KR102615970B1 - 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법 - Google Patents
소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102615970B1 KR102615970B1 KR1020230012684A KR20230012684A KR102615970B1 KR 102615970 B1 KR102615970 B1 KR 102615970B1 KR 1020230012684 A KR1020230012684 A KR 1020230012684A KR 20230012684 A KR20230012684 A KR 20230012684A KR 102615970 B1 KR102615970 B1 KR 102615970B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- bovine
- virus
- diarrhea
- serum
- calves
- Prior art date
Links
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 190
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 158
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 137
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 123
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 title claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 241000702673 Bovine rotavirus Species 0.000 claims abstract description 168
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 claims abstract description 162
- 241000711443 Bovine coronavirus Species 0.000 claims abstract description 157
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 claims abstract description 59
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 58
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 60
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 36
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 29
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 20
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 20
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 17
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 14
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 12
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 11
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 10
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 8
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 7
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 6
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940124859 Rotavirus vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 3
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 claims description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 claims description 2
- 241000282818 Giraffidae Species 0.000 claims description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 19
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 12
- 244000309466 calf Species 0.000 description 210
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 55
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 55
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 55
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 38
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 29
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 29
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 27
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 26
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 22
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 22
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 22
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 19
- 230000034994 death Effects 0.000 description 18
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 18
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 13
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 13
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 13
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 12
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 12
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 11
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 9
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 8
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 8
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 6
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 6
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 6
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 6
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 6
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 6
- 206010012742 Diarrhoea infectious Diseases 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 5
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 5
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 5
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 5
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 5
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 4
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 2
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 2
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 2
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000003031 feeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 2
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDRAOGVAQOVDEB-KTKRTIGZSA-N (3-hydroxy-2,3,3a,5,6,6a-hexahydrofuro[3,2-b]furan-6-yl) (z)-octadec-9-enoate Chemical compound OC1COC2C(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC21 JDRAOGVAQOVDEB-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241001471959 Bovine rotavirus A unknown G-type Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 206010012741 Diarrhoea haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl] (4ar,5r,6as,6br,9s,10s,12ar)-10-[(2r,3r,4s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)CO[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1OC(=O)[C@]12CCC(C)(C)CC1C1=CCC3[C@@]([C@@]1(C[C@H]2O)C)(C)CCC1[C@]3(C)CC[C@@H]([C@@]1(C)C=O)O[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO2)O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)C(=O)NCCCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@](O)(CO)[C@H]1O NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 1
- WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N avridine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CCCN(CCO)CCO)CCCCCCCCCCCCCCCCCC WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010555 avridine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012812 general test Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 201000006334 interstitial nephritis Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 208000013435 necrotic lesion Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
Abstract
본 발명은 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 소에서 설사병을 야기하는 소 코로나바이러스(Bovine coronavirus: BCV), 소 로타바이러스(Bovine rotavirus: BRV) 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus: BVDV) 감염에 취약한 신생 반추동물 또는 어린 반추동물의 설사병 예방/치료를 위해 상기 3종 바이러스 중 하나 이상을 성체 반추동물에게 접종하여 제조한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 소에서 설사병을 야기하는 소 코로나바이러스(Bovine coronavirus: BCV), 소 로타바이러스(Bovine rotavirus: BRV) 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스(Bovine viral diarrhea virus: BVDV) 감염에 취약한 신생 반추동물 또는 어린 반추동물의 설사병 예방/치료를 위해 상기 3종 바이러스 중 하나 이상을 성체 반추동물에게 접종하여 제조한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
출생 후 20일령까지 송아지에서 가장 많이 발생하는 질병은 설사 질병(Diarrheal illness)으로, 이는 송아지 폐사의 주원인이 되며, 국내외 축산 농가에 막대한 경제적 피해를 주고 있다.
송아지에서 바이러스성 설사병을 유발하는 주요 바이러스 3종은 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스며, 이들 모두 매년 국내외 축산 농가에서 발생하고 있다.
가축전염병 중앙예찰협의회의 2019년 1/4분기 자료에 따르면 2018년에 한국 축산 농가에서 발생한 소 바이러스성 설사병의 발생 건수 중 소 코로나바이러스 감염이 원인에 되어 발생한 경우가 224건 있었고, 소 로타바이러스 감염에 의한 발생 건수가 553건 있었으며, 소 바이러스성설사병바이러스 감염에 의한 발생 건수는 216건 있는 것으로 확인되었다.
소 코로나바이러스는 어린 연령의 송아지에서 설사을 유발하고, 어른 소에서는 겨울철설사병(Winter dysentery: WD)을 유발하는 설사병 원인 바이러스로 알려져 있다. 송아지는 소 코로나바이러스에 감염 시 50~100%의 높은 이환율과 심한 수양성 설사가 야기되고, 소 코로나바이러스에 감염된 송아지로부터 종종 혈액과 점액이 섞여 배출되어 이는 감염원으로 집단감염의 원인이 되기도 한다. 특히, 어린 송아지의 경우 소 코로나바이러스에 감염되면 수양성 설사 및 출혈성 설사가 주요 증상으로 2~6일 간 지속되며, 식욕부진, 원기소실 및 탈수로 인해 체중이 감소될 수 있다.
소 로타바이러스는 송아지에서 설사를 유발하며, 상기 설사는 엷은 황색 설사가 흔하지만 간혹 점액질 및 혈액이 수반되기도 한다. 소 로타바이러스에 감염된 송아지는 4~8일간 설사가 지속되는 경우가 흔하며, 어린 송아지일수록 탈수의 정도가 심하고 세균 등의 병원균 감염이 동반되는 경우가 빈번하다.
소 바이러스성설사병바이러스는 송아지에서 설사를 유발하며, 임신한 소를 감염시켜 태어난 PI(Persistent Infection) 송아지는 생존기간에 소 바이러스성설사병바이러스를 지속적으로 배출하여 동거 소들에게 감염(집단 감염)을 초래하여 축산 농가에서 근본적인 근절이 어렵다.
일반적으로 바이러스성 설사병에 대한 예방법은 모우의 임신기간 중 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 중 하나 이상을 접종하여 수집한 초유를 신생자우가 섭취하도록 하여 면역력을 습득하도록 하는 것인데 신생자우는 초유를 24시간 내 섭취하지 못할 경우 상기 바이러스들에 대한 방어능이 낮아지는 문제점이 있었다.
미국 연구진에 따르면 IgG를 포함하는 면역혈청제제를 모우의 초유 대신 갓 태어난 송아지에 경구 투여 시 수동면역 획득으로 송아지의 면역력/생존력이 증가할 수 있음을 임상 연구에서 밝힌 바 있다. 또한, 미국과 남미 연구진에 따르면 송아지에 소 로타바이러스에 대한 항체가 유도된 면역혈청을 초유와 함께 경구 투여 후 소 로타바이러스 강독주로 공격접종 시 설사 증상과 바이러스 배출이 감소되어 소 로타바이러스에 대한 방어능이 증진되었다는 보고가 있었다.
한국에서는 송아지의 세균성 질병 및 바이러스성 질병의 예방 및 치료 용도로 유럽에서 수입한 면역혈청제제(예컨대, 보비글로빈(Boviglobin, Biowet-dwalew사, 폴란드))를 사용하고 있기는 하나, 이는 한국의 축산 농가에서 최근 유행하는 바이러스성 설사병 바이러스인 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스를 동시에 효과적으로 방어할 수 없으므로, 상기 3종 바이러스를 효과적으로 방어할 수 있는 면역혈청, 및 이의 안정화된 제제의 개발이 시급한 실정이다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 반추동물, 특히 축산 농가에서 빈번하게 발생하는 소/송아지의 바이러스성 설사병 바이러스에 대한 방어능을 증진시키는 수단/방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 한국의 축산 농가에서 최근 유행하는 소 설사병 유발 바이러스인 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스를 선별하여 배양하고 분리한 후 불활화시켜 제조한 백신을 성우에게 3~4회 예방접종 시 높은 수준의 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(면역혈청제제)이 생성/형성되는 것을 확인하였고, 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스를 공격접종한 송아지들에게 상기 고도면역혈청 투여 시 소 설사병 유발 바이러스의 증식 저하로, 설사 증상을 완화시키고 건강상태를 향상시켜 폐사률을 감소시키는 효과가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 반추동물, 바람직하게는 신생 반추동물 또는 어린 반추동물에 투여가능한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은, 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum)의 제조 방법으로서,
(a) 소 설사병 유발 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대배양한 바이러스를 수득하는 단계;
(b) 상기 계대배양한 바이러스를 반추동물에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 접종한 반추동물의 혈청을 수득하는 단계;를 포함하며,
상기 소 설사병 유발 바이러스는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 제조 방법으로 제조한 고도면역혈청을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 고도면역혈청을 유효성분으로 함유하는, 소 설사병 유발 바이러스로 인한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 고도면역혈청을 유효성분으로 함유하는, 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 고도면역혈청을 인간을 제외한 반추동물에 투여하는 단계를 포함하는, 소 설사병 유발 바이러스로 인한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 고도면역혈청을 인간을 제외한 반추동물에 투여하는 단계를 포함하는, 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청을 반추동물(소/송아지 등)에 투여 시 소 바이러스성 설사병을 예방할 수 있으며, 소 바이러스성 설사병 바이러스에 감염된 반추동물의 설사 증상을 완화시키고 건강상태를 향상시켜 폐사률 및 전염율을 감소시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 배양한 소 코로나바이러스(BCV 1b) 백신주, 소 로타바이러스(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV 1b 및 BVDV 2a) 백신주의 시간대별 증식 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1의 소 코로나바이러스(BCV 1b) 백신주, 소 로타바이러스(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV 1b 및 BVDV 2a) 백신주를 송아지에 접종한 다음, 시기별로 채혈한 혈청의 각 바이러스에 대한 중화능을 항체 역가(항체가, antibody titer)로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1의 고도면역혈청의 제조 및 품질 향상을 위한 공정 흐름도를 나타낸 것이다.
도 4는 소 코로나바이러스(BCV 1b), 소 로타바이러스(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV 1b 및 BVDV 2a)를 송아지에 공격접종한 후 1일 후에 본 발명에 따른 실시예 1의 고도면역혈청의 항체 역가를 고역가, 중역가 및 저역가 수준으로 송아지 그룹 당 5두씩 투여하여 생존율의 향상 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 소 코로나바이러스(BCV 1b), 소 로타바이러스(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV 1b 및 BVDV 2a)에 대한 고도면역혈청의 투여 여부에 따른 치료 효과를 송아지의 부검장기의 병변 여부로 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 6: 대조군).
도 2는 본 발명에 따른 실시예 1의 소 코로나바이러스(BCV 1b) 백신주, 소 로타바이러스(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 백신주 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV 1b 및 BVDV 2a) 백신주를 송아지에 접종한 다음, 시기별로 채혈한 혈청의 각 바이러스에 대한 중화능을 항체 역가(항체가, antibody titer)로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예 1의 고도면역혈청의 제조 및 품질 향상을 위한 공정 흐름도를 나타낸 것이다.
도 4는 소 코로나바이러스(BCV 1b), 소 로타바이러스(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV 1b 및 BVDV 2a)를 송아지에 공격접종한 후 1일 후에 본 발명에 따른 실시예 1의 고도면역혈청의 항체 역가를 고역가, 중역가 및 저역가 수준으로 송아지 그룹 당 5두씩 투여하여 생존율의 향상 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 소 코로나바이러스(BCV 1b), 소 로타바이러스(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV 1b 및 BVDV 2a)에 대한 고도면역혈청의 투여 여부에 따른 치료 효과를 송아지의 부검장기의 병변 여부로 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 6: 대조군).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 길이, 면적, 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum)의 제조 방법으로서,
(a) 소 설사병 유발 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대배양한 바이러스(배양물)를 수득하는 단계;
(b) 상기 계대배양한 바이러스(배양물)를 반추동물에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 접종한 반추동물의 혈청을 수득하는 단계;를 포함하며,
상기 소 설사병 유발 바이러스는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 2종 이상, 더 바람직하게는 3종인 것을 특징으로 하는, 제조 방법에 관한 것이다.
상기 제조 방법은 1종 이상, 바람직하게는 2종 이상의 소 설사병 유발 바이러스, 가장 바람직하게는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스의 사용을 통해 소 설사병 유발 바이러스에 대한 증진된 항바이러스 활성으로 소 바이러스 설사병을 완화/개선시키는 활성이 증가된 고도면역혈청을 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소 코로나바이러스는 바람직하게는 BCV 1b 타입주, 더 바람직하게는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC18738P로 2018년 11월 7일에 수탁(기탁)된 소 코로나바이러스 백신주인 Bovine Coronavirus 17KBC401일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 소 로타바이러스는 바람직하게는 BRV G6P[5] 타입주 및 BRV G8P[5] 타입주, 더 바람직하게는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18739P로 2018년 11월 7일에 수탁(기탁)된 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus 17KBR412 및 수탁번호 KCTC14813BP로 2021년 12월 7일에 수탁(기탁)된 소 로타바이러스 백신주인 Bovine Rotavirus G8P[5](17KBR413)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 소 바이러스성설사병바이러스는 바람직하게는 BVDV 1b 타입주 및 BVDV 2a 타입주, 더 바람직하게는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18532P로 2016년 12월 28일에 수탁(기탁)된 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD1b-JH(Bovine viral diarrhea virus) 및 수탁번호 KCTC18533P로 2016년 12월 28일에 수탁(기탁)된 소 바이러스성설사병바이러스 백신주인 BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 사람 선암종 세포, 원숭이 신장세포 및 소 신장세포로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 소 코로나바이러스는 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 사람 결직장 선암종(Colorectal Adenocarcinoma) 세포인 HRT-18 세포에서 연속계대배양 후, 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x105.5TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소 로타바이러스는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포인 MA-104 세포, LLC-MK2 세포, BSC-1 세포, CV-1 세포, Vero 세포, CMK 세포, AGMK 세포, TF-104 세포 등 또는 소 신장세포인 MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney) 세포, GBK 세포, FBK 세포 등, 더 바람직하게는 MA-104 세포 또는 TF-104 세포, 가장 바람직하게는 TF-104 세포에서 연속계대배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x108.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 소 바이러스성설사병바이러스는 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포인 Vero 세포, MA-104 세포, LLC-MK2 세포, BSC-1 세포, CV-1 세포, CMK 세포, AGMK 세포, TF-104 세포 등 또는 소 신장세포인 MDBK 세포, GBK 세포, FBK 세포 등, 더 바람직하게는 Vero 세포, MA-104 세포, TF-104 세포 또는 MDBK 세포, 가장 바람직하게는 Vero 세포 또는 MDBK 세포에서 연속계대배양 후, 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 계대배양한 바이러스는 불활화(불활성화) 처리 및 중화화 처리 후 상기 접종하는 단계에서 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 불활화 처리는 공지의 방법으로 이루어질 수 있으며, 예컨대 바이러스 불활화에 사용되는 BEI(Binary ethyleneimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제(불활성화제)를 사용하여 불활화될 수 있다.
상기 불활화 처리는 바람직하게는 상기 계대배양한 바이러스에 BEI를 처리하는 것이고, 상기 중화화 처리는 바람직하게는 상기 계대배양한 바이러스에 BEI 처리 후 중화제인 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)을 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다. 예컨대, 상기 불활화 처리 시 바람직하게는 약 0.1M의 BEI 용액을 바이러스 항원양의 1중량%로 처리할 수 있으며, 상기 중화화 처리 시 바람직하게는 약 2M의 티오황산나트륨 용액을 바이러스 항원양의 약 0.1중량%로 처리할 수 있다. 상기 바이러스 항원양은 표적동물 접종에 사용되는 바이러스 항원, 즉 상기 계대배양한 바이러스인 BCV 항원, BRV 항원 및 BVDV 항원의 적정 바이러스 역가에 해당하는 바이러스의 함량에 기초하여 설정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 소 코로나바이러스는 불활화 처리(및 중화화 처리)를 거친 후, 사람의 선암종 세포, 바람직하게는 HRT-18 세포에 접종하여 3일 이상 계대배양 후, 세포변성효과(Cytopathic Effect, CPE)를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 소 로타바이러스는 불활화 처리(및 중화화 처리)를 거친 후, 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 원숭이 신장세포, 가장 바람직하게는 TF-104 세포에 접종하여 3일 이상 계대배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 소 바이러스성설사병바이러스는 불활화 처리(및 중화화 처리)를 거친 후, 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포, 바람직하게는 Vero 세포 또는 MDBK 세포에 접종하여 3일 이상 계대배양 후, 세포변성효과를 나타내지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
더 구체적으로, 상기 불활화된 소 코로나바이러스는,
(a) 소 코로나바이러스를 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포에 감염시켜 수득한 소 코로나바이러스 배양물(계대배양한 바이러스)에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 코로나바이러스 제조 방법을 통해 제조될 수 있다(대한민국 등록특허 제10-2243374호 참조).
상기 불활화된 소 코로나바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 코로나바이러스를 사람 선암종 세포 또는 소 신장세포에 감염시킨 후 30대 이상의 계대수(Passage Number), 바람직하게는 45~50대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x105.5TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 가지는 소 코로나바이러스일 수 있다.
상기 불활화된 소 코로나바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 소 코로나바이러스 배양물의 상층액일 수 있다.
상기 불활화된 소 코로나바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 불활화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.
상기 불활화된 소 코로나바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 불활화 반응은 포르말린을 불활화제로 사용할 경우 포르말린(예컨대, 약 0.2%(v/v) 포르말린)을 22~25℃의 온도에서 6~8일, 바람직하게는 6.5~7.5일간 처리하는 것으로 이루어질 수 있으며, BEI를 불활화제로 사용할 경우 BEI를 36~38℃의 온도에서 18~20시간 처리하는 것으로 이루어질 수 있다.
상기 불활화된 소 코로나바이러스 제조 방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활화제의 중화제로서 불활화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨을 사용하고, 포르말린을 사용할 경우 아황산나트륨을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 불활화된 소 코로나바이러스 제조 방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 사람 선암종 세포로는 HRT-18 세포 등을 사용하거나, 소 신장세포로는 MDBK 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또, 상기 불활화된 소 로타바이러스는,
(a) 소 로타바이러스를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 감염시켜 수득한 소 로타바이러스 배양물(계대배양한 바이러스)에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 로타바이러스 제조 방법을 통해 제조될 수 있다(대한민국 등록특허 제10-2243374호 참조).
상기 불활화된 소 로타바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 로타바이러스를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종(감염)시킨 후 5대 이상의 계대수, 바람직하게는 7~9대 이상의 계대수, 더 바람직하게는 7~25대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x106.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x108.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 가지는 소 로타바이러스일 수 있다.
상기 불활화된 소 로타바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 소 로타바이러스 배양물의 상층액일 수 있다.
상기 불활화된 소 로타바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 불활화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.
상기 불활화된 소 로타바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 불활화 반응은 포르말린을 불활화제로 사용할 경우 포르말린(예컨대, 약 0.2%(v/v) 포르말린)을 22~25℃의 온도에서 6~8일, 바람직하게는 6.5~7.5일간 처리하는 것으로 이루어질 수 있으며, BEI를 불활화제로 사용할 경우 BEI를 36~38℃의 온도에서 24~30시간 처리하는 것으로 이루어질 수 있다.
상기 불활화된 소 로타바이러스 제조 방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활화제의 중화제로서 불활화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨을 사용할 수 있고, 포르말린을 사용할 경우 아황산나트륨을 사용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 불활화된 소 로타바이러스 제조 방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 원숭이 신장세포로는 TF-104 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스는,
(a) 소 바이러스성설사병바이러스를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 감염시켜 수득한 소 바이러스성설사병바이러스 배양물(계대배양한 바이러스)에 불활화제를 적정 농도로 첨가 후, 소정 기간 동안 반응시키는 단계;
(b) 상기 불활화제와 반응시킨 배양물에 중화제를 첨가하여 상기 단계에서 반응한 배양물 중 남아있는 불활화제 를 중화시키는 단계;
(c) 중화 후, 수득한 배양물을 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 접종한 다음, 소정 기간 동안 배양시키는 단계; 및
(d) 배양 후, 상기 접종한 배양물로 인한 상기 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포의 세포변성효과(CPE)의 유무를 확인하는 단계를 포함하는, 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법을 통해 제조될 수 있다(대한민국 등록특허 제10-1938556호 참조).
상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 소 바이러스성설사병바이러스를 원숭이 신장세포 또는 소 신장세포에 감염시킨 후 10대 이상의 계대수, 바람직하게는 15~30대의 계대수로 연속계대배양하여 수득한 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x105.5TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 가지는 소 바이러스성설사병바이러스일 수 있다.
상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 수득한 배양물은 2,000~4,000rpm, 바람직하게는 2,500~3,500rpm에서 원심분리하여 수득한 소 바이러스성설사병바이러스 배양물의 상층액일 수 있다.
상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 불활화제로서 BEI, 포르말린, 글루타알데하이드, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제, 바람직하게는 BEI를 사용할 수 있다.
상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 불활화 반응은 포르말린을 불활화제로 사용할 경우 포르말린(예컨대, 약 0.2% (v/v) 포르말린)을 22~25℃의 온도에서 6~8일, 바람직하게는 6.5~7.5일간 처리하는 것으로 이루어질 수 있으며, BEI를 불활화제로 사용할 경우 BEI를 36~38℃의 온도에서 18~20시간 처리하는 것으로 이루어질 수 있다.
상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법의 단계 (a)에서, 불활화 반응은 불활화에 따른 항원성 손실이 부재한 온도 조건인 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃, 가장 바람직하게는 약 37℃의 온도에서, 72시간 이상, 바람직하게는 48시간 이상, 가장 바람직하게는 20시간 동안 이루어질 수 있다.
상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법의 단계 (b)에서, 바이러스 불활화제의 중화제로서 불활화제 유형에 맞는 중화제, 예컨대, BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨을 사용할 수 있고, 포르말린을 사용할 경우 아황산나트륨을 사용할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
상기 불활화된 소 바이러스성설사병바이러스 제조 방법의 단계 (a) 및 단계 (c)에서, 원숭이 신장세포로는 Vero 세포 등을 사용하거나, 소 신장세포로는 MDBK 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 반추동물을 접종하는 단계에서 계대배양한 바이러스를 접종하는 반추동물에 1종 이상의 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 어쥬번트, 항생제, 방부제(보존제), 면역조절제 등을 투여할 수 있다.
"담체"라는 용어는 목적동물에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매(용액), 분산 매질, 코팅제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제(항균제, 항진균제 등), 흡착 지연제, 보조제(어쥬번트, Adjuvant), 삽입물 등을 의미한다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 1종 이상의 전달 비히클(Vehicle)의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 1종 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 1종 이상 이내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.
상기 면역반응은, 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료적으로 효과적인 백신의 양은 사용되는 특정 바이러스, 목적동물(예컨대, 소)의 건강 상태 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다.
상기 희석제로는 물, 식염수, 글루코스, 에탄올, 글라이세롤 등이 포함될 수 있고, 상기 등장성 작용제로는 염화나트륨, 글루코스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 상기 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 보조제로는 광물성 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어 사포닌 유도체, 예를 들어 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가음이온(다중음이온); 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루론 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어 몬타나이드(Montanide) ISA-50(셉픽(Seppic), 프랑스), 카 보폴(Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II(하이드로닉스(Hydronic), 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼(예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체(CytRx, 죠 지아주 아틀란타); SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노 포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균(E. coli) 유래 열-불안정성 장 독소(재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313(셉픽(Seppic사), 프랑스); ISA206; 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel)(셉픽(Seppic), 프랑스), 카반트 SOE(CAvant SOE)(중앙백신, 한국) 및 카반트 DOE(CAvant DOE)(중앙백신, 한국); 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 몬타나이드 01 겔, 카반트 SOE 및 카반트 DOE로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트이다.
상기 어쥬번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 조절하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다.
상기 반추동물을 접종하는 단계에서 사용되는 불활화된 바이러스 항원은 상기 어쥬번트와 혼합하여 사용되며, 상기 불활화된 바이러스와 어쥬번트의 혼합 비율은 부피기준으로 1~10 : 10~1, 바람직하게는 5:5 ~ 5:10 또는 5:5 ~ 9:1, 더 바람직하게는 5:5 ~ 5:10 또는 7:3 ~ 9:1, 가장 바람직하게는 5:5 ~ 5:10, 7:3 또는 9:1인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 반추동물을 접종하는 단계에서 사용되는 계대배양한 바이러스는, 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x105.5TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 코로나바이러스; 1x106.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x106.5TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x107.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 로타바이러스; 및 1x105.0TCID50/mL 이상, 바람직하게는 1x105.5TCID50/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가(바이러스 함량)를 갖는 소 바이러스성설사병바이러스;를 상술한 바와 같이 불활화 및 중화화시킨 것이다.
상기 반추동물을 접종하는 단계에서 계대배양한 바이러스를 반추동물에 접종 시 투여가능한 항생제로는 겐타마이신(Gentamicin) 및 메티올레이트(Merthiolate)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반추동물을 접종하는 단계에서 계대배양한 바이러스를 반추동물에 접종 시 투여가능한 면역조절제로는 1종 이상의 사이토카인(예컨대, 인터류킨, 인터페론 등)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 반추동물을 접종하는 단계에서 계대배양한 바이러스를 반추동물에 접종 시 계대배양한 바이러스 및 이와 함께 투여되는 담체, 희석제, 어쥬번트, 항생제, 면역조절제 등은 적합한 투여 제형, 예컨대 주사 용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 냉동-건조, 동결-건조 또는 탈수 형태(단, 투여 전에 제약상 허용되는 비히클(예컨대, 멸균 식염수, 완 충액 등)로 재수화 또는 현탁됨)로 제조될 수 있다.
상기 제형은 인간을 제외한 포유동물, 바람직하게는 반추동물에서 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 혈중 항체를 유도하기 위해 본원 명세서에 개시된 계대배양한 바이러스의 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.
상기 반추동물을 접종하는 단계는 근육, 피하, 진피, 복강, 정맥, 경구 및 비강 중에서 선택되는 1종 이상의 접종 경로, 바람직하게는 피하 또는 근육내 접종 경로, 가장 바람직하게는 반추동물의 어깨 부분의 근육내 접종 경로를 통해 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청은 반추동물의 혈액을 상온 또는 약 37℃의 온도에서 수시간 정치하여 응고된 혈병을 제외한 액상의 혈장 또는 혈청을 10~17℃, 바람직하게는 12~15℃의 온도에서 6,000~7,000rpm, 바람직하게는 7,000rpm으로 50~70분, 바람직하게는 55~65분간 수회, 바람직하게는 2회 이상 원심분리하는 공정으로 수득한 상층부의 혈청일 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 종래기술을 활용하여 수득한 혈청일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청은 소 설사병 유발 바이러스에 대해 바람직하게는 9(log2) 이상, 더 바람직하게는 10(log2) 이상, 가장 바람직하게는 11(log2) 이상의 중화항체 역가를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 혈청은 소 코로나바이러스에 대해 바람직하게는 8(log2) 이상, 더 바람직하게는 9(log2) 이상, 가장 바람직하게는 10(log2) 이상의 중화항체 역가를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 혈청은 소 로타바이러스에 대해 바람직하게는 8(log2) 이상, 더 바람직하게는 9(log2) 이상, 가장 바람직하게는 10(log2) 이상의 중화항체 역가를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 혈청은 바람직하게는 56~65℃, 더 바람직하게는 57~62℃, 가장 바람직하게는 60℃에서 1시간 비동화 처리(Heat inactivation) 후 당류의 첨가로 안정화시키는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 비동화 처리 온도가 56℃ 미만인 경우 보체 등의 비동화가 불완전하게 될 수 있고, 상기 비동화 처리 온도가 65℃를 초과할 경우 면역글로불린(항체) 단백질의 변성을 일으킬 수 있다.
상기 당류는 바람직하게는 포도당(덱스트로즈, D(+)-글루코스 등)을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 혈청에 포함되는 당류의 함량은 당류의 총 중량의 4~8중량%, 바람직하게는 5~7중량%, 가장 바람직하게는 6~6.5중량%인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 혈청은 방부제(보존제), 바람직하게는 치메로살(thimerosal)의 첨가를 통해 사용 기간 및 보관 기간을 연장할 수 있다.
상기 혈청에 첨가되는 치메로살은 혈청의 총 부피 기준으로, 0.02부피%(% v/v) 이하, 바람직하게는 0.01부피% 이하일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 혈청은 7.0~9.0μm, 바람직하게는 8μm 마이크로필터(microfilter), 3.0~5.0μm, 바람직하게는 3μm 마이크로필터, 1.0~1.5μm, 바람직하게는 1.2μm 마이크로필터 및 0.5~0.9μm, 바람직하게는 0.8μm 마이크로필터, 0.4~0.5μm, 바람직하게는 0.45μm 마이크로필터로 순차적으로 여과되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 고도면역혈청은 반추동물의 소 설사병 유발 바이러스에 대한 면역반응 유도용 또는 반추동물의 면역 증강용임을 특징으로 할 수 있다.
반추동물에서의 면역반응 유도 및 면역 증강을 위한 효과적인 고도면역혈청 및 기타 투여 성분들의 용량은 각 성분의 유형 및 반추동물의 투여 일정(스케쥴)에 따라 달라질 수 있다. 특히, 상기 투여 시 사용되는 고도면역혈청의 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 방어능에 따라 반추동물에 면역반응을 효과적으로 유도해낼 수 있는 효과량(유효량)이 달라질 수 있다.
상기 면역반응은, 세포성 면역 및/또는 체액성 면역의 유도를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료적으로 효과량은 사용되는 특정 바이러스, 반추동물의 유형, 건강 상태 및/또는 감염 정도에 따라 달라질 수 있으며, 숙련된 수의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 고도면역혈청을 유효성분으로 함유하는, 소 설사병 유발 바이러스로 인한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료용 수의학적/약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 고도면역혈청을 유효성분으로 함유하는, 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료용 수의학적/약학 조성물에 관한 것이다.
본원 명세서에서 "백신"이라는 용어는 반추동물, 바람직하게는 신생 반추동물 또는 어린 반추동물, 가장 바람직하게는 신생 송아지 또는 어린 송아지에 투여될 수 있는 형태의 제제를 지칭한다.
상기 제제는 반추동물에서 소 설사병 유발 바이러스인 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스 각각의 서로 다른 유전형, 특히 소 코로나바이러스인 BCV 1b 타입주, 소 로타바이러스인 BRV G6P[5] 타입주 및 BRV G8P[5] 타입주와, 소 바이러스성설사병바이러스인 BVDV 1b 타입주 및 BVDV 2a 타입주에 대해 면역반응을 유발하는 항바이러스 활성(항체의 작용력)을 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 수의학적/약학 조성물은 상술한 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 어쥬번트, 항생제, 방부제(보존제), 면역조절제 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 수의학적/약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 보존제/방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 상기 수의학적/약학 조성물은 반추동물에 투여한 후 활성성분(중화항체 등)의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 멸균 주사용액 등의 형태일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청을 인간을 제외한 반추동물에 투여하는 단계를 포함하는, 소 설사병 유발 바이러스로 인한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청을 인간을 제외한 반추동물에 투여하는 단계를 포함하는, 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 반추동물은 소, 산양, 면양, 사슴, 낙타 및 기린으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 이들의 신생 반추동물 또는 어린 반추동물인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 "소"란 용어는 소과 동물로, 수소, 암소, 수송아지, 암송아지, 임신우, 수유중인 암소, 임신우의 태아 등 모두를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 신생 송아지(Newborn calves) 또는 어린 송아지(Young calves)이다.
상기 성체 반추동물, 바람직하게는 소과, 더 바람직하게는 성우는 면역체계가 충분히 발달되어 감염체(전염성 병원체/바이러스 자체, 또는 이의 핵산, 단백질, 지질 등)를 접종하였을 때 감염체의 감염을 방어할 수 있는 중화항체 등의 방어항체 또는 점막면역성이 있는 방어항체를 포함하는 혈청을 유도 및 생산할 수 있다.
상기 신생 송아지는 1개월령 미만, 바람직하게는 3주령 미만, 가장 바람직하게는 7일령 미만의 연령대인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 어린 송아지는 6개월령 미만, 바람직하게는 4개월령 미만, 가장 바람직하게는 3개월령 미만의 연령대인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 투여하는 단계는 경구, 근육, 피하, 진피, 복강, 정맥, 비강 및 항문으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 투여 경로, 바람직하게는 정맥 투여 경로를 통해 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 투여하는 단계는 바람직하게는 정맥 투여(예컨대, 정맥주사) 경로에 의해 반추동물에게 투여하지만, 다른 투여 경로, 예를 들면, 비강 투여(예컨대, 에어로졸 또는 다른 무침 투여), 경피 투여 및 비경구 투여(예컨대, 복강 투여, 림프절내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 질 투여 또는 근육내 투여) 경로를 조합한 경로를 포함하는 공지된 경로를 통해 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고도면역혈청은 신생 반추동물과 어린 반추동물, 바람직하게는 신생 송아지 및 어린 송아지(또는 임신우의 젖을 먹는 송아지)에 1 내지 24시간 간격으로 2회 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원 명세서에서, '치료'란 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상 태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
상기 반추동물의 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 소바이러스성설사병바이러스의 감염 및 그에 따른 질환 여부는 임상 증상 여부 및 간이진단키트를 이용한 항원 검사로 확인할 수 있다.
상기 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스, 및/또는 소바이러스성설사병바이러스에 감염된 반추동물의 통상적인 임상 증상으로는 연변, 수양성설사, 혈액이나 점막조직이 설사 분변에 섞여 나오기도 하며, 발열, 침울, 식욕부진 및 체중감소, 탈수 및 (기침 등의) 호흡기 증상 동반을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "TCID50(Tissue Culture Infective Dose 50%)"는 바이러스의 "감염 유발 단위"로, 세포 또는 조직 배양물의 50％를 감염 또는 사망시키는데 필요한 양으로 정의된다. 상기 TCID50의 계산방법을 간략하게 설명하면, 먼저 바이러스 시료를 연속계단희석(Serial Dilution)하고 각 희석된 바이러스 시료를 세포배양용 플레이트(예컨대, 96-well plate)의 각 웰에서 동일한 수로 배양된 숙주세포들에 첨가하여 감염시킨 다음, 세포병변을 나타내는 웰 수를 확인하여 50%의 웰 수에서 세포병변을 나타내는 희석율의 역수로 최종 바이러스의 TCID50 값을 계산한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[실시예 1]: 소에서 설사병을 유발하는 소 코로나바이러스(BCV), 소 로타바이러스(BRV) 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV)에 대한 고도면역혈청의 제조
[1-1]: BCV 백신주, BRV 백신주 및 BVDV 백신주로 이루어진 불활화된 복합 백신주의 제조
소에서 설사병을 유발하는 바이러스인 BCV, BRV 및 BVDV 각각의 백신주를 고도면역혈청의 제조를 위한 항원으로 사용하였다.
소 코로나바이러스, 및 이의 불활화된 바이러스(항원)는, 대한민국 등록특허 제10-2243374호를 참조하여, BCV 1b 타입주인 BCV 17A4-1 백신주(수탁명칭: Bovine Coronavirus 17KBC401; 수탁번호 KCTC18738P; 수탁일자: 2018.11.07)로 제조하였다.
소 로타바이러스, 및 이의 불활화된 바이러스(항원)는, 대한민국 등록특허 제10-2243374호를 참조하여, BRV G6P[5] 타입주인 BRV17A4-12 백신주(수탁명칭: Bovine Rotavirus 17KBR412주; 수탁번호 KCTC18739P; 수탁일자: 2018.11.07) 및 BRV G8P[5] 타입주인 BRV 17A21-2 백신주(수탁명칭: Bovine Rotavirus G8P[5](17KBR413), 수탁번호 KCTC14813BP; 수탁일자: 2021년 12월 7일)로 제조하였다.
소 바이러스성설사병바이러스, 및 이의 불활화된 바이러스(항원)는, 대한민국 등록특허 제10-1938556호를 참조하여, BVDV 1b 타입주인 BVD1b-JH 백신주(수탁명칭: BVDV1b-JH(Bovine viral diarrhea virus); 수탁번호: KCTC18532P; 수탁일자: 2016.12.28) 및 BVDV 2a 타입주인 BVD2a-CA 백신주(수탁명칭: BVD2a-CA(Bovine viral diarrhea virus); 수탁번호: KCTC18533P; 수탁일자: 2016.12.28)로 제조하였다.
상기 바이러스들은 감염원으로 사용하거나, 불활화하여 면역원으로 사용하였다. 불활화한 바이러스의 제조(생산)를 위해 GMP(Good Manufacturing Practice, 우수 의약품 제조·관리 기준) 생산시설에서 106.0~107.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가(virus titer)를 갖도록 BCV, BRV 및 BVDV 각각의 바이러스를 배양하였고(도 1 참조), 수확한 각각의 바이러스 배양액에 불활화제인 0.2%(v/v) 포르말린을 22~25℃에서 7일간 처리하거나, 불활화제인 BEI를 37℃에서 18~20시간 처리하여 불활화한 바이러스를 제조하였다.
그다음, 불활화제 유형에 맞는 중화제, 즉 BEI를 사용할 경우 티오황산나트륨을 처리하였고, 포르말린을 사용할 경우 아황산나트륨을 처리하여 불활화제가 처리된 바이러스를 중화시킨 다음, 불활화/중화화된 BCV, BRV 및 BVDV를 혼합하여 면역용 항원(불활화 백신)을 제조하였다.
[1-2]: 고도면역혈청의 항체 역가 확인
상기 [1-1]에서 제조한 불활화 백신으로 소에서 고도면역혈청을 제조하기 위해, 상기 불활화 백신에 3종의 어쥬번트(adjuvant)인 Montanide gel(제조사: SEPPIC), CAvant SOE(제조사: 중앙백신) 및 CAvant DOE(제조사: 중앙백신)를 배합하여 어쥬번트 유형에 따른 소 접종군(G1, G2 및 G3의 3그룹으로, 각 그룹 당 5두씩 배정된 10~12개월령 한우)을 준비하였다.
여기서, G1 그룹은 상기 불활화 백신과 Montanide gel 01PR을 9:1의 부피비로 배합하여 접종한 그룹이었고, G2 그룹은 상기 불활화 백신과 CAvant SOE을 35:65의 부피비로 배합하여 접종한 그룹이었으며, G3 그룹은 상기 불활화 백신과 CAvant DOE를 제조사의 설명서에 따라 적정 부피비로 배합하여 접종한 그룹이었다.
상기 각 그룹의 접종에 사용한 불활화 백신의 항원 함량은, BCV 1b의 경우 >106.0TCID50/mL의 바이러스 역가, BRV G6P[5] 및 G8P[5]의 경우 각각 >107.0TCID50/mL의 바이러스 역가, 및 BVDV 1b 및 BVDV 2a의 경우 각각 >106.0TCID50/mL의 바이러스 역가를 가지도록 BCV 1b, BRV G6P[5], BRV G8P[5], BVDV 1b 및 BVDV 2a를 각각 불활화하여 혼합한 불활화된 복합 백신주를 유형별 어쥬번트와 배합한 후, G1, G2 및 G3의 3그룹의 소에게 접종하였다.
상기 접종은 두당 5mL씩 3주 간격으로 3회 근육접종한 후, 약 5개월에 걸쳐 5회 채혈하여 BCV, BRV 및 BVDV에 대한 혈청의 중화항체 역가를 확인하였다.
그 결과, 도 2의 (A)에 나타낸 바와 같이 불활화 백신을 접종한 G1 그룹 및 G2 그룹의 5회차 채혈분에서 BCV에 대한 중화항체 역가가 고역가(>10 log2)로 형성되는 것을 확인하였고, 도 2의 (B)에 나타낸 바와 같이 불활화 백신을 접종한 G2 그룹의 3회차 채혈분에서 BRV에 대한 중화항체 역가가 고역가(>10 log2)로 형성되는 것을 확인하였으며, 도 2의 (C)에 나타낸 바와 같이 불활화 백신을 접종한 G2 그룹의 5회차 채혈분에서 BVDV에 대한 중화항체 역가가 고역가(>10 log2)로 형성되는 것을 확인하였다.
종합하면, 상기 불활화 백신을 어쥬번트 유형과 무관하게 배합 후 소에 2회 접종 시 채취한 3회차 채혈분은 BCV, BRV 및 BVDV 각 바이러스에 대해 높은 중화항체 역가로 고도면역을 갖는 혈청(고도면역혈청)임을 확인할 수 있었다.
[1-3]: 고도면역혈청의 정제 공정 및 제품 생산
상기 [1-2]에서 제조한 혈청(고도면역혈청)의 축산 농가의 보급을 위해, 아래 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 혈청(고도면역혈청)이 안정된 상태로 사용/보관 가능하도록 비동화 처리하고, 안정화제 및 보존제(방부제)인 치메로살을 첨가한 후 여과하여 제품(의약품) 형태로 생산하였다.
상기 혈청은 반추동물의 혈액을 상온 또는 37℃에서 수시간 정치하여 응고된 혈병을 제외한 액상의 혈장 또는 혈청을 12~15℃에서 7,000rpm으로 60분간 원심분리하는 공정을 2회 반복하여 수득한 상층부의 혈청(혈청 상등액)이었다.
구체적으로, 소(한우)의 채혈 혈액을 12~15℃에서 6,000~7,000rpm으로 원심분리하여 형성되는 하층부의 혈구 성분을 제외한 상층부의 혈청(고도면역혈청)을 회수한 후, 동일 원심분리과정을 1회 더 반복하여 회수한 혈청(고도면역혈청)을 약 60℃에서 약 1시간 비동화 처리를 하고, 혈청제의 안정화제인 25% 포도당 수용액을 첨가하였다(혈청 중 새로 첨가된 포도당 최종 농도: 6~6.5중량%). 그다음, 포도당을 첨가한 혈청(고도면역혈청)에 보존제(방부제)인 치메로살(thimerosal)을 혈청 중 최종 농도가 0.01부피% 이하가 되도록 첨가한 후 8μm 마이크로필터, 3μm 마이크로필터, 1.2μm 마이크로필터, 0.8μm 마이크로필터 및 0.45μm 마이크로필터로 순차적으로 5차례 여과하였다. 상기 여과한 혈청(고도면역혈청)은 소에 1회 접종(경구/정맥 투여 등)하기 적합한 1두분 용량으로 10ml씩 용기에 소분하고 용기의 입구를 밀봉한 후 용기(외부 표면 등)에 고도면역혈청의 접종량, 접종방법, 제조일자, 롯트번호, 제품명 등의 고도면역혈청 정보를 표기(라벨)하였다.
[1-4]: 고도면역혈청의 품질 관리
상기 [1-3]에서 용기에 소분한 고도면역혈청의 품질 관리는, 아래 표 1에 나타낸 바와 같이, 동물용 생물학적 제제의 검정기준에 부합하는 특성시험, 무균시험, 수소이온농도시험 및 방부제 정량시험을 실시하는 것으로 이루어졌다(참고문헌: 동물용의약품 국가출하승인검정기준 [별표5] 동물용 생물학제제 일반검정기준(농림축산검역본부고시 제2018-25호)). 구체적으로, 특성시험은 고도면역혈청의 색조시험, 혼탁도시험, 이물시험, 이취시험 및 균일성시험을 수행하는 것이고, 무균시험은 고도면역혈청을 고체/액체 배지에 첨가하였을 때 세균/곰팡이의 발육(오염) 여부를 확인하는 것이며, 수소이온농도시험은 고도면역혈청의 pH가 생체 pH인 pH 6~8로 유지되는지를 pH측정기로 확인하는 것이고, 보존제(방부제) 정량시험은 고도면역혈청 중 치메로살의 함량이 0.01부피% 이하로 유지되는지를 확인하는 것이었다.
상기 동물용 생물학적 제제의 적합 기준을 충족한 고도면역혈청을 하기 [1-5], 시험예 2 및 시험예 3에서 사용하였다.
[1-5]: 실험실 내에서 고도면역혈청의 BCV, BRV 및 BVDV에 대한 중화반응 확인
상기 [1-2]에서 제조한 고도면역혈청의 BCV, BRV 및 BVDV 각각의 유전형에 대한 중화항체 형성능을 중화반응 및 숙주세포감염 여부로 확인하였다. 구체적으로, 고도면역혈청을 2진 계단희석하고, 2x103TCID50/㎖로 희석한 각각의 바이러스 BCV, BRV 및 BVDV와 동량으로 혼합한 고도면역혈청 및 바이러스의 혼합액을 37℃에서 약 1시간 정치하였다. 그다음, 상기 고도면역혈청 및 바이러스의 혼합액을 96-웰 플레이트에 배양한 숙주세포인 HRT-18 세포, TF-104 세포 및 MDBK 세포 각각에 처리하였다. 고도면역혈청 및 BCV의 혼합액은 HRT-18 세포에 처리하였고, 고도면역혈청 및 BRV의 혼합액은 TF-104 세포에 처리하였으며, 고도면역혈청 및 BVDV의 혼합액은 MDBK 세포에 처리한 후, 37℃에서 배양하면서 세포변성효과 여부를 관찰하였고, 고도면역혈청의 중화항체 역가를 확인하였다(아래 표 2 참조). 여기서, 고도면역혈청의 중화항체 역가는 세포변성효과가 일어나지 않는 면역혈청의 최고희석배수의 역수로 표기한 것이다.
실험결과에 따르면, 표 2에 나타낸 바와 같이, 고도면역혈청은, 23(log2)의 항체 역가에서 106.0TCID50/ml의 BCV 1b를 중화시켰고, 25(log2)의 항체 역가에서 106.0TCID50/ml의 BRV G6P[5]를 중화시켰으며, 26(log2)의 항체 역가에서 106.0TCID50/ml의 BRV G8P[5]를 중화시켰고, 24(log2)의 항체 역가에서 106.0TCID50/ml의 BVDV 1b를 중화시켰으며, 25(log2)의 항체 역가에서 106.0TCID50/ml의 BVDV 2a를 중화시켰다.
상기 표 2의 결과에 기초하여, 소, 특히 송아지에서 고도면역혈청의 최저 중화항체 유효함량을 결정하기 위해 표 3과 같이 적정 중화항체 역가(면역력 획득에 필요한 중화항체 유효함량)를 설정하여 후술되는 실험에서 송아지에 고도면역혈청을 정맥주사로 투여하였다.
[실시예 2]: 소 코로나바이러스(BCV), 소 로타바이러스(BRV) 및 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV)를 공격접종한 소에 대한 고도면역혈청의 치료 효능 확인
실시예 1에서 제조한 고도면역혈청을 송아지에 정맥투여하여 BCV, BRV 및 BVDV에 대한 치료 효능을 확인하였다.
[2-1]: BCV, BRV 및 BVDV에 감염된 송아지에 대한 고도면역혈청의 치료 효능을 확인하기 위한 송아지의 선발, 공격접종 및 고도면역혈청 투여 조건
초유를 미섭취하여 면역력이 약하고 감염성 설사병에 취약한 생후 7일령 송아지 45두 중에서 BCV(BCV 1b), BRV(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 및 BDVD(BVDV 1b 및 BVDV 2a)에 대한 항체가 검출되지 않거나 검출량이 매우 낮고 설사 등의 임상 증상이 없는 송아지 15두를 선발한 후, 공격접종의 여부 및 고도면역혈청의 투여 여부로 G1~G5 그룹을 준비하였다(아래 표 4 참조).
여기서, G1 그룹은 공격접종 후, 고도면역혈청을 저역가의 항체 역가(BCV 1b: 24(log2), BRV G6P[5]: 25(log2), BRV G8P[5]: 25(log2), BVDV 1b: 25(log2), BVDV 2a: 25(log2))로 투여한 송아지 그룹이고, G2 그룹은 공격접종 후, 고도면역혈청을 중역가의 항체 역가(BCV 1b: 25(log2), BRV G6P[5]: 26(log2), BRV G8P[5]: 26(log2), BVDV 1b: 26(log2), BVDV 2a: 26(log2))로 투여한 송아지 그룹이며, G3 그룹은 공격접종 후, 고도면역혈청을 고역가의 항체 역가(BCV 1b: 26(log2), BRV G6P[5]: 27(log2), BRV G8P[5]: 27(log2), BVDV 1b: 27(log2), BVDV 2a: 27(log2))로 투여한 송아지 그룹이고, G4 그룹(양성대조군: 공격접종 있음) 및 G5 그룹(음성대조군: 공격접종 없음)은 고도면역혈청을 투여하지 않은 송아지 그룹이었다.
고도면역혈청의 투여량은 송아지의 평균 체중 30kg 및 혈액량 3L와, BCV, BRV 및 BDVD의 공격접종 시 송아지 체내에 유입 가능한 바이러스의 총량(~3×107.0TCID50/4L)을 고려하여 적절하게 조정하였다.
G1~G4 그룹의 공격접종 시 사용되는 바이러스는 실시예 1에서 제조한 BCV(BCV 1b) 백신주, BRV(BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]) 백신주 및 BDVD(BVDV 1b 및 BVDV 2a) 백신주로, 이들을 한 회당 10ml(바이러스 역가: 105 ~ 106 TCID50/ml)씩 6시간 간격으로 2회 경구 접종하되, 바이러스 종류별로 15분의 간격을 두고 공격접종하였다.
구체적으로, BCV 1b를 송아지에 공격접종 시 바이러스 함량이 105TCID50/mL가 되도록 한 바이러스 상등액 10mL을 두당 6시간 간격으로 2회 경구로 공격접종하였고, BRV를 송아지에 공격접종 시 2종의 유전형 바이러스인 BRV G6P[5] 및 BRV G8P[5]를 각각 바이러스 함량이 106TCID50/mL가 되도록 한 각각의 바이러스 상등액 10mL을 혼합하여 두당 20mL 6시간 간격으로 2회 경구로 공격접종하였고, BVDV를 송아지에 공격접종 시 2종의 유전형 바이러스인 BVDV 1b 및 BVDV 2a를 각각 바이러스 함량이 105TCID50/mL가 되도록 한 각각의 바이러스 상등액 10mL을 혼합하여 두당 20mL 6시간 간격으로 2회 경구로 공격접종하였다.
위와 같이 공격접종한 그룹별 송아지들에서 BCV, BRV 및 BVDV 감염에 대한 특이적인 임상 증상이 발현되는 시기(2days post-infection: DPI 2)에 실시예 1에서 제조한 고도면역혈청을 혈관주사(정맥주사)로 두당 10mL/dose로 회당 20시간 간격으로 2회 주입(투여)하였다. 이후, 후술하는 바와 같이, 각 그룹의 송아지의 부검 시점(DPI 16) 전까지 DPI 1~15 일자별로 송아지의 상태를 설사 유무/강도, 폐사율, 체중변화, 대용유 식이 정도, 활동성 등의 임상적 특징을 지속적으로 관찰하였고 각 그룹의 송아지로부터 수집한 분변, 비강 분비물 및 혈액 내 BCV, BRV 및 BVDV의 존부를 항원검사(RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction))로 확인하였으며, 공격접종 16일째(DPI 16)에는 모든 그룹의 송아지를 안락사하고 부검하여 수집한 장기의 BCV, BRV 및 BVDV 감염 정도를 병변 및 각 바이러스 잔존 여부(RT-PCR 수행)로 확인하였다(RT-PCR 등의 시험/분석방법은 대한민국 등록특허 제10-2243374호, 대한민국 등록특허 제10-1938556호 등 참조).
[2-2]: BCV, BRV 및 BVDV를 공격접종한 송아지에 대한 고도면역혈청의 치료 효능 확인
송아지에 BCV, BRV 및 BVDV를 공격접종한 후 고도면역혈청 투여 시, 송아지의 설사병 완화 효과를 설사 유무/강도에 따른 증상지수로 확인하였고, 송아지의 생존 효과를 폐사율로 확인하였다(표 5 및 도 4 참조).
상기 증상지수는 BCV, BRV 및 BVDV의 송아지 접종 후부터 부검 시까지 일자별로 G1~G5 그룹의 송아지의 설사 유무와 정도에 따른 평가지수로 0(무증상), 1(연변), 2(중등도 설사) 및 3(심한 설사)으로 수치화한 것이다.
G1 그룹(저역가의 고도면역혈청을 투여한 그룹)에서는 공격접종(DPI 1) 및 고도혈청 투여 후(DPI 2) 폐사 직전까지 C2 송아지 및 C3 송아지는 심한 설사 증세를 나타내었다. C2 송아지는 DPI 3에 폐사하였고, C3 송아지는 DPI 2에 폐사한 반면, C11 송아지는 DPI 1~2에서는 중등도의 설사가 지속되었고 DPI 6부터는 약한 정도의 설사가 지속되었으나 부검시까지 생존하였다(G1 그룹의 폐사율: 66.6%).
G2 그룹(중역가의 고도면역혈청을 투여한 그룹)에서는 고도면역혈청 투여 전인 DPI 2에 B9 송아지가 폐사하였다(원인불명 폐사). 남은 G2 그룹의 송아지들(B5 송아지 및 B6 송아지)은 고도면역혈청을 투여하기 전까지는 중등도의 설사 증상을 나타냈으나 고도면역혈청 투여 후 설사 증상이 개선되었고 부검시까지 추가적인 폐사는 없었다(G2 그룹의 폐사율: 33.3%).
G3 그룹(고역가의 고도면역혈청을 투여한 그룹) 및 G5 그룹(공격접종 없고 고도면역혈청 투여 없음)에서는 실험기간(부검 전까지의 관찰기간 및 검사기간) 중 폐사한 송아지는 없었다(폐사율: 0%). 특히, G3 그룹은 공격접종 후, 고도면역혈청을 투여하기 전까지는 G1 그룹 및 G2 그룹과 비슷한 정도의 설사 증상이 있었으나, 고도면역혈청 투여 후에는 설사 증상이 신속하게 완화되는 것을 DPI 4~5에서부터 부검 전까지 확인하였다.
한편, G4 그룹(양성대조군: 공격접종 있고 고도면역혈청 투여 없음)에서는 DPI 1에서 모든 송아지가 설사 증세를 나타내었고, D8 송아지 및 D9 송아지는 DPI 4에 폐사하였고, D14 송아지는 DPI 4부터 지속적인 중등도 이상의 설사 증상(설사 강도 평가 지수: 2~3)을 보이다가 무기력증, 기립 불능, 식이거부 등의 임상 증상을 나타내었고 DPI 9에서 폐사하였다(G4 그룹의 폐사율: 100%).
표 5는 BCV, BRV 및 BVDV를 송아지에 공격접종한 후 1일 후 임상 증상 발현 시 고도면역혈청(고역가, 중역가 또는 저역가)을 정맥투여 후, 공격접종일(DPI 1)부터 관찰 15일(DPI 15)까지 설사 강도를 평가 지수로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
종합하면, BCV, BRV 및 BVDV를 공격접종한 송아지에게 투여되는 고도면역혈청의 항체 역가 수준을 저역가, 바람직하게는 중역가, 더 바람직하게는 고역가로 증가시킬 경우 송아지의 바이러스 감염에 의한 설사 등의 임상 증상을 현저하게 완화시키고, 폐사율을 감소시켜 송아지의 생존율을 증진시키는 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
[2-3]: BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 후 고도면역혈청을 투여한 송아지의 식이 활동 확인
BCV, BRV 및 BVDV의 송아지 접종 기준으로 부검 시까지 일자별로 G1~G5 그룹에서의 송아지의 대용유 식이(섭취) 정도를 관찰하여 식이 활동의 정도를 정상(0점), 식욕 저하(1점) 및 섭취 불량(2점)으로 채점하여 평가하였다(표 6 참조).
G1 그룹에서는 C2 송아지, C3 송아지 및 C11 송아지 모두가 DPI 1에서부터 대용유에 대한 식이 활동이 저하되었으나, DPI 2~3에 폐사한 C2 송아지 및 C3 송아지와 달리 C11 송아지는 고도면역혈청 투여 후에는 대용유를 정상적으로 식이하는 활동을 나타내었다.
G2 그룹에서는 DPI 1에 폐사한 B9 송아지를 제외하고 B5 송아지 및 B6 송아지는 고도면역혈청을 투여하기 전 약간의 식욕 저하 증세를 보였으나, 이내 회복하여 대용유를 정상적으로 평소와 같이 섭취하였다.
G3 그룹에서는 고도면역혈청 투여 전에는 모든 송아지에서 식욕저하가 관찰되었으나, 고도면역혈청 투여 후 DPI 3부터는 대용유에 대한 정상적인 식이 활동이 가능하였다.
한편, G4 그룹에서는 송아지가 DPI 4 또는 9에서 폐사하기 전 식이 활동이 현저하게 저하되는 것을 확인하였다.
표 6은 BCV, BRV 및 BVDV를 송아지에 공격접종하고 1일 후(DPI 2) 임상 증상 발현 시 고도면역혈청(고역가, 중역가 또는 저역가)을 정맥투여 후, 공격접종 전의 송아지와 폐사 직전의 송아지 각각의 식이 활동을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
종합하면, BCV, BRV 및 BVDV를 공격접종한 송아지에게 투여되는 고도면역혈청의 항체 역가 수준을 저역가, 바람직하게는 중역가, 더 바람직하게는 고역가로 증가시킬 경우 송아지의 설사병 등의 임상 증상뿐만 아니라 식이 장애가 빠르게 회복되었고, 폐사율을 감소시켜 생존율을 증진시키는 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
[2-4]: BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 후 고도면역혈청을 투여한 송아지의 BCV, BRV 및 BVDV 검출 수준 확인
DPI 1에서 BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 후 DPI 2에서 고도면역혈청을 투여한 송아지의 분변 중 바이러스 항원(BCV 항원, BRV 항원 및 BVDV 항원) 배출 및 조직시료 중 바이러스 항원 잔류를 확인하기 위해, 송아지의 일자별 분변 시료 및 비강 분비물 시료를 수집하고, 실험기간 후에 송아지를 부검하여 장기 시료(폐장, 비장, 심장, 편도, 익하임파절, 십이지장, 소장(공장, 회장) 및 대장)를 수집하여 수집한 시료들의 BCV, BRV 및 BVDV 검출 여부를 확인하였다.
먼저, 수집한 송아지의 일자별 분변 시료 및 장기 시료에 대한 BCV 검출 수준을 항원검사로 확인하였다. 그 결과, 표 7에 나타내었다.
G1 그룹에서는 BCV 항원이 폐사하기 전 모든 송아지(C2, C3 및 C11 송아지들)의 분변 시료에서 검출되었다. DPI 3에 폐사한 C2 송아지의 경우 소장(공장, 회장) 및 대장에서 BCV 항원이 검출되었다. DPI 2에 폐사한 C3 송아지의 경우 소장(공장, 회장)에서 BCV 항원이 검출되었다. C11 송아지의 경우 고도면역혈청의 투여 후에도 분변 시료에서 DPI 14까지 BCV 항원이 높은 빈도로 검출되었으며, DPI 16에 실시한 부검 결과 소장(회장) 및 대장에서도 BCV 항원이 검출되었다.
G2 그룹에서는 DPI 2일차에 폐사한 B9 송아지의 소장(공장, 회장)과 대장에서 BCV 항원이 검출되었고, B5와 B6 송아지는 BCV 항원이 DPI 5 및 12까지 분변 시료에서 검출되었으며, B9, B5 및 B6 송아지에 대해 DPI 16에 실시한 부검 결과 소장(공장, 회장) 및 대장에서 소량의 BCV 항원이 검출되었다.
G3 그룹에서는 BCV 항원이 DPI 6까지 분변 시료에서 검출되었으나, DPI 7부터는 검출되지 않았으며 DPI 16에 실시한 부검 결과 조직시료에서도 A7 송아지의 소장(공장)에서만 소량의 BCV 항원이 검출되어, BCV의 배출 및 체내 증식이 현저하게 저하되었음을 확인하였다.
한편, G4 그룹에서는 BCV 항원이 폐사 직전까지 모든 송아지의 분변 시료에서 검출되었고, 폐사한 송아지의 부검 시 소장(공장, 회장) 및 대장에서 다량의 BCV 항원이 검출되었다.
표 7은 BCV, BRV 및 BVDV를 송아지에 공격접종한 후 1일 후 임상 증상 발현 시 고도면역혈청(고역가, 중역가 또는 저역가)을 정맥투여 후, 매일 채취된 분변 시료와 실험종료 후 부검된 장기 시료에서 BCV 항원의 검출 유무를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다(RT-PCR 등의 시험/분석방법은 대한민국 등록특허 제10-2243374호 등 참조).
다음으로, 수집한 송아지의 일자별 분변 시료, 비강 분비물 시료 및 장기 시료에 대한 BRV 검출 수준을 항원검사로 확인하였다. 그 결과, 표 8에 나타내었다.
G1 그룹에서는 BRV 항원이 폐사하기 전 모든 송아지(C2, C3 및 C11 송아지들)의 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었고, C2 송아지의 경우 소장(회장) 및 대장에서 검출되었으며, C3 송아지의 경우 소장(회장)에서 검출되었고, 특히 C11 송아지의 경우 고도면역혈청의 투여 후에도 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 DPI 10까지 높은 빈도로 검출되었으며 부검 후 소장(회장) 및 대장에서도 검출되었다.
G2 그룹에서는 BRV 항원이 고도면역혈청의 투여 후에도 부검 전 DPI 8까지 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었으며 부검 후 소장(회장) 및 대장에서도 약하게 검출되었다.
G3 그룹에서는 BRV 항원이 DPI 3까지 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었으나, DPI 4부터는 검출되지 않았으며 부검 후 A8 송아지의 소장(회장)에서만 약하게 검출되어, 체내 BRV의 증식능이 현저하게 저하되었음을 확인하였다.
한편, G4 그룹에서는 BRV 항원이 폐사 직전까지 모든 송아지의 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었고, 폐사한 송아지의 부검 시 소장(공장, 회장) 및 대장에서 검출되는 것을 확인하였다.
표 8은 BCV, BRV 및 BVDV를 송아지에 공격접종한 후 1일 후 임상 증상 발현 시 고도면역혈청(고역가, 중역가 또는 저역가)을 정맥투여 후, 매일 채취된 분변 시료 및 비강 분비물 시료와 실험종료 후 부검된 장기 시료에서 BRV 항원의 검출 유무를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다(RT-PCR 등의 시험/분석방법은 대한민국 등록특허 제10-2243374호 등 참조).
다음으로, 수집한 송아지의 일자별 분변 시료, 비강 분비물 시료 및 장기 시료에 대한 BVDV 검출 수준을 항원검사로 확인하였다. 그 결과, 표 9에 나타내었다.
G1 그룹에서는 BVDV 항원이 폐사하기 전 모든 송아지(C2, C3 및 C11 송아지들)의 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었고, C2 송아지의 경우 폐장, 비장 및 심장에서 검출되었으며, C3 송아지의 경우 편도 및 소장(회장)에서 검출되었고, 특히 C11 송아지의 경우 고도면역혈청의 투여 후에도 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 DPI 14까지 높은 빈도로 검출되었으며 부검 후 소장(회장)에서도 검출되었다.
G2 그룹에서는 BVDV 항원이 고도면역혈청의 투여 후에도 부검 전 DPI 9까지 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었으며 부검 후 폐장, 비장, 편도, 익하임파절 및 소장(회장, 공장)에서도 약하게 검출되었다.
G3 그룹에서는 BVDV 항원이 DPI 9까지 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었으나, DPI 10부터는 검출되지 않았으며 부검 후 A8 송아지의 소장(회장)에서만 약하게 검출되어, 체내 BVDV의 증식능이 현저하게 저하되었음을 확인하였다.
한편, G4 그룹에서는 BVDV 항원이 폐사 직전까지 모든 송아지의 분변 시료 및 비강 분비물 시료에서 검출되었고, 폐사한 송아지의 부검 시 폐장, 심장, 편도, 익하임파절, 십이지장, 소장(공장, 회장) 및 대장에서 검출되는 것을 확인하였다.
표 9는 BCV, BRV 및 BVDV를 송아지에 공격접종한 후 1일 후 임상 증상 발현 시 고도면역혈청(고역가, 중역가 또는 저역가)을 정맥투여 후, 매일 채취된 분변 시료 및 비강 분비물 시료와 실험종료 후 부검된 장기 시료에서 BVDV 항원의 검출 유무를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다(RT-PCR 등의 시험/분석방법은 대한민국 등록특허 제10-1938556호 등 참조).
종합하면, BCV, BRV 및 BVDV를 공격접종한 송아지에게 투여되는 고도면역혈청의 항체 역가 수준을 저역가, 바람직하게는 중역가, 더 바람직하게는 고역가로 증가시킬 경우 송아지 체내 BCV, BRV 및 BVDV의 증식능 저하 및 제거능 증가로 폐사율을 감소시켜 생존력을 증진시키는 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
[2-5]: BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 후 고도면역혈청을 투여한 송아지의 장기 및 조직의 병변 확인
BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 후 고도면역혈청의 투여 여부에 따른 송아지의 장기 병변을 장기의 외관(육안) 관찰 및 조직 검사로 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
G1 그룹에서는 관찰기간 중 폐사한 C2 송아지 및 C3 송아지를 각각 부검하여 수집한 소장 및 대장의 벽(intestinal wall)은 건강한 송아지(G5 그룹)를 부검하여 수집한 소장 및 대장의 벽의 두께보다 평균적으로 얇은 것을 확인하였고, C2 송아지 및 C3 송아지 각각의 소장 내에는 소화되지 않은 사료 고형물과 대장 내에는 황색의 설사 분변이 가득 차 있어 소화 상태가 불량한 것을 확인하였다. 이에 비해 관찰기간 동안 생존한 C11송아지를 부검하여 수집한 대장은 이상이 없었으나 십이지장, 공장 및 회장은 경미한 수준의 융모 상피의 변성 및 박리와 점막고유판 내 염증세포 침윤에 따른 염증 부위가 있음을 확인하였다.
한편, G1 그룹의 모든 송아지는 부검 시 폐, 간, 심장, 비장 및 신장에는 병변(lesion) 부위가 없었고, 부검 시 혀에는 설사병에서 흔히 나타나는 궤양 병변 부위가 없었다.
G2그룹에서는 관찰기간 동안 생존한 B5송아지 및 B6 송아지는 부검 시, G1 그룹의 C11 송아지와 유사한 형태로, 십이지장, 공장 및 회장에 경미한 수준의 융모 상피의 변성 및 박리와 점막고유판 내 염증세포 침윤에 따른 염증 부위가 있음을 확인하였다.
한편, G2그룹의 모든 송아지는 부검 시 폐, 간, 심장, 비장, 신장 및 혀에서 병변 부위를 발견하지 못하였다.
G3 그룹에서는 A7 송아지 및 A8 송아지는 건강한 송아지(G5 그룹)과 달리 부검 시 소장 및 대장의 벽은 얇은 두께를 가졌고 탄력이 감소되어 있었으며, 대장에는 연변이 소량 포함되어 있었다. 이에 비해A10 송아지는 부검 시 소장 및 대장에서 외관상 병변 부위가 없었으나, 회장에는 경미한 수준의 점막고유판 내 염증세포 침윤에 따른 염증 부위가 있음을 확인하였다.
한편, G3그룹의 모든 송아지는 부검 시 폐, 간, 심장, 비장, 신장 및 혀에서 병변 부위를 발견하지 못하였다.
양성대조군인 G4 그룹을 살펴본 결과, 실험기간 중 폐사/부패로 인해 부검 시 장기 병변 부위를 육안으로 관찰하기 어려웠으나, 도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 송아지는 잦은 설사병으로 인해 소장의 벽이 얇아져 있었고, 장내에는 묽은 설사 분변이 차 있었으며, G1 그룹 및G2 그룹의 송아지에서 확인한 소장 및 대장의 조직 병변의 정도보다 심각하였으며, 소화기관 외 장기에도 이상이 있음을 확인하였다.
구체적으로, G4 그룹의 송아지에서는 소장에 중등도 이상의 소장 상피세포의 융모 위축 및 융합(fusion), 점막하층에 염증세포의 침윤이 관찰되었고, 간에는 다발성 염증 및 괴사 병변 부위가 있었으며, 간문맥 주변에는 염증세포의 침윤이 있음을 확인하였다. 또한, 신장에는 심한 간질성 신장염, 신장 다발성 염증세포 침윤 소견을 보였으며, 비장에는 다발성 괴사 및 호산구 침윤, WPD(White pulp depletion)이 관찰되었고, 폐에는 미약한 염증이 기관지에 있었으며, 폐렴 증상이 있음을 확인하였다.
음성대조군인 G5 그룹을 살펴본 결과, 실험기간 경과 후 부검된 송아지의 소장 및 대장은 정상적인 상태임을 확인하였고, 장내 분변의 상태도 설사 분변 없이 양호하였으며, 폐, 간, 심장, 비장, 신장, 혀 등의 장기도 모두 정상인 것을 확인하였다.
종합하면, BCV, BRV 및 BVDV를 공격접종한 송아지에게 투여되는 고도면역혈청의 항체 역가 수준을 저역가, 바람직하게는 중역가, 더 바람직하게는 고역가로 증가시킬 경우 송아지 체내 BCV, BRV 및 BVDV의 증식능 저하 및 제거능 증가로 장기의 병변 부위의 감소 및 폐사율을 감소시켜 생존력을 증진시키는 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
[2-6]: BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 후 고도면역혈청을 투여한 송아지의 체중 변화 확인
BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 후 고도면역혈청의 투여 여부에 따른 송아지의 체중 변화를 확인하였고, 그 결과를 표 10에 나타내었다.
G1 그룹에서는 모든 송아지가 BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 시 체중이 감소하였으나, 실험기간 동안 생존한 C11 송아지는 공격접종 후 감소된 체중이 고도면역혈청 투여 후 증가하는 것을 확인하였다.
G2 그룹 및 G3 그룹에서는 G1 그룹과 같이 모든 송아지가 BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 시 체중이 감소하였으나, 생존한 모든 송아지는 공격접종 후 감소된 체중이 고도면역혈청 투여 후 증가하는 것을 확인하였다.
양성대조군인 G4 그룹에서는 모든 송아지가 BCV, BRV 및 BVDV의 공격접종 시 체중이 감소하였고, 고도면역혈청의 미투여로 모든 송아지가 폐사하였다.
음성대조군인 G5 그룹에서는 실험기간 동안 체중이 현저하게 증가하였다.
표 10은 BCV, BRV 및 BVDV를 송아지에 공격접종한 후 1일 후 임상 증상 발현 시 고도면역혈청(고역가, 중역가 또는 저역가)을 정맥투여 후, 공격접종 전의 송아지와 폐사직전의 송아지 각각의 체중을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
종합하면, BCV, BRV 및 BVDV를 공격접종한 송아지에게 투여되는 고도면역혈청의 항체 역가 수준을 저역가, 바람직하게는 중역가, 더 바람직하게는 고역가로 증가시킬 경우 송아지 체내 BCV, BRV 및 BVDV의 증식능 저하 및 제거능 증가로 양호한 건강상태(지표: 체중 증가)를 유지할 수 있게 되어 생존력을 증진시키는 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
[실시예 3]: 소 코로나바이러스(BCV), 소 로타바이러스(BRV) 및/또는 소 바이러스성설사병바이러스(BVDV)에 감염된 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 치료 효과의 평가를 위한 지표 설정
실시예 2의 실험결과에 기초하여, BCV, BRV 및/또는 BVDV에 감염된 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 항체 역가 조절에 따른 치료 효능을 아래 [3-1]~[3-4]의 평가 항목으로 평가 지표를 설정하고 평가 지표별로 가중치를 부여하여 정량화한 후 개체별로 각각의 평가 항목에 대한 점수를 부여하고, 최종적으로 그룹별로 개체점수를 합산하여 고도면역혈청의 치료 효능을 평가하고 고도면역혈청의 항체역가수준과 정량화된 치료 효능이 비례함을 확인하였다(아래 표 11 참조).
[3-1]: BCV, BRV 및/또는 BVDV에 감염된 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 항체 역가 조절에 따른 치료 효능을 소/송아지의 폐사 및 설사 유무로 평가
감염성 설사병이 있는 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 치료 효과를 고도면역혈청의 항체 역가(저역가, 중역가 또는 고역가) 기준에 맞게 폐사/설사 정도로 아래 표 11과 같이 평가대상인 소/송아지 개체별로 점수화한 후 소/송아지 그룹별로 개체점수를 합산하여 평가하였다..
구체적으로, 폐사 정도의 평가는 고도면역혈청을 투여한 소/송아지가 생존한 경우 소/송아지 개체 당 0점, 폐사한 경우 소/송아지 개체 당 10점으로 채점하는 것을 기준으로 하고, 설사 정도의 평가는 고도면역혈청을 투여한 소/송아지에서 투여 3일 후 설사병이 유발되지 않을 경우 소/송아지 개체 당 0점, 유발될 경우 소/송아지 개체 당 5점으로 채점하는 것을 기준으로 하며, 폐사/설사 정도의 점수가 낮을수록 치료 효과가 높은 것으로 평가하였다.
[3-2]: BCV, BRV 및/또는 BVDV에 감염된 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 항체 역가 조절에 따른 치료 효능을 소/송아지의 BCV, BRV 및/또는 BVDV 검출 유무로 평가
감염성 설사병이 있는 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 치료 효과를 고도면역혈청의 항체 역가(저역가, 중역가 또는 고역가) 기준에 맞게 BCV, BRV 및/또는 BVDV 검출 유무로 아래 표 11과 같이 평가대상인 소/송아지 개체별로 점수화한 후 소/송아지 그룹별로 개체점수를 합산하여 평가하였다.
구체적으로, BCV, BRV 및/또는 BVDV의 검출 유무에 따른 평가는 고도면역혈청을 투여한 소/송아지가 투여 5일 후 BCV, BRV 및/또는 BVDV이 음성반응을 보인 경우 소/송아지 개체 당 0점, 양성반응을 보인 경우 각 바이러스별로 소/송아지 개체 당 2점으로 채점하는 것을 기준으로 하고, BCV, BRV 및/또는 BVDV에 대한 검출 유무의 점수가 낮을수록 치료 효과가 높은 것으로 평가하였다.
[3-3]: BCV, BRV 및/또는 BVDV에 감염된 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 항체 역가 조절에 따른 치료 효능을 소/송아지의 대용유 섭취능 및 체중 감소로 평가
감염성 설사병이 있는 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 치료 효과를 고도면역혈청의 항체 역가(저역가, 중역가 또는 고역가) 기준에 맞게 대용유 섭취 정도 및 체중감소 정도로 아래 표 11과 같이 평가대상인 소/송아지 개체별로 점수화한 후 소/송아지 그룹별로 개체점수를 합산하여 평가하였다.
구체적으로, 대용유 섭취 정도의 평가는 고도면역혈청을 투여한 소/송아지가 투여 3일 후 대용유의 섭취가 양호한 경우 소/송아지 개체 당 0점, 대용유의 섭취가 불량한 경우 소/송아지 개체 당 5점으로 채점하는 것을 기준으로 하고, 체중변화 정도의 평가는 평균증체율 기준으로 고도면역혈청을 투여한 소/송아지의 체중이 1% 이상 증가할 경우 소/송아지 개체 당 0점, 감소할 경우 체중 감소범위에 따라 소/송아지 개체 당 5, 8, 10, 15점으로 채점하는 것을 기준으로 하며, 대용유 섭취 정도 및 체중변화 정도의 점수가 낮을수록 치료 효과가 높은 것으로 평가하였다.
[3-4]: BCV, BRV 및/또는 BVDV에 감염된 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 항체 역가 조절에 따른 치료 효능을 소/송아지의 장기 내 바이러스 항원 검출 여부 및 병변 유무로 평가
감염성 설사병이 있는 소/송아지에 대한 고도면역혈청의 치료 효과를 고도면역혈청의 항체 역가(저역가, 중역가 또는 고역가) 기준에 맞게 BCV, BRV 및/또는 BVDV에 감염된 소/송아지의 장기의 병변 정도로 아래 표 11과 같이 평가대상인 소/송아지 개체별로 점수화한 후 소/송아지 그룹별로 개체점수를 합산하여 평가하였다.
구체적으로, BCV, BRV 및/또는 BVDV에 감염된 소/송아지의 장기의 병변 정도에 따른 평가는 고도면역혈청을 투여한 소/송아지가 장기의 외관/조직 상 병변을 보이지 않은 경우 소/송아지 개체 당 0점, 외관/조직 상 병변을 보인 경우 소/송아지 개체 당 2점으로 채점하는 것을 기준으로 하고, 부검 시 수집한 조직시료에서 BCV 항원, BRV 항원 및/또는 BVDV 항원의 미검출 시 소/송아지 개체 당 0점, BCV 항원, BRV 항원 및/또는 BVDV 항원의 검출 시 소/송아지 개체 당 2점으로 채점하는 것을 기준으로 하여 점수가 낮을수록 치료 효과가 높은 것으로 평가하였다.
표 11은 BCV, BRV 및 BVDV에 대한 고도면역혈청의 치료 효과를 소/송아지의 폐사유무, 설사유무, 생체 시료(분변, 비강 분비물 및 장기)의 바이러스 배출유무, 체중변화, 대용유 섭취능, 부검장기의 병변 및 바이러스 항원 검출 여부를 평가 지표로 수치화하여 나타낸 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (21)
- 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum)의 제조 방법으로서,
(a) 소 설사병 유발 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 계대배양한 바이러스를 수득하는 단계;
(b) 상기 계대배양한 바이러스를 반추동물에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 접종한 반추동물의 혈청을 수득하는 단계;를 포함하며,
상기 소 설사병 유발 바이러스는 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스이고,
소 코로나바이러스는 수탁번호 KCTC18738P로 수탁된 소 코로나바이러스 BCV 1b 타입주의 백신주이고,
상기 소 로타바이러스는 수탁번호 KCTC18739P로 수탁된 소 로타바이러스 BRV G6P[5] 타입주의 백신주 및 수탁번호 KCTC14813BP로 수탁된 소 로타바이러스 BRV G8P[5] 타입주의 백신주이며,
상기 소 바이러스성설사병바이러스는 수탁번호 KCTC18532P로 수탁된 소 바이러스성설사병바이러스 BVDV 1b 타입주의 백신주 및 수탁번호 KCTC18533P로 수탁된 소 바이러스성설사병바이러스 BVDV 2a 타입주의 백신주인 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 숙주세포는 사람 선암종 세포, 원숭이 신장세포 및 소 신장세포로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 소 코로나바이러스는 사람 선암종 세포인 HRT-18 세포에서 연속계대배양 후, 1x105.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내고,
상기 소 로타바이러스 백신주는 원숭이 신장세포인 TF-104 세포에서 연속계대배양 후, 1x106.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내며,
상기 소 바이러스성설사병바이러스는 소 신장세포인 MDBK 세포에서 연속계대배양 후, 1x105.0TCID50/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 계대배양한 바이러스는 불활화 처리 및 중화화 처리 후 상기 접종하는 단계에서 사용하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제7항에 있어서,
상기 불활화 처리는 상기 계대배양한 바이러스에 BEI(Binary ethyleneimine)를 처리하는 것이고, 상기 중화화 처리는 티오황산나트륨(Sodium Thiosulfate)를 처리하는 것임을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 계대배양한 바이러스는 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel), 카반트 SOE(CAvant SOE) 및 카반트 DOE(CAvant DOE)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 어쥬번트와 혼합된 상태로 상기 접종하는 단계에서 사용하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제9항에 있어서,
상기 계대배양한 바이러스 및 어쥬번트는 1~10 : 10~1의 부피비로 혼합하여 상기 접종하는 단계에서 사용하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 접종하는 단계는 근육, 피하, 진피, 복강, 정맥, 경구 및 비강으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 접종 경로를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 반추동물은 소, 산양, 면양, 사슴, 낙타 및 기린으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 혈청은 소 설사병 유발 바이러스에 대해 10(log2) 이상의 중화항체 역가를 갖는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 혈청은 56~65℃의 온도에서 비동화 처리 후 당류의 첨가로 안정화시키는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제14항에 있어서,
상기 안정화된 혈청은 7.0~9.0㎛ 마이크로필터(microfilter), 3.0~5.0㎛ 마이크로필터, 1.0~1.5㎛ 마이크로필터, 0.5~0.9㎛ 마이크로필터 및 0.4~0.5㎛ 마이크로필터로 순차적으로 여과되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법. - 제1항 및 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum).
- 제16항에 있어서,
상기 고도면역혈청은 반추동물의 소 설사병 유발 바이러스에 대한 면역반응 유도용 또는 반추동물의 면역 증강용임을 특징으로 하는, 고도면역혈청. - 제1항 및 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum)을 유효성분으로 함유하는, 소 설사병 유발 바이러스로 인한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료용 수의학적 조성물.
- 제1항 및 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum)을 유효성분으로 함유하는, 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료용 수의학적 조성물.
- 제1항 및 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum)을 인간을 제외한 반추동물에 투여하는 단계를 포함하는, 소 설사병 유발 바이러스로 인한 감염 질환의 예방, 방어, 방지, 개선 또는 치료 방법.
- 제1항 및 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조한 소 설사병 유발 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 고도면역혈청(Hyperimmune Serum)을 인간을 제외한 반추동물에 투여하는 단계를 포함하는, 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230012684A KR102615970B1 (ko) | 2023-01-31 | 2023-01-31 | 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230012684A KR102615970B1 (ko) | 2023-01-31 | 2023-01-31 | 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102615970B1 true KR102615970B1 (ko) | 2023-12-21 |
Family
ID=89320606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230012684A KR102615970B1 (ko) | 2023-01-31 | 2023-01-31 | 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102615970B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090016236A (ko) * | 2007-08-10 | 2009-02-13 | (주)양성 | 소 질병의 항원 제조방법 및 면역항체(난황, 초유) 생산과전해질을 첨가한 송아지설사 방제용 조성물 |
| KR20090098460A (ko) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | 김윤성 | 돼지질병 예방 및 치료용 자가면역혈청의 제조방법 |
| KR20190000223A (ko) * | 2017-06-22 | 2019-01-02 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 복수의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 이용한 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법 |
| KR20210038171A (ko) * | 2019-09-30 | 2021-04-07 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물 |
-
2023
- 2023-01-31 KR KR1020230012684A patent/KR102615970B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090016236A (ko) * | 2007-08-10 | 2009-02-13 | (주)양성 | 소 질병의 항원 제조방법 및 면역항체(난황, 초유) 생산과전해질을 첨가한 송아지설사 방제용 조성물 |
| KR20090098460A (ko) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | 김윤성 | 돼지질병 예방 및 치료용 자가면역혈청의 제조방법 |
| KR20190000223A (ko) * | 2017-06-22 | 2019-01-02 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 복수의 소바이러스성설사병바이러스 백신주를 포함하는 백신 조성물, 및 이를 이용한 소바이러스성설사병바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법 |
| KR20210038171A (ko) * | 2019-09-30 | 2021-04-07 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 공개특허공보 제10-2021-0038171호* |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3098301B1 (en) | Swine mycoplasmal pneumonia attenuated live vaccine and use thereof | |
| US7309493B2 (en) | Inactivated bovine scours vaccines, process and method of preventing bovine scours | |
| RU2595873C2 (ru) | Вакцинные композиции, содержащие вирус бычьей вирусной диареи 1в типа, и способы их получения и применения | |
| KR102336158B1 (ko) | 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 백신 조성물 | |
| EP2354221A2 (en) | Porcine circovirus type 2 and use thereof | |
| KR102243374B1 (ko) | 소 코로나바이러스, 소 로타바이러스 및 소 바이러스성설사병바이러스에 대한 백신 조성물 | |
| KR101654023B1 (ko) | 돼지유행성설사병바이러스 약독화주 및 불활화백신 조성물과 이를 이용한 경구 투여용 백신 조성물 | |
| CN114634564B (zh) | 猫用三联卵黄抗体、制剂及制备方法与用途 | |
| CN108969492B (zh) | 一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗及其制备方法 | |
| CN114426956A (zh) | 猫狂犬病泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎四联灭活疫苗 | |
| CN114480304A (zh) | 猫泛白细胞减少症鼻气管炎鼻结膜炎三联灭活疫苗 | |
| CN108066758B (zh) | 貉犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法和用途 | |
| CN111450167A (zh) | 一种复合中药微生态组合物及其制备方法和应用 | |
| KR102615970B1 (ko) | 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법 | |
| CN107338227B (zh) | 牛副流感病毒pbiv3-b株及其应用 | |
| CN111686246B (zh) | 一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法 | |
| CN111073863B (zh) | 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法 | |
| US4386065A (en) | Vaccine against EAE | |
| CN114438041A (zh) | 一株牛肠道病毒1型分离毒株及其应用 | |
| CN108703952B (zh) | 一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用冻干保护剂及应用 | |
| CN107412763A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法 | |
| KR102656435B1 (ko) | 신규한 가금 아데노바이러스 및 이를 유효성분으로 포함하는 가금 아데노바이러스 다가백신 | |
| CN113832068B (zh) | 链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗 | |
| CN108704131B (zh) | 一种猪瘟口服弱毒冻干疫苗用疫苗稀释液及其应用 | |
| KR102348853B1 (ko) | 락토바실러스 플란타룸 및 가금 아데노 바이러스를 포함하는 백신 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |