CN107412763A - 一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种用ST细胞生产猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法，所述方法包括ST细胞的扩增培养；病毒接种；制苗毒液的繁殖；成品制备四个步骤。利用该方法生产得到的疫苗免疫水平高，免疫窗口期短，免疫期显著延长，肠道粘膜内总分泌型抗体(总SIgA)显著提高。

Description

一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制品领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种急性接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、食欲下降和脱水为基本特征，各种年龄的猪均易感。本病的临床症状和病理变化都是猪传染性胃肠炎十分相似，但哺乳仔猪死亡率较低，在猪群中的传播速度相对缓慢。
PEDV为冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的成员，目前发现只有一个血清型。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤其以哺乳仔猪严重。母猪的发病率在15％～90％。本病主要是在冬季多发，夏季也可发生，我国从12月份至次年2月份为本病的高发期。病猪和带毒猪是主要传染源，病毒多经发病猪的粪便排出，运输车辆、饲养员的鞋子或其他带毒的动物，都可作为传播媒介。自然感染开始于口部吸收病毒以后，主要经消化道传播，也有经呼吸道传播的报道。
当前用于防治PEDV的疫苗主要分为活疫苗和灭活疫苗。传统的灭活疫苗接种后不能在动物体内繁殖，因此使用时接种剂量大，接种次数多，且疫苗免疫后抗体产生窗口期长，总分泌型抗体不足，不能有效中和肠道内病毒。因此，灭活疫苗必须加入免疫佐剂来提高疫苗的免疫效果。
裂褶菌多糖(SPG)是从裂褶菌菌子实体、菌丝体以及发酵液中提取出来的水溶性多糖，结构为β-(1-3)糖苷为主链，具有β-(1-6)糖苷位侧链的β-D-葡聚糖；美人蕉花为美人蕉科多年生草本植物美人蕉的花；吲哚美辛为非淄体抗炎药，目前还未见将三者联用用于免疫增强的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法，利用该方法生产得到的疫苗免疫水平高，免疫窗口期短，免疫期显著延长，肠道粘膜内总分泌型抗体(总SIgA)显著提高。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用ST细胞生产猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
A)ST细胞的扩增培养：取ST细胞用胰酶消化分散，加入细胞生长液在37℃、含5％CO2的环境下培养至细胞形成良好单层，再用无血清的DMEM培养液清洗细胞，用于接种猪流行性腹泻病毒；
B)病毒接种：将猪流行性腹泻病毒毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤制备得到的细胞中，并于35～37℃吸附30～60min后吸弃病毒液，再用细胞生长液于37℃、含5％CO2的环境下培养，至细胞病变率达75％以上时收获细胞液；
C)制苗毒液的繁殖：取步骤A)中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述步骤B)得到的细胞液，于37～38℃继续继续培养，当细胞病变达75％以上时收获毒液，于-15℃以下保存；
D)成品制备：将步骤C)得到的毒液进行无菌检验、病毒含量测定，采用0.1％福尔马林灭活病毒得疫苗抗原液，在每1000ml灭活检验合格的疫苗抗原液中加入0.5～2份免疫增强剂，混合均匀；按96:4的重量比加入灭菌后的吐温-80，搅拌使之溶解后，加入白油90～100份、硬脂酸铝1～3份、Span-804份，搅拌，高压灭菌，乳化，分装，即得。
进一步地，所述步骤D)中病毒含量测定方法为：将浓缩后灭活前的毒液毒用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-85个稀释度接种48孔铺满单层ST细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞；每孔0.2mL，5％CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，每0.1mL病毒含量107.0～8.0TCID50，可用于制苗。
进一步地，所述步骤D)中每ml疫苗抗原液中含病毒107.0～8.0TCID50。
进一步地，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖12～25g、新鲜美人蕉花提取液3～9g、吲哚美辛0.5～2g、莎梵婷0.5～1.5g、蔗糖22～40g和明胶3～8g的磷酸缓冲液。
进一步地，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖15～20g、新鲜美人蕉花提取液5～9g、吲哚美辛1～2g、莎梵婷1～1.5g、蔗糖25～40g和明胶4～6g的磷酸缓冲液。
进一步地，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖15g、新鲜美人蕉花提取液6g、吲哚美辛1.5g、莎梵婷1g、蔗糖35g和明胶5g的磷酸缓冲液。
进一步地，所述新鲜美人蕉花提取液由以下步骤制得：
取美人蕉花或花蕾，取其花瓣，磨碎，加入蒸馏水，置三角瓶中，密封，90～100℃恒温水浴20～35min，迅速冷却，常温离心5～10min，取上清液，即得。
进一步地，所述细胞生长液为含有5～10％胎牛血清的90％DMEN培养液。
本发明另一目的在于提供一种如上所述的方法制备得到的疫苗。
本发明提供的免疫增强剂，其含有裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液、吲哚美辛、莎梵婷、蔗糖和明胶。其中，裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液作为主要的免疫增强活性成分，联合吲哚美辛，三者组合使用具有协同增效的作用。这一点从本发明试验二可以看出，裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液和吲哚美辛的复配使用，与三者的单独使用或两两组合相比，能够显著提高小鼠体内抗体水平，且显著大于两者单独免疫后抗体水平总和，三者复配使用具有协同增效的作用。
裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液含有的生物碱成分在疫苗低温保存过程中极易析出，从而影响了疫苗的效力。为了克服生物碱在低温易析出导致疫苗效力不稳定的缺陷，发明人经过不懈的研究，终于发现一种特别适用于本发明体系的表面活性剂-莎梵婷。莎梵婷是一种新型的环脂肽类生物表面活性剂，分子式为C53H93N7O13，其能提高生物碱在低温的稳定性，提高疫苗的效力稳定性，而且与其他表面活性剂相比，莎梵婷不容易引起组织反应性，且其易于降解。
本发明具有以下优点：
本发明提供的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，能够显著提高免疫动物体内抗体水平，缩短免疫窗口期，显著延长免疫期，提高免疫动物体内肠道黏膜总分泌型抗体的水平，且该疫苗制备方法简单，安全性高。
附图说明
图1显示了各组小鼠免疫后第28天后肠道黏膜总SIgA抗体平均水平。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1、新鲜美人蕉花提取液的制备
取美人蕉花或花蕾，取其花瓣，磨碎，加入蒸馏水，置三角瓶中，密封，95℃恒温水浴30min，迅速冷却，常温离心10min，取上清液，即得。
本发明实施例2～4免疫增强剂配方及用量
实施例5、本发明猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备
A)ST细胞的扩增培养：取ST细胞用胰酶消化分散，加入细胞生长液在37℃、含5％CO2的环境下培养至细胞形成良好单层，再用无血清的DMEM培养液清洗细胞，用于接种猪流行性腹泻病毒；
B)病毒接种：将猪流行性腹泻病毒毒种按终体积50：500接种到步骤制备得到的细胞中，并于37℃吸附45min后吸弃病毒液，再用细胞生长液于37℃、含5％CO2的环境下培养，至细胞病变率达75％以上时收获细胞液；
C)制苗毒液的繁殖：取步骤A)中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述步骤B)得到的细胞液，于37℃继续继续培养，当细胞病变达75％以上时收获毒液，于-15℃以下保存；
D)成品制备：将步骤C)得到的毒液进行无菌检验、病毒含量测定，采用0.1％福尔马林灭活病毒得疫苗抗原液，在每1000ml灭活检验合格的疫苗抗原液中加入1.5份实施例2或3或4所述的免疫增强剂，混合均匀；按96:4的重量比加入灭菌后的吐温-80，搅拌使之溶解后，加入白油95份、硬脂酸铝2份、Span-804份，搅拌，高压灭菌，乳化，分装，即得到3组疫苗，分别标记为实施例2组、实施例3组、实施例4组。
试验一、成品检验
取实施例5制备得到的实施例2～4组疫苗，按照《中国兽药典》附录进行检测，检测结果如表1所示。
表1成品检测结果
试验二、性能测试
1.1试验样品
在实施例2的基础上，按如下表1设置不同免疫增强剂组合，分别得到8组疫苗。
表1含不同免疫增强剂组合
1.2试验方法
取90只健康SRC小鼠随机分为9组，每组各10只，将流行性腹泻疫苗A、B、C、D、E、F、G、H各免疫一组小鼠，免疫途径为皮下注射，免疫剂量为20μl，对照组注射同等剂量空白疫苗I。于免疫后第14天、21天、28天、60天、90天、150天、180天、210天以及240天对各组小鼠采血，无菌分离血清，采用流行性腹泻抗体检测试剂盒(ELISA方法)检测各组小鼠血清中PEDV抗体水平，检测结果大于0.6为抗体效价合格，检测数据如表2。
于免疫第28天，取上述每组小鼠各5只，脱颈椎处死后于超净工作台内无菌操作，打开小鼠腹腔，取8㎝小鼠孔空肠肠道，无菌刮取肠道黏膜并按一定比例加入PBS缓冲液，将肠道黏膜悬浮液反复冻融三次，近4℃条件下4200g/min离心30min后取上清液，用小鼠肠道总SIgAELISA检测试剂盒检测肠道黏膜总SIgA水平，检测数据如表3，条状图如图1所示。
表2各组小鼠免疫后不同时间内血清的平均抗体水平(OD630)
从表2可以看出，没有添加免疫增强剂的疫苗A免疫小鼠，在免疫后第60天，抗体水平合格，此后成下降趋势，且第90天检测，抗体水平已低于合格水平；采用含有本发明实施例2免疫增强剂的疫苗B免疫小鼠后第14天抗体即远高于抗体合格水平，且在第28天前抗体仍处于上升趋势，此后抗体水平缓慢下降，至免疫后第240天抗体水平仍远高于抗体合格水平；采用疫苗C、D免疫小鼠，分别在免疫后第60天和第90天，抗体水平达到合格水平，此后抗体水平开始下降，到免疫后第240天，小鼠体内抗体水平已远远低于抗体合格水平；疫苗E免疫小鼠后，小鼠体内抗体水平一直未达到合格水平；采用疫苗F、G、H免疫小鼠，小鼠体内抗体水平在免疫后第28天即达到抗体合格水平，但抗体水平明显低于疫苗B抗体水平，且免疫小鼠体内抗体水平在此后呈较急速的下降趋势，在免疫后第240天，抗体水平已远低于抗体合格水平。以上结果说明，裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液和吲哚美辛的复配使用，与三者的单独使用或两两组合相比，能够显著提高小鼠体内抗体水平，且显著大于两者单独免疫后抗体水平总和，说明三者复配使用具有协同增效的作用。同时，试验结果说明，本发明免疫增强剂的加入能够显著提高动物的免疫水平，缩短免疫窗口期，显著延长抗体持续期。
表3各组小鼠免疫后第28天后肠道黏膜总SIgA抗体平均水平(μg/mL)
从表3和图1可以看出，采用灭活疫苗B免疫的小鼠肠道内总SIgA抗体平均水平显著高于其他各组，且差异极显著。灭活疫苗C、D、E免疫的小鼠肠道内总SIgA抗体平均水平略高于对照组I，但幅度不大。这说明，裂褶菌多糖、新鲜美人蕉花提取液和吲哚美辛的复配使用，无论是与三者的单独使用或两两组合相比，能显著提高免疫后小鼠肠道内总SIgA抗体平均水平，且差异显著。

Claims (8)

1.一种用ST细胞生产猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)ST细胞的扩增培养：取ST细胞用胰酶消化分散，加入细胞生长液在37℃、含5％CO2的环境下培养至细胞形成良好单层，再用无血清的DMEM培养液清洗细胞，用于接种猪流行性腹泻病毒；
B)病毒接种：将猪流行性腹泻病毒毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤A)制备得到的细胞中，并于35～37℃吸附30～60min后吸弃病毒液，再用细胞生长液于37℃、含5％CO2的环境下培养，至细胞病变率达75％以上时收获细胞液；
C)制苗毒液的繁殖：取步骤A)中已形成良好单层的细胞系培养瓶，弃去细胞生长液，接种上述步骤B)得到的细胞液，于37～38℃继续继续培养，当细胞病变达75％以上时收获毒液，于-15℃以下保存；
D)成品制备：将步骤C)得到的毒液进行无菌检验、病毒含量测定，采用0.1％福尔马林灭活病毒得疫苗抗原液，在每1000ml灭活检验合格的疫苗抗原液中加入0.5～2份免疫增强剂，混合均匀；按96:4的重量比加入灭菌后的吐温-80，搅拌使之溶解后，加入白油90～100份、硬脂酸铝1～3份、Span-804份，搅拌，高压灭菌，乳化，分装，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤D)中每1ml疫苗抗原液中含病毒107.0～8.0TCID50。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖12～25g、新鲜美人蕉花提取液3～9g、吲哚美辛0.5～2g、莎梵婷0.5～1.5g、蔗糖22～40g和明胶3～8g的磷酸缓冲液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖15～20g、新鲜美人蕉花提取液5～9g、吲哚美辛1～2g、莎梵婷0.5～1.5g、蔗糖25～40g和明胶4～6g的磷酸缓冲液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫增强剂为每1000ml中含有裂褶菌多糖15g、新鲜美人蕉花提取液6g、吲哚美辛1.5g、莎梵婷1g、蔗糖35g和明胶5g的磷酸缓冲液。
6.如权利要求3～5任一所述的方法，其特征在于，所述新鲜美人蕉花提取液由以下步骤制得：
取美人蕉花或花蕾，取其花瓣，磨碎，加入蒸馏水，置三角瓶中，密封，90～100℃恒温水浴20～35min，迅速冷却，常温离心5～10min，取上清液，即得。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞生长液为含有5～10％胎牛血清的90％DMEN培养液。
8.如权利要求1～7任一所述的方法制备得到的疫苗。
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