CN112004545A - 免疫-溶瘤的经修饰的痘苗天坛病毒和治疗癌症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过向受试者施用溶瘤病毒和疗法的组合来治疗受试者的癌症的方法，所述疗法诱导肿瘤诱导的多形核型骨髓髓系来源的抑制细胞(PMN‑MDSC)的消耗。在某些优选的实施方案中，溶瘤病毒是具有病毒的M1L‑K2L基因缺失的复制缺陷的经修饰的痘苗天坛(MVTT)病毒。在其他优选的实施方案中，诱导肿瘤诱导的PMN‑MDSC的消耗的疗法包括施用针对Ly6G的抗体，例如1A8。本发明的癌症疗法可以与一种或更多种其他的抗癌疗法组合施用。优选的另外的抗癌疗法是免疫疗法，例如施用检查点抑制剂。

Description

免疫-溶瘤的经修饰的痘苗天坛病毒和治疗癌症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月20日提交的美国临时专利申请序列号62/660,546和2018年6月20日提交的美国临时专利申请序列号62/687,531的权益，在此通过引用将其整体并入，包括任何表格、图或附图。

发明背景

间皮瘤是一种石棉相关的恶性形式肿瘤，其在人类中通常预后较差。对于这种威胁生命的恶性肿瘤，目前的护理标准只能在患者的生存率方面达到次佳的改善。利用宿主免疫系统根除恶性细胞已成为癌症免疫疗法的临床策略。尽管免疫检查点抑制剂已改善了某些癌症的治疗效果，但对间皮瘤患者它们的效果并不令人满意。因此，需要新的策略来治疗间皮瘤。近来，溶瘤病毒疗法已经成为一种有前景的癌症免疫疗法，其用于治疗包括恶性间皮瘤在内的实体瘤。然而，有限的病毒治疗功效的机制仍然难以捉摸。

病毒直接介导的癌细胞溶瘤作用是溶瘤病毒疗法的主要机制之一。在溶瘤过程中，危险相关分子模式(DAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)被释放到肿瘤微环境(TME)中，这可以通过创建免疫激活环境并随后引发或增强肿瘤反应性T细胞响应来调节释放的肿瘤抗原的免疫原性。临床前和临床研究二者均证明了适应性T细胞免疫在溶瘤病毒疗法中的关键作用。然而，TME通常是免疫抑制环境，其通过诱导耐受性树突状细胞(DC)和CD25⁺Foxp3⁺调节性T淋巴细胞(Treg)来抑制肿瘤反应性T细胞的活化。TME中的骨髓髓系来源的抑制细胞(MDSC)可以抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的响应性，导致患者疗效有限，尤其是当TME具有高度免疫抑制性时。由于T细胞免疫对于溶瘤病毒疗法的疗效必不可少，因此更好地理解TME中的限制性机制对于改善溶瘤病毒疗法的临床效果尤其重要。

MDSC是TME中主要的免疫抑制群体之一，且是癌症免疫疗法有效性的主要障碍。在恶性间皮瘤模型中，MDSC随着肿瘤病灶的发展而迅速扩增，并有助于抑制肿瘤反应性CTL响应。一贯地，TME中MDSC数量的减少可能与患者溶瘤病毒疗法期间抗原特异性CTL响应的产生和治疗效果有关。MDSC可以是单核细胞(M)或多核细胞(PMN)。在痘苗病毒治疗期间靶向COX-2-PGE2途径能够降低PMN-MDSC水平，同时增加抗肿瘤CTL响应。此外，使用COX-2抑制剂塞来昔布的早期研究通过降低PMN-MDSC频率改善了基于DC的针对间皮瘤免疫疗法。尽管这些研究表明PMN-MDSC在癌症免疫疗法中的关键作用，但很少观察到治愈已建立的肿瘤。迄今为止，在溶瘤病毒治疗过程中，TME中MDSC积累的基础机制，MDSC亚群之间的功能差异及其对引发抗肿瘤CTL的影响尚不完全清楚。

发明概述

在某些实施方案中，本发明提供了通过向受试者施用溶瘤病毒和疗法的组合来治疗受试者的癌症的方法，所述疗法诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗。在优选的实施方案中，溶瘤病毒是具有病毒的M1L-K2L基因缺失的复制缺陷的经修饰的痘苗天坛(MVTT)病毒。在其他优选的实施方案中，诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的疗法包括施用针对Ly6G的抗体，例如1A8。本发明的癌症疗法可以与一种或更多种其他的抗癌疗法组合施用。优选的另外的抗癌疗法是免疫疗法，例如施用检查点抑制剂。

附图简要说明

图1A-1E显示了编码两个检测标记物HIV-1p24和RFP的重组MVTT病毒的产生。(A)编码HIV-1p24和HcRed二者的痘苗穿梭载体pZCxz的示意图。每种蛋白质的表达由不同的启动子驱动。(B)用重组MVTT感染AB1细胞24小时。HcRed信号利用荧光显微镜获得。BF，明视野。(C)重组MVTT感染后AB1细胞中病毒蛋白表达的蛋白质印迹分析。如箭头所示，使用抗p24抗体(克隆：183-H12-5C)来检测外源蛋白质的存在。GAPDH是一种内部对照，表明每个泳道中均上样了等量的蛋白质。(D)将AB1细胞以2×10⁵细胞/孔的密度接种在24孔板中。24小时后，以0.2感染复数(MOI)重组MVTT病毒感染细胞。在三个指示的时间点收获细胞，并使用流式细胞术分析HcRed⁺AB1细胞的百分比。(E)在不同时间点从AB1细胞中收集重组MVTT病毒感染后的培养上清液，并测量释放到上清液中的病毒颗粒。

图2A-2E显示了MVTT介导的AB1细胞的溶瘤作用，导致CRT暴露以及ATP和HMGB1的释放。(A)用0.2MOI重组MVTT感染后的AB1细胞活力。通过抗CRT抗体检测AB1细胞上的CRT表达，并通过流式细胞术分析(B)或蛋白质印迹(C)进行分析。β-肌动蛋白是一种内部对照，表明该分析中使用了相同量的蛋白质。(D)在MVTT病毒感染后，培养上清液中释放的HMGB1的蛋白质印迹分析。(E)培养上清液中释放的ATP水平。

图3A-3F显示了重组MVTT病毒对AB1间皮瘤的溶瘤作用不会诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡。(A)使用不同剂量的MVTT对AB1荷瘤小鼠进行治疗研究的示意图。处理前7天皮下接种5×10⁵AB1细胞建立实体AB1间皮瘤。在高剂量组中，每2天在肿瘤内(鞘内注射，i.t.)递送每剂1×10⁸PFU MVTT病毒5次，而在中剂量组，每次注射给予鞘内注射1×10⁷PFU 4次，且在低剂量组2次。(B)用卡尺随时间测量肿瘤体积。(C)各组中的个体肿瘤生长曲线。每条线代表一只小鼠。(D)通过卡尺测量确定存活曲线，取其到肿瘤长度＞15mm的时间。(E)无肿瘤或AB1荷瘤小鼠脾细胞中的T细胞应答。用gp70-AH1、TWIST1或无关抗原OVA体外刺激脾细胞后，通过ELIspot测定法定量分泌的IFN-γ。如箭头所示，只有一只无肿瘤的小鼠对gp70-AH1表位有强烈响应。(F)从无肿瘤小鼠中分离的CD3⁺ T细胞的CTL测定。灰线表示具有强烈AH1响应的小鼠CD3⁺ T细胞的CTL活性。与PBS组相比，P＝0.08。

图4A-4F显示了在肿瘤内MVTT处理后，PMN-MDSC在肿瘤中的积累。(A)脾脏和肿瘤中总MDSC的百分比(左图)和肿瘤中MDSC的绝对细胞数(右图)。计算在指定时间点每毫克肿瘤的MDSC数。(B)代表点图显示了脾脏和肿瘤中CD11b⁺细胞内PMN-MDSC和M-MDSC的群体。数字表示细胞比例。(C)计算了M-MDSC(左图)和PMN-MDSC(右图)的MDSC亚群的百分比。(D)肿瘤中M-MDSC和PMN-MDSC的绝对细胞数。在指定的时间点，计算每毫克肿瘤的MDSC亚群数。(E)还显示了脾脏和肿瘤中CD4⁺ Treg的百分比(左图)以及肿瘤中CD4⁺ Treg的绝对细胞数(右图)。(F)脾脏和肿瘤中NK细胞的百分比(左图)和肿瘤中NK细胞的绝对细胞数(右图)。

图5A-5F显示了在肿瘤内MVTT处理后，PMN-MDSC向肿瘤部位的运输(trafficking)。(A)来自AB1荷瘤小鼠的不同MDSC亚群上趋化因子受体表达的流式细胞术分析。显示了代表性的直方图。阴影区域代表同种型对照。MVTT处理后肿瘤中C-X-C趋化因子(B)和C-C趋化因子(C)的表达。(D)MVTT处理后24小时，脾脏和肿瘤中CFSE标记的MDSC的频率(左图)和绝对数(右图)。(E)MVTT处理后24小时，肿瘤中的M-MDSC和PMN-MDSC细胞亚群。用数字显示代表性的点图，其指示门控细胞与总单峰的比例。(F)分析了PMN-MDSC比例相对于M-MDSC比例的比值变化(左图)。在过继转移之前测得的PMN-/M-MDSC比值显示为基线。显示了肿瘤中M-MDSC和PMN-MDSC的绝对数量的变化(右图)。

图6A-6D显示了MVTT处理后破坏了PMN-MDSC肿瘤运输。(A)在CD11b⁺细胞上门控的代表性点图显示了接受鞘内注射100μg 1A8或抗大鼠IgG2a(克隆：2A3)同种型对照后2天和4天，在脾脏和肿瘤中PMN-MDSC和M-MDSC的数量。点图中的数字表示门中的细胞比例。(B)用PMN-MDSC(左图)和M-MDSC(右图)计算MDSC亚群的百分比。(C)代表性的点图显示组合处理后2天和4天，脾脏和肿瘤中PMN-MDSC和M-MDSC群体。将100μg 1A8或同种型2A3与1×10⁷PFUMVTT联合并鞘内注入AB1间皮瘤。(D)分析MDSC亚群中PMN-MDSC(左图)和M-MDSC(右图)的变化。

图7A-7K显示溶瘤作用和PMN-MDSC消耗的组合恢复了抗肿瘤T细胞对肿瘤消除的免疫力。(A)处理方案的示意图。将5×10⁵个AB1细胞皮下(s.c.)接种到Balb/c小鼠中，使其生长7天，随后鞘内注射施用MVTT、1A8抗体、MVTT+1A8组合或PBS对照。每组在第9天计划进行额外的处理。计算小鼠的肿瘤生长(B)和存活曲线(C)。肿瘤消融后40天，再次攻击联合处理组的受保护小鼠，并用AB1-Luc肿瘤的代表性生物发光图像(E)测量肿瘤生长(D)。(F)通过ELISpot测定法测量的脾细胞中的T细胞应答。(G)每组中的CD3⁺ T细胞或MVTT+1A8处理组中的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以不同效应物：靶标(E：T)比率对AB1细胞具有体外细胞毒性活性。(H)以2倍的MVTT+1A8联合治疗的T细胞消耗示意图。无CD4⁺ T细胞(YTS191.1)、CD8⁺ T细胞(YTS169.4)的MVTT+1A8处理的小鼠或接受同种型对照(LTF-2)的AB1-Luc荷瘤小鼠的AB1-Luc肿瘤生长(I)和存活曲线(J)。(K)T细胞消耗组中的AB1-Luc肿瘤的代表性生物发光图像。

图8A-8F显示了PMN-MDSC通过限制DC活化来防止诱导抗肿瘤T细胞免疫。(A)CD3⁺T细胞与抗原脉冲的BMDC孵育后细胞因子的产生。在用培养基洗涤之后，将BMDC用rMVTT处理的AB1细胞上清液脉冲过夜。然后，加入纯化的CD3⁺ T细胞，并收集培养上清液以分析细胞因子的产生。在抗原脉冲过程中，几种培养物中均存在抗CRT抗体或同种型对照。来自未经免疫的

BALB/c小鼠的初始型、纯化的CD3⁺ T细胞。(B)与抗原脉冲的BMDC共培养后，CFSE标记的CD3⁺ T细胞的增殖。代表性直方图在每个图中均以数字表示，表明增殖群体。(C)在用培养基(未经刺激的)或LPS脉冲的BMDC上的CD80和CD86的表达。纯化的PMN-MDSC或M-MDSC用CFSE标记，并且与BMDC以2：1的比例存在于培养物中。从(A)到(C)的图显示了来自两次独立实验的累积数据。(D)IL-10⁺和TGF-β1⁺PMN-MDSC和M-MDSC的频率。显示了来自3个独立实验的代表性点图，其数字表示每个门中的阳性细胞群体。(E)PMN-MDSC和BMDC之间的串扰增强了IL-10的产生。在有或没有1×10⁵BMDC(BMDC：MDSC＝1：2)的情况下，培养物中存在5×10⁴纯化的PMN-MDSC或M-MDSC。孵育后4天收集上清液，并测量细胞因子的产生。(F)在IL-10受体阻断抗体或同种型对照存在下，LPS活化的BMDC上CD80和CD86的表达。纯化的PMN-MDSC或M-MDSC用CFSE标记，并与BMDC以2：1的比例存在于培养物中。在用100ng/ml LPS刺激BMDC之前，IL-10受体被抗IL-10R抗体(5μg/ml)阻断。从(E)到(F)的图显示了来自两次独立实验的代表性数据。

图9A-9C显示了联合治疗显著抑制了C57BL/6小鼠中B16F10黑素瘤的生长。在处理前7天，将C57BL/6小鼠皮下植入5x 10⁵B16F10-Luc细胞。显示了在其终点处的肿瘤生长(A)、存活曲线(B)和脾细胞的T细胞应答(C)。

图10A-10E显示了MVTT处理将PMN-MDSC募集到TME中。(A)在rMVTT处理后，已建立的AB1间皮瘤肿瘤中HcRed的表达。注射或不注射rMVTT的情况下，肿瘤中HcRed的代表性光和荧光图像的叠加图(左图)。使用IVIS光谱仪器获得荧光图像。彩色条表示荧光辐射效率乘以10⁷。显示了代表性图像。计算了来自肿瘤的HcRed荧光信号(右图)。(B)在rMVTT注射后2天，痘苗病毒蛋白在AB1肿瘤中的免疫组织化学。AB1肿瘤切片用苏木精和曙红(H&E)染色(左图)或使用市售可获得的兔抗痘苗病毒抗体(WR，Access Biomedical)和Hoechst 33258染色(蓝色)染色痘苗病毒蛋白(绿色)(右图)。显示了代表性图像。虚线显示了感染和未感染的肿瘤组织之间的边界。(C)流式细胞术散点图的门控策略显示了对MDSC亚群、NK细胞和CD4⁺ Treg以及PD1⁺/Tim3⁺CD3⁺ T细胞的鉴定。(D)肿瘤中CD3⁺ T细胞的频率(左图)和绝对数(右图)。(E)脾脏和肿瘤中PD1⁺CD3⁺ T细胞(左图)和Tim3⁺CD3⁺ T细胞(右图)的频率。

图11显示了CFSE标记的MDSC的流式细胞术分析。在rMVTT处理后24小时，在代表性小鼠中，过继转移的MDSC累积在肿瘤部位。点图中的数字表示CFSE⁺细胞相对于总单峰的比例。

图12A-12H显示了抗体和肽体处理对MDSC亚群的优先消耗。(A)H6/G3-pep编码质粒的示意图。IL2ss，IL2分泌信号。通过流式细胞术测量H6-pep、G3-pep或没有12聚体特异性序列的肽体(对照-pep)的结合亲和力。用抗小鼠IgG2b AF568检测后，将来自AB1荷瘤小鼠的脾细胞与2μg肽体一起孵育。(B)显示了在CD11b⁺细胞上门控的代表性点图，用数字表示细胞比例。(C)显示了在CD11b⁺细胞上门控的代表性直方图，用pep-H6(虚线)、G3-pep(实线)或对照pep(阴影直方图)染色。(D)鞘内注射施用100μg 1A8、H6-pep或2A3同种型对照后，脾脏和肿瘤中总MDSC的百分比。以有代表性的点图，显示了鞘内注射(i.t.)H6-pep处理之后PMN-MDSC和M-MDSC频率的变化(E)，并进行了分析(F)。鞘内注射共同施用1×10⁷PFUrMVTT和100μg H6-pep后，显示了PMN-MDSC和M-MDSC频率的变化(G)，并进行了分析(H)。

图13A-13I显示了PMN-MDSC的消耗通过诱导抗肿瘤T细胞免疫增强了MVTT治疗功效。(A)处理方案的示意图，其中在AB1细胞接种后7天给予施用一次PBS、仅1A8、组合rMVTT和1A8或组合rMVTT和H6-pep。接受一轮处理的小鼠的肿瘤生长(B)和生存曲线(C)。接受2次注射PBS、H6-pep或组合rMVTT和H6-pep的小鼠的肿瘤生长(D)、存活曲线(E)和脾细胞的T细胞应答(F)。在处理前7天，用5×10⁵B16F10-Luc细胞皮下植入C57BL/6小鼠。在第7天和第9天鞘内施用rMVTT、1A8抗体、组合rMVTT和1A8或PBS对照。显示了在其终点处的肿瘤生长(G)、存活曲线(H)和脾细胞的T细胞应答(I)。

图14A-14E显示了PMN-MDSC通过限制DC活化来防止诱导抗肿瘤T细胞免疫。(A)在CD3⁺ T细胞和抗原脉冲BMDC的共培养物中IL-6、IL-17A和IL-22的分泌。来自未经免疫的BALB/c小鼠的初始型、纯化的CD3⁺ T细胞。(B)孵育48小时后收集共培养上清液中的分泌的细胞因子。(C)在存在PMN-MDSC或M-MDSC且MDSC：BMDC比例为1：1和3：1的情况下，抗原脉冲BMDC培养物中IL-6和TNF-α的分泌。BMDC用rMVTT处理的AB1细胞上清液脉冲处理。显示的数据代表两次独立的实验。(D)rMVTT处理后肿瘤匀浆中IL-10。(E)在存在IL-10受体阻断抗体或同种型对照的情况下，在培养上清液中TNF-α和IL-12p70的产生。孵育48小时后收集培养上清液，并测量细胞因子分泌。

发明详述

使用溶瘤病毒的癌症病毒疗法是一种有前景的治疗策略，具有已证明的临床益处。在美国和欧洲，T-vec(也称为Imlygic)(一种表达免疫激活细胞因子GM-CSF的重组单纯疱疹病毒)用于治疗皮肤和淋巴结黑色素瘤得到了批准后，多种溶瘤病毒已进展到临床发展。其中，在临床环境中使用ONCOS-102腺病毒治疗恶性间皮瘤能够诱导CD8⁺ T细胞、全身性抗肿瘤CD8⁺ T细胞和Th1型极化对肿瘤的浸润。尽管T-vec和ONCOS-102的治疗效果是有希望的，但在这些研究中，只有一小部分经治疗的患者经历了临床响应。因此，研究如何诱导有效的抗肿瘤免疫响应对于增强病毒疗法对患者的治疗功效至关重要。目前正在临床试验中测试的大多数病毒都旨在获得触发免疫响应的能力。为此，了解阻断和调节系统性抗肿瘤免疫的潜在机制对于进一步改善溶瘤病毒疗法至关重要。

溶瘤病毒在肿瘤中的复制释放出危险信号CRT、HMGB1和ATP，以及DC的肿瘤抗原，从而触发抗肿瘤免疫反应。因此，结合免疫疗法的疗法已经成为改善溶瘤病毒疗法对抗各种类型的肿瘤(包括恶性间皮瘤和黑素瘤)的功效的有用策略。免疫疗法包括通过掺入免疫活化分子(例如，GM-CSF)、免疫调节药物(例如，环磷酰胺)或免疫检查点抑制剂来增强宿主抗肿瘤响应。

除了免疫检查点抑制剂的使用迅速增加外，掺有GM-CSF的单纯性疱疹病毒(T-vec)也获得了治疗晚期黑素瘤患者的监管审批。临床试验显示，舒尼替尼降低MDSC和Tregs的免疫抑制作用可增强溶瘤性呼肠孤病毒治疗期间抗肾细胞癌的免疫响应。就恶性间皮瘤而言，已显示在溶瘤腺病毒治疗期间使用一线化疗剂(顺铂或培美曲塞)可增强病毒介导的小鼠细胞毒性。

仅MVTT病毒疗法不足以有效清除肿瘤。溶瘤病毒在肿瘤中的复制释放出危险信号CRT、HMGB1、ATP和DC的肿瘤抗原，从而触发抗肿瘤免疫响应。然而，仅通过在实体瘤的多个部位肿瘤内施用极高剂量的MVTT来完全根除间皮瘤，然而即使在受保护的小鼠中，也很少引起抗肿瘤T细胞应答。

本发明描述了病毒疗法显著扩增了间皮瘤TME中的MDSC。MDSC的扩增是各种人类癌症(例如肾细胞癌、鳞状细胞癌、乳腺癌和非小细胞肺癌)中的关键免疫逃逸机制。在患有间皮瘤小鼠中，早在AB1细胞接种后7天，肿瘤就诱导了MDSC的快速增加，免疫治疗过程中MDSC的消除与肿瘤排斥密切相关。MVTT病毒治疗期间，间皮瘤TME中扩增的PMN-MDSC是由于与肿瘤细胞的病毒感染有关的C-X-C趋化因子的产生。然后，C-X-C趋化因子优先通过趋化性将CXCR2⁺PMN-MDSC从周围淋巴器官募集到肿瘤部位。这些结果强调C-C和C-X-C轴(axes)分别在M-MDSC和PMN-MDSC运输中的作用。

发现病毒感染募集的PMN-MDSC负责通过活性氧(ROS)产生抑制NK细胞，或通过PD-L1表达增强局部免疫抑制。本发明证明PMN-MDSC对DC活化表现出有效的免疫抑制功能。M-MDSC未发现对DC的类似免疫抑制作用，表明在间皮瘤TME中这两种MDSC亚群之间的功能性差异。

单独消耗PMN-MDSC也不足以有效清除肿瘤。在胰腺导管腺癌和肺癌模型中，PMN-MDSC的靶向消耗允许适度的CTL响应。然而，小鼠中的AB1间皮瘤已被认为是较差的免疫原性模型。与具有免疫能力的BALB/c小鼠相比，在免疫缺陷的SCID小鼠中AB1间皮瘤显示出相似的生长动力学。

而且，从荷间皮瘤小鼠中纯化的T细胞不含有具有有效细胞毒性活性的抗原特异性T细胞。为了更好地定义PMN-MDSC和M-MDSC在调节抗肿瘤免疫中的功能，分别进行了使用抗Ly6G或H6-pep单一疗法的消耗实验。PMN-MDSC或M-MDSC的消耗均不会对间皮瘤的生长引起任何抑制作用。另外，未检测到可测量的抗肿瘤CTL。因此，仅消耗MDSC亚群并不能促进间皮瘤抗原的暴露以触发DC活化。因此，溶瘤病毒疗法对于促进肿瘤抗原暴露和随后诱导系统性抗肿瘤T细胞响应是必需的。

因此，本发明证明治愈已建立的间皮瘤需要溶瘤病毒疗法(如MVTT病毒疗法)和PMN-MDSC消耗的组合，尽管增加了肿瘤内M-MDSC和增强DC以诱导有效的抗肿瘤CTL，但它们仍可克服免疫抑制。PMN-MDSC在调节抗肿瘤CTL响应中起关键作用。使用消耗PMN-MDSC的抗体1A8和消耗M-MDSC的肽抗体H6-pep，显示在溶瘤病毒疗法(例如MVTT病毒疗法)期间PMN-MDSC而不是M-MDSC对于TME限制肿瘤反应性CTL应答的诱导是必不可少的。

此外，溶瘤病毒疗法(例如MVTT病毒疗法)和PMN-MDSC消耗的组合激活了内源性T细胞，以引发具有广谱反应性、溶细胞活性和保护性长期记忆反应的抗肿瘤CTL。在此过程中，增加的肿瘤内M-MDSC不能阻断T细胞活化和抗肿瘤CTL。

从机制上讲，肿瘤内的PMN-MDSC而不是M-MDSC通过阻止CD80和CD86上调以及IL-6、TNF-α和IL-12p70的分泌抑制DC活化。因此，除了MDSC对T细胞的抑制作用外，本发明还描述了间皮瘤来源的PMN-MDSC对DC表现出免疫抑制活性的机制。PMN-MDSC与DC之间的串扰通过增加IL-10的产生并降低DC的活化破坏了抗肿瘤免疫。

在小鼠模型中，肿瘤来源的MDSC上调IL-10的产生，IL-10的中和作用消除了MDSC的抑制作用。考虑到免疫抑制性髓样区室在各种肿瘤和传染原下的可塑性，急性期反应蛋白可诱导分泌IL-10的肿瘤相关嗜中性粒细胞的扩增和极化，从而抑制黑色素瘤患者中抗原特异性T细胞应答。因此，分泌IL-10的PMN-MDSC可以作为保护肿瘤免受免疫监视的屏障。趋化性募集分泌IL-10的PMN-MDSC是在MVTT病毒治疗期间中止T细胞活化的关键DC抑制剂。

抑制细胞周期相关激酶(CCRK)信号传导减少了PMN-MDSC介导的免疫抑制，并抑制了肝细胞癌的致瘤性。因此，靶向CCRK以特异性破坏PMN-MDSC积累的表观遗传调控方法在开发与MVTT的联合疗法以治疗多种人类癌症(如间皮瘤)中尤其重要。

因此，本发明描述了肿瘤内PMN-MDSC是间皮瘤TME中DC的关键抑制剂，其限制了抗肿瘤CTL的诱导，损害了基于MVTT的病毒疗法的功效。

相应地，本发明的某些实施方案提供了通过施用溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的组合来治疗癌症(例如间皮瘤)的方法。

溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法可以同时或连续施用。溶瘤病毒可以在施用诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法之前或之后施用。溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的共同施用可以在相同或分开的组合物中进行。这些疗法的单独施用可以与一种或更多种其他药剂一起进行。

当单独施用时，溶瘤病毒可以在施用诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的约一天至约七天内，优选在约两天至约六天内，更优选在约三至五天内，甚至更优选在约四天内施用。在其他实施方案中，当单独施用时，溶瘤病毒可以在施用诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的约20至40小时内，优选约25至35小时内，甚至更优选约30小时内，最优选约24小时内施用。

在优选的实施方案中，溶瘤病毒在施用诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法之前施用。

溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法可以在数天的时段内多次施用，例如，在2至14天期间，更优选在4至12天期间，更优选在6天至10天期间，甚至更优选约7天期间。

在一些实施方案中，溶瘤病毒是腺病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒(包括柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和塞内加谷病毒)、副粘病毒(包括麻疹病毒和新城鸡瘟病毒(NDV))、细小病毒、弹状病毒(例如水疱性口炎病毒(VSV)，或痘苗病毒)。溶瘤病毒可以具有复制能力或是复制缺陷的。产生复制缺陷的病毒的方法是本领域已知的，并且在本发明的范围内。

在特定的实施方案中，溶瘤病毒是经修饰的痘苗病毒。优选地，经修饰的痘苗病毒是活减毒痘苗病毒，例如不能复制的痘苗病毒。在一些实施方案中，经修饰的痘苗病毒是具有复制所必需的一个或更多个基因缺失的遗传修饰的痘苗病毒。例如，M1L-K2L基因的缺失使痘苗病毒不能复制。

Zhu等人(2007)，J Virol Methods；144(1-2)：17-26描述了适用于本发明的经修饰的痘苗病毒，特别是经修饰的痘苗天坛病毒(MVTT)的实例。Zhu等人参考文献通过引用整体并入。

在某些实施方案中，经修饰的痘苗病毒是通过缺失病毒M1L-K2L基因而从痘苗天坛(VTT)产生的MVTT。在其他实施方案中，经修饰的痘苗病毒是通过用异源基因(例如编码标记荧光蛋白的基因)替换病毒M1L-K2L基因而从VTT产生的MVTT。与亲代VTT相比，MVTT毒性低100倍。因此，MVTT是具有改进的安全性的减毒牛痘天坛疫苗载体。

因此，在特定的实施方案中，溶瘤病毒是MVTT。

在进一步的实施方案中，溶瘤病毒是重组MVTT(rMVTT)。rMVTT包含来自VTT的病毒M1L-K2L基因的缺失，并且进一步包含两个或更多个替代缺失的病毒M1L-K2L基因的异源基因。两个或更多个异源基因之一可以是编码蛋白质标签的基因，例如荧光蛋白或酶。荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。红色荧光蛋白可以是HcRed或绿色荧光蛋白(GFP)。荧光蛋白的其他实例是本领域普通技术人员已知的，并且此类实施方案在本发明的范围内。例如，荧光蛋白数据库(fpbase)在本领域是众所周知的，并且可以在万维网站点：fpbase.org上找到。

在进一步的实施方案中，两个或更多个异源基因之一是编码异源病毒衣壳蛋白的基因，优选人类免疫缺陷病毒(HIV)的p24蛋白的基因。如本文所用，术语“异源病毒”是指除VTT以外的病毒。

在特定的实施方案中，两个或更多个异源基因之一是编码荧光蛋白的基因，并且两个或更多个异源基因中的另一个是编码异源病毒的衣壳蛋白的基因。优选地，两个或更多个异源基因之一是编码HcRed的基因，并且两个或更多个异源基因中的另一个是编码HIVp24的基因。

在进一步的实施方案中，两个或更多个异源基因之一在突触蛋白启动子(pSYN)的控制下，并且两个或更多个异源基因中的另一个在H5启动子(pH5)的控制下。优选地，两个或更多个异源基因之一是在pH5的控制下编码HcRed的基因，并且两个或更多个异源基因中的另一个是在pSYN的控制下编码HIV p24的基因。MVTT易于诱导DAMP(包括钙网蛋白(CRT)暴露、HMGB1和ATP释放)，以及AB1间皮瘤细胞的溶瘤作用。MVTT引发肿瘤反应性CTL，这对于治疗恶性间皮瘤至关重要。MVTT病毒疗法还诱导趋化性，其将产生IL-10的PMN-MDSC募集到TME中，在此它们抑制DC，因此阻断了抗肿瘤CTL的诱导。在MVTT病毒治疗期间，PMN-MDSC而不是M-MDSC的消耗，释放了肿瘤反应性CTL，从而导致癌症(例如间皮瘤)的治疗治愈。本发明提供了MDSC，特别是PMN-MDSC的消耗，与溶瘤性MVTT治疗相结合，可以例如通过引起细胞毒性CD8⁺ T细胞应答来恢复有效的抗肿瘤T细胞免疫。

因此，本发明的具体实施方案提供了通过施用溶瘤性MVTT和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的组合来治疗癌症(例如恶性间皮瘤或黑素瘤)的方法。

诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的某些疗法的实例包括吉西他滨、氟尿嘧啶、宾达利、PDE5抑制剂、他达拉非、硝基阿司匹林(nitroaspirin)、COX-2抑制剂，伊匹单抗(ipilimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、塞来昔布、西地那非和他达拉非、N-羟基-L-精氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、甲基巴多索隆(CDDO-Me)、醉茄素A(Withaferin A)、单克隆抗Gr1抗体、IL4Rα适体，和靶向MDSC膜蛋白的肽体(S100家族)。

在特定的实施方案中，诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法仅特异性地诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗而不影响肿瘤诱导的M-MDSC。

在优选的实施方案中，诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法是针对淋巴细胞抗原6复合基因座G6D(Ly6G)的抗体，例如抗体1A8。针对Ly6G的抗体(例如1A8)可特异性诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗，而不会影响肿瘤诱导的M-MDSC。

在某些实施方案中，所述方法包括在施用溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的组合之前、期间或之后施用化学治疗剂。

在进一步的实施方案中，在向受试者施用溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的组合之前或之后，施用放射疗法。也可以在施用溶瘤病毒和施用诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法之间施用放射疗法。

在某些实施方案中，所述方法包括在向受试者施用溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法的组合之前、期间或之后施用检查点抑制剂。可以在施用溶瘤病毒和施用诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法之间施用检查点抑制剂疗法。

某些检查点抑制剂已用于癌症疗法。检查点是指免疫系统中的抑制途径，其负责维持自我耐受并调节免疫系统响应的程度，以最大程度地减少周围组织的损伤。肿瘤细胞可以激活免疫系统检查点，以降低针对肿瘤组织的免疫响应的功效。施用检查点抑制剂可释放对免疫系统的抑制作用，并允许免疫系统具有针对肿瘤细胞的活性。示例性的检查点抑制剂包括针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279)和程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274)的抑制剂，例如抗体。示例性的抗PD-1抗体是可商购的，并且包括派姆单抗、lambrolizumab、纳武单抗、AMP-224(MERCK)和pidilizumab。示例性的抗PD-L1抗体也是可商购的，包括阿特珠单抗、MDX-1105(MEDAREX)、MEDI4736(MEDIMMUNE)MPDL3280A(GENENTECH)、BMS-936559(BRISTOL-MYERSSQUIBB)和AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。示例性的抗CTLA4抗体包括伊匹单抗(Bristol-Myers Squibb)和tremelimumab(PFIZER)。伊匹单抗最近已获得FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤(Wada等人，2013，J Transl Med 11：89)。其他检查点抑制剂是技术人员众所周知的，并且此类实施方案在本发明的范围内。

可以根据本文公开的材料和方法治疗癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的实例包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌，胃肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、腹膜癌、肝癌。例如，肝癌、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、MDS、卵巢癌、乳腺癌或多发性骨髓瘤。

在一些实施方案中，癌症是恶性间皮瘤或黑素瘤。

癌症的其他非限制性实例是基底细胞癌、胆道癌；骨癌；脑和CNS癌；绒毛膜癌；结缔组织癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；上皮内新生物；喉癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；子宫癌；泌尿系统癌，以及其他癌症和肉瘤。表1列出了可以用本发明的组合物和方法治疗的癌症类型的实例。

表1.癌症类型的实例

如本文所用，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论恶性或良性，以及所有癌前和癌性细胞和组织。例如，具体癌症的特征可以是实体瘤或非实体瘤。实体肿瘤块(如果存在)可能是原发性肿瘤块。原发性肿瘤块是指由于该组织的正常细胞的转化而导致的癌细胞在组织中的生长。在大多数情况下，原发性肿瘤块是通过囊肿的存在来鉴定的，其可以通过视觉或触诊的方法发现，或者通过形状的不规则性，组织的质地或重量来发现。然而，一些原发性肿瘤是不可触知的，并且只能通过医学影像技术(例如X射线(例如，乳房X线照相术))或磁共振成像(MRI)，或通过针吸活检术来检测。这些后者技术的使用在早期检测中更为常见。通常可以使用组织内癌细胞的分子和表型分析来确认癌症是否是组织内源性的，或者病变是否是由于其他部位的转移所致。一些肿瘤是无法切除的(由于例如转移灶的数量或因为它位于手术危险区而不能通过手术切除)。本发明的治疗和预后方法可用于早期、中期或晚期疾病以及急性或慢性疾病。

组合物和治疗

可以使用多种方法将溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法递送给受试者。溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法两者可以通过同一途径施用。或者，溶瘤病毒可以通过一种途径施用，并且诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法可以通过不同途径施用。在优选的实施方案中，溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法均鞘内(i.t.)施用。

溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法可以在一个或多个组合物中施用。药物组合物可以包括各种其他组分。可以用于药物组合物中的可接受的组分或辅助剂的实例包括抗氧化剂、自由基清除剂、肽、生长因子、抗生素、抑菌剂、免疫抑制剂、抗凝剂、缓冲剂、抗炎剂、抗血管生成剂、退热剂、缓释粘合剂、麻醉剂、类固醇和皮质类固醇。此类组分可以提供额外的治疗益处，增强抗癌疗法的治疗作用或起到预防该抗癌疗法的任何潜在副作用。

可以在同一个或独立的制剂中向受试者或受试者的癌细胞中共同施用另外的试剂。此类另外的试剂包括改变给定生物反应的试剂，例如免疫调节剂。另外的试剂可以是例如小分子，多肽(蛋白质、肽或抗体或抗体片段)或核酸(编码多肽或抑制性核酸，例如反义寡核苷酸或干扰RNA)。例如，可以施用蛋白，诸如肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(诸如α-干扰素和β-干扰素)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和组织纤溶酶原激活剂。生物反应调节剂，例如淋巴因子、白介素(例如白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)和白介素-6(IL-6))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生长因子。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物包含一种或更多种抗癌剂，例如细胞毒性剂、化学治疗剂、抗信号传导剂和抗血管生成剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物包括至少一种另外的抗癌剂(例如化学治疗剂)。在本发明方法的一些实施方案中，至少一种另外的抗癌剂与本发明的组合物一起施用。在一些实施方案中，该抗癌剂选自辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)或其他组蛋白脱乙酰酶抑制剂、三氧化二砷、阿霉素或其他蒽环类DNA插入剂，和依托泊苷或其他拓扑异构酶II抑制剂。

在一些实施方案中，组合物可以包括，和所述方法可以包括施用一种或更多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)、自噬抑制剂(例如氯喹)、烷化剂(例如美法仑、环磷酰胺)、MEK抑制剂(例如PD98509)、FAK/PYK2抑制剂(例如PF562271)，或EGFR抑制剂(例如厄洛替尼、吉非替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗)，或前述两种或更多种的组合。

因此，溶瘤病毒或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法，无论是单独施用或作为药物组合物施用，都可以包括各种其他成分作为添加剂。可以在相关情况下使用的可接受组分或辅助剂的实例包括抗氧化剂、自由基清除剂、肽、生长因子、抗生素、抑菌剂、免疫抑制剂、抗凝剂、缓冲剂、抗炎剂、抗血管生成剂、退热剂、缓释粘合剂、麻醉剂、类固醇和皮质类固醇。此类组分可以提供额外的治疗益处，起到影响本发明化合物的治疗作用，或起到防止可能由于施用化合物而引起的任何潜在副作用。免疫治疗剂也可以与治疗剂或其他药剂缀合。

如本文所用，术语“免疫疗法”是指通过刺激、诱导、颠覆(subversion)、模拟、增强、增加或任何其他方式调节受试者的免疫系统来引发或增强针对癌性或其他有害的蛋白质、细胞或组织的适应性或先天免疫力(主动或被动)，从而治疗疾病。免疫疗法(即免疫治疗剂)包括癌症疫苗、免疫调节剂、单克隆抗体(例如人源化单克隆抗体)、免疫刺激剂、树突状细胞和病毒疗法，无论是设计用来治疗现有的癌症或预防癌症的发展，或用于佐剂环境以减少癌症复发的可能性。癌症疫苗的实例包括GVAX、Stimuvax、DCVax和旨在引发对肿瘤和其他抗原(包括MUC1、NY-ESO-1、MAGE、p53等)的免疫响应的其他疫苗。免疫调节剂的实例包括1MT、伊匹单抗、曲美单抗(Tremelimumab)和/或旨在抑制或以其他方式调节针对肿瘤或其他抗原的细胞毒性或其他T细胞活性的任何药物，包括但不限于通过CTLA-4、CD80、CD86、MHC、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、CD28、其他TCR、PD-1、PDL-1、CD80、ICOS及其配体，无论是通过阻滞剂、激动剂或拮抗剂，来调节T-Reg细胞控制途径的治疗。免疫刺激剂的实例包括皮质类固醇和任何其他抗炎剂或促炎剂、甾体或非甾体，包括但不限于GM-CSF、白介素(例如IL-2、IL-7，IL-12)、细胞因子(例如干扰素)等。树突状细胞(DC)疗法的实例包括经修饰的树突状细胞和任何其他自体、异源或异种抗原呈递细胞，无论是被多种抗原、完整癌细胞、单个抗原，通过mRNA、噬菌体展示或任何其他修饰进行的修饰，包括但不限于离体生成的、抗原负载的树突状细胞(DC)以诱导抗原特异性T细胞免疫，离体基因负载的DC以诱导体液免疫，离体生成的抗原负载DC诱导肿瘤特异性免疫，离体产生的不成熟DC以诱导耐受，包括但不限于普列威等。病毒疗法的实例包括溶瘤病毒或源自病毒的遗传或可引发抗肿瘤免疫的其他材料以及与肿瘤发展相关的传染性病毒抑制剂，例如Prophage系列药物。单克隆抗体的实例包括阿仑单抗(Alemtuzumab)、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗、放射免疫疗法、替伊莫单抗、托西莫单抗/碘托西莫单抗方案。免疫疗法可以是单一疗法，或与一种或更多种其他疗法(一种或更多种其他免疫疗法或非免疫疗法)结合使用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指在体外和/或体内抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如，At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)，化学治疗剂，毒素(例如小分子毒素)或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素和抗体，包括其片段和/或变体。

如本文所用，术语“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物，例如紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL,BRISTOL-MYERS SQUIBB Oncology,Princeton,N.J.)和doxetaxel(TAXOTERE,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,法国)，苯丁酸氮芥、长春新碱、长春碱、抗雌激素包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston，GTx，Memphis,TN)和抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林等。抗癌剂的实例，包括可与本发明化合物缀合使用的化学治疗剂在表2中列出。在一个优选的实施方案中，化学治疗剂是一种或更多种蒽环类药物。蒽环类药物是一类化疗药物，其也是抗生素。蒽环类药物通过破坏DNA的结构来阻止细胞分裂并通过以下方式终止其功能：(1)插入DNA小沟的碱基对中；和(2)引起DNA中核糖的自由基损伤。蒽环类药物常用于白血病治疗。蒽环类药物的实例包括柔红霉素(CERUBIDINE)、阿霉素(ADRIAMYCIN,RUBEX)、表柔比星(ELLENCE,PHARMORUBICIN)和伊达比星(IDAMYCIN)。

表2.抗癌药的实例

尽管可以将本发明的溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法作为分离的试剂施用于受试者，但是优选将这些病毒或疗法作为药物组合物的一部分施用。因此，本发明因此进一步提供了包含溶瘤病毒、诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的化合物和至少一种药学上可接受的载体的组合的组合物。药物组合物可适于各种施用途径，例如肠内、肠胃外、静脉内、肌内、局部、皮下等。如本领域普通技术人员可以确定的，施用可以是连续的或以不同的间隔。“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的成分，且包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

可以根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法来配制根据本发明的方法施用的组合物。在许多来源中描述了制剂，其为本领域技术人员众所周知的并且容易获得。例如，Remington’s Pharmaceutical Science(Martin，E.W.，1995，Easton Pennsylvania，Mack Publishing Company，19^th ed.)描述了可用于本发明的制剂。适用于施用的制剂包括，例如，无菌水注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，它们使制剂与预期接受者的血液等渗；水性和非水性无菌悬浮液，可包括悬浮剂和增稠剂。使用前，所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以在仅需要无菌液体载体(例如注射用水)条件的冷冻干燥(冻干)条件下储存。临时的注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应该理解，考虑到所讨论的制剂类型，除了上述特别提及的成分以外，本发明的组合物可以包括本领域常规的其他试剂。

本发明的组合物、溶瘤病毒、诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法以及用于本发明方法的其他试剂，任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂组合，可在一个或更多个解剖部位，例如不需要的细胞生长部位(例如肿瘤部位，例如注射或局部施用于肿瘤)局部施用。本发明的组合物和本发明方法中使用的其他试剂可以全身性施用，例如静脉内或口服，任选地与药学上可接受的载体例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体组合用于口服递送。它们可以装入硬壳或软壳明胶胶囊中，可以压制成片剂，或者可以直接与患者饮食中的食物混合。对于口服治疗性施用，所述试剂可以与一种或更多种赋形剂组合，并以可摄入片剂、颊片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、威化饼(wafer)、喷雾剂等形式使用。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可包含以下物质：粘合剂，例如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；可以加入甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或调味剂，例如薄荷，冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料外，它还可含有液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以作为包衣或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式存在。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆剂或酏剂可以含有活性化合物，作为甜味剂的蔗糖或果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂(例如樱桃或橙色调味剂)。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应是药学上可接受的，并且在使用量上基本上是无毒的。另外，可以将组合物和试剂掺入缓释制剂和装置中。

可以将溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法施用于肿瘤(肿瘤内)或淋巴结，例如受试者的腹股沟淋巴结。溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法也可以通过输注或注射皮内、静脉内或腹膜内施用。

活性剂的溶液可以在水中制备，任选地与无毒的表面活性剂混合。分散剂也可以在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中和在油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。

适用于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散液或无菌粉剂，其适合于临时制备无菌可注射或可输注的溶液或分散液，任选地封装在脂质体中。最终剂型在生产和储存条件下应是无菌的，流动的且稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适的混合物。适当的流动性可以例如通过形成脂质体，在分散液的情况下通过维持所需的粒径或通过使用表面活性剂来维持。任选地，可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物延长吸收。

通过将溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法以所需量掺入适当的溶剂中，并根据需要，将上述各种其他成分掺入，然后过滤灭菌，从而制备无菌注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分粉末加上在先前无菌过滤的溶液中存在的任何其他所需成分。

对于局部施用，组合物和试剂可以以纯形式应用，即当它们是液体时应用。然而，通常期望将它们作为组合物与皮肤病学上可接受的载体组合地局部施用于皮肤，所述载体可以是固体或液体。

有用的固体载体包括细碎的固体，例如滑石粉、粘土、微晶纤维素、二氧化硅，氧化铝等。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇共混物，其中肽可以以有效水平溶解或分散，可选地借助于无毒表面活性剂。可以添加诸如芳香剂的添加剂和其他抗微生物剂，以优化给定用途的性能。所得的液体组合物可以从吸水垫上施用，用于浸渍绷带和其他敷料，或使用例如泵式或气溶胶喷雾器喷雾到患处。

增稠剂，例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯类、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料，也可以与液体载体一起使用，以形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接应用于用户的皮肤。可以用于将肽递送至皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例公开于Jacquet等人(U.S.Patent No.4,608,392)，Geria(U.S.Patent No.4,992,478)，Smith等人(U.S.Patent No.4,559,157)和Woltzman(U.S.Patent No.4,820,508)。

本发明药物组合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和动物模型中的体内活性来确定。在小鼠和其他动物中向人外推有效剂量的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。

相应地，本发明包括药物组合物，其包含溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法，任选地与药学上可接受的载体组合。适用于口服、局部或肠胃外施用的药物组合物，包含溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法，构成本发明的优选实施方案。在本发明的上下文中，施用于患者的剂量，特别是人的剂量应足以在合理的时间范围内在患者体内实现治疗反应，而无致命毒性，并且优选引起不超过可接受水平的副作用或发病率。本领域技术人员将认识到，剂量将取决于多种因素，包括受试者的状况(健康)、受试者的体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗的频率、治疗比率以及作为病理状况的严重程度和阶段。有利地，在一些实施方案中，本发明化合物的施用在受试者中不引起体重减轻或明显的毒性迹象。

合适的剂量导致癌症组织(例如恶性肿瘤)中活性剂的浓度，已知该浓度达到所需的响应。优选的剂量是导致癌细胞生长的最大抑制而没有难以控制的副作用的量。溶瘤病毒和诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC消耗的疗法，以及可选的其他药剂的施用可以是连续的，或是以不同的间隔。

为了提供此类剂量的施用以进行所需的治疗，在一些实施方案中，基于包括载体或稀释剂的总组合物的重量，以本发明的一种或多种试剂的总重量计，本发明的药物组合物可以包含约0.1％至45％之间，尤其是1至15％。说明性地，所施用的活性成分的剂量水平可以是：静脉内，0.01至约20mg/kg；腹膜内，0.01至约100mg/kg；皮下，0.01至约100mg/kg；肌内，0.01至约100mg/kg；口服，0.01至约200mg/kg，优选约1至100mg/kg；鼻内滴注，0.01至约20mg/kg；和气雾剂，0.01至约20mg/kg动物(体)重

定义

为了促进对本文公开主题的理解，下文定义了本文使用的许多术语、缩写或其他速记。未定义的任何术语、缩写或速记应理解为具有与本申请的提交同时期的技术人员所使用的普通含义。

如本文所用，术语“受试者”描述了哺乳动物，包括但不限于人类、猿、黑猩猩、猩猩、猴子、狗、猫、马、猪、绵羊、山羊、小鼠、大鼠和豚鼠。

如本文所用，术语“治疗”或其任何语法变化(例如，治疗(treat)、治疗(treating)和治疗(treatment)等)包括但不限于改善或减轻疾病或状况的症状；减少或延迟状况的复发；降低、压制、抑制、减轻或影响不良生理变化或疾病状况的进程和/或严重程度。例如，治疗包括，例如，预防、抑制或减慢癌症的发展或将良性癌症转变为恶性癌症的速度；减慢癌症的生长和/或扩散；并降低癌症的大小或扩散。

如本文所用，术语“有效量”是指能够治疗或改善癌症或能够以其他方式产生预期的治疗效果的量。在某些实施方案中，有效量能够使肿瘤形成速率或癌症扩散降低5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、90％、95％、99％或100％。在某些实施方案中，有效量能够使肿瘤尺寸或癌症扩散降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。

如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“一种化合物”包括不止一种此类化合物。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括”、“包含”、“具有”或其变体的程度而言，此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式包含在内。过渡术语/短语(及其任何语法变体)“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”可以互换使用。

短语“基本上由...组成”表示权利要求涵盖包含特定材料或步骤的实施方式，以及不实质性影响权利要求的基本和新颖特征的实施方式。

关于具有基因缺失的溶瘤病毒，术语“缺失”是指对基因进行的遗传修饰，包括导致下调或完全抑制基因的开放阅读框(ORF)的转录的任何开放阅读框、上游调控区和下游调控区。缺失可以通过删除整个ORF或一部分ORF来实现，例如，通过引入：移码突变、错义突变、破坏该基因编码的蛋白质活性的序列、终止密码子，或其任意组合。

关于含有异源基因的病毒，术语“异源基因”包括开放阅读框，并且可以进一步任选地包含基因的一个或更多个其他元件，例如上游调节区，下游调节区和/或终止子。

材料和方法

小鼠

根据已批准的程序维持所有小鼠。使用了6-8周大的雌性BALB/c和C57BL/6N小鼠。

细胞培养

从ATCC购买的Vero细胞，和B16F10细胞(作为友好的礼物)维持在完全Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco；补充了10％FBS和抗生素)中。从欧洲细胞培养物保藏中心购买的AB1细胞系维持在完全Roswell Park Memorial Institute-1640培养基(RPMI，Gibco；补充有10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和抗生素)中。将表达荧光素酶的细胞维持在补充了1μg/ml嘌呤霉素(Invitrogen)的完全RPMI中。在补充有50μM 2-巯基乙醇(Sigma)的完全RPMI中培养T细胞和脾细胞。

病毒和体外感染

制备了高度减毒的MVTT病毒，该病毒编码HcRed和HIV-1p24的双重报告基因。制备MVTT病毒原液(stock)，并使用连续稀释的病毒在Vero细胞中通过噬斑形成测定法确定病毒滴度。在24孔板中进行体外感染，每个孔中有2x10⁵AB1间皮瘤细胞。将0.2MOI重组MVTT加入培养基中以允许1小时的附着，然后洗涤细胞并与1ml新鲜培养基温育。感染后24、48和72小时收集培养上清液，并通过连续稀释和在Vero细胞中噬斑形成测定法来测量病毒滴度。使用抗HMGB1抗体(Abcam，ab79823)通过蛋白质印迹检查释放的HMGB1。根据制造商的说明，通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)确定上清液中释放的ATP和细胞活力。通过感染细胞与未感染细胞之间的发光比例计算相对细胞活力。还分离细胞并与抗CRT抗体(Abcam，ab92516)一起孵育以进行表面标记和流式细胞术分析。还通过蛋白质印迹法测定了细胞裂解物中的CRT表达。感染后48小时收集用于抗原呈递分析的AB1-MVTT病毒上清液。通过离心除去细胞碎片，使其通过0.2μm的低蛋白结合膜(Millipore)，并在60℃下热灭活1小时。通过在Vero细胞中的噬菌斑形成测定法证实了活病毒的成功消除。

肿瘤模型和肿瘤内处理

收获间皮瘤AB1细胞或黑素瘤B16F10细胞，并经皮下注射5×10⁵细胞在100μl PBS中的单细胞悬液分别至BALB/c或C57BL/6N小鼠的右后侧。用卡尺测量肿瘤体积并用公式计算：肿瘤体积＝1/2(长×宽²)。如前所述，还通过使用IVIS光谱(PerkinElmer)的生物发光成像来测量表达荧光素酶的肿瘤，并使用Living Image软件(4.0版，PerkinElmer)将信号强度表示为感兴趣区域(ROI)中的光子/s/cm²/sr。在肿瘤接种后7天开始对已建立的肿瘤进行肿瘤内处理。向肿瘤注射100μl重组MVTT、抗Ly6G抗体(克隆1A8，BioXCell)或两者的组合。1A8以每剂100μg施用，和大鼠IgG2a(克隆2A3，BioXcell)单独注射或与重组MVTT组合注射作为同种型对照。排斥肿瘤的小鼠通过在他们相反的侧面皮下注射，利用2×10⁶个肿瘤细胞再次攻击。当肿瘤长度超过15mm时，对所有动物实施安乐死。

离体细胞制备

如前所述分离脾细胞。将肿瘤切成小块，并在37℃下用1mg/ml胶原酶IV(Sigma)和0.5U/ml Dnase I(Roche)消化1.5小时。将细胞通过70μm过滤器，然后进行40％/80％Percoll梯度分析(Sigma)。800g离心20分钟后，回收了间期的白细胞。从胫骨和股骨中冲洗出骨髓白细胞。然后将细胞通过70μm过滤器，并使用红细胞裂解缓冲液(BD Biosciences)去除红细胞。

T细胞与MDSC的分离

脾细胞的单细胞悬液用于细胞分离。使用Dynabeads Untouched T Cell Kits(Thermo Scientific)分离CD3⁺ T细胞。使用T细胞分离试剂盒(Miltenyi)分离CD4⁺和CD8⁺T细胞。根据制造商的说明，使用MDSC分离试剂盒(Miltenyi)分离总的MDSC或MDSC亚群。

过继MDSC转移

经纯化的MDSC用CFSE(Thermo Scientific)标记。通过尾静脉向AB1荷瘤小鼠静脉内注射4×10⁶个MDSC。转移后24小时检测标记的MDSC。

体内细胞消耗

从治疗前1天开始，通过每5天腹膜内分别注射250μg抗CD4(YTS191.1，BioXcell)或抗CD8(YTS169.4，BioXcell)，从而在治疗过程中消耗CD4⁺和CD8⁺ T细胞。通过外周血单核细胞(PBMC)的流式细胞术分析确认成功的T细胞消耗。还从BioXcell购买了抗Ly6G(克隆1A8)和相应的同种型(克隆2A3)。

测量细胞因子和趋化因子的产生

培养上清中的细胞因子浓度通过LEGENDplex T Helper Cytokine Panel(BioLegend)测量。将肿瘤切成小块，并在补充有Protease Inhibitor Cocktail(Roche)的T-PER Tissue Protein Extraction Reagent(Thermo Scientific)中匀浆。趋化因子浓度通过LEGENDplex Proinflammatory Chemokine Panel(BioLegend)确定，并针对BCA蛋白测定法(Thermo Scientific)确定的总蛋白进行标准化。BMDC培养，体外抗原呈递和抑制测定

按照标准方案，在40ng/ml GM-CSF和IL-4存在下，将分离的骨髓细胞以3×10⁶个细胞/孔接种在6孔板中。每两天更换一半的分化培养基。在第9天，通过重复移液将松散粘附的细胞重悬，并与上清液中的非粘附细胞一起收集，用于流式细胞术分析，并对抗CD3,抗CD11c和抗MHC II进行表面染色，从而产生>90％的CD11c⁺MHC II⁺BMDC。对于BMDCs-T细胞共培养，将BMDC合并，并在100μl灭活的AB1-MVTT病毒上清液或培养基存在下，以每孔2×10⁴个细胞接种到96孔V型底板中。在一些培养物中，以100ng/ml的量加入anti-CRT抗体(Abcam，ab92516)或兔IgG。孵育过夜后，将BMDC用培养基彻底洗涤，并以1：1的比例添加CFSE标记的CD3⁺ T细胞，再培养10天，每4天更换一半培养基。在第7天收集的培养上清液和在第10天收集的细胞分别进行细胞因子分泌和T细胞增殖的分析。对于BMDC-MDSC共培养，将BMDC以每孔5×10⁴个细胞接种在96孔U型底板中，在纯化的PMN-MDSC或M-MDSC存在下，用100ng/ml LPS(Sigma)或100μl灭活的AB1-MVTT病毒上清液刺激。为了通过流式细胞术清楚地区分BMDC与MDSC，在与BMDC孵育之前，将纯化的MDSC亚群用CFSE标记。LPS刺激后48小时，通过流式细胞术评估BMDC成熟。当用AB1-MVTT病毒上清液刺激细胞时，在第4天用新鲜培养基替换一半的培养基，并在第7天收集上清液以评估细胞因子的分泌。

IL-10受体阻断试验

将BMDC以每孔5×10⁴个细胞接种到96孔U型底板中，并与5μg/ml抗小鼠CD210(IL-10R，克隆1B1.3a，BioLegend)抗体在37℃进行孵育30分钟。然后在培养箱中用100ng/mlLPS刺激48小时后，将1×10⁵CFSE标记的PMN-MDSC或M-MDSC与BMDC以2：1的比例添加到培养基中。将培养物的体积保持在每孔100μl，将大鼠IgG1(eBioscience)用作同种型对照。

流式细胞术

如前所述进行细胞表面和细胞内免疫染色。从eBioscience购买了以下抗体：抗CD11b(克隆M1/70)、抗Ly6C(克隆HK1.4)、抗Ly6G(克隆1A8-Ly6g)、抗CD3(克隆17A2)、抗CD4(克隆GK1.5)、抗CD8(克隆53-6.7)、抗PD1(克隆J43)、抗Tim3(克隆RMT3-23)、抗CD11c(克隆N418)、抗MHC II(克隆M5/114.15.2)、抗CD80(克隆16-10A1)，和抗CD49b(克隆DX5)。以下抗体购自BioLegend：抗CD25(克隆3C7)、抗Foxp3(克隆150D)、抗CXCR2(克隆SA045E1)，和抗CXCR3(克隆CXCR3-173)。抗CCR2(克隆REA538)抗体购自Miltenyi。样品在BD FACSAria II细胞分选仪(BD Biosciences)上运行，并使用FlowJo(Tree Star，v10)进行分析。

ELISpot和T细胞细胞毒性测定

通过ELISpot测定法评估分离的脾细胞中产生IFN-γ的T细胞。GL Biochem(上海)合成了gp70-AH1(SPSYVYHQF)、OVA257-264(SIINFEKL)、GP100(EGPRNQDWL)、TRP2(SVYDFFVWL)和TWIST1肽(15聚体，跨整个氨基酸序列，有11个氨基酸重叠)。如前所述，使用LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit(Thermo Scientific)确定纯化的T细胞对AB1细胞的细胞毒性作用。

统计分析

所有数据均以平均值±标准误差表示。通过两尾学生t检验确定显著性，p值<0.05被认为具有统计学意义。将所有动物的存活率绘制在Kaplan-Meier存活曲线上，并进行log-rank检验以分析在GraphPad Prism 5软件中的差异。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，包括所有附图和表格，均通过引用其整体并入本文，只要它们不与本说明书的明确教导相抵触即可。

以下是说明实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制性的。除非另有说明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。

实施例1–MVTT对间皮瘤细胞的溶瘤作用触发了CRT的暴露以及HMGB1和ATP的释放

为了确定MVTT的溶瘤作用，产生了重组MVTT(rMVTT)，以同时表达两个检测标记物，HIV-1p24和远红荧光突变体HcRed(图1A)。两个标记物的表达有助于检测病毒复制以及编码的基因表达。MVTT具有广泛的哺乳动物细胞感染范围。AB1间皮瘤细胞易受rMVTT感染，显示红色荧光合胞体的存在(图1B)和病毒编码的p24蛋白的表达(图1C)。HcRed信号的增加以及随时间释放的游离病毒表明rMVTT病毒可以感染AB1细胞并在其中复制(图1D-1E)。随后确定了rMVTT的溶瘤能力，表明病毒感染显著降低了AB1细胞活力(图2A)。钙网蛋白(CRT)是一种DAMP，通常位于内质网腔内，在诱导免疫原性细胞凋亡后将其转移到垂死的细胞表面，在该处它充当专业吞噬细胞的“即食(eat-me)”信号。因此，通过流式细胞术分析确定了MVTT感染后AB1细胞中CRT蛋白的表达。当使用0.2MOI rMVTT进行感染时，在24小时后，不到5％的AB1细胞在其表面暴露出CRT。但是，由于病毒主动复制，感染后48和72小时，该百分比分别增加到70％和90％(图2B，左图)。重要的是，所有CRT阳性细胞均显示HcRed表达，表明rMVTT感染是CRT蛋白暴露的原因(图2B，右图)。此外，蛋白质印迹分析还表明，rMVTT感染导致AB1细胞中CRT蛋白上调的表达(图2C)。除CRT蛋白外，其他DAMP(如高迁移率族盒1(HMGB1)和ATP)从垂死细胞中的释放可能会激活抗原呈递细胞(APC)，以增强抗肿瘤免疫性。因此，测量了CRT和HMGB1蛋白的表达，以测试溶瘤作用可能导致免疫原性细胞死亡的可能性。HMGB1蛋白很容易在rMVTT感染后72小时的培养上清液中检测到，但在未感染的AB1细胞对照中则未检测到(图2D)。此外，rMVTT感染后，随着时间的推移，上清液中释放的ATP也显著增加(图2E)。因此，rMVTT对AB1间皮瘤细胞的溶瘤作用诱导了CRT的上调表达和暴露以及从垂死细胞中释放的ATP和HMGB1，这被公认为是激发适应性抗肿瘤免疫应答的免疫原性细胞死亡的三个主要标志。

实施例2–rMVTT处理以剂量依赖性消除了已建立的AB1肿瘤，但未能提高抗肿瘤T细胞的免疫力

为了研究rMVTT在Balb/c小鼠中已建立的AB1间皮瘤的治疗能力，探索i.t.病毒注射作为确定其直接抗肿瘤功效的手段。在小鼠接受不同剂量(分为高、中、低剂量组)的rMVTT处理之前第7天接种了AB1间皮瘤细胞(图3A)。在接受rMVTT处理的所有小鼠中，AB1间皮瘤的生长均受到显著抑制(图3B)。此外，对个别小鼠肿瘤生长的观察表明，高剂量病毒处理完全消除了肿瘤生长(图3C)，导致100％存活(图3D)，而中剂量和低剂量组分别显示出降低的抗肿瘤功效，仅37.5％的小鼠和50％的小鼠保持无肿瘤状态(图3B-3D)，表明rMVTT处理以剂量依赖的方式消除了已建立的AB1间皮瘤。rMVTT的溶瘤作用可以创建免疫刺激环境，以诱导针对AB1肿瘤抗原的免疫反应。因此，通过免疫学方法测试了两种肿瘤抗原，即免疫显性AH1(gp70_423–431)和扭曲相关蛋白1(TWIST1)肽。肽gp70-AH1是源自内源性鼠白血病病毒糖蛋白70(gp70)的特征明确的免疫优势CTL表位。转录因子TWIST1的表达对于肿瘤的转移过程及其对药物治疗的抵抗力至关重要。由于在AB1细胞中同时检测到gp70-AH1和TWIST1，因此可以通过ELIspot探索抗肿瘤T细胞应答的存在，并比较荷瘤小鼠和无瘤小鼠之间的差异。仅一只经处理且无肿瘤的小鼠的脾细胞显示出AH1特异性ELIspot反应(图3E)和针对AB1细胞的细胞毒性作用(图3F)。在荷瘤小鼠和无瘤小鼠之间诱导抗肿瘤T细胞反应没有统计学意义(图3E-3F)。因此，尽管rMVTT处理剂量依赖性地消除了已建立的AB1间皮瘤，但是肿瘤的溶瘤作用不容易诱导抗肿瘤T细胞免疫。

实施例3–rMVTT处理导致TME中PMN-MDSC的积累

由于溶瘤作用后适应性抗肿瘤免疫的启动主要发生在肿瘤内部，因此对rMVTT处理后的TME进行了检查。在肿瘤内rMVTT处理后的两个时间点(第2天和第4天)，测量了不同的肿瘤驻留免疫细胞，包括CD3⁺ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CD4⁺ Treg(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)和MDSC亚群(PMN-MDSC，CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^low/int；M-MDSC，CD11b⁺Ly6G^-Ly6C^hi)的比例，以及在CD3⁺ T细胞上的耗竭表面标记物PD-1和Tim-3的表达。MDSC和Treg是抑癌微环境的主要成分。rMVTT处理后，在脾脏中发现的MDSC的总体水平似乎随时间下降，而肿瘤浸润的MDSC的频率保持在相似的水平(图4A)。然后检查了MDSC的两个主要亚群，即PMN-MDSC和M-MDSC，因为这两个亚群在形态学和抑制特性方面表现出显著差异。尽管PMN-MDSC在周围淋巴器官中大量扩增，但M-MDSC优先积累在肿瘤内部(图4B)。此外，rMVTT处理不影响脾脏或肿瘤中M-MDSC的频率，但在rMVTT处理过程中，脾脏中PMN-MDSC显著减少，而肿瘤中PMN-MDSC显著增加(图4B-4C)。一致地，响应rMVTT处理，肿瘤中绝对PMN-MDSC细胞数也显著增加(图4D)。对于比较，尽管rMVTT处理降低了脾脏中CD4⁺ Treg细胞的频率，但在肿瘤中其频率或细胞数量没有发现显著差异(图4E)。有趣的是，与早在rMVTT处理后的第2天PMN-MDSC在肿瘤中的显著积累。相反，NK细胞的频率和细胞数量显著减少(图4F)，这暗示了这两种细胞类型之间可能的反作用。病毒感染诱导的炎症反应可能会增加淋巴细胞向肿瘤的浸润。实际上，在rMVTT处理后第4天观察到肿瘤内CD3⁺ T细胞的浸润显著增加(图10D)。然而，增加的T细胞浸润伴随衰竭标志物PD-1和Tim-3的显著升高的表达(图10E)。因此，rMVTT处理改变了一组免疫细胞的局部和系统分布，特别是导致PMN-MDSC在TME中显著积累。

实施例4–肿瘤内rMVTT治疗后PMN-MDSC运输至肿瘤部位

为了了解PMN-MDSC如何被募集到肿瘤中，测定了rMVTT处理诱导的趋化因子的作用。趋化因子受体的流式细胞术分析表明，CXCR2仅在PMN-MDSC上表达，而在M-MDSC上不表达。相反，在M-MDSC上发现了高水平的CCR2表达，而在PMN-MDSC上却没有(图5A)。在rMVTT处理后测量各种趋化因子的水平。最早在处理后2天，一组C-X-C趋化因子(包括CXCL5、CXCL9和CXCL13)在肿瘤中显著上调(图5B)，而仅在4天时观察到上调的C-C趋化因子的产生(图5C)。这些结果表明，表达CXCR2的PMN-MDSC可能迁移并粘附在肿瘤床上，这主要是对增加的C-X-C趋化因子的响应。为了支持这一观点，将源自荷间皮瘤小鼠的CFSE标记的MDSC继代转移到带有相同肿瘤但在转移后使用rMVTT或PBS处理的受体小鼠中。在rMVTT处理后24小时，通过流式细胞术对CFSE标记的MDSC在脾脏和肿瘤中进行定量。与PBS处理的接受者相比，在rMVTT处理的接受者的肿瘤中观察到CFSE⁺ MDSC的百分比和绝对数目均显著增加(图5D)。通过Ly6G的表达，将肿瘤中迁移的PMN-MDSC与M-MDSC区别开(图5E)。此外，在rMVTT处理的受体中，脾脏显示略有下降的PMN-/M-MDSC比例，而其肿瘤的PMN-/M-MDSC比例和PMN-MDSC的绝对数量却显著升高(图5F)。因此，响应于由rMVTT处理诱导的趋化性，PMN-MDSC优先从外周淋巴系统迁移到TME。

实施例5–rMVTT处理后破坏PMN-MDSC的肿瘤运输

为了防止MDSC迁移到肿瘤中，测试了MDSC消耗抗体抗Ly6G单克隆抗体1A8的功效。由于通常使用1A8来消耗Ly6G⁺ MDSC，因此通过i.t.途径用1A8或同种型对照处理AB1荷瘤小鼠。与同种型对照相比，经1A8处理的小鼠脾脏MDSC的频率显著降低，但该抗体并未显示出减少肿瘤中总MDSC积累的功效。然而，正如预期的那样，注射后第2天，1A8选择性地减少了脾脏和肿瘤中的Ly6G⁺ PMN-MDSC(图6A)。尽管在第4天在肿瘤中保持了这种作用，但脾脏PMN-MDSC开始重新出现(图6A-6B)。与PMN-MDSC不同，肿瘤中M-MDSC的频率不受1A8的影响，因为观察到脾脏M-MDSC的显著增加(图6A-6B)，这可能是由于从骨髓中连续产生M-MDSC所致。随后，研究了1A8结合rMVTT的影响。rMVTT处理导致肿瘤中PMN-MDSC的扩增群体。然而，在第2天，这种扩增群体几乎被1A8抗体清除(图6C)。尽管脾脏PMN-MDSC的频率显著升高，但1A8在第4天仍继续防止PMN-MDSC的肿瘤运输(图6D)。因此，抗-Ly6G 1A8的施用可以特异性地破坏MVTT诱导的PMN-MDSC的肿瘤运输。

实施例6-基于MVTT的溶瘤作用和PMN-MDSC消耗的组合恢复了抗肿瘤T细胞免疫

考虑到MDSC是抑制抗肿瘤T细胞反应的主要免疫抑制细胞类型之一，检测了防止MVTT诱导的PMN-MDSC的肿瘤运输是否会增强溶瘤病毒处理的疗效。在与上述类似的环境中，向带有7天AB1肿瘤的Balb/c小鼠同时注射rMVTT加上1A8或同种型对照。为了改进抗肿瘤效果，两天后进行了额外的联合处理(图7A)。一次联合处理减慢了肿瘤的生长并导致了1/7小鼠的肿瘤消退，而仅通过1A8消耗PMN-MDSC并不会影响肿瘤的生长(图7B-7C)。至关重要的是，第二次联合处理有效地控制了肿瘤的生长，并最终导致已建立的AB1间皮瘤的完全消除(图7B-7C)。为了确定在这些控制者小鼠中是否产生了延长的抗肿瘤T细胞免疫，在完全肿瘤排斥后40天在它们的对侧用更高剂量(2×10⁶个细胞)的稳定表达萤火虫荧光素酶的AB1细胞(AB1-Luc)再次攻击它们(图7A)。11天后，在这些控制者小鼠中观察到AB1-Luc肿瘤的完全排斥，导致无肿瘤存活＞30周，而所有对照小鼠均形成了肿瘤(图7D-7E)。

因此，PMN-MDSC的消耗能够通过诱导延长的抗肿瘤免疫力而大大改善rMVTT处理的效果。为了测试这一点，测量了肿瘤特异性T细胞应答。收获小鼠脾细胞并针对肿瘤抗原gp70-AH1或TWIST1肽进行测试。在用rMVTT+1A8组合处理的小鼠中，引起了显著增加的针对gp70-AH1和TWIST1的T细胞应答(图7F)。与对照组相比，体外CTL测定还证明了在这些小鼠中增强的CD8⁺细胞毒性T细胞(图7G)。此外，在AB1荷瘤小鼠接受rMVTT+1A8联合处理之前，使用单克隆抗体消耗CD4⁺或CD8⁺ T细胞(图7H)。值得注意的是，CD8⁺ T细胞(YTS169.4)的消耗完全降低了联合处理的抗肿瘤活性，导致肿瘤迅速长大，所有小鼠在21天内死亡。相比之下，CD4⁺ T细胞(YTS191.1)的消耗仍然保留了治疗效果，并导致3/5小鼠的肿瘤消退(图7I-7K)。因此，由rMVTT+1A8组合诱导的CD8⁺ T细胞对于这种基于MVTT的免疫溶瘤方法至关重要。此外，局部rMVTT处理期间PMN-MDSC的消除可以恢复有效的系统性抗肿瘤T细胞免疫。

实施例7–PMN-MDSC通过限制树突状细胞的活化组织诱导抗肿瘤T细胞免疫

如上所述，MVTT诱导的肿瘤溶瘤建立了具有CRT、HMGB1和ATP产生的免疫激活环境。然而树突状细胞(DC)无法识别并整合这些信号以驱动T细胞活化。在MVTT诱导的肿瘤溶瘤过程中，PMN-MDSC的存在可能抑制DC功能。为了测试这一点，确定了PMN-MDSC对DC的直接影响。确定了骨髓来源的DC(BMDC)在加工和呈递抗原的能力，以激活源自接受了MVTT+1A8联合处理的控制小鼠的CD3⁺ T细胞。MVTT感染的AB1细胞上清液作为肿瘤抗原库的来源用于致敏BMDC。与控制者小鼠而非未经免疫的小鼠的CD3⁺ T细胞共培养时，抗原加载的BMDC大大提高了TNF-α和IFN-γ的产生(图8A)，表明响应肿瘤抗原的T细胞活化。同时，还测试了表面暴露的CRT蛋白是否会伴随(chaperone)多种肿瘤抗原以促进DC摄取。实际上，抗CR致敏T抗体对该过程的抑制作用显著降低了TNF-α和IFN-γ的产生(图8A)。为了确认，测量了T细胞增殖。抗原致敏的BMDC可以有效诱导CD4⁺和CD8⁺ T细胞增殖(图8B)，从而证明了肿瘤抗原特异性T细胞的活化。再次，抗CRT抗体的存在可以抑制T细胞增殖(图8B)，表明CRT在激活DC-T细胞轴中的作用。因此，在没有免疫抑制环境的情况下，rMVTT对肿瘤细胞的溶瘤作用可有效诱导BMDC的激活和抗原呈递。

随后，使用单独的培养基或LPS作为成熟信号来测量AB1诱导的MDSC和BMDC之间的直接相互作用。如预期的那样，LPS本身显著增加了BMDC上CD80表达的水平(P<0.0001，Medvs.LPS)(图8C)。值得注意的是，当共培养物中存在MDSC时，只有PMN-MDSC会显著抑制未经刺激的和LPS刺激的BMDC上CD80的表达，而M-MDSC则没有(图8C)。在更相关的模型中测试了是否可以观察到来自PMN-MDSC的类似抑制作用，在该模型中，用MVTT感染的AB1细胞上清而不是LPS致敏BMDC。测量共培养物中的细胞因子分泌作为BMDC活化的探针。与M-MDSC和BMDC共培养相比，BMDC对PMN-MDSC介导的抑制作用更敏感，IL-6和TNF-α的产生减少。免疫抑制性细胞因子IL-10具有阻断DC成熟过程并限制DC引发Th1响应的能力是众所周知的。实际上，只有PMN-MDSC表现出产生IL-10的亚群(图8D)，并在培养物中释放出相对较高的IL-10。因此，PMN-MDSC可以直接抑制由肿瘤溶瘤作用诱导的DC活化。因此，去除PMN-MDSC可以挽救DC的功能，从而引发过继的抗肿瘤免疫。

此外，在不同的同基因C57BL/6黑素瘤模型中也证实了联合疗法的有效性，在该模型中观察到增强的B16F10肿瘤消退，延长的生存期和抗肿瘤T细胞响应(图9A-C)，进一步证明了基于MVTT的免疫溶瘤方法的效力。

实施例8–MVTT处理将PMN-MDSC募集到TME中

由于溶瘤作用后适应性抗肿瘤免疫的启动主要发生在肿瘤内部，因此在rMVTT处理后检测了TME。注射rMVTT的AB1间皮瘤的分析表明，在肿瘤内注射后2天很容易检测到病毒编码的HcRed的表达，此后迅速下降(图10A)。一致地，痘苗病毒蛋白的免疫组织化学染色仅在rMVTT处理后2天而不是4天在肿瘤组织中发现，在感染区域内和附近具有可见的坏死区域(图10B)。这些结果证明了rMVTT在TME中快速但有限的复制。然后测量了不同的肿瘤驻留免疫细胞，包括CD3⁺ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CD4⁺ Tregs(CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺)和MDSC亚群(PMN-MDSC、CD11b⁺ Ly6G⁺ Ly6C^low/int；M-MDSC，CD11b⁺Ly6G-Ly6C^hi)的比例以及通过流式细胞术在CD3⁺ T细胞上衰竭表面标志物PD-1和Tim-3的表达(图10C)。在rMVTT处理过程中，脾脏中MDSC的总体水平似乎下降，而肿瘤浸润性MDSC的频率保持在相似的水平(图4A)。对MDSC的两个主要亚群PMN-MDSC和M-MDSC进行了检查，因为它们在形态和抑制活性方面显著不同。PMN-MDSC在周围淋巴器官中大量扩增，而M-MDSC优先积累在未经处理的对照小鼠的肿瘤内(图4B)。此外，rMVTT处理不影响在脾脏或肿瘤中的M-MDSC的频率。然而，PMN-MDSC在脾脏中显著减少，而在TME中显著增加(图4B和4C)。rMVTT处理后，肿瘤中PMN-MDSC的绝对细胞数也显著增加(图4D)。对于比较，尽管rMVTT处理降低了脾脏中CD4⁺ Treg的频率，但在肿瘤中它们的频率或细胞数量没有发现显著差异(图4E)。与早在rMVTT处理后的第2天PMN-MDSC在肿瘤中的显著积累相反，NK细胞的频率和细胞数量显著降低(图4F)，暗示着这两种细胞类型之间可能存在反作用。感染诱导的炎症反应已显示可增加淋巴细胞向TME的浸润。实际上，在rMVTT处理后第4天在肿瘤内观察到CD3⁺ T细胞显著增加(图10D)。然而，增加的T细胞浸润与衰竭标志物PD-1和Tim-3的显著升高的表达结合(图10E)。总体而言，rMVTT处理改变了免疫细胞的局部和系统分布，特别是改变了TME中PMN-MDSC的积累。

实施例9–通过MVTT诱导的趋化性将PMN-MDSC运输到TME中

为了测定在rMVTT处理后PMN-MDSC是否可以优先募集到TME中，测定了在rMVTT处理的肿瘤中两个MDSC亚群上趋化因子受体的表达和趋化因子的水平。流式细胞术分析趋化因子受体表达显示CXCR2仅在PMN-MDSC上表达，而在M-MDSC上不表达。相反，在M-MDSC上发现了高水平的CCR2表达，而在PMN-MDSC上却没有(图5A)。然后在rMVTT处理后，在肿瘤匀浆中测量各种趋化因子的水平。最早在处理后2天，一组C-X-C趋化因子(包括CXCL5、CXCL9和CXCL13)在AB1间皮瘤中显著上调(图5B)，而仅在处理后4天观察到C-C趋化因子产生上调(图5C)。因此，表达CXCR2的PMN-MDSC可能会迁移并粘附在肿瘤床上，这主要是对TME中迅速增加的C-X-C趋化因子的响应。为了检验该假设，将衍生自荷间皮瘤的小鼠的CFSE标记的MDSC过继转移到也带有间皮瘤肿瘤的受体小鼠中，但在MDSC转移后用rMVTT或PBS处理。然后在rMVTT处理后24小时通过流式细胞术对脾脏和间皮瘤中CFSE标记的MDSC进行定量(图11)。与PBS处理的接受者相比，在rMVTT处理的接受者的肿瘤中观察到CFSE⁺ MDSC的百分比和绝对数量均显著增加(图5D)。通过Ly6G的表达，将肿瘤中迁移的PMN-MDSC与M-MDSC区别开来(图5E)。在rMVTT处理的受体中，脾脏显示略有降低的PMN-/M-MDSC比例，而它们的肿瘤表现出显著升高的PMN-/M-MDSC比例和PMN-MDSC的绝对数量(图5E和5F)。总体而言，PMN-MDSC响应于rMVTT处理诱导的趋化性，优先从外周淋巴系统迁移到TME。

实施例10–抗体和肽体对MDSC亚群的优先消耗

为了研究MDSC在rMVTT处理中的作用，在我们的间皮瘤模型中探索了两种MDSC消耗剂，抗Ly6G单克隆抗体1A8和特定的消耗肽体H6-pep。1A8通常用于消耗Ly6G⁺细胞，主要是PMN-MDSC，而H6-pep和G3-pep是两种对PMN-MDSC和M-MDSC具有结合特异性的肽体。因此，使用表达质粒通过瞬时表达系统在293F细胞中制备了这两种肽抗体(图12A)。H6-pep对源自AB1荷间皮瘤的小鼠的总MDSC显示出比G3-pep更高的结合亲和力(图12B和12C)。因此，在消除实验中使用了H6-pep。当荷瘤小鼠经瘤内注射1A8或H6-pep处理后，只有1A8处理的小鼠脾脏MDSC的频率显著降低，而1A8和H6-pep似乎都没有降低肿瘤中的总MDSC积累(图12D)。但是，在注射后第2天1A8选择性地减少了脾脏和肿瘤中的Ly6G⁺ PMN-MDSC(图6A和6B)。尽管该作用在第4天在肿瘤中得以维持，但脾脏而不是TME PMN-MDSC重新出现。与PMN-MDSC不同，肿瘤M-MDSC不受1A8的影响，而与同种型对照相比，观察到脾脏M-MDSC却明显增加，可能是由于从骨髓中连续产生MDSC。相反，由于H6-pep对M-MDSC具有更高的结合亲和力，H6-pep处理显著地消耗了M-MDSC，而PMN-MDSC则没有，特别是在TME中；这种效果一直持续到第4天(图12E和12F)。M-MDSC消耗后，观察到脾PMN-MDSC的频率明显代偿性增加。

然后研究了rMVTT处理期间1A8和H6-pep的功效。rMVTT处理导致肿瘤中PMN-MDSC的募集增加(图6A和6C)。然而，在第2天该增加的群体通过1A8抗体处理几乎被清除(图6C和6D)。在第4天1A8也阻止了PMN-MDSC的肿瘤募集，尽管脾脏PMN-MDSC的频率显著升高。相比之下，H6-pep处理降低脾脏和肿瘤两者中的M-MDSC，同时增加PMN-MDSC(图12G和12H)。因此，分别施用1A8和H6-pep优先消耗PMN-MDSC和M-MDSC，甚至在rMVTT施用后仍能维持其消耗效果，这允许我们研究基于MVTT的溶瘤病毒疗法期间PMN-MDSC和M-MDSC对诱导抗肿瘤免疫的影响。

实施例11–PMN-MDSC的消耗通过诱导抗肿瘤T细胞免疫增强了MVTT治疗功效

考虑到MDSC是抑制抗肿瘤T细胞响应的主要免疫抑制细胞之一，因此探讨了PMN-MDSC的消耗是否增强了基于MVTT的溶瘤病毒疗法的疗效。在与上述类似的情况下，对荷7天的野生型AB1间皮瘤的BALB/c小鼠分别同时注射低剂量rMVTT(1×10⁷PFU)和100μg 1A8或H6-pep的组合，用于PMN-MDSC和M-MDSC的特异性消耗(图13A)。低剂量rMVTT的单次递送不能控制肿瘤的生长。然而，在这种情况下并入MDSC消耗并不能减慢肿瘤进展或延长生存期(图13B和13C)。考虑到rMVTT处理的已知剂量依赖性作用，在2天后通过额外的低剂量补充抗肿瘤作用(图7A)。单独的两次rMVTT处理减慢了肿瘤的生长并导致了1/7小鼠的肿瘤消退，而单独的1A8根本不影响肿瘤的生长(图7B和7C)。然而，引人注目的是，第二次低剂量rMVTT和1A8联合处理有效控制了肿瘤的生长，并最终导致已建立的AB1间皮瘤彻底消除(图7B和7C)。相比之下，联合rMVTT和H6-pep处理在间皮瘤消除方面未显示出明显的抗肿瘤活性或协同作用(图13D和13E)。为了确定在这些控制者小鼠中是否产生了延长的抗肿瘤T细胞免疫，在完全肿瘤排斥后40天，在它们的对侧用更高剂量(2×10⁶个细胞)的AB1-Luc细胞攻击这些小鼠(图7A)。11天后在这些控制者小鼠中观察到AB1-Luc间皮瘤的完全排斥，导致无肿瘤存活>30周，而来自对照组的所有小鼠都形成了肿瘤(图7D和7E)。这些结果表明，PMN-MDSC的去除而不是M-MDSC能够显著改善rMVTT的处理效果，这可能是通过诱导延长抗肿瘤免疫来实现的。

为了进一步检验该假设，测量了肿瘤反应性T细胞应答。收获鼠脾细胞并针对gp70-AH1或TWIST1肽进行测试(图7A)。在用低剂量rMVTT和1A8组合处理两次的小鼠中，针对gp70-AH1和TWIST1的T细胞应答显著增加(图7F)。用双重rMVTT和H6-pep组合消耗M-MDSC并未发现这种增强(图13F)。此外，与其他组相比，体外细胞毒性试验证明控制者小鼠中增强的CD8⁺CTL(图7G)。此外，在AB1荷瘤小鼠接受rMVTT和1A8联合治疗之前，分别使用单克隆抗体YTS191.1和YTS169.4消耗了CD4⁺或CD8⁺ T细胞(图7H)。值得注意的是，YTS169.4消耗CD8⁺ T细胞会完全降低联合疗法的抗肿瘤活性，导致不受控制的肿瘤生长，所有小鼠均在21天内死亡。相反，YTS191.1消耗CD4+ T细胞保留了部分治疗效果，并在3/5小鼠中导致了肿瘤消退(图7I-7K)。为了确定该发现是否可以应用于其他恶性肿瘤，在不同的同基因C57BL/6黑色素瘤模型中测试了rMVTT和1A8联合治疗的疗效。类似地，这种联合疗法导致增强的B16F10肿瘤消退，延长的生存期和增强的抗肿瘤T细胞响应(图13G-13I)。总的来说，在基于局部的MVTT溶瘤病毒治疗过程中PMN-MDSC的去除引发了强大的全身性和持久性抗肿瘤T细胞免疫。

实施例12–PMN-MDSC通过限制树突状细胞的活化阻止诱导抗肿瘤T细胞免疫

尽管rMVTT诱导的溶瘤作用建立了具有CRT、HMGB1和ATP产生的免疫激活环境，但抗间皮瘤特异性T细胞应答却不容易被诱导(图3E和3F)。然而，当在rMVTT处理期间消耗PMN-MDSC时，这种情况完全改变(图7F和7G)。因此，PMN-MDSC可能通过我们的模型的TME中的直接串扰对DC具有抑制作用。为了测试这种可能性，检测了PMN-MDSC对DC的直接影响。首先，测试了骨髓来源的DC(BMDC)加工和呈递激活CD3⁺ T细胞的抗原的能力，该CD3⁺ T细胞源自接受了rMVTT和1A8联合处理的控制者小鼠。rMVTT处理的AB1细胞上清液被用作致敏BMDC的肿瘤抗原供应。当BMDC用抗原致敏时，观察到在共培养物中促炎细胞因子IL-6的产生显著增加(图14A)。同时，与控制者小鼠而非未经免疫的小鼠的CD3⁺ T细胞共培养时，抗原加载的BMDC大大提高了TNF-α和IFN-γ(图8A)以及Th17细胞因子IL-17A和IL-22(图14A)的产生，提示响应肿瘤抗原的T细胞活化。先前已经显示了表面暴露的CRT蛋白伴随肿瘤抗原，以促进DC对其摄取。实际上，抗CRT抗体显著降低了TNF-α和IFN-γ的产生(图8A)。为了证实这些发现，测量了T细胞增殖。抗原致敏的BMDC有效诱导了对照CD4⁺和CD8⁺ T细胞增殖(图8B)，证明了肿瘤抗原特异性T细胞的活化。再次，抗CRT抗体的存在抑制了T细胞增殖(图8B)，表明CRT在激活DC-T细胞轴中的作用。因此，在不存在PMN-MDSC的情况下，rMVTT诱导的CRT暴露会增强BMDC的活化，从而引发有效的抗肿瘤T细胞免疫。

随后，测量了AB1诱导的MDSC和BMDC之间的直接相互作用。在存在或不存在LPS的情况下，将BMDC与AB1诱导的MDSC共培养。LPS刺激可显著上调BMDC上的CD80和CD86表达(CD80的P<0.001，CD86的P<0.05，未经刺激vs LPS)，表明BMDC成熟(图8C)。值得注意的是，当共培养物中存在MDSC时，PMN-MDSC而非M-MDSC会显著抑制未经刺激和LPS刺激的BMDC上CD80和CD86的表达(图8C)。还分析了LPS诱导的细胞因子产生的变化。从没有LPS的BMDC收集的上清液始终显示出非常低水平的细胞因子。相反，具有LPS的培养上清液导致促炎细胞因子IL-6和TNF-α以及1型细胞因子IL-12p70显著增加(图14B)。与PMN-MDSC下调BMDC活化的能力相一致，共培养物中PMN-MDSC的存在显著抑制了IL-6、TNF-α和IL-12p70的诱导，进一步支持了PMN-MDSC在抑制BMDC活化中的作用(图14B)。然后测试了当用rMVTT处理的AB1细胞上清液而不是LPS致敏BMDC时，PMN-MDSC是否具有类似的抑制作用。通过测量与BMDC活化相关的细胞因子，PMN-MDSC而不是M-MDSC在共培养中显著抑制IL-6和TNF-α的产生，并且PMN-MDSC对TNF-α的抑制作用是剂量依赖性的(图14C)。

为了理解PMN-MDSC介导的免疫抑制的潜在机制，检测了MDSC亚群中IL-10和TGF-β的产生。MDSC不产生TGF-β，并且仅PMN-MDSC表现出IL-10产生亚群(图8D)。此外，当PMN-MDSC与BMDC在体外共培养时(图8E)，以及在体内肿瘤内MVTT处理后(图14D)，IL-10的产生得以增强。众所周知，免疫抑制性细胞因子IL-10抑制DC成熟并阻止DC引发Th1应答。已经报道MDSC和巨噬细胞之间的串扰减少巨噬细胞产生IL-12并增加MDSC产生IL-10，以促进肿瘤进展。因此，PMN-MDSC的抑制能力可能取决于其IL-10的产生。为了测试这一点，在存在IL-10受体阻断抗体或同种型对照的情况下，将源自荷AB1小鼠的纯化的PMN-MDSC或M-MDSC与LPS激活的BMDC共培养。比较活化标记物在BMDC上的表达，PMN-MDSC的存在持续下调BMDC上的CD80和CD86表达(图8F)。然而，通过阻断IL-10受体可以部分缓解PMN-MDSC介导的抑制作用(图8F)。此外，检测了上清液中分泌的细胞因子，并且阻断IL-10受体也显著提高了TNF-α和IL-12p70的产生(图14E)，表明在我们的体外抑制试验中由PMN-MDSC产生IL-10似乎是直接的抑制手段。总体而言，尽管rMVTT处理促进CRT依赖性抗原摄取以及BMDC的活化和抗原呈递，但PMN-MDSC可能直接抑制DC活化并导致溶瘤病毒处理的功效降低或失败。

参考文献

1.Yap TA,Aerts JG,Popat S,Fennell DA.Novel insights into mesotheliomabiology and implications for therapy.Nat Rev Cancer 2017；17：475-88.

2.Rusch VW.Pemetrexed and cisplatin for malignant pleuralmesothelioma：a new standard of care？J Clin Oncol 2003；21：2629-30.

3.Dozier J,Zheng H,Adusumilli PS.Immunotherapy for malignant pleuralmesothelioma：current status and future directions.Transl Lung Cancer Res2017；6：315-24.

4.Fukuhara H,Ino Y,Todo T.Oncolytic virus therapy：A new era of cancertreatment at dawn.Cancer Sci 2016；107：1373-9.

5.Kaufman HL,Kohlhapp FJ,Zloza A.Oncolytic viruses：a new class ofimmunotherapy drugs.Nat Rev Drug Discov 2015；14：642-62.

6.Zamarin D,Holmgaard RB,Subudhi SK,Park JS,Mansour M,Palese P,etal.Localized Oncolytic Virotherapy Overcomes Systemic Tumor Resistance toImmune Checkpoint Blockade Immunotherapy.Sci Transl Med 2014；6.

7.Ranki T,Pesonen S,Hemminki A,Partanen K,Kairemo K,Alanko T,etal.Phase I study with ONCOS-102for the treatment of solid tumors-anevaluation of clinical response and exploratory analyses of immune markers.JImmunother Cancer 2016；4：17.

8.Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer：the nextgeneration.Cell2011；144：646-74.9.Scarlett UK,Rutkowski MR,Rauwerdink AM,Fields J,Escovar-Fadul X,Baird J,et al.Ovarian cancer progression iscontrolled by phenotypic changes in dendritic cells.J Exp Med 2012；209：495-506.

9.Scarlett UK,Rutkowski MR,Rauwerdink AM,Fields J,Escovar-Fadul X,Baird J,et al.Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changesin dendritic cells.J Exp Med 2012；209：495-506.

10.Bronte V,Brandau S,Chen SH，Colombo MP，Frey AB，Greten TF，etal.Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature andcharacterization standards.Nat Commun 2016；7：12150.

11.Kaufman HL，Kim DW，DeRaffele G，Mitcham J，Coffin RS，Kim-SchulzeS.Local and distant immunity induced by intralesional vaccination with anoncolytic herpes virus encoding GM-CSF in patients with stage IIIc and IVmelanoma.Ann Surg Oncol 2010；17：718-30.

12.Ranki T,Joensuu T,Jager E，Karbach J，Wahle C，Kairemo K，et al.Localtreatment of a pleural mesothelioma tumor with ONCOS-102 induces a systemicantitumor CD8+ T-cell response,prominent infiltration of CD8+lymphocytes andTh1 type polarization.Oncoimmunology 2014；3：e958937.

13.Cerullo V，Pesonen S,Diaconu I，Escutenaire S，Arstila PT，Ugolini M，et al.Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients.Cancer Res2010；70：4297-309.

14.Ribas A，Dummer R,Puzanov I，VanderWalde A，Andtbacka RHI，MichielinO，et al.Oncolytic Virotherapy Promotes Intratumoral T Cell Infiltration andImproves Anti-PD-1 Immunotherapy.Cell 2017；170：1109-19 e10.

15.Tan Z,Zhou J，Cheung AK，Yu Z,Cheung KW，Liang J，et al.Vaccine-elicited CD8+ T cells cure mesothelioma by overcoming tumor-inducedimmunosuppressive environment.Cancer Res 2014；74：6010-21.

16.Yu Z，Tan Z，Lee BK，Tang J，Wu X，Cheung KW，et al.Antigen spreading-induced CD8+ T cells confer protection against the lethal challenge of wild-type malignant mesothelioma by eliminating myeloid-derived suppressorcells.Oncotarget 2015；6：32426-38.

17.Hou W，Sampath P,Rojas JJ,Thorne SH.Oncolytic Virus-MediatedTargeting of PGE2 in the Tumor Alters the Immune Status and SensitizesEstablished and Resistant Tumors to Immunotherapy.Cancer Cell 2016；30：108-19.

18.Veltman JD，Lambers MEH，van Nimwegen M，Hendriks RW,Hoogsteden HC,Aerts JGJV，et al.COX-2 inhibition improves immunotherapy and is associatedwith decreased numbers of myeloid-derived suppressor cells inmesothelioma.Celecoxib influences MDSC function.Bmc Cancer 2010；10.

19.Yamada N,Oizumi S,Kikuchi E,Shinagawa N,Konishi-Sakakibara J,Ishimine A,et al.CD8+tumor-infiltrating lymphocytes predict favorableprognosis in malignant pleural mesothelioma after resection.Cancer ImmunolImmunother 2010；59：1543-9.

20.Krysko DV，Garg AD,Kaczmarek A,Krysko O,Agostinis P,VandenabeeleP.Immunogenic cell death and DAMPs in cancer therapy.Nat Rev Cancer 2012；12：860-75.

21.Facciponte JG,Ugel S,De Sanctis F,Li C,Wang L,Nair G,et al.Tumorendothelial marker 1-specific DNA vaccination targets tumor vasculature.JClin Invest 2014；124：1497-511.

22.Kreiter S,Vormehr M,van de Roemer N,Diken M,Lower M,Diekmann J,etal.Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses tocancer.Nature 2015；520：692-6.

23.Qin Q,Xu Y,He T,Qin C,Xu J.Normal and disease-related biologicalfunctions of Twist1 and underlying molecular mechanisms.Cell Res 2012；22：90-106.

24.Gabrilovich DI，Ostrand-Rosenberg S,Bronte V.Coordinated regulationof myeloid cells by tumours.Nat Rev Immunol 2012；12：253-68.

25.Youn JI,Gabrilovich DI.The biology of myeloid-derived suppressorcells：the blessing and the curse of morphological and functionalheterogeneity.Eur J Immunol 2010；40：2969-75.

26.Fortin C,Huang XP,Yang YP.NK Cell Response to Vaccinia Virus IsRegulated by Myeloid-Derived Suppressor Cells.Journal of Immunology 2012；189：1843-9.

27.Hoechst B,Voigtlaender T,Ormandy L,Gamrekelashvili J,Zhao F,Wedemeyer H,et al.Myeloid derived suppressor cells inhibit natural killercells in patients with hepatocellular carcinoma via the NKp30receptor.Hepatology 2009；50：799-807.

28.Zamarin D,Holmgaard RB,Ricca J,Plitt T,Palese P,Sharma P,etal.Intratumoral modulation of the inducible co-stimulator ICOS by recombinantoncolytic virus promotes systemic anti-tumour immunity.Nat Commun 2017；8：14340.

29.Singh R,Lillard JW,Jr.，Singh S.Chemokines：key players in cancerprogression and metastasis.Front Biosci(Schol Ed)2011；3：1569-82.

30.Highfill SL,Cui Y,Giles AJ,Smith JP,Zhang H,Morse E,etal.Disruption of CXCR2-mediated MDSC tumor trafficking enhances anti-PD1efficacy.Sci Transl Med 2014；6：237ra67.

31.Qin H,Lerman B,Sakamaki I,Wei GW,Cha SCC,Rao SS,et al.Generationof a new therapeutic peptide that depletes myeloid-derived suppressor cellsin tumor-bearing mice.Nat Med 2014；20：676-81.

32.Ostrand-Rosenberg S，Sinha P,Beury DW,Clements VK.Cross-talkbetween myeloid-derived suppressor cells(MDSC)，macrophages，and dendriticcells enhances tumor-induced immune suppression.Semin Cancer Biol 2012；22：275-81.

33.Helft J，Bottcher J，Chakravarty P，Zelenay S，Huotari J，Schraml BU，etal.GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population ofCD11c(+)MHCII(+)Macrophages and Dendritic Cells.Immunity 2015；42：1197-211.

34.Basu S，Srivastava PK.Calreticulin，a peptide-binding chaperone ofthe endoplasmic reticulum，elicits tumor-and peptide-specific immunity.J ExpMed1999；189：797-802.

35.Kumar V，Patel S，Tcyganov E，Gabrilovich DI.The Nature of Myeloid-Derived Suppressor Cells in the Tumor Microenvironment.Trends Immunol 2016；37：208-20.

36.Schmidt SV，Nino-Castro AC，Schultze JL.Regulatory dendritic cells：there is more than just immune activation.Front Immunol 2012；3.

37.Sinha P,Clements VK,Bunt SK,Albelda SM,Ostrand-Rosenberg S.Cross-talk between myeloid-derived suppressor cells and macrophages subverts tumorimmunity toward a type 2 response.Journal of Immunology 2007；179：977-83.

38.Beury DW,Parker KH,Nyandjo M,Sinha P,Carter KA,Ostrand-RosenbergS.Cross-talk among myeloid-derived suppressor cells,macrophages,and tumorcells impacts the inflammatory milieu of solid tumors.J Leukocyte Biol 2014；96：1109-18.

39.Andtbacka RH,Kaufman HL,Collichio F,Amatruda T,Senzer N,Chesney J,et al.Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in PatientsWith Advanced Melanoma.J Clin Oncol 2015；33：2780-8.

40.Kohlhapp FJ,Kaufman HL.Molecular Pathways：Mechanism of Action forTalimogene Laherparepvec,a New Oncolytic Virus Immunotherapy.Clin Cancer Res2016；22：1048-54.

41.Pol J,Buque A,Aranda F,Bloy N,Cremer I,Eggermont A,et al.TrialWatch-Oncolytic viruses and cancer therapy.Oncoimmunology 2016；5：e1117740.

42.Krug LM,Zauderer MG,Adusumili PS,Mcgee E，Sepkowitz K,Klang M,etal.Phase I study of intra-pleural administration of GL-ONC1,an oncolyticvaccinia virus,in patients with malignant pleural effusion.Journal ofClinical Oncology 2015；33.

43.Boisgerault N,Achard C,Delaunay T,Cellerin L,Tangy F,Gregoire M,etal.Oncolytic virotherapy for human malignant mesothelioma：recentadvances.Oncolytic Virother 2015；4：133-40.

44.Diaz RM,Galivo F,Kottke T,Wongthida P,Qiao J,Thompson J,etal.Oncolytic immunovirotherapy for melanoma using vesicular stomatitisvirus.Cancer Research 2007；67：2840-8.

45.Tai LH,de Souza CT,Belanger S,Ly L,Alkayyal AA,Zhang JQ,etal.Preventing Postoperative Metastatic Disease by Inhibiting Surgery-InducedDysfunction in Natural Killer Cells.Cancer Research 2013；73：97-107.

46.Ochoa AC,Zea AH,Hernandez C,Rodriguez PC.Arginase,prostaglandins,and myeloid-derived suppressor cells in renal cell carcinoma.Clin Cancer Res2007；13：721s-6s.

47.Diaz-Montero CM,Salem ML,Nishimura MI,Garrett-Mayer E,Cole DJ,Montero AJ.Increased circulating myeloid-derived suppressor cells correlatewith clinical cancer stage,metastatic tumor burden,and doxorubicin-cyclophosphamide chemotherapy.Cancer Immunol Immunother 2009；58：49-59.

48.Almand B,Clark JI,Nikitina E,van Beynen J,English NR,Knight SC,etal.Increased production of immature myeloid cells in cancer patients：amechanism of immunosuppression in cancer.J Immunol 2001；166：678-89.

49.Lesokhin AM,Hohl TM,Kitano S,Cortez C,Hirschhorn-Cymerman D,Avogadri F,et al.Monocytic CCR2(+)myeloid-derived suppressor cells promoteimmune escape by limiting activated CD8 T-cell infiltration into the tumormicroenvironment.Cancer Res 2012；72：876-86.

50.Liu Z，Ravindranathan R，Kalinski P，Guo ZS,Bartlett DL.Rationalcombination of oncolytic vaccinia virus and PD-L1 blockade workssynergistically to enhance therapeutic efficacy.Nat Commun 2017；8：14754.

51.Srivastava MK,Zhu L,Harris-White M,Kar UK,Huang M,Johnson MF,etal.Myeloid suppressor cell depletion augments antitumor activity in lungcancer.PLoS One 2012；7：e40677.

52.Stromnes IM,Brockenbrough JS,Izeradjene K,Carlson MA,Cuevas C,Simmons RM,et al.Targeted depletion of an MDSC subset unmasks pancreaticductal adenocarcinoma to adaptive immunity.Gut 2014；63：1769-81.

53.Lesterhuis WJ,Salmons J,Nowak AK,Rozali EN,Khong A,Dick IM,etal.Synergistic effect of CTLA-4 blockade and cancer chemotherapy in theinduction of anti-tumor immunity.PLoS One 2013；8：e61895.

54.Glodde N,Bald T,van den Boorn-Konijnenberg D，Nakamura K，O'DonnellJS,Szczepanski S,et al.Reactive Neutrophil Responses Dependent on theReceptor Tyrosine Kinase c-MET Limit Cancer Immunotherapy.Immunity2017；47：789-802 e9.

55.Van Valckenborgh E,Schouppe E,Movahedi K,De Bruyne E,Menu E,DeBaetselier P,et al.Multiple myeloma induces the immunosuppressive capacity ofdistinct myeloid-derived suppressor cell subpopulations in the bonemarrow.Leukemia 2012；26：2424-8.

56.Noman MZ,Desantis G,Janji B,Hasmim M,Karray S,Dessen P,et al.PD-L1is a novel direct target of HIF-1alpha,and its blockade under hypoxiaenhanced MDSC-mediated T cell activation.J Exp Med 2014；211：781-90.

57.Huang B，Pan PY，Li Q,Sato AI，Levy DE,Bromberg J,et al.Gr-1+CD115+immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced Tregulatory cells and T-cell anergy in tumorbearing host.Cancer Res 2006；66：1123-31.

58.De Santo C,Arscott R,Booth S,Karydis I,Jones M,Asher R,etal.Invariant NKT cells modulate the suppressive activity of IL-10-secretingneutrophils differentiated with serum amyloid A.Nat Immunol 2010；11：1039-46.

59.Meyers DE,Wang AA,Thirukkumaran CM,Morris DG.CurrentImmunotherapeutic Strategies to Enhance Oncolytic Virotherapy.FrontOncol2017；7：114.

60.Lawson KA,Mostafa AA,Shi ZQ,Spurrell J,Chen W,Kawakami J,etal.Repurposing Sunitinib with Oncolytic Reovirus as a Novel ImmunotherapeuticStrategy for Renal Cell Carcinoma.Clin Cancer Res 2016；22：5839-50.

61.Yamanaka M,Tada Y,Kawamura K,Li Q,Okamoto S,Chai K,et al.E1B-55kDa-defective adenoviruses activate p53 in mesothelioma and enhancecytotoxicity of anticancer agents.J Thorac Oncol 2012；7：1850-7.

62.Zhou J,Liu M,Sun H,Feng Y,Xu L,Chan AWH,et al.Hepatoma-intrinsicCCRK inhibition diminishes myeloid-derived suppressor cell immunosuppressionand enhances immune-checkpoint blockade efficacy.Gut2017.

63.Yu W，Fang Q，Zhu W，Wang H，Tien P，Zhang L，et al.One time intranasalvaccination with a modified vaccinia Tiantan strain MVTT(ZCI)protects animalsagainst pathogenic viral challenge.Vaccine 2010；28：2088-96.

Claims (37)

1.治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用溶瘤病毒和疗法的组合，所述疗法诱导肿瘤诱导的多形核型骨髓髓系来源的抑制细胞(PMN-MDSC)的消耗。

2.权利要求1的方法，其中所述溶瘤病毒是腺病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒、副粘病毒、细小病毒、弹状病毒或痘苗病毒。

3.权利要求1或2的方法，其中所述溶瘤病毒具有复制能力。

4.权利要求1或2的方法，其中所述溶瘤病毒是复制缺陷的。

5.权利要求1的方法，其中所述溶瘤病毒是复制减弱的痘苗病毒。

6.权利要求5的方法，其中所述复制缺陷的痘苗病毒是具有病毒的M1L-K2L基因缺失的经修饰的痘苗天坛(MVTT)病毒。

7.权利要求6的方法，其中所述MVTT包含替代缺失的病毒的M1L-K2L的异源多核苷酸。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的所述疗法特异性诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC或诱导的M-MDSC的消耗。

9.权利要求1至7中任一项的方法，其中诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的所述疗法包括向所述受试者施用吉西他滨、氟尿嘧啶、宾达利、PDE5抑制剂、他达拉非、硝基阿司匹林(nitroaspirin)、COX-2抑制剂，伊匹单抗(ipilimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、塞来昔布、西地那非和他达拉非的组合、N-羟基-L-精氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、甲基巴多索隆(CDDO-Me)、醉茄素A(Withaferin A)、单克隆抗Gr1抗体、IL4Rα适体、靶向MDSC膜蛋白的肽体，或抗淋巴细胞抗原6复合基因座G6D(Ly6G)的抗体。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的所述疗法包括施用抗体。

11.权利要求10的方法，其中所述抗体是针对MDSC的。

12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的所述疗法在二至十四天的时期内施用多次。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述溶瘤病毒和/或诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的所述疗法通过肿瘤内注射施用。

14.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括向所述受试者施用一种或更多种其他抗癌疗法。

15.权利要求14的方法，其中所述一种或更多种其他抗癌疗法包括施用化学治疗药物、检查点抑制剂、佐剂、贫血药物、放射治疗、干细胞移植、表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR T细胞)，或前述两种或更多种的组合。

16.权利要求15的方法，其中所述检查点抑制剂是以下的抑制剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)。

17.权利要求16的方法，其中所述CTLA4的抑制剂是结合CTLA4的抗体，所述PD-1的抑制剂是结合PD-1的抗体，和所述PD-L1的抑制剂是结合PD-L1的抗体。

18.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者是人类。

19.前述权利要求中任一项的方法，其中所述癌症是间皮瘤、黑素瘤或其他实体瘤。

20.组合物，其包含溶瘤病毒和产品以及药学上可接受的载体，所述产品诱导肿瘤诱导的多形核型骨髓髓系来源的抑制细胞(PMN-MDSC)的消耗。

21.权利要求20的组合物，其中所述溶瘤病毒是腺病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒、副粘病毒、细小病毒、弹状病毒或痘苗病毒。

22.权利要求20或21的组合物，其中所述溶瘤病毒具有复制能力。

23.权利要求20或21的组合物，其中所述溶瘤病毒是复制缺陷的。

24.权利要求20的组合物，其中所述溶瘤病毒是复制减弱的痘苗病毒。

25.权利要求24的组合物，其中所述复制缺陷的痘苗病毒是具有病毒的M1L-K2L基因缺失的经修饰的痘苗天坛(MVTT)病毒。

26.权利要求25的组合物，其中所述MVTT包含替代缺失的病毒的M1L-K2L的异源多核苷酸。

27.权利要求20至26中任一项的组合物，其中诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的化合物特异性地诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗，而不影响肿瘤诱导的M-MDSC。

28.权利要求20至26中任一项的组合物，其中所述诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的化合物是吉西他滨、氟尿嘧啶、宾达利、PDE5抑制剂、他达拉非、硝基阿司匹林、COX-2抑制剂，伊匹单抗、贝伐单抗、塞来昔布、西地那非和他达拉非的组合、N-羟基-L-精氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、甲基巴多索隆(CDDO-Me)、醉茄素A、单克隆抗Gr1抗体、IL4Rα适体、靶向MDSC膜蛋白的肽体，或抗淋巴细胞抗原6复合基因座G6D(Ly6G)的抗体。

29.权利要求20至28中任一项的组合物，其中诱导肿瘤诱导的PMN-MDSC的消耗的化合物包含针对Ly6G的抗体。

30.权利要求29的组合物，其中所述针对Ly6G的抗体是1A8。

31.重组修饰的痘苗天坛病毒(rMVTT)，所述rMVTT包含痘苗天坛病毒(VTT)病毒的M1L-K2L基因的缺失，并且还包含替代缺失的病毒M1L-K2L基因的两个或更多个异源多核苷酸。

32.根据权利要求31的rMVTT，其中所述两个或更多个异源多核苷酸之一包含编码荧光蛋白的异源多核苷酸。

33.根据权利要求32的rMVTT，其中所述荧光蛋白是HcRed或绿色荧光蛋白。

34.根据权利要求31至33中任一项的rMVTT，其中所述两个或更多个异源多核苷酸之一包含编码异源病毒的衣壳蛋白的异源多核苷酸。

35.根据权利要求34的rMVTT，其中所述异源病毒的衣壳蛋白是人类免疫缺陷病毒(HIV)的p24抗原(p24)。

36.权利要求31至35中任一项的rMVTT，其中所述两个或更多个异源多核苷酸之一在突触蛋白启动子(pSYN)的控制下，并且所述两个或更多个异源多核苷酸中的另一个在H5启动子(pH5)的控制下。

37.权利要求31至36的rMVTT，其中所述两个或更多个异源多核苷酸之一包含编码HIVp24的异源多核苷酸，其在pSYN的控制下，并且所述两个或更多个异源多核苷酸中的另一个包含编码HcRed的异源多核苷酸，其在pH5的控制下。

Images