KR102457060B1 - 폭스바이러스 종양용해 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결손 F4L 및/또는 14L 유전자를 포함하는 폭스바이러스, 뿐만 아니라 항암 요법에 효과적인 1종 이상의 물질을 포함하는 조성물, 및 치료 목적을 위한, 보다 구체적으로 암의 치료를 위한 상기 조성물의 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

폭스바이러스 종양용해 벡터 {POXVIRAL ONCOLYTIC VECTORS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 2008년 11월 17일에 미국을 지정국으로 하여 출원되었고 2009년 5월 28일에 영어로 WO 2009/065546 A1로서 공개되었으며 2007년 11월 19일에 출원된 EP 07301557.0을 35 U.S.C. § 119 하에 우선권 주장하는 PCT/EP2008/009720의 미국 국내 단계 출원인, 2010년 5월 18일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 12/743,402의 일부 계속 출원이고; 상기 출원 각각의 내용은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 명백하게 포함되며 각각은 그의 양수인에게 양도된다.

기술 분야

종양용해 바이러스는 종양-의존성 자기-영속화의 고유한 특성을 갖는 암의 치료에 사용되는 신규 치료제 부류이다 (HERMISTON. A demand for next-generation oncolytic adenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.322-30.). 종양용해 바이러스는 악성 세포에서 선택적 복제가 가능하고, 따라서 통상적인 암 치료보다 잠재적으로 훨씬 더 높은 수준의 효력 및 특이성을 제공한다 (FISHER. Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics. 2006, vol.8, no.4, p.301-13.). 이들 바이러스의 사용 이익은 이들이 복제되면서 이들의 숙주 세포를 용해시킨다는 것이다. 암 세포는 불활성화된 항바이러스 인터페론 경로를 가지거나 또는 바이러스의 복제가 방해받지 않고 진행될 수 있게 하는 돌연변이된 종양 억제 유전자를 갖기 때문에 많은 바이러스에게 이상적인 숙주이다 (CHERNAJOVSKY, et al. Fighting cancer with oncolytic viruses. British medical journal. 2006, vol.332, no.7534, p.170-2.).

일부 바이러스는 자연적으로 종양 세포에서 선택적으로 복제될 수 있으나, 종양용해 바이러스는 또한 자연 발생 바이러스를 변형시킴으로써 수득될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 현재 바이러스를 변형시키기 위해 사용되는 주요 전략은 다음을 포함한다: 본질적 바이러스 유전자 내 기능 결실; 이들 바이러스 유전자의 발현을 제어하기 위해 사용되는 종양- 또는 조직-특이적 프로모터; 및 아데노바이러스를 암 세포 표면으로 다시 향하게 하는 향성 변형. 가까운 미래에, 종양용해 아데노바이러스는, 중요한 항암 도구로서의 그의 잠재성을 완전히 인식하여 악성 신경교종을 갖는 환자의 예후를 개선시키도록 최적화될 필요가 있다 (JIANG, et al. Oncolytic adenoviruses as antiglioma agents. Expert review of anticancer therapy. 2006, vol.6, no.5, p.697-708.).

예를 들어, p53 돌연변이를 보유하는 세포에서 선택적으로 복제되고 이러한 세포를 사멸시키도록 변형된 아데노바이러스인 ONYX-015는 두경부, 위장 및 췌장 종양을 비롯한 다양한 고형 종양의 잠재적 치료를 위해 오닉스 파마슈티칼스(Onyx Pharmaceuticals)가 개발 중이다. 이는 E1B 유전자좌에 기능 상실 돌연변이 (이의 산물은 p53 종양 억제 단백질에 결합하여 그를 불활성화시키는 55 kDa 단백질임)를 보유하는 재조합 아데노바이러스이다. 따라서, ONYX-015 아데노바이러스는 정상 세포가 영향받지 않게 두는 것으로 생각된다. p53 종양 억제 유전자 내 돌연변이는 모든 주요 암 유형의 절반 초과에서 발생하는, 암 내 유전자 이상의 가장 흔한 유형이다. 따라서, 이들 세포는, 용이하게 복제되고 세포 사멸을 야기할 바이러스에 감수성이다. ONYX-015는 재발성 두경부암의 치료에 대한 III상 시험, 결장직장, 난소, 췌장 및 구강 종양에 대한 II상 시험, 및 소화 질환, 식도 및 간 종양에 대한 I상 시험이 진행 중이다 (COHEN, et al. ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals. Current opinion in investigational drugs. 2001, vol.2, no.12, p.1770-5.).

자연 종양용해 바이러스는 종양 세포를 선택적으로 감염 및 사멸시키는 선천적 능력을 갖는 복제-적격 바이러스이다. 50년 전 살아있는 바이러스로 암을 치료하려는 최초의 시도에서 사용되었음에도 불구하고, 자연 종양용해 바이러스에 대한 관심은 암 치료제로서의 조작된 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스에 대한 지원에 뒤처져 왔다. 그러나 최근, 이들 자연 발생 작용제의 높은 효력 및 선택성에 대한 관심이 재개되었다 (ROBERTS, et al. Naturally oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics . 2006, vol.8, no.4, p.314-21.).

자연 종양용해 바이러스 중에, 백시니아(Vaccinia) 바이러스 (폭스비리다에(Poxviridae))는 종양용해 바이러스요법에서 사용되는 이상적인 바이러스 백본에 필수적인 많은 핵심 속성을 보유한다. 이들은 급속한 세포-대-세포 확산과 함께 짧은 생활주기, 강한 용해 능력, 큰 클로닝 용량 및 잘-규정된 분자 생물학을 포함한다. 추가로, 이들은 인간 세포에서 복제될 수 있지만, 자연 건강 문제로 여겨지지 않고, 특히 천연두 박멸 캠페인 동안 수백만명의 개체에게 전달되어 잘 특징화되어 있다. 백신 균주 또는 유전자 변형된 백시니아 균주를 사용한 초기 임상 결과는 항종양 효과를 입증하였다 (THORNE, et al. Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer. Current opinion in molecular therapeutics. 2005, vol.7, no.4, p.359-65.).

대조적으로, 폭스바이러스 점액종 바이러스는 토끼류 (토끼)에 뚜렷하고 절대적인 숙주 종 향성을 가진만큼, 인간에서 직접적으로 사용된 이력이 없는 신규 종양용해 후보이다. 점액종 바이러스는 또한 인간 종양 세포를 선택적으로 감염 및 사멸시킬 수 있으며, 이는 인간 암의 대다수에서 발견된 조절이상 세포내 신호전달 경로에 연관된 고유한 향성이라는 것이 최근에 제시되었다. 이 검토는 인간 암 세포에 대한 점액종 바이러스의 향성에 관한 기존 지식, 뿐만 아니라 암의 동물 모델에서 종양을 감염시키고 제거하는 그의 능력을 나타내는 전임상 데이터를 약술한다 (STANFORD, et al. Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cancer. Expert opinion on biological therapy. 2007, vol.7, no.9, p.1415-25.).

기술적 문제

항종양 효과를 달성하기 위해 필요한 폭스바이러스의 고용량 주사는 독성 문제를 제기하였다. 유해 사건의 대다수는 백시니아 바이러스에 통상적으로 연관된 소수의 유해 반응이고, 자기-제한적이며, 백신접종 부위에 열, 두통, 피로, 근육통, 오한, 국부 피부 반응, 비특이적 발진, 다형성 홍반, 림프절병증 및 통증을 포함한다. 다른 반응에는 추가의 요법 (예를 들어, VIG, 1차 요법 및 시도포비르, 2차 요법)이 요구될 수 있다. 추가의 평가 또는 요법이 요구될 수 있는 유해 반응은 예기치 않은 접종, 전신 백시니아 (GV), 백시니아성 습진 (EV), 진행성 백시니아 (PV), 백시니아후 중추 신경계 질환 및 태아 백시니아를 포함한다 (CONO, et al. Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 2003, vol.52, no.RR-4, p.1-28.).

따라서, 자연 대응물만큼 우수한 종양용해 활성을 갖는 보다 안전한 폭스바이러스가 필요하다.

US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY), 15/11/1994)에는 변형된 재조합 폭스바이러스, 보다 구체적으로 재조합 폭스바이러스가 약화된 병독성 및 증진된 안전성을 갖도록 비본질적 바이러스-코딩된 유전적 기능을 불활성화시킨 백시니아 바이러스가 기재되어 있다. 특히, 유전적 기능은 병독성 인자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 결실시키거나 병독성 인자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 삽입 불활성화에 의해 불활성화된다. 보다 구체적으로, 이 특허에는 J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L - K1L 및 I4L의 오픈 리딩 프레임이 불활성화된 백시니아 바이러스가 기재되어 있다. 이 바이러스 (NYVAC)는 외래 핵산을 위한 벡터로서 조작되고 숙주 동물에서 면역학적 반응을 유도하기 위한 백신으로서 사용될 수 있다. 그러나 NYVAC는 대부분의 포유동물 세포에서 효율적으로 복제될 수 없고, 종양용해 바이러스로서 사용될 수 없다 (XIANGZHI, et al. Vaccinia virus K1L protein supports viral replication in human and rabbit cells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that are distinct from its binding site for ACAP2. Journal of virology. 2006, vol.353, no.1, p.220-233.).

WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US), 19/02/2004)에는 바이러스 게놈에 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 변경된 백시니아 바이러스가 기재되어 있다. 기재된 돌연변이는 하기 폴리펩티드 부류 중 하나 이상에 속한다: 1) 인터페론-조정 폴리펩티드; 2) 상보적 제어 폴리펩티드; 3) TNF 또는 케모카인-조정 폴리펩티드; 4) 세린 프로테아제 억제제; 5) IL-lp 조정 폴리펩티드; 6) 비-감염성 EEV 형태 폴리펩티드; 및 7) 세포로부터 감염성 바이러스의 방출을 억제하도록 작용하는 바이러스 폴리펩티드 (항감염성 바이러스 형태 폴리펩티드). 추가로, 백시니아 바이러스의 A41L 또는 C11R에서의 돌연변이가 또한 개시되어 있다.

백시니아 게놈 영역, 예컨대 A34R, A41L, A53R, B5R, B7R, B8R, B13R, B15R, B18R, B22R, B28R, B29R, CUR, E3L, K2L, N1L, vC12L 및 vCKBP는 본 출원에서 보다 구체적으로 기재된다. 본 발명의 방법은 본원에서 논의된 임의의 폭스바이러스의 사용을 수반한다. 본 발명자들은 또한 암 세포 또는 환자에게 유효량의 상기 변경된 백시니아 바이러스를 투여하여 암을 치료하는 방법을 개시한다.

본 발명자들은 놀랍게도 결손 I4L 및/또는 F4L 유전자를 포함하는 폭스바이러스가 개선된 안전성 프로파일을 가지나 (그의 자연 대응물과 비교하여) 동등한 종양용해 활성을 유지한다는 것을 발견하였다.

본 발명은 결손 I4L 및/또는 F4L 유전자를 포함하는 폭스바이러스 (단, 상기 폭스바이러스는 NYVAC가 아님)에 관한 것이다.

전체 출원 전반에 걸쳐 사용되고 있는 바와 같이, 단수 형태의 용어는 문맥에 달리 명백히 명시되어 있지 않는 한, 언급된 성분 또는 단계 중 "적어도 1개", "적어도 제1", "1개 이상" 또는 "복수개"를 의미한다는 의미로 사용된다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수개의 세포 (그의 혼합물 포함)를 포함한다.

용어 "및/또는"은 본원에 어디에서 사용되든지 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결되는 요소 모두 또는 그의 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 내, 바람직하게는 10% 내, 보다 바람직하게는 5% 내를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "포함하는" 및 "포함하다"는 생성물, 조성물 및 방법이 언급된 성분 또는 단계를, 다른 것을 배제하지 않고서 포함한다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 생성물, 조성물 및 방법을 정의하는데 사용될 때 "본질적으로 이루어진"은 임의의 본질적으로 유의한 다른 성분 또는 단계를 배제한다는 것을 의미한다. 따라서, 언급된 성분으로 본질적으로 이루어진 조성물은 미량 오염물 및 제약상 허용되는 담체를 배제하지는 않을 것이다. "로 이루어진"은 다른 성분 또는 단계의 미량을 넘는 요소를 배제한다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "결손 유전자를 포함하는 폭스바이러스"는 결손 유전자의 1개 이상의 핵산에서의 결실, 치환 또는 부가, 또는 이들 가능성의 임의의 조합을 포함하며, 상기 변형으로 바이러스가 비변형 유전자에 의해 생산된 단백질의 활성을 갖는 단백질을 생산할 수 없게 되는 폭스바이러스를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 결손 유전자를 포함하는 폭스바이러스는 전체 유전자 서열이 결실된 폭스바이러스를 지칭한다. 돌연변이는 재조합 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법으로 만들어질 수 있다. 폭스바이러스의 게놈을 변형시키는 방법은 관련 기술분야에서 이용가능하다. 예를 들어 문헌 [MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.. Cancer res.. 2001, no.61, p.8751-57.], [KIM, et al. Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy for cancer with JX-594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF. Molecular Therapeutic. 2006, no.14, p.361-70.], WO 2004/014314 (KIRN DAVID (US), 19/02/2004) 및 US 5364773 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY), 15/11/1994)에 개시된 방법이 본 발명의 폭스바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 본 출원의 실시예에 개시된 방법은 본 발명에 따른 폭스바이러스를 생산하는데 특히 적절하다. 다양한 폭스바이러스의 게놈의 서열이 관련 기술분야에서 입수가능하며, 예를 들어 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스(Canarypox) 바이러스, 엑트로멜리아(Ectromelia) 바이러스, 점액종 바이러스 게놈이 진뱅크(Genbank)에서 입수가능하다 (각각 수탁번호 NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_001132).

본원에 사용된 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리다에 과에 속하는 바이러스를 지칭한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 코르도폭스비리다에(Chordopoxviridae) 아과, 보다 바람직하게는 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속, 보다 더 바람직하게는 백시니아 바이러스 종에 속한다.

예를 들어, 백시니아 바이러스 균주 다이렌(Dairen) I, IHD-J, L-IPV, LC16M8, LC16MO, 리스터(Lister), LIVP, 타쉬켄트(Tashkent), WR 65-16, 와이어스(Wyeth), 앙카라(Ankara), 코펜하겐(Copenhagen), 티안 탄(Tian Tan) 및 WR이 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐이다.

폭스바이러스 백시니아는 큰 듀플렉스 DNA 게놈 (187 킬로염기 쌍)을 포함하고 감염된 세포의 세포질에서 복제되는 유일하게 공지된 DNA 바이러스 과의 구성원이다. 감염된 세포는 다량의 DNA 전구체를 세포질 복제 부위로 전달해야 하기 때문에, 바이러스는 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 데옥시우리딘 5'-트리포스페이트 뉴클레오티도히드롤라제 (dUTPase)를 비롯한, DNA 대사 및 합성에 요구되는 많은 효소적 활성을 코딩 및 발현한다.

리보뉴클레오티드 리덕타제 (EC 1.17.4.1)는 DNA 생합성에서 최초 개입 단계를 나타내는 반응인, 리보뉴클레오티드에서 데옥시리보뉴클레오티드로의 환원을 촉매한다. 바이러스 효소는 R1 및 R2로 지정된 2개의 이종 서브유닛으로 구성되어, 포유동물 효소와 서브유닛 구조에 있어서 유사하다. 바이러스 리보뉴클레오티드 리덕타제 서브유닛을 코딩하는 유전자는 서열분석되었고, 백시니아 게놈 상에 35 킬로염기만큼 이격된 위치로 국재화되어 있었다 (SLABAUGH, et al. Journal of virology. 1988, vol.62, p.519-27.; TENGELSEN, et al. Virology. 1988, no.164, p.121-31.; SCHMITT, et al. Journal of virology. 1988, no.62, p.1889-97.). 백시니아 바이러스의 큰 서브유닛 (R1로 지정됨, I4L 유전자에 의해 코딩됨)의 단량체는 86-kDa 폴리펩티드이고, 알로스테릭 이펙터인 뉴클레오티드 기질에 대한 결합 부위를 함유한다 (SLABAUGH, et al. Journal of virology. 1984, no.52, p.507-14.; SLABAUGH, et al. Journal of virology. 1984, no.52, p.501-6.). 작은 서브유닛 (R2로 지정됨, F4L 유전자에 의해 코딩됨)은 2개의 37-kDa 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체이고; 각각의 폴리펩티드는 촉매작용에 요구되는 철-안정화된 단백질-기재 자유 라디칼을 함유한다 (HOWELL, et al. Journal of Biological Chemistry. 1992, no.267, p.1705-11.). 다양한 폭스바이러스의 게놈에서의 I4L 및 F4L 유전자의 서열 및 그의 위치는 공중 데이터베이스에서, 예를 들어 수탁번호 DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 및 NC_008291을 통해 입수가능하다.

본원에 사용된 유전자 명명법은 코펜하겐 백시니아 균주의 것이고 달리 나타내지 않는 한 다른 폭스비리다에의 상동 유전자에도 또한 사용된다. 그러나, 유전자 명명법은 폭스 균주에 따라 상이할 수 있다. 참조로, 코펜하겐 및 MVA 유전자 사이의 상응은 문헌 [ANTOINE. Virology. 1998, no.244, p.365-396]의 표 1에서 찾아볼 수 있다.

바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 결손 J2R 유전자를 추가로 포함한다.

J2R 유전자는 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드 합성을 위한 샐비지 경로의 일부를 형성하는 티미딘 키나제 (TK)를 코딩한다. TK에 의해 촉매되는 반응은 ATP로부터 2'데옥시-티미딘 (dThd)으로 γ-포스포릴 모이어티를 전달하여 티미딘 5'--모노포스페이트 (dTMP)를 생성하는 것을 수반한다. 백시니아 바이러스의 TK는 유형 2이다. 유형 2 TK는 유형 1과 비교하여 더 작은 폴리펩티드 쇄 (~25 KDa)를 가지나 동종사량체를 형성한다. 이들은 대사 경로의 말기에 생성되는 피드백 억제제 dTDP 또는 dTTP에 대해 감수성이다. 유형 2 TK는 유형 1 TK와 비교하여 훨씬 더 좁은 기질 특이성을 갖고, 단지 2'데옥시우리딘 (dU) 및/또는 dThd를 인산화한다 (EL OMARI, et al. Structure of vaccinia virus thymidine kinase in complex with dTTP: insights for drug design. BMC structural biology. 2006, no.6, p.22.).

J2R 영역에 결손이 있는 폭스바이러스 및 그를 수득하는 방법은 관련 기술분야에서 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [MCCART, et al. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. cancer research. 2001, vol.61, no.24, p.8751-7.], [PUHLMANN, et al. Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant. Cancer gene therapy. 2000, vol.7, no.1, p.66-73.], [GNANT, et al. Systemic administration of a recombinant vaccinia virus expressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with 5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongation of survival in mice. Cancer Research . 1999, vol.59, no.14, p.3396-403.]의 교시가, J2R 영역에 결실이 있는 폭스바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다.

바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 결손 F2L 유전자를 추가로 포함한다.

데옥시우리딘 5'-트리포스페이트 뉴클레오티도히드롤라제 (dUTPase, EC 3.6.1.23)는 Mg(2+) 이온의 존재 하에 dUTP에서 dUMP 및 피로포스페이트로의 가수분해를 촉매한다. dNTP 풀로부터 dUTP를 제거하고 dUMP를 생성하는데 있어서의 dUTPase는 DNA 복제의 충실도를 유지하는데 및 티미딜레이트 신타제에 의해 TMP를 생성하기 위한 전구체를 제공하는데 둘 다에 관여한다. 백시니아 dUTPase는 F2L 유전자에 의해 코딩되는 15 kDa 단백질이다 (MCGEOGH. Nucleic Acids Research. 1990, no.18, p.4105-10.; BROYLES. Virology. 1993, no.195, p.863-5.). 백시니아 바이러스의 F2L 유전자의 서열은 진뱅크에서 수탁번호 M25392를 통해 입수가능하고, 다양한 폭스바이러스 게놈에서의 F2L 유전자의 서열 및 위치는 또한 진뱅크에서, 예를 들어 수탁번호 NC_006998, DQ121394, NC_001611, AY689436, AY689437, NC_008291, DQ437594, DQ437593, AY313847, AY313848, NC_006966, NC_005309, NC_003391, NC_003389, NC_001132, NC_003310, NC_002188, M35027, AY243312, AF170726, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, X94355, Y16780, AY318871, U94848, AF198100 및 M34368을 통해 입수가능하다.

바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 관심 핵산을 추가로 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 관심 핵산은 치료 분자인 유전자 산물 (즉, 치료 유전자)을 코딩하는 적어도 1종의 관심 서열을 함유한다. "치료 분자"는 환자, 특히 질환 또는 질병 상태를 앓고 있는 환자 또는 이 질환 또는 상태로부터 보호되어야 할 환자에게 적절하게 투여될 때 약리학적 또는 보호 활성을 갖는 것이다. 이러한 약리학적 또는 보호 활성은 상기 질환 또는 상기 상태의 과정 또는 증상에 대한 유익한 효과와 관련될 것으로 예상되는 것이다. 통상의 기술자가 본 발명의 과정에서 치료 분자를 코딩하는 유전자를 선택할 때, 그는 일반적으로 그의 선택을 이전에 얻은 결과와 관련시키고, 청구된 바와 같은 본 발명을 실시하는 것 이외에 과도한 실험 없이 이러한 약리학적 특성을 얻을 것으로 합리적으로 예상할 수 있다. 본 발명에 따르면, 관심 서열은 이것이 도입되는 표적 세포에 대해 동종 또는 이종일 수 있다. 유리하게, 상기 관심 서열은 폴리펩티드, 특히 치료적 또는 예방적 특성을 제공하는 치료적 또는 예방적 폴리펩티드의 모두 또는 일부를 코딩한다. 폴리펩티드는 크기 및 글리코실화되었는지 여부와 무관하게 폴리뉴클레오티드의 임의의 번역 산물인 것으로 이해되고, 펩티드 및 단백질을 포함한다. 치료적 폴리펩티드는 주요 예로서 동물 또는 인간 유기체 내 결손 또는 결핍 단백질을 보상할 수 있는 그러한 폴리펩티드, 또는 독성 효과를 통해 작용하여 신체로부터 유해한 세포를 제한 또는 제거하는 것을 포함한다. 이들은 또한 체액성 또는 세포성 반응 또는 둘 다를 유발하기 위해 내인성 항원으로서 작용하는 면역 부여 폴리펩티드일 수 있다.

치료 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 예는 시토카인 (알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터류킨, 특히 IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12, 종양 괴사 인자 (TNF), 콜로니 자극 인자 GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), 면역자극 폴리펩티드 (B7.1, B7.2 등), 응고 인자 (FVIII, FIX...), 성장 인자 (형질전환 성장 인자 TGF, 섬유모세포 성장 인자 FGF 등), 효소 (우레아제, 레닌, 트롬빈, 메탈로프로테이나제, 산화질소 신타제 NOS, SOD, 카탈라제...), 효소 억제제 (알파1-항트립신, 항트롬빈 III, 바이러스 프로테아제 억제제, 플라스미노겐 활성화제 억제제 PAI-1), CFTR (낭성 섬유증 막횡단 전도 조절자) 단백질, 인슐린, 디스트로핀, 부류 I 또는 II의 MHC 항원, 세포 유전자의 발현을 조정/조절할 수 있는 폴리펩티드, 박테리아, 기생충 또는 바이러스 감염 또는 그의 발생을 억제할 수 있는 폴리펩티드 (항원 폴리펩티드, 항원 에피토프, 경쟁에 의해 천연 단백질의 작용을 억제하는 트랜스도미넌트 변이체....), 아폽토시스 유도제 또는 억제제 (Bax, Bcl2, BclX...), 세포증식억제제 (p21, p16, Rb...), 아포지단백질 (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), 혈관신생의 억제제 (안지오스타틴, 엔도스타틴...), 혈관신생 폴리펩티드 (혈관 내피 성장 인자 VEGF의 패밀리, FGF 패밀리, CCN 패밀리 (CTGF, Cyr61 및 Nov 포함)), 산소 라디칼 스캐빈저, 항종양 효과를 갖는 폴리펩티드, 항체, 독소, 면역독소 및 마커 (베타-갈락토시다제, 루시페라제....)를 코딩하는 유전자 또는 임상 상태의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 관련 기술분야에서 인식되는 임의의 다른 관심 유전자를 포함한다.

적합한 항종양 유전자는 종양 억제 유전자 (예를 들어, Rb, p53, DCC, NF-1, 윌름스 종양(Wilm's tumor), NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73, 뿐만 아니라 이들의 각 돌연변이체), 자살 유전자 산물, 항체, 세포 분열 또는 형질도입 신호를 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특히 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 자살 유전자를 추가로 포함한다.

자살 유전자는 약물의 전구체를 세포독성 화합물로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭한다.

자살 유전자는 시토신 데아미나제 활성, 티미딘 키나제 활성, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 활성 및/또는 티미딜레이트 키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

자살 유전자 및 1개의 핵염기 모이어티를 포함하는 약물의 상응하는 전구체의 예가 하기 표에 개시되어 있다:

<표 1>

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 적어도 CDase 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. CDase는 외인성 시토신이 가수분해성 탈아미노화에 의해 우라실로 변환되는 피리미딘 대사 경로에 관여한다. CDase 활성은 원핵생물 및 하등 진핵생물에서 입증되었지만 (JUND, et al. Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15.; BECK, et al. Journal of Bacteriology. 1972, no.110, p.219-28.; HOEPRICH, et al. Journal of Infectious Diseases. 1974, no.130, p.112-18.; ESDERS, et al. J. biol. chem.. 1985, no.260, p.3915-22.), 포유동물에는 존재 하지 않는다 (KOECHLIN, et al. Biochemical pharmacology. 1966, no.15, p.435-46.; POLAK, et al. Chemotherapy. 1976, no.22, p.137-53.).

CDase는 또한 시토신의 유사체, 즉 5-플루오로시토신 (5-FC)을 탈아미노화하여, 5-플루오로우라실 (5-FU)을 형성하며, 이는 5-플루오로-UMP (5-FUMP)로 전환될 때 고도로 세포독성인 화합물이다. 포유동물 세포와 같이, CDase 활성이 결여된 세포 (효소를 코딩하는 유전자를 불활성화하는 돌연변이 때문에 또는 세포에 이 효소가 자연적으로 결핍되었기 때문에)는 5-FC에 대해 내성을 갖는다 (JUND, et al. Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15.; KILLSTRUP, et al. Journal of Bacteriology. 1989, no.171, p.2124-2127.). 대조적으로, CDase 활성을 코딩하는 서열이 전달된 포유동물 세포는 5-FC에 대해 감수성이 된다 (HUBER, et al. Cancer Research. 1993, no.53, p.4619-4626.; MULLEN, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, no.89, p.33-37.; WO 93/01281 (US HEALTH)). 추가로, 이웃하는 형질전환되지 않은 세포가 또한 5-FC에 대해 감수성이 된다 (HUBER, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, no.91, p.8302-6.). 방관자 효과로 칭해지는 이 현상은 CDase 활성을 발현하여 5-FU를 분비하고, 이는 이어서 형질 막을 가로지르는 직통 확산에 의해 이웃하는 세포를 중독시키는 세포에 기인한다. 확산에 있어서의 이러한 5-FU 특성은, 방관자 효과가 tk를 발현하는 세포와 접촉될 것을 요구하는 tk/GCV 참조 시스템과 비교하여 소극적으로 장점을 나타낸다 (MESNIL, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996, no.93, p.1831-35.). 유전자 요법, 특히 항암 유전자 요법과 관련하여 CDase가 제공하는 모든 장점은 따라서 용이하게 이해될 수 있다.

사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) (에스. 세레비지아에) FCY1, 칸디다 알비칸스(Candida Albicans) FCA1 및 이. 콜라이(E. coli) codA 유전자 (이들은 각각 이들 두 유기체의 CDase를 코딩함)가 공지되어 있고, 그의 서열이 공개되었다 (각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 4, 서열식별번호: 5; 서열식별번호: 6).

이와 관련하여, 본 발명의 보다 바람직한 실시양태에 따르면, CDase 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자는 FCY1, FCA1 또는 CodA 또는 그의 유사체이다. 이들 유전자의 유사체는 모 유전자의 핵산 서열과 적어도 70% 초과, 유리하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게 95% 초과의 동일성 정도를 갖는 핵산 서열을 갖는 유전자를 지칭한다.

특허 WO 2005/007857에는 개선된 CDase 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자가 개시되어 있다. 이 폴리펩티드는 아미노산 서열의 부가에 의해 천연 CDase로부터 유도되었다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, CDase 활성을 갖는 단백질은 WO 2005/007857에 개시된 폴리펩티드이고, 보다 바람직하게는 서열 식별자 서열식별번호: 2에 제시된 FCU1-8 폴리펩티드 및 그의 유사체이다.

원핵생물 및 하등 진핵생물에서, 우라실은 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 (UPRTase)의 작용에 의해 UMP로 변환된다. 이 효소는 5-FU를 5-FUMP로 전환시킨다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 UPRTase 활성을 갖는 단백질을 코딩한다.

해당 UPRTase는 임의의 기원, 특히 원핵, 진균 또는 효모 기원일 수 있다. 예시로서, 이. 콜라이로부터 (ANDERSEN, et al. Characterization of the upp gene encoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12. European Journal of Biochemistry. 1992, no.204, p.51-56.), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 (MARTINUSSEN, et al. Cloning and characterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology. 1994, vol.176, no.21, p.6457-63.), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)로부터 (KIM, et al. Complete sequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Mycobacterium bovis BCG. Biochemistry and molecular biology international. 1997, vol.41, no.6, p.1117-24.) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 (MARTINUSSEN, et al. Two genes encoding uracil phosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 1995, vol.177, no.1, p.271-4.)의 UPRTase를 코딩하는 핵산 서열이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 그러나, 효모 UPRTase를 사용하는 것이 가장 특히 바람직하고, 특히 문헌 [KERN, et al. The FUR1 gene of Saccharomyces cerevisiae: cloning, structure and expression of wild-type and mutant alleles. (Gene. 1990, vol.88, no.2, p.149-57.)]에 서열이 개시되어 있는 에스. 세레비지아에 FUR1 유전자에 의해 코딩되는 것이 본원에 참조로 도입된다. 참조로, 유전자의 서열 및 상응하는 UPRTase의 것은 문헌 및 전문 데이터뱅크 (스위스프롯(SWISSPROT), EMBL, 진뱅크, 메드라인(Medline) 등)에서 찾아볼 수 있다.

출원 EP 0998568 A에는 코딩 부분의 5'에서 105개 뉴클레오티드가 결여되어 N-말단 위치에서 35개의 처음 잔기가 결실된 UPRTase의 합성을 가능하게 하고 천연 단백질에서의 위치 36에서 메티오닌으로 시작되는 FUR1 유전자가 기재되어 있다. FUR1Δ105로 지정된 돌연변이체 유전자의 발현의 산물은 에스. 세레비지아에의 fur1 돌연변이체를 보완할 수 있다. 추가로, 말단절단된 돌연변이체는 천연 효소의 것보다 더 높은 UPRTase 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 특히 유리한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 천연 UPRTase의 결실 돌연변이체를 코딩한다. 결실은 바람직하게는 원래 UPRTase의 N-말단 영역에 위치한다. 이는 완전하거나 (상기 N-말단 영역의 모든 잔기에 영향을 미침) 또는 부분적일 수 있다 (1차 구조에서 1개 이상의 연속 또는 불연속 잔기에 영향을 미침). 일반적으로, 폴리펩티드는, 각각 분자의 약 삼분의 일을 나타내는 N-말단, 중앙 및 C-말단 부분으로 이루어진다. 예를 들어, 에스. 세레비지아에 UPRTase는 251개 아미노산을 갖기 때문에, 그의 N-말단 부분은 천연 형태의 제1 위치에 자리한 소위 개시제 메티오닌으로 시작되는 처음 83개 잔기로 이루어진다. 이. 콜라이 UPRTase의 경우에, 그의 N-말단 부분은 위치 1 내지 69를 포괄한다.

UPRTase 활성을 갖는 바람직한 단백질은 위치 1에서 Met 잔기로 시작되고 위치 216에서 Val 잔기로 종료되는, 실질적으로 EP 0998568 A의 서열 식별자 서열식별번호: 1에 나타난 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다. 용어 "실질적으로"는 상기 EP 0998568 A의 서열 서열식별번호: 1과 70% 초과, 유리하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과의 동일성 정도를 지칭한다. 보다 더 바람직하게, 이는 EP 0998568 A의 서열 식별자 서열식별번호: 1 에 나타난 아미노산 서열을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 특히 위치 2 (천연 UPRTase에서의 위치 37)에서 세린 잔기의 알라닌 잔기로의 치환이 언급될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 적어도 1종의 CDase 및 1종의 UPRTase 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 특허 출원 WO 96/16183 및 EP 0998568 A에는 CDase 및 UPRTase 활성을 갖는 두 도메인을 갖는 효소를 코딩하는 융합 단백질의 용도가 기재되어 있고, 발현 플라스미드에 의해 운반되는 하이브리드 유전자 codA::upp 또는 FCY1::FUR1 또는 FCY1::FUR1Δ105 (즉 FCU1)의 전달이 형질감염된 B16 세포의 5-FC에 대한 감수성을 증가시킨다는 것이 입증되어 있다. 본 발명의 보다 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 실질적으로 서열 식별자 서열식별번호: 3 (coda::upp), 서열식별번호: 1 (FCU1) 또는 FCY1::FUR1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 용어 "실질적으로"는 상기 서열과 70% 초과, 유리하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과의 동일성 정도를 지칭한다. 보다 더 바람직하게, 이는 서열 식별자 서열식별번호: 3 (coda::upp), 서열식별번호: 1 (FCU1) 또는 FCY1::FUR1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다.

핵산 서열은 사용되는 통상적인 기술에 따라 클로닝, PCR 또는 화학적 합성에 의해 용이하게 수득될 수 있다. 이들은 천연 유전자 또는 그로부터 1개 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 부가에 의해 유도된 유전자일 수 있다. 더욱이, 이들의 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 참고할 수 있는 문헌에 폭넓게 기재되어 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 공개된 데이터로부터 CDase 또는 UPRTase 서열을 클로닝하고, 가능한 돌연변이를 수행하고, 선행 기술에 따라 또는 출원 EP 0998568 A에 나타나 있는 프로토콜에 기초하여 무세포 또는 세포 시스템에서 돌연변이체 형태의 효소적 활성을 시험하고, 특히 같은 단계에서 CDase 및 UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드 및 결과적으로 상응하는 유전자의 모두 또는 일부를 융합할 수 있다.

보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.

퍼미아제는 1개의 핵염기 모이어티를 포함하는 약물 또는 그의 전구체의 세포 막을 통한 전달에 관여하는 막횡단성 단백질을 지칭한다.

퍼미아제는 퓨린 퍼미아제, 시토신 퍼미아제 및 뉴클레오시드 수송체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 퍼미아제는 에스. 세레비지아에의 퓨린 또는 시토신 퍼미아제이다. 에스. 세레비지아에의 핵염기 수송체는 FCY2로 공지된 퓨린-시토신 퍼미아제 및 FUR4로 공지된 우라실 퍼미아제로 이루어진다. 퓨린-시토신 퍼미아제인 FCY2는 효모 형질 막을 가로지는 양성자 및 아데닌, 구아닌, 하이포크산틴 및 시토신의 공수송을 매개한다 (Grenson 1969, Jund and Lacroute 1970, Polak and Grenson 1973, Chevallier et al. 1975, Hopkins et al. 1988). FCY2 단백질은 또한 시토신의 유사체인 5-플루오로시토신의 수송을 매개한다 (Grenson 1969, Jund and Lacroute 1970). FCY2 유전자는 초기에 10 내지 12개의 막횡단-관통 도메인을 갖는 것으로 예측되었으며 (Weber et al. 1990) 현재 9개가 선호되는 (Ferreira et al. 1999) 533개의 아미노산 (58 kDa)의 단백질을 코딩한다. FCY2는 퓨린 핵염기 및 시토신에 대해 유사한 친화성을 나타낸다 (Brethes et al. 1992). 에스. 세레비지아에 내로의 우라실 흡수는 우라실 퍼미아제인 FUR4에 의해 매개된다 (Jund and Lacroute 1970, Jund et al. 1977). FUR4는 10개의 막횡단 도메인 및 긴 세포질 친수성 N- 및 C- 말단 꼬리를 갖는 633개의 아미노산 (71.7 kDa)의 단백질인 것으로 예측되는 (Jund et al. 1988, Garnier et al. 1996) 우라실-양성자 공수송체이다 (Hopkins et al. 1988). FUR4 단백질은 또한 우라실의 유사체인 5-플루오로우라실의 수송을 매개할 수 있다 (Jund and Lacroute 1970).

FCY2 및 Fur4의 아미노산 서열은 스위스프롯 데이터베이스에서 특히 입수가능하다 (각각 수탁번호 P17064 및 P05316). 바람직하게, 퍼미아제는 특허 출원 WO 2006/048768에 개시된 바와 같이 아미노산 서열 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.

이와 관련하여, 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 퍼미아제는 FCY2 및 Fur4 및 그의 유사체를 포함하는 군으로부터 선택된다. Fur4 및 FCY2의 유사체는 본원 상기에 기재된 바와 같이 모 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 초과, 유리하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 가장 바람직하게는 95% 초과의 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 가지며 1개의 핵염기 모이어티를 포함하는 약물을 세포 막을 통해 수송할 수 있는 능력을 보유하는 폴리펩티드를 지칭한다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 1개의 핵염기 모이어티를 포함하는 약물 또는 이러한 약물의 전구체와 회합될 퍼미아제를 선택할 수 있다. 예를 들어, FCY2 및 Fur4는 바람직하게는 5-플루오로시토신 (5-FC)과 회합된다.

보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 관심 핵산의 발현에 필요한 요소를 추가로 포함할 수 있다.

보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열의 발현에 필요한 요소를 추가로 포함할 수 있다.

이들 관심 핵산의 발현 및/또는 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열의 발현에 필요한 요소는 상기 DNA에서 mRNA로의 전사 및 필요하다면 mRNA에서 폴리펩티드로의 번역에 요구되는 성분을 포함하였다. 다양한 척추동물 시스템에서 사용하기에 적합한 전사 프로모터는 문헌에 폭넓게 기재되어 있다. 예를 들어, 적합한 프로모터는 바이러스 프로모터, 예컨대 RSV, MPSV, SV40, CMV 또는 7.5k, 백시니아 프로모터, 유도성 프로모터 등을 포함한다. 바람직한 프로모터는 폭스 바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스의 7.5K, H5R, TK, p28, p11 또는 K1L로부터 단리된다. 대안적으로, 합성 프로모터, 예컨대 문헌 [CHAKRABARTI. Biotechniques. 1997, no.23, p.1094-97.], [HAMMOND, et al. Journal of Virological Methods. 1997, no.66, p.135-38.] 및 [KUMAR. Virology. 1990, no.179, p.151-8.]에 기재된 것, 뿐만 아니라 초기 및 후기 폭스바이러스 프로모터 사이의 키메라 프로모터를 사용할 수 있다.

관심 핵산 서열 및 퍼미아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열은 추가의 기능적 요소, 예컨대 인트론 서열, 표적화 서열, 수송 서열, 분비 신호, 핵 국재화 신호, IRES, 폴리 A 전사 종결 서열, 트리파르타이트 리더 서열, 복제 또는 통합에 관여하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 서열은 문헌에 보고되었고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 수득될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폭스바이러스를 생산하는 방법에 관한 것으로, 여기서 방법은 다음을 포함한다:

(i) 본 발명에 따른 폭스바이러스를 세포 내로 도입하는 단계,

(ii) 상기 세포를 상기 폭스바이러스가 생산될 수 있게 하는 적절한 조건 하에서 배양하는 단계, 및

(iii) 상기 폭스바이러스를 세포 배양물로부터 회수하는 단계.

폭스바이러스가 물론 배양물 상청액으로부터 회수될 수 있지만, 이는 또한 세포로부터 회수될 수도 있다. 통상적으로 사용되는 방법 중 하나는 용해 상청액에서 비리온을 수집하기 위해 연속적 동결/해동 주기를 사용하여 세포를 용해시키는 것이다. 이어서, 비리온은 관련 기술분야의 기술 (크로마토그래피 방법, 특히 염화세슘 구배를 통한 초원심분리 방법 등)을 사용하여 증폭 및 정제될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폭스바이러스를 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 보다 구체적으로는 유전자 요법에 의한 질환의 예방적 또는 치유적 치료를 의도하고, 보다 구체적으로는 증식성 질환 (암, 종양, 재협착 등)을 목표로 하거나 또는 증가된 파골세포 활성과 연관된 질환 (예를 들어 류마티스 관절염, 골다공증)을 목표로 한다.

본 발명에 따른 조성물은 통상적으로 이를 국부로, 비경구로 또는 소화 경로에 의해 투여할 목적으로 제조될 수 있다. 특히, 본 발명의 재조합 벡터 또는 폭스바이러스의 치료 유효량은 제약상 허용되는 부형제와 조합된다. 수많은 투여 경로를 고려하는 것이 가능하다. 언급될 수 있는 예는 위내, 피하, 심장내, 근육내, 정맥내, 복강내, 종양내, 비강내, 폐내 및 기관내 경로이다. 이들 세 후자의 실시양태의 경우, 에어로졸에 의해 또는 점적주입에 의해 투여가 실시되는 것이 유리하다. 투여는 단일 용량으로 또는 특정한 시간 간격 후 1회 이상 반복되는 용량으로 실시될 수 있다. 적절한 투여 경로 및 투여량은 다양한 파라미터, 예를 들어 개체, 치료될 질환 또는 전달될 관심 유전자(들)에 따라 달라진다. 본 발명에 따른 바이러스 입자에 기초한 제제는 10⁴ 내지 10¹⁴ pfu (플라크-형성 단위), 유리하게는 10⁵ 내지 10¹³ pfu, 바람직하게는 10⁶ 내지 10¹² pfu, 보다 바람직하게는 10⁶ 내지 10⁷ pfu의 용량의 형태로 제제화될 수 있다.

조성물은 또한 제약 관점에서 허용되는 희석제, 아주반트 또는 부형제, 뿐만 아니라 가용화제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 주사가능한 투여의 경우, 수성, 비수성 또는 등장성 용액 중의 제제가 바람직하다. 이는 적절한 희석제를 사용하여 사용 시에 재구성될 수 있는 액체 또는 건조 (분말, 동결건조물 등) 형태로 단일 용량으로 또는 다중 용량으로 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 요법에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료를 의도하는 의약을 제조하기 위한 본 발명에 따른 폭스바이러스 또는 조성물의 용도에 관한 것이다. 의약은 생체내 직접 (예를 들어 정맥내 주사에 의해 접근가능한 종양 내로, 에어로졸에 의해 폐 내로, 적절한 카테터를 사용하여 혈관계 내로 등) 투여될 수 있다. 바람직한 용도는 원치않는 세포 증식으로부터 유래되는 암, 종양 및 질환을 치료 또는 예방하는데 있다. 언급될 수 있는 구상가능한 적용은 유방암, 자궁암 (특히 유두종 바이러스에 의해 유발된 것), 전립선암, 폐암, 방광암, 간암, 결장암, 췌장암, 위암, 식도암, 후두암, 중추 신경계 암 (예를 들어 교모세포종) 및 혈액암 (림프종, 백혈병 등)이다. 다른 바람직한 용도는 류마티스 관절염, 골다공증 및 증가된 파골세포 활성과 연관된 다른 질환을 치료 또는 예방하는데 있다. 이는 또한 심혈관 질환과 관련하여, 예를 들어 혈관 벽의 평활근 세포의 증식 (재협착)을 억제 또는 지연시키기 위해 사용될 수 있다. 최종적으로, 감염성 질환의 경우, AIDS에 적용되는 의약을 구상하는 것이 가능하다.

본 발명의 폭스바이러스, 조성물 또는 방법이 암의 치료에 사용될 때, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 종양 세포를 특이적으로 표적화할 수 있기 때문에 바람직한 투여 경로는 전신 경로이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폭스바이러스, 조성물을 질환의 치료를 필요로 하는 숙주 유기체 또는 세포에 투여하는 것을 특징으로 하는, 질환을 치료하는 방법으로 확장된다.

유리한 실시양태에 따르면, 치료 용도 또는 치료 방법은 또한 제약상 허용되는 양의 전구약물, 유리하게는 시토신의 유사체, 특히 5-FC를 숙주 유기체 또는 세포에 투여하는 추가의 단계를 포함한다. 예시로서, 50 내지 500 mg/kg/일의 용량, 바람직하게는 200 mg/kg/일 또는 100 mg/kg/일의 용량을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명과 관련하여, 전구약물은 표준 관례에 따라 (예를 들어 경구로, 전신으로) 투여된다.

바람직하게, 투여는 본 발명에 따른 치료제의 투여 이후에, 바람직하게는 치료제의 투여로부터 적어도 3일 후, 보다 바람직하게는 적어도 4일 후, 보다 더 바람직하게는 적어도 5일 후에 실시된다. 본 발명의 보다 더 바람직한 실시양태에 따르면, 전구약물의 투여는 치료제의 투여로부터 7일 후에 실시된다. 경구 경로가 바람직하다. 전구 약물을 단일 용량으로, 또는 숙주 유기체 또는 세포 내에서 독성 대사물이 생산되게 할 수 있도록 충분히 긴 시간 동안 반복되는 용량으로 투여하는 것이 가능하다.

게다가, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 5-FU의 세포독성 효과를 강화시키는 1종 이상의 물질과 조합될 수 있다. 특히, 피리미딘의 신생 생합성 경로의 효소를 억제하는 약물 (예를 들어 하기에 언급된 것), 5-FU의 대사의 산물 (5-FdUMP)의 존재 하에 티미딜레이트 신타제의 억제를 증가시켜 복제에 요구되는 dTMP의 풀의 감소를 유발하는 류코보린과 같은 약물 (Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692), 및 최종적으로 디히드로폴레이트 리덕타제를 억제하고 PRPP (포스포리보실피로포스페이트)의 풀을 증가시킴으로써 세포 RNA 내로의 5-FU의 혼입의 증가를 가져오는 메토트렉세이트와 같은 약물 (Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137)이 언급될 수 있다.

본 발명에 따르면, 피리미딘의 신생 생합성 경로의 효소를 억제하는 약물은 바람직하게는 PALA (N-(포스포노아세틸)-L-아스파르테이트; 문헌 [Moore et al., 1982, Biochem. Pharmacol. 31, 3317-3321]), 레플루노미드, A771726 (레플루노미드의 활성 대사물; 문헌 [Davis et al., 1996, Biochem. 35, 1270-1273]) 및 브레퀴나르 (문헌 [Chen et al., 1992, Cancer Res. 52, 3251-3257])로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 항암 요법에서 효과적인 1종 이상의 물질과 조합될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물과 회합 또는 조합되어 사용될 수 있는 항암 요법에 효과적인 제약 물질 중에는, 알킬화제, 예컨대, 예를 들어 미토마이신 C, 시클로포스파미드, 부술판, 이포스파미드, 이소스파미드, 멜팔란, 헥사메틸멜라민, 티오테파, 클로람부실 또는 다카르바진; 항대사물, 예컨대, 예를 들어 겜시타빈, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 2-플루오로데옥시 시티딘, 메토트렉세이트, 이다트렉세이트, 토무덱스 또는 트리메트렉세이트; 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 테니포시드 또는 미톡산트론; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대, 예를 들어 이리노테칸 (CPT-11), 7-에틸-10-히드록시-캄프토테신 (SN-38) 또는 토포테칸; 항유사분열 약물, 예컨대, 예를 들어 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈; 및 백금 유도체, 예컨대, 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴, 스피로플라티눔 또는 카르보플라티눔이 언급될 수 있다.

본 발명의 항암 요법 및 조성물에 효과적인 1종 이상의 물질은 전신 투여 및 종양 내로의 직접 주사를 비롯한, 숙련된 진료의에게 널리 공지된 방법에 의해 1회 또는 수회 투여될 수 있다. 이는 볼루스 주사 또는 관류에 의해 진행될 수 있다 (예를 들어 0.5-6시간에 걸쳐). 항암 물질 및/또는 폭스바이러스 조성물의 다양한 투여는 적절한 기간으로 서로 이격될 수 있고, 동일한 투여 경로에 의해 또는 상이한 투여 경로에 의해 동일한 부위에 또는 상이한 부위에 동일한 또는 상이한 투여량을 사용하여 수행될 수 있다. 투여량은 다양한 파라미터, 예컨대 치료될 암, 투여(들)의 방식 및 빈도, 및 약물을 투여하는데 상용적으로 고려되는 다른 인자에 비추어 진료의에 의해 적합화될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 또는 조성물은 토포이소머라제 I 억제제, 특히 바람직하게는 이리노테칸과 조합된다. 바람직하게, 이리노테칸 및 폭스바이러스 조성물은 정맥내로 투여될 것이다. 예시로서, 이리노테칸에 대한 적합한 용량은 5 내지 100 mg/kg/일로 달라질 수 있고, 폭스바이러스에 대한 것은 1x10⁶ 내지 1x10⁹ pfu이다. 바람직하게, 폭스바이러스 조성물은 1 내지 3회 정맥내로 주사될 것이고, 이리노테칸은 1회 이상의 주기 동안 적합한 주기성 (1주 1회)으로 주사될 것이다. 추가로, 이리노테칸 치료는 폭스바이러스 조성물의 제1 투여로부터 몇일 (예를 들어 3 내지 10일) 후에 수행될 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 또는 조성물은 항유사분열 약물, 특히 바람직하게는 옥살리플라틴과 조합된다. 바람직하게, 옥살리플라틴은 복강내로 또는 정맥내로 투여될 것이고, 본 발명에 따른 폭스바이러스 조성물은 정맥내 경로에 의해 투여될 것이다. 예시로서, 옥살리플라틴에 대한 적합한 용량은 0.5 내지 10 mg/kg/일로 달라질 수 있고, 폭스바이러스에 대한 것은 1x10⁶ 내지 1x10⁹ pfu이다. 바람직하게, 폭스바이러스 조성물은 1 내지 3회 정맥내로 주사될 것이고, 옥살리플라틴은 1회 이상의 주기 동안 적합한 주기성 (예를 들어 2주마다)으로 주사될 것이다. 추가로, 바람직한 방법은 먼저 폭스바이러스 조성물을 투여하고 이어서 최초 폭스바이러스 주사로부터 몇일 (예를 들어 3 내지 10일) 후에 옥살리플라틴 치료를 수행하는 것을 포함한다.

게다가, 본 발명의 방법 또는 조성물은 또한 제약상 허용되는 양의 전구약물을 상기 기재된 바와 같은 숙주 유기체 또는 세포에 투여하는 추가의 단계를 포함한다. 본 발명과 관련하여 바람직한 전구약물은 5-FC이다.

본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 또한 방사선요법과 조합되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 또한 면역조정제, 예컨대, 예를 들어 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터류킨 (특히 IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12) 또는 종양 괴사 인자; 세포 표면 수용체의 조절에 영향을 미치는 작용제, 예컨대, 예를 들어 표피 성장 인자 수용체의 억제제 (특히 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 게피티닙, 에를로티닙 또는 라파티닙) 또는 인간 표피 성장 인자 수용체-2의 억제제 (특히 트라스투주맙); 및 혈관신생에 영향을 미치는 작용제, 예컨대, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자의 억제제 (특히 베바시주맙 또는 라니비주맙)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다.

도 1. 백시니아 바이러스 감염된 인간 결장직장 종양 세포 (LoVo)의 5-FC에 대한 시험관내 감수성. 나타낸 바이러스 (모의 (●) VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (△))에 의해 0.0001의 MOI로 감염된 LoVo 세포를 다양한 농도의 5-FC에 노출시켰다. 감염 5일 후 세포 생존을 측정하였다. 결과를 약물의 존재 또는 부재 하에서의 세포 생존율의 백분율로 표현하였다. 값은 바이러스의 복제로 인한 세포 사망률 없이 3개의 개별 결정치의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 2. 백시니아 바이러스 감염된 인간 결장직장 종양 세포 (LoVo)의 5-FC에 대한 시험관내 감수성. 나타낸 바이러스 (모의 (●) VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-F4L-/FCU1 (◇))에 의해 0.0001의 MOI로 감염된 LoVo 세포를 다양한 농도의 5-FC에 노출시켰다. 감염 5일 후 세포 생존을 측정하였다. 결과를 약물의 존재 또는 부재 하에서의 세포 생존율의 백분율로 표현하였다. 값은 바이러스의 복제로 인한 세포 사망률 없이 3개의 개별 결정치의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 3. 나타낸 바이러스에 의해 0.0001의 MOI로 감염된 LoVo에서 감염 후 제5일에 VVTK-/FCU1 및 VVTK-I4L-/FCU1의 시험관내 복제 효능. 값은 3개의 개별 결정치의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 4. 나타낸 바이러스에 의해 0.0001의 MOI로 감염된 LoVo에서 감염 후 제5일에 VVTK-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1의 시험관내 복제 효능. 값은 3개의 개별 결정치의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 5. 스위스 누드 마우스에서 바이러스의 정맥내 주사 후에 피하 LoVo의 평균 종양 부피 ± SEM. 종양 (촉지성 종양)의 접종으로부터 7일 후에, 마우스를 10⁷ pfu의 완충제 + 염수 (◇), 완충제 + 5-FC (◆), VVTK-I4L-/FCU1 + 염수 (△) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (▲)로 치료하였다. 동물을 바이러스 주사로부터 7일 후에 3주 동안, 경구 위관영양에 의해 1일 2회 100 mg/kg/j의 염수 또는 5-FC로 치료하였다. 종양 부피를 1주 2회 측정하였다.
도 6. 스위스 누드 마우스에서 바이러스의 정맥내 주사 후에 피하 LoVo의 평균 종양 부피 ± SEM. 종양 (촉지성 종양)의 접종으로부터 7일 후에, 마우스를 10⁷ pfu의 완충제 + 염수 (◇), 완충제 + 5-FC (◆), VVTK-F4L-/FCU1 + 염수 (□) 또는 VVTK-F4L-/FCU1 + 5-FC (■)로 치료하였다. 동물을 바이러스 주사로부터 7일 후에 3주 동안, 경구 위관영양에 의해 1일 2회 100 mg/kg/j의 염수 또는 5-FC로 치료하였다. 종양 부피를 1주 2회 측정하였다.
도 7. 스위스 누드 마우스에서 바이러스의 정맥내 주사 후에 피하 LoVo의 평균 종양 부피 ± SEM. 종양 (촉지성 종양)의 접종으로부터 11일 후에, 마우스를 완충제 + H₂O (◇), 또는 완충제 + 5-FC (◆), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H₂O의 1회 주사 (○), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 1회 주사 (바이러스 주사로부터 7일 후에 3주 동안 5-FC 투여) (●), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H₂O의 2회 주사 (제11일 및 제33일) (□), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 2회 주사 (제11일 및 제33일) (제18일로부터 제32일까지 및 제40일로부터 제54일까지 5-FC 투여) (■)로 치료하였다. 동물을 경구 위관영양에 의해 1일 2회 100 mg/kg의 5-FC로 치료하였다. 종양 부피를 1주 2회 측정하였다.
도 8. 스위스 누드 마우스에서 바이러스의 정맥내 주사 후에 피하 U87-MG (교모세포종 종양 세포)의 평균 종양 부피 ± SEM. 종양 (촉지성 종양)의 접종으로부터 11일 후에, 마우스를 완충제 + H₂O (◇), 또는 완충제 + 5-FC (◆), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H₂O (○), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (●)로 치료하였다. 동물을 바이러스 주사로부터 7일 후에 3주 동안, 경구 위관영양에 의해 1일 2회 100 mg/kg의 5-FC로 치료하였다. 종양 부피를 1주 2회 측정하였다.
도 9. 분열 세포 내 바이러스 수율 대 전면생장 세포 내 바이러스 수율의 비. PANC1 (췌장 인간 종양), H1299 (폐 인간 종양) 또는 U118MG (신경교종 인간 종양) 세포를 100 pfu의 (

) VVTK-/FCU1 또는 (

) VVTK-I4L-/FCU1로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 바이러스 역가를 결정하였다. 값은 분열 세포 내 바이러스 수율 대 전면생장 세포 내 바이러스 수율 사이의 비이다.
도 10. 분열 세포 내 바이러스 수율 대 전면생장 세포 내 바이러스 수율의 비. PANC1 (췌장 인간 종양), H1299 (폐 인간 종양) 또는 U118MG (신경교종 인간 종양) 세포를 100 pfu의 (

) VVTK-/FCU1 또는 (

) VVTK-F4L-/FCU1로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 바이러스 역가를 결정하였다. 값은 분열 세포 내 바이러스 수율 대 전면생장 세포 내 바이러스 수율 사이의 비다.
도 11. 피하 인간 종양을 보유하는 스위스 누드 마우스 내로 1x10⁶ pfu의 VVTK-/FCU1 (

) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (

)에 의한 정맥내 감염 후 제6일 및 제21일에 기관 또는 종양에서의 바이러스 역가 (pfu/mg 조직).
도 12. 피하 인간 종양을 보유하는 스위스 누드 마우스 내로 1x10⁶ pfu의 VVTK-/FCU1 (

) 또는 VVTK-F4L-/FCU1 (

)에 의한 정맥내 감염 후 제6일 및 제21일에 기관 또는 종양에서의 바이러스 역가 (pfu/mg 조직).
도 13. 정맥내 주사에 의해 1x10⁸ pfu의 VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (○)을 사용한 치료 후에 스위스 누드 마우스의 생존.
도 14. 정맥내 주사에 의해 1x10⁷ pfu (A) 또는 1x10⁸ pfu (B)의 VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (◇)을 사용한 치료 후에 면역적격 B6D2 마우스의 생존.
도 15. 스위스 누드 마우스에서 1x10⁶ pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-I4L-/FCU1의 정맥내 주사 후에 감염 후 제13일 및 감염 후 제34일에서의 꼬리 상의 두진의 평균 양.
도 16. 스위스 누드 마우스에서 1x10⁶ pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1의 정맥내 주사 후에 감염 후 제13일 및 감염 후 제34일에서의 꼬리 상의 두진의 평균 양.
도 17. 스위스 누드 마우스에서 1x10⁷ pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-I4L-/FCU1의 정맥내 주사 후에 감염 후 제15일 및 감염 후 제31일에서의 꼬리 상의 두진의 평균 양.
도 18. 스위스 누드 마우스에서 1x10⁷ pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1의 정맥내 주사 후에 감염 후 제15일 및 감염 후 제31일에서의 꼬리 상의 두진의 평균 양.

실시예

벡터 플라스미드의 구축.

I4L을 결실시키기 위한 셔틀 플라스미드를, 티미딘 키나제 유전자에 결실이 있으며 백시니아 합성 프로모터 p11K7.5의 제어 하에 FCU1 유전자를 발현하는 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐 (수탁번호 M35027)의 DNA를 사용하여 구축하였다. I4L의 DNA 플랭킹 영역을 PCR에 의해 증폭시켰다. I4L의 하류 플랭킹 영역의 프라이머는 5' - TCC CCC GGG TTA ACC ACT GCA TGA TGT ACA -3' (서열식별번호: 7; SmaI 부위 밑줄표시됨) 및 5' - GCC GAG CTC GAG GTA GCC GTT TGT AAT TCT -3' (서열식별번호: 8; SacI 부위 밑줄표시됨)였다. 상류 영역의 프라이머는 5' - GCC TGG CCA TAA CTC CAG GCC GTT - 3' (서열식별번호: 9; MscI 부위 밑줄표시됨) 및 5' - GCC CAG CTG ATC GAG CCG TAA CGA TTT TCA - 3' (서열식별번호: 10; PvuII 부위 밑줄표시됨)였다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 SmaI/SacI 또는 MscI/PvuII로 소화시키고 PpolyIII 플라스미드의 상응하는 부위 내로 라이게이션시켰다. I4L의 하류 플랭킹 영역의 반복 영역을 프라이머 5' - GCC GCA TGC ATC CTT GAA CAC CAA TAC CGA - 3' (서열식별번호: 11; SphI 부위 밑줄표시됨) 및 5' - GCT CTA GAG AGG TAG CCG TTT GTA ATC TG - 3' (서열식별번호: 12; XbaI 부위 밑줄표시됨)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고 PpolyIII 플라스미드에 삽입하였다. 반복 영역을 사용하여 결실된 바이러스의 생산 동안 선택 카세트를 제거한다. pH5R 백시니아 프로모터의 제어 하에 GFP/GPT 융합 유전자에 상응하는 선택 카세트를 PpolyIII 플라스미드의 SacI/SphI 부위 내로 삽입하였다. 수득된 플라스미드는 I4L 유전자의 결실을 위한 pΔI4L로 명명된 재조합 셔틀 플라스미드이다.

F4L을 결실시키기 위한 셔틀 플라스미드를 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐 (수탁번호 M35027)의 DNA를 사용하여 구축하였다. F4L의 DNA 플랭킹 영역을 PCR에 의해 증폭시켰다. F4L의 하류 플랭킹 영역의 프라이머는 5' - CGC GGA TCC TTT GGT ACA GTC TAG TAT CCA - 3' (서열식별번호: 13; BamHI 부위 밑줄표시됨) 및 5' - TCC CCC GGG TTA TAA CAG ATG CAG TAT CCA - 3' (서열식별번호: 14; SmaI 부위 밑줄표시됨)였다. 상류 영역의 프라이머는 5' - GCC CAG CTG TTC AAT GGC CAT CTG AAA TCC - 3' (서열식별번호: 15; PvuII 부위 밑줄표시됨) 및 5' - GAA GAT CTA GTA TCG CAT CTA AAA GAT GG - 3' (서열식별번호: 16; BglII 부위 밑줄표시됨)였다. 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 BamHI/SmaI 또는 BglII/PvuII로 소화시키고 PpolyIII 플라스미드의 상응하는 부위 내로 라이게이션시켰다. I4L의 하류 플랭킹 영역의 반복 영역을 프라이머 5' - GCC GAG CTC ACC CAC ACG TTT TTC GAA AAA - 3' (서열식별번호: 17; SacI 부위 밑줄표시됨) 및 5' - GCC GCA TGC TTA TAA CAG ATG CAG TAT CAA - 3' (서열식별번호: 18; SphI 부위 밑줄표시됨)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, PpolyIII 플라스미드에 삽입하였다. 반복 영역을 사용하여 결실된 바이러스의 생산 동안 선택 카세트를 제거한다. pH5R 백시니아 프로모터의 제어 하에 GFP/GPT 융합 유전자에 상응하는 선택 카세트를 PpolyIII 플라스미드의 SacI/SmaI 부위 내로 삽입하였다. 수득된 플라스미드는 F4L 유전자의 결실을 위한 pΔF4L로 명명된 재조합 셔틀 플라스미드이다.

재조합 백시니아 바이러스의 생성.

CEF 세포를 VVTK-FCU1 (백시니아 바이러스, J2R 키나제 유전자에 결손이 있음, 합성 프로모터 p11k7.5의 제어 하에 FCU1 유전자를 발현함) 균주 코펜하겐에 의해 0.1의 MOI로 감염시키고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 재조합 셔틀 플라스미드의 CaCl₂ 공동침전물 (0.2 μg)로 형질감염시켰다. 세포를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 나타나는 바이러스의 희석물을 사용하여 최종 농도 15 μg/ml의 하이포크산틴, 최종 농도 250 μg/ml의 크산틴 및 최종 농도 250 μg/ml의 미코페놀산을 함유하는 선택 배지에서 CEF 세포를 감염시켰다. 형광 (GFP) 및 양성 (GPT 선택) 플라크를 단리시키고, GPT 선택 배지의 존재 하에 CEF 세포에서의 여러 라운드의 선택 동안 선택하였다. VVTK-FCU1의 존재 또는 부재를 결실 영역 내부 프라이머를 사용하여 40회 주기의 PCR에 의해 결정하였다. 모 바이러스의 제거 후에, 이중 결실된 바이러스를 사용하여, 선택 카세트를 제거하기 위해 GPT 선택 배지 없이 CEF를 감염시켰다. 비-형광 플라크를 단리시키고, CEF에서 2회 주기 동안 선택하였다. 최종 재조합 VV 바이러스를 CEF에서 증폭시키고, 정제하고, 바이러스 스톡을 플라크 검정에 의해 CEF 상에서 적정하였다.

5-FC에 대한 시험관내 세포 감수성.

인간 종양 세포를 각 재조합 VV에 의해 0.0001의 MOI로 형질도입하였다. 총 3 x 10⁵개 세포/웰을 다양한 농도의 5-FC를 함유하는 배지 2 ml의 6-웰 배양 접시에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 5일 동안 배양하고, 트리판 블루 배제에 의해 생존 세포를 계수하였다. 도 1, 2, 3 및 4에 도시된 결과는 I4L 및 J2R 유전자에 결손이 있는 바이러스에서보다 또는 F4L 및 J2R 유전자에 결손이 있는 바이러스에서보다 J2R 유전자에 결손이 있는 바이러스에서 FCU1 활성이 동등하다는 것을 제시한다.

배양된 세포에서의 시험관내 복제.

분열 또는 전면생장 세포를 6-웰 플라크에서 100 pfu의 바이러스 (거의 MOI 0.0005)로 감염시켰다. 분열 세포에 대해 10% FCS가 보충되고 전면생장 세포에 대해서는 보충이 없는 배지 2 mL를 첨가하였다. 세포를 감염 48시간 후에 수거하였다. 세포를 -20℃에서 저장하고, 초음파 처리하여 바이러스를 방출시키고, 바이러스를 또한 CEF 세포 상에서 플라크 적정에 의해 정량화하였다. 분열 세포 내 복제와 전면생장 세포 내 복제 사이의 비는 모든 세포에서 유사하다. 바이러스 VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1은 모두 전면생장 세포에서보다 분열 세포에서 더 많이 복제된다.

복제 바이러스 특이성에 대한 검정의 간접적 수단으로서, 분열 대 전면생장 종양 세포 (췌장 인간 종양 PANC1; 폐 인간 종양 H1299; 신경교종 인간 종양 U118MG)에서 생산된 바이러스의 수율을 결정하였다. 전면생장 세포를 1x10⁶개 세포/웰로 플레이팅하고, 완전 배지에서 7일 동안 배양한 다음, 감염 1일 전에 세포를 세척하고, 혈청이 없는 배지에서 배양하였다. 분열 세포를 감염 1일 전에 3x10⁵개 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포 분열의 수준을 평가하기 위해, 핵산 내로 혼입된 적정된 티미딘의 양을 세포 플레이팅으로부터 5시간, 24시간 및 48시간 후에 측정하였다. 이 기간 동안, 전면생장 세포에서 티미딘 혼입은 비교적 일정하였으나 분열 세포에서는 시간이 지남에 따라 혼입의 증가가 관찰되었다. 이어서, 세포를 100 pfu의 바이러스로 감염시키고, 감염 48시간 후 분열 종양 세포와 전면생장 종양 세포에서 생산된 바이러스의 수율 사이의 비를 CEF 상에서 플라크 적정에 의해 결정하였다. 도 9 및 도 10에 도시된 결과는 바이러스 VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1이 모두 전면생장 세포에서보다 분열 세포에서 더 많이 복제된다는 것을 제시한다. 도 9 및 10에 도시된 결과는 더욱이 바이러스 VVTK-/FCU1과 비교하여 VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 둘 다의 경우에 모든 상이한 유형의 세포에서 비의 증가를 제시한다. 모든 상이한 유형의 세포에서 비의 증가는 전면생장 세포에서 바이러스 VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 둘 다의 보다 낮은 복제에 기인한다. 이들 결과는 바이러스 VVTK-/FCU1과 비교하여 VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 둘 다가 분열 세포에 대하여 증가된 특이성을 나타낸다는 것을 입증한다.

피하 종양 모델.

암컷 스위스 누드 마우스를 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 입수하였다. 연구에 사용된 동물은 연령에 있어서 균일하고 (6주), 체중은 23-26 g이었다. 스위스 누드 마우스의 옆구리에 5x10⁶개 LoVo 세포를 피하로 (s.c.) 주사하였다. 종양이 50-70 mm³의 직경에 도달하였을 때, 마우스를 맹검 방식으로 무작위화하여 생체내 실험을 위해 나타낸 벡터로 처리하였다.

바이러스의 생체분포.

다양한 바이러스의 존재를 종양 및 기관 샘플에서 바이러스 적정에 의해 평가하였다. 1x10⁶ pfu의 VV-FCU1 또는 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1을 확립된 피하 LoVo 종양을 보유하는 누드 마우스 내로 꼬리 정맥 주사에 의해 정맥내로 (i.v.) 주사하였다. 마우스를 나타낸 시점에서 희생시키고, 종양 및 다른 기관을 수집 및 칭량하였다. 종양 및 기관을 PBS 중에서 균질화하고, 역가를 이전에 기재된 바와 같이 CEF 상에서 결정하였다. 바이러스 역가를 조직의 밀리그램으로 표준화하였다. 바이러스 역가를 조직의 밀리그램으로 표준화하였다. 표 2, 3, 4 및 5 (바이러스 역가의 범위는 pfu/mg 조직으로 제시됨)에 도시된 결과는 14일 후에 본 발명에 따른 바이러스가 종양에서 대부분 발견된다는 것을 제시한다. 도 11 및 12에 도시된 결과는 바이러스 VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 모두가 분석된 다른 기관 (VVTK-/FCU1의 경우 꼬리는 제외)에서보다 종양에서 약 1000 내지 10000배 더 많은 바이러스로 종양을 표적화한다는 것을 제시한다. 제6일에 소량의 VVTK-/FCU1이 폐, 비장, 신장 및 림프절에서 검출되었고 (10 pfu/mg 미만), 피부, 꼬리 및 골수에서는 보다 많이 검출되었으며, 제21일에 피부 및 꼬리에서 보다 많이 검출되었다. 대조적으로, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 둘 다는 제6일에 단지 소량만이 림프절 및 꼬리에 있고 제21일에는 단지 종양에만 있어 보다 높은 종양 특이성을 갖는다.

<표 2>

<표 3>

<표 4>

<표 5>

피하 종양 모델에서 본 발명의 폭스바이러스의 항종양 활성.

확립된 피하 LoVo 종양 (50 내지 70 mm³)을 보유하는 누드 마우스를 각각 1.10⁷ pfu의 용량의 나타낸 벡터에 의해 1회 정맥내로 (꼬리 정맥으로) 치료하였다. 바이러스 주사 후 제7일에 시작하여, 5-FC를 100 mg/kg (물 중 0.5% 5-FC 0.5 ml)으로 경구 위관영양에 의해 3주 동안 1일 2회 제공하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 매주 2회 측정하였다. 종양 부피를 식 (p/6) (길이 x 폭²)을 사용하여 mm³로 계산하였다. 도 5 및 6에 도시된 결과는 다양한 바이러스가 종양의 성장을 제어할 수 있는 종양용해 활성 (p<0.05), 및 종양 성장의 제어를 추가로 개선시킬 수 있는 5-FC의 투여와 조합된 활성 (바이러스의 종양용해 및 FCU1 유전자의 치료) (p<0.01)과 유사한 효능을 갖는다는 것을 제시한다.

확립된 피하 LoVo 종양 (50 내지 70 mm³)을 보유하는 누드 마우스를 하기에 따라 1.10⁷ pfu의 용량의 나타낸 벡터에 의해 정맥내로 (꼬리 정맥으로) 치료하였다: 종양 (촉지성 종양)의 접종으로부터 11일 후에, 마우스를 완충제 + H₂O, 또는 완충제 + 5-FC, 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H₂O의 1회 주사, 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 1회 주사 (바이러스 주사로부터 7일 후에 3주 동안 5-FC 투여), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H₂O의 2회 주사 (제11일 및 제33일), 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 2회 주사 (제11일 및 제33일) (제18일로부터 제32일까지 및 제40일로부터 제54일까지 5-FC 투여). 동물을 경구 위관영양에 의해 1일 2회 100 mg/kg의 5-FC로 치료하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 매주 2회 측정하였다. 종양 부피를 식 (p/6) (길이 x 폭²)을 사용하여 mm³로 계산하였다. 도 7에 도시된 결과는 1회 또는 2회 주사 후 바이러스 단독으로 항종양 활성이 없음을 제시한다. 5-FC 치료의 추가는 제50일까지 비히클 군 및 바이러스 단독 (5-FC 부재)과 비교하였을 때 통계적으로 유의한 종양 성장 억제를 제시한다 (p<0.05). 1회 단일 주사와 마찬가지로, VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 2회 정맥내 주사는 비히클 군 및 바이러스 단독 (5-FC 부재) 2회 주사와 비교하였을 때 유의한 항종향 활성을 입증한다 (p<0.05). 더욱이, 5-FC 치료와 조합된 바이러스의 1회 주사와 2회 주사 사이에 제56일로부터 종양 진화에 있어서 유의한 차이가 관찰된다 (p<0.05).

확립된 피하 U87-MG (교모세포종 종양 세포)를 보유하는 누드 마우스를 하기에 따라 1.10⁷ pfu 용량의 나타낸 벡터에 의해 정맥내로 (꼬리 정맥으로) 치료하였다: 종양 (촉지성 종양)의 접종으로부터 11일 후에, 마우스를 완충제 + H₂O, 또는 완충제 + 5-FC, 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H₂O, 또는 10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC로 치료하였다. 동물을 바이러스 주사로부터 7일 후에 3주 동안, 경구 위관영양에 의해 1일 2회 100 mg/kg의 5-FC로 치료하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 매주 2회 측정하였다. 종양 부피를 식 (π/6) (길이 x 폭²)을 사용하여 mm³로 계산하였다. 도 8에 도시된 결과는 강한 항종양 활성을 유발하는, U87-MG 세포에서의 VVTK-I4L-/FCU1의 높은 종양용해 활성을 제시한다 (p<0.0001). 경구 위관영양에 의한 5-FC의 추가와 조합된 활성은 유사한 활성을 유발한다 (p<0.0001).

바이러스 병원성.

바이러스 병원성을 스위스 누드 마우스 (도 13) 및 면역적격 B6D2 마우스 (도 14) 둘 다에서 수행된 생존 연구에 의해 평가하였다. 마우스당 100 μL의 완충제 중 1.10⁷ 또는 1.10⁸ pfu의 모든 VVTK-/FCU1 및 VVTK-I4L-/FCU1을 마우스에 정맥내로 주사하였다. 마우스를 실험 과정 전반에 걸쳐 매일 관찰하였다. 스위스 누드 마우스에서 (도 13), 1x10⁸ pfu의 VVTK-/FCU1의 주사는 감염 3일 후에 동물의 40%의 사망을 유발한다. 나머지 마우스는 감염 후 제50일 내지 제80일에 사망하였다. VVTK-I4L-/FCU1의 투여는 병원성이 보다 낮았으며, 동물의 대다수가 제65일 내지 제140일에 사망하였다 (p<0.01). 10⁷ pfu의 두 바이러스에 대해 어떠한 독성의 증거도 관찰되지 않았다 (도 14 (A)). 10⁸ pfu의 VVTK-/FCU1의 정맥내 주사 후에 모든 마우스가 사망하였다 (도 14 (B)). VVTK-I4L-/FCU1의 치료 군은 VVTK-/FCU1 감염된 마우스와 비교하여 70%로 상당히 연장된 생존을 나타냈다 (도 14 (B)). 따라서, 이 결과는 이중 결실된 바이러스 VVTK-I4L-/FCU1에 의한 독성의 감소를 입증한다.

두진 꼬리 병변 모델.

스위스 누드 마우스에 1.10⁶ pfu (도 15 및 16) 또는 1.10⁷ pfu (도 17 및 18)의 각각의 바이러스를 정맥내로 주사하였다. 꼬리 병변을 1주 1회 열거하였다. 도 15 (A) 및 16 (A)에 제시된 바와 같이, 감염 후 제13일에 1.10⁶ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1이 주사된 마우스는 1개 미만의 두진/마우스를 갖고, 이와 비교하여 VVTK-/FCU1이 주사된 마우스는 마우스당 평균 8개의 두진을 갖는다 (p<0.001). 도 15 (B) 및 도 16 (B)에 제시된 바와 같이, 주사 후 제34일에는 VVTK-/FCU1에 대해서 평균 4개의 두진, 이와 비교하여 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1에 대해서는 거의 1개로 결과가 유사하다 (p<0.0001). 감염 후 제15일에 1.10⁷ pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1이 주사된 마우스는 각각 평균 3개의 두진/마우스 및 2개의 두진/마우스를 갖고, 이와 비교하여 1.10⁷ pfu의 VVTK-/FCU1이 주사된 마우스는 평균 10개의 두진/마우스를 갖는다 (도 17 (A) 및 18 (A)). 감염 후 제31일에 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1이 주사된 마우스는 각각 평균 1.5개 두진/마우스 및 2개 두진/마우스를 갖고, 이와 비교하여 VVTK-/FCU1이 주사된 마우스는 평균 7개 두진/마우스를 갖는다 (도 17 (B) 및 18 (B)). VVTK-/FCU1과 VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 둘 다 사이의 두진 수의 차이는 통계적으로 유의하다 (p<0.01). 두진 형성은 꼬리에서의 바이러스의 복제와 상관관계가 있고, 이에 따라 병독성 및 독성과 상관관계가 있다. VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1의 정맥내 주사가 단일 결실된 TK 바이러스의 경우 보다 독성이 더 낮다.

VVTK-I4L-/FCU1 및 이리노테칸의 조합

이리노테칸과 조합된 VVTK-I4L-/FCU1 치료의 치료 효과를 인간 췌장암 MiaPaca2 세포주 (ATCC® 번호: CRL-1420™) 상에서 5FC 전구약물의 존재 및 부재 하에 생체내 평가하였다. 보다 구체적으로, 누드 마우스 (n=12 마우스/군)에 5x10⁶개 MiaPaca2 세포를 피하로 주사하였다. 종양이 100-200 mm³였을 때, VVTK-I4L-/FCU1을 종양 이식 후 제24일, 제28일 및 제30일에 1x10⁶ pfu로 정맥내로 주사하였다. 이리노테칸을 제28일, 제31일, 제35일, 제38일, 제42일, 제45일에 33 mg/kg/일로 정맥내로 투여하였다. 종양 이식 후 제31일에 시작하여, 5-FC를 경구 위관영양에 의해 3주 동안 1일 2회 100 mg/kg으로 제공하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 부피를 식 (π/6) (길이 x 폭²)을 사용하여 mm³로 계산하였다. 종양 크기가 부피로 4000 mm³를 초과하였을 때 마우스를 사망시켰다. 만-휘트니(Mann-Whitney) U-검정을 사용하여, 군 사이의 종양 부피 차이를 결정하였다. P-값 <0.05를 유의한 것으로 간주하였다.

인간 췌장 MiaPaca2 이식된 종양의 종양 부피를 종양 이식 후 일수 73일의 기간에 걸쳐 VVTK-I4L-/FCU1 +/- 5-FC 및 이리노테칸의 전신 주사 후에 정기적으로 (4-6일마다) 측정하였다. 표 6은 이식 24, 39, 50, 59, 63 및 73일 후에 다양한 마우스 군에서 측정된 종양 부피의 평균을 mm³로 제공한다. "iri"는 이리노테칸을 나타내고, "VV"는 VVTK-I4L-/FCU1을 나타낸다.

<표 6>

MiaPaca2 모델에서, 종양 성장의 관점에서, 대조군 (비치료군)과 5-FC 단독 군 사이에 차이가 없었다. 5-FC 존재 또는 부재 하에 VVTK-I4L-/FCU1을 투여하는 것은 약한 항종양 효과를 유발하였다. 5-FC 존재 또는 부재 하에 이리노테칸을 투여하는 것은 비치료와 비교하여 유의한 종양 성장 제어를 나타냈다. 종양 성장 제어의 관점에서 최대 이익은 VVTK-I4L-/FCU1을 이리노테칸과 조합한 경우 및 이와 5-FC 투여의 존재 또는 부재 하의 경우에서 관찰되었다.

결론적으로, VVTK-I4L-/FCU1 및 이리노테칸의 조합 (5-FC 존재 또는 부재)을 사용한 치료는 다른 군과 비교하여 종양 성장의 유의한 억제를 유발하였다.

VVTK-I4L-/FCU1 및 옥살리플라틴의 조합

옥살리플라틴과 조합된 VVTK-I4L-/FCU1 치료의 치료 효과를 결장직장암 LoVo 세포주 상에서 5FC 전구약물의 존재 및 부재 하에 생체내 평가하였다. 5FU를 또한 이들 조건에서 시험하였다.

보다 구체적으로, 누드 마우스 (n=11 마우스/군)에 5x10⁶개 LoVo 세포를 피하로 주사하였다. 종양이 100-200 mm³였을 때, VVTK-I4L-/FCU1을 종양 이식 후 제21일에 1x10⁷ pfu로 정맥내로 주사하였다. 옥살리플라틴을 제24일, 제27일, 제31일, 제34일, 제38일, 제41일에 2.5 mg/kg/일로 복강내로 투여하였다. 종양 이식 후 제28일에 시작하여, 5-FC를 3주 동안 1일 2회 100 mg/kg으로 경구 위관영양에 의해 제공하였다. 종양 이식 후 제23일에 시작하여, 5-FU를 3주 동안 20 mg/kg/일로 복강내로 제공하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 부피를 식 (π/6) (길이 x 폭²)을 사용하여 mm³로 계산하였다. 종양 크기가 부피로 4000 mm³를 초과하였을 때 마우스를 사망시켰다. 만-휘트니 U-검정을 사용하여, 군 사이의 종양 부피 차이를 결정하였다. P-값 <0.05를 유의한 것으로 간주하였다.

인간 결장직장 LoVo 이식된 종양의 종양 부피를 종양 이식 후 일수 52일의 기간에 걸쳐 VVTK-I4L-/FCU1 +/- 5-FC 및 옥살리플라틴의 전신 주사 후에 정기적으로 (4-6일마다) 측정하였다. 표 7은 이식 19, 25, 32, 46, 49 및 52일 후에 다양한 마우스 군에서 측정된 종양 부피의 평균을 mm³로 제공한다. "oxa"는 옥살리플라틴을 나타내고, "VV"는 VVTK-I4L-/FCU1을 나타낸다.

<표 7>

LoVo 모델에서, 종양 성장의 관점에서, 옥살리플라틴 단독, 5-FC 단독, 옥살리플라틴 + 5-FC, 5-FU 단독, 옥살리플라틴 + 5-FU 또는 VVTK-I4L-/FCU1 단독을 사용한 치료는 대조 (비치료) 마우스와 비교하여 약한 종양 성장 제어를 제공하였다. VVTK-I4L-/FCU1 + 옥살리플라틴 또는 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC는 비치료와 비교하여 유의한 종양 성장 제어를 유발하였다. 종양 성장 제어의 관점에서 최대 이익은 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC + 옥살리플라틴의 조합에서 관찰되었다. 이 조합을 사용한 치료는 비치료, 옥살리플라틴 단독, 5-FC 단독, 옥살리플라틴 + 5-FC, VVTK-I4L-/FCU1 단독, VVTK-I4L-/FCU1 + 옥살리플라틴 또는 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC와 비교하여 유의한 종양 성장 억제를 유발하였다. 더욱이 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC + 옥살리플라틴의 조합을 사용한 치료는 화학요법 약물 5-FU 단독 또는 이와 옥살리플라틴의 조합 (5-FU는 최대 허용 농도로 복강내로 제공되었음)과 비교하여 유의한 항종양 효과를 유발하였다.

결론적으로, VVTK-I4L-/FCU1 및 옥살리플라틴의 조합을, 주목할 만하게는 5-FC의 존재 하에 사용한 치료가, 각각의 VVTK-I4L-/FCU1 및 옥살리플라틴 뿐만 아니라 표준 항종양 약물 5FU와 비교하여 증진된 항종양 효과를 제공한다는 것이 입증되었다

통계적 분석.

통계적 분석을 비파라미터 만-휘트니 U 검정 및 스타티스티카(STATISTICA) 7.1 소프트웨어 (스타트소프트, 인크.(StatSoft, Inc.))를 사용하여 수행하였다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

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145 150 155 160 Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn Gln Leu Leu 165 170 175 Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Arg Asn Lys Asn Thr Thr Arg Pro Asp Phe 180 185 190 Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu Glu Gly Leu 195 200 205 Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp Thr Asn Glu 210 215 220 Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly Val Ser Ile 225 230 235 240 Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp Cys Cys Arg 245 250 255 Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu Glu Thr Ala 260 265 270 Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Arg 275 280 285 Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala Ile 290 295 300 Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro Glu Arg Ile 305 310 315 320 Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu Lys Tyr His 325 330 335 Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu Asp Arg Gly 340 345 350 Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp Phe Gly Asp 355 360 365 Arg Tyr Tyr Cys Val 370 <210> 2 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Ala Ser 145 150 155 160 Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn Gln Leu Leu 165 170 175 Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Ser Asn Lys Asn Thr Thr Arg Pro Asp Phe 180 185 190 Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu Glu Gly Leu 195 200 205 Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp Thr Asn Glu 210 215 220 Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly Val Ser Ile 225 230 235 240 Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp Cys Cys Arg 245 250 255 Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu Glu Thr Ala 260 265 270 Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Arg 275 280 285 Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala Ile 290 295 300 Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro Glu Arg Ile 305 310 315 320 Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu Lys Tyr His 325 330 335 Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu Asp Arg Gly 340 345 350 Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp Phe Gly Asp 355 360 365 Arg Tyr Tyr Cys Val 370 <210> 3 <211> 644 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> derived from Escherichia Coli <400> 3 Met Val Ser Asn Asn Ala Leu Glu Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro 1 5 10 15 Gly Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser 20 25 30 Ala Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu 35 40 45 Asp Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile 50 55 60 His Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser 65 70 75 80 Gly Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu 85 90 95 Leu Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp 100 105 110 Gln Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser 115 120 125 Asp Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu 130 135 140 Val Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly 145 150 155 160 Ile Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg 165 170 175 Leu Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg 180 185 190 Glu Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys 195 200 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Claims (16)

1. 리보뉴클레오티드 리덕타제의 큰 서브유닛을 코딩하는 유전자 (I4L 유전자) 및/또는 리보뉴클레오티드 리덕타제의 작은 서브유닛을 코딩하는 유전자 (F4L 유전자)의 결손 및 티미딘 키나제를 코딩하는 유전자 (J2R 유전자)의 결손을 포함하고 자살 유전자를 추가로 포함하는 종양용해 폭스바이러스를 항암 요법에 효과적인 1종 이상의 물질과 조합하여 포함하며, 여기서 항암 요법에 효과적인 1종 이상의 물질은 이리노테칸 및 옥살리플라틴으로부터 선택되고, 상기 자살 유전자는 적어도 1종의 시토신 데아미나제 및 1종의 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 백시니아(Vaccinia) 바이러스 균주 코펜하겐(Copenhagen)인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 폭스바이러스 및 상기 1종 이상의 물질이 전신 경로를 통해 또는 종양 내로, 또는 정맥내로 투여되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
4. 제1항에 있어서, 이리노테칸의 용량이 5 내지 100 mg/kg/일로 포함되고, 폭스바이러스의 용량이 1x10⁶ 내지 1x10⁹ pfu로 포함되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 1 내지 3회 정맥내로 주사되고, 이리노테칸이 상기 폭스바이러스의 제1 투여로부터 3 내지 10일 후에 주사되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
6. 제1항에 있어서, 옥살리플라틴이 정맥내로 또는 복강내로 투여되고, 폭스바이러스가 정맥내로 투여되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
7. 제6항에 있어서, 옥살리플라틴의 용량이 0.5 내지 10 mg/kg/일로 포함되고, 폭스바이러스의 용량이 1x10⁶ 내지 1x10⁹ pfu로 포함되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
8. 제6항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 1 내지 3회 정맥내로 주사되고, 옥살리플라틴이 1회 이상의 주기 동안 2주마다 주사되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 옥살리플라틴이 상기 폭스바이러스의 제1 투여로부터 3 내지 10일 후에 투여되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
10. 제1항에 있어서, 자살 유전자가 서열 식별자 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 서열에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
11. 제10항에 있어서, 상기 사용이 제약상 허용되는 양의 전구약물을 추가로 포함하는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 전구약물이 5-플루오로시토신인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 전구약물이 상기 폭스바이러스 조성물의 투여로부터 적어도 3일, 또는 적어도 4일, 또는 적어도 5일 후에 투여되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
14. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 암이 유방암, 자궁암, 전립선암, 폐암, 방광암, 간암, 결장암, 췌장암, 위암, 식도암, 후두암, 중추 신경계 암, 혈액암, 교모세포종암 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 암 치료에 사용하기 위한 조성물.
15. 삭제
16. 삭제

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