DE60038048T2 - Mindestens ein cryptosporidium parvum-antigen und mindestens ein antigen eines anderen darmkrankheitserregers enthaltende zusammensetzungen und impfstoffe - Google Patents

Mindestens ein cryptosporidium parvum-antigen und mindestens ein antigen eines anderen darmkrankheitserregers enthaltende zusammensetzungen und impfstoffe Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft (ein) Antigen(e)/Epitop(e) von Cryptosporidium parvum und enterische Pathogene (wie zum Beispiel andere enterische Pathogene), Zusammensetzungen und Verfahren, welche die Gleichen umfassen oder verwenden, um eine Immunantwort dagegen hervorzurufen, oder zur Prävention, Behandlung oder zur Kontrolle von Cryptosporidium parvum und/oder enterische Infektionen, und Verwendungen davon.
  • Ebenfalls hierin erwähnt werden Verfahren und/oder Zusammensetzungen, und/oder Verwendungen solcher Zusammensetzungen oder Komponenten davon bei der Formulierung solcher Zusammensetzungen, zum Hervorrufen einer Immunreaktion gegen und/oder für die Prävention und/oder Behandlung und/oder Kontrolle der enterischen Infektionen in Tieren, zum Beispiel Säugern, wie zum Beispiel Rindern, Katzen, Hunde oder Pferden oder Arten davon.
  • Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen und/oder Verwendungen solcher Zusammensetzungen oder Komponenten davon bei der Formulierung solcher Zusammensetzungen zum Hervorrufen einer Immunreaktion gegen und/oder für die Prävention, und/oder Behandlung und/oder Kontrolle der Infektion durch Cryptosporidium parvum.
  • Hierin wird auch die gleichzeitige Verwendung eines Cryptosporidium parvum-Impfstoffes mit enterischen, z. B. Rinder-enterischen (z. B. Rota/Coronavirus, E. coli)-Impfstoffen und/oder die Verwendung einer Kombination von Impfstoffen, die Cryptosporidium parvum + Rota/Coronavirus, E. coli enthalten, erwähnt, sowie auch die Prävention, Kontrolle oder Behandlung oder das Hervorrufen einer Immunreaktion, um die Verschlimmerung von enterischen, z. B. Rinder-enterischen, Erkrankungen, aufgrund der gleichzeitigen Infektion mit Cryptosporidium parvum, zu vermindern. Die durch die Impfung induzierte Immunität gegen Cryptosporidium parvum, kann die Schwere der Krankheit, die durch hierin erwähnte enterische Pathogene induziert wird, erheblich vermindern. Ein Kombinations-Impfstoff, der Cryptosporidium parvum enthält, ist für eine vollständigere Prävention einer multiätiologischen enterischen Krankheit in neugeborenen Tieren, wie zum Beispiel Kälbern nützlich, die durch Rota- und Coronaviren und E. coli K99 und F41 verursacht werden.
  • Ebenfalls hierin erwähnt wird der Effekt einer gleichzeitigen Infektion Cryptosporidium parvum mit anderen enterischen, z. B. Rinder-enterischen, Pathogenen. Cryptosporidium parvum wird üblicherweise im Stuhl von neugeborenen Tieren, wie zum Beispiel Säugern, z. B. Kälbern, festgestellt. Cryptosporidium parvum ist allein im Stande klinische Zeichen von enterischer Erkrankung zu erzeugen, unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit von anderen potentiell pathogenen Viren und Bakterien im Darmtrakt. Viren, wie zum Beispiel Coronavirus, und Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, z. B. F41, die in dem Gebiet als sehr pathogen eingestuft worden sind, sind nicht im Stande wichtige klinische Zeichen der Erkrankung in experimentellen Challenge-Modellen zu verursachen. Die Erfindung kann daher die gleichzeitige Infektion von Rindern mit Cryptosporidium parvum betreffen, da diese gleichzeitige Infektion die Erkrankung, die durch andere enterische Pathogene, wie zum Beispiel Coronavirus, Rotavirus und E. coli, z. B. F41, verursacht wurde, erschweren kann.
  • Verschiedene Dokumente, werden in diesem Text zitiert. Die Zitate im Text können als eine Zitierung eines Dokuments in der Literaturnachweisliste, z. B., als ein Autor(en) und Dokumentenjahr-Zitierung zu einem im Literaturnachweis gelisteten Dokument oder durch eine vollständige Zitierung im Text zu einem Dokument, welches im Literaturnachweis gelistet sein kann oder nicht, stattfinden.
  • Es gibt kein Zugeständnis, das irgendeines der verschiedenen, in diesem Text zitierten Dokumente, im Bezug auf die vorliegende Erfindung als Stand der Technik darstellt. Jedes Dokument, das eine Person oder Personen, die hierin als Erfinder genannt sind, als einen Autor oder Erfinder aufweist, ist hierin ein Dokument, das, im Bezug auf die erfinderische Einheit hierin nicht von jemandem anderen ist.
  • STAND DER TECHNIK
  • Enterische Rindererkrankung ist das Ergebnis einer enteropathogenen Darminfektion, die sich am häufigsten in irgendeiner Form von Durchfall manifestiert. Diese Erkrankung, die landläufig auch als neonataler Rinderdurchfall bezeichnet wird, ist für erhebliche ökonomische Verluste in der Landwirtschaft verantwortlich. Die Sterblichkeit der Kälber, gemeinsam mit dem Bedarf von einer therapeutischen Intervention und der möglichen nachteiligen Langzeit-Wirkungen auf die Tiere, sind die Hauptfaktoren, die für die ökonomische Belastung der Bauern verantwortlich sind. Eine Schätzung deutet darauf hin, dass neonataler Kälberdurchfall für etwa 75% des Sterbens von Milchkälbern, mit einem Alter von weniger als 3 Wochen, verantwortlich ist. Radostits, OM, et al., Herd Health Food Animal Production Medicine, 2. Auflage, Sounders, Philadelphia, Seiten 184–213, 1994. Die Handhabung des neonatalen Kälberdurchfalls ist aus mehreren Gründen schwierig, einige der wichtigsten umfassen: (1) die Beteiligung von verschiedenen Erregern in der Pathogenese der Erkrankung; (2) die Unspezifität der klinischen Zeichen; (3) die Feststellung, dass manche Infektionen asymptomatisch verlaufen können; und (4) die Beteiligung von Wirtsfaktoren, wie zum Beispiel Ernährung und endogene Immunität. Moon, HW, et al., JAVMA 173 (5): 577–583 (1978). Viring, S, et al., Acta Vet. Scand. 34: 271–279 (1999).
  • Die Entwicklung einer Strategie zur Verhinderung oder Behandlung von enterischer Rinderkrankheit ist sehr schwierig gewesen. Obwohl bekannt ist, dass verschiedene Enteropathogene während der Infektion vorhanden sind, ist nicht bekannt, welches Pathogen oder welche Kombination an Pathogenen tatsächlich für die Erkrankung verantwortlich ist. Epidemiologische Studien in den Vereinigten Staaten, sowie in anderen Teilen der Welt zeigen, dass die häufigsten, mit neonatalem Kälberdurchfall in Zusammenhang stehenden Enteropathogene Cryptosporidium parvum, Rotavirus, Coronavirus und E. coli umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Während in den meisten Fällen einige dieser Enteropathogenen von Ausbrüchen dieser Krankheit isoliert werden, stimmt das Vorherrschen von jedem dieser Erreger nicht mit einer einzigen erkrankten Population oder zwischen mehreren infizierten Herden überein. Traditionell haben Studien Rotavirus als das häufigste Enteropathogen bei an Durchfall erkrankten Kälbern festgestellt. In einer Studie von mit einem Durchfall erkrankten Kälbern in Großbritannien zum Beispiel, wurden Rotavirus und Cryptosporidium parvum in 42 bzw. 23% der Population nachgewiesen. Zwanzig Prozent der Kälber waren mit mehr als einem Pathogen infiziert. Neuere Berichte deuten jedoch darauf hin, dass Cryptosporidium parvum das vorherrschende Pathogen in enterischen Rinderinfektionen darstellt. In einer neuen Studie, die Cryptosporidium parvum evaluiert, und gleichzeitigen Infektionen durch andere Haupt-Enteropathogene in neonatalen Kälbern, wurde Cryptosporidium parvum in 52.3% der Population gefunden, gefolgt durch einzelne Infektionen mit Rotavirus bei 42,7%. de la Fuente et al., Preventive Veterinary Medicine 36: 145–152 (1998). Gleichzeitige Infektion mit zwei Erregern fand in 21,6% dieser Untersuchungsgruppe statt, während drei von vier Pathogenen in 6% bzw. 0,5% festgestellt wurde. Die häufigste gemischte Infektion in dieser Gruppe war eine Kombination von Cryptosporidium-Rotavirus. Es gibt über die Rolle der einzelnen enterischen Pathogene in neonatalem Kälberdurchfall begrenzte Information. Darüber hinaus werden gemeinsame Mechanismen von viralen, bakteriellen und durch Protozoen ausgelöste Pathogenese, die der enterischen Rindererkrankung zugrunde liegen, noch weniger verstanden. Unabhängig vom Fehlen des Verständnisses des Mechanismus der Pathogene, führt die Infektion mit mehr als einem Pathogen jedoch zu einem schwereren klinischen Ergebnis, als Infektionen, die durch ein einzelnes Enteropathogen verursacht werden.
  • Zurzeit gibt es kein Behandlungsverfahren, welches ausreichenden Schutz gegen neonatalen Kälberdurchfall ermöglicht. Es gibt kein einziges Arzneimittel oder eine Kombination von chemotherapeutischen Mitteln, die bei der Behandlung dieser Erkrankung nützlich ist. Obwohl Impfstoffe vorhanden sind, welche auf enterische Rindererkrankung abzielen, haben sie nur beschränkten Erfolg und Akzeptanz gefunden. Gegenwärtig sind Impfstoffe vorhanden, die Antigene zu drei Enteropathogenen aufweisen, von welchen festgestellt wurde, dass sie mit der Erkrankung in Zusammenhang stehen, nämlich Rotavirus, Coronavirus und E. coli. Von der Wirksamkeit der einzelnen Komponenten dieser kommerziell erhältlichen enterischen Rinderimpfstoffe (Rota/Corona, E. coli) ist gezeigt worden, dass sie in experimentellen Challenge-Modellen schützen. Trotz der Verfügbarkeit solcher Impfstoffe unter Außenbedingungen, ziehen neonataler Durchfall, Kälberdiarrhöe und Winterdurchfall, Rinder, Weide und Kuh-Kalb-Unternehmen noch weiterhin in Mitleidenschaft. Erzeuger hinterfragen ständig die Wirksamkeit von gegenwärtigen Impfstoffen unter Außenbedingungen, die E. coli K99, Rota- und Coronavirus enthalten, wie sich durch geringe Nutzung der enterischen Kombinationsimpfstoffe im US-Markt widerspiegelt (nur 4% der schwangeren Tiere werden jährlich mit diesem Produkt geimpft).
  • Vor kurzem ist ein monovalenter experimenteller Impfstoff gegen Cryptosporidium parvum entwickelt worden, und von ihm wurde gezeigt, dass er gegen einen experimentellen Challenge mit Cryptosporidium parvum schützte. Die an der enterischen Krankheit beteiligten vielfachen Enteropathogene können jedoch nicht durch die Behandlung mit einem Cryptosporidium parvum-Impfstoff alleine bewältigt werden. Die enteropathogene Infektion scheint außerdem weltweit vorzuliegen; man findet sie in der ganzen Welt und die meisten Wirbeltiere sind für eine solche Infektion anfällig. Der Bedarf enteropathogene Infektion zu bekämpfen ist daher nicht auf Rinderarten beschränkt. Darüber hinaus ist es schwierig die enterische Erkrankung zu kontrollieren. Sie ist wahrscheinlich von mehreren Faktoren abhängig; Cryptosporidium parvum kann ein Faktor sein, aber bis jetzt gibt es keinen definitiven Beweis, dass Cryptosporidium parvum die enterische Erkrankung tatsächlich verstärkt oder, dass seine Verwendung in einer Kombination von immunogenen, immunologischen Zusammensetzungen oder von Impfstoffzusammensetzungen die Prävention von enterischer Krankheit erhöht.
  • Von einem weiteren Problem, dem man bei der Herstellung und Verwendung von Kombinationsimpfstoffen begegnet, ist das Phänomen, das als "Wirksamskeit-Interferenz" bezeichnet wird, wobei die Wirksamkeit von einem Antigen in der Kombination abgeschwächt oder reduziert wird, es wird angenommen, dass es von der Dominanz durch ein anderes Antigen in dem Kombinationsimpfstoff stammt; vergleiche Paoletti et al., U.S. Patentnummer 5.843.456 . Dieses Phänomen ist in Kombination mit Impfstoffen beobachtet worden, die E. coli als ein Antigen oder Antigene einsetzen; zum Beispiel kann einzelnes oder vielfaches Bacterin andere Antigene in Kombinationsimpfstoffen beinträchtigen.
  • Es wird daher angenommen, dass vordem das Problem von Cryptosporidium parvum, das zu enterischen Infektionen und Symptomen beiträgt, oder die Art in welcher dieses Problem hierin behandelt wird, z. B. Kombinationszusammensetzungen einschließlich Cryptosporidium parvum-Antigen(e) oder Epitop(e) von Interesse mit mindestens einem anderen Antigen oder Epitop von Interesse aus einem Pathogen, welches enterische Infektion und/oder Symptome und/oder Rekombinante(n) und/oder Vektor(en) und/oder Plasmid(e), die (ein) solche(s) Antigen(e) oder Epitop(e) von Interesse exprimieren und die Verabreichung von solchen Zusammensetzungen an schwangere Säuger, wie zum Beispiel schwangere Kühe und/oder neugeborene oder junge Säuger, wie zum Beispiel Kälber innerhalb des ersten Monats nach der Geburt und das Befassen mit jedem möglichen Problem der Beeinträchtigung der Wirksamkeit, sind nicht offenbart oder vorgeschlagen worden.
  • GEGENSTÄNDE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Gegenstand der Erfindung sind enterische immunologische Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen, insbesondere jene, die im Gebiet der Veterinärmedizin verwendet werden können, zum Beispiel für Tiere wie Rinder, Hunde, Katzen oder Pferde oder Arten davon.
  • Ein anderer Gegenstand der Erfindung können solche immunologische Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen sein, die effektiv verwendet werden können, um neugeborene und/oder junge Tiere zu immunisieren, wie zum Beispiel neugeborene Tiere passiv zu immunisieren, z. B. Säuger, zum Beispiel Rinder, Hunde, Katzen oder Pferde oder Arten davon; Vorteilhafterweise Rinder.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung können verbesserte immunologische Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen gegen Cryptosporidium parvum sein, zum Beispiel für die Verwendung mit Säugern, z. B. Hunden, Katzen oder Pferden oder Arten davon, insbesondere Rindern oder Arten davon.
  • Es werden hierin Verfahren zur Immunisierung von neugeborenen und/oder jungen Tieren, wie zum Beispiel die passive Immunisierung von neugeborenen Tieren, z. B. Säugern, wie zum Beispiel Hunden, Katzen oder Pferden oder Arten davon, insbesondere Rindern oder Arten davon, erwähnt.
  • Sogar noch weiter werden hierin Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen Cryptosporidium parvum oder enterische Pathogene erwähnt, einschließlich Cryptosporidium parvum oder zum Kontrollieren, Vorbeugen und/oder Behandeln von enterischen Infektionen und/oder Symptomen, einschließlich Cryptosporidium parvum; zum Beispiel umfassend die Verabreichung einer erfinderischen Zusammensetzung; sowie auch Verfahren zum Erzeugen von solchen Zusammensetzungen, Verwendungen von Komponenten solcher Zusammensetzungen zur Bereitung solcher Zusammensetzungen, unter anderem.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine kombinierte enterische immunologische Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, umfassend:
    Ein erstes Antigen oder Epitop von Interesse aus Cryptosporidium parvum und/oder einen Vektor, welcher das erste Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert,
    und ein zweites Antigen oder Epitop von Interesse von einem anderen enterischen Pathogen und/oder dem ersten Vektor, welcher das erste Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert und auch das zweite Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert und/oder einen zweiten Vektor, der das zweite Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert,
    und einen pharmazeutisch verträglichen Träger;
    wobei das Antigen aus dem enterischen Pathogen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Antigenen von E. coli, Rotavirus, Coronavirus und Gemischen davon.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in einem anderen Aspekt eine Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bereit, wobei diese Zusammensetzung als eine Rinder, Hunde, Katzen oder Pferde kombinierte enterische immunologische Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung verwendet wird.
  • In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments für die Prävention und/oder die Behandlung und/oder Kontrolle von Cryptosporidium parvum und/oder enterischen Infektionen in Tieren bereitgestellt.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, umfassend das Beimischen der Antigene oder Epitope oder Vektoren und eines Trägers.
  • In einem anderen Aspekt wird ein Kit für die Erzeugung einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, umfassend die Antigene, Epitope oder Vektoren, jedes in einem getrennten Behälter oder Behältern, wahlweise gemeinsam verpackt; und ferner wahlweise mit Anweisungen für das Beimischen und/oder die Verabreichung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in einem anderen Aspekt die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Behandlung und/oder Kontrolle von Cryptosporidium parvum und/oder enterischen Infektionen in Tieren bereit.
  • Die Impfung oder Immunisierung gegen enterische Pathogene, wie zum Beispiel enterische Pathogene, einschließlich Cryptosporidium parvum, wird durch die Verwendung einer immunologischen oder Impfstoffzusammensetzung, einschließlich einer Kombination von mindestens zwei Cryptosporidium parvum-Antigenen oder Epitopen davon und/oder Vektor(en), die mindestens zwei Cryptosporidium parvum-Antigene oder Epitope davon exprimieren, z. B. P21 oder ein Epitop davon und/oder einen Vektor, der P21 exprimiert, oder ein Epitop davon oder Cp23 oder ein Epitop davon und/oder einen Vektor, der CP23 oder ein Epitop davon exprimiert und Cp15/60 oder ein Epitop davon und/oder einen Vektor, der Cp15/60 exprimiert (zum Beispiel eine Zusammensetzung, die mindestens ein Epitop von Cp23 erhält und mindestens ein Epitop von Cp15/60; und es sollte beachtet werden, dass das Cp23-Antigen oder Protein P21 enthalten kann) stark und unerwartet verbessert. Die Kombination von beiden Antigenen (oder Epitop(en) von Interesse und/oder Vektoren, welche die Antigene und/oder Epitop(e) exprimieren) führt zu einem synergistischen Effekt mit einer verbesserten oder nützlichen Erzeugung einer Immunantwort, z. B. Antikörper, zelluläre Antworten oder beides, gegen Cryptosporidium parvum und/oder einer enterischen Infektion oder Pathogenen oder Symptomen, wie zum Beispiel eine sehr hohe Erzeugung von Antikörpern gegen Cryptosporidium parvum. Das erlaubt auch die Herstellung von wirkungsvollen immunologischen Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen, die nützlich sind, um neugeborene oder junge Tiere oder Säuger, zum Beispiel Hunde, Katzen oder Pferde oder Arten davon; insbesondere Rinder, zu schützen. Zum Beispiel können Zusammensetzungen, die Antigene und/oder Epitop(e) von Interesse enthalten, durch die Inokulierung von den Muttertieren oder schwangeren Weibchen eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort hervorzurufen, die an den noch ungeborenen Nachkommen und das neugeborene oder junge Tier über Milch oder Kolostrum während der Stillzeit weitergegeben werden kann und Zusammensetzungen, die Vektor(en) enthalten, die Antigene und/oder Epitop(e) exprimieren, können bei der Inokulation von Männchen und Weibchen aller Alterstufen vorteilhaft eingesetzt werden, z. B. jenen, die nicht schwanger sind und/oder neugeborene oder junge Tiere darstellen und die Inokulation von neugeborenen oder jungen Tieren kann alleine oder vorteilhafterweise gemeinsam mit der Inokulation der Muttertiere oder der schwangeren Weibchen durchgeführt werden, z. B., um zu ermöglichen, dass eine Immunreaktion in den jungen oder neugeborenen Tieren erzeugt wird, während sie auch Antikörper oder andere immunologische Mittel über die Milch oder das Kolostrum während des Stillens erhalten.
  • Das Kombinieren von Antigen(en) und/oder Epitop(en) von Interesse gegen Cryptosporidium parvum in einer immunologischen oder Impfstoffzusammensetzung, mit mindestens einem anderen Antigen oder Epitop von Interesse gegen mindestens ein anderes enterisches Pathogen von der Tierart (und vorteilhafterweise einer Vielzahl von Antigen(en) und/oder Epitiop(en) von Interesse aus einer Vielzahl von Pathogen(en), z. B. enterischen Pathogen(en), kann den Schutz gegen enterische Pathologien erheblich erhöhen.
  • Eine besonders vorteilhafte erfinderische, immunologische oder Impfstoffzusammensetzung kann gegen Cryptosporidium parvum gerichtet sein und kann umfassen: (i) mindestens ein Cp23-Antigen oder Epitop von Interesse davon und/oder mindestens einen Vektor, welcher mindestens ein Cp23-Antigen oder Epitop von Interesse davon umfasst oder mindestens ein P21-Antigen oder Epitop von Interesse davon und/oder mindestens einen Vektor, der mindestens ein P21-Antigen oder Epitop von Interesse davon exprimiert und (ii) mindestens ein Cp15/60-Antigen oder Epitop von Interesse davon und/oder mindestens einen Vektor, der mindestens ein Cp15/60 exprimiert. Die Zusammensetzung umfasst vorteilhafterweise ferner mindesten ein zusätzliches Antigen oder Epitop von Interesse aus einem anderen enterischen Pathogen und/oder einem Vektor, der mindestens ein zusätzliches Antigen umfasst (welcher der gleiche Vektor sein kann, der das Cp23 oder P21-Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert und/oder das Cp15/60-Antigen oder Epitop von Interesse, z. B. die Zusammensetzung kann einen Vektor umfassen, der das Cp23- oder P21-Antigen oder Epitop von Interesse und gleichzeitig das Cp15/60-Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert, und gegebenenfalls das optionale zusätzliche Antigen oder Epitop von Interesse).
  • Ein anderes Cryptosporidium parvum-Antigen ist das CP41-Antigen, das in Mark C. Jenkins et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Nov. 1999, 6, 6: 912–920 beschrieben wird. Die immunologischen Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen gemäß der Erfindung können daher dieses Antigen oder Epitop von Interesse umfassen und/oder einen Vektor, der dieses Antigen oder Epitop davon exprimiert, möglicherweise und vorzugsweise gemeinsam mit mindestens einem anderen Cryptosporidium parvum, wie hierin beschrieben, wie zum Beispiel Cp23, P21 und Cp15/60, z. B. in Kombination mit Cp23 oder P21 und/oder Cp15/60. Für die Expression dieses Antigens kann man stromaufwärts von der Nucleotidsequenz ein Startcodon hinzufügen, die auf 2 von dieser Publikation vorkommt, und ein Stoppcodon, stromabwärts von dieser Sequenz.
  • Eine effiziente immunologische oder Impfstoffzusammensetzung gegen Enteritis wird auch produziert, indem nur eines von dem Cp23 oder einem Epitop davon hinzugefügt wird, oder ein Vektor, der Vektor, der das Antigen oder Epitop exprimiert, oder P21 oder ein Epitop davon oder ein Vektor, der das Antigen oder Epitop exprimiert, oder Cp15/60 oder ein Epitop davon oder ein Vektor, der das Antigen oder Epitop davon exprimiert, oder CP41 oder ein Epitop davon oder ein Vektor, der das Antigen oder ein Epitop exprimiert, wie zum Beispiel ein Cryptosporidium parvum-Antigen oder Epitop von Interesse, vorteilhafterweise in Kombination mit mindestens einem anderen Cryptosporidium parvum-Antigen oder Epitop von Interesse oder einem Vektor, der ein solches Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert; und diese Zusammensetzung kann weiter mindestens ein zusätzliches Antigen oder Epitop von Interesse aus einem anderen enterischen Pathogen und/oder Vektor umfassen, der mindestens ein zusätzliches Antigen exprimiert (und dieser Vektor kann gleichzeitig Antigen(e) und/oder Epitop(e) exprimieren).
  • Es werden hierin Verfahren zum Hervorrufen einer immunologischen oder schützenden (Impfstoff)-Antwort erwähnt, gegen oder zur Kontrolle, Prävention und/oder Behandlung von enterischen Pathogenen oder enterischen Infektionen oder enterischen Symptomen, einschließlich Cryptosporidium parvum; zum Beispiel umfassend die Verabreichung einer erfinderischen Zusammensetzung.
  • Eine erfinderische Zusammensetzung kann an einen schwangeren Säuger verabreicht werden, wie zum Beispiel eine Färse oder eine Kuh (nachstehend als Kuh bezeichnet), Hund, Katze, oder Pferd während der Schwangerschaft; zum Beispiel einmal oder zweimal während der üblichen Schwangerschaft (für eine Kuh üblicherweise eine 9-monatige oder 170 Tage Schwangerschaft) wie zum Beispiel eine erste Verabreichung etwa 1 bis etwa 2,5 oder etwa 3 Monate vor der Kalbung und eine zweite oder einzige Verabreichung nahe der Kalbung, z. B. in den letzten 3 Wochen vor der Kalbung, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 15 Tage vor der Kalbung. Auf diese Weise kann das Weibchen die passive Immunität an das Neugeborene übertragen, z. B. an Kälber nach der Geburt über die Milch oder das Kolostrum. Vorteilhafterweise werden Zusammensetzungen, welche das (die) Antigen(e) und/oder Epitop(e) von Interesse umfassen (im Gegensatz zu Zusammensetzungen, die Vektor(en), Rekombinante(n) und/oder DNA-Plasmid(e) umfassen), an schwangere Säuger verabreicht, um wie erwünscht eine Antikörperreaktion hervorzurufen. Und im Gegensatz dazu werden solche Zusammensetzungen, welche den (die) Vektor(en), Rekombinante(n) und/oder das (die) DNA-Plasmid(e) umfassen, welche das (die) Antigen(e) und/oder Epitop(e) von Interesse in vivo exprimieren, vorteilhafterweise an einen neugeborenen oder sehr jungen Säuger verabreicht (z. B. einen Säuger, der für eine enterische Erkrankung empfänglich ist, wie zum Beispiel ein Rind während seiner ersten Lebensmonate oder an andere Säuger während einer analogen Periode in ihrem Leben), nachdem eine zelluläre und/oder Antikörperreaktion nützlich sein kann, um enterische Zustände, Infektionen oder Symptome in solchen neugeborenen und/oder sehr jungen Tieren zu verhindern, behandeln und/oder zu kontrollieren. Die neugeborenen und/oder sehr jungen Tiere können einen Booster einer antigenischen und/oder epitopischen und/oder Vektor/Rekombinante/DNA-Plasmid-Zusammensetzung während der Dauer der Empfänglichkeit erhalten; und ihre Mutter kann, wahlweise und vorteilhafterweise, auch während der Schwangerschaft immunisiert worden sein, wie hierin beschrieben, sodass das neugeborene und/oder sehr junge Tier eine immunologische Reaktion erhalten kann, indem es die Verabreichung direkt oder passiv bekommt.
  • Eine besonders erfinderische Zusammensetzung kann ein oder mehrere E. coli Antigene enthalten (z. B. inaktiviertes E. coli, das Pili trägt, wie zum Beispiel K99, Y, 31A und/oder F41 und/oder diese Pili in einer Untereinheitenform oder in vivo rekombinant exprimiert) und/oder ein oder mehrere Rotavirusantigene (z. B. vorteilhafterweise inaktiviertes Rotavirus), und/oder ein oder mehrere Coronavirusantigen(e) (z. B. Rinder-Coronavirusantigen, vorteilhafterweise wie zum Beispiel inaktiviertes Coronavirus) in Kombination mit einem oder mehreren Cryptosporidium parvum-Antigenen, wie zum Beispiel P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60. (Ein oder mehrere dieser Antigenen können, wie vorstehend erwähnt, ein Epitop von Interesse darstellen, das innerhalb des Antigens enthalten ist; und ein oder mehrere dieser Antigene oder Epitope von Interesse können in vivo durch eine Rekombinante oder ein Plasmid exprimiert werden).
  • Daher kann eine besonders erfinderische Zusammensetzung umfassen (i) ein oder mehrere Cryptosporidium parvum-Antigene, wie zum Beispiel P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41 und, vorteilhafterweise, P21 und/oder Cp23 und Cp15/60 und (ii) mindestens ein E. coli-Antigen (z. B. mindestens eine oder alle von K99, Y, 31A, F41 und/oder Pili, die von inaktiviertem E. coli getragen werden oder als Untereinheiten oder wie exprimiert in vivo; K99 und/oder F41 sind vorzugsweise vorhanden und Y und/oder 31A sind vorzugsweise auch vorhanden) und/oder Coronavirus und/oder Rotavirus-Antigen; wie zum Beispiel ein oder mehrere C. parvum-Antigene, wie zum Beispiel P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41 und vorteilhafterweise P21 und/oder Cp23 und Cp15/60 und ein oder mehrere Rotavirusantigene, wie zum Beispiel inaktiviertes Rotavirus, oder ein oder mehrere C. parvum-Antigene, wie zum Beispiel P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41 und vorteilhafterweise P21 und/oder Cp23 und Cp15/60 und ein oder mehrere Coronavirusantigene, wie zum Beispiel inaktiviertes Coronavirus, z. B. inaktiviertes Rinder-Coronavirus, oder ein oder mehrere C. parvum-Antigene, wie zum Beispiel P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41 und vorteilhafterweise P21 und/oder Cp23 und Cp15/60 und ein oder mehrere E. coli-Antigene, wie zum Beispiel K99, Y, 31A, F41 und/oder andere Pili, die durch inaktivertes E. coli getragen werden oder als Untereinheiten oder wie exprimiert in vivo, z. B. eine Kombination von K99, Y, 31A und/oder F41. Ein beispielhaftes E. coli Antigen, welches in der Erfindung nützlich ist, kann ein Pili sein, nachdem E. coli-Pili die Beeinträchtigung der Wirksamkeit verhindern kann. Eine beispielhafte Zusammensetzung kann ein oder mehrere C. parvum-Antigene umfassen, wie zum Beispiel P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41 und vorteilhafterweise P21 und/oder Cp23 und Cp15/60 und mindestens ein E. coli-Antigen, und mindestens ein Rotavirus-Antigen, z. B. P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41 und vorteilhafterweise P21 und/oder Cp23 und Cp15/60 und inaktiviertes Rotavirus, und inaktiviertes Coronavirus und mindestens ein E. coli-Antigen, vorteilhafterweise Pili oder bevorzugt mindestens ein oder mehrere von K99, Y, 31A und F41, oder eine Kombination von K99, Y, 31A und F41. (Ein oder mehrere dieser Antigene können, wie vorstehend erwähnt, ein Epitop von Interesse darstellen, beinhaltet innerhalb des Antigens; und ein oder mehrere dieser Antigene oder Epitope von Interesse können in vivo durch eine Rekombinante oder ein Plasmid exprimiert werden). In Bezug auf mögliche Beeinträchtigung der Wirksamkeit durch einzelnes oder multiples Bacterin, haben die Erfinder festgestellt, dass jede mögliche Beeinträchtigung der Wirksamkeit durch Erhöhen der Menge des anderen Antigens, das im Kombinations-Impfstoff vorhanden ist, vermieden wird; und, dass die Verwendung von Pili als ein E. coli Antigen die Beeinträchtigung der Wirksamkeit auch verhindert.
  • In diesen erfinderischen Zusammensetzungen, kann eine einzelne Dosis das E. coli Antigen aufweisen (oder jedes E. coli Antigen, im Fall von vielfachen E. coli Antigenen), die in einer Menge vorhanden sind, die üblicherweise in Impfstoffen gegen enterische Pathogene gefunden wird, wie zum Beispiel eine Menge, um in Meerschweinchen einen Serumtiter von mindestens 0,9 log 10 zu erhalten; das Rotavirus-Antigen kann in einer Menge vorhanden sein, die herkömmlicherweise in Impfstoffen gegen enterische Pathogene gefunden wird, wie zum Beispiel eine Menge, um in Meerschweinchen einen Serumtiter von mindestens 2.0 log 10 zu erhalten und das Coronavirus-Antigen, kann in einer Menge vorhanden sein, die herkömmlicherweise in Impfstoffen gegen enterische Pathogene gefunden wird, wie zum Beispiel eine Menge, um Meerschweinchen einen Serumtiter von mindestens 1,5 log 10 zu erhalten; und die erfinderische Zusammensetzung kann ein Adjuvans, wie zum Beispiel Aluminium-Hydroxyd umfassen, das in einer einzelnen Dosierung in einer Menge vorhanden sein kann, die üblicherweise in Impfstoffen gefunden wird, wie zum Beispiel vorzugsweise eine Menge von etwa 0,7 bis etwa 0,9 mg.
  • Demgemäß stellt die Erfindung in einem Aspekt eine kombinierte enterische immunologische, immunogene Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung bereit, umfassend ein erstes Antigen oder Epitop von Interesse aus Cryptosporidium parvum und/oder einen ersten Vektor, der das erste Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert, und ein zweites Antigen oder Epitop von Interesse aus einem anderen enterischen Pathogen und/oder der erste Vektor, der das erste Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert, exprimiert auch das zweite Antigen oder Epitop von Interesse und/oder ein zweiter Vektor, der das zweite Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Die Zusammensetzung kann Antigen umfassen, das von Cryptosporidium parvum stammen kann und ein Antigen von einem anderen enterischen Pathogen. Die Zusammensetzung kann ein Antigen aus Cryptosporidium und ein Antigen aus einem anderen enterischen Pathogen einer Rinderart umfassen; oder von einer Hundeart; oder einer Katzenart; oder einer Pferdeart. Das Antigen aus dem enterischen Pathogen kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus den Antigenen von E. coli, Rotavirus, Coronavirus, Clostridium spp. und Gemischen davon. Das enterische Pathogen kann E. coli darstellen. Das Antigen von E. coli kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus E. coli, das ein K99-Antigen trägt, ein E. coli, das ein F41-Antigen trägt, E. coli, das ein Y-Antigen trägt, E. coli, das ein 31A-Antigen trägt, K99-Antigen, F41-Antigen, Y-Antigen, 31A-Antigen, und Gemische davon.
  • Es wird hierin eine Zusammensetzung erwähnt, wobei das enterische Pathogen ein Rinder-Coronavirus umfassen kann; und/oder Rinder-Rotavirus, und/oder Clostridium perfringens. Das Antigen des enterischen Pathogens kann die Clostridium perfringens Typ C und D Impfstoffe enthalten. Es wird hierin eine Zusammensetzung erwähnt, wobei das enterische Pathogen E. coli, Rinder-Rotavirus, Rinder-Coronavirus und Clostridium perfringens oder E. coli, Rinder-Rotavirus, Rinder-Coronavirus umfassen kann.
  • Darüber hinaus wird hierin eine Zusammensetzung erwähnt, wobei das Antigen des enterischen Pathogens E. coli Antigene umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E. coli, welches das K99-Antigen trägt, E. coli, welches das F41-Antigen trägt, E. coli, welches das Y-Antigen trägt, E. coli, welches das 31A-Antigen trägt, K99-Antigen, F41-Antigen, Y-Antigen, 31A-Antigen, und Gemische davon; inaktiviertes Rinder-Coronavirus; inaktiviertes Rinder-Rotavirus und Clostridium perfringens Typ C und D Impfstoffe; oder E. coli Antigene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E. coli, welches das K99-Antigen trägt, E. coli, welches das F41-Antigen trägt, E. coli, welches das Y-Antigen trägt, E. coli, welches das 31A-Antigen trägt, K99-Antigen, F41-Antigen, Y-Antigen, 31A-Antigen und Gemische davon, inaktiviertes Rinder-Coronavirus; und inaktiviertes Rinder-Rotavirus.
  • Die erfinderische Zusammensetzung kann vorteilhafterweise Untereinheiten Cryptosporidium parvum-Antigene umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P21, Cp23, Cp15/60, CP41 und Gemische davon, wie zum Beispiel Cp23 und Cp15/60 oder P21 und Cp15/60.
  • In der erfinderischen Zusammensetzung bei der Vereinigung von Antigenen aus Cryptosporidium parvum und mindestens einem anderen enterischen Pathogen, kann das Cryptosporidium parvum-Antigen auch inaktivierte oder lebende attenuierte Oocyten, oder Untereinheiten, die aus Oocyten erhalten wurden, umfassen oder darstellen.
  • Die erfinderischen Zusammensetzungen können ein Adjuvans, wie zum Beispiel Saponin oder Aluminiumhydroxid umfassen; und erfinderische Zusammensetzungen können in der Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion vorliegen.
  • Es wird hierin eine immunologische, immunogene Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung gegen Cryptosporidium parvum erwähnt, welche ein erstes Antigen einschließt, umfassend ein P21- oder Cp23-Antigen oder ein Epitop davon, oder einen ersten Vektor, der das erste Antigen exprimiert und ein zweites Antigen, umfassend Cp15/60-Antigen oder ein Epitop davon oder den ersten Vektor, wobei der erste Vektor sowohl die ersten als auch die zweiten Antigene exprimiert oder einen zweiten Vektor, der das zweite Antigen exprimiert und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Zusammensetzung kann Cp23- und Cp15/60-Antigene umfassen, die in der Form von getrennten Fusionsproteinen vorliegen. Die Zusammensetzung kann einen Vektor umfassen, der Cp23 und Cp15/60 exprimiert. Die Zusammensetzung kann einen ersten rekombinanten Vektor umfassen, der Cp23 exprimiert und einen zweiten rekombinanten Vektor, der Cp15/60 exprimiert. Und die Zusammensetzung kann P21 und Cp15/60 umfassen. Diese Zusammensetzungen können ferner ein Adjuvans umfassen.
  • Darüber hinaus wird hierin eine immunologische, immunogene Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzung gegen Cryptosporidium parvum erwähnt, welche ein erstes Antigen einschließt, umfassend ein P21- oder Cp23- oder Cp15/60 oder CP41-Antigen oder ein Epitop davon oder einen ersten Vektor, der das erste Antigen exprimiert und ein zweites Antigen, umfassend ein zweites Antigen oder Epitop davon aus Cryptosporidium parvum oder den ersten Vektor, wobei der erste Vektor sowohl das erste als auch das zweite Antigen exprimiert, oder einen zweiten Vektor, der das zweite Antigen exprimiert, wobei das erste und zweite Antigen sich voneinander unterscheiden und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Hierin wird auch ein Verfahren zur Rinder-Immunisierung eines neugeborenen Kalbes gegen enterische Erkrankung erwähnt, umfassend die Verabreichung einer erfinderischen Zusammensetzung an ein schwangeres weibliches Kalb vor der Geburt, sodass das neugeborene Kalb mütterliche Antikörper gegen Cryptosporidium parvum durch das Kolostrum und/oder die Milch erhält. Dieses Verfahren kann ferner das Füttern des neugeborenen Kalbs mit Kolostrum und/oder Milch von einer Kuh (Kühen) umfassen, welche (welchen) die Zusammensetzung während der Schwangerschaft verabreicht wurde. Das Verfahren kann die Verabreichung der Zusammensetzung an das neugeborene Kalb umfassen. Die Verabreichung, die dem schwangeren Weibchen verabreicht wird, kann Antigene oder Epitope davon umfassen und die an das Kalb verabreichte Zusammensetzung kann Vektoren umfassen. Es wird hierin daher ein Verfahren zur aktiven Immunisierung von erwachsenen und neugeborenen Kälbern erwähnt, umfassend die Verabreichung einer erfinderischen Zusammensetzung an Kälber.
  • Es wird hierin auch ein Verfahren zur Rinder-Immunisierung eines neugeborenen Kalbs erwähnt, umfassend die Fütterung des neugeborenen Kalbs mit Kolostrum und/oder Milch von Kühen, welchen die Zusammensetzung während der Schwangerschaft verabreicht wurde. In einem weiteren Sinne wird hierin auf ähnliche Weise ein Verfahren zur Immunisierung eines neugeborenen Säugers erwähnt, umfassend die Fütterung des Neugeborenen mit Kolostrum und/oder Milch von einem weiblichen Säuger, welchem die Zusammensetzung während der Schwangerschaft verabreicht wurde; und der Säuger ist vorteilhafterweise ein Rind, eine Katze, ein Hund oder ein Pferd. Noch weiter kann die Erfindung ein Verfahren zu Herstellung einer erfinderischen Zusammensetzung einschließen, umfassend die Beimischung der Antigene oder Epitope oder Vektoren und des Trägers.
  • Und die Erfindung kann einen Kit zur Herstellung einer erfinderischen Zusammensetzung einschließen, umfassend die Antigene, Epitope oder Vektoren, jedes in einem getrennten Behälter oder Behältern (manche Antigene, Epitope oder Vektoren können gemeinsam in einem Behälter sein, wie zum Beispiel die Cryptosporidium parvum-Antigene, Epitope oder Vektoren können gemeinsam in einem Behälter vorliegen und die anderen Antigene, Epitope oder Vektoren in einem oder mehreren Behältern, oder der Träger, das Verdünnungsmittel und/oder Adjuvans können in getrennten Behältern vorliegen), wahlweise gemeinsam verpackt; und weiter wahlweise mit Anleitungen für die Beimischung und/oder Verabreichung.
  • Der Begriff "umfassend" kann in dieser Offenbarung "einschließlich" bedeuten, oder kann die Bedeutung haben, die dem Begriff "umfassend" im U. S. Patentgesetz üblicherweise gegeben wird.
  • Andere Aspekte der Erfindung werden in der nachfolgenden Offenbarung beschrieben oder sind durch sie offensichtlich (und innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung).
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die folgende genaue Beschreibung, die als Beispiel gegeben wird und nicht dazu gedacht ist die Erfindung auf spezifisch beschriebene Ausführungsformen einzuschränken, kann gemeinsam mit den begleitenden Figuren verstanden werden, die hier als Referenz enthalten sind, in welchen:
  • 1 eine physikalische und Restriktionskarte von Plasmid pJCA155 zeigt;
  • 2 eine physikalische und Restriktionskarte von Plasmid pJCA156 zeigt;
  • 3 eine physikalische und Restriktionskarte von Plasmid pJCA157 zeigt;
  • 4 eine physikalische und Restriktionskarte von Plasmid pJCA158 zeigt;
  • 5 eine physikalische und Restriktionskarte von Plasmid pJCA159 zeigt;
  • 6 eine physikalische und Restriktionskarte von Plasmid pJCA160 zeigt;
  • 7 zeigt eine vergleichende Oocytenzählung im Stuhl von Kälbern, die entweder mit C. parvum, oder Rinder-Rotavirus oder beidem herausgefordert wurden, oder nicht herausgefordert wurden (Beispiel 12);
  • 8 zeigt eine vergleichende Rotavirusausscheidung im Stuhl von Kälbern, gemäß Beispiel 12;
  • 9 zeigt einen vergleichenden allgemeinen tierischen Zustand für Kälber, gemäß Beispiel 12;
  • 10 zeigt einen vergleichenden tierischen Dehydrationsstatus in Kälbern, gemäß Beispiel 12;
  • 11 zeigt eine vergleichende Zählung von flüssigem Stuhl für Kälber, gemäß Beispiel 12;
  • 12 zeigt einen vergleichenden Anorexiestatus für Kälber, gemäß Beispiel 12; und
  • 13 zeigt eine vergleichende, rektale Temperaturentwicklung in Kälbern, gemäß Beispiel 12.
  • GENAUE BESCHREIBUNG
  • Ein Aspekt der Erfindung ist daher eine kombinierte enterische immunologische, immunogene Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung, die mindestens ein Antigen oder Epitop von Interesse aus mindestens einer Cryptosporidium spp., umfasst, vorzugsweise einschließlich Cryptosporidium parvum, und mindestens ein Antigen aus mindestens einem anderen enterischen Pathogen, vorteilhafterweise einem Pathogen, das die tierische Art infiziert, die geschützt werden soll, wie zum Beispiel Hund, Katze, Pferd oder Rinderarten und noch mehr von Vorteil einer Rindeart; und/oder einen Vektor oder Vektoren und/oder eine Rekombinante oder Rekombinanten und/oder ein Plasmid oder Plasmide, die das Cryptosporidium spp. Antigen oder Epitop von Interesse exprimieren und/oder mindestens eines der (des) Antigen(e)s oder Epitop(e)s von Interesse, des anderen enterogenen Pathogens; und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Universelle immunologische, immunogene oder Impfstoffzusammensetzungen sind auch vorgesehen, da enterische Pathogene oft mehrere (mehr als eine) Tierarten infizieren.
  • Eine immunologische Zusammensetzung ruft eine immunologische Reaktion hervor – lokal oder systemisch. Eine immunogene Zusammensetzung ruft auch eine lokale oder systemische immunologische Reaktion hervor. Demgemäß umfassen die Begriffe "immunologische Zusammensetzung" und "immunogene Zusammensetzung" eine "Impfstoffzusammensetzung" (da die beiden vorherigen Begriffe Schutzzusammensetzungen sein können).
  • Cryptosporidium parvum-Antigene, die in dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen vorzugsweise:
    • (1) Ein Protein von 148 Aminosäuren, das Cp15/60 genannt wird (siehe z. B., U.S. Patentnummer 5.591.434 . Dieses Protein ist in US-A-5.591.434 in SEQ ID NO: 2 mit 10 weiteren Aminosäuren am 5'-Ende, stromaufwärts des Methionins (Met) dargestellt. Es liegt innerhalb des Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung ein Antigen zu benützen, das im Wesentlichen aus der 148 Aminosäuresequenz von Cp15/60 besteht, oder sie umfasst, oder aus einer längeren Aminosäuresequenz, einschließlich dieser 148 Aminosäuren; z. B. die gesamte Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 in US-A-5.591.434 dargestellt ist oder irgendein Polypeptid, umfassend ein Fragment der 148 oder 158 Aminosäuresequenz, welche ein Epitop davon umfasst, vorteilhafterweise ein Epitop, das Schutz hervorruft, oder ein Epitop, das die Immunogenität der Gesamtlängensequenz aufweist) und/oder
    • (2) Cp23 und/oder P21 (Cp23 ist ein Antigen von etwa 23 kDa; siehe Perryman et al., Molec Biochem Parasitol 80: 137–147 (1996); WO-A-9807320 und L. E. Perryman et al., Vaccine: 17 (1999) 2142–2149. Der Hauptteil dieses Proteins (187 Aminosäuren) wird hierin als P21 bezeichnet und hat eine Aminosäuresequenz, die homolog zu der Aminosäuresequenz von Protein 07 ist, welche in SEQ ID NO: 12, in WO-A-98 07320 offenbart wird. Um exprimiert zu werden, können eine oder zwei oder mehrere Aminosäuren an das Ende von P21 hinzugefügt werden, wie zum Beispiel Met-, oder Met-Gly- oder ähnliche Aminosäuren. Es liegt innerhalb des Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung ein Antigen zu verwenden, das im Wesentlichen die 187 Aminosäuresequenz oder einer längeren Aminosäuresequenz umfasst oder daraus besteht, oder einem Polypeptid, umfassend ein Fragment der 187 Aminosäuresequenz, welche ein Epitop davon umfasst, vorteilhafterweise ein Epitop, das Schutz hervorruft oder ein Epitop, das die Immunogenität der gesamten Sequenz aufweist. Die gesamte Aminosäuresequenz von Cp23 und die entsprechende Nucleotidsequenz sind leicht erhältlich. Das P21-Protein stellt den Hauptteil und das C-terminale Ende von Cp23 dar. Die P21 Nucleotidsequenz kann als eine Sonde verwendet werden, um eine DNA-Bank zu durchmustern, z. B. eine Bank, wie sie in Beispiel 1 offenbart wurde. Diese Methodik ist einem Fachmann gut bekannt. Auf der Basis des Molekulargewichts von Cp23 kann sichergestellt werden, dass etwa 25–35 Aminosäuren am N-terminalen Ende von P21 fehlen, um die vollständige Cp23 Aminosäuresequenz aufzuweisen. Diese Information gibt jenen, die im Fachgebiet bewandert sind, die Mittel das Startcodon leicht zu finden und daher das 5'-Ende der Cp23-Nucleotidsequenz und die N-terminale Aminosäuresequenz leicht zu finden.
  • Die Antigene oder Epitope von Interesse können einzeln oder in Kombination in Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden, z. B. kann eine erfinderische Zusammensetzung (1) oder (2) oder beide, (1) und (2) umfassen.
  • Ein anderes mögliches Antigen ist, wie vorstehend offenbart, das CP41-Antigen.
  • Gemäß der bevorzugten Ausführungsform sind diese Antigene oder Epitope von Interesse in der Zusammensetzung als Proteine oder Untereinheiten-Antigene eingeschlossen. Sie können durch chemische Synthese oder durch Expression in vitro hergestellt werden. Die Beispiele beschreiben wie die Sequenzen erhalten werden können, die Cp15/60 und P21 codieren und wie Vektoren konstruiert werden können, die sie exprimieren. Diese Sequenzen können in geeignete Clonierungsvektoren oder Expressionsvektoren cloniert werden. Diese Vektoren werden dann verwendet, um geeignete Wirtszellen zu transfizieren. Die Antigene, die durch die Nucleotidsequenz codiert werden, die in den Vektor inseriert ist, z. B. Cp23 und/oder P21 und/oder Cp15/60 werden durch wachsende Wirtszellen produziert, die durch Expressionsvektoren unter Bedingungen transformiert werden, wodurch das Antigen erzeugt wird. Diese Methodik ist einem Fachmann gut bekannt. Wirtszellen können entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein, z. B. Escherichia coli (E. coli), Hefen, wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, tierische Zellen, insbesondere tierische Zeltlinien. Ein Fachmann kennt die Vektoren, die in einer bestimmten Wirtszelle verwendet werden können. Diese Vektoren können so ausgewählt werden, dass ein Fusionsprotein erzeugt wird, welches dann verwendet werden kann, um das Antigen leicht wieder zu finden.
  • Darüber hinaus können, im Hinblick auf Sequenzen, Nucleinsäuresequenzen, die für die Expression des C. parvum Antigens oder des Epitops von Interesse nützlich sind, Nucleinsäuresequenzen umfassen, die im Stande sind unter hoch stringenten Bedingungen zu hybridisieren oder jene die eine hohe Homologie mit Nucleinsäuremolekülen aufweisen, die in dieser Erfindung eingesetzt werden (z. B. Nucleinsäuremoleküle in Dokumenten, die hierin erwähnt werden); und "Hybridisierung unter hoch stringenten Bedingungen" kann synonym sein mit "stringente Hybridisierungsbedingungen" ein Begriff, der im Fachgebiet gut bekannt ist; siehe zum Beispiel Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laborstory Manual", zweite Auflage, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach" Harnes und Higgins Hg. IRL Press, Oxford, 1985.
  • Im Hinblick auf Nucleinsäuremoleküle und Polypeptide, die in der Ausübung der Erfindung verwendet werden können, weisen die Nucleinsäuremoleküle und Polypeptide vorteilhafterweise mindestens etwa 75% oder mehr Homologie oder Identität auf, vorteilhafterweise 80% oder mehr Homologie oder Identität, mehr von Vorteil 85% oder mehr Homologie oder Identität, wie zum Beispiel mindestens etwa 85% oder etwa 86% oder etwa 87% oder etwa 88% oder etwa 89% Homologie oder Identität, zum Beispiel mindestens etwa 90% Homologie oder Identität oder mehr, wie zum Beispiel etwa 91% oder etwa 92% oder etwa 93% oder etwa 94% Identität oder Homologie, vorteilhafterweise mindestens etwa 95% bis 99% Homologie oder Identität oder mehr, wie zum Beispiel mindestens etwa 95% Homologie oder Identität oder mehr, z. B. mindestens etwa 96%, oder etwa 97% oder etwa 98%, oder etwa 99% oder sogar etwa 100% Identität oder Homologie oder etwa 75%, vorteilhafterweise von etwa 85% bis etwa 100% oder von etwa 90% bis zu etwa 99% oder bis zu etwa 100% oder von etwa 95% bis etwa 99% oder etwa 100% Identität oder Homologie, mit Hinblick auf Sequenzen, die in hierin zitierten Dokumenten dargelegt sind (einschließlich Untersequenzen davon, die hierin besprochen werden); und daher beinhaltet die Erfindung einen Vektor, der ein Epitop oder eine epitopische Region von einem C. parvum-Isolat codiert, oder eine Zusammensetzung, umfassend ein solches Epitop, Zusammensetzungen, umfassend ein Epitop oder epitopische Region von einem C. parvum-Isolat und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Vektoren und Zusammensetzungen, z. B. schließt die Erfindung auch ein, dass diese Nucleinsäuremoleküle und Polypeptide in der gleichen Weise verwendet werden können, wie hier erwähnte Nucleinsäuremoleküle, Fragmente davon und Polypeptide.
  • Nucleotid-Sequenzhomologie kann unter Verwendung des "Align"-Programmes von Myers und Miller verwendet werden ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11–17, 1988, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind) und sind bei NCBL erhältlich. Alternativ oder zusätzlich kann der Begriff "Homologie" oder "Identität" im Hinblick auf eine Nucleotid- oder Aminosäuresequenz zum Beispiel ein quantitatives Maß an Homologie zwischen zwei Sequenzen anzeigen. Die Prozent an Sequenzhomologie können als (Nref – Ndif)·100/Nref berechnet werden, wobei Ndef die Gesamtzahl von nicht-identischen Resten in den beiden Sequenzen darstellt, wenn sie abgeglichen sind und wobei Nref die Anzahl der Reste in einer der Sequenzen ist. Daher wird die DNA-Sequenz AGTCAGTC eine Sequenzähnlichkeit von 75% mit der Sequenz AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2) aufweisen.
  • Alternativ oder zusätzlich können sich "Homologie" oder "Identität" mit Hinblick auf Sequenzen auf die Nummer von Positionen mit identischen Nucleotiden oder Aminosäuren beziehen, geteilt durch die Zahl der Nucleotide oder Aminosäuren in der kürzeren der beiden Sequenzen, wobei das Alignment der beiden Sequenzen in Übereinstimmung mit dem Wilbur und Lipman Algorithmus bestimmt werden (Wilbur und Lipman, 1983 PNAS USA 80: 726), zum Beispiel unter Verwendung einer Fenstergröße von 20 Nucleotiden, einer Wortlänge von 4 Nucleotiden und einer "Gap-Penalty" von 4 und Computer-unterstützter Analyse und Interpretation von den Sequenzdaten, einschließlich Alignment, kann bequem unter Verwendung von im Handel erhältlichen Programmen durchgeführt werden (z. B. IntelligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc. CA). Wenn von RNA-Sequenzen gesagt wird, dass sie ähnlich sind, oder einen Grad an Sequenzidentität oder Homologie mit DNA-Sequenzen aufweisen, wird Thymidin (T) in der DNA-Sequenz als gleich mit Uracil (U) in der RNA-Sequenz angesehen. RNA-Sequenzen innerhalb des Geltungsbereiches der Erfindung können aus DNA-Sequenzen abgeleitet werden, indem Thymidin (T) in der DNA-Sequenz als gleich mit Uracil (U) in den RNA-Sequenzen angesehen wird.
  • Zusätzlich oder alternativ kann die Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit oder Identität oder Homologie unter Verwendung des BlastP-Programmes bestimmt werden (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389–3402) und bei NCBI (verwendet in der Bestimmung der Sequenzhomologie, wie gezeigt im Anhang I; siehe auch die Beispiele). Die folgenden Referenzen stellen auch Algorithmen für den Vergleich der relativen Identität oder Homologie von Aminosäureresten von zwei Proteinen bereit, und zusätzlich oder alternativ im Hinblick auf das Vorhergehende, können die Lehren in diesen Referenzen verwendet werden, um die Prozent an Homologie oder an Identiät zu bestimmen. Needleman SB und Wunsch CD, "A general method applicable to the search of similarities in the amino acid sequences of two Proteins," J. Mol. Biol. 48: 444–453 (1970); Smith TF und Waterman MS, "Comparison of Biosequences," Advances in Applied Mathematics 2: 482–489 (1981); Smith TF, Waterman MS und Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res., 11: 2205–2220 (1983); Feng DF und Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees," J. of Molec. Evol., 25: 351–360 (1987); Higgins DG und Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment an a microcomputer," CABIOS, 5: 151–153 (1989); Thompson JD, Higgins DG und Gibson TJ, "Cluster W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific "Gap-Penalties" and weight matirx choice," Nucleic Acid Res., 22: 4673–4680 (1994); und Devereux J, Haeberlie P und Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX." Nucl. Acids Res. 12: 387–395 (1984).
  • Darüber hinaus, was Nucleinsäuremoleküle betrifft, die in dieser Erfindung verwendet werden (z. B. wie in hierin zitierten Dokumenten), umfasst die Erfindung die Verwendung von Codon-äquivalenten Nucleinsäuremolekülen. Zum Beispiel, wenn die Erfindung ein Protein "X" einschließt (z. B. P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41), welches die Aminosäuresequenz "A" aufweist und durch das Nucleinsäuremolekül "N" codiert ist, umfasst die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die auch Protein X über ein oder mehrere unterschiedliche Codons codiert, als die, die in Nucleinsäuremolekül N vorhanden sind.
  • Das Antigen oder Epitop von Interesse, das in der Ausübung der Erfindung verwendet wird, kann aus (einem) bestimmten Pathogen(en) erhalten werden, z. B. C. parvum, E. coli, Rotavirus, Coronavirus, und ähnlichen oder kann aus rekombinanter in vitro und/oder in vivo Expression von (einem) Gen(en) oder Teilen davon erhalten werden. Verfahren zur Herstellung und/oder Verwendung solcher Vektoren (oder Rekombinanten) für die Expression können durch oder analog zu den Verfahren stattfinden, die in den U.S. Patentnummern 4.603.112 , 4.769.330 , 5.174.993 , 5.505.941 , 5.338.683 , 5.494.807 , 4.722.848 , 5.942.235 , PCT-Veröffentlichungen WO 94/16716 , WO 96/39491 , Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update," PNAS USA 93: 11349–11353, October 1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination and safety, "PNAS USA 93: 11341–11348, Oktober 1996, Smith et al., U.S. Patentnummer 4.745.051 (rekombinantes Baculovirus), Richardson, C. D. (Herausgeber), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells infected with a Baculovirus Expression Vector," Molecular and Cellular Biology, Dez., 1983, Bd. 3, Nr. 12, S. 2156–2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector," Molecular and Cellular Biology, März 1984, Bd. 4. Nr. 3, S. 399–406; EPA 0 370 573 , EP Patentveröffentlichungsnummer 265785 , U.S. Patentnummer 4.769.331 (rekombinantes Herpesvirus), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93: 11307–11312, Oktober 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313–11318, Oktober 1996, Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes," PNAS USA 93: 11334–11340, Oktober 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371–11377, Oktober 1996, Kitson et al., J. Virol. 65, 3068–3075, 1991; U.S. Patentnummern 5.591.439 , 5.552.143 , 6.156,567 und 6.090.393 rekombinantes Adenovirus), Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Bd. 3) S. 237–52, 1993, Ballay et al., EMBO Journal, Bd. 4, S. 3861–65, Graham, Tibtech 8, 85–87, April, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 429–434, PCT WO91/11525 , Feigner et al., (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550–2561, Science, 259: 1745–49, 1993 und Mc Clements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease," PNAS USA 93: 11414–11420, Oktober 1996, und die U.S. Patentnummern 5.591.639 , 5.589.466 und 5.580.859 , unter anderem DNA Expressionsvektoren betreffend. Siehe auch WO 98/33510 ; Ju et al., Diabetologia, 41: 736–739, 1998 (lentivirales Expressionssystem); Sanford et al., U.S. Patentnummer 4.945.050 ; Fischbach et al., (Intracel), WO 90/01543 ; Robinson et al., Seminare in IMMUNOLOGIE, Bd. 9, Seiten 271–283 (1997) (DNA Vektorensystem); Szoka et al., U.S. Patentnummer 4.394,448 (Verfahren zur Insertion von DNA in lebende Zellen); McCormick et al., U.S. Patentnummer 5.677.178 (Verwendung von cytopathischen Viren); U.S. Patentnummer 5.928.913 (Vektoren für den Gentransfer), und Tartaglia et al., U.S. Patentnummer 5.990.091 (Vektoren, die eine verstärkte Expression aufweisen), sowie andere hierin zitierte Dokumente. Ein viraler Vektor, der zum Beispiel ausgewählt ist aus Herpesviren, Adenoviren, Pockenviren, insbesondere Vacciniavirus, Vogelpockenvirus, Kanarien-Pockenvirus; sowie DNA-Vektoren (DNA-Plasmide) werden vorteilhaft bei der Anwendung in der Erfindung umgesetzt, insbesondere für in vivo Expression (wohingegen bakterielle und Hefesysteme für die in vitro Expression vorteilhaft eingesetzt werden).
  • Wenn die Wirt-Vektor-Kombination zur Produktion von Antigen ohne Exkretion führt, zum Zweck der Einfachheit ihrer Produktion und ihrer Wiedergewinnung, liegen diese Antigene vorzugsweise in der Form von Fusionsproteinen vor (z. B. einem HIS-tag). Mit anderen Worten kann das Antigen das Antigen an sich umfassen, sowie fremde Aminosäuren.
  • Techniken zur Proteinreinigung und/oder Isolierung aus dieser Offenbarung und unter anderem hierin zitierte Dokumente, und daher innerhalb des Bereichs eines Fachmannes, können ohne übermäßiges Experimentieren verwendet werden, um rekombinante oder Vektor-Expressionsprodukte und/oder Antigen(en), in der Ausübung der Erfindung zu reinigen und/oder zu isolieren und solche Techniken im allgemeinen umfassen: Ausfällung, indem man sich die Löslichkeit des Proteins von Interesse bei verschiedenen Salzkonzentrationen zu Nutze macht, Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln, Polymeren und anderen Materialien, Affinitätsausfällungen und selektive Denaturierung; Säulen-Chromatographie, einschließlich flüssige Hochleistungs-Chromatographie (HPLC), (Ionen-Austausch, Affinität, Immunaffinität oder Farbliganden-Chromatographie; Immunpräzipitation und die Verwendung von Gelfiltration; elektrophoretische Verfahren, Ultrafiltration und Isoelektrische Fokussierung, unter anderem.
  • Wie hierin gemäß eines anderen Aspekts erwähnt, schließt die Erfindung ein, dass die Antigene und/oder Epitope von Interesse nicht als Untereinheiten in den Zusammensetzungen eingeschlossen sind, sondern dass sie in vivo exprimiert werden, z. B. schließt die Erfindung ein, dass die Zusammensetzung (einen) rekombinanten Vektor(en) umfassen, welche(r) die Antigene in vivo exprimier(en)(t), wenn sie an das Tier verabreicht werden. Der Vektor kann ein DNA-Vektorplasmid umfassen, ein Herpesvirus, ein Adenovirus, ein Pockenvirus, einschließlich einem Vacciniavirus, einem Vogelpockenvirus, einem Kanarien-Pockenvirus und einem Schweinepockenvirus, und ähnliches. Die Vektor-basierenden Zusammensetzungen können einen Vektor umfassen, der eine Nucleotidsequenz des Antigens, das exprimiert werden soll, z. B. Cp15/60 und/oder Cp23 für Cryptosporidium parvum, enthalten und exprimieren.
  • Das Wort Plasmid soll jede DNA-Transkriptionseinheit in Form einer Polynucleotidsequenz umfassen, einschließlich der Sequenz, die exprimiert werden soll. Vorteilhafterweise umfasst das Plasmid Elemente, die für seine Expression notwendig sind, zum Beispiel der Expression in vivo. Die zirkuläre Plasmidform, ringförmig (supercoiled) oder anders, ist vorteilhaft und die lineare Form ist auch im Geltungsbereich der Erfindung eingeschlossen. Das Plasmid kann entweder ein nacktes Plasmid darstellen, oder eine Plasmidformulierung, zum Beispiel in Lipiden oder Liposomen, z. B. kationischen Liposomen (siehe z. B. WO-A-90 11082 ; WO-A-92 19183 ; WO-A-96 21797 ; WO-A-95 20660 ). Das immunologische Plasmid oder die Impfstoffzusammensetzung kann mittels einer Genpistole ("gene gun") verabreicht werden, oder intramuskulär, oder nasal oder durch irgendein anderes Mittel, welches die Expression in vivo und vorteilhafterweise eine immunologische oder schützende Antwort ermöglicht.
  • Anwendungen sind eingereicht worden, welche DNA und/oder Vektor-Impfstoffe oder immunogene oder immunologische Zusammensetzungen für Katzen, Hunde, Rinder und Pferde umfassen, und erfinderische Zusammensetzungen, können DNA und/oder Vektor-Impfstoffe oder immunogene oder immunologische Zusammensetzungen aus diesen Anwendungen umfassen und/oder erfinderischen Zusammensetzungen können erzeugt werden und/oder formuliert werden und/oder in einer zu den Zusammensetzungen dieser Anwendungen analogen Weise verabreicht werden.
  • Zusammensetzungen für die Verwendung in der Erfindung können in Übereinstimmung mit Standardtechniken erzeugt werden, die Fachleuten in den Veterinär-, pharmazeutischen oder medizinischen Wissenschaften gut bekannt sind. Solche Zusammensetzungen können in Dosierungen verabreicht werden und durch Techniken, die Fachleuten in der Veterinär-Wissenschaft durch Beachtung von Faktoren wie Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand und besondere Behandlung des Tieres und des Verabreichungsweges gut bekannt sind. Die Komponenten der erfinderischen Zusammensetzungen können alleine verabreicht werden oder können gleichzeitig oder nacheinander mit anderen Zusammensetzungen verabreicht werden (z. B. kann das (die) C. paivum-Antigen(e) und/oder Epitop(e) alleine verabreicht werden und gefolgt durch die stufenweise Verabreichung von Antigen(en) und/oder Epitop(en) von anderen enterischen Pathogenen oder Zusammensetzungen, umfassend (ein) enterische(s) Antigen(e) oder Epitop(e) können Vektoren oder Rekombinanten oder Plasmide umfassen, die auch (ein) enterisch(e) Antigen(e) oder Epitop(e) der gleichen oder von unterschiedlichen Pathogenen exprimieren) oder mit anderen prophylaktischen oder therapeutischen Zusammensetzungen (z. B. andere immunogene, immunologische oder Impfstoff-Zusammensetzungen). Die Erfindung stellt daher multivalente oder "Cocktails" bereit, oder Kombinations-Zusammensetzungen, oder Verfahren, die sie anwenden. Die Bestandteile und Art (schrittweise, z. B. als Teil von einem Prime-Boost-Regime, oder als Teil eines Booster-Programms, wobei eine immunogene, immunologische oder Impfstoff-Zusammensetzung periodisch während der Lebenszeit des Tieres verabreicht wird, wie zum Beispiel jährlich, saisonal, zweimal im Jahr und ein ähnliches Booster-Programm; oder gemeinsame Verabreichung) der Verabreichung, sowie die Dosierungen, können bestimmt werden, indem solche Faktoren wie Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand und bestimmte Behandlung des Tieres in Betracht gezogen werden, z. B. Kuh und der Verabreichungsweg. In diesem Zusammenhang wird sich auf die U.S. Patentnummer 5.843.456 bezogen und auf Tollwut- Zusammensetzungen und Kombinationszusammensetzungen und Verwendungen davon gerichtet.
  • Zusammensetzungen der Erfindung können für parenterale oder Verabreichung über die Schleimhaut verwendet werden, vorzugsweise intradermal, subkutan oder intramuskuläre Wege. Wenn die Verabreichung über die Schleimhaut gewählt wird, ist es möglich orale, nasale oder vaginale Wege zu verwenden.
  • In solchen Zusammensetzungen können der (die) Vektor(en), oder Antigen(e) oder Epitop(e) von Interesse(n) in Beimischung mit einem geeigneten Träger, Verdünnungsmittel, oder Hilfsstoff verwendet werden, wie zum Beispiel steriles Wasser, physiologische Salzlösung, Glukose oder ähnliches. Die Zusammensetzungen können auch lyophilisiert werden. Die Zusammensetzungen können unterstützende Substanzen enthalten, wie zum Beispiel pH-Wert-Pufferungsmittel, Adjuvantien, Konservierungsmittel, Polymer-Hilfsstoffe, die für Schleimhautwege verwendet werden und ähnliches, abhängig vom Verabreichungsweg und der gewünschten Herstellung.
  • Standard Texte, wie zum Beispiel "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17. Auflage, 1985, kann herangezogen werden, um geeignete Herstellungen ohne übermäßiges Experimentieren herzustellen. Geeignete Dosierungen, können auch auf den Text hierin und auf hierin zitierte Dokumente basieren.
  • Hilfsstoffe sind Substanzen, welche die Immunreaktion zu Antigenen verstärken. Hilfsstoffe können Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, Saponine, z. B. Quil A, Mineralöl-Emulsionen, pluronische Polymere mit Mineral oder eine metabolisierbare Ölemulsion, das Wasser-in-Öl-Adjuvans, synthetische Polymere umfassen (z. B. Homo, – und Copolymere von Milchsäure und Glykolsäure, die verwendet worden sind, um Mikrospheren zu erzeugen, die Antigene einkapseln, siehe Eldridge et al., Mol. Immunol. 28: 287–294 (1993), z. B. biologisch abbaubare Mikrospheren), nicht-ionische Block-Copolymere, Copolymere mit niedrigem Molekulargewicht in auf Öl basierenden Emulsionen (siehe Hunter et al., The Therory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, Seiten 51–94 (1995)), Copolymere mit hohem Molekulargewicht in wässrigen Rezepturen (Todd et al., Vaccine 15: 564–570 (1997)), Cytokine wie zum Beispiel IL-2 und IL-12 (siehe, z. B. U.S. Patentnummer 5.334.379 ) und GM-CSF (Granulocyten Makrophagen-Koloniestimmulierender Faktor, siehe, im allgemeinen, U.S. Patentnummern 4.999.291 und 5.461.663 , siehe auch Clark et al., Science 1987, 230: 1229; Grant et al., Drugs, 1992, 53: 516) vorteilhafterweise GM-CSF unter anderem aus den Tierarten, die geimpft werden sollen. Bestimmte Adjuvantien können in vivo mit Antigen(en) und/oder Epitop(en) exprimiert werden; z. B. Cytokine, GM-CSF (siehe, z. B. C. R. Maliszewski et al., Molec. Immunol 25(9): 843–50 (1988); S. R. Leong, Vet Immunol and Immunopath 21: 261–78 (1989), betreffend Rinder GM-CSF. Ein Plasmid, das GM-CSF codiert kann modifiziert werden, um DNA zu enthalten und zu exprimieren, die ein Antigen von einem Rinderpathogen codiert, zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder wahlweise ein Epitop davon, das auch ein Antigen und/oder Epitop von einem anderen Rinderpathogen codiert, oder es kann gemeinsam mit einem solchen Plasmid verwendet werden).
  • Ein weiterer Fall eines Adjuvans ist eine Verbindung, ausgewählt aus den Polymeren von Acryl oder Methacrylsäure und den Copolymeren von Maleinsäureanhydrid und einem Alkenylderivat. Vorteilhafte Adjuvansverbindungen sind die Polymere von Acryl oder Methacrylsäure, die vernetzt sind, insbesondere mit Polyalkenylethern von Zuckern oder Polyalkoholen. Diese Verbindungen sind durch den Begriff Carbomer bekannt (Pharmeuropa Bd. 8, Nr. 2. Juni 1996). Fachleute können sich auf U.S. Patentnummer 2.909.462 beziehen, die solche Acryl-Polymere beschreibt, die mit einer polyhydoxylierten Verbindung vernetzt sind, die mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweist, vorzugsweise nicht mehr als 8, die Hydrogenatome von mindestens 3 Hydroxylen, sollen durch ungesättigte aliphatische Radikale ersetzt sein, die mindestens 2 Kohlenstoffatome aufweisen. Die bevorzugten Radikale sind jene, die 2 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, z. B. Vinyle, Allyle und andere ethylenisch ungesättigte Gruppen Die ungesättigten Radikale können selbst andere Substituenten, wie zum Beispiel Methyl, enthalten. Die Produkte, die unter dem Namen Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) verkauft werden sind besonders geeignet. Sie sind mit einer Allyl-Sucrose oder mit Allyl-Pentaeythritol quervernetzt. Davon kann Carbopol® 974P, 934P und 971 P erwähnt werden. Unter den Copolymeren von Maleinsäureanhydrid und Alkenylderivat werden die Co-Polymer EMA® (Monsanto) die Co-Polymere von Maleinsäureanhydrid und Ethylen, linear oder quervernetzt mit Divinylether bevorzugt. Es kann auf J. Fields et al., Nature, 186: 778–780, 4. Juni 1960 verwiesen werden.
  • Aus Sicht der Struktur, werden die Polymere von Acryl- oder Methacrylsäure und die Copolymere EMA® vorzugsweise aus einfachen Einheiten der folgenden Formel gebildet:
    Figure 00300001
    In welchen:
    R1 und R2, die identisch oder unterschiedlich sind, H oder CH3 darstellen;
    X = 0 oder 1, vorzugsweise x = 1; und
    Y = 1 oder 2, mit x + y = 2.
  • Für die Copolymere EMA®, x = 0 und y = 2. Für die Carbomere, x = y = 1.
  • Die Auflösung dieser Polymere in Wasser führt zu einer sauren Lösung, die neutralisiert wird, vorzugsweise auf physiologischen pH-Wert, um die adjuvante Lösung zu ergeben, in welche die immunogene, immunologische Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzung selbst eingebaut wird. Die Carboxylgruppen des Polymers liegen dann teilweise in COO-Form vor.
  • Vorzugsweise wird eine Adjuvans-Lösung gemäß der Erfindung, insbesondere aus Carbomer, in destilliertem Wasser hergestellt, vorzugsweise in der Gegenwart von Natriumchlorid, die erhaltene Lösung, weist einen sauren pH-Wert auf. Diese Stammlösung wird verdünnt, indem sie zu der gewünschten Menge hinzugefügt wird (zum Erhalten der gewünschten Endkonzentration) oder einem wesentlichen Teil davon, von Wasser geladen mit NaCl, vorzugsweise physiologischer Salzlösung NaCl 9g/l) alles gemeinsam in mehreren Teilen mit gleichzeitiger oder anschließender Neutralisierung (pH-Wert 7,3 bis 7,4), vorzugsweise mit NaOH. Diese Lösung bei physiologischem pH-Wert wird verwendet werden, da sie zum Mischen mit dem Impfstoff gedacht ist, was besonders in gefriergetrockneter, flüssiger oder gefrorener Form gelagert werden kann.
  • Die Polymerkonzentration in der endgültigen Impfstoffzusammensetzung kann 0,01% bis 2% Gew./Vol. ausmachen, z. B. 0,06 bis 1% Gew./Vol., wie zum Beispiel 0,1 bis 0,6% w/v.
  • Förderliche immunogene und Impfstoff-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können auch hergestellt werden, indem sie in Form von Emulsionen formuliert werden, insbesondere Öl-in-Wasser Emulsionen, z. B. eine Emulsion, wie zum Beispiel die auf Seite 147 in „Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" beschriebene SPT-Emulsion, herausgegeben von M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, oder die Emulsion MF59, beschrieben auf Seite 183 in dem gleichen Buch. Insbesondere kann die Öl-in-Wasser Emulsion auf leichtem flüssigem Parafinöl basieren (gemäß der europäischen Pharmacopeia); Isoprenoidöl, wie zum Beispiel Squalen; Öl, das durch Oligomerisierung von Alkenen erhalten wurde, insbesondere durch Isobutylen oder aus Decen; Säure oder Alkoholester mit linearen Alkylgruppen, insbesondere Pflanzenöle; Ethyloleat, Propylenglycol Di(Caprylat/Caprat), Glyzerin Tri(Caprylat/Caprat), Propylenglycoldioleat; Ester von verzweigten Fettsäuren oder Alkoholen, insbesondere Ester von isostearischer Säure. Das Öl wird in Kombination mit den Emulgatoren verwendet, um die Emulsion zu bilden. Emulgatoren sind vorzugsweise nicht-ionische Tenside, insbesondere Sorbitanester, Mannidester, Glyzerinester, Polyglyzerinester, Propylenglykolester oder Ester von Ölsäure, von Isostearischer Säure, von Ricinolsäure, von Hydroxystearinsäure, möglicherweise ethoxyliert, Block-Copolymere wie zum Beispiel Polyoxypropylen-Polyoxyethylen, insbesondere die Produkte, die pluronisch (und zwar pluronisch L121) genannt werden.
  • Aus dieser Offenbarung und dem Stand der Technik kann ein Fachmann falls erwünscht ein geeignetes Adjuvans auswählen und die Menge davon, um es in einer immunologischen, immunogenen Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzung gemäß der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren einzusetzten.
  • Die immunololgischen Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen gemäß der Erfindung können mindestens aus einem lebenden abgeschwächten, inaktivierten, oder Untereinheiten-Impfstoff, oder einem rekombinanten Impfstoff zusammengesetzt sein (z. B. Pockenvirus, als Vektor oder DNA-Plasmid), der mindestens ein Immunogen, Antigen oder Epitop von Interesse aus einem anderen Pathogen exprimiert.
  • Zusammensetzungen, in Form von verschiedenen Verabreichungswegen werden von der Erfindung vorgesehen. Und wieder werden die effektive Dosis und der Verabreichungsweg durch bekannte Faktoren bestimmt, wie zum Beispiel Alter, Gewicht. Dosierungen von jedem aktiven Mittel, z. B. jedem C. parvum-Antigen oder Epitop von Interesse und/oder jedem Antigen oder Epitop aus jedem enterischen Pathogen kann wie in den hierin zitierten Dokumenten sein, oder wie sonst hierin erwähnt und/oder sich zwischen ein oder mehreren bis ein paar hundert oder tausend Mikrogramm bewegen, z. B. 1 μg bis 1 mg, für eine Untereinheit einer immunogenen, immunologischen Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung; und 104 bis 1010 TCID50 vorzugsweise 106 bis 108 TCID50 vor der Inaktivierung, für ein inaktivierte immunogene, immunologische Impfstoffzusammensetzung.
  • Rekombinanten oder Vektoren können in einer geeigneten Menge verabreicht werden, um eine in vivo Expression entsprechend den hierin beschriebenen und/oder in den hierin zitierten Dokumenten beschriebenen Dosierungen zu erhalten. Zum Beispiel kann ein geeigneter Bereich für virale Suspensionen empirisch bestimmt werden. Der virale Vektor oder die Rekombinante zur Verwendung in der Zusammensetzung der Erfindung kann dem Tier verabreicht werden oder infiziert oder in die Zellen transfiziert werden, in einer Menge von mindestens etwa 103 PbE; stärker bevorzugt etwa 104 PbE bis etwa 1010 PbE z. B. etwa 105 PbE bis etwa 109 PbE, zum Beispiel etwa 106 PbE bis etwa 108 PbE, mit Dosierungen, die sich im Allgemeinen zwischen etwa 106 und etwa 1010 bewegen, vorzugsweise etwa 1010 PbE/Dosis und vorteilhafterweise etwa 108 PbE pro Dosis von etwa 1 ml bis etwa 5 ml, vorteilhafterweise etwa 2 ml. Und wenn mehr als ein Genprodukt durch mehr als eine Rekombinante exprimiert wird, kann jede Rekombinante in diesen Mengen verabreicht werden; oder jede Rekombinante kann so verabreicht werden, dass in Kombination eine Summe an Rekombinanten vorliegt, die diese Mengen umfassen. In Plasmidzusammensetzungen, die in dieser Erfindung eingesetzt werden, können die Dosierungen wie in den hierin zitierten Dokumenten sein oder wie hierin beschrieben. Vorteilhafterweise sollte die Dosierung eine ausreichende Menge an Plasmid darstellen, um eine Reaktion hervorzurufen, die analog den Zusammensetzungen ist, wobei das (die) Antigen(e) oder Epitop(e) von Interesse direkt vorhanden sind; oder in solchen Zusammensetzungen Expressionsanaloge zu Dosierungen aufzuweisen; oder Expressionsanaloge aufzuweisen, zu der Expression, die in vivo durch rekombinante Zusammensetzungen erhalten wurde. Zum Beispiel können geeignete Mengen von jeder Plasmid-DNA in Plasmid-Zusammensetzungen 1 μg bis 2 mg sein, vorzugsweise 50 μg bis 1 mg. Hierin zitierte Dokumente, bezüglich DNA-Plasmidvektoren können durch den Fachmann herangezogen werden, um andere geeignete Dosierungen für den in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendeten DNA-Plasmidvektoren ohne übermäßiges Experimentieren sicherzustellen.
  • Die Dosierung der Zusammensetzung(en), Konzentration der Komponenten darin und der zeitlichen Koordinierung der Verabreichung der Zusammensetzung(en) jedoch, welche eine geeignete immunologische Reaktion hervorruft, kann durch Verfahren, wie zum Beispiel Antikörpertitrationen von Seren, z. B. durch ELISA und/oder Serumneutralisierung und/oder Serumschutz-Testanalysen bestimmt werden. Solche Bestimmungen benötigen vom Wissenstand eines Fachmannes, dieser Offenbarung und der hierin zitierten Dokumente kein übermäßiges Experimentieren. Und die Zeit für schrittweise Verabreichungen kann ebenfalls mit Verfahren ermittelt werden, die aus dieser Offenbarung und dem Stand der Technik ohne übermäßiges Experimentieren ermittelbar sind.
  • Vorzugsweise umfasst die kombinierte enterische immunologische oder Impfstoffzusammensetzung beide Cryptosporidium parvum Antigene, wie vorstehend definiert.
  • Antigene oder Epitope von enterischen Pathogenen, die vorteilhafterweise mit Cryptosporidium Antigen(en) oder Epitop(en) kombiniert sind (vorteilhafterweise P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41, wie zum Beispiel P21 oder Cp23 und Cp15/60, oder (ein) Epitop(e) davon), können ein oder mehrere Antigene oder Epitope von Interesse aus E. coli umfassen, und/oder Rotavirus, und/oder Coronavirus, und/oder Clostridium spp., wie zum Beispiel Cl. perfringes, mindestens ein Antigen oder Epitop von Interesse aus E. coli, Rotavirus, und Coronavirus. Antigene aus E. coli umfassen vorzugsweise ein, vorzugsweise mehrere (mehr als eines), stärker bevorzugt alle der Antigene mit den Namen K99, F41, Y und 31A und/oder Epitope davon. Bevorzugte Antigene sind K99 und F41. Eine auf diese Weise vorteilhafte Zusammensetzung umfasst eines von K99 und F41, und vorzugsweise beide. Es wird für eine Zusammensetzung auch bevorzugt, dass sie auch Y und/oder 31A umfasst, vorteilhafterweise Y und 31A. Zum Beispiel können diese Antigene als Untereinheiten enthalten sein oder sie können durch E. coli Bakterien getragen werden. Vorzugsweise umfassen die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung mindestens ein Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E. coli, welches das K99-Antigen trägt, E. coli, welches F41-Antigen trägt, E. coli, welches Y-Antigen trägt, E. coli, welches 31A-Antigen trägt, K99-Antigen, F41-Antigen, Y-Antigen, 31A-Antigen und irgendwelche Gemische davon.
  • Wie hierin erwähnt, kann E. coli verwendet werden, um Cryptosporidium parvum Antigene oder Epitope zu erzeugen. Die Cryptosporidium parvum Antigene oder Epitope können in einem E. coli-Stamm exprimiert werden, der mindestens eines der E. coli Antigene exprimiert, sodass die gleichzeitige Expression von E. coli und Cryptosporidium parvum Antigenen durchgeführt wird. Für die in vitro Expression können die Zellen wie üblich aufgebrochen werden und die E. coli und Cryptosporidium parvum Antigene oder Epitope wiedergewonnen werden; vorteilhafterweise, wenn es interne oder nicht-Oberflächenexpression der Antigene oder Epitope gibt, werden die Antigene oder Epitope als Fusionsproteine oder mit Markierungen exprimiert; z. B. His-tag. Für in vivo Expression werden die Nucleinsäuremoleküle, welche die Antigene oder Epitope codieren, vorteilhafterweise mit einer Signalsequenz verbunden, sodass es extrazelluläre Expression der Antigene oder Epitope gibt und, vorteilhafterweise ist E. coli nicht pathogen. In bestimmten Ausführungsformen kann E. coli daher der Vektor und das Antigen oder Epitop von Interesse sein.
  • Als Erläuterung hinzugefügt sind hier Antigene von Clostridium perfringes vorzugsweise Typ C- und/oder D-Toxoide, stärker bevorzugt Typ C- und D-Toxoide.
  • Es wird hierin eine kombinierte enterische immunologische, immunogene Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung für Rinderarten erwähnt, umfassend mindestens ein Antigen oder Epitop aus mindestens einer Cryptosproridium spp., vorzugsweise einschließlich Cryptosporidium parvum, vorteilhafterweise P21 und/oder Cp23 und/oder Cp15/60 und/oder CP41, wie zum Beispiel P21 oder Cp23 und Cp15/60 und/oder ein Epitop von Interesse davon, und mindestens ein Antigen oder Epitop aus mindestens einem zusätzlichen enterischen Rinderpathogen, wie zum Beispiel E. coli, Rinder-Rotavirus, Rinder-Coronavirus und Clostridium perfringens, oder Kombinationen davon und vorzugsweise einschließlich mindestens ein Antigen oder Epitop aus jedem dieser Pathogene oder mindestens einem Antigen oder Epitop aus E. coli, Rotavirus, und Coronavirus. Im Hinblick auf ein Epitop von Interesse des gewünschten Antigens und wie man bestimmt welcher Teil eines Antigens ein Epitop von Interesse darstellt, wird auf U.S. Patentnummern 5.990.091 , 6.090.393 und 6.156.567 verwiesen. Aus der Offenbarung hierin sowie dem Fachwissen, wie zum Beispiel den hierin zitierten Dokumenten, ist kein übermäßiges Experimentieren notwendig, um ein Epitop von Interesse sicher zu stellen oder eine Zusammensetzung innerhalb der Erfindung zu formulieren, umfassend (ein) Antigen(e) und/oder Epitop(e) und/oder Vektor(en), welche Antigen(e) und/oder Epitop(e) exprimieren.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine enterische immunologische oder Impfstoff-Zusammensetzung für Rinder bereit, umfassend E. coli Antigene, wie hierin besprochen, wie zum Beispiel die Antigene K99, F41, Y und 31A, sowie inaktiviertes Rinder-Coronavirus, inaktiviertes Rinder-Rotavirus. Diese Zusammensetzung kann ferner Clostridium perfringens Typ C- und D-Toxoide umfassen. Vorzugsweise umfasst die E. coli Valenz entweder inaktiviertes E. coli, welches das K99-Antigen umfasst, inaktiviertes E. coli, welches das F41-Antigen trägt, inaktiviertes E. coli, welches das Y-Antigen trägt und inaktiviertes E. coli, welches das 31A-Antigen trägt oder K99-Antigen, F41-Antigen, Y-Antigen und 31A-Antigen.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine immunologische Impfstoffzusammensetzung gegen Cryptosporidium parvum, die Cp23 oder P21 und Cp15/60 Antigene oder Epitope davon umfasst und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform sind diese Antigene als Proteine oder Untereinheiten-Antigene in die Zusammensetzung eingebaut. Sie können durch chemische Synthese oder durch Expression in vitro erzeugt werden. Für die Einfachheit der Herstellung durch Expression in einem geeigneten Wirt und ihrer Wiedergewinnung liegen diese Antigene vorzugsweise in der Form von Fusionsproteinen vor (z. B. mit HIS-tag). Mit anderen Worten kann das Antigen das Antigen an sich umfassen und fremde Aminosäuren.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform werden diese Antigene nicht als Untereinheiten in die Zusammensetzung aufgenommen, sondern die Zusammensetzung umfasst entweder einen rekombinanten Vektor, der Cp23 oder P21 und Cp15/60 umfasst oder ein Epitop davon oder einen rekombinanten Vektor, der Cp23 oder P21 oder ein Epitop davon umfasst und einen rekombinanten Vektor, der Cp15/60 oder ein Epitop davon umfasst, wobei diese Vektoren das (die) Antigen(e) oder Epitop(e) in vivo exprimieren, wenn sie an ein Tier verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann ein Antigen oder Epitop und einen Vektor umfassen, der das andere Antigen oder Epitop exprimiert.
  • Es werden hierin Verfahren zur Impfung erwähnt, wobei man eine kombinierte enterische immunologische oder Impfstoffzusammensetzung verabreicht, oder eine immunologische oder Impfstoffzusammensetzung gegen Cryptosporidium parvum gemäß der Erfindung. Es wird hierin ein Verfahren zur Immunisierung eines neugeborenen Kalbs gegen eine enterische Krankheit besprochen, umfassend die Verabreichung einer immunologischen oder Impfstoffzusammensetzung, umfassend Cp23 oder P21 und Cp15/60 Cryptosporidium parvum Antigene oder Epitope davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, an die schwangere Kuh oder eine schwangere Färse vor der Geburt, sodass das neugeborene Kalb mütterliche Antikörper gegen Cryptosporidium parvum aufweist. Vorzugsweise umfasst das Verfahren das Füttern des neugeborenen Kalbs mit Kolostrum und/oder Milch, die von einer Kuh kommen, z. B. der Mutter, die immunisiert wurde. Zur Impfung oder Immunisierung gegen enterische Krankheit kann man nicht nur einen kombinierten Impfstoff, eine immunogene oder immunologische Zusammensetzung verwenden, die verschiedene Valenzen enthält, sondern auch getrennte Impfstoff-, immunogene oder immunologische Zusammensetzungen, die getrennt verabreicht werden können, z. B. schrittweise oder die vor der Verwendung gemischt werden können.
  • Antigene und Epitope von Interesse, die in erfinderischen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, können unter Verwendung irgendeines Verfahrens erzeugt werden, welches einem Fachmann zur Verfügung steht, zum Beispiel unter Verwendung von Verfahren in US-A-5.591.434 und WO-A-9807320 . Ferner kann man Antigene von anderen enterischen Pathogenen aus im Handel erhältlichen Quellen erhalten, wie zum Beispiel TRIVACTON®6; zum Beispiel Cp23 und/oder P21 und/oder Cp15/60 oder ein Epitop davon, z. B. P21 oder Cp23 und Cp15/60 oder ein Epitop davon, oder ein Vektor, der diese(s) Antigen(e) oder Epitop(e) exprimiert, kann zu TRIVACTON®6 in hierin festgelegten Mengen hinzugefügt werden. Clostridium perfringens Toxoide C und D können zu TRIVACTON®6 hinzugefügt werden. Darüber hinaus kann das inaktivierte E. coli, das Pili trägt in TRIVACTON®6 durch die isolierten Pili ersetzt werden. Ein solcher Impfstoff, immunogene oder immunologische Zusammensetzung (mit inaktiviertem E. coli oder isolierten Pili) zu welchen C. parvum-Antigen(e) oder Epitop(e) und/oder Clostridium perfringes Antigen(e) oder Epitop(e) hinzugefügt werden und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Zusammensetzungen und Kits, werden daher hierin erwähnt.
  • Darüber hinaus wird, was die E. coli Valenz und/oder Antigen(e) und/oder Epitop(e) betrifft, die bei der Ausübung der Erfindung wichtig sind, auf EP-A-80.412 , EP-A-60.129 , GB-A-2.094,324 und die U.S. Patentnummern 4.298.597 , 5.804.198 , 4.788.056 , 3.975.517 , 4.237,115 , 3.907.987 , 4.338.298 , 4.443.547 , 4.343792 , 4.788.056 und 4.311.797 verwiesen. Was Rotavirusantigen(e) und/oder Epitop(e) betrifft wird auf P. S. Paul und Y. S. Lyoo, Vet Microb. 37: 299–317 (1993) verwiesen und auf die U.S. Patentnummern 3.914.408 und 5.620.896 . Im Bezug auf Coronavirusantigen(e) und/oder Epitop(e), wird auf WO-A-98 40097 , WO-A-96 41874 und die U.S. Patentnummern 3.914.408 und 3.919.413 verwiesen. Für Clostridium, z. B. Cl. perfringens, Antigen(e) und/oder Epitop(e) wird auf WO-A-94 22476 , EP-A-734.731 , WO-A-98 27964 , GB-A-2.050.830 , GB-A-1.128.325 , D. Calmels und Ph. Desmettre, IV Symposium der Kommission für die Studie von Tierkrankheiten, verursacht durch Anaerobe, Paris, 16–18 Nov., 1982, die U.S. Patentnummern 5.178.860 , 4.981.684 und 4.292.307 verwiesen; und auf IMOTOXAN® (MERIAL, Lyon, Frankreich) (enthaltend die Typen B, C, D, Cl. perfringens, Toxoide aus Cl. septicum, Cl. novyi, Cl. tetani und die Kultur von Cl. chauvoei). Und zusätzlich zu TRIVACTON®6, kann man andere im Handel erhältliche kombinierte Impfstoffe verwenden, zu welchen die C. parvum-Valenz hinzugefügt werden kann, zum Beispiel SCOURGUARD 3 (K)/C® (SmithKline Beecham), welches inaktiviertes Rotavirus und Coronavirus, K99 E. coli Bacterin und Cl. perfringes Typ C-Toxoid enthält.
  • Ein bevorzugtes Verfahren, um Antigene oder Epitope von Interesse zu erhalten ist es, die DNA-Sequenz zu clonieren, welche das Antigen und Epitop von Interesse in einem Fusions- oder nicht-Fusionsplasmid codiert und seine Expression in E. coli durchzuführen. Fusionsplasmide (z. B. die Antigen(e) oder Epitop(e) mit einem tag, wie zum Beispiel einem His-tag exprimieren) werden bevorzugt, da sie es erlauben, dass man das erzeugte Antigen leicht wiedergewinnt. Geeignete Plasmide werden in den Beispielen beschrieben. Die Produktion von Antigenen durch chemische Synthese wird hierin erwähnt.
  • Hierin werden die Verfahren zur Verwendung der hierin besprochenen Antigene oder Epitope oder Vektoren besprochen, die solche Antigene oder Epitope für die Herstellung eines Impfstoffes, einer immunologischen oder immunogenen Zusammensetzung, z. B. gegen C. parvum oder gegen enterische Erkrankungen exprimieren; zum Beispiel durch Beimischen der Antigene, Epitope oder Vektoren mit einem geeigneten oder verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel und wahlweise auch mit einem Adjuvans. Die Zusammensetzungen können zur Rekonstitution lyophilisiert werden. Die Erfindung umfasst ferner einen Kit zur Herstellung einer erfinderischen Zusammensetzung. Der Kit kann das (die) Antigen(e), Epitop(e) und/oder Vektor(en) enthalten, Träger und/oder Verdünnungsmittel und wahlweise ein Adjuvans; die Bestandteile können in getrennten Behältern vorliegen. Die Behälter, welche die Bestandteile enthalten, können in einer oder mehr als einer Packung vorliegen; und der Kit kann Anleitungen zur Beimischung von Bestandteilen und/oder Verabreichung des Impfstoffes, der immunogenen oder immunologischen Zusammensetzung enthalten.
  • Es wird hierin die Erzeugung von hyperimmunem Kolostrum und/oder Milch beschrieben, zum Beispiel durch Hyperimmunisierung des schwangeren Sängerweibchens (wie einer Kuh) durch mindestens 1, vorteilhafterweise mindestens 2 und stärker bevorzugt mindestens 3, Verabreichungen der erfinderischen Zusammensetzung(en) (z. B. C. parvum-Zusammensetzungen oder kombinierte enterischen Zusammensetzungen, gemäß der Erfindung). Wahlweise, aber vorteilhafterweise kann das auf diese Weise erzeugte Kolostrum und/oder die Milch dann behandelt werden, um die Immunglobuline zu konzentrieren und die Komponenten des Kolostrums und der Milch zu entfernen, die nicht zur erwünschten immunologischen, immunogenen und/oder Impfstoffreaktion beitragen, oder zum Nährwert des Kolostrums oder der Milch. Diese Behandlung kann vorteilhafterweise die Koagulation des Kolostrums oder der Milch umfassen, z. B. mit Rennin und der flüssigen Phase, welche die wieder gefundenen Immunglobuline enthält. Es wird hierin hyperimmunes Kolostrum oder Milch erwähnt oder ein Gemisch davon und/oder Zusammensetzungen, die das hyperimmune Kolostrum oder die Milch oder das Gemisch davon umfassen. Darüber hinaus wird hierin die Verwendung des hyperimmunen Kolostrums oder der Milch oder des Gemisches davon oder Zusammensetzungen, umfassend die gleiche beschrieben, um C. parvum und/oder eine enterische Infektion in einem jungen Tier, wie zum Beispiel einem Neugeborenen, zum Beispiel einem Kalb, zu verhindern oder zu behandeln.
  • Demgemäß soll die Erfindung ferner durch die folgenden Beispiele beschrieben werden, die als Erläuterung bereitgestellt werden und nicht als eine Einschränkung der Erfindung betrachtet werden sollten.
  • BEISPIELE
  • Liste der Sequenzen:
    • SEQ ID NO: 1 Oligonucleotid JCA295
    • SEQ ID NO: 2 Oligonucleotid JCA296
    • SEQ ID NO: 3 Oligonucleotid JCA297
    • SEQ ID NO: 4 Oligonucleotid JCA298
    • SEQ ID NO: 5 Oligonucleotid JCA299
    • SEQ ID NO: 6 Oligonucleotid JCA300
    • SEQ ID NO: 7 Oligonucleotid JCA301
    • SEQ ID NO: 8 Oligonucleotid JCA302
    • SEQ ID NO: 9 Oligonucleotid JCA303
    • SEQ ID NO: 10 Oligonucleotid JCA304
  • Alle Plasmidkonstrukte sind unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken gemacht worden (Clonierung, Restriktionsspaltung, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)), wie beschrieben in Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor New York. 1989). Alle DNA-Restriktionsfragmente, die erzeugt wurden, und für die vorliegende Erfindung verwendet wurden, sowie die PCR-Fragmente, sind unter Verwendung des Geneclean® Kits (BIO101 Inc. La Jolla, CA) isoliert und gereinigt worden.
  • Beispiel 1: Clonierung der C. parvum P21 und Cp15/60 Gene
  • Oocyten von Cryptosporidium parvum werden aus einem infizierten Kalb isoliert und werden aus Rinder-Stuhlproben, wie beschrieben durch Sagodira S. et al. (Vaccine. 1999. 17. 2346–2355) gereinigt. Die gereinigten Oocyten werden dann in destilliertem Wasser bei +4°C gelagert. Zur Verwendung als Matrize für PCR-Reaktionen, wird die genomische DNA aus den gereinigten Oocyten wie beschrieben bei Jochmann S. et al., freigesetzt (Microbial Pathogenesis 1999. 26. 307–315).
  • Eine alternative Quelle für C. parvum DNA wird durch die genomischen EcoRI-Banken für die Cryptorsporidium parvum Iowa (A), Iowa (I), KSU-1 und KSU-2 Isolate gebildet, die durch die American Tissue Culture Collection (ATCC-Nummern 87667, 87668, 87439 bzw. 87664) erhältlich sind. Die spezifischen P21 und Cp15/60 Gene werden wie folgt isoliert:
    Die Sequenz, die das P21 Protein codiert, wird durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von C. parvum DNA und den folgenden Primern amplifiziert:
    Figure 00400001
  • Diese PCR erzeugt ein PCR-Fragment von etwa 585 bp. Dieses PCR-Fragment wird mit NcoI und EcoRI-Restriktionsenzymen gespalten, um nach der Agarose-Gelelektrophorese und der Gewinnung mit dem GeneClean Kit (BIO101 Inc.) ein 575 bp NcoI-EcoRI-Restriktionsfragment (= Fragment A) zu isolieren. Die Sequenz von diesem Fragment codiert ein Protein, das homolog zu der Sequenz ist, die in der Patentanmeldung WO 98/07320 ( PCT/US97/14834 ) in SEQ ID NO: 12 beschrieben wird.
  • Eine zweite PCR wird durchgeführt, um die Sequenz zu amplifizieren, die das Cp15/60 Protein codiert und um geeignete Restriktionsstellen für weitere Clonierung an die 5'- und 3'-Enden hinzuzufügen. Die PCR wird unter Verwendung von C. parvum DNA und den folgenden Primern durchgeführt:
    Oligonucleotid JCA297 (35-mer) SEQ ID NO: 3
    Figure 00410001
  • Diese PCR erzeugt ein Fragment von etwa 465 bp. Dieses Fragment wird gereinigt und dann mit XhoI und EcoRI gespalten, um nach der Agarose-Gelelektrophorese und Wiedergewinnung mit dem GeneClean Kit (BIO101 Inc.) das 435 bp XhoI-EcoRI-Fragment (= Fragment B) zu erhalten. Die amplifizierte Sequenz wird entworfen um mit der Sequenz, die von Nucleotid #31 bis #528 der SEQ ID NO: 1 im U.S. Patent # 5.591.434 und den in GenBank unter den Zugangsnummern U22892 und AAC47447 hinterlegten Sequenzen ähnlich zu sein.
  • Beispiel 2: Konstruktion von Plasmid pJCA155 (GST-P21 Fusionsprotein in Vektor pBAD/HisA)
  • Die Sequenzen, die zur Expression des GST-P21 Fusionsproteins benötigt werden, werden durch PCR amplifiziert, um 2 Fragmente zu erzeugen, die leicht in den pBAD/HisA Expressions-Plasmidvektor (Cat # V430-01 In Vitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008, USA) cloniert werden zu können. Die erste PCR wird unter Verwendung des pGEX-2TK Plasmids (Cat # 27-4587-01 Amersham-Pharmacia Biotech) und den folgenden Primern durchgeführt:
    Figure 00410002
  • Diese PCR erzeugt ein Fragment von etwa 720 bp, welches die GST-Einheit mit dem Zusatz von einer NcoI-Restriktionsstelle am 5'-Ende für Clonierungszwecke in pBAD/HisA codiert; diese Modifikation fügt ein Glycincodon zu dem GST-P21 Fusionsprotein hinzu). Dieses PCR-Fragment wird dann mit NcoI und XhoI gespalten, um nach der Agarose-Gelelektrophorese und Wiedergewinnung mit dem GeneClean Kit (BIO101 Inc.) das 710 bp NcoI-XhoI-Fragment (= Fragment C) zu erzeugen.
  • Die zweite PCR wird unter Verwendung von C. parvum-DNA und den folgenden Primern durchgeführt:
    Figure 00420001
    Oligonucleotid JCA296 (33-mer) SEQ ID NO: 2
  • Diese PCR erzeugt ein Fragment von etwa 580 bp, welches die P21-Einheit mit dem Zusatz der XhoI und EcoRI-Restriktionsstellen an den 5' bzw. 3'-Enden codiert. Dieses PCR-Fragment wird dann mit XhoI und EcoRI gespalten, um nach der Agarose-Gelelektrophorese und Wiedergewinnung mit dem GeneClean Kit (BIO101 Inc.) das 572 bp XhoI-EcoRI-Fragment (= Fragment D) zu erhalten.
  • Das pBAD/HisA Plasmid (Cat. # V430-01, In Vitrogen Corp.) wird mit NcoI und EcoRI gespalten. Die gespaltenen Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, um (Gene Clean Kit, BIO101 Inc.) das # 3960 bp NcoI-EcoRI-Fragment (= Fragment E) zu erhalten.
  • Die Fragmente C, D und E werden dann zusammen ligiert, um das Plasmid pJCA155 zu erzeugen. Dieses Plasmid hat eine Gesamtgröße von 5243 bp (1) und codiert ein 425 Aminosäuren langes GST-P21-Fusionsprotein.
  • Beispiel 3: Konstruktion von Plasmid pJCA156 (Hiso-P21 Fusionsprotein im Vektor pBAD/HisA)
  • Der pBAD/HisA-Vektor (Cat # V430-01, In Vitrogen) wird mit NcoI und EcoRI gespalten und das # 3960 bp NcoI-EcoRI-Restriktionsfragment (= Fragment E) wird wiedergewonnen und wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert.
  • Eine PCR wird durchgeführt, um die Sequenz zu amplifizieren, welche die His6-P21-Fusion codiert, und um die NcoI bzw. EcoRI-Restriktionsstellen an das 5' – 3'-Ende hinzuzufügen, um dieses PCR-Fragment in den pBAD/HisA Plasmidvektor zu subclonieren.
  • Eine PCR wird unter Verwendung der C. parvum-DNA und den folgenden Primern durchgeführt:
    Figure 00420002
    und Oligonucleotid JCA296 (33-mer) SEQ ID NO: 2
  • Diese PCR erzeugt ein Fragment von etwa 610 bp. Dieses Fragment wird gereinigt und dann mit NcoI und EcoRI gespalten, um nach der Agarose-Gelelektrophorese und der Wiedergewinnung mit dem GeneClean Kit (BIO101 Inc.) das 600 bp NcoI-EcoRI-Fragment (= Fragment F) zu isolieren.
  • Die Fragmente E und F werden zusammen ligiert, um das Plasmid pJCA156 zu erzeugen. Dieses Plasmid hat eine Gesamtgröße von 4562 bp (2) und codiert ein 199 Aminosäure langes His-6/P21 Fusionsprotein.
  • Beispiel 4: Konstruktion von Plasmid pJCA157 (P21-Protein alleine im pBAD/HisA Vektor)
  • Der BAD/HisA-Vektor (Cat # V430-01, In Vitrogen Corp.) wird mit NcoI und EcoRI gespalten und das # 3960 bp NcoI-EcoRI-Restriktionsfragment (= Fragment E) wird wie in Beispiel 3 beschrieben wiedergewonnen.
  • Eine PCR wird durchgeführt, um die Sequenz zu amplifizieren, die das P21 Protein codiert und um die NcoI bzw. EcoRI Restriktionsstellen an die 5' und 3'-Enden anzufügen, um dieses PCR-Fragment in den pBAD/HisA-Plasmidvektor zu subclonieren. Die PCR wird unter Verwendung der C. parvum-DNA und den folgenden Primern durchgeführt.
    Oligonucleotid JCA295 (35-mer) SEQ ID NO: 1
    und Oligonucleotide JCA296 (33-mer) SEQ ID NO: 2, um wie in Beispiel 1 beschrieben, ein 575 bp NcoI-EcoRI-Fragment zu erhalten (Fragment A).
  • Die Fragmente E und A werden zusammenligiert, um Plasmid pJCA157 zu erzeugen. Dieses Plasmid hat eine Gesamtgröße von 4535 bp (3) und codiert 189 Aminosäuren einschließlich dem P21 Protein.
  • Beispiel 5: Konstruktion von Plasmid pJCA158 (GST-Cp15/60 Fusionsprotein im pBAD/HisA-Vektor)
  • Eine PCR wird durchgeführt, um die Sequenz zu amplifizieren, die das GST-Protein codiert und um geeignete Restriktionsstellen an den 5' und 3'-Enden hinzuzufügen, um das PCR-Fragment in den endgültigen pBAD/HisA-Plasmidvektor zu subclonieren. Die PCR wird unter Verwendung der DNA von Plasmid pGEX-2TK (Cat # 27-4587-01, Amersham-Pharmacia Biotech) als eine Matrize und den folgenden Primern durchgeführt:
    Oligonucleotid JCA299 (35-mer) SEQ ID NO: 5
    und Oligonucleotid JCA300 (45-mer) SEQ ID NO: 6, um wie in Beispiel 2 beschrieben, ein 710 bp NcoI-XhoI-Fragment (= Fragment C) zu erhalten.
  • Der pBAD/HisA-Vektor (Cat # V430-01, In Vitrogen) wird mit NcoI und EcoRI gespalten und das # 3960 bp NcoI-EcoRI-Restriktionsfragment (= Fragment E) wird wiedergewonnen und wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert.
  • Die Fragmente C, E und B (Beispiel 1) werden zusammenligiert, um Plasmid pJCA158 zu erzeugen. Dieses Plasmid hat eine Gesamtgröße von 5132 bp (4) und exprimiert ein 388 Aminosäuren langes GST-Cp15/60 Fusionsprotein.
  • Beispiel 6: Konstruktion von Plasmid pJCA159 (Hiso-Cp15/60 Fusionsprotein im pBAD/HisA-Vektor)
  • Der pBAD/HisA-Vektor (Cat # V430-01, In Vitrogen) wird mit NcoI und EcoRI gespalten und das # 3960 bp NcoI-EcoRI-Restriktionsfragment (= Fragment E) wird wiedergewonnen und wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert.
  • Eine PCR wird durchgeführt, um die Sequenz zu amplifizieren, welche die Hiso-Cp15/60 Fusion codiert und um günstige Restriktionsstellen an die 5'- und 3'-Enden hinzuzufügen, um dieses PCR-Fragment in den pBAD/HisA-Plasmidvektor zu subclonieren. Die PCR wird unter Verwendung einer C. parvum-DNA und den folgenden Primern durchgeführt:
    Figure 00440001
    und Oligonucleotid JCA298 (42-mer) SEQ ID NO: 4
  • Diese PCR erzeugt ein Fragment von etwa 496 bp. Dieses Fragment wird gereinigt und dann mit NcoI und EcoRI gespalten, um nach der Agarosegelelektrophorese und Wiedergewinnung mit dem GeneClean Kit (BIO101 Inc.) das 483 bp NcoI-EcoRI-Fragment (= Fragment G) zu erhalten.
  • Die Fragmente E und G werden zusammenligiert, um Plasmid pJCA159 zu erzeugen. Dieses Plasmid hat eine Gesamtgröße von 4445 bp (5) und exprimiert ein 159 Aminosäuren langes His6/Cp15/60 Fusionsprotein.
  • Beispiel 7: Konstruktion von Plasmid pJCA160 (Cp15/60 Protein alleine im pBAD/HisA-Vektor)
  • Der pBAD/HisA-Vektor (Cat # V430-01, In Vitrogen) wird mit NcoI und EcoRI gespalten und das # 3960 bp NcoI-EcoRI-Restriktionsfragment (= Fragment E) wird wiedergewonnen und wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert.
  • Eine PCR wird durchgeführt, um die Sequenz zu amplifizieren, die das Cp15/60-Protein codiert und um günstige Restriktionsstellen an die 5'- und 3'-Enden hinzuzufügen, um dieses PCR-Fragment in den pBAD/HisA-Plasmidvektor zu subclonieren.
  • Die PCR wird unter Verwendung einer C. parvum-DNA und den folgenden Primern durchgeführt:
    Figure 00450001
    und Oligonucleotid JCA298 (42-mer) SEQ ID NO: 4
  • Diese PCR erzeugt ein Fragment von etwa 460 bp. Dieses Fragment wird gereinigt und dann mit NcoI und EcoRI gespalten, um nach der Agarose-Gelelektrophorese und Wiedergewinnung mit dem GeneClean Kit (BIO101 Inc.) das 450 bp NcoI-EcoRI Fragment (= Fragment H) zu erhalten.
  • Die Fragmente E und H werden zusammenligiert, um Plasmid pJCA160 zu erzeugen. Dieses Plasmid hat eine Gesamtgröße von 4412 bp (6) und exprimiert ein 148 Aminosäuren langes Cp15/60 Protein.
  • Beispiel 8: Kultur von rekombinanten E. coli Clonen und Einführung der rekombinanten Proteine
  • Plasmid-DNA (Beispiele 2 bis 7) wird in Escherichia coli DH5α transformiert (oder in irgendeinen geeigneten E. coli K12 Stamm, der den Fachleuten gut bekannt ist, wie zum Beispiel E. coli TOP10 (Cat # C4040-03 In Vitrogen Corp.)) und auf Agarplatten von Luria-Bertani (LB) Medium mit 50 μg/ml Ampicillin gezüchtet. Eine Kolonie wird für jede mit einem Plasmid transformierte E. coli-Population abgenommen und, zum Wachstum über Nacht, in 10 ml LB-Medium mit Ampicillin gegeben (oder einem anderen geeigneten Antibiotikum). Ein ml aus der über Nacht- Kultur wird zu einem Liter LB-Medium hinzugefügt und bei +30°C gezüchtet, bis die OD600nm ungefähr 3.0 erreicht.
  • Die Proteinherstellung wird mit unterschiedlichen Endkonzentrationen von DL-Arabinose (Cat # A9524, Sigma, St Louis, MO) (Bereich von 0,002% bis 0,2% zur Bestimmung der Konzentration für den optimalen Ertrag) induziert, die zur Kultur hinzugefügt werden und bei +30°C für 4–6 Stunden inkubiert werden.
  • Beispiel 9: Extraktion und Reinigung der rekombinanten Fusionsproteine
  • Am Ende der Induktion (Beispiel 8) werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (3000 g, 10 Minuten, +4°C) und in Lysepuffer suspendiert (50 mM Tris HCl pH-Wert 8.0, 1 mM EDTA, 1 μM PMSF, 1 mg/ml Lysozym) und 25-mal mit Ultraschall behandelt, mit 30 Sekunden Impulsen, mit 1-minütigen Pausen zwischen den Impulsen. Triton X-100 wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1% hinzugefügt. Die Trümmer werden durch Zentrifugation entfernt.
  • Falls nötig können alternative Techniken (die Fachleuten bekannt sind) zur Lyse der bakteriellen Zellen verwendet werden.
  • 9.1. GST-Fusion von rekombinanten Proteinen
  • Rekombinante GST-Fusionsproteine (hergestellt durch E. coli, das mit den Plasmiden pJCA155 oder pJCA158 transformiert wurde) wurden aus den bakteriellen Lysaten affinitätsgereinigt, wie in Beispiel 8 beschrieben, unter Verwendung einer Glutathion-Agarose (Cat # G4510 Sigma) oder Glutathion-Sepharose 4B (Cat # 17-0756-01, Amersham-Pharmacia Biotech) erzeugt. Bakterielle Lysate und die Glutathion-Agarose wurden für 4 Stunden bei +4°C inkubiert. GST-Fusionsproteine wurden dann aus der Agarose in einem Mengenformat mit 10 mM Gluthathion in reduzierter Form (Cat # G4705, Sigma) unter sanften Bedingungen isoliert (K. Johnson und D. Smith Gene. 1988. 67. 31–40). (Referenz: Anonym. GST-Genfusionssystem: Technisches Handbuch. 3. Auflage Heights, IL: Amersham-Pharmacia Biotech, 1997). Jeder Fachmann kann aus der Offenbarung und dem Wissen im Stand der Technik die Korrektur dieses Prozesses nach oben zur Reinigung großer Mengen an GST-Fusionsproteinen ohne übermäßiges Experimentieren erreichen.
  • 9.2. His6-Fusion von rekombinanten Proteinen:
  • Rekombinate His6-Fusionsproteine sind unter Verwendung des ProBondTM Nickel-chelatierenden Harzes (Cat # R801-15, In Vitrogen Corp.), nach den Anweisungen des Herstellers, erzeugt worden.
  • Die Herstellung von nativem E. coli-Lysat (lösliches rekombinantes Protein): die Zellen aus einer 1-Liter Kultur an E. coli (transformiert mit Plasmiden pJCA156 oder pJCA159) werden durch Zentrifugation geerntet (3000 g für 5 Minuten). Das Pellet wird in 200 ml des nativen Bindungspuffers resuspendiert (20 mM Phosphat, 500 mM NaCl, pH-Wert 7,8). Das resuspendierte Pellet wird dann mit Ei-Lysozym bei einer Endkonzentration von 100 μg/ml für 15 Minuten auf Eis inkubiert. Dieses Gemisch wird dann 2–3 Impulsen zu je 10 Sekunden bei mittlerer Intensität mit Ultraschall behandelt, während die Suspension auf Eis gehalten wird. Das Gemisch wird dann einer Reihe an Einfrier/Auftau-Zyklen zum Abschließen der Lyse unterzogen und die unlöslichen Trümmer werden schließlich durch Zentrifugation bei 3000 g für 15 Minuten entfernt. Das Lysat wird durch Hindurchleiten durch einen 0.8 um Filter geklärt und auf Eis oder bei –20°C bis zur Reinigung gelagert.
  • Das lösliche rekombinante His6-Fusionsprotein, das im klaren Lysat vorhanden ist, wird an eine 50 ml vor-äquilibrierte ProBondTM Harzsäule Mengengebunden (Cat # R640-50 und R801-15, In Vitrogen Corp.) mit zwei 100 ml Lysat-Aliquots. Die Säule wird für 10 Minuten vorsichtig geschaukelt, um das Harz in einem resupendierten Zustand beizubehalten und dem Polyhistidin-tagged Protein die vollständige Bindung zu ermöglichen. Das Harz setzt sich durch Schwerkraft oder durch langsame Zentrifugation (800 g) ab und der Überstand wird vorsichtig abgesaugt. Ein identischer Zyklus wird mit dem zweiten Aliquot durchgeführt.
  • Waschen der Säule und Flution:
  • Vier aufeinander folgende Schritte werden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Anonym XpressTM System Protein Purification – A Manual of Methods for Purification of Polyhistidine – Containing Recombinant Proteins. In Vitrogen Corp. Editor. Version D. 1988):
    • 1. Die Säule wird mit 100 ml an nativem Bindungspuffer, pH-Wert 7,8 durch Resuspendieren des Harzes gewaschen, Schütteln für 2 Minuten und dann Auftrennung des Harzes vom Überstand durch Schwerkraft oder Zentrifugation. Dieses Verfahren wird 2 weitere Male wiederholt (insgesamt 3 Waschungen).
    • 2. Die Säule wird mit 100 ml des nativen Waschpuffers pH-Wert 6,0 durch Resuspendieren des Harzes gewaschen, Schütteln für 2 Minuten und dann Abtrennen des Harzes vom Überstand durch Schwerkraft oder Zentrifugation. Dieses Verfahren wird mindestens 3 weitere Male wiederholt, bis die OD280 weniger als 0,01 ausmacht.
    • 3. Die Säule wird mit 100 ml des nativen Waschpuffers pH-Wert 5,5 durch Resuspendieren des Harzes gewaschen, Schütteln für 2 Minuten und dann Auftrennen des Harzes vom Überstand durch Schwerkraft oder Zentrifugation. Dieses Verfahren wird einmal wiederholt (insgesamt 2 Waschungen).
    • 4. Die Säule wird dann in der vertikalen Position eingespannt und die Kappe wird vom unteren Ende abgebrochen. Das rekombinante Protein wird mit 150 ml des Elutionspuffers bei nativem pH-Wert eluiert. 10 ml Fraktionen werden gesammelt. Die Flution wird überwacht, indem die OD280 der Fraktionen abgelesen wird.
  • Falls nötig kann das eluierte rekombinante Protein entweder durch Dialyse oder durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat konzentriert werden.
  • Die endgültige Konzentration der rekombinanten Proteincharge wird gemessen, indem die OD280 abgelesen wird.
  • Jeder Fachmann kann die Korrektur dieses Prozesses nach oben, ohne übermäßiges Experimentieren erzielen.
  • Beispiel 10: Extraktion und Reinigung der C. parvum P21 und Cp15 rekombinanten nicht-Fusionsproteine
  • Die bakteriellen Zellen von E. coli (transformiert mit den Plasmiden pJCA157 oder pJCA160) werden in 4 Liter-Kulturen des M9 Minimalmediums gezüchtet (ergänzt durch die geeigneten Aminosäuren) (Sambrook J. et al., (Molecular Cloning: A Laborstory Manual. 2. Auflage. Cold Spring Harbor Laborstory. Cold Spring Harbor. New York. 1989) bei 30°C bis die OD600 nm ungefähr 3.0 erreicht und sie wie beschrieben in Beispiel 8 induziert werden. Die bakteriellen Zellen werden dann aufgebrochen, indem sie bei hohem Druck durch einen RANNTE Homogenisator Mini-Labtyp 8.30 H, mit einem maximalen Durchfluss von 10 Litern pro Stunde und einem Arbeitsdruck zwischen 0 und 1000 bar, hindurchgeleitet werden. Das Lysat wird durch Filtration durch einen CUNO-Filter Zeta plus, LP-Typ geklärt und dann 50-mal auf einem Ultrafilter PALL-Filtron (Referenz OS010G01) UF 10 kDa. Das Proteinsuspensionskonzentrat wird auf eine Größenausschluß Chromatographiesäule mit einem hohen Sephacryl S-100-Gel mit hoher Auflösung unter einem Volumen auftragen, das 2–3% des Säulenvolumens entspricht aufgetragen. Die Flution wird mit einem PBS-Puffer durchgeführt. Die gesammelten Fraktionen, die dem erwarteten Molekulargewicht für die Untereinheiten Impfstoffproteine entsprechen, werden 10-mal auf einer Hohlfaserpatrone A/G Technologietyp Midgee Patronenmodell UFP-10-B-MB01 konzentriert (oder Modell UFP-10-C-MB01 oder Modell UFP-10-E-MB01). Die konzentrierten Proben werden dann bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. Die spezifischen rekombinanten C. parvum-Proteine können dann in den geeigneten Verhältnissen zum endgültigen zusammengesetzten Impfstoff gemischt werden (siehe Beispiel 11).
  • Beispiel 11: Impfstoffformulierungen; Impfung von schwangeren Kühen; passive Immunisierung und Challenge-Experimente in neugeborenen Kälbern
  • Das Produkt (mit Adjuvans oder ohne) wird intramuskulär (IM), subkutan (SK) oder intradermal (ID) verabreicht, um Serumantikörperantworten gegen C. parvum hervorzurufen. Nach zweimaliger Verabreichung an schwangere Tiere ruft es eins Serumantikörperreaktion hervor, welche passiv, über Kolostrum und Milch, auf das Neugeborene übertragen wird. Das Verabreichungsprotokoll für schwangere Tiere kann 2 Dosierungen umfassen, die verabreicht werden, wischen dem Zeitpunkt als die Schwangerschaft festgestellt wurde und der Geburt des Kalbes, wie etwa 1 Monat vor der Geburt und etwa 3 bis 5 Tage vor der Geburt; oder 2 Monate vor der Geburt (was in Milchkühen mit dem vorläufigen Ende der Milchproduktion vor der Geburt des nächsten Kalbes zusammenfällt) und eine Auffrischung vor der Geburt (z. B. irgendwann zwischen 3 Wochen und 1 Woche vor der Geburt), abhängig von den Haltungspraktiken (diese Pläne bevorzugen jedoch maximale Effizienz). Gegenwärtige Haltungspraktiken bevorzugen, dass die Produkte im letzten Trimester verabreicht werden. Das Volumen des Produktes kann von zwischen 1 ml bis 5 ml sein, wie zum Beispiel 2 ml. Kombinationsimpfstoffe können einen lyophilisierten und einen flüssigen Anteil aufweisen, der vor der Injektion gemischt werden kann. Um unter Außenbedingungen einen maximalen Schutz zu erhalten, kann das Cryptosporidium-Antigen als eine Komponente eines E. coli/Rota/Corona-Kombinationsimpfstoffes hinzugefügt werden.
  • Die folgenden Untersuchungen werden durchgeführt:
  • Studie A: C. parvum verstärkt die Pathogenität von enterischem Virus und/oder Bakterium
  • Experimentelle Herausforderung unter Nutzung von 3 neugeborenen Kälbern pro Gruppe wie folgt:
    • 1. Coronavirus alleine
    • 2. Coronavirus und C. parvum
    • 3. E. coli F41 alleine
    • 4. E. coli F41 und C. parvum
    • 5. C. parvum alleine
    • 6. Nicht herausgeforderte Kontrollen
  • Kälber werden innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt über den oralen Weg herausgefordert. Die Menge an verwendetem Herausforderungsmaterial, ist jenes, das nötig ist, um klinische Zeichen zu erzeugen (Depression, Durchfall, Dehydrierung) und kann von der Art des Tieres abhängen (gnotobiotisch künstlich aufgezogen oder herkömmliches Kalb, das von seinem Muttertier gestillt wird). Allgemeine klinische Zeichen (Temperatur, Verhalten, Hydration, Durchfallbewertung, usw.) werden gesammelt. Zusätzliche serologische und Shedding-Information wird gesammelt.
  • Ergebnis
  • Coronavirus oder E. coli F41 monovalente experimentelle Herausforderungen erzeugen keine klinischen Zeichen der enterischen Erkrankung in neugeborenen Kälbern. Zweifache Herausforderung mit Coronavirus oder E. coli F41 mit C. parvum bei einer C. parvum Dosierung, die normalerweise keine klinische Erkrankung verursacht, wird signifikante klinische Zeichen von enterischer Erkrankung erzeugen.
  • Studie B: Ein Kombo-Impfstoff (E. coli K99/F41, Rota- und Coronavirus), der C. parvum enthält, stellt, durch gleichzeitige Infektion von vielfachen enterischen Viren oder Bakterien, in neugeborenen Kälbern einen verstärkten Schutz gegen eine enterische Krankheitsursache bereit.
  • Behandlungsgruppen von 30 schwangeren Kühen die geimpft wurden mit:
    • 1. Kombination (Rota und Coronaviurs, E. coli K99 und F41), 8 Tiere;
    • 2. Kombination plus Crypto, 8 Tiere;
    • 3. Nicht geimpfte Kontrollen, 14 Tiere.
  • Experimentelle Herausforderung wie folgt:
    • 1. Vielfache Herausforderung (Coronavirus und F41 und C. parvum auf subklinischem Niveau);
    • 2. Indikatortiere
    • 3. Nicht herausgefordert
  • Kälber erhalten Kolostrum (von Hand gefüttert oder man gestattet dem Kalb beim Muttertier zu trinken) und jene, die herausgefordert werden, werden innerhalb von 24 Stunden nachdem sie geboren wurden über den oralen Weg herausgefordert. Die Menge an Herausforderungsmaterial ist die Menge, die notwendig ist, um klinische Zeichen zu erzeugen (z. B. wie bestimmt in Studie A, und wie in Studie A erwähnt, können sie abhängig von der Art des verwendeten Tieres variieren (z. B. gnotobiotisch künstlich aufgezogenes oder herkömmliches Kalb, das von seinem Muttertier gestillt wird). Allgemeine klinische Zeichen (Temperatur, Verhalten, Durchfallbewertung) werden gesammelt. Zusätzliche serologische und Shedding-Information wird gesammelt.
  • Aufbau:
  • 6 Kälber, die von geimpften (Kombo und Kombo plus Crypto) oder von Kontrollkühen geboren wurden, werden mit einer Herausforderung herausgefordert, die 3 Komponenten aufweist (Coronavirus und F41 plus C. parvum) und 3 Kälber (aus nicht geimpften Kontrollkühen verbleiben als Indikatortiere.
  • Ergebnis
  • Verwendung eines Kombinations-Impfstoffes, der C. parvum enthält, erzeugt einen besseren Schutz als ein Kombinations-Impfstoff alleine unter vielfachen Herausforderungssituationen (Coronavirus und E. coli F41 mit C. parvum bei einer subklinischen Dosierung).
  • Beispiel 12: Wirkung von zweifacher Infektion mit C. parvum und Rinder-Rotavirus in einem experimentellen Herausforderungsmodell in neugeborenen Kälbern
  • Diese Studie wurde entworfen, um die Schwere der klinischen Zeichen und der Stuhlexkretion in Kälbern nach einer monovalenten Herausforderung mit C. parvum oder Rinder-Rotavirus und nach einer zweifachen Herausforderung mit Rinder-Rotavirus mit C. parvum zu vergleichen.
  • Vier Gruppen von 6 Kälbern werden verwendet, um ausreichend Daten zu ergeben, um im Stande zu sein die Unterschiede in den Fällen klinischer Zeichen zwischen den Gruppen herauszufinden.
  • Kühe werden einzeln in Einzäunungen oder Koppeln gehalten. Neugeborene Kälber werden von ihren Muttertieren sobald wie möglich nach der Geburt getrennt, untersucht, um Stuhl oder Schmutz auf dem Kalb zu entfernen und ihre Nabelschnüre werden in ungefähr 7% Jodlösung getaucht. Sie werden dann sofort in Sicherheitsunterkünfte gebracht und einzeln in Soffwechselverschlägen beherbergt. Kälber werden innerhalb von 6 Stunden nach der Geburt herausgefordert.
  • Kälber werden zweimal täglich für den gesamten Test, pro Fütterung mit 1 bis 2 Viertelgallonen oder 10% Körpergewicht gefüttert, unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Milchersatzes mit 30% Kolostrumersatz. Es wird besonders darauf geachtet die Verabreichung von Milch innerhalb der ersten 2 Stunden vor oder nach der Herausforderung zu vermeiden.
  • Der Weg der natürlichen Infektion ist oral; daher werden alle Herausforderungen unter Verwendung einer oralen Ösophagusröhre verabreicht.
    Gruppe A: nicht-herausgeforderte Kontrollkälber.
    Gruppe B: 1–3 × 105 C. parvum-Oocyten (Stamm Beltsville) verdünnt in 60 ml an im Handel erhältlichen Antibiotika-freier Sojamilch.
    Gruppe C: Gleichzeitige Inokulation von 1–3 × 105 C. parvum-Oocyten (Stamm Beltsville), verdünnt in 60 ml im Handel erhältlichen Antibiotika-freier Sojamilch und von 10 ml Rinder-Rotavirus-Inokulum (Stamm IND BRV G6P5) verdünnt in 40 ml PBS.
    Gruppe D: 10 ml Stuhlfiltrat aus mit Rinderrotavirus infizierten Kälbern (Stamm IND BRV G6P5) verdünnt in 40 ml PBS.
  • Stuhlproben werden einmal am Tag aus der Sammelpfanne nach sorgfältigem Mischen entnommen, um sicherzustellen, dass eine repräsentative Probe erhalten wird.
  • Die Oocyten werden aus dem Kälberstuhl durch Zentrifugation auf Sucrosekissen abgetrennt und unter Verwendung einer Zellzählkammer (Hämocytometer) unter dem Mikroskop gezählt. Für das Rotavirus-Shedding werden die Stühle in Puffer verdünnt und das Rotavirusantigen wird unter Verwendung eines ELISA-Kits von Le Centre d'Economie Rurale (CER) 1 rue du Carmel, B6900 Marloie, Belgien, quantifiziert.
  • Die Kälber werden vor der Herausforderung auf klinische Zeichen untersucht und dann zweimal täglich für 10 Tage nach der Herausforderung. Die Beobachtungen umfassen die rektale Temperatur, den allgemeinen Zustand, Anorexie, Durchfall, Dehydrierung und Tod.
  • Depression, Durchfall und Dehydrierung werden wie folgt klassifiziert: Allgemeiner Zustand:
    Gut das Kalb ist aufgeweckt, munter und reagierend,
    Apatisch das Kalb ist still, munter und reagierend
    Depression das Kalb liegt auf der Seite, zögernd beim Aufstehen und reagiert nur langsam
    Erschöpfung das Kalb ist zusammengeringelt oder erschöpft oder reagiert nicht
    Dehydrierung:
    Keine keine Dehydrierung
    Geringfügig bestehen bleibende Falten der Haut, trockenes Maul und eingesunkene Augäpfel
    Schock Schockzustand
    Durchfall:
    Keiner normaler Stuhl
    Weich zähflüssiger oder schleimiger Stuhl
    Flüssig flüssiger Stuhl
  • Anorexie wird basierend darauf bestimmt, ob das Kalb weniger als zwei Liter Milch zu sich nimmt. Während der ersten 48 Stunden des Lebens können die Kälber über ein Ösophagusrohr gefüttert werden.
  • Die Punktezahl wird für jedes Kalb an jedem Tag erhalten, basierend auf der Anwesenheit von klinischen Zeichen (bewertet als 1) und der Abwesenheit (bewertet als 0) für jede Krankheitskategorie.
  • Die rektale Temperatur wird in Fahrenheit gemessen. Zwei Kälber sind in Gruppe C an den Tagen 7 und 8 gestorben, zwei in der Gruppe B am Tag 7 und keines in Gruppe D und eines in Gruppe A am 3. Tag.
  • Die Ergebnisse werden in den 7 bis 13 gezeigt.
  • Ein synergistischer Effekt auf klinische Anzeichen und Mikroorganismenausscheidung im Stuhl ist beobachtet worden wenn beide Mikroorganismen verabreicht wurden im Vergleich zu einzelnen Verabreichungen.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001

Claims (22)

  1. Kombinierte enterische immunologische Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung umfassend: ein erstes Antigen oder Epitop von Interesse aus Cryptosporidium parvum und/oder einen Vektor, welcher das erste Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert, wobei das erste Antigen oder Epitop von Interesse eine oder mehrere Untereinheiten von Cryptosporidium parvum-Antigenen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P21, Cp23, Cp15/60, CP41 und Gemischen davon ist/sind, und ein zweites Antigen oder Epitop von Interesse von einem anderen enterischen Pathogen und/oder den ersten Vektor, welcher das erste Antigen oder Epitop von Interesse sowie das zweite Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert, und/oder einen zweiten Vektor, welcher das zweite Antigen oder Epitop von Interesse exprimiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger; wobei das Antigen des enterischen Pathogens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Antigenen von E. coli, Rotavirus, Coronavirus und Gemischen davon.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das enterische Pathogen E. coli umfasst.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Antigen von E. coli ein Antigen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das K99-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das F41-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das Y-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das 31A-Antigen trägt, K99-Antigen, F41-Antigen, Y-Antigen, 31A-Antigen und Gemischen davon.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das E. coli-Antigen ein K99-Antigen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das K99-Antigen trägt, K99-Antigen und Gemischen davon; und/oder ein F41-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das F41-Antigen trägt, F41-Antigen und Gemischen davon.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das E. coli-Antigen ein K99-Antigen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das K99-Antigen trägt, K99-Antigen und Gemischen davon; und einem F41-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das F41-Antigen trägt, F41-Antigen und Gemischen davon; und einem Y-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das Y-Antigen trägt, Y-Antigen und Gemischen davon.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das enterische Pathogen Rinder-Coronavirus umfasst.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das enterische Pathogen Rinder-Rotavirus umfasst.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das enterische Pathogen E. coli, Rinder-Rotavirus und Rinder-Coronavirus umfasst.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Antigen des enterischen Pathogens ein oder mehrere E. coli-Antigene umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das K99-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das F41-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das Y-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das 31A-Antigen trägt, K99-Antigen, F41-Antigen, V-Antigen, 31A-Antigen und Gemischen davon; inaktiviertes Rinder-Coronavirus; ein oder mehrere E. coli-Antigene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das K99-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das F41-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das Y-Antigen trägt, inaktiviertem E. coli, welches das 31A-Antigen trägt, K99-Antigen, F41-Antigen, Y-Antigen, 31A-Antigen und Gemischen davon; inaktiviertes Rinder-Coronavirus; und inaktiviertes Rinder-Rotavirus.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das eine oder mehrere E. coli-Antigen(e) ein K99-Antigen umfasst(en), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das K99-Antigen trägt, K99-Antigen und Gemischen davon; und/oder ein F41-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das F41-Antigen trägt, F41-Antigen und Gemischen davon.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das E. coli-Antigen ein K99-Antigen umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das K99-Antigen trägt, K99-Antigen und Gemischen davon; und ein F41-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das F41-Antigen trägt, F41-Antigen und Gemischen davon; und ein Y-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus inaktiviertem E. coli, welches das Y-Antigen trägt, Y-Antigen und Gemischen davon.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung die E. coli-Antigene K99 und F41 umfasst.
  13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das erste Antigen oder Epitop von Interesse Cp23 und Cp15/60 ist.
  14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das erste Antigen oder Epitop von Interesse P21 und Cp15/60 ist.
  15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welche ein Adjuvans umfasst.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Adjuvans Saponin oder Aluminiumhydroxid umfasst.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Adjuvans in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion vorliegt.
  18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Zusammensetzung als kombinierte enterische immunologische Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung für Rinder, Hunde, Katzen, oder Pferde verwendet wird.
  19. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 für die Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und/oder Behandlung und/oder Kontrolle von Cryptosporidium parvum-Infektionen und/oder enterischen Infektionen in Tieren.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Tier ein rinderartiges Tier ist.
  21. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend das Zusammenmischen von Antigenen oder Epitopen oder Vektoren und einem Träger.
  22. Kit für die Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend die Antigene, Epitope oder Vektoren, welche in einem separaten Behälter oder Behältern vorliegen, und welche gegebenenfalls zusammengepackt sind; und weiterhin gegebenenfalls mit Anweisungen für das Zusammenmischen und/oder die Verabreichung.
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