CN114438041A - 一株牛肠道病毒1型分离毒株及其应用 - Google Patents
一株牛肠道病毒1型分离毒株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的一株新的牛肠道病毒1型EV‑E‑HN1817株，该毒株对于乙醚、氯仿等脂溶性溶剂及胰蛋白酶具有一定的抵抗能力，可以耐受pH=3.0和5.0的酸性环境，然而，对pH=9.0和10.0的碱性环境较为敏感，50℃处理30min会使得病毒活性明显下降，表明其对热较为敏感。将牛肠道病毒1型EV‑E‑HN1817病毒灭活后制备得到的灭活疫苗能够刺激犊牛产生一定浓度的中和抗体，在首次免疫后14天可以达到1:64以上的中和抗体效价，加强免疫后14天，其中和抗体效价最高可以达到1:256。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株牛肠道病毒1型分离毒株及其应用。
背景技术：
牛肠道病毒（BEV）感染是由小RNA病毒科肠道病毒属的牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV）引起的以消化道和呼吸道症状为主要特征的一种新发动物传染病。据报道，牛肠道病毒的感染谱较宽，各种品种和日龄的牛群均易感，具有较高的发病率，牛群感染该病毒后常表现为发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻等症状，严重者甚至出现突然死亡。本病在国内为新发传染病，BEV感染在牛群中非常普遍，且除感染牛只外，也可通过口-口、粪-口等接触传播方式感染人、羊及其它脊柱动物。感染牛肠道病毒的病牛其排泄物和分泌物也携带有大量病原体，通过污染水源、圈舍、饲料等迅速感染整个牛群，加之该病原体具有可在环境中存活较长时间和其感染谱较广等特点，造成了牛肠道病毒感染的广泛传播；同时，牛肠道病毒常与其它病原体一起呈现混合感染或者继发感染的状态，以致对当今养牛业的健康发展起到了较为严重的阻碍作用，给养牛业造成巨大的经济损失。此外，部分牛群感染肠道病毒后，不表现临床症状，为隐性感染。
牛肠道病毒属于小RNA病毒科、肠道病毒属，为单股正链RNA病毒。它具有典型的小RNA病毒结构，主要抗原表位也集中在结构蛋白VP1上，但其致病力明显弱于同属的人肠道病毒，所以多年以来并未引起人们足够的重视。BEV感染最早于1959年由美国学者MOLL等首次报道，此后许多国家和地区也先后报道了BEV感染。国内已有多株牛肠道病毒被分离鉴定，其中BHM26、BJ50和BJ001株等3株为EV-F2，HY12与HLJ-3531/2013株等两株为EV-E，这些病毒均从表现腹泻的牛粪便中分离获得。BEV感染的主要传播途径为接触传播，通过接触被感染动物的口鼻分泌物、尿液、粪便或者被粪便污染的草料等能够直接引发病毒的传播，有报道认为该病还可能通过喷嚏、咳嗽产生的飞沫导致牛群的感染。本病主要传染源是患病牛和无症状的病毒携带者，各年龄阶段的牛均为易感动物，密集型的饲养方式致使牛群之间密切接触，一旦有牛感染BEV就会引起牛群的广泛感染。近年来，BEV感染在我国有逐年升高的趋势，感染牛群出现腹泻与呼吸道症状，给养牛业造成了较大经济损失。国外流行病学调查结果显示，牛群的BEV感染阳性率为17.6％-80%，河南省是我国养牛生产快速发展的省份之一，钱明珠等对河南省17个地市中采集的1970份牛粪便样品进行BEV感染的病原学检测，平均感染率达23.35％，南阳市的感染率为24.1%。
由于BEV感染为国内新发传染病，现在对此病尚无有效的免疫制剂进行预防，也无有效的药物用于临床治疗，山东省农业科学院奶牛研究中心等单位研究了比阿培南、头孢拉定、H-Lys-Trp-Lys-OH等在制备防治牛肠道病毒感染药物中的应用，然而，其仍处于研究的初级阶段，尚未进入临床治疗。鉴于国内目前分离的毒株较少，对于其研究不够深入，因而，分离毒株，并对其进行深入研究，研发能预防或治疗牛肠道病毒感染的药物对我国养牛业具有重大意义。
发明内容：
为解决目前BEV感染研究不足，没有相关药物和疫苗的现状，本发明旨在提供一株牛肠道病毒1型分离毒株及其应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一株牛肠道病毒1型分离毒株，其特征在于，所述分离毒株于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCCNo.V202071，分类命名为牛肠道病毒1型EV-E-HN1817；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
本发明还请求保护所述牛肠道病毒1型分离毒株在制备用于预防或治疗牛肠道病毒感染的药物中的应用。
进一步地，所述药物为疫苗，优选为灭活疫苗。
本发明还请求保护一种牛肠道病毒灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗以牛肠道病毒1型EV-E-HN1817为抗原，经灭活制备得到。
本发明还请求保护一种制备牛肠道病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，病毒原液的制备，将牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株接种至生长状态良好的MDBK细胞培养，制备得到疫苗病毒原液；
步骤二，灭活，将检验合格的疫苗病毒原液澄清过滤去细胞碎片，边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活16h，期间不断搅拌，灭活后病毒液于2～8℃保存；
步骤三，疫苗的制备；
步骤四，分装定量分装，压盖，2-8℃保存。
优选的，所述步骤一为：将生长状态良好的MDBK细胞单层弃去培养液，按2％的量吸附接种牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株，37℃吸附2小时后加入维持液继续培养，每日观察记录细胞病变情况，当细胞80％以上病变时收获，冻融2次，取样进行半成品检验，测定病毒滴度并将病毒液稀释至109.0 TCID50 /mL，即得到疫苗病毒原液，-80℃保存。
优选的，所述步骤三包括如下步骤：
（1）油相制备：将90重量份注射用白油、5重量份硬脂酸铝混匀并加热至70℃，再加入5重量份span-80，至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；
（2）水相制备：将吐温-80与灭活的病毒液按1:19的体积比例混合，搅拌30-35min使吐温-80完全溶解混匀；
（3）乳化：将油相和水相以1:2体积比例乳化25-30min，取10ml疫苗加入离心管中，4000rpm，离心10min，管底析出的水相≤0.5ml。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的一株新的牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株，该毒株对于乙醚、氯仿等脂溶性溶剂及胰蛋白酶具有一定的抵抗能力，可以耐受pH=3.0和5.0的酸性环境，然而，对pH=9.0和10.0的碱性环境较为敏感，50℃处理30min会使得病毒活性明显下降，表明其对热较为敏感。将牛肠道病毒1型EV-E-HN1817病毒灭活后制备得到的灭活疫苗能够刺激犊牛产生一定浓度的中和抗体，在首次免疫后14天可以达到1:64以上的中和抗体效价，加强免疫后14天，其中和抗体效价最高可以达到1:256。
附图说明：
图1：分离毒株的RT-PCR鉴定，通道1，分离毒株；通道2，阴性对照；M，marker。
具体实施方式：
实施例1：BEV病毒的分离与鉴定
1.1样品及样品的处理
南阳地区某养牛场发生疑似牛肠道病毒感染，经取样RT-PCR检测，其BEV感染率高达80%。在该牛场中采集病牛的粪便样品5份，采集的粪便样品分别用灭菌的PBS缓冲液（pH=7.2）按照1:4（W/V）稀释后，充分研磨匀浆，8000r/min离心15min，收集上清，加入2000U/mL的青霉素-链霉素混合液，4℃静置4h后，用0.22μm滤膜过滤两次，-80℃保存备用。
病毒的分离培养
取制备好的上清样品1mL，接种到长满单层的MDBK细胞，同时接种1mLPBS作为阴性对照，置于37℃培养箱中孵育吸附2h，而后弃去接种物，DMEM培养液洗涤两次后，加入含2%FBS的DMEM培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中继续培养，盲传3代。
采用以上同样的方法，将第3代病毒液接种至长满单层的MDBK细胞，每隔6h观察1次细胞。接种48-72h后，将接毒细胞反复冻融3次，离心获得病毒液再次接种MDBK细胞，重复上述操作，将病毒传至5代。
病毒TCID50的测定
对F5代病毒液进行连续10倍稀释，具体方法是：
（1）从-80℃超低温冰箱取出病毒液，反复冻融三次，将病毒液做10-2~10-13连续稀释，
（2）拿出已经铺满培养瓶底部的96孔MDBK细胞培养板，弃去培养液后，将病毒液接种到MDBK细胞中，每孔100 μL，并设置重复和阴性对照，感作2 h 后加入2% DMEM 的维持液。
（3）放入37℃，5％CO2细胞培养箱底部孵育2h，然后将病毒液弃去，更换100μL 1％细胞维持液，继续置入37℃，5％CO2细胞培养箱培养。连续观察72h，计录每个稀释度出现CPE 孔数，按照Reed-Muench 方法计算病毒的TCID50。
经计算，F5代病毒的滴度为108.9TCID50/mL；继续传代后，F10的病毒滴度为1012.5TCID50/mL。
分离毒株的RT-PCR检测
采用文献报道的BEV 5’-UTR-F（5’-tttaaaacagcctgggggttgtac-3’）和BEV 5’-UTR-R（5’-cggagtaccgaaagtagtctgttc-3’）（张姗等，中国兽医科学，2018,48（07））对分离的病毒进行RT-PCR检测鉴定，经RT-PDR检测，其能扩增出于预期相符的667bp的特异性片段，如图1所示。
分离病毒的理化特性鉴定
对该病毒进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、耐热性试验、耐酸性试验等理化特性鉴定。
1.5.1乙醚敏感性试验：取2mL F5代病毒液与0.5mL乙醚混匀置4℃过夜，1200g离心30min，吸取下层病毒液并过滤除菌，于MDBK细胞中测定得到处理后的病毒液的滴度为106.7TCID50 /mL。
1.5.2氯仿敏感性试验：F5病毒液以3000g离心15min去除细胞碎片，取1.2mL上清与200μL氯仿混匀置4℃过夜，次日取上层病毒液并过滤除菌，于MDBK细胞中测定得到处理后的病毒液的滴度为105.9TCID50 /mL。
1.5.3胰蛋白酶敏感性试验：取1mL病毒液与等体积0.5%胰蛋白酶溶液混匀（胰蛋白酶终浓度为0.25%），置37℃作用1h，立即加入4mL胎牛血清以终止胰蛋白酶的作用，过滤除菌后于MDBK细胞中测定得到处理后的病毒液的滴度为106.2TCID50 /mL。
1.5.4耐酸耐碱性试验：分别取2mL病毒液，将其pH调至3.0、5.0、9.0和10.0，置于37℃水浴中作用1h，再将pH调至7.0，过滤除菌后于MDBK细胞中测定得到处理后的病毒液的滴度为105.2TCID50 /mL（pH=3.0）、105.7TCID50 /mL（pH=5.0）、103.1TCID50 /mL（pH=9.0）102.9TCID50 /mL（pH=10.0）。
1.5.5温度敏感性试验：取1mL病毒液置于50℃水浴中作用30min，1200g离心30min，吸取下层病毒液并过滤除菌，于MDBK细胞中测定得到处理后的病毒液的滴度为103.7TCID50 /mL（50℃）。
基于以上结果可知，本发明所分离得到的BEV毒株对于乙醚、氯仿等脂溶性溶剂及胰蛋白酶具有一定的抵抗能力，可以耐受pH=3.0和5.0的酸性环境，然而，对pH=9.0和10.0的碱性环境较为敏感，50℃处理30min会使得病毒活性明显下降，表明其对热较为敏感。
病毒的保藏
2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No.V202071，分类命名为牛肠道病毒1型EV-E-HN1817；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
实施例2. BEV灭活疫苗的制备：
2.1病毒原液制备
将生长状态良好的MDBK细胞单层弃去培养液，按2％的量吸附接种牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株，37℃吸附2小时后加入维持液继续培养，每日观察记录细胞病变情况。当细胞80％以上病变时收获，冻融2次，取样进行半成品检验，测定病毒滴度并将病毒液稀释至109.0 TCID50 /mL，即得到疫苗病毒原液，-80℃保存。
灭活
将检验合格的疫苗病毒原液澄清过滤去细胞碎片，边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活16h，期间不断搅拌，灭活后病毒液于2～8℃保存。
疫苗制备及分装
2.3.1油相制备
将90重量份注射用白油、5重量份硬脂酸铝混匀并加热至70℃，再加入5重量份span-80，至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用。
2.3.2水相制备
将吐温-80与灭活的病毒液按1:19的体积比例混合，搅拌30-35min使吐温-80完全溶解混匀。
2.3.3乳化
将油相和水相以1:2体积比例乳化25-30min，取10ml疫苗加入离心管中，4000rpm，离心10min，管底析出的水相≤0.5ml。
2.3.4分装定量分装，压盖，2-8℃保存。
实施例3. 灭活疫苗的效果评价
3.1 犊牛免疫
在南阳地区某健康牛场，无腹泻相关病症的发生，且取样经RT-PCR检测为BEV感染阴性。选取该牛场1-1.5月龄犊牛5头，经RT-PCR复核为BEV感染阴性，其中随机1头为对照组，编号为1号，4头为试验组，分别编号为2-5号。在试验前分别采血分离血清，-20℃保存，而后采用实施例2制备的疫苗进行初次免疫，试验组每头注射2mL疫苗，对照组相应注射2mL生理盐水；首次免疫14天后抽血分离血清，并进行加强免疫，试验组每头注射2mL疫苗，对照组相应注射2mL生理盐水，加强免疫后14天再次抽血取血清，-20℃保存。
中和抗体水平的测定方法
步骤一，培养MDBK细胞，铺96孔细胞培养板；
步骤二，补体灭活：待测血清56℃水浴处理30分钟；
步骤三，血清稀释：采用DMEM培养基对待测血清进行倍比梯度稀释，分别按照1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，1:256，1:512，1:1024，1:2048进行稀释；
步骤四，稀释好的100μl血清与100TCID50的牛肠道病毒1型EV-E-HN1817病毒液等体积混合，37℃、5％CO2孵育1h，得到病毒-血清混合物；
步骤五，接种细胞：将步骤一中得到的培养好的96细胞培养板中的MDBK细胞用PBS洗涤两次后，再用无血清的DMEM培养基洗涤一次，加入上述步骤四得到的病毒-血清混合物100μL，37℃、5％CO2培养箱中孵育2h；
步骤六，吸弃掉病毒血清中和液，加入250μL DMEM洗涤一次后加入200μL DMEM于37℃、5％CO2培养箱中孵育并及时观察记录结果。
以能保护50％细胞培养管不被污染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点，用Reed和Muench法计算血清的中和效价。
经测定，各血清样品中的中和抗体效价如下：
表1 犊牛接种后的中和抗体效价水平检测结果
| 编号 | 接种前（0天） | 首免后14天 | 加强免疫后14天 |
| 1号 | ≤1:4 | ≤1:4 | ≤1:4 |
| 2号 | ≤1:4 | 1:128 | 1:256 |
| 3号 | ≤1:4 | 1:128 | 1:128 |
| 4号 | ≤1:4 | 1:128 | 1:256 |
| 5号 | ≤1:4 | 1:64 | 1:128 |
基于以上结果可知，本发明将牛肠道病毒1型EV-E-HN1817病毒灭活后制备得到的灭活疫苗能够刺激犊牛产生一定浓度的中和抗体，在首次免疫后14天可以达到1:64以上的中和抗体效价，加强免疫后14天，其中和抗体效价最高可以达到1:256。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (7)
1.一株牛肠道病毒1型分离毒株，其特征在于，所述分离毒株于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCCNo.V202071，分类命名为牛肠道病毒1型EV-E-HN1817；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
2.根据权利要求1所述的牛肠道病毒1型分离毒株在制备用于预防或治疗牛肠道病毒感染的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述药物为疫苗，优选为灭活疫苗。
4.一种牛肠道病毒灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗以牛肠道病毒1型EV-E-HN1817为抗原，经灭活制备得到。
5.一种制备权利要求4所述的牛肠道病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，病毒原液的制备，将牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株接种至生长状态良好的MDBK细胞培养，制备得到疫苗病毒原液；
步骤二，灭活，将检验合格的疫苗病毒原液澄清过滤去细胞碎片，边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活16h，期间不断搅拌，灭活后病毒液于2～8℃保存；
步骤三，疫苗的制备；
步骤四，分装定量分装，压盖，2-8℃保存。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤一为：将生长状态良好的MDBK细胞单层弃去培养液，按2％的量吸附接种牛肠道病毒1型EV-E-HN1817株，37℃吸附2小时后加入维持液继续培养，每日观察记录细胞病变情况，当细胞80％以上病变时收获，冻融2次，取样进行半成品检验，测定病毒滴度并将病毒液稀释至109.0 TCID50 /mL，即得到疫苗病毒原液，-80℃保存。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤三包括如下步骤：
（1）油相制备：将90重量份注射用白油、5重量份硬脂酸铝混匀并加热至70℃，再加入5重量份span-80，至温度达到115℃时维持40min，冷却后备用；
（2）水相制备：将吐温-80与灭活的病毒液按1:19的体积比例混合，搅拌30-35min使吐温-80完全溶解混匀；
（3）乳化：将油相和水相以1:2体积比例乳化25-30min，取10ml疫苗加入离心管中，4000rpm，离心10min，管底析出的水相≤0.5ml。
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