KR100286573B1

KR100286573B1 - 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에 박테린 및 그의 이용방법

Info

Publication number: KR100286573B1
Application number: KR1019930700407A
Authority: KR
Inventors: 게리알.페터슨; 크리스나스워미이엔기대얄루
Original assignee: 솔베이 애니멀 헬쓰, 인크.
Priority date: 1990-08-16
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 2001-04-16
Also published as: ES2103827T3; US5565205A; AU8492391A; EP0550477A4; CA2089552A1; WO1992003157A1; JPH06503708A; GR3024214T3; DK0550477T3; EP0550477A1; BR9106748A; KR930701191A; AU643829B2; CA2089552C; DE69125842T2; EP0550477B1; ATE151990T1; DE69125842D1; JP3040467B2

Abstract

본 발명은 이상(二相) 에틸렌이민으로 불활성화시킨, 미코플라스마 히오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae)에 의한 감염으로 부터 돼지를 면역화시키기에 유효한 양의 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물 및 생리학적으로 허용되는 적절한 담체를 함유함을 특징으로 하는 박테린을 제공한다.

본 발명은 또한 이 박테린의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 미코플라스마 히오뉴모니에를 이상 에틸렌이민과 접촉시킴을 특징으로 하는 미코플라스마 히오뉴모니에 독성주의 불활성화 방법을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 돼지를 면역화하기 위해 일 용량의 박테린을 돼지에게 투여함을 특징으로 하는 미코플라스마 히오뉴모니에에 의한 감염에 대하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다.

Description

[발명의 명칭]

불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae) 박테린 및 그의 이용방법

[발명의 배경]

미코플라스마 히오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae)는 흔한 돼지 호흡기 병원균이다.

미코플라스마 히오뉴모니에는 돼지의 호흡기에 감염하여, 기관, 기관지 및 기관지에 집락을 형성한다.

미코플라스마는 호흡기 통로에 덮여있는 섬모가 더 이상 박동하지 못하도록 하는 섬모정지 인지를 생산한다.

결과적으로 섬모는 퇴화되어 더 심각한 이차 병원균에 의한 감염에 걸리기 쉽게된다.

미코플라스마 히오뉴모니에에 의해 발생되는 질병, 즉 지방병적인 폐렴은 모든 연령의 돼지에게 걸릴수 있는 만성의 비치명적 질병이다(R.F.Ross, Mycoplasmal diseases, pp. 436~444, in A.D. Laman, et al.,(eds.) Diseases of Swine, Iowa State University Press, 1986).

감염된 돼지는 기침과 발열의 미약한 증세를 나타낼 뿐이다.

그러나, 질병으로 인한 경제적인 충격은 심각하다.

이 질병은 돼지에게 있어서 질병-관련 체중감소의 가장 중요한 원인중의 하나인 것으로 믿어지고 있다(Whittlestone, pp. 133~176, in Tully ans Whitcomb(eds.) The Mycoplasma Vol 2 : Human and Animal Mycoplasma, New york, Academic Press, (1979)).

이 질병에 걸리면 일반적으로 체중이 잘 늘지 않으며, 발육이 더디고 잘 아픈 동물로 된다.

또, 감염된 돼지는 자주 다른 미생물에 의한 2차 감염에 걸리기 쉽다(Burch, Pig America pp. 26~77, December, 1982).

미코플라스마에 의한 감염으로 부터 돼지를 보호하기 위한 백신을 제공하고자 하는 수많은 시도가 있어 왔다.

그러나, 이러한 백신은 성공적이지 못하였고 질병은 아직도 널리 만연되어 있다.

몇몇 연구가들이 재조합 방법으로 생산한 미코플라스마 히오뉴모니에의 표면 항원을 함유하는 백신을 발표하였다[Schaller et al., U.S. Patent No. 4,894,332, 1990년 1월 6일 발행 : 유럽특허 공개 283,840호. 1988년 9월 28일 공개].

1986년 1월 3일자로 공개된 PCT 공개 제 WO 86/00019호는 다른 세포는 전혀 함유하지 않고, 미코플라스마 히오뉴모니에 혈장 막만을 함유하는 미코플라스마 히오뉴모니에 백신을 개시하고 있다.

에테리지등[Etheridge et al., Res, Vet. Sci. 33 : 188(1982)]은 생백신을 정맥내, 피하 또는 복강내 투여하면 미코플라스마 히오뉴모니에에 의한 폐 집락화에 대하여 불안전한 보호작용이 일어나는 것을 발견하였다.

크리스텐센등[Kristensen et al., Am. J. Vet. Res. 42 : 484(1981)]은 열불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 주사한후에 돼지가 미코플라스마성 폐렴에 대해 보호작용을 나타내지 않는 것을 발견하였다.

로스등[Ross et al., Am. J. Vet. Res. 45 : 1899(1984)]은 동결-해동 방법에 의해 제조한 미코플라스마 히오뉴모니에 추출물을 돼지를 면역화하는데 사용할 수 있음을 발견하였는데, 이때 얻어지는 보호 효과는 가변적이며, 경우에 따라 면역화 돼지에게서 병변의 전개가 증강되는 것도 관찰되었다.

이들 연구자들은 또한 포르말린 불활성화법에 의해 제조한 온전세포(whole-cell) 백신에 대하여 연구하였다.

포르말린 불활성화법은 미코플라스마 히오뉴모니에의 보호적 면역원성을 현저히 감추기 때문에, 이에 의해 얻은 백신은 효과적이지 않다.

요시오까등(Yoshioka et al., 미국 특허 제 3,917,819호, 발행일 : 1975년 11월 4일)은 미코플라스마 히오뉴모니에에 대한 불활성화 백신을 비롯하여, 포르말린으로 불활성화한 미코플라스마를 함유하는 수가지의 사(死) 미코플라스마 백신을 개시하고 있다.

그러나, 이 백신은 포르말린 불활성화에 의해 제조된 것이다.

즉, 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에 백신을 이용한 선행 기술은 성공적이지 못한데, 그 이유는 아마도 불활성화에 이용된 조건들, 즉 열처리, 포르말린 처리 또는 동결-해동이 생명체가 갖고있는 잠재적인 보호적 항원성을 파괴하기 때문인것 같다.

따라서, 지금까지 불활성화 독성 미코플라스마 히오뉴모니에를 함유하는, 미코플라스마성 폐렴으로 부터 돼지를 보호하기 위한 효과적인 온전 세포 백신은 개발되어 있지 않다.

본 발명은 이상(二相)에틸렌이민에 의한 처리법을 이용하여 불활성화시킨 미코플라스마 히오뉴모니에를 함유하는 온전세포 미코플라스마 히오뉴모니에 백신 또는 세균을 제공한다.

다른 불활성화 기술과는 달리, 본 발명의 방법은 놀랍게도 생명체의 보호적 면역원성에 악영향을 주지 않기 때문에 효과적인 박테린으로 제제화할 수 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 이상 에틸렌이민으로 불활성화시킨, 미코플라스마 히오뉴모니에에 의한 감염으로 부터 돼지를 면역화시키기에 유효한 양의 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물 및 생리학적으로 허용되는 적절한 담체를 함유하는 박테린을 제공한다.

본 발명은 적절한 배지내에서 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물을 배양하여 생육시키고 ; 이렇게 생육시킨 독성 미코플라스마 히오뉴모니에를 이상 에틸렌이민으로 처리하여 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화하며 ; 얻어진 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 농축시키고 ; 생성된 농축 및 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 회수하며 ; 그리고 이렇게 회수한 농축 및 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 생리학적으로 허용되는 적절한 담체와 혼합하여 박테린으로 제제화함을 특징으로 하는 박테린의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 미코플라스마 히오뉴모니에 배양액을 약 4mM 농도의 이상 에틸렌이민과 접촉시키고 ; 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화시키기에 효과적인 조건하에 배양액을 보온하며 ; 그리고 이상 에틸렌이민을 중화시키기에 유효한 농도의 티오황산나트륨을 첨가하여 배양액중의 이상 에틸렌이민을 중화시킴을 특징으로 하는 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 주의 불활성화방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 1용량의 박테린을 돼지에게 투여하여 미코플라스마 히오뉴모니에 감염에 대하여 돼지를 면역화함을 특징으로 하는, 미코플라스마 히오뉴모니에에 의한 감염에 대하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도 : 포르말린을 이용한 불활성화법으로 만든 박테린과 비교한, 이상 에틸렌이민으므로 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화하여 만든 박테린에 의하여 돼지내에서 유도된 상대 항체 역가를 비교한 ELISA 결과

제2도 : 이상 에틸렌이민-불활성화 박테린의 최소 보호용량 연구의 결과.

1주일(PV), 3주일(VI), 4주일(V2), 5주일(PCHI) 및 7주일(PCH3)된 돼지에게서 혈청 시료를 얻고, 항체 역가는 ELISA로 분석하였다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 현재로서 바람직한 구현예에서는, 박테린의 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물은 1002(ATCC 수탁번호 55088)로 명명된 분리물을 포함한다.

본 발명은 하기에서 1002로 명명된 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물(ATCC 수탁번호 55088)을 참고로 하여 설명되지만, 이성분 에틸렌이민으로 불활성화시킨 독성 미코플라스마 히오뉴모니에는 어느 것이나 모두 유효한 박테린으로 제제화 할 수 있는 것으로 예측된다.

수많은 독성 미코플라스마 히오뉴모니에가 당업계에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)을 비롯한 여러 기관으로 부터 입수할 수 있다.

마지막으로, 1002 분리물은 특허출원 절차를 목적으로 하는 미생물 기탁의 국제적 인정에 관한 부다페스트 조약에 따라 그 조건을 만족시켜 메릴랜드 20852 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어 있다.

박테린은 또 생리학적으로 허용되는 적절한 담체를 포함한다.

매우 다양한 이런 담체가 당업계에 공지되어 있으며, 특정한 담체를 선택하는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자가 행할 수 있는 일이다.

단지 예를 들자면, 생리학적으로 허용되는 적절한 담체에는 증류수, 탈이온수, 식염수 또는 광유가 포함된다.

현재로서 바람직한 구현예에서, 박테린은 또 유효량의 보조약을 함유한다.

본 명세서에서 사용된 "보조약"은 면역 반응을 일으킬 수 있는 물질이다.

보조약에는 독약, 자극약 및 박테린이 주입된 동물의 면역 반응을 증대시킬 수 있는 일반적인 물질들이 포함될 수 있다.

현재로서 바람직한 본 발명의 구현예에서는, 보조약에는 아크릴산 중합체, 예를들면 호모중합체를 포함한다.

이러한 아크릴산 호모 중합체의 예로서 시판되는 것은 카르보폴(Carbopol) 941(B.F. Goodrich Co., Cleveland, ohio)이다.

카르보폴의 화학식은 (CH₂CHOOOH)_N이다.

특정 보조약의 유효량은 박테린에 의해 백신화된 동물의 면역 반응에 미치는 보조약의 강화작용을 최적화하도록 쉽게 결정할 수 있다.

일반적으로, 보조약으로 유용한 아크릴산 중합체의 유효량은 박테린의 약 0.2%(W/V)이다.

본 발명의 박테린은 이상 에틸렌이민으로 불활성화시킨 돼지를 면역화하는데 유효한 양의 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물을 포함한다.

미코플라스마 히오뉴모니에에 의한 감염으로 부터 돼지를 "효과적으로 면역화"한다는 것은 박테린이 미코플라스마성 폐렴의 정도를 경감시키거나 예방한다는 것을 의미한다.

어느 경우에 있어서든, 당업자는 보조약을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 특정 분리물과 담체의 배합물에 있어서, 돼지를 면역화하기에 유효한 이상 에틸렌이민-불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에의 양을 쉽게 결정할 수 있다.

현재로서 바람직한 본 발명의 구현예에서, 유효량은 박테린 1ml당 최소한 약 10⁹미코플라스마 히오뉴모니에 DNA 세포 균등물이다("DNA 세포 균등물"에 대해서는 후술하는 방법 및 재료란 참고).

본 발명은 또한 적절한 배지에서 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물을 배양하여 생육시키고 ; 이렇게 생육시킨 독성 미코플라스마 히오뉴모니에를 이상 에틸렌이민으로 처리하여 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화하며 ; 얻어진 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 농축시키고 ; 생성된 농축 및 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 회수하며 ; 그리고 이렇게 회수한 농축 및 불활성화된 미코플라스마 히오뉴모니에를 생리학적으로 허용되는 적절한 담체와 혼합하여 박테린으로 제제화함을 특징으로 하는 박테린의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 1002로 명명된 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물(ATCC 수탁번호 55088)이 박테린의 제조에 사용되었다.

보다 구체적으로 설명하면, 미코플라스마 히오뉴모니에의 극성 분리물을 미코플라스마 브로쓰, 베이스, 효모 엑기스, 글루코스, L-시스테인, 암피실린, 탈륨 아세테이트, 돼지 혈청 및 탈이온수를 함유하는 적절 배지내에서 배양하여 생육시킨다.

현재로서 바람직한 이러한 배지의 일례는 보다 상세히 후술되어 있다.

분리물이 배양되는 정확한 조건은 배지의 정확한 조성 및 생육시키게 된 특정 미생물에 따라 달라질 수 있다.

그러나, 분리물은 전형적으로 배양시부터 수확시기까지 측정하여 약 48~약 144시간동안 생육시킨다.

이렇게 생육시킨 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물을 이어서 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화시킬 수 있도록 이상 에틸렌이민으로 처리한다.

즉, 분리물의 배양액을 약 1~ 약 10mM, 예를들면 약 4mM 농도의 이상 에틸렌이민과 접촉시킬 수 있다.

이어서, 배양액을 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화시키기에 유효한 조건, 예를들면 약 37℃에서 최소한 약 12시간동안 보온한다.

이어 배양액에 에틸렌이민을 중화시키기에 유효한 농도, 예를들면 약 10mM~약 20M, 예를들면 16mM 농도의 티오황산 나트륨을 첨가하여 배양액중의 이상 에틸렌이민을 중화시킨다.

본 발명의 한 구현예에서는, 미코플라스마 히오뉴모니에와 접촉하여 그를 불활성화시키는데 사용되는 이상 에틸렌이민은 배양액에 이상 에틸렌이민으로 전환되어 목적하는 불활성화 농도의 이상 에틸렌이민을 형성할 수 있게 하는 양, 예를들면 약 4mM 이상의 브로모에틸아민 히드로브로마이드를 배양액에 첨가하므로써 현장에서 형성시킨다.

생성된 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 농축시킨다.

이러한 미생물을 농축시키는 여러 방법들이 당업계에 공지되어 있다.

예를들면, 한외원심분리 같은 원심분리법 또는 한외여과 같은 여과법에 의해 미생물을 농축시킬수 있다.

이어서 역시 당업계에 주지된 방법을 이용하여 농축 및 불활성화된 미코플라스마 히오뉴모니에를 회수한다.

마지막으로, 이렇게 회수한 농축 및 불활성화된 미코플라스마 히오뉴모니에를 박테린을 형성할 수 있도록 생리학적으로 허용되는 적절한 담체와 배합된다.

최적의 상태로는, 이 혼합물은 유효량의 EDTA, 예를들면 박테린에 대하여 약 0.05~약 0.20%, 특히 최소한 약 0.07%(W/V)의 EDTA, 또는 유효 농도의 티메로, 예를들면 박테린에 대하여 약 0.005~약 0.05%, 특히 약 0.01%(W/V)의 티메로졸을 함유한다.

박테린은 또한 상기 방법을 여러가지로 변형하여 제조할 수 도 있다.

예를들면, 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화한 후에 농축시키는 것이 아니라, 불활성화전에 농축시킬수있다.

또, 박테린의 제조를 농축단계 전후에 불활성화단계를 반복하여서도 실시할 수 있다.

농축된 이상 에틸렌이민-불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에는 적절한 담체를 첨가하여 제제화할 수 있다.

희석제, 염료 또는 방부제를 첨가할 수도 있다.

EDTA같은 킬레이터를 바람직하게는 최소한 약 0.07%(W/V)의 최종 농도로 첨가할 수 있다.

식염수같은 희석제나, 당업계에 주지된 다른 담체를 사용하여, 박테린의 제조시에 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 희석할 수 있다.

방부제를 첨가할 수도 있다.

본 발명의 한 구현예에서는 방부제로서 티메로살을 최소한 약 0.01%(W/V)의 최종 농도로 첨가한다.

본 발명은 또한 미코플라스마 히오뉴모니에 배양액을 약 4mM 농도의 이상 에틸렌이민과 접촉시키고 ; 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화시키기에 효과적인 조건, 예를들면 약 37℃의 효과적인 온도에서 약 12시간의 유효시간동안 배양액을 보온하며, 그리고 이상 에틸렌이민을 중화시키기에 유효한 농도, 예를들면 이상 에틸렌이민 농도의 4배, 즉 이상 에틸렌이민의 농도가 약 4mM이면 약 16mM의 티오황산나트륨을 첨가하여 배양액중의 이상 에틸렌이민을 중화시킴을 특징으로 하는 독성 미코플라스마 히오뉴모니에주의 불활성화 방법을 제공한다.

또한 상술한대로, 이상 에틸렌이민은 L-브로모에틸아민 히드로브로마이드를 배양액에 첨가하여 현장에서 형성시킬수 있다.

본 발명은 또한 미코플라스마 히오뉴모니에 감염에 대해 돼지를 면역화시키기 위하여 최소한 1용량의 박테린을 돼지에게 투여함을 특징으로 하는, 미코플라스마 히오뉴모니에에 의한 감염에 대하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다.

원칙적으로, 박테린은 각종 경로를 통해 투여될 수 있다.

그러나, 현재로서 바람직한 본 발명의 구현예에서는, 박테린은 근육내 경로를 통해 투여된다.

또한, 현재로서는 박테린 용량은 약 2ml의 박테린을 함유하는 것이 바람직한데, 1ml 중에는 약 10⁹미코플라스마 히오뉴모니에 DNA 세포 균등물이 함유되어 있다.

박테린은 바람직하게는 2회 돼지에게 투여된다.

한번은 돼지 생후 약 1주일에, 그리고 두번째는 약 3주일에 투여된다.

주사투여를 목적으로 하는 본 발명에 따른 박테린은 생리학적으로 허용되는 비활성액체 희석제에 현탁된 불활성화된 독성 미코플라스마 히오뉴모니에를 포함한다.

적절한 희석제에는 물, 식염수 또는 당업계에 주지되어 있는 많은 다른 희석제들이 포함된다.

유리하게는, 미코플라스마 히오뉴모니에는 무균 조건하에서 멸균 희석제에 현탁된다.

주사용 박테린은 통상의 기술, 예를들면 돼지의 혈액과 등장을 이루는 염용액에 대해 투석하므로써 등장성으로 만들수있다.

박테린의 등장성을 얻기위해 주시 매질로 사용하기에 적절한 염용액을 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 박테린은 사용전에 희석하는 농축 조성물 또는 즉시 사용 가능한 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

후자의 경우에, 불활성화된 독성 미코플라스마 히오뉴모니에의 농도는 1ml당 최소한 약 10⁹DNA 세포 균등물이다.

본 발명의 이상 에틸렌이민-불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에는 또한 하나 또는 그 이상의 다른 유효 성분, 즉 미코플라스마 히오뉴모니에 또는 다른 질병-유발제에 대한 보호적 면역 반응을 유발할 수 있는 항원성 물질을 함유하는 백신의 일성분으로 사용될수도 있다.

[재료 및 방법]

박테린의 제조에 사용된 미생물은 1002로 명명되어 ATCC에 수탁번호 55088로 기탁되어 있는 독성 미코플라스마 히오뉴모니에이다.

원래 감염된 폐 균등물의 10^-2희석액을 미코플라스마 브로쓰에서 배양하여 감염폐로부터 분리한 이 균주는 마스터 종균(Master Seed)("X")을 확립하기 위하여 브로쓰에 7회 통과시켰다.

마스터 종균("X")의 동일성은 미코플라스마 브로쓰 한천에 도말하고 전형적인 미코플라스마 히오뉴모니에 형태학에 관하여 생육을 검사하므로써 확립하였다.

비교하기 위한 참고 균주로는 -NVSL에서 입수한 미코플라스마 히오뉴모니에 J주를 이용하였다.

마스터 종균("X")의 동일성은 SDS-PAGE 및 면역 블롯팅법을 통하여 참고 균주 미코플라스마 히오뉴모니에 J주 및 다른 관련 미코플라스마 균주와 비교하여 확립하였다.

마스터 종균("X")는 1002로 명명된 분리물의 제7차 통과물이다.

생산 종균은 "X + 2"로 통과물이다.

종 배양액은 "X + 3" 내지 "X + 6"의 통과물이고, 생산 배양액은 "X +6" 내지 "X +7"의 통과물이다.

종 배양액과 생산 배양액은 다음의 배지에서 번식시킨다.

1. 미코플라스마 브로쓰 베이스(시판품) …… 16,800g

2. 효모엑기스(시판품) …… 1,000g

3. 글루코스 …… 5,000g

4. L-시스테인 히드로클로라이드 …… 0.100g

5. 암피실린 …… 0.250g

6. 탈륨 아세테이트, 미국약전 …… 0.250g

7. 페놀레드(지시약 염료) …… 0.020g

[종 배지에 사용]

8. 멸균된 정상 돼지 혈청 …… 100,000g

(종 배지에 사용하기전에 58.5℃에서 30분간 열-불활성하 가능)

9. 탈이온수 …… 1,000,000g

각 성분들이 완전히 용해되면, NaOH를 이용하여 pH를 7.8 ± 0.4로 조정한다.

용액을 멸균 0.3μ 심층 필터, 멸균 0.3μ막 필터 또는 멸균 용기에 들어있는 멸균 0.2μ 카트리지 필터에 통과시켜 여과 멸균한다.

심층, 막 또는 카트리지 필터 및 용기는 사용전에 121℃ ± 2℃에서 적어도 30분이상 멸균시킨다.

기본 배지는 사용전에 글루코스, L-시스테인 히드로클로라이드, 암피실린 및 돼지 혈청없이 121℃ ± 2℃에서 30분간 오토클레이브할 수 있다.

L-시스테인 히드로클로라이드와 암피실린은 0.2μ 필터에 통과시켜 여과 멸균한 후 기본 배지에 무균적으로 첨가된다.

글루코스 용액은 30%(W/V)용액으로서 121℃ ± 2℃에서 별도로 30분간 오토클레이브한다.

멸균된 정상 돼지 혈청은 무균적으로 첨가한다.

완전 배지의 pH는 멸균 5N NaOH를 이용하여 7.8 ± 0.4로 조정한다.

종 배양 배지는 2℃~7℃에서 30일 까지 보관할 수 있으며, 오토클레이브된 생산배양액은 2℃~7℃에서 10일까지 보관할 수 있다.

종배양액은 30~80% 배지를 함유하는 250~4,000-ml 폴리카보네이트 플라스크 또는 유리 플라스크, 12-1 유리 항라리, 28- 및 200-1 발효조에서 생육시킨다.

생산 배양액은 30~80% 배지를 함유하는 200~3,000-1 발효조에서 생육시킨다.

마스터 종균("X")은 -20℃ 또는 냉각기중에서 100% 배지중에 유지시킨다.

생산 종균("X + 2")은 -20℃ 또는 냉각기중에서 90% 배지 + 10% 글리세롤에서 유지시킨다.

씨딩이나 접종을 위한 현탁액은 동결 종배양액("X" 또는 "X + 2")를 재빨리 해동시키고 5`15%(V/V)의 비율로 배지에 접종시키므로써 제조한다.

종배양액은 5~15%(V/V)의 비율로 배지에 멸균적으로 옮긴다.

종배지와 생산 배지는 다음과 같은 방법으로접종시킨다.

동결된 생산 종 배양액("X + 2")을 사용하여 250ml 플라스크에 들어있는 배지에 5~15%(V/V)의 비율로 접종하여 "X + 3" 통과액을 만든다.

이어서 적절한 용기내에 5~15%(V/V)의 비율로 멸균적으로 옮기므로써 그 다음의 종배양액들("X + 4" 내지 "X + 9")을 제조한다.

4,000ml 플라스크에 5~15%(V/V)의 비율로 접종하는데에는 250ml 플라스크 배양액을 사용할 수 있다.

4,000ml 플라스크 배양액은 121 항아리에 5~15%(V/V)의 비율로 접종될 수 있다.

121 항아리 배양액을 사용하여 28-~200-1 발효조에 5~15%(V/V)의 비율로 접종할 수 있다.

28-`200-1 발효조 배양액을 사용하여 200~3001 생산 발효조를 5~15%(V/V)의 비율로 접종할 수 있다.

종배양액과 생산 배양액은 37℃ ± 2℃에서 48~120시간 동안 보온한다.

모든 배양액은 생육기간 전체에 걸쳐 교반하에 보온한다.

발효조에는 멸균 공기를 주입하여 통기시킬 수 있다.

종배양액과 생산 배양액의 pH는 멸균 NaOH 용액을 첨가하여 7.4 ± 0.4로 유지시킬 수 있다.

30% 글루코스 멸균 용액은 필요한대로 생산 배양액에 첨가할 수 있다.

현미경으로 검사하여 생육 특성을 결정한다.

특징적인 생육이 일어나고 있는 것은 배지 pH의 감소(종배양액)나 배지의 pH를 유지하지 위한 NaOH 이용의 증가(생산 배양액)로 확인할 수 있다.

생육량은 다음과 같이 DNA 형광계로 측정한다.

4개의 1.5ml 배양액 부분 표본을 미세 원심분리 튜브에 수집한다.

시료를 12,000×g에서 10분간 원심 분리한다.

상층액을 완전하게 배수시키고, 펠릿을 10mM 트리스(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 1%(W/V) 소듐 도데실 설페이트로 이루어진 TNES 120μl에 재현탁시킨다.

재현탁된 펠릿을 볼텍스를 이용하여 10분간 격렬하게 교반한다.

유리 큐벳안에서 펠릿 재현탁액 10μl를 2ml의 획스트(Hoechst)염료 용액 : 10mM트리스(pH 7.4), 150mM NaCl 및 1mM EDTA(TNE)에 용해시킨 0.4㎍/ml과 혼합한다.

이어 큐벳을 DNA 표준물질을 이용하여 미리 보정해놓은 형광계에 넣는다.

형광의 양은 존재하는 DNA의 양에 비례한다.

다음 식을 이용하여 배양액중의 미코플라스마 히오뉴모니에 DNA 세포 균등물(Mycoplasma hyopneumoniae DNA cell equivalents : MHDCE)의 수를 계산한다.

또한

수확하기전에, 현미경을 이용하여 생산 배양액에 대하여 생육 특성 및 생육양을 검사하고 또 오염에 대하여 검사한다.

불활성화하기전에, 생산 배양액에 멸균 5N NaOH를 가하여 Ph를 8.2 ± 0.2로 조정한다.

불활성화를 위하여, 발효조안에 있는 생산 배양액에 직접 L-브로모에틸아민 히드로브로마이드(BEA)를 4mM 이상의 최종 농도로 첨가한다.

배양액은 37℃ ± 2℃에서 12~24시간 동안 교반하에 유지한다.

미코플라스마 균주를 이상 에틸렌이민에 노출시켜 불활성화시킨다.

생산 배양액중에서 L-브로모에틸아민 히드로브로마이드(BEA)의 보온중에 현장에서 생성된 이상 에틸렌이민(BEI)(일차 불황성화제)은 발효조내의 불활성화된 생산 배양액에 직접 티오황산 나트륨을 이상 에틸렌이민(BEI) 몰농도의 4배 이상의 최종 몰농도로 첨가하므로써 중화시킨다.

배양액을 37℃ ± 2℃에서 12~24시간 동안 교반하에 유지한다.

접종에서부터 수확에 이르기까지의 최단 및 최장 시간은 각각 48 및 144이다.

수확은 생산조의 물질을 멸균 용기에 풀링하여 행할 수 있다.

수확된 유체는 원심 분리 및/또는 한외여과에 의해 최초 부피의 약 10% ± 5%로 농축하고, 이어 멸균 염용액을 이용하여 투석여과할 수 있다.

농축액은 L-브로모에틸아민 히드로브로마이드(BEA)를 4mM 이상의 최종 농도로 첨가하여 다시 불활성화할 수 있다.

농축액은 37℃ ± 2℃에서 12~24시간 동안 교반하에 보온한다.

불활성화중에 생성된 이상 에틸렌이민(BEI)에 티오황산나트륨을 이상 에틸렌이민(BEI) 몰농도의 4배의 최종 몰농도로 첨가하여 에틸렌이민을 중화시킨다.

농축액을 37℃ ± 2℃에서 교반하에 12~24시간동안 보온한다.

티메로살 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 각각 0.01 및 0.07%의 최종 농도로 첨가한다.

특징적인 생육을 나타내는 생산 배양액만을 수확한다.

수확하기전에 각 생산조로 부터 그람-염색을 준비한다.

박테린은 티메로살 및 에틸렌디아민테트라아세트산을 각각 0.01% 및 0,07% 미만의 농도로 첨가하여 보존한다.

박테린에는 보조약인 카르보폴(B.F. Goodrich Co.)을 0.2%(W/V)의 최종 농도로 첨가할 수 있다.

멸균 염용액을 희석제로 사용할 수 있다.

적색 염료 FD ＆ C 40을 1l당 15mg의 농도로 박테린에 첨가할 수 있다.

최종 제품종의 미코플라스마 세포의 농도는 DNA 형광 측정법으로 결정하였을때 2.0ml 용량당 2×10⁹미코플라스마 히오뉴모니에 DNA 세포 균등물 이상이다.

만족할만한 미코플라스마 농축액을 보조약, 방부제, 염료 및 희석제와 함께 교반기가 장착된 멸균 용기내에 무균적으로 배합해넣고 30분 이상 교반한다.

본 발명은 하기 실시예를 참고로 보다 상세히 설명된다.

그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 국한되지 않고 또 국한되는 것으로 해석되어서도 안된다.

[실시예1]

4개의 서로 다른 종류의 미코플라스마 히오뉴모니에(Mhp) :

Mhp 10002-주, Mhp 10005-NB12주, Mhp 1003-J주, Mhp 1004-11주 및 Mhp1006-415주의 독성을 평가하였다.

피험 균주의 독성은 공격받은 돼지의 폐에 나타난 병변에 의하여 측정하였다.

이 기준에 따르면 엠. 히오뉴모니에 1002는 독성이 있는 것으로 판명되어 공격주로 사용하고, 박테린의 제조에 사용하기 위해 선택되었다.

29마리의 생후 3주된 위광견병-시험된 돼지를 각각 8마리, 8마리, 7마리, 6마리로 하여 4군으로 분할하였다.

이들 돼지를 생후 6주일되어 공격할 시기가 될때까지 격리하여 키웠다.

4주의 미코플라스마 히오뉴모니에 각각의 저통과 배양액 원액을 해동하고, 각 주의 10% 접종액을 흡막폐렴-유사 생명체(PPLO) 완전배지(51페이지 참고)에 첨가하였다.

배양액을 37℃에서 12일간 보온하였다.

적절한 공격 배양액 6ml를 1~1/2인치 고무 튜브가 부착된 10ml 주사기를 이용하여 각각의 비공에 투여하였다.

흡입을 촉진하기 위하여 잠시동안 비공위에 플라스틱 봉지를 걸어두었다.

이러한 공격을 3일간 연속적으로 반복하였다.

색변화 유니트(CCU)를 측정하므로써 공격 접종액을 정량 하였다.

모든 돼지를 안락사시키고 첫번째 공격이 있은지 3주후에 부검을 실시하였다.

폐를 꺼내어 특징적인 엠. 히오뉴모니에 병변을 검사하였다.

전형적인 엠. 히오뉴모니에 병변이 있는 폐 부위를 절단하고 적절한 멸균 용기내에 넣어 -70℃에서 동결 보존하였다.

이들 기관 시료로 부터 엠. 히오뉴모니에를 분리하는 것은 나중에 실시하였다.

얻어진 결과를 표 1과 2에 나타내었다.

이 연구에서 4종류의 다른 엠. 히오뉴모니에가 이용되었다.

총 용량은 9.0×10⁷~9.0×10¹⁰CCU/돼지 이었다.

동물 대 폐병변이 있는 군의 비율(동물/폐병변이 있는 군)은 17~50% 범위이었다.

모든 돼지에 있어서, 폐병변은 심장엽 및 근첨엽에만 국한되어 있었고, 엠. 히오뉴모니에의 특징으로 나타내었다.

용량(CCU/돼지)과 폐병변의 정도사이에는 상호 관련이 없는 것으로 나타났다.

엠. 히오뉴모니에 1002와 Mhp 1005-NB 12가 가장 독성이 강한 것으로 나타났다.

그러나, 엠. 히오뉴모니에 1002가 빠르게 생육하였고 본 발명자들의 PPLO 배지에서 더 높은 CCU값까지 생육하였다.

수집된 폐사료로 부터 공격 균주를 분리하고자 하는 시도는 성공적이었다.

배양액을 위상차 현미경으로 관찰하였는데 엠. 히오뉴모니에임을 나타내는 것이었다.

폐 병발, PPLO 배지에서의 생육 및 분리물을 이용한 이전의 연구들을 기초로 하여 엠. 히오뉴모니에 1002를 선택하여 계속 연구하였다.

[PPLO 완전배지]

I. 성분

A. PPLO 브로쓰 W/O 크리스탈 바이올렛(800ml)

a. 탈이온수에 16.8g의 디프코(Difco) PPLO W/O 크리스탈 바이올렛을 용해시켜 800ml로 만든다.

b. 자기 교반기를 이용하여 교반하면서 500g의 앰버라이트 IRA 400과 실온에서 2시간동안 혼합한다.

c. 여과지를 이용하여 앰버라이트를 여거한다.

B. 탈륨 아세테이트(2.5ml)

a. 총 부피 2.5ml의 탈이온수에 0.25g의 탈륨 아세테이트를 용해시킨다.

C. 페놀 레드(0.5ml)

a. 0.5ml의 탈이온수에 0.02g의 페놀 레드를 용해시킨다.

D. L-시스테인 히드로클로라이드(1ml)

a. 1.0ml의 탈이온수에 0.1g의 L-시스테인 히드로클로라이드를 용해시킨다(사용하는 당일 제조).

E. 암피실린(2.5ml)

a. 2.5ml의 탈이온수에 0.25g의 암피실린을 용해시킨다(사용 당일 제조).

F. 글루코스(50ml)

a. 총 부피 50ml의 탈이온수에 10g의 글루코스를 용해시킨다.

G. 효모엑기스(50ml)

a. 25g의 효모(Fleischman Co.)를 자기 교반기를 이용하여 빠르게 교반하면서 150ml의 탈이온수에 용해시킨다.

b. 효모 혼합물에 0.81ml의 10N NaOH를 천천히 가한다.

c. 15psi에서 15분간 오토클레이브한다.

d. 4℃에서 밤새 보관한다.

e. 8000rpm에서 30분간 원심분리한다.

f. 상층액을 수집하여 측정한다.

g. 2ml의 1N HCl을 100ml의 상층액에 첨가한다.

h. 10,000rpm에서 1시간동안 원심 분리한다.

i. 상층액을 수집한다.

j. 상층액을 처음에는 0.8μ 필터에, 이어서 0.45μ 필터에, 그리고 최종적으로 0.2μ 필터에 통과시켜 여과한다.

k. 4℃에서 보관한다.

H. 기브코(Gibco)돼지 혈청(100ml)

a. 56℃에서 30분간 열화성화한다.

Ⅱ. 성분의 배합

a. 괄호안에 표시된 양만큼 각 성분을 혼합한다.

b. 처음에는 3.0μ 필터에, 이어서 0.45μ 필터에, 그리고 마지막으로 0.2μ필터에 통과시켜 여과한다.

c. 37℃에서 밤새 보온하여 순도를 검사한다.

d. 4℃에서 보관한다.

[색변화 유니트]

재료 및 장치 :

Mhp 완전 배지

12개의 12×75mm 스냅-캡 플라스틱 튜브

피펫 또는 콘월 주사기

배양액

방법 :

1) 12개의 튜브 모두에 1.8ml의 배지를 가한다.

2) 처음 튜브에는 0.2ml의 배양액을 넣고 튜브 11에는 10배 희석액을 넣는다.

튜브 11에서 0.2ml의 배양액을 버린다.

3) 튜브 12에는 배양액을 넣지않고 대조로 사용한다.

4) 튜브를 안전하게 마개를 막고 37℃에서 14일간 보온한다.

5) 역가를 측정하기 위하여 색 변화를 관찰한다.

제14일에, 색이 적색에서 황색으로 변한 가장 묽은 희석액을 기록하고 다음 식에 따라 CCU/ml를 계산한다 :

CCU/ml = 가장 묽은 색 변화 희석액 × 0.2/2.0

[실시예2]

이상 에틸렌이민(BEI)-불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에 박테린 및 포르말린-불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에 박테린에 대하여 엠. 히오뉴모니에에 의한 독성 공격으로 부터 돼지를 보호하는 능력을 평가하였다.

포르말린-불활성화 박테린이 BEI-불활성화 박테린보다 현저하게 높은 ELISA 역가를 나타내었다.

그러나, BEI-불활성화 박테린만이 공격으로 부터 현저하게 보호하여 주었다.

이러한 결과는 엠. 히오뉴모니에에 대한 면역 반응에 있어서, 국소적 분비 항체 및/또는 세포 중개 면역이 순환 항체보다 더 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 것이다.

이들 결과를 평가하여 볼때, BEI-불활성화 박테린이 차후의 연구를 위하여 선택될 것이다.

이 연구에서 사용된 돼지는 이오니아 피그스, 인코포레이티드(Ionia Pigs, Incorporarted, Ionia, Iowa)에서 입수한 것이다.

원래는 P-5723-3으로 명명된 미코플라스마 히오뉴모니에 주 1002(찰스 암스트롱 박사, Purdue University)를 각 통과마다 10% 접종액을 사용하여 상술한 대로 X + 7 통과액이 될때까지 배지에 연속적으로 통과시켰다.

각 통과액은 75rpm에서 휘저으면서 37℃에서 72~80시간동안 보온하였다.

X + 7 통과액 배양액을 보온한후, 미코플라스마 주의 생육정도와 농도를 각각 배양배지의 색과 위상차 현미경에 의해 시각적으로 관찰하였다.

색변화 유니트(CCU)의 정량법을 이용하여 존재하는 생명체의 수를 결정하기 위해 시료를 채취하였다.

불활성화-프로말린 : 포르말린의 400ML의 X + 7 배양액에 0.2%의 최종 농도로 첨가하였다.

세포 현탁액을 37℃에서 24시간 동안 75rpm에서 휘저었다.

불활성화-이상 에틸렌이민(BEI) : X + 7 배양액 400ml에 40ml의 2%(W/V) 중탄산나트륨을 첨가하여 pH를 7.5로 상승시켰다.

10ml 탈이온수에 용해시킨 2-브로모에틸아민 히드로브로마이드 0.33g양을 0.2㎛ 필터에 통과시켜 멸균하고 배양액에 첨가하였다.

배양액을 37℃에서 24시간 동안 혈장에서 75rpm으로 휘저었다.

0.5g의 티오황산나트륨을 함유하는 탈이온수 10ml를 여과 멸균하고 불활성화 배양액에 첨가하여 BEI를 중화시켰다.

중화된 배양액을 37℃에서 24시간동안 75rpm으로 휘저었다.

박테린을 제조하기 위하여, 각 불활성화 배양액의 세포를 4℃에서 15,000×g에서 40분간 펠릿화하고, 이어 약 50ml의 PBS에 재현탁시키고, 이러한 방식으로 3회 세척하였다.

최종 펠릿을 약 50ml의 PBS에 재현탁시켰다.

재현탁된 세포를 카르보폴과 혼합하여 최종 제제가 0.2%(W/V)의 카르보폴을 함유하고, 2ml 용량 제형이 5×10¹⁰CCU를 포함하도록 한다.

백신은 또한 방부제로서 0.005%(W/V) 티메로살을 함유한다.

대략생후 1주 및 3주된 새끼 돼지에게 2ml 용량의 적절한 박테린을 목 부위에 근육내 투여하여 백신화하였다.

1군의 돼지에게는 백신을 주사하지 않고 공격 대조군으로 이용하였다.

엠. 히오뉴모니에 분리물 1002의 X 통과액을 10% 접종액을 이용하려 상술한 배지내에서 X + 2단계까지 통과시켰다.

배양액을 37℃에서 75rpm으로 80시간동안 휘저었다.

X + 2 통과액의 보온후에, 미코플라스마 균주의 생육 정도 및 농도를 백신 제조를 위한 미코플라스마의 농축에서와 동일한 방법으로 평가하였다.

동물에게 일치 백신을 투여한 것과 동일한 날에, 생후 1주일된 몇마리의 돼지에 상기 공격 배양액 2ml를 접종하였다.

접종물은 15게이지 바늘을 통하여 기관에 삽입된 3-1/2 프렌치 톰 캣 카테테르를 통하여 주사되었다.

3주 동안 감염이 진행되도록 하였다.

상술한 방법대로 피험 돼지를 위한 공격 배양액을 제조하였다.

그러나, 72시간, 96시간 및 120시간 동안 생육한 후에는 X + 2 통과 배양액을 이용하여 공격하였다.

생후 4주에(2차 백신이 있은지 1주후) 1~2ml의 프롬에이스 베탈라르(Prom Ace Vetalar)(1 : 10)용액을 이용하여, 백신화 및 비백신화 동물을 진정시켰다.

진정처치후에, 비강에 삽입된 짧은 고무 튜브에 연결된 주사기를 통하여 3ml 용량의 공격 배양액을 비강내(비강당 1.5ml씩) 투여하였다.

동일한 배양액을 이용하여 다음 이틀동안 상기 절차를 반복하였다.

CCU에 의해 72시간 배양액 시료중에 생존하는 미코플라스마 균주를 정량하였다.

역가는 5×10⁸과 5×10⁹CCU/ml 범위에 있었다.

공격시에, (3주전에 먼저 감염시킨)삼사마리의 종돈을 각 시험군과 함께 섞어 자연스러운 공격이 이루어지도록 하였다.

1차 백신화가 있는 날(PV), 2차 백신이 있는 날(VI), 공격 제1일(V2), 공격후 1주일(PCH1) 및 공격후 3주일(PCH2)된 날에 모든 새끼 돼지로 부터 혈액 시료를 채취하였다.

각 혈액시료중의 혈청을 56℃에서 30분간 열불활성화하고 -20℃에서 보관하였다.

ELISA 분석법을 이용하여 엠. 히오뉴모니에 항체를 시험하였다.

최초 공격이 있고 21일 후에, 동물의 대정맥에 직접 유타나시아 용액 2~5ml를 주입하여 안락사시켰다.

즉시 흉강을 열고 폐를 그대로 꺼내었다.

폐의 사진을 찍고 다음과 같은 방법으로 총 병변을 평가하였다.

각 근첨엽 및 심장엽에는 10점, 중간엽에는 5점, 그리고 횡격막엽의 각 주요 모서리에는 5점을 주어, 만약 이들 지역이 모두 전체적으로 경화되어 있다면(이 경우는 흔하지 않게 심한 경우이다), 병변 점수는 55점이 된다.

얻어진 실제 점수는 이 최고 점수의 백분율로 표시한다.

이를 병변점수율(%)로 정의한다.

병변점수를 기록하기 위하여 도식화하였다.

각 처치군간의 중요한 차이점을 확인하기 위하여, 투-테일드 스튜던트 T-시험(Two tailed Student's T-test)에 의해 병변 점수율을 통계학적으로 분석하였다.

ELISA 결과를 제1도에 나타내었다.

1주령된 돼지에게는, 백신화전에 (PV) 모든 군의 돼지가 항-엠. 히오뉴모니에 순환항체를 갖고있다.

이런 역가는 재백신화전(VI)에 3주령된 돼지에게서 감소되고 있다.

4주령시에, 공격전에(V2), 포르말린-또는 BEI-불활성화 박테린으로 백신화한 동물은 비백신화 동물보다 높은 역가를 나타낸다.

그러나, 포르말린-불활성화 박테린은 BEI-불활성화 박테린보다 극적으로 높은 역가를 유발시켰다.

병변 점수 결과를 표 3에 나타내었다.

BEI-불활성화 박테린은 평균 병변점수율을 약 60% 정도 감소시켰다.

이러한 감소는 통계학적으로 매우 의의있는 것이다(P 〈 0.01).

혈청학적 반응과 병변점수율 사이에는 상호 관계가 없는 것으로 보인다.

포르말린-불활성화 박테린이 가장 높은 순환 항체 역가를 유발시키는 반면, BEI-불활성화 박테린만이 공격으로 부터 돼지를 보호하였다.

이러한 결과는 미코플라스마 히오뉴모니에에 의한 감염에 대한 면역보호에 있어서 순환 항체가 중요한 역할을 하지 않는다는 것을 시사한다.

아마도 국소적 분비 항체 및/또는 세포-매개 면역성이 훨씬 더 중요한 것 같다.

BEI-불활성화 박테린은 아마도 면역계의 이러한 무기를 유발시키는 것처럼 보인다.

[실시예3]

면역성 존속기간 시험에 의해 미코플라스마 히오뉴모니에 박테린을 평가하였다. 박테린을 1주 및 3주령된 돼지에게 투여하였다.

백신 처리하지 않은 같은 배의 새끼를 대조로 사용하였다.

백신화군과 비백신화군의 일부에게 1월령되었을때 독성 엠. 히오뉴모니에를 이용하여 공격하였다.

또 다른 일부의 백신화군 및 비백신화군에게는 2월령되었을때 공격하였다.

나머지 동물에게는 4월령 되었을때 공격하였다.

1월, 2월 및 4월령된 백신화군에 있어서 유의할만한(P 〈 0.05)보호가 관찰되었다.

이러한 결과는 1주열 및 3주령 되었을때의 백신화가 돼지에게 장기간의 보호를 제공한다는 것을 시사한다.

이 연구에서 사용된 박테린은 1ml당 9.0 log₁₀미코플라스마 히오뉴모니에 DNA 세로 균등물(MHDCE)을 포함하였다.

76마리의 1주령된 돼지를 2개의 처치군으로 나누고, 같은 배의 새끼들을 이 처리군에 분포시켰다.

이들 동물중 60마리(처치군마다 30마리)는 이오니아 피더 피그스, 인코포레이티드(Ionia Feeder Pigs, Inc., Ionia, Iowa)로 부터 구입한 것이고, 16마리의 동물(각 처치군마다 8마리)은 솔베이 애니멀 헬쓰 인코포레이션(Solvay Animal Health, Inc., Charles City, Iowa)사의 SPF 돼지부에서 구입한 것이다.

첫번째 처치군의 돼지는 1주령사에 오른쪽 귀 뒤쪽의 목 근육을 통해 근육내 주사하여 백신화하였다.

2주후에 목의 좌측에 동일하게 반복하였다.

두번째 처치군의 동물은 백신화하지 않았다.

이오니아 돼지를 3주령시에 이유시키고 격리실로 옮겼다.

SPF 돼지는 공격시까지 SPF 떼와 함께 있도록 하였다.

상술한대로 공격 물질을 제조하여 투여하였다.

1월령시에, 10마리의 이오니아 백신처리 동물, 10마리의 이오니아 대조동물, 2마리의 SPF 백신처리 동물 및 2마리의 SPF 대조동물들을 격리실로 옮기고 공격처리를 행하였다.

2월령시에, 이오니아 백신처리 동물 8마리 및 대조동물 8마리, 그리고 SPF 백신처리 동물 1마리 및 대조동물 3마리를 격리실로 옮기고 공격 처리를 행하였다.

4월령시에 이오니아 백신처리 동물 8마리 및 대조동물 8마리, 그리고 SPF 백신 처리 동물 5마리 및 대조동물 3마리를 격리실로 옮기고 공격 처리를 행하였다.

공격이 있은지 3주후에, 모든 돼지를 안락사시키고, 상술한 대로 폐 병변 점수율을 결정하였다.

연구도중에 죽은 동물은 분석에 포함시키지 않았다.

연구 과정중에 총 8마리의 백신 무처리 동물 및 6마리의 백신처리 동물이 죽었다.

이들 동물은 일반적으로 실험대상으로 부적합하였거나, 심한 장염, 늑막염 또는 심낭염을 앓았다.

부검시에 엠. 히오뉴모니에로 부터 유래된 것이 아닌 총 폐병변, 즉 표면 피브린, 흉곽 협착 또는 출혈 농양이 있었던 동물은 분석에 포함시키지 않았다.

총 1마리의 백신무처리 동물 및 3마리의 백신처리 동물이 이러한 병변을 나타내었다.

원-테일드(one-tailed)스튜던트 T-시험에 의해 폐병변 점수율을 통계학적으로 분석하였다.

병변점수율과 통계학적 분석을 표 4에 나타내었다.

백신 무처리 동물을 비롯하여 모든 돼지에 있어서, 연령에 따라 엠. 히오뉴모니에 공격에 대한 내성이 생기는 것으로 나타났다.

백신처리 및 백신 무처리 동물군 모두에 있어서, 평균 병변 점수율은 공격시의 동물의 연령에 따라 감소한다.

이러한 공격에 대한 증강된 내성이 면역학적 현상인지 생리학적 현상인지는 명확하지 않다.

백신처리 동물에게는 4월령되었을때에도 유의할만한(P〈0.05)보호가 주어진다.

상술한 방법대로 계산한 실제 보호율은 동물의 연령에 따라 감소한다.

그러나, 4월령 되었을때의 63%의 보호율은 병변이 실제적으로 감소되었음을 나타낸다.

이 시험의 결과는 엠. 히오뉴모니에 박테린이 돼지에게서 장기간 지속되는 보호를 유발할 수 있다는 것을 입증한다.

1주령 및 3주령 되었을 때 백신 처리된 돼지는 4월령 되었을때에도 현저하게 보호를 받는다.

시장에 내기 위한 돼지는 평균적으로 약 5~5.5개월 동안 생존한다.

따라서, 엠. 히오뉴모니에 박테린으로 백신화하면 중요한 생육시기동안에 보호를 부여할 수 있다.

4월령 이후에 일어나는 엠. 히오뉴모니에 감염은 보호작용에 현저한 충격을 주지 않는다.

★ 유의성(P 〈 0.05)

[실시예4]

이 실시예에는, 매 ml당 7.0, 8.0, 9.0, 9.25, 10.0 log₁₀엠. 히오뉴모니에 DNA 세포 균등물(HDCE)를 함유하는 미코플라스마 히오뉴모니에 박테린을 최저 보호용량(MPD)연구에서 평가하였다.

박테린을 1주 및 3주령된 동물에게 2ml씩 근육내 주사하였다.

1ml당 ≥ 9.0 log₁₀MHDCE를 함유하는 박테린에 의해 공격에 대한 유의할만한(P 〈 0.05)보호가 유발되었다.

이 시험에서 사용된 동물은 이오니아 피더 피그스사에서 구입하였다.

128마리의 1주령된 돼지를 각 16마리씩 8개 처치군으로 나누었다.

처치군에 같은 배의 새끼를 분포시켰다.

돼지의 귀에 태그를 붙여 확인하였다.

3개의 군에는 백신처리를 하지 않았다.

백신을 우측 귀 뒤쪽의 목 근육에 2ml식 근육내(IM) 주사에 의해 투여하고, 2주후에 목의 좌측에 대해 반복하여 투여하였다.

돼지를 3주령 되었을때 이유시키고, 솔베이 애니멀 헬쓰 인코포레이션의 연구 기관으로 옮겼다.

백신처리 돼지와 백신 무처리 군중 두마리의 돼지를 솔베이사의 두개의 격리실에서 양육하였다.

두개의 격리실중 각각에 백신무처리 군의 돼지 1마리씩을 넣었다.

세번째 백신 무처리군은 외래성 엠. 히오뉴모니에 공격에 노출되는 것을 피하기 위하여 별도로 양육하였다.

4주령되었을때, 백신 처리군 동물과 백신 무처리 2군(NV/CH)에게 독성 엠. 히오뉴모니에를 투여하였다.

별도로 양육한 세번째 백신 무처리군(NV/NC)에게는 투여하지 않았다.

1주, 3주, 4주 및 7주령되었을때 각 돼지로 부터 혈청 시료를 채취하고, 실시예 2에 기술한대로 ELISA에 의해 염. 히오뉴모니에에 대한 항체를 정량하였다.

공격이 있고 3주후에, 모든 돼지를 안락사시키고, 병변 점수율을 결정하였다.

엠. 히오뉴모니에에 의하지 않은 총 폐병변, 즉 표면 피브린, 흉곽 협착 또는 출혈성 농양이 있는 동물은 분석에 포함시키지 않았다.

연구 과정중에 죽은 동물도 분석에 포함시키지 않는 원-테일드 스튜턴트 T-시험에 의해 폐병변 점수율을 통계학적으로 분석하였다.

시험은 두개의 백신무처리, 피공격군이 서로 현저하게 다르지 않다는 것을 보여주었다.

따라서, 두개의 군을 다른 처치군의 T-시험 분석에 서로 합하였다.

ELISA 결과를 표 5에 나타내었다.

1주령시에, 동물들은 측정 가능한 양의 엠. 히오뉴모니에 항체를 갖고 있었다.

ELISA에서는 온전 세포 엠. 히오뉴모니에 항원을 사용한다.

따라서, 어머니로 부터 받은 이들 항체중 일부가 미코플라스마 히오뉴모니에(Mycoplasma flocullare)에 대한 것일 수 있다는 가능성을 배제하기는 어렵다.

엠. 히오뉴모니에와 엠. 플로클라레는 일부 항원을 공유한다.

그럼에도 불구하고, 어머니에게서 받은 이들 항체들은 급속히 사라져서 3주령되면 균질하게 낮아진다.

1ml당 ≥ 9.0 log₁₀MHDCE를 함유하는 박테린으로 백신처리된 동물들은 3주령시에 2차 백신 처리후에 혈청 전환된다.

예측하지 못했던 결과는 아무런 공격도 있기전의 4주령된 백신 무처리 및 무공격 대조군에서 역가가 증가하는 것이었다.

그러나, 증가율은 백신처리군에서 보다 훨씬 덜 극적이었다.

이러한 결과는 1ml당 ≥ 9.0 log₁₀MHDCE를 함유하는 박테린의 엠. 히오뉴모니에 순환 항체 역가를 효과적으로 유발하는 것을 시사하는 것이다.

병변 점수율과 통계학적 분석을 표 6에 나타내었다.

보호율을 계산하기 위하여, 다른 처치 군의 평균 병변 점수율로 부터 백신무처리, 무공격군의 평균 병변 점수율을 삭감하였다.

얻어진 조정된 평균값을 다음 식에 대입하였다.

백신처리에 의해 유발되는 보호율은 용량이 증가됨에 따라 증가된다는 것은 명확하다.

T-시험 분석은 1ml당 ≥ 9.0 log₁₀MHDCE를 함유하는 박테린에의해 유의할만한(P 〈 0.05) 보호가 얻어진다는 것을 나타낸다.

1ml당 7.0 log₁₀MHDCE를 함유하는 박테린이 투여된 처치군은 백신 무처리 공격 대조군보다 높은 평균 병변점수율을 나타냈는데, 이는 최적 용량보다 낮은 용량은 공격후의 병변 전개를 증가시킬수 있다는 것을 시사한다.

이러한 결과는 최소 보호 용량이 약 2×10⁹MHDCE(1ml당 9.0 log₁₀MHDCE를 함유하는 박테린 2ml)라는 결론을 뒷받침한다.

[실시예5]

DNA 결합 염료 획스트 33258을 이용하여 미코플라스마 히오뉴모니에를 측정하는 형광 분석법을 기재한다.

이 분석법은 엠. 히오뉴모니에 배양액을 원심분리하여 세포를 농축시키고, 세정제 완충액중에서 세포를 분해시키며 분해물을 분석하는 단계를 포함한다.

미니형광계(TKO-100, Hoefer Scientific)을 사용하고, 분광법으로 정량한 정제된 DNA를 이용하여 표준 곡선을 확립한다.

엠. 히오뉴모니에 배양액의 생육을 분석법을 이용하여 감시하고, 결과를 전통적인 색변화 유니트(CCU) 분석법과 비교하였다.

미코플라스마 히오뉴모니에 연구와 관련된 한가지 문제점은 이 생명체의 생육을 감시하기 어렵다는 점이다.

도말 효율이 생육단계마다 현저하게 달라지며 콜로니가 작고 극히 느리게 생육하기 때문에, 콜로니 형성 유니트(CFU) 분석법이 실용적이지 않다.

전통적으로 엠. 히오뉴모니에 세포는 색 변화 유니트(CCU) 분석법에 의해 그 수가 계산되어 왔다.

이 분석법은 여러 배양액 희석액을 만들어 신선한 배지 튜브에 넣는 것을 포함한다.

이어 희석액을 37℃에서 14일간 보온한다.

미코플라스마 히오뉴모니에를 함유하는 튜브는 산성 pH로의 변화를 나타낸다.

원배양액의 역가는 생육을 나타내는 가장 묽은 희석액으로 표시한다.

CCU법의 높은 실험적 오차 및 분석에 요구되는 수많은 복제 튜브때문에, 보다 빠르고 정확한 시험이 요구되어 왔다.

획스트 33258 염료와 TKO 100DNA 미니 형광계는 호퍼 사이언티픽 프로덕트(Hoefer Scientific Products)사로 부터 구매하였다.

청어 정자 DNA는 시그마 케미칼(Sigma Chemical Co.)사로 부터, 그리고 다른 모든 화학물질도 시그마 케미칼로 부터 시약 등급의 것을 구입하였다.

엠. 히오뉴모니에 분리물을 상기 실시예 1에 설명된대로 진탕 플라스크내에 있는 200ml 배양액중에 생육시켰다.

6개의 플라스크에 접종하고 평행하게 보온하였다.

각 배양액으로 부터 24시간 간격으로 시료를 채취하여 pH를 측정하고 CCU 및 DNA 분석을 행하였다.

6배양액 각각의 pH값을 각 시점마다 평균하였다.

색변화 분석은 상기 실시예 1에서 설명한대로 행하였다.

6배양액에서 얻은 CCU값을 각 시점마다 평균하였다.

DNA 분석을 위해서, 각 배양액의 4개의 부분 표본 1.5ml 씩을 미세원심분리 튜브에 모으고 12,000×g에서 10분간 원심 분리하였다.

상층액을 완전히 배수하고, 펠릿을 10mM 트리스(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA 및 1%(W/V) 소듐 도데실 설페이트(TNES)에 재현탁시켰다.

재현탁 펠릿을 10초간 격렬하게 보르텍스하였다.

10μl의 재현탁액을 유리 큐벳내에서 10mM 트리스(pH 7.4), 150mM NaCl 및 1mM EDTA에 용해시킨 0.04%(W/V) 획스트 염료 2ml와 혼합하였다.

큐벳을 TNES로 희석시킨 청어 정자 DNA 표품을 이용하여 미리 보정해높은 TKO 100 DNA 미니 형광계에 넣었다.

각 시료의 4개의 부분 표본 각각에 대해 얻어진 값을 평균하고, 6배양액의 결과를 평균하였다.

분석에 있어서 동적인 선형 반응 범위는 10μl 피험 시료당 대략20~2000ng DNA 이었다.

이는 1ml 배양액당 0.16~16㎍ DNA의 유효 범위로 전환시킬 수 있다.

엠. 히오뉴모니에 게놈은 대략 5×10⁸달톤이다(S. Razin, The Mycoplasmas. Microbiol. Rev. 42 : 414~470(1978)).

이는 매 세포당 8×10^-10㎍ DNA에 해당한다.

따라서 형광 분석의 하한치(0.16㎍DNA/ml 배양액) ÷ (8×10^-10㎍ DNA/세포) = 2×10⁸세포/ml 배양액이다.

상한치는 이 값의 100배 또는 1ml당 2×10¹⁰세포이다.

이 분석은 세포 농도를 측정하는 간접적 방법이며 따라서 결과는 1ml당 엠. 히오뉴모니에 DNA 세포 균등물 또는 MHDCE로 나타낸다.

로그기의 생육중에(24~72시간), MHDCE와 CCU값 사이에 좋은 상호 관계가 있다.

MHDCE는 CCU값보다 4~5배 높다.

일반적으로 CCU 분석이 미코플라스마 세포의 농도를 낮게 평가한다고 느껴진다.

따라서 DNA 분석법은 엠. 히오뉴모니에 세포의 진짜 숫자를 보다 정확하게 반영할 수 있다.

CCU 분석법은 본래부터 실험적 오차가 나기 쉽다.

CCU 분석법의 정확성을 개량하기 위해서는 많은 수의 복제 튜브와 보다 미세한 일련의 희석액(2배 또는 4배 희석액)이 요구된다.

DNA 분석법은 실험적 오차가 나기 쉽지 않다.

DNA 분석법에 있어서 각종 시료 조작 및 소량 측정이 관여하고 있기 때문에 약간의 오차가 있다.

그러나, 이런 오차는 시험을 수행하는 조작자의 기술과 관련되어 있다.

대부분의 조작자는 어느 정도의 훈련과 경험후에 DNA 분석을 매우 잘 수행한다.

DNA 분석법은 살아있거나 죽어있는 세포내의 DNA 또는 용액중에 유리되어 있는 모든 DNA를 측정한다.

한편 CCU 분석법은 살아있는 세포만을 측정한다.

이는 왜 시간에서의 배양액중의 MHDCE가 24시간에서보다 약간 높은가 하는 것을 설명한다.

0시간에서 측정된 DNA의 실질적인 일부가 아마도 죽였고, 일련의 이전의 결과로서 죽어가는 세포들이 생존하지 못하기 때문이다.

정체기의 배양액(〉 72시간)에 있어서, CCU 분석법은 생존 세포의 손실을 명확하게 드러낸다.

엠. 히오뉴모니에는 산성 조건에 민감하여, 이 사방에 의한 손실은 아마도 pH와 관련되어 있을 것이다.

DNA 분석법은 더 늦게 반응하는데, 아마도 이미 죽거나 죽어가고 있는 세포들이 아직 검출될 DNA를 갖고 있기 때문일 것이다.

엠. 히오뉴모니에를 정량하기 위한 CCU 분석법은 몇가지 결점을 갖는다.

첫째로, 이 방법은 미코플라스마 세포의 수를 실제보다 낮게 평가할 수 있다.

둘째로, 이 방법은 실험적 오차를 내기가 쉽다.

이 오차를 줄이기 위해서는 많은 수의 복제 튜브, 비싼 매질 및 노동이 요구된다.

세째로, 이 분석법은 완결하는데 최소한 14일이 걸린다.

DNA 분석법은 이러한 문제점을 모두 극복한다.

측정된 미코플라스마 세포의 수는 CCU에 의한 숫자보다 4~5배 높으며, 보다 정확하게 실제 세포의 수를 반영한다.

적합한 장치와 훈련이 갖추어진다면 DNA 분석은 CCU 분석보다 실험적 오차를 덜 낸다.

마지막으로 DNA 분석에는 15~30분이 소요된다(분석할 시료가 여럿인 경우에는 시간이 더 소요된다).

이런 이유때문에 DNA 분석법은 미코플라스마 배양액을 진정하게 시간 감시하는데 있어 적합하다.

DNA 분석법은 세포가 살어있거나 또는 죽어있거나는 불문하고, 그리고 그들의 대사상태에 무관하게 모든 세포를 측정한다는 것을 기억하여야 한다.

따라서, 이 분석법은 미코플라스마 생육 곡선의 로그기중에 있어 가장 잘 정보를 제공해준다.

Claims

이상(二相) 에틸렌이민으로 불활성화시킨, 미코플라스마 히오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae)에 의한 감염으로부터 돼지를 면역화 시키기에 유효한 양의 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물 및 생리학적으로 허용되는 적절한 담체를 함유함을 특징으로 하는 박테린.
제1항에 있어서, 독성 미코플라스마 히오뉴모니에에 분리물이 1002로 명명된 분리물(ATCC 수탁번호 55088)을 함유함을 특징으로 하는 박테린.
제1항에 있어서, 미코플라스마 히오뉴모니에의 유효한 면역량이 최소한 2×10⁹미코플라스마 히오뉴모니에 DNA 세포 균등물임을 특징으로 하는 박테린.
제1항에 있어서, 유효량의 보조약을 더 함유함을 특징으로 하는 박테린.
제4항에 있어서, 보조약은 아크릴산 중합체를 함유함을 특징으로 하는 박테린.
제5항에 있어서, 유효량의 보조약은 박테린의 약 0.2%(W/V)임을 특징으로 하는 박테린.
(a) 적절한 배지에서 독성 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물을 배양하여 생육시키고 ;

(b) 이렇게 생육시킨 독성 미코플라스마 히오뉴모니에를 이상 에틸렌이민으로 처리하여 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화 시키며 ;

(c) 얻어진 불활성화 미코플라스마 히오뉴모니에를 농축시키고 ;

(d) 생성된 농축 및 불활성화된 미코플라스마 히오뉴모니에를 회수하며 ; 그리고

(e) 이렇게 회수한 농축 및 불활성화된 미코플라스마 히오뉴모니에를 생리학적으로 허용되는 적절한 담체와 혼합하여 박테린으로 제제화함을 특징으로 하는 박테린의 제조방법.
제7항에 있어서, 단계 (a)에서 독성 분리물은 1002로 명명된 분리물 (ATCC 수탁번호 55088)로 함유함을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 단계 (a)에서 미코플라스마 히오뉴모니에 분리물은 약 48-약 144시간 동안 생육시킴을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 단계 (b)에서

(ⅰ) 미코플라스마 히오뉴모니에 배양액을 약 4mM 농도의 이상 에틸렌이민과 접촉시키고 ;

(ⅱ) 배양액을 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화시키기에 유효한 조건하에서 보온하며 ; 그리고

(ⅲ) 이상 에틸렌이민을 중화시키기에 유효한 양의 티오황산나트륨을 첨가하여배양액중의 이상 에틸렌이민을 중화시킴을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 단계(ⅱ)에서 유효한 조건은 최소한 약 12시간동안 보온시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 단계(ⅲ)에서 티오황산나트륨의 유효 중화농도는 약 16mM임을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 단계(ⅰ)에서 미코플라스마 히오뉴모니에와 접촉하는 이상 에틸렌이민은 배양액에 L-브로모에틸아민 히드로브로마이드를 첨가하여 현장에서 생성시킴을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 단계(e)에서 유효 농도의 EDTA와 유효농도의 치메로살을 함께 더 혼함함을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, EDTA의 유효 농도는 박테린의 최소한 약 0.07%(W/V)임을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 치메로살의 유효 농도는 박테린의 약 0.01%(W/V)임을 특징으로 하는 방법.
(a) 미코플라스마 히오뉴모니에 배양액을 약 4mM 농도의 이상 에틸렌이민과 접촉시키고 ;

(b) 미코플라스마 히오뉴모니에를 불활성화시키기에 효과적인 조건하에 배양액을 보온하며 ; 그리고

(c) 이상 에틸렌이민을 중화시키기에 유효한 농도의 티오황산 나트륨을 첨가하여 배양액중의 이상 에틸렌이민을 중화시킴을 특징으로 하는 독성 미코플라스마 히오뉴모니에주의 불활성화 방법.
제17항에 있어서, 단계 (b)에서 효과적인 조건은 최소한 약 12시간동안 보온하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 단계 (c)에서 티오황산나트륨의 유효 중화농도는 약 16mM임을 특징으로 하는 방법.
이상 에틸렌이민으로 불활성화된, 1002로 명명된 독성 미코플라스마 히오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae) 분리물(ATCC 수탁번호 55088).