают, что использование консенсусных иммуногенов может обладать способностью увеличивать распространенность клеточного иммунного ответа по сравнению с естественными антигенами. [Yan., J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype В consensus-based envelope DNA vaccine. Mol. Ther., 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J. Virol., 2007. 81(16): p. 8507-14].
Следовательно, остается потребность в усовершенствованных вакцинах и способах предотвраще- 1 045015 ния и лечения инфекции ВПЧ, в частности инфекций, ведущих к раку шейки матки и/или карциномам легкого, миндалин и гортани.
Сущность изобретения
В аспектах изобретения предлагаются композиции, содержащие по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, которая содержит гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, выбранный из группы, состоящей из ВПЧ 6, ВПЧ 11, ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33, ВПЧ 39, ВПЧ 45, ВПЧ 52 и ВПЧ 58.
В другом аспекте изобретения предлагаются композиции, содержащие одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, которые выбраны из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, не содержат на 5'-конце лидерной последовательности, которая представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 10.
В другом аспекте изобретения предлагаются композиции, содержащие одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, которые выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 19; по меньшей мере по меньшей мере по меньшей мере
SEQ ID NO: 21; SEQ ID на 95% гомологичной SEQ на 95% гомологичной SEQ на 95% гомологичной SEQ
NO: 23;
ID
ID
ID
NO
NO
NO
1;
3;
5;
последовательности последовательности последовательности последовательности нуклеиновой нуклеиновой нуклеиновой нуклеиновой кислоты, кислоты, кислоты, кислоты,
- 2 045015 по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 7; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 17; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 19; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 21; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 23; фрагмента SEQ ID NO: 1; фрагмента
SEQ ID NO: 3; фрагмента SEQ ID NO: 5; фрагмента SEQ ID NO: 7; фрагмента SEQ ID NO: 17; фрагмента SEQ ID NO: 19; фрагмента SEQ ID NO: 21; фрагмента SEQ ID NO: 23; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 5; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 7; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 17; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 19; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 21; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, не содержат на 5'-конце лидерной последовательности, представляющей собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 9.
Предложенные нуклеотидные последовательности могут представлять собой плазмиду.
В дополнительных аспектах изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие раскрытые нуклеотидные последовательности; предпочтительно с несколькими антигенами.
В некоторых аспектах изобретения присутствуют способы стимуляции у индивидуума эффективного иммунного ответа более чем против одного подтипа ВПЧ, включающие введение указанному индивидууму композиции, содержащей одну или несколько предложенных последовательностей нуклеотидов; предпочтительно, композиции содержат более чем один антиген. Способы предпочтительно включают стадию введения предложенных нуклеотидных последовательностей индивидууму электропорацией.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 представляет собой филогенетическое дерево на основе оценки способа ближайшего связывания выравниваний Е6 и Е7 (A и В соответственно). Звездочки указывают на расположение консенсусных последовательностей на каждом дереве.
Фиг. 2 иллюстрирует экспрессию р6Е6Е7 и p11E6E7 in vivo. Генные продукты были выделены из лизированных трансфицированных 293-Т клеток, пропущены через гель SDS-PAGE и определены с использованием ауторадиографии. Оба белка ВПЧ 6 и ВПЧ 11 Е6/Е7 являются примерно 32 кДа каждый (А). Клетки рабдомиосаркомы человека (RD) также были трансфицированы р6Е6Е7 и р11Е6Е7 и затем фиксированы после иммунофлуоресцентного окрашивания. Флуоресценция ФИТЦ подтверждает экспрессию р6Е6Е7 и р11Е6Е7 (В). Флуоресценция ДАПИ подтверждает локализацию ядра как следствие окрашивания по Хехсту.
Фиг. 3. Анализы способом иммуноферментных пятен с ИФН-γ показали индукцию устойчивых клеточно-опосредованных ответов относительно р6Е6Е7 (А) и р11Е6Е7 (В) у мышей C57BL/6. Анализы проводили с использованием спленоцитов, выделенных у мышей в каждой соответствующей группе (5 мышей на группу) после трехразовой двухнедельной иммунизации. Каждая иммунизация состояла из 20 мкг на модель. Мыши в комбинированной группе принимали как р6Е6Е7, так и р11Е6Е7 в дозе 20 мкг на модель, в целом 40 мкг ДНК для иммунизации. ДНК вводили посредством в/м инъекции, затем проводили электропорацию (* обозначает р<0,0001; t обозначает р=0,0001).
Фиг. 4. Дополнительные анализы способом иммуноферментных пятен с ИФН-γ проводили с использованием отдельных пептидов для характеристики доминантных эпитопов. Спленоциты, выделенные у вакцинированных мышей и отрицательного контроля, были стимулированы перекрывающимися пептидами, которые перекрывали весь белок слияния ВПЧ 6 Е6/Е7 (А) или белок слияния ВПЧ 11 Е6/Е7 (В).
Фиг. 5. Выработка цитокинов антигенспецифическими Т-клетками, охарактеризованная окрашиванием внутриклеточных цитокинов. Спленоциты, выделенные у мышей, вакцинированных р6Е6Е7 (А) и р11Е6Е7 (В), были стимулированы средой роста R10, РМА или консенсусными генными пептидами в течение 4 ч перед воздействием поверхностного маркера и внутриклеточным окрашиванием. Представленные выше точечные диаграммы отображают различия в процентах при вычитании из исходного значения для общих клеток CD4+ или CD8+ клеток, вырабатывающих ИФН-γ, ИЛ-2 и ФНО-α. Р-значения для графиков со звездочками были неспособны определить по причине того, что среднее в отрицательной контрольной группе было нулем.
Фиг. 6. Иллюстрирует аминокислотную последовательность для ВПЧ 31 Е6/Е7 (SEQ ID NO: 18), аннотированного таким образом, чтобы показать лидерную последовательность IgE (IgEL), сайт эндопротеолитического расщепления и сайты, где домены Е6 и Е7 мутировали таким образом, чтобы увеличить экспрессию и иммуногенность.
- 3 045015
Фиг. 7. Иллюстрирует аминокислотную последовательность для ВПЧ 52 Е6/Е7 (SEQ ID NO: 20), аннотированного таким образом, чтобы показать лидерную последовательность IgE (IgEL), сайт эндопротеолитического расщепления и сайты, где домены Е6 и Е7 мутировали таким образом, чтобы увеличить экспрессию и иммуногенность.
Подробное описание предпочтительных вариантов реализации изобретения
Определения.
Терминология, применяемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов реализации изобретения, но не для ограничения. В описании и приложенной формуле изобретения слова в единственном числе означают также и множественное число, если из контекста очевидно не следует иное.
При указании числовых диапазонов в данном документе каждое промежуточное число в них явно включено с такой же степенью точности. Например, для диапазона 6-9 числа 7 и 8 охватываются в дополнение к 6 и 9, и для диапазона 6,0-7,0 явно включены числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.
(a) Адъювант.
Адъювант, как применяется в данном документе, может обозначать любую молекулу, добавленную к вакцинам ДНК плазмиды, раскрытым в данном документе, с целью увеличения антигенности одного или нескольких антигенов, кодируемых ДНК плазмидами и кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот, раскрытыми в дальнейшем.
(b) Антитело.
Антитело может обозначать антитело классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или его фрагменты, фрагменты или производные, в том числе Fab, F(ab')2, Fd и одноцепочечные антитела, диатела, антитела с двойной специфичностью, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может быть антителом, выделенным из образца сыворотки млекопитающего, поликлональным антителом, очищенным аффинностью антителом или их смесями, которые демонстрируют достаточную специфичность связывания с целевым эпитопом или полученной из него последовательностью.
(c) Антиген.
Антиген обозначает белки, содержащие домен ВПЧ Е6 или ВПЧ Е7, и предпочтительно слияние Е6 и Е7 с сайтом эндеопротеолитического расщепления между ними. Антигены включают SEQ ID NO: 2 (подтип 6), 4 (подтип 11), 6 (подтип 33), 8 (подтип 58), 18 (подтип 31), 20 (подтип 52), 22 (подтип 16) и 24 (подтип 18); их фрагменты указанной в данном документе длины, варианты, т.е. белки с последовательностями, гомологичными SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 18, 20, 22 и 24, определенными в данном документе, фрагменты вариантов с длиной, указанной в данном документе, и их комбинации. Антигены могут содержать лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 или, в альтернативном варианте, такая последовательность может быть удалена с N-конца. Антигены необязательно могут содержать сигнальные пептиды, такие как пептиды из других белков.
(d) Кодирующая последовательность.
Кодирующая последовательность или кодирующая нуклеиновая кислота, как применяется в данном документе, может обозначать нуклеиновую кислоту (молекулу РНК или ДНК), которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, как определено в разделе (c) выше. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, в том числе промотор и сигнал полиаденилирования, способный направлять экспрессию в клетках индивидуума или млекопитающего, которому введена нуклеиновая кислота. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать последовательности, которые кодируют сигнальные пептиды, например, лидерную последовательность IgE, такую как SEQ ID NO: 9.
(e) . Комплемент.
Комплемент или комплементарный в данном описании может означать, что нуклеиновая кислота может содержать спаривание оснований по Уотсону-Крику (например, A-T/U и C-G) или Хугстену между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами в молекулах нуклеиновой кислоты.
(f) Фрагмент.
Фрагмент может обозначать полипептидный фрагмент антигена, который способен индуцировать у млекопитающего иммунный ответ против антигена. Фрагмент антигена может быть на 100% идентичным полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более,
75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более,
93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более,
99% или более процентов длины конкретного полноразмерного антигена, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может включать фрагмент полипептида, который является на 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более гомологичным антигену и дополнительно содержит N-концевой метионин или гетерологичный сиг- 4 045015 нальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Фрагменты могут дополнительно содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту антигена.
Фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует антиген, может быть на 100% идентичным полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать
60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более,
90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более,
96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины конкретной полноразмерной кодирующей последовательности, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более или 99% или более гомологичным антигену, и необязательно дополнительно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Фрагменты могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту кодирующей последовательности.
(g) Идентичный.
Идентичный или идентичность, как применяется в данном описании, в контексте двух или более нуклеиновых кислот или последовательностей полипептида может означать, что последовательности содержат указанный процент остатков, которые являются одинаковыми в рамках указанного участка. Процент можно вычислить путем оптимального выравнивая двух последовательностей, сравнивая две последовательности в пределах указанного участка с определением количества положений, в которых идентичный остаток встречается в обеих последовательностях, с получением количества совпадающих положений, с делением количества совпадающих положений на общее количество положений в указанном участке и умножением результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. В случаях, где длина двух последовательностей является различной или выравнивание дает один или несколько ступенчатых концов и указанный участок сравнения содержит только одну последовательность, остатки одной последовательности включают в знаменатель, но не в числитель уравнения. При сравнении ДНК и РНК тимин (Т) и урацил (U) могут считаться эквивалентами. Идентичность может быть определена вручную или с применением компьютерного алгоритма для последовательностей, такого как BLAST или BLAST 2.0.
(h) Иммунный ответ.
Иммунный ответ в данном описании может обозначать активацию иммунной системы хозяина, например млекопитающего, в ответ на введение одного или нескольких антигенов с помощью предложенных вакцин ДНК плазмиды. Иммунный ответ может существовать в форме клеточной или гуморальной реакции или обеих.
(i) Нуклеиновая кислота.
Нуклеиновая кислота, или олигонуклеотид, или полинуклеотид в данном описании может обозначать по меньшей мере два нуклеотида, соединенные вместе ковалентной связью. Дополнительно, изображение одноцепочечной нити определяет последовательность комплементарной нити. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает комплементарную нить изображенной одноцепочечной нити. Множество вариантов нуклеиновой кислоты может применяться для той же цели, что и указанная нуклеиновая кислота. Поэтому нуклеиновая кислота дополнительно включает в существенной мере идентичные нуклеиновые кислоты и комплементарные к ним. Одноцепочечная нить предлагает зонд, который может гибридизоваться с последовательностью-мишенью в условиях строгой гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в условиях строгой гибридизации.
Нуклеиновые кислоты могут быть однонитевыми или двухнитевыми или могут содержать части как двухнитевой, так и однонитевой последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, как геномную, так и кДНК, РНК или гибрид, где нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов, а также комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены способами химического синтеза или рекомбинантными способами.
(j) Функционально связанный.
Функционально связанный в данном описании может означать, что экспрессия гена осуществляется под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может располагаться в направлении 5' (выше) или 3' (ниже) гена, который он контролирует. Расстояние между промотором и
- 5 045015 геном может быть приблизительно таким же, как расстояние между таким промотором и геном, который он контролирует, в том гене, из которого получен промотор. Как известно из уровня техники, вариация указанного расстояния может быть применена без потери функции промотора.
(k) Промотор.
Промотор в данном описании может обозначать синтетическую молекулу или молекулу природного происхождения, которая способна обеспечивать, активировать или увеличивать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или несколько специфических транскрипционных регуляторных последовательностей с целью дополнительного увеличения экспрессии и/или модификации экспрессии в пространстве и/или времени. Кроме того, промотор может содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промотор может происходить из источников, которые включают вирусные, бактериальные, грибковые, растения насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально относительно клетки, ткани или органа, в котором происходит экспрессия, или относительно стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние стимулы, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металла или индуцирующие агенты. Характерные примеры промоторов включают промотор Т7 бактериофага, промотор Т3 бактериофага, промотор SP6, оператор-промотор lac, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE.
(l) Строгие условия гибридизации.
Строгие условия гибридизации в данном описании могут обозначать условия, в которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) гибридизуется со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), например, в сложной смеси нуклеиновых кислот. Строгие условия зависят от последовательности и будут различными в различных обстоятельствах. Строгие условия могут быть выбраны таким образом, чтобы температура была ниже около на 5-10°С, чем температура плавления (Тпл) для конкретной последовательности при определенной ионной силе рН. Тпл может представлять собой температуру (при определенной ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных к мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в равновесии (поскольку последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Тпл 50% зондов заняты в равновесии). Строгими условиями могут быть такие, при которых концентрация соли составляет менее около 1,0 М иона натрия, такие как концентрация иона натрия (или других солей) около 0,01-1,0 М при рН 7,0-8,3 и температура, составляющая по меньшей мере 30°С для коротких зондов (например, около 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для длинных зондов (например, более около 50 нуклеотидов). Дополнительно, строгие условия могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал может превышать по меньшей мере в 2-10 раз фон гибридизации. Примеры строгих условий гибридизации включают следующее: 50% формамида, 5х стандартный солевой раствор и 1% натрия додецилсульфата (НДС), инкубация при 42°С, или 5х стандартный солевой раствор, 1% НДС, инкубация при 65°С, с промыванием в 0,2х стандартный солевой раствор и 0,1% НДС при 665°С.
(m) В существенной мере комплементарный.
В существенной мере комплементарный в данном описании может означать, что первая последовательность является по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной комплементарной цепи второй последовательности в пределах участка длиной 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеотидов или аминокислот или что две последовательности гибридизуются в строгих условиях гибридизации.
(n) В существенной мере идентичный.
В существенной мере идентичный в данном описании может означать, что первая и вторая последовательности являются по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными в пределах участка длиной 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеотидов или аминокислот, или в отношении нуклеиновых кислот, если первая последовательность является в существенной мере комплементарной по отношению к комплементарной цепи второй последовательности.
(о) Вариант.
Вариант, применяемый в данном описании к нуклеиновой кислоте, может обозначать (i) часть или фрагмент контрольной нуклеотидной последовательности; (ii) комплементарную цепь контрольной нуклеотидной последовательности или ее часть; (iii) нуклеиновую кислоту, которая в существенной мере идентична контрольной нуклеиновой кислоте или ее комплементарной цепи; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в строгих условиях с контрольной нуклеиновой кислотой, ее комплементарной цепью, или последовательности, в существенной мере им идентичные.
Вариант в отношении пептида или полипептида, аминокислотная последовательность которая от- 6 045015 личается вставкой, делецией или консервативной заменой аминокислот, но сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Дополнительно, вариант может обозначать белок с аминокислотной последовательностью, которая является в существенной мере идентичной контрольному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере один вид биологической активности. Консервативная замена аминокислоты, т.е. замена аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных участков), признана в данной области техники как обычно влекущая за собой незначительное изменение. Такие незначительные изменения могут быть идентифицированы, частично, путем рассмотрения индекса гидрофобности аминокислот, как известно из уровня техники. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на рассмотрении ее гидрофобности и заряда. Из уровня техники известно, что аминокислоты со сходными индексами гидрофобности могут быть заменены, и все еще сохраняют функцию белка. В одном аспекте изобретения аминокислоты с индексами гидрофобности ±2 заменяемы. Кроме того, гидрофильность аминокислот может применяться для выявления замен, которые будут приводить к белкам, сохраняющим биологическую функцию. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет вычисление наибольшей локальной средней величины гидрофильности указанного пептида, пригодного показателя, который, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4554101, включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Замена аминокислот со сходными значениями гидрофильности может приводить к пептидам, сохраняющим биологическую активность, например иммуногенность, как известно из уровня техники. Замены могут быть произведены для аминокислот со значениями гидрофильности в пределах ±2 друг относительно друга. Как на индекс гидрофобности, так и на значение гидрофильности аминокислот влияет конкретная боковая цепь такой аминокислоты. В соответствии с таким наблюдением понятно, что замены аминокислот, которые совместимы с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот, и особенно боковых цепей таких аминокислот, на что указывает гидрофобность, гидрофильность, заряд, размер и другие свойства.
(р) Вектор.
Вектор, применяемый в данном описании, может обозначать последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектор может быть плазмидой, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или искусственной хромосомой дрожжей. Вектор может быть ДНК или РНК вектором. Вектор может быть либо самореплицирующимся экстрахромосомным вектором, либо вектором, который интегрирован в геном хозяина.
Раскрытые усовершенствованные вакцины основаны на мультифазной стратегии для усиления клеточных иммунных ответов, вызванных иммуногенами. Были разработаны модифицированные консенсусные последовательности. Также раскрыты генетические варианты воплощения, включающие кодонную оптимизацию, РНК-оптимизацию и добавление высокоэффективной лидерной последовательности иммуноглобина. Новая конструкция разработана для вызова более сильного и обширного клеточного иммунного ответа, чем соответствующие кодон-оптимизированные иммуногены.
Усовершенствованные ВПЧ вакцины основаны на белках и генетических конструкциях, которые кодируют белки с эпитопами, делающими их особенно эффективными в качестве иммуногенов, против которых может быть вызван анти-ВПЧ. Соответственно, вакцины могут стимулировать терапевтический или профилактический иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации изобретения средствами, доставляющими иммуногены, являются ДНК-вакцина, рекомбинантная вакцина, белковая субъединичная вакцина, композиция, содержащая иммуноген, аттенуированная вакцина или инактивированная вакцина. В некоторых вариантах реализации изобретения вакцина содержит комбинацию, выделенную из групп, состоящих из одной или нескольких ДНК-вакцин, одной или нескольких рекомбинантных вакцин, одной или нескольких белковых субъединичных вакцин, одной или нескольких композиций, содержащих иммуноген, одной или нескольких аттенуированных вакцин и одной или нескольких инактивированных вакцин.
В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения вакцина, доставляемая индивидууму, модулирует активность иммунной системы индивидуума и тем самым усиливает иммунный ответ против ВПЧ. Когда молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок, попадает в клетки индивидуума, в клетках экспрессируется нуклеотидная последовательность и таким образом к индивидууму доставляется белок. Предоставляются способы доставки последовательности, кодирующей белок, в молекулу нуклеиновой кислоты, такую как плазмида, как часть рекомбинантной вакцины и как часть аттенуированной вакцины, как выделенные белки или белки, входящие в вектор.
Предоставляются композиции и способы, которые профилактически и/или терапевтически иммунизируют индивидуума против ВПЧ.
Композиции для доставки молекул нуклеиновых кислот, которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует иммуноген, функционально связаны с регуляторными элементами. Композиции могут содержать плазмиду, которая кодирует иммуноген, рекомбинантную вакцину, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует иммуноген, живой аттенуированный патоген,
- 7 045015 который кодирует белок по изобретению и/или содержит белок по изобретению; инактивированный патоген, содержащий белок по изобретению, или композицию, такую как липосома или субъединичная вакцина, которая содержит белок по изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к инъекцируемым фармацевтическим композициям, которые содержат композиции по изобретению.
В аспектах изобретения предлагаются композиции, содержащие по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, содержащую гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, выбранный из группы, состоящей из ВПЧ 6, ВПЧ 11, ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33, ВПЧ 39, ВПЧ 45, ВПЧ 52 и ВПЧ 58. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции могут содержать ВПЧ 6, ВПЧ 11, ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33, ВПЧ 52 и ВПЧ 58. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции могут содержать ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33, ВПЧ 52 и ВПЧ 58. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции могут содержать ВПЧ 6, ВПЧ 11, ВПЧ 16 и ВПЧ 18. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции могут содержать ВПЧ 16, ВПЧ 31 и ВПЧ 52.
В другом аспекте изобретения предлагаются композиции, содержащие одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, выбранный из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 25; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 26.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, выбранные из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; нуклеотидной последова- 8 045015 тельности, кодирующей SEQ ID NO: 6; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, выбранные из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 6; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 8; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24.
- 9 045015
В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, выбранные из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 2; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 4; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, выбранные из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; фрагмента нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 18; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 20; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 22.
В другом аспекте изобретения предлагаются композиции, содержащие одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих гибридный антиген ВПЧ Е6-Е7, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 5; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 7; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 17; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 19; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 21; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 23; фрагмента SEQ ID NO: 1; фрагмента SEQ ID NO: 3; фрагмента
SEQ ID NO: 5; фрагмента SEQ ID NO: 7; фрагмента SEQ ID NO: 17; фрагмента SEQ ID NO: 19; фрагмента SEQ ID NO: 21; фрагмента SEQ ID NO: 23; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 5; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 7; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 17; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 19; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 21; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 17; SEQ ID nO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 5; последовательности нуклеиновой кислоты,
- 10 045015 по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 7; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 17; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 19; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 21; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 23; фрагмента SEQ ID NO: 5; фрагмента SEQ ID NO: 7; фрагмента SEQ ID NO: 17; фрагмента SEQ ID nO: 19; фрагмента SEQ ID NO: 21; фрагмента SEQ ID NO: 23; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 5; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 7; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 17; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 19; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 21; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной
SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной
SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной
SEQ ID NO: 21; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной
SEQ ID NO: 23; фрагмента SEQ ID NO: 1; фрагмента SEQ ID NO: 3; фрагмента SEQ ID NO: 21; фрагмента SEQ ID NO: 23; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 1; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 3; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 21; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 17;
последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 19;
последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной SEQ ID NO: 21;
фрагмента SEQ ID NO: 17; фрагмента SEQ ID NO: 19; фрагмента SEQ ID NO: 21; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 17; последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 19; и последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 95% гомологичной фрагменту SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидные последовательности, раскрытые в данном документе, не содержат лидерной последовательности. Нуклеотидные последовательности, содержащие ВПЧ 6, ВПЧ 11, ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33, ВПЧ 39, ВПЧ 45, ВПЧ 52 и ВПЧ 58, не содержат лидерной последовательности. В частности, гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, включая нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 2; нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 4; нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 6; нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 8; нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 18; нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 20; нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 22; нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 24; и нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 25, не содержат лидерной последовательности на 5' конце, например, нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 10. В частности, гибридные антигены ВПЧ Е6-Е7, включая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23, не содержат лидерной последовательности на 5'-конце, например нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичными предложенным нуклеотидным последовательностям; предпочтительно на 95, 96, 97, 98, или 99, или 98 или 99%.
Предложенные нуклеотидные последовательности могут быть введены в один из множества известных векторов или систем доставки, в том числе плазмиду, вирусный вектор, липидный вектор, наночастицу; предпочтительно плазмиду.
В дополнительных аспектах предложены фармацевтические композиции, содержащие раскрытые нуклеотидные последовательности; предпочтительно с несколькими антигенами.
В некоторых аспектах изобретения присутствуют способы стимуляции у индивидуума эффективного иммунного ответа более чем против одного подтипа ВПЧ, включающие введение указанному индивидууму композиции, содержащей одну или несколько предложенных последовательностей нуклеотидов; предпочтительно, композиции содержат более одного антигена. Способы предпочтительно включают
- 11 045015 стадию введения предложенных нуклеотидных последовательностей индивидууму электропорацией.
SEQ ID NO: 1 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 6 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 1 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, связанную с нуклеотидной последовательностью на 5'-конце SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 2 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 6 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 2 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце консенсусной иммуногенной последовательности. Лидерная последовательность IgE - это SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 2 или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 2.
Фрагменты SEQ ID NO: 2 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 2 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной SEQ ID NO: 2, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 2, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 2, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 1, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным антигену SEQ ID NO: 2 и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 1 могут содержать 786 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 830 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 856 или более нуклеотидов; и в некоторых вариантах реализации изобретения 865 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 1, такие как раскрытые в данном документе, могут, кроме того, содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 1 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 2 могут содержать 252 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 266 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 275 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 278 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 3 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 11 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 3 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, связанную с нуклеотидной последовательностью на 5'-конце SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 4 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 11 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 4 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце консенсусной иммуногенной последовательности. Лидерная последовательность IgE является SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 4 или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 4.
Фрагменты SEQ ID NO: 4 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности,
- 12 045015 за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 4 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной SEQ ID NO: 4, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 4, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 4, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Кроме того, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 3, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным антигену SEQ ID NO: 4, и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 3 могут содержать 786 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 830 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 856 или более нуклеотидов и в некоторых вариантах реализации изобретения 865 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 3, такие как раскрытые в данном документе, могут, кроме того, содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации фрагменты SEQ ID NO: 3 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 4 могут содержать 252 или более аминокислоты; в некоторых вариантах реализации изобретения 266 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 275 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 278 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 5 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 33 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 5 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, связанную с нуклеотидной последовательностью на 5'-конце SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 6 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 33 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 6 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на Nтерминальном конце консенсусной иммуногенной последовательности. Лидерная последовательность IgE является SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 6 или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 6.
Фрагменты SEQ ID NO: 6 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 6 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной SEQ ID NO: 6, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 6, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 6, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Кроме того, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к
- 13 045015 фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 5, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным антигену SEQ ID NO: 6, и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 5 могут содержать 746 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 787 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 812 или более нуклеотидов и в некоторых вариантах реализации изобретения 820 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 5, такие как раскрытые в данном документе, могут, кроме того, содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 5 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 6 могут содержать 235 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 248 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 256 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 259 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 7 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 58 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 7 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, связанную с нуклеотидной последовательностью на 5'-конце SEQ ID NO: 7.
SEQ ID NO: 8 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 58 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 8 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце консенсусной иммуногенной последовательности. Лидерная последовательность IgE является SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 8 или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 8.
Фрагменты SEQ ID NO: 8 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 8 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной SEQ ID NO: 8, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 8, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 8, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Кроме того, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 7, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид.
Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомо
- 14 045015 логичным антигену SEQ ID NO: 8, и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 7 могут содержать 752 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 794 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 819 или более нуклеотидов и в некоторых вариантах реализации изобретения 827 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 7, такие как раскрытые в данном документе, могут, кроме того, содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 7 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 8 могут содержать 235 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 249 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 257 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 260 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 17 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 31 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 17 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, присоединенную к нуклеотидной последовательности на 5'-конце SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 18 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 31 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 18 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце последовательности консенсусного иммуногена. Лидерная последовательность IgE представляет собой SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 18 или молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 18.
Фрагменты SEQ ID NO: 18 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 18 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной SEQ ID NO: 18, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 18, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 18, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Кроме того, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более,
65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более,
91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более,
97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 17, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным антигену SEQ ID NO: 18, и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 17 могут содержать 713 или более нуклеотидовв; в некоторых вариантах реализации изобретения 752 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 776 или более нуклеотидов; и в некоторых вариантах реализации изобретения 784 или более нуклеотидов.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 17, такие как раскрытые в
- 15 045015 данном описании, могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 17 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 18 могут содержать 236 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 249 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 257 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 259 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 19 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 52 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 19 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, присоединенную к нуклеотидной последовательности на 5'-конце SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 20 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 52 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 20 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце последовательности консенсусного иммуногена. Лидерная последовательность IgE представляет собой SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 20 или молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 20.
Фрагменты SEQ ID NO: 20 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 20 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной SEQ ID NO: 20, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 20, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 20, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Кроме того, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 19 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более,
65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более,
91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более,
97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 19, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным антигену SEQ ID NO: 20, и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует Nконцевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 19 могут содержать 713 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 752 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 776 или более нуклеотидов; и в некоторых вариантах реализации изобретения 784 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 19, такие как раскрытые в данном описании, могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 19 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 20 могут содержать 236 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 249 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 257 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 259 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 21 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 16 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 21 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, присоединенную к нуклеотидной последовательности на 5'-конце SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 22 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков
- 16 045015
ВПЧ 16 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 22 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на
N-терминальном конце последовательности консенсусного иммуногена. Лидерная последовательность
IgE представляет собой SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 22 или молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 22.
Фрагменты SEQ ID NO: 22 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 22 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной SEQ ID NO: 22, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 22, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 22, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Кроме того, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 21 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более,
65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более,
91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более,
97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 21, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным антигену SEQ ID NO: 22, и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 21 могут содержать 736 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 777 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 802 или более нуклеотидов; и в некоторых вариантах реализации изобретения 810 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 21, такие как раскрытые в данном описании, могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 21 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 22 могут содержать 238 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 251 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 259 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 261 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 23 содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует консенсусный иммуноген белков ВПЧ 18 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 23 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 9, присоединенную к нуклеотидной последовательности на 5'-конце SEQ ID NO: 23. SEQ ID NO: 24 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 18 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 24 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце последовательности консенсусного иммуногена. Лидерная последовательность IgE представляет собой SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах реализации изобретения вакцины содержат SEQ ID NO: 24 или молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 24.
Фрагменты SEQ ID NO: 24 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одной аминокислоты на N- и/или С-конце, в каждом случае с сигнальными пептидами и/или метионином в положении 1 или без них. Фрагменты SEQ ID NO: 24 могут содержать 60% или более, 65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полно- 17 045015 размерной SEQ ID NO: 24, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент SEQ ID NO: 24, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным SEQ ID NO: 24, и дополнительно содержать N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Кроме того, фрагменты могут содержать N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. N-концевой метионин и/или сигнальный пептид могут быть присоединены к фрагменту.
Фрагменты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 23 могут быть на 100% идентичными полноразмерной последовательности, за исключением отсутствия по меньшей мере одного нуклеотида на 5'- и/или 3'-конце, в каждом случае с последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды и/или метионин в положении 1, или без них. Фрагменты могут содержать 60% или более,
65% или более, 70% или более, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более,
91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, 95% или более, 96% или более,
97% или более, 98% или более, 99% или более процентов длины полноразмерной кодирующей последовательности SEQ ID NO: 23, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. Предпочтительно фрагмент может содержать фрагмент, кодирующий полипептид, который является на 95% или более, на 96% или более, на 97% или более, на 98% или более или на 99% или более гомологичным антигену SEQ ID NO: 24, и дополнительно необязательно содержать последовательность, кодирующую N-концевой метионин или гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при вычислении процента гомологии. Дополнительно, фрагменты могут содержать кодирующие последовательности для N-концевого метионина и/или сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, которая кодирует N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть присоединена к фрагменту.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 23 могут содержать 705 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 744 или более нуклеотидов; в некоторых вариантах реализации изобретения 767 или более нуклеотидов вариантов; и в некоторых вариантах реализации изобретения 775 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 23, такие как раскрытые в данном описании, могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для лидерных последовательностей IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 23 не содержат кодирующих последовательностей для лидерных последовательностей IgE.
В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты SEQ ID NO: 24 могут содержать 234 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 247 или более аминокислот; в некоторых вариантах реализации изобретения 255 или более аминокислот; и в некоторых вариантах реализации изобретения 257 или более аминокислот.
SEQ ID NO: 25 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 45 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 25 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце последовательности консенсусного иммуногена. Лидерная последовательность IgE представляет собой SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
SEQ ID NO: 26 содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена белков ВПЧ 39 Е6 и Е7. SEQ ID NO: 26 содержит лидерную последовательность IgE SEQ ID NO: 10 на N-терминальном конце последовательности консенсусного иммуногена. Лидерная последовательность IgE представляет собой SEQ ID NO: 10 и может кодироваться SEQ ID NO: 9.
Существуют композиции, содержащие аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; или SEQ ID NO: 26; или их фрагментов, по меньшей мере на 95% гомологичных; или их комбинаций. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции содержат SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 22.
Аминокислотная последовательность может представлять собой фрагменты, по меньшей мере на 95% гомологичные любой из аминокислотных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность может быть фрагментами, по меньшей мере на 98% гомологичными любой из аминокислотных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность может быть фрагментами, по меньшей мере на 99% гомологичными любой из аминокислотных последовательностей.
В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения способы стимуляции иммунного ответа в индивидуумов против иммуногена включают введение индивидууму аминокислотной последо
- 18 045015 вательности для консенсусного иммуногена, выбранного из группы, состоящей из ВПЧ 6 Е6 и Е7, ВПЧ 11 Е6 и Е7, ВПЧ 16 Е6 и Е7, ВПЧ 18 Е6 и Е7, ВПЧ 31 Е6 и Е7, ВПЧ 33 Е6 и Е7, ВПЧ 52 Е6 и Е7, ВПЧ 58 Е6 и Е7, ВПЧ 45 Е6 и Е7, ВПЧ 39 Е6 и Е7, их функциональных фрагментов и их экспрессирующихся кодирующих последовательностей. Предпочтительно иммуногены представляют собой консенсусные ВПЧ 6, ВПЧ 11, ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33, ВПЧ 52 и ВПЧ 58. Предпочтительно иммуногены представляют собой консенсусные ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33, ВПЧ 52 и ВПЧ 58. Предпочтительно иммуногены представляют собой консенсусные ВПЧ 6, ВПЧ 11, ВПЧ 16 и ВПЧ 18. Предпочтительно иммуногены представляют собой консенсусные ВПЧ 16, ВПЧ 31 и ВПЧ 52.
Некоторые варианты реализации изобретения включают выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена, выбранного из группы, состоящей из ВПЧ 6 Е6 и Е7, ВПЧ 11 Е6 и Е7, ВПЧ 16 Е6 и Е7, ВПЧ 18 Е6 и Е7, ВПЧ 31 Е6 и Е7, ВПЧ 33 Е6 и Е7, ВПЧ 52 Е6 и Е7, ВПЧ 58 Е6 и Е7, ВПЧ 45 Е6 и Е7 и ВПЧ 39 Е6 и Е7 и их фрагментов. Некоторые варианты реализации изобретения включают рекомбинантную вакцину, которая кодирует аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена, выбранного из группы, состоящей из ВПЧ 6 Е6 и Е7, ВПЧ 11 Е6 и Е7, ВПЧ 16 Е6 и Е7, ВПЧ 18 Е6 и Е7, ВПЧ 31 Е6 и Е7, ВПЧ 33 Е6 и Е7, ВПЧ 52 Е6 и Е7, ВПЧ 58 Е6 и Е7, ВПЧ 45 Е6 и Е7 и ВПЧ 39 Е6 и Е7 и их фрагментов. Некоторые варианты реализации изобретения включают субъединичную вакцину, которая содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена, выбранного из группы, состоящей из ВПЧ 6 Е6 и Е7, ВПЧ 11 Е6 и Е7, ВПЧ 16 Е6 и Е7, ВПЧ 18 Е6 и Е7, ВПЧ 31 Е6 и Е7, ВПЧ 33 Е6 и Е7, ВПЧ 52 Е6 и Е7, ВПЧ 58 Е6 и Е7, ВПЧ 45 Е6 и Е7 и ВПЧ 39 Е6 и Е7 и их фрагментов. Некоторые варианты реализации изобретения включают живую аттенуированную вакцину и/или инактивированную вакцину, которая содержит аминокислотную последовательность для консенсусного иммуногена, выбранного из группы, состоящей из ВПЧ 6 Е6 и Е7, ВПЧ 11 Е6 и Е7, ВПЧ 16 Е6 и Е7, ВПЧ 18 Е6 и Е7, ВПЧ 31 Е6 и Е7, ВПЧ 33 Е6 и Е7, ВПЧ 52 Е6 и Е7, ВПЧ 58 Е6 и Е7, ВПЧ 45 Е6 и Е7 и ВПЧ 39 Е6 и Е7.
Существуют способы стимуляции иммунного ответа у индивидуума против ВПЧ, включающие введение указанному индивидууму композиции, содержащей последовательности нуклеиновых кислот, предложенные в данном описании. В некоторых вариантах реализации изобретения способы дополнительно включают введение последовательностей нуклеиновых кислот индивидууму электропорацией.
В некоторых аспектах присутствуют способы стимуляции иммунного ответа у индивидуума против ВПЧ, включающие введение указанному индивидууму композиции, содержащей аминокислотную последовательность, предложенную в данном описании. В некоторых вариантах реализации изобретения способы дополнительно включают введение аминокислотных последовательностей индивидууму электропорацией.
В одном аспекте изобретения вакцины являются такими, которые возбуждают иммунный ответ против подтипов ВПЧ, которые, как было выявлено, преимущественно связаны с формами рака головы и шеи и другими формами отоларингологических заболеваний, в частности, вакцины включают ВПЧ 6 Е6 и Е7 и ВПЧ 11 Е6 и Е7 и преимущественно обе.
В другом аспекте изобретения вакцины являются такими, которые возбуждают иммунный ответ против подтипов ВПЧ, которые, как было выявлено, преимущественно связаны с формами рака шейки матки у пациентов из США и, точнее, у пациентов из Азии, в частности, вакцины включают ВПЧ 33 Е6 и Е7 и ВПЧ 58 Е6 и Е7, и, преимущественно, обе.
Предпочтительными являются комбинации, пригодные для возбуждения иммунного ответа против подтипов ВПЧ, для которых обнаружена связь с раком шейки матки, в том числе предраковыми поражениями, и которые включают: подтипы ВПЧ 16, 18, 31, 33, 52, 58, 6, 11, 39 и 45 или ВПЧ подтипы 16, 18, 31, 33, 52, 58, 6 и 11. Другие подкомбинации для такого рака шейки матки включают:
и 18; 16, 18 и 6; 16, 18 и 11; 16, 18 и 31; 16, 18 и 33; 16, 18 и 52; 16, 18 и 58; 16, 18, 6 и 11; 16, 18, 6 и 31; 16, 18, 6 и 33; 16, 18, 6 и 52; 16, 18, 6 и 58; 16, 18, 11 и 31; 16, 18, 11 и 33, 16, 18, 11 и 52; 16, 18, 11 и 58; 16, 18, 31 и 33; 16, 18, 31 и 52; 16, 18, 31 и 58; 16, 18, 33 и 52; 16, 18, 33 и 58; 16, 18, 52 и 58;
6, 11 и 16; 6, 11 и 18; 6, 11 и 31; 6, 11 и 33; 6, 11 и 52; 6, 11 и 58; 6, 11, 16 и 31; 6, 11, 16 и 33; 6, 11, 16 и 52; 6, 11, 16 и 58; 6, 11, 18 и 31; 6, 11, 18 и 33; 6, 11, 18 и 52; 6, 11, 18 и 58; 6, 11, 31 и 33; 6, 11, 31 и 52; 6, 11, 31 и 58; 6, 11, 33 и 52; 6, 11, 33 и 58; 6, 11, 52 и 58;
6, 16 и 31; 6, 16 и 33; 6, 16 и 52; 6, 16 и 58; 6, 16, 31 и 33; 6, 16, 31 и 52; 6, 16, 31 и 58; 6, 16, 33 и 52; 6, 16, 33 и 58; 6, 16, 52 и 58;
6, 18 и 31; 6, 18 и 33; 6, 18 и 52; 6, 18 и 58; 6, 18, 31 и 33; 6, 18, 31 и 52; 6, 18, 31 и 58; 6, 18, 33 и 52; 6, 18, 33 и 58;
6, 31 и 33; 6, 31 и 52; 6, 31 и 58; 6, 31, 33 и 52; 6, 31, 33 и 58;
6, 33 и 52; 6, 33 и 58; 6, 33, 52 и 58;
6, 52 и 58;
11, 31 и 33; 11, 31 и 52; 11, 31 и 58; 11, 31, 33 и 52; 11, 31, 33 и 58; 11, 31, 52 и 58;
11, 31 и 52; 11, 31 и 58; 11, 31, 52 и 58;
11, 52 и 58;
16, 31 и 33; 16, 31 и 52; 16, 31 и 58; 16, 31, 33 и 52; 16, 31, 52 и 58;
- 19 045015
16, 33 и 52; 16, 33 и 58; 16, 33, 52 и 58;
18, 31 и 33; 18, 31 и 52; 18, 31 и 58; 18, 31, 33 и 52; 18, 31, 33 и 58;
31, 33 и 52; 31, 33 и 58; 31, 33, 52 и 58; и 31, 52 и 58.
Усовершенствованные вакцины содержат белки и генетические конструкции, которые кодируют белки с эпитопами, делающие их особенно эффективными как иммуногены, против которых можно вызвать анти-ВПЧ иммунный ответ. Соответственно, вакцины можно предоставить для выработки терапевтического или профилактического иммунного ответа. В некоторых вариантах реализации изобретения средствами, доставляющими иммуногены, являются ДНК-вакцина, рекомбинантная вакцина, белковая субъединичная вакцина, композиция, содержащая иммуноген, аттенуированная вакцина или инактивированная вакцина. В некоторых вариантах реализации изобретения вакцина содержит комбинацию, выделенную из групп, состоящих из: одной или нескольких ДНК-вакцин, одной или нескольких рекомбинантных вакцин, одной или нескольких белковых субъединичных вакцин, одной или нескольких композиций, содержащих иммуноген, одной или нескольких аттенуированных вакцин и одной или нескольких инактивированных вакцин.
Аспекты изобретения предоставляют способы доставки последовательности, кодирующей белок, в молекулу нуклеиновой кислоты, такую как плазмида, как часть рекомбинантной вакцины и как часть аттенуированной вакцины, как выделенные белки или белки, входящие в вектор.
В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения, предоставляются композиции и способы, которые профилактически и/или терапевтически иммунизируют индивидуума.
ДНК-вакцины описаны в патентах США №. 5593972, 5739118, 5817637, 5830876, 5962428, 5981505, 5580859, 5703055, 5676594 и предварительных заявках, цитированных здесь, каждая из которых включена в данное описание путем ссылки. В дополнение к протоколам доставки, описанным в этих заявках, альтернативные способы доставки ДНК описаны в патентах США №. 4945050 и 5036006, которые включены в данный документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение связано с усовершенствованными живыми аттенуированными вакцинами, усовершенствованными инактивированными вакцинами и усовершенствованными вакцинами, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных генов, которые кодируют антигены, а также с субъединичными и гликопротеидными вакцинами. Примеры живых аттенуированных вакцин, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных антигенов, субъединичных вакцин и гликопротеидных вакцин описаны в патентах США №: 4510245; 4797368; 4722848; 4790987; 4920209; 5017487; 5077044; 5110587; 5112749; 5174993; 5223424; 5225336; 5240703; 5242829; 5294441; 5294548; 5310668; 5387744; 5389368; 5424065; 5451499; 54533 64; 5462734; 5470734; 5474935; 5482713; 5591439; 5643579; 5650309; 5698202; 5955088; 6034298; 6042836; 6156319 и 6589529, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.
Попадая в клетку, генетическая конструкция(и) может остаться в клетке как функционирующая экстрахомосомная молекула и/или интегрированная в хромосомную ДНК клетки. ДНК может быть интродуцирована в клетку, где она остается как отдельный генетический материал в форме плазмиды или плазмид. В альтернативном варианте, линейная ДНК, которая может интегрироваться с хромосомой, может быть интродуцирована в клетку. Когда ДНК интродуцируется в клетку, могут быть добавлены реагенты, которые стимулируют интеграцию ДНК в хромосомы. Последовательности ДНК, которые полезны для стимуляции интеграции, также могут быть включены в молекулу ДНК. Альтернативно, РНК может вводиться в клетку. Также предусматривается предоставлять генетические конструкции как линейные микрохромосомы, включающие центромеру, теломеры и точку начала репликации. Генные конструкции могут оставаться частью генетического материала в аттенуированных живых микроорганизмах или рекомбинантных бактериальных векторах, которые живут в клетках. Генные конструкции могут быть частью геномов рекомбинантных вирусных вакцин, когда генетический материал или интегрируется в хромосому клетки, или остается экстрахомосомным. Генетические конструкции включают регуляторные элементы, необходимые для генной экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты.
Элементы включают: промотор, инициирующий кодон, терминирующий кодон и сигнал полиаденилирования. Кроме того, для экспрессии генной последовательности, которая кодирует белок-мишень или иммуномодулирующий белок, часто требуются энхансеры. Необходимо, чтобы эти элементы были функционально встроены в последовательность, которая кодирует требуемые белки и чтобы регуляторные элементы работали у тех, кому они вводятся.
Инициирующие кодоны и терминирующий кодон обычно считаются частью нуклеотидной последовательности, которая кодирует требуемый белок. Однако необходимо, чтобы эти элементы функционировали у тех, кому вводится генная конструкция. Инициирующий и терминирующий кодоны должны быть внутри кодирующей последовательности.
Используемые промоторы и сигнал полиаденилирования должны работать в клетках тех, кому они вводятся.
Примеры промоторов полезны для осуществления на практике настоящего изобретения, особенно в производстве генетической вакцины для индивидуумов, включая, но не ограничиваясь промоторами обезьяньего вируса 40 (SV40), промотором мышиного вируса опухоли молочной железы (MMTV), вируса
- 20 045015 иммунодефицита человека (MV), такого как промотор BIV длинного концевого повтора (LTR), вируса
Молони, ALV, цитомегаловируса (CMV), такого как CMV предранний промотор, вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус саркомы Рауса (RSV), а также промоторы из генов человека, таких как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин и человеческий металлотионеин.
Примеры сигналов полиаденилирования полезны для осуществления на практике настоящего изобретения, особенно для производства генетических вакцин для людей, включая, но не ограничиваясь, SV40 сигналы полиаденилирования и LTR сигналы полиаденилирования. Преимущественно используется SV40 сигнал полиаденилирования, который находится в рСЕР4 плазмиде (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), называемый SV40 сигналом полиаденилирования.
Кроме регуляторных элементов, требуемых для экспрессии ДНК, другие элементы также могут быть включены в молекулу ДНК. Такие дополнительные элементы включают энхансеры. Энхансер может быть выбран из группы, включающей, но не ограниченной, человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин и вирусные энхансеры, такие как CMV, RSV и EBV.
Генетические конструкции могут предоставляться с точкой начала репликации у млекопитающих для создания экстрахомосомной конструкции и выработки множественных копий конструкции в клетке. Плазмиды pVAX1, pCEP4 и pREP4 из Invitrogen (Сан-Диего, Калифорния) содержат точку начала репликации вируса Эпштейна-Барра и ядерный кодирующий регион антигена EBNA-1, который генерирует многокопийную эписомную репликацию без интеграции.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения, связанных с применением иммунизации, используются молекула(ы) нуклеиновой кислоты, которые включают нуклеотидные последовательности, кодирующие белок изобретения; и, дополнительно, гены белков, которые добавочно усиливают иммунный ответ против таких белков-мишеней. Примерами таких генов являются гены, кодирующие другие цитокины и лимфокины, такие как альфа-интерферон, гамма-интерферон, фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFa, TNFe, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, МНС, CD80,CD86 и IL-15, включая IL-15, обладающий сигнальной последовательностью, удаляющей и необязательно включающей сигнальный пептид из IgE. Другие гены, которые могут быть полезны, включают гены, кодирующие МСР-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-селектин, Р-селектин, Е-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, IL-7, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, TNF рецептор, Flt, Аро-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены интерферонового ответа, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
Может быть добавлен дополнительный элемент, который служит мишенью для клеточной деструкции, если по каким-либо причинам желательно элиминировать клетки, получившие генетическую конструкцию. Ген тимидинкиназы (tk) герпеса в экспрессирующейся форме может быть включен в генетическую конструкцию. Лекарство ганцикловир может быть введено индивидууму и это лекарство станет причиной избирательного цитолиза любой клетки, продуцирующей tk, тем самым предоставляя средство для избирательной деструкции клеток с генетической конструкцией.
Для того, чтобы максимизировать продукцию белка, могут быть выбраны регуляторные последовательности, которые хорошо подходят для генной экспрессии в клетках, куда введена конструкция. Больше того, могут быть выбраны кодоны, которые наиболее эффективно транскрибируются в клетке. Специалист в данной области может получить конструкции ДНК, являющиеся функциональными в клетке.
В некоторых вариантах реализации изобретения могут быть предоставлены генные конструкты, в которых кодирующие последовательности для белков, описанных здесь, связаны с IgE сигнальным белком. В некоторых вариантах реализации изобретения белки, описанные здесь, связаны с IgE сигнальным белком.
В некоторых вариантах реализации изобретения, для которых используется белок, например имея средние специальные знания и используя хорошо известные технологии, можно продуцировать и изолировать белки изобретения, используя хорошо известные технологии. В некоторых вариантах реализации изобретения, для которых используется белок, например имея средние специальные знания, можно, используя хорошо известные технологии, вставлять молекулы ДНК, которые кодируют белок изобретения в коммерчески доступные векторы экспрессии для использования в хорошо известных системах экспрессии. Например, коммерчески доступная плазмида pSE420 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния) может быть использована для продукции белка в Е. coli. Коммерчески доступная плазмида pYES2 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния) может, например, быть использована для продукции в штаммах дрожжей S. cerevisiae. Коммерчески доступная МАХВАС™ полная бакуловирусная система экспрессии
- 21 045015 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния) может, например, быть использована для продукции в клетках насекомых. Коммерчески доступная плазмида pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния) может, например, быть использована для продукции в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка. Обладая средними специальными знаниями, можно использовать эти коммерческие векторы и системы экспрессии или другое для продуцирования белка с помощью стандартных технологий и легко доступных исходных материалов.
(См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989), включенный в данный документ посредством ссылки.) Таким образом, требуемые белки можно получить как в прокариотических, так и в эукариотических системах, результатом чего будет диапазон обработанных форм белка.
Обладая средними специальными знаниями, можно использовать другие коммерческие доступные векторы экспрессии и системы или создать векторы, используя хорошо известные способы и легко доступные исходные материалы. Системы экспрессии, содержащие необходимые контрольные последовательности, такие как промоторы и сигналы полиаденилирования и предпочтительные энхансеры, легко доступны и известны специалистам у множества хозяев. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989). Генетические конструкции включают белки, кодирующие последовательность, функционально связанную с промотором, который работает в клеточной линии, в которую трансфицированы конструкции. Примеры конститутивных промоторов включают промоторы из цитомегаловируса или SV40. Примеры индуцируемых промоторов включают мышиный вирус лейкемии молочной железы или промоторы металлотионеина. Имея средние специальные знания, можно легко создать генетические конструкции, полезные для трансфекции в клетки ДНК, которая кодирует белок изобретения, из легко доступных исходных материалов. Вектор экспрессии, включающий ДНК, которая кодирует белок, используется для трансформации совместимых хозяев, которые затем культивируются и содержатся при условиях, в которых происходит экспрессия чужеродной ДНК.
Произведенный белок извлекается из культуры путем лизиса клеток, или из среды культуры, как принято и известно специалистам. Имея средние специальные знания и используя хорошо известные технологии, можно выделить белок, произведенный с использованием таких систем экспрессии. Способы очистки белка из естественных источников с использованием антител, которые специфически связываются с определенным белком, как описано выше, могут также применяться для очистки белка, произведенного по методологии рекомбинантной ДНК.
В дополнение к производству белков путем рекомбинантных техник, автоматизированные белковые синтезаторы также могут быть использованы для производства выделенного, исключительно чистого белка. Такие техники хорошо известны специалистам и полезны, если производные, у которых есть замена, не обеспечиваются в производстве белка, кодируемого ДНК.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены при использовании любой из нескольких хорошо известных технологий, включая введение ДНК (также известное как ДНК-вакцинация), рекомбинантные векторы, такие как рекомбинатный аденовирус, рекомбинатный аденовирус, ассоциированный с вирусом и рекомбинантная вакцина.
Способы введения включают, но не ограничиваются, введение внутримышечно, внутриназально, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутривенно, внутриартериально, интраокулярно и орально, а также местно, трансдермально, путем ингаляции или суппозиторием или в ткань слизистой оболочки, в виде орошения вагинальной, ректальной, уретральной, ротовой и подъязычной тканей. Предпочтительные пути введения включают внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную и подкожную инъекцию. Генетические конструкции могут вводиться посредством, включая, но не ограничиваясь, способы и устройства электропорации, традиционные шприцы, устройства для безыгольной инъекции или генной пушки для баллистической трансфекции.
Примеры устройств для элекропорации и способов электропорации, предпочтительных для легкой доставки ДНК-вакцин, включают те, что описаны в патенте США № 7245963 Draghia-Akli, et al., патент США изд. 2005/0052630 подписан Smith, et al., полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки. Также предпочтительными являются устройства для электропорации и способы электропорации для легкой доставки ДНК-вакцин, предоставляемые в одновременно находящейся на рассмотрении заявке того же владельца на патент США, серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., заявляющей приоритет по статье 35 USC 119(е) предварительных заявок с серийными номерами: 60/852149, поданной 17 октября 2006 г., и 60/978982, поданной 10 октября 2007 г., включенными в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
Нижеследующее представляет собой пример реализации с использованием технологии электропорации и обсуждается более детально в патентных ссылках, описанных выше: устройства электропорации могут быть сконфигурированы для доставки в требуемую ткань млекопитающего импульсом энергии, производимым постоянным током, таким же, как заданный ток, введенный пользователем. Устройство для электропорации содержит электропорационную составляющую и набор электродов или набор рукояток. Электропорационная составляющая может содержать один или несколько из различных элементов
- 22 045015 приспособлений для электропорации, включая контроллер, волновой генератор тока, тестер импеданса, регистратор волн, входной элемент, элемент сообщения о статусе, коммуникационный порт, компонент памяти, источник питания и переключатель энергии и выключатель питания. Электропорационная составляющая может функционировать как один элемент электропорационных приборов, и другие элементы являются отдельными элементами (или составляющими) в сообщении с электропорационной составляющей. В некоторых вариантах реализации изобретения элетропорационная составляющая может функционировать как более чем один элемент устройства для электропорации, который может находиться в сообщении с другими элементами устройства для электропорации, отдельно от электропорационной составляющей. Использование электропорационной технологии для доставки усовершенствованной ВПЧ-вакцины не ограничено элементами устройств для электропорации, существующих как части одного электромеханического или механического устройства, поскольку элементы могут функционировать как одно устройство или как различные элементы, сообщающиеся друг с другом.
Электропорационная составляющая способна доставить энергетический импульс, который производит постоянный ток в нужной ткани и содержит механизм обратной связи. Набор электродов содержит комплект электродов, в который входит множество электродов различного размера, где набор электродов получает импульс энергии от электропорационной составляющей и доставляет ее в нужную ткань посредством электродов. По меньшей мере один из множества электродов является нейтральным во время доставки импульса энергии и измеряет импеданс в нужной ткани и передает значение импеданса к электропорационной составляющей. Механизм обратной связи может получить значение импеданса и может подогнать импульс энергии, доставляемый электропорационной составляющей, для поддержания постоянного тока.
В некоторых вариантах реализации изобретения множество электродов может доставлять импульс энергии в децентрализованную структуру. В некоторых вариантах реализации изобретения множество электродов может доставлять импульс энергии в децентрализованную структуру благодаря контролю электродов запрограммированной последовательностью, причем запрограммированная последовательность вводится пользователем электропорационной составляющей. В некоторых вариантах реализации изобретения запрограммированная последовательность содержит множество импульсов, доставляемых последовательно, где каждый импульс из множества импульсов доставляется по крайней мере двумя активными электродами с одним нейтральным электродом, который оценивает импеданс, и где последующий импульс из множества импульсов доставляется различно одним из по меньшей мере двух активных электродов с одним нейтральным электродом, который оценивает импеданс.
В некоторых вариантах реализации изобретения механизм обратной связи выполняется или аппаратурой, или программным обеспечением. Предпочтительно механизм обратной связи выполняется аналоговой системой управления с обратной связью. Предпочтительно эта обратная связь происходит каждые 50, 20, 10 или 1 мкс, но предпочтительна обратная связь в режиме реального времени или мгновенная (т.е. практически мгновенная, как определяется в доступных техниках установленное время ответа). В некоторых вариантах реализации изобретения нейтральный электрод оценивает импеданс в нужной ткани и передает импеданс механизму обратной связи, и механизм обратной связи реагирует на импеданс и корректирует импульс энергии, поддерживая значение постоянного тока, равное заданному значению. В некоторых вариантах реализации изобретения механизм обратной связи непрерывно и мгновенно поддерживает постоянный ток в течение доставки импульса энергии.
В некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты доставляется в клетки вместе с введением полинуклеотида с функцией энхансера или организующего агента генетической вакцины. Полинуклеотиды с функцией энхансера описаны в патентах США серийные номера 5593972, 5962428 и в международной заявке PCT/US94/00899, поданной 26 января 1994 г., которые включены посредством ссылки. Организующие агенты генетической вакцины описаны в патенте США № 021579, в соответствии с заявкой, поданной 1 апреля 1994 г., который включен в данный документ посредством ссылки. Коагенты, которые вводятся вместе с молекулами нуклеиновых кислот, могут вводиться в смеси с молекулами нуклеиновой кислоты или одновременно вводиться отдельно, до или после введения молекул нуклеиновой кислоты. Кроме того, другие агенты, которые могут выполнять функции трансфектирующих агентов и/или реплицирующих агентов и/или воспалительных агентов и которые могут вводиться совместно с GVF, включая факторы роста, цитокины и лимфокины, такие как альфа-интерферон, гамма-интерферон, GM-CSF, фактор роста тромбоцитов (PDGF), ФНО, эпидермальный фактор роста (ЭФР), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 и IL-15, а также фактор роста фибробластов, поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, LPS-аналог, включающий монофосфорилированный липид A (WL), мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и гиалуроновая кислота, могут также быть использованы для совместного введения с генетической конструкцией. В некоторых вариантах реализации изобретения может быть использован иммуномодулирующий белок, такой как GVF. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты предоставляется совместно с PLG, чтобы обеспечить доставку энхансера.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат от около 1 нг до около
- 23 045015
2000 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат от около 5 нг до около 1000 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат от около 10 нг до около 800 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат от около 0,1 до около 500 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат от около 1 до около 350 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат от около 25 до около 250 мкг ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат от около 100 до около 200 мкг ДНК.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению разработаны в соответствии с используемым способом введения. В случаях, когда фармацевтические композиции являются инъецируемыми фармацевтическими композициями, они стерильны, не содержат пирогенных препаратов и не содержат твердых частиц. Предпочтительно используется изотоническая формула. Обычно добавки для изотоничности могут включать хлористый натрий, декстрозу, манит, сорбитол и лактозу. В некоторых случаях предпочитаются изотонические растворы, такие как фосфатный солевой буфер. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах реализации изобретения в формулу добавляется сосудосуживающий агент.
В соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения предоставляются способы стимуляции иммунных ответов. Вакцина может быть основанной на белке, живой аттенуированной вакциной, клеточной вакциной, рекомбинантной вакциной или вакциной нуклеиновой кислоты или ДНКвакциной. В некоторых вариантах реализации изобретения способы стимуляции в индивидуума иммунного ответа против иммуногена включают способы стимуляции мышечных иммунных ответов, состоящих из введения индивидууму одного или нескольких СТАСК белка, ТЕСК белка, МЕС белка и их функциональных фрагментов, или их экспрессирующихся кодирующих последовательностей в комбинации с очищенными молекулами нуклеиновой кислоты, которые кодируют белок по изобретению, и/или рекомбинантной вакциной, которая кодирует белок по изобретению, и/или субъединичной вакциной, содержащей белок по изобретению, и/или живой аттенуированной вакциной, и/или инактивированной вакциной. Один или несколько СТАСК белок, ТЕСК белок, МЕС белок и их функциональные фрагменты могут быть введены прежде, одновременно или после введения очищенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует иммуноген, и/или рекомбинантной вакцины, которая кодирует иммуноген, и/или субъединичной вакцины, которая содержит иммуноген, и/или живой аттенуированной вакцины и/или инактивированной вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения индивидууму вводится выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько белков, выбранных из группы, содержащей: СТАСК, ТЕСК, МЕС и их функциональные фрагменты.
Кроме того, настоящее изобретение иллюстрируется на следующем примере. Должно быть понятно, что этот пример, показывающий варианты реализации изобретения, предоставляет лишь способ иллюстрации. Из вышеизложенного обсуждения и этого примера специалист может убедиться в важнейших характеристиках этого изобретения и, без отступления от объема его притязаний и не выходя за его границы, может внести различные изменения и модифицировать изобретение, чтобы адаптировать его к различным использованиям и условиям. Таким образом, различные варианты реализации изобретения в дополнение к тем, что показаны и описаны здесь, будут очевидны специалистам из вышеизложенного описания. Такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Каждый из патентов США, заявок США и ссылок на литературу, цитируемых в ходе этого раскрытия, тем самым включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
Примеры
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется на следующих примерах. Должно быть понятно, что эти примеры, показывающие преимущественные варианты реализации изобретения, предоставляют лишь способ иллюстрации. Из вышеизложенного обсуждения и этих примеров специалист может убедиться в важнейших характеристиках этого изобретения и без отступления от объема его притязаний и не выходя за его границы, может внести различные изменения и модифицировать изобретение, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные варианты реализации изобретения в дополнение к тем, что показаны и описаны здесь, будут очевидны специалистам из вышеизложенного описания. Такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1.
Новая созданная ВПЧ-16 ДНК вакцина, кодирующая гибридный белок Е6/Е7.
Иммуноген разработан для экспрессии в виде полипротеина, при этом последовательности Е6 и Е7 разделены сайтом протеолитического расщепления. Кроме того, полипротеин экспрессируется с лидерной последовательностью IgE. Дизайн полипротеина включает делеции или мутации в последовательности Еб, которые важны для связывания р53 и деградации, а также мутации в сайте связывания с рибосомой на белке Е7.
Кодирующие последовательности ВПЧ 16 Е6/Е7 (SEQ ID NO: 21), которые кодируют полипротеин
- 24 045015 (SEQ ID NO: 22), вставляют в вектор pVAX, чтобы генерировать экспрессионную плазмиду. В оптимизированных антигенах вируса папилломы человека 16-6 & 7 (ВПЧ 16 Е6 & 7) под управлением промотора ЦМВ (PCMV), с бычьим гормоном роста на 3'-конце и сигналом полиаденилирования (bGHpA), применяется основа pVAX, которая содержит ген резистентности к канамицину (Kan) и плазмидную точку начала репликации (pUC ori).
Дизайн и экспрессия вакцины ВПЧ 18 Е6/Е7.
Получены оптимизированные консенсусные последовательности для человеческих вирусных белков 18 Е6 & 7 вируса папилломы человека (ВПЧ). Последовательность сконструирована для высоких уровней экспрессии. Данная последовательность пригодна для нашей технологии генетической иммунизации. Результаты экспериментов, выполняемых с применением консенсусной последовательности, являются положительными. Плазмидная конструкция содержит последовательность нуклеиновой кислоты консенсуса ВПЧ 18-6 & 7 (SEQ ID NO: 23). Последовательность нуклеиновой кислоты консенсуса ВПЧ 18-6 & 7, которая введена в плазмиду, содержит кодирующую последовательность для лидерного пептида IgE, присоединенного к кодирующим последовательностям консенсуса ВПЧ 18-6 & 7.
Генерируют экспрессионную плазмиду pGX3002, которая экспрессирует оптимизированные антигены вируса папилломы человека 18-6 & 7 (ВПЧ 18 Е6 & 7) (SEQ ID NO: 24) под управлением промотора ЦМВ (PCMV), с бычьим гормоном роста на 3' конце и сигналом полиаденилирования (bGHpA), в которой применяется основа pVAX, содержащая ген резистентности к канамицину (Kan) и плазмидную точку начала репликации (pUC ori).
Схема и экспрессия вакцины ВПЧ 6 и ВПЧ11 Е6/Е7.
Конструкция ВПЧ6 и 11 Е6/Е7 гибридных иммуногенов на основе консенсусной последовательности.
Тип ВПЧ 6 или 11 Е6 и Е7 генных последовательностей был собран из GeneBank, и консенсусные нуклеотидные последовательности Е6 и Е7 были получены после проведения множественного выравнивания. Консенсусная последовательность ВПЧ 6 Е6 или Е7 белков была получена из 98 или 20 последовательностей, соответственно, в то время как консенсусная последовательность ВПЧ 11 Е6 или Е7 белков была получена из 76 или 13 последовательностей соответственно. Процедура множественного выравнивания, используемая в филогенетическом исследовании, включала применение Clustal X (версия 2.0). Как это показано на фиг. 1А и В, отмечалась примерно 0-2% дивергенция последовательности между штаммами ВПЧ, принадлежащих к одному и тому же виду в белках Е6 и Е7. Однако генетические расстояния могли составлять до 19,3% в белке Е6 и 16,3% в белке Е7 между ВПЧ 6 и 11. На основе таких результатов филогенетических анализов, мы разработали две видоспецифические Е6/Е7 консенсусные ДНК-вакцины.
Несколько модификаций было проведено после получения консенсусной последовательности слияния Е6/Е7 (фиг. 1С). Высокоэффективная лидерная последовательность была слита в рамке кверху от старт-кодона для облегчения экспрессии. Кодон и РНК оптимизация также были проведены, как это описано ранее (J. Yan, et al., Cellular immunity induced by a novel ВПЧ 18 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion consensus protein in mice and rhesus macaques, Vaccine. 26 (2008), 5210-5215; и J. Yan, et al., Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel ВПЧ-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen, Vaccine. 27 (2009), 431-440). Эндопротеолитический сайт расщепления был введен между белком Е6 и Е7 для надлежащего скручивания белка и лучшего процессинга CTL. Оба синтезированных рекомбинантных гена 6Е6Е7 и 11Е6Е7 имели в длину 840 пар оснований. Синтезированные гены с верифицированной последовательностью были субклонированы в вектор экспрессии pVAX в сайтах BamHI и XhoI соответственно для дальнейшего исследования. Консенсусные аминокислотные последовательности были получены трансляцией консенсусных нуклеотидных последовательностей.
После получения ВПЧ 6 и 11 консенсусных Е6 и Е7 последовательностей, оптимизация кодоном и РНК оптимизация были проведены, как это описано ранее (J. Yan, et al., Vaccine. 26 (2008), 5210-5215; и J. Yan, et al., Induction, Vaccine. 27 (2009), 431-440). Белки слияния, кодирующие тип 6 или 11 ВПЧ консенсусный белок слияния Е6/Е7 (6Е6Е7 или 11Е6Е7) были синтезированы, и последовательности верифицированы. Синтезированные 6Е6Е7 или 11Е6Е7 были расщеплены BamHI и XhoI, клонированы в вектор экспрессии pVAX (Invitrogen) при контроле непосредственно-раннего промотора цитомегаловируса, и такие конструкции были названы р6Е6Е7 или р11Е6Е7.
293-Т клетки были культивированы в 6-луночных планшетах и трансфицированы pVAX, р6Е6Е7 или р11Е6Е7 с использованием трансфекционного реагента FuGENE6 (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана). Спустя два дня после трансфекции клетки были лизированы с использованием модифицированного буфера для лизиса клеток RIPA, и клеточный лизат был собран. Были проведены анализы вестерн-блоттингом с использованием моноклонального антитела к НА (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) с визуализацией антимышиного козьего IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (SigmaAldrich, Сент-Луис, Миссури), с использованием системы для анализа вестерн-блоттингом ECLTM (Amersham, Пискатавей, Нью-Йорк).
Непрямые иммунофлуоресцентные анализы были проведены с использованием клеток рабдомиосаркомы человека (клетки RD) для верификации экспрессии р6Е6Е7 и р11Е6Е7. Клетки RD, культивированные в слайд-камерах, были культивированы с pVAX, р6Е6Е7 или р11Е6Е7 с использованием Tur- 25 045015 bofectin 8.0 (Origene, Роквил, Мэриленд). После клетки были фиксированы с PFA и пермеабилизированы 0,1% Triton-X в ФСБ. Клетки были подвергнуты 1-2 ч инкубациям с первичными и вторичными антителами в добавлении к промыванию ФСБ, дополненным глицином и БСА между инкубациями. Используемые первичные и вторичные антитела были моноклональным мышиным антителом к НА (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и FITC-конъюгированным антимышиным IgG (Abcam, Кембридж, Массачусетс), соответственно. Окрашивание по Хехсту также проводили для идентификации ядер клеток и локализации RD клеток. После завершения всех инкубаций, клетки были погружены на предметное стекло и фиксированы Fluoromount-G (Southern Biotech, Бирмингем, Алабама). Образцы были проанализированы и визуализированы с использованием конфокального микроскопа (CDB Microscopy Core, University of Pennsylvania Cell and Developmental Biology, Филадельфия, Пенсильвания).
Антигены ВПЧ 31, 33, 39, 45, 52 и 58 Е6Е7.
Генные последовательности Е6 и Е7 ВПЧ типа 31, 33, 39, 45, 52 и 58, индивидуально, были получены от GeneBank, и консенсусные нуклеотидные последовательности Е6 и Е7 были получены после проведения многократного выравнивания (тип 31 - SEQ ID NO: 18; тип 33 - SEQ ID NO: 6; тип 52 - SEQ ID NO: 20 и тип 58 - SEQ ID NO: 8). Методика многократного выравнивания, примененная в филогенетическом исследовании, включает применением Clustal X (версия 2.0). На основании результатов филогенетических анализов, нами разработаны типоспецифические консенсусные ДНК вакцины Е6/Е7.
Несколько модификаций были осуществлены после генерации консенсусной гибридной последовательности Е6/Е7.
Высокоэффективная лидерная последовательность была введена внутри рамки считывания в конструкцию выше стартового кодона, чтобы облегчить экспрессию. Кроме того, осуществляют оптимизацию кодонов и РНК, как было описано ранее (J. Yan, et al., Cellular immunity induced by a novel HPV18 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion consensus protein in mice and rhesus macaques, Vaccine. 26 (2008), 52105215; and J. Yan, et al., Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen, Vaccine. 27 (2009), 431-440). Сайт эндеопротеолитического расщепления был введен между белком Е6 и Е7 для надлежащего сворачивания белка и лучшего процессинга цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL). Синтетические гены с верифицированной последовательностью субклонируют в вектор экспрессии pVAX в сайтах BamHI и XhoI, соответственно, для дальнейшего изучения. Консенсусные последовательности аминокислот получают, транслируя консенсусные нуклеотидные последовательности.
Генерируют экспрессионную плазмиду, которая экспрессирует оптимизированные антигены вируса папилломы человека 31, 33, 52 и 58-Е6 & 7 (ВПЧ 31 Е6 & 7 - SEQ ID NO: 17, ВПЧ 33 Е6 & 7 SEQ ID NO: 5, ВПЧ 52 Е6 & 7 - SEQ ID NO: 19 и ВПЧ 58 E6 & 7 - SEQ ID NO: 7) под управлением промотора ЦМВ (PCMV), с бычьим гормоном роста на 3' конце и сигналом полиаденилирования (bGHpA), в которой применяется основа pVAX, содержащая ген резистентности к канамицину (Kan) и плазмидную точку начала репликации (pUC ori). Подобным образом, генерируют экспрессионную плазмиду, содержащую вставку, которая представляет собой оптимизированные антигены вируса папилломы человека 39 и 45 Е6&Е7 (последовательность ВПЧ 39 Е6&Е7, которая кодирует SEQ ID NO: 26; и последовательность ВПЧ 45 Е6&Е7, которая кодирует SEQ ID NO: 25).
Пример 2.
Мыши и вакцинация групп лечения.
В этом эксперименте использовали самок мышей C57BL/6 в возрасте между 6 и 8 неделями. Мыши были получены в Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Мышей содержали в университетской лаборатории по животным ресурсам в университете Пенсильвании (шт. Филадельфия, РА) в соответствии с политикой Комитета по использованию и содержанию животных университета Пенсильвании (IACUC) и национальных институтов здравоохранения. Мыши, используемые в этих экспериментах, были разделены на группы по четыре для иммунизации. Мыши были иммунизированы р6Е6Е7, р11Е6Е7 или обеими конструкциями, и группа pVAX служила в качестве отрицательного контроля.
Вакцинация ДНК и электропорация.
Каждая мышь получала три дозы по 20 мкг каждый ДНК плазмиды с интервалом в 14 дней. Мыши в группе, получавшей оба р6Е6Е7 и р11Е6Е7, получали 20 мкг обеих плазмид, в целом 40 мкг ДНК на вакцинацию. ДНК конструкции вводили посредством внутримышечной инъекции в правую четырехглавую мышцу, затем получали прямоугольные импульсы, вырабатывамые электропоратором CELLECTRA™ (Inovio Pharmaceuticals, Блу Белл, Пенсильвания). Электропоратор был настроен для доставки двух электрических импульсов при 0,2 А при 52 мс/пульс с разноской и задержкой в 1 с. Способ электропорации проводился, как это описано ранее.
Анализ способом иммуноферментных пятен ИФН-γ.
Мыши в обеих группах контроля и лечения были умерщвлены спустя 1 неделю после третьей иммунизации. Селезенка была собрана у каждой мыши и перенесена в среду RPMI-1640 с 10% ФБС и антибиотиками (R10). С использованием гомогенизатора (Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY) селезенка
- 26 045015 была пульверизирована и впоследствии перенесена в краситель для клеток и суспендирована в лизирующем буфере АСК. После удаления эритроцитов, спленоциты были выделены и суспендированы в среде R10. 96-луночные IP планшеты Multiscreen™ с высоким содержанием белка (Millipore, Бедфорд, Массачусетс) были предварительно покрыты моноклональным мышиным антителом захвата ИФН-γ (R & D Systems, Миннеаполис, Миннесота) и инкубированы в течение ночи при 4°С. После трех промываний 1х ФСБ, планшеты были блокированы 1% БСА и 5% сахарозой в 1х ФСБ в течение 2 ч при комнатной температуре. Выделенные спленоциты в среде R10 были подсчитаны и внесены в трех повторностях в лунки в концентрации 2x105 клеток на лунку. Два набора пептидов, распространяющихся на консенсусную последовательность Е6/Е7 для ВПЧ6 и ВПЧ11 были восстановлены в ДМСО (GenScript USA, Пискатавей, Нью-Йорк). Пептиды содержали 15 аминокислотных последовательностей, из которых 8 остатков частично совпадали с каждым последующим пептидом. Пептиды для ВПЧ 6 и 11, каждый, были разделены на два пула - один пул для Е6 и другой для Е7 - в концентрациях 2 мкг/мл в ДМСО. В лунки, оставленные для положительного и отрицательного контроля, был внесен Конкавалин A (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и питательная среда R10 вместо пептидов соответственно. Планшеты были впоследствии помещены в инкубатор с атмосферой 5% CO2. После инкубации в течение 24 ч при 37°С планшеты были промыты 1x ФСБ. В каждую лунку было добавлено биотинилированное антимышиное антитело ИФН-γ для определения (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) и затем проводили инкубацию в течение ночи при 4°С. Планшеты были впоследствии промыты и обработаны в соответствии с протоколом проявления цвета, предоставленным R & D Systems с использованием стрептавидина-АР и BCIP/NBT Plus (R & D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Лунки были высушены на воздухе в течение ночи, и пятна внутри лунок были просканированы и подсчитаны на системе считывания планшетов ELISpot с программным обеспечением ImmunoSpot®3 и ImmunoSpot®4 (Cellular Technology Ltd., Шейкер Хайтс, Огайо). Сообщенные показатели образующих пятна клеток были преобразованы в пятнообразующие единицы на 1x106 спленоцитов с использованием арифметики.
Принимая во внимание их чувствительность и способность обладать Т-клеточной активностью, анализы способом иммуноферментных пятен ИФН-γ использовали для определения количества антигенспецифических клеток, секретирующих ИФН-гамма в ответ на стимуляцию пептидами Е6 и Е7 ВПЧ 6 или 11.
Как это показано на фиг. 3А и 3В, среднее количество СОЕ/106 спленоцитов для мышей, вакцинированных р6Е6Е7, было 1442,8, в то время как среднее количество СОЕ/106 спленоцитов для мышей, иммунизированных р11Е6Е7, было 2845, что было по существу выше, чем в отрицательной контрольной группе. Таким образом, оба р6Е6Е7 и р11Е6Е7 были эффективны в вызове робастного типоспецифического Е6 и Е7-специфического иммунного ответа у мышей.
Интересно то, что вакцинация р6Е6Е7 или р11Е6Е7 также индуцировала перекрестный клеточный иммунный ответ. Аддитивная частота СОЕ/106 спленоцитов у мышей, иммунизированных р11Е6Е7 относительно пептидов ВПЧ 6 Е6/Е7, была 552,8 СОЕ/106 спленоцитов, и Е6/Е7 ВПЧ 11-специфический иммунный ответ у мышей с иммунизацией р6Е6Е7 был 888,3 СОЕ/106 спленоцитов. Белки Е6 ВПЧ 6 или 11 обладают примерно 80% идентичностью, в то время как белки Е7 ВПЧ 6 или 11 обладают примерно 84% идентичностью. Могут быть некоторые общие иммунные эпитопы между антигенами Е6 и Е7 ВПЧ 6 или 11. Перекрестная реакционноспособность, отмечаемая в анализе ELISpot для ИФН-гамма, указала на наличие общих иммунных эпитопов между антигенами Е6 и Е7 ВПЧ6 и 11.
Спленоциты у мышей, получавших оба р6Е6Е7 и р11Е6Е7 (комбинированная группа), также были подвержены анализу ELISpot для изучения иммунной интерференции этих двух конструкций при совместной вакцинации (фиг. 3А и 3В). В комбинированной группе отмечалось среднее число 1670 СОЕ/106 спленоцитов (у=55,7, р<0,001) относительно пептидов Е6 и Е7 ВПЧ 6. Эта же группа спленоцитов выработала 2010 СОЕ/106 спленоцитов (у=247,8, р=0,002) относительно пептидов Е6 и Е7 ВПЧ 11. Данные указывают, что совместная вакцинация двумя конструкциями может вызвать статистически значимый Е6 и Е7-специфический клеточный ответ относительно ВПЧ6 и ВПЧ 11 и что такой ответ не мешает один другому.
Эпитопное картирование.
Исследования эпитопным картированием были проведены для определения доминантных эпитопов в пептидных пулах для определения иммунных доминантных пептидов в консенсусных антигенах Е6/Е7 (фиг. 4А и 4В). Исследования проводили, как это было описано ранее для анализа ELISpot ИФН-γ. Вместо пулов для стимуляции спленоцитов использовали отдельные пептиды.
Каждый пептид, используемый в этом однопептидном анализе, являлся частично перекрывающимся фрагментов антигенов Е6 и Е7 ВПЧ6 или ВПЧ11. Данные картирования указали, что пептид 7 (TAEIYSYAYKQLKVL) SEQ ID NO: 11 был доминантным эпитопом для иммуногенов Е6 и Е7 ВПЧ6 (фиг. 4А). TAEIYSYAYKQLKVL SEQ ID NO: 11 содержал 8,9,10-мерных аминокислотных эпитопов, которые при верифицировании оказались Н2-КЬ ограниченными с использованием программного обеспечения для прогнозирования связывания HLA, предоставленного NIH BIMAS. Далее опишем ВПЧ11 Е6 и Е7специфический Т-клеточный иммунный ответ (фиг. 4В). Пептидный анализ также был проведен с пере
- 27 045015 крывающимися фрагментами Е6 и Е7 ВПЧ11. Эпитопное картирование показало, что доминантные эпитопы для антигенов Е6 и Е7 ВПЧ11 были пептидами 7 (TAEIYAYAYKNLKVV) SEQ ID NO: 12 и 27 (HCYEQLEDSSEDEVD) SEQ ID NO: 13. Как и для пептида 7 в анализе эпитопным картированием ВПЧ6, прогнозирующее HLA связывание программное обеспечение BIMAS подтвердило TAEIYAYAYKNLKW SEQ ID NO: 12 как эпитоп, ограниченный Н2-КЬ. Другая база данных пептидного связывания HLA, Immune Epitope Database and Analysis Resource, предоставленная NIH NIAID, подтвердила, что HCYEQLEDSSEDEVD SEQ ID NO: 13 является эпитопом, ограниченным Н2-КЬ. Посредством исследования картирования эпитопов было выявлено три иммунных субдоминантных пептида под номерами 6 (FCKNALTTAEIYSYA) SEQ ID NO: 14; 9 (LFRGGYPYAACACCL) SEQ ID NO: 15 и 13 (YAGYATTVEEETKQD) SEQ ID NO: 16.
Внутриклеточное окрашивание цитокинов.
В свете высокого иммунного ответа, показанного ELISpot для ИФН-γ, анализы внутриклеточного окрашивания цитокинов были проведены для предоставления более целостного взгляда на клеточный ответ, индуцируемый р6Е6Е7 и р11Е6Е7. Спленоциты из вакцинированных и невакцинированных групп мышей были выделены и стимулированы пептидами, перекрывающими Е6 и Е7 участки ВПЧ6 и ВПЧ11 в течение 4 ч при при 37°С в 5% CO2. Положительный и отрицательный контроль использовали в анализе способом замещения клеток в форбол 12-миристат 13-ацетате (РМА) и клеточной среде R10, соответственно. После инкубации клетки были вначале окрашены красителем ViViD (Invitrogen, Карлсбед, Калифорния) для дифференциации между живыми и мертвыми клетками, и затем все клетки были окрашены следующими поверхностными маркерами антител: АРС-Су7 антимышиное CD3e хомяка, PerCP-Су5.5 антимышиное CD4 крысы и АРС антимышиное CD8a крысы (BD Biosciences, Сан Диего, Калифорния). Клетки впоследствии были фиксированы с использованием набора Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Сан Диего, Калифорния). После фиксации в соответствии с протоколом производителя клетки были окрашены следующими внутриклеточными маркерами антител: Alexa Fluor 700 антимышиный ИФН-γ крысы, клон РЕ-Су7 антимышиный ФНО крысы и РЕ антимышиный IL-2 крысы (BD Biosciences, Сан Диего, Калифорния). После окрашивания клетки были фиксированы раствором ФСБ, содержащим 2% параформальдегида. Подготовленные клетки были получены с использованием проточного цитометра LSR II, оснащенного программным обеспечением BD FACSDiva (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния). Полученные данные были проанализированы с использованием последней версии программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ашленд, Оригон). Явления CD4+ и CD8+ были выделены с использованием следующей последовательности блоков: синглет из FSC-A в сравнении с FSC-H, все спленоциты из FSC-A в сравнении с SSC-A, живые клетки из красителя ViViD (Pacific Blue) в сравнении с SSC-A, CD3+ клетки из CD3 (АРС-Су7) в сравнении с SSC-A, и CD4+ или CD8+ из CD4 (PerCP-Су5.5: положительный - CD4+, отрицательный - CD8+) в сравнении с SSC-A. Последние две популяции были блокированы относительно Alexa Fluor 700, РЕ-Су7 и РЕ для наблюдения изменений в выработке IL-2, ИФН-γ и ФНО-α соответственно.
Клетки были блокированы таким образом, что данные внутриклеточного окрашивания цитокинов могут быть дифференцированы по CD4+ и CD8+ клеточному ответу. При стимуляции ВПЧ 6 Е6 и Е7-специфическими пептидами у мышей, вакцинированных р6Е6Е7, отмечались средние значение 0,163% (у=0,09), 0,003% (у=0,07) и 0,188% (у=0,20) для всех клеток CD4+, вырабатывающих ИФН-γ, ФНО-α и IL-2 соответственно (фиг. 5А). У такой же группы мышей были средние показатели 3,323% (у=1,39), 0,838% (у=0,32) и 1,172% (у=1,81) для всех клеток CD8+, вырабатывающих ИФН-γ, ФНО-α и IL-2 соответственно. Подобные данные для внутриклеточных цитокинов были собраны с использованием спленоцитов у мышей, вакцинированных р11Е6Е7, после инкубации с антигенами Е6 и Е7 ВПЧ 11 (фиг. 5В). Для всех клеток CD4+ у мышей с вакцинацией р11Е6Е7 средний показатель 0,051% (у=0,04) привел к выработке ИФН-γ, 0,068% (у=0,09) привел к выработке ФНО-α и 0,026% (у=0,037) привел к выработке IL-2. Кроме того, среднее значение 4,52% (у=2,53), 2,08% (у=1,56) и 0,21% (у=0,22) всех клеток CD8+ у мышей с вакцинацией р11Е6Е7 привело к выработке ИФН-γ, ФНО-α и IL-2 соответственно. За исключением нескольких панелей, процент клеток, вырабатывающих цитокины, при лечении в сравнении с соответствующими группами без лечения был статистически значимым при доверительном интервале 89% или выше. При наблюдении величины выработки цитокинов клетками CD4+ в сравнении с Т-клетками CD8+ можно прийти к выводу, что иммунный ответ, вызванный р6Е6Е7 и р11Е6Е7, сильно смещен в сторону выработки CD8+ лимфоцитов, которые связаны со всеми моделями в собственном клеточном клиренсе.
Статистический анализ.
Для анализа статической значимости всех количественных данных, полученных в этом исследовании, использовали критерий Стьюдента. Если не указано иное, значения р были рассчитаны для определения статистической значимости при различных доверительных интервалах.
Данное исследование выявило убедительные доказательства того, что ДНК-вакцины могут достичь уровня иммуногенности, выявленного в экспериментах с использованием других популярных и традиционных платформ вакцин. Высокие уровни клеточного ответа, измеренные в других подобных исследова
- 28 045015 ниях ДНК-вакцины, специфической к Е6 и Е7 ВПЧ, были связаны с данными, указывающими на предположительную профилактическую и терапевтическую противоопухолевую эффективность. Большая часть ВПЧ-связанных моделей исследования и стимуляции возникновения заболевания направлены на рак шейки матки. Принимая во внимание, что ВПЧ6 и ВПЧ11 являются такими же релевантными к раку шейки матки, как и другие серотипы ВПЧ, терапевтическая эффективность р6Е6Е7 и р11Е6Е7 не может быть полностью оценена с использованием стандартных моделей стимуляции возникновения заболевания ВПЧ. Было бы полезным определение защитного и терапевтического потенциала р6Е6Е7 и р11Е6Е7 при возникновении соответствующих моделей стимуляции возникновения заболевания. Таким образом, можно только предложить иммуногенную эффективность р6Е6Е7 и р11Е6Е7 при отслеживании высоких уровней ИФН-γ и выработке цитокинов, определенных анализами ELISpot и внутриклеточным окрашиванием цитокинов. Тем не менее было выявлено, что такие уровни являются по существу робастными по величине и обещанием того, что две конструкции будут вызывать значительные уровни клеточного иммунного ответа. По причине того, что злокачественные новообразования, связанные с ВПЧ, являются вторичными после сопутствующей инфекции множественных серотипов, существует большая необходимость в дополнительном изучении возможности комбинации вакцин, направленных на различные серотипы вируса. Дополнительное исследование, изучающее динамику Т-клеток и конкуренцию вакцин, оправдано для дальнейшей характеристики эффектов конкурентной вакцинации из двух плазмид.
Внутриклеточное окрашивание цитокинов показало, что вакцинация р6Е6Е7 и р11Е6Е7 была способна вызвать значительный процент Т-клеток, вырабатывающих ИФН-γ, ФНО-α и IL-2. С учетом известной в данный момент функции на иммунную систему, ИФН-γ исторически использовался в качестве меры клеточного иммунного ответа. Некоторые из таких важных ролей включают способность модулировать и стимулировать врожденный и адаптивный иммунитет. Кроме того, широко принято, что основными производителями ИФН-γ являются Т-клетки, что делает выработку ИФН-γ приемлемой мерой измерения клеточной иммуногенности после воздействия отдельной вакцины на антигены. ФНО-α является другим цитокином, который участвует в регуляции иммунной системы. Его известная способность индуцировать апоптоз и регулировать пролиферацию опухоли делает его важным параметром для учета при характеристике иммунного ответа после вакцинации. Выработка ФНО-α может быть дополнительно интересна с учетом потенциальных свойств пролиферации опухоли ВПЧ6 и ВПЧ11. IL-2 является другой сигнальной молекулой, которая, как отмечалось, играет центральную роль в пролиферации и дифференциации Т-клеток в иммунной системе. Как следствие, IL-2 часто исследуют в сочетании с другими цитокинами для получения дополнительной перспективы на значение и качество отдельного иммунного ответа. Принимая во внимание все указанное выше, процент по существу клеток CD4+ м CD8 +, вырабатывающих ИФН-γ, ФНО-α и IL-2 после вакцинации р6Е6Е7, указывает на то, что вакцина была успешной в индуцировании сильного иммунного ответа. За исключением клеток CD4+, секретирующих IL-2, такая же тенденция справедлива для клеток, выделенных у мышей, вакцинированных р11Е6Е7. Кроме того, следует отметить, что то, что клетки CD8+ вызывают сильный иммунный ответ у вакцинированных мышей - признак того, что это является важным в оценке противоопухолевой эффективности двух плазмид.
Пример 3.
Мыши и вакцинация групп лечения.
Можно использовать мышей-самок C57BL/6 в возрасте 6-8 недель. Мышей можно получить из Jackson Laboratory (Бар-Харбор, Мэн). Мышей можно разделить на группы по 4 для иммунизации. Мышей можно иммунизировать одной из следующих комбинаций: а) плазмида, кодирующая ВПЧ 16Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 18Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 6Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 11Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 31Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 33Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 52Е6Е7 и плазмида, кодирующая ВПЧ 58Е6Е7; b) плазмида, кодирующая ВПЧ 16Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 18Е6Е7, плазмида, кодирующая плазмида, кодирующая ВПЧ 31Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 33Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 52Е6Е7 и плазмида, кодирующая ВПЧ 58Е6Е7; с) плазмида, кодирующая ВПЧ 16Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 18Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 31Е6Е7 и плазмида, кодирующая ВПЧ 33Е6Е7; d) плазмида, кодирующая ВПЧ 16Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 18Е6Е7, плазмида, кодирующая ВПЧ 6Е6Е7 и плазмида, кодирующая ВПЧ 11Е6Е7; и группа pVAX, служащая отрицательным контролем.
ДНК вакцинация и электропорация.
Каждая мышь получает три дозы по 20 мкг суммарно каждой ДНК плазмиды с промежутками 14 дней. Конструкции ДНК вводят внутримышечной инъекцией в мышцу правого квадрицепса, с последующими прямоугольными импульсами, генерируемыми электропоратором CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Блю Белл, Пенсильвания). Электропоратор настраивают таким образом, чтобы доставлять два электрических импульса по 0,2 А, 52 мс/импульс, разделенные 1-секундной задержкой. Процедуру электропорации осуществляют, как было описано ранее, в соответствии с информацией CELLECTRA, любезно предоставленной Inovio Pharmaceuticals.
Анализ IFN-γ ELISpot.
Мышей в группах лечения и контрольных группах умерщвляют через 1 неделю после третьей им
- 29 045015 мунизации. Извлекают селезенку каждой мыши и переносят в среду RPMI-1640, содержащую 10% сыворотки телячьего эмбриона (СТЭ) и антибиотики (R10). С помощью гомогенизатора Stomacher (Seward Laboratory Systems, Богемия, Нью-Йорк), селезенку измельчают, затем пропускают сквозь фильтр для клеток и суспендируют в лизирующем буфере АСК. После удаления эритроцитов спленоциты выделяют и суспендируют в среде R10. 96-луночные планшеты Multiscreen IP с высоким содержанием белка (Millipore, Бэдфорд, Массачусетс) предварительно покрывают моноклональным мышиным IFN-γ захватывающим антителом (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) и инкубируют в течение ночи при 4°С. После трехкратного промывания 1 х фосфатно-солевым буфером (ФСБ), планшеты блокируют 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 5% сахарозы в 1х ФСБ в течение 2 ч при комнатной температуре. Выделенные спленоциты в среде R10 подсчитывают и помещают в трех экземплярах в лунки с плотностью 2х105 клеток на лунку. Два набора пептидов, соединяющих консенсусную последовательность Е6/Е7, для каждой ВПЧ плазмиды разбавляют ДМСО (GenScript USA, Пискатавей, НьюЙорк). Пептиды содержат последовательности из 15 аминокислот, из которых 8 остатков перекрываются для каждого последующего пептида. Пептиды для каждой ВПЧ плазмиды делят на 2 пула - один пул для Е6 и другой для Е7 - в концентрациях 2 мкг/мл в ДМСО. Лунки, зарезервированные для положительного и отрицательного контроля, получают Конкавалин A (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и питательную среду R10 вместо пептидов, соответственно. Затем планшеты помешают в инкубатор с атмосферой, содержащей 5% CO2. После инкубации в течение 24 ч при 37°С, лунки промывают 1х ФСБ. Биотинилированное антимышиное антитело для выявления IFN-γ (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота) добавляют в каждую лунку, и затем инкубируют на протяжении ночи при 4°С. Далее планшеты промывают и обрабатывают в соответствии с протоколом проявления цвета, предоставленным R&D Systems, с применением Стрептавидино-щелочной фосфатазы (ЩФ) и 5-бром-4-хлор-3'-индолилфосфата/нитро-голубого тетразолия BCIP/NBT Plus (R & D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Лунки сушат на воздухе на протяжении ночи, пятна в лунках сканируют и производят подсчет с помощью системы для считывания планшетов ELISpot и программного обеспечения ImmunoSpot® 3 и ImmunoSpot®4 (Cellular Technology Ltd., Шейкер Хайтс, Огайо).
Зарегистрированные импульсы бляшкообразующих клеток преобразуют в показательные бляшкообразующие единицы на 1 х 106 спленоцитов с помощью расчетов.
С учетом их чувствительности и способности иллюстрировать Т-клеточную активность, анализы ELISpot IFN-γ применяют для определения количества антиген-специфичных интерферон-гаммасекретирующих клеток в ответ на стимуляцию пептидами Е6 и Е7 ВПЧ 6 или 11.
Пример 4.
Результаты VGX-3100 Фазы 1 у человека (комбинация ВПЧ 16 Е6Е7 и ВПЧ 18 Е6Е7).
Пациенты с предварительно леченой цервикальной интраэпителиальной дисплазией (CIN) 2/3.
В/м введение комбинированной ДНК вакцины VGX-3100 с применением электропорационного устройства (ЕР) постоянного тока CELLECTRA®.
См. Bagarazzi et al. Sci. Transl. Med. 4, 155ra138 (2012), которая включена в настоящий документ в полном объеме.
| Когорта | Количество пациентов | Доза (мг) |
| 1 | 6 | 0,3 X 2 плазмиды (ВПЧ16/ВПЧ18) |
| 2 | 6 | 1X2 плазмиды (ВПЧ16/ВПЧ18) |
| 3 | 6 | 3X2 плазмиды (ВПЧ16/ВПЧ18) |
Ответ в форме антител.
Антитела против всех четырех антигенов с высокими титрами у 15/18 (83%) и подтверждение вестерн-блоттингом наличия у всех пациентов до 9 месяцев.
Антигенспецифические клеточные ответы на ВПЧ 16, 18 Е6, Е7:
14/18 (78%) положительный по данным ELISpot IFN-γ (>50 синцитий-образующих единиц (СОЕ)/106 МКПК);
увеличение при повышении дозы до >2500 СОЕ/106 МКПК для одного антигена, >5670 СОЕ/106 МКПК для всех четырех антигенов;
пять субъектов отвечали на все четыре антигена;
ответ длился до 9 месяцев после первичной серии;
4-я доза усиливает Т-клеточные ответы до >2 лет;
дейкоцитарный антиген человека (HLA) DR+/CD38+ CD8+ Т-клетки высвобождают Гранзим В/перфорин для уничтожения клеток
Claims (8)
1. Белок для стимуляции иммунного ответа против по меньшей мере ВПЧ 31 и 52, содержащий консенсусный антиген ВПЧ, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 20; аминокислотной последовательности, гомологичной по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 18, аминокислотной последовательности, гомологичной по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 20, фрагмента последовательности SEQ ID NO: 18, содержащего 90% или более последовательности SEQ ID NO: 18, и фрагмента последовательности SEQ ID NO: 20, содержащего 90% или более последовательности SEQ ID NO: 20.
2. Белок по п.1, содержащий фрагмент последовательности SEQ ID NO: 18 без лидерной последовательности на N-конце, которая представляет собой последовательность, представленную SEQ ID NO: 10; или фрагмент SEQ ID NO: 20 без лидерной последовательности на N-конце, которая представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 10.
3. Белок по п.1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20.
4. Белок по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 95% последовательности SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20.
5. Белок по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 98% последовательности SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20.
6. Белок по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, гомологичную по меньшей мере на 99% последовательности SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20.
7. Фармацевтическая композиция для применения по меньшей мере против ВПЧ 31 и 52, содержащая активный ингредиент, который представляет собой антиген ВПЧ, содержащий белок по п.1.
8. Способ стимуляции эффективного иммунного ответа по меньшей мере против ВПЧ 31 и 52, включающий введение фармацевтической композиции по п.7.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61/777,198 | 2013-03-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045015B1 true EA045015B1 (ru) | 2023-10-26 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11844830B2 (en) | Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same | |
| AU2017265076B2 (en) | Vaccines for Human Papilloma Virus and methods for using the same | |
| US9050287B2 (en) | Vaccines for human papilloma virus and methods for using the same | |
| JP2022068160A (ja) | ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法 | |
| JP6567824B2 (ja) | ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法 | |
| JP6795468B2 (ja) | ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法 | |
| EA045015B1 (ru) | Усовершенствованные вакцины против вируса папилломы человека и способы их применения | |
| KR20240093830A (ko) | 인간 파필로마 바이러스에 대한 백신 및 이것을 사용하는 방법 |