CN111556760A - 作为疫苗免疫佐剂的热灭活的牛痘病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开文本的技术涉及热灭活的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒(热iMVA)或热灭活的牛痘病毒作为疫苗免疫佐剂的用途。具体而言，本发明技术涉及热iMVA单独或与用作癌症免疫治疗剂的免疫检查点阻断(ICB)抗体组合作为癌症疫苗中肿瘤抗原的疫苗佐剂的用途。

Description

作为疫苗免疫佐剂的热灭活的牛痘病毒
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月6日提交的美国临时专利申请号62/582,263的权益和优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开文本的技术总体上涉及肿瘤学、病毒学和免疫疗法领域。本发明技术涉及热灭活的牛痘病毒作为疫苗免疫佐剂的用途。具体而言，本发明技术涉及热灭活的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒或“热iMVA”单独或与用作癌症免疫治疗剂的免疫检查点阻断(ICB)抗体组合作为癌症疫苗中肿瘤抗原的疫苗佐剂的用途。
背景技术
提供了以下描述以帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献均不被承认是本技术领域的现有技术。
恶性肿瘤固有地对常规疗法具有抗性，并且提出了重大的治疗挑战。免疫疗法是一个不断发展的研究领域，并且是治疗某些类型的癌症的另外的选择。免疫疗法方法所基于的基本原理是可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞，并且靶向它们进行破坏。尽管癌细胞呈递抗原，并且存在可能对肿瘤细胞潜在发生反应的免疫细胞，但是在许多情况下，免疫系统未被激活或肯定地被抑制。此现象的关键是肿瘤通过迫使免疫系统的细胞抑制免疫系统的其他细胞来保护自身免受免疫应答影响的能力。肿瘤发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。因此，需要改善的免疫治疗方法来增强宿主抗肿瘤免疫和靶向肿瘤细胞进行破坏。
发明内容
在一方面，本公开文本提供了一种在有需要的受试者中治疗实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予包含抗原和治疗有效量的佐剂的免疫原性组合物，所述佐剂包含灭活的改良安卡拉牛痘病毒和/或灭活的牛痘病毒。在一些实施方案中，所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒是热灭活的改良安卡拉牛痘病毒(热iMVA)或UV灭活的MVA，并且所述灭活的牛痘病毒是热灭活的牛痘病毒或UV灭活的牛痘病毒。在一些实施方案中，所述灭活的改良牛痘病毒是热iMVA。
在本文公开的方法的一些实施方案中，所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、NY-ESO-1、人乳头瘤病毒E6和E7及其组合。在一些实施方案中，所述抗原包含选自以下的新抗原：M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)、M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6)及其组合。
在本文公开的方法的一些实施方案中，所述给予步骤包括以一个或多个剂量给予所述免疫原性组合物。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括向受试者给予选自以下的免疫检查点阻断剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性死亡1(PD-1)抑制剂，PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。
在一些实施方案中，所述免疫原性组合物与所述免疫检查点阻断剂的给予分开、依序或同时递送至受试者。
在一些实施方案中，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，治疗包含以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫应答或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫应答、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。
在一些实施方案中，所述免疫应答的诱导、增强或促进包括以下中的一种或多种：如与未处理的对照样品相比，干扰素γ(IFN-γ)在脾、引流淋巴结和/或血清中的T细胞中表达水平增加；如与未处理的对照样品相比，抗原特异性T细胞在脾、引流淋巴结和/或血清中水平增加；以及如与未处理的对照样品相比，抗原特异性免疫球蛋白在血清中水平增加。在一些实施方案中，所述抗原特异性免疫球蛋白是IgG1或IgG2。
在一些实施方案中，将所述免疫原性组合物配制为肿瘤内、肌内、皮内或皮下给予。
在一些实施方案中，所述肿瘤选自黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤鳞状细胞癌、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、胃癌、肝癌和肉瘤。
在一些实施方案中，所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒或灭活的牛痘病毒以每次给予约105至约1010噬斑形成单位(pfu)的剂量给予。
在本文公开的方法的一些实施方案中，所述受试者是人。
在一方面，本公开文本提供了一种包含抗原和佐剂的免疫原性组合物，所述佐剂包含灭活的改良安卡拉牛痘病毒和/或灭活的牛痘病毒。在一些实施方案中，所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒是热灭活的改良安卡拉牛痘病毒(热iMVA)或UV灭活的MVA，并且所述灭活的牛痘病毒是热灭活的牛痘病毒或UV灭活的牛痘病毒。在一些实施方案中，所述灭活的改良牛痘病毒是热iMVA。
在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物的抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、NY-ESO-1、人乳头瘤病毒E6和E7及其组合。在一些实施方案中，所述抗原包含选自以下的新抗原：M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)、M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6)及其组合。
在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物进一步包含选自以下的免疫检查点阻断剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性死亡1(PD-1)抑制剂，PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。在一些实施方案中，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
在本发明技术的免疫原性组合物一些实施方案中，灭活的改良安卡拉牛痘病毒或灭活的牛痘病毒以每次给予约105至约1010噬斑形成单位(pfu)的剂量给予。
在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含使用说明、容器器件和以下各项的单独部分：(a)抗原；和(b)佐剂，所述佐剂包含灭活的改良安卡拉牛痘病毒和/或灭活的牛痘病毒。在一些实施方案中，所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒是热灭活的改良安卡拉牛痘病毒(热iMVA)或UV灭活的MVA，并且所述灭活的牛痘病毒是热灭活的牛痘病毒或UV灭活的牛痘病毒。在一些实施方案中，所述灭活的改良牛痘病毒是热iMVA。在一些实施方案中，所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、NY-ESO-1及其组合。在一些实施方案中，所述抗原包含选自以下的新抗原：M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)、M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6)及其组合。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含选自以下的免疫检查点阻断剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性死亡1(PD-1)抑制剂，PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断剂包含PD-L1抑制剂，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
附图说明
图1A-图1K是示出了在存在或不存在免疫佐剂热灭活的MVA(热iMVA)的情况下，将C57BL/6J小鼠用鸡卵清蛋白(OVA)进行肌内(IM)疫苗接种后的抗原特异性T细胞和抗体应答的一系列图。图1A：OVA肌内疫苗接种策略。在第0天和第14天，将小鼠用OVA(10μg/小鼠)+/-热iMVA(107pfu/小鼠的当量)进行肌内注射。在第21天收集脾、淋巴结和血清。图1B和图1D：将脾细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图1D：在PBS、OVA或OVA+热iMVA疫苗接种的小鼠的脾中IFN-γ+CD8+T细胞的点状图。图1C和图1E：将脾细胞用OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(SEQ ID NO:2)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD4+T细胞的IFN-γ的表达。图1E：在PBS、OVA或OVA+热iMVA疫苗接种的小鼠的脾中IFN-γ+CD4+T细胞的点状图。图1F和图1H：将来自引流淋巴结(dLN)的细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图1G和图1I：将来自dLN的细胞用OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(SEQ ID NO:2)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD4+T细胞的IFN-γ的表达。图1J和图1K：通过ELISA确定PBS、OVA或OVA+热iMVA疫苗接种的小鼠的血清中的OVA特异性免疫球蛋白G1(IgG1)或OVA特异性免疫球蛋白G2c(IgG2c)的效价(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；n＝5)。
图2A-2G是示出了在C57BL/6J小鼠中，用OVA+/-热iMVA或完全弗氏佐剂(CFA)进行肌内(IM)或皮下(SC)疫苗接种后的抗原特异性T细胞和抗体应答的一系列图。图2A：OVA疫苗接种策略。在第0天和第14天，将小鼠用OVA(10μg/小鼠)+/-热iMVA(107pfu/小鼠的当量)进行肌内或皮下注射。在第21天收集脾、淋巴结和血清。图2B：将脾细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图2C：将脾细胞用OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(SEQ ID NO:2)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD4+T细胞的IFN-γ的表达。图2D：将来自dLN的细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图2E：将dLN用OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(SEQ ID NO:2)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD4+T细胞的IFN-γ的表达。图2F和图2G：通过ELISA确定PBS、OVA或OVA+热iMVA或OVA+CFA疫苗接种的小鼠的血清中的OVA特异性免疫球蛋白G1(IgG1)或OVA特异性免疫球蛋白G2c(IgG2c)的效价(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns：不显著；n＝5，PBS组除外)。
图3A-3G是示出了在C57BL/6J、STINGGt/Gt和Batf3-/-小鼠中，用OVA+/-热iMVA皮下(SC)疫苗接种后的T细胞和抗体应答的一系列图。图3A：OVA疫苗接种策略。在第0天和第14天，将小鼠用OVA(10μg/小鼠)+热iMVA(107pfu/小鼠的当量)进行皮下注射。在第21天收集脾、淋巴结和血清。图3B：将脾细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图3C：将脾细胞用OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(SEQ ID NO:2)(10μg/ml)刺激。通过流式细胞术测量CD4+T细胞的IFN-γ的表达。图3D：将来自dLN的细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图3E：将来自dLN的细胞用OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(SEQ ID NO:2)(10μg/ml)刺激。通过流式细胞术测量CD4+T细胞的IFN-γ的表达。图3F和图3G：通过ELISA确定OVA+热iMVA疫苗接种的WT、STINGGt/Gt和Batf3-/-小鼠的血清中的OVA特异性免疫球蛋白G1(IgG1)或OVA特异性免疫球蛋白G2c(IgG2c)的效价(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns：不显著；n＝5，PBS组除外)。
图4A-图4C是示出了在C57BL/6J、STINGGt/Gt和Batf3-/-小鼠中，用MVA-OVA+/-热iMVA进行皮肤划痕疫苗接种后的T细胞和抗体应答的一系列图。图4A：MVA-OVA疫苗接种策略。在第0天，在存在或不存在热iMVA(105pfu/小鼠的当量)的情况下，将C57BL/6J小鼠用不同剂量的MVA-OVA(105、106、107pfu/小鼠)进行疫苗接种。一周后，收获安乐死小鼠的脾、淋巴结和血清。关于STINGGt/Gt和Batf3-/-小鼠，将它们用MVA-OVA(106pfu/小鼠)进行疫苗接种。图4B：将脾细胞与MVA-OVA感染的BMDC共培养。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图4C：将脾细胞与OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)脉冲处理的BMDC共培养12h。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。(*p<0.05；**p<0.01；ns：不显著；n＝5，PBS组除外)。
图5A-图5D是示出了热iMVA处理后GM-CSF培养的骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的细胞表面MHC-I(H-2Kb)表达及其摄取荧光标记的模型抗原OVA(OVA-647)的能力的一系列图。图5A：将BMDC与OVA(1mg/ml)+/-热iMVA(MOI为1)或聚IC(5μg/ml)一起孵育16h。然后，使用抗H-2Kb抗体通过FACS确定细胞表面H-2Kb表达。图5B：示出了BMDC的H2-Kb的平均荧光强度。图5C：将BMDC用热iMVA(MOI为1)感染1h并且然后与OVA-647(0.5mg/ml)一起孵育1h。通过流式细胞术测量BMDC中吞噬的OVA-647的荧光强度。图5D：将BMDC与热iMVA(MOI为1)感染16h并且然后与OVA-647(0.5mg/ml)一起孵育1h。通过流式细胞术确定BMDC中吞噬的OVA-647的荧光强度。
图6A-图6B是示出了与用OVA+/-热iMVA脉冲处理的GM-CSF培养的BMDC一起孵育后，羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的OT-I T细胞的增殖的一系列图。将BMDC与OVA(0.1、0.2、0.5mg/ml)+/-热iMVA(MOI为1)一起孵育3h，然后洗涤并且与CFSE标记的OT-I细胞共培养3天(BMDC:OT-I T细胞＝1:5)。将流式细胞术应用于测量OT-I细胞的CFSE强度。图6A：与仅用OVA脉冲处理的BMDC一起孵育的OT-I T细胞的CFSE。图6B：与用OVA和热iMVA脉冲处理的BMDC一起孵育的OT-1细胞的CFSE。
图7A-图7B是示出了与在存在或不存在热iMVA的情况下用OVA脉冲处理的GM-CSF培养的BMDC一起孵育后，CFSE标记的OT-II T细胞的增殖的一系列图。将BMDC与OVA(0、0.1、0.2、0.5mg/ml)+/-热iMVA(MOI为1)或聚IC(5μg/ml)一起孵育3h，然后洗涤并且与CFSE标记的OT-II细胞共培养3天(BMDC:OT-II T细胞＝1:5)。将流式细胞术应用于测量OT-II细胞的CFSE强度。图7A：与仅用OVA脉冲处理的BMDC一起孵育的OT-II T细胞的CFSE。图7B：与用OVA+热iMVA或聚IC脉冲处理的BMDC一起孵育的OT-I细胞的CFSE。
图8是示出了与在存在或不存在热iMVA的情况下用OVA脉冲处理的来自C57B/6J的FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)培养的BMDC一起孵育后，CFSE标记的OT-I细胞的增殖的一系列图。在存在Flt3L(100ng/ml)的情况下，将骨髓细胞在细胞培养基中分化9天。将Flt3L培养的BMDC与OVA(0.01、0.03mg/ml)+/-热iMVA(MOI为1)一起孵育3h，然后与CFSE标记的OT-I细胞共培养3天(BMDC:OT-I＝1:5)。将流式细胞术应用于测量OT-I细胞的CFSE强度。
图9A-图9C是示出了鼠pDC对于热iMVA引起的疫苗佐剂作用是重要的一系列图。图9A：在存在或不存在pDC-耗尽抗体抗PDCA-1的情况下，用或不用热iMVA的OVA疫苗接种策略。在第0天和第14天，将C57BL/6J小鼠用OVA(10μg/小鼠)+/-热iMVA(107pfu/小鼠的当量)进行皮内免疫。在第-1天、第1天、第13天和第15天，腹膜内给予选择性耗尽pDC的抗PDCA1抗体(500μg/小鼠)或对照IgG(500μg/小鼠)。在第21天收集脾和淋巴结用于抗原特异性CD8+T细胞分析。图9B：将脾细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达。图9C：将来自引流淋巴结(dLN)的细胞用OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(10μg/ml)刺激12h。通过流式细胞术测量CD8+T细胞的IFN-γ的表达(*p<0.05；***p<0.001；n＝5，PBS组除外)。
图10A-图10D是示出了在引流淋巴结中不同树突细胞群体中的OVA-647摄取的一系列图。图10A：将鼠腹股沟淋巴结进行消化并且获得单个细胞悬浮液并且将所述单个细胞悬浮液用细胞表面标记来标记。将迁移性树突细胞群体标记为MHC-II+CD11c+。将驻留树突细胞标记为MHC-IIIntCD11c+。将迁移性树突细胞分为CD11b+DC、Langerin-CD11b-DC和Langerin+DC。将Langerin+DC分为两个群体：CD103+DC和朗格汉斯(Langerhans)细胞。驻留树突细胞由两个群体构成：CD8α+驻留DC和CD8α-驻留DC。图10B：将C57/B6J小鼠通过皮内注射用OVA-647(10μg/小鼠)进行疫苗接种。24h后，收获dLN，并且通过流式细胞术测量dLN的不同的树突细胞群体中的OVA-647强度。图10C：将C57/B6小鼠通过皮内注射用OVA-647(10μg/小鼠)+热iMVA(107pfu的当量)或Addavax(25μl/小鼠)进行疫苗接种。24h后，收获dLN，并且通过流式细胞术测量dLN的CD103-CD11b-DC群体之间的OVA-647+细胞的百分比(**p<0.01；n＝3)。图10D：通过流式细胞术测量dLN的CD11b+DC之间的OVA-647+细胞的百分比(*p<0.05；n＝3)。
图11A-图11D是示出了在治疗鼠B16-OVA肿瘤模型中，在存在或不存在佐剂和免疫检查点阻断抗体抗PD-L1的情况下，辐照全细胞疫苗接种的功效的一系列图。图11A：在存在或不存在抗PD-L1的情况下，用或不用热iMVA或聚IC的辐照B16-OVA疫苗接种策略。在C57BL/6J小鼠的右侧腹皮内植入B16-OVA细胞(5x 104)。在第3、6和9天，在小鼠左侧腹用辐照B16-OVA细胞(1x 106)在使用或不使用免疫佐剂热iMVA(107pfu/小鼠的)的情况下或在使用TLR3激动剂聚IC(50μg/小鼠)的当量情况下进行皮内免疫，总共进行三次。在第3、6和9天，向所指示的组腹膜内给予抗PD-L1抗体(200μg/小鼠)。监测小鼠的肿瘤大小和存活。图11B和图11C：用PBS(n＝5)、辐照B16-OVA(n＝5)、辐照B16-OVA+热iMVA(n＝5)、辐照B16-OVA+聚IC(n＝5)、PBS+抗PD-L1(n＝10)、辐照B16-OVA+抗PD-L1(n＝10)、辐照B16-OVA+热iMVA+抗PD-L1(n＝10)、辐照B16-OVA+聚IC+抗PD-L1(n＝10)进行疫苗接种的荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线**，p<0.01。图11D：肿瘤植入后数天内，不同治疗组的单独肿瘤体积。
图12A-图12C示出了在治疗疫苗接种肿瘤模型中，黑色素瘤新抗原肽与热iMVA的共给予引起了抗肿瘤作用。图12A：疫苗接种模型。图12B和图12C：用黑色素瘤新抗原肽混合物(M27/M30/M48)进行的皮下(SC)疫苗接种延迟了B16-F10肿瘤生长并且延长了小鼠的存活。当新抗原肽混合物与热iMVA共给予时，增强了抗肿瘤作用。
图13示出了牛痘病毒株安卡拉(GenBank登录号：U94848.1；SEQ ID NO:3)的完整的基因组序列。
具体实施方式
应当理解，为了提供对本发明技术的实质性理解，下文在各个细节层次上描述了本发明技术的某些方面、模式、实施方案、变型和特征。
I.定义
下文提供了如本说明书中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学技术语均通常具有与本发明技术所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。
如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物，除非上下文另外明确说明。例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。
如本文所用，术语“约”涵盖可能在测量中发生的并且对于熟练技术人员而言清楚的实验误差范围。
如本文所用，术语“佐剂”是指增强、增加或加强宿主对抗原(包括肿瘤抗原)的免疫应答的物质。
如本文所用，向受试者“给予”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。给予可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、肿瘤内或局部。给予包括自给予和由另一个人给予。
如本文所用，术语“抗原”指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性地结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，抗原包含在全细胞内，如在含有肿瘤抗原的全细胞疫苗中。在一些实施方案中，所述靶抗原涵盖癌症相关抗原或新抗原，并且包括由肿瘤或非肿瘤癌症表达的蛋白质或其他分子，如存在于癌细胞但不存在于非癌细胞中的分子以及如与非癌细胞相比在癌细胞中上调的分子。
如本文所用，术语“有效量”是指药剂当以一个或多个剂量并且在一段时间中给予时，足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如使得可预防或减少本文所述疾病或病症或者与本文所述疾病或病症相关的一种或多种体征或症状的量。在治疗或预防应用的情况下，给予至受试者的组合物的量将根据组合物，疾病的程度、类型和严重程度以及根据个体的特征(如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性)而变化。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。所述组合物也可以与一种或多种另外的治疗化合物组合给予。在本文所述的方法中，可以将治疗组合物给予至具有本文所述疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。如本文所用，组合物的“治疗有效量”指其中疾病或病症的生理作用得到改善或消除的组合物水平。治疗有效量可以在一次或多次给予中给予。
如本文所用，“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)中的一种或多种的作用，所述作用导致对癌性细胞、转移性肿瘤细胞等的选择性损伤、破坏或从人体消除。免疫应答可以包括细胞应答，如T细胞应答，其为细胞功能(即T细胞功能)的改变(调节，例如，显著增强、刺激、激活、损伤或抑制)。T细胞应答可以包括特定类型的T细胞或T细胞子集(例如，效应CD4+、CD4+辅助、效应CD8+、CD8+细胞毒性或自然杀伤(NK)细胞)的产生、增殖或扩增或刺激。可以通过检测一种或多种细胞受体或细胞表面分子(例如，CD或分化分子簇)来鉴定此类T细胞子集。T细胞应答还可以包括影响其他细胞的分化或增殖的细胞因子(如可溶性介体(例如，细胞因子、淋巴因子、细胞因子结合蛋白或白细胞介素))的表达改变(统计上显著的增加或减少)。例如，干扰素-(IFN-)γ是针对细胞内病原体和癌症的免疫的必需细胞因子。IFN-γ是由介导先天免疫应答和适应性免疫应答二者的细胞产生的。自然杀伤(NK)和自然杀伤T(NKT)细胞是此细胞因子的先天细胞来源并且在激活后快速产生IFN-γ。免疫应答还可以包括体液(抗体)应答。
在本文使用术语“免疫原性组合物”以指代将在已经暴露于所述组合物的哺乳动物中引起免疫应答的组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含抗原和单独的或与免疫检查点阻断抑制剂组合的包含热iMVA的佐剂。如本文所用，免疫原性组合物涵盖疫苗。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含含有肿瘤抗原的全细胞疫苗(例如辐照的全细胞疫苗)。
如本文所用，术语“灭活的MVA”是指热灭活的MVA(热iMVA)和/或UV灭活的MVA，其是有传染性的、非复制性的并且不能抑制在感染的DC细胞中IFN I型的产生。如本文所用，术语“灭活的牛痘病毒”包括热灭活的牛痘病毒和/或UV灭活的牛痘病毒。通过加热和UV辐射的组合灭活的MVA或牛痘病毒也在本公开文本的范围内。
如本文所用，“热灭活的MVA”(热iMVA)和“灭活的牛痘病毒”分别是指MVA和牛痘病毒，已经将它们在不破坏其免疫原性或其进入靶细胞(肿瘤细胞)的能力，但是除去所述病毒的残余复制能力和抑制宿主的免疫应答的因子的条件下，暴露于热处理。此类条件的例子是在约50至约60℃范围内的温度下暴露约一小时的时间段。其他时间和条件可以由本领域技术人员确定。
如本文所用，“UV灭活的MVA”和“UV灭活的牛痘病毒”分别是指MVA和牛痘病毒，其已经通过在不破坏其免疫原性或其进入靶细胞(肿瘤细胞)的能力但是除去病毒的残余复制能力的条件下暴露于UV而失活。可用于本发明方法的此类条件的例子是使用例如365nmUV灯泡暴露于UV约30min至约1小时的时间。UV波长和暴露的这些条件的其他限制可由本领域技术人员确定。
如本文所用，术语“个体”、“患者”或“受试者”可为单独生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，“受试者”意指可能患有癌症并且当由此痛苦时需要治疗的任何动物(哺乳动物、人或其他)患者。在一些实施方案中，所述个体、患者或受试者是人。
如本文所用，“转移”是指癌症从其原发部位扩散到体内的相邻组织或远端位置。癌细胞(包括癌症干细胞)可以脱离原发性肿瘤，穿透淋巴管和血管，在血流中循环，并且在体内其他部位的正常组织中生长。转移是一个顺序过程，取决于从原发性肿瘤中脱落、穿过血流或淋巴管行进并且停止于远端部位的肿瘤细胞(或癌症干细胞)。一旦到达另一个部位，癌细胞就会重新穿透血管或淋巴管壁，继续繁殖并且最终形成新的肿瘤(转移性肿瘤)。在一些实施方案中，将这种新的肿瘤称为转移性(或继发性)肿瘤。
如本文所用，“MVA”意指“改良安卡拉牛痘”，并且是指衍生自安卡拉毒株并且开发用作疫苗和疫苗佐剂的牛痘的高度减毒的毒株。通过经鸡胚细胞连续传代从野生型安卡拉毒株中分离出原始的MVA。如此处理后，它失去了约15％的野生型牛痘基因组，包括其在灵长类动物(包括人)细胞中有效复制的能力。MVA序列披露于Genbank U94848.1中(图13；SEQID NO:3)。临床级MVA可从丹麦的Bavarian Nordic A/S Kvistgaard商购和公开获得。此外，MVA可从马里兰州罗克维尔的ATCC和法国巴黎的CMCN(巴斯德国家微生物研究所(Institut Pasteur Collection Nationale des Microorganismes))获得。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给予相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其配制品是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(第20版，A.Gennaro编辑,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,费城,宾夕法尼亚州)中。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指当给予动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的物质和组合物。如本文所用，所述术语包括所有惰性的、无毒的、液体或固体的填充剂或稀释剂(只要它们不以不适当的负面方式与本发明的治疗性物质反应)、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、防腐剂等，例如液体药物载体(例如，无菌水、盐水、糖溶液、Tris缓冲液、乙醇和/或某些油)。
如本文所用，障碍或病症的“预防”(“prevention”、“prevent”或“preventing”)是指如下一种或多种化合物，其在统计学样品中，相对于未治疗的对照样品降低所治疗样品中的障碍或病症的发生率，或者相对于未治疗的对照样品延迟障碍或病症的一种或多种症状的发作。
如本文所用，术语“分开的”治疗使用指通过不同途径同时或基本上同时给予至少两种活性成分。
如本文所用，术语“依序的”治疗使用指在不同时间给予至少两种活性成分，给予途径相同或不同。更具体地，依序使用指完整地给予一种活性成分，之后开始给予其他一种或多种活性成分。因此，可以在给予一种或多种活性成分之前几分钟、几小时或几天内给予另一种活性成分。在这种情况下不存在同时治疗。
如本文所用，术语“同时的”治疗使用指通过相同的途径并且同时或基本上同时给予至少两种活性成分。
如本文所用，“实体瘤”是指除血液系统癌症(如淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤)以外的所有肿瘤性细胞生长和增殖以及所有癌前和癌性细胞和组织。实体瘤的例子包括但不限于：软组织肉瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤和其他骨瘤(例如，骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilms肿瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、脑/CNS肿瘤(例如，星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、儿童肿瘤如非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、生殖细胞瘤、胚胎瘤、室管膜瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。本公开文本的组合物和方法将有用的一些最常见的实体瘤包括：头颈癌、直肠腺癌、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、子宫(例如，子宫内膜癌、输卵管癌)卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(鳞状和腺癌)、小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、导管原位癌、肾细胞癌和肝细胞癌、肾上腺肿瘤(例如，肾上腺皮质癌)、食道肿瘤、眼肿瘤(例如，黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊肿瘤、胃肠道肿瘤、Wilms肿瘤、心脏肿瘤、头颈肿瘤、喉肿瘤和下咽肿瘤、口腔(例如，唇、口、唾液腺)肿瘤、鼻咽肿瘤、神经母细胞瘤、腹膜肿瘤、垂体肿瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、小肠肿瘤、胃肿瘤、睾丸肿瘤、胸腺肿瘤、甲状腺肿瘤、甲状旁腺肿瘤、阴道肿瘤和前述任一种的转移。
如本文所用，“治疗”(“treating”或“treatment”)涵盖治疗受试者如人中的本文所述疾病或障碍，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起所述障碍的消退；(iii)减缓所述障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓所述疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指与所述疾病相关的症状例如已得到缓和、减轻、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如本文所述的各种肿瘤治疗方式旨在意指“基本上的”，其包括完全治疗以及少于完全治疗，并且其中获得了一些生物学或医学有关的结果。所述治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗，或者是针对急性病症治疗的单次或几次给予。
如本文所用，“T细胞”是指胸腺衍生的淋巴细胞，其参与多种细胞介导的适应性免疫反应。
如本文所用，“辅助T细胞”是指CD4+T细胞；辅助T细胞识别与MHC II类分子结合的抗原。辅助T细胞至少有两种类型，Th1和Th2，它们产生不同的细胞因子。
如本文所用，“细胞毒性T细胞”是指通常在其表面带有CD8分子标记(CD8+)并且通过破坏在其表面具有特异性抗原分子的靶T细胞而在细胞介导的免疫中起作用的T细胞。细胞毒性T细胞还会释放颗粒酶，即一种丝氨酸蛋白酶，它可以经由穿孔素形成的孔进入靶T细胞并且诱导细胞凋亡(细胞死亡)。颗粒酶用作细胞毒性表型的标记。细胞毒性T细胞的其他名称包括CTL、细胞溶解性T细胞、细胞溶解性T淋巴细胞、杀伤性T细胞或杀伤性T淋巴细胞。细胞毒性T细胞的靶标可以包括病毒感染的细胞、被细菌或原生动物寄生虫感染的细胞或癌细胞。大多数细胞毒性T细胞具有存在于其细胞表面上的CD8蛋白。CD8被吸引到I类MHC分子的部分。通常，细胞毒性T细胞是CD8+细胞。
II.免疫系统和癌症
恶性肿瘤固有地对常规疗法具有抗性，并且提出了重大的治疗挑战。免疫疗法已经成为一个不断发展的研究领域，并且是治疗某些类型的癌症的另外的选择。免疫疗法方法所基于的基本原理是可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞，并且靶向它们进行破坏。
大量研究支持在癌症进展中免疫系统组成部分差异存在的重要性(Jochems等人,Exp Biol Med,236(5):567-579(2011))。临床数据表明，高密度的肿瘤浸润的淋巴细胞与改善的临床结果相联系(Mlecnik等人,Cancer Metastasis Rev.；30:5-12,(2011))。已经在多种类型的癌症中报道了在稳健淋巴细胞浸润与患者存活之间的相关性，所述癌症包括黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌、乳腺癌、尿路上皮癌、结直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胆囊癌和食道癌(Angell等人,Current Opinion in Immunology,25:1-7,(2013))。肿瘤免疫浸润物包括巨噬细胞、树突细胞(DC)、单核细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、幼稚和记忆淋巴细胞、B细胞和效应T细胞(T淋巴细胞)，主要负责识别肿瘤细胞表达的抗原和随后通过细胞毒性T细胞破坏肿瘤细胞。
尽管癌细胞呈递抗原，并且存在可能针对肿瘤细胞潜在地发生反应的免疫细胞，但是在许多情况下，免疫系统未被激活或肯定被抑制。此现象的关键是肿瘤通过迫使免疫系统的细胞抑制免疫系统的其他细胞来保护自身免受免疫应答影响的能力。肿瘤发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。例如，肿瘤细胞分泌免疫抑制性细胞因子(如TGF-β)，或者在肿瘤病灶中诱导免疫细胞(如CD4+T调节性细胞和巨噬细胞)以分泌这些细胞因子。肿瘤还具有使CD4+T细胞偏向表达调节表型的能力。总的结果是T细胞应答受损和细胞凋亡诱导受损或CD8+细胞毒性T细胞的抗肿瘤免疫能力降低。此外，MHC I类在肿瘤细胞表面的肿瘤相关的改变的表达使所述肿瘤细胞对于免疫应答是“不可见的”(Garrido等人Cancer Immunol.Immunother.59(10),1601–1606(2010))。抑制抗原呈递功能和树突细胞(DC)另外有助于逃避抗肿瘤免疫(Gerlini等人Am.J.Pathol.165(6),1853-1863(2004))。
此外，肿瘤微环境的局部免疫抑制性质以及免疫编辑可以导致不表达靶抗原的癌细胞亚群逃逸。因此，找到能促进免疫系统的抗肿瘤活性的保存和/或恢复的方法将具有重大的治疗益处。
III.改良安卡拉牛痘(MVA)
改良安卡拉牛痘(MVA)病毒是痘病毒科中正痘病毒属的成员。MVA是通过在牛痘病毒的安卡拉毒株(CVA)的鸡胚成纤维细胞(CEF)上进行大约570次连续传代而产生的(Mayr等人,Infection 3,6-14(1975))。这些长期传代的结果是，所得的MVA病毒含有大量的基因组缺失，并且宿主细胞高度限于禽类细胞(Meyer等人,J.Gen.Virol.72,1031-1038(1991))。在各种动物模型中都显示出所得的MVA是显著无毒性的(Mayr等人,Dev.Biol.Stand.41,225-34(1978))。
MVA的安全性和免疫原性已经在临床试验中进行了广泛的测试和记录，特别是针对人天花病。这些研究包括超过120,000名个体，并且已经证明在人中具有出色的功效和安全性。此外，与其他基于牛痘的疫苗相比，MVA具有减弱的毒力(传染性)，同时其触发良好的特异性免疫应答。因此，已经将MVA建立为安全的疫苗载体，其具有诱导特异性免疫应答的能力。
由于上述特征，MVA成为了开发工程化的MVA载体(用于重组基因表达和疫苗)的有吸引力的候选物。作为疫苗载体，已经针对多种病理病症对MVA进行了研究，所述病理病症包括HIV、结核病和疟疾以及癌症(Sutter等人,Curr Drug Targets Infect Disord 3:263-271(2003)；Gomez等人,Curr Gene Ther 8:97-120(2008))。
已经证明，人单核细胞衍生的树突细胞(DC)的MVA感染会导致DC激活，其特征在于共刺激分子的上调和促炎细胞因子的分泌(Drillien等人,J Gen Virol 85:2167-2175(2004))。在此方面，MVA与无法激活DC的标准野生型牛痘病毒(WT-VAC)不同。树突细胞可以分为两种主要的亚型：常规树突细胞(cDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)。前者(特别是CD103+/CD8α+亚型)特别适合于将抗原交叉呈递至T细胞；后者是I型IFN的强大生产者。
人细胞的病毒感染导致由I型干扰素(尤其是干扰素-α(α))介导的先天免疫应答(第一道防线)的激活。这通常会导致免疫学“级联”的激活，其中使激活的T细胞(CTL和辅助细胞)发生募集和增殖，并且最终产生抗体。然而，病毒表达抑制宿主免疫应答的因子。MVA是比WT-VAC更好的免疫原，并且在哺乳动物细胞中复制较差。(参见例如，Brandler等人,J.Virol.84,5314-5328(2010))。
图13提供了由GenBank登录号U94848.1给出的MVA基因组序列(SEQ ID NO:3)。
IV.向受试者递送作为佐剂的热灭活的MVA(热iMVA)以治疗癌症
A.组合物
免疫激活癌症疫苗佐剂
癌症新抗原的近期发现已经产生了对癌症疫苗接种以及癌症疫苗接种与免疫检查点阻断组合以增强疫苗接种作用的新的兴趣。开发可以使抗肿瘤免疫应答最大化的有效的疫苗佐剂对于癌症疫苗的成功是重要的。
癌症疫苗包含癌症抗原和免疫佐剂。癌症抗原通常包括肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原和在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原。癌症抗原可以以以下形式提供：辐照的肿瘤细胞、装载肿瘤细胞裂解物或肽的树突细胞(DC)、编码抗原的DNA或RNA，以及具有编码一种或多种抗原的一种或多种转基因的溶瘤病毒。树突细胞(DC)是专业的抗原呈递细胞，其对于引发幼稚T细胞产生抗原特异性T细胞应答是重要的。免疫佐剂是促进DC的抗原摄取和/或DC成熟和激活的试剂。已经显示出在临床前模型和临床设置中，几种免疫佐剂(包括toll样受体(TLR)激动剂、聚(I:C)(TLR3激动剂)、CpG(TLR9激动剂)、咪喹莫特(TLR7激动剂)以及STING激动剂)可改善疫苗功效。
作为佐剂疗法的热iMVA
本发明技术的公开本文涉及热灭活的MVA(热iMVA)作为疫苗佐剂的用途。已经显示出热iMVA或热灭活的疫苗可经由cGAS/STING依赖途径在常规DC(cDC)中诱导I型IFN，并且还可经由TLR7/MyD88依赖机制在浆细胞样DC(pDC)中诱导I型IFN。并且，作为单一疗法或与免疫检查点阻断(ICB)组合，热iMVA的瘤内注射根除了注射的肿瘤并且导致了系统性抗肿瘤免疫的产生。然而，还没有描述热iMVA作为疫苗佐剂用于在肿瘤床外的外周性疫苗接种的用途。
靶抗原
本文公开的组合物和方法不旨在受抗原或新抗原的选择的限制。尽管提供了许多抗原和新抗原的例子，熟练的技术人员可以容易地利用本文公开的佐剂和所选择的抗原或新抗原。可用于本发明技术的治疗方案中的示例性非限制性靶抗原包括肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)和NY-ESO-1。在一些实施方案中，所述抗原是选自以下的新抗原：M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)、M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6)及其组合。所述靶抗原还可以是包含以上所列抗原的免疫活性部分的片段或融合多肽。
免疫检查点阻断(ICB)
在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物进一步包含一种或多种免疫检查点阻断剂。免疫检查点阻断(ICB)抗体已经处于免疫疗法的最前线并且已经作为癌症管理选项(包括外科手术、辐射和化学疗法)的支柱之一为人所接受。由于免疫检查点已经涉及下调抗肿瘤免疫，所以靶向免疫检查点蛋白或其配体(CTLA-4、PD-1或PD-L1)的药剂和抗体已经成功解除对抗肿瘤T细胞的抑制，从而导致激活的T细胞的增殖和存活。这已经促使FDA批准多种免疫检查点阻断(ICB)剂用于患有各种组织学类型的晚期癌症的患者，所述癌症包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、尿路上皮癌、默克尔细胞癌、PD-L1+胃腺癌，以及错配修复缺陷和微卫星不稳定(MSI)高转移实体瘤。
免疫检查点阻断剂的非限制性例子包括调节一种或多种检查点蛋白活性的药剂或抗体，所述检查点蛋白包括细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)或其配体，以及程序性死亡1(PD-1)或其配体PD-L1和PD-L2。
本发明技术的药物组合物和制剂
本文公开了包含抗原和作为佐剂的热iMVA的药物组合物，其可以含有载体或稀释剂，所述载体或稀释剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、Tris缓冲液、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在一些实施方案中，包括等渗剂(例如，糖或氯化钠)以及缓冲剂。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)或载体分子可以实现可注射组合物的延长吸收。其他赋形剂可以包括润湿剂或乳化剂。通常，对于本领域技术人员清楚的是，可以包括适合于可注射制剂的赋形剂。
包含抗原和作为佐剂的热iMVA的药物组合物和制剂可以借助常规混合、溶解、制粒、乳化、封装、包埋或冻干过程来制造。可以使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂以常规方式配制药物组合物，所述载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂有助于配制适合于体外、体内或离体使用的制剂。所述组合物可以与一种或多种另外的生物学活性剂(例如，GM-CSF的平行给予)组合，并且可以用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制，以产生适合于肠胃外或瘤内给予的本公开文本的药物(包括生物)或兽药组合物。
如本领域技术人员所理解的，许多类型的配制品是可能的。如本领域所公认的，所选择的具体类型取决于所选择的给予途径。例如，通常设计全身配制品用于通过注射(例如，静脉内)给予，以及设计用于瘤内递送的那些配制品。在一些实施方案中，全身或瘤内配制品是无菌的。
无菌可注射溶液是通过如下方式来制备：根据需要将抗原和作为佐剂的热iMVA掺入所需量的具有本文列举的各种其他成分的适当溶剂中，然后进行合适的灭菌手段。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述方法由先前无菌过滤的溶液产生病毒加上任何另外的所需成分的粉末。
在一些实施方案中，可以将本公开文本的抗原和热iMVA组合物配制在水性溶液中，或者配制在生理相容性溶液或缓冲液(如汉克氏溶液、林格氏溶液、甘露糖醇溶液或生理盐水缓冲液)中。在某些实施方案中，抗原和热iMVA组合物中的任一种均可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂、渗透剂或分散剂、缓冲剂、冻干保护剂或防腐剂，如聚乙二醇、聚山梨醇酯80、1-十二烷基六氢-2H-氮杂卓-2-酮(月桂氮卓酮(laurocapran))、油酸、柠檬酸钠、Tris HCl、右旋糖、丙二醇、甘露糖醇、聚山梨醇酯聚乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯
Figure BDA0002565206640000201
异丙基肉豆蔻酸酯、苯甲醇、异丙醇、乙醇、蔗糖、海藻糖和可以用于本公开文本的任何组合物中的本领域通常已知的其他此类配制剂。
在一些实施方案中，可以将本公开技术的组合物在-80℃下储存。为了制备疫苗注射剂，例如，可以将102-108或102-109个病毒颗粒在安瓿瓶(优选玻璃安瓿瓶)中在2％蛋白胨和1％人白蛋白的存在下，例如，在100ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干。可替代地，可以通过逐步冷冻干燥配制品中的重组病毒来产生可注射制剂。此配制品可以含有另外的添加剂，如甘露糖醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其他添加剂，如适合于体内给予的抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白质(例如，人血清白蛋白)。然后将玻璃安瓿瓶密封，并且可以将其在4℃与室温之间储存几个月。在一些实施方案中，将安瓿瓶储存在低于-20℃的温度下。
对于治疗，可以将冻干物溶解于水性溶液(如生理盐水或Tris缓冲液)中，并且全身地或瘤内地给予。本领域技术人员可以优化给予的模式、剂量和给予次数。
根据本公开文本的包含抗原和作为佐剂的热iMVA的药物组合物可以包含另外的佐剂，所述另外的佐剂包括铝盐(如氢氧化铝或磷酸铝)、Quil A、细菌细胞壁肽聚糖、病毒样颗粒、多聚糖、toll样受体、纳米珠等。
疫苗
在一些实施方案中，将包含热iMVA佐剂和一种或多种抗原的组合物配制到疫苗中。在一些实施方案中，所述疫苗是含有肿瘤抗原的全细胞疫苗(例如辐照的全细胞疫苗)。在一些实施方案中，向受试者给予所述疫苗以引发针对用其配制的抗原的免疫应答。
热iMVA作为癌症疫苗免疫佐剂的有效量和剂量
通常，尽管可以给予更低或更高的剂量，向受试者给予在约106至约1010个噬斑形成单位(pfu)范围内的热iMVA剂量。在一些实施方案中，所述剂量范围从约102至约1010pfu。在一些实施方案中，所述剂量范围从约103至约1010pfu。在一些实施方案中，所述剂量范围从约104至约1010pfu。在一些实施方案中，所述剂量范围从约105至约1010pfu。在一些实施方案中，所述剂量范围从约106至约1010pfu。在一些实施方案中，所述剂量范围从约107至约1010pfu。在一些实施方案中，所述剂量范围从约108至约1010pfu。在一些实施方案中，所述剂量范围从约109至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量是约107至约109pfu。pfu与病毒颗粒的等效性可以根据所使用的特定pfu滴定方法而有所不同。通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒，而0.69PFU是约1TCID50。可以以一个或多个分剂量在规定的时间段内并且以规定的给予频率来给予治疗有效量的热iMVA。
例如，对于本领域技术人员清楚的是，根据本公开文本的作为佐剂的热iMVA的治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：受试者的疾病状态、年龄、性别、体重和一般状况，以及热iMVA在特定受试者体内引起所需免疫应答的能力(受试者对疗法的反应)。在将热iMVA递送给受试者时，剂量也将根据诸如以下的因素而变化：一般医疗状况、以前的病史、疾病类型和进展、肿瘤负荷、肿瘤中肿瘤浸润免疫细胞的存在或不存在等。
在一些实施方案中，以剂量单位形式配制本公开文本的组合物可能是有利的，以便于给予和剂量的统一。如本文所用的“剂量单位形式”是指适合作为待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有与所需的药学上或兽医学上可接受的载体结合的经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性材料。
热iMVA作为癌症疫苗免疫佐剂的给予和治疗方案
通常将药物组合物配制为与其预期的给予途径相容。可以使用多于一种途径来实现免疫原性组合物(例如疫苗)中作为佐剂的热iMVA的给予。给予途径的例子包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下)、瘤内、鞘内、鼻内、全身、透皮、离子电渗疗法、皮内、眼内或局部给予。在一个实施方案中，在需要直接的局部反应的情况下，例如通过肿瘤内注射，将包含抗原和作为佐剂的热iMVA的本发明技术的药物组合物直接给予到肿瘤中。在一些实施方案中，相对于肿瘤床，外周性给予包含抗原和作为佐剂的热iMVA的本发明技术的药物组合物。此外，给予途径可以变化，例如使用瘤内注射进行第一次给予，并且经由静脉内注射进行随后的给予，或其任何组合。可以在规定的时间段内并且以规定的给予频率来给予癌症疫苗注射中治疗有效量的作为佐剂的热iMVA。在某些实施方案中，本发明技术的药物组合物可以与其他治疗处理(如化学疗法或放射疗法)结合使用。在一些实施方案中，包含治疗有效量的作为佐剂的热iMVA的本发明技术的药物组合物可以与免疫检查点阻断疗法(如靶向免疫检查点蛋白CTLA-4、PD-1、PD-L1和/或PD-L2的抗体)结合使用。
在某些实施方案中，包含抗原和作为佐剂的热iMVA的药物组合物是每周或每月至少一次给予，但是如果需要可以更频繁地给予，如每周两次持续数周、数月、数年，或者甚至只要益处持续存在，即可无限期给予。如果耐受并且如果所述给予产生持续或增加的益处，则考虑更频繁的给予。本发明方法的益处包括但不限于以下：减少癌细胞数量、减小肿瘤大小(例如，肿瘤体积)、根除肿瘤、抑制癌细胞向外周器官的浸润、抑制或稳定或根除转移性生长、抑制或稳定肿瘤生长以及稳定或改善生活质量。此外，益处可以包括诱导针对肿瘤的免疫应答、增加的IFN-γ+CD8+T细胞、增加的IFN-γ+CD4+T细胞、效应CD4+T细胞的激活、效应CD8+T细胞的增加、或调节性CD4+细胞的减少。例如，在黑色素瘤的情况下，益处可以是在黑色素瘤的初次诊断的一、二、三、四、五年或更多年内没有复发或转移。可以对结肠癌和其他实体瘤进行类似的评估。
B.方法
在一方面，本公开文本提供了在有需要的受试者中通过增强免疫应答来治疗实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予包含一种或多种抗原和包含热灭活的改良安卡拉牛痘(热iMVA)的佐剂的免疫原性组合物，从而通过增强免疫应答来治疗肿瘤。
在一些实施方案中，本公开文本提供了如下方法，所述方法包括向受试者给予包含一种或多种抗原和作为佐剂的热iMVA的免疫原性组合物以引发针对所述抗原的免疫应答。
在本文公开的方法的一些实施方案中，所述给予步骤包括以多个剂量给予所述免疫原性组合物。
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向受试者给予选自以下的免疫检查点阻断剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性死亡1(PD-1)抑制剂，PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物与所述免疫检查点阻断剂的给予分开、依序或同时递送至受试者。在一些实施方案中，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
C.试剂盒
在一些实施方案中，提供了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括容器器件和以下各项的单独部分：(a)抗原和(b)包含热iMVA的佐剂。
V.肿瘤免疫中的I型IFN和胞质DNA传感途径
I型IFN在宿主抗肿瘤免疫中起重要作用(Fuertes等人,Trends Immunol 34,67-73(2013))。IFNAR1缺陷型小鼠在植入肿瘤细胞后更容易患上肿瘤；自发的肿瘤特异性T细胞引发在IFNAR1缺陷型小鼠中也存在缺陷(Diamond等人,J Exp Med 208,1989-2003(2011)；Fuertes等人,J Exp Med 208,2005-2016(2011))。最近的研究显示，胞质DNA传感途径在肿瘤衍生的DNA的先天免疫传感中很重要，所述先天免疫传感导致抗肿瘤CD8+T细胞免疫的形成(Woo等人,Immunity 41,830-842(2014))。此途径在放射诱导的抗肿瘤免疫中也起作用(Deng等人,Immunity 41,843-852(2014))。尽管可以在患有癌症的患者体内检测到自发的抗肿瘤T细胞应答，但是在大多数患者体内癌症最终克服了宿主抗肿瘤免疫。改变肿瘤免疫抑制性微环境的新型策略将有益于癌症疗法。
VI.免疫应答
除了通过上调特定的免疫系统活性(如抗体和/或细胞因子的产生、或细胞介导的免疫的激活)来诱导免疫应答外，免疫应答还可以包括可检测的免疫的抑制、减弱或任何其他下调，以重建稳态并且防止对宿主自身器官和组织的过度损伤。在一些实施方案中，根据本公开文本的方法诱导的免疫应答产生效应CD8+(抗肿瘤细胞毒性CD8+)T细胞或激活的T辅助细胞或二者，它们可以直接或间接地导致肿瘤细胞死亡或使肿瘤细胞丧失繁殖能力。
可以通过检测多种熟知的免疫学参数中的任一种来确定通过本公开文本的组合物和方法对免疫应答的诱导(Takaoka等人,Cancer Sci.94:405-11(2003)；Nagorsen等人,Crit.Rev.Immunol.22:449-62(2002))。因此，可以通过许多熟知的测定(包括免疫测定)中的任一种来确立免疫应答的诱导。此类测定包括但不必限于以下的体内、离体或体外确定：可溶性免疫球蛋白或抗体；可溶性介体(如细胞因子、趋化因子、激素、生长因子等)以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介体；如通过免疫系统的细胞的改变的功能或结构特性确定的细胞激活状态变化，所述特性例如细胞增殖、改变的运动性、改变的细胞内阳离子梯度或浓度(如钙)；细胞多肽的磷酸化或去磷酸化；特化活性如特定基因表达或细胞溶解行为的诱导；免疫系统细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发作；或可以用于检测免疫应答的存在的任何其他标准。例如，可以通过与CD4+、CD8+或NK细胞结合的特异性抗体来检测区分免疫细胞类型的细胞表面标记。可以检测到的其他标记和细胞组分包括但不限于干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、IFN-α、IFN-β(IFNB)、IL-6和CCL5。用于检测免疫应答的常用方法包括但不限于流式细胞术、ELISA、免疫组织化学。进行这些和类似测定的程序是众所周知的，并且可以在例如Letkovits(Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook ofTechniques,Current Protocols in Immunology,1998)中找到。
VII.树突细胞在疫苗功效中的作用
树突细胞(DC)是专业的抗原呈递细胞，其在先天免疫与适应性免疫的联系中发挥重要的作用。DC可以有效地捕获抗原，经历成熟，并且迁移到淋巴器官中以引发幼稚T细胞，从而产生抗原特异性T细胞免疫应答。DC包含几种异质群体，每种群体在抗原呈递中发挥不同的作用。例如，Batf3依赖性CD103+/CD8αDC在交叉呈递扩增并激活CD8+T细胞的抗原中最有效。CD11b+DC在产生Th2中是重要的。相比之下，pDC是有效的I型IFN产生细胞，并且可能通过I型IFN的产生，可以与CD103+/CD8αDC合作用于抗原交叉呈递。I型IFN信号传导对于CD103+/CD8αDC的功能是重要的。
VIII.STING途径在疫苗功效中的作用
STING(IFN基因的刺激物，也称为跨膜蛋白173(TMEM 173))是先天免疫的内质网定位的关键衔接子。STING途径通过与环状二核苷酸相互作用而激活，所述环状二核苷酸包括由哺乳动物胞质DNA传感器cGAS产生的环状GMP-AMP(cGAMP)以及由细菌产生的环状二核苷酸(CDN)。最近的报道表明，可以通过由STING/IRF3介导的胞质DNA传感途径检测肿瘤DNA，从而导致自发性CD8+T细胞引发。STING或IRF3缺陷的小鼠不能排斥免疫原性肿瘤。此外，STING缺陷型小鼠对使用抗CTLA-4和抗PD-L1的组合免疫疗法具有抗性，部分是因为肿瘤特异性T细胞无法在STING缺陷型宿主中扩增所致。此外，鼠STING激动剂DMXAA的肿瘤内递送也在B16.SIY模型中的肿瘤根除中显示依赖于STING的功效。然而，人STING对DMAXX刺激不敏感，这解释了DMXAA在临床试验中的失败。相比之下，合成的环状二核苷酸(CDN)可以充当人STING激动剂，并且临床前研究显示CDN的肿瘤内递送以STING依赖性方式在B16黑色素瘤模型中引起抗肿瘤作用。STING对于iMVA诱导的抗肿瘤治疗作用也是重要的。STING缺陷型小鼠远不如WT小鼠擅长响应于热iMVA根除肿瘤。注射和未注射肿瘤的免疫分析显示，热iMVA处理导致在STING缺陷型小鼠中减少的CD8+T细胞增加。
实验性实施例
通过以下实施例进一步说明本发明技术，所述实施例不应被解释为以任何方式进行限制。
总之，本文所述的例子显示，热iMVA与抗原(例如，鸡卵清蛋白(OVA))的共给予增加了脾和引流淋巴结中抗原特异性(例如，OVA特异性)CD8+T细胞和CD4+T细胞的百分比，并且提高了抗原特异性(例如，OVA特异性)免疫球蛋白(例如，IgG2c和IgG1)的血清水平。这些结果还显示，在Batf3-/-小鼠以及缺失浆细胞样树突细胞(pDC)的小鼠中，OVA特异性CD8+T细胞的诱导显著减少。此外，这些结果还显示，在鼠治疗疫苗接种模型中，用具有热iMVA的辐照的B16-OVA细胞进行的疫苗接种延长了中值存活期，所述中值存活期在免疫检查点阻断抗体的存在下进一步延长。此外，本文呈现的结果证明热iMVA增强了通过DC的抗原呈递，并且证明了热iMVA可以作为疫苗佐剂用于基于肽、基于病毒的疫苗载体和辐照的全细胞疫苗接种。
通用材料和方法
病毒和细胞系。MVA和MVA-OVA病毒由Gerd Sutter(慕尼黑大学)慷慨提供，并且使其在BHK-21(幼仓鼠肾细胞，ATCC CCL-10)细胞中繁殖。MVA可商购和/或公开获得。将病毒通过36％的蔗糖垫纯化。热iMVA通过将纯化的MVA病毒在55℃下孵育1小时来产生。在含有10％FBS、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)和50mg/ml庆大霉素的伊格尔最低必需培养基(伊格尔MEM，可以从Life Technologies购买，Cat#11095-080)中培养BHK-21细胞。鼠黑色素瘤细胞系B16-F10最初从I.Fidler(MD Anderson Cancer Center)获得。B16-OVA细胞由G.Dranoff(Dana Farber Cancer Center)慷慨提供。将B16-F10细胞和B16-OVA维持在RPMI 1640培养基中，所述培养基补充有10％FBS、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM NEAA、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES缓冲液。所有细胞在37℃下在5％CO2孵育器中生长。
除非另外指示，否则本文所用的细胞和细胞系可商购或公开获得。
小鼠。6周龄与10周龄之间的雌性C57BL/6J小鼠从Jackson Laboratory购买，并且将其用于制备骨髓衍生的树突细胞以及用于体内实验。将这些小鼠饲养在SloanKettering Institute的动物实验室中。严格按照美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)中的建议执行所有程序。所述方案得到了Sloan-Kettering Cancer Institute的动物实验伦理委员会(Committee on the Ethics of Animal Experiments)的批准。Batf3-/-和STINGGt/Gt小鼠在K.Murphy(华盛顿大学；Batf3-/-)和R.Vance(加利福尼亚大学伯克利分校；STINGGt/Gt)的实验室中产生。将这些小鼠养育并且维持在Sloan Kettering Institute的动物实验室中。
对于鸡卵清蛋白(OVA)免疫实验，在第0天和第14天，将小鼠用与或不与热灭活的MVA(热iMVA；107pfu/小鼠的当量)一起或者与完全弗氏佐剂(CFA)一起的OVA(每只小鼠10μg溶解于50μl PBS中)进行注射。对于仅用OVA或用OVA+热MVA进行的疫苗接种，按照疫苗接种策略中的详细说明，测试了肌内(IM)、皮下(SC)或皮内(ID)递送方法。对于用OVA+CFA进行的疫苗接种，由于注射部位令人疼痛的反应和组织受损的风险，仅使用皮下给予。在第21天，收集脾、引流淋巴结(dLN)和血液用于评价抗原特异性T细胞和抗体反应。
在一些实验中，STINGGt/Gt、Batf3-/-小鼠和年龄匹配的WT对照用于用OVA+热iMVA进行SC疫苗接种。
对于浆细胞样树突细胞(pDC)的耗尽，在第-1天、第1天、第13天和第14天，四次向小鼠腹膜内(i.p.)注射在500μl PBS中的500μg靶向CD317的BX444抗pDC抗体(BioXCell)。CD317也称为BST2和PDCA-1，其仅在来自幼稚小鼠的pDC上表达。按照相同的时间表，向对照小鼠腹膜内注射在500μl PBS中的500μg同种型对照大鼠IgG1抗辣根过氧化物酶(HRPN)抗体(BioXCell)。如前所述，在第0天和第14天给予用OVA+热iMVA进行的免疫接种。在第21天，收集脾、dLN和血液用于评价抗原特异性T细胞和抗体反应。
对于使用与或不与热iMVA一起的MVA-OVA进行的皮肤划痕(SS)，将6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠进行麻醉，并且将5μl病毒施加至距尾巴基部1cm处的尾部皮肤。SS通过用281/2G针轻轻刮擦皮肤25次来完成(Liu等人Immunity 2006)。应用增加剂量的MVA-OVA(105、106、107pfu)。对于组合，在SS之前，将107pfu的MVA-OVA与105pfu当量的热iMVA混合。一周后，从安乐死的小鼠收获脾、dLN和血液。
在一些实验中，STINGGt/Gt、Batf3-/-小鼠和年龄匹配的WT对照用于使用106pfu的MVA-OVA进行的SS疫苗接种。
分泌IFN-γ的抗原特异性T细胞的流式细胞术分析。将脾或dLN切碎成单细胞悬浮液并且进行分析。对于OVA257-264(SIINFEKL)(SEQ ID NO:1)或OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)(SEQ ID NO:2)特异性T细胞分析，将脾细胞或dLN细胞与10μg/ml的相应的肽(Invivogen)一起孵育过夜，然后用以下抗体染色：PE-Cy7抗CD3、APC-Cy7抗CD4、PE-Cy5.5抗CD8和APC抗IFN-γ抗体。所有抗体均购自eBioscience。通过使用可固定染料eFluor506(eBioscience)来区分活细胞与死细胞。使用LSR II流式细胞仪(BDBiosciences)获得数据。将数据用FlowJo软件(Tree Star)分析。对于MVA-OVA特异性T细胞分析，首先将BMDC用MVA-OVA(MOI＝5)感染6h，然后将它们与脾细胞或淋巴结细胞共孵育过夜，之后针对IFN-γ的产生进行细胞内细胞因子染色。
OVA特异性抗体的ELISA分析。将ELISA板用10μg/ml的OVA蛋白涂布过夜。然后将板在37℃下用在PBST中的1％BSA封闭1h。将血清进行两倍连续稀释并且添加到每个孔中并且在37℃下孵育1h。用PBST洗涤三次后，将板与HRP标记的二抗(HRP-抗小鼠IgG1或HRP-抗小鼠IgG2c)在37℃下一起孵育1h。然后添加TMB底物(Sigma)并且测量A450吸光度。
骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的产生。通过如下方式来收集来自小鼠胫骨和股骨的骨髓细胞：首先从骨骼除去肌肉，然后使用0.5cc U-100胰岛素注射器(Becton Dickinson)用含10％FCS的RPMI冲洗出细胞。离心后，将细胞重悬于ACK裂解缓冲液(Lonza)中，以便通过将细胞在冰上孵育1-3min来裂解红细胞。然后将细胞收集，重悬于新鲜培养基中，并且通过40μm细胞滤器(BD Biosciences)过滤。计数细胞数量。对于GM-CSF-BMDC的产生，将骨髓细胞(每个15cm细胞培养皿中500万个细胞)在GM-CSF(30ng/ml，由Sloan KetteringInstitute的Monoclonal Antibody Core实验室生产)的存在下在CM中培养10-12天。CM是补充有10％胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM必需和非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES缓冲液的RPMI 1640培养基。每2天通过用新鲜培养基更换50％的旧培养基来饲喂细胞，并且每3-4天重新铺板以除去贴壁细胞。仅将非贴壁细胞用于实验。对于fms样酪氨酸激酶3配体培养的小鼠骨髓衍生的树突细胞(Flt3L-BMDC)的产生，将骨髓细胞(6孔板的每孔中5×106个细胞)在Flt3L(100ng/ml；R&DSystems)的存在下培养7至9天。每2至3天通过用新鲜培养基更换50％的旧培养基来饲喂细胞。
OT-I或OT-II增殖测定。从OT-I或OT-II小鼠收获脾，并且用小鼠CD8+或CD4+分离试剂盒(Miltenyi)纯化T细胞。将OT-I或OT-II细胞在室温下用10μM的羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(ThermoFisher)标记15min。将GM-CSF培养的或Flt3L培养的BMDC与OVA(0.1、0.2、0.5mg/ml)+/-热iMVA(MOI为1)一起孵育3h，然后洗涤并且与CFSE标记的OT-I或OT-II(BMDC:OT-I或OT-II T细胞＝1:5)共培养3天。用抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体染色后，使用LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)确定CFSE强度。在一些实验中，使用toll样受体3(TLR3)激动剂聚IC(5μg/ml)代替热iMVA。
在BMDC上的MHC-I(H-2Kb)表达和BMDC的OVA摄取。将GM-CSF培养的BMDC与OVA(1mg/ml)+/-热iMVA(MOI为1)或聚IC(5μg/ml)一起孵育16h，然后使用抗H2-Kb抗体(eBioscience)通过FACS测量在细胞表面的H2-Kb的细胞表面表达。对于OVA-647摄取，将GM-CSF培养的BMDC用热iMVA(MOI为1)感染或模拟感染1h或16h，并且然后与AlexaFluorTM647缀合的卵清蛋白(OVA-647；ThemoFisher)一起孵育1h。通过流式细胞术确定BMDC中吞噬的OVA-647的荧光强度。将数据用Flowjo软件(Treestar)分析。
迁移性树突细胞的OVA-647摄取和转运。将10μg OVA-647与或不与热iMVA(107pfu的当量)一起皮内注射至C57Bl/6J小鼠的右侧腹中。24h后，收集引流腹股沟淋巴结。产生单细胞悬浮液并且将其用以下抗体染色：efluor450-CD19(1D3)、TER119(TER119)、CD49b(DX5)、PE-Cy7-CD3e(145-2C11)、Alexa Fluor-700-CD11c(N418)、PE-Texa Red-MHC-II(M5/114.15.2)、APC-Cy7-CD11b(M1/70)、FITC-CD103(2E7)、PE-Cy5.5-CD8a(53-6.7)和PE-Langerin(eBioL31)。所有抗体均来自eBioscience。通过流式细胞术确定DC子集中吞噬的OVA-647的荧光强度。将数据用FlowJo软件(Treestar)分析。
在一些实验中，使用疫苗佐剂Addavax(25μl/小鼠)代替热iMVA。
肿瘤植入模型和用辐照的B16-OVA细胞进行皮内疫苗接种。简言之，在第0天，将5x104个B16-OVA黑色素瘤细胞皮内植入(i.d.)到C57BL/6J小鼠的右侧腹。肿瘤植入后3、6、9天，在小鼠左侧腹用γ-辐照(150Gy)的B16-OVA(1x 106个细胞/小鼠)+/-热iMVA(107pfu/小鼠)进行皮内疫苗接种。测量肿瘤大小并且检测小鼠的存活。
在一些实验中，使用聚IC(50μg/小鼠)代替热iMVA。
在一些实验中，在第3、6、9天免疫期间，腹膜内给予抗PD-L1抗体(200μg/小鼠；来自BioXcell的克隆10F.9G2)。
统计学。将双尾非配对Student's t检验用于研究中两组的比较。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活数据。认为显著的p值在图中指示如下：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。在每个图例中都讨论了研究中包含的动物数量。
实施例1：在免疫的小鼠中，热iMVA与模型抗原鸡卵清蛋白(OVA)的共给予增强了 脾和引流淋巴结(dLN)中OVA特异性CD8+和CD4+T细胞以及血清抗OVA IgG抗体的产生。
此实施例证明了热iMVA可充当疫苗佐剂以增强树突细胞(DC)的抗原呈递。将小鼠用与或不与热iMVA(1x 107pfu)一起的OVA(10μg)进行肌内(IM)免疫两次，间隔2周。第二次疫苗接种后1周，将小鼠进行安乐死，并且随后收集脾、引流淋巴结(dLN)和血液用于OVA特异性T细胞和抗体评估(图1A)。为了确定抗OVA CD8+T细胞应答，将脾细胞(500,000个细胞)与作为OVA的MHC I类(Kb)限制性肽表位的OVA 257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)一起孵育12h，之后将其针对抗CD8和抗IFN-γ抗体进行染色。为了测试抗OVA CD4+T细胞应答，将脾细胞(500,000个细胞)与作为OVA的MHC II类I-Ad限制性肽表位的OVA 323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)肽(SEQ ID NO:2)一起孵育12h，之后将其针对抗CD4和抗IFN-γ抗体进行染色。与仅给予OVA相比，热iMVA与OVA的肌内共给予导致脾中抗OVA IFN-γ+CD8+T细胞和抗OVA IFN-γ+CD4+T细胞的增加。在脾的CD8+T细胞中IFN-γ+T细胞的百分比从OVA处理的小鼠的1％增加到OVA +热iMVA处理的小鼠的1.8％(P<0.01；n＝5；图1B、图1D)。在脾的CD4+T细胞中IFN-γ+T细胞的百分比从OVA处理的小鼠的0.5％增加到OVA +热iMVA处理的小鼠的1.5％(P<0.01；n＝5；图1C、图1E)。
在dLN中观察到，在IM OVA+热iMVA之后，抗OVA IFN-γ+CD8+T细胞和抗OVA IFN-γ+CD8+T细胞的相似诱导。简言之，从dLN产生单细胞悬浮液，并且将500,000个细胞与OVA257-264或OVA 323-339肽一起孵育。在dLN的CD8+T细胞中IFN-γ+T细胞的百分比从OVA处理的小鼠的0.5％增加到OVA+热iMVA处理的小鼠的2.5％(P<0.01；n＝5；图1E、图1H)。在dLN的CD4+T细胞中IFN-γ+T细胞的百分比从OVA处理的小鼠的0.25％增加到OVA+热iMVA处理的小鼠的0.65％(P<0.05；n＝5；图1G、图1I)。另外，与仅给予OVA相比，OVA和热iMVA的肌内共给予诱导了更高效价的抗OVA IgG1和IgG2c(对于IgG1，P<0.01；n＝5；图1J；对于IgG2，P<0.001；n＝5；图1K)。
实施例2：在产生抗原特异性CD8+和CD4+T细胞应答方面，热iMVA优于完全弗氏佐剂 (CFA)。
完全弗氏佐剂(CFA)包含在不可代谢的油(石蜡油和二缩甘露醇一油酸(mannidemonooleate))中的热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。它还含有TLR2、TLR4和TLR9的配体。抗原与CFA一起注射诱导Th1优势免疫应答。目前，CFA在人体中的使用由于其毒性概况而不被允许，并且其在动物体内的使用由于注射部位的疼痛反应和组织受损的风险而受限于皮下或腹膜内途径。为了测试热iMVA是否优于CFA，将小鼠用OVA抗原+热iMVA或OVA+CFA皮下疫苗接种两次，间隔2周，并且随后如实施例1所述，收获所收获的脾、dLN和血液，用于抗OVA CD8+和CD4+T细胞和抗体应答。在疫苗接种的小鼠的脾中，与用OVA+CFA进行免疫相比，OVA与热iMVA的皮下共给予诱导更高水平的抗原特异性CD8+和CD4+T细胞。在脾的CD8+T细胞中IFN-γ+T细胞的百分比从OVA处理的小鼠的0.8％增加到OVA+热iMVA处理的小鼠的1.6％，而在OVA+CFA处理的小鼠为1.0％(P<0.01；n＝5；OVA+热iMVA相比于OVA+CFA；图2B)。在脾的CD4+T细胞中IFN-γ+T细胞的百分比从OVA处理的小鼠的0.75％增加到OVA+热iMVA处理的小鼠的1.6％，而在OVA+CFA组中为0.75％(P<0.001；n＝5；OVA+热iMVA相比于OVA+CFA；图2C)。在dLN中观察到相似的差异，这揭示了，在疫苗接种的小鼠的dLN中，与用OVA+CFA进行免疫相比，OVA与热iMVA的皮下共给予诱导了更高水平的抗原特异性CD8+和CD4+T细胞(对于IFN-γ+CD8+T细胞，P<0.05；n＝5；OVA+热iMVA相比于OVA+CFA；图2D；对于IFN-γ+CD4+T细胞，P<0.001；n＝5；OVA+热iMVA相比于OVA+CFA；图2E)。在OVA+CFA免疫的小鼠血清中的IgG1效价高于在OVA+热iMVA免疫的小鼠血清中的那些IgG1效价(P<0.01；n＝5；OVA+热iMVA相比于OVA+CFA；图2F)，而在OVA+CFA免疫的小鼠血清中的IgG2c效价低于在OVA+热iMVA免疫的小鼠血清中的那些IgG2c效价(P<0.01；n＝5；OVA+热iMVA相比于OVA+CFA；图2G)。IgG1被认为是“Th2样”同种型，而IgG2c被认为是“Th1样”同种型。这些结果指示，OVA与热iMVA的共给予促进了IgG2c同种型的产生。与OVA+热iMVA的肌内共给予相比，OVA+热iMVA的皮下共给予诱导了脾中更高水平的抗OVA CD8+T细胞(P<0.05；＝5；SCOVA+热iMVA相比于IM OVA+热iMVA；图2B)。
实施例3：热iMVA介导的疫苗佐剂对抗原特异性T细胞应答的作用需要Batf3依赖 性DC。
Batf3是对于CD103+/CD8α+谱系DC的发展很重要的转录因子，所述DC在病毒和肿瘤抗原的交叉呈递中发挥重要作用。Batf3缺陷型小鼠无法排斥高免疫原性肿瘤。为了测试STING或Batf3是否在热iMVA介导的疫苗佐剂作用中起作用，将WT C57B/6、STINGGt/Gt或Batf3-/-小鼠用OVA+热iMVA进行皮下疫苗接种两次，间隔两周。然后在最后一次疫苗接种后一周，收获脾、dLN和血液用于细胞和体液免疫应答的分析(图3A)。发现在脾中由热iMVA诱导的CD8+T细胞中抗OVA IFN-γ+T细胞的百分比从免疫的WT小鼠的1.2％降低至免疫的Batf3-/-小鼠的0.38％(P<0.01；n＝5；WT相比于Batf3-/-；图3B)。另外，在dLN中由热iMVA诱导的CD8+T细胞中抗OVA IFN-γ+T细胞的百分比从免疫的WT小鼠的1.3％降低至免疫的Batf3-/-小鼠的0.4％(P<0.0001；n＝5；WT相比于Batf3-/-；图3D)。Batf3缺陷似乎不影响脾或dLN中抗OVA IFN-γ+CD4+T细胞的产生(图3C和图3E)。这些结果支持在我们的疫苗接种模型中，Batf3依赖性DC在交叉呈递OVA抗原中在脾和dLN中产生OVA特异性CD8+T细胞的作用。
还观察到，在脾中由热iMVA诱导的CD8+T细胞中抗OVA IFN-γ+T细胞的百分比从免疫的WT小鼠的1.2％降低至免疫的STINGGt/Gt小鼠的0.97％(P<0.31；n＝5；WT相比于STINGGt /Gt；图3B)。在dLN中由热iMVA诱导的CD8+T细胞中抗OVA IFN-γ+T细胞的百分比从免疫的WT小鼠的1.3％降低至免疫的STINGGt/Gt小鼠的0.98％(P＝0.0564；n＝5；WT相比于STINGGt/Gt；图3D)。STING缺陷似乎不影响脾或dLN中抗OVA IFN-γ+CD4+T细胞的产生(图3C和图3E)。与WT小鼠相比，在免疫的STINGGt/Gt小鼠中，血清IgG2c效价降低，而血清IgG1效价在两组之间无显著差异(图3F和图3G)。
实施例4：在划痕期间，MVA-OVA与热iMVA的共给予增强了OVA特异性CD8+T细胞的 产生。
MVA是多种感染因子和癌症的高度减毒的、非复制性的、安全并且有效的疫苗载体。经由皮肤划痕测试了MVA疫苗接种的最佳剂量。在皮肤划痕后，向6-8周龄雌性C57BL/6J小鼠的尾部以105、106和107pfu的剂量给予MVA-OVA(其编码在P7.5启动子控制下的全长OVA)。在疫苗接种后一周，将小鼠安乐死并且分离脾以供测试抗原特异性CD8+T细胞应答。将骨髓衍生的DC(BMDC)用MVA-OVA(MOI为5)感染1h并且然后孵育5h，之后将BMDC与脾细胞一起孵育12h。处理细胞用于针对IFN-γ+CD8+T细胞的细胞内细胞因子染色(ICS)。可替代地，将BMDC与SIINFEKL肽(SEQ ID NO:1)一起孵育1h并且然后与脾细胞一起孵育12h。针对与SIINFEKL肽(SEQ ID NO:1)反应的IFN-γ+CD8+T细胞进行ICS。发现对于任一测定，在三个剂量中，用107pfu的MVA-OVA进行皮肤划痕引起最高百分比的IFN-γ+CD8+T细胞(P<0.01；n＝5；107pfu相比于105pfu；图4B、图4C)。
为了测试STING或Batf3依赖性DC是否在MVA诱导的疫苗接种作用中起作用，在皮肤划痕后，还向STINGGt/Gt或Batf3-/-小鼠的尾部给予106pfu剂量的MVA。发现与免疫的WT小鼠中的那些抗病毒和抗OVA IFN-γ+CD8+T细胞相比，MVA-OVA诱导的抗病毒和抗OVA IFN-γ+CD8+T细胞减少(P<0.05；n＝5；WT相比于Batf3-/-；图4B)。未观察到在MVA-OVA疫苗接种后，在STING缺陷型小鼠的脾中产生抗原特异性IFN-γ+CD8+T细胞的显著缺陷(图4B和图4C)。为了测试热iMVA是否对重组MVA介导的疫苗接种提供了佐剂作用，在皮肤划痕后，向WT小鼠的尾部共给予热iMVA(105pfu的当量)与MVA-OVA(107pfu)。发现热iMVA(105pfu)和MVA-OVA(107pfu)的共给予将抗病毒和抗OVA IFN-γ+CD8+T细胞从0.74％增加到0.90％(P＝0.461；n＝5；MVA-OVA107相比于MVA-OVA 107+热iMVA 105；图4B)。另外，热iMVA(105pfu)和MVA-OVA(107pfu)的共给予将抗SIINFEKL(SEQ ID NO:1)IFN-γ+CD8+T细胞从0.87％增加到1.57％(P＝0.094；n＝5；MVA-OVA 107相比于MVA-OVA 107+热iMVA 105；图4C)。这些结果指示，Batf3依赖性DC对于重组MVA诱导的抗原特异性CD8+T细胞应答也很重要。因此，热iMVA可以作为重组MVA介导的疫苗作用的佐剂发挥作用，以增强抗原特异性CD8+T细胞。
实施例5：热iMVA诱导GM-CSF培养的骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的MHC-I表达，但 是它不增加抗原的吞噬作用。
用热iMVA感染BMDC诱导了DC成熟，这依赖于STING介导的胞质DNA传感途径(Dai等人,Science Immunology 2017)。在此实施例中，将热iMVA对BMDC细胞表面上的MHC-I表达的诱导与聚I:C进行比较。在存在或不存在热iMVA的情况下，将BMDC与OVA一起孵育3或16h，或与聚IC一起孵育16h。使用抗H-2Kb抗体通过FACS确定细胞表面MHC-I(H-2Kb)表达。发现尽管与热iMVA共孵育3h不增加H-2Kb表达，但是与热iMVA共孵育16h显著增加了H-2Kb的细胞表面表达(P<0.001；n＝3；OVA+热iMVA 3h相比于OVA+热iMVA 16h；图5A、图5B)。H-2Kb的平均荧光强度从与仅OVA共孵育的BMDC上的1778增加到与OVA+热iMVA共孵育16h的BMDC上的5900，以及与OVA+聚IC共孵育的BMDC上的3900(P<0.05；n＝3；OVA+热iMVA16h相比于OVA+聚IC 16h；图5A、图5B)。此结果表明，与聚IC相比，热iMVA是BMDC上MHC-I表达的更强的诱导剂。
为了评估BMDC摄取荧光标记的模型抗原OVA(OVA-647)的能力是否受热iMVA处理的影响，将BMDC用热iMVA(MOI为1)感染1h并且然后与OVA-647一起孵育1h。通过流式细胞术测量BMDC中吞噬的OVA-647的荧光强度。发现与热iMVA一起预孵育1h不会影响其吞噬OVA-647的能力(图5C)。相比之下，当将BMDC用热iMVA(MOI为1)感染或模拟感染16h，并且然后与OVA-647一起孵育1h时，与模拟处理的BMDC相比，在热iMVA处理的BMDC中吞噬的OVA-647的荧光强度有所降低(图5D)。这些结果指示，尽管热iMVA处理的BMDC经历成熟，但是它们吞噬抗原的能力由于成熟而降低。
实施例6：GM-CSF培养的BMDC与热iMVA和OVA的共孵育增强了体外OT-I和OT-II T 细胞的增殖。
将表皮树突细胞用活的WT牛痘感染抑制了DC激活抗原特异性T细胞的能力(Deng等人,JVI,2006)。为了测试BMDC的热iMVA感染是否增强了抗原特异性OT-I和OT-II T细胞的增殖，在存在或不存在热iMVA的情况下，将BMDC与各种浓度的OVA一起孵育3h。将细胞洗涤以除去未吸收的OVA或病毒，并且然后与羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的OT-I T细胞共培养3天(BMDC:OT-I T细胞＝1:5)。将流式细胞术应用于测量OT-I细胞的CFSE强度。发现用热iMVA预孵育增强了DC刺激OT-I T细胞增殖的能力，如在分裂细胞中通过CSFE稀释所指示(图6A和图6B)。还发现用热iMVA或聚IC预处理适度增强了DC刺激OT-IIT细胞增殖的能力，所述OT-II T细胞识别通过DC上的MHC-II呈递的OVA抗原(图7A和图7B)。
实施例7：Flt3L培养的BMDC与热iMVA和OVA的共孵育显著增强了体外OT-I T细胞 的增殖。
FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)是区分Batf3依赖性CD103+/CD8α+DC和浆细胞样DC(pDC)的关键生长因子。在存在或不存在热iMVA的情况下，将Flt3L培养的BMDC用OVA脉冲处理，并且然后与CFSE标记的OT-I细胞共培养3天(BMDC:OT-I＝1:5)。将流式细胞术应用于测量OT-I细胞的CFSE强度。发现即使在极低OVA浓度下，热iMVA也有效刺激OT-I细胞的增殖，所述OT-I细胞识别在MHC-I上呈递的OVA257-264(SIINFEKL)肽(SEQ ID NO:1)(图8)。
实施例8：浆细胞样树突细胞(pDC)在热iMVA介导的疫苗佐剂作用中起重要作用。
本文所述的结果表明，Flt3L培养的DC在交叉呈递OVA抗原以刺激OT-I T细胞增殖方面比GM-CSF培养的DC更有效。Flt3培养的DC产生浆细胞样DC(pDC)，所述浆细胞样DC是有效的I型IFN产生细胞，其可以经由MyD88依赖性内体toll样受体7和9通过热灭活的牛痘激活(Cao等人,2012,PLoS One)。pDC还可以交叉呈递抗原以刺激CD8+T细胞应答。为了测试pDC是否在体内热iMVA介导的佐剂作用中发挥作用，在用OVA+热iMVA进行皮内免疫之前一天和之后一天使用抗PDCA-1抗体，这在第0天和第14天进行。在第21天分离脾和dLN用于抗原特异性CD8+T细胞分析(图9A)。发现OVA+热iMVA的皮内共给予将脾的CD8+T细胞中的IFN-γ+T细胞的百分比从OVA处理的小鼠的0.097％增加到OVA+热iMVA处理的小鼠的0.16％(P<0.001；n＝5；OVA +热iMVA；图9B)。pDC的耗尽导致了脾的CD8+T细胞中IFN-γ+T细胞的百分比的显著降低(P<0.001；n＝5；OVA+热iMVA +对照IgG相比于OVA+热iMVA+抗PDCA-1；图9B)。在dLN中获得了相似的结果(图9C)。这些结果支持了在体内肽疫苗接种模型中，pDC在热iMVA引起的疫苗佐剂作用中的关键作用。
实施例9：迁移性树突细胞子集Langerin-CD11b-和CD11b+DC在OVA抗原摄取中是 有效的。
许多DC子集存在于淋巴结中，包括迁移性DC和驻留DC。迁移性DC是MHC-II+CD11c+。驻留树突细胞群体是MHC-IIIntCD11c+。迁移性DC可以进一步分为CD11b+DC、Langerin-CD11b-DC和Langerin+DC。Langerin+DC由CD103+DC和Langerhans细胞构成，而驻留DC由CD8α+驻留DC和CD8α-驻留DC构成(图10A)。为了测试哪些DC子集在吞噬用荧光染料(OVA-647)标记的OVA抗原中是有效的并且具有迁移至dLN的能力，将OVA-647皮内(ID)注射到右侧腹，并且在注射后24h收获dLN。发现Langerin-CD11b-和CD11b+DC是将OVA-647携带至dLN中的两个重要的迁移性DC子集(图10B)。为了比较OVA-647与或不与疫苗佐剂Addavax或热iMVA的共给予是否影响Langerin-CD11b-和CD11b+DC中OVA-647+细胞的百分比，将OVA-647与或不与Addavax或热iMVA一起皮内(ID)注射，并且分析Langerin-CD11b-和CD11b+DC中的OVA-647+DC。发现OVA与热iMVA的共给予增加了Langerin-CD11b-和CD11b+DC中OVA-647+细胞的百分比，而OVA与Addavax的共给予未能实现相同的增加(**P<0.01；n＝3；OVA+热iMVA相比于OVA+Addavax；图10C，*P<0.05；n＝3；OVA+热iMVA相比于OVA+Addavax；图10D)。Addavax是一种广为接受的基于角鲨烯的水包油纳米乳液，其配方与已经在欧洲获得许可用于辅助流感疫苗的MF59类似。这些结果表明，OVA-647与热iMVA的共给予增强了迁移性DC将吞噬的抗原转运至dLN的能力。
实施例10：热iMVA是用于辐照的全细胞疫苗的有效免疫佐剂。
使用辐照的全细胞疫苗而不是肽肿瘤抗原或新抗原的优势包括：(i)肿瘤细胞提供了可以被宿主免疫系统识别的多种肿瘤抗原；以及(ii)可以绕过鉴定肿瘤抗原或新抗原的需要或时间。分析了将热iMVA与辐照的B16-OVA一起添加是否改善了疫苗接种的功效，以及抗PD-L1的系统性递送是否可以进一步改善疫苗接种的功效。将小鼠皮内植入B16-OVA，在第3、6和9天在对侧胁腹用辐照的B16-OVA、B16-OVA+热iMVA或B16-OVA+聚IC对所述小鼠进行三次皮内疫苗接种。发现用辐照的B16-OVA+热iMVA进行疫苗接种将中值存活期从16天(用辐照的B16-OVA疫苗接种)延长到了23天(**，P<0.01；N＝5；辐照的B16-OVA+热iMVA相比于仅辐照的B16-OVA；图11B)。在抗PD-L1抗体的存在下，用辐照的B16-OVA+热iMVA进行疫苗接种将中值存活期从20天延长到了27天(**，P<0.01；N＝10；辐照的B16-OVA+热iMVA+抗PD-L1相比于辐照的B16-OVA+抗PD-L1；图11C)。在辐照的B16-OVA+热iMVA与辐照的B16-OVA+聚IC组之间，未观察到中值存活期的统计学差异。接受聚IC的小鼠比热iMVA处理的小鼠体重减轻更多，这表明系统性炎症和毒性(数据未显示)。这些结果表明，热iMVA是用于辐照的全细胞疫苗接种的有效并且安全的疫苗佐剂。
实施例11：热iMVA是新抗原肽疫苗接种的免疫佐剂。
为了测试热iMVA是否可以充当新抗原肽疫苗接种的疫苗佐剂，使用了皮下疫苗接种模型，在所述模型中，首先将小鼠用B16-F10细胞(7.5x 104个细胞/小鼠)进行皮内植入。植入后第3天和第7天，将小鼠用与或不与热iMVA或聚I:C一起的新抗原肽(M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)和M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6))的混合物在对侧胁腹进行皮下(SC)疫苗接种。监测肿瘤生长和小鼠存活。发现仅用新抗原肽进行的SC疫苗接种产生全身性抗肿瘤免疫(图12A-图12C)。当将新抗原肽混合物与热iMVA共给予时，增强了抗肿瘤作用(图12A-图12C)。
实施例12：热iMVA是病毒抗原肽疫苗接种的免疫佐剂。
病毒抗原是可以被宿主免疫系统识别的有效免疫原。为了测试热iMVA或热灭活的牛痘和病毒抗原(如人乳头瘤病毒E7的合成长肽(SLP))的组合是否引发抗病毒T细胞，将小鼠用仅E7 SLP/或E7 SLP+热iMVA/或E7+聚I:C进行皮下疫苗接种两次，间隔2周，并且随后收获所收获的脾、dLN和血液用于抗CD8+和CD4+T细胞和抗体应答。为了测试热iMVA在治疗性疫苗接种模型中的作用，将表达E7的癌细胞进行皮内植入，并且然后在使用或不使用佐剂的情况下间隔两周进行疫苗接种，并且在小鼠中分析肿瘤体积。
实施例13：确定在产生抗原特异性免疫应答中，肿瘤内(IT)疫苗接种是否优于皮 下(SC)疫苗接种。
已经显示，热iMVA的肿瘤内(IT)注射根除注射的肿瘤并且诱导系统性抗肿瘤免疫，这需要Batf3依赖性CD103+/CD8α+DC和STING介导的胞质DNA传感途径。热iMVA的IT递送部分通过激活cGAS/STING途径改变肿瘤免疫抑制微环境，并且促进CD103+DC的肿瘤抗原呈递。预期与热iMVA+抗原的SC递送相比，热iMVA+模型抗原或新抗原的IT递送将增强肿瘤浸润DC的抗原呈递并且产生优异的适应性免疫。
为了测试在产生抗原特异性免疫应答中，IT疫苗接种是否优于SC疫苗接种，将B16-F10黑色素瘤细胞(5x 105个细胞)在右侧腹进行皮内植入。在植入后第7天，当肿瘤的直径为2-3mm时，可以将热iMVA和OVA蛋白直接注射到肿瘤中，或者在距右侧腹肿瘤1cm处进行SC注射。注射后一周，将收集TDLN和脾，并且将通过FACS分析抗OVA CD4和CD8 T细胞。
可替代地，将B16-F10新抗原肽混合物(M27/M30/M48)与热iMVA直接共注射到右侧腹的肿瘤中，或在距离右侧腹肿瘤1cm处进行SC注射。注射后一周，将收集TDLN和脾，并且将其与M27、M30或M48肽共培养16h用于ELISPOT分析。
等效物
本发明技术并不受限于本申请中描述的具体实施方案，所述具体实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。对于本领域技术人员清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行多种修改和改变。除了本文列举的方法和装置外，本领域技术人员根据前述描述将明了在本发明技术范围内的功能上等效的方法和装置。此类修改和改变意图落在所附权利要求的范围内。本发明技术仅由所附权利要求的条款以及此类权利要求授权的等效物的全部范围来限定。应当理解，本发明技术不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在是限制性的。
另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员应认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
本领域技术人员应理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围及子范围的组合。任何所列范围都可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样本领域技术人员应理解，诸如“高达(up to)”、“至少(at least)”、“大于(greater than)”、“小于(less than)”等所有言辞都包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等等。
本文提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体而并入，包括所有图形和表格，并入程度至其与本说明书的明确教示一致。
其他实施方案在以下权利要求中提出。

Claims (32)

1.一种在有需要的受试者中治疗实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予包含抗原和治疗有效量的佐剂的免疫原性组合物，所述佐剂包含灭活的改良安卡拉牛痘病毒和/或灭活的牛痘病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒是热灭活的改良安卡拉牛痘病毒(热iMVA)或UV灭活的MVA，并且所述灭活的牛痘病毒是热灭活的牛痘病毒或UV灭活的牛痘病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述灭活的改良牛痘病毒是热iMVA。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、NY-ESO-1、人乳头瘤病毒E6和E7及其组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述给予步骤包括以一个或多个剂量给予所述免疫原性组合物，其中所述给予步骤包括以一个或多个剂量给予所述免疫原性组合物，和/或其中所述抗原和所述佐剂是分开、依序或同时给予。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者给予选自以下的免疫检查点阻断剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性死亡1(PD-1)抑制剂，PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述免疫原性组合物与所述免疫检查点阻断剂的给予分开、依序或同时递送至所述受试者。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中治疗包含以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫应答或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫应答、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述免疫应答的诱导、增强或促进包括以下中的一种或多种：
如与未处理的对照样品相比，干扰素γ(IFN-γ)在脾、引流淋巴结和/或血清中的T细胞中的表达水平增加；
如与未处理的对照样品相比，抗原特异性T细胞在脾、引流淋巴结和/或血清中的水平增加；以及
如与未处理的对照样品相比，抗原特异性免疫球蛋白在血清中的水平增加。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗原特异性免疫球蛋白是IgG1或IgG2。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中将所述免疫原性组合物配制为肿瘤内、肌内、皮内或皮下给予。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤鳞状细胞癌、默克尔细胞癌、胃癌、肝癌和肉瘤。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒或灭活的牛痘病毒以每次给予约105至约1010噬斑形成单位(pfu)的剂量给予。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
16.一种包含抗原和佐剂的免疫原性组合物，所述佐剂包含灭活的改良安卡拉牛痘病毒和/或灭活的牛痘病毒。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒是热灭活的改良安卡拉牛痘病毒(热iMVA)或UV灭活的MVA，并且所述灭活的牛痘病毒是热灭活的牛痘病毒或UV灭活的牛痘病毒。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其中所述灭活的改良牛痘病毒是热iMVA。
19.根据权利要求16、17或18所述的免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、Pmel17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、NY-ESO-1、人乳头瘤病毒E6和E7及其组合。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含选自以下的免疫检查点阻断剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性死亡1(PD-1)抑制剂，PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。
22.根据权利要求21所述的免疫原性组合物，其中所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
23.根据权利要求16-22中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒或灭活的牛痘病毒以每次给予约105至约1010噬斑形成单位(pfu)的剂量给予。
24.一种试剂盒，所述试剂盒包含使用说明、容器器件和以下各项的单独部分：(a)抗原；和(b)佐剂，所述佐剂包含灭活的改良安卡拉牛痘病毒和/或灭活的牛痘病毒。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述灭活的改良安卡拉牛痘病毒是热灭活的改良安卡拉牛痘病毒(热iMVA)或UV灭活的MVA，并且所述灭活的牛痘病毒是热灭活的牛痘病毒或UV灭活的牛痘病毒。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述灭活的改良牛痘病毒是热iMVA。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的试剂盒，其中所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原、GPA33、HER2/neu、GD2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、MUM-1、CDK4、N-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、ErbB2、癌症抗原125(CA-125)、癌胚抗原(CEA)、RAGE、MART(黑色素瘤抗原)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、MUC-5ac、MUC-16、MUC-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、Pmel 17(gp100)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、前列腺癌psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、EBNA(爱泼斯坦-巴尔病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(LRP)Bcl-2、前列腺特异性抗原(PSA)、Ki-67、CEACAM6、结肠特异性抗原-p(CSAp)、NY-ESO-1、人乳头瘤病毒E6和E7及其组合。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含选自以下的免疫检查点阻断剂：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)抑制剂、程序性死亡1(PD-1)抑制剂，PD-L1抑制剂和PD-L2抑制剂。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述免疫检查点阻断剂包含PD-L1抑制剂，所述PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。
30.根据权利要求4-14中任一项所述的方法，其中所述抗原包含选自以下的新抗原：M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)、M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6)及其组合。
31.根据权利要求20-23中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含选自以下的新抗原：M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)、M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6)及其组合。
32.根据权利要求27-29中任一项所述的试剂盒，其中所述抗原包含选自以下的新抗原：M27(REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD)(SEQ ID NO:4)、M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL)(SEQ ID NO:5)、M48(SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS)(SEQ ID NO:6)及其组合。
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CN113350499A (zh) * 2021-06-29 2021-09-07 贵州医科大学 鸡卵清蛋白OVA mRNA在制备非特异性免疫刺激剂中的应用
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