ES2768715T3 - Vectores oncolíticos poxvíricos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un poxvirus oncolítico que comprende un gen deficiente que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa (I4L) y/o la subunidad pequeña de la ribonucleótido reductasa (F4L) y un gen deficiente que codifica la timidina quinasa (J2R) y que además comprende un gen suicida para uso en tratar cáncer en combinación con una o más sustancias eficaces en terapia anticáncer, en donde la una o más sustancias eficaces en la terapia anticáncer se seleccionan de irinotecano y oxaliplatino.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores oncolíticos poxvíricos

Campo técnico

Los virus oncolíticos son una clase de agentes terapéuticos novedosos usados para el tratamiento de cáncer que tienen la propiedad única de autoperpetuación dependiente del tumor (HERMISTON. A demand for next-generation oncolytic adenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.322-30). Los virus oncolíticos son capaces de replicación selectiva en células malignas y por tanto ofrecen niveles de potencia y especificidad que son potencialmente mucho mayores que los tratamientos convencionales contra el cáncer (FISHER. Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.301-13). El beneficio de usar estos virus es que según se replican, lisan sus células huéspedes. Las células cancerosas son huéspedes ideales para muchos virus porque tienen la ruta del interferón antivírico inactivada o tienen genes supresores de tumores mutados que permiten que la replicación vírica prosiga sin estorbos (CHERNAJOVSKY, et al. Fighting cancer with oncolytic viruses. British medicaljournal. 2006, vol.332, no.7534, p.170-2).

Algunos virus son capaces de forma natural de replicarse selectivamente en células tumorales, pero también se pueden obtener virus oncolíticos por modificación de virus naturales. Para este fin, las principales estrategias usadas actualmente para modificar los virus incluyen: deleciones funcionales en genes víricos esenciales; promotores específicos de tumor o tejido usados para controlar la expresión de estos genes víricos; y modificación del tropismo para redirigir los adenovirus a la superficie de células cancerosas. En el futuro cercano, se necesita optimizar los adenovirus oncolíticos para entender por completo su potencial como herramientas anticancerosas y, por tanto, mejorar el pronóstico para pacientes con gliomas malignos (JIANG, et al. Oncolytic adenoviruses as antiglioma agents. Expert review of anticancer therapy. 2006, vol.6, no.5, p.697-708).

Por ejemplo, ONYX-015, un adenovirus modificado selectivamente para replicarse en y destruir células que portan mutaciones en p53, está en desarrollo por Onyx Pharmaceuticals para el potencial tratamiento de varios tumores sólidos, incluyendo tumores de cabeza y cuello, gastrointestinales y pancreáticos. Es un adenovirus recombinante que porta una mutación de pérdida de función en el locus E1B, cuyo producto es una proteína de 55 kDa que se une a e inactiva la proteína supresora de tumores p53. Por tanto, se supone que el adenovirus ONYX-015 deja las células normales sin afectar. Las mutaciones en el gen supresor tumoral p53 son el tipo más común de anomalía genética en cáncer, produciéndose en más de la mitad de todos los tipos principales de cáncer. Por tanto, estas células son susceptibles al virus, que se replicará fácilmente y producirá muerte celular. ONYX-015 está en ensayos de fase III en curso para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello recurrente, ensayos de fase II para tumores colorrectales, de ovario, páncreas y boca, y en ensayos de fase I para enfermedades digestivas, tumores del esófago e hígado (COHEN, et al. ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals. Current opinion in investigational drugs. 2001, vol.2, no.12, p.1770-5).

Los virus oncolíticos naturales son virus competentes para replicación que tienen una capacidad innata para infectar y destruir selectivamente células tumorales. A pesar de ser usados en los intentos originales para tratar cáncer con virus vivos hace cinco décadas, el interés en los virus oncolíticos naturales ha sido relegado detrás del apoyo para adenovirus y herpesvirus manipulados como agentes terapéuticos contra el cáncer. Recientemente, sin embargo, ha habido un interés renovado en la alta potencia y selectividad de estos agentes naturales (ROBERTS, et al. Naturally oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.314-21).

Entre los virus oncolíticos naturales, los virus Vaccinia (un Poxviridae) poseen muchos de los atributos clave necesarios para un esqueleto vírico ideal para uso en viroterapia oncolítica. Estos incluyen un ciclo de vida corto, con rápida propagación célula a célula, fuerte capacidad lítica, una gran capacidad de clonación y biología molecular bien definida. Además, aunque capaces de replicarse en células humanas, no se consideran un problema de salud natural y están especialmente bien caracterizados habiéndose administrado a millones de individuos durante la campaña para erradicar la viruela. Los resultados clínicos tempranos usando o bien cepas de vaccinia o cepas de vaccinia genéticamente modificadas han demostrado efectos antitumorales (THORNe , et al. Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer. Current opinion in molecular therapeutics. 2005, vol.7, no.4, p.359-65).

En contraste, el poxvirus virus del mixoma es un candidato oncolítico novedoso que no tiene antecedentes de uso en seres humanos directamente, ya que tiene un tropismo de especie de huésped absoluto a los lagomorfos (conejos). Se ha mostrado recientemente que el virus del mixoma es capaz también de selectivamente infectar y destruir células tumorales humanas, un tropismo único que está ligado a rutas de señalización intracelular disreguladas encontradas en la mayoría de los cánceres humanos. Esta revisión resume el conocimiento existente sobre el tropismo del virus del mixoma para células cancerosas humanas, así como datos preclínicos que muestran su capacidad para infectar y depurar tumores en modelos animales de cáncer (STANFORD, et al. Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cancer. Expert opinion on biological therapy. 2007, vol.7, no.9, p.1415-25).

Problema técnico

La inyección de altas dosis de poxvirus necesarias para alcanzar un efecto antitumoral generó cuestiones de toxicidad. La mayoría de los sucesos adversos son menores, las reacciones adversas que habitualmente se han ligado a virus Vaccinia son autolimitadas e incluyen fiebre, dolor de cabeza, fatiga, mialgia, escalofríos, reacciones cutáneas locales, sarpullidos no específicos, eritema multiforme, linfadenopatía y dolor en el sitio de vacunación. Otras reacciones podrían requerir terapias adicionales (por ejemplo, VIG, una terapia de primera línea y cidofovir, una terapia de segunda línea). Las reacciones adversas que podrían requerir evaluación o terapia adicional incluyen inoculación involuntaria, vaccinia generalizada (VG), eczema vacunal (EV), vaccinia progresiva (PV), enfermedad del sistema nervioso central posvacunal, y vaccinia fetal (CONO, et al. Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR. Recommendations and reports: Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 2003, vol.52, no. RR-4, p.1-28).

Por tanto, hay una necesidad para poxvirus más seguros con una actividad oncolítica tan buena como la de sus homólogos naturales.

Antecedentes técnicos

El documento US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15/11/1994 describe un poxvirus recombinante modificado, más particularmente un virus vaccinia que tiene funciones genéticas codificadas no esenciales inactivadas codificadas por el virus de modo que el poxvirus recombinante tiene virulencia atenuada y seguridad aumentada. En particular, las funciones genéticas se inactivan por deleción de un marco abierto de lectura que codifica un factor de virulencia o por inactivación por inserción de un marco abierto de lectura que codifica un factor de virulencia. Más en particular, esta patente describe un virus vaccinia en el que el marco abierto de lectura para J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, e I4L se ha inactivado. Este virus (Ny Va C) se puede manipular como un vector para un ácido nucleico exógeno y usar como una vacuna para inducir una respuesta inmunológica en un animal huésped. Sin embargo, NYVAC es incapaz de replicarse de forma eficaz en la mayoría de las células de mamíferos y no se puede usar como un virus oncolítico (XIANGZHI, et al. Vaccinia virus K1L protein supports viral replication in human and rabbit cells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that are distinct from its binding site for ACAP2. Journal of virology. 2006, vol.353, no.1, p.220-233).

El documento WO 2004/014314 (KIRN DAVID (EEUU)) 19/02/2004 describe un virus vaccinia alterado que comprende una o más mutaciones en su genoma vírico. Las mutaciones descritas están en una o más de las siguientes clases de polipéptidos: 1) polipéptido que modula interferón; 2) polipéptido de control del complemento; 3) TNF o polipéptido que modula quimioquina; 4) inhibidor de serina proteasa; 5) polipéptido que modula IL-Ip; 6) polipéptidos de forma de EEV no infecciosa; y 7) polipéptido vírico que actúa para inhibir la liberación de virus infeccioso de las células (polipéptido de la forma antiinfecciosa del virus). Además, también se divulgan mutaciones en A41L o C11R del virus vaccinia.

Divulgación de la invención

La presente invención se refiere a un poxvirus oncolítico que comprende un gen deficiente que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa (I4L) y/o la subunidad pequeña de la ribonucleótido reductasa (F4L) y un gen deficiente que codifica la timidina quinasa (J2R) y que comprende además un gen suicida para uso en tratar cáncer en combinación con una o más sustancias eficaces en terapia anticáncer, en donde la una o más sustancias eficaces en la terapia anticáncer se seleccionan de irinotecano y oxaliplatino.

Como se usa a lo largo de la solicitud entera, los términos “un” y “una” se usan en el sentido que significan “al menos un/a”, “al menos un/a primer/a”, “uno/a o más” o “una pluralidad” de los componentes o etapas referenciados, a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por ejemplo, el término “una célula” incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.

El término “y/o” siempre que se usa en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término”.

El término “alrededor de” o “aproximadamente” como se usa en el presente documento significa dentro del 20%, preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado.

Como se usa en el presente documento, los términos “comprender” y “comprende” se pretende que signifiquen que los productos, composiciones y métodos incluyen los componentes o etapas referenciados, pero no excluyen otros. “Consistir esencialmente en” cuando se usa para definir productos, composiciones y métodos, significará excluir otros componentes o etapas de cualquier significación esencial. Por tanto, una composición que consiste esencialmente en los componentes enumerados no excluiría contaminantes traza y soportes farmacéuticamente aceptables. “Consistir en” significará excluir más de los elementos traza de otros componentes o etapas.

Como se usa en el presente documento, el término “poxvirus que comprende un gen deficiente” se refiere a un poxvirus que comprende una deleción, sustitución o adición en uno o más ácidos nucleicos del gen deficiente, o cualquier combinación de estas posibilidades en donde dichas modificaciones producen la incapacidad de que el virus produzca una proteína que tiene la actividad de la proteína producida por el gen sin modificar. En una forma de realización preferida de la invención, un poxvirus que comprende un gen deficiente se refiere a un poxvirus en el que la secuencia génica entera se ha delecionado. La mutación se puede hacer en un número de maneras que conocen los expertos en la materia usando técnicas recombinantes. Los métodos para modificar el genoma de un poxvirus están disponibles en la técnica. Por ejemplo, los métodos divulgados en MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer res. 2001, no.61, p.8751-57, KIM, et al. Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy for cancer with JX-594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF. Molecular Therapeutic. 2006, no.14, p.361-70, documento WO 2004/014314 (KIRN DAVID (EE UU)) 19/02/2004 y documento US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) 15/11/1994 se pueden usar para producir el poxvirus para uso según la invención. Los métodos divulgados en el ejemplo de la presente solicitud son particularmente relevantes para producir un poxvirus para uso según la invención.

Las secuencias del genoma de varios poxvirus están disponibles en la técnica, por ejemplo, los genomas del virus vaccinia, virus de la viruela bovina, virus de la viruela del canario, el virus ectromelia, el virus del mixoma, están disponibles en Genbank (número de registro NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_001132, respectivamente).

Como se usa en el presente documento, el término “poxvirus” se refiere a un virus que pertenece a la familia Poxviridae. Según una forma de realización preferida, el poxvirus según la invención pertenece a la subfamilia Chordopoxviridae, más preferiblemente al género Orthopoxvirus e incluso más preferiblemente a la especie del virus vaccinia.

Por ejemplo, se pueden usar las cepas del virus vaccinia Dairen I, IHD-J, L-IPV, LC16M8, LC16M0, Lister, LIVP, Tashkent, WR 65-16, Wyeth, Ankara, Copenhague, Tian Tan y WR. Según una forma de realización particularmente preferida, el poxvirus para uso según la invención es un virus vaccinia de la cepa Copenhague.

El poxvirus vaccinia contiene un gran genoma de ADN dúplex (187 pares de kilobases) y es un miembro de la única familia conocida de virus ADN que se replica en el citoplasma de células infectadas. Puesto que la célula infectada debe administrar grandes cantidades de precursores de ADN a los sitios de replicación citoplásmicos, el virus codifica y expresa muchas actividades enzimáticas requeridas para el metabolismo y síntesis de ADN, incluyendo ribonucleótido reductasa y desoxiuridina 5'-trifosfato nucleotidohidrolasa (dUTPasa).

La ribonucleótido reductasa (EC 1.17.4.1) cataliza la reducción de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos, una reacción que representa la primera etapa comprometida en la biosíntesis del ADN. La enzima vírica es similar en estructura de subunidades a la enzima de mamíferos, estando compuesta de dos subunidades heterólogas, designadas R1 y R2. Los genes que codifican las subunidades de la ribonucleótido reductasa vírica se han secuenciado y localizado a posiciones en el genoma de vaccinia separadas por 35 kilobases (SLABAUGH, et al. Journal of virology. 1988, vol.62, p.519-27; TENGELSEN, et al. Virology. 1988, no.164, p.121-31; SCHMITT, et al. Journal of virology. 1988, no.62, p.1889-97). Los monómeros de la subunidad grande del virus vaccinia (designada R1, codificada por el gen I4L) son polipéptidos de 86 kDa, y contienen sitios de unión para sustratos nucleótidos y efectores alostéricos (SLABAUGH, et al., Journal of virology. 1984, no.52, p.507-14; SLABAUGH, et al. Journal of virology. 1984, no.52, p.501-6). La subunidad pequeña (designada R2, codificada por el gen F4L) es un homodímero que comprende dos polipéptidos de 37 kDa; cada polipéptido contiene un radical libre basado en proteína estabilizado por hierro que se requiere para la catálisis (HOWELL, et al. Journal of Biological Chemistry. 1992, no. 267, p.1705-11). Las secuencias para los genes I4L y F4L y sus localizaciones en el genoma de varios poxvirus están disponibles en bases de datos públicas, por ejemplo, a través del número de registro DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 y NC_008291.

La nomenclatura génica usada en el presente documento es la de la cepa de vaccinia Copenhague y se usa también para los genes homólogos de otros poxvirus a menos que se indique otra cosa. Sin embargo, la nomenclatura génica puede ser diferente según la cepa pox. Para información, la correspondencia entre los genes de Copenhague y MVA se puede encontrar en la Tabla I de ANTOINE, Virology, 1998, no. 244, p.365-396.

El gen J2R codifica una timidina quinasa (TK) que forma parte de la ruta salvaje para la síntesis de desoxirribonucleótidos de pirimidina. La reacción catalizada por la t K implica la transferencia de una fracción Y-fosforilo de ATP a 2'-desoxi-timidina (dThd) para producir timidina 5'-monofosfato (dTMP). La TK del virus vaccinia es de tipo 2. Las TK de tipo 2 tienen una cadena polipeptídica menor comparada con las de tipo 1, siendo de ~25 KDa, pero forma homotetrámeros. Son sensibles a los inhibidores de retroalimentación dTDP o dTTP, que se generan al final de la ruta metabólica. Las TK de tipo 2 tienen una especificidad de sustrato mucho más estrecha comparadas con las TK de tipo 1 y solo fosforilan 2'-desoxiuridina (dU) y/o dThd (EL OMARI, et al. Structure of vaccinia virus thymidine kinase in complex with dTTP: insights for drug design. BMC structural biology. 2006, no.6, p.22).

Los poxvirus deficientes en la región J2R y los métodos para obtenerlos están disponibles en la técnica. Por ejemplo, se puede usar la enseñanza de MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. cáncer research. 2001, vol.61, no.24, p.8751-7, PUHLMANN, et al. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant. Cáncer gene therapy. 2000, vol.7, no.1, p.66-73, GNANT, et al. Systemic administration of a recombinant vaccinia virus expressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with 5-fluorocytosine leads to tumorspecific gene expression and prolongation of survival in mice. Cáncer Research. 1999, vol.59, no.14, p.3396-403, para producir un poxvirus con la región J2R delecionada.

Según una forma de realización preferida, el poxvirus para uso según la invención comprende además un gen F2L deficiente.

La desoxiuridina 5'-trifosfato nucleotidohidrolasa (dUTPasa, EC 3.6.1.23) cataliza la hidrólisis de dUTP a dUMP y pirofosfato en presencia de iones Mg(2+). La dUTPasa, al eliminar dUTP del conjunto de dNTP y generar dUMP, está implicada tanto en mantener la fidelidad de la replicación del ADN como en proporcionar el precursor para la producción de TMP por la timidilato sintetasa. La dUTPasa de vaccinia es una proteína de 15 kDa codificada por el gen F2L (MCGEOg H. Nucleic Acids Research. 1990, no.18, p.4105-10; BROYLES. Virology. 1993, no.195, p.863-5). La secuencia del gen F2L del virus vaccinia está disponible en genbank a través del número de registro M25392, las secuencias y localizaciones del gen F2L en varios genomas de poxvirus también están disponibles en genbank, por ejemplo, a través del número de registro NC_006998, DQ121394, NC_001611, AY689436, AY689437, NC_008291, DQ437594, DQ437593, AY313847, AY313848, NC_006966, NC_005309, NC_003391, NC_003389, NC_001132, NC_003310, NC_002188, M35027, AY243312, AF170726, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, X94355, Y16780, AY318871, U94848, AF198100 y M34368.

Según un aspecto preferido, el poxvirus puede comprender además un ácido nucleico de interés.

El ácido nucleico de interés puede contener al menos una secuencia de interés que codifica un producto génico que es una molécula terapéutica (es decir, un gen terapéutico). Una “molécula terapéutica” es una que tiene una actividad farmacológica o protectora cuando se administra de forma apropiada a un paciente, en especial un paciente que padece una enfermedad o estado de enfermedad o que se debe proteger contra esta enfermedad o afección. Tal actividad farmacológica o protectora es una que se espera esté relacionada con un efecto beneficioso en el curso o un síntoma de dicha enfermedad o dicha afección. Cuando el experto en la materia selecciona en el curso de la presente invención un gen que codifica una molécula terapéutica, en general relaciona su elección a resultados previamente obtenidos y puede esperar razonablemente, sin experimentación excesiva diferente de practicar la invención como se reivindica, obtener tal propiedad farmacológica. La secuencia de interés puede ser homóloga o heteróloga para las células diana en las que se introduce. Ventajosamente dicha secuencia de interés codifica todo o una parte de un polipéptido, especialmente un polipéptido terapéutico o profiláctico que da una propiedad terapéutica o profiláctica. Se entiende que un polipéptido es cualquier producto de traducción de un polinucleótido independientemente del tamaño, y si está glucosilado o no, e incluye péptidos y proteínas. Los polipéptidos terapéuticos incluyen como ejemplo principal esos polipéptidos que pueden compensar por proteínas defectuosas o deficientes en un organismo animal o humano, o los que actúan a través de efectos tóxicos para limitar o eliminar células perjudiciales del cuerpo. También pueden ser polipéptidos que confieren inmunidad que actúan como antígeno endógeno para provocar una respuesta humoral o celular, o ambas.

Los ejemplos de polipéptidos codificados por un gen terapéutico incluyen genes que codifican una citoquina (interferón alfa, beta o gamma, interleuquina, en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12, un factor de necrosis tumoral (TNF), una factor estimulante de colonias GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), un polipéptido inmunoestimulador (B7.1, B7.2 y similares), un factor de coagulación (FVIII, FIX...), un factor de crecimiento (factor de crecimiento transformante TGF, factor de crecimiento de fibroblastos FGF y similares), una enzima (ureasa, renina, trombina, metaloproteinasa, óxido nítrico sintasa NOS, SOD, catalasa...), un inhibidor de enzima (alfa-1-antitripsina, antitrombina III, inhibidor de proteasa vírica, inhibidor del activador del plasminógeno PAI-1), la proteína CFTR (regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística), insulina, distrofina, un antígeno de MHC de clase I o II, un polipéptido que puede modular/regular la expresión de genes celulares. un polipéptido capaz de inhibir una infección bacteriana, parasítica o vírica o su desarrollo (polipéptidos antigénicos, epítopos antigénicos, variantes transdominantes que inhiben la acción de una proteína nativa por competición.), un inductor o inhibidor de apoptosis (Bax, Bcl2, BclX...), un agente citostático (p21, p16, Rb...), una apolipoproteína (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), un inhibidor de angiogénesis (angiostatina, endostatina...), un polipéptido angiogénico (familia de factores de crecimiento endoteliales vasculares VEGF, familia FGF, familia CCN incluyendo CTFG, Cyr61 y Nov), un captador de radicales de oxígeno, un polipéptido que tiene un efecto antitumoral, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina, un marcador (beta-galactosidasa, lucife rasa .) o cualquier otro gen de interés que se reconoce en la técnica como que es útil para el tratamiento o prevención de un estado clínico.

Los genes antitumorales adecuados incluyen, pero no están limitados a los que codifican genes supresores tumorales (por ejemplo, Rb, p53, DCC, NF-1, tumor de Wilm, NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73, así como sus respectivos mutantes), productos de genes suicidas, anticuerpos, polipéptidos que inhiben la división celular o señales de transducción.

Gen suicida se refiere a un gen que codifica una proteína capaz de convertir un precursor de un fármaco en un compuesto citotóxico.

Los genes suicidas comprenden, pero no están limitados a genes que codifican proteínas que tienen una actividad citosina desaminasa, una actividad timidina quinasa, una actividad uracilo fosforribosil transferasa, una actividad purina nucleósido fosforilasa y/o una actividad timidilato quinasa.

Se divulgan ejemplos de genes suicidas y los correspondientes precursores de un fármaco que comprenden una fracción de nucleobase en la siguiente tabla:

Tabla 1

Según una forma de realización preferida de la invención, el gen suicida codifica una proteína que tiene al menos una actividad CDasa. La CDasa está implicada en la ruta metabólica de la pirimidina mediante la cual la citosina exógena se transforma en uracilo por medio de una desaminación hidrolítica. Mientras que las actividades CDasa se han demostrado en procariotas y eucariotas inferiores (JUND, et al. Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15; BECK, et al. Journal of Bacteriology. 1972, no.110, p.219-28; HOEPRICH, et al. Journal of Infectious Diseases. 1974, no.130, p.112-18; ESDERS, et al. J. biol. chem. 1985, no.260, p.3915-22), no están presentes en mamíferos (KOECHLIN, et al. Biochemical pharmacology. 1966, no.15, p.435-46; Po LAK, et al. Chemotherapy. 1976, no.22, p.137-53).

La CDasa también desamina un análogo de citosina, es decir, 5-fluorocitosina (5-FC), formando mediante ello 5-fluorouracilo (5-FU), que es un compuesto que es muy citotóxico cuando se convierte a 5-fluoro-UMP (5-FUMP). Las células que carecen de actividad CDasa, ya sea debido a una mutación que inactiva el gen que codifica la enzima o porque son deficientes de forma natural en esta enzima, como son las células de mamífero, son resistentes a 5-FC (Ju Nd , et al. Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15; KILLSTRUP, et al. Journal of Bacteriology. 1989, no.171, p.2124-2127). Por contraste, las células de mamífero en las que se transfirieron secuencias que codifican actividad CDasa se volvieron sensibles a 5-FC (HUBER, et al. Cancer Research. 1993, no.53, p.4619-4626; MULLEN, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, no.89, p.3337; documento WO 93/01281 (US HEALTH)). Además, las células cercanas, no transformadas también se vuelven sensibles a 5-FC (HUBER, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, no.91, p.8302-6). Este fenómeno, que se denomina un efecto espectador, es debido a que las células que expresan la actividad CDasa secretan 5-FU, que después intoxica las células vecinas por difusión directa a través de la membrana plasmática. Esta propiedad de 5-FU en difundir de forma pasiva representa una ventaja comparada con el sistema de referencia tk/GCV, donde el efecto espectador requiere que haya contacto con las células que expresan tk (MESNIL, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996, no.93, p.1831-35). Todas las ventajas que ofrece la CDasa en el contexto de terapia génica, en particular terapia génica anticáncer, se pueden por tanto entender fácilmente.

Los genes FCY1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), FCA1 de Candida Albicans y codA de E. coli, que codifican respectivamente la CDasa de estos dos organismos, son conocidos y sus secuencias se han publicado (SEQ ID N°: 4; SEQ ID N°: 5; SEQ ID N°: 6, respectivamente).

A este respecto, según una forma de realización más preferida de la invención, el gen que codifica una proteína que tiene una actividad CDasa es FCY1, FCA1 o CodA o un análogo de los mismos. Análogos de estos genes se refiere a un gen que tiene una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un grado de identidad mayor del 70%, ventajosamente mayor del 80%, preferiblemente mayor del 90%, y lo más preferiblemente mayor del 95% con la secuencia de ácido nucleico del gen parental.

La patente WO 2005/007857 divulga un gen que codifica una proteína que tiene una actividad CDasa mejorada. Este polipéptido deriva de una CDasa nativa por adición de una secuencia de aminoácidos. Según otra forma de realización preferida de la invención, la proteína que tiene una actividad CDasa es un polipéptido divulgado en el documento WO 2005/007857 y más preferiblemente el polipéptido FCU1-8 representado en el identificador de secuencia SEQ ID N°: 2 y análogos del mismo.

En procariotas y eucariotas inferiores, el uracilo se transforma en UMP por la acción de la uracilo fosforribosil transferasa (UPRTasa). Esta enzima convierte 5-FU a 5-FUMP. Según otra forma de realización preferida de la invención, el gen suicida codifica una proteína que tiene una actividad UPRTasa.

La UPRTasa en cuestión puede ser de cualquier origen, en particular de origen procariota, fúngico o de levadura. A modo de ilustración, las secuencias de ácido nucleico que codifican las UPRTasas de E coli (ANDERSEN, et al. Characterization of the upp gene encoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12. European Journal of Biochemistry. 1992, no.204, p.51-56), de Lactococcus lactis (MARTINUSSEN, et al. Cloning and characterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology. 1994, vol.176, no.21, p.6457-63), de Mycobacterium bovis (KIM, et al. Complete sequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Mycobacterium bovis BCG. Biochemistry and molecular biology International. 1997, vol.41, no.6, p.1117-24) y de Bacillus subtilis (MARTINUSSEN, et al. Two genes encoding uracil phosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 1995, vol.177, no.1, p.271-4) se pueden usar en el contexto de la invención. Sin embargo, es más particularmente preferido usar una UPRTasa de levadura y en particular la codificada por el gen FUR1 de S. cerevisiae cuya secuencia divulgada en KERN, et al. The FUR1 gene of Saccharomyces cerevisiae: cloning, structure and expression of wild-type and mutant alleles. (Gene.

1990, vol.88, no.2, p.149-57) se introduce aquí a modo de referencia. Como guía, las secuencias de los genes de las correspondientes UPRTasas se pueden encontrar en la bibliografía y las bases de datos de especialistas (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medline y similares).

La solicitud EP 0998568 A describe un gen FUR1 que carece de 105 nucleótidos en el 5' de la parte codificante lo que permite la síntesis de una UPRTasa de la que los primeros 35 residuos se han delecionado en la posición N-terminal y que empieza con la metionina en la posición 36 en la proteína nativa. El producto de expresión del gen mutante, designado FUR1A105, es capaz de complementar un mutante fu rl de S. cerevisiae. Además, el mutante truncado muestra una mayor actividad UPRTasa que la de la enzima nativa. Por tanto, según una forma de realización particularmente ventajosa de la invención, el gen suicida codifica un mutante de deleción de una UPRTasa nativa. La deleción está preferiblemente localizada en la región N-terminal de la UPRTasa original. Puede ser completa (que afecta a todos los residuos de dicha región N-terminal) o parcial (que afecta a uno o más residuos continuos o discontinuos en la estructura primaria). En general, un polipéptido consiste en partes N-terminal, central y C-terminal, cada una representa aproximadamente un tercio de la molécula. Por ejemplo, puesto que la UPRTasa de S. cerevisiae tiene 251 aminoácidos, su parte N-terminal consiste en los primeros 83 residuos empezando con la llamada metionina iniciadora situada en la primera posición de la forma nativa. Respecto a la UPRTasa de E. coli, su parte N-terminal cubre las posiciones 1 a 69.

Una proteína preferida que tiene una actividad UPRTasa comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se representa en el identificador de secuencia SEQ ID N°: 1 del documento EP 0998568 A, empezando con el residuo de Met en la posición 1 y terminando con el residuo de Val en la posición 216. El término “sustancialmente” se refiere a un grado de identidad con dicha secuencia SEQ ID N°: 1 del documento EP 0998568 A mayor del 70%, ventajosamente mayor del 80%, preferiblemente mayor del 90%, y lo más preferiblemente mayor del 95%. Más preferiblemente aún, comprende la secuencia de aminoácidos representada en el identificador de secuencia SEQ ID N°: 1 del documento EP 0998568 A. Como se ha mencionado anteriormente, puede comprender mutaciones adicionales. Se pueden mencionar en particular la sustitución del residuo de serina en la posición 2 (posición 37 en la UPRTasa nativa) por un residuo de alanina.

Según otra forma de realización preferida de la invención, el gen suicida codifica una proteína que tiene al menos una actividad CDasa y una UPRTasa. Las solicitudes de patente WO 96/16183 y EP 0998568 A describen el uso de una proteína de fusión que codifica una enzima con dos dominios que tienen las actividades CDasa y UPRTasa y demuestran que la transferencia de un gen híbrido codA::upp o FCY1::FUR1 o FCY1::FUR1A105 (es decir, FCU1) portado por un plásmido de expresión aumenta la sensibilidad de las células B16 transfectadas a 5-FC. Según una forma de realización más preferida de la invención, el gen suicida codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se representa en el identificador de secuencia SEQ ID N°: 3 (coda::upp), SEQ ID N°: 1 (FCU1) o FCY1::FUR1. El término sustancialmente” se refiere a un grado de identidad con dicha secuencia mayor del 70%, ventajosamente mayor del 80%, preferiblemente mayor del 90%, y lo más preferiblemente mayor del 95%. Más preferiblemente aún, comprende la secuencia de aminoácidos representada en el identificador de secuencia SEQ ID N°: 3 (coda::upp), SEQ ID N°: 1 (FCU1) o FCY1::FUR1. Como se ha mencionado anteriormente, puede comprender mutaciones adicionales.

Las secuencias de ácido nucleico se pueden obtener fácilmente por clonación, por PCR o por síntesis química según las técnicas convencionales en uso. Pueden ser genes nativos o genes derivados de los últimos por mutación, deleción, sustitución y/o adición de uno o más nucleótidos. Además, sus secuencias se describen ampliamente en la bibliografía que pueden consultar los expertos en la materia.

Los expertos en la materia son capaces de clonar las secuencias de CDasa o UPRTasa a partir de datos publicados y de llevar a cabo posibles mutaciones, de ensayar la actividad enzimática de las formas mutantes en un sistema acelular o celular según la tecnología del estado de la técnica o basado en el protocolo indicado en la solicitud EP 0998568 A, y de fusionar, en particular en fase, los polipéptidos con actividad CDasa y UPRTasa, y en consecuencia todo o parte de los correspondientes genes.

Según una forma de realización más preferida, el poxvirus para uso según la invención comprende además una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa.

Permeasa se refiere a una proteína transmembrana implicada en la transferencia de un fármaco que comprende una fracción de nucleobase, o un precursor de la misma a través de la membrana celular.

La permeasa comprende, pero no está limitada a, purina permeasa, citosina permeasa y transportadores de nucleósidos.

Según una forma de realización preferida de la invención, la permeasa es una purina o citosina permeasa de S. cerevisiae. Los transportadores de nucleobases de S. cerevisiae consisten en la purina-citosina permeasa, conocida como FCY2, y la uracilo permeasa, conocida como FUR4. La purina-citosina permeasa FCY2 media el simporte de protones y adenina, guanina, hipoxantina y citosina a través de la membrana plasmática de levaduras (Grenson 1969, Jund y Lacroute 1970, Polak y Grenson 1973, Chevallier et al. 1975, Hopkins et al. 1988). La proteína FCY2 también media el transporte de 5-fluorocitosina, un análogo de citosina (Grenson 1969, Jund y Lacroute 1970). El gen FCY2 codifica una proteína de 533 aminoácidos (58 kDa) inicialmente predicha que tenía 10-12 dominios transmembranaque atraviesan (Weber et al. 1990), ahora favorecido con nueve (Ferreira et al. 1999). FCY2 muestra afinidades similares para las nucleobases de purina y citosina (Brethes et al. 1992). La absorción de uracilo en S. cerevisiae está mediada por la uracilo permeasa, FUR4 (Jund y Lacroute 1970, Jund et al. 1977). FUR4 es un simportador de uraciloprotón (Hopkins et al. 1988) predicho que es una proteína de 633 aminoácidos (71,7 kDa) con 10 dominios transmembrana y largas colas citoplásmicas hidrofílicas N- y C-terminales (Jund et al. 1988, Garnier et al. 1996). La proteína FUR4 también puede mediar el transporte de 5-fluorouracilo, un análogo de uracilo (Jund y Lacroute 1970).

Las secuencias de aminoácidos de FCY2 y Fur4 están notablemente disponibles en la base de datos Swissprot (número de registro P17064 y P05316, respectivamente). Preferiblemente, la permeasa tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 como se divulga en la solicitud de patente WO 2006/048768.

A este respecto, según una forma de realización preferida de la invención, la permeasa se elige del grupo que comprende FCY2 y Fur4 y análogos de las mismas. Análogos de Fur4 y FCY2 se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un grado de identidad mayor del 70%, ventajosamente mayor del 80%, preferiblemente mayor del 90%, y lo más preferiblemente mayor del 95% con la secuencia de aminoácidos de la proteína parental como se ha descrito aquí anteriormente y que retiene la capacidad para transportar un fármaco que comprende una fracción de nucleobase a través de la membrana celular.

Un experto en la materia es capaz de elegir la permeasa que se asociará con el fármaco o el precursor del fármaco que comprende una fracción de nucleobase. Por ejemplo, FCY2 y Fur4 se asocian preferiblemente con 5-fluorocitosina (5-FC).

Según una forma de realización más preferida, el poxvirus para uso según la invención puede comprender además los elementos necesarios para la expresión del ácido nucleico de interés.

Según una forma de realización más preferida, el poxvirus para uso según la invención puede comprender además los elementos necesarios para la expresión de la secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa.

Estos elementos necesarios para la expresión del ácido nucleico de interés y/o la secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa comprenden los elementos requeridos para la transcripción de dicho ADN a ARNm y, si es necesario, para la traducción del ARNm a polipéptido. Los promotores transcripcionales adecuados para uso en varios sistemas de vertebrados se describen ampliamente en la bibliografía. Por ejemplo, los promotores adecuados incluyen promotores víricos como RSV, MPSV, SV40, CMV o 7.5k, promotor de vaccinia, promotores inducibles, etc. Los promotores preferidos se aíslan de poxvirus, por ejemplo, 7.5K, H5R, TK, p28, p11 o K1L del virus vaccinia. Alternativamente, se puede usar un promotor sintético como los descritos en CHAKRABARTI. Biotechniques. 1997, no.23, p.1094-97, HAMMOND, et al. Journal of Virological Methods. 1997, no.66, p.135-38 y KUMAR. Virology. 1990, no.179, p.151-8, así como promotores quiméricos entre promotores tempranos y tardíos de poxvirus.

La secuencia de ácido nucleico de interés y la secuencia de ácido nucleico que comprende un gen que codifica una permeasa pueden incluir además elementos funcionales adicionales, tal como secuencias de intrones, secuencias de direccionamiento, secuencias de transporte, señal de secreción, señal de localización nuclear, IRES, secuencias de terminación de la transcripción de poli A, secuencias líder tripartitas, secuencias implicadas en replicación o integración. Dichas secuencias se han descrito en la bibliografía y las pueden obtener fácilmente los expertos en la materia.

También se divulga en el presente documento un proceso para preparar un poxvirus para uso según la invención, proceso en el que:

(i) un poxvirus para uso según la invención se introduce en una célula,

(ii) dicha célula se cultiva en condiciones que son apropiadas para permitir que dicho poxvirus se produzca, y (iii) dicho poxvirus se recupera del cultivo celular.

Mientras que el poxvirus se puede, por supuesto, recuperar del sobrenadante de cultivo, también se puede recuperar de las células. Uno de los métodos comúnmente empleados consiste en lisar las células por medio de ciclos consecutivos de congelación/descongelación para recoger los viriones en el sobrenadante de lisis. Los viriones se pueden después amplificar y purificar usando los métodos de la técnica (método cromatográfico, método de ultracentrifugación, en particular, mediante un gradiente de cloruro de cesio, etc.).

La composición para uso según la invención puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Una composición para uso según la invención se pretende más específicamente para el tratamiento preventivo o curativo de enfermedades por medio de terapia génica y se dirige más específicamente a enfermedades proliferativas (cánceres, tumores, restenosis, etc.) o se dirige a enfermedades asociadas con una actividad de osteoclastos aumentada (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoporosis).

Una composición para uso según la invención se puede hacer convencionalmente con vista a administrarla localmente, por vía parenteral o por la vía digestiva. En particular, una cantidad terapéuticamente eficaz del vector recombinante o poxvirus para uso según la invención se combina con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Es posible prever un gran número de rutas de administración. Los ejemplos que se pueden mencionar son las rutas intragástrica, subcutánea, intracardiaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonar e intratecal. En el caso de estas tres últimas formas de realización, es ventajoso que la administración tenga lugar por medio de un aerosol o por medio de instilación. La administración puede tener lugar como una única dosis o como una dosis que se repite en una o más ocasiones después de un intervalo de tiempo particular. La ruta apropiada de administración y la dosis varían dependiendo de una variedad de parámetros, por ejemplo, el individuo, la enfermedad que se va a tratar o el/los gen(es) de interés que se va(n) a transferir. Las preparaciones basadas en partículas víricas para uso según la invención se pueden formular en forma de dosis entre 1o4 y 1014 ufp (unidades formadoras de placa), ventajosamente 105 y 1013 ufp, preferiblemente 106 y 1012 ufp, más preferiblemente 106 y 107.

La composición también puede incluir un diluyente, un adyuvante o un excipiente que sea aceptable desde el punto de vista farmacéutico, así como agentes solubilizantes, estabilizantes y conservantes. En el caso de una administración inyectable, se da preferencia a una formulación en una solución acuosa, no acuosa o isotónica. Se puede presentar como una dosis única o como una multidosis, en forma líquida o seca (polvo, liofilizado, etc.) que se puede reconstituir en el momento del uso usando un diluyente apropiado.

También se divulga el uso de un poxvirus o una composición como se ha descrito en el presente documento para preparar un medicamento que se pretende para tratar el cuerpo humano o animal por terapia génica. El medicamento se puede administrar directamente in vivo (por ejemplo, por inyección intravenosa, a un tumor accesible, en los pulmones por medio de un aerosol, en el sistema vascular usando un catéter apropiado, etc.). Un uso preferido consiste en tratar o prevenir cánceres, tumores y enfermedades que resultan de proliferación celular indeseada. Las aplicaciones concebibles que se pueden mencionar son cánceres de la mama, del útero (en particular los inducidos por virus del papiloma), de la próstata, del pulmón, de la vejiga, del hígado, del colon, del páncreas, del estómago, del esófago, de la laringe, del sistema nervioso central (por ejemplo, glioblastoma) y de la sangre (linfomas, leucemia, etc.). Otro uso preferido consiste en tratar o prevenir artritis reumatoide, osteoporosis y otras enfermedades asociadas con una actividad de osteoclastos aumentada. También se puede usar en el contexto de enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, para inhibir o retrasar la proliferación de las células de músculo liso de la pared de los vasos sanguíneos (restenosis). Por último, en el caso de enfermedades infecciosas, es posible concebir que el medicamento se aplique al SIDA.

Cuando la composición para uso según la invención se usa para el tratamiento de cáncer, la ruta preferida de administración es la ruta sistémica ya que el poxvirus es capaz de dirigirse específicamente a las células tumorales.

También se divulga un método para tratar enfermedades caracterizado en que un poxvirus, una composición como se ha descrito se administra a un organismo o célula huésped que está en necesidad de tal tratamiento.

Según una forma de realización ventajosa, el uso terapéutico o el método de tratamiento también comprende una etapa adicional en la que cantidades farmacéuticamente aceptables de un profármaco, ventajosamente un análogo de citosina, en particular 5-FC, se administran al organismo o célula huésped. A modo de ilustración, es posible usar una dosis de desde 50 a 500 mg/kg/día, siendo preferida una dosis de 200 mg/kg/día o de 100 mg/kg/día. Dentro del contexto de la presente invención, el profármaco se administra según la práctica estándar (por ejemplo, por vía oral, sistemáticamente).

Preferiblemente, la administración tiene lugar después de la administración del agente terapéutico para uso según la invención, preferiblemente al menos 3 días, más preferiblemente al menos 4 días e incluso más preferiblemente al menos 5 días después de la administración del agente terapéutico. Según una forma de realización incluso más preferida, la administración del profármaco tiene lugar 7 días después de la administración del agente terapéutico. La ruta oral es preferida. Es posible administrar una única dosis del profármaco o dosis que se repiten durante un tiempo que es lo suficientemente largo para permitir que el metabolito tóxico se produzca en el organismo o célula huésped.

Además, la composición para uso según la invención se puede combinar con una o más sustancias para potenciar el efecto citotóxico de 5-FU. Se puede hacer mención, en particular, de fármacos que inhiben las enzimas de la ruta para la biosíntesis de novo de las pirimidinas (por ejemplo, las mencionadas posteriormente), fármacos tal como Leucovorina (Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692), que, en presencia del producto del metabolismo de 5-FU (5-FdUMP), aumenta la inhibición de la timidilato sintasa, produciendo una disminución en el conjunto de dTMP, que se requiera para la replicación, y por último fármacos tal como metotrexato (Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137) que, al inhibir la dihidrofolato reductasa y aumentar el conjunto de PRPP (fosforribosilpirofosfato), produce un aumento en la incorporación de 5-FU en el ARN celular.

En el contexto de la presente invención, los fármacos que inhiben las enzimas de la ruta para la biosíntesis de novo de las pirimidinas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en PALA (N-(fosfonoacetil)-L-aspartato; Moore et al., 1982, Biochem. Pharmacol. 31, 3317-3321), Leflunomida, A771726 (metabolito activo de Leflunomida; Davis et al., 1996, Biochem. 35, 1270-1273) y Brequinar (Chen et al., 1992, Cancer Res. 52, 3251-3257).

La composición o el método como se han descrito se pueden combinar con una o más sustancias eficaces en terapia anticáncer. Entre las sustancias farmacéuticas eficaces en la terapia anticáncer que se pueden usar en asociación o en combinación con las composiciones para uso según la invención, se pueden mencionar agentes alquilantes tales como, por ejemplo, mitomicina C, ciclofosfamida, busulfán, ifosfamida, isosfamida, melfalán, hexametilmelamina, tiotepa, clorambucilo, o dacarbacina; antimetabolitos tales como, por ejemplo, gemcitabina, capecitabina, 5-fluorouracilo, citarabina, 2-fluorodesoxicitidina, metotrexato, idatrexato, tomudex o trimetrexato; inhibidores de topoisomerasa II tales como, por ejemplo, doxorrubicina, epirrubicina, etopósido, tenipósido o mitoxantrona; inhibidores de topoisomerasa I tales como, por ejemplo, irinotecano (CPT-11), 7-etil-10-hidroxi-camptotecina (SN-38) o topotecano; fármacos antimitóticos tales como, por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina o vinorelbina; y derivados de platino tales como, por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino, espiroplatino o carboplatino.

La una o más sustancias eficaces en terapia anticáncer y la composición para uso según la invención se pueden administrar una vez o varias veces por métodos que conoce bien el experto en la materia incluyendo la administración sistémica e inyección directa en el tumor. Se puede proceder mediante inyección en embolada o perfusión (por ejemplo, durante 0,5-6 horas). Las varias administraciones de la sustancia anticáncer y/o la composición de poxvirus pueden estar separadas entre sí por un periodo apropiado de tiempo y llevarse a cabo por la misma ruta o por rutas diferentes de administración en el mismo sitio o en sitios diferentes usando las mismas o diferentes dosis. La dosis la puede adaptar el practicante a la luz de varios parámetros tales como la naturaleza del cáncer que se va a tratar, el modo y la frecuencia de la(s) administración(es), y otros factores considerados rutinariamente al administrar un fármaco.

En una forma de realización, el poxvirus para uso según la invención se combina con el inhibidor de topoisomerasa I irinotecano. Preferiblemente, el irinotecano y la composición de poxvirus se administrarán por vía intravenosa. A modo de ilustración, las dosis adecuadas para irinotecano pueden variar desde 5 a 100 mg/kg/día y esas para poxvirus de 1x106 a 1x109 ufp. Preferiblemente, la composición de poxvirus se inyectará de una a tres veces por vía intravenosa y el irinotecano a una periodicidad adecuada (por ejemplo, una vez a la semana) durante uno o más ciclos. Además, el tratamiento con irinotecano se llevará a cabo unos pocos días (por ejemplo, de 3 a 10 días) después de la primera administración de la composición de poxvirus.

En otra forma de realización, el poxvirus para uso según la invención se combina con el fármaco antimitótico oxaliplatino. Preferiblemente, el oxaliplatino se administrará por vía intraperitoneal o intravenosa y la composición de poxvirus según la invención por la ruta intravenosa. A modo de ilustración, las dosis adecuadas para oxaliplatino pueden variar desde 0,5 a 10 mg/kg/día y esas para poxvirus de 1x106 a 1x109 ufp. Preferiblemente, la composición de poxvirus se inyectará de una a tres veces por vía intravenosa y el oxaliplatino a una periodicidad adecuada (por ejemplo, cada dos semanas) durante uno o más ciclos. Además, un método preferido comprende la primera administración de la composición de poxvirus seguida por el tratamiento con oxaliplatino unos pocos días (por ejemplo, de 3 a 10 días) después de la primera inyección de poxvirus.

Además, el uso según la invención también puede comprender una etapa adicional en la que cantidades farmacéuticamente aceptables de un profármaco se administran al organismo o célula huésped como se ha descrito anteriormente. Un profármaco preferido en el contexto de la invención es 5-FC.

Las composiciones para uso según la invención también se pueden usar en combinación con radioterapia.

Las composiciones para uso según la invención también se pueden usar en combinación con uno o más otros agentes incluyendo, pero no limitados a, agentes inmunomoduladores tales como, por ejemplo, interferón alfa, beta o gamma, interleuquina (en particular IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12) o factor de necrosis tumoral; agentes que afectan la regulación de receptores de superficie celular tales como, por ejemplo, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (en particular cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, gefitinib, erlotinib o lapatinib) o inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (en particular trastuzumab); y agentes que afectan la angiogénesis tales como, por ejemplo, inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (en particular bevacizumab o ranibizumab).

Breve descripción de las figuras en los dibujos

Figura 1. Sensibilidades in vitro a 5-FC de células de tumor colorrectal humano (LoVo) infectadas con virus vaccinia. Las células LoVo, infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados (control (•) VVTK-/FCU1 (■) o VVTK-I4L-/FCU1 (A)) se expusieron a varias concentraciones de 5-FC. La supervivencia celular se midió 5 días después de la infección. Los resultados se expresaron en porcentaje de viabilidad celular en presencia o no de fármacos. Los valores se representan en media ± DE de tres determinaciones individuales sin la mortalidad celular debida a la replicación de los virus.

Figura 2. Sensibilidades in vitro a 5-FC de células de tumor colorrectal humano (LoVo) infectadas con virus vaccinia. Las células LoVo, infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados (control (•) VVTK-/FCU1 (■) o VVTK-F4L-/FCU1 (0)) se expusieron a varias concentraciones de 5-FC. La supervivencia celular se midió 5 días después de la infección. Los resultados se expresaron en porcentaje de viabilidad celular en presencia o no de fármacos. Los valores se representan en media ± DE de tres determinaciones individuales sin la mortalidad celular debida a la replicación de los virus.

Figura 3. Eficacia de replicación in vitro de VVTK-/FCU1 y VVTK-I4L-/FCU1 en LoVo infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados el día 5 tras la infección. Los valores se representan en media ± DE de tres determinaciones individuales.

Figura 4. Eficacia de replicación in vitro de VVTK-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 en LoVo infectadas a una MOI de 0,0001 con los virus indicados el día 5 tras la infección. Los valores se representan en media ± DE de tres determinaciones individuales.

Figura 5. Volumen tumoral medio ± EEM de LoVo s.c. en ratones desnudos Swiss después de inyección i.v. de virus.

7 días después de la inoculación con tumor (tumor palpable), los ratones se trataron con 107 ufp de tampón solución salina (0), tampón 5-FC (♦), VVTK-I4L-/FCU1 solución salina (A) o VVTK-I4L-/FCU1 5-FC (▲). Los animales se trataron por solución salina o 5-FC a 100 mg/kg/día dos veces al día por alimentación forzada oral, 7 días después de la inyección del virus durante 3 semanas. El volumen del tumor se midió dos veces a la semana.

Figura 6. Volumen tumoral medio ± EEM de LoVo s.c. en ratones desnudos Swiss después de inyección i.v. de virus.

7 días después de la inoculación con tumor (tumor palpable), los ratones se trataron con 107 ufp de tampón solución salina (0), tampón 5-FC (♦), VVTK-F4L-/FCU1 solución salina (□) o VVTK-F4L-/FCU1 5-FC (■). Los animales se trataron por solución salina o 5-FC a 100 mg/kg/día dos veces al día por alimentación forzada oral, 7 días después de la inyección del virus durante 3 semanas. El volumen del tumor se midió dos veces a la semana.

Figura 7. Volumen tumoral medio ± EEM de LoVo s.c. en ratones desnudos Swiss después de inyección i.v. de virus.

11 días después de la inoculación con tumor (tumor palpable), los ratones se trataron con tampón H² O (0), o tampón 5-FC (♦), o una inyección de 107 ufp de Vv Tk-I4L-/fCu 1 H² O (o), o una inyección de 107 ufp de VVTK-I4L-/fCu 1 5-FC (5-FC administrada 7 días después de la inyección del virus y durante 3 semanas) (•), o dos inyecciones (día 11 y día 33) de 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 H²O (□), o dos inyecciones (día 11 y día 33) de 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 5-FC (5-FC administrada desde el día 18 al día 32 y desde el día 40 al día 54) (■). Los animales se trataron por solución salina o 5-FC a 100 mg/kg dos veces al día por alimentación forzada oral. El volumen del tumor se midió dos veces a la semana.

Figura 8. Volumen tumoral medio ± EEM de U87-MG (células tumorales de glioblastoma) s.c. en ratones desnudos Swiss después de inyección i.v. de virus. 11 días después de la inoculación con tumor (tumor palpable), los ratones se trataron con tampón H²O (0), o tampón 5-FC (♦), o 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 H²O (o), o 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 5-FC (•). Los animales se trataron por 5-FC a 100 mg/kg dos veces al día por alimentación forzada oral, 7 días después de la inyección del virus y durante 3 semanas. El volumen del tumor se midió dos veces a la semana.

Figura 9. Razón del rendimiento del virus en células en división frente a en células confluentes. Se infectaron células PANC1 (tumor humano pancreático), H1299 (tumor humano de los pulmones) o U118MG (tumor humano de glioma) con 100 ufp de (■) VVTK-/FCU1 o (□) VVTK-I4L-/FCU1. 48 h tras la infección, se determinaron los títulos víricos. Los valores son la razón entre rendimientos de virus en células en división frente a en células confluentes.

Figura 10. Razón del rendimiento del virus en células en división frente a en células confluentes. Se infectaron células PANC1 (tumor humano pancreático), H1299 (tumor humano de los pulmones) o U118MG (tumor humano de glioma) con 100 ufp de (■) VVTK-/FCU1 o (□) VVTK-F4L-/FCU1.48 h tras la infección, se determinaron los títulos víricos. Los valores son la razón entre rendimientos de virus en células en división frente a en células confluentes.

Figura 11. Títulos víricos (ufp/mg de tejido) en órganos o tumores el día 6 y el día 21 después de infección i.v. en ratones desnudos Swiss que portan tumores humanos subcutáneos con 1x106 UFP de VVTK-/FCU1(^) o VVTK-I4L-/FCU1 (□).

Figura 12. Títulos víricos (ufp/mg de tejido) en órganos o tumores el día 6 y el día 21 después de infección i.v. en ratones desnudos Swiss que portan tumores humanos subcutáneos con 1x106 UFP de VVt K-/FCU1(^) o VVTK-F4L-/FCU1 (□).

Figura 13. Supervivencia de ratones desnudos Swiss después del tratamiento con 1x108 ufp de VVTK-/FCU1(^) o VVTK-I4L-/FCU1 (o) por inyección i.v.

Figura 14. Supervivencia de ratones inmunocompetentes B6D2 después del tratamiento con 1x107 ufp (A) o 1x108 ufp (B) de VVTK-/FCU1(^) o VVTK-I4L-/FCU1 (0) por inyección i.v.

Figura 15. Cantidad media de pústulas en colas después de la inyección i.v. de 1x106 ufp de VVTK-/FCU1 o VVTK-I4L-/FCU1 en ratones desnudos Swiss el día 13 tras la infección y el día 34 tras la infección.

Figura 16. Cantidad media de pústulas en colas después de la inyección i.v. de 1x106 ufp de VVTK-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 en ratones desnudos Swiss el día 13 tras la infección y el día 34 tras la infección.

Figura 17. Cantidad media de pústulas en colas después de la inyección i.v. de 1x107 ufp de VVTK-/FCU1 o VVTK-I4L-/FCU1 en ratones desnudos Swiss el día 15 tras la infección y el día 31 tras la infección.

Figura 18. Cantidad media de pústulas en colas después de la inyección i.v. de 1x107 ufp de VVTK-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 en ratones desnudos Swiss el día 15 tras la infección y el día 31 tras la infección.

Manera(s) de llevar a cabo la invención

Ejemplos

Construcción de vectores y plásmidos

Se construyó un plásmido lanzadera para delecionar I4L usando el ADN de la cepa Copenhague del virus vaccinia (número de registro M35027) delecionado en el gen de la timidina quinasa y que expresa el gen FCU1 bajo el control del promotor sintético de vaccinia p11K7.5. Las regiones flanqueantes de ADN de I4L se amplificaron por PCR. Los cebadores de la región flanqueante posterior de I4L fueron 5'- TCC CCC GGG TTA ACC AcT GCA TGA TGT ACA -3' (SEQ ID N°:7; sitio Smal subrayado) y 5'- GCC GAG CTC GAG GTA GCC GTT TGT AAT TCT -3' (SEQ ID N°:8; sitio SacI subrayado). Los cebadores de la región anterior fueron 5'- GCC TGG CCA TAA CTC CAG GCC GTT - 3' (SEQ ID N°:9; sitio MscI subrayado) y 5' - GCC CAG CTG ATC GAG CCG TAA CGA TTT TCA - 3' (SEQ ID N°:10; sitio Pvull subrayado). El fragmento de ADN amplificado se digirió con las enzimas de restricción SmaI/SacI o MscI/PvuII y se ligó en los sitios correspondientes en el plásmido PpolylII. Una región repetida de la región flanqueante posterior de I4L se amplificó por PCR usando los cebadores 5'- GCC GCA TGC ATC Ct T GAA CAC CAA TAC CGA - 3' (SEQ ID N°:11; sitio Sphl subrayado) y 5'- GCT CTA GAG AGG TAG CCG TTT GTA ATC TG -3 ' (SEQ ID N°:12; sitio Xbal subrayado) y se insertó en el plásmido PpolylII. La región repetida se usa para eliminar el casete de selección durante la producción de virus delecionados. El casete de selección, correspondiente al gen de fusión GFP/GPT bajo el control del promotor de vaccinia pH5R, se insertó en el sitio Sacl/Sphl en el plásmido PpolylII. El plásmido obtenido es el plásmido lanzadera recombinante nombrado pAI4L para la deleción del gen I4L.

Se construyó un plásmido lanzadera para delecionar F4L usando el ADN de la cepa Copenhague del virus vaccinia (número de registro M35027). Las regiones flanqueantes de ADN de F4L se amplificaron por PCR. Los cebadores de la región flanqueante posterior de F4L fueron 5'- CGC GGA TCC TTT GGT a Ca GTC TAG TAT CCA - 3' (SEQ ID N°:13; sitio BamHI subrayado) y 5' - TCC CCC GGG TTA TAA CAG ATG CAG TAT CCA- 3' (SEQ ID N°:14; sitio SmaI subrayado). Los cebadores de la región anterior fueron 5'- GCC CAG CTG TTC AAT GGC CAT CTG AAA TCC - 3' (SEQ ID N°:15; sitio PvuII subrayado) y 5'- GAA GAT CTA GTA TCG CAT CTA AAA GAT GG -3 ' (SEQ ID N°:16; sitio BglII subrayado). El fragmento de ADN amplificado se digirió con las enzimas de restricción BamHI/SmaI o BglII/PvuII y se ligó en los sitios correspondientes en el plásmido PpoIyIII. Una región repetida de la región flanqueante posterior de F4L se amplificó por Pc R usando los cebadores 5'- Gc C GAG CTC ACC CAC ACG TTT TTC gAa AAA - 3' (SEQ ID N°:17; sitio SacI subrayado) y 5'- GCC GCA TGC TTA TAA CAG ATG CAG TAT CAA-3' (SEQ ID N°:18; sitio SphI subrayado) y se insertó en el plásmido PpolylII. La región repetida se usa para eliminar el casete de selección durante la producción de virus delecionados. El casete de selección, correspondiente al gen de fusión GFP/GPT bajo el control del promotor de vaccinia pH5R, se insertó en el sitio SacI/SmaI en el plásmido PpolylII. El plásmido obtenido es el plásmido lanzadera recombinante nombrado pAF4L para la deleción del gen F4L.

La generación de virus vaccinia recombinantes

Se infectaron células CEF con VVTK-FCU1 (virus vaccinia, deficiente para el gen de la quinasa J2R, que expresa el gen FCU1 bajo el control del promotor sintético p11k7.5) cepa Copenhague a una MOI de 0,1 y se incubó a 37°C durante 2 h, después se transfectaron con un coprecipitado de CaCl² del plásmido lanzadera recombinante (0,2 |jg). Las células se incubaron durante 48 h a 37°C. Después se usaron diluciones de los virus que surgen para infectar células CEF en medio de selección que contiene hipoxantina a una concentración final de 15 jg/ml, xantina a una concentración final de 250 jg/m l y ácido micofenólico a una concentración final de 250 jg/ml. Se aislaron placas fluorescentes (GFP) y positivas (selección de GPT) y se seleccionaron durante varias rondas de selección en células CEF en presencia de medio de selección GPT. La presencia o no de VVTK-FUC1 se determinó por 40 ciclos de PCR con cebadores dentro de la región de deleción. Después de la eliminación del virus parental, el virus doble delecionado se usó para infectar CEF sin medio de selección GPT para eliminar el casete de selección. Se aislaron placas no fluorescentes y se seleccionaron durante 2 ciclos en CEF. Los virus VV recombinantes finales se amplificaron en CEF, se purificaron y se titularon soluciones madre de virus en CEF por ensayo de placa.

Sensibilidad celular in vitro a 5-FC

Se transdujeron células tumorales humanas mediante los respectivos VV recombinantes a una MOI de 0,0001. Un total de 3 x 105 células/pocillo se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos en 2 ml de medio que contenía varias concentraciones de 5-FC. Las células se cultivaron después a 37°C durante 5 días, y las células viables se contaron por exclusión de azul de tripán. Los resultados representados en la figura 1, 2, 3 y 4 muestran que la actividad FCU1 es equivalente en los virus deficientes para el gen J2R que en virus deficientes para el gen I4L y J2R o que en virus deficientes para el gen F4L y J2R.

Replicación in vitro en células cultivadas

Se infectaron células en división o confluentes, en placas de 6 pocillos, a 100 UFP de virus (casi MOI 0,0005). Se añadieron 2 ml de medio suplementado con STF al 10% para células en división y no suplementado para células confluentes. Las células se recogieron a las 48 horas tras la infección. Las células se almacenaron a -20°C y se sonicaron para liberar el virus, el virus también se cuantificó por titulación en placa en células CEF. La razón entre replicación en células en división y células confluentes son similares en todas las células. Tanto los virus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 como VVTK-F4L-/FCU1 se replican más en células en división que en células confluentes.

Como medio indirecto para ensayar la especificidad de replicación de virus, se determinó el rendimiento de virus producido en células tumorales en división frente a confluentes (tumor humano pancreático PANC1; tumor humano de pulmón H1299; tumor humano glioma U118MG). Las células confluentes se sembraron a 1x106 células/pocillo y se cultivaron en medio completo durante 7 días después 1 día antes de la infección las células se lavaron y cultivaron en medio sin suero. Las células en división se sembraron a 3x105 células/pocillo un día antes de la infección. Para evaluar el nivel de división celular, la cantidad de timidina tritiada incorporada en ácido nucleico se midió 5 horas, 24 horas y 48 horas después de sembrar las células. Durante este periodo la incorporación de timidina fue relativamente constante en células confluentes mientras que en células en división se vio un aumento en la incorporación a lo largo del tiempo. Después las células se infectaron con 100 ufp de virus, y 48 h tras la infección se determinó la razón entre el rendimiento de virus producido en células tumorales en división y en células tumorales confluentes por titulación de placa en CEF. Los resultados representados en las figuras 9 y 10 muestran que tanto los virus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 como VVTK-F4L-/FCU1 se replican más en células en división que en células confluentes. Los resultados representados en las figuras 9 y 10 muestran además un aumento de la razón en todos los tipos diferentes de células tanto para virus VVTK-I4L-/FCU1 como VVTK-F4L-/FCU1 en comparación con VVTK-/FCU1. Este aumento de la razón en todos los tipos diferentes de células se debe a una menor replicación de virus tanto VVTK-I4L-/FCU1 como VVTK-F4L-/FCU1 en células confluentes. Estos resultados demuestran que los virus tanto VVTK-I4L-/FCU1 como VVTK-F4L-/FCU1 muestran una especificidad aumentada hacia células en división comparados con VVTK-/FCU1.

Modelo tumoral subcutáneo

Se obtuvieron ratones desnudos Swiss hembra de Charles River Laboratories. Los animales usados en los estudios eran de edad uniforme (6 semanas) y los pesos corporales variaron desde 23-26 g. Los ratones desnudos Swiss se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en el flanco con 5x106 células LoVo. Cuando los tumores alcanzaron diámetros de 50-70 mm3, los ratones se aleatorizaron de una manera enmascarada y se trataron con los vectores indicados para los experimentos in vivo.

Biodistribución del virus

La presencia de varios virus se evaluó por titulación de virus en tumores y muestras de órganos. Se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) 1x106 UFP de VV-FCU1 o VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-f4l-/FCU1 por inyección en la vena de la cola en ratones desnudos que portan los tumores LoVo establecidos s.c. Los ratones se sacrificaron en los puntos de tiempo indicados, y los tumores y otros órganos se recogieron y se pesaron. Los tumores y órganos se homogenizaron en PBS y se determinaron los títulos en CEF como se ha descrito previamente. Los títulos víricos se estandarizaron a miligramo de tejido. Los títulos víricos se estandarizaron a miligramo de tejido. Los resultados representados en las tablas 2, 3, 4 y 5 (el intervalo de los títulos del virus se presenta en ufp/mg de tejido) muestra que después de 14 días el virus según la invención se encuentra mayoritariamente en el tumor. Los resultados representados en las figuras 11 y 12 muestran que tanto virus VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 como VVTK-F4L-/FCU1 se dirigen al tumor con aproximadamente de 1.000 a 10.000 veces más virus en el tumor que en los otros órganos analizados excepto para las colas en el caso de VVTK-/FCU1. Una pequeña cantidad de VVTK-/FCU1 se detecta en los pulmones, bazo, riñón y ganglios linfáticos (menos de 10 ufp/mg) y más en la piel, cola y médula ósea el día 6, y la piel y la cola el día 21. En contraste, tanto VVTK-I4L-/FCU1 como VVTK-F4L-/FCU1 tienen mayor especificidad tumoral con solo una pequeña cantidad en los ganglios linfáticos y la cola el día 6, y solo en el tumor el día 21.

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

Actividad antitumoral del poxvirus de la invención en el modelo de tumor s.c.

Ratones desnudos que portan tumores LoVo s.c. establecidos (50-70 mm3) se trataron una vez por vía intravenosa (por la vena de la cola) con los vectores indicados a la dosis de 1.107 UFP, respectivamente. Empezando el día 7 después de la inyección vírica, se dio 5-FC por alimentación forzada oral a 100 mg/kg (0,5 ml de 5-FC al 0,5% en agua) dos veces al día durante 3 semanas. El tamaño del tumor se midió dos veces a la semana usando calibradores. El volumen del tumor se calculó en mm3 usando la fórmula (p/6) (longitud x anchura2). Los resultados representados en la figura 5 y 6 muestran que los varios virus tienen una eficacia similar con una actividad oncolítica (p<0,05) capaz de controlar el crecimiento del tumor, y una actividad combinada (oncolítica del virus y terapéutica del gen FCU1) con la administración de 5-FC que puede mejorar más el control del crecimiento tumoral (p<0,01).

Los ratones desnudos que portan tumores LoVo s.c. establecidos (50-70 mm3) también se trataron por vía intravenosa (por la vena de la cola) con los vectores indicados a la dosis de 1.107 UFP según lo siguiente: 11 días después de la inoculación con el tumor (tumor palpable), los ratones se trataron con tampón H² O, o tampón 5-FC, o una inyección de 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 H²O, o una inyección de 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 5-FC (5-FC administrada 7 días después de la inyección vírica y durante 3 semanas), o dos inyecciones (día 11 y día 33) de 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 H²O, o dos inyecciones (día 11 y día 33) de 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 5-FC (5-FC administrada desde el día 18 al día 32 y desde el día 40 al día 54). Los animales se trataron con 5-FC a 100 mg/kg dos veces al día por alimentación forzada oral. El tamaño del tumor se midió dos veces a la semana usando calibradores. El volumen del tumor se calculó en mm3 usando la fórmula (p/6) (longitud x anchura2). Los resultados representados en la figura 7 muestran que no hay actividad antitumoral del virus solo después de una o dos inyecciones. La adición del tratamiento de 5-FC muestra inhibición estadísticamente significativa de crecimiento tumoral (p<0,05) cuando se compara con los grupos de vehículo y virus solo (sin 5-FC) hasta el día 50. Como con la inyección única, dos inyecciones i.v. de VVTK-I4L-/FCU1 5-FC demuestran una actividad antitumoral significativa cuando se compara con los grupos de vehículo y dos inyecciones de virus solo (sin 5-FC) (p<0,05). Además, se observa una diferencia significativa en la evolución del tumor a partir del día 56 entre una y dos inyecciones de virus en combinación con el tratamiento de 5-FC (p<0,05).

Ratones desnudos que portan tumores U87-MG (células tumorales de glioblastoma) s.c. establecidos se trataron por vía intravenosa (por la vena de la cola) con los vectores indicados a la dosis de 1.107 UFP según lo siguiente: 11 días después de la inoculación con el tumor (tumor palpable), los ratones se trataron con tampón H²O, o tampón 5-FC, o 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 H² O, o 107 ufp de VVTK-I4L-/FCU1 5-FC. Los animales se trataron con 5-FC a 100 mg/kg dos veces al día por alimentación forzada oral, 7 días después de la inyección del virus y durante 3 semanas. El tamaño del tumor se midió dos veces a la semana usando calibradores. El volumen del tumor se calculó en mm3 usando la fórmula (n/6) (longitud x anchura2). Los resultados representados en la figura 8 una alta actividad oncolítica del VVTK-I4L-/FcUl en células U87-MG que produjo una fuerte actividad antitumoral (p<0,0001). La actividad combinada con la adición de 5-FC, por alimentación forzada oral, produce una actividad similar (p<0,0001).

Patogenicidad vírica

La patogenicidad vírica se evaluó con estudios de supervivencia hechos tanto en ratones desnudos Swiss (figura 13) como en ratones B6D2 inmunocompetentes (figura l4). Los ratones se inyectaron I.V. con 1.107 o 1.108 UFP de todos VVTK-/FCU1 y VVTK-I4L-/FCU1 en 100 |jl de tampón por ratón. Los ratones se observaron a diario a lo largo del curso del experimento. En ratones desnudos Swiss (figura l3), la inyección de 1x108 UFP de VVTK-/FCU1 produce la muerte del 40% de los animales 3 días después de la infección. El resto de los ratones murió entre el día 50 y el día 80 después de la infección. La administración de VVTK-I4L-/FCU1 fue menos patógena, la mayoría de los animales murió entre el día 65 y el día 140 (p<0,01). No se ha observado evidencia de toxicidad en ambos virus a 107 ufp (figura 14 (A)). Todos los ratones murieron después de la inyección i.v. de 108 ufp de VVTK-/FCU1 (figura 14 (B)). El grupo con tratamiento de VVTK-I4L-/FCU1 tuvo supervivencia significativamente prolongada al 70% comparado con los ratones infectados con VVTK-/FCU1 (Figura 14 (B)). Por tanto, este resultado demuestra la disminución de toxicidad con el virus doble delecionado VVTK-I4L-/FCU1.

Modelo de lesión en la cola de pústulas

Se inyectaron ratones desnudos Swiss I.V. con 1.106 (figuras 15 y 16) o 1.107 (figuras 17 y 18) UFP de cada virus. Las lesiones en la cola se enumeraron una vez a la semana. Los ratones inyectados con 1.106 UFP de VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 tuvieron menos de 1 pústula/ratón comparados con ratones inyectados con VVTK-/FCU1 con una media de 8 pústulas por ratón el día 13 tras la infección (p<0,001) como se muestra en la figura 15 (A) y la figura 16 (A) . Los resultados son similares el día 34 tras la inyección con una media de 4 pústulas con VVTK-/FCU1 comparado con casi 1 para VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 (p<0,0001) como se muestra en la figura 15 (B) y la figura 16 (B) . Los ratones inyectados con 1.107 UFP de VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 tuvieron respectivamente una media de 3 pústulas/ratón y 2 pústulas/ratón comparados con los ratones inyectados con 1.107 UFP de VVTK-/FCU1 con una media de 10 pústulas/ratón el día 15 tras la infección (figura 17 (A) y figura 18 (A)). El día 31 tras la infección los ratones inyectados con VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 tuvieron respectivamente una media de 1,5 pústulas/ratón y 2 pústulas/ratón comparados con los ratones inyectados con VVTK-/FCU1 con una media de 7 pústulas/ratón (figura 17 (B) y figura 18 (B)). La diferencia en el número de pústulas entre VVTK-/FCU1 y VVTK-I4L-/FCU1 y VVTK-F4L-/FCU1 es estadísticamente significativa (p<0,01). La formación de pústulas se correlaciona con la replicación del virus en la cola y así con la virulencia y toxicidad. La inyección i.v. de VVTK-I4L-/FCU1 o VVTK-F4L-/FCU1 es menos tóxica que con el virus con deleción única de TK.

Combinación VVTK-I4L-/FCU1 e irinotecano

Los efectos terapéuticos del tratamiento con VVTK-I4L-/FCU1 en combinación con irinotecano se evaluaron in vivo en la línea celular de cáncer de páncreas humano MiaPaca2 (número de ATCC®: CRL-1420™) en presencia y ausencia del profármaco 5FC. Más específicamente, ratones desnudos (n = 12 ratones/grupo) se inyectaron por vía subcutánea con 5 x 106 células MiaPaca2. Cuando los tumores tuvieron 100-200 mm3, se inyectó VVTK-I4L-/FCU1 por vía intravenosa a 1 x 106 UFP los días 24, 28 y 30 tras la implantación del tumor. Se administró irinotecano por vía intravenosa a 33 mg/kg/día los días 28, 31, 35, 38, 42, 45. Empezando el día 31 tras la implantación del tumor, se dio 5-FC por alimentación forzada oral a 100 mg/kg dos veces al día durante 3 semanas. El tamaño del tumor se midió usando calibradores. El volumen del tumor se calculó en mm3 usando la fórmula (n/6) (longitud x anchura2). Los ratones se mataron cuando el tamaño tumoral superó 4000 mm3 de volumen. Se usaron pruebas U de Mann-Whitney para determinar las diferencias del volumen del tumor entre los grupos. Un valor P <0,05 se consideró significativo.

El volumen de tumor de tumores implantados MiaPaca2 pancreáticos humanos se midió regularmente (cada 4-6 días) después de la inyección sistémica de VVTK-I4L-/FCU1 /- 5-FC e irinotecano durante un periodo de 73 días tras la implantación del tumor. La tabla 6 proporciona la media de los volúmenes tumorales en mm3 medida en los varios grupos de ratones los días 24, 39, 50, 59, 63 y 73 después de la implantación. “iri” representa irinotecano y “W ” VVTK-I4L-/FCU1.

Tabla 6

f: ratones sacrificados cuando el volumen tumoral es >4000 mm3.

En el modelo MiaPaca2, en términos de crecimiento tumoral, no hubo diferencia entre el grupo control (sin tratar) y el grupo con 5-FC sola. La administración de VVTK-I4L-/FCU1 con o sin 5-FC produjo un ligero efecto antitumoral. La administración de irinotecano con o sin 5-FC mostró un control del crecimiento tumoral significativo comparado con sin tratamiento. El mayor beneficio en términos de control del crecimiento tumoral se vio con VVTK-I4L-/FCU1 en combinación con irinotecano y esto con o sin administración de 5-FC.

En conclusión, el tratamiento con la combinación de VVTK-I4L-/FCU1 e irinotecano (con o sin 5-FC) produjo inhibición significativa del crecimiento tumoral comparado con los otros grupos.

Combinación de VVTK-I4L-/FCU1 y oxaliplatino

Se evaluaron los efectos terapéuticos del tratamiento con VVTK-I4L-/FCU1 en combinación con oxaliplatino in vivo en la línea celular LoVo de cáncer colorrectal en presencia o ausencia del profármaco 5FC. También se ensayó 5FU en estas condiciones.

Más específicamente, ratones desnudos (n = 11 ratones/grupo) se inyectaron por vía subcutánea con 5 x 106 células LoVo. Cuando los tumores tuvieron 100-200 mm3, se inyectó VVTK-I4L-/FCU1 por vía intravenosa a 1 x 107 Ufp el día 21 tras la implantación del tumor. Se administró oxaliplatino por vía intraperitoneal a 2,5 mg/kg/día los días 24, 27, 31, 34, 38, 41. Empezando el día 28 tras la implantación del tumor, se dio 5-FC por alimentación forzada oral a 100 mg/kg dos veces al día durante 3 semanas. Empezando el día 23 tras la implantación del tumor, se dio 5-FU por vía intraperitoneal a 20 mg/kg/día durante 3 semanas. El tamaño del tumor se medió usando calibradores. El volumen del tumor se calculó en mm3 usando la fórmula (n/6) (longitud x anchura2). Los ratones se mataron cuando el tamaño tumoral superó 4000 mm3 de volumen. Se usaron pruebas U de Mann-Whitney para determinar las diferencias del volumen del tumor entre los grupos. Un valor P <0,05 se consideró significativo.

El volumen de tumor de tumores implantados LoVo colorrectal humano se midió regularmente (cada 4-6 días) después de la inyección sistémica de VVTK-I4L-/FCU1 /- 5-FC y oxaliplatino durante un periodo de 52 días tras la implantación del tumor. La tabla 7 proporciona la media de los volúmenes tumorales en mm3 medida en los varios grupos de ratones los días 19, 25, 32, 46, 49 y 52 después de la implantación. “oxa” representa oxaliplatino y “VV” VVTK-I4L-/FCU1.

Tabla 7

En el modelo LoVo, en términos de crecimiento tumoral, el tratamiento con oxaliplatino solo, 5-FC sola, oxaliplatino 5-FC, 5-FU solo, oxaliplatino 5-FU o VVTK-I4L-/FCU1 solo proporcionaron un ligero control del crecimiento tumoral comparado con los ratones control (sin tratar). VVTK-I4L-/FCU1 oxaliplatino o VVTK-I4L-/FCU1 5-FC produjeron un control significativo del crecimiento tumoral comparado con sin tratamiento. El mayor beneficio en términos de control del crecimiento tumoral se vio con la combinación VVTK-I4L-/FCU1 5-FC oxaliplatino. El tratamiento con esta combinación produjo inhibición significativa del crecimiento tumoral comparado con sin tratamiento, oxaliplatino solo, 5-FC sola, oxaliplatino 5-FC, VVTK-I4L-/FCU1 solo, VVTK-I4L-/FCU1 oxaliplatino o VVTK-I4L-/FCU1 5-FC. Además, el tratamiento con la combinación VVTK-I4L-/FCU1 5-FC oxaliplatino produjo efecto significativamente antitumoral comparado con el fármaco quimioterapéutico 5-FU solo o en combinación con oxaliplatino (5-FU se dio por vía intraperitoneal a las concentraciones toleradas máximas).

En conclusión, el tratamiento de VVTK-I4L-/FCU1 y oxaliplatino notablemente en presencia de 5-FC demostró proporcionar un efecto antitumoral aumentado comparado con cada uno de VVTK-I4L-/FCU1 y oxaliplatino, así como con el fármaco antitumoral estándar 5-FU.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron usando la prueba U de Mann-Whitney no paramétrica y el software STATISTICA 7.1 (StatSoft, Inc.). Un p < 0,05 se consideró que era estadísticamente significativo.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un poxvirus oncolítico que comprende un gen deficiente que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa (I4L) y/o la subunidad pequeña de la ribonucleótido reductasa (F4L) y un gen deficiente que codifica la timidina quinasa (J2R) y que además comprende un gen suicida para uso en tratar cáncer en combinación con una o más sustancias eficaces en terapia anticáncer, en donde la una o más sustancias eficaces en la terapia anticáncer se seleccionan de irinotecano y oxaliplatino.

2. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 1 en donde dicho poxvirus es un virus vaccinia cepa Copenhague.

3. La composición para uso en tratar cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en donde dicha composición y dicha una o más sustancias se administran a través de la ruta sistémica o en el tumor, preferiblemente por vía intravenosa.

4. La composición para uso en tratar cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde las dosis de irinotecano están comprendidas desde 5 a 100 mg/kg/día y las dosis de poxvirus están comprendidas desde 1x106 a 1x109 ufp.

5. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 4 en donde dicho poxvirus se inyecta de una a tres veces por vía intravenosa y el irinotecano se inyecta de 3 a 10 días después de la primera administración de dicho poxvirus.

6. La composición para uso en tratar cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el oxaliplatino se administra por vía intravenosa o intraperitoneal y el poxvirus se administra por vía intravenosa.

7. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 6 en donde las dosis de oxaliplatino están comprendidas desde 0,5 a 10 mg/kg/día y las dosis de poxvirus están comprendidas desde 1x106 a 1x109 ufp.

8. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 6 o 7 en donde dicho poxvirus se inyecta de una a tres veces por vía intravenosa y el oxaliplatino cada dos semanas durante uno o más ciclos.

9. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 8 en donde dicho oxaliplatino se administra de 3 a 10 días después de la primera administración de dicha composición de poxvirus.

10. La composición para uso en tratar cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde dicho gen suicida codifica una proteína que tiene al menos una actividad citosina desaminasa y una uracilo fosforribosil transferasa.

11. La composición para uso en tratar cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde el gen suicida codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como la representada en la secuencia en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

12. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 10 o 11 en donde dicho uso comprende además una cantidad farmacéuticamente aceptable de un profármaco.

13. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 12 en donde dicho profármaco es 5-fluorocitosina.

14. La composición para uso en tratar cáncer según la reivindicación 13 en donde dicho profármaco se administra preferiblemente al menos 3 días, más preferiblemente al menos 4 días e incluso más preferiblemente al menos 5 días después de la administración de dicha composición de poxvirus.

15. La composición para uso en tratar cáncer según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres de la mama, del útero, de la próstata, del pulmón, de la vejiga, del hígado, del colon, del páncreas, del estómago, del esófago, de la laringe, del sistema nervioso central, por ejemplo, glioblastoma, y de la sangre, preferiblemente cáncer de páncreas y cáncer colorrectal.