KR20160070095A - 종양 항원을 발현하는 폭스바이러스 및 면역 관문 저해제의 길항제 및/또는 효현제를 구비하는 암을 치료하기 위한 복합제 치료제 - Google Patents

종양 항원을 발현하는 폭스바이러스 및 면역 관문 저해제의 길항제 및/또는 효현제를 구비하는 암을 치료하기 위한 복합제 치료제 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 면역 관문 저해제의 하나 이상의 효현제 또는 길항제와 조합된 종양 연관 항원을 코딩하는 재조합 폭스바이러스를 사용한 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제, 조성물 및 방법을 포함한다.

Description

종양 항원을 발현하는 폭스바이러스 및 면역 관문 저해제의 길항제 및/또는 효현제를 구비하는 암을 치료하기 위한 복합제 치료제{COMBINATION THERAPY FOR TREATING CANCER WITH A POXVIRUS EXPRESSING A TUMOR ANTIGEN AND AN ANTAGONIST AND/OR AGONIST OF AN IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR}
본 발명은 종양 항원을 코딩하는 재조합 폭스바이러스(poxvirus)를 사용한 암의 치료에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 면역 관문 저해제(immune checkpoint inhibitor)의 하나 이상의 효현제 및/또는 길항제와 조합된 하나 이상의 종양 항원을 코딩하는 재조합 폭스바이러스를 사용한 암의 치료에 관한 것이다.
재조합 폭스바이러스는 감염성 유기체 및, 더욱 최근에는 종양에 대한 백신으로서 사용된다(Mastrangelo et al. J Clin Invest. 2000;105(8):1031-1034). 이 폭스바이러스 그룹 중 2개인 조류폭스바이러스(avipoxvirus) 및 오소폭스바이러스(orthopoxvirus)는 종양과 싸우는 데 효과적인 것으로 나타났고, 가능한 암 치료에 관여한다.
계두바이러스(fowlpox virus)가 포유동물 세포에 진입하고 단백질을 발현하지만 복제에 실패하면서, 예시적인 하나의 조류폭스바이러스 종인 계두가 인간 투여에 대한 안전한 비히클인 것으로 밝혀졌다(Skinner et al. Expert Rev Vaccines. 2005 Feb;4(1):63-76). 부가적으로, 발현을 위한 비히클로서의 계두바이러스의 사용은 암, 말라리아, 폐결핵 및 AIDS에 대한 백신의 다수의 임상 실험에서 평가되었다(상기 문헌 참조).
오소폭스바이러스는 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 환자에 대한 항원의 투여에 유용한 벡터인 것으로 밝혀졌다. 가장 널리 공지된 오소폭스바이러스인 백시니아는 천연두의 세계적인 근절에 사용되고, 벡터 및/또는 백신으로서 유용성을 나타냈다. 재조합 백시니아 벡터는 몇몇 종양 연관 유전자, 예컨대 p97, HER-2/neu, p53 및 ETA를 포함하는, 광범위한 삽입된 유전자를 발현하도록 조작되었다(Paoletti, et al., 1993).
또 다른 공지된 오소폭스바이러스는 변형된 백시니아 안카라(Modified Vaccinia Ankara: MVA) 바이러스이다. MVA는 폭스비리다에(Poxviridae) 과에서 오소폭스바이러스 속의 구성원인 백시니아 바이러스와 연관된다. MVA는 백시니아 바이러스(CVA)의 안카라 균주의 닭 배아 섬유아세포에서 516회 연속 계대배양에 의해 생성된다(검토를 위해, 문헌[Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 (1975)]을 참조한다). 이 장기간 계대배양의 결과로서, 생성된 MVA 바이러스의 게놈은 이의 게놈 서열의 약 31 킬로염기가 결실되고, 따라서 조류 세포에 대한 복제에 대해 제한된 대단한 숙주 세포로서 기재되어 있다(Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). 다양한 동물 모델에서 생성된 MVA가 상당히 독성이 없는 것으로 밝혀졌다(Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978)). 부가적으로, 이 MVA 균주는 인간 천연두 질환에 대해 면역화하기 위해 백신으로서 임상 실험에서 시험되었다(Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987); Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)). 이 인간 연구에서, MVA는 백시니아 기반 백신과 비교하여 독성 또는 감염성이 감소하지만, MVA는 우수한 특이적 면역 반응을 여전히 유도한다.
이후 십 년에, MVA는 재조합 유전자 발현에 대한 바이러스 벡터로서 또는 재조합 백신으로서 사용하도록 조작되었다(Sutter, G. et al., Vaccine 12: 1032-40 (1994)).
메이어(Mayr) 등이 1970년대 동안에 MVA가 인간 및 포유동물에서 매우 약독화되고 독성이 없다고 증명하였음에도, 이들 세포에서 잔존하는 복제가 발생하므로, 일부 조사자들은 MVA가 포유동물 및 인간 세포주에서 완전히 약독화되지 않는다고 보고하였다(Blanchard et al., J Gen Virol 79, 1159-1167 (1998); Carroll & Moss, Virology 238, 198-211 (1997); Altenberger, 미국 특허 제5,185,146호; Ambrosini et al., J Neurosci Res 55(5), 569 (1999)). 사용된 바이러스가 본질적으로 다양한 세포주에서 이의 특성, 특히 이의 성장 거동이 다르므로, 이 공보에 보고된 결과는 MVA의 다양한 공지된 균주에 의해 얻어지는 것으로 추정된다. 이러한 잔존하는 복제는 인간에서의 사용과 연관된 안전성 우려를 포함하는 다양한 이유로 바람직하지 않다.
더 안전한 생성물, 예컨대 백신 또는 의약품의 개발을 위해 안전성 프로필이 증대된 MVA의 균주가 기재되어 있다. 미국 특허 제6,761,893호 및 제6,193,752호를 참조한다. 이러한 균주는 비인간 세포 및 세포주, 특히 닭 배아 섬유아세포(chicken embryo fibroblast: CEF)에서 재생 복제할 수 있지만, 공지된 백시니아 균주에 의한 복제를 허용하기 위해 공지된 소정의 인간 세포주에서 상당한 재생 복제를 할 수 없다. 이러한 세포주는 HaCat인 인간 케라틴세포 세포주(Boukamp et al. J Cell Biol 106(3): 761-71 (1988)), HeLa인 인간 자궁경부 선암 세포주(ATCC 번호 CCL-2), 293인 인간 배아 신장 세포주(ECACC 번호 85120602) 및 143B인 인간 골육종 세포주(ECACC 번호 91112502)를 포함한다. 이러한 균주는, 매우 면역손상되고 복제 바이러스에 매우 감수성인, 예를 들어 소정의 마우스 균주, 예컨대 형질전환 마우스 모델 AGR 129에서 생체내 상당한 재생 복제를 또한 할 수 없다. 미국 특허 제6,761,893호를 참조한다. 이러한 하나의 MVA 균주 및 이의 유도체 및 재조합("MVA-BN"이라 칭함)이 기재되어 있다. 미국 특허 제6,761,893호 및 제6,193,752호(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다.
MVA 및 MVA-BN은 각각 재조합 유전자 발현에 대한 바이러스 벡터로서 또는 재조합 백신으로서 사용하기 위해 조작되었다. 예를 들어, 문헌[Sutter, G. et al., Vaccine 12: 1032-40 (1994)], 미국 특허 제6,761,893호 및 제6,193,752호를 참조한다.
암 면역치료제에 대한 소정의 접근법은 종양 연관 항원에 의한 백신접종을 포함한다. 소정의 경우에, 이러한 접근법은 종양 연관 항원에 대한 숙주 면역 반응을 증진시키는 전달 시스템의 사용을 포함한다. 소정의 경우에, 이러한 전달 시스템은 재조합 바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Harrop et al., Front. Biosci. 11:804-817 (2006); Arlen et al., Semin. Oncol. 32:549-555 (2005); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (suppl. 2):14567-14571 (2004)]을 참조한다.
HER-2는 다수의 암 환자의 종양 세포에서 과발현된 종양 연관 항원이다. 다양한 HER-2 폴리펩타이드에 의한 면역화는 이 항원을 발현하는 종양 세포에 대해 면역 반응을 생성하기 위해 사용된다. 예를 들어, 문헌[Renard et al., J. Immunology 171:1588-1595 (2003); Mittendorf et al., Cancer 106:2309-2317 (2006)]을 참조한다.
MVA-BN-HER2인, HER-2 항원을 코딩하는 MVA는, 폐에서의 조절 T 세포(Treg)의 높은 빈도를 특징으로 하는 강한 종양 매개 면역억제 환경에도 불구하고, 실험적 폐 전이의 쥣과 모델에서 강력한 항종양 효율을 발휘하는 것으로 나타났다(Mandl et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61:19-29). 재조합 MVA는 강한 Th1 우세 HER-2-특이적 항체 및 T 세포 반응을 유도하는 것으로 보고되었다(상기 문헌 참조). 항종양 활성은 매우 활성화된, HER-2-특이적, CD8+CD11c+ T 세포에 의한 폐의 침윤의 증가를 특징으로 하고, 폐에서의 Treg 세포의 빈도의 감소를 수반하여, 이팩터 T 세포 대 Treg 세포의 비율을 상당히 증가시킨다(상기 문헌 참조).
MVA-BN-HER2는 안전하고 관용성을 파괴하여 전이 환경에서 인간 임상 연구에서 특이적 T 및 B 세포 반응을 유도하는 것으로 또한 밝혀졌다(Guardino et al., Cancer Research: December 15, 2009; Volume 69, Issue 24, Supplement 3).
트라스투주맙(허셉틴(Herceptin)))은 HER2의 세포외 도메인을 표적화하는 인간화 단일클론 항체(mAb)이고, HER2 양성 유방암에서 임상 효율을 나타냈다(Wang et al., Cancer Res. 2012 September 1; 72(17): 4417-4428). 그러나, 상당한 수의 환자는 초기 트라스투주맙 치료에 반응하지 못하고, 많은 트라스투주맙 반응성 종양은 연속 치료 후에 저항을 발전시킨다(상기 문헌 참조).
면역 세포 상의 저해 수용체는 암에서의 면역 탈출의 중심 조절물질이다(Woo et al., Cancer Res; 72(4); 917-27, 2011). 이 저해 수용체 중에서, CTLA-4(세포독성 T 림프구 연관 단백질 4)는 우세한 오프-스위치(dominant off-switch)로서 작용하는 반면, 다른 수용체, 예컨대 PD-1(프로그래밍된 사멸 1, CD279) 및 LAG-3(림프구 활성화 유전자, CD223)은 더 미묘한 레오스탯(rheostat) 기능을 하는 것으로 보인다(상기 문헌 참조).
CTLA-4는 활성화된 T 세포에서 상향 조절된 면역 관문 분자이다(Mackiewicz, Wspolczesna onkol 2012; 16 (5):363-370). 항-CTLA4 mAb는 CTLA-4와 CD80/86의 상호작용을 차단하고, 면역 억제의 기전을 끄고, DC에 의한 T 세포의 연속 자극이 가능하게 할 수 있다. CTLA-4, 이필리무맙 및 트레멜리무맙에 지향된 2개의 IgG mAb는 흑색종을 가지는 환자에서 임상 실험에서 사용된다. 그러나, 항-CTLA-4 항체에 의한 치료는 높은 수준의 면역 관련 부작용을 나타낸다(상기 문헌 참조).
면역계를 조절하는 또 다른 인간 mAb는 사멸-1 수용체(PD-1R)에 지향된 BMS-936558(MDX-1106)이고, (PD-1L)의 리간드는 흑색종 세포에서 직접적으로 발현될 수 있다(상기 문헌 참조). PD-1R은 T 세포 활성화 및 관용성을 조절하는 공동자극 분자의 B7:CD28 패밀리의 일부이고, 따라서 항-PD-1R은 관용성을 파괴하는 데 있어 중요한 역할을 할 수 있다(상기 문헌 참조).
PD-1/PD-L1 경로의 확대는 T 세포 이팩터 기능, 사이토카인 분비 및 증식을 저해한다(Turnis et al., OncoImmunology 1:7, 1172-1174; 2012). 높은 수준의 PD-1은 고갈된 또는 만성적으로 자극된 T 세포와 연관된다(상기 문헌 참조). 더구나, PD-1 발현의 증가는 암 환자의 생존의 감소와 상관된다(상기 문헌 참조).
이 현재의 연구는 PD-1 발현이 암의 생존율과 연관될 수 있다는 것을 제시하지만, 암을 치료하는 데 있어서 PD-1의 저해에 의한 초기 연구는 매우 다양한 부작용을 나타냈다(Mellman et al. Nature 2011; 480(7378): 480-489); 또한 문헌[Chow, Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2013, "Exploring novel immune-related toxicities and endpoints with immune-checkpoint inhibitors in non-small cell lung cancer"]을 참조한다.
LAG-3은 다양한 림프 세포 유형의 활성화 시 발현된 음성 조절 분자이다(상기 문헌 참조). LAG-3은 천연 및 유도 면역억제 Treg 세포 둘 다의 최적 기능에 필요하다(상기 문헌 참조).
단일클론 항체에 의한 PD-1 및 LAG-3의 복합 봉쇄는 확립된 종양의 성장을 상승적으로 제한한다(Woo et al., Cancer Res; 72(4); 917-27, 2011). 항-LAG-3/항-PD-1 복합 면역치료제가 확립된 Sa1N 및 MC38 종양을 효과적으로 제거하지만, 이 치료제는 확립된 B16 종양에 효과적이지 않다(상기 문헌 참조). 투르니스(Turnis) 등은 이들의 연구["highlighted the difficulty in predicting the outcome of combination treatments." Turnis et al., OncoImmunology 1:7, 1172-1174; 2012]를 보고하였다.
유도성 공동자극 분자(inducible co-stimulatory molecule: ICOS)는 Treg에서 고도로 발현되어 흑색종 및 난소암을 포함하는 다양한 종양을 침윤시키는 것으로 보고되었다(Faget et al., OncoImmunology 2:3, e23185; March 2013). 유방암종에서 TA-Treg와 TA-pDC의 상호작용 동안 ICOS/ICOSL 상호작용이 발생하는 것으로 또한 보고되었다(상기 문헌 참조). ICOS에 대한 길항제 항체는 ICOS:ICOS-L 상호작용을 저해하고, pDC에 의해 유도된 Treg의 증식을 무효화하기 위해 사용되었다. WO 2012/131004. 길항제 항체는 종양 진행을 감소시키기 위해 유방 종양의 쥣과 모델에서 사용되었다(상기 문헌 참조).
ICOS에 지향된 효현제 항체는 종양의 치료를 위해 차단 항-CTLA-4 항체 및 차단 항-PD-1 항체와 조합되어 유용한 것으로 제시되어 있다(WO 2011/041613).
능동 면역치료제 및 암 백신을 포함하는 부가적인 암 치료제에 대한 실질적인 충족되지 못한 의학 요구가 명확히 존재한다. 많은 양상에서, 본 개시내용의 실시형태는 현재 이용 가능한 암 치료제를 증가시키고 개선하기 위해 복합제 치료제를 제공함으로써 이 수요를 해결한다.
일반적인 일 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 종양 항원을 코딩하는 재조합 폭스바이러스를 면역 관문 저해제의 하나 이상의 길항제 또는 효현제와 조합하여 사용하여 암 환자를 치료하기 위한 치료제, 조성물 및 방법을 포괄한다.
더욱 특정한 양상에서, 본 발명은 종양 항원을 발현하는 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 조합을 PD-1, LAG-3의 길항제 및/또는 ICOS의 효현제의 하나 이상의 조합과 이용하는 용도, 방법 및 조성물을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제를 포함한다. 치료제는 (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 포함한다. (a) 및 (b)가 복합제로서 투여되는 것으로 본 발명에 의해 고안된다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 인간 암 환자를 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스를 환자에게 투여하는 단계; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
훨씬 또 다른 실시형태에서, 인간 암 환자를 치료하기 위한 치료제 및 방법은 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스 및 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나와 조합하여 인간 암 환자에 대한 이의 투여를 추가로 포함한다.
훨씬 또 다른 실시형태에서, 인간 암 환자를 치료하기 위한 치료제 및 방법은 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 2종 이상의 재조합 오소폭스바이러스 및 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나와 조합하여 인간 암 환자에 대한 이의 투여를 추가로 포함한다.
부가적인 실시형태에서, 본 발명은 인간 암 환자의 치료에서 사용하기 위한 약제 또는 조성물을 포괄한다. 약제 또는 조성물은 (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 포함한다. 부가적인 실시형태에서, 약제 또는 조성물은 (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 부가적으로 포함한다.
훨씬 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 인간 암 환자의 치료를 위한 약제학적 조성물 또는 약제의 제조에서의 조성물의 용도를 포함하고, 상기 조성물은 (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 포함한다. 부가적인 실시형태에서, 약제 또는 조성물은 (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 부가적으로 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로, 재조합 오소폭스바이러스는 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 및/또는 MVA-BN으로부터 선택된다. 소정의 부가적인 실시형태에서, 재조합 조류폭스바이러스는 계두바이러스이다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로, 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 및 항-ICOS 효현제는 각각 항체를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로, 재조합 오소폭스바이러스 및 재조합 조류폭스바이러스에 의해 코딩된 적어도 하나의 종양 항원은 CEA, MUC-1, PAP, PSA 및 HER-2 항원으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 종양 항원은 PAP 및 PSA로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 종양 항원은 CEA 및 MUC-1로부터 선택된다. 훨씬 또 다른 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 종양 항원은 HER-2 항원이다.
소정의 부가적인 실시형태에서, 인간 암 환자의 치료는 유방암, 결장직장암, 폐암, 위암, 췌장암, 전립선암, 방광암 및/또는 난소암으로부터 선택된 암을 포함한다.
본 발명의 부가적인 목적 및 이점은 하기 설명에서 부분적으로 기재될 것이고, 부분적으로 설명으로부터 명확하거나, 본 발명의 실행에 의해 습득될 것이다. 본 발명의 목적 및 이점은 특히 첨부된 청구범위에서 지적된 부재 및 조합의 수단에 의해 실현되고 획득된다.
상기 일반 설명 및 하기 상세한 설명 둘 다는 오직 예시적이고 설명적이고, 청구된 바대로 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이 명세서에 포함되고 이의 일부를 구성하는 수반된 도면은 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 예시하고, 설명과 함께, 본 발명의 실행을 설명하도록 작용한다.
도 1. MVA-BN-HER2에 의한 치료 후 T 세포에서 폐, 비장 및 혈액에서의 ICOS 발현을 나타낸다. 나이브 (종양 비함유) 마우스를 1일(A 및 B) 또는 1일 및 15일(C 및 D)에 MVA-BN-HER2에 의해 치료하였다. CD8+T 세포(A 및 C) 및 CD4+ T 세포(B 및 D)에 대한 ICOS 발현. 데이터는 평균±SEM(각각의 시점에서 그룹마다 3마리의 마우스)으로 표시된다.
도 2. 항-ICOS 효현제와 조합된 MVA-BN-HER2의 투여 후 종양 용적을 나타낸다. 고형 CT26-HER-2 종양을 가지는 마우스를 1일 및 15일에 MVA-BN-HER2에 의해 치료하고, 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 18일, 22일, 25일에 항-ICOS에 의해 치료하였다(i.p.). A) 평균 종양 성장. B) 개별 마우스에서의 종양 성장.
도 3. 실험적 폐 전이 모델에서 종양을 제거하고 생존을 증가시키기 위해 MVA-BN-HER2가 항-CTLA-4와 상승작용한다는 것을 나타낸다. 폐에서 CT26-HER-2 종양을 가지는 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-HER2에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4에 의해 치료하였다.
도 4. 종양 이식 후 25일에 MVA-BN-HER2는 단독으로 및 항-CTLA-4와 조합되어 CT26-HER2 폐 종양 부담을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 폐에서 CT26-HER-2 종양을 가지는 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-HER2에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4에 의해 치료하고; 종양 부담을 25일에 분석하였다. A) 각각의 그룹으로부터의 대표적인 폐는 비치료 및 항-CTLA-4 치료 폐에서 작은 덩어리로서 종양이 가시적이라는 것을 나타낸다. MVA-BN-HER2에 의해 치료된 마우스에서 종양이 가시적이지 않았다. 기준자는 1㎝이다. B) MVA-BN-HER2에 의해 치료된 마우스는 25일에 나이브 마우스에 유사한 폐 중량을 가지지만, 폐 중량은 25일에 비치료 및 항-CTLA-4 치료 마우스에서 상당히 더 컸다.
도 5. 종양/폐로부터의 T 세포에서 및 MVA-BN-HER2에 의해 치료된 마우스에서 말초에서 및 높은 종양 부담을 가지는 마우스의 종양/폐에서 증가한 ICOS 발현을 나타낸다. 폐에서 CT26-HER-2 종양을 가지는 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-HER2에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4에 의해 치료하였다. 그룹마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 A) 11일 및 25일에 CD4+ T 세포에서의 ICOS 발현. B) 11일 및 25일에 CD8+ T 세포에서의 ICOS 발현. C) 25일에 CD4+ T 세포에서의 평균 ICOS 발현. 그룹마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 D) 25일에 CD8+ T 세포에서의 평균 ICOS 발현.
도 6. ICOS+ CD4+ T 세포는 종양 보유 마우스에서 대략 동일한 비율의 FoxP3+이지만, 치료에 반응하는 마우스에서 주로 FoxP3-이라는 것을 나타낸다. 폐에서 CT26-HER-2 종양을 가지는 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-HER2에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4에 의해 치료하였고, FACS 분석을 종양 이식 후 24일 또는 25일에 수행하였다. 그룹마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 A) FoxP3+ Treg에서의 ICOS 발현. B) FoxP3- CD4 T 세포에서의 ICOS 발현. C) FoxP3+ Treg에서의 평균 ICOS 발현. D) 그룹마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 FoxP3- CD4 T에서의 ICOS 발현.
도 7. MVA-BN-HER2 및 항-CTLA-4와의 복합제 치료제가 이팩터 대 조절 T 세포 비율을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 폐에서 CT26-HER-2 종양을 가지는 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-HER2에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4에 의해 치료하였고, FACS 분석을 종양 이식 후 24일 또는 25일에 수행하였다. 그룹마다 3-4마리의 마우스를 가지는 단일 실험으로부터 A) CD8 Teff:Treg 비율(CD8+ICOS+FoxP3-/CD4+ICOS+FoxP3+) 및 B) CD4 Teff:Treg 비율(CD4+ICOS+FoxP3-/CD4+ICOS+FoxP3. 그룹마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 C) 평균 CD8 Teff:Treg 비율 및 D) 평균 CD4 Teff:Treg 비율.
도 8. MVA-BN-HER2에 의한 치료 후 T 세포에서의 폐, 비장 및 혈액에서의 PD-1 발현을 나타낸다. 나이브 (종양 비함유) 마우스를 MVA-BN-HER2에 의해 1일(A 및 B) 또는 1일 및 15일(C 및 D)에 치료하였다. CD8+ T 세포(A 및 C) 및 CD4+ T 세포(B 및 D)에서의 PD-1 발현. 데이터는 평균±SEM(각각의 시점에서 그룹마다 3마리의 마우스)으로 도시된다.
도 9. MVA-BN-HER2 치료제 및 항-PD-1이 종양 성장을 느리게 하고, 생존율을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 마우스를 고형 CT26-HER-2 고형 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-HER2 및 항-PD-1에 의해 1일 및 15일에 치료하였다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 2000㎣ 미만의 종양 용적에 기초한 마우스의 생존율(%). C) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 10. MVA-BN-HER2에 의한 치료 후 T 세포에서 폐, 비장 및 혈액에서의 LAG-3 발현을 나타낸다. 나이브 (종양 비함유) 마우스를 MVA-BN-HER2에 의해 1일(A 및 B) 또는 1일 및 15일(C 및 D)에 치료하였다. CD8+ T 세포(A 및 C) 및 CD4+ T 세포(B 및 D)에서의 LAG-3 발현. 데이터는 평균±SEM(각각의 시점에서 그룹마다 3마리의 마우스)으로 도시된다.
도 11. MVA-BN-HER2 및 항-LAG-3이 종양 성장을 느리게 하고, 생존율을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 마우스를 1일에 고형 CT26-HER-2 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-HER2 및 항-LAG-3에 의해 1일 및 15일에 치료하였다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 2000㎣ 미만의 종양 용적에 기초한 마우스의 생존율(%). C) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 12. MVA-BN-HER2, 항-PD-1 및 항-LAG-3 치료제가 마우스에서 완전한 종양 회귀를 발생시킨다는 것을 나타낸다. 마우스를 1일에 고형 CT26-HER-2 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-HER2, 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 1일 및 15일에 치료하였다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 2000㎣ 미만의 종양 용적에 기초한 마우스의 생존율(%). C) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 13. MVA-BN-HER2, 항-PD-1 및 항-LAG-3 치료제가 마우스에서 종양 회귀를 발생시킨다는 것을 나타낸다. 마우스를 1일에 고형 CT26-HER-2 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-HER2, 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 4일 및 18일에 치료하였다. 도 12와 비교하여, 치료제는 4일 및 18일로 지연되었다(도 12, 1일 및 15일에). (A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 2000㎣ 미만의 종양 용적에 기초한 마우스의 생존율(%). C) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 14. 실험적 폐 전이 모델에서 MVA-BN-HER2는 단독으로 및 항-PD-1 및 항-LAG-3과 조합되어 생존율을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 폐에서 CT26-HER-2 종양을 가지는 마우스를 MVA-BN-HER2, 항-PD-1, 및 항-LAG-3에 의해 4일 및 18일에 치료하였다.
도 15. MVA-BN-HER2, 항-PD-1 및 항-LAG-3 항체에 의해 치료된 마우스의 HER2 특이적 T 세포 반응이 삼중 복합제 치료제에 의해 더 높다는 것을 나타낸다. 마우스를 1일에 고형 CT26-HER-2 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-HER2, 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 4일 및 18일에 치료하고, IFN-γ를 마지막 치료 4주 후 ELISPOT에 의해 측정하였다. 종양 비함유 마우스로부터의 비장세포를 HER-2 ECD 중첩 펩타이드 라이브러리(A, 166 중첩 15합체) 또는 Kd 결합 HER-2 펩타이드 p63(B)에 의해 재자극하였다.
도 16. 성장하는 CT26-HER-2 종양이 모든 치료 그룹 중에서 유사한 HER2 특이적 항체를 유도하는 것을 나타낸다. 마우스를 1일에 고형 CT26-HER-2 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-HER2, 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 4일 및 18일에 치료하였다. 혈청을 25일에 마우스로부터 수집하고, HER-2 역가를 ELISA에 의해 측정하였다.
도 17. MVA-BN-CV301 및 항-PD-1이 종양 성장을 느리게 한다는 것을 나타낸다. 마우스를 MC38-CEA 고형 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-CV301 및 항-PD-1에 의해 1일 및 15일에 치료하였다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 18. MVA-BN-CV301 및 항-LAG-3의 투여 후 종양 용적을 나타낸다. 마우스를 MC38-CEA 고형 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-CV301 및 항-LAG-3에 의해 1일 및 15일에 치료하였다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 19. 항-PD-1 및 항-LAG-3과 조합된 MVA-BN-CV301의 투여 후 종양 용적을 나타낸다. 마우스를 MC38-CEA 고형 종양에 의해 이식하고, MVA-BN-CV301, 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 1일 및 15일에 치료하였다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 20. 프로스트박(PROSTVAC) 및 항-PD-1의 투여 후 종양 용적을 나타낸다. 마우스를 E6(RM11-PSA) 고형 종양에 의해 이식하고, 프로스트박-V에 의해 1일에 치료하고, 프로스트박-F에 의해 8일 및 15일에 치료하였다. 항-PD-1은 1일 및 15일에 주어졌다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 21. 프로스트박 및 항-LAG-3의 투여 후 종양 용적을 나타낸다. 마우스를 E6(RM11-PSA) 고형 종양에 의해 이식하고, 프로스트박-V에 의해 1일에 치료하고, 프로스트박-F에 의해 8일 및 15일에 치료하였다. 항-LAG-3은 1일 및 15일에 주어졌다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 22. 프로스트박, 항-PD-1 및 항-LAG-3의 투여 후 종양 용적을 나타낸다. 마우스를 E6(RM11-PSA) 고형 종양에 의해 이식하고, 프로스트박-V에 의해 1일에 치료하고, 프로스트박-F에 의해 8일 및 15일에 치료하였다. 항-PD-1 및 항-LAG-3은 1일 및 15일에 주어졌다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 마우스에서의 개별 종양 성장.
도 23. CV301 및 항-PD-1의 투여 후 종양 용적을 나타낸다. CEA 형질전환 마우스를 MC38-CEA 고형 종양에 의해 이식하고, CV301-V에 의해 4일에 치료하고, CV301-F에 의해 11일 및 18일에 치료하였다. 계두 GM-CSF(CV301-V/F와 혼합됨) 및 항-PD-1은 4일, 11일 및 18일에 주어졌다. A) 마우스에서의 평균 종양 용적. B) 마우스에서의 개별 종양 성장.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 파상풍 독소로부터 유래한 2개의 TH-세포 에피토프를 포함하는 HER2 단백질을 코딩하는 작제물의 뉴클레오타이드 서열이다.
서열 번호 2는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 변형 HER2 단백질의 아미노산 서열이다.
다수의 현재의 임상 실험은 백시니아, 변형된 백시니아 안카라(MVA), 및 하나 이상의 종양 연관 항원(tumor-associated antigen: TAA)을 발현하기 위해 조작된 계두 기반 벡터를 사용하는 치료제를 포함한다. 이 벡터는 다양한 암에 대해 능동 면역 반응을 생성하기 위해 단독으로 또는 프라임-부스트(prime-boost) 전략에서 사용된다. 프로스트박(등록상표)은 PSA 및 트리콤(상표명)을 발현하는 백시니아 및 계두를 사용한 이종 프라임-부스트 전략을 이용하고, 현재 거세 저항성 전이 전립선암에 대해 전세계 III상 임상 실험(PROSPECT)에 있다.
MVA-BN-HER2(Mandl et al, 2012)는 HER-2+-유방암의 치료를 위한 I상 임상 실험이다. 이 재조합 벡터는 MVA-BN으로 공지된 매우 약독화된 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 스톡으로부터 유래한다. 이것은 HER-2에 대해 효과적인 면역 반응의 유도를 수월하게 하기 위해 파상풍 독소로부터의 2개의 보편적 T 세포 에피토프(TTp2 및 TTp30)를 포함하도록 조작된 HER-2의 세포외 도메인으로 이루어진 HER-2의 변형 형태(HER2로 지칭)를 발현한다.
폭스바이러스 기반 면역치료제의 항종양 효율을 추가로 증대시키기 위해, MVA-BN-HER2는 T 세포 활성화를 하향 조절하는 면역 관문 단백질인 CTLA-4의 활성을 차단하는 단일클론 항체와 조합된다. CT26-HER-2 실험적 폐 전이 모델에서, 중앙 생존 시간은 비치료 마우스에서 30일로부터 MVA-BN-HER2 치료에 의해 49.5일로 증가하지만, 항-CTLA-4 치료제는 그 자체로 아주 적은 생존 이익을 나타낸다(중앙 생존 35일). 반대로, 항-CTLA-4와 조합된 MVA-BN-HER2는 마우스의 50% 초과에서 생존을 100일 초과로 상당히 증가시켰다(p<0.0001). 100일에, 생존 마우스의 폐를 검사하고, 종양이 가시적이지 않다. 별개의 실험에서, 표현형 분석을 수행하였다. MVA-BN-HER2 치료제는 나이브 마우스의 폐에서 CD8+ T 세포에서 유도성 동시자극 분자(ICOS)를 극적으로 증가시켰다(종양 무). 25일에 종양 보유 마우스에서, 비치료 및 항-CTLA-4 치료 마우스의 폐에서 조절 T 세포(CD4+FoxP3+)의 수가 증가하였고, 이것은 폐 종양 부담의 증가와 상관되었다. 조절 T 세포는 ICOS에 양성이었다. MVA-BN-HER2에 의해 치료된 마우스는 FoxP3 음성인 ICOS+ CD4+ T 세포가 증가하였다.
MVA-BN-HER2를 다양한 종양 모델에서 PD-1, LAG-3 및 ICOS에 지향된 다양한 효현제 및 길항제 항체와 조합하여 시험하였다. 조합은 MVA-BN-HER2의 효과를 증대시키는 것으로 밝혀졌다.
부가적으로, PD-1 및 LAG-3에 대해 지향된 다양한 길항제 항체를 재조합 오소폭스바이러스 및 재조합 조류폭스바이러스를 사용하는 비상동성-프라임 부스트 투약 섭생과 조합하여 시험하였다. 예를 들어, PSA 및 트리콤을 각각 발현하는 백시니아 바이러스 및 계두바이러스를 포함하는 프로스트박(등록상표)을 다양한 길항제 항체와 조합하여 시험하였다. CEA, MUC-1 및 트리콤을 각각 발현하는 백시니아 바이러스 및 계두바이러스를 포함하는 CV301(PANVAC로서도 공지됨)을 또한 다양한 길항제 항체와 조합하여 시험하였다. 이종 프라임-부스트 투약 섭생의 유효성은 다양한 길항제 항체와 조합되어 투여될 때 증가하였다.
PD-1 및 LAG-3에 지향된 다양한 길항제 항체를 MVA-CV301의 동종 프라임-부스트 섭생에서 부가적으로 시험하였다. CEA, MUC-1 및 트리콤을 발현하는 MVA 바이러스의 프라임 및 부스팅을 포함하는 MVA-CV301의 유효성은 PD-1 및/또는 LAG-3에 지향된 항체와 조합되어 시험될 때 개선되는 것으로 밝혀졌다.
종양 항원을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스
다양한 양상에서, 본 개시내용은 종양 항원을 각각 코딩하고/하거나 발현하는 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 재조합 조류폭스바이러스를 포함한다. 하나 이상의 바람직한 양상에서, 오소폭스바이러스 및 조류폭스바이러스는 각각 백시니아 바이러스 및 계두바이러스이다.
용어 "조류폭스바이러스"는 임의의 조류폭스바이러스, 예컨대 계두바이러스, 카나리아 두창 바이러스(Canarypoxvirus), 운코폭스바이러스(Uncopoxvirus), 흰찌르레기폭스바이러스(Mynahpoxvirus), 비둘기폭스바이러스(Pigeonpoxvirus), 앵무새폭스바이러스(Psittacinepoxvirus), 메추라기폭스바이러스(Quailpoxvirus), 공작폭스바이러스(Peacockpoxvirus), 펭귄폭스바이러스(Penguinpoxvirus), 참새폭스바이러스(Sparrowpoxvirus), 찌르레기폭스바이러스(Starlingpoxvirus) 및 터키폭스바이러스(Turkeypoxvirus)를 의미한다. 바람직한 조류폭스바이러스는 카나리아 두창 바이러스 및 계두바이러스이다.
카나리아 두창 바이러스의 예는 균주 렌츨러(Rentschler)이다. ALVAC라 칭하는 플라크 정제된 카나리아 두창 균주(미국 특허 제5,766,598호)는 미국 균주 은행(American Type Culture Collection: ATCC)에 의해 부다페스트 조약의 조건 하에 수탁 번호 VR-2547로 수탁되었다. 또 다른 카나리아 두창 균주는 인스티튜트 메리유 인코포레이션(Institute Merieux, Inc)으로부터 이용 가능한, LF2 CEP 524 24 10 75로 지칭된, 상업용 카나리아 두창 백신 균주이다.
계두바이러스의 예는 균주 FP-1, FP-5, TROVAC(미국 특허 제5,766,598호) 및 POXVAC-TC(미국 특허 제7,410,644호)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. FP-1은 1일령 닭에서 백신으로 사용되도록 변형된 듀벳(Duvette) 균주이다. 균주는 O DCEP 25/CEP67/2309(1980년 10월)로 지정된 상업용 계두바이러스 백신 균주이고, 인스티튜트 메리유 인코포레이션으로부터 이용 가능하다. FP-5는 미국 과학 연구실(쉐링 코포레이션(Schering Corp.)의 부서)(위스콘신주 매디슨)(미국 수의 면허 165호, 제품 번호 30321)로부터 이용 가능한 닭 배아 기원의 상업용 계두바이러스 백신 균주이다.
하나 이상의 실시형태에서, 재조합 오소폭스바이러스는 바람직하게는 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 및 MVA-BN으로부터 선택된다.
백시니아 바이러스 균주의 예는 균주 헤븐 오프 템플(Temple of Heaven), 코펜하겐, 파리, 부다페스트, 다롄(Dairen), 괌(Gam), MRIVP, Per, 타슈켄트(Tashkent), TBK, Tom, 베른, 파트와단가(Patwadangar), BIEM, B-15, 리스터(Lister), EM-63, 뉴욕시 건강 협회(New York City Board of Health), 엘스트리(Elstree), 이케다(Ikeda) 및 WR을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 백시니아 바이러스(VV) 균주는 와이어쓰(DRYVAX) 균주(미국 특허 제7,410,644호)이다.
또 다른 바람직한 VV 균주는 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스이다(Sutter, G. et al. [1994],Vaccine 12: 1032-40). 본 발명의 실행에 유용하고, 부다페스트 조약의 요건에 따라 수탁된 MVA 바이러스 균주의 예는 유럽 동물 세포 배양 수집(European Collection of Animal Cell Cultures: ECACC), 백신 조사 및 제조 실험실(Vaccine Research and Production Laboratory), 공중 건강 실험실 서비스(Public Health Laboratory Service), 응용 미생물학 및 조사 센터(Centre for Applied Microbiology and Resear)(영국 윌트셔주 SP4 0JG 솔즈베리 포턴 다운)에서 1994년 1월 27일에 수탁 번호 ECACC 94012707로 수탁된 균주 MVA 572, 및 ECACC 00120707 하에 2000년 12월 7일에 수탁된 MVA 575를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유럽 세포 배양 수집(ECACC)에서 번호 V00083008 하에 2000년 8월 30일에 수탁된 MVA-BN, 및 이의 유도체는 부가적인 예시적인 균주이다.
MVA-BN이 이의 더 높은 안전성(덜 복제 형질전환)에 바람직하지만, 모든 MVA는 본 발명에 적합하다. 본 발명의 실시형태에 따라, MVA 균주는 MVA-BN 및 이의 유도체이다. MVA-BN 및 이의 유도체의 정의는 PCT/EP01/13628(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, MVA는 유럽 세포 배양 수집(ECACC)에서 번호 V00083008 하에 2000년 8월 30일에 수탁되고, 국제 PCT 공보 WO2002042480(또한 예를 들어 미국 특허 제6,761,893호 및 6,913,752호 참조)(이들 모두 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 MVA-BN이다. 이 특허 공보에 기재된 바대로, MVA-BN은 세포주 293, 143B, HeLa 및 HaCat에서 재생으로 복제되지 않는다. 특히, MVA-BN은 인간 배아 신장 세포주 293에서 0.05 내지 0.2의 증폭비를 나타낸다. 인간 골육종 세포주 143B에서, MVA-BN은 0.0 내지 0.6의 증폭비를 나타낸다. MVA-BN은 인간 자궁경부 선암 세포주 HeLa에서 0.04 내지 0.8의 증폭비를 나타내고, 인간 각질세포 세포주 HaCat에서 0.02 내지 0.8의 증폭비를 나타낸다. MVA-BN은 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(CV1: ATCC 번호 CCL-70)에서 0.01 내지 0.06의 증폭비를 가진다.
MVA-BN의 증폭비는 PCT 공보 WO2002042480(또한 예를 들어 미국 특허 제6,761,893호 및 제6,913,752호 참조)에 기재된 바대로 닭 배아 섬유아세포(CEF:1차 배양물)에서 1 초과이다. 바이러스는 500 초과의 비로 CEF 1차 배양물에서 쉽게 전파되고 증폭될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 재조합 MVA는 MVA-BN의 유도체이다. 이러한 "유도체"는 수탁 균주(ECACC 번호 V00083008)와 본질적으로 동일한 복제 특징을 나타내지만, 이의 게놈의 하나 이상의 부분에서 차이점을 나타내는 바이러스를 포함한다. 수탁 바이러스와 동일한 "복제 특징"을 가지는 바이러스는 CEF 세포 및 세포주, HeLa, HaCat 및 143B에서 수탁 균주와 유사한 증폭비로 복제하고; 예를 들어 AGR129 형질전환 마우스 모델에서 결정되는 바대로 생체내 유사한 복제 특징을 나타내는 바이러스이다.
소정의 실시형태에서, 오소폭스바이러스는 오소폭스바이러스에 이종인 부가적인 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 재조합 백시니아 바이러스이다. 소정의 이러한 실시형태에서, 이종 서열은 면역계에 의해 반응을 유도하는 에피토프를 코딩한다. 따라서, 소정의 실시형태에서, 재조합 오소폭스바이러스는 에피토프를 포함하는 단백질 또는 물질에 대해 백신접종하도록 사용된다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 오소폭스바이러스 및 조류폭스바이러스는 적어도 하나의 종양 연관 항원을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 종양 연관 항원은 단독으로 또는 조합하여(예를 들어, CEA 및 MUC-1 또는 PAP 및 PSA) HER-2, PSA, PAP, CEA 또는 MUC-1 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
추가의 실시형태에서, 종양 연관 항원은 하나 이상의 외래 TH 에피토프를 포함하도록 변형된다. 이러한 암 면역치료제는 비제한적인 예로 본 명세서에 기재되어 있고, "MVA-BN-mHER2"라 칭한다. 본 명세서에 기재된 바대로, MVA-BN-mHER2(이들로 제한되지 않음)를 포함하는 이러한 암 면역치료제는 암의 치료에 유용하다. 본 발명은 면역손상 환자를 포함하는 인간 및 다른 포유동물의 프라임/부스트 백신접종 섭생에서 이러한 물질의 사용을 허용하고; 체액 및 세포 면역 반응 둘 다를 유도하고, 예컨대 이미 존재하는 Th2 환경에서 Th1 면역 반응을 유도한다.
소정의 실시형태에서, 종양 관련 항원은 바이러스 게놈의 비필수 구역으로 삽입된 이종 핵산 서열에서 구현된다. 소정의 이 실시형태에서, 이종 핵산 서열은 PCT/EP96/02926에 기재된 바대로 MVA 게놈의 천연 발생 결실 부위에서 삽입된다. 폭스바이러스 게놈으로 이종 서열을 삽입하는 방법은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되고/되거나 승인된 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 부형제, 희석제 및/또는 안정화제를 포함한다. 이러한 첨가제는 예를 들어 물, 식염수, 글라이세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, 및 pH 완충 물질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 담체는 통상적으로 주로 서서히 대사된 분자, 예컨대 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 등이다.
백신의 제조의 경우, 오소폭스바이러스는 생리학적으로 허용되는 형태로 전환될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이러한 제조는 예를 들어 문헌[Stickl, H. et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)]에 기재된 바대로 천연두에 대한 백신접종에 사용되는 폭스바이러스 백신의 제조에서의 경험에 기초한다.
예시적인 제조는 하기와 같다. 정제된 바이러스는 10mM 트리스, 140mM NaCl(pH 7.4) 중에 제제화된 5x108TCID50/㎖의 역가로 -80℃에서 저장된다. 백신 샷의 제조를 위해, 예를 들어 바이러스의 102 내지 108개의 입자는 앰플, 바람직하게는 유리 앰플 내의 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재 하에 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 동결건조될 수 있다. 대안적으로, 백신 샷은 제제 중의 바이러스의 단계별 동결 건조에 의해 제조될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 제제는 부가적인 첨가제, 예컨대 만니톨, 덱스트란, 당, 글라이신, 락토스, 폴리비닐피롤리돈, 또는 생체내 투여에 적합한 다른 첨가제, 예컨대 항산화제 또는 불활성 가스, 안정화제 또는 재조합 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민)(이들로 제한되지 않음)을 함유한다. 앰플은 이후 몇 달 동안 적합한 온도, 예를 들어 4℃ 내지 실온에서 밀봉되고 저장될 수 있다. 그러나, 수요가 존재하지 않는 한, 앰플은 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도에서 저장된다.
백신접종 또는 치료제를 포함하는 다양한 실시형태에서, 동결건조물은 0.1 내지 0.5㎖의 수성 용액, 바람직하게는 생리학적 식염수 또는 트리스 완충제 중에 용해되고, 전신으로 또는 국소로, 즉 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 비강내, 피내, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 투여 경로에 의해 투여된다. 투여 방식, 용량 및 투여 수의 최적화는 당해 분야의 당업자의 기술 및 지식 내에 있다.
소정의 실시형태에서, 약독화 백시니아 바이러스 균주는 면역손상 동물, 예를 들어 SIV에 의해 감염된 원숭이(CD4<400/㎕의 혈액), 또는 면역손상 인간에서 면역 반응을 유도하는 데 유용하다. 용어 "면역손상"은 오직 불완전한 면역 반응을 나타내거나 감염 물질에 대한 방어의 효율이 감소한 개인의 면역계의 상태를 기술한다.
소정의 예시적인 종양 연관 항원
소정의 실시형태에서, 면역 반응은 세포 연관 폴리펩타이드 항원에 대해 대상체에서 생성된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 세포 연관 폴리펩타이드 항원은 종양 연관 항원이다.
용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합 또는 변형 펩타이드 결합에 의해 서로에 연결된 2개 이상의 아미노산의 중합체를 의미한다. 아미노산은 천연 발생 및 비천연 발생이거나, 천연 발생 아미노산의 화학 유사체일 수 있다. 상기 용어는 단백질, 즉 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 기능적 생물분자를 또한 의미하고; 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함할 때, 이들은 착체를 형성할 수 있거나, 공유 연결되거나 비공유 연결될 수 있다. 단백질 내의 폴리펩타이드(들)는 글라이코실화 및/또는 리피드화되고/되거나, 보결 분자단을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바대로, 바람직하게는, 종양 연관 항원은, 단독의 또는 조합된(예를 들어, CEA와 MUC-1 또는 PAP와 PSA), HER-2, PSA, PAP, CEA 또는 MUC-1이다.
다수의 종양 연관 항원은 당해 분야에 공지되어 있다. 예시적인 종양 연관 항원은 5 알파 환원효소, 알파-태아단백질, AM-1, APC, 아프릴(April), BAGE, 베타-카테닌, Bcl12, bcr-abl, CA-125, CASP-8/FLICE, 카텝신, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33 CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55, CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, CGFR, EMBP, Dna78, 파네실 트랜스퍼라제, FGF8b, FGF8a, FLK-1/KDR, 엽산 수용체, G250, GAGE-패밀리, 가스트린 17, 가스트린 방출 호르몬, GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pmel17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, 헤파란, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT, IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA, LKLR-FUT, MAGE-패밀리, 맘마글로빈, MAP17, 멜란-A/MART-1, 메소텔린, MIC A/B, MT-MMPs, 뮤신, NY-ESO-1, 오스테오넥틴, p15, P170/MDR1, p53, p97/멜라노트랜스페린, PAI-1, PDGF, uPA, PRAME, 프로바신, 프로게니포이엔틴, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX-패밀리, STAT3, STn, TAG-72, TGF-알파, TGF-베타, 티모신-베타-15, TNF-알파, TRP-1, TRP-2, 티로시나제, VEGF, ZAG, p16INK4 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
바람직한 PSA 항원은 미국 특허 7,247,615호(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 바대로 155번 위치에서 류신으로의 아이소류신의 아미노산 변화를 포함한다.
하나 이상의 바람직한 CEA 항원은 미국 특허 제7,723,096호 및 PCT 출원 제PCT/US2004/037810호 및 제PCT/US2004/038643호(이들 모두 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 CEA 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
하나 이상의 바람직한 MUC-1 항원은 미국 특허 제7,118,738호 및 PCT 출원 제PCT/US2013/020058호, 제PCT/US2004/037810호 및 제PCT/US2004/038643호(이들 모두 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 MUC-1 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
또 다른 예시적인 종양 연관 항원은 HER-2이다. HER-2는 현재까지 c-erbB-1(EGFr), c-erbB-2(HER-2, c-Neu), c-erbB-3 및 c-erbB-4(Salomon et al, 1995)의 4개의 상이한 수용체로 이루어진 표피 성장 인자 수용체 패밀리(c-erbB)의 구성원이다. C-erbB-3 및 c-erbB-4는 EGFr 및 HER-2보다 덜 잘 규명된다. HER-2는 통합 막 당단백질이다. 성숙 단백질은 EGFr 수용체를 명확히 닮은 구조 특징을 가지는 185kD의 분자량을 가진다(Prigent et al, 1992). EGFr은 또한 1개의 하위단위로 이루어진 통합 막 수용체이다. 이것은 170kD의 겉보기 분자량을 가지고, 621개의 아미노산의 표면 리간드-결합 도메인, 23개의 아미노산의 단일 소수성 막관통 도메인 및 542개의 아미노산의 매우 보존된 세포질 타이로신 키나제 도메인으로 이루어진다. 단백질은 N-글라이코실화된다(Prigent et al, 1994).
이 패밀리 내의 모든 단백질은 타이로신 키나제이다. 리간드와의 상호작용은 수용체 이합체화를 발생시키고, 이것은 타이로신 키나제의 촉매 작용을 증가시킨다(Bernard. 1995, Chantry 1995). 패밀리 내의 단백질은 동종 및 이종 이합체화할 수 있고, 이것은 이들의 활성에 중요하다. EGFr은 성장 촉진 효과를 전달하고, 세포에 의한 글루코스 및 아미노산의 흡수를 자극한다(Prigent et al 1992). HER-2는 또한 성장 촉진 신호를 전달한다.
표피 성장 인자 수용체는 정상 조직에서 낮은 양으로 발현되지만, 이것은 많은 유형의 암에서 과발현된다. EGFr은 유방암(Earp et al, 1993, Eppenberger 1994), 신경교종(Schlegel et al, 1994), 위암(Tkunaga et al, 1995), 피부 편평 암종(Fujii 1995), 난소암(van Dam et al, 1994) 등에서 과발현된다. HER-2는 가장 특징적으로 분비 상피에서 아주 적은 정상 인간 조직에서 낮은 양으로 또한 발현된다. HER-2의 과발현은 유방, 위암, 췌장암, 방광암 및 난소암의 약 30%에서 발생한다.
이 수용체의 발현은 종양 및 암 유형의 분화의 정도에 따라 변하고, 예를 들어 유방암에서, 1차 종양은 수용체 둘 다를 과발현하는 반면; 위암에서, 과발현은 전이 종양에서 차후 단계에서 발생한다(Salomon et al, 1995). 암종 세포에서 과발현된 수용체의 수는 환자로부터 단리된 몇몇 두경부암, 외음부암, 유방암 및 난소암 세포주에 대해 106/세포보다 크다(Dean et al, 1994).
수용체의 EGFr 패밀리가 종양 면역치료제에 대한 적합한 표적을 구성하는 몇몇 이유가 존재한다. 처음에, 이들은 종양에 대해 면역 반응을 지시해야 하는 많은 유형의 암에서 과발현된다. 둘째로, 종양은 대개 수용체의 이 패밀리에 대해 리간드를 발현하거나 과발현하고, 몇몇은 리간드에 의해 매개된 증식성 효과에 과민성이다. 셋째로, 성장 인자 수용체를 과발현하는 종양을 가지는 환자는 대개 불량한 예후를 가진다. 과발현은 특히 유방암, 폐암 및 방광암에서 불량한 예후와 밀접히 연관되고, 종래의 치료제에 민감하지 않다기보다는 침윤/전이 표현형과 연관될 수 있다(Eccles et al, 1994).
종양 항원(또는 종양 관련 항원)을 코딩하는 핵산은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있는 것으로 고려된다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열은 연결되어서, 코딩 서열의 발현은 발현 제어 서열에 적합한 조건 하에 달성된다. 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서(enhancer), 전사 종결자, 단백질 코딩 오픈 리딩 프레임의 시작 시 시작 코돈, 인트론에 대한 스플라이싱 신호 및 인프레임 중지 코돈을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 프로모터는 SV40 초기 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 CMV 전초기 I 프로모터, 및 다양한 폭스바이러스 프로모터, 예컨대 하기 백시니아 바이러스 또는 MVA 유래 프로모터(이들로 제한되지 않음): ATI 프로모터, 30K 프로모터, I3 프로모터, PrS 프로모터, Pr7.5K, 40K 프로모터, PrSynIIm 프로모터, PrLE1 프로모터 및 PrSSL 프로모터(PCT 출원 PCT/EP2009/008459에 기재된 바와 같음)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
부가적인 발현 제어 서열은 리더 서열, 종결 코돈, 폴리아데닐화 신호, 및 원하는 숙주 시스템에서 원하는 재조합 단백질(예를 들어, HER-2, PSA, PAP, CEA 또는 MUC-1)을 코딩하는 핵산 서열의 적절한 전사 및 후속 번역에 필요한 임의의 다른 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 폭스바이러스 벡터는 원하는 숙주 시스템에서 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터의 전달 및 후속 복제에 필요한 부가적인 요소를 또한 함유할 수 있다. 당해 분야의 당업자에 의해 종래의 방법(Ausubel et al., (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley 및 Sons, New York, N.Y.)을 이용하여 이러한 벡터가 쉽게 작제되고 상업적으로 이용 가능한 것으로 추가로 이해될 것이다.
변형 종양 연관 항원
소정의 실시형태에서, 세포 연관 폴리펩타이드 항원은 변형되어서, APC의 표면에서 MHC 클래스 I 분자와 관련하여 제시될 때, CTL 반응은 표면에서 폴리펩타이드 항원으로부터 유래한 에피토프를 제시하는 세포에 대해 유도된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 적어도 하나의 제1 외래 TH 에피토프는, 제시될 때, APC의 표면에서 MHC 클래스 II 분자와 관련된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 세포 연관 항원은 종양 연관 항원(TAA)이다.
에피토프를 제시할 수 있는 예시적인 APC는 수지상 세포 및 대식세포를 포함한다. 부가적인 예시적인 APC는 임의의 음작용 또는 식균작용 APC를 포함하고, 이것은 1) MHC 클래스 I 분자에 결합된 CTL 에피토프 및 2) MHC 클래스 II 분자에 결합된 TH 에피토프를 동시에 제시할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 종양 연관 항원(TAA), 예컨대 CEA, MUC-1, PAP, PSA, HER2(이들로 제한되지 않음) 중 하나 이상에 대한 변형이 이루어져서, 대상체에 대한 투여 후, 다중클론 항체가 생성되고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 TAA 중 하나 이상과 주로 반응한다. 이러한 항체는 종양 세포를 공격하고 제거할 뿐만 아니라, 전이 세포가 전이로 발전하는 것을 막는다. 이 항종양 효과의 이팩터 기전은 보체 및 항체 의존 세포내 세포독성을 통해 매개될 것이다. 또한, 유도된 항체는 수용체의 성장 인자 의존적 올리고-이합체화 및 내재화의 저해를 통해 암 세포 성장을 또한 저해한다. 소정의 실시형태에서, 이러한 변형된 폴리펩타이드 항원은 종양 세포에 의해 디스플레이된 공지되고/되거나 예측된 TAA 에피토프에 지향된 CTL 반응을 유도한다.
소정의 실시형태에서, 변형된 TAA 폴리펩타이드 항원은 세포 연관 폴리펩타이드 항원의 CTL 에피토프 및 변이를 포함하고, 변이는 외래 TH 에피토프의 적어도 하나의 CTL 에피토프를 포함한다. 소정의 이러한 변형된 TAA는 비제한적인 일 예에서 외래 TH 에피토프의 적어도 하나의 CTL 에피토프 및 적어도 하나의 CTL 에피토프를 포함하는 변이를 포함하는 하나 이상의 변형 HER-2 폴리펩타이드 항원을 포함할 수 있다. 이를 제조하는 방법은 미국 특허 제7,005,498호 및 미국 특허 공보 제2004/0141958호 및 2006/0008465호에 기재되어 있다.
소정의 실시형태에서, 외래 TH 에피토프는 천연 발생 "무차별" T 세포 에피토프이다. 이러한 무차별 T 세포 에피토프는 동물 종 또는 동물 집단의 대부분의 개체에서 활성이다. 소정의 실시형태에서, 백신은 이러한 무차별 T 세포 에피토프를 포함한다. 소정의 이러한 실시형태에서, 무차별 T 세포 에피토프의 사용은 동일한 백신에서 매우 많은 수의 상이한 CTL 에피토프에 대한 수요를 감소시킨다. 예시적인 무차별 T 세포 에피토프는 P2 및 P30 에피토프(Panina-Bordignon et al., 1989), 디프테리아 독소, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 및 피. 팔시파룸(P. falciparum) CS 항원(이들로 제한되지 않음)을 포함하는 파상풍 독소로부터의 에피토프를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
부가적인 무차별 T 세포 에피토프는 상이한 HLA-DR에 의해 코딩된 대부분의 HLA-DR 분자에 결합할 수 있는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, WO 98/23635호(Frazer IH et al., assigned to The University of Queensland); 문헌[Southwood S et. al, 1998, J. Immunol. 160: 3363 3373; Sinigaglia F et al., 1988, Nature 336: 778 780; Rammensee HG et al., 1995, Immunogenetics 41: 4 178 228; Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med 178: 27 47; Hammer J et al., 1993, Cell 74: 197 203; 및 Falk K et al., 1994, Immunogenetics 39: 230 242]을 참조한다. 후자 문헌은 또한 HLA-DQ 및 -DP 리간드를 다룬다. 이 문헌에 기재된 모든 에피토프는, 이들과 공통 모티프를 공유하는 에피토프와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 후보 천연 에피토프로서 관련된다.
소정의 다른 실시형태에서, 무차별 T 세포 에피토프는 대부분의 일배체형에 결합할 수 있는 인공 T 세포 에피토프이다. 소정의 이러한 실시형태에서, 인공 T 세포 에피토프는 WO 95/07707 및 상응하는 논문[Alexander J et al., 1994, Immunity 1: 751 761]에 기재된 바대로 pan DR 에피토프 펩타이드("PADRE")이다.
mHER2
다양한 변형 HER-2 폴리펩타이드 항원 및 이를 제조하는 방법은 미국 특허 제7,005,498 및 미국 특허 공보 제2004/0141958 및 2006/0008465(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다. 이들 문헌은 HER-2 폴리펩타이드에서 상이한 위치에서 무차별 T 세포 에피토프를 포함하는 다양한 변형 HER-2 폴리펩타이드 항원을 기술한다.
인간 HER-2 서열은 오직 단백질의 1차 구조에 기초하여 다수의 도메인으로 분할될 수 있다. 이 도메인은 하기와 같다. 세포외 (수용체) 도메인은 1-654번 아미노산으로부터 연장되고, 하기와 같이 몇몇 하위도메인을 함유한다: 도메인 I(성숙 폴리펩타이드의 N 말단 도메인)는 1-173번 아미노산으로부터 연장되고; 도메인 II(시스테인 농후 도메인, 24개의 시스테인 잔기)는 174-323번 아미노산으로부터 연장되고; 도메인 III(상동성 EGF 수용체에서의 리간드 결합 도메인)은 324-483번 아미노산으로부터 연장되고; 도메인 IV(시스테인 농후 도메인, 20개의 시스테인 잔기)는 484-623번 아미노산으로부터 연장된다. 막관통 잔기는 654-675번 아미노산으로부터 연장된다. 세포내 (키나제) 도메인은 655-1235번 아미노산으로부터 연장되고, 타이로신 키나제 도메인(이것은 아미노산 655-1010번 아미노산으로부터 연장됨(코어 TK 도메인은 725-992번으로부터 연장됨)); 및 C 말단 도메인(이것은 아미노산 1011-1235번 아미노산으로부터 연장됨)을 함유한다.
P2 또는 P30 인간 T 헬퍼 에피토프에 의해 대체되는 HER-2의 아미노산 서열에서의 부위의 선택은 미국 특허 제7,005,498호 및 미국 특허 공보 제2004/0141958호 및 제2006/0008465호에 기재되어 있다. 요약하면, 하기 매개변수가 고려된다:
1. 공지되고 예측된 CTL 에피토프;
2. 관련 수용체(특히 EGFR)에 대한 상동성;
3. 시스테인 잔기의 보존;
4. 예측된 루프, α-헬릭스 및 β-시트 구조;
5. 가능한 N-글라이코실화 부위;
6. 노출되고 묻힌 아미노산 잔기의 예측;
7. 도메인 체계화.
CTL 에피토프는 도메인 I, 도메인 III, TM 도메인에서 및 TK 도메인에서 2개 또는 3개의 "핫 스판(hot spot)"에서 클러스터링되는 것으로 보인다. 미국 특허 제7,005,498호 및 미국 특허 공보 제2004/0141958호 및 제2006/0008465호에 기재된 바대로, 이들은 매우 보존되어야 한다.
다른 수용체와 높은 정도의 상동성을 가지는 구역은 HER-2의 "전체" 3원 구조, 및 이에 따라 항체 인식에 구조적으로 중요할 것이지만, 낮은 상동성을 가지는 구역은 가능하게는 결과로서 구조의 오직 국소 변경에 의해 교환될 수 있다.
시스테인 잔기는 대개 분자내 이황화 브릿지 형성에 관여하고, 따라서 3차 구조에 관여하고 변화되지 않아야 한다. 알파-헬릭스 또는 베타-시트 구조를 형성하는 것으로 예상된 구역이 단백질의 폴딩에 관여하는 것으로 생각되므로, 이 구역은 외래 에피토프의 삽입 점으로서 회피되어야 한다.
가능한 N-글라이코실화 부위는 단백질의 만노실화가 원하는 경우 보존되어야 한다.
분자에서 내부인 것으로 (소수성 특성에 의해) 예측된 구역은 바람직하게는 폴딩에 관여하는 것으로서 보존되어야 한다. 반대로, 용매 노출 구역은 모델 TH 에피토프 P2 및 P30의 삽입에 대한 후보 위치로서 작용할 수 있다.
마지막으로, 단백질의 도메인 체계화는 단백질 구조 및 기능에 대한 관련성으로 인해 고려되어야 한다.
미국 특허 제7,005,498호 및 미국 특허 공보 제2004/0141958호 및 제2006/0008465호에 기재된 바대로, 전략의 초점은 HER-2의 세포외 부분의 구조를 가능한 많이 보존해야 한다는 것인데, 왜냐하면 이것이 중화 항체에 대한 표적으로서 관련된 단백질의 일부이기 때문이다. 반대로, 암 세포의 표면에서 네이티브 막 결합 HER-2의 세포내 부분은 체액 면역계에 대해 접근 가능하지 않다.
HER-2의 다양한 도메인에서 삽입된 파상풍 독소의 P2 및 P30 에피토프를 사용한 다양한 예시적인 작제물은 미국 특허 제7,005,498호 및 미국 특허 공보 제2004/0141958호 및 제2006/0008465호에 제공되어 있다. "mHER2"라 칭하는 예시적인 일 변형 HER-2 폴리펩타이드 항원은 세포외 도메인 및 막관통 도메인의 9개의 아미노산; 변형 HER-2 폴리펩타이드의 273번 내지 287번 아미노산 잔기 사이의 도메인 II에 삽입된 P2 에피토프; 및 변형 HER-2 폴리펩타이드의 655번 내지 675번 아미노산 잔기 사이의 도메인 IV에 삽입된 P30 에피토프를 포함한다.
재조합 MVA-BN-mHER2
비제한적인 실시형태에서, MVA-BN-mHER2와 같은 종양 연관 항원을 포함하는 재조합 MVA는 하기와 같이 작제된다. 초기 바이러스 스톡을 복제에 허용되는 세포 유형, 예를 들어 CEF 세포를 사용하여 세포 배양물에서 재조합에 의해 생성한다. 세포를 둘 다 약독화 백시니아 바이러스, 예를 들어 MVA-BN에 의해 접종하고, 종양 연관 항원, 예를 들어 바이러스 게놈의 mHER2, 서열 및 플랭킹 구역을 코딩하는 재조합 플라스미드(예를 들어, pBN279)에 의해 형질감염시킨다. 비제한적인 일 실시형태에서, 플라스미드 pBN279는 MVA-BN에 또한 존재하는 서열을 함유한다(ORF 64와 65 사이의 플랭킹 유전자간 구역, IGR 64/65). mHER2 서열을 MVA-BN 서열 사이에 삽입하여 MVA-BN 바이러스 게놈으로의 재조합을 허용한다. 소정의 실시형태에서, 플라스미드는 하나 이상의 선택 유전자를 포함하는 선택 카세트를 또한 함유하여 CEF 세포에서 재조합 작제물의 선택을 허용한다. 바람직한 실시형태에서, 재조합 MVA는 서열 번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
배양물의 동시 감염 및 형질감염은 바이러스 게놈과 재조합 플라스미드 사이에 상동성 재조합을 허용한다. 삽입체 보유 바이러스를 이후 단리하고, 규명하고, 바이러스 스톡을 제조한다. 소정의 실시형태에서, 바이러스를 선택의 부재 하에 CEF 세포 배양물에서 계대배양하여, GPT 및 mRFP1인 선택 유전자를 코딩하는 구역의 손실을 허용한다.
PD-1 및 LAG-3의 길항제
소정의 실시형태에서, 본 발명은 PD-1 및 LAG-3의 길항제를 포함한다. PD-1 및 LAG-3의 길항제는 각각 PD-1 및 LAG-3을 간섭한다.
이러한 길항제는 PD-1 또는 LAG-3에 특이적으로 결합하고 PD-1 또는 LAG-3 생물학적 활성을 저해하는 항체; PD-1 또는 LAG-3의 발현을 간섭하는 안티센스 핵산 RNA; PD-1, LAG-3의 발현을 간섭하는 작은 간섭 RNA; 및 PD-1 또는 LAG-3의 소분자 저해제를 포함한다.
PD-1 또는 LAG-3의 후보 길항제는 당해 분야에 공지되고/되거나 본원에 개시된 다양한 기법에 의해 기능, 예컨대 실험실내 또는 마우스 모델에서 PD-1 또는 LAG-3 기능에 의해 저해를 간섭하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
ICOS의 효현제
본 발명은 ICOS의 효현제를 추가로 포함한다. ICOS의 효현제는 ICOS를 활성화한다. 일 실시형태에서, 효현제는 ICOS 천연 리간드인 ICOS-L이다. 효현제는 결합 및 활성화 특성을 보유하는 ICOS-L의 돌연변이 형태일 수 있다. ICOS-L의 돌연변이 형태는 실험실내 ICOS를 자극하는 데 있어서 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
바람직하게는, ICOS의 효현제는 항체이다.
항체
일 실시형태에서, PD-1 또는 LAG-3의 길항제 또는 ICOS의 효현제는 항체이다. 항체는 합성, 단일클론 또는 다중클론일 수 있고, 당해 분야에 널리 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 항체는 (비특이적 결합과 반대로) 항체의 항원 결합 부위를 통해 PD-1, LAG-3 또는 ICOS에 특이적으로 결합한다. PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드, 단편, 변이체, 융합 단백질 등은 이것과 면역반응성인 항체를 생성하는 데 있어서 면역원으로서 사용될 수 있다. 더 구체적으로, 폴리펩타이드, 단편, 변이체, 융합 단백질 등은 항체의 형성을 발생시키는 항원 결정부위 또는 에피토프를 함유한다.
이 항원 결정부위 또는 에피토프는 선형 또는 입체구성적(불연속)일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드의 아미노산의 단일 구획으로 이루어지는 반면, 입체구성 또는 불연속 에피토프는 단백질 폴딩 시 매우 근접한 폴리펩타이드 사슬의 상이한 구역으로부터의 아미노산 구획으로 이루어진다(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)). 폴딩된 단백질이 복잡한 표면을 가지므로, 이용 가능한 에피토프의 수는 쾌 다수이지만; 단백질의 입체구성 및 입체 장애로 인해, 에피토프에 실제로 결합하는 항체의 수는 이용 가능한 에피토프의 수보다 적다(C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)). 에피토프는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 동정될 수 있다.
PD-1, LAG-3 또는 ICOS에 특이적으로 결합하고, 기능을 차단("길항제 항체")하거나, 기능을 활성화(효현제 항체)하는 scFV 단편을 포함하는 항체가 본 발명에 의해 포함된다. 이러한 항체는 종래의 수단에 의해 생성될 수 있다.
본 발명은 기능을 차단("길항제 항체")하거나, 기능을 활성화(효현제 항체)하는 PD-1, LAG-3 또는 ICOS에 대한 단일클론 항체를 포함한다. PD-1, LAG-3 및 ICOS에 대한 예시적인 차단 단일클론 항체는 WO 2012/131004 및 WO 2011/041613(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
항체는 높은 결합도 및 특이성 둘 다로 이의 표적에 결합할 수 있다. 이것은 비교적 큰 분자(약 150kDa)이고, 항체 결합 부위가 단백질-단백질 상호작용 부위에 근접하게 있을 때, 2개의 단백질(예를 들어, PD-1, LAG-3 또는 ICOS 및 이의 표적 리간드) 사이의 상호작용을 입체적으로 저해할 수 있다. 본 발명은 PD-1, LAG-3 또는 ICOS-리간드 결합 부위에 매우 근접하게 에피토프에 결합하는 항체를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 발명은 분자간 상호작용(예를 들어, 단백질-단백질 상호작용)을 간섭하는 항체, 및 분자내 상호작용(예를 들어, 분자 내의 입체구성 변화)을 방해하는 항체를 포함한다. 항체는 PD-1 또는 LAG-3의 생물학적 활성, 또는 리간드에 대한 PD-1 또는 LAG-3의 결합을 차단하는 능력에 대해 및/또는 다른 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 효현제 항체는 ICOS의 생물학적 활성을 활성화하는 능력에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다.
다중클론 및 단일클론 항체는 둘 다 종래의 기법에 의해 제조될 수 있다.
PD-1, LAG-3 및 ICOS, 및 PD-1, LAG-3 및 ICOS의 아미노산 서열에 기초한 펩타이드는 PD-1, LAG-3 또는 ICOS에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "항체"는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 이들의 단편, 예컨대 F(ab')2 및 Fab 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 단일-도메인 항체 단편(VHH 또는 나노바디), 2가 항체 단편(다이바디), 및 임의의 재조합으로 및 합성으로 생성된 결합 파트너를 포함하도록 의도된다.
항체는 약 107M-1 이상의 Ka로 PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드에 결합하는 경우 특이적으로 결합한다고 정의된다. 결합 파트너 또는 항체의 친화도는 종래의 기법, 예를 들어 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)]에 기재된 것을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
다중클론 항체는 당해 분야에 널리 공지된 절차를 이용하여 다양한 공급원, 예를 들어 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스 또는 래트로부터 용이하게 생성될 수 있다. 일반적으로, 정제된 PD-1, LAG-3 또는 ICOS, 또는 적절히 접합된 PD-1, LAG-3 또는 ICOS의 아미노산 서열에 기초한 펩타이드를 통상적으로 비경구 주사를 통해 숙주 동물에게 투여한다. PD-1, LAG-3 또는 ICOS의 면역원성은 부형제, 예를 들어 프로인트 완전 또는 불완전 부형제의 사용을 통해 증대될 수 있다. 부스터 면역화 이후, 혈청의 작은 샘플을 수집하고, PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드에 대한 반응성에 대해 시험한다. 이러한 결정에 유용한 다양한 검정의 예는 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]에 기재된 것; 및 향류 면역전기영동(countercurrent immuno-electrophoresis: CIEP), 방사선면역검정, 방사선면역침전, 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assays: ELISA), 도트 블롯 검정 및 샌드위치 검정과 같은 절차를 포함한다. 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호를 참조한다.
단일클론 항체는 널리 공지된 절차를 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 RE 제32,011호, 제4,902,614, 4,543,439호 및 제4,411,993호; 문헌[Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, and Bechtol (eds.), 1980]에 기재된 절차를 참조한다.
예를 들어, 숙주 동물, 예컨대 마우스를 임의로 부형제의 존재 하에 단리되고 정제된 PD-1, LAG-3 또는 ICOS, 또는 접합된 PD-1, LAG-3 또는 ICOS 펩타이드에 의해 적어도 1회 및 바람직하게는 약 3주 간격으로 적어도 2회 복강내 주사할 수 있다. 어느 동물이 가장 융합하는지를 결정하기 위해 마우스 혈청을 이후 종래의 도트 블롯 기법 또는 항체 포획(antibody capture: ABC)에 의해 평가하였다. 대략 2주 내지 3주 후, 마우스에 PD-1, LAG-3 또는 ICOS, 또는 접합된 PD-1, LAG-3 또는 ICOS 펩타이드의 정맥내 부스트를 제공한다. 마우스를 이후 희생시키고, 비장 세포를 확립 프로토콜에 따라 상업적으로 구입 가능한 골수종 세포, 예컨대 Ag8.653(ATCC)과 융합한다. 간단히 말하면, 골수종 세포를 배지 중에 수회 세척하고, 약 3개의 비장 세포 대 1개의 골수종 세포의 비율로 마우스 비장 세포에 융합한다. 융합제는 당해 분야에 사용되는 임의의 적합한 물질, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)일 수 있다. 융합체는 융합된 세포의 선택적 성장을 허용하는 배지를 함유하는 플레이트로 도말된다. 이후, 융합된 세포가 대략 8일 동안 성장하게 허용할 수 있다. 생성된 하이브리도마로부터의 상청액을 수집하고, 염소 항-마우스 Ig에 의해 우선 코팅된 플레이트에 첨가한다. 세척 이후, 라벨, 예컨대 표지된 PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드를 각각의 웰에 첨가하고 이후 항온처리한다. 양성 웰을 후속하여 검출할 수 있다. 양성 클론은 벌크 배양물에서 성장할 수 있고, 상청액을 후속하여 단백질 A 칼럼(파마시아(Pharmacia))에 걸쳐 정제한다.
본 발명의 단일클론 항체는 대안적인 기법, 예컨대 문헌[Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)](본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 것을 이용하여 생성할 수 있다. 유사하게, 결합 파트너는 특이적 결합 항체를 코딩하는 유전자의 가변 구역을 도입하기 위해 재조합 DNA 기법을 이용하여 작제될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Larrick et al., Biotechnology, 7:394 (1989)]에 기재되어 있다.
종래의 기법에 의해 생성될 수 있는 이러한 항체의 항원 결합 단편은 또한 본 발명에 의해 포함된다. 이러한 단편의 예는 Fab 및 F(ab')2 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유전 조작 기법에 의해 생성된 항체 단편 및 유도체가 또한 제공된다.
본 발명의 단일클론 항체는 키메라 항체, 예를 들어 쥣과 단일클론 항체의 인간화 버전을 포함한다. 이러한 인간화 항체는 공지된 기법에 의해 제조될 수 있고, 항체가 인간에게 투여될 때 면역원성 감소의 이점을 제공한다. 일 실시형태에서, 인간화 단일클론 항체는 쥣과 항체의 가변 구역(또는 단지 이의 항원 결합 부위) 및 인간 항체로부터 유래한 불변 구역을 포함한다. 대안적으로, 인간화 항체 단편은 쥣과 단일클론 항체의 항원 결합 부위 및 인간 항체로부터 유래한 가변 구역 단편(항원 결합 부위가 결여)을 포함할 수 있다. 키메라의 및 추가의 조작된 단일클론 항체의 제조를 위한 절차는 문헌[Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989), 및 Winter and Harris (TIPS 14:139, May, 1993)]에 기재된 것을 포함한다. 형질전환으로 항체를 생성하는 절차는 GB 2,272,440, 미국 특허 제5,569,825호 및 제5,545,806호에서 발견될 수 있다.
유전 조작 방법에 의해 생성된 항체, 예컨대 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조될 수 있는, 인간 부분 및 비인간 부분 둘 다를 포함하는 키메라 및 인간화 단일클론 항체를 사용할 수 있다. 이러한 키메라 및 인간화 단일클론 항체는 당해 분야에 공지된 표준 DNA 기법을 이용하여, 예를 들어 로빈슨(Robinson) 등의 국제 공보 WO 제87/02671호; 아키라(Akira) 등의 유럽 특허 출원 제0184187호; 타니구치, 엠.(Taniguchi, M.)의 유럽 특허 출원 제0171496호; 모리슨 등의 유럽 특허 출원 제0173494호; 뉴베거(Neuberger) 등의 PCT 국제 공보 WO 제86/01533호; 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호; 카빌리 등의 유럽 특허 출원 제0125023호; 문헌[Better et al., Science 240:1041 1043, 1988; Liu et al., PNAS 84:3439 3443, 1987; Liu et al., J. Immunol. 139:3521 3526, 1987; Sun et al. PNAS 84:214 218, 1987; Nishimura et al., Canc. Res. 47:999 1005, 1987; Wood et al., Nature 314:446 449, 1985; 및 Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553 1559, 1988); Morrison, S. L., Science 229:1202 1207, 1985; Oi et al., BioTechniques 4:214, 1986; Winter의 미국 특허 제5,225,539호; Jones et al., Nature 321:552 525, 1986; Verhoeyan et al., Science 239:1534, 1988; 그리고 Beidler et al., J. Immunol. 141:4053 4060, 1988]에 기재된 방법을 이용하여 유전 조작에 의해 생성될 수 있다.
합성 및 반합성 항체와 관련하여, 이러한 용어는 항체 단편, 아이소타입 전환 항체, 인간화 항체(예를 들어, 마우스-인간, 인간-마우스), 하이브리드, 복수의 특이성을 가지는 항체, 및 완전 합성 항체 유사 분자(이들로 제한되지는 않음)를 포함하도록 의도된다.
치료학적 분야의 경우, 인간 일정한 및 가변 구역을 가지는 "인간" 단일클론 항체는 항체에 대한 환자의 면역 반응을 최소화하기 위해 대개 바람직하다. 이러한 항체는 인간 면역글로불린 유전자를 함유하는 형질전환 동물을 면역화함으로써 생성될 수 있다. 문헌[Jakobovits et al. Ann NY Acad Sci 764:525-535 (1995)]을 참조한다.
PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드에 대한 인간 단일클론 항체는 대상체의 림프구로부터 유래한 mRNA로부터 제조된 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 cDNA를 사용하여 조합 면역글로불린 라이브러리, 예컨대 Fab 파지 디스플레이 라이브러리 또는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 작제함으로써 또한 제조될 수 있다. 예를 들어, 맥카페르티(McCafferty) 등의 PCT 공보 WO 제92/01047호; 문헌[Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581 597; 및 Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725 734]을 참조한다. 또한, 항체 가변 구역의 조합 라이브러리는 공지된 인간 항체를 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, PD-1, LAG-3 또는 ICOS에 결합하는 것으로 공지된 인간 항체의 가변 구역은 예를 들어 무작위로 변경된 돌연변이유발된 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 돌연변이되어, 돌연변이된 가변 구역의 라이브러리를 생성할 수 있고, 이것은 이후 PD-1, LAG-3 또는 ICOS에 결합하는 것으로 스크리닝될 수 있다. 면역글로빈 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 구역 내의 무작위 돌연변이를 유도하는 방법, 무작위화된 중쇄 및 경쇄를 교차하여 짝짓기를 형성하는 방법 및 스크리닝 방법은 예를 들어 바바스(Barbas) 등의 PCT 공보 WO 96/07754; 문헌[Barbas et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4457 4461]에서 발견될 수 있다.
면역글로불린 라이브러리는 항체 디스플레이 라이브러리를 형성하기 위해 바람직하게는 섬질 파지로부터 유래한 디스플레이 패키지의 집단에 의해 발현될 수 있다. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위해 사용하기에 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들어 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 제5,223,409호; 강(Kang) 등의 PCT 공보 WO 제92/18619호; 도웨(Dower) 등의 PCT 공보 WO 제91/17271호; 윈터(Winter) 등의 PCT 공보 WO 제92/20791호; 마크랜드(Markland) 등의 PCT 공보 WO 제92/15679호; 브레이틀링(Breitling) 등의 PCT 공보 WO 제93/01288호; 맥카페르티 등의 PCT 공보 WO 제92/01047호; 가라드(Garrard) 등의 PCT 공보 WO 제92/09690호; 라드너 등의 PCT 공보 WO 제90/02809호; 문헌[Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370 1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81 85; Huse et al. (1989) Science 246:1275 1281; Griffths et al. (1993) supra; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889 896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624 628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576 3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133 4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978 7982]에 발견될 수 있다. 디스플레이 패키지(예를 들어, 섬질 파지)의 표면에서 디스플레이되면, 항체 라이브러리는 PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 발현하는 패키지를 확인하고 단리하기 위해 스크리닝된다. 바람직한 실시형태에서, 라이브러리의 1차 스크리닝은 부동화 PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드에 의한 패닝을 포함하고, 부동화 PD-1, LAG-3 또는 ICOS 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 발현하는 디스플레이 패키지가 선택된다.
종양 항원을 발현하는 재조합 오소폭스바이러스 , 및 PD -1, LAG -3 및 ICOS 의 효현제 /길항제와의 예시적인 병용 치료
적어도 하나의 양상에서, 본 발명은 각각 종양 항원을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스와 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 또는 길항제와의 조합을 이용하는 치료의 방법을 포함한다.
예시적인 일 실시형태에서, 종양 연관 항원 HER-2를 과발현하는 세포에 의해 매개된 암(예를 들어, 유방암)을 가지는 환자는 1) HER-2 항원을 코딩하는 하나 이상의 재조합 오소폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스(예를 들어, 와이어쓰 또는 MVA)의 조합 또는 2) HER-2 항원을 코딩하는 재조합 오소폭스바이러스 및 재조합 조류폭스바이러스(예를 들어, 계두바이러스, POXVAC-TC)의 조합에 의해 치료될 수 있고; 조합 1) 또는 2)는 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 및/또는 길항제와 투여된다. 바람직한 실시형태에서, MVA는 MVA-BN이다. 특히 바람직한 실시형태에서, MVA는 서열 번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
부가적인 예시적인 실시형태에서, 전립선암을 가지는 환자는 PSA 및/또는 PAP 항원을 코딩하는, 재조합 오소폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스(예를 들어, 와이어쓰 또는 MVA) 및 재조합 조류폭스바이러스(예를 들어, 계두바이러스, POXVAC-TC)와 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 또는 길항제의 조합에 의해 치료될 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 재조합 백시니아 바이러스 및 계두바이러스의 조합은 프로스트박(등록상표)(각각 PSA 및 트리콤을 발현하는, 백시니아 바이러스 및 계두바이러스)이고, 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 및/또는 길항제와 투여된다.
훨씬 부가적인 실시형태에서, 종양 연관 항원 CEA 및/또는 MUC-1을 과발현하는 세포에 의해 매개된 암을 가지는 환자는 각각 CEA 및 MUC-1 항원을 코딩하는, 재조합 오소폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스(예를 들어, 와이어쓰, MVA 또는 MVA-BN) 및 재조합 조류폭스바이러스(예를 들어, 계두바이러스, POXVAC-TC)와 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 또는 길항제의 조합에 의해 치료될 수 있다. CEA 및 MUC-1을 과발현하는 세포에 의해 매개된 암의 몇몇 비제한적인 예는 유방암, 결장직장암, 폐암, 위암, 췌장암, 방광암 및 난소암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 하나 이상의 바람직한 실시형태에서, 복합제 치료제는 CV301(CEA, MUC-1 및 트리콤을 각각 발현하는, 백시니아 바이러스 및 계두바이러스)을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 복합제 치료제는 CEA, MUC-1 및 트리콤을 각각 발현하는 MVA(또는 MVA-BN) 및 계두를 포함하는 이종 프라임-부스트인 MVA/계두-CV301을 포함한다.
훨씬 또 다른 실시형태에서, 종양 연관 항원 CEA 및/또는 MUC-1을 과발현하는 세포에 의해 매개된 암을 가지는 환자는 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 또는 길항제와 조합되어 CEA 및/또는 MUC-1 항원을 코딩하는 동종 프라임-부스트에 의해 치료될 수 있다. 2개 이상의 재조합 오소폭스바이러스가 백시니아 바이러스(예를 들어, 와이어쓰, MVA 또는 MVA-BN)일 수 있는 것으로 고려된다. CEA 및 MUC-1을 과발현하는 세포에 의해 매개된 암의 몇몇 비제한적인 예는 유방암, 결장직장암, 폐암, 위암, 췌장암, 방광암 및 난소암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 하나 이상의 바람직한 실시형태에서, 치료는 동종 프라임-부스트로서 투여되는, CEA, MUC-1 및 트리콤을 각각 발현하는, 2개 이상의 MVA(또는 MVA-BN) 바이러스를 포함하는 MVA-CV301일 수 있다.
재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스는 전신으로 또는 국소로, 즉 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 비강내, 피내, 방혈, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 방혈을 통한다. 더 바람직하게는, 투여는 피하 또는 근육내를 통한다. 일 실시형태에서, 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 105 내지 1010 TCID50이 환자에게 투여된다. 바람직하게는, 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 107 내지 1010 TCID50이 환자에게 투여된다. 더 바람직하게는, 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 108 내지 1010 TCID50이 환자에게 투여된다. 가장 바람직하게는, 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 108 내지 109 TCID50이 환자에게 투여된다.
상기 정의된 바대로 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 단일 투여에 의해 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스는 또한 제1 백신접종에 사용되고, 제1 백신접종에서 사용된 것과 동일한 또는 관련된 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스의 투여에 의해 제1 백신접종에서 생성된 면역 반응을 부스팅하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 조류폭스바이러스는 이종 프라임-부스트 섭생에서 또한 사용될 수 있고, 프라이밍 백신접종 중 하나 이상은 상기 정의된 바대로 오소폭스바이러스에 의해 수행되고, 부스팅 백신접종 중 하나 이상은 또 다른 유형의 백신, 예를 들어 본 명세서에 정의된 바와 같은 조류폭스바이러스 또는 또 다른 바이러스 백신, 단백질 또는 핵산 백신에 의해 수행된다.
암은 바람직하게는 유방암, 결장직장암, 폐암, 위암, 췌장암, 방광암, 전립선암 및 난소암을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
암 환자는 마우스 또는 래트를 포함하는 임의의 포유동물일 수 있다. 바람직하게는, 암 환자는 영장류, 가장 바람직하게는 인간이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 또는 길항제, 및 종양 항원을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 오소폭스바이러스는 동시에 투여된다. 복합제 치료제가 어느 치료 단독보다 우수하다.
바람직한 실시형태에서, 오소폭스바이러스는 효현제 및/또는 길항제 투여의 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 내의 투여이다. 오소폭스바이러스는 효현제 및/또는 길항제 전에 또는 후에 투여될 수 있다.
환자에게 투여되는 효현제 또는 길항제의 투약량은 통상적으로 환자의 체중의 0.1㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏이다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 투약량은 환자의 체중의 0.1㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏, 더 바람직하게는 환자의 체중의 1㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏, 가장 바람직하게는 환자의 체중의 3㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이다. 일반적으로, 인간 및 인간화 항체는 외래 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종으로부터의 항체보다 인간 신체 내에 더 긴 반감기를 가진다. 따라서, 인간 항체의 더 낮은 투약량 및 덜 빈번한 투여가 대개 가능하다.
효과적인 치료제에 필요한 활성 성분의 분량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태 및 투여된 다른 약제를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료 투약량은 안전성 및 효율을 최적화하기 위해 적정될 수 있다. 통상적으로, 실험실내 사용된 투약량은 활성 성분의 인시츄 투여에 유용한 양의 유용한 지도를 제공할 수 있다. 특정한 장애의 치료를 위한 유효량의 동물 시험은 인간 투약량의 추가의 예측 표시를 제공할 것이다. 다양한 고려가 예를 들어 문헌[Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Edition (1985), MacMillan Publishing Company, New York, 및 Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Edition, (1990) Mack Publishing Co, Easton Pa.]에 기재되어 있다. 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 비강, 이온영동 투여 등을 포함하는 투여 방법이 이 문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 제형에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 단위 제형은 고체 제형, 예컨대 산제, 정제, 환제, 캡슐, 및 드라제, 및 액체 제형, 예컨대 엘릭시르제, 시럽 및 현탁제를 포함한다. 활성 성분은 무균 액체 제형에서 비경구로 또한 투여될 수 있다. 젤라틴 캡슐은 활성 성분 및 비활성 성분으로서 분말화 담체, 예컨대 글루코스, 락토스, 수크로스, 만니톨, 전분, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 나트륨 사카린, 탈쿰, 탄산마그네슘 등을 함유한다. 바람직한 색상, 맛, 안정성, 완충 능력, 분산 또는 다른 공지된 바람직한 특징을 제공하기 위해 첨가될 수 있는 부가적인 비활성 성분의 예는 적색 산화철, 실리카 겔, 라우릴 황산 나트륨, 이산화티탄, 먹을 수 있는 화이트 잉크(white ink) 등이다. 유사한 희석제는 압축 정제를 만들기 위해 사용될 수 있다. 정제 및 캡슐 둘 다는 수시간에 걸친 약제의 연속 방출을 제공하기 위해 지속 방출 생성물로서 제조될 수 있다. 압축 정제는 당 코팅되거나 필름 코팅되거나(임의의 불쾌한 맛을 차폐하고, 대기로부터 정제를 보호하기 위해), 위장관에서의 선택적 붕괴에 대해 장용 코팅될 수 있다. 경구 투여에 대한 액체 제형은 환자 수용성을 증가시키기 위해 착색제 및 향료를 함유할 수 있다.
약제학적 제제 내의 본 발명의 조성물의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.1중량% 미만으로부터, 보통 적어도 약 2중량%에서 20중량% 내지 50중량% 이상만큼 변할 수 있고, 선택된 특정한 투여 방식에 따라 유체 용적, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다.
고체 조성물의 경우, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 탈쿰, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함하는 종래의 비독성 고체 담체를 사용할 수 있다. 경구 투여의 경우, 약제학적으로 허용되는 비독성 조성물은 임의의 보통 사용되는 부형제, 예컨대 이전에 수록된 담체, 및 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 조성물인 10 내지 95%, 더 바람직하게는 25% 내지 75%의 농도의 활성 성분을 도입함으로써 형성된다.
에어로졸 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 계면활성제 및 추진제와 함께 미세하게 분산된 형태로 공급된다. 본 발명의 조성물의 바람직한 백분율은 0.01 내지 20중량%, 바람직하게는 1 내지 10중량%이다. 계면활성제는 물론 비독성이고, 바람직하게는 추진제 중에 가용성이어야 한다. 대표적인 이러한 물질은 6개 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산, 예컨대 c-아프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산과 지방족 다가 알콜 또는 이의 환식 무수물의 에스터 또는 부분 에스터이다. 혼합 에스터, 예컨대 혼합 또는 천연 글라이세라이드를 사용할 수 있다. 계면활성제는 조성물 중 0.1 내지 20중량%, 바람직하게는 0.25 내지 5중량%를 구성할 수 있다. 조성물의 잔량은 보통 추진제이다. 담체는, 원하는 바대로, 비강내 전달을 위해 예를 들어 레시틴에서처럼 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 작제물은 부가적으로 당해 분야에 널리 공지된 기법에 의해 데포-유형 시스템, 캡슐화 형태 또는 임플란트에서 전달될 수 있다. 유사하게, 작제물은 관심 있는 조직의 펌프를 통해 전달될 수 있다.
임의의 상기 제제는 본 발명에 따라 치료 및 치료제에서 적절할 수 있되, 제제 내의 활성제는 제제에 의해 비활성화되지 않고, 제제는 생리학적으로 상용성이다.
치료학적 조성물 및 용도
본 발명은 추가로 종양 에피토프에 대한 면역학적 반응의 발생 또는 개선을 유도하거나 기여할 수 있는, 치료학적 조성물 또는 백신의 제조를 위한, 본 발명에 따른 오소폭스바이러스 벡터 및 조류폭스바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 따라서 약제 또는 백신으로서 유용한 바이러스 또는 벡터를 제공한다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 또는 길항제와 조합된 본 발명에 따른 재조합 오소폭스바이러스 벡터(예컨대 백시니아, MVA 또는 MVA-BN) 및/또는 재조합 조류폭스바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 재조합 오소폭스바이러스 벡터 및 재조합 조류폭스바이러스 벡터는 암의 치료를 위해 치료학적 조성물 또는 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 예방학적 및/또는 치료학적 백신접종 프로토콜에서, 종양의 치료를 위해 및 특히 항암 치료로서 사용하기 위한 조성물을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 암 환자, 예컨대 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 위암, 췌장암, 방광암 또는 난소암 환자(이들로 제한되지 않음)에 대한 투여 또는 이의 치료를 위한 조성물을 포함한다.
하나 이상의 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 암 환자, 특히 유방암 환자 또는 전립선암 환자에 대한 투여 또는 이의 치료를 위한 조성물의 용도를 포괄한다.
일 실시형태에서, 동시 또는 순차 투여를 위한 조성물은 본 발명에 따른 MVA 벡터 및 본 발명에 따른 하나 이상의 항체, 효현제 또는 길항제를 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 하나 이상의 면역자극/조절 분자를 부가적으로 또는 대안적으로 포함할 수 있다. 임의의 적합한 면역자극/조절 분자, 예컨대 인터류킨(IL)-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15Ra, IL-15/IL-15Ra-Fc, 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)-α, B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-2, LFA-3, CD70, CD-72, RANTES, G-CSF, GM-CSF, OX-40L, 41 BBL, 항-CTLA-4, IDO 저해제, 항-PDL1, 항-PD1, 및 이들의 조합을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 B7.1, ICAM-1 및 LFA-3(또한 트리콤이라 칭함)의 조합을 포함한다. 하나 이상의 면역자극/조절 분자는 하나 이상의 면역자극/조절 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 재조합 바이러스 벡터, 예컨대 폭스바이러스 벡터)의 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 면역자극/조절 분자(예를 들어, IL-12)는 키토산과 함께 또는 이것 없이 DNA 플라스미드의 형태로 투여될 수 있다.
더 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 종양 항원을 포함하는 것 이외에, 재조합 오소폭스바이러스 및/또는 재조합 조류폭스바이러스는 B7.1, ICAM-1 및/또는 LFA-3(또한 트리콤이라 칭함)의 조합을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
실시예
실시예 1
MVA - BN - mHER2의 작제
배양물의 동시 감염 및 형질감염은 바이러스 게놈과 재조합 플라스미드 사이에 상동성 재조합이 일어나게 하였다. 삽입체 보유 바이러스를 단리하고, 규명하고, 바이러스 스톡을 제조하였다.
플라스미드 pBN279는 MVA-BN에 또한 존재하는 서열을 함유한다(ORF 64와 65 사이의 유전자간 구역, IGR 64/65). mHER2 서열을 MVA-BN 서열 사이에 삽입하여, MVA-BN 바이러스 게놈으로 재조합시켰다. 따라서, 폭스바이러스 프로모터, 구체적으로 합성 백시니아 바이러스 프로모터(PrS)의 하류에서 mHER2 서열을 함유하는 플라스미드를 작제하였다. 플라스미드는 약물 내성 유전자(구아닌-잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제; EcoGPT)의 상류에 PrS 프로모터를 포함하고 단량체 적색 형광 단백질 1(monomeric Red Fluorescence Protein 1: mRFP1)의 상류에 PrS 프로모터를 포함하는 선택 카세트를 또한 함유하였다.
HER-2 서열을 p2 및 p30의 파상풍 독소 에피토프를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 첨가에 의해 변형시켜, 이것에 대한 면역 반응을 증가시켰다(mHER2). mHER2를 MVA-BN 게놈으로 삽입하고, 선택 카세트를 제거한 후, 바이러스 "삽입체 구역"은 (둘러싼 바이러스 리딩 프레임과 비교하여 반대 배향으로 도시된) 하기 구조를 가졌다:
PrS 프로모터 - mHER2 서열. 삽입체 구역을 박테리아 재조합 플라스미드 pBN279에서처럼 MVA-BN 유전자간 구역 서열 64/65에 의해 플랭킹하였다(플랭크 1(64) 및 플랭크 2(65)). 작제물의 뉴클레오타이드 서열이 이하에 표시되어 있다.
Figure pct00001
HER2 시작 및 중지 코돈은 볼드체로 표시되어 있다. 플랭킹 서열은 이탤릭체로 표시되어 있다. 플랭크 1(64): 451-1052, 밑줄 HER2: 3298-1247(볼드체), 시작: 3298-3296(볼드체 + 밑줄), 중지: 1249-1247(볼드체 + 밑줄), PrS 프로모터: 3442-3403(이탤릭체 + 밑줄), 플랭크 (65): 3463-4065(밑줄).
코딩된 mHER2 폴리펩타이드의 번역물이 이하에 표시되어 있다:
Figure pct00002
p2 및 p30 서열의 파상풍 독소 에피토프는 볼드체로 표시되어 있다.
CEF 배양물을 MVA-BN에 의해 접종하고, 또한 pBN279 플라스미드 DNA에 의해 형질감염시켰다. 결국, 이 세포 배양물로부터의 샘플을 선택 약물을 함유하는 배지 중에 CEF 배양물로 접종하고, mRFP1 발현 바이러스 클론을 플라크 정제에 의해 단리하였다. 선택 약물의 존재 하에 성장하고 mRFP1을 발현한 바이러스 스톡을 MVA-BN-mHER2라 칭했다. MVA-BN-mHER2의 생성 및 바이러스 스톡의 제조는 네(4) 회의 플라크 정제를 포함하는 아홉(9) 회의 순차 계대배양을 포함하였다.
MVA-BN-mHER2를 CEF 세포 배양물에서 선택 약물의 부재 하에 계대배양하였다. 선택 약물의 부재는 삽입된 서열로부터 선택 유전자, gpt 및 mRFP1 및 연관 프로모터를 코딩하는 구역(선택 카세트)을 손실시켰다. 선택 카세트를 손실시키는 재조합은 플랭크 1(F1) 구역 및 이 구역의 하위구획인 F1 반복부(F1 rpt)(플라스미드 pBN279에서 선택 카세트를 플랭킹함)에 의해 매개되었다. 이 중복된 서열은 재조합을 매개하도록 포함되었고, 이 재조합은 선택 카세트를 손실시켜, 64/65 유전자간 구역에서 삽입된 mHER2 서열이 오직 남았다.
선택 카세트가 결여된 플라크 정제된 바이러스를 제조하였다. 이러한 제조는 다섯(5) 회의 플라크 정제를 포함하는 열다섯(15) 회의 계대배양을 포함하였다.
MVA-BN-mHER2 스톡에서의 mHER2 서열의 존재 및 모 MVA-BN 바이러스의 부재를 PCR 분석에 의해 확인하였고, 네스티드 PCR을 이용하여 선택 카세트(gpt 및 mRFP1 유전자)의 부재를 검증하였다.
mHER2 단백질의 발현은 실험실내 MVA-BN-mHER2에 의해 접종된 세포에서 입증되었다.
실시예 2
MVA-BN-HER2 및 항체에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령, 약 20g)를 시몬센 레보라토리즈(Simonsen Laboratories)(캘리포니아주 길로이)로부터 구입하였다. 실험적 폐 전이 모델의 경우, 마우스를 300㎕의 DPBS 중의 5.0×104개의 CT26-HER-2 세포에 의해 i.v. 이식하여, 폐에서 종양을 형성하였다. 고형 종양 모델에서, 마우스를 100㎕의 DPBS 중의 1.0×105개의 CT26-HER-2 세포에 의해 등에서 i.d. 이식하였다. 종양을 1주 2회 측정하고, 종양 용적을 식에 따라 계산하였다: 종양 용적(㎣) = (길이×폭2)/2.
항-ICOS(클론 17G9), 항-CTLA-4(9D9), 항-PD-1(RMP1-14) 및 항-LAG-3(C9B7W)의 항체를 바이오 X 셀(Bio X Cell)(뉴햄프셔주 서부 레바논)로부터 구입하였다. 모든 항체를 도면 범례에 표시된 일자에 100㎕의 PBS 중에 마우스마다 200㎍으로 i.p. 주사하였다. 바이러스 치료의 경우, 마우스를 꼬리 방혈(tail scarification)(t.s., Bavarian Nordic[BN](독일 마르틴스리이트)에 의해 제조됨)을 통해 7.1㎕의 1.0×107 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하였다.
문헌[Mandl et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61:19-29]에 기재된 바대로, 혈청 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하고, IFN-γ를 ELISPOT에 의해 결정하였다. FACS 분석을 위해 전혈, 비장 및 폐를 수집하였다. 폐를 1-2㎜ 조각으로 절단하고, 10% FBS, 50U/㎖의 DNAse I 및 250U/㎖의 콜라게나제 I(Worthington Biochemical Corporation(뉴저지주 레이크우드))에 의해 DMEM 중에 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 폐, 비장세포 및 전혈로부터의 적혈구를 용해하고, 단일 세포 현탁액을 표준 프로토콜에 따라 바이오레전드(Biolegend)(캘리포니아주 샌 디에고)로부터 구입한 항체에 의해 염색하였다: CD3e(145-2c11 또는 500A2), CD4(RM4-5), CD8(53-6.7), CD278(ICOS, 7E.17G9), CD279(PD-1, 29F.1AA12) 및 CD223(LAG-3, C9B7W). 조절 T 세포를 제조업자(eBioscience, 캘리포니아주 샌 디에고)의 지시에 따라 FoxP3/전사 인자 염색 완충제 세트 및 FoxP3 항체(FJK-16s)를 사용하여 확인하였다.
윈도우용 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 6.01(그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 모든 통계 분석을 도면 범례에 기재된 바대로 수행하였다.
실시예 3
MVA - BN - HER2 치료는 CD8 + 및 CD4 + T 세포에서 ICOS를 증가시킨다
나이브 종양 비함유 마우스를 1일 또는 1일 및 15일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하였다. 각각의 시점에 3마리의 마우스로부터의 장기. 도 1에 도시된 바대로, MV-BN-mHER2에 의한 치료는 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 ICOS 발현을 증가시켰다.
실시예 4
MVA - BN - HER2에 의해 치료된 마우스에서 항- ICOS에 의한 항종양 반응의 유도.
Balb/c 마우스를 1E5 CT26-HER2 세포 i.d.에 의해 1일에 이식하였다. 마우스를 1일 및 15일에 꼬리 방혈(t.s.)에 의해 1E7 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하고, 1일, 4일, 8일, 11일, 15일, 18일, 22일 및 25일에 항-ICOS(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. ** p<0.01, **** p<0.0001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA. 도 2에 도시된 바대로, 종양 용적은 MVA-BN-mHER2 단독과 비교하여 MVA-BN-mHER2와 항-ICOS에 의해 상당히 감소하였다.
실시예 5
MVA-BN-HER2에 의해 치료된 마우스에서 항-CTLA-4에 의한 항종양 반응의 유도
CT26-HER-2 실험적 폐 전이 모델에서, 마우스를 1일에 5E4 CT26-HER-2 세포 i.v.에 의해 이식하여, 폐에서 종양을 형성하였다. 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. **** p<0.0001, 로그-랭크 시험. 도 3에 도시된 바대로, MVA-BN-mHER2 및 항-CTLA-4에 의한 치료는 전체 생존율을 증가시키는 데 있어서 효과적이었다.
실시예 6
MVA-BN-HER2는 25일에 폐 종양 부담을 상당히 감소시킨다
마우스를 1일에 5E4 CT26-HER-2 세포 i.v.에 의해 i.v. 이식하여, 폐에서 종양을 형성하였다. 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. A) 25일에, 마우스를 안락사시키고, 트리판 블루(Trypan Blue)에 의해 기도를 통해 관류시켰다. 폐를 제거하고, 과산화수소 중에 간단히 액침시키고 PBS 중에 세척하였다. 종양은 비치료 및 항-CTLA-4 치료 마우스에서 작은 덩어리로서 가시적이었다. MVA-BN-mHER2에 의해 치료된 마우스의 폐에서 종양이 가시적이지 않았다. 기준자는 1㎝이다. B) 25일에 폐 중량. **** p<0.0001, 듀넷의 다중 비교 시험에 의한 1방향 ANOVA. 결과가 도 4에 도시되어 있다.
실시예 7
폐 ICOS는 MVA-BN-HER2 치료 또는 폐 종양에 의해 증가한다
마우스를 1일에 5E4 CT26-HER-2 세포 i.v.에 의해 i.v. 이식하여, 폐에서 종양을 형성하였다. 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 각각의 시점에서의 3마리의 마우스로부터의 장기를 분석을 위해 혼주하였다(A 및 B). 데이터는 그룹(C 및 D)마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 평균±SEM으로서 표시된다. 도 5에 도시된 바대로, 폐 ICOS는 MVA-BN-mHER2에 의한 치료 시 증가하였다.
실시예 8
종양 보유 마우스에서, ICOS + CD4 + T 세포는 FoxP3 + 이다
마우스를 1일에 5E4 CT26-HER-2 세포 i.v.에 의해 i.v. 이식하여, 폐에서 종양을 형성하였다. 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 각각의 시점에서의 3마리의 마우스로부터의 장기를 분석을 위해 혼주하였다(A 및 B). 데이터는 그룹(C 및 D)마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 평균±SEM으로서 표시된다. 도 6에 도시된 바대로, ICOS 발현은 종양 보유 대조군 및 항-CTLA-4 치료 마우스에서 FoxP3+ Treg 및 FoxP3- Teff 세포 둘 다에서 증가하였고, 이 마우스에서 종양 부담이 높았다. ICOS는 MVA-BN-mHER2 치료 이후 FoxP3- Teff 세포에서만 증가하였고, 항-CTLA-4와의 조합 후 더 뚜렷하였다.
실시예 9
MVA - BN - HER2와 항- CTLA -4는 이팩터 대 조절 T 세포 비율을 증가시킨다
마우스를 1일에 5E4 CT26-HER-2 세포 i.v.에 의해 i.v. 이식하여, 폐에서 종양을 형성하였다. 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하고, 3일 및 17일에 항-CTLA-4(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 각각의 시점에서의 3마리의 마우스로부터의 장기를 분석을 위해 혼주하였다(A 및 B). 데이터는 그룹(C 및 D)마다 3-4마리의 마우스를 가지는 3회 독립 실험으로부터 평균±SEM으로서 표시된다. 도 7에 도시된 바대로, MVA-BN-mHER2 및 항-CTLA-4에 의한 치료는 종양 부위에서의 CD8 및 CD4 이팩터 대 조절 T 세포 비율 둘 다, 및 비장 및 혈액을 증가시켰다.
실시예 10
PD-1 발현은 MVA-BN-HER2 치료에 의해 증가한다
나이브 종양 비함유 마우스를 1일 또는 1일 및 15일에 MVA-BN-HER2(1E7 Inf.U., t.s.)에 의해 치료하였다. 각각의 시점에서의 3마리의 마우스로부터의 장기. 도 8에 도시된 바대로, MV-BN-mHER2에 의한 치료는 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 PD-1 발현을 증가시켰다.
실시예 11
MVA-BN-HER2 및 항-PD1에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
Balb/c 마우스를 1일에 1E5 CT26-HER-2 세포 i.d.에 의해 이식하였다. 마우스를 꼬리 방혈(t.s.)에 의해 1일 및 15일에 1E7 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하고, 1일 및 15일에 항-PD1(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. **** p<0.0001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA. 도 9에 도시된 바대로, 종양 용적은 항-PD-1 단독에 의한 치료와 비교하여 MVA-BN-mHER2와 항-PD1에 의해 상당히 감소하고, 생존율은 MVA-BN-mHER2 단독과 비교하여 상당히 증가하였다.
실시예 12
MVA-BN-HER2에 대한 LAG-3 면역 반응
나이브 종양 비함유 마우스를 1일 또는 1일 및 15일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하였다. 각각의 시점에서의 3마리의 마우스로부터의 장기. 도 10에, CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 LAG-3 발현이 도시되어 있다.
실시예 13
MVA-BN-HER2 및 항-LAG-3에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
Balb/c 마우스를 1일에 1E5 CT26-HER-2 세포 i.d.에 의해 이식하였다. 마우스를 꼬리 방혈(t.s.)에 의해 1일 및 15일에 1E7 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하고, 1일 및 15일에 항-LAG-3(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. **** p<0.0001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA. 도 11에 도시된 바대로, 항-LAG3과 조합된 MVA-BN-mHER2에 의한 치료는 MVA-BN-mHER2 단독 및 항-LAG3 단독과 비교하여 전체 생존율을 증가시켰다.
실시예 14
MVA - BN - HER2 및 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
Balb/c 마우스를 1일에 1E5 CT26-HER-2 세포 i.d.에 의해 이식하였다. 도 12에서, 마우스를 꼬리 방혈(t.s.)에 의해 1일 및 15일에 1E7 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하고, 1일 및 15일에 항-PD1 및 항-LAG-3(각각 200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 도 13에서, 마우스를 t.s.에 의해 4일 및 18일에 1E7 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하고, 4일 및 18일에 항-PD-1 및 항-LAG-3(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. **** p<0.0001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA. 도 12 및 도 13에 도시된 바대로, 항-PD1 및 항-LAG3 둘 다와 조합된 MVA-BN-mHER2에 의한 치료는 MVA-BN-mHER2 단독 및 항-PD1 및 항-LAG3 단독과 비교하여 종양 용적을 감소시키고(도 12A 및 도 13A), 전체 생존율을 증가시켰다(도 12B 및 도 13B).
실시예 15
MVA - BN - HER2 및 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
CT26-HER-2 실험적 폐 전이 모델에서, 마우스를 1일에 5E4 CT26-HER-2 세포 i.v.에 의해 이식하여, 폐에서 종양을 형성하였다. 마우스를 4일 및 18일에 MVA-BN-mHER2(1E7 Inf.U. t.s.)에 의해 치료하고, 4일 및 18일에 항-PD-1 및 항-LAG-3(각각 200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. * P<0.05, *** p<0.001, 로그-랭크 시험. 도 14에 도시된 바대로, 항-PD-1 및 항-LAG3과 조합된 MVA-BN-mHER2에 의한 치료는 항-PD1 및 항-LAG3 단독과 비교하여 전체 생존율을 증가시켰다.
실시예 16
ELISPOT MVA 반응
Balb/c 마우스를 1일에 1E5 CT26-HER-2 세포 i.d.에 의해 이식하였다. 마우스를 꼬리 방혈(t.s.)에 의해 4일 및 18일에 1E7 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하고, 4일 및 18일에 항-PD1 및 항-LAG-3(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 마지막 치료 4주 후, 특이적 T 세포 반응을 문헌[Mandl et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61:19-29]에 기재된 바대로 IFN-γ ELISPOT에 의해 결정하였다. 도 15에 도시된 바대로, 항-PD-1 및 항-LAG3과 조합된 MVA-BN-mHER2에 의한 치료는 항-PD1 및 항-LAG3 단독과 비교하여 종양 항원 특이적 IFN-γ 수준을 증가시켰다.
실시예 17
항체 역가
Balb/c 마우스를 1일에 1E5 CT26-HER-2 세포 i.d.에 의해 이식하였다. 마우스를 꼬리 방혈(t.s.)에 의해 4일 및 18일에 1E7 Inf.U. MVA-BN-mHER2에 의해 치료하고, 4일 및 18일에 항-PD1 및 항-LAG-3(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 혈청 항체 역가를 문헌[Mandl et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61:19-29]에 기재된 바대로 ELISA에 의해 결정하였다. 2. 결과는 도 16에 도시되어 있다.
실시예 18
MVA-BN-CV301 및 항-PD-1에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
암컷 C57/BL6 마우스(6 내지 8주령, 약 20g, 시몬센 레보라토리즈(캘리포니아주 길로이))를 1일에 MC38-CEA 세포(2×105, i.d. 등 옆구리에서)에 의해 이식하였다. 마우스를 1일 및 15일에 MVA-BN-CV301(1E7 Inf.U., s.c. 꼬리 바닥 위)에 의해 치료하였다. 마우스를 1일 및 15일에 항-PD-1(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 결과는 도 17에 도시되어 있다. * p<0.05, **** p<0.0001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA.
실시예 19
MVA-BN-CV301 및 항-LAG-3에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
암컷 C57BL/6 마우스(6 내지 8주령, 약 20g, 시몬센 레보라토리즈(캘리포니아주 길로이))를 1일에 MC38-CEA 세포(2×105, i.d. 등 옆구리에서)에 의해 이식하였다. 마우스를 1일 및 15일에 MVA-BN-CV301(1E7 Inf.U., s.c. 꼬리 바닥 위)에 의해 치료하였다. 마우스를 1일 및 15일에 항-LAG-3(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 결과는 도 18에 도시되어 있다. ** p<0.01, *** p<0.001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA.
실시예 20
MVA - BN -CV301 및 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
암컷 C57BL/6 마우스(6 내지 8주령, 약 20g, 시몬센 레보라토리즈(캘리포니아주 길로이))를 1일에 MC38-CEA 세포(2×105, i.d. 등 옆구리에서)에 의해 이식하였다. 마우스를 1일 및 15일에 MVA-BN-CV301(1E7 Inf.U., s.c. 꼬리 바닥 위)에 의해 치료하였다. 마우스를 1일 및 15일에 항-PD1 및 항-LAG-3(각각 200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. ** p<0.01, **** p<0.0001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA. 도 19에 도시된 바대로, MVA-BN CV301 및 항-PD1 및 항-LAG3의 복합제 치료제는 항-PD1 및 항-LAG3 단독 또는 MVA-BN-CV301 단독과 비교하여 종양 용적을 감소시켰다.
실시예 21
프로스트박 및 항-PD-1에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
수컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령, 약 20g, 시몬센 레보라토리즈(캘리포니아주 길로이))를 1일에 E6 세포(RM11-PSA, 1.5×105, i.d. 등 옆구리에서)에 의해 이식하였다. 마우스를 1일에 프로스트박-V(2E7 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하고, 8일 및 15일에 프로스트박-F(1E8 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하였다. 마우스를 1일 및 15일에 항-PD-1(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 치료의 결과는 도 20에 도시되어 있다.
실시예 22
프로스트박 및 항-LAG-3에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
수컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령, 약 20g, 시몬센 레보라토리즈(캘리포니아주 길로이))를 1일에 E6 세포(RM11-PSA, 1.5×105, i.d. 등 옆구리에서)에 의해 이식하였다. 마우스를 1일에 프로스트박-V(2E7 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하고, 8일 및 15일에 프로스트박-F(1E8 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하였다. 마우스를 1일 및 15일에 항-LAG-3(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 치료의 결과는 도 21에 도시되어 있다.
실시예 23
프로스트박 및 항-PD-1 및 항-LAG-3에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
수컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령, 약 20g, 시몬센 레보라토리즈(캘리포니아주 길로이))를 1일에 E6 세포(RM11-PSA, 1.5×105, i.d. 등 옆구리에서)에 의해 이식하였다. 마우스를 1일에 프로스트박-V(2E7 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하고, 8일 및 15일에 프로스트박-F(1E8 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하였다. 마우스를 1일 및 15일에 항-PD-1 및 항-LAG-3(각각 200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. 도 22에 도시된 바대로, 프로스트박과 항-PD-1 및 항-LAG-3의 복합제 치료제는 항-PD-1 및 항-LAG-3 단독 또는 프로스트박 단독과 비교하여 종양 용적을 감소시켰다.
실시예 24
PANVAC (CV301-V/F) 및 항-PD-1에 의해 치료된 마우스에서의 항종양 반응의 유도
인간 CEA에 대한 형질전환 암컷 C57/BL6 마우스((Tg(CEA)18/B6j, 시티오브호프 국립 의료 센터의 잭 쉬벨리(Jack Shively)로부터 받음, 또한 문헌[Clarke et a. Cancer Research, 58:1469ff., 1998] 참조)를 1일에 MC38-CEA 세포(3.0×105, i.d. 등 옆구리에서)에 의해 이식하였다. 마우스를 4일에 CV301-백시니아(CV301-V)(PANVAC-V로도 공지됨)(2E7 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하고, 11일 및 18일에 CV301-계두(CV-301-F)(PANVAC-F로도 공지됨)(1E8 Inf.U., s.c. 꼬리 아래에서)에 의해 치료하였다. CV301-V/F 치료제를 4일, 11일 및 18일에 계두 GM-CSF(1E7 Inf.U.)와 혼합하였다. 마우스를 4일, 11일 및 18일에 항-PD-1(200㎍, i.p.)에 의해 치료하였다. ** p<0.01, **** p<0.0001, 터키의 다중 비교 후시험에 의한 반복 측정 2방향 ANOVA. 도 23에 도시된 바대로, CV301-V/F와 항-PD-1의 복합제 치료제는 대조 마우스와 비교하여 종양 성장을 지연시켰다.
기재된 발명의 정신으로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성의 정확한 상세사항이 변경되거나 변형될 수 있다는 것이 명확할 것이다. 본 발명자들은 하기 청구범위의 사상 및 범위에 해당하는 모든 이러한 변형 및 변경을 청구한다.
SEQUENCE LISTING <110> BAVARIAN NORDIC A/S <120> COMBINATION THERAPY FOR TREATING CANCER WITH A POXVIRUS EXPRESSING A TUMOR ANTIGEN AND AN ANTAGONIST AND/OR AGONIST OF AN IMMUNE CHECKPOINT INHIBITOR <130> WO2015/069571 <140> PCT/US2014/063516 <141> 2014-10-31 <150> US 61/900,226 <151> 2013-11-05 <160> 2 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 4487 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of a construct encoding a modified HER2 protein including two epitopes derived from tetanus toxin <400> 1 aaaaaaataa taattaacca ataccaaccc caacaaccgg tattattagt tgatgtgact 60 gttttctcat cacttagaac agatttaaca atttctataa agtctgtcaa atcatcttcc 120 ggagacccca taaatacacc aaatatagcg gcgtacaact tatccattta tacattgaat 180 attggctttt ctttatcgct atcttcatca tattcatcat caatatcaac aagtcccaga 240 ttacgagcca gatcttcttc tacattttca gtcattgata cacgttcact atctccagag 300 agtccgataa cgttagccac cacttctcta tcaatgatta gtttcttgag tgcgaatgta 360 atttttgttt ccgttccgga tctatagaag acgataggtg tgataattgc cttggccaat 420 tgtctttctc ttttactgag tgattctagt tcaccttcta tagatctgag aatggatgat 480 tctccagtcg aaacatattc taccatggat ccgtttaatt tgttgatgaa gatggattca 540 tccttaaatg ttttctctgt aatagtttcc accgaaagac tatgcaaaga atttggaatg 600 cgttccttgt gcttaatgtt tccatagacg gcttctagaa gttgatacaa cataggacta 660 gccgcggtaa cttttatttt tagaaagtat ccatcgcttc tatcttgttt agatttattt 720 ttataaagtt tagtctctcc ttccaacata ataaaagtgg aagtcatttg actagataaa 780 ctatcagtaa gttttataga gatagacgaa caattagcgt attgagaagc atttagtgta 840 acgtattcga tacattttgc attagattta ctaatcgatt ttgcatactc tataacaccc 900 gcacaagtct gtagagaatc gctagatgca gtaggtcttg gtgaagtttc aactctcttc 960 ttgattacct tactcatgat taaacctaaa taattgtact ttgtaatata atgatatata 1020 ttttcacttt atctcatttg agaataaaaa tggaattcct gcagcccggg ggatccttaa 1080 ttaactgggt acccaaggcc ttgggtttgg gggatcctta attaactggg taccgggccc 1140 cccctcgagg tcgacggtat cgataagctt gatggccgcc actgtgctgg atatctgcag 1200 aattccacca cactggacta gtggatccga gctcggtacc aagcttctac agaatgccaa 1260 ccaccgcaga gacgatctcc aggtggctgg cgctcacctt gggcacgcgc agccagaagc 1320 tcacggtgaa gttgttgaag gacgtcagag ggctggctct ctgctcggcg gggcagccct 1380 tgtcatccag gtccacacag gagtgggtgc agttgatggg gcaaggctgg catgcgccct 1440 cctcatctgg aaacttccag atgggcatgt aggagaggtc aggtttcaca ccgctggggc 1500 agcgggccac gcagaaggga gggtccttat agtgggcaca ggccacacac tggtcagcct 1560 ccggtccaaa acaggtcact gagccattct ggggctgaca ctcagggtgg cacggcaaac 1620 agtgcctggc attcacatac tccctgggga gcccctgcag tactcggcat tcctccacgc 1680 actcctggcc ccgaaggaac tggctgcagt tgacacactg ggtgggccct ggaccccagc 1740 agtgccctcg ggcgcacagc tggtggcagg ccaggccctc gcccacacac tcgtcctctg 1800 gccggttggc agtgtggagc agagcttggt gcgggttccg aaagagctgg tcccagggca 1860 ccgtgtgcac gaagcagagg tgggtgttat ggtggatgag ggccagtcca ctgcccagtt 1920 ccctcagtga gcgcagcccc agccagctga tgcccagccc ttgcagggtc agcgagtagg 1980 cgccattgtg cagaattcgt ccccggatta cttgcaggtt ctggaagacg ctgaggtcag 2040 gcaggctgtc cggccatgct gagatgtata ggtaacctgt gatctcttcc agagtctcaa 2100 acacttggag ctgctctggc tggagcgggg cagtgttgga ggctgggtcc ccatcaaagc 2160 tctccggcag aaatgccagg ctcccaaaga tcttcttgca gccagcaaac tcctggatat 2220 tggcactggt aactgccctc acctctcgca agtgctccat gcccagacca tagcacactc 2280 gggcacaggg cttgctgcac ttctcacacc gctgtgttcc atcctctgct gtcacctctt 2340 ggttgtgcag ggggcagacg agggtgcagg atcccacgtc cgtagaaagg tagttgtagg 2400 gacaggcagt cacacagctg gcgccgaatg tataccgcag ctcggtgata ccgatgaatt 2460 tggagttagc tttgatgtac tggaccaggg ctgggcagtg cagctcacag atgccactgt 2520 ggttgaagtg gaggcaggcc aggcagtcag agtgcttggg gcccgtgcag ccggcagcac 2580 actgctcatg gcagcagtca gtgggcagtg gccccttgca gcgggcacag ccaccggcac 2640 agacagtgcg cgtcaggctc tgacaatcct cagaactctc tccccagcag cgggagccct 2700 tacacatcgg agaacagggg tggcaggccc gagagcggtt ggtgtctatc agtgtgagag 2760 ccagctggtt gttcttgtgg aagatgtcct tccacaaaat cgtgtcctgg tagcagagct 2820 gggggttccg ctggatcaag acccctcctt tcaagatctc tgtgaggctt cgaagctgca 2880 gctcccgcag gcctcctggg gaggcccctg tgacaggggt ggtattgttc agcgggtctc 2940 cattgtctag cacggccagg gcatagttgt cctcaaagag ctgggtgcct cgcacaatcc 3000 gcagcctctg cagtgggacc tgcctcactt ggttgtgagc gatgagcacg tagccctgca 3060 cctcctggat atcctgcagg aaacttaagc tggcattggt gggcaggtag gtgagttcca 3120 ggtttccctg caccacctgg cagccctggt agaggtggcg gagcatgtcc aggtgggtct 3180 cgggactggc agggagccgc agcttcatgt ctgtgccggt gcacacttgg gtgctcgcgg 3240 ctccgggggg caagagggcg aggaggagcc cccagcggca caaggccgcc agctccatgg 3300 tggcggctag atcgaattcc tgcagcccaa acccgattta aattggcgcc cgtacggaag 3360 atcttcgacg tctaagcggc cgcaatagct agctagtccg gatatttata ttccaaaaaa 3420 aaaaaataaa atttcaattt ttgtttaaac acgcgttcta gattttgttt aaccactgca 3480 tgatgtacag atttcggaat cgcaaaccac cagtggtttt attttatcct tgtccaatgt 3540 gaattgaatg ggagcggatg cgggtttcgt acgtagatag tacattcccg tttttagacc 3600 gagactccat ccgtaaaaat gcatactcgt tagtttggaa taactcggat ctgctatatg 3660 gatattcata gattgacttt gatcgatgaa ggctcccctg tctgcagcca tttttatgat 3720 cgtcttttgt ggaatttccc aaatagtttt ataaactcgc ttaatatctt ctggaaggtt 3780 tgtattctga atggatccac catctgccat aatcctattc ttgatctcat cattccataa 3840 ttttctctcg gttaaaactc taaggagatg cggattaact acttgaaatt ctccagacaa 3900 tactctccga gtgtaaatat tactggtata cggttccacc gactcattat ttcccaaaat 3960 ttgagcagtt gatgcagtcg gcataggtgc caccaataaa ctatttctaa gaccgtatgt 4020 tctgatttta tcttttagag gttcccaatt ccaaagatcc gacggtacaa cattccaaag 4080 atcatattgt agaataccgt tactggcgta cgatcctaca tatgtatcgt atggtccttc 4140 cttctcagct agttcacaac tcgcctctaa tgcaccgtaa taaatggttt cgaagatctt 4200 cttatttaga tcttgtgctt ccaggctatc aaatggataa tttaagagaa taaacgcgtc 4260 cgctaatcct tgaacaccaa taccgatagg tctatgtctc ttattagaga tttcagcttc 4320 tggaatagga taataattaa tatctataat tttattgaga tttctgacaa ttactttgac 4380 cacatccttc agtttgagaa aatcaaatcg cccatctatt acaaacatgt tcaaggcaac 4440 agatgccaga ttacaaacgg ctacctcatt agcatccgca tattgta 4487 <210> 2 <211> 683 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Modified HER2 protein encoded by SEQ ID NO:1 <220> <221> P2 <222> (273)..(287) <223> T-helper cell epitope P2 derived from Tetanus Toxin <220> <221> P30 <222> (654)..(674) <223> T-helper cell epitope P30 derived from Tetanus Toxin <400> 2 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 100 105 110 Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro 115 120 125 Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser 130 135 140 Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln 145 150 155 160 Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn 165 170 175 Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys 180 185 190 His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser 195 200 205 Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys 210 215 220 Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys 225 230 235 240 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu 245 250 255 His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val 260 265 270 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg 275 280 285 Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu 290 295 300 Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln 305 310 315 320 Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys 325 330 335 Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu 340 345 350 Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys 355 360 365 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp 370 375 380 Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe 385 390 395 400 Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro 405 410 415 Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg 420 425 430 Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu 435 440 445 Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly 450 455 460 Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val 465 470 475 480 Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr 485 490 495 Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His 500 505 510 Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys 515 520 525 Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys 530 535 540 Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys 545 550 555 560 Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys 565 570 575 Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp 580 585 590 Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu 595 600 605 Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln 610 615 620 Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys 625 630 635 640 Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Phe Asn Asn 645 650 655 Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His 660 665 670 Leu Glu Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu 675 680

Claims (56)

  1. 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제로서, (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스(orthopoxvirus); 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 포함하되; (a) 및 (b)는 복합제 치료제로서 투여되는, 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 오소폭스바이러스는 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 안카라(modified vaccinia Ankara: MVA) 바이러스 또는 MVA-BN으로부터 선택된, 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 추가로 포함하되; (a) 및 (b)는 복합제 치료제로서 투여되는, 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 조류폭스바이러스(avipoxvirus) 및 길항제 또는 효현제 복합제는 제3항의 재조합 오소폭스바이러스 및 길항제 또는 효현제 복합제 후 투여되는, 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 조류폭스바이러스는 계두바이러스(fowlpoxvirus)인, 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 2종 이상의 재조합 오소폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 추가로 포함하고; (a) 및 (b)는 복합제 치료제로서 투여되는, 인간 암 환자의 치료를 위한 치료제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제는 항체를 포함하는, 복합제 치료제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 CEA, MUC-1, PAP, PSA 및 HER-2 항원으로부터 선택된, 복합제 치료제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장직장암, 위암, 췌장암, 전립선암, 방광암 또는 난소암인, 복합제 치료제.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 PAP 항원인, 복합제 치료제.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 PSA 항원인, 복합제 치료제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 암은 전립선암인, 복합제 치료제.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 MUC-1 및 CEA 항원으로부터 선택된, 복합제 치료제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장직장암, 폐암, 위암, 췌장암, 방광암 및 난소암으로부터 선택된, 복합제 치료제.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 HER-2 항원인, 복합제 치료제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 복합제 치료제.
  17. 인간 암 환자를 치료하는 방법으로서,
    (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스를 상기 환자에게 투여하는 단계; 및
    (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스를 상기 환자에게 투여하는 단계; 및
    (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조류폭스바이러스는 계두바이러스인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 후속하는 재조합 오소폭스바이러스 및 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 상기 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  21. 제17항 또는 제20항에 있어서, 상기 오소폭스바이러스는 백시니아 바이러스인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 백시니아 바이러스는 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 및 MVA-BN으로부터 선택된, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 길항제 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  24. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LAG-3 길항제 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  25. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-ICOS 효현제 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  26. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 길항제 항체 및 항-LAG-3 길항제 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 CEA, MUC-1, PAP, PSA 또는 HER-2 항원인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 치료제는 전립선암, 유방암, 폐암, 위암, 췌장암, 방광암 또는 난소암에 지향된, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  29. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 CEA 또는 MUC-1 항원인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 암 치료제는 유방암, 결장직장암, 폐암, 위암, 췌장암, 방광암 또는 난소암에 지향된, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  31. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 PAP 항원인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  32. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 PSA 항원인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 암 치료제는 전립선암에 지향된, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  34. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 HER-2 항원인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 암 치료제는 유방암에 지향된, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  36. 제17항 및 제18항 및 중 제23항 내지 제35항 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 길항제; 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나와 조합된 상기 재조합 오소폭스바이러스 및 재조합 조류폭스바이러스는 이종 프라임-부스트 섭생(heterologous prime-boost regimen)의 일부로서 투여되고;
    상기 이종 프라임-부스트 섭생은 상기 길항제 또는 효현제와 조합된 상기 재조합 오소폭스바이러스의 제1 프라임 용량 및 상기 길항제 또는 효현제와 조합된 상기 재조합 조류폭스바이러스의 하나 이상의 후속 부스트 용량을 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 이종 프라임-부스트 섭생은 프로스트박(PROSTVAC) 또는 CV301인, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  38. 제17항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 길항제; 항-LAG-3 항체 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나와 조합된 상기 재조합 오소폭스바이러스는 동종 프라임-부스트 섭생(homologous prime-boost regimen)의 일부로서 투여되고;
    상기 동종 프라임-부스트 섭생은 상기 길항제 또는 효현제와 조합된 상기 재조합 오소폭스바이러스의 제1 프라임 용량 및 상기 길항제 또는 효현제와 조합된 동일한 재조합 오소폭스바이러스의 하나 이상의 후속 부스트 용량을 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법.
  39. 인간 암 환자의 치료를 위한 복합제 치료제로서, 상기 복합제는
    (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 각각 포함하는, 재조합 오소폭스바이러스 또는 재조합 조류폭스바이러스; 및
    (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제를 포함하는, 복합제 치료제.
  40. 제40항에 있어서, 상기 재조합 오소폭스바이러스는 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 또는 MVA-BN으로부터 선택된, 복합제 치료제.
  41. 제39항에 있어서, 상기 재조합 조류폭스바이러스는 계두바이러스인, 복합제 치료제.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 항-PD-1 길항제 항체를 포함하는, 복합제 치료제.
  43. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 항-LAG-3 길항제 항체를 포함하는, 복합제 치료제.
  44. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 항-PD-1 길항제 항체 및 항-LAG-3 길항제 항체를 포함하는, 복합제 치료제.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 CEA, MUC-1, PAP, PSA 및 HER-2 항원으로부터 선택된, 복합제 치료제.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 길항제 항체, 항-LAG-3 길항제 항체 또는 항-ICOS 효현제 항체 중 적어도 하나와 조합된 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 각각 포함하는 하나 이상의 후속 재조합 오소폭스바이러스 또는 조류폭스바이러스를 추가로 포함하는, 복합제 치료제.
  47. 인간 암 환자에서 암을 치료하기 위한 키트로서, (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제 항체, 항-LAG-3 길항제 항체 또는 항-ICOS 효현제 항체 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
  48. 제47항에 있어서, 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스를 추가로 포함하는, 키트.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 CEA, MUC-1, PAP, PSA 및 HER-2 항원으로부터 선택된, 키트.
  50. 인간 암 환자의 치료에 사용하기 위한 약제 또는 조성물로서, 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 오소폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 포함하되, (a) 및 (b)는 복합제로서 투여되는, 약제 또는 조성물.
  51. 제50항에 있어서, (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 추가로 포함하되; (a) 및 (b)는 복합제로서 투여되는, 약제 또는 조성물.
  52. 인간 암 환자의 치료를 위한 약제학적 조성물 또는 약제의 제조에서의 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 오소폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제를 포함하는, 용도.
  53. 제52항에 있어서, 상기 조성물은 (a) 적어도 하나의 종양 항원의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 조류폭스바이러스; 및 (b) 항-PD-1 길항제, 항-LAG-3 길항제 또는 항-ICOS 효현제 중 적어도 하나를 추가로 포함하되; (a) 및 (b)는 복합제로서 투여되는, 용도.
  54. 상기 재조합 오소폭스바이러스는 백시니아 바이러스, 변형된 백시니아 안카라(MVA) 및 MVA-BN으로부터 선택된, 제50항 또는 제51항의 약제 또는 조성물 또는 제52항 또는 제53항의 용도.
  55. 상기 재조합 조류폭스바이러스는 계두바이러스인, 제51항의 약제 또는 조성물 또는 제53항의 용도.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 종양 항원은 CEA, MUC-1, PAP, PSA 및 HER-2 항원으로부터 선택된, 약제 또는 조성물.
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