CN112574887A - 一种提高重组柯萨奇病毒稳定性的方法 - Google Patents

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蔡立刚
曹雪芹
刘志毅
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

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Abstract

本发明涉及及生物制品制备技术领域，具体公开了一种提高重组柯萨奇病毒稳定性的方法，将细菌脂多糖(LPS)作为保护剂加入病毒保存体系可以有效提升柯萨奇病毒的热稳定性，可以方便柯萨奇病毒的运输和保藏，为柯萨奇病毒的研究提供更多便利。

Description

一种提高重组柯萨奇病毒稳定性的方法
技术领域
本发明属于生物制品制备技术领域，具体涉及一种提高重组柯萨奇病毒稳定性的方法。
背景技术
细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和多糖构成的物质(糖脂质)。脂多糖存在于覆盖全身的外膜(脂质双分子层)的细胞外侧的脂质中。在LPS的生理活性表现中被认为起到最重要作用的是类脂A部分，类脂A可以单独体现其生理作用。
LPS很难从细胞壁脱落，当细菌死亡等时它会通过溶解、破坏细胞来脱落。LPS具有热稳定性和化学稳定性，用一般的高压灭菌器或干热灭菌法是无法让其灭活的。要想让其灭活就需要用250℃的高温加热30分钟。
热稳定性是流感病毒的固有生物学特性,主要由病毒的血凝素蛋白决定,并且与环境温度、pH、盐度、空气湿度和界面性质等理化因素密切相关,在病毒进化与传播过程中发挥重要作用。
柯萨奇病毒(Coxsacie virus，CV)为1948年Gillbert Dalldorf博士和他的同事在寻找治愈脊髓灰质炎疾病的过程中在粪便样品中首次获得，因在纽约柯萨奇小镇发现而得名。同其他类型肠道病毒相同，柯萨奇病毒可通过粪—口途径和口—口途径传播。其中，接触感染者粪便污染的水、食物及土壤可以导致粪—口途径传播。一般情况下，婴幼儿大多隐性感染；而5岁以下，尤其是3岁以下儿童，排毒时间可长达一个月。病毒感染人体后，可引起上呼吸道感染、急性心肌炎等疾病，对婴幼儿的健康造成严重威胁。
柯萨奇病毒具备RNA病毒的共性，由于其结构简单、稳定性差，突变更快，进而为诊断试剂的研发和治疗药物的研发带来极大的挑战；此外柯萨奇病毒的热稳定性差，不便于运输和保藏，给病毒的研究带来诸多不便。
基于现有技术中存在的技术问题，因此有必要提出一种提高重组柯萨奇病毒热稳定性的方法。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高重组柯萨奇病毒稳定性的方法，解决现有技术中柯萨奇病毒的热稳定性差，不便于运输和保藏的问题。
为解决上述问题，本发明方案如下：
本发明提出LPS在柯萨奇病毒B3保存试剂盒中的应用。进一步地，所述应用中，LPS作为保护剂提高柯萨奇病毒B3的热稳定性。
根据本发明的实施例，所述LPS浓度为50-1000μg/ml；优先为50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml；更优选地，所述LPS浓度优选500μg/ml。
本发明还有一个目的在于，提出一种提高重组柯萨奇病毒稳定性的方法，步骤包括，将病毒经细胞培养、纯化后与LPS混育保存，所述病毒为柯萨奇病毒B3。进一步地，所述LPS浓度为50-1000μg/ml；优选为500μg/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提出LPS可用于提高重组柯萨奇病毒热稳定性，并且在500μg/ml浓度下热稳定性更好，可以作为病毒保存试剂盒用于病毒的运输和保藏，给病毒的研究带来极大的方便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明LPS条件下热处理对柯萨奇病毒活力与未加LPS的对比结果示意图。
图2为本发明不同浓度的LPS对柯萨奇病毒活力影响示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例LPS对柯萨奇病毒热稳定性的影响
1.用柯萨奇病毒B3感染vero细胞，24h后，当细胞完全病变时收获病毒液上清即为病毒收获液，病毒收获液依次经100KD膜超滤浓缩，分子筛6FF和QA离子交换柱层析纯化，获得病毒纯化液，储存于-80℃；
2.将vero细胞以2.5×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养18-24h。当细胞生长至单层无缝隙时，用DMEM倍比稀释病毒接种。每孔加入病毒稀释液200μl，置于37℃孵育、5％CO2培养箱中培养1h，弃病毒稀释液；每孔加入2ml固体培养基(含5％FCS的2×DMEM和1.6％琼脂糖，1:1配置)，放入湿盒。置37℃、5％CO2培养箱中培养，30min后倒置培养72h。镜下观察荧光表达及CPE，根据CPE情况进行染色。于细胞培养板中加入0.05％中性红染色液，室温作用1h，弃染色液。挑选培养板中噬斑未融合且噬斑个数适中的培养孔，镜下观察技术噬斑个数，按以下公式计算病毒毒力：PFU/ml＝每个稀释浓度噬斑的平均值/(病毒的稀释浓度×每孔病毒接种量)。
3.纯化后的病毒与LPS混育
1)分别测定不同时间的热处理后残留的病毒活力。柯萨奇病毒与LPS混育，将1×108PFU的柯萨奇病毒B3与相同浓度的LPS温育后，再经42℃热处理。以1×108PFU的柯萨奇病毒B3与PBS混合液作为对照组。结果如图1所示，不难发现对照组发生病毒活性出现大幅下降，而加入LPS后的柯萨奇病毒B3可保持4h内持续稳定，并且6h内活性仅出现小幅下降。
2)分别测定不同浓度下的LPS对等量柯萨奇病毒B3(1×108PFU)的活性，42℃下分别经2h混育后，测定残留病毒的活性。结果如图2所示，没有加入LPS的病毒被热处理后活力大幅度下降；但是相比而言，用LPS处理后的病毒残留活力与LPS浓度近似正相关，即LPS浓度越高，病毒残留活性相对越强，然而，当LPS浓度达到1000μg/ml时，残留活性较500μg/ml提升幅度不大。
3)测定加入500μg/mlLPS的1×108PFU柯萨奇病毒B3在不同温度下随时间推移的热稳定性，同时设置未加入LPS的柯萨奇病毒B3(1×108PFU)为对照组。实验组测得数据如表1所示，对照组如表2所示。
表1：加入LPS的柯萨奇病毒B3的热稳定性数据
Figure BDA0002869127950000041
表2：没有加入LPS的柯萨奇病毒B3的热稳定性数据
Figure BDA0002869127950000042
Figure BDA0002869127950000051
表1与表2对比，可见LPS对于不同温度下的柯萨奇病毒B3热稳定性均有提升，在4天后病毒还能达到104PFU，而未加入LPS的柯萨奇病毒B3在第2天起逐步出现完全失活的情况。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的方案和这里示出与描述的图示示例。

Claims (8)

1.LPS在柯萨奇病毒B3保存试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LPS作为保护剂提高柯萨奇病毒B3的热稳定性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述LPS浓度为50-1000μg/ml。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述LPS浓度为50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述LPS浓度为500μg/ml。
6.一种提高重组柯萨奇病毒稳定性的方法，步骤包括，将病毒经细胞培养、纯化后与LPS混育保存，所述病毒为柯萨奇病毒B3。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述LPS浓度为50-1000μg/ml。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LPS浓度为500μg/ml。
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