KR20040030783A - 마이코플라즈마 보비스 백신 및 동물에서의 폐렴 감소 방법 - Google Patents

마이코플라즈마 보비스 백신 및 동물에서의 폐렴 감소 방법 Download PDF

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로빈 리 케이취
데이비드 로쓰 맥가빈
로버트 존 얀세이
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화이자 프로덕츠 인크.
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Abstract

본 발명은, 마이코플라즈마 보비스 백신 및, 마이코플라즈마 보비스 백신의 유효량을 동물에게 투여함으로써 마이코플라즈마 보비스 감염에 의해 유발된 동물의 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 마이코플라즈마 보비스 백신은 완전 또는 부분 세포로 이루어진 불활성화 또는 변성된 생 제제, 소단위 백신, 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 본 발명에 따라 투여된 마이코플라즈마 보비스 백신은 합성되거나 재조합에 의해 생성될 수 있다. 본 발명은 또한 조합 백신, 마이코플라즈마 보비스 백신의 제조 방법, 및 키트에 관한 것이다.

Description

마이코플라즈마 보비스 백신 및 동물에서의 폐렴 감소 방법 {MYCOPLASMA BOVIS VACCINE AND METHODS OF REDUCING PNEUMONIA IN ANIMALS}
마이코플라즈마 보비스는 집에서 기르거나 집단 사육되는 소 및 젖소에서 중요한 전세계적인 소 병원체이다. 가장 빈번하게 보고된 임상 징후는 종종 관절염을 수반하는 송아지의 폐렴이고, 이것은 또한 폐렴-관절염 증후군으로서 알려져 있다. 그의 병인학적 역할은 암소 및 황소의 유방염, 이염, 및 생식 질병 또는 질환과 연관되어 있다. 소 호흡기 질병(BRD)에 기인한 사망률의 최대 36％가 엠. 보비스(M. bovis)와 관련이 있기 때문에, 엠. 보비스 유발 호흡기 질병으로 인해 상당한 경제적 손실이 유발된다. 사망률을 감소시키기 위하여, 완전히 인가된 백신이 현재 없기 때문에, 항생물질 요법이 종종 사용된다. 엠. 보비스 질병의 예방은 다른 호흡기 질병으로의 동물의 소인을 감소시킬 수도 있다. 따라서, 매우 효능이 있고 어린 송아지에게 안전한 엠. 보비스 박테린(bacterin)이 목축 산업을 위해 매우 중요하다.
발명의 요약
본 발명은, 마이코플라즈마 보비스 백신 및, 유효량의 마이코플라즈마 보비스 백신과 제약학적으로 허용가능한 담체를 동물에게 투여함으로써 마이코플라즈마 보비스 감염에 의해 유발된 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 백신은 마이코플라즈마 보비스에 특이적인 세포성 또는 체액성의 1차 및 2차 면역 반응을 유발하거나 증가시키기에 충분한 양으로 제공된다. 하나의 측면에서, 동물은 송아지이다. 본 발명의 예방접종 방법은 엠. 보비스 항원투여에 대항한 보호를 송아지에게 제공한다. 또한, 마이코플라즈마 보비스 백신을 사용하는 본 발명의 예방접종 방법은 송아지의 면역능을 증가시키고, 이에 의해 다른 BRD 병원체에 대한 증가된 내성, 예를들어 이에 한정되지는 않지만 1형 소 헤르페스바이러스(BHV-1), 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 소 호흡기 세포융합(syncitial) 바이러스(BRSV), 파라인플루엔자 바이러스(P13), 파스퇴렐라 멀토사이다(Pasteurella multocida), 해모필루스 솜너스(Haemophilus somnus), 마이코플라즈마 마이코이데스(Mycoplasma mycoides), 마이코플라즈마 아갈락티애(Mycoplasma agalactiae), 마이코플라즈마 캘리포니컴(Mycoplasma californicum), 마이코플라즈마 보비리니스(Mycoplasma bovirhinis), 마이코플라즈마 디스파르(Mycoplasma dispar), 마이코플라즈마 캐니스(Mycoplasma canis) 및 만헤이미아 해모리티카(Manheimia haemolytica)에 의해 유발되는 감염 및 질병에 대한 감소된 소인을 제공한다. 본 발명은 또한 마이코플라즈마 보비스 백신, 및 유효량의 마이코플라즈마 보비스 백신 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 동물에게 투여함으로써 감염된 무리로부터 마이코플라즈마 보비스를 박멸하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 투여된 마이코플라즈마 보비스 백신은, 아쥬반트 및 임의로 조합 백신에서 사용하기 위한 제2의 또는 그 이상의 항원들과 같은 추가의 성분을 포함할 수도 있다. 제2의 항원은, 이에 한정되지는 않지만 1형 소 헤르페스바이러스(BHV-1), 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 소 호흡기 세포융합 바이러스(BRSV), 파라인플루엔자 바이러스(P13), 파스퇴렐라 멀토사이다, 해모필루스 솜너스, 마이코플라즈마 마이코이데스, 마이코플라즈마 아갈락티애, 마이코플라즈마 캘리포르니컴, 마이코플라즈마 보비리니스, 마이코플라즈마 디스파르, 마이코플라즈마 캐니스 및 만헤이미아 해모리티카를 포함한 것에서 선택된다.
본 발명은 또한 적절한 배지중의 배양액에서 마이코플라즈마 보비스의 단리물을 생육시키고, 마이코플라즈마 보비스를 2원 에틸렌이민으로 처리하여 마이코플라즈마 보비스를 불활성화시키고, 불활성화된 마이코플라즈마 보비스를 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 박테린을 제제화하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 보비스 백신의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 마이코플라즈마 보비스 및 아쥬반트 및 임의로 이에 한정되지는 않지만 1형 소 헤르페스바이러스(BHV-1), 소 바이러스성 설사바이러스(BVDV), 소 호흡기 세포융합 바이러스(BRSV), 파라인플루엔자 바이러스(P13), 파스퇴렐라 멀토사이다, 해모필루스 솜너스, 마이코플라즈마 마이코이데스, 마이코플라즈마 아갈락티애, 마이코플라즈마 캘리포르니컴, 마이코플라즈마 보비리니스, 마이코플라즈마 디스파르, 마이코플라즈마 캐니스, 및 만헤이미아 해모리티카를 포함하는 것에서 선택된 항원을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis) 백신 제제 및 마이코플라즈마 보비스 감염에 의해 유발된 동물의 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 마이코플라즈마 보비스 백신은 완전 또는 부분 세포로 이루어진 불활성화 또는 변성된 생 제제, 소단위 백신, 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 본 발명에 따라 투여된 마이코플라즈마 보비스 백신은 합성될 수 있거나 재조합에 의해 생성될 수 있다.
도 1은 실험적 엠. 보비스 항원투여 직전 및 후에 군의 평균 체온을 나타내는 그래프이다. 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량으로 예방접종된 송아지(A 군)는, 위약 예방접종된 동물(B 군)과 비교할 때, 4-8일, 10-18일 및 20일에 유의하게 낮은 평균 체온을 나타냈다.
도 2는 실험적 엠. 보비스 항원투여 직전 및 후에 군의 평균 체온을 나타내는 그래프이다. 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량으로 예방접종된 송아지(A, B 및 C 군)는 위약 예방접종된 동물(D 군)과 비교할 때, 7-17일에 유의하게 낮은 평균 체온을 나타냈다.
도 3은 실험적 엠. 보비스 항원투여 직전 및 후에 군의 평균 체온을 나타내는 그래프이다. 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량으로 예방접종된 송아지(처리군 2, 3, 4 및 5)는, 위약 예방접종된 동물(처리군 1)과 비교할 때, 5-20일에 유의하게 낮은 평균 체온을 나타냈다.
본 발명은, 유효량의 불활성화된 마이코플라즈마 보비스 백신 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 보비스 감염에 의해 유발된 동물의 질병 또는 질환의 치료 또는 예방 방법 및 백신을 포함한다. 본 발명은 엠. 보비스 백신 및 엠. 보비스 백신 키트의 제조 방법을 포함한다. 마이코플라즈마 보비스 균주의 예는 ATCC 25025 (1968년 10월 8일에 R. G. Wittler에 의해 기탁됨), 25523 (1969년 10월 22일에 R. G. Wittler에 의해 기탁됨) 및 27368 (1972년 7월 5일에 R. G. Wittler에 의해 기탁됨)이며, 이 기탁물은 모두 미국 20110-2209 버지니아주 매나사스 유니버시티 블러버드 1801의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 바람직한 구현양태에서, 박테린의 마이코플라즈마 보비스 단리물은 하나 이상의 하기 균주를 포함한다: 2300, 3625, 16150, 20518 또는 5063.
본 발명은, 불활성화된 마이코플라즈마 보비스 단리물이 효과적인 박테린으로 제제화될 수 있는 것으로 예상한다. 바람직한 구현양태에서, 2원 에틸렌이민(BEI)으로 불활성화된 마이코플라즈마 보비스 단리물은 효과적인 박테린으로 제제화될 수 있다. 마이코플라즈마 보비스 단리물 균주 2300, 3625, 16150, 20518 또는 5063의 기탁은, 특허절차 목적을 위한 국제 미생물 기탁 인증에 관한 부다페스트 조약에 따라서, 미국 20110-2209 버지니아주 매나사스 유니버시티 블러버드 1801의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었고, 각각 균주 PTA-3558, -3559, -3560, -3561 및 -3685로 명명되었다.
특정한 구현양태에서, 본 발명의 방법에서 사용된 백신은 부분 또는 완전 세포로 이루어진 엠. 보비스 불활성화 제제(박테린) 또는 변성 생 백신 및 제약학적으로 허용가능한 담체, 또는 부분 또는 완전 세포로 이루어진 엠. 보비스 불활성화 제제(박테린) 또는 변성 생 백신 및 아쥬반트를 포함한다.
제한을 위한 것이 아니라 개시내용의 명확성을 위하여, 본 발명의 상세한 설명을 다음과 같이 본 발명의 특정한 특징, 구현양태 또는 응용을 설명하는 소단락으로 나눈다.
정의 및 약어
종의 이름 앞에 있는 약어 엠(M).은 마이코플라즈마 속을 가리킨다.
여기에서 사용된 마이코플라즈마 보비스 감염에 관한 용어 "치료 또는 예방"은 마이코플라즈마 보비스 세균의 복제를 억제하거나, 마이코플라즈마 보비스의 번식 또는 전염을 억제하거나, 또는 숙주에서 마이코플라즈마 보비스 자체가 정착하는 것을 막고, 마이코플라즈마 보비스 감염에 의해 유발된 질병 또는 질환의 증상을 경감시키거나, 동물로부터 엠. 보비스의 제거를 촉진하는 것을 의미한다. 치료는, 세균 부하를 감소시키고, 폐 감염을 저하시키고, 폐 병변을 감소시키고, 직장 온도를 감소시키고(거나) 체중 획득 및(또는) 성장을 증가시킨다면 치료적인 것으로 간주된다. 본 발명의 방법은 예를들어 폐렴, 호흡기 감염 및 폐 병변을 예방 또는 감소시키고, 폐에서의 엠. 보비스 수준을 감소시키고, 온도를 감소시키고, 동물, 특히 소에서의 체중 획득을 증가시키는데 효과적이다.
여기에서 사용된 용어 "엠. 보비스 백신"은, 엠. 보비스 감염에 의해 유발된 질환 또는 질병을 예방 또는 치료하는데 유용한 백신을 가리킨다. 엠. 보비스 백신은 독성 엠. 보비스에 의해 소에서의 감염을 치료 또는 예방하는데 효과적인 백신을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엠. 보비스 백신은 예를들어 완전 또는 부분 엠. 보비스 세포 제제, 불활성화 또는 변성된 생 백신, 하나 이상의 엠. 보비스 유래 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이러한 단백질 또는 폴리펩티드의 면역원성 단편을 갖는 소단위 백신, 또는 하나 이상의 엠. 보비스 유래 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그의 면역원성 단편을 암호화하고, 소에서 생체내 발현될 수 있는 하나 이상의 엠. 보비스 유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 엠. 보비스 폴리펩티드, 단백질, 이러한 폴리펩티드 및 단백질의 면역원성 단편, 또는 엠. 보비스 유전자 또는 핵산은 당 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 합성되거나 재조합에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용된 엠. 보비스 백신은 박테린이다.
여기에서 사용된 용어 면역원성 단편은, 숙주 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 엠. 보비스로부터의 단백질 단편을 가리킨다. 면역 반응은 제한없이 세포성 및(또는) 체액성 면역의 유발을 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "동물"은 포유동물을 포함하여 모든 비-인간 동물을 가리킨다.
여기에서 사용된 용어 "소"는, 이에 한정되지 않지만 거세한 수송아지, 황소, 암소 및 송아지를 포함하는 소과의 동물을 가리킨다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 비-인간 포유동물인 동물, 가장 바람직하게는 송아지에 적용된다.
여기에서 사용된 용어 "박테린"은 백신으로서 사용하기에 적합한, 불활성화된 완전 또는 부분 엠. 보비스 세포의 제제를 가리킨다.
용어 "면역학적 유효량"은, 백신이 투여되는 피험체에서 면역 반응을 이끌어 내기에 충분한 엠. 보비스 백신의 양을 가리킨다. 면역 반응은 제한없이 세포성 및(또는) 체액성 면역의 유발을 포함할 수 있다. 엠. 보비스 백신의 유효량은 예를들어 박테린이 마이코플라즈마 폐렴의 중증을 예방 또는 감소시킨다는 것을 의미한다.
여기에서 사용된 용어 "아쥬반트"는 면역 반응의 증강제이다.
용어 "제약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고, 화학적으로 불활성이고, 투여되는 피험체에게 독성이 아닌, 담체 매질을 가리킨다.
불활성화(부분 또는 완전 세포) 및 변성된 생 백신
본 발명은, 마이코플라즈마 보비스 백신 및, 적절한 배지 중의 배양액에서 마이코플라즈마 보비스의 단리물을 생육시키고, 마이코플라즈마 보비스를 2원 에틸렌이민으로 처리하여 마이코플라즈마 보비스를 불활성화시키고, 불활성화된 마이코플라즈마 보비스를 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 박테린을 제제화하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 보비스 백신의 제조 방법을 제공한다. 하나의 구현양태에서, 마이코플라즈마 보비스가 폐 조직으로부터 단리된다. 다른 구현양태에서, 마이코플라즈마 보비스가 림프절 조직으로부터 단리된다. 이러한 각종 담체들이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 증류수 또는 탈이온수, 염수 또는 미네랄수가 포함된다. 불활성화 세균 단리물 이외에도, 박테린 생성물은 적절한 양의 하나 이상의 일반적으로 사용되는 아쥬반트를 포함할 수 있다. 적절한 아쥬반트는 광물 겔, 예를들어 수산화알루미늄; 리조레시틴과 같은 표면 활성 물질; 글리코시드, 예를들어 사포닌 및 사포닌 유도체, 예컨대 퀼(Quil) A 또는 GPI-0100; 양이온성 계면활성제, 예를들어 DDA(4급 탄화수소 암모늄 할로게나이드, 플루론 폴리올; 다음이온 및 다원자 이온; 폴리아크릴산, 비-이온성 블록 중합체, 예를들어 플루로닉(Pluronic) F-127 (B.A.S.F., USA); 아브리딘 및 란티딘; 펩티드; 재조합 변이성 불안정 독소, 예를들어 류코톡신(LT) 또는 콜레라 독소(CT); 화학적으로 결합되거나 근접한 분자 수송체; 광물유, 예를들어 몬타나이드(Montanide) ISA-50 (프랑스 파리의 셉픽(Seppic)), 카르보폴, 암피겐(Amphigen) (미국 하이드로닉스(Hydronics)), 오마하(Omaha) (미국 NE.), 알히드로겔(Alhydrogel) (덴마크 프레데릭선드, 수퍼포스 바이오섹터(Superfos Biosector)), 오일 유화액, 예를들어 바이올F/알라셀A (Bayol F/Arlacel A) 및 물과 같은 광물유의 유화액, 또는 식물성유, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 알룸, 콜레스테롤 사이토카인 및 아쥬반트들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 다원자 이온은 분산제, 증점제 및 고화방지제로서 작용할 수 있고, 장기간에 걸친 침강 후에 단분산 현탁액으로서 백신을 재현탁시킬 수 있다. 아쥬반트 조합이 수성의 캡슐화되거나(조절 방출 또는 지연 방출) 또는 마이크로캡슐화 형태로 존재할 수 있다. 면역원은 리포좀 내에 혼입될 수 있거나, 또는 백신 제제에서 사용하기 위한 다당류 및(또는) 기타 중합체에 접합될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 박테린 생성물에 포함될 수 있는 추가의 물질은 예를들어 하나 이상의 보존제, 예컨대 에틸렌-디아민 테트라 아세트산(EDTA)의 디소듐 또는 테트라소듐 염, 메티올레이트 등을포함한다. 백신은 액체 투여형태로 제제화될 수 있거나, 사용 전에 제약학적으로 허용가능한 희석제에 재현탁되는 가용성 성분 또는 미립자를 구성하는 고체 투여형태로 존재할 수 있다. 가용성 성분 또는 미립자의 제조 방법은 바이아서베이션(biacervation), 응고, 분무 건조, 기포 건조, 침전, 초임계 용매화/캡슐화 및 동결건조를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 구현양태에서, 2300으로 명명된 마이코플라즈마 보비스 단리물이 박테린을 제제화하는데 사용된다. 추가의 바람직한 구현양태에서, 퀼 A, 암피겐 및 콜레스테롤의 아쥬반트 조합이 박테린을 제제화하는데 사용된다.
단리물이 생육되는 정확한 조건은, 배지의 정확한 조성 및 생육되는 특정 단리물에 의존하여 변할 수 있다. 그러나, 단리물은 전형적으로 배양 시간으로부터 회수 시간까지 측정하여 약 24시간 내지 약 72시간동안 생육된다. 이렇게 생육된 독성 마이코플라즈마 보비스 단리물을, 미국 특허 5,565,205호에 기재된 바와 같이 2원 에틸렌이민(BEI)으로 처리하여 마이코플라즈마 보비스를 불활성화시키거나, 또는 당 기술분야에 공지된 포르말린, 글루타르알데히드, 열, 방사선조사, BPL 또는 기타 불활성화제를 사용하여 불활성화시킨다. 예를들어, 단리물을 BEI로 처리하는 경우에, 단리물의 배양액을 약 2 내지 약 10mM의 농도에서 BEI와 접촉시킬 수 있다. 이어서, 배양액을 마이코플라즈마 보비스를 불활성화시키기에 효과적인 조건하에서 예를들어 약 37℃에서 약 24시간 이상동안 배양시킨다. 이어서, BEI 배양액을 효과적인 중화 농도, 예를들어 2 내지 10mM로 티오황산나트륨을 첨가함으로써 중화시킨다.
얻어지는 불활성화 마이코플라즈마 보비스를 농축할 수도 있다. 이러한 유기체를 농축하기 위해 다양한 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를들어, 유기체를 원심분리, 예를들어 초원심분리에 의해, 또는 여과, 예를들어 한외여과에 의해 농축할 수도 있다.
얻어지는 농축되고 불활성화된 마이코플라즈마 보비스를 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 회수한다. 최종적으로, 이렇게 회수되는 농축되고 불활성화된 마이코플라즈마 보비스를 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 박테린을 제제화한다. 당업자에게 잘 알려져 있는 상기 방법에 대한 여러 변형에 의해 박테린을 제조할 수도 있다.
공지된 기술을 사용하여 감염된 소 폐 병변으로부터 엠. 보비스 단리물을 직접적으로 수득할 수 있다. 공지된 기술을 사용하여 감염된 소 림프절 조직으로부터 엠. 보비스 단리물을 직접적으로 수득할 수도 있다. 또한, 공지된 기술을 사용하여 감염된 소 림프절 조직으로부터 엠. 보비스 단리물을 직접적으로 수득할 수도 있다. 본 발명은 또한, 예컨대 계대배양에 의한 독성 균주의 약독화에 의해 변성된 생 엠. 보비스 백신을 제조하는 것을 포함하며, 이 기술은 당 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 백신의 적절한 제제는 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사액을 포함하고; 주사 전에 액체 중에서 용액 또는 현탁액을 만들기에 적절한 고체 형태를 제조할 수도 있다. 제제는 유화될 수도 있다.
불활성화 마이코플라즈마 보비스 단리물은, 이에 한정되지는 않지만 1형 소헤르페스바이러스(BHV-1), 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 소 호흡기 세포융합 바이러스(BRSV), 파라인플루엔자 바이러스(P13), 파스퇴렐라 멀토사이다, 해모필루스 솜너스, 마이코플라즈마 마이코이데스, 마이코플라즈마 아갈락티애, 마이코플라즈마 캘리포르니컴, 마이코플라즈마 보비리니스, 마이코플라즈마 디스파르, 마이코플라즈마 캐니스, 및 만헤이미아 해모리티카를 포함하는, 세균 및 바이러스와 조합될 수도 있다.
소단위 백신
본 발명의 방법은 정제된 엠. 보비스 면역원성 단백질, 폴리펩티드 및 이러한 단백질 및 폴리펩티드의 면역원성 단편을 가진 소단위 백신을 사용하여 실행될 수 있다. 이러한 단백질 및 폴리펩티드는 당 기술분야에 공지된 기술을 사용하여, 예를들어 표면 작용제, 또는 열, 화학적 및 기계적 추출물을 사용하여 제조된 추출물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단백질 순도 또는 균일성을 결정하기 위해 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있고, 예컨대 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 이어서 염색 겔 위의 단일 폴리펩티드 띠를 눈으로 확인한다. 당 기술분야에 공지된 HPLC 또는 기타 유사한 방법을 사용하여 더욱 높은 분해능을 결정할 수 있다.
특정한 구현양태에서, 본 발명에서 사용된 백신은 엠. 보비스의 적어도 하나의 단백질, 예컨대 이것에 한정되지는 않지만 P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46, P50, P54-58, P77, P82, P87-89, P97 및 P175을 포함한다.
다른 구현양태에서, 본 발명의 소단위 백신은 엠. 보비스 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 면역원성 단편이 아닌 하나 이상의 다른 면역원성 또는 항원성 분자, 바람직하게는 바이러스성 또는 세균성 항원을 포함한다. 바람직한 구현양태에서, 항원은 1형 소 헤르페스바이러스(BHV-1), 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 소 호흡기 세포융합 바이러스(BRSV), 파라인플루엔자 바이러스(P13), 파스퇴렐라 멀토사이다, 해모필루스 솜너스, 마이코플라즈마 마이코이데스, 마이코플라즈마 아갈락티애, 마이코플라즈마 캘리포르니컴, 마이코플라즈마 보비리니스, 마이코플라즈마 디스파르, 마이코플라즈마 캐니스, 및 만헤이미아 해모리티카이다. 이러한 조성물은 조합 백신으로서 유용하다. 본 발명의 소단위 백신 및 조합 백신은 엠. 보비스 감염에 의해 유발된 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
추가의 특정한 구현양태에서, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드의 면역원성 단편은, 이에 한정되지 않지만 P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46, P50, P54-58, P77, P82, P87-89, P97 및 P175를 포함하는 본 발명의 방법에서 사용되는 면역원성 단백질 및 폴리펩티드의 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 서열을 갖는다.
또한, 백신에서 사용하기 위한 엠. 보비스 단백질은 실질적으로 순수하거나 균일하다. 본 발명의 방법은, 이러한 단백질을 암호화하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 발현하는 숙주 세포로부터 정제된 단백질 또는 폴리펩티드를 사용한다. 이러한 단백질 정제는 당 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를들어, 문헌 ["Methods In Enzymology", 1990, Academic Press,Inc., SanDiego, "Protein Purification: Principles and practice", 1982, Springer-Verlag, New York]에 기재된 기술을 참조한다.
또한, 정제된 엠. 보비스 폴리펩티드 및 단백질 및 그의 면역원성 단편은 공지된 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
엠. 보비스 폴리펩티드 및 단백질 및 그의 면역원성 단편은 아데노바이러스 또는 살모넬라(Salmonella)와 같은 생 재조합 바이러스성 및 세균성 벡터를 사용하여 발현되고 전달될 수 있다. 실제 벡터가 공지되어 있으며, 당 기술분야 내에서 쉽게 입수될 수 있거나, 잘 알려진 방법을 사용하여 당업자에 의해 구축될 수 있다.
유전자 및 핵산 백신
본 발명의 방법은, 면역원성 단백질, 폴리펩티드 및 이러한 단백질과 폴리펩티드의 면역원성 단편을 암호화하는 엠. 보비스 유전자 또는 핵산을 사용하여 실행될 수 있다. 이러한 유전자 및 핵산은 생체내에서 발현될 수 있고, 당 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
특정한 구현양태에서, 본 발명에서 사용되는 백신은, 엠. 보비스의 단백질, 예컨대 이에 한정되지는 않지만 P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46, P50, P54-58, P77, P82, P87-89, P97 및 P175를 암호화하는 하나 이상의 유전자 또는 핵산을 포함한다.
추가의 특정한 구현양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 유전자 또는 핵산은 엠. 보비스 단백질 또는 폴리펩티드의 면역원성 단편을 암호화하고, 이에 한정되지는 않지만 P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46, P50, P54-58, P77, P82, P87-89, P97 및 P175을 포함하는, 본 발명의 방법에서 사용되는 면역원성 단백질 및 폴리펩티드의 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 포함한 서열을 갖는다.
본 발명의 방법의 다른 구현양태에서, 사용되는 유전자 또는 핵산은 공지된 방법에 의해, 예를들어 유전자 건(gene gun) 또는 기타 바늘이 없는 전달 장치를 사용하여 투여된다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현양태에서, 사용되는 유전자 또는 핵산은 DNA 백신이다. 또한, 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 핵산 또는 유전자가 리포좀 또는 기타 형질감염 촉진제와 함께 존재할 수 있다.
DNA 백신의 제조 및 전달 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를들어 문헌 [Krishnan, B.R., "Current Status of DNA vaccines in veterinary medicine", Advanced Drug Delivery Reviews, Elsevier Science (2000)] 참조.
투여량, 투여 방식 및 처치
본 발명에 따르면, 동물, 바람직하게는 대략 생후 1 내지 10주의 송아지에게 엠. 보비스 백신의 유효량을 1회 이상의 투여량으로 투여하는 것이, 엠. 보비스의 이후 항원투여에 대항하여 효과적인 면역성을 제공한다. 바람직하게는, 엠. 보비스 백신을 생후 약 7 내지 28일에, 다시 약 28 내지 48일에 투여한다. 엠. 보비스 박테린 백신의 유효량은 투여량 당 약 1×106내지 약 5×1010콜로니 형성단위(CFU)를 함유한다. 바람직하게는, 효과적인 면역성을 제공하는 엠. 보비스 박테린 백신은 약 1×108내지 약 5×1010CFU/투여량, 더욱 바람직하게는 약 5×108내지 약 5×1010CFU/투여량을 함유한다.
본 발명에 따르면, 투여를 위한 엠. 보비스 박테린 백신의 유효량은 약 0.5 내지 약 5.0ml, 바람직하게는 약 1.5ml 내지 약 2.5ml, 더욱 바람직하게는 약 2ml이다.
본 발명의 방법에서 효과적인 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이러한 단백질 또는 폴리펩티드의 면역학적 단편을 포함하는 소단위 백신인 엠. 보비스 백신의 양은, 약 0.01㎍ 내지 약 200㎍이다.
본 발명의 방법에서 효과적인 면역원성 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이러한 단백질 또는 폴리펩티드의 면역원성 단편을 암호화하는 하나 이상의 엠. 보비스 유전자 또는 핵산(바람직하게는 DNA)을 포함하는 백신인 엠. 보비스 백신의 양은 약 0.1㎍ 내지 약 200mg이다. 본 발명에 따르면, 경구, 비내, 점막, 국소, 경피 및 비경구 (예를들어, 정맥내, 복강내, 피내, 피하 또는 근육내)를 포함한 공지된 경로에 의해 투여를 달성할 수 있다. 투여는 바늘이 없는 전달 장치를 사용하여 달성될 수 있다. 경로의 조합을 이용하여, 예를들어 비경구 경로를 이용한 첫번째 투여 및 점막 경로를 이용한 이후 투여에 의해 투여를 달성할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 피하 또는 근육내 투여이다.
본 발명은 또한, 엠. 보비스에 대항한 면역성을 발생 및(또는) 유지시키기위해 송아지에게 추가 투여량을 투여할 필요가 없는, 1회 투여량 예방접종 방법을 포함한다.
본 발명에 따르면, 생후 약 3 내지 6주에서 송아지에게 마이코플라즈마 보비스 박테린의 유효량을 투여하면, 폐렴을 포함한 호흡기 감염에 대한 효과적인 면역성을 제공하고, 폐 병변을 감소시키고, 폐에서 엠. 보비스의 수준을 감소시키고, 체온을 낮추고, 체중 획득을 증가시킨다.
본 발명은, 마이코플라즈마 보비스 감염에 대항하여 송아지를 면역화시키기 위해 적어도 1회 투여량, 바람직하게는 2회 투여량의 박테린을 송아지에게 투여하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 보비스 감염에 대해 송아지를 면역화시키는 방법을 제공한다. 바람직한 구현양태에서, 박테린을 피하 투여한다. 또한, 박테린 투여량이 약 2ml의 박테린을 포함하고, 각각의 1ml가 약 2.5×108개의 마이코플라즈마 보비스 콜로니 형성 단위를 함유하는 것이 바람직하다. 박테린은 송아지가 태어난 후에 송아지에게 2번 투여하는 것, 즉 약 3주에 한번 투여하고 약 6주에 한번 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명은, 이러한 동물에서 폐렴, 관절염, 유방염, 이염 및 생식 질환을 포함한 질환을 치료 또는 예방하기 위하여, 동물, 바람직하게는 소에게 마이코플라즈마 보비스 박테린의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
백신 키트
본 발명은, 본 발명의 백신 제제의 하나 이상의 성분들을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한 제약학적 키트를 제공한다. 본 발명은, 본 발명의 백신의 면역 유효량을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물을 면역화하거나, 또는 동물에서의 다양한 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현양태에서, 키트는 불활성화 마이코플라즈마 보비스 단리물 및 퀼 A 또는 GPI-0100, DDA, 사포닌, 콜레스테롤, 알루미늄 겔, 카르보폴, 암피겐, 알히드로겔, 수중유, 유중수, 사이토카인으로부터 선택된 아쥬반트 또는 아쥬반트들의 조합을 용기내에 포함한다. 다른 구현양태에서, 본 발명의 키트는 임의로, 이에 한정되지는 않지만 1형 소 헤르페스바이러스(BHV-1), 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 소 호흡기 세포융합 바이러스(BRSV), 파라인플루엔자 바이러스(P13), 파스퇴렐라 멀토사이다, 해모필루스 솜너스, 마이코플라즈마 마이코이데스, 마이코플라즈마 아갈락티애, 마이코플라즈마 캘리포르니컴, 마이코플라즈마 보비리니스, 마이코플라즈마 디스파르, 마이코플라즈마 캐니스 및 만헤이미아 해모리티카를 포함하는 것에서 선택되는 항원을, 동일한 용기 또는 제2의 용기내에 포함한다.
포장
백신 조성물은 원한다면 팩 또는 분배기 장치에 담아 제공될 수 있고, 이것은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 용량 형태를 함유할 수도 있다. 팩은 예를들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 포함할 수도 있다. 팩 또는 분배기 장치에는 투여 지시가 동봉될 수도 있다. 적합한 제약학적 담체 내에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조할 수도 있고, 적절한 용기에 위치시키고, 지시된 증상의 치료를 위해 라벨을 붙여 명시할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더 설명된다.
실시예 1
재료 및 방법
동물
예방접종을 위하여, 생후 약 14일의 건강한 교배종 젖소 송아지를 입수하였다. 연구 개시 전에 7일 동안 송아지를 순응시켰다. 모든 송아지에게, 알려진 어떠한 오염물이나 살충제를 함유하지 않는 농축된 비-약제첨가 상용사료를 먹이고 물에 자유롭게 접근하도록 하였다.
백신
박테린은 BEI 불활성화 완전 세포 엠. 보비스 세균을 투여량 당 적절한 농도로 함유하였다. 또한, 각각의 백신 제제는 인산염 완충 염수(PBS) 및 적절한 아쥬반트를 함유하였다. 위약은 PBS 또는 PBS와 수중유 아쥬반트를 함유하였다.
항원투여 방법
연속 3일 동안 비내 경로에 의해 신선한 엠. 보비스 배양액 [약 1×108내지 1×1010콜로니 형성 단위(CFU/ml)] 10ml 또는 12ml를 각각의 송아지에게 투여하였다. 각각의 실험적 항원투여를 완료한 직후에, 항원투여 접종물의 생균 수(CFU/ml)를 결정하였다.
실험 절차
각각의 송아지를 특유의 귀 꼬리표 번호로 표시하였다. 동물들을 연령에 의해 우리와 처리군으로 무작위 배분하였다.
동물들을 0일(좌측 목) 및 21일(우측 목)에 피하 경로에 의해 2ml의 적절한 백신 또는 위약으로 예방접종하였다.
항원투여 전 1일, 항원투여 후 7일, 항원투여 후 14일 및 항원투여 후 대략 3주에 모든 동물들의 체중을 재었다.
항원투여 전 1일, 항원투여 직전 및 항원투여 후 20일에 각각의 아침에 직장 온도를 측정하였다.
각 송아지의 경부 정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 첫번째 예방접종 전 약 1일, 두번째 예방접종 전 1일, 항원투여 전 1일(두번째 예방접종 후 약 3주), 항원투여 후 7일, 항원투여 후 14일, 및 부검시 (항원투여 후 약 3주)에 송아지들에게서 채혈하였다. 봄멜리 AG(Bommeli AG) (스위스 리에베펠트-베른 훽스트 루셀 베트 다이아그노스틱스 (Hoechst Roussel Vet Diagnostics))에 의해 제조된 엠. 보비스 ELISA 키트 (체키트 엠. 보비스 세로(Chekit M.bovis Sero))에 의해 평가할 때까지, 각각의 혈액 샘플로부터의 혈청을 -20℃에서 보관하였다. 405nm의 파장에서 멀티스캔(Multiscan) 판독기에 의해 ELISA 플레이트를 판독하였다. 하기 식: 퍼센트 = (샘플 OD - 네가티브 혈청 OD) / (포지티브 혈청 OD - 네가티브 혈청 OD) × 100을 사용하여, 광학 밀도(OD) 값을 포지티브 대조 혈청의 OD 값에 관련된 퍼센트로 전환하였다. 60％ 미만의 값은 네가티브로 간주되었다. 60 내지 80％의 퍼센트를 갖는 혈청은 의심스러운 것으로 간주되고, 80％ 초과의 OD를 나타내는 혈청은 포지티브로 인정되었다.
실험적 엠. 보비스 항원투여 후 약 3주에 모든 동물들을 부검하였다. 송아지를 안락사시키고, 중추신경계를 제외한 모든 주요 기관들을 전체적으로 검사하였다.
폐를 꺼내고, 엠. 보비스 감염에 기인한 특징적인 병변에 관해 육안으로 평가하였다. 표준 폐 다이아그램 위에 병변을 스케치하였다. 다음과 같은 각각의 폐 엽(lung lobe) 당 전체 폐 질량의 비율을 사용하여 각각의 폐 엽 당 육안적 연관성 퍼센트를 평가하였다.
폐 엽 폐의 퍼센트
좌측 위 5
우측 위 6
중간 5
좌측 아래 6
우측 아래 7
부이하선소엽 4
좌측 횡경막 32
우측 횡경막 35
이어서, 육안적 병변을 가진 전체 폐의 퍼센트를 결정하기 위하여, 평가된 폐 엽 값을 합하였다 (Pointon 등, 1992). 또한, 퍼센트 감소율을 계산하기 위하여 하기 식을 사용하였다.
100-처리군의 평균 퍼센트 폐 손상/대조군의 평균 퍼센트 폐 손상 = 퍼센트 감소율
또한, 각각의 폐를 50ml의 PBS로 세정하였다. 기관지 세정액으로부터의 엠. 보비스 생균수를 단리하고 결정하기 위한 시도를 행하였다. 기관지 세정액의 적절한 연속 희석액을 제조하고, 샘플을 적절한 한천 배지 위에 도말함으로써, 엠. 보비스 생균수 (CFU/ml)를 결정하였다.
실시예 2
이 실시예에서, 어린 송아지에서 엠. 보비스 박테린의 효능을 평가하였다. 24마리의 건강한 교배종 송아지를 연령에 따라 무작위 배분하였다.
0일(좌측 목) 및 21일(우측 목)에 피하 경로에 의해 2ml의 백신 또는 위약으로 동물을 예방접종하였다. 실험적 처리군 및 사용된 백신을 표 1에 나타낸다.
실험적 처리군
처리군 실험적 백신 (2ml 투여량) 동물 수
A 엠. 보비스(5 × 108CFU) + 암피겐 11
B 위약 (PBS + 암피겐) 13
두번째 예방접종 후 약 3주째에 상기 기재된 바와 같이 송아지에게 항원투여하였다. 연속 3일 동안 비내 경로에 의해 신선한 엠. 보비스 배양액 10ml를 각각의 송아지에 투여하였다.
엠. 보비스 실험적 항원투여의 완료 후 1시간 내에 각각의 항원투여 접종물의 생균 수(CFU/ml)를 결정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
마이코플라즈마 보비스 항원투여 접종물의 생균수 (CFU/ml)
항원투여 배양물 CFU/ml
1일 5.0 × 109
2일 1.0 × 109
3일 1.2 × 109
실험적 엠. 보비스 항원투여 전 1일, 항원투여 후 7일, 항원투여 후 14일, 및 항원투여 후 대략 3주에, 모든 동물들의 체중을 재었다. 결과를 표 3에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린이 투여된 송아지(처리군 A)는, 위약 예방접종된 군(처리군 B)과 비교할 때, 체중 획득이 증가하였다.
실험적 마이코플라즈마 보비스 항원투여 후의 체중 요약평균 체중(kg) ± 표준 편차
처리군 항원투여전 항원투여 후1주 항원투여 후2주 항원투여 후3주 체중 획득
A 94.8±12.9 98.7±13.9 107.3±13.6 114.6±12.9 19.8
B 104.0±15.6 106.8±14.7 109.9±14.1 113.0±14.7 9.0
실험적 엠. 보비스 항원투여 전 1일, 항원투여 직전 및 항원투여 후 20일 동안 각각의 아침에 직장 온도를 측정하였다. 결과를 도 1에 요약한다. 엠. 보비스 박테린으로 예방접종된 송아지(처리군 A)는, 위약 예방접종된 동물(처리군 B)과 비교할 때, 4-8일, 10-18일 및 20일에 더욱 낮은 평균 체온을 나타냈다.
엠. 보비스 특이적 혈청 항체 반응(IgG)을 표 4에 요약한다. 포지티브 대조 혈청의 80％ 초과의 평균 퍼센트 광학 밀도(OD) 값을 갖는 혈청 샘플을 엠. 보비스에 대해 포지티브인 것으로 간주하였다. 모든 송아지들은 예방접종 전에 엠. 보비스 네가티브였다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 A)는 두번째 예방접종 전에 엠. 보비스에 대해 혈청포지티브였고, 연구 전체 기간동안 혈청포지티브로 유지되었다. 처리군 B의 동물들 (위약으로 예방접종된 동물)은 실험적 엠. 보비스 항원투여 이후에 2주까지 혈청네가티브였다.
마이코플라즈마 보비스 혈청 항체(IgG)의 요약포지티브 대조 혈청에 대한 광학 밀도 값의 평균 퍼센트±표준 편차
처리군 예방접종전 두번째예방접종 전 항원투여전 항원투여 후1주 항원투여 후2주 항원투여 후3주
A 26.4±29.1 210.2±79.5 94.6 342.6±12.6 392.5±11.3 385.4±13.2
B 29.9±39.5 71.4±64.8 24.9±42.2 77.5±55.5 250.7±79.7 326.6±50.0
실험적 엠. 보비스 항원투여 후 약 3주째에 모든 동물들을 부검하였다. 폐를 꺼내고, 엠. 보비스 감염에 기인한 특징적인 병변에 대해 육안으로 평가하였다. 퍼센트 폐 손상 스코어 및 폐 병변의 퍼센트 감소를 표 5에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 A)는, 위약 예방접종 동물 (처리군 B)과 비교할 때, 폐 손상 스코어의 71.2 퍼센트 감소를 나타냈다. 이러한 결과는, 실험적 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량이 실험적 항원투여 후에 송아지에서 보호를 유발할 수 있음을 증명한다.
퍼센트 폐 손상 스코어의 요약평균 체중 퍼센트 ±표준 편차
처리군 퍼센트 폐 손상 퍼센트 감소
A 1.80±3.04 71.2
B 6.25±6.73 -
각각의 폐를 50ml의 PBS로 세정하였다. 실험적 엠. 보비스 항원투여 이후 약 21일에 기관지 세정 샘플로부터의 엠. 보비스의 단리 결과를 표 6에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여한 송아지(처리군 A)는, 위약 예방접종된 송아지(처리군 B)와 비교할 때, 폐 세정 샘플에서 감소된 발생빈도 및 감소된 수준의 생존가능한 엠. 보비스를 가졌다.
폐 세정 액으로부터 마이코플라즈마 보비스 단리 요약
처리군 엠. 보비스 포지티브 동물의 수 CFU/ml
A 3/11 3.27×102
B 13/13 2.41×106
결론적으로, 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 A)는, 위약 투여된 동물(처리군 B)과 비교할 때, 낮은 폐 병변을 발현하고, 직장 온도가 낮아지고, 체중 획득이 증가하였으며, 폐 세정 샘플로부터 단리된 생존 엠. 보비스 수준이 대략 4 로그 감소하였다. 결과는, 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량이 혈청학적 반응을 유발하고 엠. 보비스 실험적 항원투여로부터의 보호를 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
이 실시예에서, 어린 송아지에서 각종 엠. 보비스 박테린의 효능을 평가하였다. 58마리의 건강한 교배종 송아지를 연령에 따라 무작위 배분하였다.
0일(좌측 목) 및 21일(우측 목)에 피하 경로에 의해 적절한 백신 또는 위약 2ml로 동물을 예방접종하였다. 실험적 처리군 및 사용된 백신을 표 1A에 나타낸다.
두번째 예방접종 후 3주째에 상기 기재된 바와 같이 송아지에게 항원투여하였다. 연속 3일 동안 비내 경로에 의해 신선한 엠. 보비스 배양액 12ml를 각각의 송아지에게 투여하였다.
엠. 보비스 실험적 항원투여 완료 후 1시간 내에 각각의 항원투여 접종물의 생균수(CFU/ml)를 결정하였다. 결과를 표 2A에 나타낸다.
마이코플라즈마 보비스 항원투여 접종물의 생균수 (CFU/ml)
항원투여 배양물 CFU/ml
1일 2.2×109
2일 3.2×109
3일 1.7×109
실험적 엠. 보비스 항원투여 전 1일, 항원투여 후 7일, 항원투여 후 14일, 및 항원투여 후 대략 3주에 모든 동물들의 체중을 재었다. 결과를 표 3A에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린(처리군 A, B 및 C)을 투여받은 송아지는 위약 예방접종된 군(처리군 D)과 비교할 때 증가된 체중 획득을 가졌다.
실험적 마이코플라즈마 보비스 항원투여 후의 체중 요약평균 체중(kg) ±표준 편차
처리군 항원투여 전 항원투여 후1주 항원투여 후2주 항원투여 후3주 체중 획득
A 79.79±12.29 88.00±13.86 98.43±12.35 103.71±10.76 23.92±5.99
B 78.21±9.50 86.93±9.90 98.29±8.47 105.21±9.32 27.00±5.23
C 78.07±16.78 86.60±17.11 98.00±20.92 104.00±21.56 25.93±8.80
D 78.93±19.16 88.60±20.44 94.43±20.01 96.93±20.89 18.00
실험적 엠. 보비스 항원투여 전 1일, 항원투여 직전, 및 항원투여 후 20일 동안 각각의 아침에 직장 온도를 측정하였다. 결과를 도 2에 요약한다. 엠. 보비스 백신의 2회 투여량을 투여받은 송아지(처리군 A, B 및 C)는, 위약 예방접종된 동물(처리군 D)과 비교할 때, 7 내지 17일에 더 낮은 평균 체온을 나타냈다.
엠. 보비스 특이적 혈청 항체 반응(IgG)을 표 4A에 요약한다. 포지티브 대조 혈청의 80％ 초과의 평균 퍼센트 광학 밀도(OD) 값을 가진 혈청 샘플을 엠. 보비스에 대해 포지티브인 것으로 간주하였다. 모든 송아지들은 예방접종 전에 엠. 보비스 네가티브였다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지 (처리군 A, B 및 C)는 두번째 예방접종 전에 엠. 보비스에 대해 혈청포지티브였고, 연구 기간에 걸쳐 혈청포지티브로 유지되었다. 처리군 D의 동물들(위약 예방접종된 동물)은 실험적 엠. 보비스 항원투여 후 3주까지 혈청네가티브였다.
마이코플라즈마 보비스 혈청 항체(IgG)의 요약포지티브 대조 혈청에 대한 광학 밀도 값의 평균 퍼센트 ±표준 편차
처리군 예방접종전 두번째예방접종 전 항원투여전 항원투여 후1주 항원투여 후2주 항원투여 후3주
A 네가티브 244.3±66.0 314.7±10.5 134.9±7.4 115.5±8.0 142.5±6.9
B 네가티브 262.1±86.9 309.9±33.6 139.5±7.5 114.9±7.5 145.0±4.1
C 네가티브 184.5±60.6 292.2±93.7 141.1±9.1 118.9±7.5 140.4±7.7
D 네가티브 36.9±70.6 37.2±81.0 37.4±27.9 53.2±39.4 100.5±99.6
모든 동물들을 실험적 엠. 보비스 항원투여 후 대략 3주에 부검하였다. 폐를 꺼내고, 엠. 보비스 감염에 기인한 특징적인 병변에 대하여 육안으로 평가하였다. 퍼센트 폐 손상 스코어 및 폐 병변의 퍼센트 감소를 표 5A에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 A, B 및 C)는, 위약 예방접종된 동물(처리군 D)과 비교할 때, 낮은 퍼센트 폐 손상 스코어를 나타냈다. 이러한 결과는, 실험적 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량이 실험적 항원투여 후 송아지에서 보호를 유도할 수 있음을 증명한다.
퍼센트 폐 손상 스코어의 요약평균 체중 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 퍼센트 폐 손상 퍼센트 감소
A 1.71±3.03 77.5
B 1.49±3.23 80.4
C 3.61±6.17 52.5
D 7.60±15.93 -
각각의 폐를 50ml의 PBS로 세정하였다. 실험적 엠. 보비스 항원투여 후 대략 21일에 기관지 세정 샘플로부터 엠. 보비스의 단리 결과를 표 6A에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 A, B 및 C)은, 위약 예방접종된 송아지(처리군 D)와 비교할 때, 감소된 발생빈도 및 폐 세정 샘플에서 감소된 생존 엠. 보비스의 수준을 가졌다.
폐 세정액으로부터 마이코플라즈마 보비스 단리의 요약
처리군 엠. 보비스 포지티브 동물의 수 CFU/ml
A 5/14 1.93×102
B 1/14 42.9
C 9/15 1.34×106
D 12/14 4.50×106
결론적으로, 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 A, B 및 C)는, 위약 투여된 동물(처리군 D)과 비교할 때, 폐 병변을 덜 발현하고, 직장 온도가 낮아지고, 체중 획득이 증가하였으며, 폐 세정 샘플로부터 단리된 생존 엠. 보비스의 수준이 감소하였다. 결과는, 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량이 혈청학적 반응을 유발할 수 있고 엠. 보비스 실험적 항원투여로부터의 보호를 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
이 실시예에서, 동종 또는 이종 항원투여 후에, 어린 송아지에서 엠. 보비스 박테린 제제의 효능을 평가하였다. 83마리의 건강한 교배종 송아지를 연령에 따라 무작위 배분하였다.
0일(좌측 목) 및 21일(우측 목)에 피하 경로에 의해 적절한 백신 또는 위약 2ml로 동물을 예방접종하였다. 실험적 처리군 및 사용된 백신을 표 1B에 나타낸다.
두번째 예방접종 후 약 4주에 상기 기재된 바와 같이 송아지에게 항원투여하였다. 연속 3일 동안 비내 경로에 의해 신선한 엠. 보비스 균주 5063 배양액 12ml(콧구멍 당 6ml)를 각각의 송아지에 투여하였다.
엠. 보비스 실험적 항원투여 완료 후 1시간 내에, 각각의 항원투여 접종물의 생균수(CFU/ml)를 결정하였다.
실험적 엠. 보비스 항원투여 전 1일 및 항원투여 후 대략 3주에 모든 동물들의 체중을 재었다. 평균 1일 체중 획득 결과를 표 2B에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 2, 3, 4, 및 5)는, 위약 예방접종 군(처리군 1)과 비교할 때, 평균 1일 체중 획득이 증가하였다.
실험적 마이코플라즈마 보비스 항원투여 후의 평균 1일 체중 획득의 요약평균 1일 체중 획득(kg)
처리군 평균 1일 체중 획득
1 0.3
2 0.5
3 0.7
4 0.6
5 0.9
실험적 엠. 보비스 항원투여 직전(47일) 및 항원투여 후 20일 동안 각각의아침에 직장 온도를 측정하였다. 결과를 표 3B에 요약한다. 엠. 보비스 백신의 2회 투여량을 투여받은 송아지(처리군 2, 3, 4 및 5)는, 위약 예방접종된 동물(처리군 1)과 비교할 때 52일 내지 67일에서 낮은 평균 체온을 나타냈다.
엠. 보비스 특이적 혈청 항체 반응(IgG)을 표 3B에 요약한다. 포지티브 대조 혈청의 0.8080％ 초과의 평균 퍼센트 광학 밀도(OD) 값을 가진 혈청 샘플을 엠. 보비스에 대해 포지티브인 것으로 간주하였다. 모든 송아지들은 예방접종 전에 엠. 보비스 네가티브였다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 2, 3, 4 및 5)는, 예방접종 후에 항체 반응을 나타내었다. 처리군 1의 동물 (위약 예방접종된 동물)은, 실험적 엠. 보비스 항원투여 후 3주까지 혈청네가티브였다.
마이코플라즈마 보비스 혈청 항체(IgG)의 요약포지티브 대조 혈청에 대한 광학 밀도 값의 평균 퍼센트±표준 편차
처리군 예방접종 전 두번째 예방접종 전 항원투여 전 항원투여 후 3주
1 7.04±13.69 28.14±31.58 5.33±52.24 183.67±51.32
2 2.77±10.47 79.59±71.35 49.78±34.91 294.75±29.32
3 7.40±13.20 98.21±102.30 69.77±27.44 298.29±21.13
4 8.34±14.00 87.15±56.79 65.43±40.81 295.47±26.59
5 5.54±10.02 62.40±72.18 68.31±20.88 300.13±22.91
모든 동물들을 실험적 엠. 보비스 항원투여 후 대략 3주에 부검하였다. 폐를 꺼내고, 엠. 보비스 감염에 기인한 특징적인 병변에 대해 육안으로 평가하였다. 최소 제곱 평균(LSM) 퍼센트 폐 손상 스코어 및 폐 병변의 퍼센트 감소를 표 4B에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지 (처리군 2, 3, 4 및 5)는, 위약 예방접종된 동물 (처리군 1)과 비교할 때 낮은 LSM 퍼센트 폐 손상 스코어를 나타냈다. 이 결과는, 실험적 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량이 실험적 항원투여 후에 송아지에서 보호를 유도할 수 있음을 증명한다.
LSM 퍼센트 폐 손상 스코어의 요약평균 체중 퍼센트
처리군 LSM 퍼센트 폐 손상 퍼센트 감소
1 6.5 -
2 0.7 89.23
3 0.9 86.15
4 2.8 56.92
5 2.9 55.38
각각의 폐를 50ml의 PBS로 세정하였다. 실험적 엠. 보비스 항원투여 후 대략 21일에, PCR에 의한 기관지 세정 샘플내의 엠. 보비스의 존재 결과를 표 5B에 요약한다. 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 2, 3, 4 및 5)는, 위약 예방접종된 송아지 (처리군 1)와 비교할 때, PCR에 의한 폐 세정 샘플에서 엠. 보비스의 발생빈도가 감소하였다.
폐 세정액에서 PCR에 의한 마이코플라즈마 보비스의 존재 요약
처리군 엠. 보비스 포지티브 동물의 수 퍼센트 포지티브
1 14/16 87.5
2 0/17 0
3 4/12 25.0
4 2/15 11.8
5 1/16 5.9
결론적으로, 실험적 엠. 보비스 박테린을 투여받은 송아지(처리군 2, 3, 4 및 5)는, 위약 투여된 동물(처리군 1)과 비교할 때, 폐 병변을 덜 발현하고, 직장 온도가 낮아지고, 평균 1일 체중 획득이 증가하였으며, 폐 세정 샘플에서의 엠. 보비스 발생빈도가 감소하였다. 결과는, 엠. 보비스 박테린의 2회 투여량이 혈청학적 반응을 유발할 수 있고 엠. 보비스 실험적 항원투여로부터의 보호를 유도할 수 있음을 나타내었다. 또한 이 결과는, 하나의 엠. 보비스 균주를 함유한 백신이, 명백히 상이한 균주를 사용한 실험적 항원투여 후에 송아지를 보호할 수 있음을 밝혀내었다.

Claims (15)

  1. 면역학적 유효량의 불활성화 완전 또는 부분 마이코플라즈마 보비스 (Mycoplasma bovis) 세포 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 동물의 면역화를 위한 백신 제제.
  2. 제1항에 있어서, 아쥬반트(adjuvant)를 더 포함하는 백신 제제.
  3. 제1항에 있어서, 엠. 보비스(M. bovis) 백신의 유효량이 투여량 당 약 1×106내지 약 5×1010콜로니 형성 단위(CFU)를 함유하는 것인 백신 제제.
  4. 제1항에 있어서, 마이코플라즈마 보비스 백신이 바이러스성 또는 세균성의 호흡기, 장, 또는 생식기 병원체 항원을 더 포함하는 것인 백신 제제.
  5. 유효량의 마이코플라즈마 보비스 백신을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 보비스 감염에 의해 유발된 동물의 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  6. 제13항에 있어서, 유효량의 엠. 보비스 백신이 투여량 당 약 1×106내지 약5×1010콜로니 형성 단위(CFU)를 함유하는 것인 방법.
  7. 제13항에 있어서, 투여되는 상기 백신의 양이 약 0.5 내지 약 5.0ml인 방법.
  8. 제13항에 있어서, 투여되는 상기 백신의 양이 약 1.5ml 내지 약 2.5ml인 방법.
  9. 제27항에 있어서, 백신 약 2ml를 송아지에게 2번 투여하는 방법.
  10. 마이코플라즈마 보비스의 단리물을 적절한 배지 중의 배양액에서 생육시키고; 마이코플라즈마 보비스를 2원 에틸렌이민으로 처리하여 마이코플라즈마 보비스를 불활성화시키고; 불활성화된 마이코플라즈마 보비스를 적절한 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 마이코플라즈마 보비스 백신의 제조 방법.
  11. 마이코플라즈마 보비스 박테린(bacterin) 및 아쥬반트를 적어도 하나의 용기에 포함하는 키트.
  12. 제약학적으로 허용가능한 담체 내에, 불활성화 마이코플라즈마 보비스 단리물을 박테린의 투여량 당 약 5×108콜로니 형성 단위의 양으로 포함하는 박테린.
  13. 제12항에 있어서, 아쥬반트를 더 포함하는 박테린.
  14. 제13항에 있어서, 유효량의 마이코플라즈마 보비스 백신을 1회 투여량으로 투여하는 방법.
  15. 면역학적 유효량의 불활성화 완전 또는 부분 마이코플라즈마 보비스 세포, 퀼 A(QuilA), 암피겐(Amphigen) 및 콜레스테롤을 포함하는, 동물의 면역화를 위한 백신 제제.
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