CN1826410B - 具有改良的胞嘧啶脱氨酶活性的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有CDase活性的多肽，特征在于其通过添加一段氨基酸序列而衍生自天然CDase，条件是所述多肽不具有UPRtase或胸苷激酶活性。

Description

具有改良的胞嘧啶脱氨酶活性的多肽
本发明涉及具有CDase活性的多肽，特征在于其通过添加氨基酸序列而衍生自天然CDase，条件是所述多肽没有UPRtase或胸苷激酶活性。
本发明还涉及编码这种具有CDase活性的多肽的核苷酸序列，涉及表达所述具有CDase活性的多肽的载体，涉及病毒颗粒和宿主细胞，并涉及包含其的组合物。最后，本发明还涉及其治疗性应用和使用其的治疗方法。在自杀基因治疗的情况下，本发明特别用于对于特别是增生性和感染性疾病的应用。
基因治疗定义为将遗传信息转移至宿主细胞或生物体。在美国，1990年9月，对一个由于突变而影响了编码腺嘌呤脱氨酶(ADA)的基因的遗传免疫缺陷的患者进行了对于人的第一次治疗方案。这第一次实验的相对成功鼓舞了这种方法用于多种疾病的研究，包括遗传疾病(目的是校正缺陷基因的障碍)和获得性疾病(癌症、感染性疾病，如AIDS等)。从那时起这个技术经历了大量的发展，包括“自杀基因”治疗，其应用了表达产物能够将非活性物质(前体药物)转化为胞毒性物质，从而引起细胞死亡的基因。1992年，几个小组证实了这种新的方法用于治疗肿瘤和抑制引起AIDS的HIV病毒的传播的相关性。
在这方面，编码单纯疱疹1型病毒胸苷激酶(HSV-1TK)的基因构成了自杀基因的原型(Caruso et al.，1993，Proc.Nati.Acad.Sci.USA90，7024-7028；Culver et al.，1992，Science 256，1550-1552；Ramet al.，1997，Nat.Med.3，1354-1361)。虽然TK多肽没有那样的毒性，但是其催化核苷类似物如无环鸟苷或9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤的转化。修饰的核苷掺入到正在延伸中的DNA链中，结果抑制了细胞分裂。目前可以获得大量的自杀基因/前体药物对。可以被特别提及的是大鼠细胞色素p450及环磷酰胺(Human Gene Therapy 5，969-978)、大肠杆菌(E.coli)嘌呤核苷磷酸化酶及6-甲基嘌呤脱氧核苷(Sorscher et al.，1994，Gene Therapy 1，223-238)、大肠杆菌鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶及6-硫黄嘌呤(Mzoz and Moolten，1993，Human Gene Therapy 4，589-595)和胞嘧啶脱氨酶(CDase)及5-氟胞嘧啶(5FC)。
CDase参与嘧啶代谢途径，通过其外源胞嘧啶通过水解脱氨转化为尿嘧啶。虽然CDase活性在原核生物和低等真核生物中被证实(Jund and Lacroute，1970，J.Bacteriol.102，607-615；Beck et al.，1972，J.Bacteriol.110，219-228；De Haan et al.，1972，Antonie vanLeeuwenhoek 38，257-263；Hoeprich et al.，1974，J.Inf.Dis.130，112-118；Esders and Lynn，1985，J.Biol.Chem.260，3915-3922)，但是其不存在于哺乳动物中(Koechlin et al.，1966，Biochem Pharmacol.15，435-446；Polak et al.，1976，Chemotherapy 22，137-153)。已知酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)FCY1和大肠杆菌codA基因，其分别编码这两种生物的CDase，其序列已被公开(EP402108；Erbs et al.，1997，Curr.Genet.31，1-6；WO93/01281)。
CDase也将胞嘧啶类似物，即5-氟胞嘧啶(5-FC)脱氨，从而形成5-氟尿嘧啶(5-FU)，当转化为5-氟-UMP(5-FUMP)时其是高毒性的化合物。因为使编码该酶的基因失活的突变或者因为该酶天然缺陷，如哺乳动物细胞，而缺少CDase活性的细胞对于5-FC是抗性的(Jund and Lacroute，1970，J.Bacteriol.1989 171，2124-2127)。相反，转移了编码CDase活性的序列的哺乳动物细胞对于5-FC变得敏感(Huber et al.，1993，Cancer Res.53，4619-4626；Mullen et al.，1992，Proc.Nati.Acad.Sci USA 89，33-37；WO93/01281)。另外，邻近的、未转化的细胞对于5-FC也变得敏感(Huber et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，8302-8306)。称为旁观者效应(bystandereffect)的这种现象是由于表达CDase活性的细胞分泌5-FU，其然后通过跨质膜的直接扩散(straightforward diffusion)而使邻近细胞中毒。与tk/GCV参考系统相比，5-FU的被动扩散的性质显示了一个优势，因为tk/GCV参考系统的旁观者效应要求与表达tk的细胞接触(Mesnil et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，1831-1835)。在基因治疗中，特别是抗癌基因治疗中CDase提供的所有优点可以容易地被理解。
为了改良使用CDase活性方法的效率，现有技术WO-A-96/16183推荐使用编码具有CDase和UPRTase活性的一种两结构域酶的融合蛋白，并且证实在体外通过表达质粒携带的杂种codA：：upp或FCY1：：FUR1基因的转移提高了转染的B16细胞对于5-FC的敏感性。WO99/54481通过使用缺失N-末端部分突变的、编码UPRTase的FUR1基因提供了对这个发明的改良。
本发明是对于现有技术的改良，其使用了具有CDase活性的多肽，特征在于其通过添加氨基酸序列而衍生自天然CDase，条件是所述多肽没有UPRTase或胸苷激酶活性。
本发明提供了更有效率的多肽，从而可能提高细胞对5-FC的敏感性或者通过产生5-FU诱导旁观者效应并且改良了使用自杀基因的基因治疗的前景。这个突变体可以用于大量的应用，特别是抗癌和抗病毒应用，以及所有需要细胞死亡的应用。
“胞嘧啶脱氨酶活性”(CDase活性)应被理解为涵盖胞嘧啶或其类似物之一的脱氨作用。
“衍生自天然CDase”广义指所述具有CDase活性的多肽包含与所述天然CDase具有大于70％，有利地大于80％，优选大于90％及非常优选大于95％的相同性程度的氨基酸序列。更优选地，具有CDase活性的多肽包含天然CDase的氨基酸序列。
在本发明的范围内，天然CDase指原核或真核来源的CDase。优选地，CDase是酵母CDase，特别是酿酒酵母FCY1基因编码的酶。编码不同来源的CDase的基因的克隆和序列在现有技术和专门的数据库中是可获得的。关于信息，FCY1基因的序列揭示于Erbs et al.(1997，Curr.Genet.31，1-6)。
优选的例子是天然CDase，其包含基本上如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，起始于1位的Met残基并终止于158位的Glu残基。术语“基本上”指与所述SEQ ID NO：1序列的相同性程度，其大于70％，有利地大于80％，优选大于90％及非常优选大于95％。更优选地，所述多肽包含SEQ ID NO：1所示的、起自1位的Met残基并终止于158位的Glu残基的氨基酸序列。具有SEQ ID NO：1所示的、起自1位的Met残基并终止于158位的Glu残基的氨基酸序列的多肽是非常适于实施本发明的。
根据有利的实施方案，本发明的多肽具有略微高于所述天然CDase的CDase活性。因此，随后的实例证实了添加没有UPRTase活性的氨基酸序列可能提高靶细胞对5-FC的敏感性和/或在处理的动物中诱导的旁观者效应。敏感性提高的因数有利地至少为2，优选至少为5及非常优选为10或更高。
“没有UPRtase活性的多肽”涵盖了不能将5-FU转化为5-FUMP的多肽。氨基酸序列转化5-FU为5-FUMP的能力可以通过使用本申请的实施例中揭示的方法评估。
“没有胸苷激酶活性的多肽”涵盖了不能磷酸化核苷(例如dT)和核苷类似物如9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(9-{[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]}鸟苷)、泛昔洛韦(famciclovir)、布昔洛韦(buciclovir)、喷昔洛韦(penciclovir)、valciclovir、无环鸟苷(9-[2-羟基乙氧基甲基]鸟苷)、三氟胸苷、1-[2-脱氧、2-氟、β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶、ara-A(阿糖腺苷、vivarabine)、1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脱氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷、碘苷(5-碘-2’-脱氧尿苷)、AZT(3’叠氮-3’胸苷)、ddC(双脱氧胞苷)、AIU(5-碘-5’-氨基2’，5’-双脱氧尿苷)和AraC(阿糖胞苷)。
根据优选的实施方案，添加到天然CDase的氨基酸序列长度在10和1000个氨基酸之间，优选在100和400个氨基酸之间并非常优选在200和300个氨基酸之间。尽管添加可以发生在天然CDase中的任何位点，但是优选N-或者C-末端，特别是C-末端。
有利地，添加到天然CDase的氨基酸序列衍生自具有UPRTase活性的多肽。
“衍生自具有UPRtase活性的多肽”广义指所述氨基酸序列与具有UPRTase活性的多肽的氨基酸序列具有大于70％，有利地大于80％，优选大于90％及非常优选大于95％的相同性程度。
在本发明的范围内，具有UPRTase活性的多肽指能够将尿嘧啶或其衍生物之一转化为单磷酸类似物，特别是将5-FU转化为5-FUMP的多肽。“突变”是指在所述多肽中添加、缺失和/或取代一或多个残基。
本发明的氨基酸序列衍生自其的、具有UPRtase活性的多肽可以是任何来源，特别是原核、真菌或酵母来源的。作为例子，来自大肠杆菌的UPRTase(Anderson et al.，1992，Eur.J.Biochem 204，51-56)、来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的UPRTase(Martinussen andHammer，1994，J.Bacteriol.176，6457-6463)、来自牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的UPRTase(Kim et al.，1997，BiochemMol.Biol.mt 41，1117-1124)和来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的UPRTase(Martinussen et al.，1995，J.Bacteriol.177，271-274)可以用于本发明。然而，非常特别优选的是酵母UPRTase，特别是酿酒酵母FUR1基因编码的，其序列揭示于Kern et al.(1990，Gene 88，149-157)。更特别地，已知所述基因的序列和相应的UPRTase的序列可以发现于现有文献和专门的数据库中(SWISSPROT、EMBL、Genbank、Medline等)。更特别地，fur1-7、fur1-8和fur1-9编码的突变体可以用于本发明。在一个优选的实施方案中，衍生自具有UPRTase活性的多肽的氨基酸序列是fur1-8等位基因编码的氨基酸序列(Kern et al.，1990，Gene 88，149-157)。
根据特别有利的实施方案，本发明添加到天然CDase的氨基酸序列衍生自天然UPRTase的缺失突变体。缺失优选位于原始UPRTase的N末端区域。缺失可以是全部(影响所述N-末端区域的所有残基)或部分的(影响一级结构中可能连续或不连续的一或多个残基)。通常，多肽由N-末端部分、中间部分和C-末端部分组成，每一部分代表了大约三分之一的分子。例如，在含有251个氨基酸的酿酒酵母UPRTase的情况中，N-末端部分由头83个残基组成，起自所谓的起始甲硫氨酸，位于天然形式的第一位。在大肠杆菌UPRTase的情况中，N-末端部分包括了第1-69位。
已经示出名为FUR1Δ105的突变基因的表达产物能够互补酿酒酵母fur1突变体，从而证实其是功能性的。
非常优选本发明具有UPRTase活性的多肽至少通过缺失全部或部分所述天然UPRTase的第二个ATG密码子上游的N-末端区域而衍生自天然UPRTase。优选全部缺失上述区域。例如，FUR1基因编码的UPRTase包含+1位的第一个ATG密码子，随后在+36位还有一个。因此，可以设想在本发明中缺失+1-35位的残基，从而得到起自位于天然形式的+36位的甲硫氨酸的多肽。已经示出名为FUR1Δ105的突变基因的表达产物能够互补酿酒酵母fur1突变体，从而证实其是功能性的。
本发明添加到天然CDase的优选氨基酸序列包括基本上如SEQID NO：2所示的、起自第2位的Ser残基并终止于216位的Val残基的氨基酸序列。术语“基本上”指与所述序列相同性的程度，其大于70％，有利地大于80％，优选大于90％及非常优选大于95％。更优选地，添加到天然CDase的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的、起自第2位的Ser残基并终止于216位的Val残基的氨基酸序列。添加到天然CDase的、具有如SEQ ID NO：2所示的起自第2位的Ser残基并终止于216位的Val残基的氨基酸序列的氨基酸序列非常特别适用于实施本发明。这个添加到天然CDase的氨基酸序列可能含有额外的突变。可以特别提及的是SEQ ID NO：2中第2位的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代。
本发明的具有CDase活性的优选多肽包含基本上如SEQ ID NO：1所示、起自第1位的Met残基并终止于373位的Val残基的氨基酸序列。术语“基本上”指与所述SEQ ID NO：1序列相同性的程度，其大于70％，有利地大于80％，优选大于90％及非常优选大于95％。更优选地，多肽包含SEQ ID NO：1所示的、起自第1位的Met残基并终止于373位的Val残基的氨基酸序列。具有如SEQ ID NO：1所示、起自第1位的Met残基并终止于373位的Val残基的氨基酸序列的多肽非常特别适于实施本发明。
通常，本发明的多肽可以通过常规的化学合成方法或者通过重组DNA技术生产(见例如Maniatis et al.，1989，Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。为此，本发明还涵盖了一种制备方法，其中编码所述多肽的核苷酸序列被导入细胞中以产生转化细胞，所述转化细胞在适于生产所述多肽的条件下培养，并且从所述细胞培养物中收集所述多肽。生产者细胞可以是任何来源的，没有限制，可以是细菌、酵母或哺乳动物细胞，只要被研究的核苷酸序列能整合进其基因组或者整合进能复制的合适的表达载体中。当然，所述核苷酸序列置于能使其在生产者细胞中表达的转录和翻译信号的控制下。本领域技术人员已知表达载体和控制信号。所述多肽可以从培养基或细胞(在其被裂解后)中回收并进行常规的纯化步骤(通过层析、电泳、过滤、免疫沉淀等)。
本发明还涉及编码本发明多肽的核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是cDNA或基因组序列或其混合类型。适当地，其可以含有一或多个内含子以提高宿主细胞中的表达，这些内含子可以是天然、异源(例如兔β-球蛋白基因的内含子等)或合成来源的。本发明所用的序列可以通过常规分子生物学技术获得，例如通过用特异探针筛选文库、通过免疫筛选表达文库或通过使用适当引物的PCR或通过化学合成法获得。突变体可以通过使用定点诱变技术、PCR、用限制酶和连接酶消化取代、缺失和/或添加一或多个核苷酸产生自天然序列或者化学合成产生。突变体和构建体有功能的能力可以通过分析酶活性或者通过测量靶细胞对5-FC和/或5-FU的敏感性而验证。
本发明还涉及携带本发明核苷酸序列的重组载体，所述核苷酸序列置于在宿主细胞中表达其所需的元件的控制下。重组载体可以是质粒或病毒来源，并适当地可以组合了一或多种改良了载体的转染效率和/或稳定性的物质。这些物质广泛记载于现有文献中，可以为本领域技术人员获得(见例如Feigner et al.，1987，Proc.West.Pharmacol.Soc.32，115-121；Hodgson and Solaiman，1996，Nature Biotechnology 14，339-342；Remy et al.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，647-654)。作为非限制性说明，所述物质可以是聚合物、脂质，特别是阳离子脂质、脂质体、核蛋白或中性脂质。这些物质可以单独使用或组合使用。可以设想的组合是组合了阳离子脂质(DOGS、DC-CHOL、精胺-Chol、亚精胺-Chol等)、溶血磷脂(例如十六烷基磷酸胆碱)和中性脂质(DOPE)的重组质粒载体。
根据优选的实施方案，可以用于本发明的阳离子脂质是EP901463B1中所述的阳离子脂质，并更优选pcTG90。
可以用于本发明的质粒的选择是广泛的。它们可以是克隆载体和/或表达载体。通常，本领域技术人员已知这些质粒，其中一些已经可以商业获得，也可以使用遗传操作技术构建它们或修饰它们。可以提及的例子是衍生自pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Strategene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)或p Poly(Latheet al.，1987，Gene 57，193-201)的质粒。优选地，用于本发明的质粒含有一个复制起点，以保证在生产者细胞和/或宿主细胞中起始复制(例如，对于一个要在大肠杆菌中生产的质粒可以选择ColEl起点，如果希望质粒在哺乳动物宿主细胞中自我复制可以选择oriP/EBNA1系统，Lupton and Levine，1985，Mol.Cell.Biol.5，2533-2542；Yates et al.，Nature 313，812-815)。质粒可以额外包含选择基因，使得可以选择或鉴定转化细胞(营养缺陷突变的互补、编码对抗生素抗性的基因等)。当然，质粒可以含有额外的改良其在给定细胞中的维持性(maintenance)和/或稳定性的元件(cer序列，其有助于单体形式的质粒的维持(Summers and Sherrat，1984，Cell 36，1097-1103)、整合进入细胞基因组的序列)。
对于病毒载体，可以设想衍生自痘病毒(痘苗病毒，特别是MVA、canarypoxvirus等)、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、甲病毒属、泡沫病毒或腺伴随病毒的载体。可以使用有复制能力(replicationcompetent)的或复制缺陷的病毒载体。优选使用不整合的载体。在这方面，腺病毒载体和MVA非常特别适于实施本发明。
根据优选的实施方案，本发明的病毒载体衍生自修饰的安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Ankara，MVA)。Mva载体和生产这种载体的方法在欧洲专利EP83286和EP206920以及Mayr et al.(1975，Infection 3，6-14)和Sutter et Moss(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，10847-10851)中被充分描述。根据更优选的实施方案，本发明的核苷酸序列可以插入MVA载体的缺失I、II、III、IV、V和VI中，甚至更优选插入缺失III中(Meyer et al.，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038；Sutter et al.，1994，Vaccine 12，1032-1040)。
逆转录病毒具有感染分裂细胞的特性，并且在大多数情况下整合进分裂细胞，在这方面，其特别适于在与癌症相关中的应用。本发明的重组逆转录病毒通常含有LTR序列、壳体化区域和本发明的核苷酸序列，其置于逆转录病毒LTR或内部启动子如下述那些的控制下。重组逆转录病毒可以衍生自任何来源的逆转录病毒(鼠、灵长类、猫科、人类等)且特别来自MOMuLV(莫洛尼鼠类白血病毒)、MVS(鼠类肉瘤病毒)或弗罗德鼠逆转录病毒(Friend murine retrovirus，Fb29)。其在能够反式(in trans)提供构成病毒颗粒所需的病毒多肽gag、pol和/或env的壳体化细胞系中增殖。这种细胞系在现有文献中描述(PA137，Psi CRIP GP+Am-12等)。本发明的逆转录病毒载体可以含有修饰，特别是在LTR中(用真核启动子取代启动子区域)或者是在壳体化区域中(用异源壳体化区域取代，例如VL30型)(见法国专利9408300和9705203)。
优选使用腺病毒载体，其缺失全部或部分至少一个复制必需的区域，所述必需区域选自E1、E2、E4和L1-L5区域以避免载体在宿主生物体内或在环境中增殖。优选缺失E1区域。然而，其可以组合影响、特别是全部或部分E2、E4和/或L1-L5区域的其它修饰/缺失，只要缺陷的必需功能可以通过互补细胞系和/或辅助病毒反式互补。在这方面，可以使用现有技术中的第二代载体(second-generationvectors)(见例如国际申请WO-A-94/28152和WO-A-97/04119)。作为说明，缺失主要部分的E1区域和E4转录单位是非常特别有利的。为了提高克隆容量，腺病毒载体可以额外缺失全部或部分的非必需E3区域。按照另一种选择，可以使用最小腺病毒载体，其保留了壳体化必需的序列，即5’和3’ITR(末端反向重复序列)和壳体化区域。不同的腺病毒载体和制备其的技术是已知的(见例如Graham andPrevect，1991，Methods in Molecular Biology，Vol 7，p109-128；Ed：E.J.Murey，The Human Press me)。
而且，本发明腺病毒载体的来源可以根据物种和血清型而变化。载体可以来自人或动物来源(犬类、鸟类、牛、鼠类、绵羊、猪、猿等)的腺病毒基因组或者来自包含至少两种不同来源的腺病毒基因组片段的杂种。更特别提及的可以是犬来源的CAV-1或CAV-2腺病毒、鸟类来源的DAV腺病毒或牛来源的Bad 3型腺病毒(Zakharchuk etal.，Arch.Virol.，1993，128：171-176；Spibey and Cavanagh，J.Gen.Virol.1989，70：165-172；Jouvenne et al.，Gene 1987，60：21-28；Mittal et al.，J.Gen.Virol.，1995，76：93-102)。然而，优选人来源的腺病毒载体，优选来自血清型C腺病毒，特别是2型或5型血清型腺病毒。
本文所用术语“有复制能力”指在没有任何反式互补的宿主细胞中能够复制的病毒载体。本发明中，该术语还涵盖了复制选择性或条件复制型腺病毒载体，其被工程化以在癌症或高增生性宿主细胞中更好地或选择性复制。
根据本发明的优选实施方案，有复制能力的载体是有复制能力的腺病毒载体。这些有复制能力的腺病毒载体为本领域技术人员所熟知。其中，缺失了编码55kD P53抑制物的E1b区域的腺病毒载体是特别优选的，如ONYX-015病毒(Bischoff et al.，1996；Heise et al.，2000；WO 94/18992)。因此，这个病毒可以用于选择性感染和杀死p53缺陷性赘生性细胞。本领域技术人员还可以根据已有技术突变和破坏腺病毒5或者其它病毒中的p53抑制基因。缺失了E1A Rb结合区域的腺病毒载体也可以用于本发明。例如，Delta24病毒，其是具有E1A区域中24个碱基对缺失的突变体腺病毒(Fueyo et al.，2000)。Delta24在Rb结合区域中具有缺失且不结合Rb。因此，在正常细胞中该突变体病毒的复制被抑制。然而，如果Rb是失活的及细胞变为赘生性的，Delta24不再被抑制。因此，突变体病毒有效复制并裂解Rb缺陷细胞。
本发明的腺病毒载体可以在体外在大肠杆菌中通过连接或同源重组产生(见例如国际申请WO-A-96/17070)或通过在互补细胞系中重组产生。
表达必需的元件由所有能使核苷酸序列能被转录为RNA和mRNA以翻译为多肽的元件组成。这些元件包括，特别是，可被调节的或组成型启动子。当然，所述启动子适用于所选择的载体和宿主细胞。可以提及的例子是PGK(磷酸甘油酸激酶)、MT(金属硫蛋白；Mclvor et al.，1987，Mol.Cell Biol.7，838-848)、α-1抗胰蛋白酶、CFTR、表面活性剂、免疫球蛋白、β-肌动蛋白(Tabin et al.，1982，Mol.Cell Biol.2，426-436)和SRa(Takebe et al.，1988，Mol.Cell Biol.8，466-472)基因的真核启动子，SV40病毒(猿猴病毒)的早期启动子，RSV(劳斯肉瘤病毒)的LTR，HSV-1TK启动子、CMV病毒(巨细胞病毒)的早期启动子，痘苗病毒的p7.5K pH5R、pK1L、p28和p11启动子，及E1A和MLP腺病毒启动子。所述启动子也可以是在肿瘤或癌症细胞中刺激表达的启动子。特别提及的是MUC-1基因的启动子，该基因在乳腺癌和前列腺癌中过表达(Chen et al.，1995，J.Clin.Invest.96，2775-2782)，CEA(代表癌胚抗原)基因的启动子，其在结肠癌中过表达(Schrewe et al.，1990，Mol.Cell.Biol.10，2783-2748)，酪氨酸酶基因的启动子，其在黑素瘤中过表达(Vile etal.，1993，Cancer Res.53，3860-3864)，ERBB-2基因的启动子，其在乳腺癌和胰腺癌中过表达(Harris et al.，1994，Gene Therapy 1，170-175)和α-胎蛋白基因的启动子，其在肝癌中过表达(Kanai et al.，1997，Cancer Res.57，461-465)。巨细胞病毒(CMV)早期启动子是非常特别优选的。
然而，当使用衍生自痘苗病毒的载体(例如MVA载体)时，胸苷激酶7.5K基因的启动子时特别优选的。
所需的元件还可以包括额外的改良本发明核苷酸序列在宿主细胞中表达或其维持性的元件。可以特别提及的是内含子序列、分泌信号序列、核定位序列、IRES类型的翻译再起始的内部位点、转录终止poly A序列、三联前导序列和复制起点。这些元件为本领域技术人员已知。
本发明的重组载体还可以包括一或多个感兴趣的额外基因，可以将这些基因置于相同的调节元件(多顺反子盒)或独立的元件的控制之下。可以特别提及的基因是编码白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、特别是GM-CSF和对血管发生有作用的因子(例如PA1-1，代表纤溶酶原激活物抑制剂)的基因。在一个特别的实施方案中，本发明的重组载体包括编码IL-2或编码干扰素γ(INFγ)的感兴趣的基因。也可以设想组合本发明的核苷酸序列和其它的自杀基因，如HSV-1TK基因、ricin基因、霍乱毒素基因等。
本发明还涉及包含本发明重组载体的病毒颗粒。这种病毒颗粒可以使用任何本领域常规的技术从病毒载体中产生。所述病毒颗粒再适用于载体缺陷型的互补细胞中增殖。对于腺病毒载体，例如将使用293细胞系，其是用人胚胎肾细胞建立的并且有效地互补E1功能(Graham et al.，1977，J.Gen.Virol.36，59-72)，使用A549-E1细胞系(Imler et al.，1996，Gene Therapy 3，75-84)或者使用允许双重互补(double complementation)的细胞系(Yeh et al.，1996，J.Virol.70，559-565；Krougliak and Graham，1995，Human Gene Therapy 6，1575-1586；Wang et al.，1995，Gene Therapy 2，775-783；国际申请WO 97/04119)。还可以使用辅助病毒以至少部分互补缺陷的功能。互补细胞是能够反式提供对于在病毒衣壳中壳体化病毒基因组所需的早期和/或晚期因子的细胞，以便产生含有所述重组载体的病毒颗粒。所述细胞自身可能不能互补载体的所有缺陷的功能，此时可以用提供额外功能的载体/辅助病毒进行转染/转导。
本发明还涉及制备病毒颗粒的方法，其中方法包括：
(i)将本发明的重组载体导入能够反式互补所述载体的互补细胞中，以获得转染的互补细胞，
(ii)在适于使所述病毒颗粒产生的条件下培养所述转染的互补细胞，及
(iii)从细胞培养物中回收所述病毒颗粒。
病毒颗粒当然可以从培养上清中回收，其也可以从细胞中回收。一个常用的方法由通过连续冷冻/融解循环来裂解细胞组成，以便在裂解上清中收集病毒体。然后可以使用本领域技术(层析方法、超速离心方法、特别是通过氯化铯梯度等)扩增和纯化该病毒体。
本发明还涉及包含本发明的核苷酸序列或重组载体、或者用本发明的病毒颗粒感染的宿主细胞。为此，宿主细胞由可以被上述的重组载体转染或被病毒颗粒感染的任何细胞组成。哺乳动物细胞，特别是人细胞是非常特别适合的。所述细胞可以包含整合进或未整合进(附加体(episome))基因组的形式的所述载体。细胞可以是任何来源的原代或肿瘤细胞，特别是造血细胞(全能干细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞等)、肌细胞(卫星细胞、肌原细胞、成肌细胞、平滑肌细胞等)、心细胞、肺细胞、气管细胞、肝细胞、上皮细胞或成纤维细胞。
本发明还涉及包含本发明多肽、核苷酸序列、重组载体、病毒颗粒或宿主细胞并组合了药用可接受赋形剂的组合物。
本发明还涉及包含本发明多肽和一种感兴趣多肽的组合物，所述感兴趣的多肽被前述一种感兴趣的基因编码。这些感兴趣的多肽，可以特别提及的是白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)，特别是GM-CSF和对血管发生有作用的因子(例如PA1-1，代表纤溶酶原激活物抑制剂)。非常特别优选IL-2或INFγ。
所述组合物还可以基于能使上述多肽在宿主细胞中表达的核苷酸序列。该核苷酸序列可以被同一个表达载体或者被两个独立的载体携带。所述组合物当然可以包含产生自表达所述核苷酸序列的病毒载体的病毒颗粒。
本发明还涉及包含本发明核苷酸序列和编码选自IL-2和INFγ的多肽的感兴趣的第二种核苷酸序列的组合物。
本发明的组合物更特异地用于通过基因治疗预防或治疗疾病，且更特异针对增生性疾病(癌症、肿瘤、再狭窄等)及感染起源的疾病，特别是病毒感染(由乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒、HIV、疱疹、逆转录病毒等诱导的)。
本发明的组合物可以通过局部、肠胃外或通过消化道常规施用。特别地，治疗有效量的治疗性或预防性制剂组合了药用可接受的赋形剂。可以设想大量的施用途径。可以提及的例子是胃内、皮下、心内、肌内、静脉内、腹膜内、肿瘤内、鼻内、肺内和气管内途径。在后三种实施方案中，有利地通过气雾剂或通过滴入法施用。施用可以是单剂量或一定时间间隔后一或多次重复施用的剂量。适当的施用途径和剂量依赖于多种参数而变化，例如个体、要治疗的疾病或被转移的感兴趣基因。基于本发明病毒颗粒的制备物可以如下剂量形式配制，当使用腺病毒颗粒时，在104和1014pfu(蚀斑形成单位)之间，有利地为105和1013pfu之间，优选在106和1012pfu之间，更优选在109和1010之间，当使用MVA颗粒时，在106和107之间。至于本发明的重组载体，可以设想剂量包含0.01-100mg的DNA，优选0.05-10mg，非常特别优选0.5-5mg。基于多肽的组合物优选包含0.05-10g，非常特别优选0.05-5g所述多肽。当然，这些剂量在临床时可以调整。
所述制剂还可以包括药用可接受的稀释剂、佐剂或赋形剂，以及增溶、稳定和保存剂。在注射施用时，优选水溶液、非水溶液或等渗溶液的制剂。其可以是单剂量或多剂量，以液体或使用适当的稀释剂在使用时可以复水的干燥(粉末、冻干物等)形式。制剂还可以包含适当量的前体药物。
本发明还涉及本发明的多肽、重组载体、病毒颗粒或宿主细胞在制备用于通过基因治疗或通过施用由重组途径生产的蛋白而治疗人或动物机体的药物中的治疗性或预防性应用。根据第一种可能性，药物可以直接体内施用(例如通过静脉内注射，进入可接近的肿瘤，通过气雾剂进入肺，使用适当的导管进入血管系统)。还可以采用回体(exvivo)方法，该方法从患者中取出细胞(骨髓干细胞、外周血淋巴细胞、肌细胞等)，在体外用本领域的技术转染或感染它们，然后将其重新施用给患者。优选的应用是治疗或预防癌症、肿瘤和非所需细胞增殖导致的疾病。可以提及的可能想到的应用是乳腺癌、子宫癌(特别是乳头瘤病毒诱导的)、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、喉癌、中枢神经系统癌症(例如成胶质细胞瘤)和血癌(淋巴瘤、白血病等)。其也可以用于心血管疾病中，例如抑制或延迟血管壁平滑肌细胞的增生(再狭窄)。最后，再感染性疾病中，可以设想所述药物用于AIDS。
本发明还涉及通过基因治疗治疗疾病的方法，特征在于将本发明的核苷酸序列、重组载体、病毒颗粒或宿主细胞施用给需要这种治疗的宿主生物体或细胞。
根据一个有利的实施方案，所述治疗性应用或治疗方法还包含一个额外的步骤，其中药用可接受量的前体药物，有利的为胞嘧啶类似物，特别是5-FC被施用给宿主生物体或细胞。作为说明，可以使用50-500mg/kg/天的剂量，优选200mg/kg/天的剂量。本发明中，在施用本发明的治疗剂之前、同时或随后，按照标准实践(例如口服，系统性)施用前体药物。优选口服途径。可以施用单剂量的前体药物或在足够长的时间内重复施用剂量以使得毒性代谢物在宿主生物体或细胞中产生。
而且，本发明的组合物或方法可以组合一或多种加强5-FU胞毒性作用的物质。可以特别提及的是抑制嘧啶从头开始的生物合成途径中的酶的药物(例如如下提及的)，如甲酰四氢叶酸的药物(Waxmanet al.，1982，Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18，685-692)，其在没有5-FU的代谢产物(5-FdUMP)时，增加了胸苷酸合酶的抑制，导致dTMP库(pool)的降低，其是复制所需的，及最后如氨甲蝶呤的药物(Cadmanet al.，1979，Science 250，1135-1137)，其通过抑制二氢叶酸还原酶和增加PRPP(磷酸核糖焦磷酸)库，导致5-FU向细胞RNA中的掺入增加。
本发明的组合物或方法可以组合一或多种在抗癌治疗中有效的物质。可以与本发明的组合物联合或组合使用的、在抗癌治疗中有效的药物物质可以是烷化剂，如丝裂霉素C、环磷酰胺、白消安、异环磷酰胺(ifosfamide)、异环磷酰胺(Isosfamide)、苯丙氨酸氮芥、六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)、硫化三磷、苯丁酸氮芥或者达卡巴嗪(dacarbazine)；抗代谢物，如吉西他滨(gemcitabine)、卡西他滨(capecitabine)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(Cytarabine)、2-氟脱氧胞苷、氨甲蝶呤、idatrexate、雷替曲塞(tomudex)或者三甲曲沙(trimetrexate)；拓扑异构酶II抑制剂，如阿霉素、表阿霉素(epirubicin)、鬼臼亚乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷或米托蒽醌(mitoxantrone)；拓扑异构酶I抑制剂，如伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)或者托泼替坎(topotecan)；抗有丝分裂药，如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春花碱、长春花新碱或长春瑞宾(Vinorelbine)；及铂(platinum)衍生物，如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、螺铂(spiroplatinum)或者卡铂(carboplatinum)。本发明的组合物或方法还可以组合放射治疗。
本发明还涉及使用本发明的序列或重组载体作为哺乳动物细胞中的阳性选择标记。有利地，所述细胞被转染且然后在存在嘧啶的从头生物合成途径的抑制剂的情况下培养细胞混合物，如存在PALA(N(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸；Moore et al.，1982，Biochem.Pharmacol.31，3317-3321)、A771726(来氟诺胺(Leflunomide)的活性代谢物；Davis et al.，1996，Biochem.35，1270-1273)和布利喹啉(Brequinar)(Chen et al.，1992，Cancer Res.52，3251-3257)。这种抑制剂的存在阻断了UMP的从头合成，其是合成RNA和DNA所需的，从而导致了细胞死亡。这种胞毒性作用可以通过在存在尿嘧啶时表达本发明的编码UPRTase活性的核苷酸序列或者通过在存在胞嘧啶时将上述核苷酸序列与编码CDase活性(合适的融合形式)的序列共表达而被克服。结果，只有转染的细胞(整合了UPRTase/CDase序列的细胞)能够在存在嘧啶合成途径抑制剂时生长。因此，本发明的应用使得转染细胞能够有效地从细胞混合物中被鉴定和/或分离。
本发明还涉及本发明的序列或重组载体作为阴性选择标记的应用。例如，本发明的序列或重组载体可以用于选择胚胎干细胞或进行核转移后获得的细胞，所述细胞中的基因是间断的或修饰的(例如在制备转基因动物的方法中)的(见例如Capecchi，1989，Science 244，1288-1292；Reid et al.，1990，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 87，4299-4303)。这种应用组合了对新霉素有抗性的基因例如可以选择经过了同源重组事件并在存在遗传霉素核相应的氟化嘧啶(使用编码CDase活性的核苷酸序列时是5-FC)时单独能够生长的细胞。经历了非靶向重组事件的细胞可以在存在遗传霉素时生长但不能在存在氟化嘧啶时生长。另一种作为阴性选择标记的潜在应用发现于植物领域，因为就如哺乳动物细胞一样，植物不具有任何内源性CDase活性。通过转染本发明能够表达外源CDase的核苷酸序列它们对5-FC敏化(见例如Perera et al.，1993，Plant.Mol.Biol.23，797-799)。
本发明的序列或重组载体还可以用作细菌或酵母的阴性选择标记。在这个特定实施方案中，优选使用缺少天然CDase基因的酵母或细菌。细菌中，特别优选EP0792369BB1中揭示的那些。例如，本发明的序列可以用于在包含本发明序列的质粒中通过同源重组来克隆序列。在这些实验中，本发明的序列位于待克隆的序列要被插入的位置。因此，同源重组后，包含所需质粒的细胞能够在存在5-FC时生长。
图1示出了用本发明的载体处理的CD1裸鼠中LOVO肿瘤细胞的生长。
实施例1：构建Fcu1-8
FCU1-8通过定向诱变FCU1构建，从pCI-neoFCU1(pTG13046)出发，以寡核苷酸5’-gtattcttattactgatgatgg-3’(以修饰A549en T)将183位的Arg以Ser取代，得到质粒pCT-neoFCU1-8(pTG15546)。
实施例2：在哺乳动物细胞中表达FCY1、FCU1及Fcu1-8并确定CDase和UPRTase活性
测试了质粒pCIneo(Promega)、pCI-neoFCY1(pTG15916)、pCI-neoFCU1(pTG13046)和pCI-neoFCU1-8(pTG15546)瞬时转染的哺乳动物COS7的原液的CDase和UPRTase活性。
程序如下：5105COS7细胞在37℃接种于含有5ml DMEM/10％FCS培养基的60mm烧瓶中。24小时后，在存在或不存在5μg质粒时用20μl的lipofectine(GIbco BRL)处理细胞。于2ml DMEM培养基中在37℃20小时后，细胞在存在5ml DMEM/10％FCS下温育。37℃48小时后，用PBS洗细胞，然后悬浮于25μl裂解缓冲液中(Tris-HClpH 7.550mM/NaCl 150mM/EDTA 5mM/DTT 1mM/triton 1％)。在4℃裂解30分钟后离心，在含有细胞裂解物的上清中测量CDase和UPRTase活性。
对于CDase活性：在存在2μl反应CDase缓冲液(Tris-HCl pH7.5
100mM/[H3]5-FC 3mM具有0.25μCi/μl)的情况下，于37℃温育4μl的细胞裂解物20分钟。
对于UPRTase活性：在存在2μl反应UPRTase缓冲液(Tris-HClpH7.5100mM/MgCl210mM/5-PRPP 10mM/[C14]5-FU 3mM具有0.02μCi/μl)的情况下，于37℃温育4μl的细胞裂解物20分钟。
在100℃、1分钟终止酶反应。将等份的1μl沉积在TLC聚乙烯亚胺纤维素平板上(Merck)。通过使用混合物水/1-丁醇(14％/86％)作为溶剂从5-FC中分离5-FU，并且5-FUMP和5-FU的分离通过使用水作为溶剂进行。迁移后，TLC平板在PosphorImager(445SI；Molecular Dynamics)上扫描。通过Bradford方法测量蛋白质浓度。
来自3个独立测量计算的酶活性结果示于下表中：
  CDasepmole 5-FC转化的/min/mg蛋白   UPRTasepmole 5-FU转化的/min/mg蛋白
  未转染   不可检测   不可检测
  pCI-neo   不可检测   不可检测
  pCI-neo FCY 1   783+/-311   不可检测
  pCI-neo FCU 1   9268+/-628   3866+/-518
  pCI-neo Fcu1-8   8263+/-782   不可检测
相比于FCU1基因，Fcu1-8突变体散失了UPRTase活性，保留了10倍高于天然FCY1基因的CDase活性的CDase活性。基因FCU1中Arg183变为Ser导致UPRTase活性，但不修饰CDase活性。
实施例3：构建表达FCU1的腺病毒(AdTG14800)
分离含有FCU1基因的pCI-neoFCU1(pTG13046)的XhoI-MluI片段并将其导入用这些相同酶切割的转移载体pTG13387中，得到转移载体pTG14799。在BJ 5183大肠杆菌中通过pTG14799的PacI-BstEII片段和ClaI线性化的载体pTG6624之间的同源重组重构(reconstitute)腺病毒载体AD-FCU1(pTG14800)。最终构建体AD-FCU1含有E1和E3缺失的Ad5基因组(核苷酸459-3510及28249-30758)且代替E1，包含FCU1基因的表达盒置于CMV启动子和β-球蛋白/IgG的控制下，随后是bGH的poly A序列。在互补细胞系(例如PERC6系)中通过转染产生表达FCU1(AdTG14800)的腺病毒颗粒。
实施例4：构建表达Fcu1-8的腺病毒(AdTG15606)
分离含有Fcu1-8基因的pCI-neoFCU1-8(pTG15546)的XhoI-MluI片段并将其导入用这些相同酶切割的转移载体pTG13387中，得到转移载体pTG15547。在BJ 5183大肠杆菌菌株中通过pTG15547的PacI-BstEII片段和ClaI线性化的载体pTG6624之间的同源重组重构腺病毒载体AD-FCU1-8(pTG15606)。最终构建体AD-FCU1-8含有缺失了E1(NT 459-3510)和E3(NT 28249-30758)区域的Ad5基因组且代替E1，包含Fcu1-8基因的表达盒置于CMV早期启动子杂种β-球蛋白/IgG和MVC的控制下，随后是bGH的poly A序列。在互补E1功能的细胞系例如PERC6中通过转染产生表达Fcul-8的病毒颗粒(AdTG15606)。
实施例5：通过表达FCU1(AdTG14800)和Fcu1-8(AdTG15606)的腺病毒的感染
体外结果
确定CDase和UPRTase活性
用空腺病毒(AdTG15149)、表达FCU1的腺病毒(AdTG14800)和表达Fcu1-8的腺病毒(AdTG15606)感染人肿瘤细胞系A549(ATCCCcl-185)。感染程序如下：于50μl PBS-2％FCS-阳离子1％悬液中的5106细胞在37℃在存在MOI5的腺病毒的情况下温育30分钟。总数5106细胞然后在存在5ml的DMEM-10％FCS下在60mm的烧瓶中温育。37℃24小时后，在PBS中洗细胞，然后重悬于25μl的裂解缓冲液中(Tris-HCl pH7.550mM/NaCl 150mM/EDTA 5mM/DTT1mM/triton 1％)。在4℃裂解30分钟后离心，在含有细胞裂解物的上清中测量CDase和UPRTase活性(如前述)。
来自3个独立测量计算的酶活性结果示于下表中：
  CDasepmol 5-FC转化的/min/mg蛋白   UPRTasepmol 5-fu转化的/min/mg蛋白
  未感染   不可检测   不可检测
  Ad-空(AdTG15149)   不可检测   不可检测
  Ad-FCU1(AdTG14800)   12000+/-1870   1110+/-190
  Ad-FCU1-8(AdTG15606)   12970+/-1350   不可检测
对于表达Fcu1-8的腺病毒感染的细胞，结果表示UPRTase活性丧失，但CDase活性保留了。
实施例6：构建表达FCU1的MVA(MVATG15637)
在BJ 5183大肠杆菌菌株中通过pCI-neoFCU1(pTG13046)的HindIII-KpnI片段和XhoI线性化的载体pTG14269之间的同源重组重构转移载体Mva-fcu1(pTG15637)。这个转移载体MVA-fcu1(pTG15637)含有置于p11K7.5启动子控制下的FCU1基因表达盒，其两侧为与MVA缺失III相邻的序列。在胚胎鸡细胞中通过MVAN33和质粒pTG15637之间的同源重组产生表达FCU1的MVA颗粒(具有FCU1插入缺失III且在p11K7.5启动子控制下的MVATG15637)。
实施例7：构建表达Fcu1-8的Mva(MVATG15638)
在BJ 5183大肠杆菌菌株中通过通过pCI-neoFCU1-8(pTG15546)的HindIII-KpnI片段和XhoI线性化的载体pTG14269之间的同源重组重构转移载体MVA-FCU1-8(pTG15638)。这个转移载体MVA-FCU1-8(pTG15638)含有含有置于p11K7.5启动子控制下的Fcu1-8基因表达盒，其两侧为与MVA缺失III相邻的序列。在胚胎鸡细胞中通过MVAN33和质粒pTG15638之间的同源重组产生表达Fcu1-8的MVA颗粒(具有Fcu1-8插入缺失III且在p11K7.5启动子控制下的MVATG15638)。
实施例8：表达FCU1(MVATG15637)和FCU1-8(MVATG15638)的MVA的感染
体外结果
确定CDase和UPRTase活性
用空MVA(MVAN33)、表达FCU1的MVA(MVA15637)和表达FCU1-8的MVA(MVA15638)感染人肿瘤细胞系A549(ATCCCCCL-185)。感染程序如下：于50μl PBS-FCS 2％-阳离子1％悬液中的5106细胞在37℃在存在MOI 0.05的腺病毒的情况下温育30分钟。总数5106细胞然后在存在5ml的DMEM-10％FCS下在60mm的烧瓶中温育。37℃24小时后，在PBS中洗细胞，然后重悬于25μl的裂解缓冲液中(Tris-HCl pH7.550mM/NaCl 150mM/EDTA 5mM/DTT1mM/triton 1％)。在4℃裂解30分钟后离心，在含有细胞裂解物的上清中测量CDase和UPRTase活性(按照前述程序)。
来自3个独立测量计算的酶活性结果示于下表中：
  CDasepmol 5-FC转化的/min/mg蛋白   UPRTasepmol 5-FU转化的/min/mg蛋白
  未感染   不可检测   不可检测
  MVA-空(MVAN33)   不可检测   不可检测
  MVA-FCU 1(MVATG15637)   177860+/-6650   43860+/-4230
  MVA-FCU1-8(MVATG15638)   232220+/-15580   不可检测
对于表达FCU1-8的MVA感染的细胞，结果表示UPRTase活性丧失，但CDase活性保留了。
实施例9：体内表达
通过皮内途径在8组15只CD1裸鼠中在J0注射5.106人细胞LoVo(结肠腺癌)。只要肿瘤具有30-50mm3的体积(J+10)，通过肿瘤内施用注射量为5.106PFU的MVA。从J+10，口服施用0.5ml水或0.5ml的0.5％5-FC溶液，一天两次，14天。肿瘤的体积(图1)显出与MVA-FCU1/5-FC组相比，MVA-fCU1-8/5-FC组的肿瘤的大小得到了更好的控制。
Figure IYZ000001344719400011
Figure IYZ000001344719400031

Claims (27)

1.具有CDase活性的多肽，特征在于其通过添加衍生自具有UPRTase活性的多肽的氨基酸序列而衍生自天然CDase，条件是所述多肽没有UPRtase或胸苷激酶活性，其中所述具有CDase活性的多肽由SEQ ID NO：1所示的、起自第1位的Met残基并终止于373位的Val残基的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的多肽，特征在于其具有高于所述天然CDase的CDase活性。
3.编码权利要求1的多肽的核苷酸序列。
4.携带权利要求3的核苷酸序列的重组载体，所述核苷酸序列置于在宿主细胞中表达其所需的元件的控制之下。
5.权利要求4的重组载体，特征在于所述载体选自质粒和病毒载体，当合适时，其组合一或多种改良载体的转染效率和/或稳定性的物质。
6.权利要求5的重组载体，其中所述改良载体的转染效率和/或稳定性的物质选自包含阳离子脂质、阳离子聚合物、溶血磷脂和多肽的组。
7.权利要求5的重组载体，特征在于所述载体是衍生自痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、甲病毒属、泡沫病毒或腺伴随病毒的病毒载体。
8.权利要求7的重组载体，特征在于所述载体衍生自修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)。
9.权利要求8的重组载体，特征在于权利要求3的核苷酸序列被插入到MVA基因组中天然发生缺失的位点中，所述天然发生缺失的位点选自缺失I、II、III、IV、V和VI。
10.权利要求9的重组载体，其中天然发生缺失的位点是缺失III。
11.权利要求4的重组载体，特征在于表达所需的元件包含启动子。
12.权利要求11的重组载体，特征在于启动子是胸苷激酶7.5K基因启动子。
13.权利要求7的重组载体，特征在于所述载体是缺少全部或部分复制必需的、选自E1、E2、E4和L1-L5区域的至少一个区域的腺病毒载体。
14.权利要求13的重组载体，特征在于所述载体是额外缺少全部或部分非必需E3区域的腺病毒载体。
15.权利要求11的重组载体，特征在于所述启动子是巨细胞病毒(CMV)早期启动子。
16.权利要求4-15任一项的重组载体，特征在于其额外包含一或多种感兴趣的基因，所述感兴趣的基因选自编码白细胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)和对血管发生有作用的因子的基因。
17.权利要求16的重组载体，特征在于感兴趣的基因编码选自IL-2和INFγ的多肽。
18.制备病毒颗粒的方法，其中：
(i)将权利要求4-17任一项的重组载体导入能够反式互补所述载体的互补细胞中，以获得转染的互补细胞，
(ii)在适于产生所述病毒颗粒的条件下培养所述转染的互补细胞，及
(iii)从细胞培养物中回收所述病毒颗粒。
19.包含权利要求4-17任一项的重组载体的或者根据权利要求18的方法获得的病毒颗粒。
20.包含权利要求3的核苷酸序列或者权利要求4-17任一项的重组载体的、或者用权利要求19的病毒颗粒感染的宿主细胞。
21.一种组合物，其包含权利要求1或2的多肽、权利要求3的核苷酸序列、权利要求4-17任一项的重组载体、权利要求19的病毒颗粒或者权利要求20的宿主细胞，并组合有一种药学可接受的赋形剂。
22.权利要求21的组合物，特征在于其包含权利要求1或2的多肽和感兴趣的第二种多肽。
23.权利要求22的组合物，特征在于所述感兴趣的第二种多肽是选自IL-2或INFγ的多肽。
24.权利要求21的组合物，特征在于其包含权利要求3的核苷酸序列和感兴趣的第二种核苷酸序列，所述第二种核苷酸序列编码选自IL-2和INFγ的多肽。
25.权利要求1或2的多肽、权利要求3的核苷酸序列、权利要求4-17任一项的重组载体、权利要求19的病毒颗粒或者权利要求20的宿主细胞在制备用于通过基因治疗或通过施用通过重组途径生产的蛋白质治疗人或动物的药物中的治疗性或预防性应用。
26.权利要求25的治疗性应用，其用于制备用于治疗癌症、肿瘤和因非所需细胞增殖而导致的疾病的药物。
27.权利要求25或26的治疗性应用，其中所述药物还包含5-FC。
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