ES2833425T3 - Combinación de virus oncolítico con moduladores de punto de control inmunitario - Google Patents

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Abstract

Combinación que comprende un poxvirus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario que antagonizan por lo menos parcialmente la actividad del/de los punto(s) de control inmunitario inhibidor(es) para la utilización para el tratamiento de un cáncer; en el que dicho poxvirus oncolítico es un virus vaccinia oncolítico defectuoso para la timidina cinasa (TK) resultante de las mutaciones inactivadoras en el gen vírico J2R y defectuoso para la actividad de ribonucleótido reductasa (RR) resultante de las mutaciones inactivadoras en los genes víricos I4L y/o F4L; en la que dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario son un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los siguientes: PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA y CTLA4; y en la que dicho poxvirus oncolítico y dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario se administran secuencialmente y en la que dicho poxvirus oncolítico se administra en primer lugar y dicho(s) modulador(es) de punto de control inmunitario se administran en segundo lugar.

Description

DESCRIPCIÓN
Combinación de virus oncolítico con moduladores de punto de control inmunitario
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general al campo de la viroterapia oncolítica y, más específicamente, a composiciones y métodos para tratar, prevenir o inhibir enfermedades proliferativas, especialmente el cáncer. Entre las formas de realización se incluye un virus oncolítico para la utilización para el tratamiento del cáncer en combinación con uno o más moduladores de punto de control inmunitario, tal como se define en las reivindicaciones. Las formas de realización incluyen asimismo un kit que comprende dichos componentes y un método de tratamiento que utiliza dicho virus oncolítico con dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario, tal como se define en las reivindicaciones.
Cada año se diagnostica cáncer en más de 12 millones de personas en todo el mundo. En los países industrializados, aproximadamente una de cada cinco personas morirá de cáncer. Aunque existe un amplísimo número de quimioterápicos, con frecuencia resultan ineficaces, especialmente contra tumores malignos y metastásicos que se establecen en un estadio muy temprano de la enfermedad. Además, la inmunidad antitumoral con frecuencia resulta ineficaz debido al hecho de que las células tumorales han desarrollado evolutivamente mecanismos para escapar a la defensa del hospedador. Uno de los mecanismos principales de supresión inmunitaria es un proceso conocido como “agotamiento de las células T”, que resulta de la exposición crónica a antígenos y se caracteriza por la regulación positiva de receptores inhibitorios. Dichos receptores inhibitorios sirven de puntos de control inmunitario a fin de evitar reacciones inmunitarias descontroladas. Se han descrito en la literatura diversos puntos de control inmunitario que actúan a diferentes niveles de la inmunidad de las células T, incluyendo la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) y sus ligandos PD-L1 y PD-L2, CTLA-4 (proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos), LAG3 (gen 3 de activación linfocitaria), atenuador de linfocitos B y T, inmunoglobulina de células T, proteína 3 que contiene dominio mucina (TIM-3) y supresor de inmunoglobulina de dominio V de la activación de las células T
Con independencia del mecanismo de acción, dichos puntos de control inmunitario pueden inhibir el desarrollo de una respuesta inmunitaria antitumoral eficiente. Existe un creciente interés en los posibles beneficios terapéuticos de bloquear dichos puntos de control inmunitario como medio para inhibir la tolerancia del sistema inmunitario a los tumores y de esta manera rescatar las células T antitumorales agotadas (Leach et al., Science 271: 1734-6, 1996). Se ha desarrollado un enorme número de anticuerpos antagonistas durante la última década (por ejemplo, anti-Tim3, anti-PD-L1, anti-CTLA-4, anti-PD1, etc.) y, más importante, algunos se han asociado a respuestas clínicas objetivas en pacientes de cáncer. Los anticuerpos con diana en CTLA-4 ya han sido comercializados (por ejemplo, Ipilimumab, Yervoy, Bristol-Myers Squibb, b Ms ) para el melanoma metastásico. BMS ha informado de que, de 1800 pacientes de melanoma tratados con Ipilimumab, 22% todavía están vivos 3 años después. También continúan las terapias de anticuerpos con anti-PD-L1 (por ejemplo, MPDL3280A, Roche) y anti-PD-1 (por ejemplo, Nivolumab, BMS).
Otro enfoque terapéutico que está surgiendo en el campo del cáncer son los virus oncolíticos (Hermiston, Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 322-30, 2006). Los virus oncolíticos son capaces de replicación selectiva en las células en división (por ejemplo, células de cáncer), mientras que no dañan las células que no se dividen (por ejemplo, células normales). A medida que las células en división infectadas son destruidas por lisis, liberan nuevas partículas de virus infecciosas que infectan las células en división circundantes. Las células de cáncer son hospedadores ideales para muchos virus porque su ruta antivírica de interferón está inactivada o presentan genes supresores tumorales mutados que permiten que continúe la replicación vírica sin obstáculos (Chernajovsky et al., British Med. J. 332: 170-2, 2006). Ya se han sometido a ensayo clínico varios virus, incluyendo adenovirus, reovirus, virus del sarampión, herpes simplex, virus de la enfermedad de Newcastle y vaccinia, como agentes oncolíticos.
Algunos virus son naturalmente oncolíticos (tales como los reovirus y el picornavirus del Valle de Seneca), mientras que otros se manipulan para selectividad tumoral mediante la modificación del genoma vírico. Entre dichas modificaciones se incluyen deleciones funcionales en genes víricos esenciales, la utilización de promotores específicos tumorales o de tejidos para controlar la expresión génica vírica y la modificación del tropismo para redirigir el virus a la superficie de las células de cáncer.
El primer virus oncolítico en ser aprobado por una agencia reguladora fue un adenovirus modificado genéticamente denominado H101 (Shanghai Sunway Biotech) que obtuvo la aprobación en 2005 de la China's State Food and Drug Administration (SFDA) para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. Otro adenovirus oncolítico, llamado ONYX-015, se encuentra en ensayo clínico para el tratamiento de diversos tumores sólidos (en fase III para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello recurrente) (Cohen et al., Curr. Opin. Investig. Drugs 2: 1770-5, 2001). A título de otro ejemplo, el herpes simplex oncolítico 1 (T-VEC) ha sido manipulado genéticamente para atenuar la virulencia vírica, incrementar la selectividad para las células de cáncer y potenciar la respuesta inmunitaria antitumoral (mediante expresión de GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos)). La eficacia clínica en melanoma no resecable ha sido demostrada en ensayos clínicos de fase II y fase III (Senzer et al., J. Clin. Oncol. 27: 5763-71,2009).
Los virus vaccinia (VV) poseen muchos de los atributos clave necesarios para la utilización en viroterapia oncolítica, tal como el tropismo natural para tumores, la fuerte capacidad lítica, el ciclo de vida corto con rápida expansión célula a célula, una expresión génica altamente eficiente y una gran capacidad de clonación. Además, se han administrado en millones de individuos durante la campaña de erradicación de la viruela sin problemas de seguridad importantes. A este respecto, un VV con doble deleción de TK (timidina cinasa) y VGF (factor de crecimiento de VV) expresante de GM-CSF (denominado JX-963) ha mostrado una selectividad significativa para el cáncer en ratones portadores tumorales (Thorne et al., J. Clin. Invest. 117: 3350-8, 2007). En la misma línea, JX-594, un VV con deleción de TK (cepa Wyeth) armado con GM-CSF ha mostrado datos clínicos prometedores y se espera para dentro poco el inicio de un ensayo de fase III aleatorizado de pacientes con carcinoma hepatocelular.
En la literatura también se han descrito terapias de combinación. El documento n° WO2010/014784 describe la combinación de un anticuerpo anti-CTLA4 con quimioterápicos utilizados para el tratamiento del cáncer, tales como GLEEVEC, TAXOL y similares. El documento n° WO2014/047350 contempla un virus oncolítico recombinante con un gen codificante de un anticuerpo anti-PD-1 insertado en el genoma vírico. Madan et al. (Madan, R. A. et al., Ipilimumab and a poxviral vaccine targeting prost phase 1 dose-escalation trial. The Lancet Oncology, vol. 13, n° 5, 501-508, 2012) y Rojas et al. (Rojas, J. et al., Optimizing oncolytic vaccinia virus and anti-CTLA4 combination therapy to treat cancer (VAC8P.997). J. Immunol. 192 (1 suplemento) 142.3, mayo de 2014) dan a conocer tratamientos de combinación de virus vaccinia oncolíticos que no son defectuosos para actividad de ribonucleótido reductasa (RR) con anticuerpos anti-CTLA-4 o anti-CD25.
Problema técnico
Podría esperarse que el cáncer continúe siendo una amenaza sanitaria global grave durante muchos años debido al elevado número de factores causales que pueden actuar juntos o por separado para iniciar o fomentar el desarrollo de un cáncer. Además, los tumores malignos y especialmente metastásicos con frecuencia son resistentes a las terapias convencionales, lo que explica la significativa morbilidad de algunos cánceres.
De esta manera, existe una importante necesidad de desarrollo de enfoques más eficaces, para mejorar la prevención y el tratamiento de dichas enfermedades proliferativas, y especialmente enfoques de combinación.
La terapia de combinación, en la que un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario se administran juntos, proporciona una respuesta inmunitaria sinérgica en comparación con cualquiera de los dos enfoques utilizado por separado. Inesperadamente, el tratamiento combinado en el que se administra un virus vaccinia oncolítico antes de la administración de n anticuerpo anti-punto de control inmunitario, tal como anti-PD1-o anti-CTLA-4, mejora la respuesta antitumoral, tal como se ha puesto de manifiesto en un animal modelo apropiado, proporcionando potencialmente de esta manera una terapia eficaz y potente contra el cáncer. De acuerdo con lo anterior, las formas de realización y ejemplos proporcionados en la presente memoria proporcionan un avance significativo en el tratamiento y la prevención de enfermedades proliferativas tales como el cáncer.
Dicho problema técnico se resuelve mediante la provisión de las formas de realización tal como se define en las reivindicaciones.
Otros aspectos y aspectos, características y ventajas adicionales resultarán evidentes a partir de la descripción siguiente de las formas de realización o ejemplos actualmente preferidos. Dichas formas de realización o ejemplos se proporcionan para el propósito de la exposición.
Sumario de la presente invención y la presente divulgación
La presente invención se refiere a una combinación que comprende un poxvirus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario que antagonizan por lo menos parcialmente la actividad de uno o más puntos de control inmunitaria inhibidores para la utilización en el tratamiento de un cáncer, en el que dicho poxvirus oncolítico es un virus vaccinia oncolítico defectuoso para la timidina cinasa (TK) que resulta de las mutaciones inactivadoras en el gen vírico J2R y defectuoso para la actividad de ribonucleótido reductasa (RR) que resulta de las mutaciones inactivadoras en los genes víricos I4L y/o F4L, en el que dichos modulador o moduladores de punto de control inmunitario son anticuerpos de unión específica a cualquiera de los siguientes: PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA y CTLA4; y en el que dicho poxvirus oncolítico y dichos modulador o moduladores de punto de control inmunitario se administran secuencialmente y en el que dicho poxvirus oncolítico se administra en primer lugar y dichos modulador o moduladores de punto de control inmunitario se administran en segundo lugar.
La presente divulgación se refiere más generalmente a una combinación sinérgica de virus oncolíticos con uno o más moduladores de punto de control inmunitario para la utilización para el tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como cánceres. El virus oncolítico se selecciona preferentemente de entre el grupo que consiste en reovirus, el virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), el virus de la estomatitis vesicular (VEV), el virus del sarampión, el virus influenza, el virus Sinbis, adenovirus, poxvirus y virus herpes (VHS) y similares. En la invención, el virus oncolítico es un virus vaccinia manipulado para que no posea actividad de timidina cinasa (TK), en el que el genoma de dicho VV presenta una mutación inactivadora en el gen J2R, y que también ha sido manipulado para que no posea actividad de ribonucleótido reductasa (RR), en el que el genoma de dicho VV presenta una mutación inactivadora en el gen I4L y/o F4L.
En una forma de realización, el virus vaccinia expresa además por lo menos un gen terapéutico, en particular un gen codificante de un producto de un gen suicida y/o una proteína inmunoestimuladora.
En un ejemplo, el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario son moléculas antagonistas que antagonizan la actividad de PD-1, PD-L1 o CTLA4. En la invención, uno o más moduladores de punto de control inmunitario son anticuerpos de unión específico a cualquiera de los siguientes: PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA y CTLA4, con una preferencia específica para un anticuerpo anti-PD-1 y/o un anticuerpo anti-CTLA4.
En una forma de realización, el virus oncolítico se formula preferentemente para la administración intravenosa o intratumoral y/o el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario se formula preferentemente para la administración intravenosa, intraperitoneal o intratumoral.
La presente divulgación proporciona además un método para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, incluyendo el cáncer, que comprende la administración en un mamífero que lo necesita de cantidades sinérgicamente eficaces de un virus oncolítico tal como se ha indicado en la presente memoria y de uno o más moduladores de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria. Por ejemplo, la enfermedad proliferativa tratada mediante el método dado a conocer en la presente memoria es el cáncer, y especialmente melanoma, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer mamario, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar y cáncer hepático. En un ejemplo, el método comprende una etapa adicional en la que se administra una cantidad farmacéuticamente aceptable de un profármaco en dicho mamífero. La administración de dicho profármaco tiene lugar preferentemente por lo menos 3 días después de la administración de dicho virus oncolítico o composición vírica.
La presente invención se refiere además a un kit que comprende por lo menos un poxvirus oncolítico en un recipiente y uno o más moduladores de punto de control inmunitario que antagonizan por lo menos parcialmente la actividad de uno o más puntos de control inmunitaria inhibidores en otro recipiente, para la utilización en el tratamiento de un cáncer mediante la administración secuencial, en el que dicho poxvirus oncolítico se administra en primer lugar y dicho modulador o modulares de punto de control inmunitario se administran en segundo lugar, en el que dicho poxvirus oncolítico es un virus vaccinia oncolítico, y en el que dicho modulador o moduladores de punto de control inmunitario son anticuerpos de unión específica a cualquiera de los siguientes: PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA y CTLA4.
La presente divulgación proporciona además un kit que incluye un virus oncolítico tal como se indica en la presente memoria y uno o más moduladores de punto de control inmunitario preferentemente en recipientes separados.
Descripción detallada
La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones.
La presente divulgación se refiere más generalmente a una combinación que comprende por lo menos un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario para la utilización en el tratamiento de enfermedades proliferativas, tales como cáncer.
Definiciones
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “un” y “una” se utilizan en el sentido de que significan “por lo menos una”, “por lo menos una primera”, “una o más” o “una pluralidad” de los componentes o etapas referenciados, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “una célula” incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.
La expresión “una o más” se refiere a una o a un número superior a uno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc.).
La expresión “y/o” en cualquier parte de la presente memoria incluye el significado de “y”, “o” y “ la totalidad o cualquier otra combinación de los elementos conectados mediante dicha expresión”.
El término “aproximadamente” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que no se aparta más de 20%, preferentemente no más de 10% y más preferentemente no más de 5% de un valor o intervalo dado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, al utilizarlo para definir productos, composiciones y métodos, la expresión “que comprende” (y cualquier forma de “que comprende”, tal como “comprende”), “que presenta” (y cualquier forma de “que presenta', tal como “presenta”), “que incluye” (y cualquier forma de “que incluye”, tal como “incluye”) o “que contiene” (y cualquier forma de “que contiene”, tal como “contiene”) son expresiones abiertas y no excluyen elementos o etapas de métodos no indicados adicionales. De esta manera, un polipéptido “comprende” una secuencia de aminoácidos en el caso de que la secuencia de aminoácidos puede ser parte de la secuencia de aminoácidos final del polipéptido. Dicho polipéptido puede presentar hasta varios cientos de residuos aminoácidos adicionales. La expresión “que consiste esencialmente en” significa que excluye otros componentes o etapas de cualquier significación esencial. De esta manera, una composición que consiste esencialmente en los componentes indicados no excluiría contaminantes traza y portadores farmacéuticamente aceptables. Un polipéptido “consiste esencialmente en” una secuencia de aminoácidos en el caso de que dicha secuencia de aminoácidos se encuentre presente con eventualmente sólo unos cuantos residuos aminoácidos adicionales. La expresión “que consiste en” significa que se excluyen más que elementos traza de otros componentes o etapas. Por ejemplo, un polipéptido “consiste en” una secuencia de aminoácidos en el caso de que el polipéptido no contenga ningún otro aminoácido aparte de la secuencia de aminoácidos indicada.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se refieren a polímeros de residuos aminoácidos que comprenden por lo menos nueve o más aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. El polímero puede ser lineal, ramificado o cíclico y puede comprender aminoácidos naturales y/o análogos de aminoácidos y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Como indicación general, en el caso de que el polímero de aminoácido no presente más de 50 residuos aminoácidos, preferentemente se denomina polipéptido o proteína, mientras que, en el caso de que presente 50 aminoácidos de longitud o menos, se denomina “péptido”.
Dentro del contexto de la presente divulgación, las expresiones “ácido nucleico”, “molécula de ácidos nucleicos”, “polinucleótido” y “secuencia de nucleótidos” se utilizan intercambiablemente y definen un polímero de cualquier longitud de polidesoxirribonucleótidos (ADN) (por ejemplo, ADNc, ADN genómico, plásmidos, vectores, genomas víricos, ADN aislado, sondas, cebadores y cualquier mezcla de los mismos) o polirribonucleótidos (ARN) (por ejemplo, ARNm, ARN antisentido, ARNip) o polirribo-polidesoxirribonucleótidos mixtos. Comprenden polinucleótidos de cadena sencilla o de doble cadena, lineales o circulares, naturales o sintéticos, modificados o no modificados. Además, un polinucleótido puede comprender nucleótidos no naturales y puede estar interrumpido por componentes no nucleótidos.
El término “análogo” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula (polipéptido o ácido nucleico) que muestra una o más modificaciones con respecto a la contrapartida nativa. Puede contemplarse cualquier modificación o modificaciones, incluyendo la sustitución, inserción y/o deleción de uno o más nucleótidos/residuos aminoácidos. Resultan preferidos los análogos que conservan un grado de identidad de secuencia de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 85%, más preferentemente de por lo menos 90% y todavía más preferentemente de por lo menos 98% respecto a la secuencia de la contrapartida nativa.
De una manera general, el término “ identidad” se refiere a una correspondencia aminoácido a aminoácido o nucleótidos a nucleótido entre dos polipéptido o secuencias de ácidos nucleicos. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, considerando el número de huecos que necesitan introducirse para la alineación óptima y la longitud de cada hueco. Se encuentran disponibles diversos programas informáticos y algoritmos matemáticos en la técnica para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos, tales como, por ejemplo, el programa Blast, disponible de NCBI o ALIgn en Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, supl., 3: 482-9, 1981). También se encuentran disponibles programas para determinar la identidad de secuencias de nucleótidos en bases de datos especializadas (por ejemplo, Genbank, el paquete Wisconsin de análisis de secuencias, y los programas BESTFIT, FAST y GAP). Con fines ilustrativos, “identidad de por lo menos 80%” se refiere a 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “aislado” se refiere a una proteína, polipéptido, péptido, polinucleótido, vector, etc. que ha sido extraído de su medio natural (es decir, separado de por lo menos otro componente o componentes con los que se encuentra asociado naturalmente o se encuentra en la naturaleza). Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos se encuentra aislada en el caso de que se encuentre separada de secuencias normalmente asociadas a la misma en la naturaleza (por ejemplo, disociada de un genoma), aunque puede estar asociada a secuencias heterólogas.
La expresión “obtenido de”, “originado en” u “originar” se utiliza para identificar la fuente original de un componente (por ejemplo, molécula de polipéptido o ácido nucleico), pero no pretende limitar el método mediante el cual se genera el componente, que puede ser, por ejemplo, mediante síntesis química o medios recombinantes.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “célula hospedadora” debe entenderse ampliamente sin ninguna limitación respecto a una organización particular en un tejido, órgano o células aisladas. Dichas células pueden ser un tipo único de células o un grupo de diferentes tipos de células, tales como estirpes de células en cultivo, células primarias y células en división. En el contexto de la exposición, la exposición “células hospedadoras” incluye células procarióticas, células eucarióticas inferiores, tales como levaduras, y otras células eucarióticas, tales como células de insecto, células vegetales y de mamífero (por ejemplo, humanas o no humanas), así como células capaces de producir el virus oncolítico y/o el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario para la utilización en la presente memoria. Dicho término incluye además células que pueden ser o que han sido el receptor de los vectores indicados en la presente memoria, así como la progenie de dichas células.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “virus oncolítico” se refiere a un virus capaz de replicarse selectivamente en células en división (por ejemplo, una célula proliferativa, tal como una célula de cáncer) con el objetivo de retrasar el crecimiento y/o lisar dicha célula en división, in vitro o in vivo, mostrando una replicación nula o mínima en células que no se están dividiendo. Típicamente, un virus oncolítico contiene un genoma vírico empaquetado en una partícula vírica (o virión) y es infeccioso (es decir, capaz de infectar y entrar en una célula hospedadora o sujeto).
El término “tratamiento” (y cualquier forma de tratamiento, tal como “que trata” o “tratar”) tal como se utiliza en la presente memoria comprende una profilaxis (por ejemplo, una medida preventiva en un sujeto en riesgo de presentar el estado patológico del que debe tratarse) y/o terapia (por ejemplo, en un sujeto que se ha diagnosticado que presenta el estado patológico), finalmente asociado con modalidades terapéuticas convencionales. El resultado del tratamiento es retrasar, curar, mejorar o controlar la progresión del estado patológico diana. Por ejemplo, un sujeto se trata con éxito de un cáncer en el caso de que, tras la administración de un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitaria tal como se indica en la presente memoria, el sujeto muestra una mejora observable de su estado clínico.
La expresión “que administra” (o cualquier forma de administración, tal como “administrado”) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la administración en un sujeto de un agente terapéutico, tal como el virus oncolítico y/o el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “enfermedad proliferativa” comprende cualquier enfermedad o estado que resulta del crecimiento y expansión celular incontrolados, incluyendo cánceres, así como enfermedades asociadas a una actividad incrementada de los osteoclastos (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoporosis, etc.) y enfermedades cardiovasculares (restenosis que resulta de la proliferación de las células musculares lisas de la pared de los vasos sanguíneos, etc.). El término “cáncer” puede utilizarse intercambiablemente con cualquiera de los términos “tumor”, “malignidad”, “neoplasma”, etc. Estos términos pretenden incluir cualquier tipo de tejido, órgano o célula, cualquier estadio de malignidad (por ejemplo, de una prelesión a estadio IV).
El término “sujeto” se refiere de manera general a un organismo para el que se necesita o para el que puede resultar beneficioso cualquier producto y método dado a conocer en la presente memoria. Típicamente, el organismo es un mamífero, particularmente un mamífero seleccionado de entre el grupo que consiste en animales domésticos, animales de granja, animales de competición y primates. Preferentemente, el sujeto es un ser humano diagnosticado de, o en riesgo de sufrir, una enfermedad proliferativa, tal como un cáncer. Los términos “sujeto” y “paciente” pueden utilizarse intercambiablemente en referencia a un organismo humano y comprende hombres y mujeres. El sujeto que debe tratarse puede ser un neonato, un niño, un adulto joven o un adulto.
El término “combinación” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier conjunto posible de diversos componentes (por ejemplo, virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario). Dicho conjunto incluye una mezcla de por lo menos un virus oncolítico con uno o más moduladores de punto de control inmunitario en la forma de polipéptidos (por ejemplo, anticuerpo recombinante o mezcla de anticuerpos recombinantes) o una o más moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, transportados por uno o más vectores manipulados para expresar dicho modulador o moduladores de punto de control inmunitaria), así como una mezcla de uno o más polipéptidos y moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, un anticuerpo recombinante y un vector de expresión). Se encuentran comprendidas combinaciones que proporcionan concentraciones molares iguales de cada modulador de punto de control inmunitario en el caso de que se utilice más de uno, así como combinaciones con concentraciones muy diferentes. Se apreciará que la concentración óptima de cada componente de la combinación podrá ser determinada por el experto en la materia. Preferentemente, la combinación es sinérgica, proporcionando una eficacia más elevada que cada entidad por sí sola.
La expresión “modulador de punto de control inmunitario” se refiere a una molécula capaz de modular la función de una proteína de punto de control inmunitario de una manera positiva o negativa (en particular, la interacción entre una célula presentadora de antígeno (CPA), tal como una célula de cáncer, y una célula T efectora inmunitaria). La expresión “punto de control inmunitario” se refiere a una proteína que participa directa o indirectamente en una ruta inmunitaria que bajo condiciones fisiológicas normales resulta crucial para evitar reacciones inmunitarias incontroladas y que, de esta manera, resulta crucial para el mantenimiento de la autotolerancia y/o la protección de los tejidos. El modulador o los moduladores de punto de control inmunitario que se utilizan en la presente memoria pueden actuar independientemente en cualquier etapa de la inmunidad mediada por células T, incluyendo la selección clonal de células específicas de antígeno, activación de las células T, proliferación, tráfico a sitios de antígeno e inflamación, ejecución de una función efectora directa y señalización mediante citocinas y ligandos de membrana. Cada una de dichas etapas está regulada por señales estimuladoras e inhibidoras compensatorias responsables de la regulación fina de la respuesta. En el contexto de la presente divulgación, el término comprende uno o más moduladores de punto de control inmunitario capaces de regular negativamente por lo menos parcialmente la función de un punto de control inmunitario inhibidor (antagonista) y/o uno o más moduladores de punto de control inmunitario capaces de regular positivamente por lo menos parcialmente la función de un punto de control inmunitario estimulatorio (agonista).
Virus oncolítico
El virus oncolítico para la utilización en la presente divulgación puede obtenerse de cualquier elemento vírico identificado actualmente con la condición de que sea oncolítico por su propensión a replicarse selectivamente y a eliminar las células en división, aunque no las células que no se están dividiendo. Puede ser un virus nativo que es naturalmente oncolítico o puede manipularse mediante modificación de uno o más genes víricos de manera que se incremente la selectividad tumoral y/o replicación preferente en células en división, tales como las que participan en la replicación del ADN, metabolismo de los ácidos nucleicos, tropismo del hospedador, unión a superficies, virulencia, lisis y expansión (ver, por ejemplo, Kirn et al., Nat. Med. 7: 781, 2001; Wong et al., Viruses 2: 78-106, 2010). También puede contemplarse someter uno o más genes víricos al control de elementos reguladores específicos de suceso o tejido (por ejemplo, promotores).
Entre los virus oncolíticos ejemplificativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, reovirus, virus del valle de Seneca (VVS), virus de la estomatitis vesicular (VEV), virus de la enfermedad de Newcastle (VEN), virus del herpes simplex (VHS), virus morbilivirus, retrovirus, virus influenza, virus Sinbis, poxvirus, adenovirus o similar.
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente divulgación se obtiene a partir de un reovirus. Un ejemplo representativo incluye reolisina (bajo desarrollo por Oncolytics Biotech, NCT01166542).
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente memoria se obtiene a partir de un virus del Valle de Seneca. Un ejemplo representativo incluye NTX-010 (Rudin et al., Clin. Cancer. Res. 17(4): 888-95, 2011).
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente memoria se obtiene a partir de un virus de la estomatitis vesicular (VEV). Se describen en la literatura ejemplos representativos para la utilización en la presente memoria (por ejemplo, Stojdl et al., Nat. Med. 6(7): 821-5, 2000; Stojdl et al., Cancer Cell 4(4): 263-75, 2003).
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente memoria se obtiene a partir de un virus de la enfermedad de Newcastle. Entre los ejemplos representativos para la utilización en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las cepas 73-T PV701 yy HDV-HUJ, así como las indicadas en la literatura (por ejemplo, Phuangsab et al., Cancer Lett. 172(1): 27-36, 2001; Lorence et al., Curr. Cancer Drug Targets 7(2): 157-67, 2007; Freeman et al., Mol. Ther. 13(1): 221-8, 2006).
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente memoria se obtiene a partir de un virus del herpes simplex (VEV). Los herpesviridae son una gran familia de virus ADN la totalidad de los cuales comparte una estructura común y están compuestos por genomas de ADN lineal de doble cadena relativamente grandes codificantes de 100 a 200 genes encapsidados dentro de una cápside icosaédrica dentro de una cubierta de membrana de bicapa lipídica. Aunque el virus herpes oncolítico puede derivarse de diferentes tipos de VHS, resultan particularmente preferidos el VHS1 y el VHS2. El virus herpes puede modificarse genéticamente de manera que restrinja la replicación vírica en los tumores o reduzca su citotoxicidad en las células que no se están dividiendo. Por ejemplo, cualquier gen vírico implicado en el metabolismo de los ácidos nucleicos puede estar inactivado, tal como la timidina cinasa (Martuza et al., Science 252: 854-6, 1991), ribonucleótido reductasa (RR) (Boviatsis et al., Gene Ther. 1: 323-31, 1994; Mineta et al., Cancer Res. 54: 3363-66, 1994), o uracilo-N-glucosilasa (Pyles et al., J. Virol. 68: 4963-72, 1994). Otro aspecto implica mutantes víricos con defectos en la función de genes codificantes de factores de virulencia, tales como el gen ICP34.5 (Chambers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-5, 1995). Entre los ejemplos representativos de virus herpes oncolítico se incluye NV1020 (por ejemplo, Geervarghese et al., Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28, 2010) y T-VEC (Andtbacka et al., J. Clin. Oncol. 31, 2013, número de resumen n° LBA9008).
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente memoria se obtiene a partir de un morbillivirus que puede obtenerse de la familia Paramyxoviridae, con una preferencia específica para el virus del sarampión. Entre los ejemplos representativos de virus del sarampión oncolítico adecuado se incluyen, aunque sin limitación, MV-Edm (McDonald et al., Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84, 2006) y HMWMAA (Kaufmann et al., J. Invest. Dermatol.
133(4): 1034-42, 2013).
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente memoria se obtiene a partir de un adenovirus. Se encuentran disponibles en la técnica métodos para la manipulación de adenovirus oncolíticos. Una estrategia ventajosa incluye la sustitución de promotores víricos con promotores selectivos de tumor o modificaciones del producto o productos del gen adenovírico E1 para inactivar su función de unión a p53 o a la proteína retinoblastoma (Rb) que están alteradas en las células tumorales. En el contexto natural, el gen adenovírico E1B55kDa coopera con otro producto adenovírico para inactivar p53 (p53 frecuentemente se encuentra desregulada en las células de cáncer), bloqueando de esta manera la apoptosis. Entre los ejemplos representativos de adenovirus oncolítico se incluyen ONYX-015 (por ejemplo, Kuri et al., Nat. Med. 6(8): 879-85, 2000) y H101, también denominado Oncorine (Xia et al., Ai Zheng 23(12): 1666-70, 2004).
Por ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en la presente memoria es un poxvirus. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “poxvirus” se refiere a un virus perteneciente a la familia Poxviridae, con una preferencia específica para un poxvirus perteneciente a la subfamilia Chordopoxviridae y más preferentemente, el género Orthopoxvirus. Se encuentran disponibles en la técnica secuencias del genoma de diversos poxvirus, por ejemplo, los genomas víricos del virus vaccinia, virus de la viruela bovina, virus de la viruela del canario, virus Ectromelia y virus Myxoma se encuentran disponibles de la técnica y bases de datos especializados, tales como GenBank (número de acceso NC_006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_)01132, respectivamente).
En la invención, el poxvirus oncolítico es un virus vaccinia oncolítico. Los virus vaccinia son elementos de la familia poxvirus caracterizada por un genoma de ADN de doble cadena de 200 kb que codifica numerosos enzimas víricos y factores que permiten que el virus se replique independientemente de la maquinaria de la célula hospedadora. La mayoría de las partículas de virus vaccinia son intracelulares (VMI, o 'virión maduro intracelular') con una única cubierta lipídica y se mantienen en el citosol de las células infectadas hasta la lisis. La otra forma infecciosa es una partícula de doble cubierta (VCE, o 'virión con cubierta extracelular') que gema a partir de la célula infectada sin lisarla.
Aunque puede derivarse de cualquier cepa de virus vaccinia, las cepas Elstree, Wyeth, Copenhagen y Western Reserve resultan particularmente preferidas. La nomenclatura génica utilizada en la presente memoria es la de la cepa Copenhagen de vaccinia. También se utiliza en la presente memoria para los genes homólogos de otros poxviridae, a menos que se indique lo contrario. Sin embargo, la nomenclatura génica puede ser diferente según la cepa de poxvirus, aunque la correspondencia entre la cepa Copenhagen y otras cepas de vaccinia se encuentra generalmente disponible en la literatura.
Preferentemente, el virus vaccinia oncolítico para la utilización en la presente divulgación se modifica mediante la alteración de uno o más genes víricos. Dicha modificación o modificaciones preferentemente conducen a la síntesis (o falta de síntesis) de una proteína defectuosa incapaz de garantizar la actividad de la proteína producida bajo condiciones normales por el gen no modificado. Las modificaciones comprenden la deleción, mutación y/o sustitución de uno o más nucleótidos (contiguos o no) dentro del gen vírico o de sus elementos reguladores. La modificación o modificaciones pueden realizarse de varias maneras conocidas por el experto en la materia utilizando técnicas de recombinación convencionales. Se dan a conocer modificaciones ejemplificativas en la literatura, con una preferencia específica por las que alteran los genes víricos implicados en el metabolismo del ADN, la virulencia del hospedador y la ruta de IFN (ver, por ejemplo, Guse et al., Expert Opinion Biol. Ther.11(5):595-608, 2011).
Los poxvirus oncolíticos para la utilización en la presente invención se modifican mediante la alteración del gen codificante de la timidina cinasa (locus J2R). El enzima TK participa en la síntesis de los desoxirribonucleótidos. TK resulta necesario para la replicación vírica en células normales, ya que estas células presentan generalmente una concentración baja de nucleótidos, mientras que resulta dispensable en las células en división, que contienen una concentración elevada de nucleótidos.
Los poxvirus oncolíticos para la utilización en la presente invención también se modifican mediante la alteración de por lo menos un gen o ambos genes codificantes de la ribonucleótido-reductasa (RR). En el contexto natural, dicho enzima cataliza la reducción de los ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos, que representa una etapa crucial en la biosíntesis del ADN. El enzima vírico es similar en su estructura de subunidades al enzima de mamífero, al estar compuestos de dos subunidades heterólogas, denominadas R1 y R2, codificadas por, respectivamente, el locus I4L y el locus F4L. Las secuencias de los genes I4L y F4L y sus localizaciones en el genoma de diversos poxvirus se encuentran disponibles en las bases de datos públicas, por ejemplo mediante los números de acceso DQ437594, DQ437593, DQ377804, AH015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, M-35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, X71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 y NC_008291. En el contexto de las presentes invención y divulgación, el gen I4L (codificante de la subunidad grande R1) o el gen F4L (codificante de la subunidad pequeña R2) o ambas pueden estar inactivados.
Alternativamente o en combinación, también pueden buscarse otras estrategias para incrementar adicionalmente la especificidad tumoral del virus. Un ejemplo representativo de modificaciones adecuadas incluye la disrupción del gen codificante de FCV del genoma vírico. El FCV (factor de crecimiento de VV) es una proteína secretada que se expresa tempranamente después de la infección celular y su función aparentemente es importante para la extensión vírica en células normales. Otro ejemplo es la disrupción del gen A56R codificante de la hemaglutinina, eventualmente en combinación con la deleción de TK (Zhang et al., Cancer Res. 67: 10038-46, 2007). La disrupción del gen o genes moduladores de interferón también puede resultar ventajosa (por ejemplo, el gen B8R o B18r ) o el gen B13R inhibidor de caspasa-1.
El virus oncolítico para la utilización en la presente invención es un virus vaccinia defectuoso para las actividades de tanto TK como RR, que resulta de las mutaciones inactivadoras tanto del gen J2R como del gen I4L y/o F4L incluidos en el genoma vírico (por ejemplo, tal como se indica en el documento n° WO2009/065546 y Foloppe et al., Gene Ther. 15: 1361-71,2008).
Genes terapéuticos
En un ejemplo, el virus oncolítico para la utilización en las presentes invención y divulgación expresa además por lo menos un gen terapéutico insertado en el genoma vírico. Un “gen terapéutico” codifica un producto capaz de proporcionar una actividad biológica al administrarlo apropiadamente en un sujeto, que se espera que cause un efecto beneficioso sobre el curso o un síntoma del estado patológico que debe tratarse mediante potenciación de la eficacia antitumoral o refuerzo de la naturaleza oncolítica del virus. En el contexto de las presentes invención y divulgación, el gen terapéutico puede ser de origen humano o no (por ejemplo, de origen bacteriano, levadura o vírico). Preferentemente, el gen terapéutico no es un gen o secuencia de ácido nucleico codificante de un modulador de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria.
Puede contemplarse un amplio número de genes terapéuticos en el contexto de la exposición, tales como los codificantes de polipéptidos que pueden compensar para las proteínas defectuosas o deficientes en el sujeto, o aquellas que actúan mediante efectos tóxicos limitando o eliminando células dañinas del cuerpo o aquellas que codifican polipéptidos que confieren inmunidad. Pueden ser genes nativos o genes obtenidos de estos últimos mediante mutación, deleción, sustitución y/o adición de uno o más nucleótidos.
Ventajosamente, el virus oncolítico utilizado en las presentes invención y divulgación es portador de un gen terapéutico seleccionado de entre el grupo que consiste en genes codificantes de productos de gen suicida y proteínas inmunoestimuladoras.
Gen suicida
La expresión “gen suicida” se refiere a un gen codificante de una proteína capaz de convertir un precursor de un fármaco en un compuesto citotóxico. Los genes suicidas comprenden, aunque sin limitarse a ellos, genes codificantes de proteínas con una actividad de citosina desaminasa, una actividad de timidina cinasa, una actividad de uracilo fosforribosil transferasa, una actividad de nucleósido purina fosforilasa y una actividad de timidilato cinasa. Los ejemplos de genes suicidas y precursores correspondientes de un fármaco que comprende una fracción nucleobase se dan a conocer en la tabla a continuación.
Tabla 1
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Deseablemente, el gen suicida codifica una proteína que presenta por lo menos actividad de citosina desaminasa (CDasa). En los procariotas y eucariotas inferiores (no se encuentra presente en mamíferos), la CDasa participa en la ruta metabólica de las pirimidinas por la que la citosina exógena se transforma en uracilo mediante una desaminación hidrolítica. La CDasa también desamina un análogo de la citosina, es decir, la 5-fluorocitosina (5-FC), formando de esta manera 5-fluorouracilo (5-FU), un compuesto que es altamente citotóxico al convertirlo en 5-fluoro-UMP (5'-FUMP). La molécula de ácidos nucleicos codificante de CDasa puede obtenerse de cualesquiera procariotas y eucariotas inferiores, tales como Saccharomyces cerevisiae (gen FCY1), Candida Albicans (gen FCA1) y Escherichia coli (gen codA). Las secuencias génicas y proteínas CDasa codificadas se han publicado y se encuentran disponibles en bancos de datos especializados (SWISSPROT EMBL, GenBank, Medline y similares). También pueden utilizarse análogos funcionales de dichos genes. Dichos análogos preferentemente presentan una secuencia de ácidos nucleicos con un grado de identidad de por lo menos 70%, ventajosamente de por lo menos 80%, preferentemente de por lo menos 90% y todavía más preferentemente de por lo menos 95% respecto a la secuencia de ácidos nucleicos del gen nativo.
Alternativamente o en combinación, el virus oncolítico utilizado en las presentes invención y divulgación es portador en su genoma vírico de un gen suicida codificante de un polipéptido que presenta actividad de uracilo fosforribosil transferasa (UPRTasa). En procariotas y eucariotas inferiores, el uracilo se transforma en UMP mediante la acción de UPRTasa. Dicho enzima convierte 5-FU en 5-FUMP A título ilustrativo, las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las UPRTasas de E. coli (Andersen et al., European J. Biochem. 204: 51-56, 1992), de Lactococcus lactis (Martinussen et al., J. Bacteriol. 176: 6457-63, 1994), de Mycobacterium bovis (Kim et al., Biochem. Mol. Biol.
Internat. 41: 1117-24, 1997) y de Bacillus subtilis (Martinussen et al., J. Bacteriol. 177: 271-4, 1995) pueden utilizarse en el contexto de las presentes invención y divulgación. Sin embargo, resulta más particularmente preferido utilizar una UPRTasa de levadura y, en particular, la codificada por S. cerevisiae (gen FUR1), cuya secuencia se da a conocer en Kern et al. (Gene 88: 149-57, 1990). También pueden utilizarse análogos de UPRTasa funcionales, tal como el mutante de FUR1 truncado N-terminalmente que se describe en el documento n° EP998568 (con una deleción de los 35 primeros residuos hasta el segundo residuo de Met presente en la posición 36 en la proteína nativa) que muestra una actividad de UPRTasa más elevada que la del enzima nativo.
Preferentemente, el gen suicida insertado en el genoma vírico del virus oncolítico para la utilización en las presentes invención y divulgación codifica un polipéptido que presenta actividades de CDasa y UPRTasa. Dicho polipéptido puede manipularse mediante la fusión de dos dominios enzimáticos, uno que presenta actividad de CDasa y el segundo que presenta actividad de UPRTasa. Entre los polipéptidos ejemplificativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los polipéptidos de fusión codA::upp, FCY1::FUR1 y FCY1::FUR1[Delta] 105 (FCU1) y FCU1-8 descritos en los documentos n° WO96/16183, n° EP998568 y n° WO2005/07857. Resulta de particular interés el gen suicida FCU1 (o fusión FCY1:FUR1[Delta] 105) codificante de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada en el identificador de secuencia SEC ID n° 1 del documento n° WO2009/065546. Las presentes invención y divulgación comprenden análogos de dichos polipéptidos con la condición de que conserven las actividades de CDasa y/o UPRTasa. Se encuentra comprendido en los conocimientos del experto en la materia el aislamiento de las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de CDasa y/o UPRTasa a partir de los datos publicados, eventualmente la manipulación de análogos de las mismas y someter a ensayo la actividad enzimática o sistema celular según técnicas convencionales (ver, por ejemplo, el documento n° EP998568).
Genes terapéuticos inmunoestimuladores
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “proteína inmunoestimuladora” se refiere a una proteína que presenta la capacidad de estimular el sistema inmunitario, de una manera específica o no específica. Es conocido en la técnica un enorme número de proteínas por su capacidad de ejercer un efecto inmunoestimulador. Entre los ejemplos de proteínas inmunoestimuladoras adecuadas en el contexto de las presentes invención y divulgación se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, citocinas, con una preferencia específica para las interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15 e IL-24), quimiocinas (por ejemplo, CXCL10, CXCL9, CXCL11), interferones (por ejemplo, IFNg, IFNalfa), factor de necrosis tumoral (TNF), factores estimulantes de colonias (por ejemplo, GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), proteínas expuestas a APC (células presentadoras de antígenos (por ejemplo, B7.1 , B7.2 y similares), factores de crecimiento (factor de crecimiento transformante TGF, factor de crecimiento fibroblástico FGF, factores de crecimiento endotelial vascular VEGF, y similares), antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I o II, inductores o inhibidores de la apoptosis (por ejemplo, Bax, Bcl2, BcIX...), agentes citostáticos (p21, p16, Rb...), immunotoxinas, antígenos (polipéptidos antigénicos, epítopos y similares) y marcadores (beta-galactosidasa, luciferasa....). Preferentemente, la proteína inmunoestimuladora es una interleucina o un factor estimulante de colonias, con una preferencia específica por GM-CSF.
Expresión de los genes terapéuticos
El gen terapéutico puede obtenerse fácilmente mediante clonación, mediante PCR o mediante síntesis química según las técnicas convencionales. Además, el gen terapéutico puede optimizarse para proporcionar un nivel de expresión elevado en una célula hospedadora o sujeto particular. En efecto, se ha observado que los patrones de uso de codones de los organismos son altamente no aleatorios y la utilización de los codones puede ser marcadamente diferente en diferentes hospedadores. Debido a que el gen terapéutico podría ser de origen bacteriano o de eucariotas inferiores (por ejemplo, el gen suicida), puede presentar un patrón de uso de codones inapropiado para la expresión eficiente en células eucarióticas superiores (por ejemplo, en el ser humano). Típicamente, la optimización de los codones se lleva a cabo sustituyendo uno o más codones “nativos” (por ejemplo, bacterianos o de levadura) correspondientes a un codón utilizado infrecuentemente en el organismo hospedador de interés por uno o más codones codificantes del mismo aminoácido que se utilizan con mayor frecuencia. No resulta necesario sustituir todos los codones nativos correspondientes a codones utilizados infrecuentemente, ya que la expresión incrementada puede conseguirse incluso con la sustitución parcial.
Además de la optimización del uso de los codones, la expresión en la célula hospedadora o sujeto puede mejorarse adicionalmente mediante modificaciones adicionales de la secuencia génica. Por ejemplo, la secuencia génica terapéutica puede modificarse de manera que se evite la agregación de codones no óptimos raros en zonas concentradas y/o que se supriman o modifiquen elementos de secuencia “negativos” que se espera que influyan negativamente sobre los niveles de expresión. Entre dichos elementos de secuencia negativos se incluyen, aunque sin limitación, las regiones con un contenido de GC muy elevado (>80%) o muy bajo (<30%), tramos de secuencia ricos en AT o GC, secuencias de repetición directa o invertida inestables, estructuras secundarias R A y/o elementos reguladores crípticos internos, tales como cajas TATA internas, sitios chi, sitios de entrada ribosómica y/o sitios donantes/aceptores de corte y empalme.
De acuerdo con las presentes invención y divulgación, el gen o los genes terapéuticos insertados en el genoma del virus oncolítico para la utilización en la invención y exposición se encuentran operablemente ligados a elementos reguladores adecuados para su expresión en una célula hospedadora o sujeto. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “elementos reguladores” o “secuencia reguladora” se refiere a cualquier elemento que permita, contribuya o module la expresión del gen o genes terapéuticos en una célula hospedadora o sujeto dado, incluyendo la replicación, duplicación, transcripción, corte y empalme, traducción, estabilidad y/o transporte del ácido o ácidos nucleicos o sus derivados (es decir, ARNm). Tal como se utiliza en la presente memoria, “operablemente ligado” se refiere a que los elementos que se unen están dispuestos de manera que funcionan concertadamente con sus fines pretendidos. Por ejemplo, un promotor se encuentra operablemente ligado a una molécula de ácido nucleico en el caso de que el promotor afecte a la transcripción desde el inicio de transcripción hasta el terminador de dicha molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora permisiva.
El experto en la materia apreciará que la elección de las secuencias reguladoras puede depender de factores tales como el gen mismo, el virus en el que se inserta, la célula hospedadora o sujeto, el nivel de expresión deseado, etc. El promotor resulta de especial importancia. En el contexto de la invención y exposición, puede ser constitutivo, dirigiendo la expresión del gen o genes terapéuticos en muchos tipos de célula hospedadora o específico para determinadas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicamente hepáticas) o regulado en respuesta a sucesos específicos o factores exógenos (por ejemplo, por la temperatura, un aditivo nutriente, una hormona, etc.) o según la etapa del ciclo vírico (por ejemplo, tardía o temprana). También pueden utilizarse promotores que se encuentran reprimidos durante la etapa de producción en respuesta a sucesos específicos o factores exógenos, a fin de optimizar la producción del virus y evitar la potencial toxicidad del polipéptido o polipéptidos expresados.
Entre los promotores adecuados para la expresión constitutiva en células de mamífero se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) (patente US n° 5.168.062), el promotor del VSR, el promotor tardío mayor de adenovirus, el promotor de fosfoglicero-cinasa (PGK) (Adra et al., Gene 60: 65-74, 1987), el promotor de timidina cinasa (TK) del virus herpes simplex (VHS)-1 y el promotor de la polimerasa de T7 (documento n°WO98/10088). Los promotores del virus vaccinia están particularmente adaptados a la expresión en poxvirus oncolíticos. Entre los ejemplos representativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los promotores 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., Cancer Gene Ther. 15(1): 18-282008), TK, p28, p11 y K1L de vaccinia, así como promotores sintéticos tales como los indicados en Chakrabarti et al. (Biotechniques 23: 1094-7, 1997; Hammond et al., J. Virol Methods 66: 135-8, 1997 y Kumar y Boyle, Virology 179: 151-8, 1990), así como promotores quiméricos tempranos/tardíos. Entre los promotores adecuados para los virus del sarampión oncolíticos se incluyen, aunque sin limitación, cualquier promotor que dirija la expresión de las unidades de transcripción del sarampión (Brandler y Tangy, CIMID 31: 271, 2008).
El experto en la materia apreciará que los elementos reguladores que controlan la expresión del gen o genes terapéuticos pueden comprender además elementos adicionales para el inicio, la regulación y/o la terminación correctos de la transcripción (por ejemplo, secuencias de terminación de la transcripción poliA), transporte del ARNm (por ejemplo, secuencias de señal de localización nuclear), procesamiento (por ejemplo, señales de corte y empalme) y estabilidad (por ejemplo, intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes), traducción (por ejemplo, un iniciador Met, secuencias líder tripartitas, sitios de unión ribosómica IRES, péptidos de señal, etc.).
El gen terapéutico puede insertarse en cualquier sitio del genoma vírico, con una preferencia específica para un locus no esencial, por ejemplo, el gen TK resulta particularmente apropiado para la inserción en virus vaccinia oncolítico.
El virus oncolítico para la utilización en la invención es un virus vaccinia (preferentemente de la cepa Copenhague) defectuoso para las actividades tanto TK y RR (por ejemplo, resultante de mutaciones inactivadoras en los genes víricos tanto J2R como I4L). Más preferentemente, dicho virus vaccinia está armado con un gen suicida con una preferencia especial por el gen suicida FCU1 indicado en la presente memoria. Todavía más preferentemente, el gen suicida (por ejemplo, FCU1) se encuentra bajo el control transcripcional del promotor vaccinia p11K7.5. Aún todavía más preferentemente, FCU1 introducido bajo el control del promotor del virus vaccinia se inserta dentro del locus de TK del genoma vírico.
En un ejemplo alternativo y además preferido de la presente divulgación, el virus oncolítico para la utilización en la presente divulgación es un virus vaccinia (preferentemente de la cepa Wyeth) defectuoso para la actividad de TK (resultante de mutaciones inactivadoras en el gen vírico J2R). Más preferentemente, dicho virus vaccinia está armado con un gen terapéutico inmunoestimulador con una preferencia especial por el gen de GM-CSF humano indicado en la presente memoria. Todavía más preferentemente, el gen terapéutico (por ejemplo, GM-CSF) se encuentra bajo el control transcripcional de un promotor de vaccinia temprano-tardío sintético y se inserta preferentemente dentro del locus de TK.
Típicamente, el virus oncolítico para la utilización según las presentes invención y divulgación se produce en una estirpe celular hospedadora adecuada utilizando técnicas convencionales, incluyendo el cultivo de la célula hospedadora transfectada o infectada bajo condiciones adecuadas de manera que permite la producción de partículas víricas infecciosas y la recuperación de las partículas víricas infecciosas producidas a partir del cultivo de dicha célula y opcionalmente la purificación de dichas partículas víricas infecciosas recuperadas. Entre las células hospedadoras adecuadas para la producción del virus oncolítico se incluyen, aunque sin limitación, estirpes celulares humanas, tales como HeLa (ATCC), células 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1997), HER96, PER-C6 (Fallaux et al., Human Gene Ther. 9: 1909-17, 1998), células aviares, tales como las indicadas en los documentos n° WO2005/042728, n° WO2006/108846, n° WO2008/129058, n° WO2010/130756, n° WO2012/001075, etc.), estirpes celulares de hámster, tales como BHK-21 (ATCC n° CCL-10), así como fibroblastos primarios de embrión de pollo (FEP) preparados a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados. El virus oncolítico puede aislarse por lo menos parcialmente antes de utilizarse según las presentes invención y divulgación. Pueden contemplarse diversas etapas de purificación, incluyendo la clarificación, tratamiento enzimático (por ejemplo, benzonasa, proteasa), y etapas cromatográficas y de filtración. Se describen en la técnica métodos apropiados (por ejemplo, los documentos n° WO2007/147528, n° WO2008/138533, n° WO2009/100521, n° WO2010/130753 y n° WO2013/022764).
Modulador o moduladores de punto de control inmunitario
Los puntos de control inmunitarios y moduladores de los mismos, así como los métodos de utilización de dichos compuestos están descritos en la literatura. Según la presente divulgación, el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario pueden ser, independientemente, un polipéptido o una molécula de ácidos nucleicos codificante de polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende un dominio capaz de unión al punto de control inmunitario diana y/o la inhibición de la unión de un ligando a dicho punto de control inmunitario diana de manera que ejerce una función antagonista (es decir, es capaz de antagonizar una señal inhibidora mediada por punto de control inmunitario) o una función agonista (es decir, es capaz de reforzar una señal estimuladora mediada por punto de control inmunitario). Dichos modulador o moduladores de punto de control inmunitario pueden seleccionarse independientemente de entre el grupo que consiste en péptidos (por ejemplo, ligandos peptídicos), dominios solubles de receptores naturales, ARNi, moléculas antisentido, anticuerpos y andamiajes de proteínas.
Preferentemente, el modulador de punto de control inmunitario es un anticuerpo. En el contexto de las presentes invención y divulgación, el término “anticuerpo” (“Ab”) se utiliza en el sentido más amplio y comprende anticuerpos naturales y manipulados por el ser humano, así como anticuerpos de longitud completa o fragmentos funcionales o análogos de los mismos que son capaces de unirse al punto de control inmunitario o epítopo (conservando de esta manera la parte de unión a diana). El anticuerpo utilizado en la invención y exposición puede ser de cualquier origen, por ejemplo, humano, humanizado, animal (por ejemplo, un anticuerpo de roedor o de camélido), o quimérico. Puede ser de cualquier isotipo, con una preferencia específica por un isotipo IgG1 o IgG4. Además, puede estar glucosilado o no glucosilado. El término anticuerpo incluye además anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, con la condición de que muestren la especificidad de unión indicada en la presente memoria.
Con fines ilustrativos, los anticuerpos de longitud completa son glucoproteínas que comprenden por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada que está constituida de tres dominios CH1, CH2 y CH3 (eventualmente con una bisagra entre CH1 y CH2). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera que comprende un dominio CL. Las regiones VH y VL comprenden regiones hipervariables, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), entremezcladas con regiones más conservadas denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR en el orden siguiente: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Las regiones c Dr de las cadenas pesada y ligera son determinantes para la especificidad de unión.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino, de camello, de rata, etc.) cuya secuencia proteica ha sido modificada para incrementar su similitud a un anticuerpo humano (es decir, producido naturalmente en el ser humano). El procedimiento de humanización es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Presta et al., Cancer Res. 57(20): 4593-9, 1997; patentes US n° 5.225.539; n° 5.530.101, n° 6.180.370; documento n° WO2012/110360). Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal desarrollado para la utilización humana puede humanizarse mediante la sustitución de uno o más residuos de las regiones FR para que resulte más similar a la secuencia de inmunoglobulina humana, mientras que la amplia mayoría de los residuos de las regiones variables (especialmente las CDR) no resultan modificadas y corresponden a las de una inmunoglobulina no humana. Como regla general, el número de dichas sustituciones de aminoácidos en las regiones FR típicamente no es superior a 20 en cada región variable VH o VL.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que comprende uno o más elementos de una especie y uno o más elementos de otra especie, por ejemplo un anticuerpo no humano que comprende por lo menos una parte de una región constante (Fc) de una inmunoglobulina humana.
Pueden manipularse muchas formas de anticuerpo para la utilización en la combinación de la invención y exposición. Entre los ejemplos representativos se incluyen, aunque sin limitación, Fab, Fab', F(ab')2, dAb, Fd, Fv, scFv, di-scFv y diacuerpo, etc. Más específicamente:
(i) un fragmento Fab representado por un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1,
(ii) un fragmento F(ab')2 representado por un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante por lo menos un puente disulfuro en la región de bisagra,
(iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1,
(iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo,
(v) un fragmento dAb que consiste en un único fragmento de dominio variable (dominio VH o VL),
(vi) un Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende los dos dominios de un fragmento Fv, VL y VH, que están fusionados entre sí, eventualmente con un conector para producir una única cadena proteica (ver, por ejemplo, Bird et al., Science 242: 423-6, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83, 1988; patentes US n° 4.946.778 y n° 5.258.498), y
(vii) cualquier otro anticuerpo artificial.
Los métodos para preparar anticuerpos, fragmentos y análogos de los mismos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies - A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, 1988). Puede citarse, por ejemplo, la tecnología del hibridoma (tal como se indica en Kohler y Milstein, Nature 256: 495-7, 1975; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-30, 1983; Cole et al., en: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy; Alan Liss, páginas 77 a 96), técnicas recombinantes (por ejemplo, utilizando métodos de expresión fágica), síntesis peptídica y corte enzimático. Pueden producirse fragmentos de anticuerpos mediante una técnica recombinante, tal como se indica en la presente memoria. También pueden producirse mediante corte proteolítico con enzimas, tales como la papaína, para producir fragmentos Fab, o pepsina para producir fragmentos F(ab')2, tal como se indica en la literatura (ver, por ejemplo, Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-25, 1983). Los análogos (o fragmentos de los mismos) pueden generarse mediante métodos convencionales de biología molecular (PCR, técnicas de mutagénesis). En caso necesario, dichos fragmentos y análogos pueden cribarse para funcionalidad de la misma manera que con anticuerpos intactos (por ejemplo, mediante un ensayo ELISA estándar).
Preferentemente, por lo menos uno de los moduladores de control inmunitario para la utilización en las presentes invención y divulgación es un anticuerpo monoclonal, con una preferencia específica para un ser humano (en el que ambas regiones de marco se derivan de las secuencias de inmunoglobulina de estirpe germinal humana) o un anticuerpo humanizado según un procedimiento bien conocido de humanización.
Deseablemente, el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario utilizados en la presente divulgación antagonizan por lo menos parcialmente (por ejemplo, más de 50%) la actividad del punto o puntos de control inmunitario, en particular los mediados por cualquiera de los siguientes: PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA y CTLA4. En la invención, el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a cualquiera de dichas proteínas diana. La expresión “se une específicamente a” se refiere a la capacidad de especificidad y afinidad de unión a una diana o epítopo particular incluso en presencia de una población heterogénea de otras proteínas y compuestos biológicos. De esta manera, bajo las condiciones de ensayo indicadas, el anticuerpo utilizado en la invención y exposición se une preferentemente a su diana y no se une en una cantidad significativa a otros componentes presentes en una muestra o sujeto de ensayo. Preferentemente, dicho anticuerpo muestra una afinidad de unión elevada a su diana, con una constante de disociación de equilibrio igual o inferior a 1x10‘6 M (por ejemplo, de por lo menos 0,5x10‘6, 1x10‘7, 1x10‘8, 1x10‘9, 1x10‘1°, etc.). Alternativamente, el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario utilizados en la presente divulgación ejercen una función agonista en el sentido de que son capaces de estimular o reforzar señales estimuladoras, en particular las mediadas por CD28, con una preferencia específica por cualquiera de los puntos de control inmunitario ICOS, CD137 (o 4-1BB), OX40, CD27, CD40 y G iTr . Los ensayos estándares de evaluación de la capacidad de unión de los anticuerpos a los puntos de control inmunitario son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias western, RIA y citometría de flujo. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también puede evaluarse mediante ensayos estándares conocidos en la técnica, tales como el análisis Biacore.
Preferentemente, por lo menos uno de los moduladores de punto de control inmunitario para la utilización en la presente divulgación comprende un anticuerpo humano o humanizado capaz de antagonizar un punto de control inmunitario que participa en la respuesta mediada por células T Un ejemplo preferido de modulador de punto de control inmunitario en las presentes invención y divulgación está representado por un modulador capaz de antagonizar por lo menos parcialmente la proteína 1 de muerte programada (PD-1) y especialmente un anticuerpo que se une específicamente a PD-1 humano. PD-1 es parte de la superfamilia génica de inmunoglobulinas (Ig) y un elemento de la familia de CD28. Es una proteína transmembranaria de tipo 1 de 55 kDa que se expresa en células con experiencia de antígeno (por ejemplo, células B activadas, células T y células mieloides) (Agata et al., Int. Immunol. 8: 765-72, 1996; Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82, 2002; Bennett et al., J. Immunol 170: 711-8, 2003). Opin. Immunol. 24: 207-12, 1990). Se han identificado dos ligados de PD-1, respectivamente PD-L1 (ligando 1 de muerte programada) y PD-L2 (ligando 2 de muerte programada) (Freeman et al., J. Exp. Med.
192: 1027-34, 2000; Carter et al., Eur. J. Immunol. 32: 634-43, 2002). p D-L1 ha sido identificado en 20% a 50% de los cánceres humanos (Dong et al., Nat. Med. 8: 787-9, 2002). La interacción entre PD-1 y PD-L1 resulta en una reducción de los linfocitos infiltrantes de tumor, en una reducción de la proliferación mediada por receptores de células T y en la evasión inmunitaria por parte de las células cancerosas (Dong et al., J. Mol. Med. 81: 281-7, 2003; Blank et al., Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314, 2005). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de PD-1 completas pueden encontrarse en GenBank n° de acceso U64863 y NP_005009.2. Se encuentran disponibles en la técnica varios anticuerpos anti-PD1 (ver, por ejemplo, los indicados en los documentos n° WO2004/004771; n° WO2004/056875; n° WO2006/121168; n° WO2008/156712; n° WO2009/014708; n° WO2009/114335; n° WO2013/043569 y n° WO2014/047350). Los anticuerpos anti-PD-1 preferidos en el contexto de las presentes invención y divulgación han sido aprobados por la FDA o se encuentran en desarrollo clínico avanzado y puede utilizarse en particular un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado de entre el grupo que consiste en Nivolumab (también denominado BMS-936558, bajo desarrollo en Bristol Myer Squibb), pembrolizumab (también denominado Lanbrolizumab o MK-3475; bajo desarrollo en Merck) y Pidilizumab (también denominado CT-011, bajo desarrollo en CureTech).
Otro ejemplo preferido de modulador de punto de control inmunitario en las presentes invención y divulgación está representado por un modulador capaz de antagonizar por lo menos parcialmente el ligando de PD-1 denominado PD-L1 y especialmente un anticuerpo que reconoce PD-L1 humano. Se encuentran disponibles en la técnica varios anticuerpos anti-PD-L1 (ver, por ejemplo, los indicados en el documento n° EP1907000). Los anticuerpos anti-PD-L1 preferentes han sido aprobados por la FDA o se encuentran bajo desarrollo clínico avanzado (por ejemplo, MPDL3280A, bajo desarrollo en Genentech/Roche, y BMS-936559, bajo desarrollo en Bristol Myer Squibb).
Todavía otro ejemplo preferido de modulador de punto de control inmunitario en las presentes invención y divulgación está representado por un modulador capaz de antagonizar por lo menos parcialmente la proteína CTLA-4 y especialmente un anticuerpo que reconoce CTLA-4 humano. c TlA-4 (o antígeno 4 asociado a linfocito T citotóxico), también conocido como c D152, fue identificado en 1987 (Brunet et al., Nature 328: 267-70, 1987) y está codificado por el gen CTLA4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-5). CTLA4 es un elemento de la superfamilia de receptores de inmunoglobulina. Se expresa sobre la superficie de las células T ayudantes, en donde regula principalmente la amplitud de las etapas tempranas de activación de las células T. El trabajo reciente sugiere que CTLA-4 podría funcionar in vivo mediante la captura y eliminación de B7-1 y B7-2 de las membranas de las células presentadoras de antígeno, haciendo que éstas no se encuentren disponibles para la inducción de CD28 (Qureshi et al., Science 332: 600-3, 2011). La secuencia de ácidos nucleicos de CTLA-4 completa puede encontrarse en GenBank n° de acceso LI 5006. Se encuentran disponibles en la técnica varios anticuerpos anti-CTLA-4 (ver, por ejemplo, los indicados en la patente US n° 8.491.895). Los anticuerpos anti-CTLA-4 preferidos en el contexto de las presentes invención y divulgación han sido aprobados por la FDA o se encuentran bajo desarrollo clínico avanzado. Puede citarse más particularmente el ipilimumab, comercializado por Bristol Myer Squibb como Yervoy (ver, por ejemplo, las patentes US n° 6.984.720, n° 8.017.114); el tremelimumab, bajo desarrollo en -Pfizer (ver, por ejemplo, las patentes US n°7.109.003 y n° 8.143.379) y los anticuerpos anti-CTLA4 de cadena sencilla (ver, por ejemplo, los documentos n°WO97/20574 y n° WO2007/123737).
El modulador de punto de control inmunitario para antagonizar el receptor de LAG3 también puede utilizarse en la combinación de las presentes invención y divulgación (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.773.578).
Otro ejemplo de modulador de punto de control inmunitario en la presente divulgación está representado por un agonista de OX40, tal como el ligando agonista de OX40 (OX40L) (ver, por ejemplo, las patentes US n° 5.457.035, n° 7.622.444 y el documento n° WO03/082919), o un anticuerpo dirigido al receptor de OX40 (ver, por ejemplo, la patente US n° 7.291.331 y el documento n° 03/106498).
Otros ejemplos de moduladores de punto de control inmunitario en la presente divulgación están representados por el anticuerpo anti-KIR o el anticuerpo anti-CD96 con diana en los receptores inhibidores alojados en las células T CD8+ y en las células NK.
Las presentes invención y divulgación comprenden una combinación que comprende más de un modulador de punto de control inmunitario. Un ejemplo preferido incluye, aunque sin limitación, la utilización de un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-PD-1 en combinación con un virus oncolítico tal como se indica en la presente memoria.
Producción de modulador de punto de control inmunitario
El modulador o los moduladores de punto de control inmunitario para la utilización en las presentes invención y divulgación pueden producirse por medios recombinantes utilizando vectores de expresión y células hospedadoras adecuados.
Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la parte o partes relevantes del modulador de punto de control inmunitario deseado pueden obtenerse utilizando técnicas estándares de biología molecular (por ejemplo, amplificación por PCR, clonación de ADNc o síntesis química) utilizando datos de secuencia accesibles en la técnica y la información proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, los ADNc codificantes de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo o sus CDR pueden aislarse a partir del hibridoma productor, de bibliotecas génicas de inmunoglobulinas o de cualquier fuente disponible.
En un ejemplo, la molécula o las moléculas de ácidos nucleicos codificantes del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario pueden clonarse en un vector adecuado y expresarse en una célula hospedadora para producir dicho modulador de punto de control inmunitario por medios recombinantes. La inserción en el vector de expresión puede llevarse a cabo mediante biología molecular rutinaria, tal como se indica en, por ejemplo, Sambrook et al., (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001). La inserción en un vector adenovírico o en un vector poxvírico puede llevarse a cabo mediante recombinación homóloga, tal como se indica en, respectivamente, Chartier et al. (J. Virol. 70: 4805-10, 1996) y Paul et al. (Cancer Gene Ther. 9: 470­ 7, 2002). Tal como se indica en la presente memoria en relación al gen terapéutico, la molécula o las moléculas de ácidos nucleicos codificantes del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario también pueden optimizarse para incrementar los niveles de expresión.
Puede utilizarse o construirse una diversidad de sistemas de hospedador-vector para expresar el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario para la utilización en las presentes invención y divulgación, incluyendo organismos procarióticos, tales como bacterias (por ejemplo, E. coli o Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe y Pichia pastoris), sistemas de células de insecto (por ejemplo, células Sf9 y baculovirus), sistemas de células vegetales (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV, y el virus del mosaico de tabaco, TMV) y sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células en cultivo). Típicamente, dichos vectores se encuentran disponibles comercialmente (por ejemplo, en Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega, etc.) o se encuentran disponibles de instituciones depositarias, tales como la American type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.) o han sido el sujeto de numerosas publicaciones que describen su secuencia, organización y métodos de producción, permitiendo la aplicación de los mismos por parte del experto.
Entre los vectores adecuados para la utilización en sistemas procarióticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pPoly (Lathe et al., Gene 57: 193-201, 1987), pTrc (Amann et al., Gene 69: 301-15, 1988); pET lid (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990); pIN (Inouye et al., Nucleic Acids Res. 13: 3101-9, 1985; Van Heeke et al., J. Biol. Chem. 264: 5503-9, 1989), y vectores pGEX en los que la molécula de ácidos nucleicos puede expresarse en fusión con glutatión-S-transferasa (GST) (Amersham Biosciences Product).
Entre los vectores adecuados para la expresión en levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae) se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. 6: 229-34, 1987), pMFa (Kujan et al., Cell 30: 933-43, 1982), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54: 113-23, 1987), pYES2 (Invitrogen Corporation) y pTEF-MF (Dualsystems Biotech Product).
Entre los vectores plásmidos adecuados para la expresión en células hospedadoras de mamífero se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, Nature 329: 840, 1987) y pMT2PC (Kaufman et al., Em BO J. 6: 187-95, 1987), pVAX y pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al., J. Virol. 76: 12735-46, 2002).
También pueden utilizarse sistemas de expresión basados en virus en el contexto de la invención y exposición derivados de una diversidad de virus diferentes (por ejemplo, baculovirus, retrovirus, adenovirus, vAa , poxvirus, virus del sarampión y similares). Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “vector vírico” comprende un vector de ADN, así como partículas víricas generadas a partir del mismo. Los vectores víricos preferentemente son defectuosos para la replicación o de replicación deteriorada.
Además, el vector de expresión utilizado en el contexto de las presentes invención y divulgación puede comprender además uno o más elementos adicionales que permiten el mantenimiento, propagación o expresión de la molécula de ácidos nucleicos codificante del modulador de punto de control inmunitario en la célula hospedadora. Entre dichos elementos adicionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, uno o más genes marcadores a fin de facilitar la identificación y el aislamiento de las células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, mediante complementación de una auxotrofía celular o mediante resistencia a antibióticos), elementos estabilizadores (por ejemplo, secuencia cer, tal como se indica en Summers y Sherrat, Cell 36: 1097-103, 1984 y sistema DAP tal como se indica en la patente US n° 5.198.343) y elementos integrativos (por ejemplo, secuencias víricas de LTR y transposones).
Entre los genes marcadores adecuados para la expresión en células hospedadoras procarióticas se incluyen genes de resistencia a tetraciclina y a ampicilina. Además, los genes de resistencia pueden utilizarse para la expresión en células hospedadoras de mamífero, tales como dihidrofolato reductasa (dhfr), que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567, 1980; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527, 1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1, 1981); zeo, que confiere resistencia a la zeomicina; kana, que confiere resistencia a la canamicina e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). Pueden utilizarse genes URA3 y LEU2 para la expresión en sistemas de levadura, que proporcionan la complementación de los mutantes de levadura ura3 o leu2.
El vector de expresión puede, en caso apropiado, agruparse con una o más sustancias que mejoran la eficiencia de transfección y/o la estabilidad del vector. Dichas sustancias se encuentran ampliamente documentadas en la literatura. Entre los ejemplos representativos de reactivos de transfección capaces de facilitar la introducción del vector en la célula hospedadora se incluyen, aunque sin limitación, polímeros policatiónicos (por ejemplo, quitosano, polimetacrilato, PEI, etc.), lípidos catiónicos (por ejemplo, DC-col/DOPE, lipofectina transfectam ahora disponibles de Promega) y liposomas.
Las tecnologías de ADN recombinante también pueden utilizarse para mejorar la expresión de la molécula de ácidos nucleicos en la célula hospedadora, por ejemplo, mediante la utilización de vectores de elevado número de copia, la sustitución o modificación de una o más secuencias reguladoras de la transcripción (por ejemplo, promotor, intensificador y similares), la optimización del uso de codones en la célula hospedadora y la supresión de secuencias negativas que podrían desestabilizar el transcrito.
Preferentemente, la molécula de ácido nucleico codificante del modulador de punto de control inmunitario se encuentra en una forma para su expresión en una célula hospedadora, que significa que la molécula de ácido nucleico se introduce bajo el control de una o más secuencias reguladoras, apropiadas al vector, la célula hospedadora y/o el nivel de expresión deseado tal como se indica en relación al gen terapéutico.
Entre los promotores adecuados para la expresión en una célula hospedadora de E. coli se incluyen, aunque sin limitación, el promotor pL del bacteriófago lambda, el promotor lac, y los promotores pTAC inducibles por TRP e IPTG. Entre los promotores adecuados para la expresión en levaduras se incluyen los promotores TEF (Mumberg et al., Gene 156: 119-22, 1995), PGK (Hitzeman et al., Science 219: 620-5, 1983), MF alfa (Inokuchi et al., Mol. Cell. Biol. 7: 3185-93, 1987), CYC-1 (Guarente et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2199, 1981), GAL-1, GAL4, GAL10, PHO5, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP o GAPDH) y alcohol deshidrogenasa (ADH) (Denis et al., J. Biol. Chem. 25: 1165, 1983). También pueden utilizarse promotores eucarióticos inducibles regulados por compuestos suministrados exógenamente, incluyendo, aunque sin limitación, el promotor metalotioneína (MT) inducible por cinc (Mc Ivor et al., Mol. Cell Biol. 7: 838-48, 1987), el promotor del virus del tumor mamario del ratón (VTMM) inducible por dexametosa (Dex), el promotor de insecto ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-51, 1996), el promotor reprimible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51, 1992), el promotor inducible por tetraciclina (Kim et al., J. Virol. 69: 2565-73, 1995), el promotor inducible por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech. 15: 239-43, 1997) y el promotor inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest.
100: 2865-72, 1997). Finalmente, los promotores indicados para la expresión del gen terapéutico también resultan adecuados especialmente para la expresión de uno o más moduladores de punto de control inmunitario, especialmente en células de mamífero.
El modulador de punto de control inmunitario puede modificarse. Pueden contemplarse diversas modificaciones, tales como las que modifican la secuencia de aminoácidos, así como las destinadas a incrementar su semivida biológica, su afinidad o su estabilidad.
Por ejemplo, puede incluirse un péptido de señal para facilitar la secreción del modulador de punto de control inmunitario en el cultivo celular. El péptido de señal típicamente se inserta en el extremo N-terminal de la proteína inmediatamente después del iniciador Met. La elección de los péptidos de señal es amplia y se encuentra accesible al experto en la materia.
A título de ejemplo adicional, también puede añadirse un péptido etiqueta (típicamente una secuencia peptídica corta capaz de ser reconocida por antisueros o compuestos disponibles) para facilitar la purificación del modulador de punto de control inmunitario recombinante. Puede utilizarse una amplia diversidad de péptidos de etiqueta, incluyendo, aunque sin limitación, una etiqueta PK, un octapéptido FLAG, una etiqueta m Yc , una etiqueta HIS (habitualmente un tramo de 4 a 10 residuos de histidina) y etiqueta e-Tag (patente US n° 6.686.152). El péptido o los péptidos de etiqueta pueden posicionarse independientemente en el extremo N-terminal de la proteína o, alternativamente, en su extremo C-terminal, o alternativamente, internamente o en cualquiera de dichas posiciones en el caso de que se utilicen varias etiquetas. Los péptidos de etiqueta pueden detectarse mediante ensayos de inmunodetección utilizando anticuerpos antietiqueta.
A título de otro ejemplo, la glucosilación del modulador de punto de control inmunitario puede alterarse de manera que incremente su afinidad para su diana. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo, mediante mutación de uno o más residuos dentro del sitio o sitios de glucosilación. Alternativamente, puede modificarse el tipo de glucosilación, por ejemplo mediante expresión en una célula hospedadora con maquinaria de glucosilación alterada. Con fines ilustrativos, la proteína no glucosilada puede expresarse en E. coli, mientras que el modulador que no presenta fucosa en sus carbohidratos puede producirse en otras células, tales como las indicadas en el documento n° US 2004-0110704 (que no presenta actividad de alfa(1,6)-fucosiltransferasa). Dichos patrones de glucosilación alterada se ha descrito que incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos.
Otra modificación es la pegilación, por ejemplo para incrementar la semivida biológica del anticuerpo. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, los documentos n° EP154316, n° EP401384, n° WO98/15293 y n° WO01/23001, etc.).
Otro enfoque que puede seguirse es el acoplamiento del modulador de punto de control inmunitario con un agente externo, tal como un agente radiosensibilizador, un agente citotóxico y/o un agente de marcaje. El acoplamiento puede ser covalente o no. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “radiosensibilizador” se refiere a una molécula que provoca que las células sean más sensibles a la terapia de radiación. Entre los radiosensibilizadores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdR), 5- yododesoxiuridina (lUdR), bromodesoxicitidina, fluorodesoxiuridina (FUdR), hidroxiurea y cisplatino.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “agente citotóxico” se refiere a un compuesto que resulta directamente tóxico para las células, evitando su reproducción o crecimiento, tal como toxinas (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma). Tal como se utiliza en la presente memoria, un “agente de marcaje” se refiere a un compuesto detectable. El agente de marcaje puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcajes isotópicos radioactivos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar la modificación química de un compuesto sustrato que resulta detectable.
Los métodos para producir recombinantemente el modulador de punto de control inmunitario son convencionales en la técnica. Típicamente, dichos métodos comprenden: (a) introducir el vector de expresión indicado en la presente memoria en una célula productora adecuada para producir una célula productora transfectada o infectada, (b) cultivar dicha célula productora transfectada o infectada bajo condiciones adecuadas para su crecimiento, (c) recuperar el modulador de punto de control inmunitario a partir del cultivo celular, y (d) opcionalmente, purificar el modulador de punto de control inmunitario recuperado. En el contexto de la invención y exposición, entre las células productoras se incluyen células procarióticas, células eucarióticas inferiores, tales como levaduras, y otras células eucarióticas, tales como células de insecto, células vegetales y células de mamífero (por ejemplo, humanas o no humanas). Entre las células de E. coli preferidas se incluyen, aunque sin limitación, E. coli BL21 (Amersham Biosciences). Entre las células levaduras productoras preferentes se incluyen, aunque sin limitación, S. cerevisiae, S. pombe y Pichia pastoris. Entre las células de mamífero productoras preferentes se incluyen, aunque sin limitación, BHK-21 (renales de hámster neonato), CV-1 (estirpe celular renal de mono africano), células c Os (por ejemplo, COS-7), células de ovario de hámster chino (CHO), células NIH/3T3 de ratón, células de mieloma n So , células HeLa, células Vero, células HEK293 y células PERC.6, así como las células de hibridoma correspondientes.
Las células productoras pueden cultivarse en biorreactores de fermentación, matraces y placas de Petri convencionales. El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula hospedadora dada. En la presente memoria no se intentarán describir en detalle los diversos métodos conocidos para la producción de proteínas en células procarióticas y eucarióticas. La producción del modulador de punto de control inmunitario puede ser periplásmico, intracelular o preferentemente secretado al exterior de la célula productora (por ejemplo, al medio de cultivo).
En caso necesario, especialmente en el caso de que el modulador de punto de control inmunitario no se secrete al exterior de la célula productora o en el caso de que no se secrete por completo, puede recuperarse mediante procedimientos estándares de lisis, incluyendo la congelación-descongelación, la sonicación, la disrupción mecánica, la utilización de agentes de lisado y similares. En caso de que se secrete, puede recuperarse directamente a partir del medio de cultivo.
A continuación, el modulador de punto de control inmunitario puede purificarse mediante métodos de purificación bien conocidos, incluyendo la precipitación con sulfato amónico, la extracción con ácido, la electroforesis en gel, la filtración y los métodos cromatográficos (por ejemplo, la cromatografía de fase inversa, de exclusión por tamaño, de intercambio iónico, de afinidad, de fosfocelulosa, de interacción hidrófoba o en hidroxilapatito, etc.). Las condiciones y tecnología utilizadas para purificar una proteína particular dependerán de factores tales como la carga neta, el peso molecular, la hidrofobicidad y la hidrofilicidad, y resultarán evidentes para el experto en la materia. Además, el nivel de purificación dependerá del uso deseado. También se entiende que, dependiendo de la célula productora, las proteínas moduladoras de punto de control inmunitario pueden presentar diversos patrones de glucosilación, o pueden estar no glucosiladas (por ejemplo, al producirse en bacterias) tal como se indica en la presente memoria.
Deseablemente, el modulador de punto de control inmunitario utilizado en las presentes invención y divulgación se purifica por lo menos parcialmente en el sentido de que se encuentra sustancialmente libre de otros anticuerpos con diferentes especificidades antigénicas y/o otros materiales celulares. Además, el modulador de punto de control inmunitario puede formularse según las condiciones utilizadas convencionalmente en la técnica (por ejemplo, el documento n° WO2009/073569).
Otro aspecto de la exposición se refiere a la utilización de una o más moléculas de ácidos nucleicos codificantes del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario indicadas en la presente memoria. Por ejemplo, el modulador de punto de control inmunitario puede administrarse en el sujeto en la forma de un vector que expresa el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario. En el presente contexto puede utilizarse cualquiera de los vectores indicados en la presente memoria.
Terapia de combinación
El virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario pueden administrarse juntos en una única composición o concurrentemente en composiciones separadas, que comprenden opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable además de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente o agentes activos. La composición única comprende el caso en que el virus oncolítico y dicho modulador o modulador o moduladores de punto de control inmunitario se mezclan entre sí (por ejemplo, una mezcla del virus oncolítico y uno o más anticuerpos o una mezcla del virus oncolítico y uno o más vectores para la expresión del anticuerpo o anticuerpos). Pueden administrarse composiciones separadas del virus oncolítico y de dicho modulador o moduladores de punto de control inmunitario simultánea o secuencialmente, una vez o varias veces (por separado o de manera alternada) y mediante la misma vía o por vías diferentes.
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” corresponde a la cantidad de cada uno de los agentes activos (virus oncolítico y el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario) comprendidos en la combinación o composición de la invención y exposición que resulta suficiente para producir uno o más resultados beneficiosos. Dicha cantidad terapéuticamente eficaz puede variar como función de diversos parámetros, en particular el modo de administración, el estado de la enfermedad, la edad y el peso del sujeto, la capacidad del sujeto de responder al tratamiento, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia de tratamiento y/o la necesidad de prevención o terapia. Respecto a la utilización profiláctica, la combinación se administra a una dosis suficiente para prevenir o retrasar la aparición y/o establecimiento y/o recaída de un estado patológico (por ejemplo, una enfermedad proliferativa, tal como cáncer), especialmente en un sujeto en riesgo. Para la utilización “terapéutica”, la combinación de virus y uno o más moduladores de punto de control inmunitario se administra en un sujeto diagnosticado de un estado patológico (por ejemplo, una enfermedad proliferativa, tal como cáncer) con el objetivo de tratar la enfermedad, eventualmente asociadamente a una o más modalidades terapéuticas convencionales. En particular, una cantidad terapéuticamente eficaz podría ser aquella cantidad necesaria para causar una mejora observable del estado clínico respecto al estado de línea base o respecto al estado esperado en caso de no tratamiento, por ejemplo, la reducción del número de tumores, la reducción del tamaño tumoral, la reducción del número o extensión de las metástasis, el incremento de la longitud de la remisión, la estabilización (es decir, el no empeoramiento) del estado de la enfermedad, el retraso o enlentecimiento de la progresión o gravedad de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de enfermedad, la prolongación de la supervivencia, una mejor respuesta al tratamiento estándar, una mejora de la calidad de vida, una mortalidad reducida, etc. Una cantidad terapéuticamente eficaz también podría ser la cantidad necesaria para causar el desarrollo de una respuesta antitumoral no específica (innata) y/o específica eficaz. Típicamente, el desarrollo de una respuesta inmunitaria, en particular una respuesta de células T, puede evaluarse in vitro, en modelos animales adecuados, o utilizando muestras biológicas recogidas del sujeto. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas utilizadas rutinariamente en laboratorios (por ejemplo, citometría de flujo, histología) para llevar a cabo la vigilancia tumoral. También pueden utilizarse diversos anticuerpos disponibles, a fin de identificar diferentes poblaciones de células inmunitarias que participan en la respuesta antitumoral que se encuentran presentes en los sujetos tratados, tales como las células T citotóxicas, células T citotóxicas activadas, células asesinas naturales y células asesinas naturales activadas. Una mejora del estado clínico puede evaluarse fácilmente mediante cualquier medición clínica relevante utilizada típicamente por el médico u otro profesional sanitario experto.
La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” pretende incluir todos y cada uno de los portadores, solventes, diluyentes, excipientes, adyuvantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de absorción y similares compatibles con la administración en mamíferos, y en particular en sujetos humanos.
Cada uno de los virus oncolíticos y uno o más moduladores de punto de control inmunitario o la composición de los mismos puede introducirse independientemente en un solvente o diluyente apropiado para el uso humano o animal. El solvente o diluyente es preferentemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y presenta una fuerza iónica relativamente baja. Entre los ejemplos representativos se incluyen agua estéril, solución salina fisiológica (por ejemplo, cloruro sódico), solución de Ringer, soluciones de glucosa, trehalosa o sacarosa, solución de Hank y otras soluciones salinas fisiológicamente equilibradas acuosas (ver, por ejemplo, la edición más reciente de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).
En otros ejemplos, cada uno del virus oncolítico y la composición o composiciones de modulador de punto de control inmunitario se tampona convenientemente para el uso en el ser humano. Entre los tampones adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, tampón de fosfato (por ejemplo, PBS), tampón de bicarbonato y/o tampón Tris, capaces de mantener un pH fisiológico o ligeramente básico (por ejemplo, entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 9).
Cada virus oncolítico y/o composición o composiciones de punto de control inmunitario pueden contener además otros excipientes farmacéuticamente aceptables para proporcionar propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables, incluyendo, por ejemplo, osmolalidad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, tasa de disolución de la formulación, modificación o mantenimiento de la liberación o absorción en un sujeto humano o animal, estimular el transporte a través de la barrera sanguínea o penetración en un órgano particular.
Cada virus oncolítico y composición o composiciones de modulador de punto de control inmunitario puede comprender además uno o más adyuvantes capaces de estimular la inmunidad (especialmente la inmunidad mediada por células T) o facilitar la infección de células tumorales con la administración, por ejemplo, mediante receptores de tipo Toll (TLR), tales como TLR-7, TLR-8 y TLR-9, incluyendo, aunque sin limitación, alúmina, emulsión de aceite mineral, tal como adyuvante completo e incompleto de Frend (IFA), lipopolisacárido o un derivado del mismo (Ribi et al., Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419, 1986), saponinas, tales como QS21 (Sumino et al., J.Virol. 72: 4931, 1998; documento n° WO98/56415), compuestos imidazo-quinolina, tales como Imiquimod (Suader, J. Am Acad Dermatol. 43:S6), S-27609, 2000 (Smorlesi, Gene Ther. 12: 1324, 2005) y compuestos relacionados, tales como los indicados en el documento n° WO2007/147529, oligodesoxinucleótidos citosina fosfato guanosina, tales como CpG (Chu et al., J. Exp. Med. 186: 1623, 1997; Tritel et al., J. Immunol. 171: 2358, 2003) y péptidos catiónicos, tales como IC-31 (Kritsch et al., J. Chromatogr. Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 822: 263-70, 2005).
En un ejemplo, el virus oncolítico y el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario comprendidos en la combinación de las presentes invención y divulgación pueden formularse con el objetivo de mejorar su estabilidad, en particular bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento a largo plazo (es decir, durante como mínimo 6 meses, con una preferencia por como mínimo dos años) a temperaturas de congelación (por ejemplo, -70°C o -20°C), refrigerado (por ejemplo, a 4°C) o a temperaturas ambientales. Se encuentran disponibles diversas formulaciones en la técnica, en forma congelada, líquida o liofilizada (por ejemplo, documentos n° WO98/02522, n° WO01/66137, n° WO03/053463, n° WO2007/056847 y n° WO2008/114021, etc). Pueden obtenerse composiciones sólidas (por ejemplo, en polvos secas o liofilizadas) mediante un procedimiento que implica el secado al vacío y la liofilización. Con fines ilustrativos, las soluciones salinas tamponadoras estériles de histidina, acetato, citrato o fosfato, tales como polisorbato-80 y estabilizantes, tales como sacarosa o manitol, están adaptadas a la conservación de los anticuerpos recombinantes y las formulaciones tamponadas que incluyen NaCl y/o azúcar están particularmente adaptadas a la conservación de virus (por ejemplo, Tris 10 mM pH 8 con sacarosa al 5% (p/v), glutamato sódico 10 mM y NaCl 50 mM o solución salina tamponada con fosfato con glicerol (al 10%) y NaCl).
En determinados ejemplos, el modulador de punto de control inmunitario puede formularse para garantizar la distribución correcta o una liberación retardada in vivo. Por ejemplo, puede formularse en liposomas. Pueden utilizarse polímeros biocompatibles biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Se han descrito muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones, por ejemplo por J. R. Robinson, en: "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
La dosis apropiada de virus oncolítico y modulador o moduladores de punto de control inmunitario puede adaptarse como una función de diversos parámetros y puede ser determinada rutinariamente por el experto en la materia a la luz de las circunstancias relevantes. La dosis adecuada del modulador o los moduladores de punto de comprobación inmunitario varía entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, ventajosamente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, deseablemente entre aproximadamente 0,5 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg, preferentemente entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, más preferentemente entre aproximadamente 2 mg/kg y aproximadamente 15 mg, con una preferencia específica para dosis de entre aproximadamente 3 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg o 10 mg/kg) al utilizarla sistémicamente. Sin embargo, las dosis reducidas en un factor de 10 a 100 pueden considerarse para una o más inyecciones intratumorales locales del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario. La dosis adecuada del virus oncolítico varía entre aproximadamente 105 y aproximadamente 1013 vp (partículas víricas), iu (unidades infecciosas) o pfu (unidades formadoras de placa), según el virus y la técnica cuantitativa utilizada. Como regla general, las dosis de virus vaccinia de entre aproximadamente 105 y aproximadamente 1013 pfu resultan adecuadas, preferentemente de entre aproximadamente 106 pfu y aproximadamente 1011 pfu, más preferentemente de entre aproximadamente 10 y pfu y aproximadamente 5x109 pfu; las dosis de entre aproximadamente 108 pfu y aproximadamente 109 pfu resultan particularmente preferidas (por ejemplo, una dosis de 108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108 o 109 pfu), especialmente para el uso humano. De la misma manera, las dosis reducidas en un factor de 10 a 100 pueden considerarse para una o más inyecciones intratumorales locales del virus oncolítico. Las dosis individuales de 106 a 5x1012 vp resultan particularmente apropiadas para los adenovirus oncolíticos, preferentemente de entre 107 y 1012 vp, más preferentemente de entre 108 y 5x1011 vp. La cantidad de virus presente en una muestra puede determinarse mediante técnicas rutinarias de titulación, por ejemplo, mediante recuento del número de placas tras la infección de células permisivas utilizando células permisivas (por ejemplo, BHK-21 o CEF), inmunotinción (por ejemplo, utilizando anticuerpos antivirus; Caroll et al., Virology 238: 198-211, 1997), mediante la medición de la absorbancia A260 (títulos de vp) o incluso mediante inmunofluorescencia cuantitativa (títulos de iu).
Administración
El virus oncolítico y/o el modulador de punto de control inmunitario pueden administrarse juntos o por separado en el sujeto y en una única dosis o en múltiples dosis. Las administraciones pueden llevarse a cabo mediante la misma vía o por vías diferentes y pueden tener lugar en el mismo sitio o en sitios alternativos.
Cualquiera de las vías de administración convencionales es aplicable en el contexto de la invención y exposición, incluyendo las vías parenteral, tópica o mucosal, para cada uno de los agentes activos comprendidos en la combinación de la invención y dados a conocer en la presente memoria. Las vías parenterales están destinadas a la administración como una inyección o infusión y comprenden vías tanto sistémicas como locales. Los tipos de inyección parenteral comunes son: intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intradérmica (en la dermis), subcutánea (bajo la piel), intramuscular (en el músculo) e intratumoral (en un tumor o en estrecha proximidad al mismo). Las infusiones típicamente se administran por la vía intravenosa. Entre las administraciones mucosales se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la vía oral/alimentaria, intranasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal o intrarrectal. La administración tópica también puede llevarse a cabo por medios transdérmicos (por ejemplo, un parche y similares). Las administraciones pueden utilizar jeringas y agujas convencionales (por ejemplo, agujas de inyección Quadrafuse) o cualquier compuesto o dispositivo disponible en la técnica capaz de facilitar o mejorar la administración del agente o agentes activos en el sujeto. Entre las vías de administración preferidas para el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario se incluyen la intravenosa (por ejemplo, inyección o infusión intravenosa), intratumoral e intraperitoneal. También se encuentran contemplados los parches transdérmicos. Entre las vías de administración preferidas para el virus oncolítico se incluyen las vías intravenosa e intratumoral. Las inoculaciones intratumorales locales del virus oncolítico podrían combinarse ventajosamente con inyecciones intratumorales locales del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario, concomitantemente o con una programación diferente, esperando efectos abscopales óptimos sobre metástasis o lesiones tumorales distantes. Lo anterior puede permitir además reducir las cantidades eficaces de cada producto y reducir además los efectos secundarios no deseados.
En la invención, el virus oncolítico y el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario se administran secuencialmente, administrando el virus oncolítico en primer lugar y el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario, en segundo lugar. Puede utilizarse la misma administración secuencial en la presente divulgación, o viceversa (la administración del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario en primer lugar y el virus oncolítico en segundo lugar). En el caso de que se utilice más de un modulador de punto de control inmunitario (por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4), pueden administrarse simultánea o secuencialmente, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado se encuentra comprendida dentro de los intervalos indicados en la presente memoria. Además, en el caso de que se administre más de una dosis de la terapia de combinación secuencialmente, el orden de la administración secuencial puede invertirse o mantenerse en el mismo orden en cada punto temporal de administración. Además, las administraciones secuenciales pueden combinarse con administraciones concurrentes. También resulta posible llevar a cabo ciclos secuenciales de administraciones que se repiten después de un periodo de reposo. Los intervalos entre cada administración pueden ser de entre varias horas y un año (por ejemplo, cada 24 h, 48 h, 72 h, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente o anualmente). Los intervalos también pueden ser irregulares (por ejemplo, tras la medición de anticuerpos monoclonales en los niveles sanguíneos del paciente). Las dosis pueden variar para cada administración dentro del intervalo indicado anteriormente.
En el contexto de la invención y exposición, el virus oncolítico puede administrarse una vez o varias veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 veces, etc.) a una dosis comprendida en el intervalo de entre 107 y 5x109 pfu. El intervalo de tiempo entre cada administración de virus puede variar entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 8 semanas, ventajosamente entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 6 semanas, preferentemente entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 4 semanas y todavía más preferentemente entre aproximadamente 1 semana y aproximadamente 3 semanas. En combinación, el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario se administran una o varias veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 veces, etc.) en una dosis comprendida en el intervalo de entre 2 mg/kg y 15 mg/kg. El intervalo de tiempo entre cada administración del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario puede variar entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 8 semanas, ventajosamente entre aproximadamente 2 días y aproximadamente 6 semanas, preferentemente entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 4 semanas y todavía más preferentemente entre aproximadamente 3 días y aproximadamente 3 semanas. Con fines ilustrativos, un programa de administración preferido para el ipilimumab es 3 mg/kg como infusión intravenosa cada 3 semanas para un total de cuatro dosis. Con fines ilustrativos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado se encuentra comprendido dentro de los intervalos indicados. En la invención, el virus oncolítico y el modulador o los moduladores de punto de control inmunitario se administran secuencialmente (por separado o alternadamente), empezando con el virus, seguido del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario. El periodo de tiempo entre la primera administración del virus oncolítico y la primera administración del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario puede variar entre aproximadamente varias horas (por lo menos 6 horas) y varias semanas. En un ejemplo preferido, el método dado a conocer en la presente memoria comprende por lo menos una administración del virus oncolítico antes de iniciar la administración del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario, con una preferencia específica por como mínimo 2 administraciones víricas seguido de 2 a 5 administraciones del modulador o los moduladores de punto de control inmunitario (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días de separación entre la segunda administración vírica y la primera administración de modulador de punto de control inmunitario). Otro esquema terapéutico preferido implica 2 a 5 (por ejemplo, 3) administraciones intravenosas o intratumorales de 108 o 109 pfu de virus vaccinia oncolítico en un intervalo de aproximadamente 1 o 2 semanas, seguido de, o alternado con, 2 a 5 (por ejemplo, 3 o 4) administraciones intravenosas de 3 a 10 mg/kg de uno o más anticuerpos antipunto de control inmunitario cada 2 o 3 semanas.
La presente divulgación se refiere además a un método para tratar una enfermedad proliferativa, tal como cáncer, que comprende administrar un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario en un sujeto que lo necesita. En particular, la combinación de un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria es para la utilización en el tratamiento de una enfermedad proliferativa y, especialmente, en el tratamiento de un cáncer en un sujeto que presenta, o está en riesgo de presentar, un cáncer.
La presente divulgación se refiere además un método para inhibir el crecimiento de células tumorales in vivo, que comprende administrar un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario en un sujeto que lo necesita. En particular, la combinación de un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria es para la utilización para incrementar la lisis de las células en división.
La presente divulgación se refiere además a un método para potenciar una respuesta inmunitaria a células tumorales, que comprende administrar un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario en un sujeto que lo necesita. En particular, la combinación de un virus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria es para la utilización para incrementar el número y/o funcionalidad de los linfocitos T CD8+ y especialmente los linfocitos T CD8+ infiltrantes de tumor.
La presente divulgación se refiere además a una estirpe celular tumoral alogénica infectada ex vivo con el virus oncolítico indicado en la presente memoria en combinación con uno o más moduladores de punto de control inmunitario indicados en la presente memoria., así como a un método para el tratamiento ex vivo de una enfermedad proliferativa, tal como cáncer, que comprende administrar dicha estirpe celular tumoral alogénica infectada con dicho virus oncolítico, seguido de la administración de dicho modulador o moduladores de punto de control inmunitario en un sujeto que lo necesita, de manera que se activa la inmunidad inducida por dicha estirpe celular de tumor alogénico infectado en dicho sujeto.
Entre los ejemplos de enfermedades proliferativas que pueden tratarse utilizando la combinación de la invención y exposición y los métodos dados a conocer en la presente memoria se incluyen cáncer óseo, cáncer hepático, cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer del esófago, cáncer orofaríngeo, cáncer pulmonar, cáncer de cabeza o cuello, cáncer de piel, melanoma, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer ovárico, cáncer de mama, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de próstata, linfoma, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, sarcoma de los tejidos blandos, leucemias crónicas o agudas, cáncer de la vejiga, cáncer renal, neoplasma del sistema nervioso central (SNC), glioma, etc. Las presentes invención y divulgación también resultan útiles para el tratamiento de cánceres metastásicos, especialmente cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai et al., Int. Immunol. 17: 133-44, 2005). Entre los cánceres preferidos que pueden tratarse utilizando la terapia de combinación según la invención y exposición se incluyen los cánceres que típicamente responden a la inmunoterapia. Entre los ejemplos no limitativos de cánceres preferidos para el tratamiento se incluyen el melanoma (por ejemplo, el melanoma maligno metastásico), el cáncer renal (por ejemplo, el carcinoma de células claras), el cáncer de próstata (por ejemplo, el adenocarcinoma prostático refractario a hormonas), el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, el cáncer pulmonar (por ejemplo, el cáncer pulmonar de células no pequeñas) y el cáncer hepático (por ejemplo, hepatocarcinoma).
Según un ejemplo ventajoso, especialmente en el caso de que el virus oncolítico se arme con un gen suicida, la terapia de combinación de la invención y exposición o los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden comprender una etapa adicional en la que se administran en el sujeto cantidades farmacéuticamente aceptables de un profármaco, ventajosamente un análogo de la citosina, en particular 5-FC. A título ilustrativo, resulta posible utilizar una dosis de entre 50 y 500 mg/kg/día, resultando preferida una dosis de 200 mg/kg/día o de 100 mg/kg/día. Dentro del contexto de las presentes invención y divulgación, el profármaco se administra de acuerdo con la práctica convencional (por ejemplo, por vía oral, sistemáticamente, etc.). Preferentemente, la administración tiene lugar después de la administración del virus oncolítico, preferentemente por lo menos 3 días, más preferentemente por lo menos 4 días y todavía más preferentemente por lo menos 7 días después de la administración del virus. La vía oral resulta preferida. Resulta preferido administrar una única dosis de profármaco o dosis que se repiten durante un tiempo que es suficientemente prolongado para permitir que el metabolito tóxico sea producido dentro del organismo hospedador o célula.
La combinación de la invención y exposición o el método dado a conocer en la presente memoria pueden estar asociados a una o más sustancias eficaces en la terapia anticáncer. Entre las sustancias farmacéuticas eficaces en la terapia anticáncer que pueden utilizarse asociadas o en combinación con las composiciones dadas a conocer en la presente memoria, pueden mencionarse más específicamente:
s agentes alquilantes, tales como, por ejemplo, mitomicina C, ciclofosfamida, busulfán, ifosfamida, isosfamida, melfalán, hexametilmelamina, tiotepa, clorambucilo o dacarbazina,
s antimetabolitos, tales como, por ejemplo, gemcitabina, capecitabina, 5-fluorouracilo, citarabina, 2-fluorodesoxicitidina, metotrexato, idatrexato, tomudex o trimetrexato,
s inhibidores de la topoisomerasa II, tales como, por ejemplo, doxorrubicina, epirrubicina, etopósido, tenipósido o mitoxantrona,
s inhibidores de la topoisomerasa I, tales como, por ejemplo, irinotecán (CPT-11), 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38) o topotecán,
s fármacos antimitóticos, tales como, por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina o vinorelbina,
s derivados del platino, tales como, por ejemplo, cisplatino, oxaliplatino, espiroplatino o carboplatino,
s inhibidores de los receptores de tirosina cinasa, tales como sunitinib (Pfizer) y sorafenib (Bayer), y
s anticuerpos antineoplásicos.
La combinación de la invención y exposición o método dado a conocer en la presente memoria también puede utilizarse asociado con otro u otros agentes, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, agentes inmunomoduladores, tales como, por ejemplo, interferón alfa, beta o gamma, interleucina (en particular, IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12) o factor de necrosis tumoral; agentes que afectan a la regulación de los receptores de superficie celular, tales como, por ejemplo, inhibidores del receptor de factor de crecimiento epidérmico (en particular, cetuximab, panitumumab, zalutumumab, nimotuzumab, matuzumab, gefitinib, erlotinib o lapatinib) o inhibidores del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (en particular, trastuzumab) y agentes que afectan a la angiogénesis, tales como, por ejemplo, el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (en particular, bevacizumab o ranibizumab).
Dichas sustancias eficaces en la terapia anticáncer pueden administrarse en el sujeto secuencial o concomitantemente con la combinación de la invención y exposición o método dado a conocer en la presente memoria.
Alternativamente o en combinación, la combinación de la invención y la exposición o método dado a conocer en la presente memoria también pueden utilizarse asociados con radioterapia.
Las presentes invención y divulgación proporcionan además kits que incluyen el agente o agentes activos de la combinación de la invención y exposición en forma de kit. En un ejemplo, un kit incluye por lo menos un virus oncolítico tal como se expone en la presente memoria en un recipiente (por ejemplo, en un vial estéril de vidrio o plástico) y uno o más moduladores de punto de control inmunitario tal como se indica en la presente memoria en otro recipiente (por ejemplo, en un vial estéril de vidrio o plástico). Un kit preferido comprende un virus vaccinia oncolítico (por ejemplo, un virus vaccinia defectuoso en las actividades TK y RR armado con un gen suicida) y uno o más moduladores de punto de control inmunitario que se unen específicamente a CTLA-4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4, tal como ipilimumab). Otro kit preferido comprende un virus vaccinia oncolítico (por ejemplo, un virus vaccinia defectuoso en las actividades TK y RR armado con un gen suicida) y uno o más moduladores de punto de control inmunitario que se unen específicamente a PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1, tal como nivolumab o lanbrolizumab). Otro kit preferido comprende un virus vaccinia oncolítico (por ejemplo, un virus vaccinia defectuoso en las actividades TK y RR armado con un gen suicida) y uno o más moduladores de punto de control inmunitario que se unen específicamente a PD-L1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-LI, tal como MPDL3280A o BMS936559). Opcionalmente, el kit puede incluir un dispositivo para realizar la administración de los agentes activos. El kit puede incluir además un impreso en el envase que incluye información referente a las composiciones o componente individual y formas de dosis en el kit.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A, B y C ilustran el crecimiento de tumores MCA205 implantados en ratones en diferentes puntos temporales (MCA205, D13 y D20, respectivamente) tratados con 2 inyecciones intratumorales de 107 pfu de WRTG17137 los días 0 y 3, y 3 inyecciones intraperitoneales de 250 |jg de anticuerpo anti-PD-1 los días 6, 9 y 12.
La figura 2 ilustra el porcentaje de supervivencia en ratones a los que se han implantado 8x105 células tumorales MCA205 y que se han tratado con 2 inyecciones intratumorales de WRTG17137 en los días 0 y 3 y 3 inyecciones intraperitoneales de anticuerpo anti-PD-1 en los días 6, 9 y 12.
Las figuras 3 A, B y C ilustran el crecimiento de tumores MCA205 implantados en ratones en diferentes puntos temporales (D3, D8 y D13, respectivamente) tratados con 2 inyecciones intratumorales de 107 pfu de WRTG17137 los días 0 y 3, y 3 inyecciones intraperitoneales de 100jg de anticuerpo anti-CTLA4 los días 6, 9 y 12.
La figura 4 ilustra el porcentaje de supervivencia de ratones en los que se han implantado 8x105 células tumorales y que han sido tratados con 2 inyecciones intratumorales de WRTG17137 los días 0 y 3, y con 3 inyecciones intraperitoneales de anticuerpo anti-CTLA-4 los días 6, 9 y 12.
Las figuras 5 A y B ilustran el crecimiento de tumores MCA205 implantados en ratones tratados con 2 inyecciones intratumorales de dosis crecientes de WRTG17137 (105, 106 o 107 pfu) los días 0 y 3, y 3 inyecciones intraperitoneales de 250 jg de anticuerpo anti-PD-1 los días 6, 9 y 12. Se midió la progresión tumoral los días 12 y 14. Los puntos negros y redondos representan la progresión tumoral en ratones tratados con el virus únicamente, y los puntos grises y cuadrados representan la progresión tumoral en ratones tratados con el virus y el anticuerpo anti-PD1.
La figura 6 ilustra el crecimiento de tumores MCA205 implantados en ratones tratados con 2 inyecciones intratumorales de 107 pfu de WRTG17137 los días 0 y 3, y 3 inyecciones intraperitoneales de 250 jg de anticuerpo anti-PD-1 o control de isotipo; la primera inyección, de anticuerpo, se realizó el día 1, 3, 5 o 7 después de la segunda inyección, de virus. La progresión tumoral se midió durante el tiempo. Los puntos redondos negros representan la progresión tumoral en ratones tratados con el virus y el control de isotipo, mientras que los puntos grises en forma de cuadrado, triángulo, rombo y hexágono representan la progresión tumoral en ratones tratados con el virus y el anticuerpo anti-PD1, 1, 3, 5 y 7 días después de la segunda inyección de virus.
La figura 7 ilustra el crecimiento de tumores MCA205 implantados en ratones tratados con 2 inyecciones intratumorales de 107 pfu de WRTG17137 los días 0 y 3, y 3 inyecciones intraperitoneales de 100jg de anticuerpo anti-CTLA-4 o control de isotipo; la primera inyección, de anticuerpo, se realizó el día 1, 3, 5 o 7 después de la segunda inyección, de virus. La progresión tumoral se midió durante el tiempo. Los puntos redondos negros representan la progresión tumoral en ratones tratados con el virus y el control de isotipo, mientras que los puntos grises en forma de cuadrado, triángulo, rombo y hexágono representan la progresión tumoral en ratones tratados con el virus y el anticuerpo anti-CTLA-4, 1, 3, 5 y 7 días después de la segunda inyección de virus.
Ejemplos
Los presentes inventores se propusieron combinar los enfoques de bloqueo de punto de control inmunitario y de vectores vaccinia oncolíticos. La replicación del virus en los tumores conduciría a la muerte celular, a la destrucción del tumor y a la liberación de antígeno tumoral. La combinación de virus oncolíticos con inhibidores antipunto de control inmunitario debería soltar los frenos de la generación de las células T y resultar en células T específicas tumorales. La evidencia preclínica de efectos sinérgicos de los bloqueantes de punto de control inmunitario combinados con vectores víricos debía demostrarse en modelos tumorales de ratón. Lo anterior implica la utilización de: i) anticuerpos antipunto de control inmunitario específicamente murinos, y ii) un poxvirus oncolítico capaz de infectar células murinas con una eficacia más elevada.
El virus oncolítico seleccionado para dichos estudios (WRTG17137) era un virus vaccinia (VV) cepa Western Reserve (WR) defectuoso para la timidina cinasa (TK) (locus J2R) y RR (locus I4L), que convierte al virus en no replicante en células sanas (no en división). En contraste, el VV Tk - RR' se supone que se replica selectiva y eficientemente en las células tumorales. Está armado con el gen FCU-1 derivado de levadura quimérica, un enzima que convierte el profármaco 5-fluorocitosina (5-FC) en los anabolitos tóxicos 5-fluorouracilo (5-FU) y 5-fluorouridín-5'-monofosfato (Erbs et al., Cancer Res. 60(14): 3813-22, 2000).
Se sometieron a ensayo individualmente dos moduladores de punto de control inmunitario: los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 y anti-CTLA4, en combinación con WRTG17137.
Combinación de VV oncolítico con mAb anti-PD-1
En primer lugar, se decidió que la diana sería el bloqueante de punto de control inmunitario murino PD-1 (Pd-1_m) utilizando un anticuerpo apropiado. Como anti-PD-1_m se seleccionó el anticuerpo de rata anti-PD-1_m RMP1-14 (BioXcell). Se ha demostrado que dicho anticuerpo bloquea la interacción de PD1_m y sus ligandos (Yamazaki et al., J. Immunol. 175(3): 1586-92, 2005).
La combinación de inhibidores de PD-1_m (clon comercial RMP1-14) y el virus oncolítico WRTG17137 se sometió a ensayo in vivo en el modelo de ratón MCA205 (Shu y Rosenberg, Cancer Res. 45(4): 1657-62, 1985). Se experimentaron diversos programas de administración.
En un primer contexto, en ratones C57BL/6 se inyectaron por vía subcutánea 8x105 células tumorales MCA205. El día 7 después de la inyección de células tumorales, se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) 250 |jg de anticuerpo anti-PD1_m RMP1-14 o su control de isotipo 2A3 los días 0, 3 y 6. A continuación, se inyectó intratumoralmente (it) el virus WRTG17137 (1x107 pfu) dos veces los días 7 y 10. Se sometieron a ensayo cuatro grupos de 13 ratones, un grupo de control recibió control de isotipo (3 inyecciones ip los días 0, 3 y 6), un grupo de ratones fue tratado con el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 0, 3 y 6), un grupo de ratones fue tratado con el virus oncolítico (2 inyecciones it los días 7 y 10) y el cuarto grupo recibió mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 0, 3 y 6) seguido un día después de la última inyección de anticuerpo por 2 inyecciones de WRTG17137 (2 inyecciones it los días 7 y 10). Se realizó un seguimiento de la progresión tumoral y la supervivencia de los ratones durante 40 días.
Tal como se esperaba, el tumor incrementó de tamaño muy rápidamente en el grupo de control, mientras que el crecimiento tumoral se retrasó en los otros tres grupos en la misma medida, aunque se observó una ligera mejora en el grupo que recibió tanto anticuerpo de Pd-1_m como el virus oncolítico. Los resultados de supervivencia fueron análogos, con una supervivencia de 50% obtenida a los 16, 23, 24 y 26 días, respectivamente en grupo de control, grupo de anticuerpo, grupo tratado con WRTG17137 y grupo tratado con anticuerpo WRTG17137.
En el segundo contexto, los ratones C57BL/6 recibieron inyecciones subcutáneas de 8x10 5 células tumorales MCA205 tal como anteriormente y los animales fueron divididos en cuatro grupos de 13 ratones, respectivamente: un grupo de control que recibió control de isotipo (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12), un grupo de ratones tratados con el virus oncolítico (2 inyecciones it los días 0 y 3 de 1x107 pfu de WRTG17137), un grupo de ratones tratados con el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12 de 250 jg de anticuerpo anti-PD1_m RMP1-14) y un cuarto grupo que recibió tanto el virus (los días 0 y 3) como, tres días después, el anticuerpo (3 inyecciones ip cada tres días, es decir, los días 6, 9 y 12). Se realizó un seguimiento de la progresión tumoral y la supervivencia durante 40 días.
Tal como se esperaba, los tumores incrementaron de tamaño muy rápidamente en el grupo de control, mientras que el crecimiento tumoral se retrasó en la totalidad de los otros tres grupos. Sin embargo, tal como se ilustra en la figura 1, se retrasó el crecimiento tumoral en la misma medida en los grupos tratados con únicamente un componente (anticuerpo de PD-1_m o virus oncolítico) y el enlentecimiento fue más pronunciado en el grupo que había recibido tanto anticuerpo de PD-1_m como el virus oncolítico, especialmente en los puntos temporales D13 y D20.
Tal como se ilustra en la figura 2, se obtuvo una supervivencia de 50% el día 16 en el grupo de control. Se observó un incremento de la supervivencia debido a la inyección de WRTG17137 (supervivencia de 50% el día 22) o debido a la inyección de Pd-1_m (supervivencia de 50% el día 20). Se incrementó la supervivencia adicionalmente tras la administración de WRTG17137, seguido del anticuerpo (supervivencia de 50% medida el día 28).
Combinación de inhibidores anti-CTLA4
La combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 (clon comercial 9D9) con el virus oncolítico WRTG17137 se sometió a ensayo in vivo en el modelo de ratón MCA205. Se experimentaron diversos programas de administración.
En un primer contexto, en ratones C57BL/6 se inyectaron por vía subcutánea 8x105 células tumorales (MCA205). El día 7 después de la inyección de células tumorales, se inyectaron ip 100 jg de anticuerpo anti-CTLA-4 9D9 (BioXcell) los días 0, 3 y 6. A continuación, se inyectó intratumoralmente el virus WRTG17137 (1x107 pfu) dos veces los días 7 y 10. Se sometieron a ensayo cuatro grupos de 6 ratones, un grupo de control recibió control de isotipo (3 inyecciones ip los días 0, 3 y 6), un grupo de ratones fue tratado con el mAb anti-CTLA-4 (3 inyecciones ip los días 0, 3 y 6), un grupo de ratones fue tratado con el virus oncolítico (2 inyecciones it los días 7 y 10) y el cuarto grupo recibió mAb anti-CTLA-4 (3 inyecciones ip los días 0, 3 y 6) seguido un día después de la última inyección de anticuerpo por 2 inyecciones de WRTG17137 (2 inyecciones it los días 7 y 10). Se realizó un seguimiento de la progresión tumoral y la supervivencia de los ratones durante 35 días.
Tal como se esperaba, los tumores incrementaron de tamaño muy rápidamente en el grupo de control, mientras que el crecimiento tumoral se retrasó en la totalidad de los otros tres grupos, aproximadamente en la misma medida.
En el segundo contexto, en ratones se inyectaron por vía subcutánea 8x105 células tumorales MCA205, tal como anteriormente. Se sometieron a ensayo cuatro grupos de 6 ratones: un grupo de control que recibió control de isotipo MCP-11 (3 inyecciones ip los días 0, 3 y 6); un grupo de ratones tratados con el virus oncolítico (2 inyecciones it los días 0 y 3 de 1x107 pfu de WRTG17137); un grupo de ratones tratados con el mAb anti-CTLA-4 9D9 (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12) y un cuatro grupo que recibió tanto el virus (los días 0 y 3) como, tres días después, el anticuerpo anti-CTLA-4 (3 inyecciones ip cada tres días, es decir, los días 6, 9 y 12). Se realizó un seguimiento de la progresión tumoral y la supervivencia durante 35 días.
Tal como se esperaba, los tumores incrementaron de tamaño muy rápidamente en los grupos de control. El crecimiento tumoral se retrasó en la totalidad de los tres otros grupos. Sin embargo, tal como se ilustra en la figura 3, el volumen tumoral se redujo en los grupos tratados con solo un componente (anticuerpo anti-CTLA-4 o virus oncolítico); el enlentecimiento fue mucho más pronunciado en el grupo que recibió tanto anticuerpo anti-CTLA-4 como virus oncolítico.
Tal como se ilustra en la figura 4, se obtuvo una supervivencia de 50% el día 18 en el grupo de control. Se observó un incremento de la supervivencia debido a la inyección de WRTG17137 (supervivencia de 50% el día 21) o debido a la inyección de anticuerpo anti-CTLA-4 (supervivencia de 50% el día 20). Se incrementó la supervivencia adicionalmente tras la administración de WRTG17137, seguido del anticuerpo (supervivencia de 50% medida el día 32).
Efectos relacionados con la dosis
Se llevó a cabo el mismo experimento que anteriormente, con diferentes dosis de virus. Se trataron cuatro grupos de seis ratones después de la implantación tumoral (8x105 células tumorales MCA). Un grupo de control recibió tampón de formulación en lugar de virus y control de isotipo en lugar del anticuerpo. Un segundo grupo fue tratado con 105, 106 o 107 pfu de WRTG17137 (2 inyecciones it los días 0 y 3) y un tercer grupo, con el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12 de 250 |jg de anticuerpo anti-PD1_m RMP1-14). Un cuarto grupo recibió tanto el virus (105, 106 o 107 pfu los días 0 y 3) como, tres días después, el anticuerpo (3 inyecciones ip cada tres días, es decir, los días 6, 9 y 12). Se realizó un seguimiento de la progresión tumoral durante 15 días.
La figura 5 ilustra la progresión tumoral observada en ratones tratados con la misma dosis de virus solo (puntos negros y redondos) o en combinación con el anticuerpo anti-PD-1 (puntos grises y cuadrados) 12 y 14 días después de la primera inyección de virus. Con independencia de la dosis de virus inyectada en el tumor, se retrasó el crecimiento tumoral en los ratones tratados con la combinación de virus anti-PD-1 en comparación con el medido en ratones tratados con el virus oncolítico solo.
Estos resultados ilustran la actividad antitumoral terapéutica y sinérgica de la combinación de la invención al administrar el virus en primer lugar, antes del modulador de punto de control inmunitario.
Variación del intervalo de tiempo entre las administraciones de virus y de anticuerpo
Combinación de anticuerpo anti-PD1
En ratones C57BL/6 hembra de seis semanas de edad se inyectaron 8x105 células tumorales MCA205 por vía subcutánea (sc) en el flanco derecho. El día 0 (D0), tras alcanzar el volumen tumoral 40 a 60 mm3, los animales fueron aleatorizados y divididos en 11 grupos de 6 ratones. Un grupo de control recibió tampón (2 inyecciones it los días 0 y 3); un grupo de ratones con el virus oncolítico (2 inyecciones it los días 0 y 3 de 1x107 pfu de WRTG17137); un grupo que recibió tanto el virus (los días 0 y 3) y el control de isotipo (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 4, 7 y 10 de 250 jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12 de 250 jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 8, 11 y 14 de 250 jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 10, 13 y 16 de 250 jg de anticuerpo anti-PD1_m RMP1-14); un grupo de ratones recibió tanto el virus (los días 0 y 3) como el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 4, 7 y 10 de 100 jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14); un grupo de ratones que recibió tanto el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12 de 100 jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14); un grupo de ratones que recibieron tanto el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 8, 11 y 14 de 100 jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14) y un grupo de ratones que recibieron tanto el virus (los días 0 y3) como el mAb anti-PD-1 (3 inyecciones ip los días 10, 13 y 16 de 100 jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14). Se realizó un seguimiento de la progresión tumoral y la supervivencia durante el tiempo.
Tal como se muestra en la figura 6, se retardó el crecimiento tumoral en ratones tratados con la combinación de virus y anti-PD-1 (250 jg/ratón) en comparación con el medido en ratones tratados con el virus oncolítico y el anticuerpo de isotipo. A más tiempo entre las administraciones del virus y del anticuerpo, más crecimiento tumoral se controla. Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de control y el grupo de virus anti-PD-1 (D+7, es decir, 3 inyecciones ip los días 10, 13 y 16 de 250 |jg de anticuerpo anti-PD1_m clon RMP1-14) los días 9 y 13 después del tratamiento. Se observó la misma tendencia en los grupos de animales tratados con la combinación de WRTG17137 (1x107 pfu/ratón) y anti-PD-1 (100 jg/ratón), aunque sin ninguna diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo de control (1x107 pfu/ratón 100 jg de isotipo/ratón).
Combinación de anticuerpo anti-CTLA-4
En ratones C57BL/6 hembra de seis semanas de edad se inyectaron 8x105 células tumorales MCA205 por vía subcutánea (sc) en el flanco derecho. El día 0 (D0), tras alcanzar el volumen tumoral 40 a 60 mm3, los animales fueron aleatorizados y divididos en 11 grupos de 6 ratones. Un grupo de control recibió tampón (2 inyecciones it los días 0 y 3); un grupo de ratones con el virus oncolítico (2 inyecciones it los días 0 y 3 de 1x107 pfu de WRTG17137); un grupo que recibió tanto el virus (los días 0 y 3) y el control de isotipo (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-CTLA4 (3 inyecciones ip los días 4, 7 y 10 de 100 jg de anticuerpo anti-CTLA4_m clon 9D9); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-CTLA4_m (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12 de 100 jg de anticuerpo anti-CTLA4_m clon 9D9); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-CTLA4_m (3 inyecciones ip los días 8, 11 y 14 de 100 jg de anticuerpo anti-CTLA4 clon 9D9); un grupo de ratones tratados con el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-CTLA4 (3 inyecciones ip los días 10, 13 y 16 de 100 jg de anticuerpo anti-CTLA4_m clon 9D9); un grupo de ratones recibió tanto el virus (los días 0 y 3) como el mAb anti-CTLa4 (3 inyecciones ip los días 4, 7 y 10 de 50 jg de anticuerpo anti-CTLA4_m clon 9D9); un grupo de ratones que recibió tanto el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-CTLA4 (3 inyecciones ip los días 6, 9 y 12 de 50 jg de anticuerpo anti-CTLA4_m clon 9D9); un grupo de ratones que recibieron tanto el virus (los días 0 y 3) y el mAb anti-CTLA4 (3 inyecciones ip los días 8, 11 y 14 de 50 jg de anticuerpo anti-CTLA4_m clon 9D9) y un grupo de ratones que recibieron tanto el virus (los días 0 y3) como el mAb anti-CTLA4_m (3 inyecciones ip los días 10, 13 y 16 de 50 jg de anticuerpo anti-CTLA4_m clon 9D9). Se realizó un seguimiento de la progresión tumoral y la supervivencia durante el tiempo.
Tal como se muestra en la figura 7, se retardó el crecimiento tumoral en ratones tratados con la combinación de virus y anti-CTLA-4 (100 jg/ratón) en comparación con el medido en ratones tratados con el virus oncolítico y el anticuerpo de isotipo. El crecimiento tumoral se retrasó todavía más con un periodo de tiempo corto (día 1, 3 o 5) entre las administraciones de virus y de anticuerpo; se observaron diferencias estadísticamente significativas para estos 3 grupos con respecto al grupo de control 6, 9 y 13 días después del tratamiento. Se observó la misma tendencia en los grupos de animales D+1, D+3 y D+5 tratados con la combinación de WRTG17137 (1x107 pfu/ratón) y anti-CTLA-4 (50 jg/ratón), aunque sin ninguna diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo de control (1x107 pfu/ratón 100 jg de isotipo/ratón).
El experto en la materia apreciará, o podrá determinar mediante nada más que experimentación rutinaria, numerosos equivalentes de los métodos y reactivos específicos indicados en la presente memoria, incluyendo alternativas, variantes, adiciones, deleciones, modificaciones y sustituciones.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Combinación que comprende un poxvirus oncolítico y uno o más moduladores de punto de control inmunitario que antagonizan por lo menos parcialmente la actividad del/de los punto(s) de control inmunitario inhibidor(es) para la utilización para el tratamiento de un cáncer; en el que dicho poxvirus oncolítico es un virus vaccinia oncolítico defectuoso para la timidina cinasa (TK) resultante de las mutaciones inactivadoras en el gen vírico J2R y defectuoso para la actividad de ribonucleótido reductasa (RR) resultante de las mutaciones inactivadoras en los genes víricos I4L y/o F4L; en la que dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario son un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los siguientes: PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA y CTLA4; y en la que dicho poxvirus oncolítico y dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario se administran secuencialmente y en la que dicho poxvirus oncolítico se administra en primer lugar y dicho(s) modulador(es) de punto de control inmunitario se administran en segundo lugar.
2. Combinación para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicho poxvirus oncolítico expresa además por lo menos un gen terapéutico insertado en el genoma vírico, en el que dicho gen terapéutico se selecciona de entre el grupo que consiste en genes que codifican productos de gen suicida y genes que codifican proteínas inmunoestimuladoras.
3. Combinación para la utilización según la reivindicación 2, en la que dicho gen suicida se selecciona de entre el grupo que consiste en genes que codifican proteína con una actividad de citosina desaminasa (CDasa), una actividad de timidina cinasa, una actividad de uracil fosforribosil transferasa (UPRTasa), una actividad de purina nucleósido fosforilasa y una actividad de timidilato cinasa, preferentemente en la que dicho producto de gen suicida presenta unas actividades de CDasa y UPRTasa, y más preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste en los polipéptidos codA::upp, FCY1::FUR1 y FCY1::FUR1[Delta] 105 (FCU1) y FCU1-8.
4. Combinación para la utilización según la reivindicación 3, en la que dicho poxvirus oncolítico es un virus vaccinia defectuoso para las actividades tanto de TK como RR y que comprende insertado en su genoma el gen suicida FCU1 terapéutico.
5. Combinación para la utilización según la reivindicación 2, en la que dicha proteína inmunoestimuladora es una interleucina o un factor estimulante de colonias, con una preferencia específica porGM-CSF.
6. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende de aproximadamente 107 pfu a aproximadamente 5x109 pfu de dicho poxvirus oncolítico.
7. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario comprenden un anticuerpo que se une específicamente a PD-1 humano y, en particular, un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado de entre el grupo que consiste en nivolumab, lanbrolizumab y pidilizumab.
8. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario comprenden un anticuerpo que se une específicamente a PD-L1 humano y, en particular, un anticuerpo anti-PD-L1 seleccionado de entre el grupo que consiste en MPDL3280A y BMS-936559.
9. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario comprenden un anticuerpo que se une específicamente a CTLA-4 humana y, en particular, un anticuerpo anti-CTLA4 seleccionado de entre el grupo que consiste en ipilimumab, tremelimumab y anticuerpos anti-CTLA4 de cadena sencilla.
10. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg de dichos uno o más moduladores de punto de control inmunitario.
11. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho(s) modulador(es) de punto de control inmunitario se administra(n) por vía intravenosa, intratumoral o intraperitoneal y en la que dicho poxvirus oncolítico se administra por vía intravenosa o intratumoral.
12. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende de 2 a 5 administraciones intravenosas o intratumorales de 108 o 109 pfu de virus vaccinia oncolítico en un intervalo de aproximadamente 1 o 2 semanas, seguido de, o intercalado con, 2 a 5 administraciones intravenosas de 3 a 10 mg/kg de uno o más anticuerpos de punto de control autoinmunitario cada 2 o 3 semanas.
13. Combinación para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste en melanoma, cáncer renal, cáncer prostático, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar y cáncer hepático.
14. Kit que comprende por lo menos un poxvirus oncolítico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 11 a 12 en un recipiente y uno o más moduladores de punto de control inmunitario como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 7 a 12 en otro recipiente, para la utilización en el tratamiento de un cáncer mediante administración secuencial, en el que dicho poxvirus oncolítico se administra en primer lugar y dichos modulador o moduladores de punto de control inmunitario se administran en segundo lugar.
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