KR20170033364A - 종양 세포 붕괴성 바이러스와 면역 체크포인트 조절제의 배합물 - Google Patents

종양 세포 붕괴성 바이러스와 면역 체크포인트 조절제의 배합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암과 같은 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 적어도 1개의 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함하는 배합물을 제공한다. 이는 또한 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스와 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 개별적인 용기에 포함하는 키트에 관한 것이기도 하다. 이는 또한 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이기도 하다.

Description

종양 세포 붕괴성 바이러스와 면역 체크포인트 조절제의 배합물{COMBINATION OF ONCOLYTIC VIRUS WITH IMMUNE CHECKPOINT MODULATORS}
본 발명은 일반적으로 종양 세포 붕괴성(oncolytic) 바이러스 요법의 분야, 보다 구체적으로 증식성 질환, 특히 암을 치료, 예방 또는 억제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구현예는 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)와 함께 암의 치료에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스를 포함한다. 구현예는 또한 이러한 성분을 포함하는 키트 및 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)와 함께 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스를 사용하는 치료 방법을 포함한다.
매년, 암은 전세계에서 1200만명 이상의 대상체에게 진단된다. 선진국에서는 5명 중 대략 1명이 암으로 사망한다. 방대한 수의 화학요법제가 존재하지만, 그들은 특히 그 질환의 매우 초기 단계에 확립되는 악성 및 전이성 종양에 대해 종종 효과가 없다. 또한, 항종양 면역은 종양 세포가 숙주 방어를 회피하기 위한 메카니즘을 진화시켰다는 사실에 기인하여 종종 효과적이지 않다. 면역 억제의 주요 메카니즘 중의 하나는 항원에 대한 만성 노출로부터 생성되고 억제성 수용체의 상향조절을 특징으로 하는 "T-세포 고갈"로서 공지된 과정이다. 이러한 억제성 수용체는 억제되지 않은 면역 반응을 예방하기 위해 면역 체크포인트의 역할을 한다. 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1) 및 이의 리간드 PD-L1 및 PD-L2, CTLA-4(세포독성 T-림프구 관련 단백질-4), LAG3(림프구-활성화 유전자 3), B 및 T 림프구 감쇠제, T-세포 면역글로불린, 뮤신 도메인 함유 단백질 3(TIM-3), 및 T 세포 활성화의 V-도메인 면역글로불린 억제제를 포함하는, T 세포 면역의 상이한 수준에서 작용하는 다양한 면역 체크포인트가 문헌에 기재되어 있다.
작용 메카니즘이 무엇이든, 이러한 면역 체크포인트는 효율적인 항종양 면역 반응의 발달을 억제할 수 있다. 종양에 대한 면역계 내성을 억제하고 따라서 고갈된 항종양 T 세포를 구조하는 수단으로서 이러한 면역 체크포인트를 차단하는 가능한 치료적 이점에 대한 관심이 증가하고 있다(참조: Leach et al., 1996, Science 271: 1734-6). 과거 수십년 동안 방대한 수의 길항제 항체가 개발되었고(예: 항 Tim3, -PD-L1, -CTLA-4, -PD1 등), 가장 중요하게는 일부가 암 환자의 객관적인 임상 반응에 관련되었다. CTLA-4를 표적화하는 항체는 전이성 흑색종을 위해 이미 시판되고 있다(예; 이필리무맙, 예르보이(Yervoy), 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb), BMS). BMS는, 이필리무맙으로 치료된 1800명의 흑색종 환자로부터 22%가 3년 후에 여전히 살아 있다고 보고했다. 항 PD-L1(예: MPDL3280A, Roche), 항 PD-1(예: 니볼루맙, BMS)에 의한 항체 요법도 또한 진행중이다.
암의 분야에서 출현되고 있는 다른 치료 접근법은 종양 세포 붕괴성 바이러스이다(참조: Hermiston, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 322-30). 종양 세포 붕괴성 바이러스는 비분열 세포(예: 정상 세포)를 손상시키지 않으면서 분열 세포(예: 암 세포)에서 선택적 복제를 할 수 있다. 감염된 분열 세포가 용해에 의해 파괴되면, 그들은 주위 분열 세포를 감염시키기 위해 새로운 감염성 바이러스 입자를 방출한다. 암 세포는, 항바이러스 인터페론 경로가 불활성화되었거나 바이러스 복제가 방해받지 않고 진행될 수 있도록 하는 종양 억제제 유전자를 돌연변이시키기 때문에 다수의 바이러스를 위한 이상적인 숙주이다(참조: Chernajovsky et al., 2006, British Med. J. 332: 170-2). 아데노 바이러스, 레오 바이러스, 홍역, 단순 포진, 뉴캐슬병 바이러스 및 백시니아를 포함하는 다수의 바이러스가 현재 종양 세포 붕괴성 제제로서 임상적으로 시험되었다.
일부 바이러스는 천연 종양 세포 붕괴성(예: 레오바이러스 및 세네카 밸리 피코르나 바이러스)인 반면, 나머지는 바이러스 게놈을 변형시킴으로 종양 선택성을 위해 유전자 조작된다. 이러한 변형은 필수 바이러스 유전자에서 기능적 결실, 바이러스 유전자 발현을 조절하기 위해 종양- 또는 조직-특이적 프로모터의 사용 및 바이러스를 암 세포 표면으로 재지시하기 위한 지향성 변형을 포함한다.
규제 당국에 의해 승인된 최초의 종양 세포 붕괴성 바이러스는 2005년 두경부암의 치료용으로 중국 국가 식품 의약청(China's State Food and Drug Administration (SFDA))으로부터 승인된 H101(Shanghai Sunway Biotech)로 명명되는 유전적으로 변형된 아데노 바이러스였다. ONYX-015로 명명되는 다른 종양 세포 붕괴성 아데노 바이러스는 다양한 고형 종양(재발성 두경부암의 치료를 위한 단계 III 중)의 치료를 위해 임상 시험 중이다(참조: Cohen et al., 2001, Curr. Opin. Investig. Drugs 2: 1770-5). 다른 예로서, 종양 세포 붕괴성 단순 포진 1(T-VEC)은 바이러스 독성을 감쇠시키고, 암 세포에 대한 선택성을 증가시키고, (GM-CSF(과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자) 발현을 통해) 항종양 면역 반응을 향상시키기 위해 유전적으로 조작되었다. 절제불가능한 흑색종의 임상 효능은 단계 II 및 단계 III 임상 시험에서 입증되었다(참조: Senzer et al, 2009, J. Clin. Oncol. 27: 5763-71).
백시니아 바이러스(VV)는 종양에 대한 자연 지향성, 강력한 용해 능력, 신속한 세포 대 세포 확산을 동반한 짧은 생활 주기, 매우 효율적인 유전자 발현 및 거대한 클로닝 용량과 같은 종양 세포 붕괴성 요법에 사용하기 위해 필요한 다수의 중요한 특성을 포함한다. 또한, 그들은 주요한 안전 문제 없이 천연두 박멸 캠페인 동안 수백만 명의 개체에게 전달되었다. 이와 관련하여, TK(티미딘 키나제) 및 VGF(VV 성장 인자용) 이중 결실된 VV 발현 GM-CSF(JX-963이라 명명됨)는 종양 보유 마우스에서 유의한 암 선택성을 나타냈다(참조: Thorne et al., 2007, J Clin Invest. 117: 3350-8). 동일 라인에서, GM-CSF로 구비된(armed) TK-결실 VV(Wyeth 균주), JX-594는 유망한 임상 데이터를 나타냈고, 간세포 암에서 무작위화 단계 III 시험이 곧 개시될 것으로 예상된다.
병용 요법도 또한 문헌에 기재되어 있다. WO2010/014784는 글리벡(GLEEVEC), 탁솔(TAXOL) 등과 같은 암 치료용으로 사용된 화학요법제와 항 CTLA4 항체의 배합물을 기재한다. WO2014/047350은 바이러스 게놈에 삽입된 항-PD-1 항체를 코딩하는 유전자와 함께 재조합 종양 세포 붕괴성 바이러스를 고려한다.
기술적 문제
암의 발병을 개시 또는 촉진시키기 위해 함께 또는 개별적으로 작용할 수 있는 많은 수의 원인 인자에 기인하여 암이 수년간 계속 심각한 전세계적인 건강 위협이 될 것으로 기대할 수 있다. 또한, 악성 및 특히 전이성 종양은 흔히 일부 암의 중대한 이환율을 설명하는 종래의 요법에 내성이다.
따라서, 이러한 증식성 질환의 예방 및 치료를 향상시키기 위한 보다 효과적인 접근법, 특히 병용 접근법을 개발하는 것이 중요하게 필요하다.
종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)가 모두 투여된 병용 요법은 단독으로 사용되는 어느 하나의 접근법과 비교하여 상승적 면역 반응을 제공하였다. 놀랍게도, 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스가 항-PD-1 또는 항-CTLA-4와 같은 항-체크포인트 항체의 투여 전에 투여된 병용 치료는 적합한 모델 동물에서 입증된 바와 같이 항-종양 반응을 개선시켜 잠재적으로 암에 대한 효과적이고 강력한 요법을 제공한다. 따라서, 본원에 제공된 구현예는 암과 같은 증식성 질환의 치료 및 예방에서 상당한 진보를 제공한다.
이 기술적 문제는 청구범위에 정의된 구현예의 제공에 의해 해결된다.
본 발명의 기타 및 추가의 국면, 특징 및 이점은 본 발명의 현재 바람직한 구현예의 이하 설명으로부터 명백할 것이다. 이러한 구현예는 개시의 목적으로 제공된다.
본 발명은 암과 같은 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)와 종양 세포 붕괴성 바이러스의 상승적 배합물에 관한 것이다. 종양 세포 붕괴성 바이러스는 바람직하게는 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 아데노 바이러스, 폭스 바이러스, 및 포진 바이러스(HSV) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 종양 세포 붕괴성 바이러스는 백시니아 바이러스이다. 바람직한 구현예에서, 백시니아 바이러스는 티미딘 키나제(TK) 활성을 결여시키기 위해 유전자 조작된다(예를 들면, 상기 VV의 게놈은 J2R 유전자의 불활성화 돌연변이 또는 결손 TK 표현형을 생성하기 위한 유전자 결실을 갖는다). 대안적으로 또는 조합하여, 백시니아 바이러스는 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR) 활성을 결여시키기 위해 유전자 조작된다(예를 들면, 상기 VV의 게놈은 I4L 및/또는 F4L 유전자의 불활성화 돌연변이 또는 결손 RR 표현형을 생성하기 위한 유전자 결실을 갖는다).
하나의 구현예에서, 백시니아 바이러스는 적어도 하나의 치료적 유전자, 특히 자살 유전자 생성물 및/또는 면역자극성 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 발현시킨다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 PD-1, PD-Ll 또는 CTLA4의 활성을 길항시키는 길항제 분자이고, 항 PD-1 항체 및/또는 항 CTLA4 항체가 특히 바람직하다.
하나의 구현예에서, 종양 세포 붕괴성 바이러스는 바람직하게는 정맥내 또는 종양내 투여용으로 제형화되고/되거나 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 바람직하게는 정맥내 또는 복강내 또는 종양내 투여용으로 제형화된다.
본 발명은 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스의 상승적 유효량 및 본원에 기재된 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)의 상승적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 암을 포함하는 증식성 질환의 치료 방법을 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법으로 치료되는 증식성 질환은 암, 특히 흑색종, 신장암, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암 및 간암이다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 프로드럭의 약제학적으로 허용되는 양이 상기 포유동물에 투여되는 추가의 단계를 포함한다. 상기 프로드럭의 투여는 바람직하게는 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스 또는 바이러스 조성물의 투여 후 적어도 3일 후에 일어난다.
본 발명은 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 바람직하게는 별도의 용기에 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
상세한 설명
본 발명은 암과 같은 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 적어도 하나의 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함하는 배합물에 관한 것이다.
정의
전체 출원을 통해 사용된 바와 같이, 용어 "하나"는, 맥락이 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 언급된 구성 요소 또는 단계의 "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상" 또는 "복수"를 의미한다는 의미에서 사용된다. 예를 들면, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 포함하여 복수의 세포를 포함한다.
용어 "하나 이상"은 1 또는 1 초과 수(예: 2, 3, 4, 5 등)를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 모두 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략적으로"는 소정의 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 생성물, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용된 경우, 용어 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예를 들면, "포함하다" 및 "포함한다"), "갖는" (및 갖는의 임의의 형태, 예를 들면, "가지다" 및 "갖는다"), "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예를 들면, "포함한다" 및 "포함하다") 또는 "함유하는" (및 함유하는의 임의의 형태, 예를 들면, "함유한다" 및 "함유하다")은 제한 없고, 추가의, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 따라서, 폴리펩티드는 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 일부일 수 있는 아미노산 서열을 "포함한다". 이러한 폴리펩티드는 수백 개의 추가의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. "본질적으로 이루어지는"은 임의의 본질적인 유의성을 갖는 다른 구성 요소 또는 단계를 배제함을 의미한다. 따라서, 인용된 구성 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 미량의 오염물질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 배제하지 않는다. 폴리펩티드는 이러한 아미노산 서열이 최종적으로 단지 소수의 추가 아미노산 잔기와 함께 존재하는 경우 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다". "이루어지는"은 다른 구성 요소 또는 단계의 미량 원소 이상을 제외함을 의미한다. 예를 들면, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 인용된 아미노산 서열 이외의 임의의 아미노산을 함유하지 않는 경우 아미노산 서열로 "이루어진다".
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 결합된 적어도 9개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 중합체는 직쇄, 측쇄 또는 환형일 수 있고, 천연 및/또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 차단될 수 있다. 일반적 표시로서, 아미노산 중합체가 50개 이상의 아미노산 잔기이면, 이는 바람직하게는 폴리펩티드 또는 단백질로서 명명되는 반면, 50개 아미노산 이하의 길이이면, 이는 "펩티드"로서 명명된다.
본 발명의 맥락 내에서, 용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 상호교환적으로 사용되고, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)(예: cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드, 벡터, 바이러스 게놈, 단리된 DNA, 프로브, 프라이머 및 이의 임의의 혼합물) 또는 폴리리보뉴클레오티드(RNA)(예: mRNA, 안티센스 RNA, SiRNA) 또는 혼합 폴리리보폴리데옥시리보뉴클레오티드의 임의 길이의 중합체를 정의한다. 그들은 단일 또는 이중 가닥, 직쇄 또는 환형, 천연 또는 합성의 변형되거나 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 비-뉴클레오티드 구성 요소에 의해 차단될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유사체"는 천연 대응물에 대한 하나 이상의 변형(들)을 나타내는 분자(폴리펩티드 또는 핵산)을 의미한다. 하나 이상의 뉴클레오티드/아미노산 잔기(들)의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 임의의 변형(들)이 예상될 수 있다. 천연 대상물의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성 정도, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98%의 동일성을 유지하는 유사체가 바람직하다.
일반적인 방식으로, 용어 "동일성"은 두 폴리펩티드 또는 핵산 서열 사이의 아미노산 대 아미노산 또는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응을 의미한다. 두 서열 사이의 동일성의 비율은 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 아미노산 서열 사이의 동일성의 비율을 결정하기 위해, 예를 들면, NCBI 에 이용가능한 Blast 프로그램과 Atlas of Protein Sequence and Structure에서의 ALIGN과 같은 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘이 당해 분야에서 이용가능하다(참조: Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9). 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 프로그램은 또한 전문화된 데이터 베이스에 이용가능하다(예: Genbank, 위스콘신 서열 분석 패키지, BESTFIT, FASTA 및 GAP 프로그램). 예시 목적으로, "적어도 80% 동일성"은 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 이의 자연 환경으로부터 제거된(즉, 자연적으로 관련되거나 자연에서 발견된 적어도 하나의 다른 구성 요소(들)로부터 분리된) 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 등을 의미한다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열은 자연에서 이와 통상적으로 관련되는 서열로부터 분리될 때(예: 게놈으로부터 해리됨) 단리되지만, 이는 이종 서열과 관련될 수 있다.
용어 "로부터 수득된", "기원하는" 또는 "기원하다"는 구성 요소(예: 폴리펩티드, 핵산 분자)의 원래 공급원을 동정하기 위해 사용되지만, 이는, 예를 들면, 화학적 합성 또는 재조합 수단에 의해 존재할 수 있는 구성 요소가 제조되는 방법을 제한하는 것을 의미하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 조직, 기관 또는 단리된 세포에서 특별한 조직화에 관하여 임의의 제한 없이 광범위하게 이해되어야 한다. 이러한 세포는 독특한 형태의 세포 또는 배양 세포주, 1차 세포 및 분열 세포와 같은 상이한 형태의 세포의 그룹일 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "숙주 세포"는 원핵 세포, 효모와 같은 하등 진핵 세포 및 곤충 세포, 식물 및 포유동물(예: 인간 또는 비-인간) 세포와 같은 다른 진핵 세포 뿐만 아니라 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스 및/또는 면역 체크포인트 조절제(들)를 생성할 수 있는 세포를 포함한다. 이 용어는 또한 본원에 기재된 벡터의 수령자일 수 있거나 수령자이었을 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "종양 세포 붕괴성 바이러스"는 시험관내 또는 생체내에서 상기 분열 세포의 성장을 늦추고/거나 용해시키면서 비-분열 세포에서의 복제를 전혀 나타내지 않거나 최소한 나타낼 목적으로 분열 세포(예: 암 세포와 같은 증식성 세포)에서 선택적으로 복제할 수 있는 바이러스를 의미한다. 전형적으로, 종양 세포 붕괴성 바이러스는 바이러스 입자 (또는 비리온)에 패키징되는 바이러스 게놈을 함유하고, 감염성이다(즉, 숙주 세포 또는 대상체를 감염시켜 침입할 수 있다).
본원에 사용된 용어 "치료" (및 "치료하는", "치료하다"와 같은 치료의 임의 형태)는 최종적으로 통상적인 치료 양식과 함께 예방(예: 치료되는 병리학적 상태를 가질 위험이 있는 대상체에서 예방 수단) 및/또는 치료(예: 병리학적 상태를 갖는 것으로 진단된 대상체에서)를 포함한다. 치료 결과는 표적화된 병리학적 상태의 진행을 늦추고, 치유하고, 경감시키거나 억제하는 것이다. 예를 들면, 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크 포인트 조절제(들)의 투여 후 대상체가 이의 임상 상태의 관찰가능한 개선을 나타내는 경우, 대상체는 암이 성공적으로 치료된다.
본원에 사용된 용어 "투여하는" (또는 "투여된"과 같은 투여의 임의 형태)은 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스 및/또는 면역 체크포인트 조절제(들)와 같은 치료제의 대상체로의 전달을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "증식성 질환"은 암 뿐만 아니라 증가된 파골세포 활성과 관련된 질환(예: 류마티스성 관절염, 골다공증 등) 및 심혈관 질환(혈관벽의 평활근 세포의 증식으로부터 생성되는 재협착 등)을 포함하는 조절되지 않은 세포 성장 및 확산으로부터 생성되는 임의의 질환 또는 상태를 포함한다. 용어 "암"은 임의의 용어 "종양", "악성 종양", "신생물" 등과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 임의 형태의 조직, 기관 또는 세포, 임의 단계의 악성 종양(예: 선장애로부터 단계 IV까지)을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "대상체"는 일반적으로 본 발명의 임의의 생성물 및 방법이 필요하거나 유익할 수 있는 유기체를 의미한다. 전형적으로, 유기체는 포유동물, 특히 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 및 영장류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물이다. 바람직하게는, 대상체는 암과 같은 증식성 질환을 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 진단된 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 유기체를 언급할 때 상호교환적으로 사용될 수 있고, 남성 및 여성을 포함한다. 치료될 대상체는 신생아, 유아, 청소년 또는 성인일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "배합물"은 다양한 구성 요소(예: 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 면역 체크포인트 조절제(들))의 임의의 가능한 배열을 의미한다. 이러한 배열은 폴리펩티드(예: 재조합 항체 또는 재조합 항체의 혼합물) 또는 핵산 분자(들)(예: 이러한 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 발현시키기 위해 유전자 조작된 하나 이상의 벡터에 의해 수반됨) 뿐만 아니라 폴리펩티드(들)와 핵산 분자(들)의 혼합물(예: 재조합 항체 및 발현 벡터) 형태의 적어도 하나의 종양 세포 붕괴성 바이러스와 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)의 혼합물을 포함한다. 본 발명은 하나 이상이 사용될 때 각 면역 체크포인트 조절제의 등몰 농도를 포함하는 배합물 뿐만 아니라 매우 상이한 농도를 갖는 배합물을 포함한다. 배합물의 각 구성 요소의 최적 농도는 당업자에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 배합물은 상승적이어서 각 개체 단독보다 높은 효능을 제공한다.
용어 "면역 체크포인트 조절제"는 면역 체크포인트 단백질의 기능을 긍정적 또는 부정적인 방식(특히, 항원 제시 세포(APC), 예를 들면, 암 세포와 면역 T 이펙터 세포 사이의 상호작용)으로 조절할 수 있는 분자를 의미한다. 용어 "면역 체크포인트"는 정상적인 생리학적 조건하에 조절되지 않은 면역 반응을 예방하고 따라서 자체 내성 및/또는 조직 보호의 유지를 위해 중요한 면역 경로에 직접 또는 간접적으로 관여하는 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 항원 특이적 세포의 클로날 선택, T 세포 활성화, 증식, 항원 및 염증 부위로의 전송, 직접 이펙터 기능의 실행 및 사이토카인 및 멤브레인 리간드를 통한 신호전달을 포함하는 T-세포 매개 면역의 임의 단계에서 독립적으로 작용할 수 있다. 이러한 단계 각각은 반응을 미세하게 조정하는 자극성 및 억제성 신호를 상쇄시킴으로써 조절된다. 본 발명의 맥락에서, 상기 용어는 억제성 면역 체크포인트의 기능을 적어도 부분적으로 하향 조절할 수 있는 면역 체크포인트 조절제(들)(길항제) 및/또는 자극성 면역 체크포인트의 기능을 적어도 부분적으로 상향 조절할 수 있는 면역 체크포인트 조절제(들)(작용제)를 포함한다.
종양 세포 붕괴성 바이러스
본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 현재 동정된 임의의 바이러스 구성원으로부터 수득될 수 있고, 단, 그것은 비-분열 세포와 비교하여 분열 세포를 선택성 복제 및 사멸시키는 이의 경향에 의해 종양 세포 붕괴성이다. 이는 자연적으로 종양 세포 붕괴성인 천연 바이러스일 수 있거나, DNA 복제, 핵산 대사, 숙주 지향성, 표면 부착, 독성, 용해 및 확산에 관련된 것들과 같은 분열 세포에서 종양 선택성 및/또는 우선적 복제를 증가시키기 위해 하나 이상의 바이러스 유전자를 변형시킴으로써 유전자 조작될 수 있다(참조: 예를 들면, Kirn et al., 2001, Nat. Med. 7: 781; Wong et al., 2010, Viruses 2: 78-106). 하나 이상의 바이러스 유전자(들)를 이벤트 또는 조직-특이적 조절 요소(예: 프로모터)의 제어하에 배치함을 또한 예상할 수 있다.
예시적인 종양 세포 붕괴성 바이러스는 제한 없이 레오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(SVV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 단순 포진 바이러스(HSV), 모빌리바이러스 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 신비스 바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스 등을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 레오바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 레오리신(Oncolytics Biotech에 의해 개발중; NCT01166542)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 세네카 밸리 바이러스로부터 수득된다. 대표적인 예는 NTX-010을 포함한다(참조: Rudin et al., 2011, Clin. Cancer. Res. 17(4): 888-95).
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(VSV)로부터 수득된다. 본 발명에 사용하기 위한 대표적인 예는 문헌에 기재되어 있다(참조: 예를 들면, Stojdl et al., 2000, Nat. Med. 6(7): 821-5; Stojdl et al., 2003, Cancer Cell 4(4): 263-75).
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스로부터 수득된다. 본 발명에 사용하기 위한 대표적인 예는 제한 없이 73-T PV701 및 HDV-HUJ 균주 뿐만 아니라 문헌에 기재된 것들(참조: 예를 들면, Phuangsab et al., 2001, Cancer Lett. 172(1): 27-36; Lorence et al., 2007, Curr. Cancer Drug Targets 7(2): 157-67; Freeman et al., 2006, Mol. Ther. 13(1): 221-8)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV)로부터 수득된다. 헤르페스바이러스과는 모두 공통 구조를 공유하고, 지질 이중 막에 싸여진 20면체 캡시드 내에 캡시드화된 100 내지 200개의 유전자를 코딩하는 비교적 거대한 이중 가닥의 직쇄 DNA 게놈으로 구성되는 DNA 바이러스의 거대한 패밀리이다. 종양 세포 붕괴성 헤르페스 바이러스가 상이한 형태의 HSV로부터 유도될 수 있지만, HSV1 및 HSV2가 특히 바람직하다. 헤르페스 바이러스는 종양에서 바이러스 복제를 제한하거나 비-분열 세포에서 이의 세포독성을 감소시키기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 티미딘 키나제(참조: Martuza et al., 1991, Science 252: 854-6), 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)(참조: Boviatasis et al., 1994, Gene Ther. 1: 323-31; Mineta et al.,1994, Cancer Res. 54: 3363-66) 또는 우라실-N-글리코실라제(참조: Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4963-72)와 같은 핵산 대사에 관여하는 임의의 바이러스 유전자가 불활성화될 수 있다. 또 다른 국면은 ICP34.5 유전자와 같은 독성 인자를 코딩하는 유전자의 기능에 결함을 갖는 바이러스 돌연변이체를 포함한다(참조: Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. : Sci. USA 92: 1411-5). 종양 세포 붕괴성 헤르페스 바이러스의 대표적인 예는 NV1020(참조: 예를 들면, Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28) 및 T-VEC(참조: Andtbacka et al., 2013, J. Clin. Oncol. 31, abstract number LBA9008)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 파라믹소바이러스과로부터 수득될 수 있는 모빌리바이러스로부터 수득되고, 홍역 바이러스가 특히 바람직하다. 적합한 종양 세포 붕괴성 홍역 바이러스의 대표적인 예는 제한 없이 MV-Edm(참조: McDonald et al., 2006; Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84) 및 HMWMAA(참조: Kaufmann et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133(4): 1034-42)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 아데노바이러스로부터 수득된다. 방법은 종양 세포 붕괴성 아데노바이러스를 유전자 조작하기 위해 당해 분야에서 이용가능하다. 유리한 전략은 종양 세포에서 변화된 p53 또는 망막아종(Rb) 단백질로 이의/그들의 결합 기능을 불활성화하기 위해 종양 선택적 프로모터에 의한 바이러스 프로모터의 치환 또는 E1 아데노바이러스 유전자 생성물(들)의 변형을 포함한다. 자연적인 맥락에서, 아데노바이러스 ElB55kDa 유전자는 다른 아데노바이러스 생성물과 협력하여 p53을 불활성화시키고(p53은 종종 암 세포에서 조절되지 않는다), 따라서 아폽토시스를 예방한다. 종양 세포 붕괴성 아데노바이러스의 대표적인 예는 ONYX-015(참조: 예를 들면, Khuri et al., 2000, Nat. Med 6(8): 879-85) 및 또한 온코린으로 명명되는 H101(참조: Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12): 1666-70)을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 폭스바이러스이다. 본원에 사용된 용어 "폭스바이러스"는 폭스바이러스과에 속하는 바이러스를 의미하고, 코르도폭스바이러스 아과, 보다 바람직하게는 오르토폭스바이러스속에 속하는 폭스바이러스가 특히 바람직하다. 다양한 폭스바이러스의 게놈, 예를 들면, 백시니아 바이러스, 우두 바이러스, 카나리폭스 바이러스, 엑트로멜리나 바이러스, 점액종 바이러스 게놈의 서열은 당해 분야 및 Genbank와 같은 전문화된 데이터베이스에 이용가능하다(각각 수탁 번호 NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_001132).
바람직하게는, 종양 세포 붕괴성 폭스바이러스는 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스이다. 백시니아 바이러스는 바이러스를 숙주 세포 기구로부터 독립적으로 복제할 수 있게 하는 다수의 바이러스 효소 및 인자를 코딩하는 200kb 이중 가닥 DNA 게놈을 특징으로 하는 폭스바이러스과의 구성원이다. 백시니아 바이러스 입자의 대부분은 단일 지질 외피를 갖는 세포내이고(세포내 성숙 비리온의 경우 IMV), 용해될 때까지 감염 세포의 시토졸에 잔류한다. 다른 감염 형태는 이를 용해시키지 않고 감염 세포로부터 발육하기 시작하는 이중 외피 입자(세포외 외피 비리온의 경우 EEV)이다.
그것은 임의의 백시니아 바이러스 균주로부터 유래할 수 있지만, 엘스트리(Elstree), 와이어쓰(Wyeth), 코펜하겐(Copenhagen) 및 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주가 특히 바람직하다. 본원에 사용된 유전자 명명법은 코펜하겐 백시니아 균주의 명명법이다. 이는 또한 달리 기술되지 않는 한 다른 폭스바이러스과의 상동 유전자를 위해 본원에 사용된다. 그러나, 유전자 명명법은 폭스 균주에 따라서 상이할 수 있지만, 코펜하겐과 다른 백시니아 균주 사이의 대응은 일반적으로 문헌에서 이용가능하다.
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 하나 이상의 바이러스 유전자(들)를 변경함으로써 변형된다. 상기 변형(들)은 바람직하게는 변형되지 않은 유전자에 의해 정상적인 조건하에 생성된 단백질의 활성을 보장할 수 없는 결함 단백질의 합성 (또는 합성의 결여)을 유도한다. 변형은 바이러스 유전자 또는 이의 조절 요소 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드(들)(연속 또는 비연속)의 결실, 돌연변이 및/또는 치환을 포함한다. 변형(들)은 통상적인 재조합 기술을 사용하여 당업자에게 공지된 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 예시적인 변형은 문헌에 개시되어 있고, DNA 대사, 숙주 독성 및 IFN 경로에 관여하는 바이러스 유전자를 변경하는 것들이 특히 바람직하다(참조: 예를 들면, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.ll(5):595-608).
보다 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 폭스바이러스는 티미딘 키나제-코딩 유전자(유전자좌 J2R)를 변경함으로써 변형된다. TK 효소는 데옥시리보뉴클레오티드의 합성에 관련된다. TK는 이러한 세포가 일반적으로 저농도의 뉴클레오티드를 갖기 때문에 정상 세포에서 바이러스 복제를 위해 필요한 반면, 이는 고농도의 뉴클레오티드를 함유하는 분열 세포에는 불필요하다.
대안적으로 또는 조합하여, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 폭스바이러스는 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)를 코딩하는 적어도 하나의 유전자 또는 두 유전자를 변경함으로써 변형된다. 자연적인 맥락에서, 이 효소는 DNA 생합성에서 중요한 단계를 나타내는 리보뉴클레오티드의 데옥시리보뉴클레오티드로의 환원을 촉매작용한다. 바이러스 효소는 서브유닛 구조가 두 개의 이종 서브유닛으로 구성되고, I4L 및 F4L 유전자좌에 의해 각각 코딩된 R1 및 R2를 설계한 포유동물 효소와 유사하다. I4L 및 F4L 유전자의 서열 및 다양한 폭스바이러스의 게놈 중의 이들의 위치는, 예를 들면, 수탁번호 DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M-35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 및 NC_008291을 통해 공공 데이터베이스에서 이용가능하다. 본 발명의 맥락에서, I4L 유전자(Rl 대형 서브유닛을 코딩하는) 또는 F4L 유전자(R2 소형 서브유닛을 코딩하는) 또는 둘 다가 불활성화될 수 있다.
대안적으로 또는 조합하여, 바이러스 종양 특이성을 추가로 증가시키기 위해 다른 전략이 또한 추구될 수 있다. 적합한 변형의 대표적인 예는 바이러스 게놈으로부터 VGF-코딩 유전자의 파괴를 포함한다. VGF(VV 성장 인자의 경우)는 세포 감염 후 조기에 발현되는 분비 단백질이고, 이의 기능은 정상 세포에서 바이러스 확산을 위해 중요해 보인다. 다른 예는 최종적으로 TK 결실과 함께 헤마글루티닌을 코딩하는 A56R 유전자의 파괴이다(참조: Zhang et al., 2007, Cancer Res. 67: 10038-46). 인터페론 조절 유전자(들)의 파괴가 또한 유리할 수 있거나(예: B8R 또는 B18R 유전자) 카스파제-1 억제제 B13R 유전자일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 J2R 유전자에서 돌연변이를 불활성화함으로써 생성되는 TK에 결함이 있는 백시니아 바이러스이다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 바이러스 게놈(예: WO2009/065546 및 Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1361-71에 기재됨)에 의해 수반되는 J2R 유전자 및 I4L 및/또는 F4L 유전자(들) 모두에서 돌연변이를 불활성화함으로써 생성되는 TK 및 RR 활성 모두에 대해 결함이 있는 백시니아 바이러스이다.
치료적 유전자
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 바이러스 게놈에 삽입된 적어도 하나의 치료적 유전자를 추가로 발현시킨다. "치료적 유전자"는 항종양 효능을 증강시키거나 바이러스의 종양 세포 붕괴성 특성을 강화시킴으로써 치료되는 병리학적 상태의 과정 또는 증상에 대한 유익한 효과를 일으킬 것으로 예상되는 대상체에게 적합하게 투여될 때 생물학적 활성을 제공할 수 있는 생성물을 코딩한다. 본 발명의 맥락에서, 치료적 유전자는 인간 기원이거나 아닐 수 있다(예: 세균, 효모 또는 바이러스 기원). 바람직하게는, 치료적 유전자는 본원에 기재된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제를 코딩하는 유전자 또는 핵산 서열이 아니다.
대상체에서 결함 또는 결손 단백질을 보상할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 것들, 또는 신체로부터 유해한 세포를 제한하거나 제거하는 독성 효과를 통해 작용하는 것들 또는 폴리펩티드를 부여하는 면역을 코딩하는 것들과 같은 방대한 수의 치료적 유전자가 본 발명의 맥락에서 예상될 수 있다. 그들은 천연 유전자 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 첨가에 의해 후자로부터 수득된 유전자일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 자살 유전자 생성물 및 면역자극성 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치료적 유전자를 수반한다.
자살 유전자
용어 "자살 유전자"는 약물의 전구체를 세포독성 화합물로 전환시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 자살 유전자는 시토신 데아미나제 활성, 티미딘 키나제 활성, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 활성 및 티미딜레이트 키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 핵염기 잔기를 포함하는 약물의 자살 유전자 및 상응하는 전구체의 예는 다음 표에 개시된다
자살 유전자 프로드럭
티미딘 키나제 간시클로비르; 간시클로비르 엘라이드산 에스테르; 펜시클로비르; 아시클로비르; 발라시클로비르; (E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘; 지도부딘; 2'-엑소-메타노카바티미딘
시토신 데아미나제 5-플루오로시토신
퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드; 플루다라빈
우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제 5-플루오로시토신; 5-플루오로우라실
티미딜레이트 키나제 아지도티미딘
바람직하게는, 자살 유전자는 적어도 시토신 데아미나제(CDase) 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 원핵생물 및 하등 진핵생물(이는 포유동물에는 존재하지 않는다)에서, CDase는 외인성 시토신이 가수분해성 탈아민화에 의해 우라실로 형질전환되는 피리미딘 대사 경로에 관여한다. CDase는 또한 시토신의 유사체, 즉 5-플루오로시토신(5-FC)을 탈아민화하여 5-플루오로-UMP(5-FUMP)로 변환될 때 매우 세포독성인 화합물, 5-플루오로우라실(5-FU)을 형성한다. 핵산 분자를 코딩하는 CDase는 임의의 원핵생물 및 하등 진핵생물, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)(FCY1 유전자), 칸디다 알비칸스(Candida Albicans)(FCA1 유전자) 및 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)(codA 유전자)로부터 수득될 수 있다. 유전자 서열 및 코딩된 CDase 단백질은 공개되었고, 전문 데이터 뱅크(SWISSPROT EMBL, Genbank, Medline 등)에서 이용가능하다. 이러한 유전자의 기능적 유사체도 또한 사용될 수 있다. 이러한 유사체는 바람직하게는 천연 유전자의 핵산 서열과 적어도 70%, 유리하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성 정도를 갖는 핵산 서열을 갖는다.
대안적으로 또는 조합하여, 본 발명에 사용되는 종양 세포 붕괴성 바이러스는 이의 바이러스 게놈에 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제(UPRTase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 자살 유전자를 수반한다. 원핵생물 및 하등 진핵생물에서, 우라실은 UPRTase의 작용에 의해 UMP로 형질전환된다. 이 효소는 5-FU를 5-FUMP로 변환시킨다. 예로써, 이. 콜리(E. coli)(참조: Andersen et al., 1992, European J. Biochem. 204: 51-56), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)(참조: Martinussen et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6457-63), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)(참조: Kim et al., 1997, Biochem. Mol. Biol. Internat. 41: 1117-24) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(참조: Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 271-4)로부터 UPRTase를 코딩하는 핵산 서열이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 그러나, 효모 UPRTase, 특히 서열이 문헌(참조: Kern et al. (1990, Gene 88: 149-57))에 개시되어 있는 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)(FUR1 유전자)에 의해 코딩된 것을 사용하는 것이 가장 특히 바람직하다. 천연 효소보다 더 큰 UPRTase 활성을 나타내는, EP998568에 기재된 N-말단 절단된 FUR1 돌연변이체(천연 단백질의 위치 36에 존재하는 제2 Met 잔기까지 35 최초 잔기의 결실을 가짐)와 같은 기능적 UPRTase 유사체도 또한 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스의 바이러스 게놈에 삽입된 자살 유전자는 CDase 및 UPRTase 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 이러한 폴리펩티드는 CDase 활성을 갖는 하나의 도메인 및 UPRTase 활성을 갖는 두 번째 도메인인 2개의 효소 도메인의 융합에 의해 유전자 조작될 수 있다. 예시적인 폴리펩티드는 제한 없이 W096/16183, EP998568 및 WO2005/07857에 기재된 융합 폴리펩티드 codA::upp, FCY1::FUR1 및 FCYl::FURl[Delta] 105 (FCUl) 및 FCUl-8을 포함한다. WO2009/065546의 서열 식별자 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 FCUl 자살 유전자 (또는 FCYl::FURl[Delta] 105 융합)가 특히 흥미롭다. 본 발명은 그들이 CDase, 및/또는 UPRTase 활성을 보유하는 한, 이러한 폴리펩티드의 유사체를 포함한다. 공개된 데이터로부터 CDase 및/또는 UPRTase-코딩 핵산 분자를 단리시키고, 결국 이의 유사체를 유전자 조작하고, 통상적인 기술(참조: 예를 들면, EP998568)에 따라 무세포계 또는 세포계에서 효소 활성을 시험하는 것은 당업자의 범위 내에 있다.
면역자극성 치료적 유전자
본원에 사용된 용어 "면역자극성 단백질"은 특이적 또는 비특이적 방식으로 면역계를 자극하는 능력을 갖는 단백질을 의미한다. 방대한 수의 단백질은 면역자극성 효과를 발휘하는 그들의 능력이 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서 적합한 면역자극성 단백질의 예는 제한 없이 사이토카인을 포함하고, 인터류킨(예: IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-24), 케모카인(예: CXCL10, CXCL9, CXCL11), 인터페론(예; IFNg, IFNα), 종양 괴사 인자(TNF), 콜로니-자극 인자(예: GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), APC(항원 제시 세포의 경우)-노출된 단백질(예: B7.1, B7.2 등), 성장 인자(형질전환 성장 인자 TGF, 섬유아세포 성장 인자 FGF, 혈관 내피 성장 인자 VEGF 등), 부류 I 또는 II의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 항원, 아폽토시스 유도제 또는 억제제(예: Bax, Bcl2, BclX...), 세포증식 억제제(p21, pl6, b...), 면역독소, 항원(항원성 폴리펩티드, 에피토프 등) 및 마커(베타-갈락토시다제, 루시페라제....)가 특히 바람직하다. 바람직하게는, 면역자극성 단백질은 인터류킨 또는 콜로니-자극성 인자이고, GM-CSF가 특히 바람직하다.
치료적 유전자의 발현
치료적 유전자는 종래의 기술에 따라서 클로닝, PCR 또는 화학적 합성에 의해 용이하게 수득될 수 있다. 또한, 치료적 유전자는 특별한 숙주 세포 또는 대상체에서 높은 수준의 발현을 제공하기 위해 최적화될 수 있다. 실제로, 유기체의 코돈 사용 패턴은 매우 비-무작위화이고, 코돈의 사용은 상이한 숙주 사이에서 현저하게 상이할 수 있다는 것이 관찰되었다. 치료적 유전자가 세균 또는 하등 진핵생물 기원(예: 자살 유전자)으로부터 유래할 수 있기 때문에, 이는 고등 진핵세포(예: 인간)에서 효율적인 발현에 부적합한 코돈 사용 패턴을 가질 수 있다. 전형적으로, 코돈 최적화는 목적하는 숙주 유기체에 드물게 사용되는 코돈에 상응하는 하나 이상의 "천연"(예: 세균 또는 효모) 코돈을 보다 빈번하게 사용되는 동일 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 코돈으로 대체시킴으로써 실행된다. 증가된 발현이 부분 대체로도 달성될 수 있기 때문에 드물게 사용되는 코돈에 상응하는 모든 천연 코돈을 대체시킬 필요는 없다.
코돈 사용의 최적화에 추가로, 숙주 세포 또는 대상체에서의 발현은 유전자 서열의 추가의 변형을 통해 추가로 개선될 수 있다. 예를 들면, 치료적 유전자 서열은 농축 영역에 존재하는 희귀한 비최적 코돈의 클러스터링을 예방하고/하거나 발현 수준에 부정적으로 영향을 미칠 것으로 예상되는 "음성" 서열 요소를 억제하거나 변형시키도록 변형될 수 있다. 이러한 음성 서열 요소는 제한 없이 매우 높은(>80%) 또는 매우 낮은(<30%) GC 함량; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 스트레치; 불안정한 직접 또는 역방향 반복 서열; R A 2차 구조; 및/또는 내부 TATA-박스, χ-부위, 리보솜 진입 부위 및/또는 접합 공여체/수용체 부위와 같은 내부 암호적 조절 요소를 갖는 영역을 포함한다.
본 발명에 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스의 게놈에 삽입된 치료적 유전자(들)는 숙주 세포 또는 대상체에서 이의 발현에 적합한 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 소정의 숙주 세포 또는 대상체에서 핵산(들) 또는 이의 유도체(즉, mRNA)의 복제, 복사, 전사, 접합, 번역, 안정성 및/또는 수송을 포함하여 치료적 유전자(들)의 발현을 허용하고, 기여하거나 조절하는 임의의 요소를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 요소들이 그들의 의도된 목적을 위해 협조하여 기능하도록 배열된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 프로모터가 허용 숙주 세포에서 상기 핵산 분자의 전사 개시로부터 종결자로의 전사를 수행하는 경우, 프로모터는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다.
조절 서열의 선택이 유전자 자체, 그것이 삽입되는 바이러스, 숙주 세포 또는 대상체, 목적하는 발현 수준 등의 상기 인자에 의존할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 프로모터는 특히 중요하다. 본 발명의 맥락에서, 이는 많은 유형의 숙주 세포 중 또는 특정 숙주 세포에 특이적이거나(예: 간-특이적 조절 서열) 또는 특정 이벤트 또는 외인성 인자(예: 온도, 영양소 첨가제, 호르몬 등)에 반응하여 조절되거나 또는 바이러스 주기의 단계(예: 늦게 또는 빨리)에 따르는 치료적 유전자(들)의 구성적 지시 발현일 수 있다. 바이러스 생산을 최적화하고 발현된 폴리펩티드(들)의 잠재적인 독성을 회피하기 위해 특정 이벤트 또는 외인성 인자에 반응하여 생산 단계 동안 억제된 프로모터를 또한 사용할 수 있다.
포유동물에서 구성적 발현에 적합한 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 전초기 프로모터(US 5,168,062), RSV 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 포스포글리세로 키나제(PGK) 프로모터(참조: Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74), 단순 포진 바이러스(HSV)-l의 티미딘 키나제(TK) 프로모터 및 T7 폴리머라제 프로모터(WO98/10088)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 백시니아 바이러스 프로모터가 종양 세포 붕괴성 폭스바이러스의 발현에 특히 적합하다. 대표적인 예는 제한 없이 백시니아 7.5K, H5R, 11K7.5(참조: Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), TK, p28, pll 및 K1L 프로모터 뿐만 아니라 문헌(참조: Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; and Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8))에 기재된 것들과 같은 합성 프로모터 뿐만 아니라 초기/후기 키메라 프로모터를 포함한다. 종양 세포 붕괴성 바이러스에 적합한 프로모터는 제한 없이 홍역 전사 단위의 발현을 지시하는 임의의 프로모터를 포함한다(참조: Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271).
당업자는 치료적 유전자(들)의 발현을 제어하는 조절 요소가 전사의 적절한 개시, 조절 및/또는 종결(예: polyA 전사 종결 서열), mRNA 수송(예: 핵 국소화 신호 서열), 처리(예: 접합 신호) 및 안정성(예: 인트론 및 비코딩 5' 및 3' 서열), 번역(예: 개시제 Met, 3연 리더 서열, IRES 리보솜 결합 부위, 신호 펩티드 등)을 위한 추가의 요소를 추가로 포함할 수 있다.
치료적 유전자는 바이러스 게놈의 임의의 위치에 삽입될 수 있고, 비필수 유전자좌가 특히 바람직하고, 예를 들면, TK 유전자는 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스에 삽입하기에 특히 적합하다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 TK 및 RR 활성(예: 두 바이러스 J2R 및 I4L 유전자에서 돌연변이를 불활성화시킴으로써 생성) 둘 다에 결함이 있는 백시니아 바이러스(바람직하게는 코펜하겐 균주로부터)이다. 보다 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 자살 유전자로 구비되고, 본원에 기재된 FCU1 자살 유전자가 특히 바람직하다. 더욱 더 바람직하게는, 자살 유전자(예: FCU1)는 pllK7.5 백시니아 프로모터의 전사 제어하에 존재한다. 더욱 더 바람직하게는, 백시니아 바이러스 프로모터의 제어하에 위치된 FCUl은 바이러스 게놈의 TK 유전자좌에 삽입된다.
대안적이고 또한 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 (바이러스 J2R 유전자에서 돌연변이를 불활성화시킴으로써 생성되는) TK 활성에 결함이 있는 백시니아 바이러스(바람직하게는 와이어쓰 균주로부터)이다. 더욱 바람직하게는, 상기 백시니아 바이러스는 면역자극성 치료적 유전자로 구비되고, 본원에 기재된 인간 GM-CSF 유전자가 특히 바람직하다. 더욱 더 바람직하게는, 치료적 유전자(예: GM-CSF)는 합성 초기-후기 프로모터 백시니아 프로모터의 전사 제어하에 존재하고, 바람직하게는 TK 유전자좌에 삽입된다.
전형적으로, 본 발명에 따라서 사용하기 위한 종양 세포 붕괴성 바이러스는 감염성 바이러스 입자의 생산을 허용하기 위해 형질감염되거나 감염된 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고 상기 세포의 배양물로부터 생성된 감염성 바이러스 입자를 회수하고, 임의로 상기 회수된 감염성 바이러스 입자를 정제함을 포함하는 통상의 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포주 내에서 생산된다. 종양 세포 붕괴성 바이러스의 생산에 적합한 숙주 세포는 제한 없이 인간 세포주, 예를 들면, HeLa(ATCC), 293 세포(참조: Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72), HER96, PER-C6(참조: Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17), WO2005/042728, WO2006/108846, WO2008/129058, WO2010/130756, WO2012/001075 등)에 기재된 것들과 같은 조류 세포, 햄스터 세포주, 예를 들면, BHK-21(ATCC CCL-10) 뿐만 아니라 수정란으로부터 수득된 닭 배아로부터 제조된 1차 닭 배아 섬유아세포(CEF)를 포함한다. 종양 세포 붕괴성 바이러스는 본 발명에 따라서 사용되기 전에 적어도 부분적으로 단리될 수 있다. 정화, 효소 처리(예: 벤조나제, 프로테아제), 크로마토그래피 및 여과 단계를 포함하는 다양한 정제 단계가 예상될 수 있다. 적합한 방법은 당해 기술 분야에 기재되어 있다(예: WO2007/147528; WO2008/138533, WO2009/100521, WO2010/130753, WO2013/022764).
면역 체크포인트 조절제(들)
면역 체크포인트 및 이의 조절제 뿐만 아니라 이러한 화합물의 사용 방법은 문헌에 기재되어 있다. 본 발명에 따라서, 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 독립적으로 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 코딩 핵산 분자일 수 있고, 상기 폴리펩티드는 길항제 기능(즉, 면역 체크포인트-매개된 억제성 신호를 길항시킬 수 있음) 또는 작용제 기능(즉, 면역 체크포인트-매개된 자극성 신호를 증폭시킬 수 있음)을 발휘하기 위해 표적화 면역 체크포인트를 결합시키고/시키거나 리간드의 상기 표적화 면역 체크포인트에의 결합을 억제할 수 있는 도메인을 포함한다. 이러한 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 독립적으로 펩티드(예: 펩티드 리간드), 천연 수용체의 가용성 도메인, RNAi, 안티센스 분자, 항체 및 단백질 스캐폴드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 항체이다. 본 발명의 맥락에서, "항체"("Ab")는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 자연 발생되고, 사람에 의해 유전자 조작되고, 또한 표적 면역 체크포인트 또는 에피토프를 결합할 수 있는 (따라서 표적 결합 부분을 보유하는) 전장 항체 또는 기능적 단편 또는 이의 유사체를 포함한다. 본 발명에 사용되는 항체는 임의의 기원, 예를 들면, 인간, 인간화, 동물(예: 설치류 또는 카멜리드 항체) 또는 키메라일 수 있다. 이는 임의의 이소타입일 수 있고, IgGl 또는 lgG4 이소타입이 특히 바람직하다. 또한, 이는 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다. 용어 항체는 또한 그들이 본원에 기재된 결합 특이성을 나타내는 한 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 포함한다.
예시 목적을 위해, 전장 항체는 이황화 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 두 개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 3개의 CH1, CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 (결국 CH1과 CH2 사이에 힌지를 갖는) 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 하나의 CL 도메인을 포함하는 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 보다 보전된 영역이 산재된 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 초가변 영역을 포함한다. 각각의 VH 및 VL은 다음과 같은 순서로 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어진다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역은 결합 특이성의 결정요인이다.
본원에 사용된 "인간화 항체"는 단백질 서열이 인간 항체에 대한 이의 유사성을 증가시키기 위해 변형된(즉, 인간에서 자연적으로 생성된) 비인간(예: 뮤린, 낙타, 랫트 등) 항체를 의미한다. 인간화 공정은 당해 분야에 익히 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20): 4593-9; US 5,225,539; US 5,530,101; US 6,180,370; WO2012/110360). 예를 들면, 인간 사용을 위해 개발된 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 서열과 같이 보이는 FR 영역의 하나 이상의 잔기를 치환함으로써 인간화될 수 있는 반면, 가변 영역(특히 CDR)의 잔기의 대부분은 변형되지 않고, 비인간 면역글로불린의 것들에 상응한다. 일반적인 가이드라인을 위해, FR 영역 중의 이러한 아미노산 치환의 수는 전형적으로 각 가변 영역 VH 또는 VL에서 20 이하이다.
본원에 사용된 "키메라 항체"는 하나의 종의 하나 이상의 요소(들) 및 다른 종의 하나 이상의 요소(들)를 포함하는 항체, 예를 들면, 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함하는 비-인간 항체를 의미한다.
항체의 많은 형태는 본 발명의 배합물에 사용하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 대표적인 예는 제한 없이 Fab, Fab', F(ab')2, dAb, Fd, Fv, scFv, di-scFv 및 디아바디 등을 포함한다. 보다 구체적으로,
(i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편으로 대표되는 Fab 단편;
(ii) 힌지 영역에서 적어도 하나의 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로 대표되는 F(ab')2 단편;
(iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편;
(iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편,
(v) 단일 가변 도메인 단편(VH 또는 VL 도메인)으로 이루어진 dAb 단편;
(vi) 단일 단백질 쇄를 제조하기 위해 결국 링커와 함께 융합된 Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH를 포함하는 단일 쇄 Fv(scFv)(참조: 예를 들면, Bird et al., 1988, Science 242: 423-6; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; US 4,946,778; US 5,258,498); 및
(vii) 임의의 다른 인공 항체.
항체, 단편 및 이의 유사체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Harlow and Lane, 1988, Antibodies - A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY). 예를 들면, 하이브리도마 기술(참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495-7; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-30; Cole et al. in Monoclonal antibodies and Cancer Therapy; Alan Liss pp77-20 96에 기재됨), 재조합 기술(예: 파지 디스플레이 방법을 사용), 펩티드 합성 및 효소 절단을 인용할 수 있다. 항체 단편은 본원에 기재된 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 그들은 또한 문헌(참조: 예를 들면, Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316-25)에 기재된 바와 같이 Fab 단편을 생성하기 위한 파파인 또는 F(ab')2 단편을 생성하기 위한 펩신과 같은 효소에 의한 단백질분해 절단에 의해 생성될 수 있다. 유사체 (또는 이의 단편)는 종래의 통상적인 분자 생물학 방법(PCR, 돌연변이 유발 기술)에 의해 생성될 수 있다 필요할 경우, 이러한 단편 및 유사체는 손상되지 않은 항체를 사용하는 경우(예: 표준 ELISA 검정에 의해)와 동일한 방식으로 기능성을 위해 스크리닝될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들) 중의 적어도 하나는 모노클로날 항체이고, 인간(여기서, 두 프레임워크 영역은 인간 생식선 면역글로빈 서열로부터 유도된다) 또는 익히 공지된 인간화 공정에 따르는 인간화 항체가 특히 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 억제성 면역 체크포인트(들)의 활성, 특히 다음 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA 및 CTLA4 중의 어느 하나에 의해 매개된 것들을 적어도 부분적으로(예: 50% 이상) 길항시키고, 이러한 표적 단백질 중의 어느 하나에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 특히 바람직하다. 용어 "에 특이적으로 결합한다"는 다른 단백질 및 생물제제의 불균일한 집단의 존재하에서도 특정의 표적 또는 에피토프에 대한 결합 특이성 및 친화성에 대한 능력을 의미한다. 따라서, 지정된 검정 조건하에, 본 발명에 사용되는 항체는 이의 표적에 우선적으로 결합하고, 시험 샘플 또는 대상체에 존재하는 다른 구성 요소에 상당량으로 결합하지 않는다. 바람직하게는, 이러한 항체는 1xl0-6M 이하(예: 적어도 0.5xl0-6, 1xlO-7, 1xlO-8, 1xlO-9, 1xlO-10 등)의 평형 해리 상수를 갖는 이의 표적에 결합하는 높은 친화성을 나타낸다. 또는, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 그것이 자극성 신호, 특히 CD28에 의해 매개되는 것들을 자극하거나 강화시킬 수 있다는 의미에서 작용제 기능을 발휘하고, ICOS, CD137 (또는 4-1BB), OX40, CD27, CD40 및 GITR 면역 체크포인트 중의 어느 하나가 특히 바람직하다. 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA 및 유동 세포 계측법을 포함하는, 면역 체크포인트를 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정은 당해 분야에 공지되어 있다. 항체의 결합 동역학(예: 결합 친화성)은 비아코어(Biacore) 분석과 같은 당해 분야에 공지된 표준 검정에 의해 평가될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 하나 이상의 체크포인트 조절제(들) 중의 적어도 하나는 T 세포 매개된 반응에 관련되는 면역 체크포인트를 길항시킬 수 있는 인간 또는 인간화 항체를 포함한다. 면역 체크포인트 조절제의 바람직한 예는 단백질 프로그램된 사망 1(PD-1) 및 특히 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체를 적어도 부분적으로 길항시킬 수 있는 조절제로 대표된다. PD-1은 면역글로불린(Ig) 유전자 상과의 일부 및 CD28 계열의 구성원이다. 이는 항원 경험 세포(예: 활성화 B 세포, T 세포 및 골수 세포) 상에서 발현된 55kDa 형태 1 막관통 단백질이다(참조: Agata et al., 1996, Int. Immunol. 8: 765-72; Okazaki et al., 2002, Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al., 2003, J. Immunol 170: 711-8). 정상적인 맥락에서, 이는 염증 반응의 시점에서 T 세포의 활성을 제한함으로써 작용하고, 이에 의해 정상 조직을 파괴로부터 보호한다(참조: Topalian, 2012, Curr. Opin. Immunol. 24: 207-12). PD-1에 대해 2개의 리간드, 각각 PD-Ll(프로그램된 사망 리간드 1) 및 PD-L2(프로그램된 사망 리간드 2)가 동정되었다(참조: Freeman et al., 2000, J. Exp. Med. 192: 1027-34; Carter et al., 2002, Eur. J. lmmunol. 32: 634-43). PD-L1은 인간 암의 20 내지 50%에서 동정되었다(참조: Dong et al., 2002, Nat. Med. 8: 787-9). PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용은 종양 침윤성 림프구의 감소, T-세포 수용체 매개된 증식의 감소 및 암 세포에 의한 면역 회피를 초래하였다(참조: Dong et al., 2003, J. Mol. Med. 81: 281-7; Blank et al., 2005, Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-5 314). 완전한 뉴클레오티드 및 아미노산 PD-1 서열은 GenBank 수탁 번호 U64863 및 NP_005009.2하에 발견될 수 있다. 다수의 항 PD1 항체는 당해 분야에 이용가능하다(참조: 예를 들면, WO2004/004771; WO2004/056875; WO2006/121168; WO2008/156712; WO2009/014708; WO2009/114335; WO2013/043569; 및 WO2014/047350에 기재된 것들). 본 발명의 맥락에서 바람직한 항 PD-1 항체는 FDA 승인되었거나 고도의 임상 개발 중이며, 특히 니볼루맙(또한 BMS-936558로 명명됨, Bristol Myer Squibb에 의해 개발 중), 펨브롤리주맙(또한, 란브롤리주맙 또는 MK-3475로 명명됨; Merck에 의해 개발 중) 및 피딜리주맙(또한 CT-011로 명명됨, CureTech에 의해 개발 중)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PD-1 항체를 사용할 수 있다
면역 체크포인트 조절제의 다른 바람직한 예는 PD-L1으로 명명되는 PD-1 리간드, 특히 인간 PD-L1을 인식하는 항체를 적어도 부분적으로 길항할 수 있는 조절제로 대표된다. 다수의 항 PD-L1 항체가 당해 분야에서 이용가능하다(참조: 예를 들면, EP1907000에 기재된 것들). 바람직한 항 PD-L1 항체는 FDA 승인되었거나 고도의 임상 개발 중이다(예: Genentech/Roche에 의해 개발 중인 MPDL3280A 및 Bristol Myer Squibb에 의해 개발 중인 BMS-936559).
면역 체크포인트 조절제의 또 다른 바람직한 예는 CTLA-4 단백질, 특히 인간 CTLA-4를 인식하는 항체를 적어도 부분적으로 길항시킬 수 있는 조절제로 대표된다. CD152로서도 공지된 CTLA4(세포독성 T-림프구 관련 항원 4의 경우)는 1987년에 동정되었고(참조: Brunet et al., 1987, Nature 328: 267-70), CTLA4 유전자에 의해 코딩된다(참조: Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-5). CTLA4는 수용체의 면역글로불린 상과의 구성원이다. 그것은, 그것이 주로 T 세포 활성화의 초기 단계의 진폭을 조절하는 헬퍼 T 세포의 표면에서 발현된다. 최근 연구는 CTLA-4가 항원 제시 세포의 막으로부터 B7-1 및 B7-2를 포획하고 제거함으로써 생체내 기능할 수 있고, 따라서 이들을 CD28의 유발에 사용불가능하게 한다는 것을 시사했다(참조: Qureshi et al., Science, 2011, 332: 600-3). 완전한 CTLA-4 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 LI 5006하에 발견될 수 있다. 다수의 항 CTLA-4 항체가 당해 분야에서 이용가능하다(참조: 예를 들면, US 8,491,895에 기재된 것들). 본 발명의 맥락에서 바람직한 항 CTLA-4 항체는 FDA 승인되거나 고도의 임상 개발 중이다. 보다 특별하게 Bristol Myer Squibb에 의해 예르보이로서 시판되는 이필리무맙(참조: 예를 들면, US 6,984,720; US 8,017,114), -Pfizer에 의해 개발 중인 트레멜리무맙(참조: 예를 들면, US 7,109,003 및 US 8,143,379) 및 단일 쇄 항-CTLA4 항체(참조: 예를 들면, WO97/20574 및 WO2007/123737)를 인용할 수 있다.
LAG3 수용체를 길항시키기 위한 면역 체크포인트 조절제는 또한 본 발명의 배합물에 사용될 수 있다(참조: 예를 들면, US 5,773,578).
면역 체크포인트 조절제의 다른 예는 OX40 작용제, 예를 들면, OX40의 작용제 리간드(OX40L)(참조: 예를 들면, US 5,457,035, US 7,622,444; WO03/082919) 또는 OX40 수용체에 지시된 항체(참조: 예를 들면, US 7,291,331 및 WO03/106498)로 대표된다.
면역 체크포인트 조절제의 다른 예는 CD8+ T 세포 및 NK 세포가 보유하는 억제성 수용체를 표적화하는 항-KIR 또는 항-CD96 항체로 대표된다.
본 발명은 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제를 포함하는 배합물을 포함한다. 바람직한 예는 제한 없이 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스와 함께 하나의 항-CTLA-4 항체 및 항-PD-1 항체를 사용함을 포함한다.
면역 체크포인트 조절제의 생산
본 발명에 사용하기 위한 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포를 사용하는 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다.
목적하는 면역 체크포인트 조절제의 관련 부분(들)을 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에서 접근가능한 서열 데이터 및 본원에 제공된 정보를 사용하는 표준 분자 생물학 기술(예: PCR 증폭, cDNA 클로닝, 화학적 합성)을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이들의 CDR의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 생성 하이브리도마, 면역글로불린 유전자 라이브러리 또는 임의의 이용 가능한 공급원으로부터 단리될 수 있다.
하나의 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제(들)를 코딩하는 핵산 분자(들)는 적합한 벡터로 클로닝될 수 있고 재조합 수단에 의해 상기한 면역 체크포인트 조절제를 생산하기 위해 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 발현 벡터로의 삽입은, 예를 들면, 문헌(참조: Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory))에 기재된 바와 같이, 통상적인 분자 생물학에 의해 수행될 수 있다. 아데노바이러스 벡터 또는 폭스바이러스 벡터로의 삽입은 각각 문헌(참조: Chartier et al. (1996, J. Virol. 70: 4805-10)) 및 문헌(참조: Paul et al. (2002, Cancer gene Ther. 9: 470-7))에 기재된 바와 같이 상동 재조합을 통해 수행될 수 있다. 치료적 유전자와 관련하여 본원에 기재된 바와 같이, 면역 체크포인트 조절제(들)를 코딩하는 핵산 분자(들)는 또한 발현 수준을 증가시키기 위해 최적화될 수 있다.
세균(예: 이. 콜리(E. coli) 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 효모(예: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)); 곤충 세포계(예: Sf 9 세포 및 바쿨로바이러스); 식물 세포계(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV; 담배 모자이크 바이러스 TMV) 및 포유동물 세포계(예: 배양 세포)와 같은 원핵생물 유기체를 포함하는 다양한 숙주-벡터계가 본 발명에 사용하기 위한 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 발현시키기 위해 사용되거나 작제될 수 있다. 전형적으로, 이러한 벡터는 시판되거나(예: Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega 등에서) 아메리칸 타이프 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, Md.)과 같은 기탁 기관으로부터 이용 가능하거나 당업자가 그들을 적용하도록 하는 그들의 서열, 조직 및 생산 방법을 기재하는 다수의 간행물의 주제였다.
원핵생물계에 사용하기 위한 적합한 벡터는 제한 없이 pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pbluescript (Stratagene), p 폴리 (Lathe et al., 1987, Gene 57: 193-201), pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69: 301-15); pET lid (Studier et al., 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185: 60-89); pIN (Inouye et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-9; Van Heeke et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-9); 및 pGEX 벡터를 포함하고, 여기서 핵산 분자는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)(Amersham Biosciences Product)와의 융합으로 발현될 수 있다.
효모(예: 에스. 세레비지애)에서의 발현에 적합한 벡터는 pYepSecl (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6: 229-34), pMFa (Kujan et al., 1982, Cell 30: 933- 43), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54: 113-23), pYES2 (Invitrogen Corporation) 및 pTEF-MF (Dualsystems Biotech Product)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포유동물 숙주 세포에서의 발현에 적합한 플라스미드 벡터는, 제한 없이, pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329: 840) 및 pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6: 187-95), pVAX 및 pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76: 12735-46)를 포함한다.
각종 상이한 바이러스(예: 바쿨로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV, 폭스바이러스, 홍역 바이러스 등)으로부터 유래된 바이러스계 발현계가 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "바이러스 벡터"는 벡터 DNA 뿐만 아니라 이의 생성된 바이러스 입자를 포함한다. 바이러스 벡터는 바람직하게는 복제-결함성이거나 복제-손상된다.
또한, 본 발명의 맥락에서 사용된 발현 벡터는 또한 숙주 세포에서 면역 체크포인트 조절제를 코딩하는 핵산 분자의 유지, 증식 또는 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 추가의 요소(들)를 포함할 수 있다. 이러한 추가의 요소는, 제한 없이, 재조합 숙주 세포의 동정 및 단리를 촉진시키기 위해(예: 세포 영양요구성의 상보성에 의해 또는 항생물질 내성에 의해) 마커 유전자(들), 안정화 요소(예: 문헌(참조: Summers and Sherrat, 1984, Cell 36: 1097-103)에 기재된 cer 서열 및 U.S. 5,198,343에 기재된 DAP 시스템) 및 통합적인 요소(예: LTR 바이러스 서열 및 트랜스포손)을 포함한다.
원핵 숙주 세포에서의 발현에 적합한 마커 유전자는 테트라사이클린 및 암피실린-내성 유전자를 포함한다. 또한, 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)(참조: Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); 미코페놀산에 내성을 부여하는 gpt(참조: Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); 아미노글리코사이드 G-418에 내성을 부여하는 neo(참조: Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); 제오마이신에 내성을 부여하는 zeo, 칸나마이신에 내성을 부여하는 kana 및 히그로마이신에 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30: 147)와 같은 내성 유전자는 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위해 사용될 수 있다. URA3 및 LEU2 유전자는 ura3 또는 Ieu2 효모 돌연변이체의 상보성을 제공하는 효모계에서의 발현을 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터는, 적절한 경우, 벡터의 형질감염 효율 및/또는 안정성을 향상시키는 하나 이상의 물질과 조합될 수 있다. 이러한 물질은 문헌에 널리 기재되어 있다. 숙주 세포에 벡터의 도입을 촉진시킬 수 있는 형질감염 시약의 대표적인 예는, 제한 없이, 폴리양이온성 중합체(예: 키토산, 폴리메타크릴레이트, PEI 등), 양이온성 지질(예: DC-Chol/DOPE, 현재 Promega로부터 이용가능한 트랜스펙탐 리포펙틴) 및 리포솜을 포함한다.
재조합 DNA 기술은 또한, 예를 들면, 높은-카피 수 벡터를 사용하고, 하나 이상의 전사 조절 서열(예: 프로모터, 인핸서 등)을 치환하거나 변형시키고, 숙주 세포에 대한 코돈 사용량을 최적화하고, 전사물을 불안정화시키는 음성 서열을 억제함으로써 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 면역 체크포인트 조절제를 코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포에서 이의 발현에 적합한 형태로 존재하고, 이는 핵산 분자가 치료적 유전자와 관련하여 기재된 바와 같이 벡터, 숙주 세포 및/또는 목적하는 발현 수준에 적합한 하나 이상의 조절 서열의 제어하에 배치된다는 것을 의미한다.
이. 콜리 숙주 세포에서의 발현에 적합한 프로모터는 박테리오파지 람다 pL 프로모터, lac, TRP 및 IPTG-유도성 pTAC 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 효모에서의 발현에 적합한 프로모터는 TEF(참조: Mumberg et al., 1995, Gene 156: 119-22), PGK(참조: Hitzeman et al., 1983, Science 219: 620-5), MF 알파(참조: Inokuchi et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 3185-93), CYC-1(참조: Guarente et al, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2199), GAL-1, GAL4, GALlO, PH05, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAP 또는 GAPDH), 및 알콜 데하이드로게나제(ADH)(참조: Denis et al., 1983, J. Biol. Chem. 25: 1165) 프로모터를 포함한다. 제한 없이, 아연 유도성 메탈로티오네인(MT) 프로모터(참조: Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 838-48), 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터(참조: No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-51), 테트라사이클린-억제성 프로모터(참조: Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51), 테트라사이클린-유도성 프로모터(참조: Kim et al., 1995, J. Virol. 69: 2565-73), RU486-유도성 프로모터(참조: Wang et al., 1997, Nat. Biotech. 15: 239-43) 및 라파마이신-유도성 프로모터(참조: Magari et al., 1997, J. Clin. Invest. 100: 2865-72)를 포함하는, 외인적으로 공급된 화합물에 의해 조절된 유도성 진핵생물 프로모터도 또한 사용될 수 있다. 최종적으로, 치료적 유전자의 발현을 위해 기재된 프로모터는 또한 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제, 특히 포유동물 세포에서의 발현에 특히 적합하다.
본 발명에 따라서, 면역 체크포인트 조절제는 변형될 수 있다. 아미노산 서열을 변형시키는 것들 뿐만 아니라 이의 생물학적 반감기, 이의 친화성 또는 이의 안정성을 증가시키는 것을 목적으로 하는 것들과 같은 다양한 변형이 고려될 수 있다.
예를 들면, 신호 펩티드는 세포 배양물에서 면역 체크포인트 조절제의 분비를 촉진시키기 위해 포함될 수 있다. 신호 펩티드는 전형적으로 Met 개시제 직후 단백질의 N-말단에 삽입된다. 신호 펩티드의 선택은 광범위하고, 당업자에게 접근 가능하다.
추가의 예로서, 태그 펩티드(전형적으로 이용 가능한 항혈청 또는 화합물에 의해 인식될 수 있는 짧은 펩티드 서열)는 또한 재조합 면역 체크포인트 조절제의 정제를 촉진시키기 위해 첨가될 수 있다. 제한 없이, PK 태그, FLAG 옥타펩티드, MYC 태그, HIS 태그(일반적으로 4 내지 10개의 히스티딘 잔기의 스트레치) 및 e-태그(US 6,686,152)를 포함하는 방대한 종류의 태그 펩티드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 태그 펩티드(들)는 단백질의 N-말단 또는 대안적으로 이의 C-말단 또는 대안적으로 내부에 또는 다수의 태그가 사용될 때 이들 위치 중 임의의 위치에 독립적으로 배치될 수 있다. 태그 펩티드는 항-태그 항체를 사용하는 면역검출 검정에 의해 검출될 수 있다.
다른 예로서, 면역 체크포인트 조절제의 글리코실화는 이의 표적에 대한 이의 친화성을 증가시키기 위해 변화시킬 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 글리코실화 부위(들) 내에서 하나 이상의 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 또는, 글리콜실화의 형태는, 예를 들면, 변경된 글리코실화 기구에 의한 숙주 세포에서의 발현에 의해 변형될 수 있다. 예시 목적을 위해, 비글리코실화 단백질은 이. 콜리에서 발현될 수 있는 반면, 그들의 탄수화물 상에 프코스가 결여된 조절제는 US 2004-0110704에 기재된 것들과 같은 다른 세포(알파 (1,6) 푸코실트랜스퍼라제 활성 결여)에서 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 기재되었다.
다른 변형은, 예를 들면, 항체의 생물학적 반감기를 증가시키는 페길화이다. 단백질을 페길화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 예를 들면, EP154316; EP401384; W098/15293, WO01/23001 등).
본 발명의 맥락에서 추구될 수 있는 다른 접근법은 방사선 증감제, 세포독성제 및/또는 표지제와 같은 외부 제제에 대한 면역 체크포인트 조절제의 커플링이다. 커플링은 공유결합이거나 아닐 수 있다. 본원에 사용된 용어 "방사선 증감제"는 세포가 방사선 요법에 더욱 민감하도록 하는 분자를 의미한다. 방사선 증감제는 메트로니다졸, 미소니다졸, 데스메틸미소니다졸, 피모니다졸, 에타니다졸, 니모라졸, 미토마이신 C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, 니코틴아미드, 5-브로모데옥시우리딘(BUdR), 5-요오도데옥시우르딘(IUdR), 브로모데옥시시티딘, 플루오로데옥시우리딘(FUdR), 하이드록시우레아 및 시스플라틴을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 독소(예: 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 이의 단편)와 같은, 이들의 복제 또는 성장을 방지하는 세포에 직접 독성인 화합물을 의미한다. 본원에 사용된 "표지제"는 검출가능한 화합물을 의미한다. 표지제는 그 자체로 검출가능할 수 있거나(예: 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물의 화학적 변형을 촉매 작용할 수 있다.
면역 체크포인트 조절제를 재조합적으로 생산하는 방법은 당해 분야에 통상적이다. 전형적으로, 이러한 방법은 (a) 본원에 기재된 발현 벡터를 형질감염되거나 감염된 생산자 세포를 생산하기 위해 적합한 생산자 세포에 도입하는 단계, (b) 상기 형질감염되거나 감염된 생산자 세포를 이의 성장에 적합한 조건하에 시험관내에서 배양하는 단계, (c) 면역 체크포인트 조절제를 세포 배양물로부터 회수하는 단계 및 (d) 임의로, 회수된 면역 체크포인트 조절제를 정제하는 단계를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 생산자 세포는 원핵 세포, 효모와 같은 하등 진핵 세포, 및 곤충 세포, 식물 및 포유동물(예: 인간 또는 비인간) 세포와 같은 다른 진핵 세포를 포함한다. 바람직한 이. 콜리는, 제한 없이, 이. 콜리 BL21(Amersham Biosciences)을 포함한다. 바람직한 효모 생산자 세포는, 제한 없이, 에스. 세레비지애, 에스. 폼베, 피키아 파스토리스를 포함한다. 바람직한 포유동물 생산자 세포는, 제한 없이, BHK-21(베이비 햄스터 신장), CV-1 (아프리카 원숭이 신장 세포주), COS(예: COS-7) 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 NIH/3T3 세포, 마우스 NSO 골수종 세포, HeLa 세포, Vero 세포, HEK293 세포 및 PERC.6 세포 뿐만 아니라 상응하는 하이브리도마 세포를 포함한다.
생산자 세포는 통상적 발효 생물 반응기, 플라스크 및 페트리 플레이트에서 배양할 수 있다. 배양은 소정의 숙주 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 원핵 세포와 진핵 세포에서 단백질을 생산하기 위한 공지된 다양한 방법을 상세히 기술하려는 어떤 시도도 여기서 행해지지 않을 것이다. 면역 체크포인트 조절제의 생산은 주변 세포질, 세포내 또는 바람직하게는 생산자 세포 외부에서(즉, 배양 배지에서) 분비될 수 있다.
필요할 경우, 특히 면역 체크포인트 조절제가 생산자 세포 외부에서 분비되지 않을 경우 또는 그것이 완전히 분비되지 않을 경우, 이는 동결 해동, 초음파 처리, 기계적 파괴, 용해제의 사용 등을 포함하는 표준 용해 절차에 의해 회수될 수 있다. 분비되는 경우, 이는 배양 배지로부터 직접 회수될 수 있다.
이어서, 면역 체크포인트 조절제는 황산암모늄 침전, 산 추출, 겔 전기영동, 여과 및 크로마토그래피 방법(예: 역상, 크기 배제, 이온 교환, 친화성, 포스포셀룰로즈, 소수성-상호작용 또는 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 등)을 포함하는 익히 공지된 정제 방법으로 정제시킬 수 있다. 특별한 단백질을 정제하기 위해 사용되는 조건 및 기술은 순 전하, 분자량, 소수성, 친수성과 같은 인자에 의존하고, 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 정제 수준은 의도된 용도에 의존할 것이다. 또한, 생산자 세포에 의존하여, 면역 체크포인트 조절제 단백질은 다양한 글리코실화 패턴을 가질수 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 비글리코실화될 수 있다(예: 세균에서 생산된 경우)는 것이 이해된다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 면역 체크포인트 조절제는 그것이 상이한 항원적 특이성을 갖는 다른 항체 및/또는 다른 세포 물질을 실질적으로 함유하지 않는다는 의미에서 적어도 부분적으로 정제된다. 또한, 면역 체크포인트 조절제는 당해 분야에 통상적으로 사용되는 조건에 따라서 제형화될 수 있다(예: WO2009/073569).
본 발명의 다른 국면은 본원에 기재된 면역 체크포인트 조절제(들)를 코딩하는 핵산 분자(들)의 사용에 관한 것이다. 예를 들면, 면역 체크포인트 조절제는 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제를 발현시키는 벡터의 형태로 대상체에게 전달될 수 있다. 본원에 기재된 벡터 중 임의의 하나가 본 맥락에서 사용될 수 있다.
병용 요법
종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 임의로 이러한 활성제(들)의 치료적 유효량 이외에 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는 단일 조성물로 또는 동시에 개별 조성물로 함께 투여될 수 있다. 단일 조성물은 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)가 함께 혼합되는 경우(예: 종양 세포 붕괴성 바이러스와 하나 이상의 항체의 혼합물 또는 종양 세포 붕괴성 바이러스와 하나 이상의 항체의 발현을 위한 하나 이상의 벡터(들)의 혼합물)를 포함한다. 종양 세포 붕괴성 바이러스와 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)의 개별 조성물은 각각 한 번 또는 수회(별도로 또는 산재된 방식으로) 동일하거나 상이한 경로를 통해 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
"치료적 유효량"은 하나 이상의 유익한 결과를 생성하기에 충분한 본 발명의 배합물 또는 조성물에 포함된 활성제(종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)) 각각의 양에 상응한다. 이러한 치료적 유효량은 다양한 파라미터, 특히 투여 방식, 질환 상태, 대상체의 년령 및 체중, 치료에 반응하는 대상체의 능력, 병용 치료의 종류, 치료의 빈도 및/또는 예방 또는 요법의 필요성의 함수로서 가변적일 수 있다. 예방적 사용이 관계되는 경우, 배합물은 특히 위험한 대상체에서 병적 상태(예: 암과 같은 증식성 질환)의 발병 및/또는 확립 및/또는 재발을 방지하거나 지연시키기에 충분한 용량으로 투여된다. "치료적" 사용을 위해, 바이러스와 면역 체크포인트 조절제(들)의 배합물은 최종적으로 하나 이상의 통상적 치료법과 관련하여 질환을 치료할 목적으로 병적 상태(예: 암과 같은 증식성 질환)를 갖는 것으로 진단된 대상체에게 투여된다. 특히, 치료적 유효량은 기준 상태 또는 치료되지 않는 경우 예상되는 상태에 대한 임상 상태의 관찰가능한 개선, 예를 들면, 종양 수의 감소, 종양 크기의 감소, 전이의 수 또는 정도의 감소, 완화 길이의 증가, 질환 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질환 진행 또는 중증도의 지연 또는 감속, 질환 상태의 완화 또는 경감, 생존 연장, 표준 치료에 대한 양호한 반응, 삶의 질의 향상, 사망률 감소 등을 유발하는데 필요한 양일 수 있다. 치료적 유효량은 또한 효과적인 비특이적(선천성) 및/또는 특이적 항종양 반응의 발달을 유발하기 위해 필요한 양일 수 있다. 전형적으로, 면역 반응, 특히 T 세포 반응의 발달은 적합한 동물 모델에서 시험관내 또는 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 실험실에서 통상적으로 사용되는 기술(예: 유동 세포 계측법, 조직학)은 종양 감시를 실행하기 위해 사용된다. 치료된 대상체에 존재하는 항종양 반응에 관여하는 상이한 면역 세포 집단, 예를 들면, 세포독성 T 세포, 활성화된 세포독성 T 세포, 자연 살해 세포 및 활성화된 자연 살해 세포를 동정하기 위해 다양한 이용 가능한 항체를 또한 사용할 수 있다. 임상 상태의 개선은 의사 또는 다른 숙련된 의료진에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 관련 임상 측정에 의해 용이하게 평가될 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 비히클"은 포유동물, 특히 인간 대상체에의 투여에 적합한 임의의 모든 담체, 용매, 희석제, 부형제, 애주번트, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 흡수제 등을 포함하는 것으로 의도된다.
종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들) 또는 이의 조성물 각각은 인간 또는 동물 사용에 적합한 용매 또는 희석제에 독립적으로 배치될 수 있다. 용매 또는 희석제는 바람직하게는 등장성, 저장성 또는 약한 고장성이고, 비교적 낮은 이온 강도를 갖는다. 대표적인 예는 멸균수, 생리 식염수(예: 염화나트륨), 링거 용액, 글루코스, 트레할로스 또는 사카로스 용액, 행크 용액, 및 다른 수성의 생리학적 균형 염 용액(참조: 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins의 가장 최근 판)을 포함한다.
다른 구현예에서, 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 면역 체크 포인트 조절제 조성물(들) 각각은 적합하게는 인간 사용을 위해 완충된다. 적합한 완충제는, 제한 없이, 인산염 완충제(예: PBS), 중탄산염 완충제 및/또는 생리학적 또는 약염기성 pH(예: 약 pH 7 내지 약 pH 9)를 유지시킬 수 있는 트리스 완충제를 포함한다.
종양 세포 붕괴성 바이러스 및/또는 면역 체크 포인트 조절제 조성물(들) 각각은 또한, 예를 들면, 삼투압, 점도, 투명도, 색, 무균성, 안정성, 제형의 용해 속도를 포함하는 목적하는 약제학적 또는 약력학적 특성을 제공하고, 인간 또는 동물 대상체에의 방출 또는 흡수를 변형시키거나 유지시키고, 혈액 장벽을 교차하는 수송 또는 특정 기관으로의 침투를 촉진시키기 위한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다.
종양 세포 붕괴성 바이러스 및 면역 체크 포인트 조절제 조성물(들) 각각은 또한 제한 없이, 알룸, 미네랄 오일 에멀젼, 예를 들면, 프로인트 완전 및 불완전(IFA), 리포다당류 또는 이의 유도체(참조: Ribi et al., 1986, Immunology and lmmunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419), QS21과 같은 사포닌(참조: Sumino et al., 1998, J.Virol. 72: 4931; W098/56415), 이미퀴모드와 같은 이미다조-퀴놀린 화합물(참조: Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43:S6), S-27609(참조: Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324) 및 WO2007/147529에 기재된 것들과 같은 관련 화합물, CpG와 같은 시토신 포스페이트 구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드(참조: Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358) 및 IC-31과 같은 양이온성 펩티드(참조: Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 822: 263-70)를 포함하여, 면역(특히, T 세포-매개 면역)을 자극하거나, 예를 들면, TLR-7, TLR-8 및 TLR-9와 같은 톨형 수용체(TLR)를 통해 투여시 종양 세포의 감염을 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 애주번트(들)를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 배합물에 포함된 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 특히 동결(예: -70℃, -20℃), 냉장(예: 4℃) 또는 주위 온도에서 제조 및 장기간 저장(즉, 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 2년 동안) 조건하에 그들의 안정성을 향상시킬 목적으로 제형화될 수 있다. 다양한 바이러스 제형은 동결된 액체 형태 또는 동결건조 형태로 당해 분야에서 이용 가능하다(예: WO98/02522, WO01/66137, WO03/053463, WO2007/056847 및 WO2008/114021 등). 고체(예: 건조 분말화되거나 동결건조됨) 조성물은 진공 건조 및 동결 건조를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다. 예시 목적으로, 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제 및 수크로스 또는 만니톨과 같은 안정화제를 함유하는 무균 히스티딘, 아세테이트 시트레이트 또는 포스페이트 완충제 생리식염수는 재조합 항체의 보존에 적합하고, NaCl 및/또는 당을 포함하는 완충 제형은 바이러스의 보존에 특히 적합하다(예: 사카로스 5% (W/V), 나트륨 글루타메이트 10mM 및 NaCl 50mM을 포함하는 트리스 10mM pH 8 또는 글리세롤(10%) 및 NaCl을 갖는 인산염-완충 생리식염수).
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 적절한 분포 또는 생체내 지연 방출을 보장하기 위해 제형화될 수 있다. 예를 들면, 이는 리포솜으로 제형화될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 다수의 방법은 문헌(참조: 예를 들면, J. R. Robinson in "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)에 기재되어 있다.
종양 세포 붕괴성 바이러스 및 면역 체크포인트 조절제(들)의 적합한 투여량은 다양한 파라미터의 함수로서 적응시킬 수 있고, 관련 상황에 비추어 의사에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 면역 체크포인트 조절제(들)의 적합한 투여량은 약 O.Olmg/kg 내지 약 50mg/kg, 유리하게는 약 O.lmg/kg 내지 약 30mg/kg, 바람직하게는 약 0.5mg/kg 내지 약 25mg/kg, 바람직하게는 약 lmg/kg 내지 약 20mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 2mg/kg 내지 약 15mg/kg으로 가변적이고, 전신적으로 사용되는 경우, 약 3mg/kg 내지 약 lOmg/kg(예: 3mg/kg, 4mg/kg, 5mg/kg, 6mg/kg, 7mg/kg, 8mg/kg, 9mg/kg 또는 lOmg/kg)의 용량이 특히 바람직하다. 그러나, 10 내지 100배까지 감소된 용량이 면역 체크포인트 조절제(들)의 국소 종양내 주사(들)를 위해 고려될 수 있다. 종양 세포 붕괴성 바이러스의 적합한 투여량은 사용되는 바이러스 및 정량적 기술에 의존하여 약 105 내지 약 1013 vp(바이러스 입자), iu(감염 단위) 또는 pfu(플라크 형성 단위)로 가변적이다. 일반적인 지침으로서, 약 105 내지 약 1013 pfu의 백시니아 바이러스 용량, 바람직하게는 약 106pfu 내지 약 1011 pfu, 더욱 바람직하게는 약 107 pfu 내지 약 5xl09 pfu가 적합하고; 특히 인간 사용을 위해 약 108pfu 내지 약 109pfu의 용량이 특히 바람직하다(예: 108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 또는 109 pfu의 용량). 동일 라인에서, 10 내지 100배까지 감소된 용량이 종양 세포 붕괴성 바이러스의 국소 종양내 주사(들)를 위해 고려될 수 있다. 106 내지 5xl012 vp의 개별 용량, 바람직하게는 107 내지 1012 vp, 더욱 바람직하게는 108 내지 5x1011 vp가 종양 세포 붕괴성 아데노바이러스에 특히 적합하다. 샘플에 존재하는 바이러스의 양은 통상적인 적정 기술에 의해, 예를 들면, 허용 세포(예: BHK-21 또는 CEF)를 사용하여 허용 세포의 감염 후 플라크의 수를 계수하고, 면역염색하고(예: 항바이러스 항체 사용; Caroll et al., 1997, Virology 238: 198-211), A260 흡광도(vp 역가)를 측정하거나, 정량적 면역형광(iu 역가)에 의해 결정될 수 있다.
투여
종양 세포 붕괴성 바이러스 및/또는 면역 체크 포인트 조절제는 단일 용량 또는 다수 용량으로 대상체에게 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 수행될 수 있고, 동일 부위 또는 대안의 부위에서 발생할 수 있다.
본 발명의 배합물에 포함된 활성제 각각을 위해 비경구, 국소 또는 점막 경로를 포함하는 임의의 통상적 투여 경로가 본 발명의 맥락에서 이용가능하다. 비경구 경로는 주사 또는 주입으로서 투여에 의도되고, 전신 뿐만 아니라 국소 경로를 포함한다. 일반적인 비경구 주사 형태는 정맥내(정맥에), 동맥내(동맥에), 피내(피부에), 피하(피부 아래), 근육내(근육에) 및 종양내(종양에 또는 이의 가까이에)이다. 주입은 전형적으로 정맥내 경로로 제공된다. 점막 투여는, 제한 없이, 경구/소화기, 비내, 기관내, 폐내, 질내 또는 직장내 경로를 포함한다. 국소 투여는 또한 경피 수단(예: 패치 등)을 사용하여 수행될 수 있다. 투여는 통상적인 시린지 및 침(예: 4중 주사 침) 또는 대상체에서 활성제(들)의 전달을 촉진시키거나 향상시킬 수 있는 당해 분야에서 이용가능한 임의의 화합물 또는 장치를 사용할 수 있다. 면역 체크포인트 조절제(들)의 바람직한 투여 경로는 정맥내(예: 정맥내 주사 또는 주입), 종양내 및 복강내를 포함한다. 경피 패치가 또한 예상될 수 있다. 종양 세포 붕괴성 바이러스의 바람직한 투여 경로는 정맥내 및 종양내를 포함한다. 종양 세포 붕괴성 바이러스의 국소 종양내 접종은 유리하게는 동시에 또는 원격 전이 또는 종양 병변에 대한 최적의 절제 효과를 기대하는 상이한 스케줄링으로 면역 체크포인트 조절제(들)의 국소 종양내 주사와 병용될 수 있다. 이는 또한 각 생성물의 유효량을 저하시키고 또한 불필요한 부작용을 감소시키는 것을 가능하게 할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)는 순차적으로 투여될 수 있고, 예를 들면, 종양 세포 붕괴성 바이러스가 먼저, 면역 체크포인트 조절제(들)가 두 번째로 투여되거나, 그 반대이다(면역 체크포인트 조절제(들)가 먼저, 종양 세포 붕괴성 바이러스가 두 번째로 투여된다). 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)가 사용되는 경우(예: 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체), 그들은 투여되는 각 항체의 투여량이 본원에서 나타낸 범위내인 경우 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 또한, 병용 요법의 하나 이상의 용량이 순차적으로 투여되면, 순차적 투여의 순서는 각 투여 시점에서 역전될 수 있거나 동일 순서로 유지될 수 있다. 또한, 순차적 투여는 동시 투여와 병용될 수 있다. 휴지 기간 후에 반복되는 투여의 순차적 주기를 진행시키는 것도 또한 가능하다. 각 투여 사이의 간격은 수시간 내지 1년(예: 24시간, 48시간, 72시간, 1주, 2주 마다, 매달 또는 매년)일 수 있다. 간격은 또한 불규칙적일 수 있다(예: 환자 혈액 수준에서 모노클로날 항체의 측정 이후). 용량은 상기 기재된 범위 내에서 각 투여를 위해 가변적일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 종양 세포 붕괴성 바이러스는 107 내지 5xl09pfu의 범위 내의 용량으로 1회 또는 수회(예: 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 또는 8회 등) 투여될 수 있다. 각 바이러스 투여 사이의 시간 간격은 약 1일 내지 약 8주, 유리하게는 약 2일 내지 약 6주, 바람직하게는 약 3일 내지 약 4주, 더욱 더 바람직하게는 약 1주 내지 약 3주로 가변적일 수 있다. 조합으로, 면역 체크 포인트 조절제(들)는 2mg/kg 내지 15mg/kg의 범위 내의 용량으로 1회 또는 수회(예: 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 또는 8회 등) 투여된다. 면역 체크 포인트 조절제(들)의 각 투여 사이의 시간 간격은 약 1일 내지 약 8주, 유리하게는 약 2일 내지 약 6주, 바람직하게는 약 3일 내지 약 4주, 더욱 더 바람직하게는 약 3일 내지 약 3주로 가변적일 수 있다. 예시 목적을 위해, 이필리무맙의 바람직한 투여 스케쥴은 전체 4회 용량에 대해 3주 마다 정맥내 주입으로서 3mg/kg이다. 일부 구현예에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 둘 이상의 모노클로날 항체는 동시에 투여되고, 이 경우, 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위 내이다. 바람직한 구현예에서, 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 면역 체크포인트 조절제(들)는 순차적으로(개별적으로 또는 산재된) 투여되고, 바이러스가 먼저 시작하고 면역 체크포인트 조절제(들)가 이어지는 것이 특히 바람직하다. 종양 세포 붕괴성 바이러스의 최초 투여와 면역 체크 포인트 조절제(들)의 최초 투여 사이의 기간은 약 수 시간(적어도 6시간) 내지 수 주(들)로 가변적일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 면역 체크포인트 조절제(들)의 투여를 개시하기 전에 종양 세포 붕괴성 바이러스의 적어도 1회 투여를 포함하고, 적어도 2회의 바이러스 투여 후 면역 체크 포인트 조절제(들)의 2 내지 5회 투여가 특히 바람직하다(예: 2차 바이러스 투여를 1차 면역 체크포인트 조절제 투여로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 분리). 다른 바람직한 치료 계획은 2 또는 3주 마다 3 내지 10mg/kg의 항-면역 체크포인트 항체(들)의 2 내지 5회(예: 3 또는 4회) 정맥내 투여가 이어지거나 산재되는 약 1 또는 2주 간격으로 108 또는 109 pfu의 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스의 2 내지 5회(예: 3회) 정맥내 또는 종양내 투여를 포함한다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 투여함을 포함하는, 암과 같은 증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스와 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)의 배합물은 증식성 질환 치료용, 특히 암을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에서 암 치료용으로 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 투여함을 포함하는, 생체내 종양 세포 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스와 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)의 배합물은 분열 세포의 용해 증가용으로 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 투여함을 포함하는, 종양 세포에 대한 면역 반응을 증강시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스와 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)의 배합물은 CD8+ T 림프구, 특히 종양 침윤성 CD8+ T 림프구의 수 및/또는 기능성 증가용으로 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)와 조합하여 본원에 기재된 종양 세포 붕괴성 바이러스로 생체외 감염된 동종이계 종양 세포주 뿐만 아니라 상기 대상체에서 상기 감염된 동종이계 종양 세포주에 의해 유도된 면역을 활성화시키기 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스로 감염된 상기 동종이계 종양 세포주를 투여한 후 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 투여함을 포함하는, 암과 같은 증식성 질환을 생체외 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배합물 및 방법을 사용하여 치료할 수 있는 증식성 질환의 예는 골암, 간암, 췌장암, 위암, 결장암, 식도암, 구강-인두암, 폐암, 두경부암, 피부암, 흑색종, 자궁암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 직장암, 항문 부위의 암, 전립선암, 림프종, 내분비계의 암, 갑상선 암, 연조직 육종, 만성 또는 급성 백혈병, 방광암, 신장암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 신경교종 등을 포함한다. 본 발명은 또한 전이성 암, 특히 PD-L1을 발현시키는 전이성 암의 치료에 유용하다(참조: Iwai et al., 2005, Int. Immunol. 17: 133-44). 본 발명에 따르는 병용 요법을 사용하여 치료할 수 있는 바람직한 암은 전형적으로 면역요법에 반응성인 암을 포함한다. 치료에 바람직한 암의 비제한적인 예는 흑색종(예: 전이성 악성 흑색종), 신장암(예: 명확한 세포 암종), 전립선암(예: 호르몬 불응성 전립선 선암종), 유방암, 결장직장암, 폐암(예: 비소세포 폐암) 및 간암(예: 간암종)을 포함한다.
유리한 구현예에 따라서, 특히 종양 세포 붕괴성 바이러스가 자살 유전자로 구비되는 경우, 본 발명에 따르는 병용 요법 또는 방법은 약제학적으로 허용되는 양의 프로드럭, 유리하게는 시토신의 유사체, 특히 5-FC가 대상체에게 투여되는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 예시로서, 50 내지 500mg/kg/일의 용량을 사용할 수 있고, 200mg/kg/일 또는 100mg/kg/일의 용량이 바람직하다. 본 발명의 맥락 내에서, 프로드럭은 표준 관행(예: 경구, 전신 등)에 따라서 투여된다. 바람직하게는, 투여는 종양 세포 붕괴성 바이러스의 투여에 이어, 바람직하게는 바이러스의 투여 후 적어도 3일, 보다 바람직하게는 적어도 4일, 더욱 더 바람직하게는 적어도 7일 후에 발생한다. 경구 경로가 바람직하다. 단일 용량의 프로드럭 또는 독성 대사산물이 숙주 유기체 또는 세포 내에서 생성되도록 하기에 충분히 긴 시간 동안 반복되는 용량들을 투여할 수 있다.
본 발명에 따르는 배합물 또는 방법은 항암 요법에 효과적인 하나 이상의 물질과 관련될 수 있다. 본 발명에 따르는 조성물과 관련하여 또는 함께 사용될 수 있는 항암 요법에 효과적인 약제학적 물질 중, 보다 구체적으로 다음을 언급할 수 있다:
√ 알킬화제, 예를 들면, 미토마이신 C, 사이클로포스파미드, 부설판, 이포스파미드, 이소스파미드, 멜팔란, 헥사메틸멜라민, 티오테파, 클로람부실 또는 다카바진;
√ 항대사산물, 예를 들면, 겜시타빈, 카페시타빈, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 2-플루오로데옥시 시티딘, 메토트렉세이트, 이다트렉세이트, 토무덱스 또는 트리메트렉세이트;
√ 토포아이소머라제 II 억제제, 예를 들면, 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 테니포사이드 또는 미톡산트론;
√ 토포아이소머라제 I 억제제, 예를 들면, 이리노테칸(CPT-11), 7-에틸-10-하이드록시-캠프토테신(SN-38) 또는 토포테칸;
√ 항유사분열 약물, 예를 들면, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴 또는 비노렐빈;
√ 백금 유도체, 예를 들면, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 스피로백금 또는 카보백금;
√ 티로신 키나제 수용체의 억제제, 예를 들면, 수니티닙((Pfizer) 및 소라페닙(Bayer); 및
√ 항신생물 항체.
본 발명에 따르는 배합물 또는 방법은 또한, 예를 들면, 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 인터류킨(특히, IL-2, IL-6, IL-10 또는 IL-12) 또는 종양 괴사 인자와 같은 면역조절제; 예를 들면, 상피 성장 인자 수용체의 억제제(특히, 세툭시맙, 파니투무맙, 잘루투무맙, 니모투주맙, 마투주맙, 게피티닙, 에를로티닙 또는 라파티닙) 또는 인간 상피 성장 인자 수용체-2의 억제제(특히 트라스투주맙)와 같은 세포 표면 수용체의 조절에 영향을 미치는 제제; 및, 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자의 억제제(특히, 베바시주맙 또는 라니비주맙)와 같은 혈관신생에 영향을 미치는 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 제제와 관련하여 사용될 수 있다.
항암 요법에 효과적인 이러한 물질은 대상체에게 본 발명에 따르는 배합물 또는 방법과 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
대안적으로 또는 조합하여, 본 발명에 따르는 배합물 또는 방법은 또한 방사선 요법과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 배합물의 활성제(들)를 키트 형태로 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 키트는 하나의 용기(예: 무균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 본원에서 논의된 적어도 하나의 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 다른 용기(예: 무균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 본원에 기재된 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함한다. 바람직한 키트는 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스(예: 자살 유전자로 구비된 TK 및 RR 활성 둘 다에 결함이 있는 백시니아 바이러스) 및 CTLA-4(예: 항-CTLA-4 항체, 예를 들면, 이필리무맙)에 특이적으로 결합하는 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함한다. 다른 바람직한 키트는 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스(예: 자살 유전자로 구비된 TK 및 RR 활성 둘 다에 결함이 있는 백시니아 바이러스) 및 PD-1(예: 항-PD-1 항체, 예를 들면, 니볼루맙 또는 란브롤리주맙)에 특이적으로 결합하는 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함한다. 다른 바람직한 키트는 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스(예: 자살 유전자로 구비된 TK 및 RR 활성 둘 다에 결함이 있는 백시니아 바이러스) 및 PD-L1(예: 항-PD-L1 항체, 예를 들면, MPDL3280A 또는 BMS936559)에 특이적으로 결합하는 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함한다. 임의로, 키트는 활성제의 투여를 실행하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트 중의 조성물 또는 개별 성분 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다.
도 1a, b 및 c는 0일 및 3일째에 107 pfu의 WRTG17137의 2회 종양내 주사 및 6일, 9일 및 12일째에 250μg의 항-PD-1 항체의 3회 복강내 주사로 치료된 상이한 시점(각각, D2, D13 및 D20)에 마우스에 이식된 MCA205 종양의 성장을 도시한다.
도 2는 8x105 MCA205 종양 세포가 이식되고, 0일 및 3일째에 WRTG17137의 2회 종양내 주사 및 6일, 9일 및 12일째에 항-PD-1 항체의 3회 복강내 주사로 치료된 마우스의 생존률을 도시한다.
도 3a, b 및 c는 0일 및 3일째에 107 pfu의 WRTG17137의 2회 종양내 주사 및 6일, 9일 및 12일째에 100μg의 항-CTLA4 항체의 3회 복강내 주사로 치료된 상이한 시점(각각, D3, D8 및 D13)에 마우스에 이식된 MCA205 종양의 성장을 도시한다.
도 4는 8x105 종양 세포가 이식되고, 0일 및 3일째에 WRTG17137의 2회 종양내 주사 및 6일, 9일 및 12일째에 항-CTLA-4 항체의 3회 복강내 주사로 치료된 마우스의 생존률을 도시한다.
도 5a 및 b는 0일 및 3일째에 증가하는 용량의 WRTG17137(105, 106 또는 107 pfu)의 2회 종양내 주사 및 6일, 9일 및 12일째에 250μg의 항-PD-1 항체의 3회 복강내 주사로 치료된 마우스에 이식된 MCA205 종양의 성장을 도시한다. 종양 진행은 12일 및 14일째에 측정한다. 검은색 둥근 점은 바이러스만으로 치료된 마우스의 종양 진행을 나타내고, 회색 사각형 점은 바이러스와 항-PDl 항체로 치료된 마우스의 종양 진행을 나타낸다.
도 6은 0일 및 3일째에 107 pfu의 WRTG17137의 2회 종양내 주사 및 250μg의 항-PD-1 항체 또는 이소타입 대조군의 3회 복강내 주사로 치료된 마우스에게 이식된 MCA205 종양의 성장을 도시하고, 1차 항체 주사는 2차 바이러스 주사 1일, 3일, 5일 또는 7일 후이다. 종양 진행은 경시적으로 측정된다. 검은색 둥근 점은 바이러스 및 이소타입 대조군으로 치료된 마우스의 종양 진행을 나타내는 반면, 회색 사각형, 삼각형, 다이아몬드 및 육각형 모양의 점은 2차 바이러스 주사 1일, 3일, 5일 및 7일 후에 바이러스 및 항-PD-1 항체로 치료된 마우스의 종양 진행을 나타낸다.
도 7은 0일 및 3일째에 107 pfu의 WRTG17137의 2회 종양내 주사 및 100μg의 항-CTLA-4 항체 또는 이소타입 대조군의 3회 복강내 주사로 치료된 마우스에게 이식된 MCA205 종양의 성장을 도시하고, 1차 항체 주사는 2차 바이러스 주사 1일, 3일, 5일 또는 7일 후이다. 종양 진행은 경시적으로 측정된다. 검은색 둥근 점은 바이러스 및 이소타입 대조군으로 치료된 마우스의 종양 진행을 나타내는 반면, 회색 사각형, 삼각형, 다이아몬드 및 육각형 모양의 점은 2차 바이러스 주사 1일, 3일, 5일 및 7일 후에 바이러스 및 항-CTLA-4 항체로 치료된 마우스의 종양 진행을 나타낸다.
본 발명자들은 면역 체크포인트 차단 접근법을 종양 세포 붕괴성 백시니아 벡터와 조합하도록 설정한다. 종양에서 바이러스 복제는 세포사, 종양의 파괴 및 종양 항원의 해방을 초래할 것이다. 종양 세포 붕괴성 바이러스와 항면역 체크포인트 억제제의 배합물은 T 세포 생성 및 생성되는 종양 특이적 T-세포로부터 브레이크를 해제해야 한다. 바이러스 벡터와 조합된 면역 체크포인트 차단제의 상승 효과에 대한 전임상 증거는 마우스 종양 모델에서 증명되어야 했다. 이는 i) 뮤린-특이적 항-면역 체크 포인트 항체 및 ii) 높은 효능으로 뮤린 세포를 감염시킬 수 있는 종양 세포 붕괴성 폭스바이러스의 사용을 의미한다.
이러한 연구를 위해 선택된 종양 세포 붕괴성 바이러스(WRTG17137)는 건강한(비분열) 세포에서 바이러스가 비복제성이도록 하는 티미딘 키나제(TK-)(유전자좌 J2R) 및 RR-(유전자좌 I4L)에 결함이 있는 백시니아 바이러스(VV) 웨스턴 리저브(WR) 균주이다. 대조적으로, VV TK-RR-은 종양 세포에서 선택적이고 효율적으로 복제하는 것으로 간주된다. 이는 5-플루오로우라실(5-FU)을 독성 동화 물질인 프로드럭 5-플루오로시토신(5-FC) 및 5-플루오로우리딘-5'모노포스페이트로로 전환시키는 효소인 키메라 효모 유래 유전자로 구비된다.(참조: Erbs et al., 2000, Cancer Res., 60(14): 3813-22).
두 면역 체크포인트 조절제, 즉 항-PD-1 및 항-CTLA4 모노클로날 항체는 WRTG17137와 함께 개별적으로 시험되었다.
종양 세포 붕괴성 VV와 항-PD-1 MAb의 배합물
이는 최초로 적절한 항체로 면역 체크포인트 차단제 뮤린 PD-1(mPD-1)을 표적화하기 위해 선택되었다. 랫트 항 mPD-1 항체 RMP1-14(BioXcell)를 항 mPD-1로서 선택하였다. 이 항체는 mPDl과 이의 리간드의 상호작용을 차단하는 것으로 나타났다(참조: Ysamazaki et al., 2005, J. Immunol. 175(3): 1586-92).
mPD-1 억제제(상업적 클론 RMP1-14)와 종양 세포 붕괴성 바이러스 WRTG17137의 배합물은 MCA205(참조: Shu and Rosenberg, 1985, Cancer Res. 45(4): 1657-62) 마우스 모델에서 생체내 시험하였다. 다양한 투여 스케줄이 실험되었다.
제1 셋팅에서, C57BL/6 마우스에게 8x105 MCA205 종양 세포를 피하 주사했다. 종양 세포 주사 7일 후에, 250μg의 항 mPDl 항체 RMP1-14 또는 이의 이소타입 대조군 2A3을 0일, 3일 및 6일째에 복강내(ip) 주사했다. 이어서, 바이러스 WRTG17137(1xlO7 pfu)을 7일 및 10일째에 2회 종양내(it) 주사했다. 이소타입 대조군을 수용한 대조군 그룹(0일, 3일 및 6일째에 3회 ip 주사), 항-PD-1 mAB로 치료된 한 그룹의 마우스(0일, 3일 및 6일째에 3회 ip 주사), 종양 세포 붕괴성 바이러스로 치료된 한 그룹의 마우스(7일 및 10일째에 2회 it 주사) 및 항-PD-1 mAb(0일, 3일 및 6일째에 3회 ip 주사) 및 최종 항체 주사 1일 후 이어지는 WRTG17137의 2회 주사(7일 및 10일째에 2회 it 주사) 둘 다를 수용한 제4 그룹인 13마리 마우스의 4 그룹을 시험했다. 종양 진행 및 마우스 생존률은 40일 동안 추적되었다.
예상된 바와 같이, 종양의 크기는 대조군에서 매우 빠르게 증가된 반면, 종양 성장은 mPD-1 항체 및 종양 세포 붕괴성 바이러스 둘 다를 수용한 그룹에서 약간의 개선이 나타났지만 다른 세 그룹 모두에서는 동일한 정도 내에서 지연되었다. 생존 결과는 대조군, 항체 그룹, WRTG17137-처리 그룹 및 항체 + WRTG17137-처리 그룹에서 각각 16일, 23일, 24일 및 26일째에 수득된 50% 생존율과 동일 선상에 있다.
제2 셋팅에서, C57BL/6 마우스는 이전과 같이 8x105 MCA205 종양 세포를 피하 주사하였고, 동물을 각각 이소타입 대조군을 수용한 대조군 그룹(6일, 9일 및 12일째에 3회 ip 주사), 종양 세포 붕괴성 바이러스로 치료된 한 그룹의 마우스(0일 및 3일째에 lxlO7 pfu WRTG17137의 2회 it 주사), 항-PD-1 mAb로 치료된 한 그룹의 마우스(6일, 9일 및 12일째에 250㎍ 항 mPD1 항체 RMP1-14의 3회 ip 주사) 및 바이러스(0일 및 3일째)에 이어, 3일 후 항체 주사(3일 마다, 즉 6일, 9일 및 12일째에 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 제4 그룹인, 13마리 마우스의 네 그룹으로 나누었다. 종양 진행 및 생존률은 40일 동안 추적되었다.
예상된 바와 같이, 종양의 크기는 대조군에서 매우 빠르게 증가된 반면, 종양 성장은 다른 세 그룹 모두에서 지연되었다. 그러나, 도 1에 도시된 바와 같이, 단지 하나의 구성 요소(mPD-1 항체 또는 종양 세포 붕괴성 바이러스)로 치료된 그룹에서 동일한 정도로 지연되고, 감속은 특히 시점 D13 및 D20에서 mPD-1 항체와 종양 세포 붕괴성 바이러스 둘 다를 수용한 그룹에서 더욱 현저하다.
도 2에 도시된 바와 같이, 50% 생존율은 대조군에서 16일째에 수득된다. 생존율의 증가는 WRTG17137 주사(22일째에 50% 생존율)에 기인하여 또는 mPD-1 주사(20일째에 50% 생존율)에 기인하여 관찰되었다. 생존율은 WRTG17137에 이어 항체의 투여 후에 추가로 증가되었다(50% 생존율은 28일째에 측정되었다).
항- CTLA4 억제제의 배합물
종양 세포 붕괴성 바이러스 WRTG17137과 항-CTLA-4 항체(상업적 클론 9D9)의 배합물은 MCA205 마우스 모델에서 생체내 시험하였다. 다양한 투여 스케줄이 실험되었다.
제1 셋팅에서, C57BL/6 마우스에게 8x105 종양 세포(MCA205)를 피하 주사했다. 종양 세포 주사 7일 후에, 100μg의 항 CTLA-4 항체 9D9(BioXcell)를 0일, 3일 및 6일째에 ip 주사했다. 바이러스 WRTG17137(1xlO7 pfu)을 7일 및 10일째에 2회 종양내 주사했다. 각각 이소타입 대조군 MCP-11을 수용한 대조군 그룹(0일, 3일 및 6일째에 3회 ip 주사), 항-CTLA-4 mAb로 치료된 한 그룹의 마우스(0일, 3일 및 6일째에 3회 ip 주사), 종양 세포 붕괴성 바이러스로 치료된 한 그룹(7일 및 10일째에 2회 it 주사) 및 항-CTLA-4 항체(0일, 3일 및 6일째에 3회 ip 주사) 및 최종 항체 주사 1일 후 이어지는 WRTG17137의 2회 주사(7일 및 10일째에 2회 it 주사) 둘 다를 수용한 제4 그룹인, 6마리 마우스의 네 그룹을 시험했다. 종양 진행 및 마우스 생존률은 35일 동안 추적되었다.
예상된 바와 같이, 종양의 크기는 대조군에서 매우 빠르게 증가된 반면, 종양 성장은 대략 동일한 정도 내에서 다른 세 그룹 모두에서 지연되었다.
제2 셋팅에서, 마우스는 이전과 같이 8x105 MCA 종양 세포를 피하 주사하였고, 이소타입 대조군 MCP-11을 수용한 대조군(0일, 3일 및 6일째에 3회 ip 주사), 종양 세포 붕괴성 바이러스로 치료된 한 그룹의 마우스(0일 및 3일째에 lxlO7 pfu WRTG17137의 2회 it 주사), 100㎍의 항-CTLA-4 mAb 9D9(6일, 9일 및 12일째에 3회 ip 주사)로 치료된 한 그룹의 마우스, 및 바이러스(0일 및 3일째)에 이어, 3일 후 항-CTLA-4 항체(3일 마다, 즉 6일, 9일 및 12일째에 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 제4 그룹인, 6마리 마우스의 네 그룹을 시험하였다. 종양 진행 및 생존률은 35일 동안 추적되었다.
예상된 바와 같이, 종양의 크기는 대조군에서 매우 빠르게 증가되었다. 종양 성장은 다른 세 그룹 모두에서 지연되었다. 그러나, 도 3에 도시된 바와 같이, 종양 용적은 단지 하나의 구성 요소(항-CTLA-4 항체 또는 종양 세포 붕괴성 바이러스)로 치료된 그룹에서 감소되었고, 감속은 항CTLA4 항체와 종양 세포 붕괴성 바이러스 둘 다를 수용한 그룹에서 더욱 더 현저하다.
도 4에 도시된 바와 같이, 50% 생존율은 대조군에서 18일째에 수득된다. 생존율의 증가는 WRTG17137 주사(21일째에 50% 생존율)에 기인하여 또는 항 CTLA-4 항체 주사(20일째에 50% 생존율)에 기인하여 관찰되었다. 생존율은 WRTG17137에 이어 항체의 투여 후에 추가로 증가되었다(50% 생존율은 32일째에 측정되었다).
용량 효과
바이러스의 가변 용량으로 이전과 동일한 실험을 수행했다. 6마리 마우스의 네 그룹은 종양 이식(8x105 MCA 종양 세포) 후 치료하였다. 대조군은 바이러스 대신 제형 완충제 및 항체 대신 이소타입 대조군을 수용했다. 제2 그룹은 105, 106 또는 107 pfu의 WRTG17137(0일 및 3일째에 2회 2 it 주사)로 치료하였고, 제3 그룹은 항-PD-1 mAb(6일, 9일 및 12일째에 250㎍의 항 mPDl 항체 MP1-14의 3회 ip 주사)로 치료하였다. 제4 그룹은 바이러스(0일 및 3일째에 105, 106 또는 107 pfu)에 이어 3일 후 항체(3일 마다, 즉 6일, 9일 및 12일째에 3회 ip 주사) 둘 다를 수용했다. 종양 진행은 15일 동안 추적되었다.
도 5는 동일 용량의 바이러스 단독(검은색 둥근 점) 또는 제1 바이러스 주사 후 12일 및 14일째에 항-PD-1과 조합하여(회색 사각형 점) 치료된 마우스에서 관찰된 종양 진행을 도시한다. 종양에 주사된 바이러스가 무엇이든, 종양 성장은 종양 세포 붕괴성 바이러스 단독으로 치료된 마우스에서 측정된 것과 비교하여 바이러스 + 항-PD-1의 조합으로 치료된 마우스에서 지연된다.
이러한 결과는 특히 바이러스가 면역 체크포인트 조절제 전에 먼저 투여되는 경우, 본 발명의 배합물의 치료적 및 상승적 항종양 활성을 예시한다.
바이러스와 항체 투여 사이의 시간 간격의 변동
항- PDl 항체 배합물
6주령 암컷 C57BL/6 마우스는 우측 옆구리에 8x105 MCA205 종양 세포를 피하(sc) 주사했다. 0일째(DO)에, 종양 용적이 40 내지 60mm2에 달하면, 동물을 무작위화하여 6마리 마우스의 11개 그룹으로 나눈다. 완충제를 수용한 대조군 그룹(0일 및 3일째에 2회 it 주사), 종양 세포 붕괴성 바이러스로 치료된 한 그룹의 마우스(0일 및 3일째에 lxlO7 pfu WRTG17137의 2회 it 주사), 바이러스(0일 및 3일째) 및 이소타입 대조군(6일, 9일 및 12일째에 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 그룹, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(4일, 7일 및 10일째에 250μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(6일, 9일 및 12일째에 250μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(8일, 11일 및 14일째에 250μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(10일, 13일 및 16일째에 250μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(4일, 7일 및 10일째에 100μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(6일, 9일 및 12일째에 100μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(8일, 11일 및 14일째에 100μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스, 및 바이러스(0 및 3일째) 및 항-PD-1 mAb(10일, 13일 및 16일째에 100μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스. 종양 진행 및 생존율은 경시적으로 추적되었다.
도 6에 도시된 바와 같이, 종양 성장은 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 이소타입 항체로 치료된 마우스에서 측정된 것과 비교하여 바이러스와 항-PD-1(250μg/마우스)의 조합으로 치료된 마우스에서 지연된다. 바이러스의 투여와 항체의 투여 사이의 시간이 길면, 더 많은 종양 성장이 제어된다. 대조군과 바이러스 + 항-PD-1 그룹(D+7, 그것은 10일, 13일 및 16일째에 250μg의 항 mPDl 항체 클론 RMP1-14의 3회 ip 주사이다)의 통계적 차이는 치료 후 9일 및 13일째에 관찰되었다. 동일한 경향은 대조군(lxlO7 pfu/마우스 + 100μg 이소타입/마우스)에 대한 임의의 통계적 차이는 없지만, WRTG17137(1xlO7 pfu/마우스)과 항-PD-1(100μg/마우스)의 배합물로 치료된 동물의 그룹에서 관찰되었다.
항- CTLA -4 항체 배합물
6주령 암컷 C57BL/6 마우스는 우측 옆구리에 8x105 MCA205 종양 세포를 피하(sc) 주사했다. 0일째(DO)에, 종양 용적이 40 내지 60mm2에 달하면, 동물을 무작위화하여 6마리 마우스의 11개 그룹으로 나눈다. 완충제를 수용한 대조군 그룹(0일 및 3일째에 2회 it 주사), 종양 세포 붕괴성 바이러스로 치료된 한 그룹의 마우스(0일 및 3일째에 lxlO7 pfu WRTG17137의 2회 it 주사), 바이러스(0일 및 3일째) 및 이소타입 대조군(6일, 9일 및 12일째에 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 그룹, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(4일, 7일 및 10일째에 100μg의 항 mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(6일, 9일 및 12일째에 100μg의 항 mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(8일, 11일 및 14일째에 100μg의 항 mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(10일, 13일 및 16일째에 100μg의 항-mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다로 치료된 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(4일, 7일 및 10일째에 50μg의 항-mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(6일, 9일 및 12일째에 50μg의 항-mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스, 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(8일, 11일 및 14일째에 50μg의 항-mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스, 및 바이러스(0 및 3일째) 및 항-CTLA4 mAb(10일, 13일 및 16일째에 50μg의 항-mCTLA4 항체 클론 9D9의 3회 ip 주사) 둘 다를 수용한 한 그룹의 마우스. 종양 진행 및 생존율은 경시적으로 추적되었다.
도 7에 도시된 바와 같이, 종양 성장은 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 이소타입 항체로 치료된 마우스에서 측정된 것과 비교하여 바이러스와 항-CTLA-4(100μg/마우스)의 배합물로 치료된 마우스에서 지연된다. 종양 성장은 치료 후 6일, 9일 및 13일째에 대조군에 대하여 이러한 3개 그룹에 대해 관찰된 통계적 차이로, 바이러스의 투여와 항체의 투여 사이의 짧은 기간(1일, 3일 또는 5일)으로 훨씬 더 지연되었다. 동일한 경향은, 대조군 그룹(lxlO7 pfu/마우스 + 100μg 이소타입/마우스)에 대한 임의의 통계적 차이는 없지만, WRTG17137(1xlO7 pfu/마우스)와 항-CTLA-4(50μg/마우스)의 배합물로 치료된 동물의 D+1, D+3 및 D+5 그룹에서 관찰되었다.
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 대체물, 변이체, 부가, 결실, 변형 및 치환을 포함하는 본원에 기재된 특정 방법 및 시약에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되고, 이하 청구범위에 의해 포함된다.

Claims (21)

  1. 암과 같은 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 적어도 하나의 종양 세포 붕괴성(oncolytic) 바이러스 및 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함하는 배합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스가 J2R 바이러스 유전자에서 돌연변이를 불활성화함으로써 생성되는 티미딘 키나제(TK)에 결함이 있는 백시니아 바이러스인, 배합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스가 바이러스 I4L 및/또는 F4L 유전자(들)에서 돌연변이를 불활성화함으로써 생성되는 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR) 활성에 결함이 있는 백시니아 바이러스인, 배합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스가 바이러스 게놈에 삽입된 적어도 하나의 치료적 유전자를 추가로 발현시키고, 상기 치료적 유전자가 자살 유전자 생성물을 코딩하는 유전자 및 면역자극성 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 배합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자살 유전자가 시토신 데아미나제(CDase) 활성, 티미딘 키나제 활성, 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제(UPRTase) 활성, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 활성 및 티미딜레이트 키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 배합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 자살 유전자 생성물이 CDase 및 UPRTase 활성을 갖고, 바람직하게는 codA::upp, FCY1::FUR1 및 FCYl::FURl[Delta] 105 (FCUl) 및 FCUl-8 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 배합물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스가 TK 및 RR 활성 둘 다에 대해 결함이 있고 게놈에 삽입된 치료적 FCUl 자살 유전자를 포함하는 백시니아 바이러스인, 배합물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 면역자극성 단백질이 인터류킨 또는 콜로니-자극 인자이고, GM-CSF가 특히 바람직한 것인, 배합물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스가 TK 활성에 대해 결함이 있고 게놈에 삽입된 치료적 인간 GM-CSF를 포함하는 백시니아 바이러스인, 배합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스를 약 107pfu 내지 약 5xl09pfu 포함하는, 배합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)가 억제성 면역 체크포인트(들)의 활성, 특히 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG 3, Tim3, BTLA 및 CTLA4 중 어느 하나에 의해 매개되는 것들을 적어도 부분적으로 길항시키는, 배합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)이 인간 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 니볼루맙, 란브롤리주맙 및 피딜리주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항-PD-1 항체를 포함하는, 배합물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)가 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 MPDL3280A 및 BMS-936559로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항 PD-L1 항체를 포함하는, 배합물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)가 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 이필리무맙, 트레멜리무맙 및 단일 쇄 항-CTLA 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항 CTLA4 항체를 포함하는, 배합물.
  15. 제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 약 2mg/kg 내지 약 15mg/kg 포함하는, 배합물.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 체크포인트 조절제(들)가 정맥내, 종양내 또는 복강내 경로로 투여되고, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스가 정맥내 또는 종양내 경로로 투여되는, 배합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)가, 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스가 먼저 투여되고 상기 면역 체크포인트 조절제(들)가 2차로 투여되는 것과 같이, 순차적으로 투여되는, 배합물.
  18. 제17항에 있어서, 108 또는 109pfu의 종양 세포 붕괴성 백시니아 바이러스를 약 1 또는 2주 간격으로 2 내지 5회 정맥내 또는 종양내 투여하고, 이이서 또는 그 사이에 3 내지 10mg/kg의 하나 이상의 항-면역 체크포인트 항체(들)를 2주 또는 3주마다 2 내지 5회 정맥내 투여함을 포함하는, 배합물
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 증식성 질환이 흑색종, 신장암, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암 및 간암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 배합물.
  20. 하나의 용기에 제2항 내지 제10항 및 제16항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 다른 용기에 제11항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제(들)를 포함하는 키트.
  21. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 종양 세포 붕괴성 바이러스 및 상기 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제의 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
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