BRPI0820576B1 - Uso de um poxvírus oncolítico compreendendo um gene i4l e/ou f4l defectivo ou uma composição compreendendo o mesmo - Google Patents

Abstract

vírus da varíola, processo para preparar o mesmo, composição, e, uso de um vírus da varíola ou uma composição. a presente invenção refere-se a um vírus da varíola compreendendo um gene f4l e/ou i4l defectivo, a uma composição compreendendo tal vírus da varíola e aos métodos e ao uso de tais composições e vírus da varíola para propósitos terapêuticos, e mais particularmente para o tratamento de câncer.

Description

Descrição Vetores oncolíticos de vírus varíola Campo Técnico

[001] Vírus oncolíticos são uma classe de agentes terapêuticos novos usados para o tratamento de câncer que têm a propriedade incomum de auto-perpetuação dependente de tumor (HERMISTON. “A demand for next-generation oncolytic adenoviruses”. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.322-30). Vírus oncolíticos são capazes de replicação seletiva em células malignas e portanto oferecem níveis de potência e especificidade que estão potencialmente muito mais avançados do que os tratamentos convencionais para câncer (FISHER. “Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses”. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.301-13). O benefício do uso destes vírus é que como se replicam, lisam suas células hospedeiras. Células de câncer são hospedeiras ideais para muitos vírus porque têm a via de interferon antiviral inativada ou têm genes supressores de tumor mutados que permitem que replicação viral proceda sem impedimento (CHERNAJOVSKY, et al. “Fighting cancer with oncolytic viruses”. British medical journal. 2006, vol.332, no.7534, p.170-2).

[002] Alguns vírus são naturalmente capazes de seletivamente se replicarem células tumorais mas vírus oncolíticos também podem ser obtidos por modificação de vírus naturalmente ocorrentes. Para este propósito, as estratégias principais usadas correntemente para modificar os vírus incluem: deleções funcionais em genes virais essenciais; promotores específicos de tecido ou tumor usados para controlar a expressão destes genes virais; e modificação de tropismo para redirecionar o adenovírus para a superfície de célula de câncer. No futuro próximo, adenovírus oncolíticos necessitam ser otimizados para totalmente realizarem seu potencial como ferramentas críticas de anticâncer e, assim, melhorarem a prognose para pacientes com gliomas malignos (JIANG, et al. “Oncolytic adenoviruses as antiglioma agents”. Expert review of anticancer therapy. 2006, vol.6, no.5, p.697-708).

[003] Por exemplo, ONYX-015, um adenovírus modificado seletivamente para se replicar em e matar células que hospedam mutações p53, está sob desenvolvimento por Onyx Pharmaceuticals para o tratamento potencial de vários tumores sólidos, incluindo tumores de cabeça e pescoço, gastrointestinais e pancreáticos. É um adenovírus recombinante que traz uma mutação de perda de função no locus E1B, cujo produto é uma proteína de 55 kDa que se liga em e inativa a proteína supressora de tumor p53. Assim, é suposto que o adenovírus ONYX-015 deixa as células normais não afetadas. Mutações no gene supressor de tumor p53 são o tipo mais comum de anormalidade genética em câncer, ocorrendo em mais da metade de todos os tipos de cânceres maiores. Assim, estas células são suscetíveis ao vírus, que prontamente se replicará e causará a morte celular. ONYX-015 está em testes de fase III em andamento para o tratamento de câncer recorrente de cabeça e pescoço, testes de fase II para tumores colorretais, de ovário, de pâncreas e de boca, e testes de fase I para doença digestiva, tumores de esôfago e do fígado (COHEN, et al. “ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals”. Current opinion in investigational drugs. 2001, vol.2, no.12, p.1770-5).

[004] Vírus naturalmente oncolíticos são vírus replicon- competentes que têm uma capacidade inata para seletivamente infectarem e matarem células de tumor. Apesar de serem usados nas tentativas originais para tratar câncer com vírus de fígado cinco décadas atrás, o interesse em vírus naturalmente oncolíticos tem retardado o suporte para adenovírus e herpesvírus engenhados como agentes terapêuticos contra câncer. Recentemente, contudo, tem havido interesse renovado na seletividade e na potência altas destes agentes naturalmente ocorridos (ROBERTS, et al. “Naturally oncolytic viruses”. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.314-21).

[005] Entre os vírus naturalmente oncolíticos, vírus de vacínia (um Poxviridae) possui muitos dos atributos chave necessários para um backbone viral ideal para uso em viroterapia oncolítica. Estes incluem um ciclo de vida curto, com rápida disseminação de célula-para-célula, capacidade lítica forte, uma capacidade de clonagem grande e uma biologia molecular bem definida. Em adição, embora capazes de se replicarem células de humano, não são consideradas um problema de saúde natural e estão especialmente bem caracterizadas tendo sido liberadas em milhões de indivíduos durante a campanha para erradicar varíola. Resultados clínicos iniciais usando quer cepas de vacina quer cepas de vacínia geneticamente modificadas têm demonstrado efeitos de antitumor (THORNE, et al. “Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer”. Current opinion in molecular therapeutics. 2005, vol.7, no.4, p.359-65).

[006] Em contraste, o vírus de mixoma de vírus da varíola é um candidato oncolítico novo que não tem história de uso em humanos diretamente, porque tem um tropismo de espécie hospedeira absoluto e distinto para lagomorfos (coelhos). Tem sido recentemente mostrado que vírus de mioxoma são capazes de também seletivamente infectarem e matarem células de tumor de humano, um tropismo incomum que está ligado às vias de sinalização intracelulares desreguladas encontradas na maioria dos cânceres de humano. Esta revisão resume o conhecimento existente sobre o tropismo de vírus de mixoma para células de câncer de humano, bem como dados pré-clínicos exibindo sua capacidade para infectar e limpar tumores em modelos animais de câncer (STANFORD, et al. “Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cancer”. Expert opinion on biological therapy. 2007, vol.7, no.9, p.1415-25).

Problema Técnico

[007] A injeção de doses altas de Vírus da varíola necessárias para alcançar um efeito antitumoral aumentou os problemas de toxidade. Os eventos adversos são em sua maioria reações adversas, menores que estão costumeiramente ligadas ao vírus de vacínia que são auto-limitados e incluem febre, dor de cabeça, fadiga, mialgia, calafrios, reações locais na pele, exantemas não específicos, eritema multiforme, linfadenopatia, e dor no sítio da vacinação. Outras reações podem exigir terapias adicionais (e.g., VIG, uma terapia de primeira linha e cidofovir, uma terapia de segunda linha). Reações adversas que podem exigir terapia ou avaliação adicional incluem inoculação inadvertida, vacínia generalizada (GV), eczema de vacínia (EV), vacínia progressiva (PV), doença de sistema nervoso central pós-vacinial, e vacínia fetal (CONO, et al. “Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians”. MMWR. Recommendations and reports: Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 2003, vol.52, no.RR-4, p.1-28).

[008] Assim, há necessidade de Vírus da varíola mais seguros com uma atividade oncolítica tão boa quanto a de suas contra-partes naturais.

Técnica Anterior

[009] US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15/11/1994 descreve um vírus da varíola recombinante modificado, mais particularmente um vírus de vacínia tendo funções genéticas codificadas por vírus não-essencial inativado de modo que o vírus da varíola recombinante tem virulência atenuada e segurança aumentada. Em particular, as funções genéticas são inativadas pela deleção de uma matriz de leitura aberta codificadora de um fator de virulência ou por inativação de inserção de uma matriz de leitura aberta codificadora de um fator de virulência. Mais particularmente, esta patente descreve um vírus de vacínia no qual a matriz de leitura aberta de para J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, e I4L em sido inativada. Este vírus (NYVAC) pode ser engenhado como um vetor para um ácido nucleico estranho e usado como uma vacina para induzir uma resposta imunológica em um animal hospedeiro. Contudo, N YVAC é incapaz para eficientemente se replicar na maioria das células de mamífero e não pode ser usado como um vírus oncolítico (XIANGZHI, et al. “Vaccinia virus K1L protein supports viral replication in human and rabbit cells through a celltype-specific set of its ankyrin repeat residues that are distinct from its binding site for ACAP2”. Journal of virology. 2006, vol.353, no.1, p.220233).

[010] WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US)) 19/02/2004 descreve um vírus de vacínia alterado que compreende uma ou mais mutações em seu genoma viral. Mutações descritas estão em uma ou mais das seguintes classes de polipeptídeos: 1) polipeptídeo modulador de interferon; 2) polipeptídeo de controle de complemento; 3) Polipeptídeo modulador de quimiocina ou TNF; 4) inibidor de serina protease; 5) Polipeptídeo modulador de IL-Ip; 6) polipeptídeos de forma de EEV não- infecciosa; e, 7) polipeptídeos virais que atuam para inibir a liberação de vírus infecciosos de células (polipeptídeo anti-forma de vírus infeccioso). Em adição, mutações em A41L ou C11R de vírus de vacínia também são reveladas.

[011] Regiões de genoma de vacínia tais como A34R, A41L, A53R, B5R, B7R, B8R, B13R, B15R, B18R, B22R, B28R, B29R, CUR, E3L, K2L, N1L, vC12L,e vCKBP são mais particularmente descritas neste pedido. Métodos da invenção envolvem o uso de qualquer um dos vírus da varíola aqui discutidos. Os inventores também revelam métodos para tratar câncer pela administração à célula de câncer ou ao paciente de uma quantidade eficaz deste vírus de vacínia alterado.

Revelação da Invenção

[012] Os inventores têm descoberto de modo surpreendente que vírus da varíola compreendendo um gene I4L e/ou F4L defectivo têm um perfil de segurança melhorado mas mantêm uma atividade oncolítica equivalente (comparados com sua contra-parte natural).

[013] A presente invenção refere-se a um vírus da varíola compreendendo um gene I4L e/ou F4L defectivo desde que o dito vírus da varíola não seja NYVAC.

[014] Como usados no pedido inteiro, os termos “um” e “uma” são usados no sentido de que significam “pelo menos um(a)”, pelo menos um(a) primeiro(a)”, “um ou mais” ou “uma pluralidade” dos componentes ou etapas referidos(as), a não ser que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas.

[015] O termo “e/ou” sempre que usado aqui inclui o significado de “e”, “ou” e “todos ou qualquer outra combinação dos elementos conectados pelo dito termo”.

[016] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” como aqui usado significa dentro de 20%, preferivelmente dentro de 10%, e mais preferivelmente dentro de 5% de um dado valor ou de uma dada faixa.

[017] Como aqui usados, os termos “compreendendo” e “compreende” são intencionados para significarem que os produtos, composições e métodos incluem os componentes ou as etapas referidos(as), mas não excluindo outros(as). "Consistindo essencialmente de" quando usado para definir produtos, composições e métodos, deve significar exclusão de outros componentes ou outras etapas de qualquer significância essencial. Assim, uma composição consistindo essencialmente dos componentes citados não excluiria contaminantes traço e veículos farmaceuticamente aceitáveis. "Consistindo de" deve significar a exclusão de mais do que elementos traço de outros componentes ou outras etapas.

[018] Como aqui usado, o termo “vírus da varíola compreendendo um gene defectivo“ refere-se a um vírus da varíola compreendendo uma deleção, substituição ou adição em um ou mais ácidos nucleicos do gene defectivo, ou qualquer combinação destas possibilidades na qual ditas modificações acarretam a incapacidade para o vírus produzir uma proteína tendo a atividade da proteína produzida pelo gene não modificado. Em uma modalidade preferida da invenção, um vírus da varíola compreendendo um gene defectivo refere-se a um vírus da varíola no qual a sequência de gene inteira tem estado deletada. Mutação pode ser feita em numerosas maneiras conhecidas por aquelas pessoas experientes na técnica usando técnicas recombinantes. Métodos para modificar o genoma de um vírus da varíola estão disponíveis na técnica. Por exemplo os métodos relevados em MCCART, et al. “Systemic cancer therapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes”. Cancer res. 2001, no.61, p.8751-57., KIM, et al. “Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy for cancer with JX-594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF”. Molecular Therapeutic. 2006, no.14, p.36170., WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US)) 19/02/2004 e US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15/11/1994 podem ser usados para produzir o vírus da varíola da invenção. Os métodos relevados no exemplo do presente pedido são particularmente relevantes para produzir um vírus da varíola de acordo com a invenção. Sequências do genoma de vários vírus da varíola estão disponíveis na técnica, por exemplo, os genomas de vírus de vacínia, vírus da varíola bovina, vírus Canarypox, vírus Ectromelia, vírus de Mixoma estão disponíveis em Genbank (números de acesso NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_001132 respectivamente)

[019] Como aqui usado o termo “vírus da varíola” refere- se a um vírus pertencendo à família Poxviridae. De acordo com uma modalidade preferida, o vírus da varíola de acordo com a invenção pertence à subfamília Chordopoxvirinae, mais preferivelmente ao gênero Orthopoxvirus e ainda mais preferivelmente à espécie do vírus de vacínia.

[020] Por exemplo, cepas de vírus de vacínia Dairen I, IHD-J, L-IPV, LC16M8, LC16MO, Lister, LIVP, Tashkent, WR 65-16, Wyeth, Ankara, Copenhagen, Tian Tan e WR podem ser usadas. De acordo com uma modalidade particularmente preferida, o vírus da varíola de acordo com a invenção é uma cepa Copenhagen do vírus da vacínia.

[021] O vírus da varíola de vacínia contém um genoma de DNA duplex grande (187 quilobases de pares) e é um membro da única família conhecida de vírus de DNA que se replica no citoplasma de células infectadas. Devido ao fato de a célula infectada precisar liberar quantidades grandes de precursores de DNA para sítios de replicação, o vírus codifica e expressa muitas atividades enzimáticas exigidas para síntese e metabolismo de DNA, incluindo ribonucleotídeo-redutase e desoxiuridina 5’-trifosfato nucleotídeo-hidrolase (dUTPase).

[022] Ribonucleotídeo-redutase (EC 1.17.4.1) catalisa a redução de ribonucleotídeos para desoxirribonucleotídeos, uma reação que representa uma primeira etapa envolvida na biossíntese de DNA. A enzima viral é similar em estrutura de subunidade à enzima de mamífero, sendo composta de duas subunidades heterólogas, designadas R1 e R2. Os genes que codificam as subunidades de ribonucleotídeo-redutase viral têm sido sequenciados e estão localizados em posições no genoma de vacínia, separadas por 35 quilobases (SLABAUGH, et al.. Journal of virology. 1988, vol.62, p.519-27.; TENGELSEN, et al.. Virology. 1988, no.164, p.121-31.; SCHMITT, et al.. Journal of virology. 1988, no.62, p.1889-97). Os monômeros da subunidade grande do vírus de vacínia (designada R1, codificada pelo gene I4L) são polipeptídeos de 86 kDa, e contêm sítios de ligação para substratos de nucleotídeo como efetores alostéricos (SLABAUGH, et al.. Journal of virology. 1984, no.52, p.507-14.; SLABAUGH, et al.. Journal of virology. 1984, no.52, p.501-6). A subunidade pequena (designada R2, codificada pelo gene F4L) é um homodímero compreendendo dois polipeptídeos de 37-kDa; cada polipeptídeo contém um radical livre baseado em proteína estabilizada por ferro que é exigido para catálise (HOWELL, et al.. Journal of Biological Chemistry. 1992, no.267, p.1705-11). Sequências para os genes I4L e F4L e suas localizações no genoma de vários vírus da varíola estão disponíveis em bancos de dados, por exemplo via números de acesso DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 e NC_008291.

[023] A nomenclatura de gene aqui usada é aquela de cepa de vacínia Copenhagen e é usada também para os genes homólogos de outros poxviridae salvo indicação em contrário. Contudo, nomenclatura de gene pode ser diferente de acordo com a cepa de varíola. Para informação, correspondência entre genes Copenhagen e MVA podem ser encontradas em Tabela I de ANTOINE. Virology. 1998, no.244, p.365-396.

[024] De acordo com uma modalidade preferida, o vírus da varíola da invenção adicionalmente compreende um gene J2R defectivo

[025] O gene J2R codifica uma Timidina quinase (TK) que forma parte da via de recuperação para a síntese de piridina-desóxi- ribonucleotídeo. A reação catalisada por TK envolve a transferência de um grupo Y-fosforil de ATP para 21-desóxi-timidina (dThd) para produzir timidina-5'-monofosfato (dTMP). TK de vírus de vacínia é de tipo 2. TK's de tipo 2 têm uma cadeia de polipeptídeo menor comparadas com tipo 1, sendo de ~25 KDa mas formam homotetrâmeros. São sensíveis aos inibidores de retro-alimentação dTDP ou dTTP, que são gerados no final da via metabólica. TKs de tipo 2 têm uma especificidade de substrato muito mais estreita comparadas com as TKs de tipo 1 e apenas fosforilam 2'-desóxi-uridina (dU) e/ou dThd (EL OMARI, et al. " Structure of vaccinia virus thymidine kinase in complex with dTTP: insights for drug design". BMC structural biology. 2006, no.6, p.22).

[026] Vírus da varíola defectivos para a região J2R e métodos para obtê-los estão disponíveis na técnica. Por exemplo, os ensinamentos de MCCART, et al. "Systemic cancer therapy with a tumor- selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes". Cancer Research. 2001, vol.61, no.24, p.8751-7., PUHLMANN, et al. " Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant ". Cancer gene therapy. 2000, vol.7, no.1, p.66-73. GNANT, et al. "Systemic administration of a recombinant vaccinia virus expressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with 5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongation of survival in mice". Cancer Research. 1999, vol.59, no.14, p.3396-403. podem ser usados para produzir um vírus da varíola deletado na região J2R.

[027] De acordo com uma modalidade preferida, o vírus da varíola da invenção adicionalmente compreende um gene F2L defectivo.

[028] Desoxi-uridina-5'-trifosfato-nucleotídeo-hidrolase (dUTPase, EC 3.6.1.23) catalisa a hidrólise de dUTP para dUMP e pirofosfato na presença de íons de Mg(2+). dUTPase, em remoção de dUTP da coleção de dNTP e geração de dUMP, está envolvida em ambos manutenção da fidelidade de replicação de DNA e na obtenção de precursor para a produção de TMP por timidilato-sintase. DUTPase de vacínia é uma proteína d 15 kDa codificada pelo gene F2L (MCGEOGH.. Nucleic Acids Research. 1990, no.18, p.4105-10.; BROYLES.. Virology. 1993, no.195, p.863-5). Sequencia do gene F2L do vírus de vacínia está disponível em genbank via número de acesso M25392, sequências e localizações do gene F2L em vários genomas de vírus da varíola também estão disponíveis em genbank, por exemplo, via números de acesso NC_006998, DQ121394, NC_001611, AY689436, AY689437, NC_008291, DQ437594, DQ437593, AY313847, AY313848, NC_006966, NC_005309, NC_003391, NC_003389, NC_001132, NC_003310, NC_002188, M35027, AY243312, AF170726, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, X94355, Y16780, AY318871, U94848, AF198100 e M34368.

[029] De acordo com uma modalidade preferida, o vírus da varíola de acordo com a invenção adicionalmente compreende um ácido nucleico de interesse.

[030] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico de interesse contém pelo menos uma sequência de interesse codificadora de um produto de gene que é uma molécula terapêutica (i.e. um agente terapêutico). Uma "molécula terapêutica é uma que tem uma atividade farmacológica ou protetora quando administrada apropriadamente a um paciente, especialmente paciente sofrendo de uma doença ou de uma condição doentia ou que deve ser protegido contra esta doença ou condição. Uma tal atividade farmacológica ou protetora é uma que é esperada em estar relacionada com um efeito benéfico durante o curso ou um sintoma de dita doença ou de dita condição. Quando o homem experiente seleciona no curso da presente invenção um gene codificador de uma molécula terapêutica,ele geralmente refere sua escolha aos resultados previamente obtidos e pode razoavelmente esperar, sem experimento indevido diferente da prática da invenção como reivindicada, obter tal propriedade farmacológica. De acordo com a invenção, a sequência de interesse pode ser homóloga ou heteróloga para as células alvo nas quais ela é introduzida. Vantajosamente dita sequência de interesse codifica todo ou parte de um polipeptídeo, especialmente um polipeptídeo terapêutico ou profilático dando uma propriedade terapêutica ou profilática. Um polipeptídeo é entendido como sendo qualquer produto traduzido de um polinucleotídeo independente do tamanho, e está ou não glicosilado, e inclui peptídeos e proteínas. Os polipeptídeos terapêuticos incluem como um exemplo primário aqueles polipeptídeos que podem compensar as proteínas deficientes ou defectivas em um organismo humano ou animal, ou aqueles que atuam por meio de efeitos tóxicos para limitar ou remover células nocivas do corpo. Também podem ser polipeptídeos concedentes de imunidade que atuam como um antígeno endógeno para provocar uma resposta celular ou humoral, ou ambos.

[031] Exemplos de polipeptídeos codificados por um agente terapêutico incluem genes codificadores de uma citoquina (alfa, beta ou gama interferon, interleucina, em particular IL-2, IL-6, IL-10 ou IL-12, um fator de necrose de tumor (TNF), um fator estimulante de colônia GM-CSF, C-CSF, M-CSF..), um polipeptídeo imunoestimulatório (B7.1, B7.2 e semelhantes), um fator de coagulação (FVIII, FIX..), um fator de crescimento (Fator de Crescimento Transformante TGF, Fator de Crescimento de Fibroblasto FGF e semelhantes), uma enzima (urease, resina, trombina, metaloproteinase, óxido-nítrico-sintase NOS, SOD, catalase), um inibidor de enzima (alfa1-antitripsina, antitrombina III, inibidor de protease viral, inibidor de ativador de plasminogênio PAI-1), ta proteína CFTR (Reguladora de Condutância de Transmembrana de Fibrose Cística), insulina, distrofina, um antígeno MHC de classe I ou II, um polipeptídeo que pode modular / regular expressão de genes celulares, um polipeptídeo capaz de inibir uma infecção bacteriana, parasítica ou viral ou seu desenvolvimento (polipeptídeos antigênicos, epitopos antigênicos, variantes transdominantes inibidores da ação de uma proteína nativa por competição..), um inibidor ou indutor de apoptose (Bax, Bcl2, BclX..), um agente citostático (p21, p 16, Rb..), uma apolipoproteína (ApoAI, ApoAIV, ApoE..), um inibidor de angiogênese (angiostatina, endostatina..), um polipeptídeo angiogênico (família de Fatores de Crescimento Endotelial Vascular Família VEGF, FGF, Família CCN incluindo CTGF, Cyr61 e Nov), um eliminador de radical de oxigênio, um polipeptídeo tendo um efeito anti-tumor, um anticorpo, uma toxina, uma imunotoxina e um marcador (beta-galactosidase, luciferase..) ou quaisquer outros genes de interesse que são reconhecidos na técnica como sendo úteis para o tratamento ou a prevenção de uma condição clínica.

[032] Genes de anti-tumor incluem mas não são limitados àqueles codificadores de genes supressores de tumor (e.g. Rb, p53, DCC, NF- 1, tumor de Wilm, NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73 bem como seus respectivos mutantes), produtos de gene suicida, anticorpos, polipeptídeos inibidores de divisão celular ou de sinais de transdução.

[033] De acordo com uma modalidade particularmente preferida, o vírus da varíola da invenção adicionalmente compreende um gene suicida.

[034] Gene suicida refere-se a um gene codificador de uma proteína capaz de converter um precursor de uma droga em um composto citotóxico.

[035] Genes suicidas compreendem mas não são limitados aos genes codificadores de proteína tendo uma atividade de citosina- desaminase, uma atividade de timidina-quinase, uma atividade de uracil- fosfo-ribosil-transferase, uma atividade de purina-nucleosídeo-fosforilase e/ou uma atividade de timidilato-quinase.

[036] Exemplos de genes suicidas e de precursores correspondentes de uma droga compreendendo um grupo de nucleobase são relevados na seguinte tabela: Tabela 1

[037] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o gene suicida codifica uma proteína tendo pelo menos uma atividade de CDase. CDase está envolvida na via metabólica de pirimidina pela qual citosina exógena é transformada em uracila por meio de uma desaminação hidrolítica. Embora atividades de CDase tenham sido demonstradas em eucariotos inferiores e procariotos (JUND, et al.. Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15.; BECK, et al.. Journal of Bacteriology. 1972, no.110, p.219-28.; HOEPRICH, et al.. Journal of Infectious Diseases. 1974, no.130, p.112-18.; ESDERS, et al.. J. biol. chem. 1985, no.260, p.3915-22.), não estão presentes em mamíferos (KOECHLIN, et al.. Biochemical pharmacology. 1966, no.15, p.435-46.; POLAK, et al.. Chemotherapy. 1976, no.22, p.137-53).

[038] CDase também desamina um análogo de citosina, i.e. 5-fluoro-citosina (5-FC), formando deste modo 5-fluoro-uracil (5-FU), que é um composto que é elevadamente citotóxico quando é convertido em 5- fluoro-UMP (5-FUMP). Células faltantes de atividade de CDase, quer por causa de uma mutação que inativa o gene codificador da enzima quer por causa de sua deficiência natural nesta enzima, como são as células de mamífero, são resistentes a 5-FC (JUND, et al.. Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15.; KILLSTRUP, et al.. Journal of Bacteriology. 1989, no.171, p.2124-2127). Em contraste, células de mamífero para dentro das quais as sequências codificadoras de atividade de CDase foram transferidas se tornaram sensíveis a 5-FC (HUBER, et al.. Cancer Research. 1993, no.53, p.4619-4626.; MULLEN, et al.. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, no.89, p.33-37.; WO 93/01281 (US HEALTH)). Em adição, as células não-transformadas, vizinhas também se tornaram sensíveis a 5-FC (HUBER, et al.. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, no.91, p.8302-6). Este fenômeno, que é chamado de um efeito espectador, é devido às células que estão expressando atividade de CDase secretando 5-FU, que então intoxica as células vizinhas por difusão direta através da membrana plasmática. Esta propriedade de 5-FU em difusão passiva representa uma vantagem comparação com o sistema de referência tk/GCV, onde o efeito espectador exige que haja o contato com as células que estão expressando tk (MESNIL, et al.. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996, no.93, p.1831-35). Todas as vantagens que CDase oferece dentro do contexto da terapia de gene, em particular terapia genética de anti-câncer, podem ser portanto prontamente entendidos.

[039] Os genes FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), FCA1 de Candida Albicans e codA de E. coli, que respectivamente codificam a CDase destes dois [sic] organismos, são conhecidos e suas sequências têm sido publicadas (SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6 respectivamente).

[040] Com respeito a isto, de acordo com uma modalidade mais preferida da invenção, um gene codificador de uma proteína tendo uma atividade de CDase é FCY1, FCA1 ou CodA ou um análogo do mesmo. Análogos destes genes referem-se a um gene tendo uma sequência de ácido nucleico que tem pelo menos um grau de identidade maior do que 70%, vantajosamente maior do que 80%, preferivelmente maior do que 90%, e muito mais preferivelmente maior do que 95% com a sequência de ácido nucleico do gene parental.

[041] Patente WO 2005/007857 revela um gene codificador de uma proteína tendo uma atividade de CDase melhorada. Estes polipeptídeos derivam de uma CDase nativa pela adição de uma sequência de aminoácidos. De acordo com outra modalidade preferida da invenção, a proteína tendo uma atividade de CDase é um polipeptídeo revelado em WO 2005/007857 e mais preferivelmente o polipeptídeo FCU1-8 representado no identificador de sequência SEQ ID N°:2 e análogos do mesmo.

[042] Em eucariotos inferiores e procariotos, uracil é transformado em UMP pela ação de uracil-fosfo-ribosil-transferase (UPRTase). Esta enzima converte 5-FU em 5-FUMP. De acordo com outra modalidade preferida da invenção, o gene suicida codifica uma proteína tendo uma atividade de UPRTase.

[043] A UPRTase em questão pode ser de qualquer origem, em particular de origem procariótica, fúngica ou de levedura. Por meio de ilustração, as sequências de ácido nucleico codificadoras das UPRTases de E. coli (ANDERSEN, et al. "Characterization of the upp gene encoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12". European Journal of Biochemistry. 1992, no.204, p.51-56.), de Lactococcus lactis (MARTINUSSEN, et al. "Cloning and characterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis". Journal of Bacteriology. 1994, vol.176, no.21, p.6457-63.), de Mycobacterium bovis (KIM, et al. "Complete sequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Mycobacterium bovis BCG". Biochemistry and molecular biology international. 1997, vol.41, no.6, p.1117-24.) e de Bacillus subtilis (MARTINUSSEN, et al. "Two genes encoding uracil phosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis". Journal of Bacteriology. 1995, vol.177, no.1, p.271-4.) podem ser usadas no contexto da invenção. Contudo, é mais particularmente preferido usar uma UPRTase de levedura e em particular aquela codificada pelo gene FUR1 de S. cerevisiae cuja sequência é revelada em KERN, et al. "The FUR1 gene of Saccharomyces cerevisiae: cloning, structure and expression of wild-type and mutant alleles". (Gene. 1990, vol.88, no.2, p.149-57). É aqui introduzido como referência. Como um guia, as sequências dos genes e aquelas das UPRTases correspondentes podem ser encontradas na literatura e nos bancos de dados especializados (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medline e semelhantes).

[044] Pedido EP 0998568 A descreve um gene FUR1 faltante de 105 nucleotídeos em 5' na parte codificadora permitindo a síntese de uma UPRTase da qual os primeiros 35 resíduos têm sido deletados na posição N-terminal e partindo com a metionina na posição 36 na proteína nativa. O produto de expressão do gene mutante, designado FUR1Δ105, é capaz de complementar um fur1 mutante de S. cerevisiae. Em adição, o mutante truncado exibe uma atividade de UPRT mais alta do que aquela da enzima nativa. Assim, de acordo com uma modalidade particularmente vantajosa da invenção, o gene suicida codifica um mutante de deleção de uma UPRTase nativa. A deleção está preferivelmente localizada na região N- terminal da UPTRase original. Ela pode ser completa (afetando todos os resíduos de dita região N-terminal) ou parcial (afetando um ou mais resíduos contínuos ou descontínuos na estrutura primária). Em geral, um polipeptídeo consiste de partes N-terminal, central e C-terminal, cada uma representando cerca de um terço da molécula. Por exemplo, visto que a UPRTase de S. cerevisiae tem 251 aminoácidos, sua parte N-terminal consiste dos primeiros 83 aminoácidos partindo da denominada metionina iniciadora situada na primeira posição da forma nativa. Como para a UPTRase de E. coli, sua parte N-terminal cobre posições 1 a 69.

[045] Uma proteína preferida tendo uma atividade de UPRTase compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente como representada no identificador de sequência SEQ ID N°: 1 de EP 0998568 A, partindo com resíduo Met em posição 1 e terminando com o resíduo Val em posição 216. O termo "substancialmente" refere-se a um grau de identidade com dita sequência SEQ ID N°: 1 EP 0998568 A maior do que 70%, vantajosamente maior do que 80%, preferivelmente maior do que 90%, e muito mais preferivelmente maior do que 95%. Mais preferivelmente ainda, compreende a sequência de aminoácidos representada pelo identificador de sequência SEQ ID N°: 1 EP 0998568 A. Como mencionado acima, pode compreender mutações adicionais. Pode ser mencionado em particular a substituição do resíduo de serina em posição 2 (posição 37 na UPRTase nativa) por um resíduo de alanina.

[046] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, o gene suicida codifica uma proteína tendo pelo menos uma atividade de CDase e uma atividade de UPRTase. Pedidos de Patente WO 96/16183 e EP 0998568 A descrevem o uso de uma proteína de fusão codificadora de uma enzima com dois domínios tendo as atividades de CDase e UPRTase e demonstram que a transferência de um gene híbrido codA::upp ou FCY1::FUR1 ou FCY1::FUR1Δ105 (i.e. FCU1) transportado por um plasmídeo de expressão aumenta a sensibilidade de células B16 transfectadas a 5-FC. De acordo com uma modalidade mais preferida da invenção, o gene suicida codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos substancialmente como representada no identificador de sequência SEQ ID N°:3 (coda::upp), SEQ ID N°:1 (FCU1) ou FCY1::FUR1. O termo "substancialmente" refere-se a um grau de identidade com dita sequência maior do que 70%, vantajosamente maior do que 80%, preferivelmente maior do que 90%, e muito mais preferivelmente maior do que 95%. Mais preferivelmente ainda, compreende a sequência de aminoácidos como representada no identificador de sequência SEQ ID N°:3 (coda::upp), SEQ ID N°:1 (FCU1) ou FCY1::FUR1. Como mencionado acima, pode compreender mutações adicionais.

[047] As sequências de ácido nucleico podem ser facilmente obtidas por clonagem, por PCR ou por síntese química de acordo com as técnicas convencionais em uso. Podem ser genes nativos ou genes derivados dos últimos por mutação, deleção, substituição e/ou adição de um ou mais nucleotídeos. Além disso, suas sequências são amplamente descritas na literatura que pode ser consultada pelas pessoas experientes na técnica.

[048] Pessoas experientes na técnica são capazes de clonar as sequências de CDase ou UPRTase dos dados publicados e de realizar as mutações possíveis, de testar a atividade enzimática das formas mutantes em um sistema acelular ou celular de acordo com a tecnologia da técnica anterior ou baseado no protocolo indicado em pedido EP 0998568 A, e de fusionar, em particular em fase, os polipeptídeos com atividade de CDase e UPRTase, e consequentemente todos ou parte dos genes correspondentes.

[049] De acordo com uma modalidade mais preferida, o vírus da varíola da invenção adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico compreendendo um gene codificador de uma permease.

[050] Permease refere-se à proteína de transmembrana envolvida na transferência de uma droga compreendendo um grupo de nucleobase, ou um seu precursor através da membrana celular.

[051] Permease compreende mas não é limitada a purina permease, citosina permease e transportadores de nucleosídeo.

[052] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, permease é uma purina ou uma citosina permease de S. cerevisiae. Os transportadores de nucleobase de S. cerevisiae consistem de a purina- citosina permease, conhecida como FCY2, e a uracil permease, conhecida como FUR4. A purina-citosina permease, FCY2 medeia o simporte de prótons e adenina, guanina, hipoxantina e citosina através da membrana plasmática de levedura (Grenson 1969, Jund e Lacroute 1970, Polak e Grenson 1973, Chevallier et al. 1975, Hopkins et al. 1988). Proteína FCY2 também medeia o transporte de 5-fluoro-citosina, um análogo de citosina (Grenson 1969, Jund e Lacroute 1970). Gene FCY2 codifica uma proteína de 533 aminoácidos (58 kDa) inicialmente predito em ter 10-12 domínios atravessando a transmembrana (Weber et al. 1990), com nove agora favorecidos (Ferreira et al. 1999). FCY2 exibe afinidades similares para as nucleobases purina e citosina (Brethes et al. 1992). Captação de uracil em S. cerevisiaeé mediada por uma uracil permease, FUR4 (Jund e Lacroute 1970, Jund et al. 1977). FUR4 é um simporter de uracil-próton (Hopkins et al. 1988) predito em ser uma proteína de 633 aminoácidos (71.7 kDa) com 10 domínios de transmembrana e caudas N- e C-terminais hidrofílicas citoplásmicas longas (Jund et al. 1988, Garnier et al. 1996). Proteína PUR4 também medeia o transporte de 5-fluoro-uracil, um análogo de uracil (Jund e Lacroute 1970).

[053] Sequências de aminoácidos de FCY2 e Fur4 estão particularmente disponíveis no banco de dados swissprot (número de acesso P17064 e P05316 respectivamente). Preferivelmente, permease tem uma sequência de aminoácidos escolhida do grupo compreendendo sequências de aminoácidos SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:2 como reveladas em Patente application WO 2006/048768.

[054] Com respeito a isto, de acordo com uma modalidade preferida da invenção, a permease é escolhida do grupo compreendendo FCY2 e Fur4 e análogos do mesmo. Análogos de Fur4 e FCY2 referem-se ao polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos um grau de identidade maior do que 70%, vantajosamente maior do que 80%, preferivelmente maior do que 90%, e muito mais preferivelmente maior do que 95% com a sequência de aminoácidos da proteína parental como descrito aqui acima e que retém a capacidade para transportar uma droga compreendendo um grupo de nucleobase através da membrana celular.

[055] A uma pessoa experiente na técnica também é capaz de escolher a permease que estará associada com a droga ou o precursor da droga compreendendo um grupo de nucleobase. Por exemplo, FCY2 e Fur4 estão preferivelmente associadas com 5-Fluoro-citosina (5-FC).

[056] De acordo com uma modalidade mais preferida, o vírus da varíola da invenção pode adicionalmente compreender os elementos necessários para a expressão do ácido nucleico de interesse.

[057] De acordo com uma modalidade mais preferida, o vírus da varíola da invenção pode adicionalmente compreender os elementos necessários para a expressão da sequência de ácido nucleico compreendendo um gene codificador de uma permease.

[058] Estes elementos necessários para a expressão do ácido nucleico de interesse e/ou a sequência de ácido nucleico compreendem um gene codificador de uma permease compreendido de elementos exigidos para transcrição de dito DNA em mRNA e, se necessário, para tradução de mRNA em polipeptídeo. Promotores transcricionais adequados para uso em vários sistemas vertebrados estão amplamente descritos em literatura. Por exemplo, promotores adequados incluem promotores virais como RSV, MPSV, SV40, CMV ou 7.5k, promotor de vacínia, promotores induzíveis, etc. Promotores preferidos são isolados de vírus da varíola e.g. 7.5K, H5R, TK, p28, p11 ou K1L de vírus de vacínia. Alternativamente, pode-se usar um promotor sintético tal como aqueles descritos em CHAKRABARTI.. Biotechniques. 1997, no.23, p.1094-97., HAMMOND, et al.. Journal of Virological Methods. 1997, no.66, p.135-38. e KUMAR.. Virology. 1990, no.179, p.151-8. bem como promotores quiméricos entre promotores de vírus varíola precoces e tardios.

[059] A sequência de ácido nucleico de interesse e a sequência de ácido nucleico compreendendo um gene codificador de uma permease podem adicionalmente incluir elementos funcionais adicionais, tais como sequências de íntron, sequências selecionadoras, sequências de transporte, sinal de secreção, sinal de localização nuclear, IRES, sequência de terminação de transcrição de poli A, sequências líderes tripartidas, sequências envolvidas em replicação ou integração. Ditas sequências têm sido relatadas na literatura e podem ser prontamente obtidas por aquelas pessoas experientes na técnica.

[060] A invenção também se refere a um processo para preparar um vírus da varíola de acordo com a invenção, em cujo processo: (i) um vírus da varíola de acordo com a invenção é introduzido em uma célula, (ii) dita célula é cultivada sob condições que são apropriadas para permitir que dito vírus da varíola seja produzido, e (iii) dito vírus da varíola é recuperado da cultura celular.

[061] Embora o vírus da varíola possa naturalmente ser recuperado do sobrenadante de cultura, ele também pode ser recuperado das células. Um dos métodos comumente utilizados consiste em lise das células por meio de ciclos consecutivos de congelamento / descongelamento com o propósito de coletar os vírions no sobrenadante de lise. Os vírions podem ser então amplificados e purificados usando as tecnologias da técnica (método cromatográfico, método de ultracentrifugação, em particular por intermédio de um gradiente de cloreto de césio, etc.).

[062] A presente invenção, também se refere a uma composição que compreende um vírus da varíola de acordo com a invenção em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[063] Uma composição de acordo com a invenção é mais especificamente intencionada para o tratamento preventivo ou curativo de doenças por meio de terapia genética e é mais especificamente almejada para doenças proliferativas (cânceres, tumores, restenose, etc.) ou almejada em doenças associadas com uma atividade de osteoclasto aumentada (e.g. artrite reumatóide, osteoporose).

[064] Uma composição de acordo com a invenção pode ser preparada convencionalmente tendo em vista a sua administração localmente, parenteralmente ou por via digestiva. Em particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus da varíola ou vetor recombinante da invenção é combinada com um excipiente farmaceuticamente aceitável. É possível considerar um número grande de vias de administração. Exemplos que podem ser mencionados são vias intragástrica, subcutânea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar e intratraqueal. No caso destas três últimas modalidades, é vantajosa a administração ocorrer por meio de um aerossol ou por meio de instilação. A administração pode ocorrer como uma dose única ou como uma dose que é repetida em uma ou mais ocasiões após um intervalo de tempo particular. A via de administração e a dosagem particulares variam dependendo de uma variedade de parâmetros, por exemplo o indivíduo, a doença a ser tratada ou o(s) gene(s) de interesse a ser(em) transferido(s). As preparações baseadas em partículas virais de acordo com a invenção podem ser formuladas na forma de doses de entre 104 e 1014 pfu (unidades formadoras de placa), vantajosamente 105 e 1013 pfu, preferivelmente 106 e 1012 pfu, mais preferivelmente 106 e 107.

[065] A composição também pode incluir um diluente, um adjuvante ou um excipiente que é aceitável do ponto de vista farmacêutico, bem como agentes de solubilização, estabilizadores e conservantes. No caso de administração injetável, preferência é dada a uma formulação em uma solução aquosa, não-aquosa ou isotônica. Ela pode ser apresentada como uma dose única ou múltiplas doses, em forma líquida ou seca (pó, liofilizado, etc.) que pode ser reconstituída no momento de uso utilizando um diluente apropriado.

[066] A presente invenção também se refere ao uso de um vírus da varíola ou uma composição de acordo com a invenção para preparar um medicamento que é intencionado para tratar o corpo humano ou animal por terapia genética. O medicamento pode ser administrado diretamente in vivo (por exemplo por injeção intravenosa, em um tumor acessível, nos pulmões por meio de aerossol, no sistema vascular usando um cateter apropriado, etc.). Um uso preferido consiste em tratar ou prevenir cânceres, tumores e doenças que resultam de proliferação celular indesejada. Aplicações concebíveis que podem ser mencionadas são cânceres da mama, do útero (em particular aqueles induzidos pelo papiloma vírus), da próstata, do pulmão, da bexiga, do fígado, do cólon, do pâncreas, do estômago, do esôfago, da laringe, do sistema nervoso central (e.g. glioblastoma) e do sangue (linfomas, leucemia, etc.). Um outro uso preferido consiste em tratar ou prevenir artrite reumatóide, osteoporose e outras doenças associadas com uma atividade de osteoclasto aumentada. Também pode ser usada no contexto de doenças cardiovasculares, por exemplo com o propósito de inibir ou retardar a proliferação das células de músculo liso da parede de vaso sanguíneo (restenose). Finalmente, no caso de doenças infecciosas, é possível conceber que o medicamento seja aplicado para AIDS.

[067] Quando o vírus da varíola, a composição ou o método da invenção é usado(a) para o tratamento de câncer, a via de administração preferida é a via sistêmica porque o vírus da varíola de acordo com a invenção é capaz de especificamente selecionar as células tumorais.

[068] A invenção também se estende a um método para tratar doenças caracterizadas pelo fato de que um vírus da varíola, uma composição de acordo com a invenção é administrado(a) a um organismo hospedeiro ou a uma célula hospedeira que está em necessidade de tal tratamento.

[069] De acordo com uma modalidade vantajosa, o uso terapêutico ou o método de tratamento também compreende uma etapa adicional na qual quantidades farmaceuticamente aceitáveis de uma pró- droga, vantajosamente um análogo de citosina, em particular 5-FC, são administradas ao organismo hospedeiro ou à célula hospedeira. Por meio de ilustração, é possível usar uma dose de 50 a 500 mg/kg/dia, com uma dose de 200 mg/kg/dia ou de 100 mg/kg/dia sendo preferida. Dentro do contexto da presente invenção, a pró-droga é administrada de acordo com prática padrão (e.g. per os, sistematicamente).

[070] Preferivelmente, a administração ocorre subsequente à administração do agente terapêutico de acordo com a invenção, preferivelmente pelo menos 3 dias, mais preferivelmente pelo menos 4 dias e ainda mais preferivelmente pelo menos 5 dias após a administração do agente terapêutico. De acordo com uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a administração da pró-droga ocorre 7 dias após a administração do agente terapêutico. A via oral é preferida. É possível administrar uma dose única de pró-droga ou doses que são repetidas por um tempo que é suficientemente longo para permitir que o metabólito tóxico seja produzido dentro do organismo hospedeiro ou da célula hospedeira.

[071] Ademais, a composição ou o método de acordo com a invenção pode ser combinada(o) com uma ou mais substâncias que potencializam o efeito citotóxico de 5-FU. Menção pode ser feita em particular às drogas que inibem as enzimas da via para a biossíntese de novo das pirimidinas (por exemplo daquelas mencionadas abaixo), drogas tais como Leucovorin (Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685692), que, na presença do produto do metabolismo de 5-FU (5-FdUMP), aumenta a inibição de timidilato sintase, resultando em um decréscimo na coleção de dTMP, que é exigido para replicação, e finalmente drogas tais como metotrexato (Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137) que, por inibição de di-hidro-folato-redutase e aumento da coleção de PRPP (fosfo- ribosil-pirofosfato), ocasiona um aumento na incorporação de 5-FU no RNA celular.

[072] De acordo com a presente invenção, as drogas que inibem as enzimas da via para a biossíntese de novo das pirimidinas são preferivelmente selecionadas do grupo consistindo de PALA (N-(fosfono- acetil)-L-aspartato; Moore et al., 1982, Biochem. Pharmacol. 31, 3317-3321), Leflunomide, A771726 (metabólito ativo de Leflunomide; Davis et al., 1996, Biochem. 35, 1270-1273) e Brequinar (Chen et al., 1992, Cancer Res. 52, 3251-3257).

[073] A composição ou o método de acordo com a invenção pode ser combinada(o) com uma ou mais substâncias eficazes em terapia de anticâncer. Entre as substâncias farmacêuticas eficazes em terapia de anticâncer que podem ser usadas em associação com ou em combinação com as composições de acordo com a invenção,podem ser mencionadas agentes de alquilação tais como, e.g., mitomicina C, ciclofosfamida, busulfan, ifosfamida, isosfamida, melfalan, hexametil-melamina, tiotepa, clorambucil, ou dacarbazina; antimetabólitos tais como, e.g., gencitabina, capecitabina, 5- fluoro-uracil, citarabina, 2-fluoro-desóxi-citidina, metotrexato, idatrexato, tomudex ou trimetrexato; inibidores de topoisomerase II tais como, e.g., doxorubicina, epirubicina, etoposide, teniposide ou mitoxantrona; inibidores de topoisomerase I tais como, e.g., irinotecan (CPT-11), 7-etil-10-hidróxi- camptotecina (SN-38) ou topotecan; drogas antimitóticas tais como, e.g., paclitaxel, docetaxel, vimblastina, vincristina ou vinorelbina; e derivados de platina tais como, e.g., cisplatina, oxaliplatina, espiroplatinum ou carboplatinum.

[074] As composições ou os métodos de acordo com a invenção também podem ser usadas(os) em combinação com radioterapia.

[075] As composições ou os métodos de acordo com a invenção também podem ser usados em combinação com um ou mais outros agentes incluindo mas não limitados a agentes imunomodulatórios tais como, e.g. alfa, beta ou gama interferon, interleucina (em particular IL-2, IL-6, IL- 10 ou IL-12) ou fator de necrose tumoral; agentes que afetam a regulação de receptores de superfície celular tais como, e.g. inibidores de Receptor de Fator de Crescimento Epidermal (em particular cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, gefitinib, erlotinibou lapatinib) ou inibidores de Receptor-2 de Fator de Crescimento Epidermal de Humano (em particular trastuzumab); e agentes que afetam angiogênese tais como, e.g. inibidor de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (em particular bevacizumabou ranibizumab).

Descrição Breve de Figuras nos Desenhos

[076] Figura 1.Sensibilidades in vitro a 5-FC de células de tumor colorretal de humano infectadas com vírus de vacínia (LoVo). Células LoVo, infectadas em um MOI de 0,0001 com os vírus indicados (falso (•) VVTK-/FCU1 (■) ou VVTK-I4L-/FCU1 (△)) foram expostas a várias concentrações de 5-FC. Sobrevivência celular foi medida em dia 5 após a infecção. Resultados foram expressados em percentagem de viabilidade celular na presença ou não de drogas. Valores são representados em média ± SD de três determinações individuais sem a mortalidade celular devido à replicação dos vírus.

[077] Figura 2.Sensibilidades in vitro a 5-FC de células de tumor colorretal de humano infectadas com vírus de vacínia (LoVo). Células LoVo, infectadas em um MOI de 0,0001 com os vírus indicados (falso (•) VVTK-/FCU1 (■) ou VVTK-F4L-/FCU£)θ foram expostas a várias concentrações de 5-FC. Sobrevivência celular foi medida em dia 5 após a infecção. Resultados foram expressados em percentagem de viabilidade celular na presença ou não de drogas. Valores são representados em média ± SD de três determinações individuais sem a mortalidade celular devido à replicação dos vírus.

[078] Figura 3. Eficácia de replicação in vitro de VVTK- /FCU1 e VVTK-I4L-/FCU1 em LoVo infectada em um MOI de 0,0001 com os vírus indicados em dia 5 após infecção. Valores são representados em média ± SD de três determinações individuais.

[079] Figura 4. Eficácia de replicação in vitro de VVTK- /FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 em LoVo infectada em um MOI de 0,0001 com os vírus indicados em dia 5 após infecção. Valores são representados em média ± SD de três determinações individuais.

[080] Figura 5. Volume médio de tumor ± SEM de s.c LoVo em camundongos nus Suíços após injeção i.v. de vírus. 7 dias após inoculação com tumor (tumor palpável), camundongos foram tratados por 107 pfu de tampão + solução salina (◊), tampão + 5-FC (♦), VVTK-I4L-/FCU1 + solução salina (△) ou VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (▲). Os animais foram tratados por solução salina ou 5-FC a 100 mg/kg/j duas vezes ao dia por gavagem oral, 7 dias após injeção de vírus durante 3 semanas. Volume de tumor foi medido duas vezes por semana.

[081] Figura 6. Volume médio de tumor ± SEM de s.c LoVo em camundongos nus Suíços após injeção i.v. de vírus. 7 dias após inoculação com tumor (tumor palpável), camundongos foram tratados por 107 pfu de tampão + solução salina (◊), tampão + 5-FC (♦), VVTK-F4L-/FCU1 + solução salina (□) ou VVTK-F4L-/FCU1 + 5-FC (■). Os animais foram tratados por solução salina ou 5-FC a 100 mg/kg/j duas vezes ao dia por gavagem oral, 7 dias após injeção de vírus durante 3 semanas. Volume de tumor foi medido duas vezes por semana.

[082] Figura 7. Volume médio de tumor ± SEM de s.c LoVo em camundongos nus Suíços após injeção i.v. de vírus. 11 dias após inoculação com tumor (tumor palpável), camundongos foram tratados por tampão + H2O (◊), ou tampão + 5-FC (♦), ou uma injeção de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O (o), ou uma injeção de 107 pfu de VVTK-I4L- /FCU1 + 5-FC (5-FC administrada 7 dias após injeção de vírus e durante 3 semanas) (•), ou duas injeções (dia 11 e dia 33) de 107 pfu de VVTK-I4L- /FCU1 + H2O (□), ou duas injeções (dia 11 e dia 33) de 107 pfu de VVTK- I4L-/FCU1 + 5-FC (5-FC administrada de dia 18 ao dia 32 e de dia 40 ao dia 54) (■). Os animais foram tratados por 5-FC a 100 mg/kg duas vezes ao dia por gavagem oral. Volume de tumor foi medido duas vezes por semana.

[083] Figura 8. Volume médio de tumor ± SEM de s.c U87-MG (células de tumor de glioblastoma) em camundongos nus Suíços após injeção i.v. de vírus. 11 dias após inoculação com tumor (tumor palpável), camundongos foram tratados por tampão + H2O (◊), ou tampão + 5-FC (♦), ou 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O (o), ou 107 pfu de VVTK- I4L-/FCU1 + 5-FC (•). Os animais foram tratados por 5-FC a 100 mg/kg duas vezes ao dia por gavagem oral, 7 dias após injeção de vírus e durante 3 semanas. Volume de tumor foi medido duas vezes por semana.

[084] Figura 9. Razão de rendimento de vírus em células se dividindo versus em células confluentes. Células PANC1 (tumor pancreático de humano), H1299 (tumor pulmonar de humano) ou U118MG (tumor de glioma de humano) são infectadas com 100 pfu de (I) VVTK- /FCU1 ou (□) VVTK-I4L-/FCU1. 48h após infecção, títulos virais foram determinados. Valores são a razão entre rendimentos de vírus em células se dividindo versus em células confluentes.

[085] Figura 10. Razão de rendimento de vírus em células se dividindo versus em células confluentes. Células PANC1 (tumor pancreático de humano), H1299 (tumor pulmonar de humano) ou U118MG (tumor de glioma de humano) são infectadas com 100 pfu de (I) VVTK- /FCU1 ou (□) VVTK-F4L-/FCU1. 48h após infecção, títulos virais foram determinados. Valores são a razão entre rendimentos de vírus em células se dividindo versus em células confluentes.

[086] Figura 11. Títulos virais (pfu/mg de tecido) em órgãos ou tumores em dia 6 e dia 21 após injeção i.v. em camundongos nus Suíços possuindo tumores subcutâneos de humano com 1x106 Pfu de VVTK- /FCU1 (I) ou VVTK-I4L-/FCU1 (□).

[087] Figura 12. Títulos virais (pfu/mg de tecido) em órgãos ou tumores em dia 6 e dia 21 após injeção i.v. em camundongos nus Suíços possuindo tumores subcutâneos de humano com 1x106 Pfu de VVTK- /FCU1 (I) ou VVTK-F4L-/FCU1 ().

[088] Figura 13. Sobrevivência de camundongos nus Suíços após tratamento com 1x108 pfu de VVTK-/FCU1 (■) ou VVTK-I4L- /FCU1 (O) por injeção i.v..

[089] Figura 14. Sobrevivência de camundongos B6D2 imunocompetentes após tratamento com 1x107 pfu (A) ou 1x108 pfu (B) de VVTK-/FCU1 (■) ou VVTK-I4L-/FCU1 (◊) por injeção i.v..

[090] Figura 15. Quantidade média de pústulas sobre caudas após injeção i.v. de 1x106 pfu de VVTK-/FCU1 ou VVTK-I4L-/FCU1 em camundongos nus Suíços em dia 13 após infecção e em dia 34 após infecção.

[091] Figura 16. Quantidade média de pústulas sobre caudas após injeção i.v. de 1x106 pfu de VVTK-/FCU1 ou VVTK-F4L- /FCU1 em camundongos nus Suíços em dia 13 após infecção e em dia 34 após infecção.

[092] Figura 17. Quantidade média de pústulas sobre caudas após injeção i.v. de 1x107 pfu de VVTK-/FCU1 ou VVTK-I4L-/FCU1 em camundongos nus Suíços em dia 15 após infecção e em dia 31 após infecção.

[093] Figura 18. Quantidade média de pústulas sobre caudas após injeção i.v. de 1x107 pfu de VVTK-/FCU1 ou VVTK-F4L- /FCU1 em camundongos nus Suíços em dia 15 após infecção e em dia 31 após infecção.

Modo(s) de Realizar a Invenção Exemplos Construção de plasmídeos vetores

[094] Um vetor bifuncional para deletar I4L foi construído usando o DNA da cepa Copenhagen do vírus de vacínia (número de acesso M35027) deletado em gene de timidina-quinase e expressando o gene FCU1 sob o controle do promotor sintético de vacínia p11K7.5. As regiões flanqueadoras de DNA de I4L foram amplificadas por PCR. Iniciadores da região flanqueadora a jusante de I4L foram 5’- TCC CCC GGG TTA ACC ACT GCA TGA TGT ACA -3’ (SEQ ID N°:7; sítio SmaI sublinhado) e 5’- GCC GAG CTC GAG GTA GCC GTT TGT AAT TCT -3’ (SEQ ID N°:8; sítio SacI sublinhado). Iniciadores para a região a montante foram 5’- GCC TGG CCATAA CTC CAG GCC GTT - 3’ (SEQ ID N°:9; sítio MscI sublinhado) e 5’ - GCC CAG CTG ATC GAG CCG TAA CGA TTT TCA - 3’ (SEQ ID N°:10; sítio PvuII sublinhado). O fragmento de DNA amplificado foi digerido com enzima de restrição SmaI/SacI ou MscI/PvuII e ligado nos sítios correspondentes em plasmídeo PpolyIII. Uma região de repetição da região flanqueadora a jusante de I4L foi amplificada por PCR usando os iniciadores 5’- GCC GCA TGCATC CTT GAA CAC CAA TAC CGA - 3’ (SEQ ID N°:11; sítio SphI sublinhado) e 5’- GCT CTA GAG AGG TAG CCG TTT GTA ATC TG - 3’ (SEQ ID N°:12; sítio XbaI sublinhado) e inserido em plasmídeo PpolyIII. A região de repetição é usada para eliminar o cassete de seleção durante a produção de vírus deletados. O cassete de seleção, correspondendo ao gene de fusão GFP/GPT sob o controle do promotor pH5R de vacínia, foi inserido no sítio SacI/SphI em plasmídeo PpolyIII. O plasmídeo obtido é o plasmídeo bifuncional recombinante chamado de pΔI4L para deleção de gene I4L.

[095] Um vetor bifuncional para deletar F4L foi construído usando o DNA da cepa Copenhagen do vírus de vacínia (número de acesso M35027). As regiões flanqueadoras de DNA de F4L foram amplificadas por PCR. Iniciadores da região flanqueadora a jusante de F4L foram 5’- CGC GGA TCC TTT GGT ACA GTC TAG TAT CCA - 3’ (SEQ ID N°:13; sítio BamHI sublinhado) e 5’ - TCC CCC GGG TTA TAA CAG ATG CAG TAT CCA - 3’ (SEQ ID N°:14; sítioSmaI sublinhado). Iniciadores para a região a montante foram 5’- GCC CAG CTG TTC AAT GGC CAT CTG AAA TCC - 3’ (SEQ ID N°:15; sítio PvuII sublinhado) e 5’- GAA GAT CTA GTA TCG CAT CTA AAA GAT GG - 3’ (SEQ ID N°:16; sítio BglII sublinhado). O fragmento de DNA amplificado foi digerido com enzima de restrição BamHI/SmaI ou BglII/PvuII e ligado nos sítios correspondentes em plasmídeo PpolyIII. Uma região de repetição da região flanqueadora a jusante de I4L foi amplificada por PCR usando os iniciadores 5’- GCC GAG CTCACC CAC ACG TTT TTC GAA AAA - 3’ (SEQ ID N°:17; sítio SacI sublinhado) e 5’- GCC GCA TGCTTA TAA CAG ATG CAG TAT CAA - 3’ (SEQ ID N°:18; sítio SphI sublinhado) e inserido em plasmídeo PpolyIII. A região de repetição é usada para eliminar o cassete de seleção durante a produção de vírus deletados. O cassete de seleção, correspondendo ao gene de fusão GFP/GPT sob o controle do promotor pH5R de vacínia, foi inserido no sítio SacI/SmaI em plasmídeo PpolyIII. O plasmídeo obtido é o plasmídeo bifuncional recombinante chamado de pΔF4L para deleção de gene F4L. A geração de vírus de vacínia recombinantes.

[096] Células CEF infectadas com VVTK-FCU1(vírus de vacínia, defectivo para o gene J2R Quinase, expressando o gene FCU1 sob o controle do promotor sintético p11k7.5) cepa Copenhagen em um MOI de 0,1 e incubadas a 37°C por 2 h, então transfectadas com um coprecipitado em CaCl2 do plasmídeo bifuncional recombinante (0,2 μg). As células foram incubadas por 48 h a 37°C. Diluições de vírus emergindo foram então usadas para infectar as células CEF em meio de seleção contendo Hipoxantina em concentração final de 15 μg/ml, xantina em concentração final de 250 μg/ml e ácido micofenólico em concentração final de 250 μg/ml. Placas fluorescentes (GFP) e positivas (seleção de GPT) foram isoladas e selecionadas para várias rodadas de seleção em células CEF na presença de meio de seleção GPT. A presença ou não de VVTK-FCU1 foi determinada por 40 ciclos de PCR com iniciadores dentro da região de deleção. Após a eliminação de vírus parental, o vírus deletado duplo foi usado para infectar CEF sem meio de seleção GPT para eliminar o cassete de seleção. Placas não-fluorescentes foram isoladas e selecionadas por 2 ciclos em CEF. Vírus VV recombinantes finais foram amplificados em CEF, purificados e estoques virais foram titulados em CEF por ensaio de placa. Sensibilidade celular in vitro a 5-FC.

[097] Células de tumor de humano foram transduzidas pelo respectivo VV recombinante em um MOI de 0,0001. Um total de 3 x 105 de células/cavidade foi plaqueado em placas de cultura de 6 cavidades em 2 mL de meio contendo várias concentrações de 5-FC. Células foram então cultivadas a 37°C por 5 dias, e as células viáveis foram contadas por exclusão de azul de tripano. Resultados mostrados em Figuras 1, 2, 3 e 4 mostram que a atividade de FCU1 é equivalente em vírus defectivos para o gene J2R do que em vírus defectivos para os genes I4L e J2R ou do que em vírus defectivos para os genes F4L e J2R.

Replicação in vitro em células cultivadas.

[098] Células se dividindo ou confluentes foram infectadas, em placas de 6 cavidades, a 100 Pfu de vírus (quase MOI 0,0005). 2 mL de meio suplementado com 10% de FCS para células se dividindo e não suplementado para células confluentes foram adicionados. As células foram colhidas em 48 horas após infecção. As células foram armazenadas a -200°C e sonicadas para liberar o vírus, o vírus também foi quantificado por titulação em placa sobre células CEF. A razão entre replicação em células se dividindo e células confluentes é similar em todas as células. Ambos os vírus VVTK- /FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 replicam-se mais em células se dividindo do que em células confluentes.

[099] Como um meio indireto para ensaiar especificidade de vírus de replicação, o rendimento de vírus produzido em células de tumor se dividindo versus células de tumor confluentes (tumor pancreático de humano PANC1; tumor pulmonar de humano H1299; tumor de glioma de humano U118MG) foi determinado. Células confluentes foram plaqueadas a 1x106células/cavidade e cultivadas em meio completo por 7 dias então 1 dia antes da infecção as células foram lavadas e cultivadas em meio sem soro. Células se dividindo foram plaqueadas a 3x105células/cavidade um dia antes da infecção. Para avaliar o nível de divisão celular, a quantidade de timidina titulada incorporada no ácido nucleico foi medida 5 horas, 24 horas e 48 horas após a plaqueamento das células. Durante este período a incorporação de timidina foi relativamente constante em células confluentes enquanto que em células se dividindo foi visto no decorrer do tempo um aumento em incorporação. Então as células foram infectadas com 100 pfu de vírus, e 48h após a infecção a razão entre o rendimento de vírus produzido em células de tumor se dividindo e em células de tumor confluentes foi determinada por titulação em placa em CEF. Resultados mostrados em figuras 9 e 10 mostram que ambos os vírus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 replicam-se mais em células se dividindo do que em células confluentes. Resultados mostrados em figuras 9 e 10 mostram além disso um aumento de razão em todos os tipos diferentes de células para ambos os vírus VVTK-I4L- /FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 por comparação com VVTK-/FCU1. Este aumento de razão em todos os tipos diferentes de células é devido a uma replicação menor de ambos os vírus VVTK-I4L-/FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 em células confluentes. Estes resultados demonstram que ambos os vírus VVTK-I4L-/FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 exibem uma especificidade aumentada para células em divisão comparados com VVTK-/FCU1.

Modelo de tumor subcutâneo.

[0100] Camundongos nus fêmeas Suíços foram obtidos de Charles River Laboratories. Animais usados nos estudos foram uniformes em idade (6 semanas) e pesos corporais variaram de 23-26 g. Camundongos nus Suíços foram injetados subcutaneamente (s.c.) no flanco com 5x106 de células LoVo. Quando os tumores alcançaram um diâmetro [sic] de 50-70 mm3, os camundongos foram randomizados em uma maneira cega e tratados com os vetores indicados para os experimentos in vivo.

Biodistribuição dos vírus.

[0101] A presença dos vários vírus foi avaliada por titulação de vírus em amostras de tumor e de órgãos. 1x106 Pfu de VV-FCU1 ou VVTK-I4L-/FCU1 ou VVTK-F4L-/FCU1 foram injetadas intravenosamente (i.v.) por injeção em veia de cauda nos camundongos nus possuindo tumores s.c. LoVo estabelecidos. Camundongos foram mortos em instantes de tempo indicados, e os tumores e os órgãos foram colhidos e pesados. Tumores e órgãos foram homogeneizados em PBS e títulos foram determinados em CEF como previamente descrito. Títulos virais foram padronizados para miligrama de tecido. Títulos virais foram padronizados para miligrama de tecido. Resultados mostrados em Tabelas 2, 3, 4 e 5 (a faixa de títulos de vírus é apresentada em pfu/mg de tecido) mostram que após 14 dias o vírus de acordo com a invenção é principalmente encontrado no tumor. Resultados mostrados em figuras 11 e 12 mostram que ambos os vírus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 selecionam o tumor com cerca de 1.000 a 10.000 vezes mais vírus no tumor do que nos outros órgãos analisados exceto no caso de VVTK-/FCU1. Uma quantidade pequena de VVTK-/FCU1 é detectada em pulmões, baço, rim, e linfonodos (menos do que 10 pfu/mg) e mais em pele, cauda e medula óssea em dia 6, e pele e causa em dia 21. Em contraste, ambos VVTK-I4L-/FCU1 e VVTK- F4L-/FCU1 têm especificidade para tumor mais alta com apenas uma quantidade pequena em linfonodos e cauda em dia 6, e apenas em tumor em dia 21. Tabela 2

Tabela 3

Tabela 4

Tabela 5

[0102] Atividade de antitumor do vírus da varíola da invenção em modelo de tumor s.c.

[0103] Camundongos nus possuindo tumores s.c. LoVo estabelecidos (50-70 mm3) foram tratados uma vez intravenosamente (por veia de cauda) com os vetores indicados em dose de 1,107 PFU, respectivamente. Partindo do dia 7 após a infecção viral, 5-FC foi dada por gavagem oral a 100 mg/kg (0,5 ml 5-FC 0,5% em água) duas vezes ao dia por 3 semanas. Tamanho de tumor foi medido duas vezes por semana usando compassos de calibre. Volume de tumor foi calculado em mm3 usando a fórmula (π/6) (comprimento x largura2). Os resultados mostrados em Figuras 5 e 6 mostram que os vários vírus têm uma mesma eficácia com uma atividade oncolítica (p<0,05) capaz de controlar o crescimento de tumor, e uma atividade combinada (oncolítica do vírus e terapêutica do gene FCU1) com administração de 5-FC que pode adicionalmente melhorar o controle do crescimento de tumor (p<0,01).

[0104] Camundongos nus possuindo tumores s.c. LoVo estabelecidos (50-70 mm3) foram também tratados intravenosamente (por veia da cauda) com os vetores indicados em dose de 1,107 PFU de acordo com o seguinte: 11 dias após inoculação com tumor (tumor palpável), camundongos foram tratados por tampão + H2O, ou tampão + 5-FC, ou uma injeção de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O, ou uma injeção de 107 pfu de VVTK-I4L- /FCU1 + 5-FC (5-FC administrada 7 dias após injeção de vírus e durante 3 semanas), ou duas injeções (dia 11 e dia 33) de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O, ou duas injeções (dia 11 e dia 33) de 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (5-FC administrada de dia 18 ao dia 32 e de dia 40 ao dia 54). Os animais foram tratados por 5-FC a 100 mg/kg duas vezes ao dia por gavagem oral. Tamanho de tumor foi medido duas vezes por semana usando compassos de calibre. Volume de tumor foi calculado em mm3 usando a fórmula (π/6) (comprimento x largura2). Os resultados mostrados em Figura 7 mostram nenhuma atividade antitumoral de vírus sozinho após uma ou duas injeções. A adição de tratamento 5-FC mostra inibição estatisticamente significativa de crescimento de tumor (p<0,05) quando comparado com os grupos de veículo e vírus sozinho (sem 5-FC) até dia 50. Como com uma única injeção, duas injeções i.v. de VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC demonstram uma atividade antitumoral significativa quando comparadas com grupos de veículo e duas injeções de vírus sozinho (sem 5-FC) (p<0,05). Além disso, uma diferença significativa sobre evolução de tumor é observada a partir do dia 56 entre uma e duas injeções de vírus em combinação de tratamento com 5-FC (p<0,05).

[0105] Camundongos nus possuindo s.c. U87-MG estabelecido (células de tumor de glioblastoma) foram tratados intravenosamente (por veia de cauda) com os vetores indicados em dose de 1,107 PFU de acordo com o seguinte: 11 dias após inoculação com tumor (tumor palpável), camundongos foram tratados por tampão + H2O, ou tampão + 5-FC, ou 107 pfu de VVTK-I4L-/FCU1 + H2O, ou 107 pfu de VVTK-I4L- /FCU1 + 5-FC. Os animais foram tratados por 5-FC a 100 mg/kg duas vezes ao dia por gavagem oral, 7 dias após injeção de vírus e durante 3 semanas. Tamanho de tumor foi medido duas vezes por semana usando compassos de calibre. Volume de tumor foi calculado em mm3 usando a fórmula (π/6) (comprimento x largura2). Os resultados mostrados em Figura 8 mostram uma atividade oncolítica alta das células VVTK-I4L-/FCU1 em U87-MG que resulta em uma atividade antitumoral elevada (p<0,0001). A atividade combinada com adição de 5-FC, por gavagem oral, resulta em atividade similar (p<0,0001). Patogenicidade viral.

[0106] Patogenicidade viral foi avaliada com estudos de sobrevivência feitos em ambos camundongos nus Suíços (Figura 13) e camundongos B6D2 imunocompetentes (Figura 14). Camundongos foram injetados I.V. com 1,107 ou 1,108 Pfu de todos VVTK-/FCU1 e VVTK-I4L- /FCU1 em 100 μL de tampão por camundongo. camundongos foram observados diariamente durante todo o curso do experimento. Em camundongos nus Suíços (Figura 13), a injeção de 1x108 Pfu de VVTK- /FCU1 resulta na morte de 40% dos animais 3 dias após a infecção. Os camundongos restantes morreram entre dia 50 e dia 80 após a infecção. A administração de VVTK-I4L-/FCU1 foi menos patogênica, a maioria dos animais morreu entre dia 65 e 140 (p<0,01). Nenhuma evidência de toxicidade tem sido observada com ambos os vírus a 107 pfu (Figura 14 (A)). Todos os camundongos morreram após injeção i.v. de 108 pfu de VVTK- /FCU1 (Figura 14 (B)). O grupo de tratamento de VVTK-I4L-/FCU1 teve sobrevivência significativamente prolongada em 70% comparado com os camundongos infectados com VVTK-/FCU1 (Figura 14 (B)). Portanto, este resultado demonstra o decréscimo de toxicidade com o vírus duplo-deletado VVTK-I4L-/FCU1.

Modelo de lesão de cauda de pústulas.

[0107] Camundongos nus Suíços foram injetados I.V. com 1,106(figuras 15 e 16) ou 1,107 (figuras 17 e 18) Pfu de cada vírus. Lesões em cauda foram enumeradas uma vez por semana. Camundongos injetados com 1,106 Pfu de VVTK-I4L-/FCU1 ou VVTK-F4L-/FCU1 têm menos do que 1 pústula/camundongo comparados com camundongos injetados com VVTK- /FCU1 com uma média de 8 pústulas por camundongo em dia 13 após infecção (p<0,001) como mostrado em Figura 15 (A) e Figura 16 (A). Os resultados são similares em dia 34 após infecção com uma média de 4 pústulas com VVTK-/FCU1 comparados com quase 1 para VVTK-I4L- /FCU1 ou VVTK-F4L-/FCU1 (p<0,0001) como mostrado em Figura 15 (B) e Figura 16 (B). Camundongos injetados com 1,107 Pfu de VVTK-I4L-/FCU1 ou VVTK-F4L-/FCU1 têm respectivamente uma média de 3 pústulas/camundongo e 2 pústulas/camundongo comparados com camundongos injetados com 1,107 Pfu de VVTK-/FCU1 tendo uma média de10 pústulas/camundongo em dia 15 após infecção (Figura 17 (A) e Figura 18 (A)). Em dia 31 após infecção camundongos injetados com VVTK-I4L- /FCU1 ou VVTK-F4L-/FCU1 têm respectivamente uma média de 1,5 pústulas/camundongo e 2 pústulas/camundongo comparados com camundongos injetados com VVTK-/FCU1 tendo uma média de7 pústulas/camundongo (Figura 17 (B) e Figura 18 (B)). A diferença em número de pústulas entre VVTK-/FCU1 e ambos VVTK-I4L-/FCU1 e VVTK-F4L-/FCU1 é estatisticamente significativa(p<0,01). A formação de pústula está correlacionada com a replicação de vírus na cauda e assim com a virulência e a toxicidade. Injeção em i.v. de VVTK-I4L-/FCU1 ou VVTK- F4L-/FCU1 é menos tóxica do que com a vírus TK deletado único.

Análise estatística

[0108] Análises estatísticas foram realizadas usando teste- U de Mann-Whitney não-paramétrico e programa de computador e STATISTICA 7.1 (StatSoft, Inc). Um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Referências • US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15.11.1994 • WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US) ) 19.02.2004 • WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US) ) 19.02.2004 • US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15.11.1994 • WO 93/01281 (US HEALTH) • WO 2005/007857 • WO 2005/007857 • EP 0998568 A • EP 0998568 A • EP 0998568 A • EP 0998568 A • WO 96/16183 • EP 0998568 A • EP 0998568 A • WO 2006/048768 • HERMISTON. A demand for next-generation oncolytic adenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.322-30. • FISHER. Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.301-13. • CHERNAJOVSKY, et al. Fighting cancer with oncolytic viruses. 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Claims (19)

1. Uso de um poxvírus oncolítico compreendendo um gene I4L e/ou F4L defectivo ou uma composição compreendendo o mesmo, caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratamento de câncer.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dito o poxvírus adicionalmente compreende um gene J2R defectivo.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dito o poxvírus adicionalmente compreende um gene F2L defectivo.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que dito o poxvírus pertence à subfamília Chordopoxvirinae.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que o dito poxvírus pertence à espécie do vírus Vacínia.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o dito poxvírus é uma cepa Copenhagen do vírus Vacínia.

7. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o dito poxvírus é uma cepa WR do vírus Vacínia.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadopelo fato de que o dito poxvírus compreende ainda um gene suicida.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o dito gene suicida codifica uma proteína tendo pelo menos uma atividade de citosina-desaminase.

10. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o dito gene suicida codifica uma proteína tendo pelo menos uma atividade de uracil-fosfo-ribosil-transferase.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito gene suicida é FCY1, FCA1 ou CodA ou um análogo do mesmo.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que dita proteína tendo pelo menos uma atividade de citosina- desaminase é o polipeptídeo FCU1-8 representado no identificador de sequência SEQ ID N°:2 e análogos do mesmo.

13. Uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que dito gene suicida codifica uma proteína tendo pelo menos uma atividade de citosina-desaminase e uma atividade de uracil-fosfo-ribosil- transferase.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que dito gene suicida codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como representada no identificador de sequência SEQ ID N°:3 (coda::upp), SEQ ID N°:1 (FCU1) ou a sequência de aminoácidos de FCY1::FUR1.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito poxvírus adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucléico compreendendo um gene codificador de uma permease.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a permease é uma purina ou uma citosina permease de S. cerevisiae.

17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a permease é escolhida do grupo compreendendo FCY2 e Fur4 e análogos do mesmo.

18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito poxvírus adicionalmente compreende os elementos necessários para a expressão do gene suicida.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o dito poxvírus adicionalmente compreende os elementos necessários para a expressão da permease.

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