ES2913236T3 - Politerapia para tratar el cáncer con un poxvirus recombinante que expresa un antígeno tumoral y un antagonista o agonista de molécula del punto de control inmunitario - Google Patents

Abstract

Una combinación farmacéutica o medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente humano con cáncer, comprendiendo la combinación o medicamento: (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de poxvirus recombinante que codifica un polipéptido que comprende al menos un antígeno asociado a tumor (TAA) seleccionado del grupo que consiste en antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado a superficie celular de mucina 1 (MUC-1), antígeno específico prostático (PSA), factor 2 de crecimiento epidérmico humano (HER-2) y Brachyury; y (b) una cantidad subterapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario que es un antagonista de PD-1 o un antagonista de CTLA-4, en el que la combinación farmacéutica o medicamento comprende un antagonista de PD-1 y un antagonista de CTLA-4, y en el que cada uno de dicho antagonista de PD-1 y antagonista de CTLA-4 es un anticuerpo, un ARN de antisentido, o un ARNip.

Description

DESCRIPCIÓN

Politerapia para tratar el cáncer con un poxvirus recombinante que expresa un antígeno tumoral y un antagonista o agonista de molécula del punto de control inmunitario

Campo de la invención

La invención se refiere a poxvirus recombinantes que codifican un antígeno tumoral en combinación con antagonistas de moléculas del punto de control inmunitario para su uso en el tratamiento de cánceres.

Antecedentes de la invención

Los poxvirus recombinantes se han usado como vacunas para organismos infecciosos y, más recientemente, para tumores. Mastrangelo et al. J Clin Invest. 2000; 105(8): 1031-1034. Dos de estos grupos de poxvirus, avipoxvirus y ortopoxvirus, han demostrado ser eficaces en combatir los tumores y se han implicado con tratamientos potenciales contra el cáncer.

Una especie de avipoxvirus ejemplar, la viruela aviar, ha demostrado ser un vehículo seguro para administraciones a seres humanos, ya que el virus de la viruela aviar entre en las células de mamífero y expresa proteínas, pero fracasa en la replicación. Skinner et al. Expert Rev Vaccines. 2005 feb; 4(1): 63-76. Además, el uso de virus de la viruela aviar como vehículo para expresión se está evaluando en numerosos ensayos clínicos de vacunas contra el cáncer, el paludismo, la tuberculosis y el SIDA.

El virus de la variolovacuna, el mejor conocido de los ortopoxvirus, se usó en la erradicación mundial de la viruela y ha mostrado utilidad como vector y/o vacuna. Se ha manipulado el vector de la variolovacuna recombinante para que exprese una amplia gama de genes insertados, incluyendo varios genes asociados a tumor tales como p97, HER-2/neu, p53 y Et A (Paoletti, et al., 1993).

Una cepa útil de ortopoxvirus es el virus Ankara de la variolovacuna modificado (MVA). El MVA se generó mediante 516 pases seriados en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara del virus de la variolovacuna (CVA) (para una revisión véase Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 (1975)). Como consecuencia de estos pases a largo plazo, el genoma del virus MVA resultante tenía aproximadamente 31 kilobases de su secuencia genómica eliminadas y, por lo tanto, se describió como célula hospedadora altamente restringida para la replicación a células aviares (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). Se demostró en una diversidad de modelos animales que el MVA resultante era significativamente avirulento (Mayr, A. y Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978)). Además, esta cepa MVA se ha ensayado en ensayos clínicos como una vacuna para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987); Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)). En estos estudios en seres humanos, MVA había disminuido la virulencia o infecciosidad en comparación con vacunas basadas en el virus de la variolovacuna, mientras que MVA aún inducía una buena respuesta inmunitaria específica.

En las siguientes décadas, el MVA se manipuló para su uso como vector vírico para expresión génica recombinante o como vacuna recombinante (Sutter, G. et al., Vaccine 12: 1032-40 (1994).

Aunque Mayr et al. demostraron durante la década de 1970 que MVA está muy atenuado y es avirulento en seres humanos y mamíferos, determinados investigadores han informado de que MVA no se atenúa completamente en líneas celulares de mamífero y humanas ya que podría producirse replicación residual en estas células. (Blanchard et al., J Gen Virol 79, 1159-1167 (1998); Carroll y Moss, Virology 238, 198-211 (1997); Altenberger, patente de Estados Unidos n.° 5.185.146; Ambrosini et al., J Neurosci Res 55(5), 569 (1999)). Se asume que los resultados presentados en estas publicaciones se han obtenido con diversas cepas conocidas de MVA, ya que los virus usados difieren esencialmente en sus propiedades, particularmente en su comportamiento de crecimiento en diversas líneas celulares. Dicha replicación residual es indeseable por diversas razones, incluyendo cuestiones de seguridad en relación con el uso en seres humanos.

Se han descrito cepas de MVA que tienen perfiles de seguridad potenciados para el desarrollo de productos más seguros, tales como vacunas o productos farmacéuticos. Véase la publicación PCT internacional WO2002042480 (véanse también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.761.893 y 6.913.752). Dichas cepas tienen capacidad de replicación reproductiva en células no humanas y líneas celulares, especialmente en fibroblastos de embrión de pollo (CEF), pero no tienen capacidad de replicación reproductiva significativa en determinadas líneas celulares humanas para permitir la replicación con cepas de la variolovacuna conocidas. Dichas líneas celulares incluyen una línea celular de queratinocitos humanos, HaCat (Boukamp et al. J Cell Biol 106(3): 761-71 (1988)), una línea celular de adenocarcinoma cervicouterino humano, HeLa (ATCC n.° CCL-2), una línea celular de riñón embrionario humano, 293 (ECACC n.° 85120602) y una línea celular de osteosarcoma óseo humano, 143B (ECACC n.° 91112502). Dichas cepas tampoco tienen capacidad de replicación reproductiva significativa in vivo, por ejemplo, en determinadas cepas de ratón, tal como el modelo de ratón transgénico AGR 129, que está gravemente inmunocomprometido y es muy susceptible a un virus replicante. Véanse las patentes de Estados Unidos n.° 6.761.893. Se ha descrito una cepa de MVA de este tipo y sus derivados y recombinantes, denominados "MVA-BN". Véase la publicación PCT internacional WO2002042480 (véanse también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.761.893 y 6.913.752).

MVA y MVA-BN se han manipulado cada una para su uso como vector vírico para expresión génica recombinante o como vacuna recombinante. Véase, por ejemplo, Sutter, G. et al., Vaccine 12: 1032-40 (1994), publicación PCT internacional WO2002042480 (véanse también, por ejemplolas patentes de Estados Unidos n.° 6.761.893 y 6.913.752).

Determinadas estrategias para inmunoterapia del cáncer han incluido vacunación con antígenos asociados a tumor. En determinados casos, dichas estrategias han incluido el uso de un sistema de suministro para promover las respuestas inmunitarias del hospedador contra antígenos asociados a tumor. En determinados casos, dichos sistemas de suministro han incluido vectores víricos recombinantes. Véase, por ejemplo, Harrop et al., Front. Biosci. 11: 804­ 817 (2006); Arlen et al., Semin. Oncol. 32: 549-555 (2005); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (supl. 2): 14567­ 14571 (2004).

HER-2 es un antígeno asociado a tumor que se sobreexpresa en células tumorales de varios pacientes con cáncer. Se ha usado inmunización con diversos polipéptidos HER-2 para generar una respuesta inmunitaria contra células tumorales que expresan este antígeno. Véase, por ejemplo, Renard et al., J. Immunology 171: 1588-1595 (2003); Mittendorf et al., Cancer 106: 2309-2317 (2006).

Se ha demostrado que un MVA que codifica un antígeno HER-2, MVA-BN-HER2, ejerce una potente eficacia antitumoral en un modelo murino de metástasis pulmonar experimental, a pesar de un fuerte entorno inmunosupresor mediado por tumor caracterizado por una alta frecuencia de linfocitos T reguladores (T^reg) en los pulmones. Mandl et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61: 19-29. Se informó de que el MVA recombinante inducía respuestas de anticuerpos y linfocitos T específicos de HER-2 fuertemente dominadas por Th1. La actividad antitumoral se caracterizó por infiltración aumentada en los pulmones de linfocitos T CD8+CD11c+, específicos de HER-2, altamente activados, y estaba acompañada por una disminución en la frecuencia de linfocitos T^reg en el pulmón, lo que provoca una relación significativamente aumentada de linfocitos T efectores a linfocitos T^reg.

También se ha demostrado que MVA-BN-HER2 es seguro e interrumpe la tolerancia para inducida respuesta de linfocitos T y B específicas en estudios clínicos en seres humanos en un entorno metastásico. Guardino et al., Cancer Research: 15 de diciembre, 2009; volumen 69, número 24, suplemento 3.

El trastuzumab (Herceptin) es un anticuerpo monoclonal (mAb) humanizado que se dirige al dominio extracelular de HER2, y ha demostrado eficacia clínica en cáncer de mama HER2-positivo. Wang et al., Cancer Res. 1 de septiembre de 2012; 72(17): 4417-4428. Sin embargo, un número significativo de pacientes no logra responder al tratamiento inicial con trastuzumab y muchos tumores sensibles a trastuzumab desarrollan resistencia después de tratamiento continuo. #

Los receptores inhibidores en los inmunocitos son reguladores centrales del escape inmunitario en el cáncer. Woo et al., Cancer Res; 72(4); 917-27, 2011. Entre estos receptores inhibidores, CTLA-4 (proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos) sirve como interruptor de inactivación dominante mientras que otros receptores tales como PD-1 (muerte programada 1, CD279), LAG-3 (gen de activación de linfocitos, CD223) y TIM-3 (dominio de inmunoglobulina de linfocitos T y dominio-3 de mucina) parecen cumplir funciones de reóstato más sutiles.

CTLA-4 es una molécula del punto de control inmunitario, que se regula por aumento en linfocitos T activados. Mackiewicz, Wspolczesna onkol 2012; 16 (5): 363-370. CTLA-4 es una molécula coestimuladora negativa expresada en linfocitos T activados que inhibe su proliferación. Véase Mellman, Nature 2011; 480: 480-9). Un mAb anti-CTLA4 puede bloquear la interacción de CTLA-4 con CD80/86 e inactivar el mecanismo de supresión inmunitaria y posibilitar la estimulación continua de linfocitos T por las DC. Dos mAb IgG dirigidos contra CTLA-4, ipilimumab y tremelimumab, se han usado en ensayos clínicos en pacientes con melanoma.

Aunque estos estudios recientes han indicado que usar mAb IgG dirigido contra CTLA-4 puede proporcionar beneficio terapéutico a pacientes con melanoma, los tratamientos con estos anticuerpos anti-CTLA-4 han mostrado niveles altos de acontecimientos adversos relacionados con el sistema inmunitario. Mellman et al. Nature 2011; 480(7378): 480­ 489. Dichos acontecimientos adversos se han caracterizado como toxicidades específicas en la diana donde los pacientes tratados desarrollaron efectos adversos que incluyen colitis e hipofisitis, así como problemas relacionados con el hígado. Madan et al., Oncoimmunology 2012; 1(7): 1167-1168 presentan un estudio para comprobar la seguridad de coadministrar ipilimumab con una vacuna de MVA-BN que codifica PSA.

Otro mAb humano que modula el sistema inmunitario es BMS-936558 (MDX-1106) dirigido contra el receptor de muerte-1 (PD-1R), cuyo ligando (PD-1L) puede expresarse directamente en células de melanoma. PD-1R es una parte de la familia de B7:CD28 de moléculas coestimuladoras que regulan la activación y tolerancia de linfocitos T y, por tanto, el anticuerpo anti-PD-lR puede desempeñar una función en interrumpir la tolerancia. El acoplamiento de la ruta de PD-1/PD-L1 provoca la inhibición de la función efectora de linfocitos T, la secreción de citocinas y la proliferación. Turnis et al., OncoImmunology 1: 7, 1172-1174; 2012. Altos niveles de PD-1 se asocian con linfocitos T agotados o crónicamente estimulados. Id. Además, la expresión aumentada de PD-1 se correlaciona con supervivencia reducida en pacientes con cáncer.

Aunque estos estudios recientes han sugerido que la expresión de PD-1 puede estar ligada a las tasas de supervivencia en cáncer, estudios previos con inhibición de PD-1 en el tratamiento de cánceres han mostrado una amplia diversidad de efectos secundarios adversos. Mellman et al. Nature 2011; 480(7378): 480-489; véase también Chow, Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2013, "Exploring novel immune-related toxicities and endpoints with immunecheckpoint inhibitors in non-small cell lung cancer".

LAG-3 es una molécula coestimuladora negativa expresada en diversas células linfoides. En estados inflamatorios (tales como estimulación con IFN-gamma) tanto LAG-3 como MHC de clase II se regulan por aumento (Triebel Trends Immunol 2003; 24: 619-22).

TIM-3 se expresa en linfocitos T durante infecciones crónicas y cáncer (Jin Proc Natl Acad Sci 2010; 107: 14733-8, Baghadi Cancer Immunol Immunother 2013; 62: 629-37).

Hay claramente una necesidad médica insatisfecha sustancial de tratamientos contra el cáncer adicionales, incluyendo inmunoterapias activas y vacunas contra el cáncer. Además, en vista de los efectos secundarios adversos observados en muchos tratamientos actuales contra el cáncer, tal como tratamiento inhibidor del punto de control, existe una necesidad en la técnica de tratamientos que conserven la eficacia a dosificaciones menores. Estos tratamientos de dosificación menor pueden ayudar a reducir y/o eliminar estos efectos adversos.

Breve sumario de la invención

La invención abarca composiciones para su uso en tratar pacientes con cáncer humanos.

En una realización, la invención abarca una combinación farmacéutica o medicamento para su uso en tratar a un paciente con cáncer humano, comprendiendo la combinación o tratamiento (a) una cantidad eficaz terapéutica de poxvirus recombinante que codifica un polipéptido que comprende al menos un antígeno asociado a tumor (TAA) seleccionado del grupo que consiste en carcinoembrionario (CEA), asociado a superficie celular de mucina 1 (MUC-1), antígeno específico prostático (PSA), factor 2 de crecimiento epidérmico humano (HER-2) y Brachyury; y (b) una cantidad subterapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario que es un antagonista de PD-1 o un antagonista de CTLA-4, en el que la combinación farmacéutica o medicamento comprende un antagonista de PD-1 y un antagonista de CTLA-4, y en el que cada uno de dicho antagonista de PD-1 y antagonista de CTLA-4 es un anticuerpo, un ARN de antisentido o un ARNip.

En una realización preferida, el poxvirus recombinante es un ortopoxvirus recombinante o un avipoxvirus recombinante.

En una realización más preferida, el ortopoxivirus recombinante es un virus de la variolovacuna recombinante o un virus Ankara (MVA) de la variolovacuna modificado recombinante. En otra realización preferida, el ortopoxvirus recombinante es m VA-BN.

En otra realización preferida, el avipoxvirus recombinante es un virus de la viruela aviar recombinante.

En otra realización más, los tratamientos contra el cáncer descritos en este documento pueden dirigirse contra cánceres tales como, aunque sin limitación, cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, cáncer renal, cáncer de hígado, melanoma, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer colorrectal o combinaciones de los mismos.

Se expondrán ventajas adicionales de la invención en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvias a partir de la descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Las ventajas de la invención se lograrán y obtendrán por medio de los elementos y combinaciones particularmente indicadas en las reivindicaciones adjuntas.

Los dibujos adjuntos sirven para explicar los principios de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4 aumentan la infiltración tumoral de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Se realizó implante en los ratones como se describe en el ejemplo 2 y se dejaron sin tratar o se trataron con 200 gg de anti-CTLA-4 (en 100 gl de PBS, i.p.) en el día 3 y 18, y/o 1 x l07 Inf. U de MV-BN-HER2 (7,1 gl, t.s.) en el día 4 y 18. En el día 25, se combinaron el tumor/pulmones o bazos (4 ratones/grupo) y se reestimularon durante una noche para medir las respuestas específicas al virus y al antígeno tumoral.

Figura 2. El tratamiento con MVA-BN-HER2 aumentó la magnitud y calidad los linfocitos T específicos de antígeno tumoral y virus en el bazo. Se realizó implante en los ratones como se describe en el ejemplo 3. A) Los gráficos circulares son el área ponderada para reflejar el número de células IFNy+ por millón de linfocitos T CD8+. B) La MFI de IFNy aumenta con los linfocitos T polifuncionales con politerapia.

Figura 3. MVA-BN-HER2 sinergiza con anti-CTLA-4 para eliminar los tumores y aumenta la supervivencia en un modelo de metástasis pulmonar experimental. Se realizó implante en los ratones en el día 1 como se describe en el ejemplo 4 y se trataron con MVA-BN-HER2 en los días 4 y 18, y anti-CTLA-4 en los días 3 y 17. .... p<0,0001, ensayo del orden logarítmico.

Figura 4. Ratones con tumores pulmonares CT26-HER-2 se trataron como se describe en el ejemplo 5 y se analizó la carga tumoral en el día 25. A) Los ratones se sacrificaron y se perfundieron a través de la tráquea con azul tripano. Se retiraron los pulmones y se sumergieron brevemente en peróxido de hidrógeno, después PBS. Los tumores son visibles como pequeñas masas en pulmones sin tratar y tratados con anti-CTLA-4. No hubo tumores visibles en ratones tratados con MVA-BN-HER2. La barra de escala es igual a 1 cm. B) Los ratones tratados con MVA-BN-HER2 tienen un peso de los pulmones similar a ratones sin tratamiento previo en el día 25, aunque el peso de los pulmones es significativamente mayor en ratones sin tratar y tratados con anti-CTLA-4 en el día 25. **** p<0,0001, ANOVA unidireccional con ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett.

Figura 5. Se implantó a los ratones tumores CT26-HER-2 como se describe en el ejemplo 6. Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4 en los días 4 y 18 a 200 gg (A, 10 mg/kg), 66 ug (B, 3 mg/kg) o 22 gg (C, 1 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, ensayo del orden logarítmico.

Figura 6. Se realizó implante en los ratones como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se trataron en el día 1 y 15 con MVA-BN-HER2 (1E7 Inf. U. en 100 gl de TBS, s.c. En la base de la cola) y 22 gg de anti-CTLA-4 (1 mg/kg) en los días 1 y 15. Los resultados demuestran que MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 a dosis baja reducía significativamente la carga tumoral en el día 20 en comparación con otros tratamientos.

Figura 7. Se implantó a los ratones tumores CT26-HER-2 como se describe en el ejemplo 8. Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 y anti-PD-1 en los días 4 y 18 a 200 gg (A, 10 mg/kg), 66 ug (B, 3 mg/kg) o 22 gg (C, 1 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, * p<0,05, ns = no significativo por ensayo del orden logarítmico.

Figura 8. Se realizó implante en ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad, ~ 20 g, Simonsen Laboratories, Gilroy, CA) como se describe en el ejemplo 9. Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 en el día 4 y 18 y anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en los días 3 y 17 a 200 gg (A, 10 mg/kg), 66 ug (B, 3 mg/kg) o 22 gg (C, 1 mg/kg) cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, ensayo del orden logarítmico.

Figura 9. Se realizó implante en ratones C57/BL6 hembra (6-8 semanas de edad, ~20 g, Simonsen Laboratories, Gilroy, CA) en el día 1 como se describe en el ejemplo 10. Los ratones se trataron con MVA-BN-CV301 y se trataron con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 (200 gg cada uno) i.p. en los días 4 y 18.

Figura 10. Politerapia con PROSTVAC y anti-PD-1 en un modelo de tumor sólido E6. Se realizó implante en los ratones como se describe en el ejemplo 12. A) Los ratones se trataron en el día 1 con PROSTVAC-V, y los días 8 y 15 con PROSTVAC-F. Se administró anti-PD-1 en los días 1 y 15. A) Volumen tumoral promedio en ratones. B) Crecimiento tumoral individual en ratones.

Figura 11. Politerapia con PROSTVAC y anti-LAG-3 en un modelo de tumor sólido E6. Se realizó implante en los ratones como se describe en el ejemplo 13. A) Los ratones se trataron en el día 1 con PROSTVAC-V y los días 8 y 15 con PROSTVAC-F. Se administró anti-LAG-3 en los días 1 y 15. A) Volumen tumoral promedio en ratones. B) Crecimiento tumoral individual en ratones.

Figura 12. PROSTVAC en combinación con anti-PD-1 y anti-LAG-3 en un modelo de tumor sólido E6. Se realizó implante en los ratones como se describe en el ejemplo 14. A) Los ratones se trataron en el día 1 con PROSTVAC-V y los días 8 y 15 con PROSTVAC-F. Se administraron anti-PD-1 y anti-LAG-3 en los días 1 y 15. A) Volumen tumoral promedio en ratones. B) Crecimiento tumoral individual en ratones.

Figura 13. Se realizó implante en los ratones como se describe en el ejemplo 15. Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 en los días 7 y 22 (1E7 Inf. U., t.s.), y anti-ICOS en los días 1,4, 8, 11, 15, 18, 22, 25 (200 |ug i.p.). A) Crecimiento tumoral promedio. B) Crecimiento tumoral en ratones individuales.

Figura 14. La expresión de Tim-3 aumenta con el tratamiento con MVA-BN-HER2. Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 32. Se midió la expresión de Tim-3 en los ratones después del día 1 y día 15 de tratamiento con MVA-BN-HER2 (1E7 Inf. U., t.s.).

Figura 15. Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 33. ICOS aumentó en los pulmones y la sangre sobre linfocitos T CD8+ en el día 10 (A) y en los pulmones, la sangre y el bazo sobre linfocitos T CD4+ (B) después de un solo tratamiento con MVA-BN-HER2. Con un segundo tratamiento de MVA-BN-HER2 en el día 15, ICOS aumentó en los pulmones, la sangre y el bazo sobre linfocitos T CD8+ (C), y los linfocitos T CD4+ (D). Datos mostrados como media ± ETM, tres ratones por grupo en cada punto temporal.

Figura 16. Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 34. La expresión de PD-1 aumentó sobre linfocitos T CD8+ en los pulmones y la sangre con tratamiento con MVA-BN-HER2 en el día 1 (A). La expresión de PD-1 aumentó adicionalmente con un segundo tratamiento en el día 15 en los pulmones, el bazo y la sangre (C). PD-1 aumentó ligeramente sobre linfocitos T CD4+ en el pulmón después de un solo tratamiento (B) y permaneció estable después de un segundo tratamiento con MVA-BN-HER2 (D).

Figura 17. Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 35. La expresión de LAG-3 aumentó en los pulmones, el bazo y la sangre sobre linfocitos T CD8+ después de tratamiento en d1 (A) o día 1 y 15 (C) con MVA-BN-HER2. La expresión de LAG-3 sobre linfocitos T CD4+ aumentó ligeramente después de un tratamiento en el día 1 (B) o día 1 y 15 (D) con MVA-BN-HER2.

Figura 18. MVA-BN-CV301 y anti-PD-1 ralentizan el crecimiento tumoral en un modelo de tumor sólido MC38-CEA. Se implantó i.d. a los ratones tumores MC38-CEA y se trataron como se describe en el ejemplo 37. Los ratones se trataron además con MVA-BN-CV301 y anti-PD-1. A) Volumen tumoral promedio en ratones. B) Crecimiento tumoral individual en ratones.

Figura 19. Politerapia con MVA-BN-CV301 y anti-LAG-3 en un modelo de tumor sólido MC38-CEA. Se implantó i.d. a los ratones tumores MC38-CEA y se trataron como se describe en el ejemplo 38. Los ratones se trataron además con MVA-BN-CV301 y anti-LAG-3. A) Volumen tumoral promedio en ratones. B) Crecimiento tumoral individual en ratones.

Figura 20. MVA-BN-CV-301 en combinación con anti-PD-1 y anti-LAG-3. Se implantó i.d. a los ratones tumores MC38-CEA y se trataron como se describe en el ejemplo 39. Los ratones se trataron además con MVA-BN-CV-301 y anti-LAG-3 y anti-PD1. A) Volumen tumoral promedio en ratones. B) Crecimiento tumoral individual en ratones.

Figura 21. Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 40. Se ensayaron esplenocitos combinados para respuestas específicas a PSA mediante ELISPOT de IFNy (A, B) y actividad citotóxica mediante citometría de flujo (% de linfocitos T CD8 CD107+ IFNy+) (C). Se determinaron los valores cuantitativos de IgG anti-PSA mediante ELISA para cada ratón individual (D). Para ELISPOT, los gráficos muestran los datos representativos de cuatro experimentos realizados independientemente.

Figura 22. Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 41. (A) Los diagramas circulares se ponderan en tamaño para reflejar los números de células detectadas (los números totales de CD8 específicos de PSA por millón de linfocitos T se indican por debajo de cada diagrama). (B) Cantidad de producción de IFNy en una base celular medida por intensidad de fluorescencia media (MFI). Los gráficos muestran los datos representativos de dos experimentos realizados independientemente.

Figura 23. Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 42. Se ensayaron esplenocitos combinados para actividad citotóxica específica de virus de la variolovacuna (VV) (paneles A y C a la izquierda) o específica de PSA (paneles A y C a la derecha) mediante citometría de flujo (% de linfocitos T CD8 CD107+ IFNy+) 14 días después del último tratamiento. Los gráficos muestran los datos representativos de dos experimentos realizados independientemente.

Descripción detallada de la invención

Varios ensayos clínicos actuales implican tratamientos que emplean vectores basados en virus de la variolovacuna, virus Ankara de la variolovacuna modificado (MVA) y virus de la viruela aviar que se manipularon para que expresaran uno o más antígenos asociados a tumor (TAA). Estos vectores se usan en solitario o en estrategias de sensibilizaciónrefuerzo para generar una respuesta inmunitaria activa contra una diversidad de cánceres. PROSTVAC® emplea una estrategia de sensibilización-refuerzo usando virus de la variolovacuna y de la viruela aviar que expresa PSA y TRICOM™ y está actualmente en un ensayo clínico global en fase III (PROSPECT) para cáncer de próstata metastásico resistente a castración. CV301, o CV-301, emplea una estrategia de sensibilización-refuerzo heteróloga usando virus de la variolovacuna y de la viruela aviar que expresa antígeno MUC-1, CEA y TRICOM™ y está actualmente en un ensayo clínico en fase II para cáncer de vejiga.

MVA-BN-HER2 (Mandl et al., 2012), está en ensayos clínicos en fase I para el tratamiento de cáncer de mama HER-2+. Este vector recombinante deriva de la reserva de virus Ankara de la variolovacuna modificado (MVA) muy atenuado conocido como MVA-BN. Expresa una forma modificada de HER-2 (denominado HER2) que consiste en el dominio extracelular de HER-2 que se ha manipulado para que incluya dos epítopos de linfocitos T universales de la toxina tetánica (TTp2 y TTp30) para facilitar la inducción de respuestas inmunitarias eficaces contra HER-2.

Para potenciar más la eficacia antitumoral de la inmunoterapia basada en poxvirus, MVA-BN-HER2 se combinó con un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de CTLA-4, una proteína del punto de control inmunitario que regula por disminución la activación de linfocitos T. En el modelo de metástasis pulmonar experimental CT26-HER-2, la mediana del tiempo de supervivencia aumentó de 30 días en ratones sin tratar a 49,5 días con tratamiento con MVA-BN-HER2, mientras que el tratamiento anti-CTLA-4 por sí mismo mostró poco beneficio de supervivencia (mediana de supervivencia de 35 días). En contraste, MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 aumentaba significativamente la supervivencia hasta más de 100 días (p <0,0001) en más de un 50 % de los ratones. A los 100 días, los pulmones de los ratones supervivientes se examinaron y no había tumores visibles.

PROSTVAC® y MVA-BN-CV301 (MVA que expresa CEA y MUC-1 con o sin TRICOM) se ensayaron cada uno también en combinación con diversos anticuerpos antagonistas dirigidos contra PD-1 y LAG-3 en diversos modelos de tumor. Se descubrió que las combinaciones potenciaban los efectos de PROSTVAC® y MVA-BN-CV301.

En vista de la toxicidad y los efectos adversos de los tratamientos contra el cáncer que implican antagonistas de CTLA-4 y otros antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario (véase, por ejemplo, Mellman et al. Nature 2011), se realizaron ensayos de valoración de la dosificación usando un poxvirus recombinante que codificaba un antígeno asociado a tumor tal como MVA-BN-HER2 en combinación con un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de CTLA-4. Como se ilustra y describe en este documento, el tratamiento con poxvirus recombinante tal como MVA-BN-HER2, cuando se combina con inhibición de CTLA-4, podría conseguir efectos terapéuticos aumentados en comparación con tratamientos contra el cáncer que usan inhibición de CTLA-4 en solitario o tratamiento con poxvirus recombinante en solitario. De forma más importante, se mantuvo la eficacia terapéutica mediante el tratamiento combinado incluso a dosificaciones menores.

Para determinar la potenciación de la eficacia antitumoral de la inmunoterapia basada en poxvirus usando antagonistas o agonistas adicionales del punto de control inmunitario, MVA-BN-HER2 se combinó con un anticuerpo monoclonal que bloquea la actividad de CTLA-4, así como un anticuerpo antagonista contra PD-1. Como se ilustra y describe en este documento, el tratamiento con poxvirus recombinante, cuando se combina con un anticuerpo contra CTLA-4 y antagonista de PD-1, podría conseguir efectos terapéuticos aumentados en comparación con tratamientos contra el cáncer que usan una inhibición combinada de CTLA-4 y PD-1 en solitario o tratamiento con poxvirus recombinante en solitario. De forma más importante, se mantuvo la eficacia terapéutica mediante el tratamiento combinado incluso a dosificaciones menores.

Para determinar adicionalmente la potenciación de la eficacia antitumoral de la inmunoterapia basada en poxvirus usando antagonistas y agonistas adicionales del punto de control inmunitario, se realizaron ensayos de valoración de la dosificación usando un poxvirus recombinante que codifica un antígeno asociado a tumor, tal como MVA-BN-HER2 en combinación con diversos antagonistas o agonistas adicionales del punto de control inmunitario como se describe en este documento. Como se ilustra y describe en este documento, el tratamiento con poxvirus recombinante, cuando se combina con antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario de la presente solicitud, pudo conseguir efectos terapéuticos aumentados. De forma más importante, se mantuvo la eficacia terapéutica mediante el tratamiento combinado incluso a dosificaciones menores.

En al menos un aspecto, las composiciones de la presente invención, junto con su eficacia terapéutica ventajosa, también a bajas dosificaciones, se diseñan para maximizar los beneficios terapéuticos de tratamientos contra el cáncer del punto de control inmunitario y poxvíricos, mientras se trabaja para minimizar los efectos secundarios adversos observados en los tratamientos contra el cáncer actuales. En una realización, estos beneficios terapéuticos con efectos adversos reducidos se consiguen a través de administración de dosificaciones menores de un antagonista del punto de control inmunitario (por ejemplo, anticuerpos antagonistas de CTLA-4) en combinación con un tratamiento poxvírico. Como se proporciona en la presente invención, cuando se combina con un tratamiento poxvírico, los antagonistas del punto de control inmunitario retienen la eficacia del tratamiento incluso a dosificaciones menores. Significativamente, estas dosificaciones menores en las que se retenía la eficacia terapéutica, pueden incluir dosificaciones a las que un antagonista del punto de control inmunitario sería terapéuticamente ineficaz cuando se administrar como monoterapia.

En otras realizaciones, la presente invención incluye una o más pautas de dosificación y métodos de administración de la combinación de un tratamiento poxvírico y un antagonista del punto de control inmunitario. En al menos un aspecto, las pautas de dosificación y métodos de administración presentados en este documento se diseñan para maximizar los beneficios terapéuticos de los tratamientos contra el cáncer del punto de control inmunitario y poxvíricos, mientras se trabaja para minimizar los efectos secundarios adversos asociados con tratamientos contra el cáncer.

Poxvirus que codifica un polipéptido que comprende un antígeno tumoral

En una realización, el poxvirus recombinante que expresa un antígeno tumoral es preferiblemente un ortopoxvirus tal como, aunque sin limitación, un virus de la variolovacuna, un virus Ankara de la variolovacuna modificado (MVA) o MVA-BN.

Ejemplos de cepas del virus de la variolovacuna son las cepas Templo del Cielo, Copenhague, París, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, Consejo de Salud de la Ciudad de Nueva York, Elstree, Ikeda y WR. Una cepa preferida del virus de la variolovacuna (VV) es la cepa Wyeth (DRYVAX) (patente de Estados Unidos 7.410.644). Otra cepa VV preferida es un virus Ankara de la variolovacuna modificado (MVA) (Sutter, G. etal. [1994], Vaccine 12: 1032-40). Otra cepa VV preferida es MVA-BN.

Ejemplos de cepas del virus MVA que son útiles en la práctica de la presente invención y que se han depositado en cumplimiento de los requisitos del Tratado de Budapest son las cepas MVA 572, depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, con el número de depósito ECACC 94012707 el 27 de enero de 1994, y MVA 575, depositada en Ec Ac C 00120707 el 7 de diciembre de 2000. MVA-BN, depositada el 30 de agosto de 2000 en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número V00083008, y sus derivados, son cepas ejemplares adicionales.

Aunque se prefiere MVA-BN por su mayor seguridad (menos competente en replicación), todos los MVA son adecuados para esta invención. De acuerdo con una realización de la presente invención, la cepa de MVA es MVA-BN y sus derivados. Se da una definición de MVA-BN y sus derivados en el documento PCT/EP01/13628 que se incorpora por referencia en este documento.

En una realización, la invención abarca el uso de ortopoxvirus recombinantes, preferiblemente un virus de la variolovacuna (VV), una cepa Wyeth, ACAM 1000, ACAM 2000, MVA o MVA-BN para tratamiento contra el cáncer. Los ortopoxvirus recombinantes se generan mediante inserción de secuencias heterólogas en un ortopoxvirus.

En determinadas realizaciones, el ortopoxvirus comprende al menos un antígeno asociado a tumor (TAA) seleccionado de un antígeno CEA, MUC-1, Ps A, h Er -2 o Brachyury.

En otras realizaciones, el antígeno asociado a tumor se modifica para que incluya uno o más epítopos T^h exógenos. Se describen en este documento diversos agentes inmunoterapéuticos contra el cáncer. En al menos un aspecto, la invención permite el uso de dichos agentes en pautas de vacunación de sensibilización/refuerzo de seres humanos y otros mamíferos, incluyendo pacientes inmunocomprometidos; e induciendo respuestas inmunitarias tanto humorales como celulares, tal como induciendo una respuesta inmunitaria Th1 en un entorno Th2 preexistente.

En determinadas realizaciones, el MVA es MVA-BN, depositado el 30 de agosto de 2000, en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número V00083008, y descrito en la publicación PCT internacional WO2002042480 (véanse también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.761.893 y 6.913.752). Como se describe en estas publicaciones de patente, MVA-BN no se replica de forma reproductiva en las líneas celulares 293, 143B, HeLa y HaCat. En particular, MVA-BN muestra una relación de amplificación de 0,05 a 0,2 en la línea celular de riñón embrionario humano 293. En la línea celular de osteosarcoma óseo humano 143B, MVA-BN muestra una relación de amplificación de 0,0 a 0,6. MVA-BN muestra una relación de amplificación de 0,04 a 0,8 en la línea celular de adenocarcinoma cervicouterino humano HeLa, y de 0,02 a 0,8 en la línea celular de queratinocitos humanos HaCat. MVA-BN tiene una relación de amplificación de 0,01 a 0,06 en células de riñón de mono verde africano (CV1: ATCC n.° CCL-70).

La relación de amplificación de MVA-BN está por encima de 1 en fibroblastos de embrión de pollo (CEF: cultivos primarios) como se describe en la publicación PCT internacional WO2002042480 (véanse también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.761.893 y 6.913.752). El virus puede propagarse fácilmente y amplificarse en cultivos primarios de CEF con una relación por encima de 500.

En determinadas realizaciones, un MVA recombinante es un derivado de MVA-BN. Dichos "derivados" incluyen virus que muestran esencialmente las mismas características de replicación que la cepa depositada (ECACC n.° V00083008), pero que muestran diferencias en una o más partes de su genoma. Los virus que tiene las mismas "características de replicación" que el virus depositado son virus que se replican con relaciones de amplificación similares a la cepa depositada en células CEF y las líneas celulares HeLa, HaCat y 143B; y que muestran características de replicación similares in vivo, determinadas, por ejemplo, en el modelo de ratón transgénico AGR129.

En determinadas realizaciones, el poxvirus es un virus de la variolovacuna recombinante que contiene secuencias de nucleótidos adicionales que son heterólogas al poxvirus. En determinadas realizaciones de este tipo, las secuencias heterólogas codifican epítopos que inducen una respuesta por parte del sistema inmunitario. Por tanto, en determinadas realizaciones, el poxvirus recombinante se usa para vacuna contra las proteínas o agentes que comprenden el epítopo. En una realización, el epítopo es un antígeno asociado a tumor, preferiblemente, HER-2. En una realización, el antígeno HER-2 comprende la secuencia de SEQ ID NO:2.

En otras realizaciones, el epítopo es un antígeno asociado a tumor seleccionado de un antígeno tal como CEA, MUC-1, PSA, HER-2 o Brachyury.

En determinadas realizaciones, se inserta una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un antígeno asociado a tumor descrito en este documento en una región no esencial del genoma del virus. En determinadas realizaciones de esas, la secuencia de ácido nucleico heteróloga se inserta en un sitio de eliminación de origen natural del genoma de MVA como se describe en el documento PCT/EP96/02926. Los métodos para insertar secuencias heterólogas en el genoma poxvírico son conocidos por los expertos en la materia.

En otra realización, el poxvirus recombinante que expresa un antígeno tumoral es un avipoxvirus, tal como, aunque sin limitación, un virus de la viruela aviar.

El término "avipoxvirus" se refiere a cualquier avipoxvirus, tal como virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario, virus de la viruela del junco, virus de la viruela del miná, virus de la viruela de la paloma, virus de la viruela de las psitácidas, virus de la viruela de la codorniz, virus de la viruela del pavo real, virus de la viruela del pingüino, virus de la viruela del gorrión, virus de la viruela del estornino y virus de la viruela del pavo. Avipoxvirus preferidos con virus de la viruela del canario y virus de la viruela aviar.

Un ejemplo de un virus de la viruela del canario es la cepa Rentschler. Una cepa de virus del canario purificada en placa denominada ALVAC (patente de Estados Unidos n.° 5.766.598) se depositó según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), número de acceso VR-2547. Otra cepa de viruela del canario es la cepa de la vacuna comercial contra la viruela del canario denominada LF2 CEP 52424 1075, disponible en el Institute Merieux, Inc.

Ejemplos de un virus de la viruela aviar son las cepas FP-1, FP-5, TROVAC (patente de Estados Unidos n.° 5.766.598) y POXVAC-TC (patente de Estados Unidos 7.410.644). FP-1 es una cepa Duvette modificada para usarse como vacuna en pollos de un día de edad. La cepa es una cepa de la vacuna comercial contra el virus de la viruela aviar denominada O DCEP 25/CEP67/2309 octubre 1980 y está disponible en el Institute Merieux, Inc. FP-5 es una cepa de la vacuna comercial contra el virus de la viruela aviar de origen de embrión de pollo disponible en American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wis., licencia veterinaria de Estados Unidos n.° 165, n.° de serie 30321.

Ejemplos de cepas del virus de la variolovacuna son las cepas Templo del Cielo, Copenhague, París, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, Consejo de Salud de la Ciudad de Nueva York, Elstree, Ikeda y WR. Una cepa preferida del virus de la variolovacuna (VV) puede incluir la cepa Wyeth (DRYVAX) (patente de Estados Unidos 7.410.644), ACAM 1000 o ACAM 2000. Otra cepa VV preferida es un virus Ankara de la variolovacuna modificado (MVA) (Sutter, G. etal. [1994], Vaccine 12: 1032-40). Otra cepa VV preferida es MVA-BN.

En determinadas realizaciones, el avipoxvirus incluye al menos un antígeno asociado a tumor (TAA) seleccionado de un antígeno CEA, MUC-1, PSA, HER-2 o Brachyury.

En otras realizaciones, el poxvirus recombinante que expresa un antígeno tumoral es una combinación de un virus de la variolovacuna que expresa un antígeno tumoral y un avipoxvirus, tal como de la viruela aviar, que expresa un antígeno tumoral. Se contempla que la combinación del virus de la variolovacuna y el virus de la viruela aviar puede administrarse como una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga. En un ejemplo no limitante, la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga es PROSTVAC® o CV301.

Para la preparación de vacunas, el poxvirus puede convertirse en una forma fisiológicamente aceptable. En determinadas realizaciones, dicha preparación se basa en la experiencia en la preparación de vacunas de poxvirus usadas para vacunación contra la viruela, como se describe, por ejemplo, en Stickl, H. e ta l., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974).

Una preparación ejemplar es como sigue. Se almacena virus purificado a -80 °C con un valor cuantitativo de 5 x 108 de DIHC5^ü/ml formulado en Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4. Para la preparación de dosis de vacuna, por ejemplo, puede liofilizarse 102-108 partículas del virus en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de peptona al 2 % y albúmina humana al 1 % en una ampolla, preferiblemente una ampolla de vidrio. Como alternativa, las dosis de vacuna pueden prepararse por liofilización por etapas del virus en una formulación. En determinadas realizaciones, la formulación contiene aditivos adicionales tales como manitol, dextrano, glúcido, glicina, lactosa, polivinilpirrolidona u otros aditivos, tales como, incluyendo, aunque sin limitación, antioxidantes o gas inerte, estabilizantes o proteínas recombinantes (por ejemplo, seroalbúmina humana) adecuadas para administración in vivo. La ampolla entonces se sella y puede almacenarse a una temperatura adecuada, por ejemplo, entre 4 °C y temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, siempre que no haya necesidad, la ampolla se almacena preferiblemente a temperaturas por debajo de -20 °C.

En diversas realizaciones que implican vacunación o tratamiento, el liofilizado se disuelve en 0,1 a 0,5 ml de una solución acuosa, preferiblemente solución salina fisiológica o tampón Tris, y se administra por vía sistémica o local, es decir, por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica o cualquier otra vía de administración conocida por los facultativos expertos en la materia. La optimización del modo de administración, la dosis y el número de administraciones pertenece a las habilidades y conocimientos de los expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, las cepas del virus de la variolovacuna atenuado son útiles para inducir respuestas inmunitarias en animales inmunocomprometidos, por ejemplo, monos (CD4 <400/gl de sangre) infectados con SIV, o seres humanos inmunocomprometidos. La expresión "inmunocomprometido" describe el estado del sistema inmunitario de un individuo que muestra solamente respuestas inmunitarias incompletas o tiene una eficacia reducida en la defensa contra agentes infecciosos.

Determinados antígenos asociados a tumor ejemplares

En determinadas realizaciones, se produce una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un antígeno polipeptídico asociado a células. En determinadas realizaciones de este tipo, un antígeno polipeptídico asociado a células es un antígeno asociado a tumor.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. Los aminoácidos pueden ser de origen natural, así como de origen no natural, o un análogo químico de un aminoácido de origen natural. El término también se refiere a proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, estas pueden formar complejos, uniéndose covalentemente o pueden unirse no covalentemente. El uno o más polipéptidos en una proteína pueden glucosilarse y/o lipidarse y/o comprender grupos protésicos.

Preferiblemente, el antígeno asociado a tumor incluye HER-2, PSA, CEA, MUC-1 o Brachyury en solitario o en combinaciones. Dicha combinación ejemplar puede incluir CEA y MUC-1, también conocida como CV301.

Se conocen en la técnica numerosos antígenos asociados a tumor. Antígenos asociados a tumor ejemplares incluyen, aunque sin limitación, 5 alfa reductasa, alfa-fetoproteína, AM-1, APC, April, BAGE, beta-catenina, Bcl12, bcr-abl, CA-125, CASP-8/FLICE, catepsinas, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33 CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55, CD59, CDC27, c Dk4, CEA, c-myc, Cox-2, dCc , DcR3, E6/E7, CGFR, EMBP, Dna78, farnesil transferasa, FGF8b, FGF8a, FLK-1/KDR, receptor de ácido fólico, G250, familia de GAGE, gastrina 17, hormona liberadora de gastrina, GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pmel17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, heparanasa, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT, IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA, LKLR-FUT, familia de MAGE, mamaglobina, MAP17, melan-A/MART-1, mesotelina, MIC A/B, MT-Mm P, mucina, NY-ESO-1, osteonectina, p15, P170/MDR1, p53, p97/melanotransferrina, PAI-1, PDGF, uPA, PRAME, probasina, progenipoietina, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, Sa RT-1, familia de SSX, STAT3, STn, TAG-72, TGF-alfa, TGF-beta, timosina-beta-15, TNF-alfa, TYRP-, TYRP-2, tirosinasa, VEGF, ZAG, p16INK4 y glutatión-S-transferasa.

Un antígeno PSA preferido comprende el cambio aminoacídico de isoleucina a leucina en la posición 155. Patente de Estados Unidos 7.247.615, que se incorpora en este documento por referencia.

Un antígeno asociado a tumor ejemplar es HER-2. HER-2 es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (c-erbB) que consiste en cuatro receptores diferentes hasta la fecha: c-erbB-1 (EGFr), c-erbB 2 (HER-2, c-Neu), c-erbB-3 y c-erbB-4 (Salomon et al., 1995). C-erbB-3 y c-erbB-4 están peor caracterizados que EGFr y HER-2. HER-2 es una glucoproteína integrada de membrana. La proteína madura tiene un peso molecular de 185 kDa con elementos estructurales que se parecen mucho al receptor de EGFr (Prigent et al., 1992). EGFr es también un receptor integrado de membrana que consiste en una subunidad. Tiene un peso molecular aparente de 170 kDa y consiste en un dominio de unión a ligando superficial de 621 aminoácidos, un solo dominio transmembranario hidrófobo de 23 aminoácidos, y un dominio tirosina cinasa citoplasmático altamente conservado de 542 aminoácidos. La proteína está N-glucosilada (Prigent et al., 1994).

Todas las proteínas en esta familia son tirosina cinasas. La interacción con el ligando da lugar a la dimerización del receptor, que aumenta la acción catalítica de la tirosina cinasa (Bernard. 1995, Chantry 1995). Las proteínas dentro de la familia pueden homo- y heterodimerizar, lo que es importante para su actividad. El EGFr transporta los efectos promotores del crecimiento y estimula la captación de glucosa y aminoácidos por las células (Prigent et al. 1992). HER-2 también transporta las señales promotoras del crecimiento.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico se expresa en tejidos normales en bajas cantidades, pero se sobreexpresa en muchos tipos de cánceres. El EGFr se sobreexpresa en cánceres de mama (Earp et al., 1993, Eppenberger 1994), gliomas (Schlegel et al., 1994), cáncer gástrico (Tkunaga et al., 1995), carcinoma escamoso cutáneo (Fujii 1995), cáncer de ovario (van Dam et al., 1994) y otros. HER-2 también se expresa en unos pocos tejidos humanos normales en baja cantidad, la mayoría característicamente en el epitelio secretor. La sobreexpresión de HER-2 se produce en aproximadamente un 30 % de cánceres de mama, gástricos, pancreáticos, de vejiga y de ovario.

La expresión de estos receptores varía dependiendo del grado de diferenciación de los tumores y el tipo de cáncer, por ejemplo, en cáncer de mama, los tumores primarios sobreexpresan ambos receptores; mientras que en cáncer gástrico, la sobreexpresión se produce en un estadio posterior en tumores metastásicos (Salomon et al., 1995). El número de receptores sobreexpresados en células de carcinoma es mayor de 106/célula para varios cánceres de cabeza y cuello, vulva, mama y líneas de cáncer de ovario aisladas de pacientes (Dean et al., 1994).

Hay varias razones por las que la familia de EGFr de receptores constituye dianas para inmunoterapia tumoral. En primer lugar, se sobreexpresan en muchos tipos de cánceres, lo que debe dirigir la respuesta inmunitaria hacia el tumor. En segundo lugar, los tumores a menudo expresan o sobreexpresan los ligandos para esta familia de receptores y algunos son hipersensibles a los efectos proliferativos mediados por los ligandos. En tercer lugar, los pacientes con tumores que sobreexpresan receptores del factor de crecimiento a menudo tienen un mal pronóstico. La sobreexpresión se ha ligado estrechamente con un mal pronóstico especialmente en cáncer de mama, cáncer pulmonar y cáncer de vejiga y puede asociarse con fenotipos invasivos/metastásicos, que son bastante insensibles a tratamientos convencionales (Eccles et al., 1994).

Antígenos asociados a tumor modificados

En determinadas realizaciones, un antígeno polipeptídico asociado a células se modifica de modo que se induzca una respuesta CTL contra una célula que presenta epítopos derivados de un antígeno polipeptídico en su superficie, cuando se presenta en asociación con una molécula MHC de clase I en la superficie de una APC. En determinadas realizaciones de este tipo, al menos un primer epítopo TH exógeno, cuando se presenta, se asocia con una molécula MHC de clase II en la superficie de la APC. En determinadas realizaciones de este tipo, un antígeno asociado a células es un antígeno asociado a tumor.

Las APC ejemplares que pueden presentar epítopos incluyen células dendríticas y macrófagos. APC ejemplares adicionales incluyen cualquier APC pino- o fagocítica, que pueda presentar simultáneamente 1) epítopos CTL unidos a moléculas MHC de clase I y 2) epítopos T^h unidos a moléculas MHC de clase II.

En determinadas realizaciones, se hacen modificaciones a uno o más de los antígenos asociados a tumor (TAA) presentados en este documento, tales como, aunque sin limitación, CEA, MUC-1, PSA, HER-2 o Brachyury, de modo que, después de administración a un sujeto, se generen anticuerpos policlonales que reaccionan predominantemente con el uno o más de los TAA descritos en este documento. Dichos anticuerpos podrían atacar y eliminar células tumorales, así como evitar que células metastásicas desarrollen metástasis. El mecanismo efectos de este efecto antitumoral estaría mediado mediante citotoxicidad celular dependiente del complemento y de anticuerpos. Además, los anticuerpos inducidos también podrían inhibir el crecimiento celular a través de inhibición de la oligodimerización dependiente del factor de crecimiento e internalización de los receptores. En determinadas realizaciones, dichos TAA modificados podrían inducir respuestas CTL dirigidas contra epítopos TAA conocidos y/o predichos presentados por las células tumorales.

En determinadas realizaciones, un antígeno polipeptídico TAA modificado comprende un epítopo CTL del antígeno polipeptídico asociado a células y una variación, en el que la variación comprende al menos un epítopo CTL de un epítopo T^h exógeno. Determinados TAA modificados de este tipo pueden incluir, en un ejemplo no limitante, uno o más antígenos polipeptídicos HER-2 que comprenden al menos un epítopo CTL y una variación que comprende al menos un epítopo CTL de un epítopo T ^h exógeno, y métodos de producir de los mismos, se describen en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.498 y las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2004/0141958 y 2006/0008465.

En determinadas realizaciones, un epítopo T ^h exógeno es un epítopo de linfocitos T "promiscuo" de origen natural. Dichos epítopos de linfocitos T promiscuos son activos en una gran proporción de individuos de una especie animal o una población animal. En determinadas realizaciones, una vacuna comprende dichos epítopos de linfocitos T promiscuos. En determinadas realizaciones de este tipo, el uso de epítopos de linfocitos T promiscuos reduce la necesidad de un número muy grande de epítopos CTL diferentes en la misma vacuna. Epítopos de linfocitos T promiscuos ejemplares incluyen, aunque sin limitación, epítopos de toxina tetánica, incluyendo, aunque sin limitación, los epítopos P2 y P30 (Panina-Bordignon et al., 1989), toxina diftérica, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, y antígeno CS de P. falciparum.

Epítopos de linfocitos T promiscuos adicionales incluyen péptidos que pueden unirse a una gran proporción de moléculas HLA-DR codificadas por los diferentes HLA-DR. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/23635 (Frazer IH et al., cedida a la Universidad de Queensland); Southwood S et al., 1998, J. Immunol. 160: 33633373; Sinigaglia F et al., 1988, Nature 336: 778780; Rammensee HG et al., 1995, Immunogenetics 41: 4178228; Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med 178: 2747; Hammer J et al., 1993, Cell 74: 197203; y Falk K et al., 1994, Immunogenetics 39: 230242. La última referencia también trata de ligandos de HLA-DQ y -DP. Todos los epítopos enumerados en estas referencias son pertinentes como epítopos naturales candidatos como se describe en este documento, ya que son epítopos que comparten motivos comunes con estos.

En otras determinadas realizaciones, el epítopo de linfocitos T promiscuo es un epítopo de linfocitos T artificial que puede unirse a una gran proporción de haplotipos. En determinadas realizaciones de este tipo, el epítopo de linfocitos T artificial es un péptido de epítopo pan DR ("PADRE") como se describe en el documento WO 95/07707 y en el artículo correspondiente Alexander J et al., 1994, Immunity 1: 751 761.

mHER2

Se describen diversos antígenos polipeptídicos HER-2 modificados y métodos para producir los mismos en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.498 y publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2004/0141958 y 2006/0008465. Esos documentos describen diversos antígenos polipeptídicos HER-2 modificados que comprenden epítopos de linfocitos T promiscuo en diferentes posiciones en el polipéptido HER-2.

La secuencia de HER-2 humana puede dividirse en varios dominios basados únicamente en la estructura primaria de la proteína. Esos dominios son como sigue. El dominio extracelular (receptor) se extiende por los aminoácidos 1-654 y contiene varios subdominios como sigue: el dominio I (dominio N terminal del polipéptido maduro) se extiende por los aminoácidos 1-173; el dominio II (dominio rico en cisteína, 24 residuos de cisteína) se extiende por los aminoácidos 174-323; el dominio III (dominio de unión a ligando en el receptor de EGF homólogo) se extiende por los aminoácidos 324-483; y el dominio IV (dominio rico en cisteína, 20 residuos de cisteína) se extiende por los aminoácidos 484-623. Los residuos transmembranarios se extienden por los aminoácidos 654-675. El dominio intracelular (cinasa) se extiende por los aminoácidos 655-1235 y contiene el dominio tirosina cinasa, que se extiende por los aminoácidos 655-1010 (el dominio TK central se extiende por 725-992); y el dominio C terminal, que se extiende por los aminoácidos 1011-1235.

La selección de sitios en la secuencia de aminoácidos de HER-2 a desplazar por los epítopos auxiliares T humanos P2 o P30 se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.498 y las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2004/0141958 y 2006/0008465. En resumen, se consideraron los siguientes parámetros:

1. Epítopos CTL conocidos y predichos;

2. Homología con receptores relacionados (EGFR en particular);

3. Conservación de residuos de cisteína;

4. Estructuras predichas de bucle, hélice a y lámina p;

5. Posibles sitios de N-glucosilación;

6. Predicción de residuos aminoacídicos expuestos y enterrados;

7. Organización de dominios.

Los epítopos CTL parecen estar agrupados en el dominio I, dominio III, el dominio TM y en dos o tres "puntos calientes" en el dominio TK. Como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.498 y las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2004/0141958 y 2006/0008465, estos deben conservarse en gran medida.

Probablemente regiones con un alto grado de homología con otros receptores son estructuralmente importantes para la estructura terciaria "global" de HER-2 y, por tanto, para el reconocimiento de anticuerpos, mientras que regiones con baja homología posiblemente pueden intercambiarse con únicamente alteraciones locales de la estructura como consecuencia.

Los residuos de cisteína a menudo están implicados en la formación de puentes disulfuro intramoleculares y, por tanto, están implicados en la estructura terciaria y no deben cambiarse. Deben evitarse regiones, que se predice que formarán estructuras de hélice alfa o lámina beta, como puntos de inserción de epítopos exógenos, ya que se cree que estas regiones están implicadas en el plegamiento de la proteína.

Deben conservarse los posibles sitios de N-glucosilación si se desea manosilación de la proteína.

Las regiones que se predice (por sus propiedades hidrófobas) que son interiores en la molécula preferiblemente deben conservarse, ya que estas podrían estar implicadas en el plegamiento. En contraste, las regiones expuestas al disolvente podrían servir como posiciones candidatas para inserción de los epítopos T^h de modelo P2 y P30.

Finalmente, la organización de dominios de la proteína debe tenerse en consideración a causa de su relevancia para la estructura y función proteínica.

Como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.498 y las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2004/0141958 y 2006/0008465, la prioridad de la estrategia ha sido conservar la estructura de la parte extracelular de HER-2 lo más posible, porque esta es la parte de la proteína que es pertinente como diana para anticuerpos neutralizantes. En contraste, la parte intracelular de HER-2 unido a membrana natural en la superficie de células cancerosas es inaccesible para el sistema inmunitario humoral.

Se proporcionan diversas construcciones ejemplares usando los epítopos P2 y P30 de la toxina tetánica insertados en diversos dominios de HER-2 en la patente de Estados Unidos n.° 7.005.498 y las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2004/0141958 y 2006/0008465. Un antígeno polipeptídico HER-2 modificado ejemplar, denominado "mHER2", comprende los dominios extracelulares y nueve aminoácidos del dominio transmembranario; el epítopo P2 insertado en el dominio II entre los residuos aminoacídicos 273 y 287 del polipéptido HER-2 modificado; y el epítopo P30 insertado en el dominio IV entre los residuos aminoacídicos 655 y 675 del polipéptido HER-2 modificado.

MVA-BN-mHER2 recombinante

En una realización, se construye MVA recombinante que comprende un antígeno asociado a tumor, por ejemplo, MVA-BN-mHER2, como sigue. La reserva de virus inicial se genera por recombinación en cultivo celular usando un tipo de célula permisivo de replicación, por ejemplo, células CEF. Las células se inoculan con un virus de la variolovacuna atenuado, por ejemplo, MVA-BN, y se transfectan con un plásmido de recombinación (por ejemplo, pBN146) que codifica la secuencia del antígeno asociado a tumor, por ejemplo, mHER2, y regiones flanqueantes del genoma del virus. En una realización no limitante, el plásmido pBN146 contiene secuencias que también están presentes en MVA-BN (los marcos abiertos de lectura 14L y 15L). La secuencia de mHER2 se inserta entre las secuencias de MVA-BN para permitir la recombinación del genoma vírico de MVA-BN. En determinadas realizaciones, el plásmido también contiene un casete de selección que comprende uno o más genes de selección para permitir la selección de construcciones recombinantes en células CEF. En una realización preferida, el MVA recombinante codifica un polipéptido que comprende SEQ ID NO:2.

La infección y transfección simultánea de cultivo permite que se produzca recombinación homóloga entre el genoma vírico y el plásmido de recombinación. Entonces se aísla el virus que porta el inserto, se caracteriza y se preparan reservas de virus. En determinadas realizaciones, el virus se pasa en cultivos celulares CEF en ausencia de selección para permitir la pérdida de la región que codifica los genes de selección, gpt y EGFP.

Antagonistas de moléculas del punto de control inmunitario

Como se describe en este documento, al menos en un aspecto, la invención abarca el uso de antagonistas del punto de control inmunitario. Dichos antagonistas del punto de control inmunitario incluyen antagonistas de moléculas del punto d control inmunitario tales como antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) y proteína 1 de muerte celular programada (PD-1). Un antagonista de CTLA-4 o PD-1 interfiere con la función de CTLA-4 o PD-1, respectivamente.

Dichos antagonistas de CTLA-4 o PD-1 incluyen anticuerpos que se unen específicamente a CTLA-4 o PD-1, respectivamente e inhiben y/o bloquean la actividad y función biológica.

Otros antagonistas de CTLA-4 o PD-1 incluyen ARN de ácido nucleico de antisentido que interfieren con la expresión de CTLA-4 o PD-1; ARN interferentes pequeños que interfieren con la expresión de CTLA-4 o PD-1; e inhibidores micromoleculares de CTLA-4 o PD-1.

Pueden cribarse antagonistas candidatos de CTLA-4 o PD-1 por la función mediante una diversidad de técnicas conocidas en la técnica y/o divulgadas dentro de la presente solicitud, tal como la capacidad de interferir con la función de CTLA-4 o PD-1 en un modelo in vitro o de ratón.

Anticuerpos

En una realización, el antagonista de CTLA-4 o PD-1 es un anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser sintéticos, monoclonales o policlonales y pueden prepararse por técnicas bien conocidas en la técnica. Dichos anticuerpos se unen específicamente a CTLA-4 o PD-1 mediante los sitios de unión a antígeno del anticuerpo (en oposición a la unión no específica). Los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc. de CTLA-4 o PD-1 pueden emplearse como inmunógenos en la producción de anticuerpos inmunorreactivos con los mismos. Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc. contienen determinantes antigénicos o epítopos que provocan la formación de anticuerpos.

Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos de una sola sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena polipeptídica que se ponen en cercana proximidad tras el plegamiento de la proteína (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2.a ed. 1996)). Como las proteínas plegadas tienen superficies complejas, el número de epítopos disponibles es bastante numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína y los impedimentos estéricos, el número de anticuerpos que realmente se unen a los epítopos es menor que el número de epítopos disponibles (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2.a ed. 1996)). Los epítopos pueden identificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos scFv, que se unen a CTLA-4 o PD-1 y bloquean su función ("anticuerpos antagonistas") o potencian/activan su función ("anticuerpos agonistas"), están incluidos por la divulgación. Dichos anticuerpos pueden generarse por medios convencionales.

En una realización, la invención abarca anticuerpos monoclonales contra CTLA-4 o PD-1 que bloquean ("anticuerpos antagonistas") la función de las moléculas del punto de control inmunitario CTLA-4 o PD-1, respectivamente. Se describe anticuerpos monoclonales de bloqueo ejemplares contra PD-1 en el documento WO 2011/041613.

Los anticuerpos pueden unirse a sus dianas con alta avidez y especificidad. Son moléculas relativamente grandes (~150 kDa), que pueden inhibir estéricamente las interacciones entre dos proteínas (por ejemplo, PD-1 y su ligando diana) cuando el sitio de unión del anticuerpo está en la proximidad del sitio de interacción de proteína-proteína. La invención abarca además anticuerpos que se unen a epítopos en cercana proximidad a un sitio de unión de ligando de CTLA-4 o PD-1.

En diversas realizaciones, la invención abarca anticuerpos que interfieren con las interacciones intermoleculares (por ejemplo, interacciones de proteína-proteína), así como anticuerpos que perturban las interacciones intramoleculares (por ejemplo, cambios conformacionales dentro de una molécula). Los anticuerpos pueden cribarse por la capacidad de bloquear o potenciar/activar la actividad biológica de CTLA-4 o PD-1 o la unión de CTLA-4 o PD-1 a un ligando, y/o por otras propiedades.

Pueden prepararse tanto anticuerpos policlonales como monoclonales por técnicas convencionales.

CTLA-4 o PD-1 y péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de CTLA-4 o PD-1 pueden utilizarse para preparar anticuerpos que se unen específicamente a CTLA-4 o PD-1. Se entiende que término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos, tales como fragmentos F(ab')2 y Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos de anticuerpo de un solo dominio (VHH o nanocuerpos), fragmentos de anticuerpo bivalentes (diacuerpos), así como cualquier compañero de unión producido de forma recombinante y sintética.

Los anticuerpos se definen por ser de unión específica si se unen a polipéptido CTLA-4 o PD-1 con una Ka de más de o igual a aproximadamente 107 M-1. Las afinidades de compañero de unión o anticuerpos pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949).

Pueden generarse fácilmente anticuerpos policlonales a partir de una diversidad de fuentes, por ejemplo, caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones o ratas, usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. En general, CTLA-4 o PD-1 purificado o un péptido basado en la secuencia de aminoácidos de CTLA-4 o PD-1 que está conjugado apropiadamente se administra al animal hospedador típicamente a través de inyección parenteral. La inmunogenia de CTLA-4 o PD-1 puede potenciarse a través del uso de un adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund. Después de inmunizaciones de refuerzo, se recogen pequeñas muestras de suero y se ensayan para la reactividad al polipéptido CTLA-4 o PD-1. Ejemplos de diversos ensayos útiles para dicha determinación incluyen los descritos en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; así como procedimientos, tales como inmunoelectroforesis a contracorriente (CIEP), radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayos de transferencia puntual, y ensayos no competitivos. Véanse las patentes de Estados Unidos n.° 4.376.110 y 4.486.530.

Pueden prepararse fácilmente anticuerpos monoclonales usando procedimientos bien conocidos. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos en las patentes de Estados Unidos n.° RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, y Bechtol (eds.), 1980.

Por ejemplo, a los animales hospedadores, tales como ratones, se les puede inyectar por vía intraperitoneal al menos una vez y preferiblemente al menos dos veces en intervalos de aproximadamente 3 semanas CTLA-4 o PD-1 aislado y purificado o péptido CTLA-4 o PD-1 conjugado, opcionalmente en presencia de adyuvante. Entonces se ensayan los sueros de ratón por técnica de transferencia puntual convencional o captura de anticuerpo (ABC) para determinar el animal que es mejor para fusión. Aproximadamente de dos a tres semanas después, a lo ratones se les administra un refuerzo intravenoso de CTLA-4 o PD-1 o péptido CTLA-4 o PD-1 conjugado. Después los ratones se sacrifican y se fusionan los esplenocitos con células de mieloma disponibles en el mercado, tales como Ag8.653 (ATCC), siguiendo protocolos establecidos. En resumen, las células de mieloma se lavan varias veces en medio y se fusionan con esplenocitos de ratón a una relación de aproximadamente tres esplenocitos a una célula de mieloma. El agente de fusión puede ser cualquier agente adecuado usado en la técnica, por ejemplo, polietilenglicol (PEG). Se siembra la fusión en placas que contienen medio que permite el crecimiento selectivo de las células fusionadas. Las células fusionadas entonces se dejan crecer durante aproximadamente ocho días. Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes se recogen y se añaden a una placa que se recubrió en primer lugar con Ig de cabra antirratón. Después de los lavados, se añade un marcador, tal como un polipéptido CTLA-4 o PD-1 marcado, a cada pocillo, seguido de incubación. Posteriormente se detectan los pocillos positivos. Los clones positivos pueden hacerse crecer en cultivo a granel y los sobrenadantes se purifican posteriormente sobre una columna de proteína A (Pharmacia).

Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden producirse usando técnicas alternativas, tales como las descritas por Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990), que se incorpora en este documento por referencia. Asimismo, pueden construirse compañeros de unión usando técnicas de ADN recombinante para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un anticuerpo de unión específica. Dicha técnica se describe en Larrick et al., Biotechnology, 7: 394 (1989).

También se incluyen fragmentos de unión a antígeno de dichos anticuerpos, que pueden producirse por técnicas convencionales, por la presente invención. Ejemplos de dichos fragmentos incluyen, aunque sin limitación, fragmentos Fab y F(ab')2. También se proporcionan fragmentos de anticuerpo y derivados producidos por técnicas de genomanipulación.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Dichos anticuerpos humanizados pueden prepararse por técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de inmunogenia reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o solamente el sitio de unión a antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Como alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y manipulados adicionalmente incluyen los descritos en Riechmann et al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et al. (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7: 934, 1989) y Winter y Harris (TIPS 14: 139, mayo, 1993). Pueden encontrarse procedimientos para generar anticuerpos de forma transgénica en el documento GB 2.272.440, patentes de Estados Unidos n.° 5.569.825 y 5.545.806.

Pueden usarse anticuerpos producidos por métodos de genomanipulación, tales como anticuerpos quiméricos y humanizados, que comprenden tanto partes humanas como partes no humanas, que pueden prepararse usando técnicas convencionales de ADN recombinante. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse por genomanipulación usando técnicas convencionales de ADN conocidas en la técnica, por ejemplo, usando métodos descritos en Robinson et al. publicación internacional n.° WO 87/02671; Akira, et al. solicitud de patente europea 0184187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 0171496; Morrison et al. solicitud de patente europea 0173494; Neuberger et al. publicación internacional PCT n.° WO 86/01533; Cabilly et al. patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; Cabilly et al. solicitud de patente europea 0125023; Better et al., Science 240: 1041 1043, 1988; Liu et al., PNAS 84: 34393443, 1987; Liu et al., J. Immunol. 139: 3521 3526, 1987; Sun et al. PNAS 84: 214218, 1987; Nishimura et al., Canc. Res. 47: 9991005, 1987; Wood et al., Nature 314: 446449, 1985; y Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553 1559, 1988); Morrison, S. L., Science 229: 1202 1207, 1985; Oi et al., BioTechniques 4: 214, 1986; Winter patente de Estados Unidos n.° 5.225.539; Jones et al., Nature 321: 552525, 1986; Verhoeyan et al., Science 239: 1534, 1988; y Beidler et al., J. Immunol. 141: 40534060, 1988.

En relación con anticuerpos sintéticos y semisintéticos, dichos términos pretenden cubrir, aunque sin limitación, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos con isotipo cambiado, anticuerpos humanizados (por ejemplo, de ratón-humano, humano-de ratón), híbridos, anticuerpos que tienen múltiples especificidades y moléculas parecidas a anticuerpo completamente sintéticas.

Para aplicaciones terapéuticas, a menudo se prefieren anticuerpos monoclonales "humanos" que tienen regiones constantes y variables humanas para minimizar la respuesta inmunitaria de un paciente contra el anticuerpo. Dichos anticuerpos pueden generarse inmunizando animales transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana. Véase Jakobovits et al. Ann NY Acad Sci 764: 525-535 (1995).

También pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos contra polipéptidos CTLA-4 o PD-1 construyendo una colección combinatoria de inmunoglobulinas, tal como una colección de Fab de presentación en fagos o una colección de scFv de presentación en fagos, usando ADNc de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina preparados a partir de ARNm derivado de linfocitos de un sujeto. Véase, por ejemplo, McCafferty et al. publicación PCT WO 92/01047; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581 597; y Griffths et al. (1993) EMBO J 12: 725734. Además, puede generarse una colección combinatoria de regiones variables de anticuerpo mutando un anticuerpo humano conocido. Por ejemplo, puede mutarse una región variable de un anticuerpo humano conocido por unirse a CTLA-4 o PD-1, usando, por ejemplo, oligonucleótidos mutagenizados alterados aleatoriamente, para generar una colección de regiones variables mutadas que entonces pueden cribarse por la unión a CTLA-4 o PD-1. Pueden encontrarse métodos de inducción de mutagénesis aleatoria dentro de las regiones CDR de las cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulina, métodos de cruce de cadenas pesadas y ligeras aleatorizadas para formar emparejamientos y métodos de cribado en, por ejemplo, Barbas et al. publicación PCT WO 96/07754; Barbas et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 44574461.

Una colección de inmunoglobulina puede expresarse mediante una población de disposiciones de presentación, preferiblemente derivadas de fago filamentoso, para formar una colección de presentación de anticuerpos. Pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles para su uso en la generación de colecciones de presentación de anticuerpos en, por ejemplo, Ladner et al. patente de Estados Unidos n.° 5.223.409; Kang et al. publicación PCT WO 92/18619; Dower et al. publicación PCT WO 91/17271; Winter et al. publicación PCT WO 92/20791; Markland et al. publicación PCT WO 92/15679; Breitling et al. publicación PCT WO 93/01288; McCafferty et al. publicación PCT WO 92/01047; Garrard et al. publicación PCT WO 92/09690; Ladner et al. publicación PCT WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370 1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81 85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275 1281; Griffths et al. (1993) supra; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889 896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624 628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576 3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373 1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 41334137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88: 79787982. Una vez presentada en la superficie de una disposición de presentación (por ejemplo, fago filamentoso), la colección de anticuerpos se criba para identificar y aislar las disposiciones que expresan un anticuerpo que se une a un polipéptido CTLA-4 o PD-1. En una realización preferida, el cribado principal de la colección implica separación con un polipéptido CTLA-4 o PD-1 inmovilizado y se seleccionan disposiciones de presentación que expresan anticuerpos que se unen a polipéptido CTLA-4 o PD-1 inmovilizado.

Además de los antagonistas y agonistas de CTLA-4 o PD-1 ya descritos en este documento, se contempla que los antagonistas y agonistas pueden incluir los conocidos en la técnica. Por ejemplo, Ipilimumab® y tremelimumab, son anticuerpos conocidos contra CTLA-4. Además, lambrolizumab, Amplimmune-224 (AMP-224), Amplimmune-514 (AMP-514), Nivolumab, MK-3475 y B7H1 son anticuerpos conocidos contra PD-1.

La presente divulgación también contempla que pueden materializarse antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario en micromoléculas, péptidos, proteínas receptoras solubles y otros tipos de proteínas de fusión.

Politerapia con un poxvirus que expresa un antígeno tumoral y un antagonista del punto de control inmunitario

En una realización, pacientes con un cáncer mediado por células que sobreexpresan el antígeno asociado a tumor HER-2 (por ejemplo, cáncer de mama) pueden tratarse mediante una combinación de: un ortopoxvirus (por ejemplo, virus de la variolovacuna, Wyeth, ACAM1000, ACAM2000, MVA o MVA-BN) o un avipoxvirus (por ejemplo, virus de la viruela aviar, POXVAC-TC), que codifica los antígenos asociados a tumor, un antígeno HER-2, con uno o más anticuerpos o antagonistas del punto de control inmunitario de acuerdo con la invención. En una realización preferida, el MVA es MVA-BN. En una realización particularmente preferida, el MVA codifica un polipéptido que comprende SEQ ID NO:2.

En una realización, pacientes con un cáncer de próstata pueden tratarse mediante la combinación de un ortopoxvirus, por ejemplo, un virus de la variolovacuna (tal como, aunque sin limitación, virus de la variolovacuna, Wyeth, ACAM1000, ACAM2000, MVA o MVA-BN) o un avipoxvirus (por ejemplo, virus de la viruela aviar, por ejemplo, POXVAC-TC), que codifica un antígeno PSA, con uno o más anticuerpos o antagonistas de acuerdo con la invención. En una realización particularmente preferida, el virus de la variolovacuna forma parte de PROSTVAC®.

En una realización, pacientes con un cáncer mediado por células que sobreexpresan el antígeno asociado a tumor CEA y/o MUC-1 (por ejemplo, cáncer de mama, colorrectal, pulmonar y de ovario) pueden tratarse mediante la combinación de un ortopoxvirus, por ejemplo, un virus de la variolovacuna (por ejemplo, virus de la variolovacuna, Wyeth, ACAM1000, ACAM2000, Mv A o MVA-Bn Wyeth o MVA) o un avipoxvirus (por ejemplo, virus de la viruela aviar, por ejemplo, POXVAC-TC), que codifica un antígeno CEA y/o MUC-1, con uno o más anticuerpos o antagonistas de acuerdo con la invención.

El poxvirus recombinante puede administrarse de forma sistémica o local, es decir, por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica, por escarificación o cualquier otra vía de administración conocida por un facultativo experto en la materia. Preferiblemente, la administración es mediante escarificación. Más preferiblemente, la administración es mediante inyección subcutánea. En una realización, se administran 10^5-10¹⁰ de DIHC⁵⁰ del poxvirus recombinante al paciente. Preferiblemente, se administran 10^{7 -}10¹⁰ de DIHC⁵⁰ del poxvirus recombinante al paciente. Más preferiblemente, se administran 10^8-10¹⁰ de DIHC⁵⁰ del poxvirus recombinante al paciente. Más preferiblemente, se administran 10^8-10⁹ de DIHC⁵⁰ del poxvirus recombinante al paciente.

El cáncer preferiblemente incluye, aunque sin limitación, un cáncer de próstata, cáncer de mama, un cáncer pulmonar, un cáncer gástrico, un cáncer pancreático, un cáncer de vejiga o un cáncer de ovario. En una realización preferida, el cáncer es un cáncer de mama metastásico.

El paciente con cáncer puede ser cualquier mamífero, incluyendo un ratón o rata. Preferiblemente, el paciente con cáncer es un primate, mucho más preferiblemente, un ser humano.

En una o más realizaciones, el poxvirus recombinante es para administración el mismo día o en 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 días desde la administración del agonista y/o antagonista del punto de control inmunitario. El poxvirus recombinante puede administrarse antes o después del agonista y/o antagonista del punto de control inmunitario.

En una realización, se administra uno o más anticuerpos, agonistas o antagonistas del punto de control inmunitario, de acuerdo con la invención y el poxvirus que codifica un polipéptido que comprende un antígeno tumoral al mismo tiempo. El tratamiento combinado es superior a cualquier tratamiento en solitario.

En una o más realizaciones preferidas, el poxvirus recombinante es para su administración antes de la administración de los antagonistas y agonistas del punto de control inmunitario.

Politerapia usando pautas de sensibilización-refuerzo homólogas/heterólogas

Es posible inducir una respuesta inmunitaria con una sola administración del poxvirus recombinante como se define anteriormente. El poxvirus de acuerdo con la presente invención también puede usarse como parte de una pauta de sensibilización-refuerzo homóloga. En la sensibilización-refuerzo homóloga, se administra una primera vacunación sensibilizante seguida de una o más vacunaciones de refuerzo posteriores. Las vacunaciones de refuerzo se configuran para reforzar la respuesta inmunitaria generada en la primera vacunación mediante la administración del mismo poxvirus recombinante que se usó en la primera vacunación.

El poxvirus recombinante de acuerdo con la presente invención también puede usarse en pautas de sensibilizaciónrefuerzo heterólogas en que una o más de las vacunaciones iniciales de sensibilización se hacen con un poxvirus como se define en este documento y en que una o más vacunaciones de refuerzo posteriores se hacen con una vacuna diferente, por ejemplo, otra vacuna vírica, una vacuna proteínica o una vacuna de ácido nucleico.

En una realización, la una o más vacunaciones de refuerzo posteriores de una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga se seleccionan de poxvirus de un género diferente al de las vacunaciones de sensibilización iniciales. En un ejemplo no limitante, cuando la primera vacuna o inicial de poxvirus incluye el virus de la variolovacuna, la segunda vacuna y posteriores de poxvirus se seleccionan de los poxvirus de un género diferente tal como suipoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus o un ortopoxvirus inmunogénicamente diferente del virus de la variolovacuna.

En una realización ejemplar, puede emplearse una pauta de sensibilización-refuerzo homóloga en la que se administra un poxvirus tal como un MVA-BN que expresa uno o más antígenos asociados a tumor (TAA), tal como, aunque sin limitación, HER2, en una primera dosificación en combinación con uno o más antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario. Puede administrarse una o más administraciones posteriores de MVA-BN que expresa uno o más TAA, tal como, aunque sin limitación, HER2, en combinación con uno o más antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario para reforzar la respuesta inmunitaria proporcionada en la primera administración. Preferiblemente, el uno o más TAA en el segundo y posteriores MVA-BN son TAA iguales o similares a los de la primera administración.

En otra realización ejemplar, puede emplearse una sensibilización-refuerzo heteróloga en la que un poxvirus, tal como el virus de la variolovacuna, que expresa uno o más TAA, se administra en una primera dosis en combinación con uno o más antagonistas del punto de control inmunitario. La primera dosis va seguida de una o más administraciones de diferente poxvirus, tal como virus de la viruela aviar, que expresa uno o más TAA. Preferiblemente, el uno o más TAA en el virus de la viruela aviar son TAA iguales o similares a los incluidos en el virus de la variolovacuna de la primera administración. Puede encontrarse descripción adicional de pautas de sensibilización-refuerzo heterólogas ejemplares adicionales en las patentes de Estados Unidos 6.165.460; 7.598.225; y 7.247.615.

En una realización preferida, el uno o más TAA en la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga incluyen antígeno específico prostático (PSA). En una realización más preferida, el antígeno PSA puede incluir aquellos antígenos PSA encontrados en las patentes de Estados Unidos 7.247.615 y 7.598.225. En un ejemplo no limitante, la sensibilizaciónrefuerzo heteróloga que incluye PSA es PROSTVAC®.

En otra realización preferida más, el uno o más TAA en la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga incluyen un antígeno asociado a superficie celular, mucina 1 (MUC1) y un antígeno carcinoembrionario (CEA). En una realización más preferida, los antígenos MUC1 y CEA pueden incluir los encontrados en las patentes de Estados Unidos 7.118.738; 7.723.096; y solicitud PCT n.° PCT/US2013/020058. En un ejemplo no limitante, la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga que incluye un antígeno MUC-1 y CEA es CV301.

En otra realización ejemplar más, puede emplearse una sensibilización-refuerzo heteróloga en la que se administra un poxvirus, tal como MVA o MVA-BN, que expresa uno o más TAA en una primera dosis en combinación con uno o más antagonistas del punto de control inmunitario. La primera dosis va seguida de una o más administraciones de diferente poxvirus, tal como virus de la viruela aviar, que expresa uno o más TAA. Preferiblemente, el uno o más TAA en el virus de la viruela aviar son TAA iguales o similares a los incluidos en el virus MVA o MVA-BN de la primera administración.

La presente divulgación contempla que las pautas de sensibilización-refuerzo homólogas y heterólogas descritas en este documento pueden incorporar una o más de las realizaciones de administración de dosificaciones de la presente invención. A modo de ejemplo, en una de las pautas de sensibilización-refuerzo homólogas y heterólogas o ambas puede administrarse una cantidad o dosificación subterapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario, como se describe en este documento.

Además, a modo de ejemplo, en una de las pautas de sensibilización-refuerzo homólogas y heterólogas o ambas, puede administrarse un antagonista del punto de control inmunitario después de un poxvirus recombinante que codifica un TAA, como se describe en este documento.

También a modo de ejemplo, en una de las pautas de sensibilización-refuerzo homólogas y heterólogas o ambas, puede aumentarse una segunda dosificación o administración de un antagonista del punto de control inmunitario en comparación con una primera dosificación o administración.

En determinadas realizaciones, la una o más vacunaciones de refuerzo se administran a intervalos que comprenden días, semanas o meses después de la administración de la vacunación de sensibilización inicial. En determinadas realizaciones, la una o más vacunaciones de refuerzo se administran a intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días después de la administración de la vacunación de sensibilización inicial. En determinadas realizaciones, la una o más vacunaciones de refuerzo se administran a intervalos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más semanas después de la administración de la vacunación de sensibilización inicial. En determinadas realizaciones, la una o más vacunaciones de refuerzo se administran a intervalos de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más meses después de la administración de la vacunación de sensibilización inicial. En determinadas realizaciones, la una o más vacunaciones de refuerzo se administran en cualquier combinación de intervalos después de la administración de la vacunación de sensibilización inicial) (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más semanas, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más meses).

Administraciones de dosificación de antagonistas del punto de control inmunitario en combinación con un tratamiento con poxvirus recombinante

Como se describe y se ilustra en este documento, el tratamiento de un cáncer usando un vector poxvírico recombinante en combinación con uno o más antagonistas del punto de control inmunitario puede ser eficaz a una diversidad de dosificaciones. De forma significativa, y en contraste con lo que se entendía en la técnica, la presente divulgación demuestras que, en combinación con un vector poxvírico recombinante que codifica un antígeno asociado a tumor, los antagonistas del punto de control inmunitario pueden ser eficaces en el tratamiento del cáncer incluso cuando los antagonistas del punto de control inmunitario se administran a dosificaciones menores. Estos tratamientos con dosificación menor pueden reducir y/o eliminar muchos de los efectos secundarios adversos que se han observado con los tratamientos actuales contra el cáncer usando antagonistas del punto de control inmunitario.

En diversos aspectos de la presente divulgación, la dosificación del antagonista administrado a un paciente como se describe en este documento puede ser de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificación administrada a un paciente es entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del paciente, y mucho más preferiblemente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente. En vista de los efectos adversos del tratamiento de seres humanos con dosificaciones mayores de antagonistas del punto de control inmunitario a seres humanos, una dosificación mucho más preferida de antagonista es de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal de un paciente.

En vista de la eficacia de los antagonistas del punto de control inmunitario a dosificaciones menores cuando se combinan con un tratamiento con poxvirus recombinante, en realizaciones alternativas, la dosificación del antagonista es de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg del peso corporal del paciente, o de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg del peso corporal del paciente. En realizaciones adicionales, la dosificación del antagonista es de aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 2,5 mg/kg o aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente.

En aspectos adicionales de la presente divulgación, la dosificación de antagonista administrado a un paciente como se describe en este documento puede ser de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosificación administrada a un paciente es entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de 3 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente, y mucho más preferiblemente de 1 mg/kg a 3 mg/kg del peso corporal del paciente. En vista de los efectos adversos del tratamiento de seres humanos con dosificaciones mayores de antagonista del punto de control inmunitario a seres humanos, una dosificación mucho más preferida de antagonista es de 1 mg/kg a 3 mg/kg del peso corporal de un paciente.

En vista de la eficacia de los antagonistas del punto de control inmunitario a dosificaciones menores cuando se combinan con un tratamiento con poxvirus recombinante, en realizaciones alternativas, la dosificación del antagonista es de 0,1 mg/kg a 3 mg/kg del peso corporal del paciente, de 0,1 mg/kg a 2 mg/kg del peso corporal del paciente, o de 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg del peso corporal del paciente. En realizaciones adicionales, la dosificación del antagonista es 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg o 3 mg/kg del peso corporal del paciente.

Las cantidades de ingrediente activo necesarias para un tratamiento eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Por tanto, las dosificaciones de tratamiento deben valorarse para optimizar la seguridad, tolerabilidad y eficacia. Típicamente, las dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar directrices útiles sobre las cantidades útiles para administración in situ de los ingredientes activos. El ensayo en animales de dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares proporcionará indicación predictiva adicional de dosificación en seres humanos. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 7.a edición (1985), MacMillan Publishing Company, Nueva York, y Remington's Pharmaceutical Sciences 18.a edición, (1990) Mack Publishing Co, Easton Pa. Se analizan en los mismos métodos para administración, incluyendo administración oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica, nasal, iontoforética y similares.

Las composiciones de la invención pueden administrarse en una diversidad de formas farmacéuticas unitarias dependiendo del método de administración. Por ejemplo, formas farmacéuticas unitarias adecuadas para administración oral incluyen formas farmacéuticas sólidas tales como polvo, comprimidos, píldoras, cápsulas y grageas, y formas farmacéuticas líquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. Los ingredientes activos también pueden administrarse por vía parenteral en formas farmacéuticas líquidas estériles. Las cápsulas de gelatina contienen el ingrediente activo y como ingredientes inactivos vehículos en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina sódica, talco, carbonato de magnesio y similares. Ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que pueden añadirse para proporcionar color, sabor, estabilidad, capacidad tamponante, dispersión deseable u otras características deseables conocidas son rojo de óxido de hierro, gel de sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Pueden usarse diluyentes similares para preparar comprimidos por compresión. Tanto los comprimidos como las cápsulas pueden fabricarse como productos de liberación mantenida para proporcionar liberación continua de medicación durante un periodo de horas. Los comprimidos por compresión pueden recubrirse con glúcidos o recubrirse con película para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger el comprimido de la atmósfera, o recubrirse con recubrimiento entérico para disgregación selectiva en el tubo gastrointestinal. Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral pueden contener colorantes y aromatizantes para aumentar la aceptación por parte del paciente.

La concentración de las composiciones de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente un 0,1 %, habitualmente a o al menos aproximadamente un 2 % hasta como mucho un 20 % a un 50 % o más en peso, y se seleccionará principalmente por los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.

Para composiciones sólidas, pueden usarse vehículos sólido atóxicos convencionales que incluyen, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Para administración oral, se forma una composición atóxica farmacéuticamente aceptable incorporando cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como los vehículos enumerados previamente, y en general un 10-95 % de ingrediente activo, es decir, una o más composiciones de la invención, y más preferiblemente a una concentración de un 25 %-75 %.

Para administración en aerosol, las composiciones de la invención se suministran preferiblemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y propulsor. Porcentajes preferidos de composiciones de la invención son un 0,01 %-20 % en peso, preferiblemente un 1-10 %. El tensioactivo de ser, por supuesto, atóxico, y preferiblemente soluble en el propulsor. Son representativos de dichos agentes los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Pueden emplearse ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir un 0,1 %-20 % en peso de la composición, preferiblemente un 0,25-5 %. El equilibrio de la composición es normalmente propulsor. También puede incluirse un vehículo, según se desee, como con, por ejemplo, lecitina para suministro intranasal.

Las construcciones de la invención adicionalmente pueden suministrarse en un sistema de tipo depósito, una forma encapsulada, o un implante por técnicas bien conocidas en la técnica. Asimismo, las construcciones pueden suministrarse mediante una bomba a un tejido de interés.

Cualquiera de las formulaciones anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, con la condición de que el agente activo en la formulación no se inactive mediante la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible.

En determinadas realizaciones, los poxvirus recombinantes de la presente invención pueden plasmarse en una o más composiciones farmacéuticas. Además de un poxvirus recombinante que codifica un TAA y uno o más antagonistas del punto de control inmunitario, las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más vehículos, aditivos, antibióticos, conservantes, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables y/o aprobados. Dichos aditivos incluyen, por ejemplo, aunque sin limitación, agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsionantes, y sustancias tamponantes del pH. Vehículos ejemplares típicamente son moléculas grandes que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos o similares.

Pautas posológicas de antagonistas del punto de control inmunitario

En realizaciones adicionales de la presente invención, las concentraciones de dosificación y pautas de dosificación de antagonista del punto de control inmunitario se configuran basándose en uno o más factores relacionados con el cáncer, tales como tamaño del tumor, volumen del tumor, estadio del cáncer de un paciente con cáncer o grupo de pacientes con cáncer (tal como cáncer pre- o posmetastásico). Además, una o más concentraciones de dosificación y pautas de dosificación de antagonista del punto de control inmunitario pueden configurarse controlando y revisando la eficacia mediante el uso de un biomarcador asociado o anticuerpo tal como, aunque sin limitación, un anticuerpo Forssman o sCD27. De acuerdo con este aspecto, las pautas de dosificación más eficaces pueden configurarse para pacientes humanos con cáncer o grupos de pacientes humanos con cáncer. Al menos en un aspecto, proporcionar pautas de dosificación más eficaces, como se describe en este documento, puede reducir los casos donde a un paciente o grupo de pacientes se le administra demasiado o demasiado poco de un antagonista del punto de control inmunitario en los tratamientos.

Como se define en este documento, las "pautas de dosificación" pueden definirse como el programa de dosis de un agente terapéutico por unidad de tiempo, incluyendo: el tiempo entre dosis o el momento en el que tienen que administrarse las dosis, y la cantidad de medicina o agente terapéutico a administrar en cada momento específico.

Al menos en un aspecto, los métodos divulgados en este documento, por ejemplo, pautas de dosificación particulares, se configuran para maximizar el beneficio terapéutico de las combinaciones de la presente divulgación mientras se minimizan los efectos secundarios adversos. En una realización, un antagonista del punto de control inmunitario se administra al paciente en el mismo día que una administración del poxvirus recombinante que codifica uno o más TAA. En realizaciones adicionales, como se describe en los párrafos que siguen, un antagonista del punto de control inmunitario se administra al paciente después de una administración de un poxvirus recombinante que codifica uno o más TAA.

Administrar un antagonista del punto de control inmunitario después de un tratamiento con poxvirus recombinante aumenta la eficacia de tratamientos contra el cáncer

Como se muestra en las figuras 14-17 y como se describe en los ejemplos 32-35, a los sujetos se les administró un poxvirus recombinante que incluye un TAA después de lo que se midieron los niveles de expresión de moléculas del punto de control inmunitario tales como TIM-3, LAG-3, ICOS y PD-1 a intervalos regulares. En respuesta al tratamiento, hubo un periodo inicial de muy poco aumento en la expresión del punto de control inmunitario. Sin embargo, después de aproximadamente 1 -2 días, los linfocitos T aumentaron la expresión de moléculas del punto de control inmunitario. Desde aproximadamente el día 3 hasta aproximadamente el día 12, aumentó drásticamente la expresión del punto de control inmunitario. La expresión aumentada aún se observaba hasta aproximadamente el día 18. Incluso más importante, este aumento en la expresión del punto de control inmunitario fue más profundo en linfocitos T CD8 en comparación con linfocitos T CD4. (Véanse las figuras 14-17).

En vista de los resultados de las figuras 14-17 y los ejemplos 32-35, el periodo de tiempo más eficaz para la administración de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario se produce después del tratamiento con un poxvirus recombinante. Por ejemplo, como se muestra en la figura 14, después de tratamiento con MVA-BN-HER2 los niveles de expresión de la molécula del punto de control inmunitario TIM-3 aumentaron de aproximadamente los días 1-3 a aproximadamente el 18, produciéndose los aumentos más significativos de aproximadamente el día 3 a aproximadamente el día 14. De acuerdo con esto, un periodo de tiempo más eficaz en el que administrar un antagonista de TIM-3 es después del tratamiento con un poxvirus recombinante durante esos periodos donde se produce expresión aumentada.

Como se muestra en las figuras 15-17, después de tratamiento con MVA-BN-HER-2, se observaron resultados de expresión aumentada similares con las moléculas del punto de control inmunitario ICOS, PD-1 y LAG-3. De acuerdo con estos resultados de expresión, para conseguir más eficacia terapéutica, cada antagonista (por ejemplo, TIM-3, PD-1, PDL-1 y LAG-3) o agonista (por ejemplo, ICOS) del punto de control inmunitario se administra a un paciente con cáncer después de tratarse con un poxvirus recombinante.

Al menos en un aspecto, se produce mayor eficacia terapéutica durante estos periodos de expresión aumentada de la molécula del punto de control inmunitario al menos en parte debido a que la expresión aumentada proporciona más sustratos a los que puede unirse el antagonista o agonista del punto de control inmunitario administrado, proporcionando de ese modo mayor bloqueo o activación de las moléculas del punto de control inmunitario.

En otro aspecto, los resultados mostrados en la figura 14-17 indican que administrar un antagonista o agonista del punto de control inmunitario después de un tratamiento con poxvirus recombinante es importante para potenciar la eficacia. Esta importancia se demuestra claramente por los periodos de expresión aumentada de la molécula del punto de control inmunitario después del tratamiento con un poxvirus recombinante.

En vista de los contenidos de la presente divulgación, en una realización, hay un método para tratar el cáncer, que comprende administrar al paciente una dosificación de una vacuna terapéutica contra el cáncer tal como, aunque sin limitación, un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus recombinante al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) administrar al paciente una dosificación de al menos un antagonista del punto de control inmunitario; en el que la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra después de la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer.

Se contempla que, en una realización, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra después de la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer en el mismo día. Adicionalmente se contempla que la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 días, de aproximadamente 2 a aproximadamente 17 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 16 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 días, de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 días, de aproximadamente 4 a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 4 a aproximadamente 13 días o de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer. En una realización más preferida, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer. En una realización más preferida, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer. Aun en una realización más preferida, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra 3 días o 7 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer.

Adicionalmente se contempla que la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra en el mismo día o de 1 a 18 días, de 2 a 17 días, de 3 a 16 días, de 3 a 15 días, de 3 a 14 días, de 3 a 12 días, de 4 a 15 días, de 4 a 14 días, de 4 a 13 días o de 4 a 12 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer. En una realización más preferida, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra de 3 a 15 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer. En una realización más preferida, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra de 3 a 7 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer. Aun en una realización más preferida, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra 3 días o 7 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer.

En realizaciones adicionales, la presente divulgación incluye administrar al paciente una dosificación posterior (con respecto a la dosificación del párrafo previo) o una segunda dosificación de una vacuna terapéutica contra el cáncer, tal como, aunque sin limitación, un poxvirus recombinante que comprende al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) administrar al paciente una dosificación posterior (con respecto a la dosificación del párrafo previo) o una segunda dosificación de al menos un antagonista del punto de control inmunitario; en el que la dosificación posterior del al menos un antagonista del punto de control inmunitario se administra después de la dosificación posterior de la vacuna terapéutica contra el cáncer. Se contempla que la dosificación posterior del antagonista del punto de control inmunitario puede administrarse a intervalos similares después de la dosificación posterior de la vacuna terapéutica contra el cáncer (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 18 días , de aproximadamente 2 a aproximadamente 17 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 16 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 días, de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 días, de aproximadamente 4 a aproximadamente 14 días, de aproximadamente 4 a aproximadamente 13 días o de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer).

La eficacia de tratamiento potenciada resultante de administrar un antagonista del punto de control inmunitario después de administrar una vacuna terapéutica contra el cáncer, tal como un tratamiento poxvírico recombinante, se demuestra además por los ejemplos 26 a 31.

En una realización, la vacuna terapéutica contra el cáncer comprende un poxvirus recombinante que incluye al menos un TAA. En otra realización preferida, el poxvirus recombinante comprende un ortopoxvirus o avipoxvirus que incluye al menos un TAA. En otra realización preferida, el ortopoxvirus comprende el virus de la variolovacuna, MVA o MVA-BN. En otra realización, el avipoxvirus comprende un virus de la viruela aviar.

En otra realización, se contempla que un antagonista de CTLA-4 se administra en el mismo día de, o aproximadamente 1 -3 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer.

En otra realización más, se contempla que un antagonista de PD-1 se administra de aproximadamente 2 a 18 días después de administrar la dosificación de la vacuna terapéutica contra el cáncer.

Aumentar la cantidad terapéuticamente eficaz de una segunda administración de un antagonista del punto de control inmunitario aumenta la eficacia de los tratamientos contra el cáncer

Como se muestra en las figuras 14-17 y como se describe en los ejemplos 32-35, a los sujetos se les administró un poxvirus recombinante que incluye un TAA en el día 1 y día 15. Se midieron los niveles de expresión de moléculas del punto de control inmunitario tales como TIM-3, LAG-3, ICOS y PD-1 a intervalos regulares. En respuesta al tratamiento del día 1, hubo un periodo inicial de muy poco aumento en la expresión del punto de control inmunitario. Sin embargo, aproximadamente 1-2 días después del tratamiento del día 1, hubo un aumento en la expresión en linfocitos T de moléculas del punto de control inmunitario. Desde aproximadamente el día 3 hasta aproximadamente el día 12, aumentó drásticamente la expresión del punto de control inmunitario. La expresión aumentada aún se observaba hasta aproximadamente el día 18.

De forma más notable, después de un segundo tratamiento o tratamiento posterior de poxvirus recombinante en el día 15, se produjo un aumento incluso mayor en la expresión de moléculas del punto de control inmunitario por los linfocitos T. Incluso más importante, este aumento en la expresión del punto de control inmunitario fue más profundo en linfocitos T CD8 en comparación con linfocitos T CD4. (Véanse las figuras 14-17). Por ejemplo, como se muestra en la figura 12, después del tratamiento con MVA-BN-HER-2 en el día 15, hubo un ligero aumento en la expresión, tras lo que en el día 18 los niveles de expresión de TIM-3 aumentaron significativamente. De acuerdo con estos resultados de expresión de TIM-3, aumentar la segunda dosificación o dosificación posterior de un antagonista de TIM-3 en comparación con la primera dosificación consigue una eficacia de tratamiento incluso mayor.

Como se muestra en las figuras 14-17, después del segundo tratamiento con poxvirus recombinante con MVA-BN-HER-2 en el día 15, se produjo expresión aumentada similar de las moléculas del punto de control inmunitario ICOS, PD-1 y LAG-3. Además, la expresión aumentada fue significativamente mayor en comparación con después del primer tratamiento con MVA-BN-HER2. De acuerdo con estos resultados de expresión, se administra una dosificación aumentada de antagonista (por ejemplo, TIM-3, PD-1, PDL-1, LAG-3) o agonista (por ejemplo, ICOS) del punto de control inmunitario a un paciente con cáncer durante un punto temporal después de un segundo poxvirus recombinante o posterior.

Al menos en un aspecto, se consigue mayor eficacia terapéutica aumentando la dosificación o cantidad del antagonista del punto de control inmunitario en un segundo tratamiento o posterior en comparación con la primera dosificación de antagonista del punto de control inmunitario. Esto se logra al menos en parte debido a que la expresión aumentada después del segundo tratamiento proporciona más sustratos a los que puede unirse el antagonista o agonista del punto de control inmunitario administrado, proporcionando de ese modo mayor bloqueo o activación de las moléculas del punto de control inmunitario.

En otro aspecto, los resultados mostrados en la figura 14-17 indican que aumentar una segunda dosificación o dosificación posterior de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario en comparación con una primera dosificación es importante para conseguir eficacia aumentada del tratamiento con antagonista del punto de control inmunitario cuando se administra en combinación con un tratamiento con poxvirus recombinante. Esta importancia se sustenta por los periodos de expresión aumentada de la molécula del punto de control inmunitario después de un segundo tratamiento con un poxvirus recombinante descrito e ilustrado en este documento.

En un aspecto adicional, aumentar la dosificación de una segunda administración o posterior de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario como se describe en este documento potencia enormemente la eficacia del tratamiento en vista de los datos recientes que describen la ocupación del receptor (RO) de linfocitos T del antagonista del punto de control inmunitario. Después de una primera dosificación de un antagonista del punto de control inmunitario, se midió la ocupación del receptor (RO) del anticuerpo anti-PD1 sobre la superficie de linfocitos T por FACS (CD45+, selección de CD3) (datos no mostrados). Los datos indican que, a diversas dosificaciones del antagonista del punto de control inmunitario PD-1 (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,4 mg/kg, 1,4 mg/kg y 5 mg/kg) hubo un alto porcentaje de RO de PD-1 en linfocitos T en el torrente sanguíneo (RO de 0,1 mg/kg = 65 %, RO de 0,4 mg/kg = 84 %, RO de 1,4 mg/kg = 96 % y RO de 5 mg/kg = 89 %). Cuando se compara con los porcentajes de RO en la sangre, la RO de los linfocitos T encontrados en tumores fue menor (RO de 0,1 mg/kg = 9 %, RO de 0,4 mg/kg = 41 %, RO de 1,4 mg/kg = 58 % y RO de 5 mg/kg = 65 %).

Durante una dosificación inicial de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario en combinación con un poxvirus recombinante, se cree que un porcentaje mayor de linfocitos T (linfocitos T CD8) específicos de tumor están típicamente presentes en las áreas periféricas tales como la sangre y los ganglios linfáticos. En vista de la RO aumentada en el antagonista del punto de control inmunitario en linfocitos T en la sangre, una primera administración de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario es más eficaz a dosificaciones menores. Para una eficacia aumentada en una segunda dosificación o dosificación posterior de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario en combinación con un poxvirus recombinante, se administra una dosificación aumentada en comparación con la primera dosificación en vista de la menor RO en linfocitos T en tumores.

En vista de los contenidos de la presente divulgación en realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona un método para tratar a un paciente humano con cáncer usando una vacuna terapéutica contra el cáncer en combinación con un antagonista del punto de control inmunitario, comprendiendo el método (a) proporcionar al paciente una primera administración de una vacuna terapéutica contra el cáncer, tal como un poxvirus recombinante, en combinación con una dosificación de al menos un antagonista del punto de control inmunitario; y (b) proporcionar una segunda administración de una vacuna terapéutica contra el cáncer en combinación con una dosificación de al menos un antagonista del punto de control inmunitario, en el que la dosificación del al menos un antagonista o agonista del punto de control inmunitario de la segunda administración está aumentada en comparación con la dosificación del al menos un antagonista o agonista del punto de control inmunitario de la primera administración.

En diversas realizaciones, la dosificación (o cantidad) de la segunda administración del antagonista o agonista del punto de control inmunitario está aumentada en un factor de: de aproximadamente 2 a aproximadamente 100, de aproximadamente 3 a aproximadamente 100, de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100, de aproximadamente 5 a aproximadamente 90, de aproximadamente 10 a aproximadamente 80, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70, de aproximadamente 10 a aproximadamente 60, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 en comparación con la dosificación de la primera administración. En realizaciones preferidas, la dosificación de la segunda administración está aumentada en un factor de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 en comparación con la dosificación de la primera administración. En otra realización preferida, la dosificación de la segunda administración está aumentada en un factor de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 en comparación con la dosificación de la primera administración. Aun en otra realización más preferida, la dosificación de la segunda administración está aumentada en un factor de: aproximadamente 3, aproximadamente 10, aproximadamente 30 o aproximadamente 100.

En diversas realizaciones adicionales, la dosificación del al menos un antagonista del punto de control inmunitario de la segunda administración está aumentada en un factor de: de 2 a 100, de 3 a 100, de 5 a 100, de 10 a 100, de 5 a 90, de 10 a 80, de 10 a 70, de 10 a 60, de 10 a 50 en comparación con la dosificación de la primera administración. En realizaciones preferidas, la dosificación de la segunda administración está aumentada en un factor de 10 a 100 en comparación con la dosificación de la primera administración. En otra realización más preferida, la dosificación de la segunda administración está aumentada en un factor de 10 a 50 en comparación con la dosificación de la primera administración. Aun en otra realización más preferida, la dosificación de la segunda administración está aumentada en un factor de 3, 10, 30 o 100.

Se contempla que, en algunas realizaciones ejemplares, una primera administración de un antagonista del punto de control inmunitario con una vacuna terapéutica contra el cáncer, tal como, aunque sin limitación, un poxvirus recombinante, incluye una dosificación subterapéutica o subterapéuticamente eficaz, tras lo que una segunda administración o posterior de un antagonista del punto de control inmunitario con una vacuna terapéutica contra el cáncer, tal como, aunque sin limitación, un poxvirus recombinante, incluye una dosificación aumentada como se expone en las pautas de dosificación descritas en este documento. En un ejemplo no limitante, una primera administración de un antagonista del punto de control inmunitario incluye una dosificación de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg. Esta primera administración va seguida de una o más administraciones posteriores con una dosificación aumentada de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg.

En una realización preferida, la vacuna terapéutica contra el cáncer comprende un poxvirus recombinante que incluye al menos un TAA. En otra realización preferida, el poxvirus recombinante comprende un ortopoxvirus o avipoxvirus que incluye al menos un TAA. En otra realización preferida, el ortopoxvirus comprende el virus de la variolovacuna, MVA o MVA-BN. En otra realización, el avipoxvirus comprende un virus de la viruela aviar. La eficacia de tratamiento potenciada resultante de administrar una segunda dosificación o dosificación posterior aumentada de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario en comparación con una primera dosificación, se demuestra adicionalmente mediante los ejemplos 26 a 31.

Una vacuna terapéutica contra el cáncer es una vacuna que presenta una o más propiedades inmunológicas exclusivas, que estimula el propio sistema inmunitario del paciente o grupo de pacientes para abordar específicamente un tumor y/o células tumorales. Estas propiedades inmunológicas exclusivas típicamente son antígenos que están asociados con un tumor o célula tumoral. En al menos un aspecto, las vacunas terapéuticas contra el cáncer funcionan retardando o deteniendo el crecimiento de células cancerosas; provocando reducción del volumen tumoral; evitando que el cáncer vuelva; o eliminando las células cancerosas que no se han destruido mediante otras formas de tratamiento.

En una realización preferida, la vacuna terapéutica contra el cáncer se basa en virus. Algunos ejemplos no limitantes de virus útiles como vacunas terapéuticas contra el cáncer incluyen: poxvirus, adenovirus, alfavirus, virus del sarampión, virus del herpes simple (HSV), parvovirus, reovirus y virus de la estomatitis vesicular (VSV). En una realización más preferida, una vacuna terapéutica contra el cáncer es un producto terapéutico basado en poxvirus.

En la tabla 1 se muestran algunos ejemplos no limitantes de vacunas terapéuticas contra el cáncer basadas en virus actualmente en desarrollo.

Tabla 1

En otra realización, una vacuna terapéutica contra el cáncer puede estar basada en levadura. Véase, por ejemplo, Cancer Immunol Immunother. 2014 mar; 63(3): 225-34. En un ejemplo no limitante, una vacuna terapéutica contra el cáncer basada en levadura incluye una vacuna de levadura recombinante-CEA (GI-6207) que actualmente está en ensayos clínicos en fase II. Véase, J Clin Oncol 31,2013 (supl.; res. TPS3127).

Aun en otra realización, una vacuna terapéutica contra el cáncer puede estar basada en bacteria. En un ejemplo no limitante, la vacuna contra el cáncer basada en bacteria incluye una vacuna de Coley. Véase, Clin Cancer Res. 2012 oct 1; 18 (19): 5449-59.

Administrar un antagonista del punto de control inmunitario después de dosificaciones de refuerzo en sensibilización-refuerzo heteróloga aumenta la eficacia de tratamientos contra el cáncer

PROSTVAC® comprende una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga que incluye una sola administración de sensibilización con PROSTVAC-V (virus de la variolovacuna que expresa PSA y TRICOM™) seguida de una o más dosis de refuerzo consecutivas de PROSTVAC-F (virus de la viruela aviar que expresa PSA y TRICOM™); también descrita en J Clin Oncol 2010, 28: 1099-1105, que se incorpora por referencia en este documento.

Como se muestra y se describe en las figuras 21-23 y los ejemplos 40-43, en un tratamiento contra el cáncer, una pauta de dosificación de PROSTVAC® heteróloga potencia enormemente la magnitud y calidad de la respuesta de linfocitos T específicos de PSA en comparación con dosificación homóloga con el mismo vector. Además, las figuras y los ejemplos demuestran que sensibilizar con PROSTVAC-V y reforzar con PROSTVAC-F proporciona el beneficio añadido de orientar la respuesta inmunitaria de CTL CD8 altamente funcional hacia PSA, el antígeno tumoral diana, y lejos del vector de la variolovacuna.

En al menos un aspecto, cuando se administra una o más dosificaciones de un poxvirus recombinante como parte de un tratamiento contra el cáncer, se consigue mayor eficacia terapéutica administrando uno o más antagonistas del punto de control inmunitario en combinación con una segunda dosificación o administración o posterior de poxvirus recombinante.

En un aspecto más particular, cuando se administra una o más dosificaciones de un poxvirus recombinante de la presente invención como parte de un tratamiento contra el cáncer como parte de una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga, se consigue mayor eficacia terapéutica administrando al menos un antagonista del punto de control en combinación con las segundas dosificaciones de refuerzo o posteriores de poxvirus recombinante que codifica al menos un TAA. Esta mayor eficacia terapéutica se logra, al menos en parte, porque durante y después de las segundas dosificaciones de refuerzo o posteriores de una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga, la respuesta inmunitaria de linfocitos T de un paciente está más centrada en el antígeno tumoral en comparación con el poxvirus recombinante.

Por consiguiente, al menos en un aspecto, una administración de un antagonista del punto de control inmunitario durante las dosificaciones de refuerzo funciona potenciando la respuesta inmunitaria de un paciente contra el antígeno tumoral, y aumentando de ese modo la respuesta inmunitaria de un paciente más específicamente contra el tumor.

En al menos otro aspecto, como parte de un tratamiento contra el cáncer que implica una pauta de sensibilizaciónrefuerzo heteróloga, administrar al menos un antagonista del punto de control inmunitario en combinación con las segundas dosificaciones de refuerzo o posteriores de poxvirus recombinante maximiza los beneficios terapéuticos del antagonista del punto de control inmunitario mientras se minimizan los efectos secundarios adversos que se han observado en los tratamientos del punto de control inmunitario.

En vista de los contenidos de la presente divulgación, en realizaciones adicionales, la presente invención incluye un método para tratar a un paciente humano con cáncer, comprendiendo el método administrar al paciente: (a) una primera vacuna terapéutica contra el cáncer, tal como, aunque sin limitación, un primer poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una segunda vacuna terapéutica contra el cáncer, tal como, aunque sin limitación, un segundo poxvirus recombinante, comprendiendo el segundo poxvirus recombinante al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); en el que el segundo poxvirus recombinante se administra en combinación con al menos un antagonista del punto de control inmunitario. En una realización adicional, el segundo poxvirus recombinante es diferente del primer poxvirus recombinante. En otras realizaciones, el segundo poxvirus recombinante es de un género diferente que el primer poxvirus recombinante.

En otra realización, el primer y segundo poxvirus recombinante son diferentes o son de un género diferente y se administran como una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga, comprendiendo la pauta de sensibilizaciónrefuerzo heteróloga: a) administrar el primer poxvirus recombinante como una primera dosis de sensibilización; y b) administrar el segundo poxvirus recombinante como una o más dosis de refuerzo en combinación con al menos un antagonista del punto de control inmunitario. En una realización preferida, la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga se selecciona de PROSTVAC®, CV301 o MVA-BN-CV301.

En otra realización más, se contempla que el primer poxvirus recombinante o el poxvirus recombinante de la dosis inicial o de sensibilización no incluye un antagonista del punto de control inmunitario.

Se contempla adicionalmente que el primer y segundo poxvirus recombinante puede ser cualquier poxvirus, tal como, aunque sin limitación, los descritos en la presente divulgación. Se contempla además que el al menos un antígeno asociado a tumor (TAA) puede ser cualquier TAA, tal como, aunque sin limitación, esos TAA descritos en la presente divulgación.

En una o más realizaciones, se administra al menos un antagonista del punto de control inmunitario el mismo día o en 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días desde la segunda o posteriores dosificaciones de un poxvirus recombinante que codifica al menos un TAA. En una realización preferida, se administra al menos un antagonista del punto de control inmunitario como parte de una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga, y se administra el mismo día o en 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7, días desde la segunda o posteriores dosificaciones de refuerzo de un poxvirus recombinante que codifica al menos un TAA.

En una o más realizaciones, se administra al menos un antagonista del punto de control inmunitario después de administrar la segunda o posteriores dosificaciones de un poxvirus recombinante que codifica al menos un TAA. En una realización preferida, se administra al menos un antagonista del punto de control inmunitario como parte de una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga, y se administra después de la segunda o posteriores dosificaciones de refuerzo de un poxvirus recombinante que codifica al menos un TAA. Se contempla que, después de la segunda o posteriores dosificaciones de refuerzo de un poxvirus recombinante, los intervalos de tiempo a los que se administra al menos un antagonista del punto de control inmunitario pueden incluir los intervalos de tiempo descritos en la presente divulgación.

Se contempla adicionalmente que, cuando se administra en combinación con una segunda o una o más dosificaciones de refuerzo posteriores de un poxvirus recombinante que codifica al menos un TAA, puede administrarse al menos un antagonista del punto de control inmunitario a una dosificación o concentración como se proporciona en la presente divulgación.

Composiciones terapéuticas y usos

La presente invención se refiere además al uso de los vectores de poxvirus de acuerdo con la invención para la preparación de composiciones terapéuticas o vacunas que pueden inducir o contribuir a la aparición o mejora de una reacción inmunológica contra epítopos tumorales. La presente invención, por tanto, proporciona vectores que son útiles como medicamento o vacuna.

Por consiguiente, la invención se refiere a una composición inmunógena que comprende un vector de MVA de acuerdo con la invención en combinación con uno o más anticuerpos, antagonistas de acuerdo con la invención.

Por tanto, los vectores de MVA de acuerdo con la invención pueden usarse para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento del cáncer.

La invención abarca una composición para su uso en protocolos de vacunación profiláctica y/o terapéutica, para el tratamiento de tumores y especialmente como tratamiento antineoplásico.

En una realización, la invención abarca una composición para la administración a o tratamiento de un paciente con cáncer, particularmente aquellos cánceres tales como, aunque sin limitación, cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de ovario o cáncer colorrectal.

En una realización, la invención abarca el uso de una composición para la administración a o tratamiento de un paciente con cáncer, particularmente aquellos cánceres seleccionados de cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de ovario o cáncer colorrectal.

En realizaciones adicionales, la invención abarca una composición o uso de una composición para la administración a o tratamiento de un paciente con cáncer, particularmente un paciente con cáncer de mama.

En una realización, la composición para administración simultánea o secuenciar comprende un vector de MVA de acuerdo con la invención y uno o más anticuerpos, antagonistas de acuerdo con la invención.

En otras realizaciones adicionales, la invención abarca una composición o uso de una composición para la administración a o tratamiento de un paciente con cáncer, particularmente un paciente con cáncer de próstata.

En una realización, la composición para administración simultánea o secuencial comprende un vector PROSTVAC® de acuerdo con la invención y uno o más anticuerpos, o antagonistas de acuerdo con la invención.

De acuerdo con las diversas realizaciones de la presente invención, en el tratamiento del cáncer, cando se combina un antagonista del punto de control inmunitario con un vector poxvírico que codifica un TAA, la dosificación a la que el antagonista del punto de control inmunitario es terapéuticamente eficaz es menor o está disminuida en comparación con 1) una dosificación terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario sin el vector poxvírico o 2) una dosificación terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario por sí mismo. Por tanto, pueden administrarse dosificaciones terapéuticamente eficaces de antagonistas del punto de control inmunitario a dosificaciones menores, reduciendo de ese modo y/o eliminando los efectos secundarios tóxicos y adversos de los tratamientos encontrados en la técnica anterior.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de una composición suficiente para conseguir un efecto terapéutico o clínico deseado en un sujeto que se está tratando. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector poxvírico que comprende un ácido nucleico de antígeno asociado a tumor (TAA) (tal como, aunque sin limitación, antígeno CEA, MUC-1, PSA, HER-2 o Brachyury) unido de forma funcional a una secuencia de control de la expresión sería una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria específica de TAA, para reducir el tamaño o carga tumoral, para reducir el número de metástasis tumorales, para retardar la progresión de un cáncer, o para aumentar la supervivencia global de un paciente o población de pacientes que tienen cáncer.

Además, a modo de ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario sería una cantidad suficiente para inhibir la función de la molécula del punto de control inmunitario diana, para unirse a la molécula de punto de control inmunitario diana para reducir el tamaño o carga tumoral, para reducir el número de metástasis tumorales, para retardar la progresión de un cáncer, o para aumentar la supervivencia global de un paciente o población de pacientes que tienen cáncer.

Un "efecto terapéutico" es un efecto terapéutico o clínico deseado en un sujeto. Un "efecto terapéutico" en un tratamiento del cáncer puede caracterizarse por: una reducción en el tamaño del tumor, la masa del tumor o la carga tumoral; una reducción en el número de metástasis tumorales; un retardo en la progresión de un cáncer, o un aumento en la supervivencia global de un paciente o población de pacientes que tienen cáncer.

El tratamiento combinado del cáncer de un antagonista del punto de control inmunitario con un poxvirus recombinante posibilita la eficacia terapéutica a dosificaciones bajas del antagonista o agonista

Como se ilustra y describe en este documento, cuando un antagonista del punto de control inmunitario se combina con un vector poxvírico que codifica un TAA, la dosificación a la que el antagonista o agonista del punto de control inmunitario es terapéuticamente eficaz es menor o está disminuida. En diversas realizaciones adicionales, la presente divulgación incluye administrar a un paciente humano con cáncer una combinación de: (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario. En esta realización, la cantidad subterapéuticamente eficaz del antagonista del punto de control inmunitario consigue un "efecto terapéutico aumentado" en comparación con una administración del poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario.

En al menos un aspecto, las dosificaciones subterapéuticamente eficaces se configuran para maximizar los beneficios terapéuticos mientras se minimizan los efectos secundarios adversos que se han observado en los tratamientos del punto de control inmunitario en la técnica anterior.

Una "cantidad subterapéuticamente eficaz" es una dosificación o cantidad a la que el antagonista del punto de control inmunitario es ineficaz para un "efecto terapéutico" por sí mismo, cuando se administra como agente monoterapéutico o monoterapia, o cuando se administra junto con otros o múltiples antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario.

En una realización, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de aproximadamente un 99 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 5 %, de un 75 % a aproximadamente un 5 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 10 %, de aproximadamente un 65 % a aproximadamente un 15 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 20 %, de aproximadamente un 55 % a aproximadamente un 25 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 30 % o de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 10 % de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario. En una realización preferida, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de aproximadamente un 99 % de disminución a aproximadamente un 30 % de disminución de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario. En otra realización preferida, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de aproximadamente un 90 % de disminución a aproximadamente un 30 % de disminución de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario. En otra realización preferida más, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista o agonista del punto de control inmunitario es de aproximadamente un 99 % de disminución, aproximadamente un 90 % de disminución o aproximadamente un 30 % de disminución de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario.

En otra realización, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de un 99 % a un 5 %, de un 90 % a un 5 %, de un 85 % a un 5 %, de un 80 % a un 5 %, de un 75 % a un 5 %, de un 70 % a un 10 %, de un 65 % a un 15 %, de un 60 % a un 20 %, de un 55 % a un 25 %, de un 50 % a un 30 % o de un 50 % a un 10 % de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario. En realización preferida, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de un 99 % de disminución a un 30 % de disminución de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario. En otra realización preferida, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de aproximadamente un 90 % de disminución a aproximadamente un 30 % de disminución de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario. En otra realización preferida más, la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de un 99 % de disminución, un 90 % de disminución o un 30 % de disminución de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario.

En una o más realizaciones, una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario puede usarse en combinación con un poxvirus recombinante que incluye al menos un TAA como parte de una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga u homóloga como se describe en este documento.

Realizaciones adicionales para combinaciones o medicamentos

En realizaciones adicionales, la presente divulgación abarca una combinación o medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente humano con cáncer. La combinación o medicamento comprende un vector de poxvirus recombinante, comprendiendo el vector de poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); (b) un antagonista de PD-1; y (c) un antagonista de CTLA-4. El antagonista de PD-1 y el antagonista de CTLA-4 pueden incluir un anticuerpo antagonista anti-PD-1 y un anticuerpo anti-CTLA-4, respectivamente.

En otra realización, la presente divulgación puede incluir una combinación o medicamento para su uso en aumentar la tasa de supervivencia global en un paciente humano con cáncer, comprendiendo la combinación o medicamento: (a) un poxvirus que incluye al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); (b) un antagonista de PD-1; y (c) un antagonista de CTLA-4. El antagonista de PD-1 y el antagonista de CTLA-4 pueden incluir un anticuerpo antagonista anti-PD-1 y un anticuerpo anti-CTLA-4, respectivamente.

En otra realización más, la presente divulgación puede incluir una combinación o medicamento para su uso en aumentar la tasa de supervivencia global en un paciente humano con cáncer, comprendiendo la combinación o medicamento: (a) un poxvirus que incluye al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario; en el que la cantidad terapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario combinado con el vector de poxvirus tiene un efecto terapéutico aumentado en comparación con una administración de un vector de poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario.

En una realización adicional más, la presente divulgación puede incluir una combinación o medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente humano con cáncer, comprendiendo la combinación o medicamento: (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario, en el que la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de tal modo que el efecto terapéutico de la combinación está aumentado en comparación con una administración del poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista o agonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario. Se contempla que la combinación o medicamento puede incluir un antagonista o agonista del punto de control inmunitario seleccionado de un antagonista de CTLA-4 o un antagonista de PD-1. Se contempla que los diversos antagonistas del punto de control inmunitario pueden plasmarse en uno o más anticuerpos.

En una realización adicional más, la presente divulgación puede incluir una combinación o medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente humano con cáncer, comprendiendo la combinación o medicamento: (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante, comprendiendo el vector de poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario; en el que la cantidad terapéuticamente eficaz o la cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario se configura para administrarse después de la cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante; y en el que la cantidad terapéuticamente eficaz y cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario combinadas con el vector de poxvirus tiene un efecto terapéutico aumentado en comparación con una administración de un vector de poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o una cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario.

En otra realización más, la presente divulgación puede incluir una combinación o medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente humano con cáncer, comprendiendo la combinación o medicamento al menos una primera y segunda administración, comprendiendo cada administración: (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario; en el que la segunda administración de una cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario está aumentada en comparación con la primera administración de la cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario; y en el que la cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista o agonista del punto de control inmunitario combinada con el poxvirus tiene un efecto terapéutico aumentado en comparación con un administración de un poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o una cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario.

En otra realización más, el poxvirus recombinante que codifica un TAA en la combinación o medicamentos descritos en este documento puede ser PROSTVAC®. En otra realización más, el poxvirus recombinante que codifica un TAA en la combinación o medicamentos descritos en este documento puede ser CV301.

En una realización adicional más, la presente divulgación puede incluir el uso de: (a) un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); (b) un antagonista de PD-1; y (c) un antagonista de CTLA-4 en la preparación de una composición farmacéutica o medicamento. El antagonista de PD-1 y el antagonista de CTLA-4 pueden incluir un anticuerpo antagonista anti-PD-1 y un anticuerpo anti-CTLA-4, respectivamente. En una realización adicional, el uso de la composición farmacéutica o medicamento divulgado puede ser para el tratamiento de un paciente humano con cáncer.

En una realización adicional más, la presente divulgación puede incluir el uso de: (a) un poxvirus que comprende al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en la preparación de una composición farmacéutica o medicamento; en el que la cantidad terapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario combinado con el vector de poxvirus tiene un efecto terapéutico aumentado en comparación con una administración de un vector de poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario.

En una realización adicional más, la presente divulgación puede incluir el uso de (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en la preparación de una composición farmacéutica o medicamento; en el que la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario es de tal modo que el efecto terapéutico de la combinación está aumentado en comparación con una administración del poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o la cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario. Se contempla que el al menos un antagonista del punto de control inmunitario puede seleccionarse de un antagonista de CTLA-4 o un antagonista de PD-1. Se contempla que los diversos antagonistas del punto de control inmunitario pueden plasmarse en uno o más anticuerpos.

En una realización adicional más, la presente divulgación puede incluir el uso de: (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en la preparación de una composición farmacéutica o medicamento; en el que la cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario se configura para administrarse después de la cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante; y en el que la cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario combinadas con el vector de poxvirus tiene un efecto terapéutico aumentado en comparación con una administración de un vector de poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o una cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario.

En otra realización más, la presente divulgación puede incluir el uso de al menos una primera y una segunda administración de dosificación, comprendiendo cada administración de dosificación: (a) una cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante, comprendiendo el poxvirus al menos un antígeno asociado a tumor (TAA); y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en la preparación de una composición farmacéutica o medicamento; en el que la cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario de la segunda administración está aumentada en comparación con la primera administración; y en el que la cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz del al menos un antagonista del punto de control inmunitario combinadas con el vector de poxvirus tiene un efecto terapéutico aumentado en comparación con una administración de un vector de poxvirus que comprende al menos un TAA en solitario o una cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad subterapéuticamente eficaz de al menos un antagonista del punto de control inmunitario en solitario o en combinación con otros antagonistas del punto de control inmunitario.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de MVA-BN-mHER2

La infección y transfección simultánea de cultivo permitió que se produjera recombinación homóloga entre el genoma vírico y el plásmido de recombinación. Se aisló el virus que portaba el inserto, se caracterizó y se prepararon reservas de virus.

El plásmido pBN146 contiene secuencias que también están presentes en MVA-BN (los marcos abiertos de lectura 14L y 15L). La secuencia de mHER2 se insertó entre las secuencias de MVA-BN para permitir la recombinación del genoma vírico de MVA-BN. Por tanto, se construyó un plásmido que contenía la secuencia de mHER2 en dirección 3' de un promotor de poxvirus, especialmente el promotor del gen del cuerpo de inclusión de tipo A del virus de la viruela vacuna. El plásmido también contenía un casete de selección que comprende un promotor sintético del virus de la variolovacuna (Ps), un gen de resistencia a fármaco (guanina-xantina fosforribosiltransferasa; Ecogpt), un sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) y la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP). Ambos genes de selección (gpt y EGFP) estaban codificados por un solo transcrito bicistrónico.

La secuencia de HER-2 se modificó mediante la adición de secuencias de nucleótidos que codifican los epítopos de la toxina tetánica de p2 y p30 para aumentar la respuesta inmunitaria contra el mismo. Después de que se insertara mHER2 en el genoma de MVA-BN, la "región de inserto" del virus tenía la siguiente estructura:

promotor de ATI - secuencia mHER2 - promotor de Ps - gpt - IRES - EGFP. La región de inserto estaba flanqueada por secuencias de la región intergénica I4L de MVA-BN (F1 y F2) en el plásmido de recombinación bacteriano pBN146. La secuencia de nucleótidos de la construcción se muestra a continuación.

AGTATGCATTTTTACGGATGGAGTCTCGGTCTAAAAACGGGAATGTACTATCTACGTACG AAACCCGCA TCCGCTCCCA TTCAA TTCACA TTGGACAAGGA TAAAA TAAAACCACTGGTG GTTTGCGATTCCGAAATCTGTACATCATGCAGTGGTTAAACAAATCTAGAACTAGTTTAA TTAAGGAGCTGTTTTGAATAAAATTTTTTTATAATAAATCTAGAACTAGTGGATCCCCCG GGCTGCAGGAATTCGATCTAGCCGCCACCATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCTGGGGGC TCCTCCTCGCCCTCTTGCCCCCCGGAGCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACA TGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACC AGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCT TAAGTTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAG TGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACA ACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAG GGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAG GAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGG ACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGG CCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGG ATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCAC TGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTG ACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCC TGGTCCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACCGAGCTGCGGTATACAT TCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCT GCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGT GTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGC GAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCT TTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCC CGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTAT ACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAA TCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCA GCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATA ACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACC AAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCT GCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACT GCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCC CCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGTGTCAGCCCCAGA ATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCACTATA AGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACA TGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCA CCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTC TGACGTCCTTCAACAACTTCACCGTGAGCTTCTGGCTGCGCGTGCCCAAGGTGAGCGCCA GCCACCTGGAGATCGTCTCTGCGGTGGTTGGCATTCTGTAGAAGCTTGGrACCGAGCTCG GATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCATCAAG CTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAGTTAATTAAGGATCCCCCG GGCTGCAGGAATTCCATTTTTATTCTCAAATGAGATAAAGTGAAAATATATATCATATAT ACAAAGTA

(SEQ ID NO:l).

Los codones de inicio y parada de HER2 se indican en negrita. Las secuencias flanqueantes se indican en cursiva.

La traducción del polipéptido mHER2 codificado se muestra a continuación:

MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQWQGNL ELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNG DPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLA LTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQC AAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVQYIKANSKFIGITELRYTFGASCVTACP YNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSAN IQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAW PDSLP DLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLAL1HHNTHLCFVHTV PWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQEC VEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARC PSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSFNNFTVS FWLRVPKVSASHLEIV SA V V G IL .

(SEQ ID NO:2).

Los epítopos de la toxina tetánica de las secuencias de p2 y p30 se indican en negrita.

Se inocularon cultivos de CEF con MVA-BN y también se transfectaron con ADN del plásmido pBN146. A su vez, las muestras de estos cultivos celulares se inocularon en cultivos de CEF en medio que contenía fármacos de selección, y se aislaron clones víricos que expresan EGFP por purificación en placa. Las reservas de virus que crecieron en presencia de los fármacos de selección y que expresaban EGFP se denominaron MVA-BN-mHER2. La generación de MVA-BN-mHER2 y la preparación de la reserva de virus implicaron doce (12) pases secuenciales, incluyendo cinco (5) purificaciones en placa.

MVA-BN-mHER2 se pasó en cultivos celulares de CEF en ausencia de fármacos de selección. La ausencia de fármacos de selección permitió la pérdida de la región que codifica los genes de selección, gpt y EGFP y el promotor asociado (el casete de selección) de la secuencia insertada. La recombinación que provoca la pérdida del casete de selección está mediada por la región F1 I4L y una subsección de esa región, la repetición F1 (F1 rpt), que flanquea el casete de selección en el plásmido pBN146. Estas secuencias duplicadas se incluyeron para mediar la recombinación que provoca la pérdida del casete de selección, dejando solamente la secuencia de mHER2 insertada en la región intergénica I4L.

Se preparó virus purificado en placa que carece del casete de selección. Dicha preparación implicó quince (15) pases incluyendo cinco (5) purificaciones en placa.

La presencia de la secuencia de mHER2 y la ausencia de virus MVA-BN precursor en reservas de MVA-BN-mHER2 se confirmó por análisis por PCR, y se usó PCR con cebadores internos para verificar la ausencia del casete de selección (los genes gpt y EGFP).

Se demostró la expresión de la proteína mHER2 en células inoculadas con MVA-BN-mHER2 in vitro.

Ejemplo 2

Aumento en IFNy como resultado del tratamiento con MVA-BN-mHER2 y anti-CTLA4

Se adquirieron ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad, ~20 g) de Simonsen Laboratories, Gilroy, CA. Para el modelo de metástasis pulmonar experimental, a los ratones se les implantó i.v. en el día 15,0 x 104 células CT26-HER-2 en 300 pl de DPBS, que forma tumores en los pulmones.

Se adquirieron los siguientes anticuerpos de Bio X Cell (West, Lebanon, NH): anticuerpo agonista anti-ICOS (clon 17G9), anti-CTLA-4 (9D9), anti-PD-1 (RMP1-14) y anti-LAG-3 (C9B7W). Todos los anticuerpos se inyectaron i.p. a 200 pg por ratón en 100 pl de PBS en los días 3 y 17 salvo que se indique otra cosa. Para tratamientos víricos, los ratones se trataron con 7,1 pl de 1,0 x 107 Inf. U. de MVA-BN-HER2 por escarificación de la cola (t.s., producida por Bavarian Nordic [BN], Martinsried, Alemania) en los días 4 y 18 salvo que se indique otra cosa.

En el día 25, se combinó sangre completa, tumor/pulmones o bazos (4 ratones/grupo) para análisis citométrico de flujo. Los esplenocitos se prepararon prensando los bazos entre dos portaobjetos de vidrio esmerilados, y lisando los glóbulos rojos con tampón de lisis ACK (Life Technologies, Grand Island, NY). Los pulmones y tumores asociados se trocearon hasta trozos de ~1-2 mm3 y se digirieron adicionalmente en suspensiones monocelulares durante 1 h a 37 °C en DMEM con FBS al 10 %, 50 U/ml de DNasa I y 250 U/ml de colagenasa I (Worthington Biochemical Corporation Lakewood, NJ). Los glóbulos rojos tanto en los pulmones como en sangre completa se lisaron con tampón de lisis de RBC (eBiosceince).

Se adquirieron de BD Bioscience (San Jose, CA) los anticuerpos contra las siguientes proteínas: CD3e (500A2), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6.7), CD107a (1D4B), IFN-y (XMG1.2); BioLegend (San Diego, CA): CD3e (145-2C11), IL-2 (JES6-5H4), LAG-3 (C9B7W), PD-1 (CD279, 29F.1A12), Tim-3 (RMT3-23), TNF-a (MP6-XT22); o eBioscience (San Diego, CA): ICOS (7E.17G9), CD16/CD32 (93).

Para identificar linfocitos T de desgranulación, se resuspendieron suspensiones monocelulares de esplenocitos (2 x 106 células/pocillo) o tumor/pulmones (1 x 106 células/pocillo) en RPMI-10 (FBS al 10 %, Penstrep al 1 % y pmercaptoetanol al 0,1 %) y se reestimularon durante una noche a 37 °C en presencia de anticuerpo anti-CD107a y Golgi Stop (BD Bioscience). Se usaron los siguientes péptidos para la reestimulación: MVA E3L y F2L (VGPSNSPTF y SPGAAGYDL, 1 pM cada uno), HER2 p63 (TYLPTNASL, 1 pM), colección de péptidos solapantes de Ec D de HER2 (OPL de HER2, 1 pM) y PSA (HpQKVTKFML, 1 pM) (5, 9-11). Se usó concanavalina A (ConA) a 5 pg/ml como control positivo. El siguiente día, las células se lavaron, se bloquearon con anticuerpos anti-CD16/CD32, y se tiñeron para marcadores superficiales. Entonces las células se lavaron, se fijaron/permeabilizaron con tampón BD Cytofix/Cytoperm, y se tiñeron de forma intracelular para IFN-y.

Se realizó tinción adicional de citocinas intracelulares en esplenocitos como se describe anteriormente excepto que se omitió el anticuerpo anti-CD107a, se añadieron Golgi Stop y Golgi Plug, y las células se tiñeron de forma intracelular para IFN-y, IL-2 y TNF-a.

Todas las muestras de FACS se adquirieron en el BD LSRII o Fortessa y se analizaron usando FlowJo versión 9.6.2 (TreeStar Inc., Ashland, OR).

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando GraphPad Prism versión 6.01 para Windows (GraphPad Software La Jolla, CA).

Los resultados se muestran en la figura 1. Las células de desgranulación específicas de antígeno tumoral (HER2 p63 CD107+IFNy+) aumentaron en el tumor/pulmones y bazo de ratones tratados con politerapia con MVA-BN-HER2 y CTLA-4. Las células de desgranulación específicas de virus (MVA E3L F2L CD107+ IFNy+) estaban elevadas en el tumor/pulmones y bazo de ratones tratados con MVA-BN-HER2,

Ejemplo 3

Aumento en IFNy y la producción de citocinas como resultado del tratamiento con MVA-BN-mHER2 y anti-CTLA4

El tratamiento con MVA-BN-HER2 aumentó la magnitud y calidad los linfocitos T específicos de antígeno tumoral y virus en el bazo. A los ratones se les implantó 5 x 104 células CT26-HER-2, y se trataron con MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4, como se describe en el ejemplo 2. En el día 25, se combinaron el tumor/pulmones o bazos (4 ratones/grupo) y se reestimularon durante una noche para medir las respuestas específicas al virus y al antígeno tumoral como se describe en el ejemplo 2.

Los resultados se muestran en la figura 2, A) Los gráficos circulares son el área ponderada para reflejar el número de células IFNy+ por millón de linfocitos T CD8+. B) La MFI de IFNy aumenta con los linfocitos T polifuncionales específicos de antígeno tumoral (HER2 p63) con politerapia.

En ambos ejemplos 2 y 3, como resultado del tratamiento con la combinación de MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4, se aumentó el número y calidad de los linfocitos T específicos de antígeno y virus. Además, el tratamiento combinado aumentó los números de linfocitos T específicos de antígeno y virus que estaban presentes en el tumor. Como se muestra por las figuras 1 y 2, el aumento en los linfocitos T específicos de antígeno y virus en ubicaciones tumorales es una mejora notable sobre los tratamientos usando tratamiento con MVA-BN-HER2 o anti-CTLA-4 en solitario. Dichos aumentos en la cantidad y especificidad de los linfocitos T específicos de antígeno y virus pueden proporcionar tratamientos mejores y más eficaces para cánceres humanos.

Además, como se muestra en la figura 2, MVA-BN-HER2 induce linfocitos T específicos de antígeno tumoral que producen IFNy. La presente divulgación contempla que los TIL (linfocitos de infiltración tumoral) inducidos por virus que secretan IFNy pueden dar lugar a PD-L1 aumentado en células tumorales; sosteniendo el bloqueo de esta ruta en combinación con tratamiento vírico.

Ejemplo 4

A los ratones se les implantó i.v. 5 x 104 células CT26-HER-2, y se trataron con MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4, como se describe en el ejemplo 2. **** p<0,0001, ensayo del orden logarítmico. Resultados. Como se muestra en la figura 3, los resultados demuestran que el tratamiento con MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4 aumenta la tasa de supervivencia global de los sujetos significativamente en comparación con el tratamiento de los cánceres con MVA-BN-HER2 o anti-CTLA-4 en solitario.

Ejemplo 5

MVA-BN-HER2 reduce significativamente la carga tumoral pulmonar en el día 25

A los ratones se les implantó i.v. 5 x 104 células CT26-HER-2, y se trataron con MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4, como se describe en el ejemplo 2. A) Los ratones se sacrificaron y se perfundieron a través de la tráquea con azul tripano. Se retiraron los pulmones y se sumergieron brevemente en peróxido de hidrógeno y se lavaron en PBS. Los tumores eran visibles como pequeñas masas en ratones sin tratar y tratados con anti-CTLA-4. No hubo tumores visibles en los pulmones de ratones tratados con MVA-BN-HER2. La barra de escala es igual a 1 cm. B) Peso del pulmón en el día 25. .... p<0,0001, ANOVA unidireccional con ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett.

Resultados. Como se muestra en la figura 4, los resultados demuestran que el tratamiento con MVA-BN-HER2 en solitario o en combinación con anti-CTLA-4 disminuyó significativamente la carga tumoral en el día 25 en comparación con el tratamiento de los cánceres sin tratamiento o anti-CTLA-4 en solitario.

Ejemplo 6

El tratamiento con MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4 aumenta la tasa de supervivencia global

A los ratones se les implantó i.v. 5 x 104 células CT26-HER-2, y se trataron con MVA-BN-HER2, como se describe en el ejemplo 2. Los ratones se trataron con anti-CTLA-4 en los días 4 y 18 a 200 gg (A, 10 mg/kg), 66 gg (B, 3 mg/kg) o 22 gg (C, 1 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, ensayo del orden logarítmico.

Resultados. Como se muestra en la figura 5, los resultados demuestran que MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 aumentaba la tasa de supervivencia global de los sujetos a cada concentración de dosificación en comparación con tratamiento, sin tratamiento o anti-CTLA-4 en solitario.

Ejemplo 7

MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4 disminuyen la carga tumoral

En el modelo de tumor sólido, a ratones BALB/c hembra se les implantó en el día 1 células CT26-HER-2 (1,0 x 105, i.d. en el flanco dorsal). Los ratones se trataron en el día 1 y 15 con MVA-BN-HER2 (1E7 Inf. U. en 100 pl de Tb S, s.c. En la base de la cola) y 22 pg de anti-CTLA-4 (1 mg/kg) en los días 1 y 15. Los tumores se midieron dos veces a la semana y el volumen del tumor se calculó de acuerdo con la fórmula: volumen del tumor (mm3) = (longitud x anchura2)/2.

Resultados. Como se muestra en la figura 6, los resultados demuestran que MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 a dosis baja reducía significativamente la carga tumoral en el día 20 en comparación con otros tratamientos. **** p<0,0001, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 8

Tratamiento con MVA-BN-HER2 y anti-PD-1

A los ratones se les implantó i.v. 5 x 104 células CT26-HER-2, y se trataron con MVA-BN-HER2, como se describe en el ejemplo 2. Los ratones se trataron con anti-PD-1 en los días 4 y 18 a 200 pg (A, 10 mg/kg), 66 ug (B, 3 mg/kg) o 22 pg (C, 1 mg/kg) i.p. en 100 pl de PBS. **** p<0,0001, * p<0,05, ns = no significativo por ensayo del orden logarítmico. Resultados. En la figura 7, los resultados muestran MVA-BN-HER2 en combinación con anti-PD-1.

Ejemplo 9

MVA-BN-HER2 en combinación con tratamiento anti-CTLA-4 y anti-1 PD-1 aumenta la tasa de supervivencia global a dosificaciones menores

A los ratones se les implantó i.v. 5 x 104 células CT26-HER-2, y se trataron con MVA-BN-HER2, como se describe en el ejemplo 2. Los ratones se trataron con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en los días 3 y 17 a 200 pg (A, 10 mg/kg), 66 pg (B, 3 mg/kg) o 22 pg (C, 1 mg/kg) de cada anticuerpo i.p. en 100 pl de PBS. **** p<0,0001, ensayo del orden logarítmico. Resultados. Como se muestra en la figura 8, los resultados demuestran que MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 aumentaba significativamente la tasa de supervivencia global de los sujetos a cada concentración de dosificación en comparación con tratamiento de los cánceres con MVA-BN-HER2 o anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en solitario. De forma más importante, las tasas de supervivencia se aumentaron a las dosificaciones menores de 3 mg/kg y 1 mg/kg de anticuerpos para MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en comparación con MVA-BN-HER2 o anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en solitario.

Ejemplo 10

MVA-BN-CV301 con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 aumenta la tasa de supervivencia global

A ratones C57/BL6 hembra (6-8 semanas de edad, ~20 g, Simonsen Laboratories, Gilroy, CA) se les implantó en el día 1 i.v. 1,0 x 106 células MC38-MUC1 en 300 pl de DPBS, lo que forma tumores en los pulmones. Los ratones se trataron con MVA-BN-CV301 (4E5 Inf. U. por vía subcutánea, s.c. por encima de la base de la cola) y se trataron con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 (200 pg cada uno) i.p. en los días 4 y 18.

Resultados. Como se muestra en la figura 9, los resultados demuestran que MVA-BN-CV301 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 aumentaba significativamente la tasa de supervivencia global de los sujetos en comparación con tratamiento de los cánceres con MVA-BN-CV301 o anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en solitario.

Ejemplo 11

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con PROSTVAC y anticuerpos

A ratones BALB/c macho (6-8 semanas de edad, ~20 g, Simonsen Laboratories, Gilroy CA) se les implantó en el día 1 células E6 (1,5 x 105, i.d. en el flanco dorsal), lo que forma tumores sólidos. Los ratones se trataron en el día 1 con PROSTVAC-V (2E7 Inf. U., s.c. en la base de la cola), y en los días 8 y 15 con PROSTVAC-F (1E8 Inf. U., s.c. en la base de la cola). Los ratones se trataron i.p. con anti-PD-1 y/o (200 pg) en los días 1 y 15. Los tumores se midieron dos veces a la semana y el volumen del tumor se calculó de acuerdo con la fórmula: volumen del tumor (mm3) = (longitud x anchura2)/2.

Ejemplo 12

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con PROSTVAC y anti-PD-1

A los ratones se les implantó i.d. con tumores E6 y se trataron con PROSTVAC y anti-PD-1 como se describe en el ejemplo 11. Los resultados se muestran en la figura 10.

Ejemplo 13

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con PROSTVAC y anti-LAG-3

A los ratones se les implantó i.d. con tumores E6 y se trataron con PROSTVAC y anti-LAG-3 como se describe en el ejemplo 11. Los resultados se muestran en la figura 11.

Ejemplo 14

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con PROSTVAC y anti-PD-1 y anti-LAG-3

A los ratones se les implantó i.d. tumores E6 y se trataron con PROSTVAC, anti-PD-1 y anti-LAG-3 como se describe en el ejemplo 11. Los resultados se muestran en la figura 12.

Ejemplo 15

MVA-BN-HER2 y anti-CTLA-4 disminuyen la carga tumoral

A los ratones se les implantó en el día 1 células CT26-HER-2 i.d. como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 en los días 7 y 22 (1E7 Inf. U., t.s.), y anti-ICOS en los días 1,4, 8, 11, 15, 18, 22, 25 (200 gg i.p.). A) Crecimiento tumoral promedio. B) Crecimiento tumoral en ratones individuales. **** p<0,0001, ** p<0,01, ANOVA bidireccional. Los resultados se muestran en la figura 13.

Ejemplo 16

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-PD-1 reduce la carga tumoral a dosificaciones menores

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 en los días 1 y 15 a 200 gg (10 mg/kg), 66 gg (3 mg/kg) o 22 gg (1 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 17

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-ICOS reduce la carga tumoral a dosificaciones menores

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-ICOS en los días 1 y 15 a 200 gg (10 mg/kg), 66 gg (3 mg/kg) o 22 gg (1 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 18

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-PD-1 y anti-LAG-3 reduce la carga tumoral a dosificaciones menores A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 y anti-LAG-3 en los días 1 y 15 a 200 gg (10 mg/kg), 66 gg (3 mg/kg) o 22 gg (1 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 19

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-ICOS reduce la carga tumoral a dosificaciones menores A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 y anti-ICOS e los días 1 y 15 a 200 gg (10 mg/kg), 66 gg (3 mg/kg) o 22 gg (1 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 20

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 reduce la carga tumoral con una segunda dosificación aumentada

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 en el día 1 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 15 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 21

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-PD-1 reduce la carga tumoral con una segunda dosificación aumentada

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 en el día 1 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 15 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 22

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-ICOS reduce la carga tumoral con una segunda dosificación aumentada

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-ICOS en el día 1 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 15 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 23

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 reduce la carga tumoral con una segunda dosificación aumentada

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en el día 1 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 15 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 24

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-PD-1 y anti-LAG-3 reduce la carga tumoral con una segunda dosificación aumentada

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 y anti-LAG-3 en el día 1 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 15 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 25

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-ICOS reduce la carga tumoral con una segunda dosificación aumentada

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 y anti-ICOS en el día 1 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 15 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 26

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 reduce la carga tumoral con poxvirus antes de anti-CTLA-4 A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 en el día 3 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 18 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 en el día 7 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 21 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 27

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-PD-1 reduce la carga tumoral con poxvirus antes de anti-PD-1 A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 en el día 3 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 18 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 en el día 7 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 21 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 28

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-ICOS reduce la carga tumoral con poxvirus antes de anti-ICOS A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-ICOS en el día 3 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 18 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-ICOS en el día 7 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) y el día 21 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 29

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 reduce la carga tumoral con poxvirus antes de anti-CTLA-4 y anti-PD-1

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en el día 3 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 18 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 en el día 7 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 21 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 30

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-PD-1 y anti-LAG-3 reduce la carga tumoral con poxvirus antes de anti-PD-1 y anti-LAG-3

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 y anti-LAG-3 en el día 3 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 18 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-PD-1 y anti-LAG-3 en el día 7 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 21 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 31

MVA-BN-HER2 en combinación con anti-CTLA-4 y anti-ICOS reduce la carga tumoral con poxvirus antes de anti-CTLA-4 e ICOS

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 y anti-ICOS en el día 3 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 18 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

A los ratones se les implantan células CT26-HER-2 y se tratan con MVA-BN-HER2 como se describe en el ejemplo 7. Los ratones se tratan con anti-CTLA-4 y anti-ICOS en el día 7 a 66 gg (3 mg/kg), 22 gg (1 mg/kg) o 2,2 gg (0,1 mg/kg) para cada anticuerpo y el día 21 a 200 gg (10 mg/kg) o 66 gg (3 mg/kg) para cada anticuerpo i.p. en 100 gl de PBS. **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p <0,01, * p<0,05, ANOVA bidireccional.

Ejemplo 32

Aumento en la expresión de Tim-3 con tratamiento con MVA-BN-HER2

Ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad, ~20 g, Simonsen Laboratories, Gilroy, CA) se trataron en el día 1 y el día 15 con 7,1 gl de 1,0 x 107 Inf. U. de MVA-BN-HER2 por escarificación de la cola (t.s., producida por Bavarian Nordic [BN], Martinsried, Alemania). Los tejidos se recogieron, se procesaron y se tiñeron como se describe en el ejemplo 2, y se midió la expresión superficial de Tim-3 a diversos intervalos.

Resultados. Como se muestra en la figura 14, a los sujetos se les administró MVA-BN-HER-2 tras lo que se midieron los niveles de expresión de Tim-3 a intervalos regulares. En respuesta al tratamiento, hubo un periodo inicial de muy poco aumento en la expresión del punto de control inmunitario. De aproximadamente el día 3 a aproximadamente el día 12, la expresión de linfocitos T de TIM-3 aumentó drásticamente. La expresión aumentada aún se observaba hasta aproximadamente el día 18. Con un segundo tratamiento de MVA-BN-HER2 en el día 15, la expresión de Tim 3 aumentó empezando en el día 17. Incluso más importante, este aumento en la expresión del punto de control inmunitario fue más profundo en linfocitos T CD8 en comparación con linfocitos T CD4.

Como se muestra en la figura 14, el tratamiento con MVA-BN-HER2 indujo transitoriamente la expresión de Tim-3 en linfocitos T. En un aspecto, esta expresión inducida de Tim-3 en linfocitos T es indicativa de que bloquear la ruta de Tim-3 mediante uno o más antagonistas de TIM-3 puede potenciar la respuesta de linfocitos T de un paciente con cáncer. Ejemplo 33

El tratamiento con MVA-BN-HER2 aumenta ICOS en linfocitos T CD8+ y CD4+

Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 (1E7 Inf. U., t.s.) en el día 1 y 15. Los tejidos se recogieron, se procesaron y se tiñeron como se describe en el ejemplo 2, y se midió la expresión superficial de ICOS a diversos intervalos.

Resultados. Como se muestra en la figura 15, a los sujetos se les administró MVA-BN-HER-2 tras lo que se midieron los niveles de expresión de ICOS a intervalos regulares. En respuesta al tratamiento, hubo un periodo inicial de muy poco aumento en la expresión del punto de control inmunitario. Después de aproximadamente 1-2 días, la expresión de linfocitos T de ICOS mostró un ligero aumento. De aproximadamente el día 3 a aproximadamente el día 12, la expresión de linfocitos T de ICOS aumentó drásticamente. La expresión aumentada aún se observaba hasta aproximadamente el día 18. Con un segundo tratamiento de MVA-BN-HER2 en el día 15, la expresión de ICOS aumentó empezando en el día 17. Incluso más importante, este aumento en la expresión del punto de control inmunitario fue más profundo en linfocitos T CD8 en comparación con linfocitos T CD4.

Como se muestra en la figura 15, el tratamiento con MVA-BN-HER2 indujo transitoriamente la expresión de ICOS en linfocitos T. En un aspecto, esta expresión inducida de ICOS en linfocitos T es indicativa de que activar la ruta de ICOS mediante uno o más agonistas de ICOS puede potenciar la respuesta de linfocitos T de un paciente con cáncer. Ejemplo 34

La expresión de PD-1 aumenta con el tratamiento con MVA-BN-HER2

Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 (1E7 Inf. U., t.s.) en el día 1 y 15. Los tejidos se recogieron, se procesaron y se tiñeron como se describe en el ejemplo 2, y se midió la expresión superficial de PD-1 a diversos intervalos. Resultados. Los resultados se muestran en la figura 16. A los sujetos se les administró MVA-BN-HER-2 tras lo que se midieron los niveles de expresión de PD-1 a intervalos regulares. En respuesta al tratamiento, hubo un periodo inicial de muy poco aumento en la expresión del punto de control inmunitario. Después de aproximadamente 1-2 días, la expresión de linfocitos T de PD-1 mostró un ligero aumento. De aproximadamente el día 3 a aproximadamente el día 12, la expresión de linfocitos T de PD-1 aumentó drásticamente. La expresión aumentada aún se observaba hasta aproximadamente el día 18. Con un segundo tratamiento de MVA-BN-HER2 en el día 15, la expresión de PD-1 aumentó empezando en el día 17. Incluso más importante, este aumento en la expresión del punto de control inmunitario fue más profundo en linfocitos T CD8 en comparación con linfocitos T CD4.

Como se muestra en la figura 16, el tratamiento con MVA-BN-HER2 indujo transitoriamente la expresión de PD-1 en linfocitos T. En un aspecto, esta expresión inducida de PD-1 en linfocitos T es indicativa de que bloquear la ruta de PD-1/PDL-1 mediante uno o más agonistas de PD-1/PDL-1 puede potenciar la respuesta de linfocitos T de un paciente con cáncer. Se sugiere además que bloquear PD-1 inducida por MVA-BN-HER2 puede dar lugar a coexpresión de LAG-3 y puede conseguirse beneficio terapéutico con bloqueo doble de la ruta de PD-1/PD-L1 y LAG-3 en combinación con MVA-BN-HER2.

Ejemplo 35

Respuesta inmunitaria de LAG-3 a MVA-BN-HER2

Los ratones se trataron con MVA-BN-HER2 (1E7 Inf. U., t.s.) en el día 1 y 15. Los tejidos se recogieron, se procesaron y se tiñeron como se describe en el ejemplo 2, y se midió la expresión superficial de LAG-3 a diversos intervalos. Resultados. Los resultados se muestran en la figura 17. A los sujetos se les administró MVA-BN-HER-2 tras lo que se midieron los niveles de expresión de LAG-3 a intervalos regulares. Hubo un aumento en la expresión de LAG-3 en linfocitos T CD4 o CD8 después de tratamiento con MVA-BN-HER2.

Ejemplo 36

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con MVA-BN-CV301 y anticuerpos

A ratones C57BL/6 hembra (6-8 semanas de edad, ~20 g, Simonsen Laboratories, Gilroy CA) se les implantó en el día 1 células MC38-CEA (2 x 105, i.d. en el flanco posterior). Los ratones se trataron en el día 1 y 15 con MVA-BN-CV301 (1E7 Inf. U., s.c. por encima de la base de la cola). Los ratones se trataron i.p. con anti-PD-1 y/o anti-LAG-3 como se describe en cada una de las figuras y ejemplos y como se describe en el ejemplo 2.

Ejemplo 37

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con MVA-BN-CV301 y anti-PD-1

A ratones C57/BL6 se les implantó i.d. Tumores MC38-CEA y se trataron como se describe en el ejemplo 36. Los resultados se muestran en la figura 18.

Ejemplo 38

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con MVA-BN-CV301 y anti-LAG-3

A ratones C57/BL6 se les implantó i.d. Tumores MC38-CEA y se trataron como se describe en el ejemplo 36. Los resultados se muestran en la figura 19.

Ejemplo 39

Inducción de una respuesta antitumoral en ratones tratados con MVA-BN-CV301 y anti-PD-1

y anti-LAG-3

A ratones C57/BL6 se les implantó i.d. Tumores MC38-CEA y se trataron como se describe en el ejemplo 36. Los resultados se muestran en la figura 20.

Ejemplo 40

Una sensibilización-refuerzo heteróloga amplifica las respuestas de linfocitos T específicas de PSA

Ratones BALB/c macho (5/grupo) se trataron cada dos semanas con: tampón (control), PROSTVAC-V (VVV) (2E6 Inf. U., s.c. en la base de la cola), PROSTVAC-F (FFF) (1E7 Inf. U., s.c. en la base de la cola), o recibieron una sensibilización con PROSTVAC-V seguida de 2 refuerzos con PROSTVAC-F (VFF). Los esplenocitos combinados se ensayaron para respuestas específicas de PSA por ELISPOT de IFNy como se describe en Mandl et al. Cancer Immunol. Immunother (2012), 61: 19-29, que se incorpora por referencia en este documento.

(A, B) y actividad citotóxica por citometría de flujo (% de linfocitos T CD8 CD107+ IFNy+) (C). Se determinaron los valores cuantitativos de IgG anti-PSA mediante ELISA para cada ratón individual (D). Para ELISPOT, los esplenocitos se reestimularon con péptidos CD4 o CD8 específicos de PSA o controles (controles no mostrados a las concentraciones indicadas). Las respuestas que eran demasiado numerosas para contarlas se presentaron como 1000 manchas/millón de células. Se determinó la significación estadística por RM-ANOVA con ensayo a posterioride Tukey a 0,01 pM. ****P <0,001 en comparación con el control (A y B). Para identificar los linfocitos T CD8+ citotóxicos, los esplenocitos se reestimularon durante una noche con un péptido CD8 específico de PSA en presencia de anticuerpo anti-CD107. Los gráficos muestran los datos representativos de cuatro experimentos realizados independientemente.

Como se muestra en la figura 21, la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga con virus de la variolovacuna seguido de una o más dosis de refuerzo con virus de la viruela aviar provocó una frecuencia mucho mayor de linfocitos T CD4 (figura 21A) y linfocitos T CD8 (figuras 21B y 22A) específicos de PSA productores de IFNy en comparación con pautas de dosificación homólogas VVV o FFF.

Además, los linfocitos T específicos de PSA procedentes de la dosificación VFF fueron de mayor avidez (figura 21A y 21B), como se evidencia por mayores frecuencias de linfocitos T que responden a las menores concentraciones de péptidos 0,01 pM en el ELISPOT. De forma importante, el número de CTL CD8 específicos de PSA funcionalmente activos resultantes de la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga VFF fue de 7 a 20 veces mayor que los generados por cualquier pauta de dosificación homóloga (figura 21C).

En contraste con las respuestas de linfocitos T, la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga no mejoró las respuestas de anticuerpo específicas de PSA (figura 21D). Estos resultados indican que la dosificación VFF heteróloga genera respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de PSA de mayor magnitud y mayor calidad medidas por mayor avidez y actividad CTL CD8 aumentada. Como se describe en este documento, estos contribuyen a respuestas antitumorales específicas anti-PSA mejoradas siguiendo una dosificación de PROSTVAC-V/F heteróloga.

Ejemplo 41

La sensibilización-refuerzo heteróloga mejora la calidad de las respuestas de linfocitos T específicos de PSA

Ratones BALB/c macho (5/grupo) se trataron como se describe en el ejemplo 40. Los bazos se recolectaron 14 días después del último tratamiento, y los esplenocitos combinados se reestimularon durante una noche con OPL de PSA o control (controles no mostrados). Las células se tiñeron para IFNy, TNFa e IL-2 intracelular antes del análisis citométrico de flujo. (A) Los diagramas circulares se ponderan en tamaño para reflejar los números de células detectadas (los números totales de CD8 específicos de PSA por millón de linfocitos T se indican por debajo de cada diagrama). (B) Cantidad de producción de IFNy en una base celular medida por intensidad de fluorescencia media (MFI). Los gráficos muestran los datos representativos de dos experimentos realizados independientemente.

Como se muestra en la figura 22, se observaron rasgos característicos distintivos adicionales en la calidad de la respuesta de linfocitos T CD8 específicos de PSA cuando se analizaban los linfocitos T CD8 específicos de PSA para la producción de multicitocinas de IFNy, TNFa e IL-2 por citometría de flujo (figura 22). Usando la expresión de citocinas, se han clasificado los linfocitos T de memoria CD8 como linfocitos T de memoria efectores CD8 doble positivos (IFNy+ TNFa+, TEM) y como linfocitos T de memoria centrales CD8 triple positivos (IFNy+ TNFa+ IL-2+; TCM). Véase, por ejemplo, Nat Rev Immunol 2008, 8: 247-258.

Además de la magnitud aumentada de la respuesta de linfocitos T CD8 (figura 21 y figura 22A), se reveló un desplazamiento pronunciado en la calidad de la respuesta de linfocitos T CD8 mediante la mayor proporción de TEM doble positivos y TCM triple positivos (figura 22A) como resultado de la pauta de PROSTVAC-V/F heteróloga en comparación con una pauta de dosificación homóloga. La sensibilización con una dosis de PROSTVAC-V 5 veces mayor no produjo ningún beneficio adicional en la magnitud o la calidad de la respuesta de linfocitos T CD8 (datos no mostrados). Además, los linfocitos T CD8 TEM doble positivos y TCM triple positivos produjeron mayores niveles de IFNy en una base celular que las células positivas simples (figura 22B). Esta producción de IFNy aumentada se observó en linfocitos T CD8 TEM y TCM independientemente de la pauta de dosificación.

Además, como se muestra en la figura 22, MVA-BN-HER2 induce linfocitos T específicos de antígeno tumoral que producen IFNy. La presente divulgación contempla que los TIL (linfocitos de infiltración tumoral) inducidos por virus que secretan IFNy pueden dar lugar a PD-L1 aumentado en células tumorales; sosteniendo el bloqueo de esta ruta en combinación con tratamiento vírico.

Ejemplo 42

Orientación inmunitaria de la respuesta de linfocitos T hacia PSA

Los ratones se trataron como se describe en el ejemplo 40. Se ensayaron esplenocitos combinados para actividad citotóxica específica de virus de la variolovacuna (VV) (paneles A y C a la izquierda) o específica de PSA (paneles A y C a la derecha) mediante citometría de flujo (% de linfocitos T CD8 CD107+ IFNy+) 14 días después del último tratamiento. Los esplenocitos se reestimularon durante una noche con péptidos E3L y F2L de la variolovacuna o con OPL de PSA en presencia de anticuerpo anti-CD107. El siguiente día, las células se tiñeron de forma intracelular para IFNy y con los marcadores superficiales CD127 y KLRG1. Se determinó el % de SLEC y DPEC citotóxicos específicos de antígeno por selección de células (CD8 CD127-KLRG1+) y (CD8+CD127+KLRG1+), respectivamente. Los gráficos muestran los datos representativos de dos experimentos realizados independientemente. Los resultados se muestran en la figura 23.

Se analizó el impacto de la pauta de dosificación de PROSTVAC - virus de variolovacuna - viruela aviar/F heteróloga en comparación con dosificación homóloga sobre las capacidades citotóxicas de subconjuntos de linfocitos T efectores específicos de vector frente a específicos de PSA. La dosificación VVV homóloga generó un número relativamente alto de SLEC (~50 %) y DPEC (~20 %) citotóxicos específicos de la variolovacuna (figura 23A y 23C), aunque menos de un 10 % de los linfocitos T CD8 citotóxicos SLEC o DPEC eran específicos de pSa . A la inversa, un 65 % de SLEC y un 30 % de los linfocitos T de memoria efectores DPEC altamente activos eran CTL específicos de PSA después de dosificación VFF heteróloga, mientras que menos de un 10 % constituían CTL específicos de la variolovacuna (figuras 23A y 23C). Por lo tanto, la pauta de PROSTVAC-V/F heteróloga provocó una mejora de 100 veces en la relación de respuestas de linfocitos T SLEC y DPEC dirigidos a PSA con respecto a dirigidos a la variolovacuna (figuras 23B y 23D). De nuevo, la sensibilización con 5 veces más PROSTVAC-V no produjo ningún beneficio adicional (datos no mostrados).

Ejemplo 43

Politerapia con CTLA-4 después de orientación inmunitaria

Ratones BALB/c macho (5/grupo) se tratan cada dos semanas con: tampón (control), sensibilización con PROSTVAC-V seguida de 2 refuerzos con PROSTVAC-F (VFF) como se describe en el ejemplo 40. Los ratones se tratan i.p. con anti-CTLA-4 (60 gg) en los días 1, 15 y 29 (a ), o en los días 15 y 29 (B), o en los días 16 y 30 (C) o en los días 17 y 31 (D). Se analizan las respuestas de linfocitos T específicos de PSA como se describe en los ejemplos 40, 41 y 42.

Como se describe en este documento y se demuestra por la presente solicitud, administrar un poxvirus recombinante que comprende un TAA en combinación con uno o más antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario es terapéuticamente eficaz a diversas dosificaciones. En particular, las combinaciones divulgadas son eficaces a dosificaciones que son menores que las dosificaciones usando uno o más antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario o tratamientos poxvíricos por sí mismos.

La presente solicitud demuestra adicionalmente que la eficacia de la combinación de poxvirus recombinante y antagonista o agonista del punto de control inmunitario se potencia enormemente dependiendo de la pauta de dosificación usada durante el tratamiento. Por ejemplo, administrar uno o más de los antagonistas o agonistas del punto de control inmunitario después de un tratamiento de poxvirus recombinante potencia enormemente la eficacia del tratamiento combinado. Además, aumentar una cantidad de dosificación de un antagonista o agonista del punto de control inmunitario después de un segundo tratamiento con poxvirus recombinante o posterior potencia enormemente la eficacia de los tratamientos combinados descritos en este documento.

La presente solicitud demuestra adicionalmente que las pautas de dosificación descritas en este documento son importantes para la eficacia enormemente potenciada de la politerapia de poxvirus recombinante y antagonista o agonista del punto de control inmunitario.

De forma significativa, la presente divulgación demuestra que un vector poxvírico que tiene un TAA, cuando se administra en combinación con un antagonista o agonista del punto de control inmunitario puede proporcionar efecto terapéutico aumentado independiente de del tipo de vector poxvírico. En particular, la presente divulgación demuestra efecto terapéutico aumentado cuando se usan múltiples tipos de poxvirus en el tratamiento combinado. Por ejemplo, se consiguieron efectos terapéuticos cuando se administró un poxvirus, tal como un ortopoxvirus o un avipoxvirus con un antagonista o agonista del punto de control inmunitario como se describe en este documento.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación farmacéutica o medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente humano con cáncer, comprendiendo la combinación o medicamento:

(a) una cantidad terapéuticamente eficaz de poxvirus recombinante que codifica un polipéptido que comprende al menos un antígeno asociado a tumor (TAA) seleccionado del grupo que consiste en antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado a superficie celular de mucina 1 (MUC-1), antígeno específico prostático (PSA), factor 2 de crecimiento epidérmico humano (HER-2) y Brachyury; y

(b) una cantidad subterapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario que es un antagonista de PD-1 o un antagonista de CTLA-4, en el que la combinación farmacéutica o medicamento comprende un antagonista de PD-1 y un antagonista de CTLA-4, y en el que cada uno de dicho antagonista de PD-1 y antagonista de CTLA-4 es un anticuerpo, un ARN de antisentido, o un ARNip.

2. La combinación o medicamento para uso de la reivindicación 1, en el que el antagonista de PD-1 comprende un anticuerpo anti-PD-1 y el antagonista de CTLA-4 comprende un anticuerpo anti-CTLA-4.

3. La combinación o medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el poxvirus se selecciona de un ortopoxvirus y un avipoxvirus.

4. La combinación o medicamento para uso de la reivindicación 3, en el que el ortopoxvirus es un virus de la variolovacuna, preferiblemente un virus Ankara de la variolovacuna modificado (MVA), más preferiblemente MVA-BN.

5. La combinación o medicamento para uso de la reivindicación 3, en el que el avipoxvirus es un virus de la viruela aviar.

6. La combinación o medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el al menos un TAA es el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2).

7. La combinación o medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el al menos un TAA comprende un antígeno CEA y un antígeno MUC-1.

8. La combinación o medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el al menos un TAA es antígeno específico prostático (PSA).

9. La combinación o medicamento para uso de la reivindicación 1, en el que el tratamiento del cáncer está dirigido contra cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, melanoma, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer renal, cáncer de hígado, melanoma, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de ovario o cáncer colorrectal.

10. La combinación o medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en el que al menos uno de los antagonistas del punto de control inmunitario se administra en una cantidad de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg del peso corporal del paciente, preferiblemente de aproximadamente 1 mg/kg del peso corporal del paciente.

11. La combinación o medicamento para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la cantidad terapéuticamente eficaz de un poxvirus recombinante en combinación con una cantidad subterapéuticamente eficaz de un antagonista del punto de control inmunitario de acuerdo con (b) se administra como parte de una pauta de sensibilización-refuerzo homóloga o heteróloga;

en el que la pauta de sensibilización-refuerzo homóloga comprende una primera dosis de sensibilización del poxvirus recombinante en combinación con el antagonista del punto de control inmunitario y una o más dosis de refuerzo posteriores de un mismo poxvirus recombinante en combinación con el antagonista del punto de control inmunitario; y en el que la pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga comprende una primera dosis de sensibilización del poxvirus recombinante en combinación con el antagonista del punto de control inmunitario y una o más dosis de refuerzo posteriores de un poxvirus recombinante diferente en combinación con el antagonista del punto de control inmunitario.

12. La combinación o medicamento para uso de la reivindicación 11, en el que el poxvirus recombinante en combinación con el antagonista del punto de control inmunitario se administra como parte de una pauta de sensibilización-refuerzo heteróloga, en el que el poxvirus recombinante de la primera dosis de sensibilización comprende un ortopoxvirus y el poxvirus recombinante de una o más dosis de refuerzo posteriores es un avipoxvirus.

13. La combinación o medicamento para uso de la reivindicación 11, en el que el ortopoxvirus se selecciona de virus de la variolovacuna, MVA o MVA-BN.