ES2567564T3 - Vectores oncolíticos de poxvirus - Google Patents

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ES2567564T3 ES08852947.4T ES08852947T ES2567564T3 ES 2567564 T3 ES2567564 T3 ES 2567564T3 ES 08852947 T ES08852947 T ES 08852947T ES 2567564 T3 ES2567564 T3 ES 2567564T3
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Abstract

Un poxvirus oncolítico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis, que comprende un gen I4L y/o F4L defectuoso.

Description

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Vectores oncolfticos de poxvirus Campo tecnico
Los virus oncolfticos son una clase de agentes terapeuticos novedosos usados para el tratamiento de cancer que tienen la propiedad unica de autoperpetuacion dependiente de tumor (HERMISTON. A demand for next-generation oncolytic adenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol. 8, n.° 4, p. 322-30). Los virus oncolfticos son capaces de una replicacion selectiva en celulas malignas y, por tanto, de ofrecer niveles de potencia y especificidad que son potencialmente mucho mas altos que los tratamientos convencionales para el cancer (FISHER. Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol. 8, n.° 4, p. 301-13). El beneficio de uso de estos virus es que a medida que se replican, lisan sus celulas huesped. Las celulas cancerosas son huespedes ideales para muchos virus debido a que tienen la ruta de interferon antivfrico inactivada o tienen genes supresores tumorales mutados que permiten que la replicacion vfrica avance sin obstaculos (CHERNAJOVSKY, et al. Fighting cancer with oncolytic viruses. British medical Journal. 2006, vol. 332, n.° 7534, p. 170-2).
Algunos virus son capaces de forma natural de replicarse de forma selectiva en celulas tumorales pero los virus oncolfticos tambien se pueden obtener por la modificacion de los virus naturales. Para este proposito, Las estrategias principales usadas en la actualidad para modificar los virus incluyen: deleciones funcionales en genes vfricos esenciales; promotores especfficos de tumor o tejido usados para controlar la expresion de estos genes vfricos; y modificacion de tropismo para redirigir el adenovirus a la superficie de celulas cancerosas. En un futuro proximo, sera necesario optimizar los adenovirus oncolfticos para entender totalmente su potencial como herramientas antineoplasicas crfticas y, por tanto, mejorar el pronostico para pacientes con gliomas malignos (JIANG, et al. Oncolytic adenoviruses as antiglioma agents. Expert review of anticancer therapy. 2006, vol. 6, n.° 5, p. 697-708).
Por ejemplo, ONYX-015, un adenovirus modificado selectivamente para replicarse en y destruir celulas que albergan mutaciones de p53, esta en desarrollo por Onyx Pharmaceuticals para el tratamiento potencial de varios tumores solidos, incluyendo tumores de cabeza y cuello, gastrointestinales y pancreaticos. Es un adenovirus recombinante que lleva una mutacion de perdida de funcion en el locus E1B, del que su producto es una protefna de 55 kDa que se une a e inactiva la protefna supresora de tumor p53. Por tanto, se supone que el adenovirus ONYX-015 dejar intactas las celulas normales. Las mutaciones en el gen supresor de tumor p53 son el tipo mas comun de anomalfa genetica en el cancer, que se produce en mas de la mitad de todos los tipos de cancer principales. Por tanto, estas celulas son susceptibles para el virus, que se replicara facilmente y provocara la muerte celular. El ONYX-015 esta en ensayos en fase III no concluidos para el tratamiento de cancer de cabeza y cuello recurrente, ensayos en fase II para tumores colorrectales, de ovario, pancreas y boca, y ensayos en fase I para enfermedad digestiva, tumores de esofago e hfgado (COHEN, et al. oNyX-015. Onyx Pharmaceuticals. Current opinion in investigational drugs. 2001, vol. 2, n.°12, p. 1770-5).
Los virus oncolfticos naturales son virus competentes para la replicacion que tienen una capacidad innata para infectar y destruir de forma selectiva celulas tumorales. A pesar de que se usaron en los intentos originales para tratar el cancer con virus vivos hace cinco decadas, el interes en los virus oncolfticos naturales se ha quedado detras del soporte a los adenovirus y herpesvirus genomanipulados como tratamientos para el cancer. Sin embargo, recientemente se ha renovado el interes en la alta potencia y selectividad de estos agentes naturales (ROBERTS, et al. Naturally oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics . 2006, vol. 8, n.° 4, p. 314-21.),
Entre los virus oncolfticos naturales, los virus de la variolovacuna (un Poxviridae) poseen muchos de los atributos clave necesarios para una estructura vfrica ideal para su uso en viroterapia oncolftica. Estos incluyen un ciclo de vida corto, con rapida propagacion celula a celula, gran capacidad lftica, una gran capacidad de clonacion y biologfa molecular bien definida. Ademas, aunque pueden replicarse en celulas humanas, no se consideran un problema de salud natural y estan especialmente bien caracterizados habiendose suministrado a millones de individuos durante la campana para erradicar la viruela. Los primeros resultados clfnicos usando cepas de vacuna o bien cepas de variolovacuna modificadas geneticamente han demostrado efectos antitumorales (THORNE, et al. Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer. Current opinion in molecular therapeutics. 2005, vol. 7, n.° 4, p. 359-65).
En contraste, el poxvirus virus del mixoma es un candidato oncolftico novedoso que no tiene antecedentes de uso en seres humanos directamente, ya que tiene tropismo de la especie huesped distinto y absoluto para lagomorfos (conejos). Recientemente se ha demostrado que el virus del mixoma tambien puede infectar y destruir selectivamente celulas tumorales humanas, un tropismo unico que esta ligado a las rutas de senalizacion intracelular reguladas incorrectamente que se encuentran en la mayorfa de los canceres humanos. Dicha revision explica el conocimiento existente sobre el tropismo del virus del mixoma para celulas cancerosas humanas, asf como los datos preclfnicos que muestran su capacidad para infectar y eliminar tumores en modelos animales de cancer (STANFORD, et al. Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cancer. Expert opinion on biological therapy. 2007, vol. 7, n.° 9, p. 1415-25).
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La inyeccion de dosis altas de poxvirus necesaria para lograr un efecto antitumoral aumento los problemas de toxicidad. La mayona de los acontecimientos adversos son reacciones adversas, secundarias, que norma lmente estan ligadas a virus de la variolovacuna son de resolucion espontanea e incluyen fiebre, cefalea, fatigua, mialgia, escalofnos, reacciones cutaneas locales, erupciones inespedficas, eritema multiforme, linfadenopatfa y dolor en el sitio de vacunacion. Otras reacciones pueden requerir tratamientos adicionales (por ejemplo, VIG, un tratamiento de primera lmea y cidofovir, un tratamiento de segunda lmea). Las reacciones adversas que pueden requerir otra evaluacion o tratamiento incluyen inoculacion involuntaria, vacuna generalizada (GV), eccema vacunal (EV), vacuna progresiva (PV), enfermedad del sistema nervioso central posvacuna y vacuna fetal (CONO, et al. Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR. Recommendations and reports: Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 2003, vol. 52, n.° RR-4, p. 1-28).
Por tanto, existe la necesidad de poxvirus mas seguros con una actividad oncolftica tan buena como la de sus homologos naturales.
Tecnica anterior
El documento US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15/11/1994 describe un poxvirus recombinante modificado, mas en particular un virus de la variolovacuna que tiene funciones geneticas codificadas codificadas para virus no esenciales inactivadas de modo que el poxvirus recombinante tiene virulencia atenuada y seguridad potenciada. En particular, las funciones geneticas se inactivan por delecion de un marco de lectura abierto que codifica un factor de virulencia o por inactivacion de insercion de un marco de lectura abierto que codifica un factor de virulencia. Mas en particular, la presente patente describe un virus de la variolovacuna en el que el marco de lectura abierto de J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L - K1L y I4L se ha inactivado. Este virus (NYVAC) se pueden genomanipular como un vector para un acido nucleico exogeno y usar como una vacuna para inducir una respuesta inmunologica en un animal huesped. Sin embargo, el NYVAC no se puede replicar eficazmente en la mayona de las celulas de mairnferos y no se puede usar como un virus oncolftico (XIANGZHI, et al. Vaccinia virus K1L protein supports viral replication in human and rabbit cells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that are distinct from its binding site for ACAP2. Journal of virology. 2006, vol. 353, n.° 1, p. 220-233).
El documento WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US)) 19/02/2004 describe un virus de la variolovacuna alterado que comprende una o mas mutaciones en su genoma vftico. Las mutaciones descritas estan en una o mas de las siguientes clases de polipeptidos: 1) polipeptido modulador de interferon; 2) polipeptido de control del complemento; 3) polipeptido modulador de TNF o quimiocina; 4) inhibidor de la serina proteasa; 5) polipeptido modulador de IL- Ip; 6) polipeptidos de la forma del EEV no infeccioso; y, 7) polipeptido vmco que actuan para inhibir la liberacion del virus infeccioso de celulas (polipeptido anti-forma del virus infeccioso). Ademas, tambien se divulgan las mutaciones en A41L o C11R de virus de la variolovacuna.
Las regiones del genoma de la variolovacuna tales como A34R, A41L, A53R, B5R, B7R, B8R, B13R, B15R, B18R, B22R, B28R, B29R, CUR, E3L, K2L, N1L, vC12L y vCKBP se describen mas en particular en esta solicitud. Los procedimientos de la invencion implican el uso de cualquiera de los poxvirus analizados en el presente documento. Los inventores tambien divulgan procedimientos para tratar el cancer administrando a la celula cancerosa o al paciente con cancer una cantidad eficaz de este virus de la variolovacuna alterado.
Divulgacion de la invencion
Los inventores han descubierto sorprendentemente que los poxvirus que comprenden un gen I4L y/o F4L defectuoso tienen una mejora en el perfil de seguridad pero mantienen una actividad oncolftico equivalente (en comparacion con su homologo natural).
En el presente documento se divulga un poxvirus que comprende un gen I4L y/o F4L defectuoso con la condicion de que dicho poxvirus no sea NYVAC. La presente invencion se refiere a un poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis, que comprende un gen I4L y/o F4L defectuoso.
Tal como se usa a lo largo de toda la solicitud, los terminos "un" y "uno" se usa en el sentido de que signifiquen "al menos uno”, "al menos un primer”, "uno o mas" o "una pluralidad" de la componentes o etapas referenciados, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el termino "una celula" incluye una pluralidad de celulas, incluyendo mezclas de las mismas.
El termino "y/o" siempre que se usa en el presente documento incluye el significado de "y", "o" y "todos o cualquier otra combinacion de los elementos conectados por dicho termino".
El termino "aproximadamente" o "aprox." como se usa en el presente documento quiere decir dentro de un 20 %, preferentemente dentro de un 10 %, y mas preferentemente dentro de un 5 % de un valor o intervalo dado.
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Como se usa en el presente documento, los terminos "que comprende" y "comprender" pretenden querer decir que los productos, composiciones y procedimientos incluyen los componentes o etapas referenciados, pero sin excluir otros. "Que consiste esencialmente en" cuando se usa para definir productos, composiciones y procedimientos, significara que excluye otros componentes o etapas de cualquier significacion esencial. Por tanto, una composicion que consiste esencialmente en los componentes enumerados no excluirfa cantidades mfnimas de contaminantes y vehfculos farmaceuticamente aceptables. "Que consiste en" querra decir que excluye mas de cantidades mfnimas de elementos de otros componentes o etapas.
Como se usa en el presente documento, el termino "poxvirus que comprende un gen defectuoso" se refiere a un poxvirus que comprende una delecion, sustitucion o adicion en uno o mas acido nucleico del gen defectuoso, o cualquier combinacion de estas posibilidades en el que dichas modificaciones dan lugar a la incapacidad del virus para producir una protefna que tenga la actividad de la protefna producida por el gen no modificado. En un modo de realizacion preferente de la invencion, un poxvirus que comprende un gen defectuoso se refiere a un poxvirus en el que se ha eliminado la secuencia genica completa. La mutacion se puede preparar de varias formas conocidas por los expertos en la tecnica usando tecnicas recombinantes. Los procedimientos para modificar el genoma de un poxvirus estan disponibles en la tecnica. Por ejemplo, los procedimientos divulgados en MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes., Cancer res., 2001, n.° 61, p. 8751-57., KIM, et al. Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy for cancer with JX-594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF. Molecular Therapeutic. 2006, n.° 14, p. 361-70., documento WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US)) 19/02/2004 y documento US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15/11/1994 se pueden usar para producir el poxvirus de la invencion. Los procedimientos divulgados en el ejemplo de la presente solicitud son particularmente relevantes para producir un poxvirus de acuerdo con la invencion. Las secuencias del genoma de varios poxvirus estan disponibles en la tecnica, por ejemplo, los genomas del virus de la variolovacuna, virus de la viruela vacuna, virus Canarypox, virus Ectromelia, virus mixoma estan disponibles en Genbank (numero de acceso NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_001132, respectivamente)
Como se usa en el presente documento, el termino "poxvirus" se refiere a un virus que pertenece a la familia Poxviridae. De acuerdo con un modo de realizacion preferente, el poxvirus de acuerdo con la invencion pertenece a la subfamilia Chordopoxvirinae, mas preferentemente, al genero Ortopoxvirus y aun mas preferentemente, a la especie de virus de la variolovacuna.
Por ejemplo, se pueden usar las cepas transferidas del virus de la variolovacuna Dairen I, CI-J, L-IPV, LC16M8, LC16MO, Lister, LIVP, Tashkent, WR 65-16, Wyeth, Ankara, Copenhague, Tian Tan y WR. De acuerdo con un modo de realizacion particularmente preferente, el poxvirus de acuerdo con la invencion es un virus de la variolovacuna cepa Copenhagen.
El poxvirus variolovacuna contiene un genoma de ADN bicatenario grande (187 pares de kilobases) y es un miembro de la familia unica conocida de virus de ADN que se replica en el citoplasma de celulas infectadas. Debido a que la celula infectada debe suministrar grandes cantidades de precursores de ADN sitios de replicacion citoplasmicos, el virus codifica y expresa muchas actividades enzimaticas requeridas para el metabolismo y la sfntesis de ADN, incluyendo de ribonucleotido reductasa y desoxiuridina 5'-trifosfato nucleotidohidrolasa (dUTPasa). La ribonucleotido reductasa (EC 1.17.4.1) cataliza la reduccion de ribonucleotidos a desoxirribonucleotidos, una reaccion que representa la primera etapa diferenciada en la biosfntesis de ADN. La enzima vfrica es similar en su estructura de subunidades a la enzima de mamffero, que esta compuesta de dos subunidades heterologas, denominadas R1 y R2. Los genes que codifican las subunidades de ribonucleotido reductasa vfrica se han secuenciado y ubicado en posiciones en el genoma de la variolovacuna, separados por 35 kilobases (SLABAUGH, et al., Journal of virology. 1988, vol. 62, p. 519-27.; TENGELSEN, et al., Virology. 1988, n.° 164, p. 121-31.; SCHMITT, et al., Journal of virology. 1988, n.° 62, p. 1889-97). Los monomeros de la subunidad grande del virus de la variolovacuna (denominada R1, codificada por el gen I4L) son polipeptidos de 86 kDa, y contienen sitios de union para sustratos nucleotfdicos y efectores alostericos (SLABAUGH, et al., Journal of virology. 1984, n.° 52, p. 507-14.; SLABAUGH, et al., Journal of virology. 1984, n.° 52, p. 501-6). La subunidad pequena (denominada R2, codificada por el gen F4L) es un homodfmero que comprende dos polipeptidos de 37 kDa; cada polipeptido contiene un radical libre a base de protefna estabilizado con hierro que se requiere para la catalisis (HOWELL, et al., Journal of Biological Chemistry. 1992, n.° 267, p. 1705-11). Las secuencias para los genes I4L y F4L y sus ubicaciones en el genoma de varios poxvirus estan disponibles en bases de datos publicas, por ejemplo, por medio del numero de acceso DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 y NC.008291.
La nomenclatura genica usada en el presente documento es la de la cepa de la variolovacuna Copenhagen y tambien se usa para los genes homologos de otros Poxviridae a menos que se indique de otro modo. Sin embargo, la nomenclatura genica puede ser diferente de acuerdo con la cepa de viruela. Para mas informacion, la correspondencia entre Copenhagen y genes MVA se pueden encontrar en la tabla I de ANTOINE. Virology. 1998, n.° 244, p. 365-396.
De acuerdo con un modo de realizacion preferente, el poxvirus de la invencion comprende ademas un gen J2R defectuoso.
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El gen J2R codifica una timidina cinasa (TK) que forma parte de la via de rescate para la sfntesis de pirimidina desoxirribonudeotido. La reaccion catalizada por TK implica la transferencia de un resto Y-fosforilo de ATP a 2'desoxitimidina (dThd) para producir timidina 3',5'-monofosfato (dTMP). La TK del virus de la variolovacuna es de tipo 2. Las TK de tipo 2 tienen una cadena polipeptfdica mas pequena en comparacion con la del tipo 1, que es de ~25 kDa pero forma homotetrameros. Son sensibles a los retroinhibidores dTDP o dTTP, que se generan en el extremo de la via metabolica. Las TK de tipo 2 tienen una especificidad por sustrato mucho mas estrecha en comparacion con las TK de tipo 1 y solo fosforilan la 2'desoxiuridina (dU) y/o dThd (EL OMARI, et al. Structure of vaccinia virus thymidine kinase in complex with dTTP: insights for drug design. BMC structural biology. 2006, n. 6, p. 22).
Los poxvirus defectuosos en la region J2R y los procedimientos para obtenerlos estan disponibles en la tecnica. Por ejemplo, las ensenanzas de MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes, cancer research. 2001, vol. 61, n. 24, p. 8751-7., PUHLMANn, et al. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant. Cancer gene therapy. 2000, vol. 7, n.° 1, p. 66-73., GNANT, et al. Systemic administration of a recombinant vaccinia virus expressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with 5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongation of survival in mice. Cancer Research. 1999, vol. 59, n.° 14, p. 3396-403, se pueden usar para producir un poxvirus con la region J2R eliminada.
De acuerdo con un modo de realizacion preferente, el poxvirus de la invencion comprende ademas un gen F2L defectuoso.
La desoxiuridina 5'-trifosfato nucleotidohidrolasa (dUTPasa, EC 3.6.1.23) cataliza la hidrolisis de dUTP a dUMP y pirofosfato en presencia de iones de Mg(2+). La dUTPasa, en la retirada de dUTP de la reserva de dNTP y en la generacion de dUMP, esta implicada tanto en mantener la fidelidad de la replicacion de ADN como en proporcionar el precursor para la produccion de TMP por timidilato sintasa. La dUTPasa de la variolovacuna es una protefna de 15 kDa codificada por el gen F2L (MCGEOgH., Nucleic Acids Research. 1990, n.° 18, p. 4105-10.; BROYlEs., Virology. 1993, n.° 195, p. 863-5). La secuencia del gen F2L del virus de la variolovacuna esta disponible en genbank por medio del numero de acceso M25392, las secuencias y ubicaciones del gen F2L en varios genomas de poxvirus tambien estan disponibles en genbank, por ejemplo, por medio de numero de acceso NC_006998, DQ121394, NC_001611, AY689436, AY689437, NC_008291, DQ437594, DQ437593, AY313847, AY313848, NC_006966, NC_005309, NC_003391, NC_003389, NC_001132, NC_003310, NC_002188, M35027, AY243312, AF170726, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, X94355, Y16780, AY318871, U94848, AF198100 y M34368.
De acuerdo con un modo de realizacion preferente, el poxvirus de acuerdo con la invencion comprende ademas un acido nucleico de interes.
En un modo de realizacion preferente, el acido nucleico de interes contiene al menos una secuencia de interes que codifica un producto genico que es una molecula terapeutica (es decir, un gen terapeutico). Una "molecula terapeutica" es una que tiene una actividad farmacologica o protectora cuando se administra apropiadamente a un paciente, en especial un paciente que padece una enfermedad o afeccion de enfermedad o que debe protegerse contra esta enfermedad o afeccion. Una actividad farmacologica o protectora de este tipo es una que se espera que este relacionada con un efecto beneficioso en el curso o un sfntoma de dicha enfermedad o dicha afeccion. Cuando el experto selecciona en el transcurso de la presente invencion un gen que codifica una molecula terapeutica, en general, relaciona su eleccion con resultados obtenidos previamente y puede esperar de forma razonable, sin experimentacion excesiva aparte de la practica de la invencion como se reivindica, obtener dicha propiedad farmacologica. De acuerdo con la invencion, la secuencia de interes puede ser homologa o heterologa a las celulas diana en las que se introduce. De forma ventajosa, dicha secuencia de interes codifica todo o parte de un polipeptido, en especial un polipeptido terapeutico o profilactico que da una propiedad terapeutica o profilactica. Se entiende que un polipeptido es cualquier producto traduccional de un polinucleotido independientemente del tamano, y de si esta glucosilado o no, e incluye peptidos y protefnas. Los polipeptidos terapeuticos incluyen como ejemplo primario los polipeptidos que pueden compensar las protefnas defectuosas o deficientes en un organismo animal o humano, o los que actuan a traves de efectos toxicos para limitar o retirar celulas daninas del organismo. Tambien pueden ser polipeptidos que confieren inmunidad que actuan como un antfgeno endogeno para provocar una respuesta humoral o celular, o ambas.
Los ejemplos de polipeptidos codificados por un gen terapeutico incluyen genes que codifican una citocina (interferon alfa, beta o gamma, interleucina, en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12, un factor de necrosis tumoral (TNF), un factor estimulador de colonias GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), un polipeptido inmunoestimulador (B7.1, B7.2 y similares), un factor de coagulacion (FVIII, FIX...), un factor de crecimiento (factor de crecimiento transformante TGF, factor de crecimiento fibroblastico FGF y similares), una enzima (ureasa, renina, trombina, metaloproteinasa, oxido nftrico sintasa NOS, SOD, catalasa...), un inhibidor enzimatico (alfa1 -antitripsina, antitrombina III, inhibidor de proteasa vfrica, inhibidor del activador de plasminogeno PAI-1), la protefna CFTR (reguladora de conductancia transmembranaria de fibrosis cfstica), insulina, distrofina, un antfgeno de MHC de clase I o II, un polipeptido que puede modular/regular la expresion de genes celulares, un polipeptido que puede inhibir una infeccion bacteriana, parasitaria o vfrica o su desarrollo (polipeptidos antigenicos, epftopos antigenicos, variantes transdominantes que inhiben la accion de una protefna natural por competencia...), un inductor o inhibidor de la apoptosis (Bax, Bcl2, BclX...), un agente citostatico (p21, p 16, Rb...), una apolipoprotefna (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), un inhibidor de la angiogenesis (angiostatina, endostatina...), un polipeptido angiogenico (familia de factores de crecimiento endotelial vascular VEGF, familia FGF,
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familia CCN incluyendo CTGF, Cyr61 y Nov), un eliminador de radicales oxfgeno, un polipeptido que tiene un efecto antitumoral, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador (beta-galactosidasa, luciferasa...) o cualquier otro gen de interes que se reconoce en la tecnica que es util para el tratamiento o prevencion de una afeccion clfnica.
Los genes antitumoral adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican genes supresores de tumor (por ejemplo Rb, p53, DCC, NF-1, tumor d eWilm, NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73 asf como sus respectivos mutantes), productos genicos suicidas, anticuerpos, polipeptidos que inhiben la division celular o senales de transduccion.
De acuerdo con un modo de realizacion particularmente preferente, el poxvirus de la invencion comprende ademas un gen suicida.
Gen suicida se refiere a un gen que codifica una protefna que puede convertir un precursor de un farmaco en un compuesto citotoxico.
Los genes suicidas comprenden, pero no se limitan a, genes que codifican una protefna que tiene una actividad citosina desaminasa, una actividad timidina cinasa, una actividad uracil fosforibosil transferasa, una actividad purina nucleosido fosforilasa y/o una actividad timidilato cinasa.
Los ejemplos de genes suicidas y precursores correspondientes de un farmaco que comprenden un resto de nucleobase se divulgan en la siguiente tabla:
Tabla 1
Gen suicida
prefarmaco
Timidina cinasa
Ganciclovir; Ganciclovir ester del acido elafdico; penciclovir; Acyclovir; Valacyclovir; (E)-5-(2-bromovinil)-2'-desoxiuridina; zidovudina; 2'-Exo-metanocarbatimidina
Citosina desaminasa
5-Fluorocitosina
Purina nucleosido fosforilasa
6-Metilpurina desoxirribosido;
Fludarabina
Uracil fosforibosil transferasa
5-Fluorocitosina;
5-Fluorouracilo
timidilato cinasa.
Azidotimidina
De acuerdo con un modo de realizacion preferente de la invencion, el gen suicida codifica una protefna que tiene al menos una actividad de CDasa. La CDasa esta implicada en la via metabolica de la pirimidina por la que la citosina exogena se transforma en uracilo por medio de una desaminacion hidrolftica. Aunque se han demostrado actividades de CDasa en procariotas y eucariotas inferiores (JUND, et al., Journal of Bacteriology. 1970, n.° 102, p. 607-15.; BECK, et al., Journal of Bacteriology. 1972, n.° 110, p. 219-28.; HOEPRICH, et al., Journal of Infectious Diseases. 1974, n.° 130, p. 112-18.; ESDERS, et al., J. Biol. Chem, 1985, no.260, p.3915-22.), no estan presenten en mamfferos (KOECHLIN, et al., Biochemical pharmacology. 1966, n.° 15, p. 435-46.; POLAK, et al., Chemotherapy. 1976, n.° 22, p. 137-53).
La CDasa tambien desamina un analogo de citosina, es decir, 5-fluorocitosina (5-FC), formando asf 5-fluorouracilo (5-FU), que es un compuesto que es altamente citotoxico cuando se convierte en 5-fluoro-UMP (5-FUMP). Las celulas que carecen de actividad de CDasa, debido a una mutacion que inactiva el gen que codifica la enzima o bien debido a que son defectuosos de forma natural de esta enzima, como lo son las celulas de mamfferos, son resistentes a 5-FC (JUND, et al., Journal of Bacteriology. 1970, n.° 102, p. 607-15.; KILLSTRUP, et al., Journal of Bacteriology. 1989, n.° 171, p. 2124-2127). En contraste, las celulas de mamffero en las que se transfirieron las secuencias que codifican la actividad de CDasa se volvieron sensibles a 5-FC (HUBER, et al., Cancer Research. 1993, n.° 53, p. 4619-4626.; MULLEN, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, n.° 89, p. 33-37.; documento WO 93/01281 (US HEALTH)). Ademas, las celulas no transformadas vecinas tambien se vuelven sensibles a 5-FC (HUBER, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, n.° 91, p. 8302-6). Este fenomeno, que se denomina un efecto de vecindad, se debe a las celulas que expresan la actividad la CDasa que segrega 5-FU, que a continuacion intoxica a las celulas vecinas por difusion sencilla a traves
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de la membrana plasmatica. Esta propiedad de 5-FU en la difusion de forma pasiva representa una ventaja en comparacion con el sistema de referencia tk/GCV, donde el efecto de vecindad requiere que haya contacto con las celulas que expresan tk (MESNIL, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996, n. 93, p. 1831-35). Todas las ventajas que la CDasa ofrece dentro del contexto de tratamiento genico, en particular de tratamiento genico antineoplasico, por lo tanto, se pueden entender facilmente.
Los genes FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (S. Cerevisiae), FCA1 de Candida albicans y codA de E. Coli, que codifican respectivamente la CDasa de estos dos organismos, son conocidos y sus secuencias se han publicado (SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6 respectivamente).
A este respecto, de acuerdo con un modo de realizacion mas preferente de la invencion, el gen que codifica una protefna que tiene una actividad de CDasa es FCY1, FCA1 o CodA o un analogo del mismo. Analogos de estos genes se refiere a un gen que tiene una secuencia de acido nucleico que tiene al menos un grado de identidad mayor de un 70 %, de forma ventajosa mayor de un 80 %, preferentemente mayor de un 90 %, y lo mas preferentemente mayor de un 95 % con la secuencia de acido nucleico del gen original.
La patente WO 2005/007857 divulga un gen que codifica una protefna que tiene una mejora en la actividad de CDasa. Este polipeptido se derivo de una CDasa natural por la adicion de una secuencia de aminoacidos. De acuerdo con otro modo de realizacion preferente de la invencion, la protefna que tiene una actividad de CDasa es un polipeptido divulgado en el documento WO 2005/007857 y mas preferentemente, el polipeptido FCU1-8 representado en el identificador de secuencia SEQ ID N°:2 y analogos del mismo.
En procariotas y eucariotas inferiores, se transforma uracilo en UMP por la accion de la uracil fosforibosil transferasa (UPRTasa). Esta enzima convierte 5-FU en 5-FUMP. De acuerdo con otro modo de realizacion preferente de la invencion, el gen suicida codifica una protefna que tiene al menos una actividad de UPRTasa.
La UPRTasa en cuestion puede ser de cualquier origen, en particular de origen procariota, fungico o de levadura. A modo de ilustracion, las secuencias de acidos nucleicos que codifican las UPRTases de E. Coli (ANDERSEN, et al. Characterization of the upp gene encoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12. European Journal of Biochemistry. 1992, n.° 204, p. 51-56.), de Lactococcus /ac//s (MARTINUSSEN, et al. Cloning and characterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology. 1994, vol. 176, n.° 21, p. 6457-63.), de Mycobacterium bovis (KIM, et al. Complete sequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Mycobacterium bovis BCG. Biochemistry and molecular biology international. 1997, vol. 41, n.° 6, p. 1117-24.) y de Bacillus subtilis (MARTINUSSEN, et al. Two genes encoding uracil phosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 1995, vol. 177, n.° 1, p. 271-4.) se pueden usar en el contexto de la invencion. Sin embargo, lo mas particularmente preferente es el uso de una UPRTasa de levadura y en particular que se codifique por el gen FUR1 de S. Cerevisiae con una secuencia divulgada en KERN, et al. The FUR1 gene of Saccharomyces cerevisiae. cloning, structure and expression of wild-type and mutant alleles. (Gene. 1990, vol. 88, n. 2, p. 149-57.) que se introduce aquf a modo de referencia. Como gufa, las secuencias de los genes y las de las UPRTasas correspondientes se pueden encontrar en la literatura y en los bancos de datos especialistas (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medline y similares).
La solicitud EP 0998568 A describe un gen FUR1 que carece de 105 nucleotidos en 5' de la parte codificante que permite la sfntesis de una UPRTasa a partir de la que se han eliminado los primeros 35 residuos en la posicion N terminal y que comienza con la metionina en la posicion 36 en la protefna natural. El producto de expresion del gen mutante, designado FUR1A105, puede complementar un mutante fur1 de S. Cerevisiae. Ademas, el mutante truncado presenta una mayor actividad de UPRTasa que la de la enzima natural. Por tanto, de acuerdo con un modo de realizacion particularmente ventajoso de la invencion, el gen suicida codifica un mutante por delecion de una UPRTasa natural. La delecion se situa preferentemente en la region N terminal de la UPRTasa original. Puede ser completa (que afecta a todos los residuos de dicha region N terminal) o parcial (que afecta a uno o mas residuos continuos o discontinuos en la estructura primaria). En general, un polipeptido consiste en las partes N terminal, central y C terminales, que representa cada una aproximadamente un tercio de la molecula. Por ejemplo, puesto que la UPRTasa de S. Cerevisiae tiene 251 aminoacidos, su parte N terminal consiste en los primeros 83 residuos comenzando con la denominada metionina iniciadora situada en la primera posicion de la forma natural. Al igual que para la UPRTasa de E. Coli, su parte N terminal cubre las posiciones 1 a 69.
Una protefna preferente que tiene una actividad de UPRTasa comprende una secuencia de aminoacidos sustancialmente como se representa en el identificador de secuencia SEQ ID N.°: 1 del documento EP 0998568 A, comenzando con el residuo Met en la posicion 1 y terminando con el residuo Val en la posicion 216. El termino "sustancialmente" se refiere a un grado de identidad con dicha secuencia SEQ ID N.°: 1 del documento EP 0998568 A mayor de un 70 %, de forma ventajosa mayor de un 80 %, preferentemente mayor de un 90 %, y lo mas preferentemente mayor de un 95 %. Mas preferentemente, todavfa, comprende la secuencia de aminoacidos representada en el identificador de secuencia SEQ ID N.°: 1 del documento EP 0998568 A. Como se menciona anteriormente, puede comprender mutaciones adicionales. Se pueden mencionar en particular, la sustitucion del residuo serina en la posicion 2 (posicion 37 en la UPRTasa natural) por un residuo alanina.
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De acuerdo con otro modo de realizacion preferente de la invencion, el gen suicida codifica una protefna que tiene al menos una actividad de CDasa y de UPRTasa. Las solicitudes de patente WO 96/16183 y EP 0998568 A describen el uso de una protefna de fusion que codifica una enzima con dos dominios que tiene las actividades de la CDasa y UPRTasa y demuestran que la transferencia de un gen hfbrido codA::uppox FCY1::FUR1 o FCY1::FUR1A105 (es decir, FCU1) transportado por un plasmido de expresion incrementa la sensibilidad de las celulas transfectadas B16 a 5-FC. De acuerdo con un modo de realizacion mas preferente de la invencion, el gen suicida codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos sustancialmente como se representa en el identificador de secuencia SEQ ID N°:3 (coda::upp), SEQ ID °:1 (FCU1) o FCY1::FUR1. El termino "sustancialmente" se refiere a un grado de identidad con dicha secuencia mayor de un 70 %, de forma ventajosa mayor de un 80 %, preferentemente mayor de un 90 %, y lo mas preferentemente mayor de un 95 %. Mas preferentemente, todavfa, comprende la secuencia de aminoacidos como se representa en el identificador de secuencia SEQ ID N°:3 (coda::upp), SEQ ID N°:1 (FCU1) o FCY1::FUR1. Como se menciona anteriormente, puede comprender mutaciones adicionales.
Las secuencias de acidos nucleicos se pueden obtener facilmente por clonacion, por PCR o por sfntesis qufmica de acuerdo con las tecnicas convencionales en uso. Pueden ser genes naturales o genes derivados de este ultimo por mutacion, delecion, sustitucion y/o adicion de uno o mas nucleotidos. Ademas, sus secuencias se describen ampliamente en la literatura que se puede consultar por expertos en la tecnica.
Los expertos en la tecnica son capaces de clonar las secuencias de CDasa o UPRTasa a partir de los datos publicados y de llevar a cabo posibles mutaciones, de someter a prueba la actividad enzimatica de las formas mutantes en un sistema no celular o celular de acuerdo con la tecnologfa de la tecnica anterior o basandose en el protocolo indicado en la solicitud EP 0998568 A, y de fusionar, en particular en fase, los polipeptidos con actividad de CDasa y UPRTasa, y, en consecuencia, todos o parte de los genes correspondientes. De acuerdo con un modo de realizacion mas preferente, el poxvirus de la invencion comprende ademas una secuencia de acidos nucleicos que comprende un gen que codifica un permeasa.
Permeasa se refiere a una protefna transmembranaria implicada en la transferencia de un farmaco que comprende un resto de nucleobase, o un precursor del mismo a traves de la membrana celular.
La permeasa comprende pero se limita a purina permeasa, citosina permeasa y transportadores de nucleosido.
De acuerdo con un modo de realizacion preferente de la invencion, la permeasa es una purina o una citosina permeasa de S. Cerevisiae. Los transportadores de nucleobases de S. Cerevisiae consisten en la purina-citosina permeasa, conocida como FCY2, y la uracil permeasa, conocida como FUR4. LA purina-citosina permeasa, FCY2 media en el cotransporte unidireccional de protones y adenina, guanina, hipoxantina y citosina a traves de la membrana plasmatica de levaduras (Grenson 1969, Jund y Lacroute 1970, Polak y Grenson 1973, Chevallier et al. 1975, Hopkins et al. 1988). La protefna FCY2 tambien media en el transporte de 5-fluorocitosina, un analogo de citosina (Grenson 1969, Jund y Lacroute 1970). El gen FCY2 codifica una protefna de 533 aminoacidos (58 kDa) que inicialmente se predice que tiene 10-12 dominios que abarcan la transmembrana (Weber et al. 1990), con nueve ahora favorecidos (Ferreira et al. 1999). FCY2 presenta afinidades similares para las nucleobases de purina y citosina (Brethes et al. 1992). La captacion de uracilo en S. Cerevisiae esta mediada por la uracil permeasa, FUR4 (Jund y Lacroute 1970, Jund et al. 1977). FUR4 es un cotransportador unidireccional de uracilo-proton (Hopkins et al. 1988) que se predice que es una protefna de 633 aminoacidos (71,7 kDa) con 10 dominios transmembranarios y colas N y C terminales hidrofilas citoplasmicas (Jund et al. 1988, Gamier et al. 1996). La protefna FUR4 tambien puede mediar en el transporte de 5-fluorouracilo, un analogo de uracilo (Jund y Lacroute 1970).
Las secuencias de aminoacidos de FCY2 y Fur4 estan disponibles notablemente en la base de datos swissprot (numero de acceso P17064 y P05316, respectivamente). Preferentemente, la permeasa tiene una secuencia de aminoacidos elegida del grupo que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 como se divulga en la solicitud de patente WO 2006/048768.
A este respecto, de acuerdo con un modo de realizacion preferente de la invencion, la permeasa se elige del grupo que comprende FCY2 y Fur4 y analogos de las mismas. Analogos de Fur4 y FCY2 se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un grado de identidad de secuencia mayor de un 70 %, de forma ventajosa mayor de un 80 %, preferentemente mayor de un 90 %, y lo mas preferentemente mayor de un 95 % con la secuencia de aminoacidos de la protefna original como se describe aquf anteriormente y que conserva la capacidad de transportar un farmaco que comprende una resto de nucleobase a traves de la membrana celular.
El experto en la tecnica puede elegir la permeasa que se asociara con el farmaco o el precursor del farmaco que comprende un resto de nucleobase. Por ejemplo, FCY2 y Fur4 se asocian preferentemente con 5-fluorocitosina (5-FC).
De acuerdo con un modo de realizacion mas preferente, el poxvirus de la invencion puede comprender ademas los elementos necesarios para la expresion del acido nucleico de interes.
De acuerdo con un modo de realizacion mas preferente, el poxvirus de la invencion puede comprender ademas los elementos necesarios para la expresion de la secuencia de acidos nucleicos que comprende un gen que codifica una permeasa. Estos elementos necesarios para la expresion del acido nucleico de interes y/o la secuencia de acidos
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nucleicos que comprende un gen que codifica un permeasa comprendieron los elementos necesarios para la transcripcion de dicho ADN en ARNm y, en caso necesario, para la traduccion de ARNm en el polipeptido. Los promotores transcripcionales adecuados para su uso en diversos sistemas de vertebrados se describen ampliamente en la literatura. Por ejemplo, los promotores adecuados incluyen promotores vfricos como RSV, MPSV, SV40, CMV o 7,5k, promotor de variolovacuna, promotores inducibles, etc. Los promotores preferentes se afslan de los poxvirus, por ejemplo 7,5K, H5R, TK, p28, p11 o K1L de virus de la variolovacuna. De forma alternativa, se puede usar un promotor sintetico tal como los descritos en CHAKRABARTI., Biotechniques. 1997, n.° 23, p. 1094-97., HAMMOND, et al., Journal of Virological Methods. 1997, n.° 66, p. 135-38, Y KUMAR., Virology. 1990, n.° 179, p. 151-8, asf como promotores quimericos entre promotores de poxvirus tempranos y tardfos.
La secuencia de acido nucleico de interes y la secuencia de acido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa puede incluir ademas elementos funcionales adicionales, tales como secuencias de intrones, secuencias dirigidas, secuencias de transporte, senal de secrecion, senal de localizacion nuclear, IRES, secuencias de terminacion de la transcripcion poli A, secuencias lfder tripartitas, secuencias implicadas en replicacion o integracion. Se ha informado de dichas secuencias en la literatura y se pueden obtener facilmente por los expertos en la tecnica.
Tambien se divulga un procedimiento para preparar un poxvirus de acuerdo con la invencion, procedimiento en el que:
(i) se introduce un poxvirus de acuerdo con la invencion en una celula,
(li) se cultiva dicha celula bajo condiciones que son apropiadas para permitir que se produzca dicho poxvirus, y (iii) se recupera dicho poxvirus del cultivo celular.
Aunque, por supuesto, se puede recuperar el poxvirus del sobrenadante de cultivo, tambien se puede recuperar de las celulas. Uno de los procedimientos empleados comunmente consiste en lisar las celulas por medio de ciclos de congelacion/descongelacion consecutivos para recoger los viriones en el sobrenadante de lisis. A continuacion, los viriones se pueden amplificar y purificar usando las tecnicas de la tecnica (procedimiento cromatografico, procedimiento de ultracentrifugacion, en particular a traves de un gradiente de cloruro de cesio, etc).
La presente invencion tambien se refiere a una composicion que comprende un poxvirus de acuerdo con la invencion en combinacion con un excipiente farmaceuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis.
Una composicion de acuerdo con la invencion esta destinada mas especfficamente al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades por medio de tratamiento genico y se dirige mas especfficamente a enfermedades proliferativas (canceres, tumores, reestenosis, etc.) o se dirige a enfermedades asociadas con un incremento en la actividad de los osteoclastos (por ejemplo artritis reumatoide, osteoporosis).
Una composicion de acuerdo con la invencion se puede preparar de forma convencional con vistas a administrarla por via local, por via parenteral o por via digestiva. En particular, una cantidad terapeuticamente eficaz del vector recombinante o poxvirus de la invencion se combina con un excipiente farmaceuticamente aceptable. Es posible prever un gran numero de vfas de administracion. Los ejemplos que se pueden mencionar son las vfas intragastrica, subcutanea, intracardfaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar e intratraqueal. En el caso de estos tres ultimos modos de realizacion, es ventajoso que la administracion tenga lugar por medio de un aerosol o por medio de instilacion. La administracion puede tener lugar como una unica dosis o como una dosis que se repite en uno o mas ocasiones despues de un intervalo de tiempo particular. La via de administracion y dosificacion apropiadas varfa dependiendo de una variedad de parametros, por ejemplo, el individuo, la enfermedad que se va a tratar o el/los gen(es) de interes que se van a transferir. Las preparaciones basadas en partfculas vfricas de acuerdo con la invencion se pueden formular en forma de dosis de entre 104 y 1014 pfu (unidades formadoras de placas), de forma ventajosa 105 y 1013 pfu, preferentemente 106 y 1012 pfu, mas preferentemente 106 y 107.
La composicion tambien puede incluir un diluyente, un coadyuvante o un excipiente que sea aceptable desde el punto de vista farmaceutico, asf como agentes solubilizantes, estabilizantes y conservantes. En el caso de una administracion inyectable, se da preferencia a una formulacion en una solucion acuosa, no acuosa o isotonica. Se puede presentar como una unica dosis o como una multidosis, en forma lfquida o seca (polvo, liofilizado, etc.) que se puede reconstituir en el momento de uso usando un diluyente apropiado.
Tambien se divulga el uso de un poxvirus o una composicion de acuerdo con la invencion para preparar un medicamento que esta destinado a tratar el cuerpo humano o animal por tratamiento genico. El medicamento se puede administrar directamente in vivo (por ejemplo, por inyeccion intravenosa, en un tumor accesible, en los pulmones por medio de un aerosol, en el sistema vascular usando un cateter apropiado, etc). Un uso preferente consiste en tratar o evitar canceres, tumores y enfermedades que resultan de una proliferacion celular no deseada. Las aplicaciones concebibles que se pueden mencionar son canceres de la mama, del utero (en particular los inducidos por papilomavirus), de la prostata, del pulmon, de la vejiga, del hfgado, del colon, del pancreas, del estomago, del esofago, de la laringe, del sistema nervioso central (por ejemplo, glioblastoma) y de la sangre (linfomas, leucemia, etc). Otro uso preferente consiste en tratar o evitar la artritis reumatoide, osteoporosis y otras enfermedades asociadas con un incremento en la actividad de los osteoclastos. Tambien se puede usar en el contexto de cardiovasculopatfas, por
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ejemplo, para inhibir o retardar la proliferacion de las celulas musculares lisas de la pared de los vasos sangufneos (reestenosis). Finalmente, en el caso de enfermedades infecciosas, se puede concebir que el medicamento se aplique a sida.
Cuando el poxvirus, composicion o procedimiento de la invencion se usa para el tratamiento de cancer, la via de administracion preferente es la via sistemica puesto que el poxvirus de acuerdo con la invencion se puede dirigir especfficamente a las celulas tumorales.
La invencion tambien se extiende a un procedimiento para tratar enfermedades caracterizado por que un poxvirus, una composicion de acuerdo con la invencion se administra a un organismo o celula huesped que necesita dicho tratamiento.
De acuerdo con un modo de realizacion ventajoso, el uso terapeutico o el procedimiento de tratamiento tambien comprende una etapa adicional en la que las cantidades farmaceuticamente aceptables de un profarmaco, de forma ventajosa un analogo de citosina, en particular 5-FC, se administran al organismo o celula huesped. A modo de ilustracion, es posible el uso de una dosis de desde 50 a 500 mg/kg/dfa, siendo preferente una dosis de 200 mg/kg/dfa o de 100 mg/kg/dfa. Dentro del contexto de la presente invencion, el profarmaco se administra de acuerdo con la practica estandar (por ejemplo, por la boca, de forma sistematica).
Preferentemente, teniendo lugar la administracion posterior a la administracion del agente terapeutico de acuerdo con la invencion, preferentemente al menos 3 dfas, mas preferentemente al menos 4 dfas e incluso mas preferentemente al menos 5 dfas despues de la administracion del agente terapeutico. De acuerdo con un modo de realizacion incluso mas preferente de la invencion, la administracion del profarmaco tiene lugar 7 dfas despues de la administracion del agente terapeutico. Es preferente la via oral. Es posible administrar una unica dosis de profarmaco o dosis que se repiten durante un tiempo que sea suficientemente largo como para permitir que se produzca el metabolito toxico dentro del organismo o celula huesped.
Ademas, la composicion o procedimiento de acuerdo con la invencion se puede combinar con una o mas sustancias que potencian el efecto citotoxico de la 5-FU. En particular, se puede hacer mencion a farmacos que inhiben las enzimas de la via para la biosfntesis de novo de la pirimidinas (por ejemplo, los mencionados a continuacion), farmacos tales como el acido folfnico (Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692), que, en presencia del producto del metabolismo de 5-FU (5-FdUMP), incrementa la inhibicion de la timidilato sintasa, dando como resultado una disminucion en la reserva de dTMP, lo que se requiere para la replicacion, y finalmente farmacos tales como metotrexato (Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137) que, al inhibir la dihidrofolato reductasa e incrementar la reserva de PRPP (fosforribosilpirofosfato) provoca un incremento en la incorporacion de 5-FU en el ARN celular.
De acuerdo con la presente invencion, los farmacos que inhiben las enzimas de la via para la de novo biosfntesis de novo de las pirimidinas se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en PALA (N-(fosfonoacetil)-L-aspartato; Moore et al., 1982, Biochem. Pharmacol. 31, 3317-3321), Leflunomida, A771726 (metabolito activo de Leflunomida; Davis et al., 1996, Biochem. 35, 1270-1273) y Brequinar (Chen et al., 1992, Cancer Res. 52, 3251-3257).
La composicion o procedimiento de acuerdo con la invencion se puede combinar con una o mas sustancias eficaces en el tratamiento antineoplasico. Entre las sustancias farmaceuticas eficaces en el tratamiento antineoplasico que se pueden usar en asociacion o en combinacion con las composiciones de acuerdo con la invencion, se pueden mencionar agentes alquilantes tales como, por ejemplo, mitomicina C, ciclofosfamida, busulfano, ifosfamida, isosfamida, melfalano, hexametilmelamina, tiotepa, clorambucilo o dacarbazina; antimetabolitos tales como, por ejemplo, gemcitabina, capecitabina, 5-fluorouracilo, citarabina, 2-fluorodeoxi citidina, metotrexato, idatrexato, tomudex o trimetrexato; inhibidores de la topoisomerasa II tales como, por ejemplo, doxorubicina, epirubicina, etoposido, teniposido o mitoxantrona; inhibidores de la topoisomerasa I tales como, por ejemplo, irinotecan (CPT-11), 7-etil-10-hidroxi-camptotecina (SN-38) o topotecan; farmacos antimitoticos tales como, por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina o vinorelbina; y derivados de platino tales como, por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino, espiroplatino o carboplatino.
Las composiciones o procedimientos de acuerdo con la invencion tambien se pueden usar en combinacion con radioterapia.
Las composiciones o procedimientos de acuerdo con la invencion tambien se pueden usar en combinacion con uno o mas de otros agentes, incluyendo pero sin limitarse a agentes inmunomoduladores tales como, por ejemplo interferon alfa, beta o gamma, interleucina (en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12) o factor de necrosis tumoral; agentes que afectan a la regulacion de los receptores de la superficie celular talescomo, por ejemplo inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidermico (en particular cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, gefitinib, erlotinib o lapatinib) o inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (en particular trastuzumab); y agentes que afectan a la angiogenesis tales como, por ejemplo inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (en particular, bevacizumab o ranibizumab).
Breve descripcion de las figuras en los dibujos
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Figura 1. Sensibilidades in vitro a 5-FC de celulas tumorales colorrectales humanas infectadas con virus de la variolovacuna (LoVo). Se expusieron celulas LoVo, infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados (simulado (•) VVTK-/FCU1 (■) o VVTK-I4L-/FCU1 (A)) a varias concentraciones de 5-FC. Se midio la supervivencia celular 5 dfas posinfeccion. Se expresaron los resultados en porcentaje de viabilidad celular en presencia o no de farmacos. Se representan los valores en media ± DE de tres determinaciones individuales sin la mortalidad celular debida a la replicacion de los virus.
Figura 2. Sensibilidades in vitro a 5-FC de celulas tumorales colorrectales humanas infectadas con virus de la variolovacuna (LoVo). Se expusieron celulas LoVo, infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados (simulado (•) VVTK-/FCU1 (■) o VVTK-F4L-/FCU1 (A)) a varias concentraciones de 5-FC. Se midio la supervivencia celular 5 dfas posinfeccion. Se expresaron los resultados en porcentaje de viabilidad celular en presencia o no de farmacos. Se representan los valores en media ± DE de tres determinaciones individuales sin la mortalidad celular debida a la replicacion de los virus.
Figura 3. Eficacia de la replicacion in vitro de VVTK-/FCU1 y VVTK-I4L-/FCU1 en LoVo infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados el dfa 5 posinfeccion. Se representan los valores en media ± DE de tres determinaciones individuales.
Figura 4. Eficacia de la replicacion in vitro de VVTK-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 en LoVo infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados el dfa 5 posinfeccion. Se representan los valores en media ± DE de tres determinaciones individuales.
Figura 5. Media del volumen de tumor ± EEM de LoVo s.c. en ratones atfmicos Swiss despues de una inyeccion i.v. de virus. 7 dfas despues de la inoculacion con tumor (tumor palpable), se trataron los ratones por 107 pfu de tampon + solucion salina (0), tampon + 5-FC (♦), VVTK-I4L-/FCU1 + solucion salina (A) o VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (▲). Se trataron los animales con solucion salina o 5-FC a 100 mg/kg/j dos veces al dfa por sonda oral, 7 dfas despues de la inyeccion del virus durante 3 semanas. Se midio el volumen de tumor dos veces a la semana.
Figura 6. Media del volumen de tumor ± EEM de LoVo s.c. en ratones atfmicos Swiss despues de una inyeccion i.v. de virus. 7 dfas despues de la inoculacion con tumor (tumor palpable), se trataron los ratones por 107 pfu de tampon + solucion salina (0), tampon + 5-FC (♦), VVTK-F4L-/FCU1 + solucion salina (□) o VVTK-F4L-/FCU1 + 5-FC (■). Se trataron los animales con solucion salina o 5-FC a 100 mg/kg/j dos veces al dfa por sonda oral, 7 dfas despues de la inyeccion del virus durante 3 semanas. Se midio el volumen de tumor dos veces a la semana.
Figura 7. Media del volumen de tumor ± EEM de LoVo s.c. en ratones atfmicos Swiss despues de una inyeccion i.v. de virus. 11 dfas despues de la inoculacion con tumor (tumor palpable), se trataron los ratones por tampon + H2O (0), o tampon + 5-FC (♦), o una inyeccion de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O (o), o una inyeccion de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (5-FC administrada 7 dfas despues de la inyeccion de virus y durante 3 semanas) (•), o dos inyecciones (dfa 11 y dfa 33) de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O (□), o dos inyecciones (dfa 11 y dfa 33) de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (5-FC administrada del dfa 18 al dfa 32 y del dfa 40 al dfa 54) (■). Se trataron los animales por 5-FC a 100 mg/kg dos veces al dfa por sonda oral. Se midio el volumen de tumor dos veces a la semana.
Figura 8. Media del volumen de tumor ± EEM de U87-MG s.c. (celulas tumorales de glioblastoma) en ratones atfmicos Swiss despues de una inyeccion i.v de virus. 11 dfas despues de la inoculacion con tumor (tumor palpable), se trataron los ratones por tampon + H2O (o), o tampon + 5-FC (♦), o 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O (o), o 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (•). Se trataron los animales por 5-FC a 100 mg/kg dos veces al dfa por sonda oral, 7 dfas despues de la inyeccion del virus y durante 3 semanas. Se midio el volumen de tumor dos veces a la semana.
Figura 9. Proporcion de produccion de viriones en celulas en division frente a celulas confluentes. Se infectan celulas PANC1 (tumor humano pancreatico), H1299 (tumor humano pulmonar) o U118MG (tumor humano de glioma) con 100 pfu de (|) VVTK-/FCU1 o (□) VVTK-I4L-/FCU1.48 h posinfeccion, se determinaron las valoraciones vfricas. Los valores son la proporcion entre las producciones de virus en celulas en division frente a celulas confluentes.
Figura 10. Proporcion de produccion de viriones en celulas en division frente a celulas confluentes. Se infectan celulas PANC1 (tumor humano pancreatico), H1299 (tumor humano pulmonar) o U118MG (tumor humano de glioma) con 100 pfu de (|) VVTK-/FCU1 o (□) VVTK-F4L-/FCU1. 48 h posinfeccion, se determinaron las valoraciones vfricas. Los valores son la proporcion entre las producciones de virus en celulas en division frente a celulas confluentes.
Figura 11. Los valores vfricos (pfu/mg de tejido) en organos o tumores el dfa 6 y el dfa 21 despues de inyeccion i.v. En ratones atfmicos Swiss que llevan tumores humanos subcutaneos con 1x106 PFU de VVTK-/FCU1 (|) o VVTK-I4L-/FCU1 (□).
Figura 12. Los valores vfricos (pfu/mg de tejido) en organos o tumores el dfa 6 y el dfa 21 despues de inyeccion i.v. En ratones atfmicos Swiss que llevan tumores humanos subcutaneos con 1x106 pfu de VVTK-/FCU1 (|) o VVTK-F4L-/FCU1 (□).
Figura 13. Supervivencia de ratones atfmicos Swiss despues del tratamiento con 1x108 pfu de VVTK-/FCU1 (■) o VVTK-I4L-/FCU1 (o) por inyeccion i.v.
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Figura 14. Supervivencia de ratones B6D2 inmunosuficientes despues del tratamiento con 1x107 pfu (A) o 1x108 pfu (B) de VVTK-/FCU1 (■) o VVTK-I4L-/FCU1 (0) por inyeccion i.v.
Figura 15. Promedio de la cantidad de pustulas en las colas despues de una inyeccion i.v de 1x106 pfu VVTK-/FCU1 o VVTK-I4L-/FCU1 en ratones atfmicos Swiss el dfa 13 posinfeccion y el dfa 34 posinfeccion.
Figura 16. Promedio de la cantidad de pustulas en las colas despues de una inyeccion i.v de 1x106 pfu VVTK-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 en ratones atfmicos Swiss el dfa 13 posinfeccion y el dfa 34 posinfeccion.
Figura 17. Promedio de la cantidad de pustulas en las colas despues de una inyeccion i.v de 1x107 pfu VVTK-/FCU1 o VVTK-I4L-/FCU1 en ratones atfmicos Swiss el dfa 15 posinfeccion y el dfa 31 posinfeccion.
Figura 18. Promedio de la cantidad de pustulas en las colas despues de una inyeccion i.v de 1x107 pfu VVTK-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 en ratones atfmicos Swiss el dfa 15 posinfeccion y el dfa 31 posinfeccion.
Modo(s) para llevar a cabo la invencion
Ejemplos
Construccion de plasmidos de vector
Se construyo un plasmido lanzadera para eliminar I4L usando el ADN de la cepa de virus de la variolovacuna Copenhagen (numero de acceso M35027) con gen timidina cinasa eliminado y que expresa el gen FCU1 bajo el control del promotor sintetico de variolovacuna p11 K7.5. Se amplificaron las regiones flanqueantes de ADN de I4L por PCR. Los cebadores de la region flanqueante en direccion 3’ de I4L fueron 5 - TCC CCC GGG TTA ACC ACT GCA TGA TGT ACA -3' (SEQ |D N°:7; sitio Smaj subrayado) y
5'- GCC GAG CTC GAG GTA GCC GTT tGT AATTCT-3' (SEQ ID N°:8; sitio Sad subrayado). Los cebadores para la region en direccion 5’ fueron 5’- GCC Q.QA TAA CTC CAG GCC GTT - 3' (SEQ |D N„.g. sitjo Msd subrayado) y 5’- GCC CAGCTG ATC GAG CCG TAA CGA TTT TCA - 3’ (SEQ |D N°:10; sitio Pvuu subrayado). Se digirio el fragmento de ADN amplificado con la enzima de restriccion Smal/Sacl o Mscl/PvuII y se unio a los correspondientes sitios en el plasmido Ppolylll. Se amplified una region de repeticion de la region flanqueante en direccion 3’ de I4L por PCR usando los cebadores 5 - GCC gca tgc atc cttgaacac caatac cga-3’ (seq ID N°:11; sitio Sphl subrayado) y 5~~ GCT CTA GAG AGG TAG CCG TTT GTA ATC TG - 3 (SEQ ID N°:12; sitio Xbal subrayado) y se inserto en el plasmido Ppolylll. Se usa la region de repeticion para eliminar el casete de seleccion durante la produccion de virus eliminados. - Se inserto el casete de seleccion, correspondiente al gen de fusion GFP/GPT bajo el control del promotor de variolovacuna pH5R, en el sitio Sacl/Sphl en el plasmido Ppolylll. El plasmido obtenido es el plasmido lanzadera recombinante denominado pAI4L para la delecion del gen I4L.
Se construyo un plasmido lanzadera para eliminar F4L usando el ADN de la cepa de virus de la variolovacuna Copenhagen (numero de acceso M35027). Se amplificaron las regiones flanqueantes de ADN de F4L por PCR. Los cebadores de la region flanqueante en direccion 3’ de F4L fueron 5'*cec GGATGG TTT GGT ACA GTC TAG TAT CCA- 3’
5' - TCC CCC GGG TTA TAA CAG ATG CAG TAT CCA - 3’
(SEQ ID N°:13; sitio BmaHI subrayado) y
N°:14; sitio Smal subrayado). Los cebadores AAT GGC CAT CTG AAA TCC - 3' (SEQ
5'- GAA GAT CTA GTA TCG CAT CTA AAA GAT GG -
para la ID
3' (SEQ ID N
region N°:15; 16
en direccion sitio
5' fueron Pvull
(SEQ ID GCC CAG CTG TTC
subrayado) y sitio Bglll subrayado). Se digirio el fragmento de
ADN amplificado con la enzima de restriccion BamHI/Smal o Bglll/Pvull y se unio a los correspondientes sitios en el plasmido Ppolylll. Se amplified una region de repeticion de la region flanqueante en direccion 3’ de I4L por PCR usando los cebadores 5’* GCC gag CTC ACC CAC ACG TTT TTC GAA AAA - 3'
5'- GCC GCA TGC TTA TAA CAG ATG CAG TAT CAA_y
(SEQ ID N°:17; sitio Sad subrayado) y (SEQ ID N°:18; sitio Sphl subrayado) y se inserto en el
plasmido Ppoly///. Se usa la region de repeticion para eliminar el casete de seleccion durante la produccion de virus eliminados. - Se inserto el casete de seleccion, correspondiente al gen de fusion GFP/GPT bajo el control del promotor de variolovacuna pH5R, en el sitio Sacl/Smal en el plasmido Ppolylll. El plasmido obtenido es el plasmido lanzadera recombinante denominado pAI4L para la delecion del gen F4L.
La generacion de virus de la variolovacuna recombinantes.
Se infectaron celulas CEF con VVTK-FCU1 (virus de la variolovacuna, defectuoso en el gen J2R de cinasa, que expresa el gen FCU1 bajo el control del promotor sintetico p11 k7.5) cepa Copenhagen a una MOI de 0,1 y se incubo a 37 °C durante 2 h, a continuacion se transfecto con un coprecipitado de CaCl2 del plasmido lanzadera recombinante (0,2 pg). Se incubaron las celulas durante 48 h a 37°C. A continuacion, se usaron diluciones de virus emergentes para infectar las celulas CEF en el medio de seleccion que contiene hipoxantina a una concentracion final de 15 pg/ml, xantina a una concentracion final de 250 pg/ml y acido micofenolico a una concentracion final de 250 pg/ml. Se aislaron placas fluorescentes (GFP) y positivas (seleccion GPT) y se seleccionaron para una serie distinta de seleccion en celulas CEF en presencia de medio de seleccion GPT. Se determino la presencia o no de VVTK-FCU1 por 40 ciclos
de PCR con cebadores dentro de la region de delecion. Despues de la eliminacion del virus original, se uso el virus con eliminacion doble para infectar CEF sin medio de seleccion GPT para eliminar el casete de seleccion. Se aislaron placas ateroescleroticas no fluorescentes y se seleccionaron para 2 ciclos en CEF. Se amplificaron los virus VV recombinantes en CEF, se purificaron y se valoraron las reservas de virus en CEF por ensayo de placas.
5 Sensibilidad celular in vitro para 5-FC.
Se transdujeron celulas tumorales humanas por el respectivo VV recombinante a una MOI de 0,0001. Se plaquearon un total de 3 x 105 celulas/pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos en 2 ml de medio que contenfa de varias concentraciones de 5-FC. A continuacion se cultivaron las celulas a 37 °C durante 5 dfas, y se contaron las celulas viables por exclusion con azul de tripano. Los resultados representados en las figuras 1, 2, 3 y 4 muestran que la 10 actividad de FCU1 es equivalente en virus defectuosos en el gen J2R que en virus defectuosos en el gen I4L y J2R o que en virus defectuosos en el gen F4L y J2R.
Replicacion in vitro en celulas cultivadas.
Se infectaron celulas en division o confluentes, en placas de 6 pocillos, a 100 PFU de virus (casi MOI 0,0005). Se anadieron 2 ml de medio complementado con FCS al 10 % para celulas en division y no complementado para celulas 15 confluentes. Se cultivaron las celulas 48 horas posinfeccion. Se almacenaron las celulas a -20 °C y se sometieron a sonicacion para liberar el virus, tambien se cuantifico el virus por valoracion de placa en celulas CEF. La proporcion entre la replicacion en celulas en division y celulas confluentes es similar en todas las celulas. Ambos virus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 se replican mas en celulas en division que en celulas confluentes.
Como media indirecta para someter a ensayo la especificidad del virus para la replicacion, se determino la produccion 20 de virus producidos en celulas en division frente a celulas tumorales confluentes (tumor humano pancreatico PANC1, tumor humano pulmonar H1299; tumor humano de glioma U118MG). Se plaquearon celulas confluentes a 1x106 celulas/pocillo y se cultivaron en medio completo durante 7 dfas, despues 1 dfa antes de la infeccion se lavaron las celulas y se cultivaron en medio sin suero. Se plaquearon celulas en division a 3x105 celulas/pocillo un dfa antes de la infeccion. Para evaluar el nivel de division celular, se midio la cantidad de timidina valorada incorporada en acido 25 nucleico 5 horas, 24 horas y 48 horas despues de plaquear las celulas. Durante este periodo la incorporacion de timidina fue relativamente constante en celulas confluentes mientras que en celulas en division se observo un incremento en la incorporacion con el tiempo. A continuacion, se infectaron las celulas con 100 pfu de virus, y 48 h posinfeccion se determino la proporcion entre la produccion de virus producidos en celulas tumorales en division y en celulas tumorales confluentes por valoracion de placa en CEF. Los resultados representados en las figuras 9 y 10 30 muestran que ambos virus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 se replican mas en celulas en division que en celulas confluentes. Los resultados representados en las figuras 9 y 10 muestran ademas un incremento en la proporcion en todos los diferentes tipos de celulas para ambos virus VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 por comparacion con VVTK-/FCU1. Este incremento de la proporcion en todos los diferentes tipos de celulas se debe a una menor replicacion de ambos virus VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 en celulas confluentes. Estos resultados 35 demuestran que ambos virus VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 presentan un incremento en la especificidad hacia celulas en division en comparacion con VVTK-/FCU1.
Modelo tumoral subcutaneo.
Se obtuvieron ratones atfmicos Swiss hembra de Charles River Laboratories. Los animales usados en los estudios eran semejantes en edad (6 semanas) y los pesos corporales oscilaban entre 23-26 g. A los ratones atfmicos Swiss se 40 les inyecto por via subcutanea (s.c.) en el costado 5x106 celulas LoVo. Cuando los tumores alcanzaron un diametro de 50-70 mm3, se aleatorizaron los ratones con enmascaramiento y se trataron con los vectores indicados para los experimentos in vivo.
Biodistribucion del virus.
Se evaluo la presencia de los diversos virus por valoracion de virus en tumores y muestras de organos. Se inyectaron 45 por via intravenosa (i.v.) 1x106 PFU de VV-FCU1 o VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 por inyeccion en la vena de la cola en ratones atfmicos que llevan tumores LoVo s.c. establecidos. Se sacrificaron los ratones en los puntos temporales indicados, y se recogieron y se pesaron los tumores y otros organos. Se homogeneizaron los tumores y organos en PBS y se determinaron las valoraciones en CEF como se describe previamente. Se estandarizaron las valoraciones vfricas a miligramo de tejido. Se estandarizaron las valoraciones vfricas a miligramo de tejido. Los 50 resultados representados en las tablas 2, 3, 4 y 5 (se presenta el intervalo de valoraciones de virus en pfu/mg de tejido) muestran que despues de 14 dfas el virus de acuerdo con la invencion se encuentra principalmente en el tumor. Los resultados representados en las figuras 11 y 12 muestran que ambos virus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 se dirigen al tumor con aproximadamente de 1.000 a 10.000 veces mas virus en el tumor que en los otros organos analizados excepto para las colas en el caso de VVTK-/FCU1. Se detecta una pequena cantidad de 55 VVTK-/FCU1 en pulmones, bazo, rinon y ganglios linfaticos (menos de 10 pfu/mg) y mas en piel, cola y medula osea el dfa 6, y piel y cola el dfa 21. Por el contrario, ambos VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 tienen mayor especificidad de tumor solo con una pequena cantidad en ganglios linfaticos y cola el dfa 6, y solo en tumor el dfa 21.
5
10
15
20
25
30
Tabla 2
Tumor Pulmones Bazo Rinon Ganglios L. Corazon
VVTK-/FCU1
(0,2-3,3)x105 0,1-2 0-2,2 0-1,8 0-61 0-0,3
VVK-I4L/FCU1
25,6-2,2x105 0-0,1 n.d 0-1 n.d n.d
Tabla 3
Ovarios Piel Cola Medula osea Cerebro Musculos
VVTK-/FCU1
2,2-74 0,1-24 13,5-7,104 0-800 0-1,8 0-22
VVK-I4L/FCU1
0-102 n.d 26,3 n.d n.d n.d
Tabla 4
Tumor Pulmones Bazo Rinon Ganglios L. Ovarios
VVTK-/FCU1
(0,2-3,3)x105 0,1-2 0-2,2 0-1,8 0-61 2,2-74
VVTK-F4L/FCU1
51,8-3,8x104 n.d n.d n.d 0-2,1 n.d
Tabla 5
Cola Medula osea Intestino Cerebro Musculos Corazon
VVTK-/FCU1
13,5-7,104 0-800 n.d 0-1,8 0-22 0-0,3
VVTK-F4L/FCU1
0-7,9 n.d n.d n.d n.d n.d
Actividad antitumoral del poxvirus de la invencion en modelo tumoral s.c.
Se trataron ratones atfmicos que llevan tumores LoVo s.c. Establecidos (50-70 mm3) una vez por via intravenosa (en la vena de la cola) con los vectores indicados a una dosis de 1,107 PFU, respectivamente. Comenzando el dfa 7 despues de la inyeccion vfrica, se les administro 5-FC por sonda oral a 100 mg/kg (0,5 ml de 5-FC al 0,5 % en agua) dos veces al dfa durante 3 semanas. Se midio el tamano de tumor dos veces a la semana usando compases calibradores. Se calculo el volumen de tumor en mm3 usando la formula (p/6) (longitud x anchura2). Los resultados representados en las figuras 5 y 6 muestran que distintos virus tienen una eficacia similar con una actividad oncolftica (p<0,05) que puede controlar el crecimiento de tumor, y una actividad combinada (oncolftica del virus y terapeutica del gen FCU1) con la administracion de 5-FC que puede mejorar adicionalmente el control del crecimiento del tumor (p<0,01).
Tambien se trataron por via intravenosa ratones atfmicos que llevan tumores LoVo s.c. establecidos (50-70 mm3) (en la vena de la cola) con los vectores indicados a una dosis de 1,107 PFU de acuerdo con lo siguiente: 11 dfas despues de la inoculacion con tumor (tumor palpable), se trataron los ratones por tampon + H2O, o tampon + 5-FC, o una inyeccion de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O, o una inyeccion de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (5-FC administrada 7 dfas despues de la inyeccion de virus y durante 3 semanas), o dos inyecciones (dfa 11 y dfa 33) de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O, o dos inyecciones (dfa 11 y dfa 33) de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (5-FC administrada del dfa 18 al dfa 32 y del dfa 40 al dfa 54). Se trataron los animales por 5-FC a 100 mg/kg dos veces al dfa por sonda oral. Se midio el tamano de tumor dos veces a la semana usando compases calibradores. Se calculo el volumen de tumor en mm3 usando la formula (p/6) (longitud x anchura2). Los resultados representados en la figura 7 muestran que no hay actividad antitumoral de virus solo despues de una o dos inyecciones. La adicion de tratamiento con 5-FC muestra una inhibicion estadfsticamente significativa del crecimiento del tumor (p<0,05) en comparacion con los grupos con vehfculo y virus solo (sin 5-FC) hasta el dfa 50. Al igual que con una unica inyeccion, dos inyecciones i.v. de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC demuestran una actividad antitumoral significativa en comparacion con los grupos de vehfculo y dos inyecciones de virus solo (sin 5-FC) (p<0,05). Ademas, se observa una diferencia significativa en la evolucion tumoral a partir del dfa 56 entre una y dos inyecciones de virus en combinacion con el tratamiento con 5-FC (p<0,05).
Se trataron por via intravenosa ratones atfmicos que llevan U87-MG s.c. establecido (celulas tumorales de glioblastoma) (en la vena de la cola) con los vectores indicados a una dosis de 1,107 PFU de acuerdo con lo siguiente: 11 dfas despues de la inoculacion con tumor (tumor palpable), se trataron los ratones por tampon + H2O, o tampon + 5-FC, o 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O, o 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC. Se trataron los animales por 5-FC a 5 100 mg/kg dos veces al dfa por sonda oral, 7 dfas despues de la inyeccion del virus y durante 3 semanas. Se midio el
tamano de tumor dos veces a la semana usando compases calibradores. Se calculo el volumen de tumor en mm3 usando la formula (n/6) (longitud x anchura2). Los resultados representados en la figura 8 muestran una actividad oncolftica alta de VVTK-I4L-/FCU1 en celulas U87-MG lo que da como resultado una actividad antitumoral fuerte (p<0,0001). La actividad combinada con la adicion de 5-FC, por sonda oral, da como resultado una actividad similar
10 (p<0,0001).
Patogenicidad vfrica.
Se evaluo la patogenicidad vfrica con estudios de supervivencia realizados tanto en ratones atfmicos Swiss (figura 13) como en ratones B6D2 inmunosuficientes (figura 14). Se les inyectaron i.v. a los ratones 1,107 o 1,108 PFU de ambos VVTK-/FCU1 y VVTK-I4L-/FCU1 en 100 pl de tampon por raton. Se observaron los ratones diariamente a en todo el 15 curso del experimento. En los ratones atfmicos Swiss (figura 13), la inyeccion de 1x108 PFU de VVTK-/FCU1 da como resultado la muerte de un 40 % de los animales 3 dfas despues de la infeccion. El resto de los ratones murio entre el dfa 50 y el dfa 80 despues de la infeccion. La administracion de VVTK-I4L-/FCU1 fue menos patogena, la mayorfa de los animales murio entre el dfa 65 al 140 (p<0,01). No se han observado pruebas de toxicidad con ambos virus a 107 pfu (figura 14 (A)). Todos los ratones murieron despues de una inyeccion i.v. de 108 pfu de VVTK-/FCU1 (figura 14 (B)). 20 El grupo con el tratamiento de VVTK-I4L-/FCU1 habfa prolongado significativamente la supervivencia a un 70 % en comparacion con los ratones infectados con VVTK-/FCU1 (figura 14 (B)). Por lo tanto, este resultado demuestra la disminucion de toxicidad con el virus con eliminacion doble VVTK-I4L-/FCU1.
Modelo de lesion de cola con pustulas.
Se les inyectaron i.v. a los ratones atfmicos Swiss 1,106 (figuras 15 y 16) o 1,107 (figuras 17 y 18) PFU de cada virus. 25 Se enumeraron las lesiones de la cola una vez a la semana. Los ratones inyectados con 1,106 PFU de VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 tienen menos de 1 pustula/ratones en comparacion con ratones inyectados con VVTK-/FCU1 con un promedio de 8 pustulas por ratones el dfa 13 posinfeccion (p<0,001) como se muestra en la figura 15 (A) y figura 16 (A). Los resultados son similares el dfa 34 posinfeccion con un promedio de 4 pustulas con VVTK-/FCU1 en comparacion con casi 1 para VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 (p<0,0001) como se muestra en la 30 figura 15 (B) y figura 16 (B). Los ratones inyectados con 1,107 PFU de VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 tienen respectivamente un promedio de 3 pustulas/ratones y 2 pustulas/ratones en comparacion con ratones inyectados con 1,107 PFU de VVTK-/FCU1 que tiene un promedio de 10 pustulas/ratones el dfa 15 posinfeccion (figura 17 (A) y figura 18 (A)). El dfa 31 posinfeccion, los ratones inyectados con VVTK-I4L-/fCu1 o VVTK-F4L-/FCU1 tienen respectivamente un promedio de 1,5 pustulas/ratones y 2 pustulas/ratones en comparacion con los ratones inyectados 35 con VVTK-/FCU1 que tienen un promedio de 7 pustulas/ratones (figura 17 (B) y figura 18 (B)). La diferencia en el numero de pustulas entre VVTK-/FCU1 y tanto VVTK-I4L-/FCU1 como vVTk-F4L-/FcU1 es estadfsticamente significativa (p<0,01). La formacion de pustulas se correlaciona con la replicacion de virus en la cola y de este modo con la virulencia y la toxicidad. La inyeccion i.v de VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 es menos toxica que con un el virus TK con eliminacion individual.
40 Analisis estadfstico.
Se realizaron analisis estadfsticos usando la prueba de la U de Mann-Whitney no parametrica y el programa informatico STATISTICA 7.1 (StatSoft, Inc). Un valor de P< 0,05 se considero estadfsticamente significativo.
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EP 0998568 A
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Claims (25)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    1. Un poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis, que comprende un gen I4L y/o F4L defectuoso.
  2. 2. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la enfermedad proliferativa es cancer o reestenosis.
  3. 3. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho poxvirus comprende ademas un gen J2R defectuoso.
  4. 4. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho poxvirus comprende ademas un gen F2L defectuoso.
  5. 5. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho poxvirus pertenece a la subfamilia Chordopoxvirinae.
  6. 6. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que dicho poxvirus pertenece a la especie del virus de la variolovacuna.
  7. 7. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que dicho poxvirus es un virus de la variolovacuna cepa Copenhagen.
  8. 8. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que dicho poxvirus es un virus de la variolovacuna cepa WR.
  9. 9. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho poxvirus comprende ademas un gen suicida.
  10. 10. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que dicho gen suicida codifica una protefna que tiene al menos una actividad de citosina desaminasa.
  11. 11. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que dicho gen suicida codifica una protefna que tiene al menos una actividad uracil fosforibosil transferasa.
  12. 12. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 10, en el que dicho gen suicida es FCY1, FCA1 o CodA o un analogo del mismo.
  13. 13. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 12, en el que dicha protefna que tiene al menos una actividad de citosina desaminasa es el polipeptido FCU1-8 representado en el identificador de secuencia SEQ ID N°:2 y analogos del mismo.
  14. 14. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 10 u 11, en el que dicho gen suicida codifica una protefna que tiene al menos una actividad de citosina desaminasa y de uracil fosforibosil transferasa.
  15. 15. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 14, en el que dicho gen suicida codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos sustancialmente como se representa en el identificador de secuencia SEQ ID N°:3 (coda::upp), SEQ ID N°:1 (FCU1) o la secuencia de aminoacidos de FCY1::FUR1.
  16. 16. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho poxvirus comprende ademas una secuencia de acido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa.
  17. 17. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 16, en el que dicha permeasa es una purina o una citosina permeasa de S. cerevisiae.
    5
    10
    15
    20
    25
  18. 18. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 17, en el que dicha permeasa se elige del grupo que comprende FCY2 y Fur4 y analogos de los mismos.
  19. 19. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 15, en el que dicho poxvirus comprende ademas los elementos necesarios para la expresion del gen suicida.
  20. 20. El poxvirus oncolftico para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con las reivindicaciones 16 a 18, en el que dicho poxvirus comprende ademas los elementos necesarios para la expresion de la permeasa.
  21. 21. Una composicion que comprende el poxvirus oncolftico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y un excipiente farmaceuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis.
  22. 22. La composicion para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 21, en la que dicha composicion se administra por la via sistemica.
  23. 23. La composicion para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 21 o 22, en la que se administra adicionalmente una cantidad farmaceuticamente aceptable de un profarmaco.
  24. 24. La composicion para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 23, en la que el profarmaco se administra al menos 3 dfas despues de la administracion del poxvirus.
  25. 25. La composicion para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, artritis reumatoide u osteoporosis de acuerdo con la reivindicacion 23, en la que el profarmaco se administra 7 dfas despues de la administracion del poxvirus.
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