KR20100110292A - 폭스바이러스성 온콜리틱 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 결손 F4L 및/또는 I4L 유전자를 포함하는 폭스바이러스, 이러한 폭스바이러스를 포함하는 조성물 및 이러한 조성물 및 폭스바이러스의 치료 목적을 위한, 및 보다 구체적으로 암 치료를 위한 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

폭스바이러스성 온콜리틱 벡터{POXVIRAL ONCOLYTIC VECTORS}
온콜리틱 바이러스는 종양-의존성 자기-지속의 고유한 특성을 가진 암의 치료에 사용되는 신규 치료제 부류이다 (문헌 [HERMISTON . A demand for next-generation oncolytic adenoviruses. Current opinion in molecular therapeutics . 2006, vol.8, no.4, p.322-30.] 참조). 온콜리틱 바이러스는 악성 세포에서 선택 복제를 할 수 있고 따라서 종래의 암 치료보다 잠재적으로 훨씬 높은 수준의 효력 및 특이성을 제공한다 (문헌 [FISHER . Striking out at disseminated metastases: the systemic delivery of oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics . 2006, vol.8, no.4, p.301-13.] 참조). 이러한 바이러스의 사용 이점은 이들이 복제하면서 이들의 숙주 세포를 용해한다는 것이다. 암 세포는 불활성화된 항바이러스성 인터페론 경로를 가지거나 또는 바이러스의 복제가 아무런 방해를 받지않고 진행될 수 있게 하는 돌연변이된 종양 억제 유전자를 가지기 때문에 많은 바이러스에게 이상적인 숙주이다 (문헌 [CHERNAJOVSKY , et al . Fighting cancer with oncolytic viruses. British medical journal . 2006, vol.332, no.7534, p.170-2.] 참조).
일부 바이러스들은 자연적으로 종양(tumoral) 세포에서 선택적 복제를 할 수 있으나 온콜리틱 바이러스는 또한 천연 발생 바이러스를 변형시킴으로써 얻을 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 바이러스를 변형시키기 위하여 현재 사용되는 주된 전략은 하기를 포함한다: 필수 바이러스 유전자내 기능 결실(functional deletion); 이러한 바이러스 유전자의 발현을 제어하기 위하여 사용되는 종양- 또는 조직-특이적 프로모터; 및 아데노바이러스를 암 세포 표면으로 다시 향하게 하는 향성(tropism) 변형. 근래에, 온콜리틱 아데노바이러스는 결정적으로 중요한 항암 도구로서의 이들의 잠재성을 완전히 인식하고 따라서 악성 신경교종을 가진 환자들의 예후를 개선시키도록 최적화될 필요가 있다 (문헌 [JIANG , et al . Oncolytic adenoviruses as antiglioma agents. Expert review of anticancer therapy . 2006, vol.6, no.5, p.697-708.] 참조).
예를 들어, ONYX-015 (p53 돌연변이를 보유하는 세포들에서 선택적으로 복제하고 이들을 사멸시키도록 변형된 아데노바이러스)는 두경부, 위장 및 췌장 종양을 비롯한 다양한 충실성 종양의 잠재적 치료를 위하여 오닉스 파마수티칼스(Onyx Pharmaceuticals)가 개발중이다. 이는 E1B 유전자좌에서 기능 상실의 돌연변이 (이의 생성물은 p53 종양 억제 단백질에 결합하여 이를 불활성화시키는 55 kDa 단백질임)를 수반하는 재조합 아데노바이러스이다. 따라서, 이러한 ONYX-015 아데노바이러스는 정상 세포에게 영향을 주지 않게 되어있다. p53 종양 억제 유전자내 돌연변이는 주요 암 유형 전체의 반 이상에서 발생하는, 암내 유전자적 이상의 가장 흔한 유형이다. 따라서, 이러한 세포들은 쉽게 복제하고 세포 사멸을 야기할 것인 바이러스에 영향받기 쉽다. ONYX-015은 재발한 두경부암의 치료에 대한 제3상 시험, 직장결장, 난소, 췌장 및 구강 종양에 대한 제2상 시험, 및 소화 질환, 식도 및 간 종양에 대한 제1상 시험 진행중이다 (문헌 [COHEN , et al . ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals. Current opinion in investigational drugs . 2001, vol.2, no.12, p.1770-5.] 참조).
천연 온콜리틱 바이러스는 종양 세포들을 선택적으로 감염 및 사멸시키는 선천적 능력을 가진 복제-가능(replication-competent) 바이러스이다. 50년 전 살아있는 바이러스로 암을 치료하려는 최초의 시도에서 사용되었음에도 불구하고, 천연 온콜리틱 바이러스에 대한 관심은 암 치료제로서의 조작된 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스에 대한 지원에 뒤쳐져 왔다. 그러나 최근, 이러한 자연 발생 약제의 높은 효력 및 선택성에 대하여 관심이 다시 모아졌다 (문헌 [ROBERTS , et al . Naturally oncolytic viruses. Current opinion in molecular therapeutics . 2006, vol.8, no.4, p.314-21.) 참조).
천연 온콜리틱 바이러스 중에, 백시니아 바이러스 (폭스비리대(Poxviridae))는 온콜리틱 바이러스적 요법(virotherapy)에서 사용되는 이상적인 바이러스 백본에 필수적인 많은 핵심 속성들을 보유한다. 이는 급속한 세포 대 세포 확산(spread)과 함께 짧은 수명주기, 강력한 용해 능력, 큰 클로닝 용량 및 뚜렷한 분자 생물학을 포함한다. 추가로, 인간 세포에서 복제를 할 수 있지만, 이들은 자연적인 건강 문제로 여겨지지 않고 천연두 박멸 캠페인 동안 수백만명의 개인에게 전달되어 특히 잘 특성화된다. 백신 균주 또는 유전적으로 변형된 백시니아 균주 중 어느 것을 사용한 초기 임상 결과는 항종양 효과를 입증하였다 (문헌 [THORNE , et al . Vaccinia virus and oncolytic virotherapy of cancer. Current opinion in molecular therapeutics . 2005, vol.7, no.4, p.359-65.] 참조).
대조적으로, 폭스바이러스 점액종(myxoma) 바이러스는 토기목(lagomorph) (토끼)에 뚜렷하고 절대적인 숙주 종 향성(tropism)을 가진만큼, 인간에서 직접적으로 사용된 역사가 없는 신규 온콜리틱 후보이다. 점액종 바이러스는 또한 인간 종양 세포들을 선택적으로 감염 및 사멸 (인간 암의 대부분에서 발견되는 조절이상 세포내 신호전달 경로로 연결된 고유한 향성)시킬 수 있다고 최근에 밝혀졌다. 이러한 검토는 인간 암 세포를 위한 점액종 바이러스의 향성에 대한 기존의 지식 및 암의 동물 모델에서 종양을 감염 및 제거(clear)하는 능력을 보여주는 전임상 데이터를 요약한다 (문헌 [STANFORD , et al . Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cancer. Expert opinion on biological therapy. 2007, vol.7, no.9, p.1415-25.] 참조).
기술적 문제점
항종양 효과를 달성하기 위하여 필요한 폭스바이러스의 고용량 주입은 독성 문제들을 제기하였다. 유해 사건의 대부분은 사소하고, 백시니아 바이러스에 통상적으로 연결된 유해 반응은 자연 치유(self-limited)적이고 열, 두통, 피로, 근육통, 오한, 국소 피부 반응, 비특이적 발진, 다형홍반, 림프절증 및 예방접종 부위에서의 통증을 포함한다. 다른 반응들은 추가적인 요법 (예를 들어, VIG, 일차(first-line) 요법 및 시도포버(cidofovir), 이차 요법)을 필요로 할 수 있다. 추가적인 평가 또는 요법을 필요로 할 수 있는 유해 반응들은 부주의한 접종, 전신성 백시니아 (GV), 종두습진(eczema vaccinatum) (EV), 진행성 백시니아 (PV), 예방접종후 중추신경계 질환, 및 태아 백시니아를 포함한다 (문헌 [CONO , et al . Smallpox vaccination and adverse reactions. Guidance for clinicians. MMWR . Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report . Recommendations and reports / Centers for Disease Control . 2003, vol.52, no.RR-4, p.1-28.] 참조).
따라서, 이들의 천연 대응물만큼 좋은 온콜리틱 활성을 가진 보다 안전한 폭스바이러스가 필요하다.
배경기술
미국 특허 제5364773호 (바이로지네틱스 코퍼레이션(VIROGENETICS CORPORATION) (TROY, NY)) (15/11/1994)는 불활성화된 비필수적 바이러스-코딩된 코딩된 유전적 기능을 가져서 재조합 폭스바이러스가 감쇠된 독력 및 향상된 안전성을 가지는 변형된 재조합 폭스바이러스, 보다 구체적으로 백시니아 바이러스를 기술한다. 구체적으로, 상기 유전적 기능은 독력 인자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 결실 또는 독력 인자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 삽입적 불활성화로 불활성화된다. 보다 구체적으로, 이 특허는 J2R, B13R+B14R, A26L, A56R, C7L - K1L, 및 I4L의 오픈 리딩 프레임이 불활성화된 백시니아 바이러스를 기술한다. 이 바이러스 (NYVAC)는 외래 핵산을 위한 벡터로 조작되고 숙주 동물에서 면역학적 반응의 유도를 위한 백신으로 사용될 수 있다. 그러나 N YVAC는 대부분의 포유동물 세포에서 효율적으로 복제를 할 수 없고 온콜리틱 바이러스로 사용될 수 없다 (문헌 [XIANGZHI , et al . Vaccinia virus K1L protein supports viral replication in human and rabbit cells through a cell-type-specific set of its ankyrin repeat residues that are distinct from its binding site for ACAP2. Journal of virology . 2006, vol.353, no.1, p.220-233.] 참조).
WO 제2004/014314호 (컨 데이비드(KIRN DAVID) (US)) (19/02/2004)는 바이러스 게놈에서 1종 이상의 돌연변이를 포함하는 변경된 백시니아 바이러스를 기술한다. 기술된 돌연변이는 1종 이상의 하기의 폴리펩티드의 부류에 있다: 1) 인터페론-조정 폴리펩티드; 2) 상보적 제어 폴리펩티드; 3) TNF 또는 케모카인-조정 폴리펩티드; 4) 세린 프로테아제 억제제; 5) IL-lp 조정 폴리펩티드; 6) 비-감염성 EEV 형태 폴리펩티드; 및 7) 세포로부터 감염성 바이러스의 방출을 억제하도록 작용하는 바이러스성 폴리펩티드 (항감염성 바이러스 형태 폴리펩티드). 추가적으로, 백시니아 바이러스의 A41L 또는 C11R에서의 돌연변이가 또한 개시된다.
A34R, A41L, A53R, B5R, B7R, B8R, B13R, B15R, B18R, B22R, B28R, B29R, CUR, E3L, K2L, N1L, vC12L, 및 vCKBP와 같은 백시니아 게놈 영역은 본 출원에서 보다 구체적으로 기술된다. 본 발명의 방법은 본 명세서에서 논의된 임의의 폭스바이러스의 사용을 수반한다. 발명자들은 또한 암 세포 또는 환자에게 이러한 변경된 백시니아 바이러스의 유효량의 투여를 통한 암 치료 방법을 개시한다.
발명자들은 결손 I4L 및/또는 F4L 유전자를 포함하는 폭스바이러스가 개선된 안전성 프로파일을 가지나 동등한 온콜리틱 활성을 유지 (그들의 천연 대응물과 비교시)한다는 것을 놀랍게도 발견하였다.
본 발명은 결손 I4L 및/또는 F4I 유전자를 포함하는 폭스바이러스 (단, 이러한 폭스바이러스는 NYVAC가 아님)에 관한 것이다.
출원 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "하나(a) 및 (an)"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 언급된 성분 또는 단계의 "적어도 하나", "적어도 첫번째", "하나 이상" 또는 "복수"를 의미하는 뜻으로 사용된다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수개의 세포들 및 이들의 혼합물들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는" 어디서든 "및", "또는" 및 "언급된 용어로 연결되는 요소들의 모든 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20 %내, 바람직하게 10 %내, 및 보다 바람직하게 5 %내를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)" 및 "포함한다(comprise)"는 생성물, 조성물 및 방법이 언급된 성분 또는 단계를 포함하나 그 외의 것들을 제외하지는 않는 것을 의미하도록 의도된다. 생성물, 조성물 및 방법을 정의하기 위하여 사용될 때의 "본질적으로 구성되는"은 임의의 본질적 중요성을 갖는 다른 성분 또는 단계의 제외를 의미할 것이다. 따라서, 기재된 성분들로 본질적으로 구성되는 조성물은 미량의 오염물질 및 제약학상 허용가능한 운반체를 제외하지 않을 것이다. "구성되는"은 다른 성분 또는 단계의 미량 이상의 원소의 제외를 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결손 유전자를 포함하는 폭스바이러스"는 이러한 결손 유전자의 하나 이상의 핵산에서의 결실, 치환 또는 부가, 또는 변형으로 바이러스가 비변형된 유전자가 생성하는 단백질의 활성을 가진 단백질을 생성할 수 없게 되는 상기 가능성들의 임의의 조합을 포함하는 폭스바이러스를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 결손 유전자를 포함하는 폭스바이러스는 유전자 서열 전체가 결실된 폭스바이러스를 지칭한다. 돌연변이는 재조합 기술을 사용하여 당업자에게 공지된 다수의 방법으로 만들어질 수 있다. 폭스바이러스의 게놈의 변형 방법은 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어 문헌 [MCCART, et al . Systemic cancer therapy with a tumor selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.. Cancer res.. 2001, no.61, p.8751-57.; KIM , et al . Systemic armed oncolytic ans immunologic therapy for cancer with JX-594, a targeted poxvirus expressing GM-CSF. Molecular Therapeutic . 2006, no.14, p.361-70.]; WO 제2004/014314호 (KIRN DAVID (US)) (19/02/2004); 및 미국 특허 제5364773호 (VIROGENETICS CORPORATION (TROY, NY)) (15/11/1994)에서 개시된 방법들이 본 발명의 폭스바이러스를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 본 출원의 실시예에 개시된 방법들은 본 발명에 따른 폭스바이러스의 제조에 특히 관련이 있다. 다양한 폭스바이러스의 게놈의 서열이 당업계에서 입수가능하다; 예를 들어, 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스(Canarypox) 바이러스, 엑트로밀리아(Ectromelia) 바이러스, 점액종 바이러스 게놈이 진뱅크에서 입수가능하다 (기탁 번호, 각각 NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_001132).
본 명세서에서 사용되는 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리대 과에 속하는 바이러스를 지칭한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 코르도폭스비리내(Chordopoxvirinae) 아과, 보다 바람직하게 진성두창바이러스(orthopoxvirus) 속 및 보다 더욱 바람직하게 백시니아 바이러스 종에 속한다.
예를 들어, 백시니아 바이러스 균주 다이렌(Dairen) I, IHD-J, L-IPV, LC16M8, LC16MO, 리스터(Lister), LIVP, 타쉬켄트(Tashkent), WR 65-16, 와이어스(Wyeth), 안카라(Ankara), 코펜하겐(Copenhagen), 티엔탄(Tian Tan) 및 WR이 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐이다.
폭스바이러스 백시니아는 큰 이중나선 DNA 게놈 (187 킬로베이스 페어)을 포함하고 감염된 세포의 세포질에서 복제하는 유일하게 공지된 DNA 바이러스의 족의 구성원이다. 감염된 세포는 대량의 DNA 전구체를 세포질 복제 부위로 전달해야 하기 때문에, 바이러스는 리보뉴클레오티드 리덕타제 및 데옥시우리딘 5'-트리포스페이트 뉴클레오티도히드로라제 (dUTPase)를 비롯하여 DNA 대사 및 합성에 필요한 많은 효소 활성을 코딩 및 발현한다.
리보뉴클레오티드 리덕타제 (EC 1.17.4.1)는 DNA 생합성에서 첫번째 개입 단계를 나타내는 반응인 리보뉴클레오티드의 데옥시리보뉴클레오티드로의 환원을 촉매한다. 바이러스성 효소는 R1 및 R2로 지칭된, 두개의 이종 아단위로 구성되어 아단위 구조에서 포유동물 효소와 유사하다. 바이러스성 리보뉴클레오티드 리덕타제 아단위를 코딩하는 유전자는 서열화되었고 35 킬로베이스로 분리된 백시니아 게놈상의 위치로 위치결정되었다 (문헌 [SLABAUGH , et al . . Journal of virology . 1988, vol.62, p.519-27.; TENGELSEN , et al . . Virology . 1988, no.164, p.121-31.; SCHMITT , et al. . Journal of virology . 1988, no.62, p.1889-97.] 참조). 백시니아 바이러스 대형 아단위의 단량체 (R1이라 지칭, I4L 유전자에 의해 코딩됨)는 86-kDa 폴리펩티드이고, 알로스테릭 이펙터 뉴클레오티드 기질을 위한 결합 부위를 포함한다 (문헌 [SLABAUGH , et al . . Journal of virology . 1984, no.52, p.507-14.; SLABAUGH , et al . . Journal of virology . 1984, no.52, p.501-6.] 참조). 소형 아단위 (R2이라 지칭, F4L 유전자에 의해 코딩됨)는 각각 촉매작용에 필요한 철-안정화된 단백질-기재 유리 라디칼을 포함하는, 두개의 37-kDa 폴리펩티드를 포함하는 호모다이머이다 (문헌 [HOWELL , et al . . Journal of Biological Chemistry . 1992, no.267, p.1705-11.] 참조). 다양한 폭스바이러스의 게놈에서 I4L 및 F4L 유전자의 서열 및 위치는 예를 들어, 기탁 번호 DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 및 NC_008291을 통하여 공공 데이터베이스에서 입수가능하다.
본 명세서에서 사용되는 유전자 명명법은 코펜하겐 백시니아 균주의 것이고 달리 표시되지 않는 한 다른 폭스비리대의 동종 유전자에도 역시 사용된다. 그러나, 유전자 명명법은 폭스 균주에 따라 상이할 수 있다. 참고로, 코펜하겐 및 MVA 유전자간의 상응성은 문헌 [ANTOINE . . Virology . 1998, no.244, p.365-396.]의 표 1에서 확인할 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 추가적으로 결손 J2R 유전자를 포함한다.
J2R 유전자는 피리미딘 데옥시리보뉴클레오티드 합성을 위한 샐비지 경로의 일부를 형성하는 티미딘 키나제 (TK)를 코딩한다. TK로 촉매되는 반응은 티미딘 5'-모노포스페이트 (dTMP)을 생성하기 위한 ATP로부터 2'데옥시-티미딘 (dThd)으로 γ-포스포릴 부분의 전달을 수반한다. 백시니아 바이러스의 TK는 유형 2이다. 유형 2 TK는 유형 1과 비교하여 보다 작은 폴리펩티드 사슬 (~ 25 KDa)을 가지나, 호모테트라머를 형성한다. 이들은 대사 경로의 종반에서 생성되는 피드백 억제제 dTDP 또는 dTTP에 감응성이다. 유형 2 TK는 유형 1 TK와 비교하여 훨씬 더 좁은 기질 특이성을 가지고 오직 2'데옥시우리딘 (dU) 및/또는 dThd만을 인산화시킨다 (문헌 [EL OMARI , et al . Structure of vaccinia virus thymidine kinase in complex with dTTP: insights for drug design. BMC structural biology . 2006, no.6, p.22.] 참조).
J2R 영역을 결손하는 폭스바이러스 및 이의 수득 방법은 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [MCCART , et al . Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. cancer research . 2001, vol.61, no.24, p.8751-7.; PUHLMANN, et al . Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy: biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant. Cancer gene therapy . 2000, vol.7, no.1, p.66-73.; GNANT , et al . Systemic administration of a recombinant vaccinia virus expressing the cytosine deaminase gene and subsequent treatment with 5-fluorocytosine leads to tumor-specific gene expression and prolongation of survival in mice. Cancer Research . 1999, vol.59, no.14, p.3396-403.]의 내용이 J2R 영역을 결실한 폭스바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 결손 F2L 유전자를 추가적으로 포함한다.
데옥시우리딘 5'-트리포스페이트 뉴클레오티도히드로라제 (dUTPase, EC 3.6.1.23)는 Mg(2+) 이온의 존재하 dUTP의 dUMP 및 피로포스페이트로의 가수분해를 촉매한다. dNTP 풀로부터 dUTP의 제거 및 dUMP의 생산에서, dUTPase는 DNA 복제의 충실도 유지 및 티미딜레이트(thymidylate) 신타제로 TMP의 생성을 위한 전구체의 제공 모두에 관여한다. 백시니아 dUTPase는 F2L 유전자에 의해 코딩되는 15 kDa 단백질이다 (문헌 [MCGEOGH . . Nucleic Acids Research . 1990, no.18, p.4105-10. ; BROYLES . . Virology . 1993, no.195, p.863-5.] 참조). 백시니아 바이러스의 F2L 유전자의 서열은 기탁 번호 M25392를 통하여 진뱅크에서 입수가능하고, 다양한 폭스바이러스 게놈에서 F2L 유전자의 서열 및 위치는 또한 예를 들어, 기탁 번호 NC_006998, DQ121394, NC_001611, AY689436, AY689437, NC_008291, DQ437594, DQ437593, AY313847, AY313848, NC_006966, NC_005309, NC_003391, NC_003389, NC_001132, NC_003310, NC_002188, M35027, AY243312, AF170726, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, X94355, Y16780, AY318871, U94848, AF198100 및 M34368을 통하여 진뱅크에서 입수가능하다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 관심 핵산을 추가적으로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 관심 핵산은 치료 분자인 유전자 생성물 (즉, 치료 유전자)을 코딩하는 1종 이상의 관심 서열을 포함한다. "치료 분자"는 환자, 특히 질환 또는 질병 상태를 앓고 있는 환자 또는 이러한 질환 또는 상태로부터 보호되어야 할 환자에게 적절히 투여시 약리학적 또는 예방적 활성을 가진 것이다. 이러한 약리학적 또는 예방적 활성은 상기 질환 또는 상기 상태의 과정 또는 증상에의 유익한 효과와 관련된 것으로 예상되는 것이다. 당업자가 본 발명의 과정에서 치료 분자를 코딩하는 유전자를 선택할때, 그는 일반적으로 그의 결정을 앞서 얻어진 결과와 관련짓고 청구된 바와 같은 본 발명의 실시 외 과도한 시행착오 없이 이러한 약리학적 특성을 얻으리라 타당하게 기대할 수 있다. 본 발명에 따르면, 관심 서열은 이것이 도입되는 표적 세포와 동종 또는 이종일 수 있다. 유리하게 언급된 관심 서열은 폴리펩티드, 특히 치료적 또는 예방적 특성을 주는 치료적 또는 예방적 폴리펩티드의 전체 또는 부분을 코딩한다. 폴리펩티드는 크기, 및 글리코실화되었는지 여부에 무관하게 폴리뉴클레오티드의 임의의 번역(translational) 생성물로 이해되고 펩티드 및 단백질을 포함한다. 치료적 폴리펩티드는 주요예로서 동물 또는 인간 유기체내 결손 또는 결핍 단백질을 보상할 수 있는 폴리펩티드 또는 독성 효과를 통하여 작용하여 신체로부터 유해한 세포들을 제한 또는 제거하는 것들을 포함한다. 이들은 또한 체액성 또는 세포성 반응, 또는 양자를 유발하기 위하여 내인성 항원으로 작용하는 면역 부여 폴리펩티드일 수 있다.
치료적 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 예는 사이토킨 (알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터루킨, 특히 IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12, 종양 괴사 인자 (TNF), 콜로니 자극 인자 GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), 면역자극 폴리펩티드 (B7.1, B7.2, 등), 응고 인자 (FVIII, FIX...), 성장 인자 (형질전환 성장 인자 TGF, 섬유아세포 성장 인자 FGF, 등), 효소 (우레아제, 레닌, 트롬빈, 메탈로프로테이나제(metalloproteinase), 산화질소 신타제 NOS, SOD, 카탈라제...), 효소 억제제 (알파1-안티트립신, 안티트롬빈 III, 바이러스 프로테아제 억제제, 플라스미노겐 활성자 억제제 PAI-1), CFTR (낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절자) 단백질, 인슐린, 디스트로핀, MHC 클래스 I 또는 II 항원, 세포 유전자의 발현을 조정/조절할 수 있는 폴리펩티드, 박테리아성, 기생충성 또는 바이러스성 감염 또는 이의 발생을 억제할 수 있는 폴리펩티드 (항원성 폴리펩티드, 항원성 에피토프, 경쟁으로 천연 단백질의 작용을 억제하는 트랜스도미넌트(transdominant) 변이체....), 아폽토시스 유도인자 또는 억제제 (Bax, Bcl2, BclX...), 세포정지제 (p21, p 16, Rb...), 아포리포단백질(apolipoprotein) (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), 혈관형성의 억제제 (안지오스타틴, 엔도스타틴...), 혈관형성 폴리펩티드 (혈관 내피 성장 인자 VEGF 족, FGF 족, CTGF, Cyr61 및 Nov를 포함한 CCN 족), 산소 라디칼 스캐빈저(scaveyer), 항종양 효과를 가진 폴리펩티드, 항체, 독소, 면역독소 및 마커 (베타-갈락토시다아제, 루시페라아제....)를 코딩하는 유전자 또는 임상 상태의 치료 또는 예방에 유용하다고 당업계에서 인식되는 임의의 다른 관심 유전자를 포함한다.
적합한 항종양 유전자는 종양 억제 유전자 (예를 들어, Rb, p53, DCC, NF-1, 윌름스 종양(Wilm's tumor), NM23, BRUSH-1, p16, p21, p56, p73 및 이들의 각 돌연변이체), 자살 유전자 생성물, 항체, 세포 분열 또는 형질도입 신호를 억제하는 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함하나 이로 제한되지는 않는다.
특히 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 추가적으로 자살 유전자를 포함한다.
자살 유전자는 약물의 전구체를 세포독성 화합물로 전환할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭한다.
자살 유전자는 시토신 데아미나제 활성, 티미딘 키나제 활성, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 활성 및/또는 티미딜레이트 키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하나 이로 제한되지는 않는다.
자살 유전자 및 하나의 핵염기(nucleobase) 부분을 포함하는 상응하는 약물의 전구체의 예들이 하기의 표에서 개시된다:
자살 유전자 예비약물(predrug)
티미딘 키나제 간시클로버(Ganciclovir);
간시클로버 엘라이딘산 에스테르;
펜시클로버(Penciclovir);
아시클로버(Acyclovir);
발라시클로버(Valacyclovir);
(E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘;
지도부딘(zidovudine);
2'-엑소(Exo)-메타노카르바티미딘
시토신 데아미나제 5-플루오로시토신
퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 6-메틸퓨린 데옥시리보시드;
플루다라빈(Fludarabine)
우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 5-플루오로시토신;
5-플루오로우라실
티미딜레이트 키나제 아지도티미딘
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 적어도 CDase 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. CDase는 외인성 시토신이 가수분해성 탈아미노기에 의해 우라실로 변환되는 피리미딘 대사 경로에 관여한다. CDase 활성이 원핵생물 및 저급 진핵생물에서 입증되었지만 (문헌 [JUND , et al . .Journal of Bacteriology . 1970, no.102, p.607-15.; BECK , et al . .Journal of Bacteriology . 1972, no.110, p.219-28.; HOEPRICH , et al . .Journal of Infectious Diseases . 1974, no.130, p.112-18.; ESDERS , et al . .J. biol . chem .. 1985, no.260, p.3915-22.] 참조), 이는 포유동물에서 존재하지 않는다 (문헌 [KOECHLIN , et al . . Biochemical pharmacology . 1966, no.15, p.435-46.; POLAK , et al . . Chemotherapy. 1976, no.22, p.137-53.] 참조).
CDase는 또한 시토신의 유사체, 즉 5-플루오로시토신 (5-FC)을 탈아미노기하여, 5-플루오로-UMP (5-FUMP)로 전환시 고도로 세포독성인 화합물인 5-플루오로우라실 (5-FU)을 형성한다. 포유동물 세포와 같이 효소를 코딩하는 유전자를 불활성화하는 돌연변이 때문에 또는 이 효소가 자연적으로 결핍되었기 때문에 CDase 활성이 결여된 세포는 5-FC에게 내성을 가진다 (문헌 [JUND , et al . .Journal of Bacteriology. 1970, no.102, p.607-15.; KILLSTRUP , et al . .Journal of Bacteriology . 1989, no.171, p.2124-2127.] 참조). 대조적으로, CDase 활성을 코딩하는 서열이 전이된 포유동물 세포는 5-FC에 감응성이 된다 (문헌 [HUBER , et al. .Cancer Research . 1993, no.53, p.4619-4626.; MULLEN , et al . .Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 1992, no.89, p.33-37.] 및 WO 93/01281 (US HEALTH) 참조). 또한, 이웃하는, 형질전환되지 않는 세포들 또한 5-FC에 감응성이 된다 (문헌 [HUBER , et al . . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 1994, no.91, p.8302-6.] 참조). 방관자 효과라 일컫는 이러한 현상은 CDase 활성을 발현하여 5-FU를 분비하고, 이가 이어서 원형질막을 가로지른 직통 확산(straightforward diffusion)에 의해 이웃한 세포들을 중독시키는 세포에 기인한다. 확산에서의 이러한 5-FU의 특성은 방관자 효과가 tk를 발현하는 세포들과의 접촉을 필요로 하는 tk/GCV 기준 시스템과 비교하여 수동적으로 장점을 나타낸다 (문헌 [MESNIL , et al . .Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 1996, no.93, p.1831-35.] 참조). 유전자 치료, 특히 항암 유전자 치료와 관련하여 CDase가 제공하는 모든 장점들은 따라서 쉽게 이해될 수 있다.
이러한 두 유기체의 CDase를 각각 코딩하는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) (S. cerevisiae) FCY1, 칸디다 알비칸스 (Candida Albicans) FCA1 및 대장균 codA 유전자는 공지되었고 이들의 서열은 공개되었다 (각각 서열 확인번호 4; 서열 확인번호 5; 서열 확인번호 6 ).
이와 관련하여, 본 발명의 보다 바람직한 실시양태에 따르면, CDase 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자는 FCY1, FCA1 또는 CodA 또는 이들의 유사체이다. 이러한 유전자들의 유사체는 모유전자의 핵산 서열과 적어도 70 % 초과, 유리하게 80 % 초과, 바람직하게 90 % 초과, 및 가장 바람직하게 95 % 초과의 동일성의 정도를 가지는 핵산 서열을 갖는 유전자를 지칭한다.
특허 WO 2005/007857은 개선된 CDase 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자를 개시한다. 이 폴리펩티드는 아미노산 서열의 부가에 의해 천연 CDase로부터 유도되었다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에 따르면, CDase 활성을 가지는 단백질은 WO 2005/007857에서 개시된 폴리펩티드이고 보다 바람직하게는 서열 확인번호 2에 나타난 FCU1-8 폴리펩티드 및 이의 유사체이다.
원핵생물 및 저급 진핵생물에서, 우라실은 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 (UPRTase)의 작용에 의해 UMP로 변환된다. 이 효소는 5-FU를 5-FUMP로 전환한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 UPRTase 활성을가지는 단백질을 코딩한다.
해당 UPRTase는 임의의 기원, 특히 원핵, 진균 또는 효모 기원일 수 있다. 예시로서, 대장균으로부터 (문헌 [ANDERSEN , et al . Characterization of the upp gene encoding uracil phosphoribosyltransferase of Escherichia coli K12. European Journal of Biochemistry. 1992, no.204, p.51-56.] 참조), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 (문헌 [MARTINUSSEN , et al . Cloning and characterization of upp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis. Journal of Bacteriology. 1994, vol.176, no.21, p.6457-63.] 참조), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)로부터 (문헌 [KIM, et al . Complete sequence of the UPP gene encoding uracil phosphoribosyltransferase from Mycobacterium bovis BCG. Biochemistry and molecular biology international. 1997, vol.41, no.6, p.1117-24.] 참조) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 (문헌 [MARTINUSSEN , et al . Two genes encoding uracil phosphoribosyltransferase are present in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology . 1995, vol.177, no.1, p.271-4.] 참조)의 UPRTase를 코딩하는 핵산 서열이 본 발명에 관련하여 사용될 수 있다. 그러나, 효모 UPRTase를 사용하는 것이 특히 가장 바람직하고 구체적으로 서열이 문헌 [KERN , et al . The FUR1 gene of Saccharomyces cerevisiae: cloning, structure and expression of wild-type and mutant alleles. (Gene . 1990, vol.88, no.2, p.149-57.)]에 개시된 S. 세레비시애 FUR1 유전자에 의해 코딩되는 것이 여기에 참조로서 도입된다. 참고로서, 이러한 유전자들의 서열 및 상응하는 UPRTase의 것은 문헌 및 전문 데이타뱅크 (스위스프로트(SWISSPROT), EMBL, 젠뱅크(Genbank), 메드린(Medline), 등)에서 확인할 수 있다.
출원 EP 0998568 A는 코딩 부분의 5'에서 105 뉴클레오티드가 결여되어 N-말단 위치에서 35 첫 잔기들이 결실된 UPRTase의 합성을 가능하게 하고 천연 단백질에서 위치 36에서 메티오닌으로 출발하는 FUR1 유전자를 기술한다. FUR1 Δ105라 지칭되는 돌연변이체 유전자의 발현의 생성물은 S. 세레비시애의 fur1 돌연변이체를 상보할 수 있다. 또한, 말단절단형 돌연변이체는 천연 효소의 것보다 높은 UPRTase 활성을 보인다. 따라서, 본 발명의 특히 유리한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 천연 UPRTase의 결실 돌연변이체를 코딩한다. 결실은 바람직하게 본래 UPRTase의 N-말단 영역에 위치한다. 이는 완전 (상기 N-말단 영역의 모든 잔기에 영향을 미침)하거나 또는 부분적 (주요 구조에서 하나 이상의 연속 또는 비연속 잔기에 영향을 미침)일 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드는 각각 분자의 약 삼분의 일을 나타내는 N-말단, 중앙 및 C-말단부로 구성된다. 예를 들어, S, 세레비시애 UPRTase가 251 아미노산을 갖기 때문에, 이의 N-말단부는 천연 형태의 첫 위치에 위치한 소위 개시제 메티오닌으로 출발하는 첫 83 잔기로 구성된다. 대장균 UPRTase에 대하여는, 이의 N-말단부는 위치 1 내지 69를 포함한다.
UPRTase 활성을 가지는 바람직한 단백질은 위치 1에서 Met 잔기로 출발하고 위치 216에서 Val 잔기로 끝나는, EP 0998568 A의 서열 확인번호 1에 나타난 바와 실질적으로 같은 아미노산 서열을 포함한다. 용어 "실질적으로"는 상기 서열 확인번호 1 EP 0998568 A와 70 % 초과, 유리하게 80 % 초과, 바람직하게 90 % 초과, 및 가장 바람직하게 95 % 초과의 동일성 정도를 지칭한다. 더욱 더 바람직하게, 이는 서열 확인번호 1 EP 0998568 A에 나타난 아미노산 서열을 포함한다. 상술한 바와 같이, 이는 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다. 특히 위치 2 (천연 UPRTase에서 위치 37)에서 세린 잔기의 알라닌 잔기로의 치환을 언급할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 적어도 하나의 CDase 및 하나의 UPRTase 활성을 가지는 단백질을 코딩한다. 특허 출원 WO 96/16183 및 EP 0998568 A는 CDase 및 UPRTase 활성을 가지는 두 도메인을 갖는 효소를 코딩하는 융합 단백질의 용도를 기술하고 발현 플라스미드에 의해 운반되는 하이브리드 유전자 codA :: upp 또는 FCY1 :: FUR1 또는 FCY1 :: FUR1 Δ105 (즉 FCU1 )의 전이가 형질감염된 B16 세포의 5-FC에 대한 감응성을 증가시킨다는 것을 입증한다. 본 발명의 보다 바람직한 실시양태에 따르면, 자살 유전자는 서열 확인번호 3 (coda::upp), 서열 확인번호 1 (FCU1) 또는 FCY1::FUR1에 나타난 바와 실질적으로 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 용어 "실질적으로"는 상기 서열과 70 % 초과, 유리하게 80 % 초과, 바람직하게 90 % 초과, 및 가장 바람직하게 95 % 초과의 동일성 정도를 지칭한다. 더욱 더 바람직하게, 이는 서열 확인번호 3 (coda::upp), 서열 확인번호 1 (FCU1) 또는 FCY1::FUR1에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 상술한 바와 같이, 이는 추가적인 돌연변이를 포함할 수 있다.
핵산 서열은 이용되고 있는 종래 기술에 따른 화학적 합성, PCR 또는 클로닝으로 용이하게 얻어질 수 있다. 이들은 천연 유전자 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 부가로써 후자로부터 유도된 유전자일 수 있다. 더욱이. 이들의 서열은 당업자가 참고할 수 있는 문헌에 널리 기술되어 있다.
당업자는 공개된 자료로부터 CDase 또는 UPRTase 서열을 클로닝 및 가능한 돌연변이를 수행, 선행기술에 따라 또는 출원 EP 0998568 A에 표시된 프로토콜에 기초하여 무세포성 또는 세포성 시스템에서 돌연변이체 형태의 효소 활성을 시험, 및 특히 동조하여(in phase) 폴리펩티드를 CDase 및 UPRTase 활성, 및 결과적으로 상응하는 유전자의 전체 또는 부분과 함께 융합할 수 있다.
보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 투과 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열을 추가적으로 포함한다.
투과 효소는 세포막을 통한 하나의 핵염기 부분을 포함하는 약물 또는 이의 전구체의 전달에 관여하는 막횡단 단백질을 지칭한다.
투과 효소는 퓨린 투과 효소, 시토신 투과 효소 및 뉴클레오시드 트랜스포터를 포함하나 이로 제한되지는 않는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 투과 효소는 S. 세레비시애의 퓨린 또는 시토신 투과 효소이다. S. 세레비시애의 핵염기 트랜스포터는 FCY2로 공지된 퓨린-시토신 투과 효소 및 FUR4로 공지된 우라실 투과 효소로 구성된다. 퓨린-시토신 투과 효소, FCY2는 효모 원형질막을 가로지른 양성자 및 아데닌, 구아닌, 히포크산틴 및 시토신의 심포트를 매개한다 (문헌 [Grenson 1969, Jund and Lacroute 1970, Polak and Grenson 1973, Chevallier et al. 1975, Hopkins et al. 1988] 참조). FCY2 단백질은 또한 시토신의 유사체, 5-플루오로시토신의 수송을 매개한다(문헌 [Grenson 1969, Jund and Lacroute 1970] 참조). FCY2 유전자는 처음에 10 내지 12 막횡단-스패닝 도메인을 가진다고 예측되었고 (문헌 [Weber et al . 1990] 참조) 현재 9개가 지지되는 (문헌 [Ferreira et al . 1999] 참조) 533개의 아미노산 (58 kDa)의 단백질을 코딩한다. FCY2는 퓨린 핵염기 및 시토신에 대하여 유사한 친화성을 보인다 (문헌 [Brethes et al . 1992] 참조). S. 세레비시애내로의 우라실 흡수는 우라실 투과 효소, FUR4에 의해 매개된다 (문헌 [Jund and Lacroute 1970, Jund et al . 1977] 참조). FUR4는 10 막횡단 도메인 및 긴 세포질 친수성 N- 및 C- 말단 꼬리를 갖는 633 아미노산 (71.7 kDa)의 단백질로 예측되는 (문헌 [Jund et al . 1988, Garnier et al . 1996] 참조) 우라실-양성자 심포터이다 (문헌 [Hopkins et al . 1988] 참조). FUR4 단백질은 또한 우라실의 유사체, 5-플루오로우라실의 수송을 매개할 수 있다 (문헌 [Jund and Lacroute 1970] 참조).
FCY2 및 Fur4의 아미노산 서열은 스위스프로트 데이터베이스에서 특히 입수가능하다 (각각 기탁 번호 P17064 및 P05316). 바람직하게, 투과 효소는 특허 출원 WO 2006/048768에 개시된 바와 같이 아미노산 서열 확인번호 1 및 서열 확인번호 2을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
이런 면에서, 본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 투과 효소는 FCY2 및 Fur4 및 이들의 유사체를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. Fur4 및 FCY2의 유사체는 여기에서 상기에 기술된 바와 같이 모단백질의 아미노산 서열과 적어도 70 % 초과, 유리하게 80 % 초과, 바람직하게 90 % 초과, 및 가장 바람직하게 95 % 초과의 동일성 정도를 가지는 및 세포막을 통하여 하나의 핵염기 부분을 포함하는 약물의 수송 능력을 보유하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 지칭한다.
당업자는 하나의 핵염기 부분을 포함하는 약물 또는 이러한 약물의 전구체와 결합할 투과 효소를 선택할 수 있다. 예를 들어, FCY2 및 Fur4는 바람직하게 5-플루오로시토신 (5-FC)과 결합한다.
보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 관심 핵산의 발현에 필요한 요소를 추가적으로 포함할 수 있다.
보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폭스바이러스는 투과 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열의 발현에 필요한 요소를 추가적으로 포함할 수 있다.
관심 핵산 및/또는 투과 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열의 발현에 필요한 요소들은 상기 DNA의 mRNA로의 전사 및 필요한 경우, mRNA의 폴리펩티드로의 번역에 필요한 요소들을 포함하였다. 다양한 척추동물 시스템에서 사용하기에 적합한 전사 프로모터는 문헌에 널리 기술되어 있다. 예를 들어, 적합한 프로모터는 RSV, MPSV, SV40, CMV 또는 7.5k와 같은 바이러스성 프로모터, 백시니아 프로모터, 유도성 프로모터 등을 포함한다. 바람직한 프로모터는 폭스 바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스의 7.5K, H5R, TK, p28, p11 또는 K1L으로부터 단리된다. 대안으로, 문헌 [CHAKRABARTI . . Biotechniques . 1997, no.23, p.1094-97.; HAMMOND, et al . . Journal of Virological Methods . 1997, no.66, p.135-38. 및 KUMAR . . Virology . 1990, no.179, p.151-8.]에 기술된 것들과 같은 합성 프로모터 및 초기 및 후기 폭스바이러스(성) 프로모터 사이의 키메라 프로모터를 사용할 수 있다.
관심 핵산 서열 및 투과 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열은 예를 들어 인트론 서열, 표적화 서열, 수송 서열, 분비 신호, 핵 위치결정 신호, IRES, 폴리 A 전사 종결 서열, 3 부분 (tripartite) 리더 서열, 복제 또는 통합에 관여하는 서열과 같은 추가적인 기능적 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 서열은 문헌에서 보고되어 있고 당업자가 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명은 또한
(i) 본 발명에 따른 폭스바이러스를 세포내로 도입하는 단계,
(ii) 상기 폭스바이러스가 제조될 수 있게 하기에 적절한 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및
(iii) 상기 폭스바이러스를 세포 배양물로부터 회수하는 단계
의, 본 발명에 따른 폭스바이러스의 제조 방법에 관한 것이다.
폭스 바이러스가 당연히 배양 상등액으로부터 회수될 수 있지만, 이는 또한 세포로부터 회수될 수도 있다. 통상적으로 이용되는 방법 중 하나는 용균 상등액에서 비리온을 수집하기 위한 연속적인 동결/해동 주기에 의한 세포 분해에 있다. 비리온은 그다음 당업계의 기술 (크로마토그래피 방법, 특히 염화세슘 구배를 통한 초원심분리 방법 등)을 사용하여 증폭 및 정제될 수 있다.
본 발명은 또한 제약학상 허용가능한 부형제와 함께 본 발명에 따른 폭스바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 보다 구체적으로 유전자 치료로 질환들을 예방적 또는 치유적으로 치료하려는 의도이고 보다 구체적으로 증식성 질환 (암, 종양, 재발협착증 등)을 목적으로 하거나 또는 증가된 파골세포 활성 관련 질환 (예를 들어 류마티스성 관절염, 골다공증)을 목적으로 한다.
본 발명에 따른 조성물은 종래적으로 이를 국소적으로, 비경구적으로 또는 소화 경로로 투여할 목적으로 제조될 수 있다. 특히, 본 발명의 재조합 벡터 또는 폭스바이러스의 치료유효량은 제약학상 허용가능한 부형제와 병용된다. 수많은 투여 경로의 고안이 가능하다. 언급될 수 있는 예는 위내, 피하, 심장내, 근육내, 정맥내, 복강내, 종양내, 비측, 폐내 및 기관내 경로이다. 상기 후자의 세 실시양태의 경우, 에어로졸에 의하여 또는 점적주입(법)에 의하여 투여가 실시되는 것이 유리하다. 투여는 단일 투여로 또는 특정한 시간 간격 후 1회 이상 반복되는 투여로 실시될 수 있다. 적절한 투여 경로 및 투여량은 각종 변수, 예를 들어 개인, 치료될 환자 또는 전이될 관심 유전자(들)에 따라 차이가 난다. 본 발명에 따른 바이러스(성) 입자에 기초한 제제는 104 및 1014 pfu (플라크-형성 단위), 유리하게 105 및 1013 pfu, 바람직하게 106 및 1012 pfu, 보다 바람직하게 106 및 107 사이의 투여량의 형태로 제제화될 수 있다.
조성물은 또한 제약학적 관점에서 허용가능한 희석제, 아쥬반트 또는 부형제, 및 가용화제, 안정화제 및 방부제들을 포함할 수 있다. 주사제 투여의 경우, 수성, 비수성 또는 등장성 용액내 제제가 바람직하다. 이는 적절한 희석제를 사용하여 사용 당시에 재구성될 수 있는 액체 또는 건조 (산제, 동결건조물 등) 형태로, 단일 투여로 또는 다중 투여로 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 치료에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료를 의도로 하는 약제 제조에 대한 본 발명에 따른 폭스바이러스 또는 조성물의 용도에 관한 것이다. 이러한 약제는 (예를 들어 정맥내 주사로, 접근가능한 종양내로, 에어로졸로 폐내로, 적절한 카테터를 사용하여 혈관계내로 등) 생체내 직접 투여될 수 있다. 바람직한 용도는 원치않는 세포 증식으로써 야기되는 암, 종양 및 질환의 치료 또는 예방에 있다. 언급될 수 있는 가능한 용도는 유방암, 자궁암 (특히 유두종 바이러스에 의하여 유발되는 것들), 전립선암 , 폐암, 방광암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 식도암, 후두암, 중추신경계암 (예를 들어 교아세포종) 및 혈액암 (림프종, 백혈병 등)이다. 다른 바람직한 용도는 류마티스성 관절염, 골다공증 및 증가된 파골세포 활성과 관련된 다른 질환들의 치료 또는 예방에 있다. 이는 또한 예를 들어 혈관벽의 평활근 세포들의 증식 (재발협착증)을 억제 또는 지연시키기 위하여 심혈관 질환과 관련하여 사용될 수 있다. 마지막으로 감염성 질환의 경우, AIDS에 적용되는 약제를 생각하는 것이 가능하다.
본 발명의 폭스바이러스, 조성물 또는 방법이 암의 치료에 사용될 때, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 구체적으로 종양 세포를 표적화할 수 있기 때문에 바람직한 투여 경로는 전신 경로이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폭스바이러스, 조성물을 이러한 치료를 요하는 숙주 유기체 또는 세포에 투여하는 것을 특징으로 하는 질환 치료 방법을 포함한다.
유리한 실시양태에 따르면, 치료 용도 또는 치료 방법은 또한 제약학상 허용가능한 양의 전구약물, 유리하게 시토신의 유사체, 특히 5-FC를 숙주 유기체 또는 세포에 투여하는 추가적 단계를 포함한다. 예시로써, 50 내지 500 mg/kg/일의 투여량, 바람직하게는 200 mg/kg/일 또는 100 mg/kg/일의 투여량을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명과 관련하여, 상기 전구약물은 표준 관행에 따라 (예를 들어 경구적으로, 또는 전신적으로) 투여된다.
바람직하게, 투여는 본 발명에 따른 치료제의 투여에 뒤이어, 바람직하게는 치료제의 투여로부터 3일 이상, 보다 바람직하게 4일 이상 및 보다 더 바람직하게 5일 이상 후에 실시된다. 본 발명의 보다 더 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 전구약물의 투여는 치료제의 투여로부터 7일 후에 실시된다. 경구 경로가 바람직하다. 전구약물의 단일 투여량 또는 숙주 유기체 또는 세포내 독성 대사물질이 생성되게 하도록 충분히 긴 시간 동안 반복되는 투여량의 투여가 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 5-FU의 세포독성 효과를 강화시키는 하나 이상의 물질과 병용될 수 있다. 특히, 피리미딘의 신생합성 (de novo biosynthesis)의 경로의 효소를 억제하는 약물 (예를 들어 하기에 언급된 것들), 5-FU의 대사의 생성물 (5-FdUMP)의 존재하에 티미딜레이트 신타제의 억제를 증가시켜 복제에 필요한 dTMP의 풀의 감소를 유발하는 류코보린(Leucovorin)과 같은 약물 (문헌 [Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692] 참조), 및 마지막으로 디히드로폴레이트 리덕타제를 억제시키고 PRPP (포스포리보실피로포스페이트)의 풀을 증가시킴으로써 세포 RNA내로의 5-FU의 혼입의 증가를 유발하는 메토트렉세이트와 같은 약물 (문헌 [Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137] 참조)을 언급할 수 있다.
본 발명에 따르면, 피리미딘의 신생합성의 경로의 효소를 억제하는 약물은 바람직하게 PALA (N-(포스포노아세틸)-L-아스파르테이트; 문헌 [Moore et al., 1982, Biochem. Pharmacol. 31, 3317-3321] 참조), 레플루노미드(Leflunomide), A771726 (레플루노미드의 활성 대사물질; 문헌 [Davis et al ., 1996, Biochem. 35, 1270-1273] 참조) 및 브레퀴나르(Brequinar) (문헌 [Chen et al ., 1992, Cancer Res. 52, 3251-3257] 참조)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 항암 요법에 효과적인 하나 이상의 물질과 병용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물과 관련하여 또는 병용하여 사용될 수 있는 항암 요법에 효과적인 제약 물질들 중, 예를 들어, 마이토마이신 C, 시클로포스파미드, 부술판, 이포스파미드, 이소스파미드, 멜팔란, 헥사메틸멜라민, 티오테파, 클로람부실, 또는 다카르바진과 같은 알킬화제; 예를 들어, 젬시타빈, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 2-플루오로데옥시 시티딘, 메토트렉세이트, 아이다트렉세이트, 토무덱스 또는 트리메트렉세이트와 같은 항대사물질; 예를 들어, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 테니포시드 또는 미토잔트론과 같은 토포이소머라제 II 억제제; 예를 들어, 이리노테칸 (CPT-11), 7-에틸-10-히드록시-캄프토테신 (SN-38) 또는 토포테칸과 같은 토포이소머라제 I 억제제; 예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈과 같은 세포분열 저지성의 약물; 및 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 스피로플라티넘 또는 카르보플라티넘과 같은 백금 유도체를 언급할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 또한 방사선요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 또한 예를 들어 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터루킨 (특히 IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12) 또는 종양 괴사 인자와 같은 면역조정제; 예를 들어 표피 성장 인자 수용체의 억제제 (특히 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 제피티닙, 에를로티닙 또는 라파티닙) 또는 인간 표피 성장 인자 수용체-2의 억제제 (특히 트라스투주맙)와 같은 세포 표면 수용체의 조절에 영향을 주는 약제; 및 예를 들어 혈관 내피 성장 인자의 억제제 (특히 베바시주맙 또는 라니비주맙)와 같은 혈관형성에 영향을 주는 약제를 포함하나 이로 제한되지는 않는 다른 약제들 중 하나 이상과 조합하여 사용될 수 있다.
도 1. 백시니아 바이러스 감염된 인간 직장결장의 종양 세포 (LoVo)의 5-FC에 대한 시험관내 감응성. 표시된 바이러스 (모의 (●) VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (△))로 0.0001의 MOI에서 감염된 LoVo 세포를 다양한 농도의 5-FC에 노출시켰다. 감염 5일 후 세포 생존을 측정하였다. 결과를 약물의 존재 또는 부재하에서의 세포 생존율의 백분율로 표현하였다. 값들은 바이러스의 복제로 인한 세포 사망률 없이 세개의 개별 측정의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 2. 백시니아 바이러스 감염된 인간 직장결장의 종양 세포 (LoVo)의 5-FC에 대한 시험관내 감응성. 표시된 바이러스 (모의 (●) VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-F4L-/FCU1 (◇))로 0.0001의 MOI에서 감염된 LoVo 세포를 다양한 농도의 5-FC에 노출시켰다. 감염 5일 후 세포 생존을 측정하였다. 결과를 약물의 존재 또는 부재하에서의 세포 생존율의 백분율로 표현하였다. 값들은 바이러스의 복제로 인한 세포 사망률 없이 세개의 개별 측정의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 3. 감염 후 5일째, 표시된 바이러스로 0.0001의 MOI에서 감염된 LoVo에서 VVTK-/FCU1 및 VVTK-I4L-/FCU1의 시험관내 복제 효율. 값들은 세개의 개별 측정의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 4. 감염 후 5일째, 표시된 바이러스로 0.0001의 MOI에서 감염된 LoVo에서 VVTK-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1의 시험관내 복제 효율. 값들은 세개의 개별 측정의 평균 ± SD로 나타나있다.
도 5. 바이러스의 정맥내 주사 후 스위스 무모 마우스에서 s.c LoVo의 평균 종양 체적 ± SEM. 종양 (촉진성 종양)의 접종으로부터 7일 후, 마우스를 107 pfu의 완충액 + 염수 (◇), 완충액 + 5-FC (◆), VVTK-I4L-/FCU1 + 염수 (△) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (▲)으로 치료하였다. 동물들을 3주 동안 바이러스 주사로부터 7일 후, 경구 가바즈로 1일 2회 100 mg/kg/j에서 염수 또는 5-FC로 치료하였다. 종양 체적을 주 2회 측정하였다.
도 6. 바이러스의 정맥내 주사 후 스위스 무모 마우스에서 s.c LoVo의 평균 종양 체적 ± SEM. 종양 (촉진성 종양)의 접종으로부터 7일 후, 마우스를 107 pfu의 완충액 + 염수 (◇), 완충액 + 5-FC (◆), VVTK-F4L-/FCU1 + 염수 (□) 또는 VVTK-F4L-/FCU1 + 5-FC (■)으로 치료하였다. 동물들을 3주 동안 바이러스 주사로부터 7일 후, 경구 가바즈로 1일 2회 100 mg/kg/j에서 염수 또는 5-FC로 치료하였다. 종양 체적을 주 2회 측정하였다.
도 7. 바이러스의 정맥내 주사 후 스위스 무모 마우스에서 s.c LoVo의 평균 종양 체적 ± SEM. 종양 (촉진성 종양)의 접종으로부터 11일 후, 마우스를 완충액 + H2O (◇), 또는 완충액 + 5-FC (◆), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H2O의 1회 주사 (○), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 1회 주사 (바이러스 주사로부터 7일 후 및 3주 동안 5-FC 투여) (●), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H2O의 2회 주사 (11일째 및 33일째) (□), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 2회 주사 (11일째 및 33일째) (18일째로부터 32일째까지 및 40일째로부터 54일째까지 5-FC 투여) (■)로 치료하였다. 동물들을 경구 가바즈로 1일 2회 100 mg/kg에서 5-FC로 치료하였다. 종양 체적을 주 2회 측정하였다.
도 8. 바이러스의 정맥내 주사 후 스위스 무모 마우스에서 s.c U87-MG (교아세포종 종양 세포)의 평균 종양 체적 ± SEM. 종양 (촉진성 종양)의 접종으로부터 11일 후, 마우스를 완충액 + H2O (◇), 또는 완충액 + 5-FC (◆), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H2O (○), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC (●)으로 치료하였다. 동물들을 바이러스 주사로부터 7일 후 및 3주 동안, 경구 가바즈로 1일 2회 100 mg/kg에서 5-FC로 치료하였다. 종양 체적을 주 2회 측정하였다.
도 9. 분할 세포내 대 전면 세포내의 바이러스 수율 비율. PANC1 (췌장 인간 종양), H1299 (폐 인간 종양) 또는 U118MG (신경교종 인간 종양) 세포를 100 pfu의 (■) VVTK-/FCU1 또는 (□) VVTK-I4L-/FCU1로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 바이러스 역가를 구하였다. 값들은 분할 세포내 대 전면 세포내의 바이러스의 수율간의 비율이다.
도 10. 분할 세포내 대 전면 세포내의 바이러스 수율 비율. PANC1 (췌장 인간 종양), H1299 (폐 인간 종양) 또는 U118MG (신경교종 인간 종양) 세포를 100 pfu의 (■) VVTK-/FCU1 또는 (□) VVTK-F4L-/FCU1로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 바이러스 역가를 구하였다. 값들은 분할 세포내 대 전면 세포내의 바이러스의 수율간의 비율이다.
도 11. 1x106 PFU의 VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (□)으로 피하 인간 종양을 보유하는 스위스 무모 마우스내로 정맥내 감염 후 6일째 및 21일째 기관 또는 종양에서의 바이러스 역가 (pfu/mg의 조직).
도 12. 1x106 PFU의 VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-F4L-/FCU1 (□)으로 피하 인간 종양을 보유하는 스위스 무모 마우스내로 정맥내 감염 후 6일째 및 21일째 기관 또는 종양에서의 바이러스 역가 (pfu/mg의 조직).
도 13. 정맥내 주사로 1x108 pfu의 VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (○)로의 치료 후 스위스 무모 마우스의 생존.
도 14. 정맥내 주사로 1x107 pfu (A) 또는 1x108 pfu (B)의 VVTK-/FCU1 (■) 또는 VVTK-I4L-/FCU1 (◇)로의 치료 후 면역적격 B6D2 마우스의 생존.
도 15. 감염 후 13일째 및 감염 후 34일째 스위스 무모 마우스내 1x106 pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-I4L-/FCU1의 정맥내 주사 후 꼬리상 두진의 평균량.
도 16. 감염 후 13일째 및 감염 후 34일째 스위스 무모 마우스내 1x106 pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1의 정맥내 주사 후 꼬리상 두진의 평균량.
도 17. 감염 후 15일째 및 감염 후 31일째 스위스 무모 마우스내 1x107 pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-I4L-/FCU1의 정맥내 주사 후 꼬리상 두진의 평균량.
도 18. 감염 후 15일째 및 감염 후 31일째 스위스 무모 마우스내 1x107 pfu VVTK-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1의 정맥내 주사 후 꼬리상 두진의 평균량.
실시예
벡터 플라스미드의 구축
I4L의 결실을 위한 셔틀 플라스미드를 백시니아 합성 프로모터 p11K7.5의 제어하에 FCU1 유전자를 발현하고 티미딘 키나제 유전자가 결실된 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐 (기탁 번호 M35027)의 DNA를 사용하여 구축하였다. I4L의 DNA 플랭킹 영역을 PCR로 증폭하였다. I4L의 하류 플랭킹 영역의 프라이머는 5’- TCC CCC GGG TTA ACC ACT GCA TGA TGT ACA - 3’(서열 확인번호 7; SmaI 부위 밑줄침) 및 5’- GCC GAG CTC GAG GTA GCC GTT TGT AAT TCT - 3’(서열 확인번호 8; SacI 부위 밑줄침)이었다. 상류 영역의 프라이머는 5’- GCC TGG CCA TAA CTC CAG GCC GTT - 3’(서열 확인번호 9; MscI 부위 밑줄침) 및 5’- GCC CAG CTG ATC GAG CCG TAA CGA TTT TCA - 3’(서열 확인번호 10; PvuII 부위 밑줄침)이었다. 증폭된 DNA 단편들을 제한 효소 SmaI/SacI 또는 MscI / PvuII로 소화시키고 PpolyIII 플라스미드의 상응 부위내로 라이게이션시켰다. I4L의 하류 플랭킹 영역의 반복 영역을 프라이머 5’- GCC GCA TGC ATC CTT GAA CAC CAA TAC CGA - 3’(서열 확인번호 11; SphI 부위 밑줄침) 및 5’- GCT CTA GAG AGG TAG CCG TTT GTA ATC TG - 3’(서열 확인번호 12; XbaI 부위 밑줄침)을 사용하여 PCR로 증폭시켰고 PpolyIII 플라스미드에 삽입하였다. 이러한 반복 영역을 사용하여 결실된 바이러스의 제조 동안 선택 카세트를 제거한다. pH5R 백시니아 프로모터의 제어하에 GFP/GPT 융합 유전자에 상응하는 선택 카세트를 PpolyIII 플라스미드의 SacI / SphI 부위내로 삽입하였다. 얻어진 플라스미드는 I4L 유전자의 결실을 위하여 pΔI4L이라 명명된 재조합 셔틀 플라스미드이다.
F4L의 결실을 위한 셔틀 플라스미드를 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐 (기탁 번호 M35027)의 DNA를 사용하여 제조하였다. F4L의 DNA 플랭킹 영역을 PCR로 증폭하였다. F4L의 하류 플랭킹 영역의 프라이머는 5’- CGC GGA TCC TTT GGT ACA GTC TAG TAT CCA - 3’(서열 확인번호 13; BamHI 부위 밑줄침) 및 5’- TCC CCC GGG TTA TAA CAG ATG CAG TAT CCA - 3’(서열 확인번호 14; SmaI 부위 밑줄침)이었다. 상류 영역의 프라이머는 5’- GCC CAG CTG TTC AAT GGC CAT CTG AAA TCC - 3’(서열 확인번호 15; PvuII 부위 밑줄침) 및 5’- GAA GAT CTA GTA TCG CAT CTA AAA GAT GG - 3’ (서열 확인번호 16; BglII 부위 밑줄침)이었다. 증폭된 DNA 단편들을 제한 효소 BamHI/SmaI 또는 BglII / PvuII로 소화시키고 PpolyIII 플라스미드의 상응 부위내로 라이게이션시켰다. I4L의 하류 플랭킹 영역의 반복 영역을 프라이머 5’- GCC GAG CTC ACC CAC ACG TTT TTC GAA AAA - 3’(서열 확인번호 17; SacI 부위 밑줄침) 및 5’- GCC GCA TGC TTA TAA CAG ATG CAG TAT CAA - 3’(서열 확인번호 18; SphI 부위 밑줄침)을 사용하여 PCR로 증폭시켰고 PpolyIII 플라스미드에 삽입하였다. 이러한 반복 영역을 사용하여 결실된 바이러스의 제조 동안 선택 카세트를 제거한다. pH5R 백시니아 프로모터의 제어하에 GFP/GPT 융합 유전자에 상응하는 선택 카세트를 PpolyIII 플라스미드의 SacI / SmaI 부위내로 삽입하였다. 얻어진 플라스미드는 F4L 유전자의 결실을 위하여 pΔF4L이라 명명된 재조합 셔틀 플라스미드이다.
재조합 백시니아 바이러스의 생성
CEF 세포들을 0.1의 MOI에서 VVTK-FCU1 (백시니아 바이러스, J2R 키나제 유전자 결손, 합성 프로모터 p11k7.5의 제어하에 FCU1 유전자 발현) 균주 코펜하겐으로 감염시키고 2시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 후, 그다음 재조합 셔틀 플라스미드의 CaCl2 공통침전물 (0.2 ㎍)로 형질감염시켰다. 상기 세포들을 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 그다음 나타나는 바이러스의 희석을 사용하여 최종 농도 15 ㎍/ml의 히포크산틴 최종 농도 250 ㎍/ml의 크산틴 및 최종 농도 250 ㎍/ml의 마이코페놀산을 함유하는 선택 배지에서 CEF 세포들을 감염시켰다. 형광 (GFP) 및 양성 (GPT 선택) 플라크를 단리시켰고 GPT 선택 배지의 존재하에 여러 라운드의 CEF 세포들의 선택을 위하여 선택하였다. VVTK-FCU1의 존재 또는 부재를 결실 영역 내부 프라이머와 함께 40회 주기의 PCR로 구하였다. 모바이러스의 제거 후, 이중 결실된 바이러스를 사용하여 선택 카세트를 제거하기 위하여 GPT 선택 배지 없이 CEF를 감염시켰다. 비형광 플라크를 단리시켰고 CEF에서 2회 주기를 위하여 선택하였다. 최종 재조합 VV 바이러스를 CEF에서 증폭시켰고, 정제하였으며 바이러스 스톡을 플라크 분석으로 CEF상에서 적정하였다.
5-FC에 대한 시험관내 세포 감응성
인간 종양 세포들을 0.0001의 MOI에서 각각의 재조합 VV로 형질도입하였다. 총 3 x 105 세포/웰을 다양한 농도의 5-FC를 함유하는 배지 2ml의 6-웰 배양 디쉬에 도말하였다. 세포들을 그다음 5일 동안 37 ℃에서 배양하였고, 트리판 블루 배제로 생존 세포들을 계수하였다. 도 1, 2, 3 및 4에 도시된 결과들은 I4L 및 J2R 유전자 결손 바이러스에서보다 또는 F4L 및 J2R 유전자 결손 바이러스에서보다 J2R 유전자 결손 바이러스에서 FCU1 활성이 동등하다는 것을 보여준다.
배양된 세포에서의 시험관내 복제.
분할 또는 전면 세포들을 100 PFU의 바이러스 (거의 MOI 0.0005)에서, 6-웰 플라크내 감염시켰다. 분할 세포에 대하여 10 % FCS로 보충되거나 전면 세포에 대하여는 보충이 되지않은 2 mL의 배지를 첨가하였다. 세포들을 감염 48시간 후 수거하였다. 이러한 세포들을 -20 ℃에서 저장하였고 초음파 처리하여 바이러스를 방출시켰으며, 바이러스를 또한 CEF 세포상 플라크 적정으로 정량화하였다. 분할 세포 및 전면 세포에서의 복제간 비율은 모든 세포들에서 유사하였다. 바이러스 VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 양자 모두 전면 세포에서보다 분할 세포에서 더많이 복제한다.
복제 바이러스 특이성에 대한 분석의 간접적 수단으로서, 분할 대 전면 종양 세포 (췌장 인간 종양 PANC1; 폐 인간 종양 H1299; 신경교종 인간 종양 U118MG)에서 제조된 바이러스의 수율을 구하였다. 전면 세포들을 1x106 세포/웰에서 도말하였고 7일 동안 완전 배지에서 배양하였으며 그다음 감염 하루 전 세포들을 세척하였고 혈청이 없는 배지에서 배양하였다. 분할 세포들은 감염 하루 전 3x105 세포/웰에서 도말하였다. 세포 분할 정도를 평가하기 위하여, 핵산으로 혼입된 적정된 티미딘의 양을 세포의 도말로부터 5시간, 24시간 및 48시간 후 측정하였다. 이 기간 동안, 전면 세포에서 티미딘 혼입은 비교적으로 일정하였으나 분할 세포에서는 시간이 지남에 따라 혼입의 증가가 관찰되었다. 그다음 상기 세포들을 100 pfu의 바이러스로 감염시켰고, 감염 48시간 후 분할 종양 세포에서 및 전면 종양 세포에서 제조된 바이러스의 수율간 비율을 CEF상 플라크 적정으로 구하였다. 도 9 및 도 10에 도시된 결과는 바이러스 VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 모두 전면 세포에서보다 분할 세포에서 더많이 복제한다는 것을 보여준다. 도 9 및 10에 도시된 결과는 게다가 VVTK-/FCU1와 비교하여 바이러스 VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 양자에 대하여 다른 모든 세포의 종류에서 비율의 증가를 보여준다. 다른 모든 세포의 종류에서 이러한 비율의 증가는 전면 세포에서 바이러스 VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 모두의 보다 낮은 복제에 기인한다. 이러한 결과들은 VVTK-/FCU1과 비교하여 바이러스 VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 모두가 분할 세포에 대하여 증가된 특이성을 보인다는 것을 입증한다.
피하 종양 모델.
스위스 무모 암컷 마우스를 찰스 리버 레버라토리스(Charles River Laboratories)로부터 입수하였다. 연구에 사용된 동물들은 연령에서 균일하였고 (6주) 신체 중량은 23 내지 26 g이었다. 5x106 LoVo 세포를 스위스 무모 마우스의 측복부에 피하로 주사하였다. 종양이 50 내지 70 ㎣의 직경에 도달하였을 때, 상기 마우스들을 맹검 방식으로 무작위화하여 생체내 실험을 위하여 표시된 벡터로 처리하였다.
바이러스의 생체내 분포
다양한 바이러스의 존재를 종양 및 기관 샘플에서 바이러스 적정에 의해 평가하였다. 1x106 PFU의 VV-FCU1 또는 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1을 확립된 s.c. LoVo 종양을 보유하는 무모 마우스내로 꼬리 정맥 주사에 의해 정맥내로 (i.v.) 주사하였다. 마우스들을 표시된 시점들에서 희생시켰고, 종양 및 다른 기관들을 수집 및 칭량하였다. 종양 및 기관들을 PBS에서 균질화하였고 역가를 전술한 바와 같이 CEF상에서 구하였다. 바이러스 역가를 조직의 밀리그램으로 표준화하였다. 바이러스 역가를 조직의 밀리그램으로 표준화하였다. 표 2, 3, 4 및 5 (바이러스 역가의 범위는 pfu/mg의 조직으로 나타남)에 도시된 결과는 14일 후 본 발명에 따른 바이러스가 종양에서 대부분 발견된다는 것을 보여준다. 도 11 및 12에 도시된 결과는 바이러스 VVTK-/FCU1, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 모두가 분석된 다른 기관 (VVTK-/FCU1의 경우 꼬리는 제외)에서보다 종양에서 약 1000 내지 10000배 더많은 바이러스로 종양을 표적화한다는 것을 보여준다. 6일째 소량의 VVTK-/FCU1가 폐, 비장, 신장 및 림프절에서 검출되었고 (10 pfu/mg 미만) 피부, 꼬리 및 골수에서 보다 많이 검출되었으며, 21일째 피부 및 꼬리에서 보다 많이 검출되었다. 반대로, VVTK-I4L-/FCU1 및 VVTK-F4L-/FCU1 모두는 6일째 오직 소량만이 림프절 및 꼬리에 있고 21일째 오로지 종양에만 있어 보다 높은 종양 특이성을 가진다.
종양 폐 비장 신장 림프절 심장
VVTK-/FCU1 (0,2-3,3)
x105 		0.1-2 0-2.2 0-1.8 0-61 0-0.3
VVTK-I4L/FCU1 25.6-2.2
x105 		0-0.1 측정되지 않음 0-1 측정되지 않음 측정되지 않음
난소 피부 꼬리 골수 뇌 근육
VVTK-/FCU1 2.2-74 0.1-24 13.5-7.104 0-800 0-1.8 0-22
VVTK-I4L/FCU1 0-102 측정되지 않음 26,3 측정되지 않음 측정되지 않음 측정되지 않음
종양 폐 비장 신장 림프절 난소
VVTK-/FCU1 (0,2-3,3)x105 0.1-2 0-2.2 0-1.8 0-61 2.2-74
VVTK-F4L/FCU1 51.8-3.8x104 측정되지 않음 측정되지 않음 측정되지 않음 0-2.1 측정되지 않음
꼬리 골수 장 뇌 근육 심장
VVTK-/FCU1 13.5-7.104 0-800 측정되지 않음 0-1.8 0-22 0-0.3
VVTK-F4L/FCU1 0-7.9 측정되지 않음 측정되지 않음 측정되지 않음 측정되지 않음 측정되지 않음
s.c 종양 모델에서 본 발명의 폭스바이러스의 항종양 활성
확립된 s.c LoVo 종양 (50 내지 70 ㎣)을 보유하는 무모 마우스를 1회 정맥내 (꼬리 정맥으로) 각각 1.107 PFU의 투여량에서 표시된 벡터로 치료하였다. 바이러스 주사 후 7일째를 시작으로, 5-FC를 100 mg/kg (0.5 ml 5-FC 물 중 0.5 %)에서 경구 가바즈로 3주 동안 1일 2회 주었다. 종양 크기를 캘리퍼(caliper)를 사용하여 주 2회 측정하였다. 종양 체적을 공식 (p/6) (길이 x 넓이2)을 사용하여 ㎣로 계산하였다. 도 5 및 6에 도시된 결과는 다양한 바이러스가 종양의 성장을 제어할 수 있는 온콜리틱 활성 (p<0.05), 및 추가적으로 종양 성장의 제어를 개선시킬 수 있는 5-FC의 투여와 함께 조합된 활성 (바이러스의 온콜리틱 및 FCU1 유전자의 치료적) (p<0.01)에 대하여 유사한 효능을 가진다는 것을 보여준다.
확립된 s.c LoVo 종양 (50 내지 70 ㎣)을 보유하는 무모 마우스를 또한 하기에 따라 1.107 PFU의 투여량에서 표시된 벡터로 정맥내 (꼬리 정맥으로) 치료하였다: 종양 (촉진성 종양)의 접종으로부터 11일 후, 마우스를 완충액 + H2O, 또는 완충액 + 5-FC, 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H2O 1회 주사, 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC 1회 주사 (바이러스 주사로부터 7일 후 및 3주 동안 5-FC 투여), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H2O 2회 주사 (11일째 및 33일째), 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC 2회 주사 (11일째 및 33일째) (18일째로부터 32일째까지 및 40일째로부터 54일째까지 5-FC 투여)로 처리하였다. 동물들을 경구 가바즈로 1일 2회 100 mg/kg에서 5-FC로 치료하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 주 2회 측정하였다. 종양 체적을 공식 (p/6) (길이 x 넓이2)을 사용하여 ㎣로 계산하였다. 도 7에 도시된 결과는 1회 또는 2회 주사 후 바이러스 단독으로 항종양 활성이 없음을 보여준다. 5-FC 치료의 추가는 50일째까지 비히클 그룹 및 바이러스 단독 (5-FC 없이)과 비교시 통계적으로 의미있는 종양 성장의 억제 (p<0.05)를 보인다. 1회 단일 주사와 마찬가지로, VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC의 2회 정맥내 주사는 비히클 그룹 및 바이러스 단독 (5-FC 없이) 2회 주사와 비교시 의미있는 항종양 활성 (p<0.05)을 입증한다. 더욱이, 5-FC 치료와 조합된 바이러스의 1회 및 2회 주사간 56일째로부터 종양 발전에서 의미있는 차이가 관찰된다 (p<0.05).
확립된 s.c U87-MG (교아세포종 종양 세포)을 보유하는 무모 마우스를 하기에 따라 1.107 PFU의 투여량에서 표시된 벡터로 정맥내 (꼬리 정맥으로) 치료하였다: 종양 (촉진성 종양)의 접종으로부터 11일 후, 마우스를 완충액 + H2O, 또는 완충액 + 5-FC, 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + H2O, 또는 107 pfu의 VVTK-I4L-/FCU1 + 5-FC으로 처리하였다. 동물들을 바이러스 주사로부터 7일 후 및 3주 동안, 경구 가바즈로 1일 2회 100 mg/kg에서 5-FC로 치료하였다. 종양 크기를 캘리퍼를 사용하여 주 2회 측정하였다. 종양 체적을 공식 (π/6) (길이 x 넓이2)을 사용하여 ㎣로 계산하였다. 도 8에 도시된 결과는 강한 항종양 활성을 야기시키는 U87-MG 세포에서 VVTK-I4L-/FCU1의 높은 온콜리틱 활성을 보여준다 (p<0.0001). 경구 가바즈에 의한, 5-FC의 추가와 조합된 활성은 유사한 활성을 야기시킨다 (p<0.0001).
바이러스의 병원성
바이러스의 병원성을 스위스 무모 마우스 (도 13) 및 면역적격 B6D2 마우스 (찰스 리버스로부터 6주) (도 14) 양자 모두에서 실행된 생존 연구로 평가하였다. 마우스들을 마우스 당 100 ㎕의 완충액내 1.107 또는 1.108 PFU의 모든 VVTK-/FCU1 및 VVTK-I4L-/FCU1으로 정맥내 주사하였다. 마우스들을 실험이 진행되는 동안에 걸쳐 매일 관찰하였다. 스위스 무모 마우스에서 (도 13), 1x108 PFU의 VVTK-/FCU1의 주사는 감염 3일 후 동물들의 40 %의 죽음을 야기하였다. 남은 마우스들은 감염 후 50일 내지 80일째 사이에서 죽었다. VVTK-I4L-/FCU1의 투여는 병원성이 보다 낮았으며, 대부분의 동물들이 65 내지 140일째 사이에서 죽었다 (p<0.01). 107 pfu에서 두 바이러스에 대하여 어떠한 독성의 증거도 관찰되지 않았다 (도 14 (A)). 108 pfu의 VVTK-/FCU1 정맥내 주사 후 모든 마우스들이 죽었다 (도 14 (B)). VVTK-I4L-/FCU1 처리된 군이 VVTK-/FCU1 감염된 마우스들과 비교하여 70 %로 상당히 연장된 생존율을 가졌다 (도 14 (B)). 따라서, 이러한 결과는 이중-결실된 바이러스 VVTK-I4L-/FCU1에 의한 독성의 감소를 입증한다.
두진 꼬리 병변 모델.
스위스 무모 마우스를 1.106 (도 15 및 16) 또는 1.107 PFU (도 17 및 18)의 각 바이러스로 정맥내 주사하였다. 꼬리 병변을 주 1회 기록하였다. 도 15 (A) 및 16 (A)에서 나타난 바와 같이 감염 후 13일째 (p<0.001)에 1.106 PFU의 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1가 주사된 마우스는 1 두진/마우스 미만을 가지고 이와 비교하여 VVTK-/FCU1가 주사된 마우스는 평균 8 두진/마우스를 가진다. 감염 후 34일째에는 도 15 (B) 및 도 16 (B)에서 나타난 바와 같이 VVTK-/FCU1에서는 평균 4 두진, 이와 비교하여 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1에 대하여는 거의 1로 (p<0.0001) 결과가 유사하다. 감염 후 15일째에 1.107 PFU의VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1가 주사된 마우스는 각각 평균 3 두진/마우스 및 2 두진/마우스를 가지며 이와 비교하여 1.107 PFU의 VVTK-/FCU1가 주사된 마우스는 평균 10 두진/마우스를 가진다 (도 17 (A) 및 18 (A)). 감염 후 31일째 VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1가 주사된 마우스는 각각 평균 1,5 두진/마우스 및 2 두진/마우스를 가지며 이와 비교하여 VVTK-/FCU1가 주사된 마우스는 평균 7 두진/마우스를 가진다 (도 17 (B) 및 18 (B)). VVTK-/FCU1 및 VVTK-I4L-/FCU1와 VVTK-F4L-/FCU1간의 두진 수의 차이는 통계적으로 의미가 있다 (p<0.01). 두진 형성은 꼬리에서의 바이러스의 복제와 연관성이 있고, 이에 따라 독력 및 독성과 연관성이 있다. VVTK-I4L-/FCU1 또는 VVTK-F4L-/FCU1의 정맥내 주사가 단일 결실된 TK 바이러스의 경우 보다 독성이 낮다.
통계적 분석.
통계적 분석을 비모수 맨-휘트니 U 시험 (Mann-Whitney U test) 및 스테티스티카(STATISTICA) 7.1 소프트웨어 (StatSoft, Inc.)를 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P가 통계적으로 의미가 있다고 여겨졌다.
참고문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE SA <120> Poxviral oncolytic vectors <130> Oncolytic VV <160> 18 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 373 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derived from Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Ala Ser 145 150 155 160 Glu Pro Phe Lys Asn Val 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<210> 2 <211> 373 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derived from Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu Ala Ser 145 150 155 160 Glu Pro Phe Lys Asn Val Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Asn Gln Leu Leu 165 170 175 Gly Leu Tyr Thr Ile Ile Ser Asn Lys Asn Thr Thr Arg Pro Asp Phe 180 185 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Ser Gly Ala 420 425 430 Asn Gly Val Met Ala Lys Ile Val Glu Val Lys His Pro Leu Val Lys 435 440 445 His Lys Leu Gly Leu Met Arg Glu Gln Asp Ile Ser Thr Lys Arg Phe 450 455 460 Arg Glu Leu Ala Ser Glu Val Gly Ser Leu Leu Thr Tyr Glu Ala Thr 465 470 475 480 Ala Asp Leu Glu Thr Glu Lys Val Thr Ile Glu Gly Trp Asn Gly Pro 485 490 495 Val Glu Ile Asp Gln Ile Lys Gly Lys Lys Ile Thr Val Val Pro Ile 500 505 510 Leu Arg Ala Gly Leu Gly Met Met Asp Gly Val Leu Glu Asn Val Pro 515 520 525 Ser Ala Arg Ile Ser Val Val Gly Met Tyr Arg Asn Glu Glu Thr Leu 530 535 540 Glu Pro Val Pro Tyr Phe Gln Lys Leu Val Ser Asn Ile Asp Glu Arg 545 550 555 560 Met Ala Leu Ile Val Asp Pro Met Leu Ala Thr Gly Gly Ser Val Ile 565 570 575 Ala Thr Ile Asp Leu Leu Lys Lys Ala Gly Cys Ser Ser Ile Lys Val 580 585 590 Leu Val Leu Val Ala Ala Pro Glu Gly Ile Ala Ala Leu Glu Lys Ala 595 600 605 His Pro Asp Val Glu Leu Tyr Thr Ala Ser Ile Asp Gln Gly Leu Asn 610 615 620 Glu His Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Leu Gly Asp Ala Gly Asp Lys Ile 625 630 635 640 Phe Gly Thr Lys <210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 Met Val Thr Gly Gly Met Ala Ser Lys Trp Asp Gln Lys Gly Met Asp 1 5 10 15 Ile Ala Tyr Glu Glu Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Val Pro 20 25 30 Ile Gly Gly Cys Leu Ile Asn Asn Lys Asp Gly Ser Val Leu Gly Arg 35 40 45 Gly His Asn Met Arg Phe Gln Lys Gly Ser Ala Thr Leu His Gly Glu 50 55 60 Ile Ser Thr Leu Glu Asn Cys Gly Arg Leu Glu Gly Lys Val Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Pro Cys Asp Met Cys Thr Gly 85 90 95 Ala Ile Ile Met Tyr Gly Ile Pro Arg Cys Val Val Gly Glu Asn Val 100 105 110 Asn Phe Lys Ser Lys Gly Glu Lys Tyr Leu Gln Thr Arg Gly His Glu 115 120 125 Val Val Val Val Asp Asp Glu Arg Cys Lys Lys Ile Met Lys Gln Phe 130 135 140 Ile Asp Glu Arg Pro Gln Asp Trp Phe Glu Asp Ile Gly Glu 145 150 155 <210> 5 <211> 150 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 5 Met Ala Phe Asp Asp Lys Lys Gly Leu Gln Val Ala Leu Asp Gln Ala 1 5 10 15 Lys Lys Ser Tyr Ser Glu Gly Gly Ile Pro Ile Gly Ser Cys Ile Ile 20 25 30 Ser Ser Asp Asp Thr Val Leu Gly Gln Gly His Asn Glu Arg Ile Gln 35 40 45 Lys His Ser Ala Ile Leu His Gly Glu Met Ser Ala Leu Glu Asn Ala 50 55 60 Gly Arg Leu Pro Gly Lys Thr Tyr Lys Asp Cys Thr Ile Tyr Thr Thr 65 70 75 80 Leu Ser Pro Cys Ser Met Cys Thr Gly Ala Ile Leu Leu Tyr Gly Phe 85 90 95 Lys Arg Val Val Met Gly Glu Asn Val Asn Phe Leu Gly Asn Glu Lys 100 105 110 Leu Leu Ile Glu Asn Gly Val Glu Val Val Asn Leu Asn Asp Gln Glu 115 120 125 Cys Ile Asp Leu Met Ala Lys Phe Ile Lys Glu Lys Pro Gln Asp Trp 130 135 140 Asn Glu Asp Ile Gly Glu 145 150 <210> 6 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Trp Arg Leu Thr Val Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn 1 5 10 15 Ala Gln Leu Pro Gly Lys Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu His Asp 20 25 30 Gly Lys Ile Ser Ala Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Val Thr 35 40 45 Glu Asn Ser Leu Asp Ala Glu Gln Gly Leu Val Leu Pro Pro Phe Val 50 55 60 Glu Pro His Ile His Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn 65 70 75 80 Trp Asn Gln Ser Gly Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu 85 90 95 Arg Lys Ala Leu Leu Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln 100 105 110 Thr Leu Lys Trp Gln Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His 115 120 125 Val Asp Val Ser Asp Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu 130 135 140 Val Lys Gln Glu Val Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe 145 150 155 160 Pro Gln Glu Gly Ile Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu 165 170 175 Glu Ala Leu Arg Leu Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe 180 185 190 Glu Phe Thr Arg Glu Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala 195 200 205 Leu Ala Gln Lys Tyr Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile 210 215 220 Asp Asp Glu Gln Ser Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His 225 230 235 240 Arg Glu Gly Met Gly Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met 245 250 255 His Ser Tyr Asn Gly Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys 260 265 270 Met Ser Gly Ile Asn Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu 275 280 285 Gln Gly Arg Phe Asp Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val 290 295 300 Lys Glu Met Leu Glu Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp 305 310 315 320 Val Phe Asp Pro Trp Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val 325 330 335 Leu His Met Gly Leu His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile 340 345 350 Asn Asp Gly Leu Asn Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn 355 360 365 Leu Gln Asp Tyr Gly Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile 370 375 380 Leu Pro Ala Glu Asn Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val 385 390 395 400 Arg Tyr Ser Val Arg Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala 405 410 415 Gln Thr Thr Val Tyr Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg 420 425 430 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 7 tcccccgggt taaccactgc atgatgtaca 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotides <400> 8 gccgagctcg aggtagccgt ttgtaattct 30 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> artificial 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tttcgaaaaa 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 18 gccgcatgct tataacagat gcagtatcaa 30

Claims (32)

  1. 결손 I4L 및/또는 F4L 유전자, 및 자살 유전자를 포함하는 관심 핵산을 포함하는 폭스바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 결손 J2R 유전자를 추가적으로 포함하는 폭스바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 결손 F2L 유전자를 추가적으로 포함하는 폭스바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 코르도폭스비리내 아과에 속하는 폭스바이러스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스 종에 속하는 폭스바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스 균주 코펜하겐인 폭스바이러스.
  7. 제5항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 백시니아 바이러스 균주 WR인 폭스바이러스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자살 유전자가 적어도 시토신 데아미나제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폭스바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 상기 자살 유전자가 FCY1, FCA1 또는 CodA 또는 이들의 유사체인 폭스바이러스.
  10. 제8항에 있어서, 적어도 시토신 데아미나제 활성을 가지는 상기 단백질이 서열 확인번호 2에 나타난 FCU1-8 폴리펩티드 및 이들의 유사체인 폭스바이러스.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자살 유전자가 적어도 하나의 시토신 데아미나제 및 하나의 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폭스바이러스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 자살 유전자가 서열 확인번호 3 (coda::upp), 서열 확인번호 1 (FCU1) 또는 FCY1::FUR1의 아미노산 서열에 나타난 바와 실질적으로 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폭스바이러스.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 투과효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열을 추가적으로 포함하는 폭스바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 투과효소가 S. 세레비시애의 퓨린 또는 시토신 투과효소인 폭스바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 투과효소가 FCY2 및 Fur4 및 이들의 유사체를 포함하는 군으로부터 선택된 폭스바이러스.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 관심 핵산의 발현에 필요한 요소를 추가적으로 포함하는 폭스바이러스.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 투과효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 서열의 발현에 필요한 요소를 추가적으로 포함하는 폭스바이러스.
  18. (i) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 폭스바이러스를 세포내로 도입하는 단계;
    (ii) 상기 폭스바이러스가 제조될 수 있게 하기에 적절한 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및;
    (iii) 상기 폭스바이러스를 세포 배양물로부터 회수하는 단계
    의, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 폭스바이러스의 제조 방법.
  19. 제약학상 허용가능한 부형제와 함께 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 폭스바이러스를 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 5-플루오로시토신의 세포독성 효과를 강화시키는 하나 이상의 물질과 조합된 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 5-플루오로시토신의 세포독성 효과를 강화시키는 상기 물질이 바람직하게 PALA, 레플루노미드 및 A771726으로 구성된 군으로부터 선택된, 피리미딘의 신생합성의 경로의 효소를 억제하는 약물인 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 5-플루오로시토신의 세포독성 효과를 강화시키는 상기 물질이 메토트렉세이트인 조성물.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폭스바이러스 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 약제 제조를 위한 용도.
  24. 제23항에 있어서, 암 치료를 위한 약제 제조를 위한 용도.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 폭스바이러스, 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 치료를 필요로 하는 숙주 유기체 또는 세포에 투여하는 것을 특징으로 하는 질환 치료 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 폭스바이러스 또는 조성물이 전신 경로를 통하여 투여되는 치료 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 전구약물의 제약학상 허용가능한 양이 상기 숙주 유기체 또는 세포에 투여되는 추가적 단계를 추가적으로 포함하는 치료 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 전구약물의 투여가 상기 폭스바이러스 또는 조성물의 투여로부터 바람직하게 3일 이상, 보다 바람직하게 4일 이상 및 보다 더 바람직하게 5일 이상 후에 실시되는 치료 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 전구약물의 투여가 상기 폭스바이러스 또는 조성물의 투여로부터 7일 후에 실시되는 치료 방법.
  30. 암 치료를 위한 약제 제조를 위한 결손 I4L 및/또는 F4L 유전자를 포함하는 폭스바이러스의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 상기 폭스바이러스가 관심 핵산을 추가적으로 포함하는 용도.
  32. 제31항에 있어서, 상기 관심 핵산이 치료 분자를 코딩하는 하나 이상의 관심 서열을 포함하는 용도.
KR1020107010922A 2007-11-19 2008-11-17 폭스바이러스성 온콜리틱 벡터 KR101542276B1 (ko)

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