KR101062140B1

KR101062140B1 - 향상된 시토신 디아미네이즈 활성을 갖는 폴리펩티드

Info

Publication number: KR101062140B1
Application number: KR1020067001291A
Authority: KR
Inventors: 필립 엘브스
Original assignee: 트랜스진 에스.에이.
Priority date: 2003-07-21
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2011-09-05
Also published as: US20070264235A1; PT1649023E; PL1649023T3; ATE405654T1; CN1826410A; EP1897938B9; EP1897938A1; WO2005007857A1; US8257692B2; IL173158A; ES2311831T3; EP1897938B1; HK1112024A1; IL173158A0; DK1649023T3; US20100330031A1; CA2532783A1; DE602004015995D1; JP4672659B2; US8226954B2

Abstract

본 발명은 폴리펩티드가 어떠한 UPRTase 또는 티미딘 키나제 활성도 갖지 않도록 하기 위하여, 아미노산 서열의 첨가에 의해 천연의 CDase로부터 유래되는 것을 특징으로 하는, CDase 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

향상된 시토신 디아미네이즈 활성을 갖는 폴리펩티드{POLYPEPTIDE HAVING AN IMPROVED CYTOSINE DEAMINASE ACTIVITY}

본 발명은 CDase 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 이 폴리펩티드가 어떠한 UPRtase 또는 티미딘 키나제 활성도 갖지 않도록 아미노산 서열의 첨가에 의해 천연의 CDase로부터 유래되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 CDase 활성을 갖는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, CDase 활성을 갖는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터, 바이러스 입자 및 숙주세포, 및 이들을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 또한 이들의 치료학적 용도 및 이들을 시행하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 자살 유전자 치료의 범주 내에서, 구체적으로는 증식성 및 감염성 질환들과 관련한 적용에 특히 유용하다.

유전자 치료는 유전적 정보를 숙주세포 또는 생물체에 전달하는 것으로서 정의된다. 인간에게 적용된 첫 번째 방법은 1990년 9월에 미국에서 아데닌 디아미네이즈 (Adenine Deaminase, ADA)를 암호화하는 유전자에 영향을 준 돌연변이로 인해 유전적으로 면역결핍상태인 환자에 처음 시도되었다. 이 첫 번째 실험의 상대적인 성공은 유전적 질환들 (결손 유전자의 기능장애를 교정하기 위한 목적으로) 및 후천적 질환들 (암, AIDS와 같은 감염성 질환들 등) 모두를 포함하는, 다양한 질환들에 대한 이 접근법의 개발을 고무시켰다. 이 방법은 그의 유전자 산물들이 불활성 성분 (전구약물)을 세포독성 성분으로 전환시키고, 그로 인해 세포 사멸을 야기할 수 있는 유전자들을 사용하는 "자살 유전자" 치료를 포함하여, 그 후로 수많은 발전들을 경험하였다. 1992년에, 여러 그룹들은 종양을 치료하고, AIDS의 원인이 되는, HIV 바이러스의 전염을 억제하기 위한 이 신규한 접근법의 타당성을 입증하였다.

이러한 관점에서, 허피스 심플렉스 바이러스 타입 1 바이러스 티미딘 키나제 (herpes simplex type 1 virus thymidine kinase, HSV-1 TK)를 암호화하는 유전자는 상기 자살 유전자들의 원형을 구성한다 (Caruso et al., 1993, Proc . Nati . Acad. Sci . USA 90: 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256: 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med . 3: 1354-1361). 상기 TK 폴리펩티드는 그 자체로는 독성을 나타내지 않지만, 이는 아시클로바 (acyclovir) 또는 간시클로바 (ganciclovir, GCV)와 같은 뉴클레오시드 유사체들의 형질전환을 촉매한다. 상기 변형된 뉴클레오시드들은 신장 과정에 있는 DNA 사슬 내로 도입되고, 그 결과로 세포 분열을 억제한다. 수많은 자살 유전자/전구약물 쌍들이 현재 이용가능하다. 랫트 시토그롬 p450 및 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide)(Human Gene Therapy 5: 969-978), 대장균 뉴클레오시드 인산화효소 (phosphorylase) 및 데옥시 리보뉴클레오시드 (deoxyribcnucleoside)(Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1: 223-238), 대장균 구아닌 포스포라이보실 전이효소 (guanine phosphoribosyl. transferase) 및 6-티오잔틴 (6-thioxanthine)(Mzoz and Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4: 589-595), 및 시토신 디아미나제 (CDase) 및 5-플루오로시토신 (fluorocytosine, 5FC)이 더욱 특별하게 언급될 수 있다.

CDase는 외인성 시토신이 가수분해성 탈아미노 반응 (hydrolytic deamination)에 의해 우라실로 전환되는 피리미딘 대사경로에 관여한다. CDase 활성은 원핵생물들 및 하등 진핵생물들에서는 입증되었지만 (Fund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol . 102: 607-615; Beck et al., 1972, J. Bacteriol . 110: 219-228; De Haan et al., 1972, Antonie van Leeuwenhoek 33: 257-263; Hoeprich et al., 1974, J. Inf . Dis . 130: 112-118; Esders and Lynn, 1985, J. Biol . Chem . 260: 3915-3922), 포유동물에는 존재하지 않는다 (Koechlin et al., 1966, Biochem Pharmacol. 15: 435-446; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22: 137-153). 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) FCY1 및 대장균 codA 유전자들은 각각 상기 두 생물체들의 CDase를 암호화하는 것으로 알려져 있고 이들의 염기서열들 또한 공개되어 있다 (EP 특허 제402 108호; Erbs et al., 1997, Curr . Genet. 31: 1-6; W093/01281).

CDase는 또한 시토신 유사체, 즉 5-플루오로시토신 (5-FC)을 탈아미노시켜 5-플루오로우라실 (5-FU)을 형성하는데, 이는 5-플루오로-UMP (5FUMP)로 전환될 때 높은 세포독성을 나타내는 화합물이다. 상기 효소를 암호화하는 유전자를 불활성 화시키는 돌연변이때문에 혹은 포유동물 세포들에서와 같이 이러한 효소가 자연적으로 결핍되었기 때문에, CDase 활성이 결여된 세포들은 5-FC에 내성을 나타낸다 (Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol . 102: 607-615; Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 2124-2127). 이와 달리, CDase 활성을 암호화하는 서열들이 도입된 포유동물 세포들은 5-FC에 대해 민감해진다 (Huber et al., 1993, Cancer Res. 53: 4619-4626; Mullen et al., 1992, Proc . Nati . Acad . Sci USA 89: 33-37; W093/01281). 또한, 이웃하는, 비형질전환된 세포들 역시 5-FC에 대해 민감해진다 (Huber et al., 1994, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91: 8302-8306). 방관자 효과 (bystander effect)라고 불리는 이러한 현상은 CDase 활성을 발현하는 세포들이 5-FU를 분비하고, 이것이 원형질막을 가로지르는 직접적인 확산에 의해 이웃하는 세포들을 중독시키기 때문이다. 확산에 있어서 5-FU의 이러한 특성은 상기 방관자 효과가 tk를 발현하는 세포들과 접촉하는 것을 요구하는 tk/GCV 기준 시스템과 비교할 때 소극적으로 장점을 나타낸다 (Mesnil et al., 1996, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 93: 1831-1835). 따라서, 유전자 치료, 구체적으로는 항암 치료 범주에서 CDase가 제공하는 모든 장점들은 쉽게 이해될 수 있다.

CDase 활성을 이용하는 방법들의 효율을 향상시키기 위하여, 종래기술 문헌WO-A-96/16183은 CDase 및 UPRTase 활성들을 보유하는 이중-도메인 효소를 암호화하는 융합 단백질을 사용하는 것을 제안하고, 발현 플라스미드에 의해 수행된, 잡종 (hybrid) codA :: upp 또는 FCY1 :: FUR1 유전자의 전달이 5-FC에 대한 형질감염 B16 세포들의 민감화 (sensitization)을 증가시킨다는 것을 생체 외에서 증명한다. W099/54481은 그의 N-말단부가 결실된 UPRTase를 암호화하는 돌연변이된 FUR1 유전자를 사용함으로써 이 발명의 향상을 제공한다.

본 발명은 CDase 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용하는데 있어서 종래 기술들을 개선한 것으로, 상기 폴리펩티드가 어떠한 UPRTase 또는 티미딘 키나제 활성도 갖지 않도록, 아미노산 서열의 부가에 의해 천연의 CDase로부터 유래되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 보다 효율적인 폴리펩티드를 제공하는데, 그로 인해 5-FC에 대한 세포들의 민감성 또는 5-FU의 생산에 의한 방관자 효과를 증가시키고 자살 유전자들을 이용한 유전자 치료의 전망을 향상시킬 수 있다. 상기 돌연변이는 수많은 적용들, 구체적으로는 항암 및 항바이러스 적용들, 및 세포 사멸을 요구하는 모든 적용들에 사용될 수 있다.

"시토신 디아미네이즈 활성" (CDase activity)은 시토신 또는 그의 유사체들 중의 하나의 탈아미노 반응을 포함하는 것으로 이해된다.

"천연의 CDase로부터 유래된"은 CDase 활성을 갖는 상기 폴리펩티드가 상기 천연의 CDase와 70% 이상, 유리하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 매우 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 폭넓게 의미한다. 한층 더욱 바람직하게는, CDase 활성을 갖는 상기 폴리펩티드는 천연의 CDase의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 취지 내에서, 천연의 CDase는 원핵생물 또는 진핵생물 기원의 CDase를 의미한다. 바람직하게는, 상기 CDase는, 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에 FCY1 유전자에 의해 암호화되는, 효모 CDase이다. 서로 다른 기원들의 CDase들을 암호화하는 유전자들의 클로닝 및 서열은 문헌 및 특정 데이터베이스에서 이용가능하다. 예를 들면, FCY1 유전자의 서열은 어브스 등 (Erbs et al., 1997, Curr . Genet. 31: 1-6)에 기술되어 있다.

바람직한 예는 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 158의 Glu 잔기에서 종결되는, 실질적으로 서열번호: 1 서열 인식자로 기재되는 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 천연의 CDase이다. 상기 용어 "실질적으로는"는 70% 이상, 유리하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 매우 바람직하게는 95% 이상인 상기 서열번호: 1 서열과의 상동성 정도를 나타낸다. 한층 더욱 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 158의 Glu 잔기에서 종결되는 서열번호: 1 서열 인식자로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 158의 Glu 잔기에서 종결되는 서열번호: 1 서열 인식자로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 본 발명의 실행을 위해 매우 특정하게 적당하다.

유리한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 상기 천연의 CDase보다 상당히 더 높은 CDase 활성을 나타낸다. 따라서, 하기 실시예들은 어떠한 UPRtase 활성도 갖지 않는 아미노산 서열의 부가가 5-FC에 대한 표적 세포들의 민감화 및/또는 처리된 동물 내에서 유도된 방관자 효과를 증가시킬 수 있음을 증명한다. 상기 민감화가 증가되는 계수는 유리하게는 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 및 매우 바람직하게는 10배 이상이다.

"어떠한 UPRtase 활성도 갖지 않는 폴리펩티드"는 5-FUMP에서 5-FU를 전환시킬 수 없는 폴리펩티드를 포함한다. 5-FUMP에서 5-FU를 전환시키는 아미노산 서열의 능력은 본 출원의 실시예에 기술된 방법을 이용함으로써 평가될 수 있다.

"어떠한 티미딘 키나제 활성도 갖지 않는 폴리펩티드"는 인산화 뉴클레오시드들 (예컨대, dT) 및 뉴클레오시드 유사체들, 예컨대 간시클로버 (9-[2-하이드록시-l-(하이드록시메틸)에톡시 메틸구아노신), 팜시클로버, 부시클로버, 펜시클로버, 발시클로버, 아시클로버 (9-[2-하이드록시 에톡시)메틸]구아노신), 트라이플루오로티미딘, 1-[2-데옥시, 2-플루오로, 베타-D-아라비노 퓨라노실]-5-아이오도우라실, 아라-A (아데노신 아라비노스, 비바라빈), 1-베타-D-아라비노퓨라노실 티미딘, 5-에틸-2'데옥시유리딘, 5-아이오도-5'-아미노-2,5'-다이데옥시유리딘, 아이독스유리딘 (5-아이오도-2'-데옥시유리딘), AZT (3'-아지도-3' 티미딘), ddC (다이데옥시시티딘), AIU (5-아이오도-5' 아미노-2',5-다이데옥시유리딘) 및 아라C (시티딘 아라비노스)를 전화시킬 수 없는 폴리펩티드를 포함한다.

바람직한 실시양태에 따르면, 천연형 CDase에 부가되는 상기 아미노산 서열은 10개에서 1000개 범위, 더욱 바람직하게는 100개에서 400개 범위, 매우 바람직하게는 200개에서 300개 범위의 아미노산 길이이다.

상기 부가가 천연의 CDase 내 임의의 위치에서 일어날 수 있다고 하더라도, N- 또는 C-말단부들이, 구체적으로는 C-말단부가 바람직하다.

유리하게는, 천연의 CDase에 부가되는 상기 아미노산 서열은 UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드로부터 유래된다.

"UPRtase 활성을 갖는 폴리펩티드로부터 유래된"은 상기 아미노산 서열이 UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 70% 이상, 유리하게는 80% 이상, 바람직하게는 90%이상, 매우 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 것을 폭넓게 의미한다.

본 발명의 취지 내에서, UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드는 우라실 또는 그의 유사체들 중의 하나를 모노인산 (monophosphate) 유사체로 전환시킬 수 있는, 구체적으로 5-FU를 5-FUMP로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 말한다. "돌연변이"는 상기 폴리펩티드의 임의의 위치에 하나 이상의 잔기들의 부가, 결실 및/또는 치환인 것으로 이해되어진다.

본 발명에 따른 아미노산 서열이 그로부터 유도될 수 있는 UPRtase 활성을 갖는 폴리펩티드는 임의의 기원, 구체적으로는 원핵생물, 곰팡이 또는 효모 기원일 수 있다. 예시로서, 대장균 유래 (Anderson et al., 1992, Eur . J. Biochem . 204: 51-56), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 유래 (Martinussen and Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176: 6457-6463), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis) 유래 (Kim et al., 1997, Biochem Mot. Biol . mt 41: 1117-1124) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 유래 (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 271-274)의 UPRTases가 본 발명의 범주 내에서 사용될 수 있다. 그러나, 효모 UPRTase, 구체적으로는 그의 서열이 컨 등 (Kern et al., 1990, Gene 88: 149-157)에 기술된 S. 세레비지에 FUR1 유전자에 의해 암호화되는 효모 UPRTase를 사용하는 것이 매우 구체적인 예시로 제공된다. 더욱 특정하게는, 예시로서, 상기 유전자들의 서열들 및 상응하는 UPRTase들의 서열들은 문헌 및 특정한 데이터베이스들 (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medline 등) 내에서 발견될 수 있다. 더욱 특정하게는, fur 1-7, fur 1-8 및 fur 1-9에 의해 암호화되는 돌연변이들이 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드로부터 유래하는 아미노산 서열은 상기 fur 1-8 유전자좌 (Kern et al., 1990, Gene 88: 149-157)에 의해 암호화되는 아미노산 서열이다.

특정하게 유리한 일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 천연의 CDase에 부가된, 상기 아미노산 서열은 천연의 UPRTase의 결실 돌연변이로부터 유래한다. 상기 결실은 원래 UPRTase의 N-말단지역 내에 위치하는 것이 바람직하다. 상기 결실은 (상기 N-말단지역의 모든 잔기들에 영향을 미치는) 전체적이거나 (일차 구조 내에서 지속되거나 지속되지 않는 하나 이상의 잔기들에 영향을 미치는) 부분적일 수 있다. 일반적인 방법으로, 폴리펩티드는 N-말단부, 중심부 및 C-말단부로 구성되는데, 각 부분은 상기 분자의 대략 1/3씩에 해당한다. 예를 들면, 251개 아미노산을 포함하는 S. 세레비지에 UPRTase의 경우에, 그의 N-말단부는 천연형의 첫 번째 위치에 위치한 소위 개시 메티오닌으로부터 시작하는, 처음 83개 잔기들로 구성된다. 대장균 UPRTase의 경우에는, N-말단부가 1 내지 69 위치들을 포함한다.

FURl△105로 명명된, 상기 돌연변이 유전자의 발현 산물은 S. 세레비지에 furl 돌연변이를 보완할 수 있고, 그로 인해 기능적임이 입증됨을 보여주었다.

매우 바람직하게는, 본 발명에 따라 UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기 천연의 UPRTase의 두 번째 ATG 코돈의 상류에서 적어도 N-말단 지역의 전체 또는 일부가 결실됨으로써 적어도 천연의 UPRTase로부터 유래된다. 상술한 지역의 완전한 결실이 바람직하다. 예를 들면, FUR1 유전자에 의해 암호화되는 UPRTase는 위치 +1에 첫 번째 ATG 코돈 (개시 ATG 코돈)을 포함하고 이어서 위치 +36에 두 번째 ATG 코돈을 포함한다. 따라서, 본 발명의 범주에 있어서 잔기들 +1 내지 +35의 결실을 고안하는 것이 가능하고, 그로 인해 상기 천연형의 위치 +36에서 일반적으로 발견되는 메티오닌에서부터 시작하는 폴리펩티드가 제공된다. FURl△105로 명명된, 상기 돌연변이 유전자의 발현 산물은 S. 세레비지에 furl 돌연변이를 보완할 수 있고, 그로 인해 기능적임이 입증됨을 보여주었다.

본 발명에 따라, 천연의 CDase에 부가된, 바람직한 아미노산 서열은 위치 2의 Ser 잔기에서 시작하여 위치 216의 Val 잔기에서 종결되는 서열번호: 2 서열 인식자로서 실질적으로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 상기 용어 "실질적으로는"는 70% 이상, 유리하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 매우 바람직하게는 95% 이상으로 상기 서열에 대한 상동성을 나타낸다. 한층 더욱 바람직하게는, 천연의 CDase에 부가된 상기 아미노산 서열은 위치 2의 Ser 잔기에서 시작하여 위치 216의 Val 잔기에서 종결되는 서열번호: 2 서열 인식자로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 위치 2의 Ser 잔기에서 시작하여 위치 216의 Val 잔기에서 종결되는 서열번호: 2 서열 인식자로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 천연의 CDase에 부가되는 아미노산 서열은 본 발명의 실행에 매우 특정하게 적당하다. 천연의 CDase에 부가된, 이 아미노산 서열은 부가적인 돌연변이들을 포함할 수 있다. 서열번호: 2 서열 인식자의 위치 2에서 세린 잔기의 알라닌으로의 치환이 구체적으로 언급될 수 있다.

본 발명에 따른 CDase 활성을 갖는 바람직한 폴리펩티드는 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 373의 Val 잔기에서 종결되는 실질적으로 서열번호: 1 서열 인식자로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 상기 용어 "실질적으로는"는 70% 이상, 유리하게는 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 매우 바람직하게는 95% 이상으로 상기 서열에 대한 상동성을 나타낸다. 한층 더욱 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 373의 Val 잔기에서 종결되는 서열번호: 1 서열 인식자로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 373의 Val 잔기에서 종결되는 서열번호: 1 서열 인식자로 표시되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 본 발명의 실행에 매우 특정하게 적당하다.

일반적인 방법으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 화학적 합성의 통상적인 방법들에 의해 또는 재조합 DNA 방법들 (예를 들면, Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조)에 의해 생산될 수 있다. 이러한 이유로, 본 발명은 또한 형질전환 세포를 제조하기 위하여 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고, 상기 폴리펩티드의 생산을 가능케하는 조건들 하에서 상기 형질전환 세포를 배양하고, 상기 폴리펩티드를 상기 세포 배양액으로부터 회수하는 제조방법을 포함한다. 상기 생산자 세포는, 고려중인 뉴클레오티드 서열이 그의 게놈 내로 도입되거나 복제할 수 있는 적절한 발현벡터 내로 도입되는 범위까지는, 아무런 제한 없이, 임의의 기원의 세포, 및 세균, 효모 또는 포유동물일 수 있다. 자연적으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 생산자 세포 내에서 이것이 발현될 수 있게 하는 전사 및 번역 시그널들의 조절 하에 놓인다. 발현벡터들 및 조절 시그널들은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 폴리펩티드는 (이들이 용해된 후) 상기 배지 또는 세포들로부터 회수될 수 있고, 통상적인 정제 단계들 (크로마토그래피, 전기영동, 여과, 면역침전 등)을 거칠 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 상기 뉴클레오티드 서열은 cDNA 또는 게놈 서열 또는 이들의 혼합된 형태일 수 있다. 적절하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 숙주세포들 내에서 발현을 증가시키기 위하여 천연의, 이종의 (예를 들면, 토끼 β-글로빈 유전자 등) 또는 합성 기원을 갖는, 하나 이상의 인트론들을 포함할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 사용되는 상기 서열들은 분자생물학의 통상적인 방법들, 예를 들면 특이적 탐침들을 이용한 라이브러리 스크리닝에 의해 또는 적당한 시발체들을 이용한 PCR에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있다. 돌연변이들은 PCR의 부위-지정 돌연변이, 제한효소 및 연결효소를 이용한 절단, 또는 그 밖의 화학적 합성 방법들을 이용한 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 천연의 서열들로부터 제조될 수 있다. 상기 돌연변이들 및 구조물들의 기능에 대한 능력은 5-FC 및/또는 5-FU에 대한 표적 세포들의 효소 활성을 분석하거나 민감성을 측정함으로써 평가될 수 있다.

본 발명은 또한 숙주세포 내에서 이를 발현시키는데 요구되는 요소들의 조절하에 놓인 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 운반하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 상기 재조합 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 기원일 수 있고, 적절하게는, 상기 벡터의 형질감염 효율 및/또는 안정성을 향상시킬 수 있는 하나 이상의 성분들과 결합시킬 수 있다. 이러한 성분들은 당업자에게 이용가능한 문헌에 광범위하게 기록되어 있다 (예를 들면, Feigner et al., 1987, Proc . West. Pharmacol . Soc. 32: 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14: 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5: 647-654 참조). 비-제한적인 예시로서, 상기 성분들은 고분자류, 지질류, 구체적으로는 양이온성 지질류, 리포솜류, 핵 단백질류 또는 중성 지질류일 수 있다. 이들 성분들은 단독으로 혹은 혼합되어 사용될 수 있다. 고안될 수 있는 조합은 양이온성 지질류 (DOGS, DC-CHOL, 스퍼민-콜, 스퍼미딘-콜 등), 라이소인지질류 (예를 들면, 헥사데실포스포콜린) 및 중성 지질류 (DOPE)와 혼합된 재조합 플라스미드 벡터의 조합이다.

바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 사용될 수 있는 상기 양이온성 지질류는 EP 특허 901463 B1에 기재된 양이온성 지질류이고, 보다 바람직하게는 pcTG90이다.

본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 상기 플라스미드류의 선택은 광범위하다. 이들은 클로닝 벡터들 및/또는 발현 벡터들일 수 있다. 일반적인 방식으로, 이들은 당업자에게 공지되어 있고, 이들 중 대다수가 상업적으로 이용가능하지만, 유전적인 조작 기술들을 이용하여 이들을 제작하거나 변형하는 것 또한 가능하다. 언급될 수 있는 예시들로는 pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) 또는 pPoly (Lathe et al., 1987, Gene 57: 193-201)로부터 유래된 플라스미드들이 있다. 바람직하게는, 본 발명의 범위 내에서 사용되는 플라스미드는 생산자 세포 및/또는 숙주 세포 내에서 복제가 개시되는 것을 보장하는 복제 기원을 포함한다 (예를 들면, ColE1 기원은 대장균 내에서 생산되도록 의도된 플라스미드를 위해 선택될 것이고, oriP/EBNA1 시스템은 플라스미드가 포유동물 숙주세포 내에서 자가-복제되는 것을 원하는 경우에 선택될 것이다. [Lupton and Levine, 1985, Mol . Cell. Biol. 5: 2533-2542; Yates et al., Nature 313: 812-815]). 상기 플라스미드는 형질감염된 세포들이 선별되거나 동정되는 것을 가능케하는 선별 유전자 (영양요구 돌연변이의 보완, 항생제에 대한 내성을 암호화하는 유전자 등)를 부가적으로 포함할 수 있다. 자연적으로, 상기 플라스미드는 제공된 세포 내에서 그의 유지 및/또는 안정성을 향상시키기 위하여 부가적인 요소들을 포함할 수 있다(단량체 형태로, 플라스미드의 유지를 촉진하는 cer 서열 [Summers and Sherrat, 1984, Cell 36: 1097-1103], 세포 게놈 내로의 도입을 위한 서열들).

바이러스 벡터와 관련하여, 폭스바이러스 (우두바이러스, 구체적으로는 MVA, 카나리아 폭스바이러스 등), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허피스바이러스, 아이파바이러스 (aiphavirus), 거품형성바이러스 (foamy virus) 또는 아데노바이러스-연계 바이러스로부터 유래된 벡터를 고안하는 것이 가능하다. 복제 가능 또는 복제 결여 벡터들을 사용할 수 있다. 통합되지 않은 벡터를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 관점에서, 아데노바이러스 벡터들 및 MVA는 본 발명의 실행에 매우 특정하게 적합하다.

바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 바이러스 벡터는 변형 우두바이러스 앙카라 (Modified Vaccinia Virus Ankara, MVA)로부터 유래한다. Mva 벡터들 및 이러한 벡터들을 생산하기 위한 방법들은 마이어 등 (Mayr et al., 1975, Infection 3: 6-14) 및 셔터 (Sutter et Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851) 뿐만 아니라 EP 특허 EP83286 및 EP206920에 상세하게 기재되어 있다. 보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 뉴클레오티드 서열은 MVA 벡터의 결실 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ 내에, 한층 더욱 바람직하게는, 결실 Ⅲ 내에 삽입될 수 있다 (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72: 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12: 1032-1040).

레트로바이러스들은 세포들을 감염시키고, 대부분의 경우 세포 내로 통합되어, 분열하는 성질을 갖는데, 이러한 측면에서 암과 관련한 용도에 특히 유용하다. 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스는 일반적으로 LTR 서열들, 이입 (encapsidation) 지역 및 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이들은 레트로바이러스 LTR 또는 하기에 기술되는 바와 같은 내부 프로모터의 조절 하에 놓인다. 재조합 레트로바이러스는 임의의 기원의 레트로바이러스 (쥐과, 영장류, 고양이과, 인간 등) 및 구체적으로는 MOMuLV (Moloney murine leukemia virus), MVS (Murine sarcoma virus) 또는 프렌드 뮤린 레트로바이러스 (Friend murine retrovirus, Fb29)로부터 유래될 수 있다. 재조합 레트로바이러스는 바이러스 입자를 구성하는데 요구되는 바이러스 폴리펩티드 gag, pol 및/또는 env를 in trans로 제공할 수 있는 이입 세포주 내에서 증식한다. 이러한 세포주들은 문헌에 기재되어 있다 (PA317, Psi GRIP GP +Am-12 등). 본 발명에 따른 상기 레트로바이러스 벡터는 변형들, 구체적으로는 LTRs (프로모터 지역의 진핵세포 프로모터로의 대체) 또는 이입 지역 (이종 이입 지역, 예를 들면 VL30 유형으로의 대체) 내에서의 변형들을 포함할 수 있다 (프랑스 출원 제94 08300호 및 제97 05203호 참조)

복제에 필수적이고 상기 벡터가 숙주 생물체 또는 환경 내에서 증식되는 것을 방지하기 위하여 El, E2, E4 및 L1-L5 지역들로부터 선택되는, 적어도 한 지역의 전체 또는 일부가 결실된 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 또한 바람직할 수 있다. El 지역의 결실이 바람직하다. 그러나, 이는 보완 세포주 및/또는 헬퍼 바이러스에 의해 상기 결여된 필수 기능들이 in trans로 보충되는 정도까지는, 구체적으로는 E2, E4 및/또는 L1-L5 지역들의 전부 또는 일부에 영향을 미치는 다른 변형(들)-/결실(들)과 결합될 수 있다. 이러한 관점에서, 당분야의 기술적 수준에서 제2-세대 벡터들을 사용하는 것이 가능하다 (예를 들면, 국제출원 WO-A-94/28152 및 WO-A-97/04119 참조). 예시로서, E1 지역 및 E4 전사 단위의 주요 부분의 결실이 특히 바람직하다. 클로닝 능력을 증가시키기 위한 목적으로, 상기 아데노바이러스 벡터는 비-필수적인 E3 지역의 전부 혹은 일부를 부가적으로 결실시킬 수 있다. 또 다른 대안에 따르면, 이입에 필수적인 서열들, 즉 5' 및 3' ITRs (Inverted Terminal Repeat), 및 이입 지역을 보유하는 최소 아데노바이러스 벡터를 이용하는 것이 가능하다. 다양한 아데노바이러스 벡터들 및 이들을 제조하는 방법들은 공지되어 있다 (예를 들면, Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p109-128; Ed: E.J. Murey, The Human Press mc 참조).

더욱이, 본 발명에 따르는 아데노바이러스 벡터의 기원은 종의 관점 및 혈청형의 관점에 따라 모두 변화될 수 있다. 상기 벡터는 인간 또는 동물 (개, 조류, 소, 쥐, 양, 돼지, 원숭이 등) 기원 또는 적어도 두 개의 서로 다른 기원들의 아데노바이러스 단편들을 포함하는 잡종으로부터 유래될 수 있다. 개 기원의 CAV-1 또는 CAV-2 아데노바이러스, 조류 기원의 DAV 아데노바이러스 또는 소 기원의 Bad 타입 3 아데노바이러스가 보다 구체적으로 언급될 수 있다 (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176; Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol . 1989, 70: 165-172; Jouvenne et al., Gene 1987, 60: 21-28; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). 그러나, 바람직하게는 혈청형 C-아데노바이러스, 구체적으로는 타입 2 또는 5 혈청형 C-아데노바이러스로부터 유래된 인간 기원의 아데노바이러스 벡터를 이용하는 것이 선호될 것이다.

여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "복제-가능 (replication-competent)"은 임의의 전이보완 (transcomplementation)의 부재시에 숙주세포 내에서 복제할 수 있는 바이러스 벡터를 말한다. 본 발명의 범위 내에서, 상기 용어는 또한 암 또는 과다증식성 숙주세포들 내에서 보다 더 혹은 선택적으로 증식하도록 조작되는 복제-선별적 (replication-selective) 또는 조건부로 복제하는 (conditionally replicative) 아데노바이러스 벡터들을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 복제 가능 벡터는 복제 가능 아데노바이러스 벡터이다. 이들 복제 가능 아데노바이러스 벡터들은 당분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 이들 중에서, ONYX-015 바이러스 (Bischoff et al, 1996; Heise et al., 2000; WO 94/18992)에서와 같이, 55 kD P53 억제제를 암호화하는 Elb 지역 내에서 결실된 아데노바이러스 벡터들이 특히 바람직하다. 따라서, 상기 바이러스는 p53-결핍 종양세포들을 선택적으로 감염시키고 사멸하는데 사용될 수 있다. 당분야의 숙련자는 또한 기존 방법들에 따라 아데노바이러스 또는 다른 바이러스들 내에서 p53 억제제 유전자를 돌연변이시키거나 파괴할 수 있다. EIA Rb 결합 지역 내에서 결실된 아데노바이러스 벡터들 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, Delta24 바이러스는 EIA 지역 내에서 24 bp 결실을 포함하는 돌연변이 아데노바이러스이다 (Fueyo et al., 2000). Delta24는 Rb 결합 지역 내에 결실을 갖고 Rb에 결합하지 않는다. 따라서, 상기 돌연변이 바이러스의 복제는 정상세포에서는 Rb에 의해 억제된다. 그러나, 만약 Rb가 불활성화되고 상기 세포가 종양화 된다면, Delta24는 더 이상 억제되지 않는다. 대신에, 상기 돌연변이 바이러스는 효과적으로 복제하고 Rb 결핍 세포들을 효과적으로 용해시킨다.

본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 연결 (ligation) 또는 동종 재조합 (예를 들면, 국제출원 WO-A-96/17070 참조)에 의해 또는 그 밖의 보완 세포주 내에서의 재조합에 의해 생체 외로 대장균 내에서 형성될 수 있다.

발현에 요구되는 요소들은 상기 뉴클레오티드 서열을 RNA로 전사시키고 상기 mRNA를 폴리펩티드로 번역시키는 모든 요소들로 구성된다. 이들 요소들은, 구체적으로는 조절가능 또는 구성적일 수 있는 프로모터를 포함한다. 자연적으로, 상기 프로모터는 선택된 벡터 및 숙주세포에 적합하다. 언급될 수 있는 예시들로는 PGK (인산글리세린산 키나아제, phosphoglycerate kinase), MT (금속티오네인, metallothionein; Mclvor et al., 1987, Mol . Cell Biol. 7: 838-848), α-1 항트립신 (antitrypsin), CFTR, 계면활성제, 면역글로불린, β-액틴 (Tabin et al., 1982, Mol . Cell Biol. 2, 426-436) 및 SRa (Takebe et al., 1988, Mol . Cell Biol. 8, 466-472) 유전자들의 진핵세포 포로모터들, SV40 바이러스 (Simian virus)의 초기 프로모터, RSV (Rous sarcoma virus)의 LTR, HSV-1 TK 프로모터, CMV 바이러스 (Cytomegalovirus)의 초기 프로모터, 우두바이러스의 p7.5K pH5R, pK1L, p28 및 p11 프로모터들, 및 ElA 및 MLP 아데노바이러스 프로모터들이다. 상기 프로모터는 또한 종양 또는 암세포 내에서 발현을 촉진하는 프로모터일 수 있다. 유방암 및 전립선암에서 과발현되는 MUC-1 유전자의 프로모터들 (Chen et al., 1995, J.. Clin . Invest. 96: 2775-2782), 결장암에서 과발현되는 CEA (암종 배아 항원을 나타내는) 유전자 (Schrewe et al., 1990, Mol . Cell. Biol . 10, 2738-2748), 흑색종에서 과발현되는 티로시나제 유전자 (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), 유방암 및 췌장암에서 과발현되는 ERBB-2 유전자 (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1: 170-175) 및 간암에서 과발현되는 α-태아단백 (α-fetoprotein) 유전자 (Kauai et al., 1997, Cancer Res. 57: 461-465)의 프로모터들이 구체적으로 언급될 수 있다. 사이토메갈로바이러스 (CMV) 초기 프로모터가 매우 특정하게 선호된다.

그러나, 우두바이러스로부터 유래된 벡터 (예를 들면, MVA 벡터)가 사용될 때, 상기 티미딘 키나제 7.5K 유전자의 프로모터가 매우 특정하게 선호된다.

필수 요소들은 나아가 본 발명에 따른 상기 뉴클레오티드 서열의 발현 또는 숙주세포 내에서 이의 유지를 향상시키는 부가적인 요소들을 추가로 포함할 수 있다. 인트론 서열들, 분비 시그널 서열들, 핵 국소화 서열들 (nuclear localization sequences), IRES 타입의 번역의 재개시를 위한 내부 위치들, 전사 종결 폴리 A 서열들, 세 부분으로 나뉜 선도서열들 (tripartitie leaders) 및 복제 기원들이 특정하게 언급될 수 있다. 이들 요소들은 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 재조합 벡터는 또한 하나 이상의 목적하는 유전자들을 포함할 수 있는데, 이들 유전자들은 동일한 조절 요소들 (다시스트론 카세트, polycistronic cassette) 또는 개별적인 요소들의 조절하에 놓일 수 있다. 구체적으로 언급될 수 있는 유전자들로는 인터류킨 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10 및 IL-12, 인터페론류, 종양괴사인자 (TNF), 콜로니 자극인자류 (CSF), 구체적으로는 GM-CSF, 및 혈관신생 (angiogenesis)에 작용하는 인자들 (예를 들면, 플라스미노겐 활성인자 억제제를 나타내는 PA1-1)을 암호화하는 유전자들이 있다. 특정한 일 실시양태에서, 본 발명에 따는 상기 재조합 벡터는 IL-2 또는 인터페론 γ (INFγ)를 암호화하는 목적 유전자를 포함한다. 본 발명에 따른 상기 뉴클레오티드 서열을 HSV-1 TK 유전자, 리신 (ricin) 유전자, 콜레라 독소 유전자 (cholera toxin gene) 등과 같은 다른 자살 유전자들과 함께 결합시키는 것을 고안하는 것 또한 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다. 이러한 바이러스 입자는 당분야에 있어서 통상적인 임의의 방법을 이용하여 바이러스 벡터로부터 형성될 수 있다. 상기 바이러스 입자는 상기 벡터들의 결핍에 적합한 보완 세포 내에서 증식된다. 아데노바이러스와 관련하여, 예를 들면, 인간 배아 신장 세포들을 이용하여 확립되고 E1 기능을 효과적으로 보완하는 293 세포주 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36: 59-72), A549-El 세포주 (Imler et al., 1996, 30 Gene Therapy 3: 75-84) 또는 이중 보완을 허용하는 세포주 (Yeh et al., 1996, J. Virol . 70: 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Therapy 6: 1575-1586; Wang et al., 1995 Gene Therapy 2: 775-783; 국제출원 WO 97/04119)를 사용할 수 있을 것이다. 적어도 부분적으로는 결핍 기능들을 보완하기 위하여 헬퍼 바이러스를 사용하는 것 또한 가능하다. 보완 세포는 재조합 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 제조하기 위하여 바이러스 캡시드 내로 바이러스 게놈을 이입하는데 필요한 초기 및/또는 후기 인자들을 in trans로 공급할 수 있는 세포로서 이해된다. 상기 세포는 단독으로 상기 벡터의 모든 결핍 기능들을 보완할 수 없을 수도 있는데, 이러한 경우에는, 부가적인 기능들을 제공하는 벡터/헬퍼 바이러스와 함께 형질감염/형질도입될 수 있다.

본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는 바이러스 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(i) 본 발명에 따르는 재조합 벡터를 상기 벡터를 보완할 수 있는 보완 세포 내로 in trans로 도입하여 형질감염된 보완 세포를 얻는 단계,

(ii) 상기 형질감염된 보완 세포를 상기 바이러스 입자가 생산될 수 있는 적절한 조건들 하에서 배양하는 단계, 및

(iii) 상기 바이러스 입자를 세포 배양액으로부터 회수하는 단계.

물론 상기 바이러스 입자는 배양 상등액으로부터 회수될 수 있지만, 상기 세포들로부터도 회수될 수 있다. 통상적으로 사용되는 방법들 중의 하나는 용해 상등액 내 비리온들 (virions)을 회수하기 위하여 상기 세포들을 연속적인 냉동/해동 순환들에 의해 용해시키는 것이다. 상기 비리온들은 그 후에 당분야의 방법들 (크로마토그래피 방법, 구체적으로는 염화칼슘 농도구배를 이용한, 초원심분리 방법 등)을 이용하여 증폭되고 정제될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 또는 재조합 벡터를 포함하거나, 또는 본 발명에 따른 바이러스 입자로 감염된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 숙주세포는 상기에 정의된 바와 같이, 재조합 벡터로 형질감염될 수 있거나 바이러스 입자로 감염될 수 있는 임의의 세포로 구성된다. 포유동물 세포, 구체적으로는 인간 세포가 매우 특정하게 적당하다. 상기 세포는 게놈 내로 통합되거나 통합되지 않은 (에피솜) 형태로 상기 벡터를 포함할 수 있다. 상기 세포는 임의의 기원의 원발성 또는 종양세포, 구체적으로는 조혈세포 (hematopoietic cell)(전능성 줄기세포, 백혈구, 림프구, 단핵구 또는 대식세포 등), 근육세포 (위성세포, 근육세포, 근육모세포, 평활근세포 등), 심장세포, 폐세포, 기관세포, 간세포, 상피세포 또는 섬유모세포일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드, 뉴클레오티드 서열, 재조합 벡터, 바이러스 입자 또는 숙주세포를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드와 앞서 언급된 목적하는 유전자들 중의 하나에 의해 암호화되는 목적하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 목적하는 폴리펩티드들 중에서, 인터류킨류 IL-2, IL-4, IL-7, IL10 및 IL-12, 인터페론류, 종양괴사인자 (TNF), 콜로니 자극 인자류 (CSF), 구체적으로는 GM-CSF, 및 혈관신생에 작용하는 인자들 (예를 들면, 플라스미노겐 활성인자 억제제를 나타내는 PA1-1)이 구체적으로 언급될 수 있다. IL-2 또는 INFγ가 매우 특정하게 고안된다.

상기 조성물은 또한 상기 숙주세포 내에서 상기한 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 뉴클레오티드 서열들을 근거로 할 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열들은 하나의 동일한 발현벡터에 의해 혹은 두 개의 개별적인 벡터들에 의해 수행될 수 있다. 물론 상기 조성물은 상기 뉴클레오티드 서열(들)을 발현하는 바이러스 벡터(들)로부터 형성되는 바이러스 입자들을 포함할 수 있다.

본 발명은 부가적으로 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 및 IL-2 및 INFγ로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는 목적하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 유전자 치료에 의한 질환들의 예방적 또는 치료적 처리에 보다 특이적으로 의도되고, 증식성 질환들 (암, 종양, 재협착 등) 및 구체적으로는 바이러스 기원의 감염성 기원의 질환들 (B형 또는 C형 간염 바이러스, HIV, 허피스바이러스, 레트로바이러스 등)을 더욱 특이적으로 목적한다.

본 발명에 따른 조성물은 국소적으로, 비경구적으로 또는 소화관을 통해 이것을 투여하는 관점에 따라 통상적으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 치료적 또는 예방적 제제의 치료학적 유효량이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된다. 수많은 투여 경로들을 고안할 수 있다. 언급될 수 있는 예들로는 위내 (intragastric), 피하, 심장내 (intracardiac), 근육내, 정맥내 (intravenous), 복막내 (intraperitoneal), 종양내 (intratumor), 비강내 (intranasal), 폐내 (intrapulmonary) 및 기관내 (intratracheal) 경로들이다. 이들 마지막 세 개의 실시양태들의 경우에는, 에어로졸에 의해 또는 점막주입에 의해 수행되는 것이 투여에 유용하다. 상기 투여는 단일 용량으로서 또는 특정한 시간 간격 후에 한번 이상의 경우로 반복되는 용량으로서 수행될 수 있다. 투여의 적절한 경로 및 투여량은 매우 다양한 변수들에 의해 변경되는데, 예를 들면, 개인, 치료하고자 하는 질환 또는 전달되어지는 목적 유전자(들)에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스 입자들을 기본으로 하는 제제들은 10⁴ 내지 10¹⁴ pfu (플라크-형성 단위, plaque-forming units) 범위, 유리하게는 10⁵ 내지 10¹³ pfu 범위, 바람직하게는 10⁶ 내지 10¹² pfu 범위, 더욱 바람직하게는 아데노바이러스 입자들이 사용된 경우에는 10⁹ 내지 10¹⁰ pfu 범위, MVA 입자들이 사용된 경우에는 10⁶ 내지 10⁷ pfu 범위의 투여량의 형태로 제제화될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터가 고려되어지는 한, 0.01 내지 100 ㎎의 DNA, 바람직하게는 0.05 내지 10 ㎎의 DNA, 매우 특정하게 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎎의 DNA를 포함하는 투여량을 고안할 수 있다. 폴리펩티드들을 근거로 하는 조성물은 바람직하게는 0.05 내지 10 g, 매우 특정하게 바람직하게는 0.05 내지 5 g의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 자연적으로, 상기 투여량은 임상의에 의해 조절될 수 있다.

상기 제형은 또한 약제학적 관점에서 허용가능한 용해제, 안정화제 및 보존제들 뿐만 아니라 희석제, 보강제 또는 담체를 포함할 수 있다. 주사가능 투여의 경우에, 제제는 수용성, 비-수용성 또는 이온성 용액인 것이 바람직하다. 이는 적절한 담체를 이용하여 사용 직전에 재구성될 수 있는, 액체 또는 건조물 (분말, 동결건조제 등)의 형태로 단일 용량 또는 다중 용량으로서 나타낼 수 있다. 상기 제형은 또한 적절한 양의 전구약물들을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료에 의해 또는 재조합 경로에 의해 생산된 단백질의 투여에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 목적으로 사용되는 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 폴리펩티드, 재조합 벡터, 바이러스 입자, 숙주세포의 치료적 또는 예방적 용도에 관한 것이다. 첫 번째 가능성에 따르면, 상기 약제는 생체 내로 직접 투여 (예를 들면, 정맥내 주사에 의해 접근가능 종양내로, 에어로졸을 이용하여 폐내로, 적절한 카테터를 이용하여 혈관내로)될 수 있다. 환자로부터 세포 (골수 줄기세포들, 말초혈액 백혈구들, 근육세포들 등)를 제거하고, 당분야의 통상적인 방법들에 따라 생체 외에서 이들을 형질감염시키거나 감염시키고, 그 후에 이들을 환자에게 다시 투여하는, 생체 밖 (ex vivo) 접근법이 또한 적용될 수 있다. 바람직한 용도는 암, 종양 및 원치않는 세포 증식으로 야기되는 질환들을 치료 또는 예방하는 것이다. 언급될 수 있는 착상가능한 적용들은 유방, 자궁 (구체적으로, 파필로마 바이러스에 의해 유도된), 전립샘, 폐, 방광, 간, 결장, 췌장, 위, 식도, 후두, 중추신경계 (예컨대, 아교모세포종) 및 혈액 (림프종, 백혈병 등)의 암이다. 또한, 예를 들면 혈관 벽 (재협착증)의 평활근세포들의 증식을 억제하거나 지연시키기 위해, 심장혈관계 질환들과 관련하여 사용될 수 있다. 마지막으로, 감염성 질환들의 경우에, AIDS에 적용되는 약제를 고안할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 재조합 벡터, 바이러스 입자 또는 숙주세포를 그러한 치료를 필요로 하는 숙주 생물체 또는 세포에 투여하는 것을 특징으로 하는, 유전자 치료에 의해 질환을 치료하는 방법으로 확장된다.

유리한 실시양태에 따르면, 치료학적 용도 또는 치료방법은 또한 약제학적으로 허용가능한 양의 전구약물, 유리하게는 시토신 유사체, 구체적으로는 5-FC를 숙주 생물체 또는 세포에 투여하는 추가적인 단계를 포함한다. 예시로서, 50 내지 500 ㎎/㎏/일, 바람직하게는 200 ㎎/㎏/일의 투여량으로 사용하는 것이 선호된다. 본 발명의 범위 내에서, 상기 전구약물은 본 발명에 따른 치료학적 제제의 투여와 동시에 또는 이에 연속하는, 먼저 발생한 투여와 함께, 표준 진료 (예컨대, 경구로 [per os], 계통적으로)에 따라 투여된다. 경구 경로가 바람직하다. 전구약물의 단일 용량 또는 숙주 생물체 또는 세포 내에서 독성 대사산물이 생산될 수 있게 할 만큼 충분히 긴 시간 동안 반복되는 용량이 투여될 수 있다.

더욱이, 본 발명에 따른 상기 조성물 또는 방법은 5-FU의 세포독성 효과를 강화시키는 하나 이상의 성분들과 혼합될 수 있다. 피리미딘의 드 보노 (de novo) 생합성에 대한 경로의 효소들을 차단하는 전구약물들 (예를 들면, 하기에 언급된 바와 같은), 5-FU의 대사산물 (5-FdUMP)의 존재시에 티미딜산 합성효소 (thymidylate synthase)의 억제를 증가시켜 복제에 필요한 dTMP의 풀 (pool)을 감소시키는 류코보린 (Leucovorin, Waxman et al., 1982, Eur . J. Cancer Clin . Oncol. 18: 685-692)과 같은 약물들, 및 디하이드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase)를 억제하고 PRPP (phosphoribosylpyrophosphate) 풀을 증가시켜 5-FU의 세포성 RNA로의 도입을 증가시키는 메토트랙세이트 (methotrexate, Cadman et al., 1979, Science 250: 1135-1137)와 같은 약물들이 구체적인 언급이 될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 조성물 또는 방법은 항암 치료에 효과적인 하나 이상의 성분들과 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물들과 연계하여 혹은 혼합하여 사용될 수 있는 항암치료에 효과적인 약제학적 성분들 중에서, 예컨대 마이토마이신 C, 사이클로포스파미드, 부설판 (busulfan), 이포스파미드 (ifosfamide), 아이소스파미드 (isosfamide), 멜파란 (melphalan), 헥사메틸멜라민 (hexamethylmelamine), 티오테파 (thiotepa), 클로람부실 (chlorambucil), 또는 다카르바진 (dacarbazine)과 같은 알킬화제 (alkylating agents); 예컨대 젬사이타바인 (gemcitabine), 카페사이타바인 (capecitabine), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 사이타라바인 (cytarabine), 2-플루오로데옥시 시티딘 (2-fluorodeoxy cytidine), 메토트랙세이드, 아이다트랙세이트 (idatrexate), 토무덱스 (tomudex) 또는 트라이메트랙세이트 (trimetrexate)와 같은 항대사제들 (antimetabolites); 예컨대 독소루비신 (doxcrubicin), 에피루비신 (epirubicin), 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide) 또는 마이토잔트론 (mitoxantrone)과 같은 토포아이소머라제 Ⅱ 억제제들; 예컨대 이리노테칸 (CPT-11), 7-에틸-10-하이드록실-캄포테신 (SN38) 또는 토포데칸 (topotecan)과 같은 토포아이소머라제 Ⅰ 억제제들; 예컨대 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine) 또는 비노렐빈 (vinorelbine)과 같은 항유사분열제 (antimitotic drugs); 및 예컨대 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 스피로플라티늄 (spiroplatinum) 또는 카보플라티늄 (carboplatinum)과 같은 백금 유사체들이 언급될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 조성물들 또는 방법들은 또한 방사선 치료와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 서열들 또는 재조합 벡터들을 포유동물 세포들에서 양성 선별 마커들로 사용하는 것에 관한 것이다. 유리하게는, 상기 세포들은 형질감염되고, 세포 혼합물은 그 후에 PALA (N(phosphoncacetyl)-Laspartate; Moore et al., 1982, Biochem . Pharmacol . 31: 3317-3321), A77 1726 (레플루노마이드 [Leflunomide]의 활성 대사산물; Davis et al., 1996, Biochem . 35: 1270-1273) 및 브레퀴나르 (Brequinar)(Chen et al., 1992, Cancer Res. 52: 3251-3257)와 같은 피리미딘류의 드 노보 생합성을 위한 경로의 억제제들의 존재 하에서 배양된다. 이러한 억제제들의 존재는 RNA 및 DNA를 합성하는데 요구되는, UMP의 드 노보 합성을 차단하고, 그로 인해 세포사멸을 유도한다. 이러한 세포독성 효과는 우라실의 존재 하에서 UPRTase 활성을 암호화하는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 발현시키거나 시토신의 존재 하에서 상기 후자 서열을 CDase 활성을 암호화하는 서열과 함께 동시에 발현시킴으로써 (융합된 형태가 적당함) 축적될 수 있다. 그 결과, 오직 형질감염된 세포들 (UPRTase/CDase 서열들이 도입된 세포들)만이 피리미딘 합성 경로의 억제제들의 존재 하에서 성장할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 용도는 형질감염된 세포가 세포 혼합물 내에서 효과적으로 동정되고/되거나 그로부터 분리되는 것을 가능케 한다.

본 발명은 또한 음성 선별 마커로서 본 발명에 따른 상기 서열들 또는 재조합 벡터들의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 서열들 또는 재조합 벡터들은 (예컨대, 유전자도입 동물을 제조하기 위한 방법들에서) 유전자들이 차단되거나 변형되는 핵 전달 (nuclear transfer) 후에 획득된 배아 줄기세포들 또는 세포들을 선별하는데 사용될 수 있다 (에를 들면, Capecchi, 1989, Science 244: 1288-1292; Reid et al., 1990, Proc . Nati . Acad . Sci . USA 87: 4299-4303 참조). 네오마이신에 대한 내성 유전자와 함께, 그러한 용도는 예를 들면, 동종 재조합 과정을 거치거나 젠타마이신 및 이에 상응하는 플루오르화 피리미딘들 (CDase 활성을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 사용된 경우에는 5-FC)의 존재 하에서 단독으로 성장할 수 있는 세포들을 선별할 수 있게 만든다. 비-표적화된 재조합 과정을 거치는 상기 세포들은 젠타마이신의 존재 하에서 성장할 수 있지만 플루오르화 피리미딘들의 존재 하에서는 성장할 수 없다. 포유동물 세포들에서와 같이, 식물들은 어떠한 내인성 CDase 활성도 가지고 있지 않기 때문에, 음성 선별 마커로서의 또 다른 잠재적인 용도가 식물 분야에서 발견된다. 이들은 외인성 CDase를 발현시킬 수 있는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열을 형질감염시킴으로써 5-FC에 민감화될 수 있다 (예를 들면, Perera et al. 1993, Plant. Mol . Biol. 23: 797-799 참조).

본 발명에 따른 상기 서열들 또는 재조합 벡터들은 또한 세균 또는 효모의 음성 선별 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 특정한 실시양태에서, 천연의 CDase 유전자가 결실된 효모 또는 세균을 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 세균들 중에서, EP 특허 EP0792369BB1에 개시된 세균들이 특히 바람직하다. 예를 들면, 본 발명에 따른 서열은 본 발명에 따른 서열을 포함하는 플라스미드 내에서 동종 재조합에 의해 서열들을 클로닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 실험들에서, 본 발명에 따른 상기 서열은 클로닝되는 상기 서열이 삽입되는 부위에 위치한다. 따라서, 동종 재조합 후에, 목적하는 플라스미드를 포함하는 세포들은 5-FC의 존재 하에서 성장할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 벡터로 처리된 CD1 누드 마우스 내에서 LOVO 종양세포들의 성장을 나타낸 것이다.

실시예 1: Fcu1 -8의 제작

FCU1-8은 플라스미드 pCI-neoFCU1-8 (pTG15546)을 얻기 위하여 위치 183의 Arg가 올리고 5'-gtattcttattactgatgatgg-3' (A549en T를 변형시키기 위하여)을 이용해 Ser로 치환된 pCI-neoFCU1 (pTG13046)로부터, FCU1의 지정 돌연변이에 의해 제작되었다.

실시예 2: 포유동물 세포들에서 FCY1 , FCU1 및 Fcul -8의 발현 및 CDase 및 UPRTase 활성의 측정

플라스미드들 pCIneo (Promega), pCI-neoFCYl (pTG15916), pCI-neoFCUl (pTG13046) 및 pCI-neoFCUl-8 (pTG15546)로 일시적으로 형질감염된 포유동물 세포 COS7의 스톡을 CDase 및 UPRTase 활성에 대해 조사하였다

실험방법은 다음과 같다: 5×10⁵ COS7 세포들을 5 ㎖의 DMEM/10% FCS 배지를 포함하는 37℃, 60 ㎜ 플라스크에 접종하였다. 24시간 경과 후, 상기 세포들을 5 ㎍의 플라스미드 존재 또는 부재 하에서 20 ㎕의 리포펙타민 (Gibco BRL)으로 처리하였다. 37℃의 2 ㎖의 DMEM 배지 내에서 20시간 경과 후에, 상기 세포들을 5 ㎖의 DMEM/10% FCS 존재 하에서 배양하였다. 48시간 경과 후, 37℃에서 상기 세포들을 PBS로 세척하였고, 그 후에 25 ㎕의 용해 완충용액 (Tris-HC1, pH 7.5, 50 mM/NaCl, 150 mM/EDTA, 5 mM/DTT, 1 mM/트라이톤 1%)에 현탁하였다. 4℃에서 30분간 용해시키고 이어서 원심분리한 후에, CDase 및 UPRTase 활성을 세포 용해물을 포함하는 상등액 내에서 측정하였다.

CDase 활성 측정: 4 ㎕의 세포 용해물을 2 ㎕의 반응성 CDase 완충용액 (트 리스-HC1, pH 7.5, 100 mM/[H3]5-FC, 3 mM with 0.25 pCi/㎕)의 존재 하에서, 37℃에서 20분간 배양하였다.

UPRTase 활성 측정: 4 ㎕의 세포 용해물을 2 ㎕의 반응성 UPRTase 완충용액 (트리스-HC1, pH 7.5, 100 mM/MgCl₂, 10 mM/5-PRPP, 10 mM/[C14]5-FU, 3 mM at 0.02 pCi/㎕)의 존재 하에서, 37℃에서 20분간 배양하였다.

효소 반응들은 100℃에서 1분간 정지되었다. 1 ㎕의 분액들을 TLC 폴리에틸렌이민-셀룰로오스 플레이트 (polyethylenimine-cellulose plates, Merck) 위에 점적하였다. 5-FU는 용매로서 물/뷰탄올 (14%/86%)의 혼합물을 사용함으로써 5-FC로부터 분리되고, 5-FUMP 및 5-FU의 분리는 용매로 물을 사용하여 수행된다. 이동 후, TLC 플레이트를 판독기 (PosphorImager, 445SI; Molecular Dynamics) 내에서 스캐닝하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법에 의해 측정되었다.

세 번의 개별적인 측정들로부터 계산된, 효소 활성의 결과들을 하기 표에 나타내었다:

FCU1 유전자와 비교하여, Fcul-8 돌연변이체는 UPRTase 활성은 상실되었지만, 천연의 FCY1 유전자의 CDase 활성보다 10배 더 높은 CDase 활성의 보존을 나타내었다. 유전자 FCU1 내 Ser에서의 Arg183 변화는 UPRTase 활성에 있어서의 손실을 야기한다.

실시예 3: FCU1 을 발현하는 아데노바이러스의 제작 ( AdTG14800 )

FCU1 유전자를 포함하는 pCI-neoFCU1 (pTG13046)의 XhoI-MluI 절편을 분리하고 동일한 효소들에 의해 절단된 전이벡터 pTG13387 내로 도입하여 전이벡터 pTG14799를 제조한다. 아데노바이러스 벡터 AD-FCU1 (pTG14800)은 BJ 5183 대장균 내에서 pTG14799의 절편 PacI-BstEⅡ 및 ClaI에 의해 선형화된 벡터 pTG6624간의 동종 재조합에 의해 재구성된다. 최종 구조물 AD-FCU1은 E1 및 E3 (뉴클레오티드 459 내지 3510 및 28249 내지 30758)이 결실된 Ad5 게놈을 포함하고, E1 대신에, FCU1 유전자를 포함하는 발현 카세트는 CMV 프로모터 및 β-글로빈/IgG 및 이어서 bGH의 폴리 A 서열의 조절 하에 놓이게 된다. FCUl을 발현하는 상기 아데노바이러스 입자들 (AdTG14800)은 보완 세포주 (예를 들면, PERC6 세포주) 내에서의 형질감염에 의해 형성된다.

실시예 4: Fcu1 -8을 발현하는 아데노바이러스의 제작 ( AdTG15606 )

Fcul-8 유전자를 포함하는 pCI-neoFCU1-8 (pTG15546)의 XhoI-MluI 절편을 분리하고 동일한 효소들로 절단된 전이벡터 pTG13387 내로 도입하여, 전이벡터 pTG15547을 제조한다. 상기 아데노바이러스 벡터 AD-FCU1-8 (pTG15606)은 BJ 5183 대장균 균주 내에서 pTG15547의 절편 Pacl-BstEⅡ 및 ClaI에 의해 선형화된 벡터 pTG6624간의 동종 재조합에 의해 재구성된다. 최종 구조물 AD-FCUl-8은 El (NT 459 내지 3510) 및 E3 (NT 28249 내지 30758) 지역들이 제거된 Ad5 게놈을 포함하고, El 대신에, Fcul-8 유전자를 포함하는 발현 카세트는 CMV 초기 프로모터 잡종 β-글로빈/IgG 및 MVC 및 이어서 bGH의 폴리 A 서열들의 조절 하에 놓이게 된다. Fcul-8을 발현하는 상기 아데노바이러스 입자들 (AdTG15606)은 예를 들면 PERC6과 같이 E1 기능을 보완하는 세포주 내에서 형질감염에 의해 형성된다.

실시예 5: FCUl ( AdTG14800 ) 및 Fcu1 -8 ( AdTG15606 )을 발현하는 아데노바이러스에 의한 감염:

생체 외 결과들

CDase 및 UPRTase 활성의 결정

인간 종양 세포주 A549 (ATCC Ccl-185)를 공 (empty) 아데노바이러스 (AdTG15149), FCUl을 발현하는 아데노바이러스 (AdTG14800) 및 Fcul-8을 발현하는 아데노바이러스 (AdTG15606)로 감염시켰다. 감염 프로토콜은 다음과 같다: 50 ㎕의 PBS-2% FCS-양이온 1%의 현탁액 내 5×10⁶ 세포들을 MOI 5의 아데노바이러스 존재 하에서 37℃에서 30분간 배양하였다. 그 후에 5×10⁶ 세포들 전체를 5 ㎖의 DMEM-10% FCS 존재 하에서 60 ㎜ 플라스크 내에 접종하였다. 37℃에서 24시간 경 과 후, 상기 세포들을 PBS로 세척하고 25 ㎕의 용해 완충용액 (Tris-HC1, pH 7.5, 50 mM/NaC1, 150 mM/EDTA, 5 mM/DTT, 1 mM/트라이톤 1%)에 재현탁하였다. 4℃에서 30분간 용해시키고 이어서 원심분리한 후, CDase 및 UPRTase 활성들을 세포 용해물을 포함하는 상등액 내에서 (상기에 기술된 프로토콜에 따라) 측정하였다.

Fcul-8을 발현하는 아데노바이러스에 의해 감염된 세포들에 대해서, 상기 결과들은 UPRTase 활성은 상실된 반면 CDase 활성은 보존되었음을 나타낸다.

실시예 6: FCUl 을 발현하는 MVA 의 제작 ( MVATG15637 )

전이벡터 Mva-fcul (pTG15637)은 BJ 5183 대장균 균주 내에서 pCI-neoFCU1 (pTG13046)의 HindⅢ-KpnI 절편 및 XhoI에 의해 선형화된 벡터 pTG14269간의 동종 재조합에 의해 재구성된다. 이 전이벡터 MVA-fcul (pTG15637)은 p11K7.5 프로모터의 조절 하에 놓이고 MVA의 결실 Ⅲ 주변의 서열들에 의해 구성된 FCU1 유전자의 발현 카세트를 포함한다. FCUl을 발현하는 MVA 입자들 (결실 Ⅲ 내 도입되고 p11K7.5 프로모터의 조절 하에 놓인 MVATG15637)은 계배아세포들 내에서 MVAN33 및 플라스미드 pTG15637간의 동종 재조합에 의해 형성된다.

실시예 7: Fcul -8을 발현하는 MVA 의 제작 ( MVATG15638 )

전이벡터 MVA-FCUl-8 (pTG15638)은 BJ 5183 대장균 균주 내에서 pCI neoFCUl-8 (pTG15546)의 HindⅢ-KpnI 절편과 XhoI에 의해 선형화된 벡터 pTG14269간의 동종 재조합에 의해 재구성된다. 이 전이벡터 MVA-FCU1-8 (pTG15638)은 p11K7.5 프로모터의 조절하에 놓이고 MVA의 결실 Ⅲ 주변의 서열들에 의해 구성된 Fcul-8 유전자의 발현 카세트를 포함한다. Fcul-8을 발현하는 MVA 입자들 (결실 Ⅲ 내에 삽입되고 p11K7.5 프로모터의 조절 하에 놓이는 Fcul-8을 갖는 MVATG15638)은 계배아세포들 내에서 MVAN33과 플라스미드 pTG15638간의 동종 재조합에 의해 형성된다.

실시예 8: FCUl ( MVATG15637 ) 및 FCU1 -8 ( MVATG15638 )을 발현하는 MVA 에 의한 감염:

생체 외 결과들

CDase 및 UPRTase 활성들의 결정

인간 종양세포주 A549 (ATCC CCCL-185)를 공 MVA (MVAN33), FCU1을 발현하는 MVA (MVA15637) 및 FCU1-8을 발현하는 MVA (MVA15638)로 감염시켰다. 상기 감염 프로토콜은 다음과 같다: 50 ㎕의 PBS-FCS 2%-양이온 1% 현탁액 내 5×10⁶ 세포들을 MOI 0.05의 아데노바이러스 존재 하에서 37℃에서 30분간 배양하였다. 5×10⁶ 세포들 전체를 그 후에 5 ㎖의 DMEM-10% FCS를 포함하는 60 ㎜ 플라스크 내에서 배양하였다. 37℃에서 24시간 후에, 상기 세포들을 PBS로 세척하고 25 ㎕의 용해 완충용액 (Tris-HC1, pH 7.5, 50 mM/NaCl, 150 mM/EDTA, 5 mM/DTT, 1 mM/트라이톤 1%)에 재현탁하였다. 4℃에서 30분간 용해시키고 이어서 원심분리한 후, CDase 및 UPRTase 활성을 세포 용해물을 포함하는 상등액 내에서 (상기에 기술된 방법에 따라) 측정하였다.

FCUl-8을 발현하는 MVA에 의해 감염된 세포들에 대해서, 상기 결과들은 UPRTase 활성은 상실된 반면 CDase 활성은 보존적임을 나타낸다.

실시예 9: 생체 내 실험

5.106 인간 세포 LoVo (결장의 선암종)를 J0 상태에서 15마리의 CD1 누드 마우스의 8 그룹들에 피내 경로에 의해 주사하였다. 종양의 부피가 30 내지 50 ㎣에 도달하자마자 (J+10), MVA를 5.106 PFU의 양으로 종양내 투여에 의해 주사하였다. J+10으로부터, 0.5 ㎖의 물 또는 0.5 ㎖의 0.5% 5-FC 용액을 하루에 2회, 14일간 경구로 제공하였다. 종양의 부피 (도 1)는 그룹 MVA-FCU1/5-FC에 비하여 그룹 MVA-fCU1-8/5-FC에서 종양의 크기가 훨씬 더 잘 조절됨을 강조한다.

<110> TRANSGENE SA <120> Polypeptide having an improved Cytosine deaminase activity <130> D21447 <140> PCT/IB2004/002505 <141> 2004-06-29 <150> US 60/508 274 <151> 2003-10-06 <150> EP 03/360 087 <151> 2003-07-21 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 373 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence :Fusion protein having a CDase activity <300> <400> 1 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Ala Ser 145 150 155 160 Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn Gln Leu Leu 165 170 175 Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Ser Asn Lys Asn Thr Thr Arg Pro Asp Phe 180 185 190 Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu Glu Gly Leu 195 200 205 Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp Thr Asn Glu 210 215 220 Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly Val Ser Ile 225 230 235 240 Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp Cys Cys Arg 245 250 255 Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu Glu Thr Ala 260 265 270 Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Arg 275 280 285 Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ala Ile 290 295 300 Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro Glu Arg Ile 305 310 315 320 Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu Lys Tyr His 325 330 335 Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu Asp Arg Gly 340 345 350 Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp Phe Gly Asp 355 360 365 Arg Tyr Tyr Cys Val 370 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Ser Ser Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn 1 5 10 15 Gln Leu Leu Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Ser Asn Lys Asn Thr Thr Arg 20 25 30 Pro Asp Phe Ile Phe Tyr Ser Asp Arg Ile Ile Arg Leu Leu Val Glu 35 40 45 Glu Gly Leu Asn His Leu Pro Val Gln Lys Gln Ile Val Glu Thr Asp 50 55 60 Thr Asn Glu Asn Phe Glu Gly Val Ser Phe Met Gly Lys Ile Cys Gly 65 70 75 80 Val Ser Ile Val Arg Ala Gly Glu Ser Met Glu Gln Gly Leu Arg Asp 85 90 95 Cys Cys Arg Ser Val Arg Ile Gly Lys Ile Leu Ile Gln Arg Asp Glu 100 105 110 Glu Thr Ala Leu Pro Lys Leu Phe Tyr Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile 115 120 125 Ser Glu Arg Tyr Val Phe Leu Leu Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly 130 135 140 Ser Ala Ile Met Ala Thr Glu Val Leu Ile Lys Arg Gly Val Lys Pro 145 150 155 160 Glu Arg Ile Tyr Phe Leu Asn Leu Ile Cys Ser Lys Glu Gly Ile Glu 165 170 175 Lys Tyr His Ala Ala Phe Pro Glu Val Arg Ile Val Thr Gly Ala Leu 180 185 190 Asp Arg Gly Leu Asp Glu Asn Lys Tyr Leu Val Pro Gly Leu Gly Asp 195 200 205 Phe Gly Asp Arg Tyr Tyr Cys Val 210 215

Claims

폴리펩티드가 어떠한 UPRTase 또는 티미딘 키나제 활성도 갖지 않도록 하기 위하여, 효모 UPRTase로부터 유래하는 아미노산 서열이 천연의 CDase의 C-말단에 부가된, 천연의 CDase로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, CDase 활성을 갖는 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 효모 UPRTase는 사카로마이세스 세레비지에 FUR1 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 2항에 있어서, 천연의 CDase에 부가된, 상기 아미노산 서열이 위치 2의 Ser 잔기에서 시작하여 위치 216의 Val 잔기로 종결되는, 서열번호: 2 서열 인식자와 80% 이상의 상동성 정도를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 3항에 있어서, 천연의 CDase에 부가된, 상기 아미노산 서열이 위치 2의 Ser 잔기에서 시작하여 위치 216의 Val 잔기로 종결되는, 서열번호: 2 서열 인식자로 기재되는 것과 같음을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 천연의 CDase가, 사카로마이세스 세레비지에 FCY1 유전자에 의해 암호화되는, 효모 CDase인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 2항에 있어서, 상기 천연의 CDase가, 사카로마이세스 세레비지에 FCY1 유전자에 의해 암호화되는, 효모 CDase인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 4항에 있어서, 상기 천연의 CDase가, 사카로마이세스 세레비지에 FCY1 유전자에 의해 암호화되는, 효모 CDase인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 7항에 있어서, 상기 천연의 CDase가 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 158의 Glu 잔기로 종결되는, 서열번호: 1 서열 인식자와 80% 이상의 상동성 정도를 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 8항에 있어서, 상기 천연의 CDase가 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 158의 Glu 잔기로 종결되는, 서열번호: 1 서열 인식자로 기재되는 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 7항에 있어서, 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 373의 Val 잔기로 종결되는, 서열번호: 1의 서열 인식자와 80% 이상의 상동성 정도를 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 10항에 있어서, 위치 1의 Met 잔기에서 시작하여 위치 373의 Val 잔기로 종결되는, 서열번호: 1의 서열 인식자로 기재되는 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 천연의 CDase보다 더 높은 CDase 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
숙주세포 내에서 발현하는데 필요한 요소들의 조절 하에 놓인, 제 13항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
제 14항에 있어서, 상기 벡터가 벡터의 형질감염 효율, 안정성 또는 형질감염 효율 및 안정성 양자를 향상시키는 최소한 하나의 성분들과 적절히 혼합되는, 플라스미드 및 바이러스 벡터들로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 15항에 있어서, 벡터의 형질감염 효율, 안정성 또는 형질감염 효율 및 안정성 양자를 향상시키는 상기 성분이 양이온성 지질류, 음이온성 고분자류, 라이소인지질류 및 폴리펩티드류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 15항에 있어서, 상기 벡터가 폭스바이러스로부터, 아데노바이러스로부터, 레트로바이러스로부터, 허피스바이러스로부터, 알파바이러스로부터, 거품형성바이러스로부터 또는 아데노바이러스-연계 바이러스로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 17항에 있어서, 상기 벡터가 변형 우두바이러스 앙카라 (MVA) 바이러스로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 18항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열이 결실 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ으로 구성된 군으로부터 선택된 MVA 게놈 내 자연적으로 발생한 결실의 부위에 삽입되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 19항에 있어서, 상기 자연적으로 발생한 결실의 부위가 결실 Ⅲ인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 14항에 있어서, 발현을 위해 필요한 상기 요소들이 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 21항에 있어서, 상기 프로모터가 티미딘 키나제 7.5K 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 17항에 있어서, 상기 벡터가 복제에 필수적이고 El, E2, E4 및 L1-L5 지역들로부터 선택되는 적어도 한 지역의 전체 혹은 일부가 결실된 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 23항에 있어서, 상기 벡터가 비-필수 E3 지역의 전체 혹은 일부가 부가적으로 결실된 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 21항에 있어서, 상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스 (CMV) 초기 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 14항에 있어서, 인터류킨류 IL-2, IL-4, IL-7, IL-10 및 IL-12, 인터페론류, 종양괴사인자 (TNF), 콜로니 자극인자류 (CSF) 및 혈관신생에 작용하는 인자류를 암호화하는 유전자들로부터 선택되는 하나 이상의 목적 유전자들을 부가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 26항에 있어서, 상기 목적 유전자가 IL-2 및 INFγ로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
(i) 제 14항에 따른 재조합 벡터가 형질감염된 보완 세포를 얻기 위하여 in trans로 상기 벡터를 보완할 수 있는 보완 세포 내로 도입되고,

(ⅱ) 상기 형질감염된 보완 세포가 바이러스 입자가 생산될 수 있는 적절한 조건들 하에서 배양되고,

(ⅲ) 상기 바이러스 입자를 세포 배양액으로부터 회수하는, 바이러스 입자를 제조하기 위한 방법.
제 14항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
제 28항에 따른 방법에 의해 획득된 바이러스 입자.
제 13항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주세포.
제 14항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
제 29항에 따른 바이러스 입자로 감염된 숙주세포.
제 30항에 따른 바이러스 입자로 감염된 숙주세포.
제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제 13항에 따른 뉴클레오티드 서열을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제 14항에 따른 재조합 벡터를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제 29항에 따른 바이러스 입자를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제 31항에 따른 숙주세포를 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 조성물.
제 35항에 있어서, IL-2 및 INFγ로부터 선택되는 폴리펩티드인, 목적하는 제2 폴리펩티드를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 36항에 있어서, IL-2 및 INFγ로부터 선택되는 폴리펩티드를 암호화하는, 목적하는 제2 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
유전자 치료에 의해 또는 재조합 경로에 의해 생산되는 단백질 투여에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 용도의 제 1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 폴리펩티드.
제 42항에 있어서,

암, 종양 및 원치않는 세포 증식으로 인해 발생하는 질환들을 치료하기 위한 용도의 폴리펩티드.
제 42항에 있어서,

약학적으로 허용가능한 양의 전구약물, 유리하게는 시토신의 유사체, 구체적으로는 5-FC와 함께 투여되는 폴리펩티드.
유전자 치료에 의해 또는 재조합 경로에 의해 생산되는 단백질 투여에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 용도의 제 13항에 따른 뉴클레오티드 서열.
제 45항에 있어서,

암, 종양 및 원치않는 세포 증식으로 인해 발생하는 질환들을 치료하기 위한 용도의 뉴클레오티드 서열.
제 45항에 있어서,

약학적으로 허용가능한 양의 전구약물, 유리하게는 시토신의 유사체, 구체적으로는 5-FC와 함께 투여되는 뉴클레오티드 서열.
유전자 치료에 의해 또는 재조합 경로에 의해 생산되는 단백질 투여에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 용도의 제 14항에 따른 재조합 벡터.
제 48항에 있어서,

암, 종양 및 원치않는 세포 증식으로 인해 발생하는 질환들을 치료하기 위한 용도의 재조합 벡터.
제 48항에 있어서,

약학적으로 허용가능한 양의 전구약물, 유리하게는 시토신의 유사체, 구체적으로는 5-FC와 함께 투여되는 재조합 벡터.
유전자 치료에 의해 또는 재조합 경로에 의해 생산되는 단백질 투여에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 용도의 제 29항에 따른 바이러스 입자.
제 51항에 있어서,

암, 종양 및 원치않는 세포 증식으로 인해 발생하는 질환들을 치료하기 위한 용도의 바이러스 입자.
제 51항에 있어서,

약학적으로 허용가능한 양의 전구약물, 유리하게는 시토신의 유사체, 구체적으로는 5-FC와 함께 투여되는 바이러스 입자.
유전자 치료에 의해 또는 재조합 경로에 의해 생산되는 단백질 투여에 의해 인간 또는 동물 신체를 치료하기 위한 용도의 제 31항에 따른 숙주세포.
제 54항에 있어서,

암, 종양 및 원치않는 세포 증식으로 인해 발생하는 질환들을 치료하기 위한 용도의 제 31항에 따른 숙주세포.
제 54항에 있어서,

약학적으로 허용가능한 양의 전구약물, 유리하게는 시토신의 유사체, 구체적으로는 5-FC와 함께 투여되는 숙주세포.