JP2022554132A - 再発性呼吸器乳頭腫症のための改善されたワクチンおよびそれを使用するための方法 - Google Patents

Abstract

ＲＲＰの治療および予防のための抗ＨＰＶ免疫原およびそれらをコードする核酸分子の使用が開示される。薬学的組成物、ＤＮＡプラスミドを含む組換えワクチン、および弱毒生ワクチンが開示され、ならびにＲＲＰを治療または予防するために免疫応答を誘導する方法が開示される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／９２５，２８３号に対する優先権および利益を主張する。

本発明は、改善されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチン、免疫応答を誘導するための、ならびに再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）に対して個体を予防的および／または治療的に免疫化するための改善された方法に関する。

ヒトパピローマウイルス関連（ＨＰＶ＋）悪性腫瘍は、新たに出現した世界的なエピデミックである（Ｇｒａｄｉｓｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＪＮＣＣＮ．２０１４；１２（４）：５４２－９０．）。ＨＰＶ関連気道消化器前がん病変および悪性腫瘍は、中咽頭、喉頭、および上気道で発生し得る。気道消化器の悪性腫瘍の大部分の病因におけるＨＰＶ６の役割は不明なままであるが、その役割は、喉頭上皮の最も一般的な良性腫瘍である、再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）において因果関係があるとして広く受け入れられている（Ｍｏｕｎｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８２；７９（１７）：５４２５－９、Ｇｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８３；８０（２）：５６０－３、Ｂｏｎａｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＡＰＭＩＳ．２０１０；１１８（６－７）：４５５－７０）。ＲＲＰは稀であり、発生率は米国において成人１００，０００人あたり１．８と推定されている（Ｗｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５；３５２（２５）：２５８９－９７）。ほとんどの病変は良性であるが、いくつかは悪性形質転換を起こし、ＲＲＰを有する患者は、喉頭腫瘍およびがん腫を発症するより高いリスクを有する（Ｏｍｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ．２０１４；９（６）：ｅ９９１１４）。

ＲＲＰの臨床経過は、罹患した個体間で大きく異なり得る。治療なしでの積極的モニタリング、手術、放射線療法、または組み合わせを含む、治療の選択は、いくつかの要因に依存する。通常、対症的管理のための乳頭腫の繰り返される外科的除去は、治療の柱であり続ける（Ｄｅｒｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２０１９；５２（４）：６６９－７９）。いくつかの場合では、悪性形質転換が起こり得、これは通常、予後不良に関連する。悪性疾患を有する幾人かのそのような患者は、潜在的に根治的な手術を含む、サルベージ療法の候補となり得る（Ｒｉｃｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ－－ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｕｒｇｅｒｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ－Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ．２００７；１３６（１）：９８－１０３）。この環境において選択された患者は放射線の恩恵を受け得るが、このアプローチの罹患率は実質的である（Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２００８；３１（４）：３９３－８）。最近、ＲＲＰを有する患者におけるペムブロリズマブの第ＩＩ相試験は、４３％の奏効率を示し、ＲＲＰの免疫療法管理の根拠を支持する（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１９；３７（１５＿ｓｕｐｐｌ）：２５０２）。

よって、当該技術分野では、ＲＲＰの治療または予防のための改善された組成物および方法の必要性がある。本発明は、この満たされていない必要性を満たす。

本発明の態様は、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む組成物、およびＲＲＰの治療または予防のためのそれらの使用を提供する。

別の態様は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択されるＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４をコードするヌクレオチド配列である５’末端のリーダー配列を有しない。

本発明の別の態様では、以下からなる群から選択されるＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む組成物が提供される：配列番号１、配列番号１と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列、配列番号１の断片、配列番号１の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列 配列番号３を有する５’末端にリーダー配列を有しない。

提供されるヌクレオチド配列は、プラスミドであり得る。

追加の態様では、開示されるヌクレオチド配列を含む薬学的組成物が提供される。

いくつかの態様では、個体における有効な免疫応答を誘導することによって、個体におけるＲＲＰを治療または予防する方法であって、当該個体に、提供されるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む組成物を投与することを含む、方法がある。方法は、好ましくは、提供されるヌクレオチド配列をエレクトロポレーションによって個体に導入するステップを含む。

いくつかの態様では、方法は、個体に、アジュバントを含む組成物を投与することをさらに含む。一実施形態では、方法は、個体に、ＩＬ－１２をコードする核酸分子を含む組成物を投与することをさらに含む。例えば、特定の実施形態では、方法は、個体に、ＩＬ－１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットのうちの１つ以上をコードする核酸分子を含む組成物を投与することをさらに含む。

いくつかの態様では、方法は、個体に、ＩＬ－１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与することを含む。一実施形態では、ｐ３５をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６をコードするヌクレオチド配列と、配列番号６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と、配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｐ４０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８をコードするヌクレオチド配列と、配列番号８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と、配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

ＨＰＶ６ Ｅ６およびＨＰＶ６ Ｅ７ ＳｙｎＣｏｎ抗原の比較３Ｄモデルである。Ｅ６は、モノマーとしてモデル化され、Ｅ７の秩序Ｃ末端領域は、ホモダイマーとしてモデル化される。無秩序Ｎ末端が図に示される。両方とも、側鎖および透明な溶媒露出表面を備えたリボンフォーマットで可視化される。両モデル上のジンクフィンガーモチーフにはアノテーションが付加される。 インターフェロンガンマは、ＲＲＰ患者におけるＨＰＶ６ Ｅ６およびＨＰＶ６ Ｅ７特異的Ｔ細胞によって産生される。対象６０３（上パネル）および６０４（下パネル）は、試験全体にわたって縦断的にＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてインターフェロンガンマを産生する能力について追跡された。Ｅ６特異的活性は青色の破線で表示され、Ｅ７特異的活性は青色の実線で表示され、両方の抗原の合計は黒色の実線で表示される。長期追跡調査（ＬＴＦＵ）時点は、用量４の完了後の時間に関して記載され、説明される。 ＩＮＯ－３１０６は、ＲＲＰ患者におけるＨＰＶ６特異的細胞傷害性リンパ球細胞を活性化する。フローサイトメトリーを実施して、免疫療法の前および後に対象から採取されたＨＰＶ６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカー発現を評価した。患者６０４におけるＩＮＯ－３１０６による治療前（上パネル）および後（下パネル）のＣＤ１３７およびＣＤ３８の発現は、左欄に記載される。患者６０４におけるＩＮＯ－３１０６による治療前（上パネル）および後（下パネル）のＫｉ６７およびＣＤ６９の発現は、右欄に記載される。 免疫遺伝子転写物は、ＩＮＯ－３１０６による治療後に、ＨＰＶ６特異的な様式で差次的に調節される。ワクチン接種前および後の刺激細胞対未刺激細胞における差次的に発現された遺伝子の倍率差を示すヒートマップ。（図４Ａ）２４時間にわたるペプチドプール対培地単独で刺激された細胞における遺伝子発現の倍率変化（≧２倍）。（図４Ｂ）１１日のＴ細胞増殖、続いて２４時間にわたるペプチドプール対培地単独での細胞の再刺激後の遺伝子発現の倍率変化（≧２倍）。データはｌｏｇ２倍率変化に変換され、赤色は上方調節を示し、緑色は下方調節を示す。 同上。 ＩＮＯ－３１０６によるＲＲＰ患者の治療は、手術の回避の形態で臨床的利益を与える。上パネル－対象６０４および６０３が手術を必要としなかった時間の長さを日数で示すスイマープロット。赤色の点線は、ＩＮＯ－３１０６による介入前の以前の手術頻度に基づいて手術が予想される時点を示す。Φは、対象６０４が手術を必要とした時点を示す。λは、示された時点で、対象６０３が手術を必要としないままであることを示す。左下パネル－緑色のバーは、左ｙ軸まで追跡し、ＣＤ３８、Ｋｉ６７、グランザイムＡ、グランザイムＢ、およびパーフォリンを発現するＨＰＶ６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きさを示す。青色のバーは、右ｙ軸まで追跡し、これらの対象について予想される手術頻度に対する手術を必要としない時間の倍率変化を示す。右下－チャートは、患者ＩＤ、ＩＮＯ－３１０６による治療後にこれらの対象によって経験される手術を必要としない時間の倍率増加、手術を必要としない時間の合計、および手術を必要としない時間の増加を示す。 対象６０１についてのＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７細胞性免疫応答を評価する実験の結果を示す。

好ましい実施形態の詳細な説明
定義．
本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することが意図されない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数の参照物を含む。

本明細書における数値範囲の列挙について、同じ程度の精度でそれらの間に介在する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲については、数字７および８が、６および９に加えて企図され、６．０～７．０の範囲については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図される。

ａ．アジュバント
本明細書で使用される「アジュバント」は、ＤＮＡプラスミドによってコードされる１つ以上の抗原の抗原性を増強するために本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドワクチンに添加され、以下に記載される核酸配列をコードする任意の分子を意味し得る。

ｂ．抗体
「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および一本鎖抗体を含む、それらの断片、断片、もしくは誘導体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二官能性抗体、およびそれらの誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはそれらの混合物であり得、これは所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示す。

ｃ．抗原
「抗原」は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７ドメイン、ならびに好ましくは、それらの間のエンドプロテアーゼ分解切断部位とのＥ６およびＥ７融合体を有するタンパク質を指す。抗原には、配列番号２（サブタイプ６）、本明細書に記載される長さのその断片、バリアント、すなわち、本明細書に記載される配列番号２に相同である配列を有するタンパク質、本明細書に記載される長さを有するバリアントの断片、およびそれらの組み合わせが含まれる。抗原は、配列番号４のＩｇＥリーダー配列を有してもよく、あるいはＮ末端からそのような配列を除去してもよい。抗原は、任意に、他のタンパク質由来のものなどのシグナルペプチドを含み得る。

ｄ．コード配列
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」は、上記セクションｃに記載されるような抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指すことを意味し得る。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を誘導することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、調節要素に作動可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列、例えば、配列番号３などのＩｇＥリーダー配列をさらに含み得る。

ｅ．補体
本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、核酸を意味し得、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対形成を意味し得る。

ｆ．断片
「断片」は、抗原に対して哺乳動物における免疫応答を誘発することができる抗原のポリペプチド断片を意味し得る。抗原の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンありまたはなしで、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸を欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、特定の全長抗原の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、好ましくは、抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同であるポリペプチドの断片を含み、加えて、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、抗原の断片に連結され得る。

抗原をコードする核酸配列の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンをコードする配列ありまたはなしで、５’および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、特定の全長コード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、好ましくは、抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同であるポリペプチドをコードする断片を含み、加えて任意に、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。

ｇ．同一
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が、特定の領域にわたって同じである残基の特定のパーセンテージを有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、２つの配列を特定の領域にわたって比較し、両方の配列において同一の残基が生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域における位置の総数で割り、結果を１００乗して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算され得る。２つの配列が異なる長さを有するか、またはアラインメントが１つ以上の食い違った末端をもたらし、特定の比較領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、計算の分子ではなく分母に含まれる。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、同等とみなされ得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行われ得る。

ｈ．免疫応答
本明細書で使用される「免疫応答」は、提供されるＤＮＡプラスミドワクチンを介した１つ以上の抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味し得る。免疫応答は、細胞もしくは体液応答、または両方の形態であり得る。

ｉ．核酸
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も画定する。よって、核酸は、描写される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、所与の核酸と同じ目的で使用され得る。よって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。よって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。

核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得られ得る。

ｊ．作動可能に連結
本明細書で使用される「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子において、そのプロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なしに適応され得る。

ｋ．プロモーター
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与、活性化、または増強することができる合成分子または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／またはその空間発現および／もしくは時間発現を改変するために１つ以上の特異的転写調節配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構成的に、あるいは発現が生じる細胞、組織もしくは臓器に対して、または発現が生じる発達段階に対して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、差次的に調節し得る。プロモーターの代表例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０前期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０前期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

ｌ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、核酸の複雑な混合物のように、第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況において異なるであろう。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５～１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡で占有される）温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）であり得る。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄。

ｍ．実質的に相補的
本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。

ｎ．実質的に同一
本明細書で使用される「実質的に同一」とは、第１の配列が第２の配列の補体に実質的に相補的である場合、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または核酸に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味し得る。

ｏ．バリアント
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列もしくはその一部分の補体、（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）参照される核酸、その補体、もしくはそれと実質的に同一である配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味し得る。

アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列において異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、類似の特性（例えば、帯電領域の親水性、程度、および分布）を有する異なるアミノ酸でアミノ酸を置き換えることは、典型的には、わずかな変化を伴うものとして当該技術分野で認識されている。これらのわずかな変化は、当該技術分野で理解されるように、アミノ酸の親水性指数を考慮することによって、部分的に、特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。類似のハイドロパシー指数のアミノ酸は、置換され、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当該技術分野で知られている。一態様では、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにすることもできる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考察は、抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。参照によって本明細書に完全に組み込まれる、米国特許第４，５５４，１０１号。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野で理解されるように、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いの±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行われ得る。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一貫して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存すると理解される。

ｐ．ベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。

免疫原によって誘導される細胞性免疫応答を増強するための多相戦略から生じる改善されたワクチンが開示される。修飾コンセンサス配列が生成された。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子修飾も開示される。新規の構築物は、対応するコドン最適化免疫原よりも強力で広範な細胞性免疫応答を誘発するように設計されている。

改善されたＨＰＶワクチンは、ＲＲＰに対する予防的または治療的戦略を媒介するように、免疫原として特に有効となるエピトープを有するタンパク質をコードするタンパク質および遺伝子構築物に基づく。したがって、ワクチンは、治療的または予防的免疫応答を誘導し得る。いくつかの実施形態では、免疫原を送達する手段は、ＤＮＡワクチン、組換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む組成物、弱毒ワクチン、または死菌ワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒ワクチン、および１つ以上の死菌ワクチンからなる群から選択される組み合わせを含む。

いくつかの実施形態によれば、ワクチンは、個体の免疫系の活性を調節し、それによってＲＲＰを治療するＨＰＶに対する免疫応答を増強するために、個体に送達される。タンパク質をコードする核酸分子が個体の細胞によって取り込まれると、ヌクレオチド配列が細胞において発現され、タンパク質がそれによって個体に送達される。プラスミドなどの核酸分子上のタンパク質のコード配列を、組換えワクチンの一部としておよび弱毒ワクチンの一部として、単離されたタンパク質またはベクターの一部として送達する方法が提供される。

個体におけるＲＲＰに対する予防的および／または治療的処置を提供する組成物および方法が提供される。

免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を送達するための組成物は、調節要素に作動可能に連結される。組成物は、免疫原をコードするプラスミド、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組換えワクチン、本発明のタンパク質をコードするおよび／もしくは本発明のタンパク質を含む弱毒生病原体、本発明のタンパク質を含む死菌病原体、または本発明のタンパク質を含むリポソームもしくはサブユニットワクチンなどの組成物を含み得る。本発明はさらに、組成物を含む注射可能な薬学的組成物に関する。

本発明の態様は、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。

別の態様は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択されるＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と、配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択されるＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原を含む。

本発明の別の態様では、以下からなる群から選択されるＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む組成物が提供される：配列番号１、配列番号１と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列、配列番号１の断片、配列番号１の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、リーダー配列が不在である。一実施形態では、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原を含むヌクレオチド配列は、リーダー配列が不在である。特に、配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含むＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原は、５’末端のリーダー配列、例えば、配列番号４をコードするヌクレオチド配列が不在である。特に、ヌクレオチド配列 配列番号１を含むＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原は、５’末端のリーダー配列、例えば、ヌクレオチド配列 配列番号３が不在である。

いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、提供されるヌクレオチド配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または９８％もしくは９９％相同であり得る。

提供されるヌクレオチド配列は、プラスミド、ウイルスベクター、脂質ベクター、ナノ粒子、好ましくはプラスミドを含む、様々な既知のベクターまたは送達系のうちの１つに含まれ得る。

追加の態様では、開示されるヌクレオチド配列を含む薬学的組成物が提供される。

いくつかの態様では、ＨＰＶの２つ以上のサブタイプに対する個体における有効な免疫応答を誘導し、それによってＲＲＰに対する予防的または治療的治療を提供する方法であって、当該個体に、提供されるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む組成物を投与することを含み、好ましくは、組成物が、２つ以上の抗原を有する、方法がある。方法は、好ましくは、提供されるヌクレオチド配列をエレクトロポレーションによって個体に導入するステップを含む。

配列番号１は、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号１は、配列番号１の５’末端でヌクレオチド配列に連結されたＩｇＥリーダー配列 配列番号３を含む。配列番号２は、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端にＩｇＥリーダー配列 配列番号４を含む。ＩｇＥリーダー配列は、配列番号４であり、配列番号３によってコードすることができる。ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原に関するさらなる情報は、少なくとも、参照によってその全体が組み込まれる、米国特許第９，０５０，２８７号に見出すことができる。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号２、または配列番号２をコードする核酸分子を含む。

配列番号２の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンありまたはなしで、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸を欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。配列番号２の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、全長配列番号２の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含むことができる。断片は、好ましくは、配列番号２と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同である配列番号２の断片を含み、加えて、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを含むことができる。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片に連結され得る。

核酸配列 配列番号１の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンをコードする配列ありまたはなしで、５’および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、全長コード配列 配列番号１の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含むことができる。断片は、好ましくは、抗原配列番号２と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同であるポリペプチドをコードする断片を含み、加えて任意に、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片に連結され得る。

いくつかの実施形態では、配列番号１の断片は、７８６個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、８３０個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、８５６個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、８６５個以上のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるものなどの配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。

いくつかの実施形態では、配列番号２の断片は、２５２個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、２６６個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、２７５個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、２７８個以上のアミノ酸を含み得る。

一実施形態では、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７免疫原またはＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７免疫原をコードする核酸分子は、ＩＬ－１２と組み合わせて投与される。一実施形態では、ＩＬ－１２は、合成ＤＮＡプラスミドからコードされる。

いくつかの実施形態では、方法は、ＩＬ－１２のｐ３５および／またはｐ４０サブユニットをコードする核酸分子を含む組成物を投与することを含む。

配列番号５は、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号６は、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号６、または配列番号６をコードする核酸分子を含む。

配列番号６の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンありまたはなしで、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸を欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。配列番号６の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、全長配列番号６の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含むことができる。断片は、好ましくは、配列番号６と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同である配列番号６の断片を含み、加えて、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片に連結され得る。

核酸配列 配列番号５の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンをコードする配列ありまたはなしで、５’および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、全長コード配列 配列番号５の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含むことができる。断片は、好ましくは、抗原配列番号６と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同であるポリペプチドをコードする断片を含み、加えて任意に、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片に連結され得る。

いくつかの実施形態では、配列番号５の断片は、５００個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、５５０個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、６００個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、６３０個以上のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるものなどの配列番号５の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号５の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。

いくつかの実施形態では、配列番号６の断片は、１５０個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、１７５個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、２００個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、２１０個以上のアミノ酸を含み得る。

配列番号７は、ＩＬ－１２のｐ４０サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号８は、ＩＬ－１２のｐ３５サブユニットのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ワクチンは、配列番号８、または配列番号８をコードする核酸分子を含む。

配列番号８の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンありまたはなしで、Ｎおよび／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸を欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。配列番号８の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、全長配列番号８の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含むことができる。断片は、好ましくは、配列番号８と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同である配列番号８の断片を含み、加えて、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片に連結され得る。

核酸配列 配列番号７の断片は、各々の場合において、１位におけるシグナルペプチドおよび／またはメチオニンをコードする配列ありまたはなしで、５’および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠損していることを除いて、全長と１００％同一であり得る。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く、全長コード配列 配列番号７の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含むことができる。断片は、好ましくは、抗原配列番号８と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上相同であるポリペプチドをコードする断片を含み、加えて任意に、相同性パーセントを計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含むことができる。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片に連結され得る。

いくつかの実施形態では、配列番号７の断片は、８５０個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、９００個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、９３０個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態では、９６０個以上のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるものなどの配列番号７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。

いくつかの実施形態では、配列番号８の断片は、２５０個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、２７５個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、３００個以上のアミノ酸、いくつかの実施形態では、３１５個以上のアミノ酸を含み得る。

いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）本明細書に開示されるＨＰＶ６抗原（例えば、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原）をコードする核酸分子を含む組成物、および（ｂ）本明細書に開示される１つ以上のＩＬ－１２サブユニット（例えば、ｐ３５および／またはｐ４０）をコードする核酸分子を含む組成物の同時投与を含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示されるＨＰＶ６抗原（例えば、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原）をコードする核酸分子を含む組成物の事前投与後に、本明細書に開示される１つ以上のＩＬ－１２サブユニット（例えば、ｐ３５および／またはｐ４０）をコードする核酸分子を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示される１つ以上のＩＬ－１２サブユニット（例えば、ｐ３５および／またはｐ４０）をコードする核酸分子を含む組成物の事前投与後に、本明細書に開示されるＨＰＶ６抗原（例えば、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原）をコードする核酸分子を含む組成物を投与することを含む。

本明細書では、ＨＰＶに対する個体における免疫応答を誘導することによって、対象におけるＲＲＰを治療または予防する方法であって、当該個体に、本明細書に提供される核酸配列を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法はまた、核酸配列をエレクトロポレーションによって個体に導入することを含む。

いくつかの態様では、ＨＰＶに対する個体における免疫応答を誘導することによって、対象におけるＲＲＰを治療または予防する方法であって、当該個体に、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む組成物を投与することを含む、方法がある。いくつかの実施形態では、方法はまた、アミノ酸配列をエレクトロポレーションによって個体に導入することを含む。

改善されたワクチンは、抗ＨＰＶ免疫応答が誘導され得る免疫原として特に有効となるエピトープを有するタンパク質をコードするタンパク質および遺伝子構築物を含む。したがって、ワクチンは、治療的または予防的免疫応答を誘導するために提供することができる。いくつかの実施形態では、免疫原を送達する手段は、ＤＮＡワクチン、組換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む組成物、弱毒ワクチン、または死菌ワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒ワクチン、および１つ以上の死菌ワクチンからなる群から選択される組み合わせを含む。

本発明の態様は、プラスミドなどの核酸分子上のタンパク質のコード配列を、組換えワクチンの一部としておよび弱毒ワクチンの一部として、単離されたタンパク質またはベクターの一部として送達する方法を提供する。

本発明のいくつかの態様によれば、個体を予防的および／または治療的に免疫化する組成物および方法が提供される。

ＤＮＡワクチンは、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号、およびそれらに引用される優先出願に記載される。それらの出願に記載される送達プロトコルに加えて、ＤＮＡを送達する代替的な方法が、ともに参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９４５，０５０号および第５，０３６，００６号に記載される。

本発明は、改善された弱毒生ワクチン、改善された死菌ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組換えベクターを使用する改善されたワクチン、ならびにサブユニットおよび糖タンパク質ワクチンに関する。弱毒生ワクチン、外来抗原を送達するために組換えベクターを使用するもの、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、４，７９７，３６８号、４，７２２，８４８号、４，７９０，９８７号、４，９２０，２０９号、５，０１７，４８７号、５，０７７，０４４号、５，１１０，５８７号、５，１１２，７４９号、５，１７４，９９３号、５，２２３，４２４号、５，２２５，３３６号、５，２４０，７０３号、５，２４２，８２９号、５，２９４，４４１号、５，２９４，５４８号、５，３１０，６６８号、５，３８７，７４４号、５，３８９，３６８号、５，４２４，０６５号、５，４５１，４９９号、５，４５３，３６４号、５，４６２，７３４号、５，４７０，７３４号、５，４７４，９３５号、５，４８２，７１３号、５，５９１，４３９号、５，６４３，５７９号、５，６５０，３０９号、５，６９８，２０２号、５，９５５，０８８号、６，０３４，２９８号、６，０４２，８３６号、６，１５６，３１９号、および６，５８９，５２９号に記載され、これらは各々参照によって本明細書に組み込まれる。

細胞によって取り込まれた場合、遺伝子構築物（複数可）は、機能する染色体外分子として細胞に存在したままであり、かつ／または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。ＤＮＡは細胞に導入され得、それはプラスミド（複数可）の形態で別個の遺伝子材料として残る。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖状ＤＮＡが細胞に導入され得る。ＤＮＡを細胞に導入する場合、染色体へのＤＮＡ組み込みを促進する試薬が添加され得る。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列もまた、ＤＮＡ分子に含まれ得る。あるいは、ＲＮＡが細胞に投与され得る。セントロメア、テロメア、および複製起点を含む直鎖状微小染色体として遺伝子構築物を提供することも企図される。遺伝子構築物は、細胞において生存する弱毒生微生物または組換え微生物ベクターにおける遺伝子材料の一部のままであり得る。遺伝子構築物は、遺伝子材料が細胞の染色体に組み込まれるか、または染色体外のままであるかのいずれかである組換えウイルスワクチンのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。要素としては、プロモーター、開始コドン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナルが挙げられる。加えて、エンハンサーは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現にしばしば必要とされる。これらの要素は、所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されること、および調節要素は、それらが投与される個体において作動可能であることが必要である。

開始コドンおよび停止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかしながら、これらの要素は、遺伝子構築物が投与される個体において機能的であることが必要である。開始コドンおよび終結コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。

使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。

特にヒトのための遺伝子ワクチンの産生において、本発明を実施するのに有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＢＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ即初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

特にヒトのための遺伝子ワクチンの産生において、本発明を実施するのに有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと呼ばれる、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）にあるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが使用される。

ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素もまたＤＮＡ分子に含まれ得る。そのような追加の要素としては、エンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ならびにＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーを含むが、これらに限定されない群から選択され得る。

遺伝子構築物は、構築物を染色体外に維持し、細胞において構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を備えることができる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのプラスミドｐＶＡＸ １、ｐＣＥＰ４、およびｐＲＥＰ４は、エプスタインバーウイルス複製起点および組み込みなしで高コピーエピソーム複製をもたらす核抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含有する。

免疫化用途に関連するいくつかの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および加えて、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子を含む核酸分子（複数可）が送達される。そのような遺伝子の例は、アルファ－インターフェロン、ガンマ－インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびシグナル配列が欠失され、任意にＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ－１５を含むＩＬ－１５などの他のサイトカインおよびリンホカインをコードするものである。有用であり得る他の遺伝子としては、以下をコードするものが挙げられる：ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－ｌα、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１８の変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、ＩＬ－７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的断片

任意の理由で遺伝子構築物を受容する細胞を排除することが望ましい場合、細胞破壊の標的となる追加の要素が付加され得る。発現可能な形態のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子は、遺伝子構築物に含めることができる。薬物ガンシクロビルは、個体に投与することができ、その薬物は、任意の細胞産生ｔｋの選択的殺滅を引き起こし、よって、遺伝子構築物を有する細胞の選択的破壊のための手段を提供する。

タンパク質産生を最大化するために、構築物が投与される細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列が選択され得る。さらに、細胞において最も効率的に転写されるコドンが選択され得る。当業者は、細胞において機能的であるＤＮＡ構築物を生成することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドに連結される、遺伝子構築物が提供され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される。

タンパク質が使用されるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技法を使用して、周知の技法を使用して本発明のタンパク質を生成および単離することができる。タンパク質が使用されるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技法を使用して、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、周知の発現系における使用のために市販されている発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質の産生のために使用され得る。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）は、例えば、酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株における産生のために使用され得る。市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）は、例えば、昆虫細胞における産生に使用され得る。市販のプラスミドｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類細胞における産生に使用され得る。当業者は、これらの商業的な発現ベクターおよび発現系、または他のものを使用して、日常的な技法および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生することができる。（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。よって、所望のタンパク質は、原核系および真核系の両方において調製することができ、タンパク質の加工形態のスペクトルをもたらす。

当業者は、他の市販の発現ベクターおよび発現系を使用してもよく、または周知の方法および容易に入手可能な出発材料を使用してベクターを産生してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナルなどの必要な制御配列、ならびに好ましくはエンハンサーを含有する発現系は、様々な宿主について、容易に入手可能であり、当該技術分野において既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。遺伝子構築物は、構築物がトランスフェクトされる細胞株において機能的であるプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード配列を含む。構成的プロモーターの例としては、サイトメガロウイルスまたはＳＶ４０からのプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、マウス乳腺白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。当業者は、容易に入手可能な出発材料から本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に産生することができる。タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用して、適合性宿主を形質転換し、これは次いで、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養され、維持される。

産生されたタンパク質は、細胞を溶解することによって、または必要に応じて当業者に既知の培養培地から回収される。当業者は、周知の技法を使用して、そのような発現系を使用して産生されるタンパク質を単離することができる。上述のように特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して天然源からタンパク質を精製する方法は、組換えＤＮＡ方法論によって産生されるタンパク質の精製に等しく適用され得る。

組換え技法によってタンパク質を産生することに加えて、単離された、本質的に純粋なタンパク質を産生するために自動化ペプチド合成装置も使用され得る。そのような技法は、当業者に周知であり、ＤＮＡコードタンパク質産生において提供されない置換を有する誘導体である場合に有用である。

核酸分子は、ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組換えワクシニアなどの組換えベクターを含む、いくつかの周知の技術のうちのいずれかを使用して送達され得る。

投与経路としては、これらに限定されないが、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、および経口、ならびに局所、経皮、吸入もしくは坐剤による、または粘膜組織への、例えば、膣、直腸、尿道、頬側、および舌下組織への洗浄によるものが挙げられる。好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、および皮下注射が挙げられる。遺伝子構築物は、エレクトロポレーション方法および装置、従来の注射器、無針注射装置、または「マイクロプロジェクタイル衝撃遺伝子銃」を含むが、これらに限定されない手段によって投与され得る。

ＤＮＡワクチンの送達を促進するために好ましいエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法の例としては、その内容が参照によってそれらの全体で本明細書に組み込まれる、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．によって提出された米国特許公開２００５／００５２６３０に記載されるものが挙げられる。また、そのすべてがそれらの全体で本明細書に組み込まれる、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号に対する利益を３５ ＵＳＣ １１９（ｅ）下で主張する、２００７年１０月１７日に出願された、同時係属中の共有された米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進するためのエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法が好ましい。

以下は、エレクトロポレーション技術を使用する実施形態の例であり、上述の特許参考文献でより詳細に考察されている：エレクトロポレーション装置は、哺乳動物の所望の組織に、ユーザーによって予め設定された電流入力と同様の定電流を生成するエネルギーのパルスを送達するように構成することができる。エレクトロポレーション装置は、エレクトロポレーション構成要素、および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。エレクトロポレーション構成要素は、コントローラ、電流波形生成器、インピーダンステスター、波形ロガー、入力要素、状態報告要素、通信ポート、メモリ構成要素、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーション装置の様々な要素のうちの１つ以上を含み、組み込むことができる。エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーション装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、エレクトロポレーション構成要素と連通する別個の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーション装置の２つ以上の要素として機能することができ、これはエレクトロポレーション構成要素とは別個のエレクトロポレーション装置のさらに他の要素と連通し得る。改善されたＨＰＶワクチンを送達するためのエレクトロポレーション技術の使用は、要素が１つの装置として、または互いに連通する別個の要素として機能することができるため、１つの電気機械または機械装置の一部として存在するエレクトロポレーション装置の要素によって制限されない。エレクトロポレーション構成要素は、所望の組織において定電流を生成するエネルギーのパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間配置において複数の電極を有する電極アレイを含み、電極アセンブリは、エレクトロポレーション構成要素からエネルギーのパルスを受信し、これを電極を通して所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、インピーダンスをエレクトロポレーション構成要素に通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信することができ、エレクトロポレーション構成要素によって送達されるエネルギーのパルスを調整して、定電流を維持することができる。

いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散化パターンでエネルギーのパルスを送達することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンス下での電極の制御を通して分散化パターンでエネルギーのパルスを送達することができ、プログラムされたシーケンスは、ユーザーによってエレクトロポレーション構成要素に入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、順次送達される複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの後続のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。

いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行される。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実行される。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓごとに生じるが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは瞬時である（すなわち、応答時間を決定するために利用可能な技法によって決定されるように、実質的に瞬時である）。いくつかの実施形態では、中性電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、インピーダンスをフィードバック機構に通信し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調整して、予め設定された電流と同様の値に定電流を維持する。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中に連続して瞬時に定電流を維持する。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、ポリヌクレオチド機能増強剤または遺伝子ワクチン促進剤の投与と併せて細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能増強剤は、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、および１９９４年１月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載される。遺伝子ワクチン促進剤は、参照によって本明細書に組み込まれる、１９９４年４月１日に出願された米国出願第０２１，５７９号に記載される。核酸分子と併せて投与される助剤は、核酸分子との混合物として投与されてもよく、または核酸分子の投与の前もしくは後に、別々に同時に投与されてもよい。加えて、トランスフェクション剤および／または複製剤および／または炎症剤として機能し得、ＧＶＦと共投与され得る他の薬剤としては、成長因子、サイトカイン、およびリンパ球、例えば、α－インターフェロン、ガンマ－インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１５、ならびに線維芽細胞成長因子、表面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞が挙げられ、ヒアルロン酸もまた使用され、遺伝子構築物と併せて投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫調節タンパク質は、ＧＶＦとして使用され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、送達／取り込みを増強するためにＰＬＧと会合して提供される。

本発明による薬学的組成物は、約１ナノグラム～約２０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による薬学的組成物は、約５ナノグラム～約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約１０～約８００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約０．１～約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約１～約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約２５～約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約１００～約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。

本発明による薬学的組成物は、使用される投与様式に従って製剤化される。薬学的組成物が注射可能な薬学的組成物である場合、それらは、滅菌、パイロジェンフリー、および微粒子フリーである。等張性製剤が好ましくは使用される。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。いくつかの場合では、リン酸塩緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンやアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、免疫応答を誘導する方法が提供される。ワクチンは、タンパク質ベースの、弱毒生ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチン、または核酸もしくはＤＮＡワクチンであり得る。いくつかの実施形態では、粘膜免疫応答を誘導する方法を含む、免疫原に対する個体における免疫応答を誘導する方法は、個体に、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的断片、またはそれらの発現可能なコード配列のうちの１つ以上を、本発明のタンパク質をコードする単離された核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組換えワクチンおよび／または本発明のタンパク質をコードするサブユニットワクチンおよび／または弱毒生ワクチンおよび／または死菌ワクチンと組み合わせて投与することを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能的断片のうちの１つ以上は、免疫原をコードする単離された核酸分子および／または免疫原をコードする組換えワクチンおよび／または免疫原を含むサブユニットワクチンおよび／または弱毒生ワクチンおよび／または死菌ワクチンの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびそれらの機能的断片からなる群から選択されるもののうちの１つ以上のタンパク質をコードする単離された核酸分子が、個体に投与される。

本発明は、以下の実施例においてさらに例示される。この実施例は、本発明の実施形態を示すが、例示としてのみ提供されることを理解されたい。上記の考察およびこの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適応するために本発明の様々な変更および修正を行うことができる。よって、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲内に該当することが意図される。

本開示を通して引用される米国特許、米国出願、および参考文献の各々は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示としてのみ提供されることを理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適応するために本発明の様々な変更および修正を行うことができる。よって、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲内に該当することが意図される。

実施例１
再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）は、通常ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）サブタイプ６、１１に関連する、気道消化管の乳頭腫の生成を特徴とする稀な障害である。ＨＰＶ６関連ＲＲＰおよび侵襲性悪性疾患の現在の治療は、ＨＰＶ特異的免疫療法の添加によって潜在的に改善され得る。入手可能な予防的ＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ主カプシドタンパク質Ｌ１に対する中和抗体を生成することができるが、それらは、ＨＰＶ感染または既存の病変に対する治療効果を実証しておらず、細胞溶解性Ｔ細胞応答を生じさせる可能性が低い（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０；４７（１－３）：８６－１１２）。一方、ＨＰＶ特異的免疫療法は、ＨＰＶウイルス自体およびＨＰＶ感染細胞に対して免疫を生成することによって、既存の病変および感染症を排除する治療的可能性を有し得る。ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質は、ＨＰＶ関連腫瘍におけるそれらの構成的発現ならびにＨＰＶ関連疾患の誘導および維持におけるそれらの重要な役割のために、このタイプの治療的介入のための理想的な標的を表す（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１０；４７（１－３）：８６－１１２）。

本明細書に提示される実験は、ＲＲＰを治療するために堅牢な免疫Ｔ細胞応答を形成するために、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７タンパク質を標的とするＤＮＡプラスミドベースの免疫療法であるＩＮＯ－３１０６の有効性を調査する。

この試験では、がんのＨＰＶ６誘導形質転換および腫瘍維持に必要なタンパク質である、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７（図１）をコードする合成コンセンサスＤＮＡ配列からなる新規のＨＰＶ６特異的免疫療法である、ＩＮＯ－３１０６の有効性を評価するために実験を行った。合成ＤＮＡプラスミドは、ゲノム組み込みの証拠なしに強力な免疫応答を誘発する能力、好ましい安全性プロファイル、安定性、および製造における相対的な容易さを含む、免疫療法プラットフォームとしていくつかの潜在的な利点を提供する（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ．２０１１；５（２）：９２－６）。ＩＮＯ－３１０６の前臨床試験は、動物モデルにおいてＨＰＶ６に対する強力かつ特異的な免疫応答を実証している（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ＆ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１２；８（４）：４７０－８）。同じ合成コンセンサスプラットフォームに基づいて設計および評価されたＨＰＶ１６／１８特異的療法（ＶＧＸ－３１００、Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、異形成病変退縮およびＨＰＶ１６／１８感染の排除の形態の臨床的利益と相関した細胞性免疫応答を実証し、ここでＨＰＶ１６および１８関連疾患を標的とする後期臨床試験を支持する（Ｂａｇａｒａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１２；４（１５５）：１５５ｒａ３８）。

前臨床試験は、ＤＮＡワクチンの免疫原性を、サイトカインアジュバントの使用によって実質的に増加することができることを示している（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００４；２２（１３－１４）：１７４４－５０、Ｈａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ．２００１；７５（１８）：８４２４－３３、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＪＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．１９９８；１８（７）：５３７－４７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９９８；２８（３）：１０８９－１０３、Ｏｐｅｒｓｃｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＪＣｌｉｎＶｉｒｏｌ．１９９９；１３（１－２）：１７－２７）。重要なことに、操作されたプラスミドＩＬ－１２遺伝子アジュバントは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を使用して送達される場合、ヒトにおいて免疫原性を増強することが示されている（Ｋａｌａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３、Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１９）。皮膚送達および局所筋肉の両方を標的とする複数の臨床試験において、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を介した最適化されたＤＮＡの送達は、誘導予防的環境から治療的アプローチに及ぶ様々な目的のために、ヒトにおいて迅速に免疫を生成する非常に再現性の高い方法であることが確立されている（Ｋａｌａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３、Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１９、Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７、Ｂａｇａｒａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１２；４（１５５）：１５５ｒａ３８、Ｍｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．２０１６；３（１６０２５、Ｔｒｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１５；３８６（１０００８）：２０７８－８８、Ｍｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８；２４（２）：２７６－９４、Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１９；２５（１）：１１０－２４、Ｍｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２３（３）：５９１－６０１）。

ここでは、本実験は、ＨＰＶ６関連ＲＲＰまたは悪性腫瘍を有する患者においてＥＰおよびＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を介して筋肉内（ＩＭ）送達される、ＩＮＯ－９０１２（ＩＬ－１２アジュバント）ありまたはなしの、ＩＮＯ－３１０６のパイロット試験の安全性および免疫原性を実証する。この試験のデータは、ＩＮＯ－３１０６およびＩＬ－１２アジュバントでの免疫療法が、ＲＲＰのための非侵襲的免疫媒介性治療選択肢であり得ることを示す。

この単一施設非盲検第１相試験では、ＨＰＶ６陽性ＲＲＰおよび悪性腫瘍を有する対象に、ＩＮＯ－９０１２ありまたはなしの、ＩＮＯ－３１０６、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７タンパク質を標的とするＤＮＡプラスミド免疫療法、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置でのエレクトロポレーション（ＥＰ）と組み合わせて筋肉内（ＩＭ）送達される、ＩＬ－１２をコードするＤＮＡプラスミド免疫療法を投与した。患者は、漸増用量のＩＮＯ－３１０６、３ｍｇを１回、次いで６ｍｇをさらに３用量受け、各用量３週間空け、第３および第４の用量は、ＩＮＯ－９０１２と共投与された。この試験の主な目的は、ＩＮＯ－９０１２ありおよびなしのＩＮＯ－３１０６の安全性および忍容性を評価することであった。副次的な目的は、ＩＮＯ－９０１２ありおよびなしのＩＮＯ－３１０６への細胞性免疫応答を決定することであった。探索的な目的には、療法に対する予備的な臨床的有効性が含まれた。

４人の患者が同意し、３人の患者がすべての選択基準および除外基準を満たし、試験に登録された。試験療法は、忍容性が良好であり、関連する重篤な有害事象がなく、すべての関連する有害事象（ＡＥ）が低グレードであった。注射部位疼痛は、すべての患者において報告された最も一般的な関連ＡＥであった。免疫原性は、複数の免疫アッセイによって証明され、細胞傷害性Ｔ細胞の特徴を含む、ＨＰＶ６特異的細胞応答の関与および拡大を示す。これらの患者では、成長切除のための手術頻度の変更という形態で予備的な有効性が示された。介入の前、両患者は、約１８０日ごとに手術を必要とした。１人の患者は、手術回避において３倍超の増加（５８４日）を示し、別の患者は、９１５日の最後の接触時点で完全に手術を必要としないままであり、手術間隔において５倍超の増加である。

本明細書に提示される実験は、ＩＮＯ－３１０６が、ＩＮＯ－９０１２ありおよびなしで、ＨＰＶ６関連ＲＲＰ気道消化器病変を有する患者において忍容性が良好であり、免疫原性であり、予備的な有効性を実証したことを示す。

これらの実験において使用される材料および方法をここで記載する。

試験集団
これは、前向き、非盲検、第１相試験であった。１８歳以上の男性および女性患者を登録対象とした。適格となるには、患者は、組織学的に記録されたＨＰＶ６関連気道消化器乳頭腫、前悪性病変を有するか、または最近の療法（例えば、放射線、化学療法）が試験治療の第１の用量の少なくとも２ヶ月前に完了した気道消化器侵襲性悪性腫瘍を有していなければならない。患者は、正常範囲内の肝臓、腎臓、肝臓、および骨髄機能を有する、ＥＣＯＧ ０－１を有していなければならない。免疫抑制もしくは免疫抑制剤の予想される使用、全身ステロイドの必要とされる使用、心臓興奮前症候群の存在、または妊娠もしくは授乳中である証拠があった場合、患者は除外された。いかなる評価も実施する前に、各患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。臨床試験は、ヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに従って実施した。

ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を使用した免疫療法およびエレクトロポレーション
ＩＮＯ－３１０６は、注射用の滅菌水中で製剤化された、ＨＰＶ６型のＥ６およびＥ７タンパク質をコードするＤＮＡプラスミドである。ＩＮＯ－３１０６は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を含む。ＩＮＯ－９０１２は、同様に注射用の滅菌水中で製剤化された合成ヒトＩＬ－１２（ｐ３５およびｐ４０サブユニット）をコードするＤＮＡプラスミドからなる。ＩＮＯ－９０１２は、配列番号６のアミノ酸配列（ＩＬ－１２のｐ３５サブユニット）をコードする配列番号５のヌクレオチド配列と、配列番号８のアミノ酸配列（ＩＬ－１２のｐ４０サブユニット）をコードする配列番号７のヌクレオチド配列と、を含む。ＩＮＯ－３１０６およびＩＮＯ－９０１２の両方は、以前に記載されたように専有技術（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して設計した（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００８；２６（４０）：５２１０－５、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００９；２７（３）：４３１－４０）。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００適応定電流エレクトロポレーション装置（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）は、３つの５２ｍｓの制御された電気パルスを、１秒間隔で、滅菌使い捨てアレイを通して注射部位に送達する。組織に挿入される場合、ニードルアレイは免疫療法注射の部位の周囲を中心とし、細胞膜内に一過性の細孔を形成して細胞トランスフェクションを増強する。ＩＮＯ－３１０６を、ＩＮＯ－９０１２ありまたはなしで、１ｍＬ体積で筋肉内に送達し、続いてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置でのＥＰを直ちに行った。治療または用量は、ＤＮＡプラスミドの注射、続いてＥＰとして定義される。

試験設計
インフォームドコンセント後、各患者に一意的な患者識別コードを割り当てた。適格性を決定し、ベースライン特徴を収集するためのスクリーニング手順を、第１の用量前の２８日以内に完了した。患者は、漸増用量のＩＮＯ－３１０６を受け、そのうち第１の用量（０日目）は３ｍｇのＩＮＯ－３１０６を送達し、第２の用量（３週目）は６ｍｇのＩＮＯ－３１０６を送達し、第３の用量（６週目）および第４の用量（９週目）は６ｍｇのＩＮＯ－３１０６を１ｍｇのＩＮＯ－９０１２とともに送達した。各用量は、任意のグレード２以上の関連全身有害事象（ＡＥ）の発生の観察を可能にするために、３週間空けて送達された。合計で、すべての患者の参加には、９週間の治療期間、続いて最後の用量から６ヶ月の長期追跡調査期間が含まれた。

この試験の主な目的は、ＩＮＯ－９０１２ありおよびなしでのＩＮＯ－３１０６の安全性および忍容性を評価することであった。副次的な目的は、ＩＮＯ－９０１２ありおよびなしでのＩＮＯ－３１０６への体液性および細胞性免疫応答を決定することであり、探索的な目的は、治療に対する予備的な臨床有効性を評価すること、および可能であれば、有効性を用量後の組織における免疫細胞浸潤と関連付けることであった。

試験は、識別子ＮＣＴ０２２４１３６９でＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに登録された。この試験プロトコルは、１９７５年ヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに準拠しており、センターの施設内審査委員会によって審査および承認された。

安全性評価
局所および全身有害事象（ＡＥ）、バイタルサイン、１２誘導心電図（ＥＣＧ）、ならびに検査異常の発生を、インフォームドコンセントの日付から最後の追跡調査来院までモニタリングした。特に、疼痛、かゆみ、紅斑、硬結、およびあざを含む、注射部位反応は、各治療の当日および治療後の連続した７日間に評価した。患者は、各来院時に、新たなＡＥまたは疾患の発生、および併用薬の使用について尋ねられた。すべての事象は、有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）、バージョン４．０３に従ってグレードを付け、ＭｅｄＤＲＡバージョン２１でコードを付けた。

３分の１以上の患者が、緊急報告を必要とする関連事象を経験した場合、いずれかの患者が重篤な有害事象（ＳＡＥ）、予期しないグレード４の毒性、試験治療に関連すると評価された潜在的に生命を脅かすＡＥもしくは死亡を経験した場合、３人以上の患者が同じ関連グレード３もしくは４のＡＥを経験した場合、またはいずれかの患者がグレード３のアナフィラキシーを報告した場合、さらなる登録および治療は直ちに中止した。

生殖能を有する女性は、スクリーニング時および各用量前の３日以内に妊娠検査を完了する必要があった。女性においては妊娠検査結果が陽性になると治療を中止した。血液学、凝固、血清化学（肝機能を含む）、およびクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）を含む検査パラメータを、試験全体を通してモニタリングし、センターで局所的に評価した。

抗原３Ｄモデリング
比較モデルを、Ｂｉｏｌｕｍｉｎａｔｅ（２０１９－２リリース、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を使用して構築し、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ ＢＩＯＶＩＡ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で可視化した。

インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔ
全血をＡＣＤ－Ａチューブに採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採血の２４時間以内に単離した。ベースライン、免疫療法投薬時、および各追跡調査来院時に試料を採取し、ＰＢＭＣをバッチで免疫分析のために凍結保存した。ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７抗原へのＴ細胞および抗体応答は、以前に記載されるように、それぞれ、インターフェロン－γ－ＥＬＩＳｐｏｔおよびＥＬＩＳＡによって決定した（Ｂａｇａｒａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１２；４（１５５）：１５５ｒａ３８）。

フローサイトメトリー
ＰＢＭＣを、細胞培養培地中で一晩凍結保存後に回収し、回転させ、洗浄し、翌日再懸濁した。計数後、１×１０^６個のＰＢＭＣを、十分な試料を有する患者からのＲ１０培地中の９６ウェルプレートに播種した。抗原特異的応答について、細胞を、２μｇ／ｍｌの濃度でプールされたＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７に対応するペプチドの組み合わせで５日刺激し、無関係なペプチドを陰性対照（ＯＶＡ）として使用し、コンカナバリンＡを陽性対照（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）として使用した。共刺激抗体またはサイトカインは、いかなる時点でも細胞培養物に添加されなかった。５日のインキュベーション期間の終了時に、細胞を、ＣＤ３－ＢＵＶ７３７、ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ１４－ＢＵＶ３９５、ＣＤ－１６－ＢＵＶ３９５、ＣＤ１３７－ＡＰＣ、グラニュライシン－ＡＦ４８８ ＣＤ－１９－ＢＵＶ３９５、ＣＤ３８－ＢＶ７８６、ＣＤ８－ＢＶ６５０、グランザイムＢ－ＡＦ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、グランザイムＡ－ＰＥＣｙ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＰＤ－１－ＰＥＤａｚｚｌｅ、パーフォリン－ＢＶ４２１、Ｋｉ６７－ＢＶ６０５、およびＣＤ６９－ＢＶ７１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）について染色した。細胞外マーカー（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＰＤ－１）についての染色をまず行い、続いて残りのマーカーについて染色するための透過処理を行った。細胞活性化後のマーカーの下方調節を考慮して、ＣＤ３を細胞内で染色した。取得されたデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョンＸ．０．７以降（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して分析した。

遺伝子発現分析のための抗原特異的ＰＢＭＣ刺激
短期刺激について－凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、一晩休息させ、ＤＭＳＯ（陰性対照）またはＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７重複ペプチドプール（ＯＬＰ）のいずれかで、３７℃、５％ＣＯ_２、および９５％湿度で２２時間刺激した。刺激後、培養上清を回収し、－２０℃で保存した。次いで、緩衝液ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞を溶解し、－８０℃で保存した。

長期刺激について－凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、一晩休息させ、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７ ＯＬＰで、３７℃、５％ＣＯ_２、および９５％湿度で１１日間刺激した。１、４、６、および８日目に、ＩＬ－２およびＩＬ－７を含有する新鮮な培地を、それぞれ、１０Ｕ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬで添加した。１１日目に、ＰＢＭＣを洗浄し、３７℃、５％ＣＯ_２、および９５％湿度で一晩休息させた。一晩休息後、ＰＢＭＣを、ＤＭＳＯ（陰性対照）またはＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７ ＯＬＰのいずれかで２２時間、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７ ＯＬＰで再刺激した。２２時間の刺激の終了時に、細胞上清を回収し、－２０℃で保存した。次いで、細胞を溶解し、－８０℃で保存した。

多重遺伝子発現分析
細胞溶解物を、製造業者の指示に従って１２のバッチで解凍し、５９４個の遺伝子および１５個の内部参照対照からなる、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）ＧＸ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖ２パネルを使用してプローブおよびフルオロフォアバーコードレポータープローブを捕捉するようにハイブリダイズした。次いで、試料を、捕捉プローブの半透明カートリッジへのハイブリダイゼーションのために自動化ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）に入れ、その後、遺伝子発現を、各試料レーンにおけるレポータープローブの直接カウントを介してｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）によって測定した。

統計的方法
少なくとも１用量の治療を受けた対象を安全性分析に含めた。ＳＡＥおよび注射部位反応を含む、ＡＥの発生率を、正確な９５％信頼区間とともに推定した。副次的および探索的エンドポイントに関連する分析は、割り当てられた数の用量を受けた対象を利用する。副次的分析では、免疫応答パラメータが推定される。探索的解析では、臨床応答および病理組織学的評価パラメータが推定される。連続結果については、平均値／中央値および９５％信頼区間が計算され、バイナリ結果については、割合および正確な９５％信頼区間がクロッパー－ピアソン法を用いて計算される。

ここで実験の結果を記載する。

患者特徴および性質
合計で、４人の患者が同意し、適格性についてスクリーニングされた。３人の患者はすべての選択基準および除外基準を満たし、２０１４年１０月から２０１７年９月まで登録された。人口統計およびベースライン特徴を表１に要約する。それら３人のうち、２人の患者は、ＨＰＶ６関連ＲＲＰを呈し（ともに声帯における疾患を有し）、１人の患者は、侵襲性悪性腫瘍を有した（初期疾患は気管に位置し、咽頭における扁平上皮がんが試験登録時に認められた）。３人の患者はすべて、４用量をすべて完了し、０日目に３ｍｇのＩＮＯ－３１０６、３週目に６ｍｇのＩＮＯ－３１０６、６週目および９週目に６ｍｇのＩＮＯ－３１０６を１ｍｇのＩＮＯ－９０１２とともに受け、すべてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を介して筋肉内に送達された。２人の患者は、治療の最後の用量後、６ヶ月の長期追跡調査期間を完了した。１人の患者は長期追跡調査を完了せず、試験からの脱落の主な理由として非試験関連の対立を報告した。３人の患者はすべて安全性分析セットに含まれる。

ＥＰによるＩＮＯ－３１０６およびＩＮＯ－９０１２の安全性および忍容性
ＥＰを介して送達されたＩＮＯ－３１０６およびＩＮＯ－９０１２は、忍容性が良好であった。治療中に発生したＡＥには、注射部位疼痛（３件の関連グレード１事象）、発熱（１件の非関連グレード１事象）、および尿路感染症（１件の非関連グレード２事象）が含まれた。すべての患者は、注射部位疼痛を報告し、ほとんどの場合、医薬品で治療され、回復につながった。入院を必要とするグレード３単麻痺の１件の治療中に発生したＳＡＥが試験で報告されたが、試験治療とは非関連であると評価された。ＡＥによってもＥＰの忍容性によっても、継続した試験治療を受けること、または継続した試験への参加を中止した患者はいなかった。試験の経過中にグレード４事象も死亡も報告されなかった。すべての患者は、検査パラメータの変化を経験し、その大部分は、血液学値のわずかな変動を含んだが、すべての異常な臨床検査値は、臨床的に有意ではないと決定された。

ＩＮＯ－３１０６は治療されたＲＲＰ患者からのＴ細胞におけるＩＦＮγ産生ならびに活性化マーカーおよび溶解性タンパク質の発現を誘導する
ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７細胞性免疫応答の評価は、試験に登録された３人の患者全員について実施した（図２および図６）。対象６０１は、ＲＲＰ患者ではなく、非治療事象に関連する死亡による限定されたデータを有するため、この対象に関連する免疫学情報は、図６に見出すことができる。細胞性免疫応答は、ＩＮＯ－３１０６投薬の前および後に得られた単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上での補助サイトカインの添加なしに一晩のＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔを行うことによってまず対処した。この評価の結果は、患者６０３が、抗原特異的ＩＦＮγ分泌の形態で、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７抗原への非常に低いベースライン活性を示したことを示す（図２）。具体的には、Ｅ６またはＥ７抗原について１０^６個のＰＢＭＣあたり２０スポット未満が認められたが、患者６０４は、試験登録時にこれらの抗原に対して合理的に堅牢な細胞応答を示し、１０^６個のＰＢＭＣあたりのＥ６スポット形成単位は１５０スポットに近づき、Ｅ７は５０スポットを超えた（図２）。

ＩＮＯ－３１０６による治療は、５０スポットを超えるＨＰＶ６抗原への総応答を含み、患者６０３においてＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７特異的細胞応答をベースラインを上回って増加させた。患者６０４は、治療に応答してＩＦＮγスポットの上昇を示さなかったが（図２）応答する患者のうち、ピーク応答までの時間は様々であり、正確に評価することは困難であった。具体的には、ＩＮＯ－３１０６の第４の用量後に非治療関連事象による死亡が患者６０１において発生し、よって治療後の追跡調査は入手不可能であり、ピーク応答は第３の用量後に認められた。患者６０３は、ＩＮＯ－３１０６の最終用量の６ヶ月後にピーク応答を示し、これはその期間中のウイルス活性化／抗原標的発現の変化に関連し得るか、またはＨＰＶ６特異的Ｔ細胞の大きなプールを構築し、支持し続ける患者の免疫系の動態を反映し得る。

ＩＦＮγの産生は、Ｔｈ１免疫応答を示すが、溶解活性と１：１で相関しないことが以前に示されている（Ｍｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２３（３）：５９１－６０１、Ｍｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１７；ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１７－２３３５、Ｔｒｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１５；３８６（１０００８）：２０７８－８８；Ｍｉｇｕｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．２０１１；７（２）：ｅ１００２００２、Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１１；１２１（１１）：４３２２－３１）。ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞溶解応答は、ウイルス感染細胞を制御および排除する免疫応答の重要な成分であることが理解される。したがって、フローサイトメトリーは、ＩＮＯ－３１０６での投薬前および後に単離された十分な試料で患者６０３および６０４からのＰＢＭＣに対して行って、治療に応答してグランザイムおよびパーフォリンを装填するＨＰＶ６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を評価した。そのために、ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントは、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、およびＫｉ６７（図３）などの細胞表面マーカーの抗原特異的発現を介した免疫活性化について、ならびに同種抗原によるインビトロ刺激後のグラニュライシン（Ｇｎｌｙ）、グランザイムＡ（ＧｒｚＡ）、グランザイムＢ（ＧｒｚＢ）、およびパーフォリン（Ｐｒｆ）の存在によって決定される溶解可能性について分析した。表２は、ＩＮＯ－３１０６による治療の前および後に、これらのマーカーの抗原特異的調節を示す。ＥＬＩＳｐｏｔ応答と一貫して、患者６０３は、溶解性タンパク質と同時に活性化マーカーを発現する様々なＣＤ８＋Ｔ細胞の堅牢な上昇を示した。最も注目すべきは、グランザイムＡ、グランザイムＢ、およびパーフォリンなどの溶解能のマーカーと組み合わされたＣＤ３８および／またはＫｉ６７の発現は、ＩＮＯ－３１０６での治療後に劇的に増加し、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７抗原に特異的な総ＣＤ８＋Ｔ細胞の３％を超える値に到達する（表２Ａ、図３）。逆に、堅牢なＴ細胞増殖の欠如を示すＥＬＩＳｐｏｔ結果と一貫して、患者６０４（表２Ｂ、図３）は、患者６０３と比較される場合、大きさの観点からＣＤ８＋Ｔ細胞応答のより小さな上昇を示した。興味深いことに、患者６０３よりも大きさは小さいが、患者６０４において誘導される推定ＣＴＬの表現型は、治療後に最も増加する可能性が高い集団が、３つの（ＣＤ３８、ＣＤ１３７、Ｋｉ６７）活性化マーカーまたは４つすべての（前の３つに加えてＣＤ６９）の同時発現で構成されたように、より高度に活性なＣＤ８＋Ｔ細胞の可能性を示す。同時にこの数の活性化マーカーの共発現は、はるかに稀であり（Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７、Ｂａｇａｒａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ．２０１２；４（１５５）：１５５ ｒａ ３８、Ｍｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．２０１６；３（１６０２５、Ｔｒｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１５；３８６（１０００８）：２０７８－８８、ｖＭｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８；２４（２）：２７６－９４、Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１９；２５（１）：１１０－２４）、複数の活性化マーカーを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の以前の調査は、これらの細胞がグランザイムを発現し、同種抗原を発現する標的においてアポトーシスを効果的に誘導することができることを示している（Ｄｕｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８ Ｊｕｌ １３；９（１）：２７２４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０５０７２－０）。実際に、この最後の考えは、患者６０４がグランザイムおよびパーフォリンだけではなく、グラニュライシンにおいても発現の増加を示したことに注目する場合、さらに支持される。この小さな試料サイズの制限は考慮される必要があるが、この評価の結果は、ＩＮＯ－３１０６が、抗原曝露の文脈において活性化が可能なＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を潜在的にもたらすこと、ならびにこれらの細胞が、グランザイム、パーフォリン、およびグラニュライシン合成が可能であり、よって、明確なＨＰＶ６特異的ＣＴＬ表現型を示すことを示す。

ＩＮＯ－３１０６は、ＲＲＰ患者におけるＴ細胞の免疫転写プロファイルを変化させる。
患者ＰＢＭＣの短期刺激（２４時間）を行い、続いてＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７由来ペプチドプールでの刺激に応答して特異的に調節されることが見出された免疫遺伝子転写物の分析を行った。患者６０１からのデータは、図６に見出すことができる。患者６０３および６０４について、遺伝子転写は、免疫療法後の炎症誘発性シグネチャーの上方調節とほとんど関連していた。患者６０３は、ベースラインと比較して、用量２でごくわずかな差次的遺伝子発現を示した。しかしながら、２週間の追跡調査来院では、未刺激細胞と比較して、ペプチドプールで刺激された細胞において、自然免疫応答に関連する遺伝子（ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８）、ＩＦＮγ経路に関連する遺伝子（ＧＢＰ１、ＧＢＰ５）、細胞間相互作用（ＣＤ２０９、ＭＲＣ１）、およびＢ細胞ヘルプ（ＣＸＣＬ１３）の顕著な上方調節が観察された。患者６０４はまた、２週間の追跡調査来院で遺伝子上方調節を示し、患者６０３において観察されたものと同様のシグネチャー（ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、Ｓｔａｔ１、ＧＢＰ１、ＧＢＰ５、ＣＣＬ８）を有した。加えて、患者６０４について、適応細胞活性化を示すマーカー（ＣＤ２７４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）の上方調節が観察された。患者６０３における遺伝子上方調節は一過性であったが、患者６０４は、用量４の３ヶ月後および６ヶ月後、後期追跡調査来院でこのシグネチャーを概ね維持した（図４Ａ、表３）。さらに、特に患者６０４について、抗原提示細胞によって発現される分子であるＩＤＯ１の発現は、経時的に急速に増加し、ベースラインで約４倍の差を示し、それは、用量２で８倍、２週間の追跡調査で１０倍、３ヶ月の追跡調査でほぼ１３倍に増加し、６ヶ月の追跡調査で６５倍増加でピークに達した（図４Ａ、表３）。

１１日間のインビトロ培養、続いて２４時間の抗原再刺激は、抗原特異的Ｔ細胞を見ることを可能にした。刺激条件は、Ｂ細胞および他のＡＰＣを含むすべての他の細胞型よりもＴ細胞の増殖を好む。分析は、エクスビボ刺激後と比較して、差次的遺伝子発現の低減したレベルを明らかにした。全体的に、両方のＲＲＰ患者は、遺伝子上方調節の同様のパターンを示し、ベースラインでは上方調節された遺伝子はほとんどなかった（患者６０３－０遺伝子および患者６０４－７遺伝子）が、免疫療法後の時点では差次的発現が増加した（患者６０３－それぞれ、用量４で４遺伝子、２週間の追跡調査で７遺伝子、３ヶ月および６ヶ月の追跡調査で３遺伝子、患者６０４－用量２で１２遺伝子、２週間の追跡調査で９遺伝子、３ヶ月の追跡調査で１０遺伝子、および６ヶ月の追跡調査で２２遺伝子）（図４Ｂ）。両方のＲＲＰ患者について、免疫療法後の試料からの刺激細胞における上方調節された遺伝子発現プロファイルは、主に、Ｔ細胞活性化および機能性（ＣＤ２７６、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＧＺＭＢ）ならびにＢ細胞ヘルプ（ＩＬ－２１、ＣＸＣＬ１３）と関連付けられた。試験に登録された各対象について差次的に発現された遺伝子の完全なリストについては、表４を参照されたい。ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９の増加した発現はまた、すべての対象について免疫療法後に観察されたが、患者６０４において、これらのマーカーは、ベースラインで既に増加していた。

ＩＮＯ－３１０６はＲＲＰの治療のための外科的介入の必要性を低減する
試験への登録前に、対象６０３および６０４は、約１８０日ごとに呼吸器乳頭腫を除去するために外科的介入を必要とした。このパターンが継続していると仮定すると、試験の経過にわたって予想される必要な外科的介入の数は、対象６０３では４回、対象６０４では２回であろう。しかしながら、試験全体にわたって、いずれの対象も気道乳頭腫の除去のための外科的介入を必要とせず、この疾患の治療における介入の必要性において臨床的変化を構成した。これらの対象の試験後追跡調査は、対象６０３が、この公開の時点で疾患の治療における外科的介入を必要としておらず、合計９１５日を超えて手術を行っていないことを明らかにする。５８４日後、対象６０４は、適切に治療するために外科的介入を必要とした疾患の再発を有し、手術頻度の全体的な低減は３倍を超えた（図５）。これらの患者の転帰における差は、試験中に生成された免疫学データのいずれかが治療への差次的臨床応答を示したかの調査を促進した。フローサイトメトリーの評価は、対象６０４が、対象６０３よりもＨＰＶ６特異的ＣＴＬの形態でより堅牢な免疫活性を有したことを示した（図５）。任意の特定の理論によって拘束されることを望まないが、したがって、対象ＣＴＬ上での応答の大きさおよび活性化マーカー発現のパターンの両方における差は、臨床的影響の持続性に関連付けられ得ることが考えられる。

ＨＰＶ６に関連する気道消化器前がん性病変および悪性腫瘍を有する３人の患者において、筋肉内投与され、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置によるエレクトロポレーションを介して送達されるＩＬ－１２ ＤＮＡアジュバントありおよびなしでのＨＰＶ６ Ｅ６／Ｅ７特異的標的化ＤＮＡ免疫療法の第Ｉ相安全性および免疫学的臨床試験の結果が本明細書に報告される。免疫療法の投与は、忍容性が良好であった。治療関連のＳＡＥはなく、最も頻度の高い治療中に発生したＡＥは注射部位反応であった。すべての患者は、少なくとも１つの免疫学的評価によって実証されるように、ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７抗原への細胞応答の誘導を示した。特に、両方の評価可能なＲＲＰ患者は、主に彼らの試験前の手術頻度と比較して遅延した治療介入（例えば、手術）の形態で、ＩＮＯ－３１０６による治療から臨床的利益を得た。さらに、ＩＮＯ－３１０６治療後により堅牢な細胞活性を示した患者は、手術を必要としないままであり、一方であまり堅牢ではない細胞活性を有する患者は、遅延したが、手術を完全には回避しなかったという事実は、ＨＰＶ６特異的な細胞応答の誘導と臨床的利益の種類／期間との間の因果関係の可能性を示す。これらの結果は、有望であり、特定の事例では、細胞応答を増強し続けるための追加の投薬が、この治療環境において好ましい場合があるという考えを提示する。ＩＮＯ－３１０６での治療は、様々なイムノアッセイにわたるＨＰＶ６特異的細胞応答の誘導をもたらした。ＥＬＩＳｐｏｔを使用したＩＦＮγの産生の確認、ならびにフローサイトメトリーを介したＣＤ８＋Ｔ細胞上のグランザイムおよびパーフォリンの合成に付随した活性化マーカーの発現の確認は、ＩＮＯ－３１０６が、高度に活性化された細胞傷害性リンパ球の特徴を有するＴ細胞を含んだ炎症誘発性免疫応答の誘導を駆動したことを示す。これらの結果は、治療の完了後のＰＢＭＣにおける炎症誘発性および調節性遺伝子転写物の動的調節の観察によってさらに強調される。具体的には、ＣＸＣＬ１０およびＧＢＰ１などのＩＦＮγ経路と関連した遺伝子は、短期および長期刺激の両方の後に上方調節された。頭頸部の扁平上皮がんにおける最近の試験は、ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＤＯ１ ＨＬＡ－ＤＲＡ、およびＳＴＡＴ１に基づく複合スコアが、治療応答速度と有意に相関したことを報告し、ＩＦＮγベースのシグネチャーが治療利益と関連していることを示した（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．２０１８；１２８（１）：Ｅ２７－Ｅ３２）。さらに、グランザイムＢおよびＴＮＦＲＳＦ９の増加した発現が観察され、トランスクリプトームレベルに対する細胞傷害性リンパ球の活性を確認した。ＨＰＶ駆動性疾患との闘いにおけるこの性質のＴ細胞応答の必要性は、ＤＮＡベースの免疫療法についての２つの以前の臨床試験において例示されており、この両方は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を使用して送達された。ＨＰＶ関連頸部異形成の文脈において、ＨＰＶ感染の排除に付随した病変の退縮の形態でのＶＧＸ－３１００（ＨＰＶ１６／１８のためのＤＮＡ免疫療法）による治療への臨床応答は、細胞傷害性の表現型マーカーを示すＩＦＮγおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を含んだ堅牢な細胞応答の存在と統計的に関連付けられた（Ｔｒｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１５；３８６（１０００８）：２０７８－８８）。加えて、中咽頭のＨＰＶ関連扁平上皮がんの治療を調査する別の試験では、ＭＥＤＩ０４５７（プラスミドコードＩＬ－１２アジュバントによるＨＰＶ１６／１８のためのＤＮＡ免疫療法）での治療後にニボルマブでの治療に対して完全奏効を達成した転移性がんを有する患者は、ＰＤ１＋細胞傷害性Ｔ細胞の療法駆動性の堅牢な増殖を有することが認められた（Ａｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１９；２５（１）：１１０－２４）。よって、本試験は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置によって送達されるＨＰＶ特異的免疫療法が、ＨＰＶ関連腫瘍形成に臨床的に影響を及ぼす可能性を有する強力なＴ細胞応答の生成を誘導するというさらなる証拠を提供する。

この試験から収集されたデータは、ＨＰＶ特異的免疫療法が、ＨＰＶ６に関連する再発性呼吸器乳頭腫症を有する患者の臨床状態に影響を及ぼし、追加または代替のアジュバント療法として作用することができる場合があることを最初に示す。これらの所見は、ペムブロリズマブの投与が日常的な外科的介入の低減した必要性と関連していた、今年これまでに提示されたデータを補完するものである（Ｐａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．３７．２５０２－２５０２．１０．１２００／ＪＣＯ．２０１９．３７．１５＿ｓｕｐｐｌ．２５０２）。これらの所見は一緒に、これらの患者の管理における免疫療法アプローチの使用を支持する早期データを提供する。この疾患の治療のための標準的な治療は、繰り返される外科的介入であり、これは、いくつかの合併症を提示し、潜在ウイルスが隣接組織に存在し得るため、病変再発を完全に根絶する可能性が低い（Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＡＰＭＩＳ．２０１０；１１８（６－７）：４２２－４９）。他の非外科的アジュバント介入は、病変の急速な再成長または侵襲性疾患を有する患者において適応されるが、そのような療法はまた、固有のリスクを有し、最適な治療レジメンを決定するためにさらなる評価を必要とする（Ｄｅｒｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２０１９；５２（４）：６６９－７９）。現在の治療の制限は、ＨＰＶ陽性の気道消化器疾患を有する患者を治療するための非侵襲的な免疫媒介性のアプローチを特定する必要性を強調する。実際に、予防的ＨＰＶワクチンは、乳頭腫の成長を低減し、介入間の時間を延長することが報告されているが、治療有効性の決定には継続的な評価が必要である（Ｍａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｏｉｃｅ．２０１７；３１（１）：１０４－６）。同様に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害は、ＲＲＰを治療するための合理的なアプローチを表すが、発現および臨床転帰への影響は、あまり特徴付けられていない（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ．２０１８；１２８（１）：Ｅ２７－Ｅ３２）。

本試験から生成されたデータは、非侵襲的免疫媒介性アプローチとしてＩＮＯ－３１０６およびＩＬ－１２アジュバントを用いた免疫療法が、ＲＲＰの既存の治療欠陥に対処するための選択肢を提供し得ることを示す。

Claims (17)

1. 個体における再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）を治療または予防するための方法であって、前記個体に、ＨＰＶ６抗原をコードする核酸分子を含む組成物を投与することを含む、方法。
2. 前記ＨＰＶ６抗原が、ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原である、請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸分子が、
   配列番号２をコードするヌクレオチド配列と、
   配列番号２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、
   配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と、
   配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記核酸分子が、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記核酸分子が、配列番号２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９９％相同であるヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
6. 前記ＨＰＶ６ Ｅ６－Ｅ７融合抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４をコードするヌクレオチド配列である５’末端のリーダー配列を有しない、請求項３に記載の方法。
7. 前記核酸分子が、
   配列番号１を含むヌクレオチド配列と、
   配列番号１と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、
   配列番号１の断片と、
   配列番号１の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
8. 前記核酸分子が、配列番号１と少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
9. 前記核酸分子が、配列番号１と少なくとも９９％相同であるヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の方法。
10. 前記核酸分子が、プラスミドである、請求項３に記載の方法。
11. 前記組成物が、薬学的組成物である、請求項３に記載の方法。
12. 前記個体に、アジュバントを含む組成物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記個体に、ＩＬ－１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットのうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. ｐ３５をコードする前記ヌクレオチド配列が、
    配列番号６をコードするヌクレオチド配列と、
    配列番号６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、
    配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と、
    配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
15. ｐ４０をコードする前記ヌクレオチド配列が、
    配列番号８をコードするヌクレオチド配列と、
    配列番号８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列と、
    配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
16. 配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同であるヌクレオチド配列。
17. 前記核酸分子を前記個体に投与することは、エレクトロポレーションを含む、請求項３に記載の方法。

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