KR20040031015A - 마이코플라즈마 보비스 시험감염 모델, 엠. 보비스 투여방법 및 폐렴성 폐 병변 유도 방법 - Google Patents

마이코플라즈마 보비스 시험감염 모델, 엠. 보비스 투여방법 및 폐렴성 폐 병변 유도 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재현가능한 엠. 보비스 시험감염 모델 및, 유효량의 엠. 보비스 배양액을 동물에 투여함으로써 엠. 보비스 감염으로 인한 질환 또는 장애를 신뢰성있게 유도 및 수립하는 방법을 제공한다. 본 발명의 시험감염용 배양액을 충분한 양으로 투여하여 엠. 보비스 특이적 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도해낸다. 본 발명에 따른 엠. 보비스 시험감염 모델은 잠재적인 백신의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다.

Description

마이코플라즈마 보비스 시험감염 모델, 엠. 보비스 투여 방법 및 폐렴성 폐 병변 유도 방법 {Mycoplasma Bovis Challenge Model, Methods for Administering M. Bovis and Methods for Inducing Pneumonic Lung Lesions}
마이코플라즈마 보비스는 집에서 기르거나 집약적으로 사육되는 식용우 및 낙농우에서 중요한 포괄적인 소과 병원체이다. 가장 빈번하게 보고된 임상 조짐은 송아지의 폐렴이고, 이는 종종 폐렴-관절염 증후군으로서도 공지된 관절염을 동반한다. 이것의 병인론성 역할은 또한 암소와 황소의 유방염, 이염, 및 생식 질환 또는 장애와 관련된다. 엠. 보비스가 소과의 호흡기 질환 (BRD)으로 인한 36% 이하의 사망률에 관련되므로, 호흡기 질환을 유도하는 엠. 보비스는 현저한 경제적 손실과 관련된다. 사망률을 감소시키기 위해서, 현재 사용할 수 있는 완전 인가된 엠. 보비스 백신이 없으므로 항생제 요법이 종종 사용된다. 엠. 보비스 질환을 예방함으로써 또한 동물들의 다른 호흡기 질환에 걸리기 쉬운 경향을 감소시킬 수 있다. 어린 송아지들에 대해 매우 효율적이고 안전한 엠. 보비스 세균백신(bacterin)이 축산 산업에 매우 가치있을 것이다. 따라서, 상당한 폐 병변 및 기타 임상 신호를 유도하는, 재현가능한 엠. 보비스 시험감염 모델이 잠재적인 엠. 보비스 백신의 효능을 평가하는데 필요하다.
<발명의 요약>
본 발명은 재현가능한 엠. 보비스 시험감염 모델 및 유효량의 엠. 보비스 배양액을 동물에 투여함으로써 엠. 보비스 감염으로 인한 질환 또는 장애를 확실하게 유도 및 수립하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시험감염용 배양액을 충분한 양으로 투여하여 엠. 보비스 특이적 세포성 또는 체액성 면역 반응을 유도해낸다. 한 측면에서, 상기 동물은 송아지이다. 본 발명에 따른 엠. 보비스 시험감염 모델은 잠재적인 백신의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한을 엠. 보비스 분리주를 적합한 배지의 배양액 중에서 충분한 생 세균 수(viable count)까지 성장시키는 방법을 포함하는 엠. 보비스 시험감염용 배양액의 제조 방법 및 이 배양액을 동물에게 실험적으로 투여하여 폐렴성 병변 및 질환의 임상 신호를 유도하는 방법을 제공한다.
본 발명은 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis) 시험감염 모델 방법 및 엠. 보비스(M. Bovis) 투여, 엠. 보비스에 의해 동물에서 질환 또는 장애를 유도 및 수립하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엠. 보비스 시험감염 모델은 잠재적 백신의 효능을 평가할 수 있다.
도 1은 실험적 엠. 보비스 시험감염 전후의 군 평균 체온을 나타내는 그래프이다. 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A 및 C)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 제1일 내지 제20일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다. 군 B의 시험감염된 송아지들은 군 D (시험감염되지 않은 대조군 동물)와 비교하여 제3일 내지 제5일, 제7일 내지 제14일, 및 제17일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다.
도 2는 실험적 엠. 보비스 시험감염 전후의 군 평균 체온을 나타내는 그래프이다. 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 B)과 비교하여 제15일, 제17일 및 제18일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다.
도 3은 실험적 엠. 보비스 시험감염 전후의 군 평균 체온을 나타내는 그래프이다. 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 B 및 C)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 제4일 내지 제21일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다. 군 A의 시험감염된 송아지들은 군 D (시험감염되지 않은 대조군 동물)와 비교하여 제7일 내지 제21일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다.
도 4는 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제3일 내지 제20일의 군 평균 체온을 나타내는 그래프이다. 2배 투여량의 엠. 보비스 백신을 투여한 송아지들 (처리군 A 및 C) 및 군 E의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 플라시보 시험감염된 군 (처리군 D)과 비교하여 제7일 내지 제20일에 보다 낮은 평균 체온을 나타냈다. 처리군 B에서 백신접종된 송아지들은 플라시보 시험감염된 군 (처리군 D)과 비교하여 제7일 내지 제12일 및 제14일 내지 제20일에 보다 낮은 평균 체온을 나타냈다.
본 발명은 시험감염 모델 및, 유효량의 엠. 보비스 배양액을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 엠. 보비스 감염으로 인한 동물들의 질환 또는 장애를 유도하는 방법을 포함한다. 본 발명은 엠. 보비스 배양액의 제조 및 투여 방법을 포함한다. 엠. 보비스 균주의 예로는 ATCC 25025 (R. G. Wittler가 1968년 10월 8일에 기탁함), 25523 (R. G. Wittler가 1969년 10월 22일에 기탁함) 및 27368 (R. G. Wittler가 1972년 7월 5일에 기탁함)이 있다. 바람직한 실시양태에서, 시험감염용 배양액 중 엠. 보비스 분리주는 하기 균주를 하나 이상 포함한다: 2300 (ATCC PTA-3558), 3625 (ATCC PTA-3559), 16150 (ATCC PTA-3560), 20518 (ATCC PTA-3561) 또는 5063.
본 발명은 임의의 엠. 보비스 분리주가 효과적인 시험감염용 배양액으로 사용될 수 있을 것으로 고려한다. 바람직한 실시양태에서, 엠. 보비스 분리주를 Beg4 배지에서 충분한 세포 밀도로 성장시키고, 유효량을 동물에게 투여하여 폐렴성 병변 및 질환의 임상 신호를 유도한다. 엠. 보비스 균주 2300 (ATCC PTA-3558), 3625 (ATCC PTA-3559), 16150 (ATCC PTA-3560), 20518 (ATCC PTA-3561) 및 5063의 분리주는 특허절차상 미생물의 국제적 등록 및 기탁에 관한 부다페스트 조약 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)에 따라 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)(10801 유니버시티 볼리바드 (University Boulevard), 메네서스(Manassas), VA 20110-2209)에 기탁하였다.
개시의 명확성을 위해, 본 발명의 상세한 설명을 하기의 서브섹션으로 나누어 본 발명의 특정 특징, 실시양태 또는 적용을 기재 또는 설명하지만, 이에 제한되지는 않는다.
정의 및 약어
종명 앞에 있는 약어 엠.(M.)은 속(genus) 마이코플라즈마를 나타낸다.
본원에서 사용되는, 엠. 보비스 감염에 관한 용어 "질환 또는 장애"는 엠. 보비스 박테리아 복제의 야기, 엠. 보비스 전염 또는 전달의 유도 또는 그의 숙주 내에서 엠. 보비스 감염의 수립 및 엠. 보비스 감염 징후의 야기를 의미한다. 박테리아 부하가 증가하고, 폐질환 감염이 증가하고, 폐 병변이 증가하고, 임상 신호 (즉, 직장 온도가 상승하고(하거나) 체중 증가 및(또는) 성장이 감소하는 것)가 증가하는 경우, 시험감염 모델이 효과적인 것으로 생각된다. 본 발명의 방법은, 예를 들어, 동물들, 특히 소에서 폐렴, 호흡기 감염 및 폐 병변의 유도, 폐에서의 엠. 보비스 수준의 증가, 온도 상승 및 체중 증가의 감소에 대해 효과적이다. 본 발명은 또한 유효량의 엠. 보비스 시험감염용 배양액을 동물, 바람직하게는 소에게 투여하는 것이 상기 동물들에서 폐렴, 관절염, 유방염, 이염 및 생식 장애를 포함한 장애를 유도할 것으로 고려한다.
본원에 사용되는 용어 "엠. 보비스 시험감염용 배양액"은 엠. 보비스 감염으로 인한 장애 또는 질환을 일으키는데 유용한 배양액을 나타낸다. 엠. 보비스 배양액은 엠. 보비스에 의해 소에서 감염을 일으키는 임의의 효과적인 배양액을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엠. 보비스 배양액에는, 예를 들어 신선하거나 결빙되거나 동결건조된 엠. 보비스 세포 제제가 포함될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "엠. 보비스 시험감염 모델"은 엠. 보비스 감염으로인한 장애 또는 질환을 유발하는데 유용한 엠. 보비스 배양액을 투여하는 방법을 나타낸다. 엠. 보비스 시험감염 모델은 엠. 보비스에 의해 소에서 감염을 일으키는데 효과적인 임의의 투여 방법을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 투여 방법에는, 예를 들어 경구, 비내, 구비내(oranasal), 국소, 경피, 연무(aerosol) 및 비경구 (예를 들어, 정맥내, 복막내, 기관내, 진피내, 피하 또는 근육내) 투여가 포함될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "동물"은 인간이 아닌 포유류를 비롯한 모든 동물을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "소"는 수송아지, 황소, 암소 및 송아지를 비롯한 소과 동물이나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법이 인간이 아닌 포유동물, 가장 바람직하게는 송아지에게 적용된다.
용어 "유효량"은 투여되는 대상체에서 질환을 유도 또는 수립하기에 충분한 엠. 보비스 배양액의 양을 나타낸다. 엠. 보비스 시험감염용 배양액의 유효량은, 예를 들어 시험감염용 배양액이 마이코플라즈마성 폐렴을 발생시키는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "엠. 보비스 백신"은 엠. 보비스에 의한 감염으로 발생하는 장애 또는 질환의 예방 또는 치료에 유용한 백신을 나타낸다. 엠. 보비스 백신에는 유해한 엠. 보비스에 의한 소에서의 감염을 치료 또는 예방하는데 효과적인 임의의 백신이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 엠. 보비스 백신에는, 예를 들어 완전 또는 부분 엠. 보비스 세포 제제, 불활성화된 또는 개질된생 백신, 엠. 보비스에서 유래된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 단백질을 갖는 서브단위 백신 또는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 면역성 단편, 또는 엠. 보비스에서 유래된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 엠. 보비스 유전자 또는 핵산 또는 그의 면역성 단편이 포함될 수 있는데, 상기 유전자 또는 핵산은 소의 생체내에서 발현될 수 있다. 엠. 보비스 폴리펩티드, 단백질, 상기 폴리펩티드 및 단백질의 면역성 단편, 또는 엠. 보비스 유전자 또는 핵산은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 합성되거나 재조합적으로 생산될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "아쥬번트"는 면역 반응의 보강제(potentiator)이다. 적합한 아쥬번트에는 광물성 겔, 예를 들어 수산화알루미늄; 표면 활성 성분, 예를 들어 리솔레시틴(lysolecithin); 글리코시드, 예를 들어, 사포닌 유도체, 예를 들어 퀼(Quil) A 또는 GPI-0100; 양이온성 계면활성제, 예를 들어 DDA, 플루로닉 폴리올; 다가음이온; 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루로닉 F-127 (B.A.S.F., USA); 펩티드; 광물성 오일, 예를 들어 몬타니드(Montanide) ISA-50 (세픽사(Seppic), 파리, 프랑스), 카르보폴, 암피겐 (하이드로닉스 오마하사(Hydronics Omaha), NE. USA), 알히드로겔 (수퍼포스 바이오섹터사(Superfos Biosector), 프레드릭썬드(Frederikssund), 덴마크) 오일 에멀젼, 예를 들어 바이올(Bayol)F/아를라셀(Arlacel) A와 같은 광물성 오일과 물의 에멀젼, 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 에멀젼화제의 에멀젼; 알룸, 콜레스테롤, 사이토킨 및 아쥬번트의 배합물이 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 면역원은 또한 리포좀에 혼입되거나, 백신 제제에 사용되는 다당류 및(또는) 기타 중합체와 결합할 수 있다.
시험감염용 배양액
본 발명은 엠. 보비스 시험감염 모델 및 적합한 배지의 배양액 중의 엠. 보비스 분리주를 충분한 세포 밀도로 성장시키는 것을 포함하는, 엠. 보비스 시험감염용 배양액의 제조 및 투여 방법; 및 배양액을 동물에게 실험적으로 투여하여 폐렴성 병변 및 질환의 임상 신호를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 엠. 보비스를 폐 조직으로부터 분리한다. 다른 실시양태에서는, 엠. 보비스를 림프절 조직에서 분리한다. 다양한 배지는 당업계에 잘 공지되어 있고, 프리스(Friis), Beg4, 헤이플릭(Hayflick) 및 MHP를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 시험감염용 배양액 중 엠. 보비스 분리주에는 하기 균주 중 하나 이상이 포함된다: 2300, 3625, 16150, 20518 또는 5063.
엠. 보비스 분리주를 성장시키는 조건은 배지의 조성 및 성장하는 특이적 분리주에 따라서 다양할 수 있다. 그러나, 분리주를 대체로 하기에 따라 성장시킨다. 분리주의 동결 바이알을 신속하게 해동시키거나, 동결 건조 바이알을 Beg4 배지 1 내지 10 ml 중에 재현탁시킨다. 멸균 Beg4 배지를 이어서 0.1% 내지 30%의 엠. 보비스의 시딩 모액과 함께 인큐베이션한다. 상기 배양액을 이어서 30℃ 내지 40℃에서 12 시간 내지 약 72 시간 동안 인큐베이션하면서, 인큐베이션 시간에서 수확 시간까지를 측정한다. 바람직한 실시양태에서, 엠. 보비스 배양액을 37℃에서 24 시간 내지 48 시간 동안 성장시킨다. 각 시험감염 일 동안, 개별 시험감염 접종원을 제조한다. 시험감염시키는 각 일에, Beg4 배지 중에 연속 희석하고 각연속 희석액을 심장 침출 한천 (Heart Infusion Agar)(HIA) 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 시험감염용 배양액의 생 세균 수, 즉 콜로니 형성 단위 (CFU)를 측정한다. 이어서, HIA 플레이트를 37℃에서 48 내지 168 시간, 바람직하게는 120 시간 동안 인큐베이션하고, 콜로니 수를 생 세균 수로 측정한다.
생성된 엠. 보비스 시험감염용 배양액을 농축할 수 있다. 상기 유기체를 농축하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 유기체를 원심분리, 예를 들어 초원심분리 또는 여과, 예를 들어 초여과로 농축할 수 있다. 생성된 농축 엠. 보비스 배양액을 이어서 당업계에 공지된 방법을 이용하여 회수한다. 시험감염용 배양액은 또한 상기 방법의 임의의 여러가지 변형법으로 제조될 수 있으며, 이것은 당업자에게 용이하게 공지되어 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 엠. 보비스 배양액에는, 예를 들어, 신선하거나 동결되거나 동결건조된 엠. 보비스 세포 제제가 포함될 수 있다.
엠. 보비스 분리주는 또한 공지된 기술을 이용하여 감염된 소의 폐 병변으로부터 직접 얻을 수도 있다. 엠. 보비스 분리주는 또한 감염된 소의 비강, 기관, 폐 세척액, 림프절, 간, 비장, 신장, 심장, 혈액 및 관절에서 공지된 기술을 이용하여 직접 얻을 수도 있다.
투여량, 투여 방식 및 처리
본 발명에 따라서, 엠. 보비스 배양액 유효량의 1배 이상의 투여량을 동물, 바람직하게는 생후 대략 3 내지 28 주의 송아지에게 투여하여 엠. 보비스 감염을 일으킨다. 바람직하게는, 엠. 보비스 배양액을 연속 3일간 투여한다. 유효량의엠. 보비스 시험감염용 배양액에는 시험감염 투여량 당 약 1 x 106내지 약 5 x 1011의 콜로니 형성 단위 (CFU)가 함유되어 있다. 바람직하게는, 충분한 질환을 제공하는 엠. 보비스 시험감염용 배양액은 약 1 x 108내지 약 1 x 1011CFU/투여량, 보다 바람직하게는 약 1 x 1010내지 약 5 x 1010CFU/투여량을 함유한다. 본 발명에 따라서, 엠. 보비스 감염이 약 1 내지 49 일 내에 소에서 재현가능하게 유도되고 임상 질환을 수립한다. 바람직하게는, 엠. 보비스의 임상 질환은 약 1 내지 21일, 보다 바람직하게는 약 1 내지 14 일 내에 재현가능하게 수립된다.
본 발명에 따라서, 투여용 엠. 보비스 시험감염용 배양액의 유효량은 약 0.5 내지 30.0 ml, 바람직하게는 약 5 ml 내지 약 20 ml, 보다 바람직하게는 약 10 내지 12 ml이다.
본 발명에 따라서, 상기 투여는 경구, 비내, 구비내, 국소, 경피, 연무 및 비경구 (예를 들어, 정맥내, 복막내, 기관내, 진피내, 피하 또는 근육내)를 포함하는 공지된 경로로 달성될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 비내 투여이다.
본 발명은 또한 단일 투여량 시험감염 방법을 고려하는데, 이는 엠. 보비스 유도성 질환을 발생시키기 위해 송아지들에게 추가 시험감염 투여량의 투여 필요성을 제거한다.
본 발명에 따라서, 엠. 보비스 시험감염 유효량을 생후 대략 3 내지 28 주의 송아지들에게 투여하여 폐렴을 비롯한 유효 호흡기 감염을 발생시키고, 폐에서의엠. 보비스 수준을 증가시키고, 온도를 상승시키고, 체중 증가를 감소시킨다. 시험감염용 배양액 중의 엠. 보비스의 양, 즉 1 X 106내지 약 5 x 1011은 약 1 내지 49일에 소에서 신뢰성있고 재현가능하게 감염을 유도하고 임상 질환을 수립하는 것으로 처음으로 측정되었다.
본 발명은 송아지에게 1회 이상의 투여량, 바람직하게는 배양액의 3회 시험감염 투여량을 투여하여 송아지에서 엠. 보비스로 감염시키는 것을 포함하는, 송아지에 엠. 보비스를 투여하여 감염시키는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 시험감염용 배양액을 비내로 투여한다. 또한, 시험감염 투여량이 약 10 내지 12 ml의 배양액을 포함하고, 각 ml에는 약 1.0 X 109의 엠. 보비스 콜로니 형성 단위를 함유하는 것이 바람직하다. 시험감염용 배양액은 바람직하게는 연속 3일동안 송아지에 투여한다.
본 발명은 또한 유효량의 엠. 보비스 시험감염용 배양액을 동물, 바람직하게는 소에게 투여하여, 상기 동물에서 폐렴, 관절염, 유방염, 이염 및 생식 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는 장애를 발생시키는 것을 고려한다.
본 발명은 하기 실시예로 추가 설명된다.
실시예 1
재료 및 방법
동물
건강하게 교배된 낙농우 또는 식용우 송아지들을 각 실험의 시험감염용으로 얻었다. 각 연구의 개시 전 최소 7일 동안 송아지들을 순응시켰다. 모든 송아지들은 임의의 공지된 오염물 또는 구충제가 없고 약물처리되지 않은 농축 음식을 매일 섭취하였고, 물을 자유롭게 섭취하였다.
시험감염 방법
각 송아지에 신선한 엠. 보비스 배양액 10 내지 20 ml [대략 1 X 108내지 1 X 1010콜로니 형성 단위 (CFU/ml)]를 비내 경로로 연속 3일 동안 투여하였다. 시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)는 각 실험의 시험감염 완결 후에 바로 측정되었다. 시험감염용 배양액의 생 세균 수를 Beg4 배지 중에 연속 희석시키고 각 연속 희석액을 HIA 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 측정하였다. HIA 플레이트를 이어서 37℃에서 120 시간동안 인큐베이션하고, 콜로니 수를 생 세균 수로 측정하였다.
실험 절차
단독 이표(ear tag) 번호를 각 송아지에게 부여하였다. 동물들을 펜스 및 처리군으로 연령에 따라 무작위로 배당하였다.
시험감염 하루 전, 시험감염 후 제7일, 시험감염 후 제14일 및 시험감염 후 대략 3 주에 모든 동물들의 체중을 측정하였다.
시험감염 하루 전, 시험감염 직전 및 시험감염 후 20일 동안 매일 아침 직장 온도를 측정하였다.
혈액 샘플을 각 송아지의 경정맥에서 체취하였다. 시험감염 대략 1일 전, 시험감염 후 제7일, 시험감염 후 제14일 및 검시 시 (시험감염 후 대략 3주) 송아지의 혈액을 취하였다. 봄멜리 아게(Bommeli AG)(호체스트 로우셀 베트 디아그노스틱스사(Hoechst Roussel Vet Diagnostics), 리베펠트-베른(Liebefeld-Bern), 스위스)에서 제작한 엠. 보비스 ELISA 키트 (Chekit M. bovis Sero)로 평가할 때까지 각 혈액 샘플로부터의 혈청을 -20℃에서 저장하였다. ELISA 플레이트를 멀티스캔 리더(Multiscan reader)를 이용하여 파장 405 nm에서 판독하였다. 광학 밀도 (OD) 값을 하기 식을 이용하여 양성 대조군 혈청의 OD 값에 관한 퍼센트로 변환하였다.
60% 미만의 값은 음성으로 간주하였다. 60 내지 80%의 퍼센트값을 갖는 혈청은 용의물질로 여겨지는 반면, OD 값이 80% 초과인 혈청은 양성으로 여겨졌다.
모든 동물들을 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 대략 3주에 검시하였다. 송아지들을 안락사시키고, 중추 신경계를 제외한 모든 주요 기관을 철저하게 조사하였다.
폐를 절제하고 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 병변에 대해 철저하게 평가하였다. 병변을 표준 폐 도표에 스케치하였다. 각 폐엽에 대한 퍼센트 전반의 관계는 하기의 총 폐 질량에 대한 개개의 폐엽의 비율을 이용하여 중량측정될 수 있다.
폐엽 폐의 퍼센트
좌측 위 5
우측 위 6
중앙 5
좌측 심장 6
우측 심장 7
부속물 4
좌측 횡격막 32
우측 횡격막 35
이어서, 중량측정된 폐엽 값을 합계하여 심한 병변을 갖는 총 폐의 퍼센트를 측정하였다 (Pointon et al, 1992). 추가로, 하기 식을 이용하여 폐 손상 (병변)에서의 퍼센트 감소를 계산하였다.
또한, 각 폐를 PBS 50 ml로 세척하였다. 기관지 세척액으로부터 엠. 보비스 생 세균 수의 분리 및 측정을 시도하였다. 기관지 세척액의 적절한 연속 희석액을 제조하고 적절한 한천 배지 상에 샘플을 플레이팅하여 엠. 보비스의 생 세균 수 (CFU/ml)를 결정할 수 있다.
실시예 2
본 실시예에서는, 상이한 엠. 보비스 시험감염 방법을 어린 송아지들에서 평가하였다. 생후 대략 7주이고 엠. 보비스에 대한 모계 항체를 보유하지 않는, 24 마리의 건강하게 교배된 낙농우 송아지들 (홀스테인(Holstein)/프리에시안 (Friesian) 교배)을 얻고, 표 1에 나타낸 바와 같이 연령에 따라 무작위로 배당하였다. 모든 송아지들을 연구 개시 전 3 주 동안 적응시켰다.
실험 처리군
처리군 온도 동물 개체수
A 연무 시험감염 (연속 2일) 6
B 연무 시험감염 (연속 3일) 6
C 비내 시험감염 (연속 3일) 6
D 시험감염되지 않은 대조군 6
생후 대략 10주의 송아지들을 상기 기재한 바와 같이 시험감염시켰다. 각 송아지에게 연속 2일 또는 연속 3일간 엠. 보비스 균주 5063의 신선한 배양액 10 ml (콧구멍 당 5 ml)를 투여하였다. 군 A 및 B의 동물들을 마스크를 통한 연무에 의해 브로쓰(broth) 배양액과 함께 시험감염시켰다. 군 C의 송아지들을 간단한 분무기 (제네시스 인더스트리스사(Genesis Industries), 엘름우드(Elmwood), WI)를 이용하여 시험감염시켰고, 군 D의 동물들은 시험감염되지 않은 대조군 송아지들로 유지하였다.
시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)를 각 엠. 보비스의 실험적 시험감염 완결 후 한 시간 내에 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
마이코플라즈마 보비스 시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)
시험감염용 배양액 CFU/ml
제1일 5.0 X 108
제2일 1.0 X 108
제3일 5.3 X 108
시험감염 하루 전, 시험감염 후 제7일, 시험감염 후 제14일 및 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제20일에 모든 동물들의 체중을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A, B 및 C)의 체중 증가는 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 감소하였다.
실험적 마이코플라즈마 보비스 시험감염 후 체중의 요약 측정된 평균 체중 (kg) ± 표준 편차
처리군 -1일 제7일 제14일 제20일 체중 증가
A 75.0 ± 10.0 76.8 ±10.0 79.9 ±8.3 82.8 ±10.9 7.8
B 73.2 ±5.9 77.2 ±6.7 80.3 ±10.3 88.2 ±8.0 15.0
C 69.0 ± 3.9 74.7 ±5.6 75.3 ±5.7 85.3 ±7.3 16.3
D 75.1 ±7.5 79.2 ±6.8 86.5 ±8.6 105.5 ±6.8 30.4
시험감염 전 3일, 2일 및 1일, 시험감염 직전 및 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 19일 동안 매일 아침 직장 온도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 요약하였다. 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A 및 C)은 임상 신호를 나타내는데, 즉 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 제1일 내지 제20일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다. 군 B의 시험감염된 송아지들은 군 D (시험감염되지 않은 대조군 동물)와 비교하여 제3일 내지 제5일, 제7일 내지 제14일 및 제17일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다.
엠. 보비스 특이적 혈청 항체 반응 (IgG)을 표 4에 요약하였다. 퍼센트 광학 밀도 (OD) 값이 양성 대조군 혈청의 0.80 초과인 혈청 샘플을 엠. 보비스에 대해 양성으로 간주하였다. 실험적 시험감염 전의 모든 송아지들은 엠. 보비스 음성이었다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A B 및 C)은 엠. 보비스 시험감염 후 제20일에 초양성이었다. 처리군 D의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 이 연구동안 내내 본질적으로 음성이었다.
마이코플라즈마 보비스 혈청 항체 반응 (IgG)의 요약 양성 대조군 혈청에 대한 광학 밀도 값의 평균 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 -1일 제7일 제14일 제20일
A 55.9 ± 41.7 108.1 ± 64.2 108.1 ± 64.2 142.7 ± 17.1
B 52.7 ± 53.8 64.5 ± 39.7 64.5 ± 39.7 151.4 ± 10.3
C 69.8 ± 50.3 82.1 ± 42.1 82.1 ± 42.1 118.0 ± 33.0
D 71.4 ± 25.3 81.9 ± 20.2 81.9 ± 20.2 4.9 ± 0.1
실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제20일에 모든 동물들을 검시하였다. 폐를 절제하고 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 병변에 대해 철저하게 평가하였다. 퍼센트 폐 손상도를 표 5에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A, B 및 C)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 보다 높은 퍼센트 폐 손상도를 나타냈다. 이러한 결과는 실험적 엠. 보비스 시험감염이 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 폐 병변을 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
퍼센트 폐 손상도의 요약 측정된 평균 체중 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 퍼센트 폐 손상
A 12.99 ± 8.13
B 11.06 ± 15.02
C 7.97 ± 5.96
D 0.71 ± 0.92
각 폐를 PBS 50 ml로 세척하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제20일에 기관지 세척액 샘플로부터 엠. 보비스를 분리한 결과를 표 6에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A, B 및 C)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 폐 세척액 샘플 중 살아있는 엠. 보비스의 발생율이 증가하였다.
폐 세척액으로부터 마이코플라즈마 보비스 분리의 요약
처리군 엠. 보비스 양성인 동물 개체수
A 6/6
B 6/6
C 6/6
D 0/6
결론적으로, 실험적 엠. 보비스 시험감염으로 폐 병변이 발병된 송아지들 (처리군 A, B 및 C)에서는 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 직장 온도가 상승하고, 체중 증가가 감소하고, 폐 세척액 샘플로부터 분리된 살아있는 엠. 보비스 발생율이 증가하였다. 이러한 결과는 엠. 보비스 배양액이 실험적 시험감염 후에 혈청학상 반응을 유도할 수 있고 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 폐 병변을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
본 실시예에서는, 엠. 보비스 시험감염 모델을 생후 5 내지 7 개월된 송아지들에서 평가하였다. 생후 대략 4 주이고 엠. 보비스에 대한 모계 항체를 보유하지 않은, 22마리의 건강하게 교배된 낙농우 또는 식용우 송아지들을 얻고, 표 7에 나타낸 바와 같이 연령에 따라 무작위로 배당하였다. 모든 송아지들을 연구 개시 전에 적응시켰다.
실험 처리군
처리군 처리 동물 개체수
A 비내 시험감염 (연속 3일) 14
B 시험감염되지 않은 대조군 8
생후 대략 5 내지 7 개월의 송아지들을 상기 기재된 바와 같이 시험감염시켰다. 군 A의 송아지들에게 엠. 보비스 균주 5063의 신선한 배양액 20 ml (콧구멍 당 10 ml)를 연속 3일 동안 투여하고, 간단한 분무기 (제네시스 인더스트리스사, 엘름우드, WI)를 이용하여 시험감염시켰다. 군 B의 동물들을 시험감염되지 않은 대조군 송아지들로 유지하였다.
시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)를 각 엠. 보비스의 실험 시험감염 완결 후 한 시간 내에 측정하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
마이코플라즈마 보비스 시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)
시험감염용 배양액 CFU/ml
제1일 1.3 X 108
제2일 4.0 X 107
제3일 1.2 X 108
시험감염 하루 전 및 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제21일에 모든 동물들의 체중을 측정하였다. 그 결과를 표 9에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 B)과 비교하여 유사한 체중 증가를 나타냈다.
실험적 마이코플라즈마 보비스 시험감염 후 체중의 요약 측정된 평균 체중 (kg) ± 표준 편차
처리군 -1일 제21일 체중 증가
A 163.6 ± 32.61 169.6 ± 30.47 6.0 ± 6.56
B 162.5 ± 40.09 167.5 ± 35.15 5.0 ± 7.56
시험감염 하루 전, 시험감염 직전 및 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제21일 동안 매일 아침 직장 온도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 요약하였다. 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A)은 임상 신호를 나타내는데, 즉 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 B)과 비교하여 제15일, 제17일 및 제18일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다.
엠. 보비스 특이적 혈청 항체 반응 (IgG)을 표 10에 요약하였다. 평균 퍼센트 광학 밀도 (OD)가 양성 대조군 혈청의 80% 초과인 혈청 샘플을 엠. 보비스에 대해 양성으로 간주하였다. 실험적 시험감염 전의 모든 송아지들은 엠. 보비스 음성이었다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A)은 엠. 보비스 시험감염 후 제21일에 초양성이었다. 처리군 B의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 제21일에도 음성이었다.
마이코플라즈마 보비스 혈청 항체 반응 (IgG)의 요약 양성 대조군 혈청에 대한 광학 밀도 값의 평균 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 -1일 제21일
A 27.9 ± 14.00 100.0 ± 0
B 26.5 ± 11.50 21.6 ± 19.2
실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제21일에 모든 동물들을 검시하였다. 폐를절제하고 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특이적 병변에 대해 철저하게 평가하였다. 퍼센트 폐 손상도를 표 11에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 B)과 비교하여 보다 높은 퍼센트 폐 손상도를 나타냈다. 이러한 결과는 실험적 엠. 보비스 시험감염이 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 폐 병변을 유도할 수 있음을 입증한다.
퍼센트 폐 손상도의 요약 측정된 평균 체중 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 퍼센트 폐 손상
A 11.10 ± 23.38
B 1.34 ± 2.77
각 폐를 PBS 50 ml로 세척하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제21일의 기관지 세척액 샘플로부터 엠. 보비스를 분리한 결과를 표 12에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 B)과 비교하여 폐 세척액 샘플 중에 살아있는 엠. 보비스 발생율이 증가하였다.
폐 세척액으로부터 마이코플라즈마 보비스 분리의 요약
처리군 엠. 보비스 양성인 동물 개체수
A 10/14
B 0/8
결론적으로, 실험적 엠. 보비스 시험감염으로 폐 병변이 발병된 송아지들 (처리군 A)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 B)과 비교하여 시험감염 후제15일, 제17일 및 제18일에 직장 온도가 상승하고, 폐 세척액 샘플로부터 분리된 살아있는 엠. 보비스 발생율이 증가하였다. 그 결과는 엠. 보비스 배양액이 실험적 시험감염 후에 혈청학상 반응을 유도할 수 있고 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 폐 병변을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4
본 실시예에서는, 3종의 엠. 보비스 균주를 어린 송아지들에서 평가하였다. 생후 대략 6 주이고 엠. 보비스에 대한 모계 항체를 보유하지 않은, 24 마리의 건강하게 교배된 낙농우 송아지들 (홀스테인/프리에시안 교배)을 얻고, 표 13에 나타낸 바와 같이 연령에 따라 무작위로 배당하였다. 모든 송아지들을 연구 전 3 주 동안 적응시켰다.
실험 처리군
처리군 처리 동물 개체수
A 비내 시험감염 균주 5063 6
B 비내 시험감염 균주 3625 6
C 비내 시험감염 균주 16150 6
D 시험감염되지 않은 대조군 6
생후 대략 9 주의 송아지들을 상기 기재된 바와 같이 시험감염시켰다. 군 A, B 및 C의 각 송아지에게 적절한 엠. 보비스 균주의 신선한 배양액 12 ml (콧구멍 당 6 ml)를 연속 3일 동안 투여하고, 간단한 분무기 (제네시스 인더스트리스사, 엘름우드, WI)를 이용하여 시험감염시켰다. 군 D의 동물들은 시험감염되지 않은 대조군 송아지들로 유지하였다.
각 시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)는 각 엠. 보비스의 실험적 시험감염 완결 후 한 시간 내에 측정하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
마이코플라즈마 보비스 시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)
시험감염 균주 5063 CFU/ml 균주 3625 CFU/ml 균주 16150 CFU/ml
제1일 2.0 X 108 1.0 X 107 1.0 X 107
제2일 2.0 X 108 2.3 X 108 2.0 X 108
제3일 3.O X 108 5.O X 108 1.O X 108
시험감염 하루 전 및 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제21일에 모든 동물의 체중을 측정하였다. 그 결과를 표 15에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A, B 및 C)은 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 체중 증가가 감소하였다.
실험적 마이코플라즈마 보비스 시험감염 후 체중의 요약 측정된 평균 체중 (kg) ± 표준 편차
처리군 -1일 제21일 체중 증가
A 73.4 ± 3.20 107.7 ± 7.86 34.3 ± 7. 53
B 67.3 ± 5.77 89.1 ± 17.78 21.8 ± 15.30
C 69.3 ± 9.12 92.9 ± 10.5 23.6 ± 9.28
D 65.5 ± 9.89 104.2 ± 16.42 38.7 ± 7.93
시험감염 하루 전, 시험감염 직전, 및 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 21일 동안 매일 아침 직장 온도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 요약하였다. 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 B 및 C)은 임상 신호를 나타내는데, 즉 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 제4일 내지 제21일에 보다 높은평균 체온을 나타냈다. 군 A의 시험감염된 송아지들이 군 D (시험감염되지 않은 대조군 동물)와 비교하여 제7일 내지 제21일에 보다 높은 평균 체온을 나타냈다.
엠. 보비스 특이적 혈청 항체 반응 (IgG)을 표 16에 요약하였다. 평균 퍼센트 광학 밀도 (OD) 값이 양성 대조군 혈청의 80% 초과인 혈청 샘플을 엠. 보비스에 대해 양성으로 간주하였다. 실험적 시험감염 전의 모든 송아지들은 엠. 보비스 음성이었다. 엠. 보비스 균주 5063, 3625 또는 16150의 시험감염용 배양액을 투여한 송아지들 (처리군 A, B 및 C)은 실험적 시험감염 후 제20일에 혈청학상 반응을 나타냈다. 처리군 D의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 제20일에도 음성이었다.
마이코플라즈마 보비스 혈청 항체 반응 (IgG)의 요약 양성 대조군 혈청에 대한 광학 밀도 값의 평균 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 -1일 제21일
A 0.98 ± 1.13 46.29 ± 14.23
B 0.43 ± 0.88 47.85 ± 28.50
C 0.77 ± 1.17 57.21 ± 48.24
D 0.98 ± 2.42 1.84 ± 1.74
실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제21일에 모든 동물을 검시하였다. 폐를 절제하고 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 병변에 대해 철저히 평가하였다. 퍼센트 폐 손상도를 표 17에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염된 송아지들 (처리군 A, B 및 C)이 시험감염되지 않은 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 보다 높은 폐 손상도를 나타냈다. 이러한 결과는 분리된 각 엠. 보비스가 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 폐 병변을 유도할 수있음을 입증한다.
퍼센트 폐 손상도의 요약 측정된 평균 체중 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 퍼센트 폐 손상
A 8.65 ± 5.27
B 16.87 ± 27.91
C 32.36 ± 9.07
D 4.07 ± 3.01
실시예 5
본 실시예에서는, 다양한 엠. 보비스 세균백신의 효능을 엠. 보비스 시험감염 모델에서 평가하였다. 생후 대략 14 일이고 엠. 보비스에 대한 모계 항체를 보유하지 않은, 66 마리의 건강하게 교배된 낙농우 송아지들 (홀스테인/프리에시안 교배)을 얻어, 연령에 따라 무작위로 배당하였다. 모든 송아지들을 연구 개시 전 1 주 동안 적응시켰다.
세균백신은 BEI 불활성화된 완전 세포 엠. 보비스 박테리아를 투여량 당 적절한 농도로 함유하였다. 추가로, 각 백신 제제는 인산 완충 염수 (PBS) 및 적절한 아쥬번트 (표 18 참조)를 함유하였다. 플라시보는 PBS를 함유하였다.
적절한 백신 또는 플라시보 2 ml를 피하 경로로 제0일 (좌측 목) 및 제21일 (우측 목)에 동물에게 백신접종하였다. 실험 처리군 및 사용된 백신을 표 19에 나타낸다.
실험 처리군
처리군 실험 백신 (2 ml 투여량) 동물 개체수
A 엠. 보비스 (5 X 108CFU)+ 앰피겐 + 알히드로겔 14
B 엠. 보비스 (5 X 108CFU) + 앰피겐 + 퀼A/콜레스테롤 14
C 엠. 보비스 (5 X 108CFU) + 앰피겐 15
D 플라시보 (PBS) - 시험감염된 대조군 15
E 플라시보 (PBS) - 시험감염되지 않은 대조군 8
2차 백신접종 후 3주된, 생후 대략 9주의 송아지들을 시험감염시켰다 (제42일). 군 A, B, C 및 D의 동물들을 간단한 분무기 (제네시스 인더스트리스사, 엘름우드, WI)를 이용하여 브로쓰 배양액과 함께 시험감염시켰다. 각 송아지에게 엠. 보비스 균주 5063의 신선한 배양액 12 ml (콧구멍 당 6 ml)를 연속 3일 동안 투여하였다. 군 E의 동물들을 시험감염되지 않은 대조군 송아지들로서 유지하였다.
각 시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)를 각 엠. 보비스 실험 시험감염 완결 후 1 시간 내에 측정하였다. 그 결과를 표 19에 나타냈다.
마이코플라즈마 보비스 시험감염 접종원의 생 세균 수 (CFU/ml)
시험감염용 배양액 CFU/ml
제1일 2.2 X 109
제2일 3.2 X 109
제3일 1.7 X 109
시험감염 하루 전, 시험감염 후 제7일, 시험감염 후 제14일 및 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제21일에 모든 동물의 체중을 측정하였다. 그 결과를 표 20에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 세균백신을 투여한 송아지들 (처리군 A, B 및 C)및 군 E의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)의 체중 증가는 시험감염된 대조군 (처리군 D)과 비교하여 증가하였다.
실험적 마이코플라즈마 보비스 시험감염 후 체중의 요약 측정된 평균 체중 (kg) ± 표준 편차
처리군 제41일 제49일 제56일 제62일 체중 증가
A 79.79±12.29 88.00±13.86 98.43±12.35 103.71±10.76 23.92±5.99
B 78.21±9.50 86.93±9.90 98.29±8.47 105.21±9.32 27.00±5.23
C 78.07±16.78 86.60±17.11 98.00±20.92 104.00±21.56 25.93±8.80
D 78.93±19.16 88.60±20.44 94.43±20.01 96.93±20.89 18.00
E 81.38±13.49 91.63±13.00 105.00±13.76 113.5±15.94 32.12±4.26
처리군 D의 체중 증가 데이타를 확인한다. 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제3일 내지 제20일 동안 매일 아침 직장 온도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 요약하였다. 엠. 보비스 백신의 2배 투여량을 투여한 송아지들 (처리군 A 및 C) 및 군 E의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 임상 신호를 나타내는데, 즉 시험감염된 대조군 (처리군 D)과 비교하여 제7일 내지 제20일에 보다 낮은 평균 체온을 나타냈다. 처리군 B의 백신접종된 송아지들은 시험감염된 대조군 (처리군 D)과 비교하여 제7일 내지 제12일 및 제14일 내지 제20일에 보다 낮은 평균 체온을 나타냈다.
엠. 보비스 특이적 혈청 항체 반응 (IgG)을 표 21에 요약하였다. 평균 퍼센트 광학 밀도 (OD) 값이 양성 대조군 혈청의 80% 초과인 혈청 샘플을 엠. 보비스에 대해 양성으로 간주하였다. 백신접종 전의 모든 송아지들은 엠. 보비스 음성이었다. 실험적 엠. 보비스 세균백신을 투여한 송아지들 (처리군 A, B 및 C)는 2차 백신접종 전에 엠. 보비스에 대해 초양성이고 연구동안 초양성으로 유지되었다. 처리군 D의 동물들 (시험감염된 대조군)은 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 20일까지 초음성이었다. 처리군 E의 송아지들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 연구동안 내내 초음성이었다.
마이코플라즈마 보비스 혈청 항체 반응 (IgG)의 요약 양성 대조군 혈청에 대한 광학 밀도 값의 평균 퍼센트 ± 표준 편차
처리 군 -1일 제20일 제41일 제49일 제56일 제62일
A 음성 244.3±66.0 314.7±10.5 134.9±7.4 115.5±8.0 142.5±6.9
B 음성 262.1±86.9 309.9±33.6 139.5±7.5 114.9±7.5 145.0±4.1
C 음성 184.5±60.6 292.2±93.7 141.1±9.1 118.9±7.5 140.4±7.7
D 음성 36.9±70.6 37.2±81.0 37.4±27.9 53.2±39.4 100.5±99.6
E 음성 57.9±58.3 46.9±34.5 32.2±22.1 -3.3±26.1 36.1±21.6
실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제20일에 모든 동물을 검시하였다. 폐를 절제하고 엠. 보비스 감염에서 기인하는 특징적인 병변에 대해 철저하게 평가하였다. 퍼센트 폐 손상도 및 폐 병변의 퍼센트 감소를 표 22에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 세균백신을 투여한 송아지들 (처리군 A, B 및 C) 및 군 E의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)의 퍼센트 폐 손상도가 시험감염된 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 보다 낮게 나타났다. 이러한 결과는 실험적 엠. 보비스 세균백신의 2배 투여량이 실험적 시험감염 후 송아지들을 보호할 수 있음을 입증한다.
퍼센트 폐 손상도의 요약 측정된 평균 체중 퍼센트 ± 표준 편차
처리군 퍼센트 폐 손상 퍼센트 감소
A 1.71 ± 3.03 77.5
B 1.49 ± 3.23 80.4
C 3.61 ± 6.17 52.5
D 7.60 ± 15.93 ----
E 0.75 ± 1.02 ----
각 폐를 PBS 50 ml로 세척하였다. 실험적 엠. 보비스 시험감염 후 제20일에 기관지 세척액 샘플로부터 엠. 보비스를 분리한 결과를 표 23에 요약하였다. 실험적 엠. 보비스 세균백신을 투여한 송아지들 (처리군 A, B 및 C) 및 군 E의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 시험감염된 대조군 송아지들 (처리군 D)과 비교하여 폐 세척액 샘플 중의 살아있는 엠. 보비스의 발생율 및 수준이 감소하였다.
폐 세척액으로부터 마이코플라즈마 보비스 분리의 요약
처리군 마이코플라즈마 보비스 양성인 동물 개체수 CFU/ml
A 4/14 1.93 X 102
B 1/14 42.9
C 7/15 1.34 X 106
D 12/15 4.50 X 106
E 2/8 4.38 X 102
처리군 B에 대한 cfu/ml 데이타를 확인한다. 결론적으로, 실험적 엠. 보비스 세균백신을 투여한 송아지들 (처리군 A, B 및 C) 및 군 E의 동물들 (시험감염되지 않은 대조군 동물)은 시험감염된 대조군 동물들 (처리군 D)과 비교하여 폐 병변이 덜 발생하고, 직장 온도가 하강하고, 체중 증가가 증가하고, 폐 세척액 샘플로부터 분리된 살아있는 엠. 보비스의 수준이 감소한다. 이러한 결과는 엠. 보비스세균백신의 2배 투여량이 실험적 시험감염 모델 시스템에서 엠. 보비스로부터 혈청학상 반응 및 보호를 유도할 수 있음을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 유효량의 엠. 보비스 배양액을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 질환 또는 장애의 유도 및 상기 질환의 임상 신호의 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질환 또는 장애가 폐렴, 호흡기 감염, 폐 병변, 관절염, 유방염, 이염 및 생식 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 동물이 수송아지, 황소, 암소 및 송아지로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 동물이 암소인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 동물이 송아지인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유효량의 엠. 보비스 배양액이 시험감염 투여량 당 약 1 x 106내지 약 5 x 1011의 콜로니 형성 단위 (CFU)를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유효량의 엠. 보비스 배양액이 약 1 X 108내지 약 1x 1011CFU/투여량을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유효량의 엠. 보비스 배양액이 약 1 x 1010내지 약 5 x 1010CFU/투여량을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 질환의 상기 임상 신호가 폐에서의 엠. 보비스 수준의 증가, 온도의 상승 또는 체중 증가의 감소를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상승된 온도가 직장 온도인 방법.
  11. a. 제1 동물에 엠. 보비스 백신을 투여하는 단계;
    b. 유효량의 엠. 보비스 시험감염용 배양액으로 상기 동물을 시험감염시키는 단계;
    c. 유효량의 엠. 보비스 시험감염용 배양액으로 제2 동물을 시험감염시키는 단계;
    d. 상기 엠. 보비스로 인한 질환의 임상 신호를 측정하는 단계; 및
    e. 상기 제1 동물에 나타난 질환의 임상 신호와 제2 동물에 나타난 질환의 임상 신호를 비교하는 단계
    를 포함하는, 엠. 보비스에 대한 백신의 효능을 평가하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 시험감염용 배양액이 시험감염 투여량 당 약 1 x 1O6내지 약 5 x 1011의 콜로니 형성 단위 (CFU)를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 시험감염용 배양액이 약 1 x 108내지 약 1 x 1011CFU/투여량을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 시험감염용 배양액이 약 1 x 1010내지 약 5 x 1010CFU/투여량을 포함하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 질환의 상기 임상 신호가 폐에서의 엠. 보비스 수준의 증가, 온도의 상승 또는 체중 증가의 감소를 포함하는 것인 방법.
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