CN106456747A - 用表达肿瘤抗原的重组痘病毒和免疫检查点分子拮抗剂或激动剂治疗癌症的组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于癌症治疗的组合物、试剂盒和方法，其使用编码肿瘤相关抗原的重组痘病毒与免疫检查点抑制剂的拮抗剂或激动剂组合。

Description

用表达肿瘤抗原的重组痘病毒和免疫检查点分子拮抗剂或激 动剂治疗癌症的组合疗法
发明领域
本发明涉及使用编码肿瘤抗原的重组痘病毒与免疫检查点分子的一种或多种激动剂或拮抗剂组合的癌症治疗。
发明背景
重组痘病毒已用作传染性生物的疫苗，并且最近用作肿瘤的疫苗。Mastrangelo等J Clin Invest.2000；105(8):1031–1034。已经证实这些痘病毒类别中的两种，禽痘病毒和正痘病毒，对抗战肿瘤有效并且已经涉及到潜在癌症治疗。同上。
一个示例性禽痘病毒种类鸡痘已显示为用于人施用的安全媒介物，因为鸡痘病毒(fowlpox virus)进入哺乳动物细胞并表达蛋白质，但是复制失败。Skinner等Expert RevVaccines.2005年2月；4(1):63-76。另外，鸡痘病毒作为媒介物用于表达的用途正在于抗癌症、疟疾、肺结核和AIDS的疫苗的众多临床试验中加以评估。同上。
最为熟知的正痘病毒牛痘被用于全球天花的根除中并且显示了其作为载体和/或疫苗的有用性。重组牛痘载体已被工程化改造以表达多种插入基因，所述基因包括若干种肿瘤相关基因诸如p97、HER-2/neu、p53和ETA(Paoletti等，1993)。
正痘病毒的有用株为修饰型牛痘安卡拉(MVA)病毒。MVA通过牛痘病毒的安卡拉株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上连续516次传代来产生(相关综述，参见Mayr,A.等Infection 3,6-14(1975))。由于这些长期传代，所得MVA病毒的基因组缺失了其基因组序列的约31千碱基并因此被描述为对于禽细胞的复制宿主细胞高度受限(Meyer,H.等,J.Gen.Virol.72,1031-1038(1991))。已证实在多种动物模型中所得MVA是明显无毒性的(Mayr,A.&Danner,K.,Dev.Biol.Stand.41:225-34(1978))。另外，这种MVA株已经在临床试验中作为针对人天花病免疫的疫苗进行了测试(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I,Abt.Org.B 167,375-390(1987)；Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99,2386-2392(1974))。在这些人类研究中，与基于牛痘的疫苗相比，MVA具有减小的毒性或传染性，同时MVA仍诱导良好的特异性免疫应答。
在接下来的数十年中，MVA被工程化改造用作用于重组基因表达的病毒载体或用作重组疫苗(Sutter,G.等，Vaccine 12:1032-40(1994))。
尽管在二十世纪七十年代期间Mayr等已证明MVA在人和哺乳动物中是高度减毒和无毒性的，但是某些研究者已报道MVA在哺乳动物和人细胞系中并未完全减毒，因为在这些细胞中可能发生残留复制。(Blanchard等，J Gen Virol 79,1159-1167(1998)；Carroll和Moss，Virology 238,198-211(1997)；Altenberger，美国专利第5,185,146号；Ambrosini等，J Neurosci Res 55(5),569(1999))。假定这些出版物中所报道的结果是用MVA的各种已知株获得的，因为所用病毒在其特性，尤其是其在各种细胞系中的生长行为方面有本质上的差异。出于各种原因(包括与在人类中使用有关的安全考虑)，此残留复制是不希望的。
已描述了具有增强的安全特性、用于开发更安全的产品(诸如疫苗或药物)的MVA株。参见国际PCT公布WO2002042480(还参见例如美国专利第6,761,893号和第6,913,752号)，其全部以引用的方式并入本文。此类株能够在非人细胞和细胞系中，特别是在鸡胚成纤维细胞(CEF)中进行繁殖性复制，但是不能在某些已知允许已知牛痘株复制的人细胞系中进行明显的繁殖性复制。此类细胞系包括人角化细胞细胞系HaCat(Boukamp等J CellBiol 106(3):761-71(1988))、人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC号CCL-2)、人胚肾细胞系293(ECACC号85120602)和人骨骼骨肉瘤细胞系143B(ECACC号91112502)。此类株还不能够在体内例如在某些小鼠品系(诸如免疫功能严重受损并且对复制病毒非常敏感的转基因小鼠模型AGR 129)中进行明显的繁殖性复制。参见，美国专利第6,761,893号。已描述了一种此类MVA株及其衍生物和重组体(称之为“MVA-BN”)。参见国际PCT公布WO2002042480(还参见例如美国专利第6,761,893号和第6,913,752号)。
MVA和MVA-BN已各自被工程化改造以用作重组基因表达的病毒载体或用作重组疫苗。参见例如，Sutter,G.等，Vaccine 12:1032-40(1994)、国际PCT公布WO2002042480(还参见例如美国专利第6,761,893号和第6,913,752号)。
癌症免疫疗法的某些途径包括使用肿瘤相关抗原的疫苗接种。在某些情况下，此类途径包括使用递送系统以促进宿主对肿瘤相关抗原的免疫应答。在某些情况下，此类递送系统包括重组病毒载体。参见，例如Harrop等，Front.Biosci.11:804-817(2006)；Arlen等，Semin.Oncol.32:549-555(2005)；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(增刊2):14567-14571(2004)。
HER-2是在许多癌症患者的肿瘤细胞中过表达的肿瘤相关抗原。用各种HER-2多肽进行的免疫已被用于产生针对表达这种抗原的肿瘤细胞的免疫应答。参见，例如Renard等，J.Immunology 171:1588-1595(2003)；Mittendorf等，Cancer 106:2309-2317(2006)。
已表明尽管在肺部中存在特征为高频率的调节性T细胞(Treg)的肿瘤介导的强烈免疫抑制性环境，但是编码HER-2抗原的MVA(MVA-BN-HER2)在实验性肺转移的鼠类模型中发挥了强有力的抗肿瘤功效。Mandl等，Cancer Immunol Immunother(2012)61:19–29。据报道重组MVA诱导了强烈的Th1-主导的HER-2-特异性抗体和T细胞应答。同上。抗肿瘤活性特征为增加了高度活化的HER-2-特异性、CD8+CD11c+T细胞对肺的浸润，并且伴随肺部中的Treg细胞频率降低，从而导致效应T细胞与Treg细胞的比率明显增大。同上。
还已表明MVA-BN-HER2在转移情形下在人临床研究中是安全的并且破坏耐受性以诱导特异性T和B细胞应答。Guardino等，Cancer Research:2009年12月15日；第69卷，第24期，增刊3。
曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin))是靶向HER2的细胞外结构域的人源化单克隆抗体(mAb)，并且已在HER2阳性乳腺癌中显示出临床功效。Wang等，Cancer Res.2012年9月1日；72(17):4417-4428。然而，大量患者对初始曲妥珠单抗治疗没有响应并且在连续治疗之后许多曲妥珠单抗响应的肿瘤发展出抗性。同上。
免疫细胞上的抑制性受体是癌症中免疫逃逸的关键调控因子。Woo等，CancerRes；72(4)；917–27,2011。在这些抑制性受体中，CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)起主要开关的作用，而其它受体诸如PD-1(程序性死亡1，CD279)、LAG-3(淋巴细胞活化基因，CD223)和TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3)似乎起到更微妙的变阻器功能。同上。
CTLA-4是免疫检查点分子，其在活化的T细胞上被上调。Mackiewicz,Wspolczesnaonkol 2012；16(5):363-370。CTLA-4是在抑制其增长的活化T细胞上表达的负性共刺激分子。参见Mellman,Nature 2011；480:480-9)。抗CTLA4mAb可阻断CTLA-4与CD80/86的相互作用并且切断免疫抑制的机制并且能够通过DC连续刺激T细胞。针对CTLA-4的两种IgG mAb即伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)已经用于黑素瘤患者的临床试验中。同上。
虽然这些新近研究已经表明，使用针对CTLA-4的IgG mAb可以为黑素瘤患者提供治疗益处，但是用这些抗CTLA-4抗体治疗已显示出高水平的免疫相关不良事件。Mellman等Nature 2011；480(7378):480-489。已将此类不良事件表征为目标命中毒性，其中受治患者出现不利影响，包括结肠炎和垂体炎，以及肝脏相关的问题。同上。
调节免疫系统的另一种人mAb是针对死亡-1受体(PD-1R)的BMS-936558(MDX-1106)，其配体(PD-1L)可在黑素瘤细胞上直接表达。同上。PD-1R是调节T细胞活化和耐受性的共刺激分子的B7:CD28家族的一部分，因此抗PD-1R可在破坏耐受性中起作用。同上。PD-1/PD-L1途径的占用产生对T细胞效应功能即细胞因子分泌和增殖的抑制。Turnis等，OncoImmunology 1:7,1172-1174；2012。高水平的PD-1与耗竭或长期刺激的T细胞相关。同上。而且，PD-1表达增加与癌症患者的存活率降低相关。同上。
虽然这些新近研究已表明PD-1表达可与癌症的存活率联系起来，但是通过抑制PD-1治疗癌症的早期研究已显示出多种不良副作用。Mellman等Nature 2011；480(7378):480-489；还参见Chow,Am Soc Clin Oncol Educ Book,2013,“Exploring novel immune-related toxicities and endpoints with immune-checkpoint inhibitors in non-small cell lung cancer”。
LAG-3是在各种淋巴样细胞上表达的负性共刺激分子。在炎症条件(诸如IFN-γ刺激)下LAG-3和MHC II类上调(Triebel Trends Immunol 2003；24:619-22)。
TIM-3在慢性感染和癌症期间在T细胞上表达(Jin Proc Natl Acad Sci 2010；107:14733-8,Baghadi Cancer Immunol Immunother 2013；62:629-37。
对另外的癌症治疗(包括活性免疫疗法和癌症疫苗)存在明显未满足的医学需求。此外，鉴于在许多当前癌症疗法，诸如检查点抑制剂疗法中所看到的不良副作用，本领域需要在较低剂量下保持功效的疗法。这些较低剂量疗法可以帮助减少和/或消除这些不利影响。
发明简述
本发明涵盖用于治疗人类癌症患者的方法、组合物和试剂盒。
在一个实施方案中，所述方法包括向人类癌症患者施用编码包含至少一种肿瘤抗原的多肽的重组痘病毒；并且向所述患者施用PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂。
在一个优选实施方案中，重组痘病毒为重组正痘病毒或重组禽痘病毒。
在一个更优选的实施方案中，重组正痘病毒为重组牛痘病毒或重组修饰型牛痘安卡拉(MVA)病毒。在另一个优选实施方案中，重组正痘病毒为MVA-BN。
在另一个优选实施方案中，重组禽痘病毒为重组鸡痘病毒。
在各个优选实施方案中，所述至少一种肿瘤抗原包括但不限于CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、tyrp1、tyrp2或畸形短尾抗原(Brachyury antigen)。
在其它优选实施方案中，PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂可分别包括抗PD-1拮抗剂抗体和抗CTLA-4抗体。
再一个实施方案中，本文描述的癌症治疗可以针对诸如但不限于以下的癌症：乳腺癌、肺癌、胃癌、肾癌、肝癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌或其组合。
又一个实施方案中，本公开涵盖一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用以下的组合：(a)治疗有效量的重组痘病毒载体，所述痘病毒载体包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，其中治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得施用所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。
还有更多实施方案中，本发明可包括用于治疗一名或多名癌症患者的试剂盒，所述试剂盒可包括治疗有效量的编码包含至少一种肿瘤抗原(TAA)的多肽的重组痘病毒；(b)PD-1拮抗剂；和(c)CTLA-4拮抗剂。
再一个实施方案中，所述试剂盒可包括：(a)重组痘病毒载体，所述痘病毒载体包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；(b)至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；和(c)施用治疗有效量的痘病毒和治疗有效量的免疫检查点拮抗剂或激动剂中的至少一种的说明书，使得治疗有效量的与痘病毒载体联合的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
又一个实施方案中，本发明包括一种用于在人类癌症患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用以下的组合：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，其中亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。
本发明另外的目的和优点将会在接下来的描述中部分阐明，部分将会从描述中显而易见，或可通过本发明的实践而了解。凭借所附权利要求书中特别指出的要素和组合，将会实现并获得本发明的目的和优点。
应理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。
并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明了本发明的一个或多个实施方案，并与描述一起用来解释本发明的原理。
附图简述
图1.MVA-BN-HER2和抗CTLA-4增加了肿瘤浸润抗原特异性CD8+ T细胞。如实施例2中所述为小鼠植入并且不处理或在第3和18天用200μg抗CTLA-4(于100μL PBS中，腹膜内)，和/或在第4和18天用1×107感染单位的MV-BN-HER2(7.1μL，经皮)处理。在第25天，合并肿瘤/肺部或脾脏(4只小鼠/组)并且再刺激过夜以测量病毒和肿瘤抗原特异性应答。
图2.用MVA-BN-HER2处理增加了脾脏中肿瘤抗原和病毒特异性T细胞的数量和质量。如实施例3中所述为小鼠植入。A)饼状图经面积加权以反映每一百万个CD8+ T-细胞中IFNγ+细胞的数量。B)用组合疗法，IFNγMFI随多功能T细胞而增加。
图3.MVA-BN-HER2与抗CTLA-4协同作用以消除实验性肺部转移模型中的肿瘤并增加存活率。在第1天如实施例4中所述为小鼠植入并且在第4和18天用MVA-BN-HER2，和在第3和17天用抗CTLA-4处理。****p<0.0001，对数秩检验。
图4.如实施例5中所述处理具有CT26-HER-2肺部肿瘤的小鼠并且在第25天分析肿瘤负荷。A)使小鼠安乐死并通过气管灌注台盼蓝。取出肺部并且短暂浸没在过氧化氢中，然后浸没在PBS中。在未处理和经抗CTLA-4处理的肺部中，可见为小块的肿瘤。在用MVA-BN-HER2处理的小鼠中没有可见肿瘤。比例尺等于1cm。B)在第25天用MVA-BN-HER2处理的小鼠具有与初始小鼠类似的肺重量，而在第25天在未处理和抗CTLA-4处理的小鼠中肺重量明显较大。****p<0.0001，单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验。
图5.如实施例6中所述为小鼠植入CT26-HER-2肿瘤。在第4和18天用MVA-BN-HER2和抗CTLA-4按200μg(A，10mg/kg)、66ug(B，3mg/kg)或22μg(C，1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，对数秩检验。
图6.如实施例7中所述为小鼠植入。在第1和第15天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，与100μL TBS中，在尾部根部处皮下)和在第1和15天用22μg抗CTLA-4(1mg/kg)处理小鼠。结果证明与其它治疗相比，MVA-BN-HER2与低剂量抗CTLA-4组合到第20天显著降低了肿瘤负荷。
图7.如实施例8中所述为小鼠植入CT26-HER-2肿瘤。在第4和18天用MVA-BN-HER2和抗PD-1按200μg(A，10mg/kg)、66ug(B，3mg/kg)或22μg(C，1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，*p<0.05，通过对数秩检验ns＝不显著。
图8.如实施例9中所述为雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，约20g，SimonsenLaboratories,Gilroy,CA)植入。在第4和18天用MVA-BN-HER2和在第3和17天用抗CTLA-4和抗PD-1按每种抗体200μg(A，10mg/kg)、66ug(B，3mg/kg)或22μg(C，1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜处理小鼠。****p<0.0001，对数秩检验。
图9.如实施例10中所述为雌性C57/BL6小鼠(6-8周龄，约20g，SimonsenLaboratories,Gilroy,CA)在第1天植入。在第4和18天用MVA-BN-CV301处理并用抗CTLA-4和抗PD-1(各200μg)经腹膜内处理小鼠。
图10.E6实体瘤模型中的PROSTVAC和抗PD-1组合疗法。如实施例12中所述为小鼠植入。A)在第1天用PROSTVAC-V，和在第8和15天用PROSTVAC-F处理小鼠。在第1和第15天给予抗PD-1。A)小鼠中的平均肿瘤体积。B)小鼠中的个别肿瘤生长。
图11.E6实体瘤模型中的PROSTVAC和抗LAG-3组合疗法。如实施例13中所述为小鼠植入。A)在第1天用PROSTVAC-V，和在第8和15天用PROSTVAC-F处理小鼠。在第1和第15天给予抗LAG-3。A)小鼠中的平均肿瘤体积。B)小鼠中的个别肿瘤生长。
图12.E6实体瘤模型中的PROSTVAC与抗PD-1和抗LAG-3组合疗法。如实施例14中所述为小鼠植入。A)在第1天用PROSTVAC-V，和在第8和15天用PROSTVAC-F处理小鼠。在第1和第15天给予抗PD-1和抗LAG-3。A)小鼠中的平均肿瘤体积。B)小鼠中的个别肿瘤生长。
图13.如实施例15中所述为小鼠植入。在第7和22天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，经皮)，和在第1、4、8、11、15、18、22、25天用抗ICOS(200μg，腹膜内)处理小鼠。A)平均肿瘤生长。B)个别小鼠中的肿瘤生长。
图14.在MVA-BN-HER2处理情况下Tim-3表达增加。如实施例32中所述处理小鼠。在第1天和第15天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，经皮)处理之后，在小鼠中测量Tim-3表达。
图15.如实施例33中所述处理小鼠。在第10天(A)肺部和血液中的CD8+ T细胞上和在用MVA-BN-HER2单次处理后肺部、血液和脾脏中的CD4+ T细胞(B)上ICOS增加。在第15天用MVA-BN-HER2第二次处理，在肺部、血液和脾脏中的CD8+ T细胞(C)和CD4+ T细胞(D)上ICOS增加。显示的数据是每组的三只小鼠在各时间点的平均值±SEM。
图16.如实施例34中所述处理小鼠。经第1天MVA-BN-HER2处理，在肺部和血液中的CD8+ T细胞上PD-1表达增加(A)。经第15天第二次处理在肺部、脾脏和血液中PD-1表达增加(C)。在单次处理之后在肺部中的CD4+ T细胞上PD-1略微增加(B)并且在第二次MVA-BN-HER2处理之后保持稳定(D)。
图17.如实施例35中所述处理小鼠。在第1天(A)或第1和15天(C)用MVA-BN-HER2处理之后，在肺部、脾脏和血液中的CD8+ T细胞上LAG-3表达增加。在第1天(B)或第1和15天处理(D)MVA-BN-HER2处理之后，CD4+ T细胞上的LAG-3表达略微增加。
图18.MVA-BN-CV301和抗PD-1减缓MC38-CEA实体瘤模型中的肿瘤生长。为小鼠皮内植入MC38-CEA肿瘤并且如实施例37中所述处理小鼠。进一步用MVA-BN-CV301和抗PD-1处理小鼠。A)小鼠中的平均肿瘤体积。B)小鼠中的个别肿瘤生长。
图19.MC38-CEA实体瘤模型中的MVA-BN-CV301和抗LAG-3组合疗法。为小鼠皮内植入MC38-CEA肿瘤并且如实施例38中所述处理小鼠。进一步用MVA-BN-CV301和抗LAG-3处理小鼠。A)小鼠中的平均肿瘤体积。B)小鼠中的个别肿瘤生长。
图20.MVA-BN-CV-301与PD-1和抗LAG-3组合。为小鼠皮内植入MC38-CEA肿瘤并且如实施例39中所述处理小鼠。进一步用MVA-BN-CV-301及抗LAG-3和抗PD1处理小鼠。A)小鼠中的平均肿瘤体积。B)小鼠中的个别肿瘤生长。
图21.如实施例40中所述处理小鼠。通过IFN ELISPOT(A、B)测定合并的脾细胞的PSA特异性应答并且通过流式细胞术测定细胞毒活性(％CD107+IFNγ+CD8 T细胞)(C)。对于每个个体小鼠通过ELISA测定抗PSA IgG滴度(D)。对于ELISPOT，曲线图示出了4次单独进行的实验的代表性数据。
图22.如实施例41中所述处理小鼠。(A)饼状图经尺寸加权以反映检测到的细胞的数量(在每张图下面指出了每一百万个T-细胞中PSA特异性CD8的总数)。(B)在每个细胞的基础上通过平均荧光强度(MFI)测量的IFNγ产量。曲线图示出了2次单独进行的实验的代表性数据。
图23.如实施例42中所述处理小鼠。在最后一次处理后14天，通过流式细胞术(％CD107+IFNγ+ CD8 T细胞)测定合并的脾细胞的牛痘病毒(VV)特异性(左侧的图A和C)或PSA特异性(右侧的图A和C)细胞毒活性。曲线图示出了2次单独进行的实验的代表性数据。
发明详述
许多当前的临床试验涉及采用被工程化改造来表达一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)的基于牛痘、修饰型牛痘安卡拉(MVA)和鸡痘的载体的疗法。将这些载体单独地使用或用于初免-加强策略(prime-boost strategies)中以产生针对多种癌症的主动免疫应答。采用使用表达PSA和TRICOMTM的牛痘和鸡痘的初免-加强策略并且目前处于对去势抗性转移性前列腺癌的全球III期临床试验(PROSPECT)中。CV301或CV-301采用使用表达MUC-1抗原、CEA和TRICOMTM的牛痘和鸡痘的异源初免-加强策略并且目前处于对膀胱癌的II期临床试验中。
MVA-BN-HER2(Mandl等，2012)处于用于治疗HER-2+-乳腺癌的I期临床试验中。这种重组载体源自高度减毒的修饰型牛痘安卡拉(MVA)病毒原种，称作MVA-BN。MVA-BN表达HER-2(命名为HER2)的由HER-2的细胞外结构域组成的经修饰形式，所述经修饰形式被工程化改造为包括来自破伤风毒素的两种通用T细胞表位(TTp2和TTp30)以有利于诱导针对HER-2的有效免疫应答。
为了进一步增强基于痘病毒的免疫疗法的抗肿瘤功效，将MVA-BN-HER2与阻断CTLA-4活性的单克隆抗体即下调T细胞活化的免疫检查点蛋白质联合。在CT26-HER-2实验性肺部转移性模型中，中值存活时间从未处理小鼠的30天增加至使用MVA-BN-HER2处理的49.5天，而单独的抗CTLA-4处理显示出几乎没有存活益处(中值存活35天)。相反，MVA-BN-HER2与抗CTLA-4组合明显将超过50％的小鼠的存活时间增加至大于100天(p<0.0001)。在第100天时，检查存活小鼠的肺部，并且没有可见肿瘤。
和MVA-BN-CV301(表达CEA和MUC-1的MVA有或没有TRICOM)各自也与针对PD-1和LAG-3的各种拮抗剂抗体组合在各种肿瘤模型中试验。发现组合会增强和MVA-BN-CV301的效果。
鉴于涉及CTLA-4拮抗剂和其它免疫检查点拮抗剂或激动剂的癌症治疗的毒性和不利影响(参见例如Mellman等Nature 2011)，使用编码肿瘤相关抗原的重组痘病毒诸如MVA-BN-HER2与阻断CTLA-4活性的单克隆抗体组合进行剂量滴定测定。如本文说明和描述的那样，重组痘病毒疗法诸如MVA-BN-HER2当与CTLA-4抑制联合时，与使用单独的CTLA-4抑制或单独的重组痘病毒疗法的癌症治疗相比，能够实现增加的疗效。最重要的是，通过组合治疗即使在较低剂量下也维持治疗功效。
为了进一步确定使用另外的免疫检查点拮抗剂或激动剂，基于痘病毒的免疫疗法的抗肿瘤功效的增强，将MVA-BN-HER2与阻断CTLA-4活性的单克隆抗体以及针对PD-1的拮抗性抗体联合。如本文说明和描述的那样，重组痘病毒疗法当与CTLA-4抗体和PD-1拮抗剂联合时，与使用结合的CTLA-4和单独的PD-1抑制或重组痘病毒疗法的癌症治疗相比，能够实现增加的疗效。最重要的是，通过组合治疗即使在较低剂量下也维持治疗功效。
为了进一步确定使用另外的免疫检查点拮抗剂和激动剂，基于痘病毒的免疫疗法的抗肿瘤功效的增强，使用编码肿瘤相关抗原的重组痘病毒诸如MVA-BN-HER2与如本文所述的各种另外的免疫检查点拮抗剂或激动剂组合进行剂量滴定测定。如本文说明和描述的那样，重组痘病毒疗法当与本申请的免疫检查点拮抗剂或激动剂联合时能够实现增加的疗效。最重要的是，通过组合治疗即使在较低剂量下也维持治疗功效。
在至少一个方面，设计本发明的方法和组合物，连同其也在低剂量下的有利治疗功效，以在致力于最小化在当前癌症疗法中所看到的不良副作用的同时，最大化免疫检查点和痘病毒癌症疗法的治疗益处。在一个实施方案中，这些伴随不利影响减少的治疗益处通过与痘病毒疗法组合施用较低剂量的免疫检查点拮抗剂或激动剂(例如，CTLA-4拮抗剂抗体)来实现。正如在本发明中所提供的，当联合痘病毒疗法时，免疫检查点激动剂和拮抗剂即使在较低剂量下也保持治疗功效。显著地，保持治疗功效的这些较低剂量可以包括免疫检查点激动剂或拮抗剂在作为单一疗法施用时将在治疗上无效的剂量。
在其它实施方案中，本发明包括一种或多种给药方案和施用痘病毒疗法和免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合的方法。在至少一个方面，设计本文提出的给药方案和施用方法以在致力于最小化与癌症疗法相关的不良副作用的同时，最大化免疫检查点和痘病毒癌症疗法的治疗益处。
编码包含肿瘤抗原的多肽的痘病毒
在本发明的一个实施方案中，存在一种方法，其包括向人类癌症患者施用编码和/或表达包含至少一种肿瘤抗原或肿瘤相关抗原的多肽的重组痘病毒；并且向所述患者施用至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂。
在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的重组痘病毒优选为正痘病毒，诸如但不限于牛痘病毒、修饰型牛痘安卡拉(MVA)病毒或MVA-BN。
牛痘病毒株的实例为天坛、哥本哈根、巴黎、布达佩斯、大连、Gam、MRIVP、Per、塔什干、TBK、Tom、伯尔尼、Patwadangar、BIEM、B-15、利斯特、EM-63、纽约市卫生局、埃尔斯特里、池田和WR的株。优选的牛痘病毒(VV)株是Wyeth(DRYVAX)株(美国专利7,410,644)。另一优选的VV株是修饰型牛痘安卡拉(MVA)病毒(Sutter,G.等[1994]，Vaccine 12:1032-40)。另一优选的VV株是MVA-BN。
在本发明的实践中有用并且已经按照布达佩斯条约的要求寄存的MVA病毒株的实例是于1994年1月27日以保藏号ECACC 94012707和于2000年12月7日以保藏号ECACC00120707寄存在英国威尔特郡索尔兹伯里波登当SP4 0JG的应用微生物学和研究中心公共卫生实验室服务局，疫苗研究和生产实验室欧洲动物细胞培养保藏中心(ECACC)的株MVA572和MVA 575。另外的示例性株是MVA-BN(其于2000年8月30日以编号V00083008寄存于欧洲细胞培养物收藏中心(ECACC))及其衍生物。
尽管MVA-BN出于其较高安全性(较低的复制能力)而被优选，但是所有MVA是适用于本发明的。根据本发明的实施方案，MVA株是MVA-BN和其衍生物。MVA-BN和其衍生物的定义在PCT/EP01/13628中给出，所述专利以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，本发明涵盖重组正痘病毒，优选牛痘病毒(VV)、Wyeth株、ACAM1000、ACAM 2000、MVA或MVA-BN用于癌症疗法的用途。重组正痘病毒通过向正痘病毒中插入异源序列产生。
在某些实施方案中，正痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)。在一个优选实施方案中，TAA包括但不限于CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、tyrp1、tyrp2或畸形短尾抗原
在其它实施方案中，肿瘤相关抗原被修饰成包括一个或多个外源TH表位。本文描述了各种癌症免疫治疗剂。在至少一个方面，本发明允许在人和其它动物(包括免疫受损患者)的初免/加强疫苗接种方案中使用此类试剂；并且诱导体液和细胞免疫应答两种，诸如在预先存在的Th2环境中诱导Th1免疫应答。
在某些实施方案中，MVA是MVA-BN，其于2000年8月30日以编号V00083008寄存于欧洲细胞培养物收藏中心(ECACC)，并且于国际PCT公布WO2002042480有描述(还参见例如美国专利第6,761,893和6,913,752号)。正如那些专利公布中所述，MVA-BN在细胞系293、143B、HeLa和HaCat中不繁殖性复制。具体而言，在人胚肾细胞系293中，MVA-BN表现出0.05至0.2的扩增比率。在人骨骼骨肉瘤细胞系143B中，MVA-BN表现出0.0至0.6的扩增比率。MVA-BN在人宫颈腺癌细胞系HeLa中表现出0.04至0.8的扩增比率，并且在人角化细胞细胞系HaCat中表现出0.02至0.8的扩增比率。在非洲绿猴肾细胞(CV1：ATCC号CCL-70)中MVA-BN具有0.01至0.06的扩增比率。
在鸡胚成纤维细胞(CEF：原代培养物)中，MVA-BN的扩增比率高于1，如国际PCT公布WO2002042480中所述(还参见例如美国专利第6,761,893号和第6,913,752号)。在CEF原代培养物中病毒可以高于500的比率容易地进行增殖和扩增。
在某些实施方案中，重组MVA是MVA-BN的衍生物。此类“衍生物”包括表现出与寄存株(ECACC号V00083008)基本上相同的复制特征，但在其基因组的一个或多个部分中表现出差异的病毒。具有与寄存的病毒相同的“复制特征”的病毒是以与CEF细胞和细胞系HeLa、HaCat和143B中的寄存株类似的扩增比率复制；并且在体内表现出类似复制特征(如例如在AGR129转基因小鼠模型中所测定的)的病毒。
在某些实施方案中，痘病毒是含有与痘病毒异源的附加核苷酸序列的重组牛痘病毒。在某些此类实施方案中，异源序列编码通过免疫系统诱导应答的表位。因此，在某些实施方案中，重组痘病毒用于针对包含该表位的蛋白质或试剂接着疫苗。在一个实施方案中，表位为肿瘤相关抗原，优选HER-2。在一个实施方案中，HER-2抗原包含SEQ ID NO:2的序列。
在其它实施方案中，表位是选自以下抗原的肿瘤相关抗原，诸如但不限于CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、tyrp1、tyrp2或畸形短尾。
在某些实施方案中，将编码本文描述的肿瘤相关抗原的异源核酸序列插入病毒基因组的非必需区中。在那些实施方案的某些中，异源核酸序列插在MVA基因组的天然存在的缺失位点处，如PCT/EP96/02926中所述。用于将异源序列插入到痘病毒基因组中的方法是本领域技术人员已知的。
在另一个实施方案中，表达肿瘤抗原的重组痘病毒是禽痘病毒，诸如但不限于鸡痘病毒。
术语“禽痘病毒”是指任何禽痘病毒，诸如鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、异常痘病毒、八哥痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、孔雀痘病毒、企鹅痘病毒、麻雀痘病毒、椋鸟痘病毒和火鸡痘病毒。优选的禽痘病毒是金丝雀痘病毒和鸡痘病毒。
金丝雀痘病毒的实例是Rentschler株。蚀斑纯化的金丝雀痘株(称为ALVAC)(美国专利第5,766,598号)根据布达佩斯条约的条款通过美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC)寄存，登记号为VR-2547。另一种金丝雀痘株是命名为LF2CEP 524 24 10 75的商用金丝雀痘疫苗株，可购自Institute Merieux,Inc。
鸡痘病毒的实例为株FP-1、FP-5、TROVAC(美国专利第5,766,598号)和POXVAC-TC(美国专利7,410,644)。FP-1是经修饰以作为疫苗用于一日龄小鸡的Duvette株。所述株是命名为O DCEP 25/CEP67/2309(1980年10月)的商用鸡痘病毒疫苗株并且可购自InstituteMerieux,Inc。FP-5是源于鸡胚的商用鸡痘病毒疫苗株，其可购自威斯康辛州麦迪逊的美国科学实验室(Schering Corp.的分部)，美国兽医许可证号165，序列号30321。
牛痘病毒株的实例为天坛、哥本哈根、巴黎、布达佩斯、大连、Gam、MRIVP、Per、塔什干、TBK、Tom、伯尔尼、Patwadangar、BIEM、B-15、利斯特、EM-63、纽约市卫生局、埃尔斯特里、池田和WR的株。优选的牛痘病毒(VV)株可包括Wyeth(DRYVAX)株(美国专利7,410,644)、ACAM 1000或ACAM 2000。另一优选的VV株是修饰型牛痘安卡拉(MVA)病毒(Sutter,G.等[1994]，Vaccine 12:1032-40)。另一优选的VV株是MVA-BN。
在某些实施方案中，禽痘病毒包括至少一种肿瘤相关抗原(TAA)。在一个优选实施方案中，TAA包括但不限于CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、tyrp1、tyrp2或畸形短尾抗原。
在其它实施方案中，表达肿瘤抗原的重组痘病毒是表达肿瘤抗原的牛痘病毒和表达肿瘤抗原的禽痘病毒(诸如鸡痘)的组合。考虑到，牛痘病毒和鸡痘病毒组合可以作为异源初免-加强方案施用。在一个非限制性实例中，异源初免-加强方案为或CV301。
为了制备疫苗，可以将痘病毒转化为生理上可接受的形式。在某些实施方案中，所述制备是基于制备用于针对天花的疫苗接种的痘病毒疫苗的经验，如例如在Stickl,H.等，Dtsch.med.Wschr.99,2386-2392(1974)中所述。
示例性制备如下所述。将纯化的病毒以在10mM Tris、140mM NaCl(pH 7.4)中配制的5x108 TCID50/ml的滴度储存在-80℃下。对于制备疫苗注射剂，例如，可将102-108个病毒粒子在安瓿(优选玻璃安瓿)中的2％蛋白胨和1％人白蛋白的存在下，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干。或者，疫苗注射剂可通过将制剂中的病毒逐步地冷冻干燥来制备。在某些实施方案中，制剂含有另外的添加剂诸如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮或适合于体内施用的其它添加剂诸如(包括但不限于)抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白)。然后，将安瓿密封并且可将其在4℃与室温之间的合适温度下储存几个月。然而，只要不存在需求，则安瓿优选地储存在低于-20℃的温度下。
在涉及疫苗接种或疗法的各个实施方案中，冻干物溶解于0.1至0.5ml的水溶液(优选生理盐水或Tris缓冲液)中，并且以全身或局部，即通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、鼻内、皮内或技术熟练的从业者已知的任何其它施用途径来施用。施用模式、剂量和施用次数的优化在本领域技术人员的技能和知识范围内。
在某些实施方案中，减毒牛痘病毒株可用于诱导免疫功能受损的动物，例如感染有SIV的猴(CD4<400/μl血液)或免疫功能受损的人的免疫应答。术语“免疫功能受损的”描述的是个体免疫系统的状态，其仅表现出不完全的免疫应答或防御传传染剂的效力降低。
某些示例性肿瘤相关抗原
在某些实施方案中，在受试者中产生了针对细胞相关多肽抗原的免疫应答。在某些此类实施方案中，细胞相关多肽抗原为肿瘤相关抗原。
术语“多肽”是指通过肽键或经修饰肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。氨基酸可以是自然存在的以及非自然存在的氨基酸或自然存在的氨基酸的化学类似物。该术语还指蛋白质，即包含至少一个多肽的功能性生物分子；当包含至少两个多肽时，这些多肽可形成复合物，可共价连接或可非共价连接。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂化的并且/或者包含辅基。
优选地，肿瘤相关抗原包括但不限于单独的或组合的HER-2、PSA、PAP、CEA、MUC-1、存活素、tyrp1、tyrp2或畸形短尾。此类示例性组合可包括CEA和MUC-1，也称作CV301。其它示例性组合可包括PAP和PSA。
许多肿瘤相关抗原是本领域已知的。示例性肿瘤相关抗原包括但不限于5α还原酶、甲胎蛋白、AM-1、APC、April、BAGE、β-联蛋白、Bcl12、bcr-abl、CA-125、CASP-8/FLICE、组织蛋白酶、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD33CD35、CD44、CD45、CD46、CD5、CD52、CD55、CD59、CDC27、CDK4、CEA、c-myc、Cox-2、DCC、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、法尼基转移酶、FGF8b、FGF8a、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、GAGE-家族、胃泌素17、胃泌素释放激素、GD2/GD3/GM2、GnRH、GnTV、GP1、gp100/Pmel17、gp-100-in4、gp15、gp75/TRP-1、hCG、类肝素酶(heparanse)、Her2/neu、HMTV、Hsp70、hTERT、IGFR1、IL-13R、iNOS、Ki67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、MAGE-家族、乳腺珠蛋白、MAP17、melan-A/MART-1、间皮素、MICA/B、MT-MMPs、粘蛋白、NY-ESO-1、骨粘连蛋白、p15、P170/MDR1、p53、p97/黑素转铁蛋白(melanotransferrin)、PAI-1、PDGF、uPA、PRAME、probasin、progenipoientin、PSA、PSM、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX-家族、STAT3、STn、TAG-72、TGF-α、TGF-β、胸腺素-β-15、TNF-α、TYRP-、TYRP-2、酪氨酸酶、VEGF、ZAG、p16INK4和谷胱甘肽-S-转移酶。
优选的PSA抗原包含位置155处异亮氨酸变为亮氨酸的氨基酸变化。美国专利7,247,615，其以引用的方式并入本文。
一种示例性肿瘤相关抗原为HER-2。HER-2是表皮生长因子受体家族(c-erbB)的成员，所述家族至今由四种不同的受体组成：c-erbB-1(EGFr)、c-erbB-2(HER-2，c-Neu)、c-erbB-3和c-erbB-4(Salomon等，1995)。与EGFr和HER-2相比，C-erbB-3和c-erbB-4表征不太充分。HER-2是整合膜糖蛋白。成熟蛋白质具有185kD的分子量并具有高度类似EGFr受体的结构特征(Prigent等，1992)。EGFr也是由一个亚基组成的整合膜受体。其具有170kD的表观分子量并且由621个氨基酸的表面配体结合结构域、23个氨基酸的单疏水性跨膜结构域和542个氨基酸的高度保守性胞质酪氨酸激酶结构域组成。蛋白质是N-糖基化的(Prigent等，1994)。
此家族中的所有蛋白质均是酪氨酸激酶。与配体的相互作用导致受体二聚化，这增大了酪氨酸激酶的催化作用(Bernard.1995,Chantry 1995)。该家族内的蛋白质能够同二聚或异二聚，这对其活性是重要的。EGFr传达生长促进作用并且刺激细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取(Prigent等1992)。HER-2也传达生长促进信号。
表皮生长因子受体在正常组织上低量表达，但是其在许多类型的癌症中过表达。EGFr在乳腺癌(Earp等，1993,Eppenberger 1994)、神经胶质瘤(Schlegel等，1994)、胃癌(Tkunaga等，1995)、皮肤鳞状细胞癌(Fujii 1995)、卵巢癌(van Dam等，1994)以及其它中过表达。HER-2在少数正常人组织上，最典型是在分泌上皮细胞上也低量表达。在约30％的乳腺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌和卵巢癌中发生HER-2过表达。
这些受体的表达根据肿瘤的分化程度和癌症类型而不同，例如在乳腺癌中，原发性肿瘤过表达两种受体；而在胃癌中，过表达在转移性肿瘤的后期发生(Salomon等，1995)。对从患者分离的若干头颈癌、外阴癌、乳腺癌和卵巢癌细胞系，癌细胞上过表达的受体的数目大于106个/个细胞(Dean等，1994)。
受体的EGFr家族之所以构成用于肿瘤免疫疗法的合适靶标存在若干原因。第一，其在许多类型的癌症中过表达，从而将要使免疫应答针对肿瘤。第二，肿瘤常常表达或过表达针对此家族受体的配体并且一些受体对由该配体介导的增殖作用是超敏感的。第三，具有过表达生长因子受体的肿瘤的患者常常具有不良预后。过表达特别是在乳腺癌、肺癌和膀胱癌中与不良预后紧密联系并且可与浸润/转移性表型相关联，所述表型对常规疗法是相当不敏感的(Eccles等，1994)。
经修饰的肿瘤相关抗原
在某些实施方案中，细胞相关多肽抗原被修饰使得当其与APC表面上的MHC I类分子缔合而呈递时，针对在其表面上呈递源自多肽抗原的表位的细胞的CTL应答得以诱导。在某些此类实施方案中，当呈递时，至少一种第一外来TH表位与APC表面上的MHC II类分子缔合。在某些此类实施方案中，细胞相关抗原为肿瘤相关抗原。
示例性的能够呈递表位的APC包括树突细胞和巨噬细胞。另外的示例性APC包括任何胞饮或吞噬APC，其能够同时呈递1)结合MHC I类分子的CTL表位和2)结合MHC II类分子的TH表位。
在某些实施方案中，对本文提出的一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)，诸如但不限于CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、tyrp1、tyrp2或畸形短尾进行修饰，使得在向受试者施用之后，产生主要与本文描述的一种或多种TAA反应的多克隆抗体。此类抗体可以攻击并消除肿瘤以及防止转移细胞发展成转移瘤。这种抗肿瘤效应的效应子机制将通过补体和抗体依赖性细胞毒性介导。另外，诱导的抗体也可以通过抑制受体的生长因子依赖性寡二聚和内化来抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，此类经修饰的TAA可诱导针对肿瘤细胞展示的已知和/或预测TAA表位的CTL应答。
在某些实施方案中，经修饰的TAA多肽抗原包含细胞相关多肽抗原的CTL表位和变型，其中所述变型包含外来TH表位的至少一个CTL表位。某些此类经修饰的TAA在一个非限制性实例中可以包括包含至少一个CTL表位的一种或多种HER-2多肽抗原和包含外来TH表位的至少一个CTL表位的变型，并且其生产方法在美国专利第7,005,498号和美国专利公布第2004/0141958和2006/0008465号中。
在某些实施方案中，外来TH表位是自然存在的“混杂”T细胞表位。此类混杂T细胞表位在动物物种或动物群体较大比例的个体中是有活性的。在某些实施方案中，疫苗包含此类混杂T细胞表位。在某些此类实施方案中，混杂T细胞表位的使用降低对同一疫苗中有很大数目的不同CTL表位的需要。示例性混杂T细胞表位包括但不限于来自破伤风毒素(包括但不限于P2和P30表位(Panina-Bordignon等，1989))、白喉毒素、流感病毒血凝素(HA)和恶性疟原虫(P.falciparum)CS抗原的表位。
另外的混杂T细胞表位包括能够结合较大比例的由不同HLA-DR编码的HLA-DR分子的肽。参见，例如WO 98/23635(Frazer IH等，转让给The University of Queensland)；Southwood S等，1998,J.Immunol.160:3363 3373；Sinigaglia F等，1988,Nature 336:778780；Rammensee HG等，1995,Immunogenetics 41:4 178 228；Chicz RM等，1993,J.Exp.Med178:27 47；Hammer J等，1993,Cell 74:197 203；以及Falk K等，1994,Immunogenetics39:230 242。后一篇参考文献还涉及HLA-DQ和-DP配体。这些参考文献中列出的所有表位作为如本文所述的候选天然表位是相关的，与这些共享共同基序的表位也是如此。
在某些其它实施方案中，混杂T细胞表位是人工T细胞表位，其能够结合大比例的单倍型(haplotype)。在某些此类实施方案中，人工T细胞表位是泛DR表位肽(“PADRE”)，如WO 95/07707和相应的论文Alexander J等，1994,Immunity 1:751 761中所述。
mHER2
各种经修饰的HER-2多肽抗原和其产生方法在美国专利号7,005,498和美国专利公布第2004/0141958和2006/0008465中有描述，所述专利在此以引用的方式并入。那些文件描述了各种经修饰的HER-2多肽抗原，所述抗原包含在HER-2多肽中的不同位置处的混杂T细胞表位。
人HER-2序列仅基于蛋白质的一级结构可划分为许多结构域。那些结构域如下所述。细胞外(受体)结构域自氨基酸1-654延伸并且含有如下所述的若干亚结构域：自氨基酸1-173延伸的结构域I(成熟多肽的N-端结构域)；自氨基酸174-323延伸的结构域II(富含半胱氨酸的结构域，24个半胱氨酸残基)；自氨基酸324-483延伸的结构域III(同源EGF受体中的配体结合结构域)；以及自氨基酸484-623延伸的结构域IV(富含半胱氨酸的结构域，20个半胱氨酸残基)。跨膜残基自氨基酸654-675延伸。细胞内(激酶)结构域自氨基酸655-1235延伸并且含有酪氨酸激酶结构域，其自氨基酸655-1010延伸(核心TK结构域自725-992延伸)；以及C-端结构域，其自氨基酸1011-1235延伸。
由P2或P30人T辅助表位取代的HER-2的氨基酸序列中位点的选择在美国专利第7,005,498号和美国专利公布第2004/0141958和2006/0008465号中。总而言之，考虑了以下参数：
1.已知和预测的CTL表位；
2.与相关受体(尤其是EGFR)的同源性；
3.半胱氨酸残基的保守性；
4.预测的环、α-螺旋和β-片层结构；
5.潜在的N-糖基化位点；
6.对暴露和包埋的氨基酸残基的预测；
7.结构域的结构组成。
CTL表位似乎簇集在结构域I、结构域III、TM结构域中，和TK结构域中的两个或三个“热点”中。如美国专利第7,005,498号和美国专利公布第2004/0141958和2006/0008465中所述，这些应该大部分保留。
与其它受体具有高度同源性的区域对于HER-2的“总体”三级结构并且因此对于抗体识别有可能在结构上重要，而具有低同源性的区域可能可被交换，结果是只造成结构的局部改变。
半胱氨酸残基常常参与分子内二硫桥的形成，且由此包含在三级结构中并且不应发生改变。预测会形成α-螺旋或β-片层结构的区域应当避免作为外来表位的插入点，因为认为这些区域会参与蛋白质的折叠。
如果需要蛋白质的甘露糖基化，则应当考虑潜在的N-糖基化位点。
预测处于分子内部的区域(根据它们的疏水特性)优选应当保留，因为这些区域可能参与折叠。相反，溶剂暴露的区域可作为插入模型TH表位P2和P30的候选位置。
最后，由于其与蛋白质结构和功能相关，应考虑到蛋白质的结构域排布。
如美国专利第7,005,498号和美国专利公布第2004/0141958和2006/0008465号中所述，策略已经集中于尽可能地保留HER-2的细胞外部分的结构，因为这是蛋白质作为中和抗体的靶标的相关部分。相反，癌细胞表面上的天然膜结合HER-2的细胞内部分是不能进入体液免疫系统的。
使用破伤风毒素的插入在HER-2的各种结构域中的P2和P30表位的各种示例性构建体提供于美国专利第7,005,498号和美国专利公布第2004/0141958和2006/0008465号中。一种示例性经修饰的HER-2多肽抗原(称之为“mHER2”)包含细胞外结构域和九个氨基酸的跨膜结构域；P2表位，其插入在结构域II中介于经修饰的HER-2多肽的氨基酸残基273至287之间；以及P30表位，其插入在结构域IV中介于经修饰的HER-2多肽的氨基酸残基655至675之间。
重组MVA-BN-mHER2
在非限制性实施方案中，如下构建包含肿瘤相关抗原的重组MVA(例如MVA-BN-mHER2)。初始的病毒原种是使用允许复制的细胞类型(例如CEF细胞)在细胞培养物中通过重组产生的。细胞接种减毒牛痘病毒，例如MVA-BN，并且用重组质粒(例如pBN146)转染，所述重组质粒编码肿瘤相关抗原，例如mHER2，即病毒基因组的序列和侧翼区。在一个非限制性实施方案中，质粒pBN146含有也存在于MVA-BN中的序列(14L和15L开放阅读框)。将mHER2序列插入在MVA-BN序列之间，以允许重组到MVA-BN病毒基因组中。在某些实施方案中，质粒还含有包含一个或多个选择基因的选择盒，以允许在CEF细胞中选择重组构建体。在优选的实施方案中，重组MVA编码包含SEQ ID NO:2的多肽。
同时感染和转染培养物允许在病毒基因组和重组质粒之间发生同源重组。然后分离携带插入物的病毒、对其表征，并制备病毒原种。在某些实施方案中，病毒在CEF细胞培养物中在选择不存在的情况下传代以允许编码选择基因、gpt和EGFP的区域丢失。
免疫检查点分子的拮抗剂
如本文所述，至少在一个方面中，本发明涵盖免疫检查点拮抗剂的使用。此类免疫检查点拮抗剂包括免疫检查点分子的拮抗剂，诸如细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PDL-1)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)。CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3或TIM-3的拮抗剂分别干扰CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3或TIM-3功能。
CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3的此类拮抗剂可包括分别特异性结合CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3并且抑制和/或阻断生物活性和功能的抗体。
CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3的其它拮抗剂可包括干扰CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3的表达的反义核酸RNA；干扰CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3的表达的小干扰RNA；及CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3的小分子抑制剂。
可通过本领域已知和/或本申请中公开的多种技术针对功能，诸如在体外或小鼠模型中干扰CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3功能的能力筛选CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3和TIM-3的候选拮抗剂。
ICOS的激动剂
本发明还涵盖ICOS的激动剂。ICOS的激动剂活化ICOS。ICOS在在活化T细胞上表达的正性共刺激分子并且与其配体的结合促进其增殖(Dong,Nature 2001；409:97-101)。
在一个实施方案中，激动剂是ICOS-L，即ICOS天然配体。激动剂可以是ICOS-L的保留结合和活化特性的突变形式。可在体外针对刺激ICOS的活性来筛选ICOS-L的突变形式。
抗体
在一个实施方案中，CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3的拮抗剂，及ICOS的激动剂是抗体。抗体可以是合成的、单克隆或多克隆的并且可以通过本领域熟知的技术制备。此类抗体经由抗体的抗原结合位点特异性结合CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS(与非特异性结合截然不同)。CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS多肽、片段、变体、融合蛋白等，在产生可与之起免疫反应的抗体中可用作免疫原。更具体地，多肽、片段、变体、融合蛋白等含有引起抗体形成的抗原决定簇或表位。
这些抗原决定簇或表位可以是线性的或是具有构象的(不连续的)。线性表位由多肽的单个氨基酸段组成，而具有构象或不连续的表位由来自多肽链的不同区域的氨基酸段组成，所述氨基酸段在蛋白质折叠后紧密接近(C.A.Janeway,Jr.和P.Travers,ImmunoBiology 3:9(Garland Publishing Inc.，第二版，1996))。因为折叠的蛋白质具有复杂的表面，所以可利用的表位数目是相当多的；然而，由于蛋白质的构象和空间位阻，实际上结合表位的抗体数目小于可利用的表位数目(C.A.Janeway,Jr.和P.Travers,ImmunoBiology 2:14(Garland Publishing Inc.，第2版1996))。可通过本领域已知的任何方法来鉴别表位。
本发明涵盖抗体，包括scFV片段，其特异性结合CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS并且阻断其功能(“拮抗剂抗体”)或增强/活化其功能(“激动剂抗体”)。可通过常规手段生成此类抗体。
在一个实施方案中，本发明涵盖针对CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS的单克隆抗体，其分别阻断(“拮抗剂抗体”)或增强/活化(“激动剂抗体”)CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS免疫检查点分子的功能。针对PD-1的示例性阻断单克隆抗体在WO2011/041613中有描述，所述专利在此以引用的方式并入。
抗体能够以高亲合力和特异性结合其靶标。它们是相对较大的分子(约150kDa)，当抗体结合位点靠近蛋白质-蛋白质相互作用位点时，其可以位阻性抑制两种蛋白质(例如PD-1及其靶配体)之间的相互作用。本发明还涵盖结合非常靠近CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS配体结合位点的表位的抗体。
在各个实施方案中，本发明涵盖干扰分子间相互作用(例如蛋白质-蛋白质相互作用)的抗体，以及扰乱分子内相互作用(例如分子内的构象变化)的抗体。可以针对阻断或增强/活化CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS的生物活性，或CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS与配体的结合，和/或针对其它特性筛选抗体。
多克隆抗体和单克隆抗体均可通过常规技术来制备。
可以利用CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS及基于CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS的氨基酸序列的肽制备特异性结合CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS的抗体。术语“抗体”意指包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段(诸如F(ab')2和Fab片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体片段(VHH或纳米抗体)、二价抗体片段(双链抗体)以及任何重组和合成产生的结合配偶体。
如果抗体以大于或等于约107M-1的Ka结合CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS多肽，则将其定义为特异性结合。可使用常规技术，例如由Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.,51:660(1949)描述的那些来容易地测定结合配偶体或抗体的亲和力。
多克隆抗体可易于由多种来源，例如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠或大鼠，使用本领域熟知的程序产生。一般而言，纯化的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS或基于适当偶联的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS的氨基酸序列的肽通常通过肠胃外注射向宿主动物施用。CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS的免疫原性可以通过使用佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂增强。在加强免疫之后，采集血清小样并测试对CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS多肽的反应性。用于此类测定的各种测定的实例包括在Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane(编),Cold Spring HarborLaboratory Press,1988中所述的那些；以及下述程序，诸如逆流免疫电泳(CIEP)、放射免疫测定、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹测定和夹心测定。参见，美国专利第4,376,110和4,486,530号。
可使用熟知的程序容易地制备单克隆抗体。参见，例如美国专利第RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993号；Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A NewDimension in Biological Analyses,Plenum Press,Kennett,McKeam和Bechtol(编)，1980中所述的程序。
例如，可以按约3周间隔，任选地在佐剂的存在下为宿主动物，诸如小鼠，在腹膜内注射分离且纯化的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS或偶联的CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3和ICOS肽至少一次且优选至少两次。然后通过常规的斑点印迹技术或抗体捕获法(ABC)测定小鼠血清以确定哪只动物是最佳融合的。大约两周至三周后，给予小鼠CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS或偶联的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS肽的静脉加强。稍后将小鼠处死并且根据已建立的方案将脾细胞与可商购获得的骨髓瘤细胞(诸如Ag8.653(ATCC))融合。简言之，将骨髓瘤细胞在培养基中洗涤若干次并且以约三个脾细胞:一个骨髓瘤细胞的比率融合至小鼠脾细胞。融合剂可以是本领域使用的任何合适试剂，例如聚乙二醇(PEG)。将融合物平板接种到含有允许融合细胞选择性生长的培养基的板中。然后可使融合细胞生长大约八天。收集来自所得杂交瘤的上清液并且将其添加到首先涂布有山羊抗小鼠Ig的板。洗涤之后，向每个孔中添加标记，诸如经标记的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS多肽，接着温育。随后可检测阳性孔。可使阳性克隆在大量培养物中生长并且随后经蛋白质A柱(Pharmacia)纯化上清液。
本发明的单克隆抗体可使用替代性技术产生，所述替代性技术为诸如由Alting-Mees等，"Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative toHybridomas",Strategies in Molecular Biology 3:1-9(1990)中所述的那些，所述文献以引用的方式并入本文。类似地，可使用重组DNA技术并入编码特异性结合抗体的基因的可变区来构建结合配偶体。此类技术在Larrick等，Biotechnology,7:394(1989)中有描述。
本发明还涵盖了此类抗体的抗原结合片段，其可通过常规技术产生。此类片段的实例包括但不限于Fab和F(ab')2片段。还提供了通过基因工程技术产生的抗体片段和衍生物。
本发明的单克隆抗体包括嵌合抗体，例如鼠单克隆抗体的人源化形式。此类人源化抗体可通过已知技术制备，并且在将抗体施用给人时，提供降低免疫原性的优点。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体包含鼠抗体的可变区(或仅其抗原结合位点)和源自人抗体的恒定区。或者，人源化抗体片段可包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点和源自人抗体的可变区片段(缺少抗原结合位点)。用于产生嵌合的和进一步工程化改造的单克隆抗体的程序包括Riechmann等(Nature 332:323,1988)、Liu等(PNAS 84:3439,1987)、Larrick等(Bio/Technology 7:934,1989)及Winter和Harris(TIPS 14:139,1993年5月)中所述的那些。以转基因方式产生抗体的程序可见于GB 2,272,440、美国专利第5,569,825和5,545,806号，两者以引用的方式并入本文。
可使用通过基因工程方法产生的抗体，诸如可使用标准重组DNA技术制得的包含人和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体。此类嵌合和人源化单克隆抗体可使用本领域已知的标准DNA技术，例如使用以下文献中所述的方法通过基因工程产生：Robinson等，国际公布第WO 87/02671号；Akira等，欧洲专利申请0184187；Taniguchi,M.，欧洲专利申请0171496；Morrison等，欧洲专利申请0173494；Neuberger等，PCT国际公布第WO 86/01533号；Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Cabilly等，欧洲专利申请0125023；Better等，Science 240:1041 1043,1988；Liu等，PNAS 84:3439 3443,1987；Liu等，J.Immunol.139:3521 3526,1987；Sun等PNAS 84:214 218,1987；Nishimura等，Canc.Res.47:999 1005,1987；Wood等，Nature 314:446 449,1985；和Shaw等，J.Natl.Cancer Inst.80:1553 1559,1988)；Morrison,S.L.,Science 229:1202 1207,1985；Oi等，BioTechniques 4:214,1986；Winter美国专利第5,225,539号；Jones等，Nature 321:552 525,1986；Verhoeyan等，Science 239:1534,1988；以及Beidler等，J.Immunol.141:4053 4060,1988。
关于合成和半合成抗体，此类术语旨在覆盖但不限于抗体片段、同种型转换抗体、人源化抗体(例如，小鼠-人、人-小鼠)、杂合体、具有多种特异性的抗体，以及完全合成的抗体样分子。
对于治疗性应用，常常优选具有人恒定区和可变区的“人”单克隆抗体，以便使患者对抗体的免疫应答最小化。可通过使含有人免疫球蛋白基因的转基因动物免疫来生成此类抗体。参见Jakobovits等Ann NY Acad Sci 764:525-535(1995)。
也可以通过使用由源自受试者的淋巴细胞的mRNA制备的免疫球蛋白轻链和重链cDNA，构建组合免疫球蛋白文库，诸如Fab噬菌体展示文库或scFv噬菌体展示文库来制备针对CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS多肽的人单克隆抗体。参见，例如McCafferty等PCT公布WO 92/01047；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581 597；以及Griffths等(1993)EMBO J 12:725 734。另外，可通过使已知的人抗体突变来产生抗体可变区的组合文库。例如，可以使已知结合CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS的人抗体的可变区突变，例如通过使用随机改变的诱变寡核苷酸，以生成突变可变区文库，然后可以筛选该文库以与CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS结合。在免疫球蛋白重链和/或轻链的CDR区内诱导随机诱变的方法、使随机化重链和轻链杂交形成配对的方法以及筛选方法可见于例如Barbas等PCT公布WO 96/07754；Barbas等(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4457 4461中。
可通过优选源自丝状噬菌体的展示包装群体来表达免疫球蛋白文库，以便形成抗体展示文库。特别适合用于产生抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于以下文献中：例如Ladner等美国专利第5,223,409号；Kang等PCT公布WO 92/18619；Dower等PCT公布WO 91/17271；Winter等PCT公布WO 92/20791；Markland等PCT公布WO 92/15679；Breitling等PCT公布WO 93/01288；McCafferty等PCT公布WO 92/01047；Garrard等PCT公布WO 92/09690；Ladner等PCT公布WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9:13701372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81 85；Huse等(1989)Science 246:1275 1281；Griffths等(1993)同上；Hawkins等(1992)J Mol Biol 226:889 896；Clackson等(1991)Nature 352:624 628；Gram等(1992)PNAS 89:3576 3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9:13731377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res 19:4133 4137；以及Barbas等(1991)PNAS 88:7978 7982。一旦展示在展示包装(例如，丝状噬菌体)的表面，就筛选抗体文库以鉴别和分离表达结合CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3或ICOS多肽的抗体的包装。在一个优选实施方案中，文库的初步筛选涉及淘选固定的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS多肽并且选择表达结合固定的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS多肽的抗体的展示包装。
除了本文已经描述的CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3和ICOS拮抗剂和激动剂以外，考虑到拮抗剂和激动剂还可包括本领域已知的那些。例如，和曲美木单抗是已知的CTLA-4抗体。另外，lambrolizumab、Amplimmune-224(AMP-224)、Amplimmune-514(AMP-514)、纳武单抗(Nivolumab)、MK-3475和B7H1是已知的PD-1抗体。PDL-1的一些示例性已知抗体包括：MPDL3280A(Roche)、MED14736(AZN)、MSB0010718C(Merck)。
本公开还预想到免疫检查点拮抗剂或激动剂可以包含在小分子、肽、可溶性受体蛋白和其它类型的融合蛋白中。
表达肿瘤抗原的痘病毒和免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合疗法
在至少一个方面，本发明涵盖采用编码肿瘤抗原的重组痘病毒与一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合的治疗方法。
在一个实施方案中，具有由过表达肿瘤相关抗原HER-2的细胞介导的癌症(例如，乳腺癌)的患者可以用以下的组合治疗：编码肿瘤相关抗原HER-2抗原的正痘病毒(例如，牛痘病毒、Wyeth、ACAM1000、ACAM2000、MVA或MVA-BN)或禽痘病毒(例如，鸡痘病毒、POXVAC-TC)与根据本发明的一种或多种免疫检查点抗体、激动剂或拮抗剂。在一个优选实施方案中，MVA是MVA-BN。在特别优选的实施方案中，MVA编码包含SEQ ID NO:2的多肽。
在一个实施方案中，前列腺癌患者可以用以下的组合治疗：编码PSA和/或PAP抗原的正痘病毒，例如牛痘病毒(例如但不限于，牛痘病毒、Wyeth、ACAM1000、ACAM2000、MVA或MVA-BN)或禽痘病毒(例如，鸡痘病毒例如POXVAC-TC)与根据本发明的一种或多种抗体、激动剂或拮抗剂。在一个优选实施方案中，牛痘病毒是的一部分。
在一个实施方案中，具有由过表达肿瘤相关抗原CEA和/或MUC-1的细胞介导的癌症(例如，乳腺癌、结直肠癌、肺癌和卵巢癌)的患者可以用以下的组合治疗：编码CEA和/或MUC-1抗原的正痘病毒，例如牛痘病毒(例如牛痘病毒、Wyeth、ACAM1000、ACAM2000、MVA或MVA-BN Wyeth或MVA)或禽痘病毒(例如，鸡痘病毒(例如POXVAC-TC))与根据本发明的一种或多种抗体、激动剂或拮抗剂。
重组痘病毒可以全身或局部，即通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、鼻内、皮内、划痕或技术熟练的从业者已知的任何其它施用途径来施用。优选地，施用通过划痕法进行。更优选地，施用通过皮下注射进行。在一个实施方案中，向患者施用105-1010TCID50的重组痘病毒。优选地，向患者施用107-1010TCID50的重组痘病毒。更优选地，向患者施用108-1010TCID50的重组痘病毒。最优选地，向患者施用108-109TCID50的重组痘病毒。
所述癌症优选地包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌或卵巢癌。在一个优选实施方案中，所述癌症为转移性乳腺癌。
癌症患者可以是任何哺乳动物，包括小鼠或大鼠。优选地，癌症患者是灵长类动物，更优选是人。
在一个或多个实施方案中，重组痘病毒用于在免疫检查点激动剂和/或拮抗剂施用的同一天或1、2、3、4、5、6或7天内施用。重组痘病毒可以在免疫检查点激动剂和/或拮抗剂之前或之后施用。
在一个实施方案中，根据本发明的一种或多种免疫检查点抗体、激动剂或拮抗剂，及编码包含肿瘤抗原的多肽的痘病毒同时施用。组合治疗优于每一种单独治疗。
在一个或多个优选实施方案中，重组痘病毒用于在施用免疫检查点拮抗剂和激动剂之前施用。
使用同源/异源初免-加强方案的组合疗法
单次施用如以上所定义的重组痘病毒可能诱导免疫应答。根据本发明的痘病毒也可用作同源初免-加强方案的一部分。同源初免-加强中，给予第一次初免疫苗接种后，接着进行一次或多次后续加强疫苗接种。通过施用在第一次疫苗接种中使用的相同重组痘病毒配置加强疫苗接种以加强在第一次疫苗接种中产生的免疫应答。
根据本发明的重组痘病毒也可用于异源初免-加强方案中，其中用如本文所定义的痘病毒进行一次或多次首次初免疫苗接种并且其中用不同疫苗，例如另一种病毒疫苗、蛋白质或核酸疫苗进行一次或多次后续加强疫苗接种。
异源初免-加强方案的所述一次或多次后续加强疫苗接种选自与首次初免疫苗接种不同属的痘病毒。在一个非限制性实例中，当第一或初始痘病毒疫苗包括牛痘时，第二和后续痘病毒疫苗选自不同属的痘病毒，猪痘(suipox)、禽痘、羊痘(capripox)或免疫原性不同于牛痘的正痘。
在一个示例性实施方案中，可以采用同源初免-加强方案，其中在第一剂量中与一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用痘病毒，诸如表达一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)(诸如但不限于HER2)的MVA-BN。可以给予表达一种或多种TAA(诸如但不限于HER2)的MVA-BN的一次或多次后续施用，与一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合，以加强在第一次施用中提供的免疫应答。优选地，第二和后续MVA-BN中的所述一种或多种TAA是与第一次施用的那些相同或相似的TAA。
在另一个示例性实施方案中，可以采用异源初免-加强，其中在第一剂量中与一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用表达一种或多种TAA的痘病毒，诸如牛痘。在这第一剂量之后一次或多次施用表达一种或多种TAA的不同痘病毒，诸如鸡痘。优选地，鸡痘病毒中的所述一种或多种TAA是与第一次施用的牛痘病毒中包括的那些相同或相似的TAA。对另外的示例性异源初免-加强方案的进一步描述可见于美国专利6,165,460、7,598,225和7,247,615中，全部专利以引用的方式并入本文。
在一个优选实施方案中，异源初免-加强方案中的所述一种或多种TAA包括前列腺特异性抗原(PSA)和/或前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原。在一个更优选的实施方案中，PSA抗原可包括见于美国专利7,247,615和7,598,225中的那些PSA抗原，所述两个专利以引用的方式并入本文。在一个非限制性实例中，包括PSA的异源初免-加强为
在另一个优选的实施方案中，异源初免-加强方案中的所述一种或多种TAA包括A粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)抗原和癌胚抗原(CEA)。在一个更优选的实施方案中，MUC1和CEA抗原可包括见于美国专利7,118,738、7,723,096和PCT申请第PCT/US2013/020058号中的那些，其全部以引用的方式并入本文。在一个非限制性实例中，包括MUC-1抗原和CEA的异源初免-加强方案为CV301。
在另一个示例性实施方案中，可以采用异源初免-加强，其中在第一剂量中与一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用表达一种或多种TAA的痘病毒，诸如MVA或MVA-BN。在这第一剂量之后一次或多次施用表达一种或多种TAA的不同痘病毒，诸如鸡痘。优选地，鸡痘病毒中的所述一种或多种TAA是与第一次施用的MVA或MVA-BN病毒中包括的那些相同或相似的TAA。
本公开考虑到本文描述的同源和异源初免-加强方案可以并入本发明的一个或多个剂量施用实施方案。举例而言，在同源和异源初免-加强方案中的一种或两种中，如本文所述，可以施用亚治疗有效量的免疫检查点拮抗剂或激动剂。
另外，举例而言，在同源和异源初免-加强方案中的一种或两种中，如本文所述，可以在编码TAA的重组痘病毒之后施用免疫检查点拮抗剂或激动剂。
同样举例而言，在同源和异源初免-加强方案中的一种或两种中，免疫检查点拮抗剂或激动剂的第二剂量或施用与第一剂量或施用相比可以增加。
在某些实施方案中，所述一次或多次加强疫苗接种在施用首次初免疫苗接种之后间隔数天、数周或数月施用。在某些实施方案中，所述一次或多次加强疫苗接种在施用首次初免疫苗接种之后间隔1、2、3、4、5、6、7天或更多天施用。在某些实施方案中，所述一次或多次加强疫苗接种在施用首次初免疫苗接种之后间隔1、2、3、4、5、6、7、8周或更多周施用。在某些实施方案中，所述一次或多次加强疫苗接种在施用首次初免疫苗接种之后间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月施用。在某些实施方案中，所述一次或多次加强疫苗接种在施用首次初免疫苗接种之后按任何间隔组合(例如，1、2、3、4、5、6、7天或更多天，1、2、3、4、5、6、7、8周或更多周，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月)施用。
免疫检查点拮抗剂或激动剂与重组痘病毒治疗组合的剂量施用
如本文说明和描述的那样，使用重组痘病毒载体与一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合对癌症的治疗可以在多种剂量下有效。明显，与本领域中所了解的相反，本公开证明与编码肿瘤相关抗原的重组痘病毒载体组合，即使在按较低剂量施用免疫检查点拮抗剂或激动剂时，免疫检查点拮抗剂或激动剂治疗癌症也可有效。这些较低剂量治疗可以减少和/或消除当前使用免疫检查点拮抗剂或激动剂进行癌症治疗所看到的许多不良副作用。
在本公开的各个方面，如本文所述向患者施用的激动剂或拮抗剂的剂量可为患者体重的约0.1mg/kg至约100mg/kg。优选地，向患者施用的剂量介于患者体重的约0.1mg/kg至约20mg/kg之间，更优选地为患者体重的约1mg/kg至约10mg/kg，更优选地为患者体重的约3mg/kg至约10mg/kg，并且最优选地为患者体重的约1mg/kg至约3mg/kg。鉴于对人类用较高剂量的免疫检查点拮抗剂或激动剂治疗人类的不利影响，激动剂或拮抗剂最优选的剂量为患者体重的约1mg/kg至约3mg/kg。
鉴于较低剂量下的免疫检查点激动剂和拮抗剂在与重组痘病毒疗法联合时的功效，在替代性实施方案中，激动剂或拮抗剂的剂量为患者体重的约0.1mg/kg至约3mg/kg，患者体重的约0.1mg/kg至约2mg/kg，或患者体重的约0.1mg/kg至约1mg/kg。在另外的实施方案中，激动剂或拮抗剂的剂量为患者体重的约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg或约3mg/kg。
在本公开另外的方面中，如本文所述向患者施用的激动剂或拮抗剂的剂量可为患者体重的0.1mg/kg至100mg/kg。优选地，向患者施用的剂量介于患者体重的0.1mg/kg至20mg/kg之间，更优选地为患者体重的1mg/kg至10mg/kg，更优选地为患者体重的3mg/kg至10mg/kg，并且最优选地为患者体重的1mg/kg至3mg/kg。鉴于对人类用较高剂量的免疫检查点拮抗剂或激动剂治疗人类的不利影响，激动剂或拮抗剂最优选的剂量为患者体重的1mg/kg至3mg/kg。
鉴于较低剂量下的免疫检查点激动剂和拮抗剂在与重组痘病毒疗法联合时的功效，在替代性实施方案中，激动剂或拮抗剂的剂量为患者体重的0.1mg/kg至3mg/kg，患者体重的0.1mg/kg至2mg/kg，或患者体重的0.1mg/kg至1mg/kg。在另外的实施方案中，激动剂或拮抗剂的剂量为患者体重的0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg或3mg/kg。
有效疗法所需的活性成分量将取决于许多不同因素，包括施用手段、靶标位点、患者的生理状态和施用的其它药剂。因此，应滴定治疗剂量以优化安全性、耐受性和功效。通常，体外使用的剂量可为活性成分原位施用的使用量提供有用的指导。特定疾病治疗的有效剂量的动物试验将提供人用剂量的进一步预测指示。各种考虑因素例如在Goodman andGilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics，第7版(1985),MacMillanPublishing Company,New York；和Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，(1990)Mack Publishing Co,Easton Pa中有描述。其中讨论了施用方法，包括口服、静脉内、腹膜内、肌内、经皮、鼻内、离子电渗施用等。
本发明的组合物可根据施用方法以多种单位剂型施用。例如，适于口服施用的单位剂型包括固体剂型诸如粉剂、片剂、丸剂、胶囊和糖衣丸，和液体剂型诸如酏剂、糖浆剂和混悬剂。活性成分还可以呈无菌液体剂型进行肠胃外施用。明胶胶囊含有活性成分和作为非活性成分的粉末载体，诸如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁等。可添加来提供所需颜色、口味、稳定性、缓冲能力、分散性或其它已知所需特征的另外的非活性成分的实例是红氧化铁、硅胶、月桂基硫酸钠、二氧化钛、可食用白色墨等。可使用类似的稀释剂来制备压制片剂。片剂和胶囊都可制备成缓释产品以便在数小时内提供药物的连续释放。压制片剂可进行糖包衣或薄膜包衣以掩蔽任何不愉快的味道并使片剂避免接触空气，或者可进行肠溶包衣以便在胃肠道中选择性崩解。用于口服施用的液体剂型可含有着色剂和调味剂以增加患者接受度。
本发明的组合物在药物制剂中的浓度可以广泛变化，即从小于约0.1重量％，通常在或至少约2重量％到至多约20重量％至50重量％或更多，并且将根据所选择的具体施用模式主要通过流体体积、粘度等来选择。
对于固体组合物，可使用常规的无毒固体载体，所述载体包括，例如，药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用，药学上可接受的无毒组合物是通过掺入任一正常采用的赋形剂(诸如先前所列出的那些载体)和一般10-95％且更优选25％-75％浓度的活性成分(即，本发明的一种或多种组合物)形成。
对于气溶胶施用，本发明的组合物优选以微细分形式与表面活性剂和推进剂一起供给。本发明组合物的优选百分比为0.01重量％-20重量％，优选1-10％。当然，表面活性剂必须是无毒的并且优选可溶于推进剂中。此类试剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸(诸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸(olesteric)和油酸)与脂族多元醇或其环酐的酯或偏酯。可采用诸如混合的或天然甘油酯的混合酯。表面活性剂可占组合物重量的0.1％-20％，优选0.25-5％。组合物的余量通常是推进剂。如果需要，还可包含载体，例如用于鼻内递送的卵磷脂。
另外本发明的构建体可于储存型系统、胶囊化形式或移植物中通过本领域熟知的技术递送。类似地，可通过泵向目的组织递送构建体。
任何前述制剂都可适于根据本发明的治疗和疗法，前提是制剂中的活性剂不因配制而失活且制剂是生理相容的。
在某些实施方案中，本发明的重组痘病毒可包含在一种或多种药物组合物中。除编码TAA的重组痘病毒和一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂外，药物组合物可包含一种或多种药学上可接受和/或经批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类添加剂包括例如但不限于水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂，以及pH缓冲物质。示例性载体通常为大的、缓慢代谢的分子诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量方案
在本发明另外的实施方案中，基于一个或多个癌症相关因素诸如肿瘤大小、肿瘤体积、一名癌症患者或一组癌症患者的癌症阶段(诸如转移前或转移后癌症)来配置免疫检查点拮抗剂或激动剂剂量浓度和给药方案。另外，可以通过使用相关生物标志物或抗体诸如但不限于Forssman或sCD27抗体监测和复查功效来配置免疫检查点拮抗剂或激动剂剂量浓度和给药方案。根据这个方面，可以为人类癌症患者或多组人类癌症患者配置更有效的给药方案。至少在一个方面中，如本文所述，提供更有效的给药方案可以减少在治疗中为一名患者或一组患者施用过多或过少免疫检查点拮抗剂或激动剂的情况。
如本文所定义，“给药方案”可以定义为每个单位时间治疗剂剂量的一览表，包括：剂量间隔时间或要给予该剂量的时间，及在每个具体时间点要给予的药品或治疗剂的量。
至少在一个方面中，将本文公开的方法，例如特别是给药方案，配置为在最小化不良副作用的同时最大化本公开组合的治疗益处。在一个实施方案中，在施用编码一种或多种TAA的重组痘病毒的同一天向患者施用免疫检查点拮抗剂或激动剂。在另外的实施方案中，如以下段落所述，在施用编码一种或多种TAA的重组痘病毒之后向患者施用免疫检查点拮抗剂或激动剂。
在重组痘病毒疗法之后施用免疫检查点拮抗剂或激动剂增加癌症治疗的功效
在图14-17中显示并且在实施例32-35中说明，为受试者施用包括TAA的重组痘病毒，之后定期测量免疫检查点分子TIM-3、LAG-3、ICOS和PD-1的表达水平。响应于治疗，在免疫检查点表达上存在初期的很少增加。然而，大约1-2天之后，T细胞增加免疫检查点分子的表达。约第3天至约第12天，免疫检查点表达明显增加。直到约第18天，仍将看到表达增加。更为重要的是，与CD4 T细胞相比在CD8 T细胞中免疫检查点表达上的这种增加更显著。(参见图14-17)。
鉴于图14-17和实施例32-35的结果，施用免疫检查点拮抗剂或激动剂最有效的时间段在用重组痘病毒治疗之后发生。例如，图14中显示，用MVA-BN-HER2处理之后，免疫检查点分子TIM-3的表达水平从约第1-3天至约第18天增加，从约第3天到约第14天出现最显著的增加。根据这一点，施用TIM-3拮抗剂最有效的时间段是在用重组痘病毒治疗之后出现表达增加的那些时间段。
图15-17中显示，用MVA-BN-HER-2处理之后，用免疫检查点分子ICOS、PD-1和LAG-3看到类似增加的表达结果。根据这些表达结果，为达到更多治疗功效，在用重组痘病毒治疗之后向癌症患者施用每种免疫检查点拮抗剂(例如，TIM-3、PD-1、PDL-1和LAG-3)或激动剂(例如，ICOS)。
至少在一个方面中，更高的治疗功效出现在免疫检查点分子表达增加的这些时期中，至少部分是因为增加的表达提供了更多可与施用的免疫检查点拮抗剂或激动剂结合的底物，从而提供了对免疫检查点分子更强的阻断或活化。
另一方面，图14-17所示的结果表明，在重组痘病毒治疗之后施用免疫检查点拮抗剂或激动剂对于增强功效很重要。用重组痘病毒治疗之后免疫检查点分子表达增加的时期明确证明了这种重要性。
鉴于本公开的教导，在一个实施方案中，存在一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用一个剂量的治疗性癌症疫苗，诸如但不限于重组痘病毒，所述重组痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；并且(b)向患者施用一个剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在所述剂量的治疗性癌症疫苗之后施用。
考虑到在一个实施方案中，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在同一天在所述剂量的治疗性癌症疫苗之后施用。另外考虑到，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗约1至约18天，约2至约17天，约3至约16天，约3至约14天，约3至约12天，约3至约10天，约3至约8天，约3至约7天，约4至约15天，约4至约14天，约4至约13天，或约4至约12天之后施用。在一个更优选的实施方案中，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗约3至约15天之后施用。在一个更优选的实施方案中，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗约3至约7天之后施用。再一个更优选的实施方案中，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗3天或7天之后施用。
另外考虑到，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗的同一天或1至18天，2至17天，3至16天，3至15天，3至14天，3至12天，4至15天，4至14天，4至13天，或4至12天之后施用。在一个更优选的实施方案中，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗3至15天之后施用。在一个更优选的实施方案中，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗3至7天之后施用。再一个更优选的实施方案中，所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗3天或7天之后施用。
在另外的实施方案中，本公开包括向患者施用后续(相对于前一段落中的剂量)或第二剂量的治疗性癌症疫苗，诸如但不限于包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)的重组痘病毒；并且(b)向患者施用后续(相对于前一段落中的剂量)或第二剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中后续剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在后续剂量的治疗性癌症疫苗之后施用。另外考虑到，后续免疫检查点拮抗剂或激动剂剂量可以在后续剂量的治疗性癌症疫苗之后(例如，在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗约1至约18天，约2至约17天，约3至约16天，约3至约15天，约3至约14天，约3至约12天，约4至约15天，约4至约14天，约4至约13天，或约4至约12天之后)按相似间隔施用。
在施用治疗性癌症疫苗，诸如重组痘病毒疗法之后，施用免疫检查点拮抗剂或激动剂产生的增强的治疗功效，通过实施例26-31进一步证明。
在一个实施方案中，治疗性癌症疫苗包含包括至少一种TAA的重组痘病毒。在另一个优选实施方案中，重组痘病毒包含包括至少一种TAA的正痘病毒或禽痘病毒。在另一个优选实施方案中，正痘病毒包含牛痘、MVA或MVA-BN。在另一个实施方案中，禽痘病毒包含鸡痘病毒。
在另一个实施方案中，考虑到CTLA-4拮抗剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗的同一天或约1-3天之后施用。
再一个实施方案中，考虑到PD-1拮抗剂或PDL-1拮抗剂在施用所述剂量的治疗性癌症疫苗约2至18天之后施用。
增加免疫检查点拮抗剂或激动剂第二次施用的治疗有效量增加了癌症治疗的功效
图14-17中显示并且实施例32-35中描述，在第1天和第15天为受试者施用包括TAA的重组痘病毒。定期测量免疫检查点分子诸如TIM-3、LAG-3、ICOS和PD-1的表达水平。响应于第1天治疗，在免疫检查点表达上存在初期的很少增加。然而，在第1天治疗大约1-2天之后，免疫检查点分子的T细胞表达增加。约第3天至约第12天，免疫检查点表达明显增加。直到约第18天，仍将看到表达增加。
最明显的是，在第15天重组痘病毒的第二或后续处理之后，T细胞对免疫检查点分子的表达出现更多的增加。更为重要的是，与CD4 T细胞相比在CD8 T细胞中免疫检查点表达上的这种增加更显著。(参见图14-17)。例如，图12中所示，在第15天用MVA-BN-HER-2处理之后，在表达上存在略微增加，之后在第18天TIM-3的表达水平显著增加。根据这些TIM-3表达结果，与第一剂量相比增加TIM-3拮抗剂的第二或后续剂量实现了更高的治疗功效。
图14-17中显示，在第15天用MVA-BN-HER-2进行第二次重组痘病毒处理之后，出现类似增加的免疫检查点分子ICOS、PD-1和LAG-3表达。进一步地，与第一次MVA-BN-HER2处理之后相比增加的表达明显更高。根据这些表达结果，在第二或后续重组痘病毒之后的时间点期间向癌症患者施用增加剂量的免疫检查点拮抗剂(例如，TIM-3、PD-1、PDL-1、LAG-3)或激动剂(例如，ICOS)。
至少在一个方面中，与免疫检查点拮抗剂或激动剂的第一剂量相比，通过增加第二次或后续治疗中免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量或量来实现更高的治疗功效。这被实现至少部分是因为在第二次治疗后增加的表达提供了更多可与施用的免疫检查点拮抗剂或激动剂结合的底物，从而提供了对免疫检查点分子更强的阻断或活化。
另一方面，图14-17所示的结果表明，与第一剂量相比，增加免疫检查点拮抗剂或激动剂的第二或后续剂量，对于在与重组痘病毒疗法组合施用时实现增加的免疫检查点拮抗剂治疗功效很重要。用本文描述和说明的重组痘病毒第二次治疗之后免疫检查点分子表达增加的时期证明了这种重要性。
再一方面，鉴于描述免疫检查点拮抗剂T细胞受体占用率(RO)的最新数据，如本文所述增加第二次或后续施用的免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量大大增强了治疗功效。在第一剂量的免疫检查点拮抗剂(抗PD1抗体)之后，通过FACS(CD45+、CD3门)在T细胞表面测量受体占用率(RO)(数据未示出)。数据表明在免疫检查点拮抗剂PD-1的不同剂量(例如，.1mg/kg、.4mg/kg、1.4mg/kg和5mg/kg)，在血流中的T细胞上存在高百分比的PD-1RO(.1mg/kg的RO＝65％，.4mg/kg的RO＝84％，1.4mg/kg的RO＝96％，及5mg/kg的RO＝89％)。与血液中的RO百分比相比较时，见于肿瘤中的T细胞的RO降低(.1mg/kg的RO＝9％，.4mg/kg的RO＝41％，1.4mg/kg的RO＝58％，及5mg/kg的RO＝65％)。
在免疫检查点拮抗剂或激动剂与重组痘病毒组合的初始剂量期间，据信通常在外周区诸如血液和淋巴结中存在较大百分比的肿瘤特异性T细胞(CD8 T细胞)。鉴于血液中T细胞上的免疫检查点拮抗剂中的RO增加，第一次施用的免疫检查点拮抗剂或激动剂在较低剂量更有效。为了第二或后续剂量的免疫检查点拮抗剂或激动剂与重组痘病毒组合的功效增加，鉴于肿瘤中T细胞上的RO较低，所以施用与第一剂量相比增加的剂量。
鉴于本公开的教导，在另外的实施方案中，本公开提供了一种使用治疗性癌症疫苗与免疫检查点拮抗剂或激动剂组合治疗人类癌症患者的方法，所述方法包括(a)与一个剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合向患者提供治疗性癌症疫苗，诸如重组痘病毒的第一次施用；并且(b)与一个剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合向患者提供治疗性癌症疫苗的第二次施用，其中第二次施用的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量与第一次施用的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量相比增加。
另外，考虑到本公开提供了一种为患者提供一系列施用的方法，所述施用包含治疗性癌症疫苗，诸如重组痘病毒，与一个剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合，其中第二次施用的剂量与第一次施用的剂量相比增加。
在各个实施方案中，免疫检查点拮抗剂或激动剂第二次施用的剂量(或量)与第一次施用的剂量相比，增加的倍数为：约2至约100倍、约3至约100倍、约5至约100倍、约10至约100倍、约5至约90倍、约10至约80倍、约10至约70倍、约10至约60倍、约10至约50倍。在优选实施方案中，第二次施用的剂量与第一次施用的剂量相比增加约10至约100倍。在另一个优选实施方案中，第二次施用的剂量与第一次施用的剂量相比增加约10至约50倍。再一个优选实施方案中，第二次施用的剂量增加的倍数为：约3倍、约10倍、约30倍或约100倍。
在各个另外的实施方案中，第二次施用的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量与第一次施用的剂量相比，增加的倍数为：2至100倍、3至100倍、5至100倍、10至100倍、5至90倍、10至80倍、10至70倍、10至60倍、10至50倍。在优选实施方案中，第二次施用的剂量与第一次施用的剂量相比增加10至100倍。在另一个优选实施方案中，第二次施用的剂量与第一次施用的剂量相比增加10至50倍。再一个优选实施方案中，第二次施用的剂量增加的倍数为：3倍、10倍、30倍或100倍。
考虑到在一些示例性实施方案中，免疫检查点拮抗剂或激动剂与治疗性癌症疫苗(诸如但不限于重组痘病毒)的第一次施用包括亚治疗或亚治疗有效剂量，之后免疫检查点拮抗剂或激动剂与治疗性癌症疫苗(诸如但不限于重组痘病毒)的第二次或后续施用包括在本文所述给药方案中提出的增加的剂量。在一个非限制性实例中，免疫检查点拮抗剂或激动剂的第一次施用包括约0.1mg/kg至约1mg/kg的剂量。这第一次施用之后是以约3mg/kg至约10mg/kg增加的剂量进行一次或多次后续施用。
在一个优选实施方案中，治疗性癌症疫苗包含包括至少一种TAA的重组痘病毒。在另一个优选实施方案中，重组痘病毒包含包括至少一种TAA的正痘病毒或禽痘病毒。在另一个优选实施方案中，正痘病毒包含牛痘、MVA或MVA-BN。在另一个实施方案中，禽痘病毒包含鸡痘病毒。施用与第一剂量相比增加的第二或后续剂量的免疫检查点拮抗剂或激动剂引起的增强的治疗功效，通过实施例26-31进一步证明。
治疗性癌症疫苗是展示出刺激一名患者或一组患者自身的免疫系统特异性靶向肿瘤和/或肿瘤细胞的一种或多种独特免疫学特性的疫苗。这些独特免疫学特性通常是与肿瘤或肿瘤细胞相关的抗原。在至少一个方面中，治疗性癌症疫苗起到延迟或终止癌细胞生长；引起肿瘤收缩；防止癌症复发；或消除尚未通过其它形式的治疗杀伤的癌细胞的功能。
在一个优选实施方案中，治疗性癌症疫苗是基于病毒的。用作治疗性癌症疫苗的病毒的一些非限制性实例包括：痘病毒、腺病毒、甲病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、细小病毒、呼肠孤病毒和水泡性口炎病毒(VSV)。在一个更优选的实施方案中，治疗性癌症疫苗是基于痘病毒的治疗剂。
表1中示出了目前正在开发的基于病毒的治疗性癌症疫苗的一些非限制性实例。
表1
在另一个实施方案中，治疗性癌症疫苗可以是基于酵母的。参见例如，CancerImmunol Immunother.2014年3月；63(3):225-34。在一个非限制性实例中，基于酵母的治疗性癌症疫苗包括目前处于II期临床试验中的重组酵母-CEA疫苗(GI-6207)。参见J ClinOncol 31,2013(增刊；摘要TPS3127)。
又一个实施方案中，治疗性癌症疫苗可以是基于细菌的。在一个非限制性实例中，基于细菌的癌症疫苗包括Coley疫苗。参见Clin Cancer Res.2012年10月1日；18(19):5449-59。
在异源初免-加强中的加强剂量之后施用免疫检查点拮抗剂或激动剂增加癌症治疗的功效
包含异源初免-加强方案，该方案包括单次初免施用PROSTVAC-V(表达PSA和TRICOMTM的牛痘病毒)，接着是一个或多个连续加强剂量的PROSTVAC-F(表达PSA和TRICOMTM的鸡痘病毒)；在J Clin Oncol 2010,28:1099-1105中也有描述，其以引用的方式并入本文。
如图21-23和实施例40-43中所显示和描述，在癌症治疗中异源给药方案与用相同载体的同源给药相比大大增强了PSA特异性T细胞应答的数量和质量。另外，附图和实施例证明用PROSTVAC-V初免和用PROSTVAC-F加强提供了使高功能CD8 CTL免疫应答集中针对PSA(靶肿瘤抗原)而远离牛痘载体的额外益处。
至少在一个方面中，当一个或多个剂量的重组痘病毒作为癌症治疗的一部分施用时，通过施用一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂，与第二或后续重组痘病毒剂量或施用组合来实现更高的治疗功效。
在一个更特定的方面中，当一个或多个剂量的本发明的重组痘病毒作为癌症治疗的一部分，作为异源初免-加强方案的一部分施用时，通过施用至少一种检查点拮抗剂或激动剂，与第二或后续加强剂量的编码至少一种TAA的重组痘病毒组合来实现更高的治疗功效。实现这种更高的治疗功效，至少部分是因为在异源初免-加强方案的第二或后续加强剂量期间和之后，与重组痘病毒相比，患者的免疫T细胞应答更多集中在肿瘤抗原上。另外，至少在一个方面中，在加强剂量期间免疫检查点拮抗剂或激动剂的施用起到增强患者对肿瘤抗原的免疫应答，从而增加患者对肿瘤更具特异性的免疫应答的功能。
在至少另一个方面中，作为涉及异源初免-加强方案的癌症治疗的一部分，施用至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与第二或后续加强剂量的重组痘病毒组合，在最小化免疫检查点治疗中所看到的不良副作用的同时，最大化免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗益处。
鉴于本公开的教导，在另外的实施方案中，本发明包括一种治疗人类癌症患者的方法，所述方法包括向患者施用(a)第一治疗性癌症疫苗，诸如但不限于第一重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；并且(b)第二治疗性癌症疫苗，诸如但不限于第二重组痘病毒，第二重组痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；其中所述第二重组痘病毒与至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用。在另一实施方案中，第二重组痘病毒不同于第一重组痘病毒。在其它实施方案中，第二重组痘病毒来自于和第一重组痘病毒不同的属。
在另一个实施方案中，第一和第二重组痘病毒不同或是不同的属并且作为异源初免-加强方案施用，异源初免-加强方案包括：a)施用所述第一重组痘病毒作为第一初免剂量；及b)与至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用的所述第二重组痘病毒作为一个或多个加强剂量。在一个优选实施方案中，异源初免加强方案选自CV301或MVA-BN-CV301。
再一个实施方案中，考虑到第一重组痘病毒或初始或初免剂量的重组痘病毒不包括免疫检查点拮抗剂或激动剂。
另外考虑到第一和第二重组痘病毒可以是任何痘病毒，诸如但不限于本公开中描述的那些。进一步考虑到所述至少一种肿瘤相关抗原(TAA)可以是任何TAA，诸如但不限于本公开中描述的那些TAA。
在另外的实施方案中，存在一种包括向癌症患者施用异源初免-加强方案的方法，该方案包括：(a)第一治疗性癌症疫苗，诸如但不限于第一重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)第二治疗性癌症疫苗，其中所述第二治疗性癌症疫苗与至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用。考虑到描述的异源初免-加强方案
在一个或多个实施方案中，至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在编码至少一种TAA的重组痘病毒的第二或后续剂量的同一天或1、2、3、4、5、6或7天内施用。在一个优选实施方案中，至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂作为异源初免-加强方案的一部分施用，并且在编码至少一种TAA的重组痘病毒的第二或后续加强剂量的同一天或1、2、3、4、5、6或7天内施用。
在一个或多个实施方案中，至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用编码至少一种TAA的重组痘病毒的第二或后续剂量之后施用。在一个优选实施方案中，至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂作为异源初免-加强方案的一部分施用，并且在编码至少一种TAA的重组痘病毒的第二或后续加强剂量之后施用。考虑到，在重组痘病毒的第二或后续加强剂量之后，施用至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的时间间隔可包括本公开中描述的那些时间间隔。
另外考虑到在与编码至少一种TAA的重组痘病毒的第二或一个或多个后续加强剂量组合施用时，至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂可以按本公开中所提供的剂量或浓度施用。
治疗性组合物和用途
本发明还涉及根据本发明的痘病毒载体用于制备治疗性组合物或疫苗的用途，所述治疗性组合物或疫苗能够诱导或有助于针对肿瘤表位的免疫反应的发生或增进。因此本发明提供了用作药剂或疫苗的载体。
因此，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含与根据本发明的一种或多种抗体、激动剂或拮抗剂组合的根据本发明的MVA载体。
因此，根据本发明的MVA载体可用于制备用于癌症治疗的治疗性组合物。
本发明涵盖用于预防性和/或治疗性疫苗接种方案中的组合物，所述组合物用于治疗肿瘤，并且特别是用作抗癌症治疗。
在一个实施方案中，本发明涵盖用于向癌症患者施用或用于治疗癌症患者的组合物，特别是诸如但不限于以下的那些癌症：乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或结直肠癌。
在一个实施方案中，本发明涵盖组合物用于向癌症患者施用或用于治疗癌症患者的用途，特别是选自以下的那些癌症：乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或结直肠癌。
在另外的实施方案中，本发明涵盖一种组合物或组合物用于向癌症患者施用或用于治疗癌症患者的用途，特别是乳腺癌患者。
在一个实施方案中，用于同时施用或依序施用的组合物包含根据本发明的MVA载体和根据本发明的一种或多种抗体、激动剂或拮抗剂。
在另外的实施方案中，本发明涵盖一种组合物或组合物用于向癌症患者施用或用于治疗癌症患者的用途，特别是前列腺癌患者。
在一个实施方案中，用于同时施用或依序施用的组合物包含根据本发明的载体和根据本发明的一种或多种抗体、激动剂或拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明涵盖一种治疗癌症的方法，其包括向患者施用(a)治疗有效量的重组痘病毒载体，所述痘病毒载体包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，其中治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得施用所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。
根据本发明的各个实施方案，在癌症治疗中，相比于1)无痘病毒载体的免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效剂量或2)单独的免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效剂量，当免疫检查点拮抗剂或激动剂与编码TAA的痘病毒载体联合时，免疫检查点拮抗剂或激动剂治疗有效的剂量更低或降低。因此，可以按较低剂量施用治疗有效剂量的免疫检查点拮抗剂或激动剂，从而降低和/或消除见于现有技术中的治疗的毒性和不良副作用。
“治疗有效量”是组合物在受治受试者中足以达到预期治疗或临床效果的量。例如，包含与表达控制序列可操作性连接的肿瘤相关抗原(TAA)核酸(诸如但不限于，CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、tyrp1、tyrp2或畸形短尾抗原)的痘病毒载体的治疗有效量将是足以引起TAA特异性免疫应答，减小肿瘤尺寸或负荷，减少肿瘤转移的数量，延迟癌症进展，或增加患有癌症的患者或患有癌症的患者群体的总存活率的量。
同样，举例而言，免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量将是足以抑制靶向免疫检查点分子的功能，结合靶向免疫检查点分子以减小肿瘤尺寸或负荷，减少肿瘤转移的数量，延迟癌症进展，或增加患有癌症的患者或患有癌症的患者群体的总存活率的量。
“疗效”是受试者中的预期治疗或临床效果。癌症治疗中的“疗效”可以通过以下表征：肿瘤尺寸、肿瘤质量或肿瘤负荷的减小；肿瘤转移数量的减少；癌症进展的延迟，或患有癌症的患者或患有癌症的患者群体的总存活率的增加。
免疫检查点拮抗剂或激动剂与重组痘病毒的组合癌症治疗使得在拮抗剂或激动剂低剂量下的治疗功效成为可能
如本文所说明和描述的，当免疫检查点拮抗剂或激动剂联合编码TAA的痘病毒载体时，免疫检查点拮抗剂或激动剂治疗有效的剂量更低或降低。在各个另外的实施方案中，本公开包括向人类癌症患者施用以下的组合：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂。在这个实施方案中，与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比，亚治疗有效量的免疫检查点拮抗剂或激动剂达到增加的“疗效”。
在至少一个方面中，配置亚治疗有效剂量以在最小化在现有技术中的免疫检查点治疗中所看到的不良副作用的同时，最大化治疗益处。
“亚治疗有效量”是免疫检查点拮抗剂在作为单一治疗剂或单一疗法施用时，或在连同其它或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂施用时，对于自身的“疗效”而言无效的剂量或量。
在一个实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量的约99％至约5％、约90％至约5％、约85％至约5％、约80％至约5％、75％至约5％、约70％至约10％、约65％至约15％、约60％至约20％、约55％至约25％、约50％至约30％或约50％至约10％。在一个优选实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量减少约99％至减少约30％。在另一个优选实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量减少约90％至减少约30％。再一个优选实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量减少约99％、减少约90％或减少约30％。
在另一个实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量的99％至5％、90％至5％、85％至5％、80％至5％、75％至5％、70％至10％、65％至15％、60％至20％、55％至25％、50％至30％或50％至10％。在一个优选实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量减少99％至减少30％。在另一个优选实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量减少约90％至减少约30％。再一个优选实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的亚治疗有效量是免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量减少99％、减少90％或减少30％。
在一个或多个实施方案中，亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂可与包括至少一种TAA的重组痘病毒组合作为如本文所述的异源或同源初免-加强方案的一部分施用。
试剂盒
在一个实施方案中，本发明涵盖包含重组痘病毒和至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的试剂盒。所述重组痘病毒和所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂可各自装在小瓶或容器中。在一个实施方案中，重组痘病毒编码如本文所述的肿瘤相关抗原(TAA)。在另一个实施方案中，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自如本文所述的免疫检查点拮抗剂或激动剂。在各个实施方案中，用于疫苗接种的试剂盒包含一套第一小瓶或容器中用于第一次疫苗接种(“初免”)及第二或第三小瓶或容器中用于第二或第三次疫苗接种(“加强”)的重组痘病毒和免疫检查点拮抗剂或激动剂。
在一个实施方案中，试剂盒可含有重组痘病毒和至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合及施用该组合用于预防癌症的说明书。在一个实施方案中，试剂盒可含有所述组合及在检测到一种或多种肿瘤相关标志物增加之后施用该组合用于预防癌症的说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒可含有重组痘病毒和至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合及施用治疗有效剂量或有效量的痘病毒和治疗有效量的免疫检查点拮抗剂或激动剂中的至少一种的说明书，使得与痘病毒载体联合的治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
在另一个实施方案中，所述试剂盒可含有重组痘病毒和至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合及施用亚治疗有效剂量或有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的说明书，其中亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。
在另一个实施方案中，所述试剂盒可含有重组痘病毒和至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合及为患者提供所述重组痘病毒和所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的一系列施用的说明书，其中所述说明书包括与所述系列中第一次施用的剂量相比，增加所述系列中第二次施用的剂量。
在另一个实施方案中，所述试剂盒可含有重组痘病毒和至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合及为患者提供所述重组痘病毒和所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的一系列施用的说明书，其中所述说明书包括提供与包含亚治疗有效剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合的第一次施用；然后提供第二次施用，其中增加至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量如本文所述。
本公开考虑到本文提供的一份或多份说明书可组合于单个试剂盒中。另外考虑到本文提供的一份或多份说明书包括本申请中提供的一个或多个给药方案。
组合或药剂另外的实施方案
在另外的实施方案中，本公开涵盖用于治疗人类癌症患者的组合或药剂。该组合或药剂包含重组痘病毒，该痘病毒载体包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；(b)PD-1拮抗剂；和(c)CTLA-4拮抗剂。PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂可分别包括抗PD-1拮抗剂抗体和抗CTLA-4抗体。
又一个实施方案中，本公开可包括用于治疗人类癌症患者的组合或药剂，该组合或药剂包含(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒载体包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，其中与痘病毒载体联合的治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。又一个实施方案中，该组合或药剂可包括选自CTLA-4拮抗剂、PD-1拮抗剂、PDL-1拮抗剂、LAG-3拮抗剂、TIM-3拮抗剂或ICOS激动剂的免疫检查点拮抗剂或激动剂。考虑到各种免疫检查点拮抗剂或激动剂可包含在一种或多种抗体中。
在另一个实施方案中，本公开可包括用于增加人类癌症患者中的总存活率的组合或药剂，该组合或药剂包含：(a)包括至少一种肿瘤相关抗原(TAA)的痘病毒；(b)PD-1拮抗剂；和(c)CTLA-4拮抗剂。PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂可分别包括抗PD-1拮抗剂抗体和抗CTLA-4抗体。
又一个实施方案中，本公开可包括用于增加人类癌症患者中的总存活率的组合或药剂，该组合或药剂包含：(a)包括至少一种肿瘤相关抗原(TAA)的痘病毒；(b)治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中与痘病毒载体联合的治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
再一个另外的实施方案中，本公开可包括一种用于治疗人类癌症患者的组合或药剂，所述组合或药剂包含：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，其中亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。考虑到，该组合或药剂可包括选自CTLA-4拮抗剂、PD-1拮抗剂、PDL-1拮抗剂、LAG-3拮抗剂、TIM-3拮抗剂或ICOS激动剂的免疫检查点拮抗剂或激动剂。考虑到各种免疫检查点拮抗剂或激动剂可包含在一种或多种抗体中。
再一个另外的实施方案中，本公开可包括一种用于治疗人类癌症患者的组合或药剂，所述组合或药剂包含：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒载体包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂配置为在治疗有效量的重组痘病毒之后施用；并且其中与痘病毒载体联合的治疗有效量和亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
再一个实施方案中，本公开可包括一种用于治疗人类癌症患者的组合或药剂，所述组合或药剂至少包含第一次和第二次施用，每次施用包含：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中第二次施用的治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与第一次施用的治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂相比增加；并且其中与痘病毒联合的治疗有效量或亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒或单独的治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
又一个实施方案中，本文所述的组合或药剂中编码TAA的重组痘病毒可为再一个实施方案中，本文所述的组合或药剂中编码TAA的重组痘病毒可为CV301。
再一个另外的实施方案中，本公开可包括：(a)重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；(b)PD-1拮抗剂；和(c)CTLA-4拮抗剂在药物组合物或药剂制备中的用途。PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂可分别包括抗PD-1拮抗剂抗体和抗CTLA-4抗体。在另一个实施方案中，公开的药物组合物或药剂的用途可以是用于治疗人类癌症患者。
再一个另外的实施方案中，本公开可包括以下物质在制备药物组合物或药剂中的用途：(a)包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)的痘病毒；(b)治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中与痘病毒载体联合的治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
再一个另外的实施方案中，本公开可包括以下物质在制备药物组合物或药剂中的用途：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂相比增加。考虑到，所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂可选自CTLA-4拮抗剂、PD-1拮抗剂、PDL-1拮抗剂、LAG-3拮抗剂、TIM-3拮抗剂或ICOS激动剂。考虑到各种免疫检查点拮抗剂或激动剂可包含在一种或多种抗体中。
再一个另外的实施方案中，本公开可包括以下物质在制备药物组合物或药剂中的用途：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂配置为在治疗有效量的重组痘病毒之后施用；并且其中与痘病毒载体联合的治疗有效量或亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
再一个实施方案中，本公开可包括至少第一和第二剂量施用在制备药物组合物或药剂中的用途，每次剂量施用包含：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；其中第二次施用的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量或亚治疗有效量与第一次施用相比增加；并且其中与痘病毒载体联合的治疗有效量或亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的治疗有效量或亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
实施例
实施例1
MVA-BN-mHER2的构建
同时感染和转染培养物允许在病毒基因组和重组质粒之间发生同源重组。分离携带插入物的病毒、对其表征，并制备病毒原种。
质粒pBN146含有也存在于MVA-BN中的序列(14L和15L开放阅读框)。将mHER2序列插在MVA-BN序列之间，以允许重组进入MVA-BN病毒基因组中。因此，构建含有在痘病毒启动子，特别是牛痘病毒A型内含体基因启动子下游的mHER2序列的质粒。该质粒还含有选择盒，其包含合成牛痘病毒启动子(Ps)、抗药性基因(鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶；Ecogpt)、内部核糖体进入位点(IRES)和增强型绿色荧光蛋白。两种选择基因(gpt和EGFP)由单一双顺反子转录产物编码。
通过添加编码p2和p30的破伤风毒素表位的核苷酸序列来修饰HER-2序列以增强针对其的免疫应答。mHER2插入MVA-BN基因组之后，病毒“插入区”具有以下结构：
ATI启动子-mHER2序列-Ps启动子-gpt-IRES-EGFP。在细菌重组质粒pBN146中插入区侧接MVA-BN I4L基因间区序列(F1和F2)。下面示出了构建体的核苷酸序列。
GAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCTGGGGGCTCCTCCTCGCCCTCTTGCCCCCCGGAGCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCTTAAGTTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACCGAGCTGCGGTATACAT
TCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCACTATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACGTCCTTCAACAACTTCACCGTGAGCTTCTGGCTGCGCGTGCCCAAGGTGAGCGCCAGCCACCTGGAGATCGTCTCTGCGGTGGTTGGCATTCTG
(SEQ ID NO：1)。
HER2起始密码子和终止密码子以粗体指示。侧翼序列以斜体指示。
下面示出了编码的mHER2多肽的翻译：
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTS IVSAVVGIL.
(SEQ ID NO：2)。
p2和p30序列的破伤风毒素表位以粗体指示。
CEF培养物接种MVA-BN并且还用pBN146质粒DNA转染。转而，将来自于这些细胞培养物的样品接种到含有选择药物的培养基中的CEF培养物中，并且通过蚀斑纯化分离表达EGFP的病毒克隆物。在选择药物和表达的EGFP的存在下生长的病毒原种命名为MVA-BN-mHER2。MVA-BN-mHER2的产生和病毒原种的制备涉及十二(12)次传代，所述传代包括五(5)次蚀斑纯化。
在不存在选择药物条件下使MVA-BN-mHER2在CEF细胞培养物中传代。不存在选择药物允许编码选择基因、gpt和EGFP及相关启动子的区域(选择盒)从插入序列的丢失。导致选择盒丢失的重组由在质粒pBN146中侧接选择盒的F1 I4L区域和该区域的子段即F1重复序列(F1 rpt)介导。包括这些重复序列是为了介导导致选择盒丢失，仅留下I4L基因间区中插入的mHER2序列的重组。
制备蚀斑纯化的缺少选择盒的病毒。此类制备涉及十五(15)次传代，所述传代包括五(5)次蚀斑纯化。
通过PCR分析确认MVA-BN-mHER2原种中存在mHER2序列而不存在亲代MVA-BN病毒，并且使用巢氏PCR验证不存在选择盒(gpt和EGFP基因)。
在体外接种了MVA-BN-mHER2的细胞中证明了mHER2蛋白质的表达。
实施例2
由于用MVA-BN-mHER2和抗CTLA4处理引起IFNγ增加
雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，约20g)购自Simonsen Laboratories,Gilroy,CA。对于实验肺部转移模型而言，在第1天为小鼠静脉移植5.0×104个于300μL DPBS中在肺部形成肿瘤的CT26-HER-2细胞。
从Bio X Cell(West,Lebanon,NH)购得以下抗体：抗ICOS激动性抗体(克隆物17G9)、抗CTLA-4(9D9)、抗PD-1(RMP1-14)和抗LAG-3(C9B7W)。除非另有指示，否则在第3和17天按每只小鼠200μg于100μL PBS中腹膜内注射所有抗体。对于病毒处理，除非另有指示，否则在第4和18天通过尾部划痕法(经皮，由Bavarian Nordic[BN],Martinsried,Germany产生)用7.1μL的1.0×107感染单位的MVA-BN-HER2处理小鼠。
在第25天，合并全血、肿瘤/肺部或脾脏(4只小鼠/组)用于流式细胞术分析。通过在两块磨砂载玻片之间按压脾脏，并且用ACK裂解缓冲液(Life Technologies,GrandIsland,NY)理解红血细胞制备脾细胞。将肺部和相关肿瘤切成约1-2mm3的小块并且在37℃下于DMEM中用10％FBS、50U/mL DNA酶I和250U/mL胶原酶I(Worthington BiochemicalCorporation,Lakewood,NJ)进一步消化1小时成单细胞悬浮液。用RBC裂解缓冲液(eBiosceince)裂解肺部和全血两者中的红血细胞。
针对以下蛋白质的抗体购自BD Bioscience(San Jose,CA)：CD3e(500A2)、CD4(RM4-5)、CD8a(53-6.7)、CD107a(1D4B)、IFN-γ(XMG1.2)；BioLegend(San Diego,CA)：CD3e(145-2C11)、IL-2(JES6-5H4)、LAG-3(C9B7W)、PD-1(CD279,29F.1A12)、Tim-3(RMT3-23)、TNF-α(MP6-XT22)；或eBioscience(San Diego,CA)：ICOS(7E.17G9)、CD16/CD32(93)。
为鉴别脱粒T细胞，使脾细胞(2×106个细胞/孔)或肿瘤/肺部(1×106个细胞/孔)的单细胞悬浮液重新悬浮在RPMI-10(10％FBS、1％青霉素-链霉素和0.1％β-巯基乙醇)中并且在37℃下在抗CD107a抗体和Golgi Stop(BD Bioscience)的存在下再刺激过夜。以下肽用于再刺激：MVA E3L和F2L(VGPSNSPTF和SPGAAGYDL，各1μM)、HER2 p63(TYLPTNASL，1μM)、HER2 ECD重叠肽库(HER2 OPL，1μM)和PSA(HPQKVTKFML，1μM)(5,9-11)。伴刀豆球蛋白A(ConA)在5μg/mL下用作阳性对照。第二天，洗涤细胞，用抗CD16/CD32抗体阻断，并且对表面标志物染色。然后洗涤细胞，用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液固定/透性化，并且在细胞内对IFN-γ染色。
如上所述对脾细胞进行另外的细胞内细胞因子染色，除省去抗CD107a抗体，添加Golgi Stop和Golgi Plug，并且在细胞内对IFN-γ、IL-2和TNF-α为细胞染色外。
在BD LSRII或Fortessa上获取所有FACS样品并且使用FlowJo 9.6.2版本(TreeStar Inc.,Ashland,OR)分析。
所有统计分析使用用于Windows(GraphPad Software,La Jolla,CA)的GraphPadPrism 6.01版本进行。
结果在图1中示出。在经MVA-BN-HER2和CTLA-4组合疗法处理的小鼠的肿瘤/肺部和脾脏中肿瘤抗原特异性脱粒细胞(HER2 p63 CD107+IFNγ+)增加。在经MVA-BN-HER2处理的小鼠的肿瘤/肺部和脾脏两者中病毒特异性脱粒细胞(MVA E3L F2L CD107+ IFNγ+)较高。
实施例3
由于用MVA-BN-mHER2和抗CTLA4处理引起IFNγ和细胞因子产量增加
用MVA-BN-HER2处理增加了脾脏中肿瘤抗原和病毒特异性T细胞的数量和质量。如实施例2中所述，为小鼠植入5×104个CT26-HER-2细胞，并用MVA-BN-HER2和抗CTLA4处理。在第25天，如实施例2中所述，合并肿瘤/肺部或脾脏(4只小鼠/组)并且再刺激过夜以测量病毒和肿瘤抗原特异性应答。
结果在图2中示出，A)饼状图经面积加权以反映每一百万个CD8+ T-细胞中IFNγ+细胞的数量。B)用组合疗法，IFNγMFI随肿瘤抗原特异性(HER2p63)多功能T细胞而增加。
在实施例2和3两者中，由于用MVA-BN-HER2和抗CTLA-4的组合处理，抗原和病毒特异性T细胞的数量和质量提高。此外，组合处理增加了存在于肿瘤中的抗原和病毒特异性T细胞的数量。如图1和2所示，肿瘤部位抗原和病毒特异性T细胞的增加是比使用单独的MVA-BN-HER2或抗CTLA-4处理明显的改进。抗原和病毒特异性T细胞的量和特异性上的此类增加可以为人类癌症提供更好且更有效的治疗。
另外，如图2所示，MVA-BN-HER2诱导产生IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞。本公开考虑到，病毒诱导的分泌IFNγ的TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)可导致肿瘤细胞上的PD-L1增加；支持与病毒处理组合对这种途径的阻滞。
实施例4
如实施例2中所述，为小鼠静脉植入5×104个CT26-HER-2细胞，并用MVA-BN-HER2和抗CTLA4处理。****p<0.0001，对数秩检验。结果。如图3所示，结果证明用MVA-BN-HER2和抗CTLA-4治疗与用单独的MVA-BN-HER2或抗CTLA-4治疗癌症相比显著增加了受试者的总存活率。
实施例5
到第25天MVA-BN-HER2明显降低肺肿瘤负荷
如实施例2中所述，为小鼠静脉植入5×104个CT26-HER-2细胞，并用MVA-BN-HER2和抗CTLA4处理。A)使小鼠安乐死并通过气管灌注台盼蓝。将肺部取出并将其在过氧化氢中短暂浸没并且在PBS中进行洗涤。在未处理和抗CTLA-4处理小鼠中可看见为小块的肿瘤。在用MVA-BN-HER2处理的小鼠中没有可见肿瘤。比例尺等于1cm。B)在第25天的肺重量。****p<0.0001，单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验。
结果。如图4所示，结果证明用单独的MVA-BN-HER2或与抗CTLA-4组合治疗与不治疗或用单独的抗CTLA-4治疗癌症相比到第25天显著降低了肿瘤负荷。
实施例6
MVA-BN-HER2和抗CTLA-4治疗增加总存活率
如实施例2中所述，为小鼠静脉植入5×104个CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。在第4和18天用抗CTLA-4按200μg(A，10mg/kg)、66μg(B，3mg/kg)或22μg(C，1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，对数秩检验。
结果。如图5所示，结果证明MVA-BN-HER2与抗CTLA-4组合在每个剂量浓度下与不治疗或用单独的抗CTLA-4治疗相比增加受试者的总存活率。
实施例7
MVA-BN-HER2和抗CTLA-4降低肿瘤负荷
在实体瘤模型中，在第1天为雌性BALB/c小鼠植入CT26-HER-2细胞(1.0×10^5，在背侧皮内)。在第1和第15天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，与100μL TBS中，在尾部根部处皮下)和在第1和15天用22μg抗CTLA-4(1mg/kg)处理小鼠。每周测量肿瘤两次并且根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长×宽2)/2。
结果。如图6所示，结果证明与其它治疗相比，MVA-BN-HER2与低剂量抗CTLA-4组合到第20天显著降低了肿瘤负荷。****p<0.0001，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例8
MVA-BN-HER2和抗PD-1处理
如实施例2中所述，为小鼠静脉植入5×104个CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。在第4和18天用抗PD-1按200μg(A，10mg/kg)、66ug(B，3mg/kg)或22μg(C，1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，*p<0.05，通过对数秩检验ns＝不显著。
结果。在图7中，结果显示了MVA-BN-HER2与抗PD-1组合。
实施例9
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗1 PD-1组合治疗在较低剂量下增加总存活率
如实施例2中所述，为小鼠静脉植入5×104个CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。在第3和17天用抗CTLA-4和抗PD-1按每种抗体200μg(A，10mg/kg)、66μg(B，3mg/kg)或22μg(C，1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，对数秩检验。
结果。如图8所示，结果证明MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗PD-1组合在每个剂量浓度下与用单独的MVA-BN-HER2或抗CTLA-4和抗PD-1治疗癌症相比显著增加受试者的总存活率。更重要的是，与单独的MVA-BN-HER2或抗CTLA-4和抗PD-1相比，对于MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗PD-1组合而言，在3mg/kg和1mg/kg抗体的较低剂量下存活率增加。
实施例10
MVA-BN-CV301与抗CTLA-4和抗PD-1增加总存活率
在第1天为雌性C57/BL6小鼠(6-8周龄，约20g，Simonsen Laboratories,Gilroy,CA)静脉植入1.0×10^6个于300μL DPBS中在肺部形成肿瘤的MC38-MUC1细胞。在第4和18天用MVA-BN-CV301(4E5感染单位，在尾部根部以上皮下)处理小鼠和用抗CTLA-4和抗PD-1(各200μg)经腹膜内内处理小鼠。
结果。如图9所示，结果证明MVA-BN-CV301与抗CTLA-4和抗PD-1组合与用单独的MVA-BN-CV301或抗CTLA-4和抗PD-1治疗癌症相比显著增加受试者的总存活率。
实施例11
抗肿瘤应答在用PROSTVAC和抗体处理的小鼠中的诱导
在第1天为雄性BALB/c小鼠(6-8周龄，约20g，Simonsen Laboratories,GilroyCA)植入形成实体瘤的E6细胞(1.5×10^5，在背侧皮内)。在第1天用PROSTVAC-V(2E7感染单位，在尾部根部处皮下)，并在第8和第15天用PROSTVAC-F(1E8感染单位，在尾部根部处皮下)处理小鼠。在第1和第15天在腹膜内用抗PD-1(200μg)处理小鼠。每周测量肿瘤两次并且根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长×宽2)/2。
实施例12
抗肿瘤应答在用PROSTVAC和抗PD-1处理的小鼠中的诱导
如实施例11中所述，为小鼠皮内植入E6肿瘤并用PROSTVAC和抗PD-1处理。结果在图10中示出。
实施例13
抗肿瘤应答在用PROSTVAC和抗LAG-3处理的小鼠中的诱导
如实施例11中所述，为小鼠皮内植入E6肿瘤并用PROSTVAC和抗LAG-3处理。结果在图11中示出。
实施例14
抗肿瘤应答在用PROSTVAC与抗PD-1和抗LAG-3处理的小鼠中的诱导
如实施例11中所述，为小鼠皮内植入E6肿瘤并用PROSTVAC、抗PD-1和抗LAG-3处理。结果在图12中示出。
实施例15
MVA-BN-HER2和抗CTLA-4降低肿瘤负荷
如实施例7中所述在第1天为小鼠皮内植入CT26-HER-2细胞。在第7和22天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，经皮)，和在第1、4、8、11、15、18、22、25天用抗ICOS(200μg，腹膜内)处理小鼠。A)平均肿瘤生长。B)个别小鼠中的肿瘤生长。****p<0.0001，**p<0.01，双因素ANOVA。结果在图13中示出。
实施例16
MVA-BN-HER2与抗PD-1组合在较低剂量下降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。在第1和15天用抗PD-1按200μg(10mg/kg)、66μg(3mg/kg)或22μg(1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例17
MVA-BN-HER2与抗ICOS组合在较低剂量下降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。在第1和15天用抗ICOS按200μg(10mg/kg)、66μg(3mg/kg)或22μg(1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例18
MVA-BN-HER2与抗PD-1和抗LAG-3组合在较低剂量下降低肿瘤负荷-
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。在第1和15天用抗PD-1和抗LAG-3按每种抗体200μg(10mg/kg)、66μg(3mg/kg)或22μg(1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例19
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗ICOS组合在较低剂量下降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。在第1和15天用抗CTLA-4和抗ICOS按每种抗体200μg(10mg/kg)、66μg(3mg/kg)或22μg(1mg/kg)，于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例20
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4组合以增加的第二剂量降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4在第1天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第15天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例21
MVA-BN-HER2与抗PD-1组合以增加的第二剂量降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗PD-1在第1天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第15天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例22
MVA-BN-HER2与抗ICOS组合以增加的第二剂量降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗ICOS在第1天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第15天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例23
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗PD-1组合以增加的第二剂量降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4和抗PD-1在第1天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第15天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例24
MVA-BN-HER2与抗PD-1和抗LAG-3组合以增加的第二剂量降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗PD-1和抗LAG-3在第1天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第15天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例25
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗ICOS组合以增加的第二剂量降低肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4和抗ICOS在第1天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第15天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例26
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4组合减小在抗CTLA-4之前用痘病毒时的肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4在第3天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第18天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4在第7天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第21天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例27
MVA-BN-HER2与抗PD-1组合减小在抗PD-1之前用痘病毒时的肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗PD-1在第3天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第18天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗PD-1在第7天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第21天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例28
MVA-BN-HER2与抗ICOS组合减小在抗ICOS之前用痘病毒时的肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗ICOS在第3天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第18天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗ICOS在第7天按66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第21天按200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例29
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗PD-1组合减小在抗CTLA-4和抗PD-1之前用痘病毒时的肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4和抗PD-1在第3天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第18天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4和抗PD-1在第7天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第21天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例30
MVA-BN-HER2与抗PD-1和抗LAG-3组合减小在抗PD-1和抗LAG-3之前用痘病毒时的肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗PD-1和抗LAG-3在第3天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第18天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗PD-1和抗LAG-3在第7天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第21天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例31
MVA-BN-HER2与抗CTLA-4和抗ICOS组合减小在抗CTLA-4和抗ICOS之前用痘病毒时的肿瘤负荷
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4和抗ICOS在第3天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第18天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
如实施例7中所述，为小鼠植入CT26-HER-2细胞并用MVA-BN-HER2处理。用抗CTLA-4和抗ICOS在第7天按每种抗体66μg(3mg/kg)、22μg(1mg/kg)或2.2μg(0.1mg/kg)并且在第21天按每种抗体200μg(10mg/kg)或66μg(3mg/kg)于100μL PBS中经腹膜内处理小鼠。****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA。
实施例32
经MVA-BN-HER2处理Tim-3表达增加
在第1和15天通过尾部划痕法(经皮，由Bavarian Nordic[BN],Martinsried,Germany产生)，用7.1μL的1.0×10^7感染单位的MVA-BN-HER2处理雌性BALB/c小鼠(6-8周龄，约20g，Simonsen Laboratories,Gilroy,CA)。如实施例2中所述收集、加工组织并且染色，并且在不同间隔测量Tim-3的表面表达。
结果。如图14所示，为受试者施用MVA-BN-HER-2，之后定期测量Tim-3的表达水平。响应于治疗，在免疫检查点表达上存在初期的很少增加。从约第3天到约第12天，TIM-3的T细胞表达明显增加。直到约第18天，仍将看到表达增加。在第15天第二次MVA-BN-HER2处理，从第17天开始Tim 3表达增加。更为重要的是，与CD4 T细胞相比在CD8 T细胞中免疫检查点表达上的这种增加更显著。
如图14所示，用MVA-BN-HER2处理瞬时诱导T细胞上的Tim-3表达。一方面，这种诱导的T细胞上的Tim-3表达表明，经由一种或多种TIM-3拮抗剂阻断Tim-3途径可以增强癌症患者的T细胞应答。
实施例33
MVA-BN-HER2处理增加CD8+和CD4+T细胞上的ICOS
在第1和15天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，经皮)处理小鼠。如实施例2中所述收集、加工组织并且染色，并且在不同间隔测量ICOS的表面表达。
结果。如图15所示，为受试者施用MVA-BN-HER-2，之后定期测量ICOS的表达水平。响应于治疗，在免疫检查点表达上存在初期的很少增加。大约1-2天之后，ICOS的T细胞表达显示出略微增加。从约第3天到约第12天，ICOS的T细胞表达明显增加。直到约第18天，仍将看到表达增加。在第15天第二次MVA-BN-HER2处理，从第17天开始ICOS表达增加。更为重要的是，与CD4 T细胞相比在CD8 T细胞中免疫检查点表达上的这种增加更显著。
如图15所示，用MVA-BN-HER2处理瞬时诱导T细胞上的ICOS表达。一方面，这种诱导的T细胞上的ICOS表达表明，经由一种或多种ICOS拮抗剂阻断ICOS途径可以增强癌症患者的T细胞应答。
实施例34
经MVA-BN-HER2处理PD-1表达增加
在第1和15天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，经皮)处理小鼠。如实施例2中所述收集、加工组织并且染色，并且在不同间隔测量PD-1的表面表达。
结果。结果在图16中示出。为受试者施用MVA-BN-HER-2，之后定期测量PD-1的表达水平。响应于治疗，在免疫检查点表达上存在初期的很少增加。大约1-2天之后，PD-1的T细胞表达显示出略微增加。从约第3天到约第12天，PD-1的T细胞表达明显增加。直到约第18天，仍将看到表达增加。在第15天第二次MVA-BN-HER2处理，从第17天开始PD-1表达增加。更为重要的是，与CD4 T细胞相比在CD8 T细胞中免疫检查点表达上的这种增加更显著。
如图16所示，用MVA-BN-HER2处理瞬时诱导T细胞上的PD-1表达。一方面，这种诱导的T细胞上的PD-1表达表明，经由一种或多种PD-1/PDL-1拮抗剂阻断PD-1/PDL-1途径可以增强癌症患者的T细胞应答。
进一步表明，阻断MVA-BN-HER2诱导的PD-1可导致LAG-3共同表达并且通过与MVA-BN-HER2组合对PD-1/PD-L1和LAG-3的双重阻滞可实现治疗益处。
实施例35
对MVA-BN-HER2的LAG-3免疫应答
在第1和15天用MVA-BN-HER2(1E7感染单位，经皮)处理小鼠。如实施例2中所述收集、加工组织并且染色，并且在不同间隔测量LAG-3的表面表达。
结果。结果在图17中示出。为受试者施用MVA-BN-HER-2，之后定期测量LAG-3的表达水平。在MVA-BN-HER2处理之后，CD4或CD8 T细胞上的LAG-3表达增加。
实施例36
抗肿瘤应答在用MVA-BN-CV301和抗体处理的小鼠中的诱导
在第1天为雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄，约20g，Simonsen Laboratories,GilroyCA)植入MC38-CEA细胞(2×105，在背侧皮内)。在第1和第15天用MVA-BN-CV301(1E7感染单位，尾部根部以上皮下)处理小鼠。如每张附图和实施例中所述并且如实施例2中所述，用抗PD-1和/或抗LAG-3经腹膜内处理小鼠。
实施例37
抗肿瘤应答在用MVA-BN-CV301和抗PD-1处理的小鼠中的诱导
如实施例36中所述为C57/BL6小鼠皮内植入MC38-CEA肿瘤并且处理小鼠。结果在图18中示出。
实施例38
抗肿瘤应答在用MVA-BN-CV301和抗LAG-3处理的小鼠中的诱导
如实施例36中所述为C57/BL6小鼠皮内植入MC38-CEA肿瘤并且处理小鼠。结果在图19中示出。
实施例39
抗肿瘤应答在用MVA-BN-CV301与抗PD-1和抗LAG-3处理的小鼠中的诱导
如实施例36中所述为C57/BL6小鼠皮内植入MC38-CEA肿瘤并且处理小鼠。结果在图20中示出。
实施例40
异源初免加强增强PSA特异性T细胞应答
BALB/c雄性(5只/组)每两周用缓冲液(对照)、PROSTVAC-V(VVV)(2E6感染单位，在尾部根部处皮下)、PROSTVAC-F(FFF)(1E7感染单位，在尾部根部处皮下)处理，或接受PROSTVAC-V初免，接着是2次PROSTVAC-F加强(VFF)。如以引用的方式并入本文的Mandl等Cancer Immunol.Immunother(2012),61:19-29中所述，通过IFNγELISPOT测定合并的脾细胞的PSA特异性应答。
(A,B)并且通过流式细胞术测定细胞毒活性(％CD107+ IFNγ+ CD8 T细胞)(C)。对于每个个体小鼠通过ELISA测定抗PSA IgG滴度(D)。对于ELISPOT，用CD4或CD8PSA特异性肽或对照(未示出在指定浓度下的对照)再刺激脾细胞。显示太多而不能计数的应答为1000点/百万个细胞。在0.01μM下通过RM-ANOVA用图基事后检验(Tukey post-test)测定统计显著性。与对照相比(A和B)，****P<0.001。为鉴别细胞毒性CD8+ T细胞，在抗CD107抗体的存在下用PSA CD8特异性肽再刺激脾细胞过夜。曲线图示出了4次单独进行的实验的代表性数据。
如图21所示，用牛痘病毒，接着用一个或多个鸡痘病毒加强剂量的异源初免-加强方案与VVV或FFF同源给药方案相比，产生频率高得多的生成IFNγ的PSA特异性CD4 T细胞(图21A)和CD8 T细胞(图21B和22A)。
而且，来自于VFF给药的PSA特异性T细胞具有更高亲合力(图21A和21B)，如在ELISPOT中在0.01μM较低肽浓度下应答的T细胞的较高频率所证明。重要的是，由VFF异源初免-加强方案产生的功能活性PSA特异性CD8 CTL的数量比通过同源给药方案产生的那些高7至20倍(图21C)。
与T细胞应答相反，异源初免-加强方案不提高PSA特异性抗体应答(图21D)。这些结果表明，通过更高亲合力和增加的CD8 CTL活性测量，异源VFF给药产生更大幅度和更高质量的CD4和CD8PSA特异性T细胞应答。如本文所述，在异源PROSTVAC-V/F给药之后这些有助于抗PSA特异性抗肿瘤应答提高。
实施例41
异源初免-加强提高PSA特异性T细胞应答的质量
如实施例40中所述处理BALB/c小鼠(5只/组)。在最后一次处理14天后收获脾脏，并且用PSA OPL或对照(对照未示出)再刺激脾细胞过夜。在流式细胞术分析之前对细胞内IFNγ、TNFα和IL-2为细胞染色。(A)饼状图经尺寸加权以反映检测到的细胞的数量(在每张图下面指出了每一百万个T-细胞中PSA特异性CD8的总数)。(B)在每个细胞的基础上通过平均荧光强度(MFI)测量的IFNγ产量。曲线图示出了2次单独进行的实验的代表性数据。
如图22所示，当通过流式细胞术分析PSA特异性CD8 T细胞的IFNγ、TNFα和IL-2的多细胞因子产量时，观察到PSA特异性CD8 T细胞质量上另外的显著特征(图22)。使用细胞因子表达，已将CD8记忆T细胞分类为双阳性CD8效应记忆T细胞(IFNγ+TNFα+，TEM)和三阳性CD8中央记忆T细胞(IFNγ+TNFα+IL-2+；TCM)。参见例如，Nat Rev Immunol 2008,8:247-258。
除CD8 T细胞应答的幅度增加之外(图21和图22A)，通过与同源给药方案相比，由异源PROSTVAC-V/F方案产生更高比例的双阳性TEM和三阳性TCM(图22A)揭示CD8 T细胞应答质量上的显著转变。用高5倍的PROSTVAC-V剂量初免在CD8 T细胞应答的幅度或质量上并未产生任何额外益处(数据未示出)。进一步地，双阳性TEM和三阳性TCM CD8 T细胞在每个细胞的基础上产生比单阳性细胞更高的IFNγ水平(图22B)。在TEM和TCM CD8 T细胞中观察到这种增加的IFNγ产量，与给药方案无关。
另外，如图22所示，MVA-BN-HER2诱导产生IFNγ的肿瘤抗原特异性T细胞。本公开考虑到，病毒诱导的分泌IFNγ的TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)可导致肿瘤细胞上的PD-L1增加；支持与病毒处理组合对这种途径的阻滞。
实施例42
T细胞应答免疫性集中针对PSA
如实施例40中所述处理小鼠。在最后一次处理后14天，通过流式细胞术(％CD107+IFNγ+CD8 T细胞)测定合并的脾细胞的牛痘病毒(VV)特异性(左侧的图A和C)或PSA特异性(右侧的图A和C)细胞毒活性。在抗CD107抗体的存在下用E3L和F2L肽或PSA OPL再刺激脾细胞过夜。第二天，对IFNγ和细胞表面标志物CD127和KLRG1为细胞染色。通过门控分别测定(CD8 +CD127-KLRG1+)和(CD8+CD127+KLRG1+)细胞上的抗原特异性细胞毒性SLEC和DPEC％。曲线图示出了2次单独进行的实验的代表性数据。结果在图23中示出。
分析与同源给药相比异源PROSTVAC牛痘病毒鸡痘/F给药方案对载体特异性与PSA特异性效应T细胞子集的细胞毒性能力的影响。同源VVV给药产生相对较高数量的牛痘特异性细胞毒性SLEC(约50％)和DPEC(约20％)(图23A和23C)，而低于10％的SLEC或DPEC细胞毒性CD8 T细胞为PSA特异性。相反，在异源VFF给药之后65％的SLEC和30％的高活性DPEC效应记忆T细胞为PSA特异性CTL，而牛痘特异性CTL占不到10％(图23A和23C)。因此，异源PROSTVAC-V/F方案引起靶向PSA与靶向牛痘的SLEC和DPEC T细胞应答的比率提高100倍(图23B和23D)。同样，用多5倍的PROSTVAC-V初免并未产生任何额外益处(数据未示出)。
实施例43
免疫集中后与CTLA-4的组合疗法
如实施例40中所述，每两周用缓冲液(对照)、PROSTVAC-V初免，接着是2次PROSTVAC-F加强(VFF)来处理BALB/c小鼠(5只/组)。在第1、15和29天(A)，或在第15和29天(B)，或在第16和30天(C)或在第17和31天(D)用抗CTLA-4(60μg)经腹膜内处理小鼠。如实施例40、41和42所述，分析PSA特异性T细胞应答。
如本文所述和本申请所证明，与一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用包含TAA的重组痘病毒在不同剂量下有效。具体而言，公开的组合在比独立使用一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂或痘病毒疗法的那些剂量低的剂量下有效。
本申请另外证明，重组痘病毒和免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的功效依赖于治疗期间使用的给药方案而大大增强。例如，在重组痘病毒治疗之后施用一种或多种免疫检查点拮抗剂或激动剂大大增强了组合治疗的功效。另外，在第二或后续重组痘病毒治疗之后增加免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量大大增强了本文所述的组合治疗的功效。
本申请另外证明，本文所述的给药方案对于大大增强的重组痘病毒和免疫检查点拮抗剂或激动剂组合疗法的功效很重要。
明显地，本公开证明具有TAA的痘病毒载体在与免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用时可以提供增加的疗效，与痘病毒载体的类型无关。具体而言，本公开证明在组合治疗中使用多种类型的痘病毒时疗效增加。例如，当痘病毒，诸如正痘病毒或禽痘病毒与本文所述的免疫检查点拮抗剂或激动剂一起施用时，达到了疗效。
将显而易见的是，本文所述的方法或组合物的精确细节可在不脱离所述发明的精神的情况下加以改变或修改。我们要求保护在以下权利要求书的范围和精神内的所有此类修改和改变。
序列表
<110> 巴法里安诺迪克有限公司
<120> 用表达肿瘤抗原的重组痘病毒和免疫检查点分子拮抗剂或激动剂治疗癌症的组合疗法
<130> BNIT0008PCT
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 2528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码包括两个源自破伤风毒素的表位的经修饰HER2蛋白质的构建体的核苷酸序列
<400> 1
agtatgcatt tttacggatg gagtctcggt ctaaaaacgg gaatgtacta tctacgtacg 60
aaacccgcat ccgctcccat tcaattcaca ttggacaagg ataaaataaa accactggtg 120
gtttgcgatt ccgaaatctg tacatcatgc agtggttaaa caaatctaga actagtttaa 180
ttaaggagct gttttgaata aaattttttt ataataaatc tagaactagt ggatcccccg 240
ggctgcagga attcgatcta gccgccacca tggagctggc ggccttgtgc cgctgggggc 300
tcctcctcgc cctcttgccc cccggagccg cgagcaccca agtgtgcacc ggcacagaca 360
tgaagctgcg gctccctgcc agtcccgaga cccacctgga catgctccgc cacctctacc 420
agggctgcca ggtggtgcag ggaaacctgg aactcaccta cctgcccacc aatgccagct 480
taagtttcct gcaggatatc caggaggtgc agggctacgt gctcatcgct cacaaccaag 540
tgaggcaggt cccactgcag aggctgcgga ttgtgcgagg cacccagctc tttgaggaca 600
actatgccct ggccgtgcta gacaatggag acccgctgaa caataccacc cctgtcacag 660
gggcctcccc aggaggcctg cgggagctgc agcttcgaag cctcacagag atcttgaaag 720
gaggggtctt gatccagcgg aacccccagc tctgctacca ggacacgatt ttgtggaagg 780
acatcttcca caagaacaac cagctggctc tcacactgat agacaccaac cgctctcggg 840
cctgccaccc ctgttctccg atgtgtaagg gctcccgctg ctggggagag agttctgagg 900
attgtcagag cctgacgcgc actgtctgtg ccggtggctg tgcccgctgc aaggggccac 960
tgcccactga ctgctgccat gagcagtgtg ctgccggctg cacgggcccc aagcactctg 1020
actgcctggc ctgcctccac ttcaaccaca gtggcatctg tgagctgcac tgcccagccc 1080
tggtccagta catcaaagct aactccaaat tcatcggtat caccgagctg cggtatacat 1140
tcggcgccag ctgtgtgact gcctgtccct acaactacct ttctacggac gtgggatcct 1200
gcaccctcgt ctgccccctg cacaaccaag aggtgacagc agaggatgga acacagcggt 1260
gtgagaagtg cagcaagccc tgtgcccgag tgtgctatgg tctgggcatg gagcacttgc 1320
gagaggtgag ggcagttacc agtgccaata tccaggagtt tgctggctgc aagaagatct 1380
ttgggagcct ggcatttctg ccggagagct ttgatgggga cccagcctcc aacactgccc 1440
cgctccagcc agagcagctc caagtgtttg agactctgga agagatcaca ggttacctat 1500
acatctcagc atggccggac agcctgcctg acctcagcgt cttccagaac ctgcaagtaa 1560
tccggggacg aattctgcac aatggcgcct actcgctgac cctgcaaggg ctgggcatca 1620
gctggctggg gctgcgctca ctgagggaac tgggcagtgg actggccctc atccaccata 1680
acacccacct ctgcttcgtg cacacggtgc cctgggacca gctctttcgg aacccgcacc 1740
aagctctgct ccacactgcc aaccggccag aggacgagtg tgtgggcgag ggcctggcct 1800
gccaccagct gtgcgcccga gggcactgct ggggtccagg gcccacccag tgtgtcaact 1860
gcagccagtt ccttcggggc caggagtgcg tggaggaatg ccgagtactg caggggctcc 1920
ccagggagta tgtgaatgcc aggcactgtt tgccgtgcca ccctgagtgt cagccccaga 1980
atggctcagt gacctgtttt ggaccggagg ctgaccagtg tgtggcctgt gcccactata 2040
aggaccctcc cttctgcgtg gcccgctgcc ccagcggtgt gaaacctgac ctctcctaca 2100
tgcccatctg gaagtttcca gatgaggagg gcgcatgcca gccttgcccc atcaactgca 2160
cccactcctg tgtggacctg gatgacaagg gctgccccgc cgagcagaga gccagccctc 2220
tgacgtcctt caacaacttc accgtgagct tctggctgcg cgtgcccaag gtgagcgcca 2280
gccacctgga gatcgtctct gcggtggttg gcattctgta gaagcttggt accgagctcg 2340
gatccactag tccagtgtgg tggaattctg cagatatcca gcacagtggc ggccatcaag 2400
cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc agttaattaa ggatcccccg 2460
ggctgcagga attccatttt tattctcaaa tgagataaag tgaaaatata tatcatatat 2520
acaaagta 2528
<210> 2
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1编码的经修饰HER2蛋白质的氨基酸序列
<220>
<221> P2
<222> (273)..(287)
<223> 源自破伤风毒素的T辅助细胞表位P2
<220>
<221> P30
<222> (654)..(674)
<223> 源自破伤风毒素的T辅助细胞表位P30
<400> 2
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Phe Asn Asn
645 650 655
Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His
660 665 670
Leu Glu Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
675 680

Claims (132)

1.一种用于治疗人类癌症患者的方法，其包括：
(a)向所述患者施用编码包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)的多肽的重组痘病毒；并且
(b)向所述患者施用PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂和所述CTLA-4拮抗剂分别包括抗PD-1拮抗剂抗体和抗CTLA-4抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂包含可溶性融合蛋白受体、肽、小分子或其组合。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述痘病毒为正痘病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述正痘病毒为牛痘病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述牛痘病毒为修饰型牛痘安卡拉(MVA)病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述MVA为MVA-BN。
8.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述痘病毒为禽痘病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述禽痘病毒为鸡痘病毒。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为癌胚抗原(CEA)、A粘蛋白1、细胞表面相关抗原(MUC-1)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、存活素、酪氨酸相关蛋白1(tyrp1)、酪氨酸相关蛋白1(tyrp2)或畸形短尾抗原。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为CEA抗原和MUC-1抗原。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为CEA抗原。
13.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为MUC-1抗原。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为PAP抗原。
15.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为PSA抗原。
16.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为HER-2抗原。
17.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为畸形短尾。
18.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为存活素。
19.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为tyrp1。
20.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述至少一种TAA为tyrp2。
21.根据权利要求1-20所述的方法，其中所述癌症治疗是针对乳腺癌、肺癌、头颈癌、甲状腺癌、黑素瘤、胃癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌或结直肠癌。
22.根据权利要求1-21所述的方法，其中所述癌症治疗是针对前列腺癌。
23.根据权利要求1-21所述的方法，其中所述癌症治疗是针对乳腺癌。
24.根据权利要求1-21所述的方法，其中所述癌症治疗是针对结直肠癌。
25.根据权利要求1-21所述的方法，其中所述癌症治疗是针对肺癌。
26.根据权利要求1-21所述的方法，其中所述癌症治疗是针对卵巢癌。
27.一种用于在人类癌症患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：向所述患者施用以下的组合：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，其中治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒载体或单独的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂包含CTLA-4拮抗剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂包含PD-1拮抗剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述CTLA-4拮抗剂和PD-1拮抗剂分别包括抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体。
31.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂中的至少一种以患者体重的约1mg/kg至约10mg/kg的量施用。
32.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的约1mg/kg至约3mg/kg的量施用。
33.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的1mg/kg至10mg/kg的量施用。
34.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的1mg/kg至3mg/kg的量施用。
35.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的约10mg/kg的量施用。
36.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的约3mg/kg的量施用。
37.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的约1mg/kg的量施用。
38.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的10mg/kg的量施用。
39.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的3mg/kg的量施用。
40.根据权利要求27-30所述的方法，其中所述免疫检查点拮抗剂或激动剂以患者体重的1mg/kg的量施用。
41.根据权利要求27-40所述的方法，其中所述治疗有效量的重组痘病毒与治疗有效量的免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为同源或异源初免-加强方案的一部分施用；
其中所述同源初免-加强方案包含与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的第一初免剂量的所述重组痘病毒和与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的一个或多个后续加强剂量的相同重组痘病毒；并且
其中所述异源初免-加强方案包含与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的第一初免剂量的所述重组痘病毒和与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的一个或多个后续加强剂量的不同重组痘病毒。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述重组痘病毒与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为同源初免-加强方案的一部分施用，其中所述第一初免剂量和所述一个或多个后续加强剂量的重组痘病毒包含正痘病毒。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述正痘病毒选自牛痘病毒、MVA或MVA-BN。
44.根据权利要求42-43所述的方法，其中所述至少一种TAA为HER2。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述重组痘病毒与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为异源初免-加强方案的一部分施用，其中所述第一初免剂量的重组痘病毒包含正痘病毒而一个或多个所述加强剂量的所述重组痘病毒包含禽痘病毒。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述正痘病毒为牛痘病毒而所述禽痘病毒为鸡痘病毒。
47.根据权利要求41、45-46所述的方法，其中所述异源初免-加强方案为PROSTVAC或CV301。
48.一种用于在人类患者中治疗癌症的试剂盒，其包含：(a)编码包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)的多肽的重组痘病毒；(b)PD-1拮抗剂；和(c)CTLA-4拮抗剂。
49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述PD-1拮抗剂和所述CTLA-4拮抗剂分别包括抗PD-1拮抗剂抗体和抗CTLA-4抗体。
50.根据权利要求48-49所述的试剂盒，其中所述至少一种TAA为CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、酪氨酸相关蛋白1(tyrp1)、酪氨酸相关蛋白2(tyrp2)、畸形短尾抗原或其组合。
51.根据权利要求48-49所述的试剂盒，其中所述至少一种TAA为PSA。
52.根据权利要求48-49所述的试剂盒，其中所述至少一种TAA为MUC-1和CEA。
53.根据权利要求48-52所述的试剂盒，其中所述痘病毒为正痘病毒或禽痘病毒。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述正痘病毒选自牛痘、MVA或MVA-BN。
55.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述禽痘病毒为鸡痘病毒。
56.根据权利要求48-55所述的试剂盒，其中所述重组痘病毒及PD-1拮抗剂和CTLA-4拮抗剂的组合与一种或多种可接受的稀释剂、缓冲剂、赋形剂或载体一起配制。
57.一种用于在人类患者中治疗癌症的方法，其包含：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；(b)治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；和(c)施用治疗有效量的所述痘病毒和治疗有效量的所述免疫检查点拮抗剂或激动剂中的至少一种的说明书，使得治疗有效量的与所述痘病毒联合的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂与施用单独的包含至少一种TAA的痘病毒或单独的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比具有增加的疗效。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG-3拮抗剂、ICOS激动剂或其组合。
59.根据权利要求57-58所述的试剂盒，其中所述至少一种TAA为CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、酪氨酸相关蛋白1(tyrp1)、酪氨酸相关蛋白2(tyrp2)、畸形短尾抗原或其组合。
60.根据权利要求48-59所述的试剂盒，其还包含在所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂之前施用所述重组痘病毒的说明书。
61.根据权利要求48-59所述的试剂盒，其还包含施用亚治疗剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的说明书，其中所述亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的所述痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。
62.根据权利要求48-59所述的试剂盒，其还包含为所述患者提供所述重组痘病毒和所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的一系列施用的说明书，其中所述说明书包括与所述系列中第一次施用的剂量相比，增加所述系列中第二次施用的剂量。
63.根据权利要求48-62所述的试剂盒，其还包含作为同源或异源初免-加强方案的一部分的与所述疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用的治疗有效量的重组痘病毒的说明书。
64.根据权利要求63所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括或CV301。
65.根据权利要求63所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括MVA-BN-HER2。
66.一种用于在人类癌症患者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用以下的组合：(a)治疗有效量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)亚治疗有效量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，其中亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂使得所述组合的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的所述痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂或与其它免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用相比增加。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的所述亚治疗有效量为免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量的约75％至约5％。
68.根据权利要求66所述的方法，其中免疫检查点拮抗剂或激动剂的所述亚治疗有效量为免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量的约50％至约10％。
69.根据权利要求66所述的方法，其中免疫检查点拮抗剂或激动剂的所述亚治疗有效量为免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量的75％至5％。
70.根据权利要求66所述的方法，其中免疫检查点拮抗剂或激动剂的所述亚治疗有效量为免疫检查点拮抗剂或激动剂的治疗有效量的50％至10％。
71.根据权利要求66-69所述的方法，其中所述治疗有效量的重组痘病毒与免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为同源或异源初免-加强方案的一部分施用。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述异源初免-加强包含PROSTVAC或CV301。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述同源初免-加强方案包含MVA-BN-HER2。
74.一种用于在人类癌症患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：
(a)向所述患者施用一个剂量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；并且
(b)向所述患者施用一个剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；
其中所述剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在所述剂量的所述重组痘病毒之后施用。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂痘病毒在施用所述剂量的所述重组痘病毒约1至约13天之后施用。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的所述重组痘病毒约4至约12天之后施用。
77.根据权利要求74所述的方法，其中所述剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的所述重组痘病毒1至13天之后施用。
78.根据权利要求74所述的方法，其中所述剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的所述重组痘病毒4至12天之后施用。
79.根据权利要求74-78所述的方法，其中所述剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂包含亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，使得与所述重组痘病毒联合的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的疗效与施用单独的包含至少一种TAA的所述痘病毒或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂相比增加。
80.根据权利要求74-79所述的方法，其还包括：
(a)向所述患者施用后续剂量的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；并且
(b)向所述患者施用后续剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；
其中所述后续剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在所述后续剂量的所述重组痘病毒之后施用。
81.根据权利要求74-80所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的所述后续剂量与所述至少一种检查点拮抗剂或激动剂的先前剂量相比增加。
82.根据权利要求74-81所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG-3拮抗剂、ICOS激动剂或其组合。
83.根据权利要求74-81所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、TIM-3拮抗剂或其组合。
84.根据权利要求74-81所述的方法，其中所述至少一种TAA为CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、酪氨酸相关蛋白1(trp1)、酪氨酸相关蛋白2(trp2)、畸形短尾抗原或其组合。
85.根据权利要求74-84所述的方法，其中所述至少一种TAA为PSA。
86.根据权利要求74-84所述的方法，其中所述至少一种TAA为MUC-1和CEA。
87.根据权利要求74-84所述的方法，其中所述重组痘病毒与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为同源或异源初免-加强方案的一部分施用。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述异源初免-加强包含PROSTVAC或CV301。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述同源初免-加强方案包含MVA-BN-HER2。
90.一种使用免疫疗法联合免疫检查点拮抗剂或激动剂治疗人类癌症患者的方法，所述方法包括(a)联合至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂为所述患者提供重组痘病毒的第一次施用，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；并且(b)联合至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂提供重组痘病毒的第二次施用，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂第二次施用的剂量与所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂第一次施用相比增加。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述第一次施用中的至少一种检查点拮抗剂或激动剂为亚治疗有效剂量。
92.根据权利要求90-91所述的方法，其中所述至少一种检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG-3拮抗剂、ICOS激动剂或其组合。
93.一种使用免疫疗法联合免疫检查点拮抗剂或激动剂治疗人类癌症患者的方法，所述方法包括(a)为所述患者提供一系列施用，所述施用包含与一个剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂联合的重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)，其中所述第二次施用中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量与所述第一次施用中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量相比增加。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述第一次施用的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的剂量为亚治疗有效剂量。
95.根据权利要求90-94所述的方法，其中所述第二次施用的剂量与所述第一次施用的剂量相比增加约2至约100倍。
96.根据权利要求90-94所述的方法，其中所述第二次施用的剂量与所述第一次施用的剂量相比增加约10至约100倍。
97.根据权利要求90-94所述的方法，其中所述第二次施用的剂量与所述第一次施用的剂量相比增加约30至约100倍。
98.根据权利要求90-94所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG-3拮抗剂、ICOS激动剂或其组合。
99.根据权利要求90-98所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、TIM-3拮抗剂或其组合。
100.根据权利要求90-98所述的方法，其中所述至少一种TAA为CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、酪氨酸相关蛋白1(trp1)、酪氨酸相关蛋白2(trp2)、畸形短尾抗原或其组合。
101.根据权利要求90-100所述的方法，其中所述重组痘病毒与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为同源或异源初免-加强方案的一部分施用；
其中所述同源初免-加强方案包含与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的第一初免剂量的所述重组痘病毒和与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的一个或多个后续加强剂量的相同重组痘病毒；并且
其中所述异源初免-加强方案包含与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的第一初免剂量的所述重组痘病毒和与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合的一个或多个后续加强剂量的不同重组痘病毒。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述重组痘病毒与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为同源初免-加强方案的一部分施用，其中所述第一初免剂量和所述一个或多个后续加强剂量的重组痘病毒包含正痘病毒。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述正痘病毒选自牛痘病毒、MVA或MVA-BN。
104.根据权利要求102-103所述的方法，其中所述至少一种TAA为HER2。
105.根据权利要求101所述的方法，其中所述重组痘病毒与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为异源初免-加强方案的一部分施用，其中所述第一初免剂量的重组痘病毒包含正痘病毒而一个或多个所述加强剂量的所述重组痘病毒包含禽痘病毒。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述正痘病毒为牛痘病毒而所述禽痘病毒为鸡痘病毒。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述正痘病毒为牛痘病毒、MVA或MVA-BN而所述禽痘病毒为鸡痘病毒。
108.根据权利要求101、105-106所述的方法，其中所述异源初免-加强方案为PROSTVAC或CV301。
109.一种用于治疗人类癌症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用：(a)第一重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；和(b)第二重组痘病毒，所述痘病毒包含至少一种肿瘤相关抗原(TAA)；其中所述第二重组痘病毒与至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在所述第二重组痘病毒之后施用。
111.根据权利要求109-110所述的方法，其中所述至少一种检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG-3拮抗剂、ICOS激动剂或其组合。
112.根据权利要求109-110所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、TIM-3拮抗剂或其组合。
113.根据权利要求109-112所述的方法，其中所述至少一种TAA为CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、酪氨酸相关蛋白1(trp1)、酪氨酸相关蛋白2(trp2)、畸形短尾抗原或其组合。
114.根据权利要求109-113所述的方法，其中所述第一和第二重组痘病毒不同并且作为异源初免-加强方案的一部分施用，所述异源初免-加强方案包括：a)施用所述第一重组痘病毒作为第一初免剂量；及b)与所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂组合施用的所述第二重组痘病毒作为一个或多个加强剂量。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述第一重组痘病毒包含正痘病毒而所述第二重组痘病毒包含禽痘病毒。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述正痘病毒为牛痘病毒而所述禽痘病毒为鸡痘病毒。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述异源初免-加强方案为PROSTVAC或CV301。
118.根据权利要求115所述的方法，其中所述正痘病毒选自牛痘病毒、MVA或MVA-BN，而所述禽痘病毒为鸡痘病毒。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述至少一种TAA为CEA和MUC-1。
120.一种用于在人类癌症患者中治疗癌症的方法，所述方法包括：
(a)向所述患者施用一个剂量的治疗性癌症疫苗；并且
(b)向所述患者施用一个剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；
其中所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在所述剂量的治疗性癌症疫苗之后施用。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述治疗性癌症疫苗为痘病毒。
122.根据权利要求120所述的方法，其中所述痘病毒为重组痘病毒，其包括至少一种肿瘤相关抗原(TAA)。
123.根据权利要求120-122所述的方法，其中所述剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在施用所述剂量的所述治疗性癌症疫苗约2至约16或约4至12天之后施用。
124.根据权利要求120-123所述的方法，其中所述剂量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂包含亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂，使得与所述治疗性癌症疫苗联合的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的疗效与施用单独的所述治疗性癌症疫苗或单独的亚治疗有效量的所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂相比增加。
125.根据权利要求120-124所述的方法，其还包括：
(a)向所述患者施用后续剂量的治疗性癌症疫苗；并且
(b)向所述患者施用后续剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂；
其中所述后续剂量的至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂在所述后续剂量的所述治疗性癌症疫苗之后施用。
126.根据权利要求120-125所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂的所述后续剂量与所述至少一种检查点拮抗剂或激动剂的先前剂量相比增加。
127.根据权利要求120-126所述的方法，其中所述至少一种免疫检查点拮抗剂或激动剂选自PD-1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG-3拮抗剂、ICOS激动剂或其组合。
128.根据权利要求122-127所述的方法，其中所述至少一种TAA为CEA、MUC-1、PAP、PSA、HER-2、存活素、酪氨酸相关蛋白1(trp1)、酪氨酸相关蛋白2(trp2)、畸形短尾抗原或其组合。
129.根据权利要求120-128所述的方法，其中所述治疗性癌症疫苗与所述免疫检查点拮抗剂或激动剂组合作为同源或异源初免-加强方案的一部分施用。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述异源初免-加强包含PROSTVAC或CV301。
131.根据权利要求129所述的方法，其中所述同源初免-加强方案包含MVA-BN-HER2。
132.一种用于增加人类癌症患者的总存活率的方法，其包括施用权利要求1-131中陈述的重组痘病毒载体和免疫检查点拮抗剂或激动剂的组合。
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