BR112017022134B1 - Uso de composição, mva?e3l e veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável - Google Patents

Abstract

USO DE MVA OU MVA?E3L COMO AGENTES IMUNOTERAPÊUTICOS CONTRA TUMORES SÓLIDOS. A presente divulgação refere-se ao vírus vaccinia modificado Ankara (MVA) ou ao MVA?E3L fornecido de forma intratumoral ou sistêmica como agente imunoterapêutico anticâncer, individualmente ou em combinação com um ou mais agentes de bloqueio de ponto de verificação imunológico para o tratamento de tumores sólidos malignos. Modalidades particulares referem-se à mobilização do sistema imunológico do hospedeiro a montar uma resposta imunológica contra o tumor.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO Pedidos Correlatos

[001] Este Pedido de patente reivindica prioridade do Pedido de Patente U.S. Provisório No de Série 62/149,484 depositada em 17 de abril de 2015. A divulgação inteira deste Pedido de patente provisório é incorporada aqui como referência em sua totalidade.

Apoio do Governo

[002] O trabalho divulgado na presente divulgação pode ter sido apoiado pelo No. de Concessão K08AI073736 e pelo No. de Concessão R56 AI095692 conferido pelos National Institutes of Health. O Governo dos E.U.A. pode ter direitos nesta invenção.

Listagem de Sequências

[003] O presente Pedido de patente contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é dessa maneira incorporada aqui como referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 15 de junho de 2016, é denominada 11000-005111- WO0_SL.txt e tem 3.493 bytes de tamanho. Campo da Invenção

[004] A presente divulgação refere-se de forma geral aos campos da oncologia, da virologia e da imunoterapia. Refere-se ao uso de poxvírus, especificamente os vírus vaccinia modificado Ankara (MVA) altamente atenuado e um vírus vaccinia modificado Ankara recombinante com deleção do fator de virulência E3 do vaccinia (MVAΔE3L) como agentes imunoterapêuticos para câncer bem como para o desenvolvimento de vetores imunoterapêuticos. Os poxvírus anteriores também podem ser utilizados em combinação com terapia de bloqueio de ponto de verificação imunológico.

Antecedente Sistema Imunológico e Câncer

[005] Tumores malignos são inerentemente resistentes às terapias convencionais e oferecem desafios terapêuticos significativos. A imunoterapia se tornou uma área de pesquisa em desenvolvimento e uma opção adicional para o tratamento de certos tipos de cânceres. A abordagem de imunoterapia se baseia no raciocínio lógico de que o sistema imunológico pode ser estimulado para identificar células de tumor e direcioná-los para destruição.

[006] Inúmeros estudos apoiam a importância da presença diferencial dos componentes do sistema imunológico na progressão do câncer (1 )(Jochems et al., Exp Biol Med, 236(5): 567-579 (2011)). Dados clínicos sugerem que altas densidades de linfócitos que se infiltram no tumor estão ligadas a melhor resultado clínico (2)(Mlecnik et al., Cancer Metastasis Rev.; 30: 5-12, (2011)). A correlação entre uma infiltração de linfócitos robusta e a sobrevivência do paciente foi relatada em vários tipos de câncer, incluindo melanoma, câncer de ovário, de cabeça e pescoço, de mama, urotelial, colorretal, pulmonar, hepatocelular, de vesícula biliar e de esôfago (3)(Angell et al., Current Opinion in Immunology, 25:1-7, (2013)). Os infiltrados imunológicos de tumor incluem macrófagos, células dendríticas (DC), mastócitos, células natural killer (NK), linfócitos naive e de memória, células B e células T efetoras (linfócitos T), primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígenos expressos pelas células de tumor e pela destruição subsequente das células de tumor por células T citotóxicas.

[007] Apesar da apresentação de antígenos por células cancerosas e da presença de células imunológicas que poderiam potencialmente reagir contra células de tumor, em muitos casos o sistema imunológico não é ativado ou é suprimido positivamente. A chave para este fenômeno é a capacidade dos tumores de proteger a si mesmos da resposta imunológica compelindo as células do sistema imunológico a inibir outras células do sistema imunológico. Os tumores desenvolvem um número de mecanismos imunomoduladores para escapar das respostas imunológicas antitumor. Por exemplo, as células de tumor secretam citocinas de inibição imunológica (tais como TGF-β) ou induzem células imunológicas, tais como células reguladoras T CD4+ e macrófagos, nas lesões de tumor a secretar estas citocinas. Os tumores também possuem a capacidade de direcionar as células T CD4+ a expressarem o fenótipo regulador. O resultado total é respostas de células T reduzidas e indução de apoptose ou capacidade imunológica antitumor reduzida de células T CD8+ citotóxicas. Adicionalmente, a expressão alterada associada ao tumor de MHC de classe I sobre a superfície das células de tumor as torna 'invisíveis' para a resposta imunológica (4)(Garrido et al. Cancer Immunol. Immunother. 59(10), 1601-1606 (2010)). A inibição de funções de apresentação de antígeno e de célula dendrítica (DC) contribui adicionalmente para a evasão da imunidade antitumor (5)(Gerlini et al. Am. J. Pathol. 165(6), 1853-1863 (2004)).

[008] Além disso, a natureza imunossupressora local do microambiente de tumor, junto com a edição imunológica, pode levar à evasão de subpopulações de células cancerosas que não expressam os antígenos alvo. Assim, a descoberta de uma abordagem que promoveria a preservação e/ou a restauração de atividades antitumor do sistema imunológico seria um benefício terapêutico considerável.

[009] Os pontos de verificação imunológicos foram implicados na regulação para menos mediada por tumor da imunidade antitumor e utilizados como alvos terapêuticos. Foi demonstrado que a disfunção de células T ocorre concorrentemente com uma expressão induzida dos receptores inibidores, CTLA-4 e polipeptídeo de morte programada 1 (PD- 1), membros dos receptores da família CD28. PD-1 é um membro inibidor da família CD28 de receptores que em adição a PD-1 inclui CD28, CTLA- 4, ICOS e BTLA. Entretanto, embora a promessa em relação ao uso de imunoterapia no tratamento de melanoma tenha sido enfatizada pelo uso clínico e também pela aprovação de órgãos reguladores de fármacos anti- CTLA-4 (ipilimumab) e anti-PD-1 (por exemplo, pembrolizumab e nivolumab) a resposta dos pacientes a estas imunoterapias foi limitada. Testes clínicos recentes, concentrados no bloqueio destes sinais inibidores nas células T (por exemplo, CTLA-4, PD-1 e o ligante de PD-1 PD-L1), mostraram que a reversão da supressão de células T é crítica para imunoterapia bem sucedida (6, 7)(Sharma et al., Science 348(6230), 56-61 (2015); Topalian et al., Curr Opin Immunol. 24(2), 202-217 (2012)). Estas observações destacam a necessidade pelo desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para armar o sistema imunológico contra câncer.

Poxvirus

[0010] Os poxvírus, tais como vírus vaccinia engenheirados, estão na dianteira como terapia oncolítica para cânceres metastásicos (8)(Kirn et al., Nature Review Cancer 9, 64-71 (2009)). Os vírus vaccinia são vírus de DNA grandes, que possuem um ciclo de vida rápido e disseminação hematogênica eficiente para tecidos distantes (9)(Moss, In Fields Virology (Lippincott Williams & Wilkins, 2007), pp.2905-2946). Os poxvírus são bem adequados como vetores para a expressão de múltiplos transgenes nas células cancerosas e assim para aumentar a eficácia terapêutica (10)(Breitbach et al., Current pharmaceutical biotechnology 13, 17681772 (2012)). Estudos pré-clínicos e testes clínicos demonstraram a eficácia de se utilizar vírus vaccinia oncolíticos e outros poxvírus para o tratamento de cânceres avançados refratários à terapia convencional (11- 13)(Park et al., Lacent Oncol 9, 533-542 (2008); Kirn et al., PLoS Med 4, e353 (2007); Thorne et al., J Clin Invest 117, 3350-3358 (2007)). A terapia oncolítica à base de poxvírus possui a vantagem de matar células cancerosas através da combinação de lise celular, apoptose e necrose. Esta também aciona a via de sensibilização do sistema imunológico inato que facilita o recrutamento de células imunológicas para os tumores e o desenvolvimento de respostas imunológicas adaptavas antitumor. As cepas de vaccinia oncolíticas atuais em testes clínicos (JX-594, por exemplo) utilizam vaccinia do tipo selvagem com deleção da timidina quinase para aumentar a seletividade do tumor e com a expressão de transgenes tal como fator estimulador de colônia de macrófagos granulócitos (GM-CSF) para estimular as respostas imunológicas (10)(Breitbach et al., Curr Pharm Biotechnol 13, 1768-1772 (2012)). Muitos estudos mostraram, entretanto, que o vaccinia do tipo selvagem possui efeitos supressores imunológicos sobre as células apresentadoras de antígenos (APCs) (14-17)(Engelmayer et al., J Immunol 163, 6762-6768 (1999); Jenne et al., Gene therapy 7, 1575-1583 (2000); P. Li et al., J Immunol 175, 6481-6488 (2005); Deng et al., J Virol 80, 9977-9987 (2006)) e assim se adicionam aos efeitos imunossupressores e imunoevasivos de tumores. Em contraste, o vírus vaccinia modificado Ankara (MVA), uma cepa de vaccinia altamente atenuada possui efeitos de ativação do sistema imunológico moderados (18, 19)(Drillien et al., J Gen Virol 85, 2167-75 (2004); Dai et al., PLoS Pathog 10(4), e1003989 (2014).

[0011] O vírus vaccinia modificado Ankara (MVA) é uma cepa de vaccinia altamente atenuada que é um vetor vacinal importante para doenças infecciosas e cânceres. O MVA foi derivado da cepa de vaccinia através de mais de 570 passagens em fibroblastos embrionários de frango. O MVA possui uma deleção de 31 kb do genoma de vaccinia original e é não replicativo na maioria das células de mamíferos. O MVA foi utilizado em mais de 120.000 pessoas durante a vacinação contra a varíola patrocinada pela WHO e mostrou ser muito seguro para uso humano. Devido a sua segurança e sua capacidade de expressar antígenos estranhos, o MVA tem sido investigado como um vetor vacinal contra HIV, tuberculose, malária, influenza, coronavírus e CMV, bem como cânceres (20-25) (Sutter et al., Current drug targets. Infectious disorders 3, 263-271 (2003); Gomez et al., Curr Gene Ther 8, 97-120 (2008); Gomez et al., Curr Gene Ther 11, 189-217 (2011); Goepfert et al., J Infect Dis 203, 610-619 (2011); Wyatt et al., Virology 372, 260-272 (2008); Garcia et al., Vaccine 29, 8309-8316 (2011)).

[0012] A investigação do MVA como agente terapêutico para câncer foi até agora limitada ao seu uso como um vetor vacinal para expressar antígenos de tumor (26, 27)(Tagliamonte et al. Hum Vaccin Immunother 10, 3332-3346 (2014); Verardi et al., Hum Vaccin Immunother 8, 961-970 (2012)). Vários antígenos de tumor foram expressos por vetores à base de MVA e alguns vírus recombinantes estão em vários estágios de testes clínicos. Por exemplo, MVA-PSA-PAP que expressa tanto antígeno específico para próstata (PSA) quanto fosfatase ácida da próstata (PAP) está em testes clínicos para pacientes com câncer de próstata metastásico. O vírus MVA-brachyury-TRICOM recombinante que expressa o antígeno de tumor brachyury e moléculas coestimuladoras de células T também está em testes clínicos para pacientes com cânceres metastásicos. O vírus recombinante MVA-p53 que expressa o supressor de tumor p53, também em testes clínicos, mostrou ser seguro. Outros antígenos de tumor que foram direcionados incluem Her2, hMUC-1, TWIST etc.

[0013] Embora o MVA seja altamente atenuado e moderadamente imunoestimulador, este mantém vários genes virais supressores imunológicos, incluindo um fator de virulência importante, E3. MVAΔE3L, um vírus MVA recombinante adicionalmente atenuado através da deleção do fator virulento de vaccinia E3, é incapaz de se replicar em fibroblastos embrionários de frango primários (CEFs), mas mantém sua capacidade de replicação em células BHK-21 de rim de hamster bebê (28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003). MVAΔE3L é capaz de replicar genomas de DNA virais em CEFs e é deficiente na síntese de proteínas tardias virais (28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003). Também induz apoptose em CEF (28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)). A infecção com MVAΔE3L de células HeLa tinha efeitos similares, com replicação viral diminuída, transcrição e tradução de genes tardios virais (29)(Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)). MVAΔE3L também induz apoptose em células HeLa, possivelmente através da ativação da via mitocondrial (29)(Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)). O dsRNA é produzido durante a transcrição de genes intermediários, que pode levar à ativação de 2’-5’-oligoadenilato sintase/RNase L e Proteína Quinase R (PKR). Em MEFs deficientes em relação à PKR, o MVAΔE3L ganha sua capacidade de expressar proteínas intermediárias e tardias ((29)(Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)).

[0014] Um estudo sugere que a proteína pró-apoptótica Noxa desempenha uma função na indução de apoptose de MVAΔE3L (30)(Fischer et al., Cell Death Differ 13, 109-118 (2006)). Embora um estudo inicial tenha mostrado que MVAΔE3L induz níveis mais altos de IFN do tipo I em CEFs do que o MVA, o mecanismo exato não foi completamente elucidado (28)(Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003).

[0015] Um MVAΔE3L foi descrito na Patente US 7049145 incorporada como referência. Este é competente em relação à infecção, mas não replicativo na maioria das células de mamífero inclusive de camundongo e ser humano.

[0016] Esta divulgação se concentra no fornecimento intratumoral de MVA ou MVAΔE3L como agentes imunoterapêuticos anticâncer. Era esperado que o fornecimento intratumoral de MVA ou MVAΔE3L induzisse respostas imunológicas inatas partindo das células imunológicas que se infiltram no tumor (por exemplo, leucócitos), células de tumor e células de estroma associadas com tumor e levasse à indução de IFN do tipo I e citocina pró-inflamatórias e quimiocinas, que resultaria na alteração do microambiente supressor imunológico de tumor.

[0017] A descoberta recente de neoantígenos de tumor em vários tumores sólidos indica que os tumores sólidos carregam neoantígenos únicos que geralmente diferem de pessoa para pessoa (31, 32)(Castle et al., Cancer Res 72, 1081-1091 (2012); Schumacher et al., Science 348, 69-74 (2015)). Os vírus recombinantes divulgados nesta invenção não funcionam através da expressão de antígenos de tumor. O fornecimento intratumoral dos presentes vírus de MVA recombinantes permite a apresentação cruzada eficiente de neoantígenos de tumor e a produção de imunidade adaptativa antitumor dentro dos tumores (e também se estendendo de forma sistêmica) e, portanto, leva à “vacinação de câncer in situ” utilizando antígenos de diferenciação de tumor e neoantígenos expressos pelas células de tumor na montagem de uma resposta imunológica contra o tumor.

[0018] Apesar da presença de neoantígenos gerados por mutações somáticas dentro dos tumores, as funções de células T específicas para antígenos de tumor são frequentemente são suspensas por vários mecanismos de inibição (33)(Mellman et al., Nature 480, 480-489 (2011)). Por exemplo, a regulação para mais do antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA-4) sobre células T ativadas pode competir com o coestimulador de célula T CD28 pela interação com CD80 (B71)/CD86 (B7.2) sobre as células dendríticas (DCs) e dessa maneira inibir a ativação e a proliferação de células T. O CTLA-4 também é expressos sobre células T reguladoras (Treg) e desempenha uma função importante na mediação da função inibidora de Tregs (34, 35)(Wing et al., Science 322, 271-275 (2008); Peggs, et al., J Exp Med 206, 1717-1725 (2009)). Em adição, a expressão de PD-L/PD-L2 sobre as células de tumor pode levar à ativação do receptor inibidor da família CD28, PD-1, levando à exaustão das células T. A imunoterapia que utiliza anticorpos contra receptores inibidores, tais como CTLA-4 e polipeptídeo de morte programada 1 (PD- 1), mostrou atividades pré-clínicas notáveis em estudos com animais e respostas clínicas em pacientes com cânceres metastásicos e foi aprovada pela FDA para o tratamento de melanoma metastásico, câncer pulmonar de células não pequenas, bem como carcinoma de célula renal (6, 36- 39)(Leach et al., Science 271, 1734-1746 (1996); Hodi et al., NEJM 363, 711-723 (2010); Robert et al., NEJM 364, 2517-2526 (2011); Topalian et al., Cancer Cell 27, 450-461 (2012) ; Sharma et al., Science 348(6230), 56-61 (2015)).

Melanoma

[0019] Melanoma, um dos cânceres mais mortais, é o câncer que cresce mais rápido nos EUA e no mundo todo. Sua incidência aumentou em 50% das mulheres caucasianas jovens desde 1980, primariamente devido à exposição ao sol em excesso e ao uso de câmaras de bronzeamento. De acordo com a American Cancer Society, aproximadamente 78.000 pessoas nos EUA serão diagnosticadas com melanoma em 2015 e quase 10.000 pessoas (ou uma pessoa por hora) morrerão de melanoma. Na maioria dos casos, o melanoma avançado é resistente a terapias convencionais, incluindo quimioterapia e radiação. Como um resultado, pessoas com melanoma metastásico possuem um prognóstico muito ruim, com uma expectativa de vida de apenas 6 até 10 meses. A descoberta de que aproximadamente 50% dos melanomas possuem mutações em BRAF (um gene promotor de tumor importante) abriu a porta para terapia direcionada nesta doença. Testes clínicos iniciais com inibidores de BRAF mostraram respostas notáveis, mas infelizmente não sustentáveis em pacientes com melanomas com mutações de BRAF. Portanto, estratégias de tratamento alternativas para estes pacientes, bem como outros com melanoma sem mutações de BRAF, são urgentemente necessárias.

[0020] Os dados patológicos humanos indicam que a presença de infiltrados de células T dentro das lesões de melanoma se correlaciona positivamente com sobrevivência mais longa do paciente (40)(Oble et al. Cancer Immun. 9, 3 (2009)). A importância do sistema imunológico na proteção contra melanoma é adicionalmente sustentada pelo sucesso parcial de imunoterapia, tais como os ativadores imunológicos IFN-α2b e IL-2 (41)(Lacy et al. Expert Rev Dermatol 7(1):51-68 (2012)) bem como as respostas clínicas sem precedentes dos pacientes com melanoma metastásico à terapia de ponto de verificação imunológico, incluindo anti- CTLA-4 e anti-PD-1/PD-L1 como um agente individual ou em terapia de combinação (6, 7, 37, 42-45)(Sharma e Allison, Science 348(6230), 56-61 (2015); Hodi et al., NEJM 363(8), 711-723 (2010); Wolchok et al., Lancet Oncol. 11(6), 155-164 (2010); Topalian et al., NEJM 366(26), 2443-2454 (2012); Wolchok et al., NEJM 369(2), 122-133 (2013); Hamid et al., NEJM 369(2), 134-144 (2013); Tumeh et al., Nature 515(7528), 568-571 (2014). Entretanto, muitos pacientes falham em responder à terapia de bloqueio de ponto de verificação imunológico sozinha. A adição de viroterapia poderia superar a resistência ao bloqueio de ponto de verificação imunológico, que é sustentado por modelos de tumor em animais (46)(Zamarin et al., Sci Transl Med 6(226), 2014). IFN do tipo I e a via de sensibilização de DNA citoplasmático na imunidade de tumor.

[0021] O IFN do tipo I desempenha funções importantes na imunidade antitumor do hospedeiro (47) (Fuertes et al., Trends Immunol 34, 67-73 (2013)). Os camundongos deficientes em relação a IFNAR1 são mais suscetíveis ao desenvolvimento de tumores após a implantação de células de tumor; a indução espontânea de células T específicas para tumor também é defeituosa em camundongos deficientes em relação a IFNAR1 (48, 49) (Diamond et al., J Exp Med 208, 1989-2003 (2011); Fuertes et al., J Exp Med 208, 2005-2016 (2011)). Estudos mais recentes mostraram que a via de sensibilização de DNA citoplasmático é importante na sensibilização imunológica inata de DNA derivado de tumor, que leva ao desenvolvimento de imunidade de células T CD8+ antitumor (50) (Woo et al., Immunity 41, 830-842 (2014)). Esta via também desempenha uma função na imunidade antitumor induzida por radiação (51) (Deng et al., Immunity 41, 843-852 (2014)). Embora as respostas de células T antitumor espontâneas possam ser detectadas em pacientes com cânceres, os cânceres eventualmente vencem a imunidade antitumor do hospedeiro na maioria dos pacientes. Novas estratégias para alterar o microambiente de supressão imunológica do tumor seriam benéficas para terapia de câncer.

Sumário

[0022] A presente divulgação refere-se à descoberta de que tanto MVA quanto MVAΔE3L possuem propriedades que podem ser utilizadas eficientemente no desenvolvimento de imunoterapias contra cânceres. A injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L leva à regressão de tumor e até mesmo à erradicação e à produção de imunidade antitumoral sistêmica. Portanto, tanto MVA quanto MVAΔE3L podem ser utilizados como imunoterapia para o tratamento de tumores sólidos. Além disso, é previsto que a combinação de fornecimento intratumoral de viroterapia à base de MVA e bloqueio de ponto de verificação imunológico (ou terapia agonista de ponto de verificação), fornecida de forma sistêmica ou de forma intratumoral, leve a atividades antitumorais aprimoradas em tumores que receberam injeção bem como tumores distantes que não receberam injeção.

[0023] Os presentes inventores observaram que a infecção com MVA de células dendríticas convencionais (cDCs) induz o IFN do tipo I através da via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada pelo sensor de DNA citoplasmático recém-descoberto cGAS (GMP-AMP cíclico sintase) e seu adaptador STING (estimulador de genes IFN). Em contraste, a infecção com vaccinia do tipo selvagem das cDCs falha em induzir o IFN do tipo I. Também observaram que a infecção das cDCs com um vírus MVA recombinante com deleção do fator de virulência E3 do vírus vaccinia (MVAΔE3L) induz níveis mais altos de IFN do tipo I que o MVA. Esta também ativa as vias de sensibilização do sistema imunológico inato para o vírus MVAΔE3L nas cDCs e induz IFN do tipo I, citocina inflamatórias e quimiocinas e apoptose em células cancerosas através de MVA e MVAΔE3L.

[0024] Estas observações levaram à possibilidade de utilizar estes vírus vaccinia modificados altamente atenuados como ativadores imunológicos para alterar o microambiente supressor imunológico induzido por tumor através da indução de IFN do tipo I e outras citocinas inflamatórias e quimiocinas nas células de tumor bem como nas células imunológicas (em outras palavras, para induzir respostas imunológicas antitumor no hospedeiro ou para aprimorar respostas antitumor que já podem estar em andamento e para reverter sua supressão). Isto por sua vez leva à apresentação de antígeno de tumor mais eficiente e à produção e à ativação de células T CD8+ citotóxicas antitumor, células T CD4+ efetoras, bem como à redução de células T reguladoras CD4+ de supressão imunológica e macrófagos associados ao tumor. Devido ao fato de que MVA e MVAΔE3L são vetores vacinais seguros, o uso de tais vetores virais dentro do tumor permite a liberação de antígeno de tumor, a apresentação eficiente e a produção de respostas de células T efetoras e de memória antitumor e a produção de anticorpo antitumor. De fato, os inventores observaram que MVA e MVAΔE3L utilizados de forma intratumoral levam à ativação de células dendríticas e maior apresentação de antígenos de tumor (incluindo antígenos virais oncogênicos, antígenos de diferenciação de tumor e neoantígenos de tumor).

[0025] A injeção localizada (por exemplo, intratumoral) de MVA e MVAΔE3L pode ser utilizada para vários estágios de tumores. Para câncer no estágio inicial, a viroterapia pode ser utilizada 2-3 semanas antes da remoção cirúrgica do tumor. Durante este período de tempo, o hospedeiro teria desenvolvido imunidade adaptativa antitumor sistêmica. Para câncer avançado, a viroterapia pode ser utilizada em combinação com outras modalidades de tratamento, incluindo cirurgia, quimioterapia, terapia direcionada, radiação e terapia de pontos de verificação imunológicos, que serão detalhados a seguir.

[0026] Com base nos resultados obtidos pelos presentes inventores com MVA inativado e descritos na PCT US2016/019663 depositada em 25 de fevereiro de 2016, incorporada como referência em sua totalidade para todas as finalidades, os presentes inventores levantaram a hipótese de que a injeção intratumoral de MVA ou MVAΔE3L forneceria efeitos benéficos adicionais a uma abordagem de direcionamento de PD-1 ou CTLA-4, através da indução de IFN do tipo I nas células imunológicas e nas células cancerosas, alterando o ambiente supressor imunológico do tumor através da ativação de células imunológicas incluindo células dendríticas bem como da facilitação da apresentação de antígeno de tumor.

[0027] Em um aspecto, a divulgação é direcionada a um método para tratamento de um tumor maligno sólido em um indivíduo que compreende o fornecimento às células de tumor do indivíduo de uma quantidade de MVA ou MVAΔE3L eficiente para induzir o sistema imunológico do indivíduo a montar uma resposta imunológica contra o tumor, por exemplo, como mostrado anteriormente neste Sumário de forma a realizar um ou mais dos seguintes (independentemente da ordem): reduzir o tamanho do tumor, erradicar o tumor, inibir o crescimento do tumor ou inibir a metástase ou o crescimento metastásico do tumor.

[0028] Em outro aspecto, a divulgação é direcionada a um método para tratamento de um tumor maligno que compreende: • o fornecimento às células de tumor do indivíduo de uma quantidade de MVA ou MVAΔE3L eficiente para induzir o sistema imunológico do indivíduo a montar uma resposta imunológica contra o tumor.

[0029] Em algumas modalidades uma ou mais das características específicas a seguir também estão presentes: • o recrutamento e a ativação de células T efetoras são acompanhados por uma redução de células CD4+ reguladoras no tumor; • o tumor é melanoma ou carcinoma de cólon; • um regime de fornecimento periódico do MVA ou do MVAΔE3L é mantido até induzir a regressão ou a erradicação do tumor; • um regime de fornecimento periódico do MVA ou do MVAΔE3L é mantido durante várias semanas, meses ou anos ou indefinidamente enquanto persistirem os benefícios; • um regime de fornecimento periódico do MVA ou do MVAΔE3L é mantido indefinidamente até que a dose máxima tolerada seja atingida; • o fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L ocorre por injeção parenteral; • o fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L ocorre por injeção intratumoral; • o fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L ocorre por injeção intravenosa; • o indivíduo é um ser humano; • o MVA ou o MVAΔE3L é fornecido em uma dosagem por administração dentro da faixa de aproximadamente 105 - 1010 unidades formadoras de placas (ufp); • o MVA ou o MVAΔE3L é fornecido em uma dosagem por administração dentro da faixa de aproximadamente 106 até aproximadamente 109 unidades formadoras de placas (ufp); • a quantidade fornecida é suficiente para infectar todas as células de tumor; • o fornecimento é repetido com uma frequência dentro da faixa de uma vez ao mês até duas vezes por semana; • o tratamento continua durante um período de semanas, meses ou anos; • o fornecimento é repetido com uma frequência dentro da faixa de uma vez ao mês até duas vezes por semana; • o melanoma é melanoma metastásico.

[0030] O fornecimento de MVA ou MVAΔE3L no local do tumor induz o sistema imunológico de um indivíduo afligido com um tumor sólido maligno a montar uma resposta imunológica contra o tumor. A estimulação do sistema imunológico do indivíduo contra o tumor pode se manifestar (e pode de fato ser testada) através de um ou mais dos efeitos imunológicos a seguir: • um aumento nas células T CD8+ citotóxicas e CD4+ efetoras antitumor dentro do tumor e/ou nos nódulos linfáticos que drenam o tumor; • indução da maturação das células dendríticas que se infiltram no dito tumor através da indução de IFN do tipo I; • indução das células T efetoras antitumor ativadas no indivíduo que reconhecem células de tumor dentro do tumor e/ou nos nódulos linfáticos que drenam o tumor; • redução de células T CD4+ supressoras (reguladoras) imunológicas dentro do tumor; e • indução de células do tumor a expressarem MHC de classe I sobre sua superfície e a produzir IFN do tipo I.

[0031] Mais particularmente, em um aspecto, a presente divulgação é direcionada a um método para tratamento de um indivíduo afligido com um tumor sólido maligno, o método compreendendo o fornecimento às células do tumor de um vírus vaccinia modificado selecionado do grupo de MVA e MVAΔE3L e combinações dos mesmos e dessa maneira o tratamento do tumor.

[0032] Em algumas modalidades, a quantidade de dito vírus é eficiente para realizar um ou mais dos seguintes: a. induzir o sistema imunológico do indivíduo a montar uma resposta imunológica contra o tumor ou melhorar uma resposta em andamento pelo sistema imunológico contra o tumor; b. reduzir o tamanho do tumor; c. erradicar o tumor; d. inibir o crescimento do tumor; e. inibir a metástase do tumor; e f. reduzir ou erradicar tumor metastásico.

[0033] Em outro aspecto a divulgação fornece um método para tratamento de um tumor maligno sólido em um indivíduo que compreende o fornecimento às células de tumor do indivíduo de uma quantidade do MVA ou do MVAΔE3L ou uma combinação dos mesmos eficiente para induzir o sistema imunológico do indivíduo a montar uma resposta imunológica contra o tumor ou para aumentar uma resposta imunológica em andamento do dito indivíduo contra o tumor, de forma a realizar um ou mais dos seguintes: reduzir o tamanho do tumor, erradicar o tumor, inibir o crescimento do tumor, inibir o crescimento metastásico do tumor, induzir a apoptose de células de tumor ou prolongar a sobrevivência do indivíduo.

[0034] Em outro aspecto, a presente divulgação é direcionada a um método para tratamento de um tumor maligno sólido em um indivíduo que compreende o fornecimento a um tumor do indivíduo de uma quantidade de vírus vaccinia modificado Ankara (MVA) ou MVAΔE3L ou uma combinação de ambos eficiente para realizar pelo menos um dos efeitos imunológicos a seguir: a. aumentar pelo menos uma das células T CD8+ efetoras e células T CD4+ efetoras dentro do tumor e/ou nos nódulos linfáticos que drenam o tumor; b. induzir a maturação das células dendríticas que se infiltram no dito tumor através da indução de IFN do tipo I; c. reduzir as células T CD4+ supressoras (reguladoras) imunológicas dentro do tumor; d. reduzir os macrófagos associados ao tumor supressores imunológicos (TAM) dentro do tumor; e. induz a produção de IFN do tipo I, citocinas inflamatórias e quimiocinas nas células imunológicas e nos fibroblastos do estroma.

[0035] Em algumas modalidades de cada um dos aspectos a seguir: f. MVA ou o MVAΔE3L não está portando ácido nucleico que codifica ou expressa um antígeno de tumor; g. tumor inclui tumor localizado no sítio de MVA ou MVAΔE3L ou tumor localizado em qualquer lugar no corpo do indivíduo; h. recrutamento e a ativação de células T CD4+ efetoras são acompanhados por uma redução de células CD4+ reguladoras no dito tumor. i. tumor é melanoma ou carcinoma de cólon ou outro tumor sólido; j. fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L é mantido até induzir regressão ou erradicação do tumor; k. fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L é mantido durante várias semanas, meses ou anos ou indefinidamente enquanto persistirem os benefícios ou uma dose máxima tolerada for atingida; l. fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L é mantido indefinidamente até que a dose máxima tolerada seja atingida; m. fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L ocorre por injeção parenteral, por exemplo, intratumoral ou intravenosa; n. indivíduo é um ser humano; o. MVA ou o MVAΔE3L é fornecido em uma dosagem por administração dentro da faixa de aproximadamente 105 - 1010 unidades formadoras de placas (ufp); p. MVA ou o MVAΔE3L é fornecido em uma dosagem por administração dentro da faixa de aproximadamente 106 até aproximadamente 109 unidades formadoras de placas (ufp); q. quantidade fornecida é suficiente para infectar todas as células de tumor; r. fornecimento é repetido com uma frequência dentro da faixa de uma vez ao mês até duas vezes por semana; o fornecimento é repetido uma vez por semana; o melanoma é melanoma metastásico; o MVA é MVAΔE3L.

[0036] Ainda em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para tratamento de um tumor maligno em um indivíduo, o método compreendendo o fornecimento às células de tumor do indivíduo de um vírus selecionado do grupo que consiste de vaccinia modificado Ankara (MVA), MVAΔE3L e uma combinação dos mesmos em uma quantidade eficiente para induzir o sistema imunológico do indivíduo a montar uma resposta imunológica contra o tumor ou para aumentar uma resposta imunológica em andamento do dito indivíduo contra o tumor e a administração conjunta ao indivíduo de uma segunda quantidade de um agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico ou um agonista de ponto de verificação imunológico eficiente para bloquear mecanismos supressores imunológicos dentro do tumor.

[0037] Em modalidades mais específicas: os mecanismos supressores imunológicos são induzidos pelas células de tumor, células de estroma ou células imunológicas que se infiltram no tumor; a administração ocorre por rota parental; o fornecimento ocorre por injeção intratumoral e a administração ocorre por rota intravenosa; tanto o fornecimento quanto a administração ocorrem por rota intravenosa; tanto o fornecimento quanto a administração ocorrem por injeção intratumoral; o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico é selecionado do grupo que consiste de inibidores de PD-1, inibidores de PD-L1, inibidores de CTLA4, anticorpos inibidores contra LAG-3 (gene de ativação de linfócito 3), TIM3 (Imunoglobulina de célula T e Mucina-3), B7-H3 e TIGIT (imunorreceptor de células T com Ig e domínios ITIM); e o agonista de ponto de verificação imunológico é selecionado do grupo que consiste de anticorpo anti-ICOS anticorpo anti-OX40 anticorpo agonista contra 4-1BB (CD137) e contra GITR; qualquer um dos ditos inibidores ou agonistas é um anticorpo; o tumor é melanoma primário ou metastásico ou carcinoma de cólon primário ou metastásico ou outro tumor sólido. o vírus é fornecido e o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico é administrado cada um de acordo com sua própria programação de administração de intervalos espaçados; uma primeira dose do vírus é fornecida primeiro e após um período de tempo decorrido é administrada uma primeira dose do agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico; o fornecimento e a administração ocorrem em paralelo durante o mesmo período total de tempo; um ou amos o vírus e o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico são respectivamente fornecidos e administrados durante um período de tempo de várias semanas, meses ou anos ou indefinidamente enquanto persistirem os benefícios e uma dose máxima tolerada não for atingida; o vírus é fornecido em uma dosagem por administração dentro da faixa de aproximadamente 105 - 1010 unidades formadoras de placas (ufp); o vírus é fornecido em uma dosagem por administração dentro da faixa de aproximadamente 106 até aproximadamente 109 unidades formadoras de placas (ufp); o fornecimento do vírus é repetido com uma frequência dentro da faixa de uma vez ao mês até duas vezes por semana; o fornecimento do vírus é repetido uma vez por semana; o vírus é MVAΔE3L; o indivíduo é um ser humano; o vírus é MVA; o vírus e o agente de bloqueio ou agonista de ponto de verificação imunológico são administrados simultaneamente; o vírus e o agente de bloqueio ou agonista de ponto de verificação imunológico são administrados na mesma composição; o MVA e o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico são fornecidos de forma intratumoral; o vírus e o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico são administrados sequencialmente; o MVA inativado e o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico são fornecidos de forma intratumoral.

[0038] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece uma composição para uso no tratamento de um tumor sólido que compreende uma quantidade de um vírus vaccinia modificado selecionado do grupo que consiste de MVA e MVAΔE3L e combinações dos mesmos eficiente para induzir o sistema imunológico de um hospedeiro ao qual a dita composição será administrada a montar uma resposta imunológica contra o tumor ou para aumentar uma resposta imunológica em andamento do hospedeiro contra o tumor; e um carreador ou um diluente farmaceuticamente aceitável.

[0039] Em modalidades mais específicas da composição a quantidade eficiente fica dentro da faixa de aproximadamente 105 - 1010 unidades formadoras de placas (ufp) em uma forma de dosagem unitária; ou a quantidade eficiente fica dentro da faixa de 106 até 109 ufp. Breve Descrição dos Desenhos

[0040] A FIG. 1 é uma série de representações gráficas de dados que mostram que MVA induz a produção de IFN do tipo I em cDCs de camundongo. A FIG. 1A são gráficos que mostram os níveis de secreção de IFN-α e IFN-β em GM-CSF-BMDCs em 1, 4, 8, 14 e 22 horas após a infecção com WT VAC ou MVA. A FIG. 1B são gráficos de barras que mostram os níveis de mRNA de IFNA4 e IFNB em GM-CSF-BMDCs em 6 horas após a infecção com WT VAC ou MVA.

[0041] A FIG. 2 é uma série de gráficos de barras que mostram que os fatores de transcrição IRF3/IRF7 e a alça de retroalimentação positiva de IFN do tipo I mediada por IFNAR1 são necessários para a indução de IFN do tipo I em cDCs de camundongo pelo MVA. As FIGS. 2A-2C são gráficos de barras de concentrações de IFN-α e IFN-β em GM-CSF- BMDCs geradas partindo de camundongos IRF3-/- (2A), IRF7-/- (2B), IFNAR1-/- (2C) ou seus controles WT de idade correspondente. Os dados são médias ± SEM (n= 3). É mostrado um experimento representativo, repetido duas vezes. *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

[0042] A FIG. 3 é uma série de representações gráficas que mostram que STING é necessário para a indução de IFN do tipo I e fosforilação de IRF3 pelo MVA em BMDCs. A FIG. 3A mostra gráficos de barras de níveis de secreção de IFN-α e IFN-β em célula GM-CSF-BMDCs gerados partindo de camundongos Sting+/+ e StingGt/Gt, estimulados com LPS ou infectados com MVA. A FIG. 3B mostra os níveis de expressão de mRNA de IFNA4 e IFNB em célula GM-CSF-BMDCs gerados partindo de camundongos Sting+/+ e StingGt/Gt e infectados com MVA. A FIG. 3C é uma imagem de immunoblot escaneada que mostra os níveis de proteína de phospho- TBK1, TBK1, fosfosserina-396 de IRF3, IRF3 e GAPDH. “hpi”, horas após a infecção, “M”, controle de infecção simulada. A FIG. 3D são gráficos de barras que mostram os níveis de secreção de IFN-α e IFN-β em camundongos StingGt/Gt, IRF3-/- e de controle WT C57B/6 de idade correspondente infectados com MVA. Os dados são médias ± SD. Os resultados mostrados são representativos de dois experimentos independentes.

[0043] A FIG. 4 é uma série de representações gráficas que demonstram que cGAS é o sensor de DNA citoplasmático crítico para infecção com MVA de cDCs. A FIG. 4A são gráficos de barras que mostram níveis de secreção de IFN-α e IFN-β em GM-CSF-BMDCs gerados partindo de camundongos cGAS-/- e seus controles WT de idade correspondente e infectados com MVA. Os dados são médias ± SEM (n=3). É mostrado um experimento representativo, repetido duas vezes (***, p < 0,001). A FIG. 4B são gráficos de barras que mostram níveis de expressão de mRNA de IFNA4 e IFNB em célula GM-CSF-BMDCs gerados partindo de camundongos cGAS-/- e seus controles WT de idade correspondente e infectados com MVA. Os dados são médias ± SEM (n=3). É mostrado um experimento representativo, repetido duas vezes (***, p < 0,001). A FIG. 4C é uma imagem de immunoblot escaneada que mostra os níveis de proteína de phospho-TBK1, TBK1, fosfosserina-396 de IRF3, IRF3 e GAPDH em cDCs cGAS+/+ e cGAS-/- infectadas com MVA. “hpi”, horas após a infecção.

[0044] A FIG. 5 é uma série de representações gráficas que mostram que MVAΔE3L induz níveis mais altos de expressão gênica de IFN do tipo I em BMDCs do que o MVA. A FIG. 5A é uma imagem escaneada de um immunoblot que mostra os níveis de proteína de E3 e β-actina em GM- CSF-BMDCs infectadas com WT VAC, MVA ou MVAΔE3L. “hpi,” horas após a infecção, “M”, controle de infecção simulada. A FIG. 5B são gráficos de barras que mostram níveis de mRNA de IFNA4 e IFNB em GM- CSF-BMDCs infectadas com MVA ou com MVAΔE3L. Os dados são médias ± SEM (n=3). É mostrado um experimento representativo, repetido duas vezes. ***, p < 0,001; foram feitas comparações entre células infectadas com MVA e com MVAΔE3L. A FIG. 5C são gráficos de barras que mostram níveis de mRNA de IFNA4 e IFNB em GM-CSF- BMDCs gerados partindo de camundongos IRF3-/- e camundongos WT C57B/6 de idade correspondente e infectados com MVA ou com MVAΔE3L. Os dados são médias ± SEM (n=3). É mostrado um experimento representativo, repetido duas vezes. ***, p < 0,001; foram feitas comparações entre células infectadas com MVA e com MVAΔE3L. A FIG. 5D é uma imagem escaneada de um immunoblot que mostra os níveis de proteína de p-IRF3 e β-actina em GM-CSF-BMDCs infectadas com MVA ou com MVAΔE3L.

[0045] A FIG. 6 é uma série de gráficos de barras que mostram que cGAS é necessário para a indução de IFN do tipo I pelo MVAΔE3L nas cDCs. A FIG. 6A inclui gráficos de barras que mostram níveis de mRNA de IFNA4 e IFNB em cDCs cGAS+/+ e cGAS-/- infectadas com MVAΔE3L. A FIG. 6B inclui gráficos de barras que mostram níveis de secreção de IFN-α e IFN-β em cDCs cGAS+/+ e cGAS-/- infectadas com MVAΔE3L ou tratadas com cGAMP, um agonista para STING. A FIG. 6C é uma imagem escaneada de um immunoblot que mostra os níveis de proteína de p-IRF3 e GAPDH em cDCs cGAS+/+ e cGAS-/- infectadas com MVAΔE3L.

[0046] A FIG. 7 é uma série de imagens escaneadas de dados de Western blot que mostram que a via de sensibilização de dsRNA também desempenha uma função na fosforilação de IRF3 induzida por MVAΔE3L. A FIG. 7A mostra níveis de proteína de p-IRF3 e β-actina nas cDCs geradas partindo de camundongos WT, STINGGt/Gt ou MAVS-/- e infectadas com MVAΔE3L ou não tratadas (NT). “hpi”, horas após a infecção. A FIG. 7B mostra níveis de proteína de phospho-TBK1, TBK1, fosfosserina-396 de IRF3, IRF3 e GAPDH nas cDCs geradas partindo de camundongos WT ou STINGGt/Gt/MDA5-/- (DKO) e infectadas com MVAΔE3L ou MVA. “hpi”, horas após a infecção.

[0047] A FIG. 8 é uma série de gráficos de barras que mostram que a infecção com MVA e com MVAΔE3L de fibroblastos primários de camundongo leva à indução da expressão gênica de Ifnb (FIG. 8A), Ccl4 (FIG. 8B), Il6 (FIG. 8C) e Ccl5 (FIG. 8D), que é muito dependente de cGAS. “NT”, não tratadas. A expressão de Ifnb (FIG. 8E), Ccl4 (FIG. 8F), Il6 (FIG. 8G) e Ccl5 (FIG. 8H) induzida por MVAΔE3L é completamente anulada em fibroblastos primários de camundongo com deficiência dupla de STING e MDA5.

[0048] A FIG. 9 é uma série de gráficos de barras que mostram que a infecção com MVA e com MVAΔE3L de fibroblastos primários de camundongo leva à produção de IFN-β (FIG. 9A), CCL4 (FIG. 9B), IL-6 (FIG. 9C) e CCL5 (FIG. 9D), que é muito dependente de STING e com alguma contribuição de MDA5.

[0049] A FIG. 10 é uma série de gráficos de barras que mostram que a infecção com MVAΔE3L leva a níveis mais altos de secreção de Ifna4 (FIG. 10A), Ifnb (FIG. 10B), Il6 (FIG. 10C), Tnf (FIG. 10D), Ccl4 (FIG. 10E) e Ccl5 (FIG. 10F) que com MVA em células de melanoma B16-F10. “NT”, não tratadas.

[0050] A FIG. 11 é uma série de imagens de immunoblot escaneadas que mostram que a infecção de células de melanoma B16-F10 com MVA ou MVAΔE3L induz a apoptose. A FIG. 11A mostra níveis de proteína de PARP, PARP clivada e β-actina em células de melanoma B16-F10 infectadas com MVA ou MVAΔE3L. A FIG. 11B mostra níveis de proteína de MCL-1 e β-actina em células de melanoma B16-F10 infectadas com MVA ou MVAΔE3L. “hpi”, horas após a infecção. A FIG. 11C mostra níveis de IRF3 fosforilada e GAPDH em células de melanoma B16-F10 infectadas com MVA ou MVAΔE3L. “hpi”, horas após a infecção.

[0051] A FIG. 12 é uma série de gráficos que mostram que a injeção intratumoral de MVA e MVAΔE3L leva à sobrevivência prolongada de camundongos que carregam tumor e à erradicação de tumores em alguns camundongos. As FIGS. 12A-C são gráficos de volume de tumor ao longo do tempo em camundongos individuais injetados com PBS (A), MVA (B) e MVAΔE3L (C). As FIGS. 12D é uma curva de sobrevivência de Kaplan- Meier de camundongos que carregam tumor injetados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. ****, p < 0,0001 (MVA vs. grupo com PBS); ***, p < 0,001 (MVAΔE3L vs. grupo com PBS). A FIG. 12E é uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos livres de tumor após o tratamento bem sucedido com MVA ou MVAΔE3L e desafiados com células de melanoma B16-F10 na superfície contralateral. Camundongos naive nunca receberam quaisquer células de tumor ou vírus no passado.

[0052] A FIG. 13 é uma série de representações gráficas de dados que mostram que a injeção intratumoral com MVA leva a alterações imunológicas no microambiente de tumor. As FIGS. 13A-B são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células CD4+ que expressam FoxP3 em tumores tratados com PBS (13A) ou MVA (13B). As FIGS. 13D-E são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células CD8+ que expressam Granzyme B em tumores tratados com PBS (13D) ou MVA (13E). As FIGS. 13G-H são gráficos de dispersão da análise de citometria de fluxo de células CD8+ que expressam Ki-67 em tumores tratados com PBS (13G) ou MVA (13H). A FIG. 13C é um gráfico que representa porcentagens de CD4+Foxp3+ em tumores tratados com PBS ou MVA. A FIG. 13F é um gráfico que representa porcentagens de células Granzyme B+CD8+ em tumores tratados com PBS ou MVA. A FIG. 13 I é um gráfico que representa porcentagens de CD8+Ki-67+ em tumores tratados com PBS ou MVA.

[0053] A FIG. 14 é uma série de representações gráficas de dados que mostram que a injeção intratumoral com MVA induz alterações imunológicas nos nódulos linfáticos que drenam o tumor (TDLNs). As FIGS. 14A-B são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células Granzyme B+CD8+ nos TDLNs de camundongos tratados com PBS (14A) ou MVA (14B). As FIGS. 14C-D são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células Ki-67+CD8+ nos TDLNs de camundongos tratados com PBS (14D) ou MVA (14E). As FIG. 14C são um gráfico que representa porcentagens de células Granzyme B+CD8+ nos TDLNs de camundongos tratados com PBS ou MVA. As FIGS. 14F são um gráfico que representa porcentagens de CD8+Ki-67+ nos TDLNs de camundongos tratados com PBS ou MVA.

[0054] A FIG. 15 é uma série de representações gráficas que mostram que MVAΔE3L induz a produção de IFN do tipo I e citocinas inflamatórias/quimiocinas em células de câncer de cólon MC38. As FIGS. 15A-D são gráficos de barras que mostram os níveis de proteína de IFN- β (15A), IL-6 (15B), CCL4 (15C) e CCL5 (15D) nos sobrenadantes de células de câncer de cólon MC38 infectadas com MVA ou MVAΔE3L. As FIGS. 15E-H são gráficos de barras que mostram os níveis de mRNA de Ifnb (15E), Il6 (15F), Ccl4 (15G) e Ccl5 (15H) nas células de câncer de cólon MC38 em 6 h após a infecção com MVA ou MVAΔE3L. A FIGS. 15I é uma imagem escaneada de um Western blot que mostra os níveis de proteína de PARP, PARP clivada, phosphor-IRF-3, IRF3 e β-actina. “hpi”, horas após a infecção.

[0055] A FIG. 16 é uma série de gráficos que mostram que MVAΔE3L inibe a tumorigênese no modelo de carcinoma de cólon de camundongo. As FIGS. 16A e 16B são gráficos de volume de tumor vs. tempo desde a injeção de PBS ou vírus em camundongos que mostram que a injeção intratumoral de MVAΔE3L é eficiente para o tratamento de adenocarcinoma de cólon de camundongo (células MC38) implantado unilateralmente em camundongos (C57B/6). São mostrados os volumes de tumor de camundongos tratados com PBS ou grupos de MVAΔE3L antes do tratamento (dia 0) e até 45 dias após o tratamento. A FIGS. 16C é uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier para os camundongos tratados (MVAΔE3L) versus camundongos de controle (PBS). ***, p < 0,001 (MVAΔE3L vs. grupo com PBS).

[0056] A FIG. 17 é uma série de representações gráficas de dados que mostram que a injeção intratumoral de MVA ou MVAΔE3L induziu efeitos antitumor em tumores distantes não injetados em um modelo de implantação bilateral de melanoma B16-F10 de camundongo. As FIGS. 17A-F são gráficos de volume de tumor injetado (A, C, E) e não injetado (B, D, F) representado contra o tempo (dias) após injeção de PBS, MVA ou MVAΔE3L respectivamente. A FIG. 17G é uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos que carregam tumor (células B16-F10) injetado com PBS (círculos preenchidos), MVA (quadrados preenchidos) ou MVAΔE3L (triângulos preenchidos). ****, p < 0,0001 (MVAΔE3L vs. grupo com PBS); ***, p < 0,001 (MVA vs. grupo com PBS).

[0057] A FIG. 18 é uma série de representações gráficas de dados que mostram que a injeção intratumoral de MVA ou MVAΔE3L induz células T CD8+ e CD4+ efetoras ativadas e reduz células T CD4+ reguladoras tanto em tumores injetados quanto não injetados em um modelo de implantação bilateral de melanoma B16-F10 de camundongo. A FIG. 18A são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células T CD3+CD8+ tanto em tumores injetados quanto não injetados tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. As FIGS. 18B são um gráfico da % de células T CD3+CD8+ tanto em tumores injetados quanto não injetados tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. As FIGS. 18C e E são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células CD8+ que expressam Granzyme B+ (18C) ou Ki-67 (18E). As FIGS. 18D e F são gráficos da % de células T CD8+Granzyme B+ (18D), CD8+Ki-67+ (18F) tanto em tumores injetados quanto não injetados tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. A FIG. 18G são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células T CD4+Foxp3+ tanto em tumores injetados quanto não injetados tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. As FIG. 18H são um gráfico da % de células T CD4+Foxp3+ tanto em tumores injetados quanto não injetados tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. As Figuras 18I e K são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células CD4+ que expressam Granzyme B+ (18I) ou Ki-67 (18K). As FIGS. 18J e L são gráficos da % de células T CD4+Granzyme B+ (18J), CD8+Ki-67+ (18L) tanto em tumores injetados quanto não injetados tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. (*, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001; ****, p < 0,0001).

[0058] A FIG. 19 é uma série de representações gráficas de dados que mostram que a injeção intratumoral de MVA ou MVAΔE3L reduz macrófagos associados ao tumor (TAMs) em um modelo de melanoma B16-F10 de camundongo. A FIG. 19A são gráficos de pontos da análise de citometria de fluxo de células TAM (CD45+Ly6C- MHCII+CD24loF4/80+CD11b+CD11c+) em tumores tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. As FIG. 19B-D são gráficos de % de TAM, TAM1 (CD11CloCD11bhi) e TAM2 (CD11ChiCD11blo) em células CD45+ em tumores tratados com PBS, MVA ou MVAΔE3L. (*, p < 0,05; ns: não significativo).

Descrição Detalhada Definições:

[0059] Como utilizados aqui os termos a seguir devem ter os mesmos significados atribuídos aos mesmos abaixo a não ser que o contexto indique claramente o contrário: “Câncer” refere-se a uma classe de doenças de seres humanos e animais caracterizada pelo crescimento celular descontrolado. A não ser que seja explicitamente indicado, o termo “câncer” pode ser utilizado aqui de forma intercambiável com os termos “tumor”, “malignidade”, “hiperproliferação” e “neoplasma(s);” o termo “célula(s) cancerosa(s)” é intercambiável com os termos “célula(s) tumoral(is)”, “célula(s) maligna(s)”, “célula (s) hiperproliferativa(s)” e “célula(s) neoplásica(s)”. “Melanoma” refere-se a um neoplasma maligno que se origina de células que são capazes de produzir melanina. O termo melanoma é sinônimo de “melanoma maligno”. O melanoma sofre metástase amplamente, envolvendo os nódulos linfáticos, a pele, o fígado, os pulmões e os tecidos cerebrais do paciente. “Tumor sólido” refere-se a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos, exceto os cânceres hematológicos tais como linfomas, leucemias e mieloma múltiplo. Os exemplos de tumores sólidos incluem, mas sem limitação: sarcoma de tecido mole, tal como fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing e outros tumores ósseos (por exemplo, osteossarcoma, histiocitoma fibroso maligno), leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma de duto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de célula pequena, carcinoma de bexiga, carcinoma epitelial, tumores do cérebro/SNC (por exemplo, astrocitoma, glioma, glioblastoma, tumores na infância, tal como tumor teratoide/rabdoide atípico, tumor de célula germinativa, tumor embrionário, ependimoma) meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma. Alguns dos tumores sólidos mais comuns para os quais as composições e os métodos da presente divulgação seriam úteis incluem: câncer de cabeça e pescoço, adenocarcinoma retal, glioma, meduloblastoma, carcinoma urotelial, adenocarcinoma pancreático, uterino (por exemplo, câncer endometrial, câncer de trompa de Falópio) câncer de ovário, câncer cervical, adenocarcinoma de próstata, câncer pulmonar de células não pequenas (escamosas e adenocarcinoma), câncer pulmonar de células pequenas, melanoma, carcinoma de mama, carcinoma dutal in situ, carcinoma de célula renal e carcinoma hepatocelular, tumores adrenais (por exemplo, carcinoma adrenocortical), de esôfato, de olho (por exemplo, melanoma, retinoblastoma), de vesícula biliar, gastrointestinal, tumor de Wilms, de coração, cabeça e pescoço, de laringe e hipofaringeal, oral (por exemplo, lábio, boca, glândula salivar), nasofaringeal, neuroblastoma, peritoneal, de pituitária, sarcoma de Kaposi, tumor de intestino delgado, de estômago, de testículo, do tipo, da tireoide, da paratireoide, vaginal e as metástases de qualquer um dos anteriores. “Metástase” refere-se ao espalhamento do câncer de seu sítio primário para tecidos vizinhos ou localizações distais no corpo. As células cancerosas podem se soltar de um tumor primário, penetrar nos vasos linfáticos e sanguíneos, circular ao longo da corrente sanguínea e crescer em tecidos normais em outro lugar no corpo. A metástase é um processo sequencial, dependente das células de tumor (ou células tronco de câncer) que se soltam do tumor primário, percorrendo ao longo da corrente sanguínea ou os vasos linfáticos e parando em um local distante. Uma vez em outro local, as células cancerosas penetram novamente nos vasos sanguíneos ou nas paredes linfáticas, continuam a se multiplicar e eventualmente formam um novo tumor (tumor metastásico). Em algumas modalidades, este novo tumor é referido como um tumor metastásico (ou secundário). “Resposta imunológica” refere-se à ação de um ou mais de linfócitos, células apresentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células anteriores ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em danos, destruição ou eliminação seletiva do corpo humano de células cancerosas, células de tumor metastásico etc. Uma resposta imunológica pode incluir uma resposta celular, tal como uma resposta de célula T que é uma alteração (modulação, por exemplo, aumento, estimulação, ativação, danos ou inibição significativa) da função celular que é uma função de célula T. Uma resposta de célula T pode incluir a produção, a proliferação ou a expansão ou a estimulação de um tipo particular de célula T ou um subconjunto de células T, por exemplo, células CD4+ efetoras, CD4+ helper, CD8+ efetoras, CD8+ citotóxicas ou natural killer (NK). Tais subconjuntos de células T podem ser identificados através da detecção de um ou mais receptores celulares ou moléculas de superfície celular (por exemplo, CD ou grupo de moléculas de diferenciação). Uma resposta de célula T também pode incluir expressão alterada (aumento ou redução estatisticamente significativa) de um fator celular, tal como um mediador solúvel (por exemplo, uma citocina, uma linfocina, uma citocina que se liga à proteína ou um interleucina) que influencia a diferenciação ou a proliferação de outras células. Por exemplo, o interferon do tipo I (IFN-α/β) é um regulador crítico da imunidade inata (52)(Huber et al. Immunology 132(4):466-474 (2011)). Estudos com animais e seres humanos mostraram uma função de IFN-α/β na influência direta sobre o destino de ambas as células T CD4+ e CD8+ durante as fases iniciais de resposta imunológica antitumor de reconhecimento de antígeno. O IFN do Tipo I é induzido em resposta à ativação de células dendríticas, por sua vez uma sentinela do sistema imunológico inato. “Imunidade de tumor” refere-se a um ou mais processos através dos quais os tumores escapam do reconhecimento e da eliminação pelo sistema imunológico. Assim, como um conceito terapêutico, a imunidade de tumor é “tratada” quando tal evasão é atenuada ou eliminada e os tumores são reconhecidos e atacados pelo sistema imunológico (o último sendo chamado aqui de “imunidade antitumor”). Um exemplo de reconhecimento de tumor é a ligação ao tumor e os exemplos de ataque do tumor são redução do tumor (em número, tamanho ou ambos) e eliminação do tumor. “Célula T” refere-se a um linfócito derivado do timo que participa de uma variedade de reações imunológicas adaptativas mediadas por célula. “Célula T helper” refere-se a uma célula T CD4+; as células T helper reconhecem o antígeno ligado às moléculas de MHC de classe II. Há pelo menos dois tipos de células T helper, Th1 e Th2, que produzem citocinas diferentes. “Célula T citotóxica” refere-se a uma célula T que geralmente carrega marcadores moleculares CD8 sobre sua superfície (CD8+) e que funciona na imunidade mediada por célula destruindo uma célula alvo que possui uma molécula antigênica específica sobre a sua superfície. As células T citotóxicas também liberam Granzyme, uma serina protease que pode entrar nas células alvos através do poro formado pela perforina e induzir apoptose (morte celular). A Granzyme serve como um marcador de fenótipo citotóxico. Outros nomes para célula T citotóxica incluem CTL, célula T citolítica, linfócito T citolítico, célula T killer ou linfócito T killer. Os alvos das células T citotóxicas podem incluir células infectadas com vírus, células infectadas com parasitas bacterianos ou protozoários ou células cancerosas. A maioria das células T citotóxicas possui a proteína CD8 presente sobre suas superfícies celulares. CD8 fica atracado nas porções da molécula de MHC de Classe I. Tipicamente, uma célula T citotóxica é uma célula CD8+. “Leucócitos que se infiltram no tumor” refere-se às células sanguíneas brancas de um indivíduo afligido com um câncer (tal como melanoma), que são residentes ou de outra maneira deixaram a circulação (sangue ou fluido linfático) e migraram para dentro de um tumor. “Inibidor de ponto de verificação imunológico” ou “agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico” refere-se a moléculas que reduzem, inibem, interferem ou modulam completamente ou parcialmente a atividade de uma ou mais proteínas de ponto de verificação. As proteínas de ponto de verificação regulam a ativação ou a função das células T. As proteínas de ponto de verificação incluem, mas sem limitação, membros da família de receptores CD28, CTLA-4 e seus ligantes CD80 e CD86; PD-1 e seus ligantes PDL1 e PDL2; LAG3, B7-H3, B7-H4, TIM3, ICOS e BTLA (53). “Parenteral” quando utilizado no contexto da administração de uma substância terapêutica inclui qualquer rota de administração sem ser a administração através do trato digestivo. São particularmente relevantes para os métodos divulgados aqui a administração intravenosa (incluindo, por exemplo, através da veia porta hepática), intratumoral ou intratecal. “Anticorpo” refere-se a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a um antígeno ou a um fragmento de ligação ao antígeno de tal molécula. Assim, os anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser fragmentos ou porções imunorreativas (de ligação ao antígeno) de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, bem como anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos recombinantes humanos e anticorpos bi- e triespecíficos. “Vírus oncolítico” refere-se a um vírus que infecta preferencialmente células cancerosas, se replica em tais células e induz a lise das células cancerosas através de seu processo de replicação. Exemplos não limitantes de vírus oncolíticos que ocorrem naturalmente incluem vírus da estomatite vesicular, reovírus, bem como vírus engenheirados para serem oncosseletivos tais como adenovírus, vírus da doença de Newcastle e vírus herpes simplex (Ver, por exemplo, Nemunaitis, J. Invest New Drugs. 17(4):375-86 (1999); Kirn, DH et al. Nat Rev Cancer. 9(1):64-71(2009); Kirn et al. Nat. Med. 7:781 (2001 ); Coffey et al. Science 282:1332 (1998)) (8, 54-56). O vírus vaccinia infecta muitos tipos de células, mas se replica preferencialmente nas células de tumor devido ao fato de que as células de tumor possuem um metabolismo que favorece a replicação, exibe a ativação de certas vias que também favorecem a replicação e cria um ambiente que escapa do sistema imunológico inato, que também favorece a replicação viral. No contexto da presente divulgação, o MVA e o MVAΔE3L não se encaixam na definição de vírus oncolíticos uma vez que não possuem um efeito antitumor primariamente através da replicação dentro das células de tumor e causando apoptose. (Nem sem encaixam na definição clássica de vacinas uma vez que estes vírus não expressam antígenos de tumor. Pode-se dizer, entretanto, que agem como moléculas imunoestimuladoras, similares aos adjuvantes, uma vez que servem para melhorar a resposta imunológica do passageiro contra o tumor.) “MVA” significa “vaccinia modificado Ankara” e refere-se a uma cepa altamente atenuada de vaccinia derivada da cepa Ankara e desenvolvida para uso como uma vacina e um adjuvante para vacina. O MVA original foi isolado da cepa Ankara do tipo selvagem através da passagem sucessiva por células embrionárias de frango. Tratada dessa maneira perde aproximadamente 15% do genoma de vaccinia do tipo selvagem inclusive sua capacidade de se replicar eficientemente em células de primatas (incluindo humanos). (57) (Mayr et al., Zentralbl Bakteriol B 167, 375-390 (1978)). A cepa vacinal contra varíola MVA: marcador, estrutura genética, experiência adquirida com a vacinação parenteral e comportamento em organismos com mecanismo de defesa debilitado. O MVA é considerado um candidato apropriado para o desenvolvimento como um vetor recombinante para fornecimento gênico ou de vacinação contra doenças infecciosas ou tumores. (58)(Verheust et al., Vaccine 30(16), 2623-2632 (2012)). O MVA possui um genoma de 178 kb de comprimento e uma sequência divulgada primeiro em (59)(Antoine et al., Virol. 244(2): 365-396 (1998)). As sequências também são divulgadas no Genbank U94848.1. O MVA de grau clínico está disponível comercialmente e publicamente na Bavarian Nordic A/S Kvistgaard, Dinamarca. Adicionalmente, o MVA está disponível na ATCC, Rockville, MD e na CMCN (Institut Pasteur Collection Nationale des Microorganismes) Paris, França. “MVAΔE3L” significa um mutante de deleção do MVA que não possui um gene E3L funcional e é infeccioso, mas não replicativo e adicionalmente possui sua capacidade de evasão do sistema imunológico do hospedeiro reduzida. Pode ser utilizado com um vetor vacinal. Este MVA mutante com nocaute em E3L e sua preparação foram descritos, por exemplo, na Patente U.S. 7.049.145. “Indivíduo” significa qualquer paciente animal (mamífero, humano ou outro) que pode ser afligido com câncer e quando é afligido dessa maneira necessita de tratamento. “Quantidade terapeuticamente eficiente” ou “quantidade eficiente” refere-se a uma quantidade suficiente de um agente quando administrado em uma ou mais dosagens e durante um período de suficiente para fornecer um resultado biológico desejado no alívio, na cura ou na paliação de uma doença. Na presente divulgação, uma quantidade eficiente respectivamente do MVA ou do MVAΔE3L é uma quantidade que (administrada durante um período de tempo adequado e a uma frequência adequada) reduz o número de células cancerosas; ou reduz o tamanho do tumor ou erradica o tumor; ou inibe (isto é, retarda ou interrompe) a infiltração de células cancerosas nos órgãos periféricos; inibe (isto é, retarda ou interrompe) o crescimento metastásico; inibe (estabiliza ou para) o crescimento de tumor; permite o tratamento do tumor e/ou induz uma resposta imunológica contra o tumor. Uma quantidade terapêutica apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por um perito comum na arte utilizando experimentos de rotina à luz da presente divulgação. Tal determinação começará com quantidades observadas como eficientes in vitro e quantidades observadas como eficientes em animais. A quantidade terapeuticamente eficiente será inicialmente determinada com base na concentração ou as concentrações observadas como conferindo um benefício para as células em cultura. As quantidades eficientes podem ser extrapoladas partindo dos dados dentro da cultura de célula e podem ser ajustadas para mais ou para menos com base nos fatores que são detalhados aqui. Um exemplo de uma faixa de quantidades eficientes é de 105 partículas virais até aproximadamente 1012 partículas virais por administração.

[0060] Com referência particular aos agentes imunoestimuladores à base de vírus divulgados aqui, “quantidade terapeuticamente eficiente” ou “quantidade eficiente” refere-se a uma quantidade de uma composição que compreende MVA ou MVAΔE3L suficiente para reduzir, inibir ou anular o crescimento de células tumorais, reduzindo ou eliminando assim o tumor ou suficiente para inibir, reduzir ou anular o espalhamento metastásico in vitro, ex vivo ou em um indivíduo ou para induzir uma resposta imunológica contra o tumor que eventualmente resultará em uma ou mais de redução, inibição e/ou anulação do espalhamento metastásico como pode ser o caso. A redução, a inibição ou a erradicação do crescimento de células tumorais pode ser o resultado de necrose, apoptose ou uma resposta imunológica ou uma combinação de dois ou mais do que foi descrito anteriormente (entretanto, a precipitação da apoptose, por exemplo, pode não ser devida aos mesmos fatores que são observados com os vírus oncolíticos). A quantidade que é terapeuticamente eficiente pode variar dependendo de fatores tais como o MVA particular utilizado na composição, a idade e o estado de saúde do indivíduo que será tratado, a extensão de formação de tumor, a presença ou a ausência de outras modalidades terapêuticas e similares. Similarmente, a dosagem da composição que será administrada e a frequência de sua administração dependerão de uma variedade de fatores, tais como a potência do ingrediente ativo, a duração de sua atividade assim que administrada, a rota de administração, o tamanho, a idade, o sexo e a condição física do indivíduo, o risco de reações adversas e o julgamento do médico atendente. As composições são administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como soluções injetáveis.

[0061] Com referência particular à terapia de combinação com um inibidor de ponto de verificação imunológico, “quantidade terapeuticamente eficiente” para um “agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico” deve significar uma quantidade de um agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico suficiente para reverter ou reduzir a supressão imunológica no microambiente de tumor e para ativar ou aumentar a imunidade do hospedeiro no indivíduo que será tratado. Há inúmeros agentes de bloqueio de ponto de verificação imunológico aprovados, em testes clínicos ou de outra maneira em desenvolvimento incluindo anticorpos inibidores contra o inibidor CD28 tal como CTLA-4 (antígeno 4 de linfócito T citotóxico) (por exemplo, ipilimumab), anticorpos inibidores anti-PD-1 (Morte programada 1) (por exemplo, nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, lambrolizumab) e anticorpos inibidores de anti-PD-L1 (ligante de morte programada 1) (MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB 00107180), bem como anticorpos inibidores contra LAG-3 (gene de ativação de linfócito 3), TIM3 (Imunoglobulina de célula T e Mucina-3), B7-H3 e TIGIT (imunorreceptor de células T com Ig e domínios ITIM). As faixas de dosagem do que é descrito acima são conhecidas ou estão prontamente dentro da perícia na arte uma vez que vários testes clínicos de dosagens foram concluídos, fazendo extrapolação com outros agentes possíveis.

[0062] Preferencialmente, o tumor expressa o ponto de verificação particular, mas este não é estritamente necessário uma vez que os agentes de bloqueio de ponto de verificação imunológico bloqueiam de forma mais geral os mecanismos supressores imunológicos dentro dos tumores, induzidos pelas células de tumor, células de estroma e células imunológicas que se infiltram no tumor.

[0063] Por exemplo, o inibidor de CTLA4 ipilimumab, quando administrado como terapia adjuvante após cirurgia no melanoma, é administrado a 1-2 mg/mL ao longo de 90 minutos para uma quantidade total de infusão de 3 mg/kg a cada três semanas para um total de 4 doses. Esta terapia é frequentemente acompanhada por reações adversas graves mediadas pelo sistema imunológico que também ameaçam a vida, que limita a dose tolerada bem como a quantidade cumulativa que pode ser administrada. É previsto que será possível reduzir a dose e/ou a quantidade cumulativa de ipilimumab quando este for administrado conjuntamente com o MVA ou o MVAΔE3L. Em particular, à luz dos resultados experimentais apresentados a seguir, é previsto que será também possível reduzir a dose do inibidor de CTLA4 se este for administrado diretamente no tumor simultaneamente ou sequencialmente com um ou ambos os vírus MVA anteriores. Consequentemente, as quantidades fornecidas anteriormente para ipilimumab serão um ponto de partida para a determinação da dosagem particular e da quantidade cumulativa que será fornecida a um paciente em administração conjunto, mas estudos de dosagem serão necessários para determinar as quantidades ótimas.

[0064] Pembrolizumab é prescrito para administração como terapia adjuvante no melanoma diluído para 25 mg/mL. É administrado em uma dosagem de 2 mg/kg ao longo de 30 minutos a cada três semanas. Novamente, este seria um ponto de partida para a determinação da dosagem e da administração na administração conjunta com MVA ou MVAΔE3L.

[0065] Nivolumab é prescrito para administração a 3 mg/kg na forma de uma infusão intravenosa ao longo de 60 minutos a cada duas semanas, fornecendo um ponto de partida similar na determinação da dosagem e da administração deste inibidor de ponto de verificação conjuntamente com MVA ou MVAΔE3L.

[0066] Os agentes de estimulação imunológica tais como anticorpos agonistas também foram explorados como imunoterapia para cânceres. Por exemplo, o anticorpo anti-ICOS se liga ao domínio extracelular de ICOS levando à ativação da sinalização de ICOS e à ativação de células T. O anticorpo anti-OX40 pode se ligar a OX40 e potencializar a sinalização de receptor de célula T levando à ativação, à proliferação e à sobrevivência das células T. Outros exemplos incluem anticorpos agonistas contra 4-1BB (CD137), GITR. Todos estes agentes estão em vários estágios de testes clínicos.

[0067] Os anticorpos agonistas de estimulação imunológica podem ser utilizados de forma sistêmica em combinação com uma injeção intratumoral de MVA ou MVAΔE3L. Alternativamente, os anticorpos agonistas de estimulação imunológica podem ser utilizados conjuntamente com MVA ou MVAΔE3L através da forma fornecimento intratumoral simultaneamente ou sequencialmente.

[0068] “Carreador e/ou diluente farmaceuticamente aceitável” ou “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui sem limitação quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias biologicamente ativas é bem conhecido na arte. Detalhes adicionais dos excipientes são fornecidos a seguir. Ingredientes ativos suplementares, tais como antimicrobianos, por exemplo, agentes antifúngicos, também podem ser incorporados nas composições.

[0069] “Fornecimento” utilizado em associação ao depósito do MVA ou do MVAΔE3L da presente divulgação no microambiente de tumor seja isto realizado através da administração local no tumor ou, por exemplo, através de rota intravenosa. O termo se concentra no MVA ou no MVAΔE3L que atinge o tumor.

[0070] “Administração conjunta” refere-se aqui à administração de uma segunda modalidade terapêutica em combinação com MVA ou MVAΔE3L, por exemplo, um agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico administrado quase ao mesmo tempo em que o MVA ou o MVAΔE3L. Por exemplo, um inibidor de PD-1/PDL-1 e/ou um inibidor de CTLA4 (em modalidades mais específicas, um anticorpo) pode ser administrado simultaneamente com MVA ou MVAΔE3L (através de injeção intravenosa ou intratumoral quando o MVA ou o MVAΔE3L for administrado de forma intratumoral ou de forma sistêmica como citado anteriormente) ou antes ou depois da administração do MVA ou do MVAΔE3L. Se a administração do MVA ou do MVAΔE3L e do agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico for realizada com diferença de 1-7 dias ou até mesmo com diferença de três, isto ocorreria dentro de “quase o mesmo tempo” como citado aqui. ***

[0071] Em uma modalidade, a presente divulgação refere-se a um método para induzir uma resposta imunológica antitumor em indivíduos afligidos com tumores que compreende o fornecimento ao tumor de uma quantidade eficiente de MVA ou MVAΔE3L. A estimulação do sistema imunológico pode se manifestar através de um ou mais dos efeitos imunológicos a seguir: um aumento em pelo menos uma das células T CD8+ efetoras e células T CD4+ efetoras dentro do tumor e/ou nos nódulos linfáticos que drenam o tumor; indução da maturação das células dendríticas que se infiltram no dito tumor através da indução de IFN do tipo I; indução de células T CD4+ efetoras no indivíduo que reconhecem células de tumor dentro do tumor e/ou nos nódulos linfáticos que drenam o tumor; redução de células T CD4+ supressoras (reguladoras) imunológicas dentro do tumor; indução das células do tumor a produzirem um ou mais de IFN do tipo I ou outras citocinas inflamatórias ou quimiocinas; redução de macrófagos associados ao tumor supressores imunológicos dentro do tumor.

[0072] O um ou mais efeitos imunológicos anteriores podem servir como indicadores iniciais de resposta do indivíduo ao tratamento e podem servir como monitores da eficácia mantida dos mesmos. A observação destes efeitos ilustra que a maneira na qual os presentes vírus tratam tumor é diferente daquela dos vetores vacinais que carregam antígenos de tumor (que não são fornecidos de forma intratumoral, mas através da rota intramuscular, subcutânea ou, raramente, intravenosa) e também diferente daquela dos vírus oncolíticos (que causam citopatia primariamente devida à replicação viral nas células de tumor). Se a apoptose resultar conforme o presente tratamento, esta não é causada pelo mesmo mecanismo que a apoptose que resulta ou pode resultar destes diferentes modos de ação.

[0073] Os presentes inventores exploraram o mecanismo da resposta imunológica e concluíram que esta é iniciada pela via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS/STING que medeia a produção de IFN do Tipo 1. Compreensões adicionais sobre o mecanismo e as células imunológicas que são recrutadas são fornecidas nos Exemplos. As conclusões apresentadas aqui não são limitadas ao ambiente experimental específico no qual estes mecanismos estão sendo elucidados.

[0074] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método de tratamento de um indivíduo diagnosticado com um tumor sólido que compreende o fornecimento ao tumor de uma quantidade terapêutica eficiente do MVA ou do MVAΔE3L.

[0075] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método para indução da imunidade antitumor em um indivíduo diagnosticado com câncer que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficiente de MVA ou de MVAΔE3L. Os métodos da presente divulgação incluem a indução de imunidade antitumor que pode reduzir o tamanho do tumor, erradicar o tumor, inibir o crescimento do tumor, inibir a metástase ou reduzir o crescimento metastásico do tumor ou erradicar o crescimento metastásico do tumor, induzir a apoptose das células de tumor ou prolongar a sobrevivência do indivíduo (comparado com indivíduos não tratados ou tratados de forma convencional).

[0076] Em outra modalidade, a presente divulgação fornece um método para aumentar, estimular ou induzir, em um indivíduo diagnosticado com um tumor maligno sólido, uma resposta imunológica antitumor que pode incluir uma resposta imunológica inata e/ou uma resposta imunológica adaptativa tal como uma resposta de célula T através da exposição do tumor ao MVA ou ao MVAΔE3L em uma quantidade terapeuticamente eficiente.

[0077] Em modalidades específicas, a presente divulgação fornece métodos de indução de uma resposta imunológica que medeia respostas imunológicas adaptativas tanto em termos de citotoxicidade de células T direcionada contra células de tumor quanto em termos de indução de células T efetoras também direcionadas contra células de tumor. Os métodos compreendem a administração a um indivíduo afligido com um tumor sólido de forma intratumoral ou (como os presentes inventores preveem) de forma intravenosa de uma composição que compreende o MVA ou o MVAΔE3L em que a administração da dita composição resulta em uma resposta imunológica específica para o tumor contra o tumor e, eventualmente, na redução, na inibição ou na erradicação do crescimento de tumor, na inibição do crescimento metastásico, na apoptose de células de tumor e/ou no prolongamento da sobrevivência do indivíduo. De fato os presentes inventores mostraram que as células cancerosas estão sendo mortas e que a resposta imunológica pode migrar para localizações remotas, como seria o caso com metástases.

[0078] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece métodos de indução de uma resposta imunológica que medeia respostas imunológicas adaptativas tanto em termos de citotoxicidade de células T direcionada contra células de tumor quanto em termos de indução de células T efetoras também direcionadas contra células de tumor. Os métodos compreendem a administração a um indivíduo de forma parenteral de uma composição que compreende o MVA ou o MVAΔE3L em que a administração da dita composição resulta em uma resposta imunológica específica para o tumor contra o tumor e, eventualmente, na redução, na inibição ou na erradicação do crescimento de tumor e/ou na inibição, na redução ou na eliminação do crescimento metastásico, na apoptose de células de tumor e/ou no prolongamento da sobrevivência do indivíduo tratado comparado com a terapia convencional ou nenhum tratamento. Para metástases intraperitoneais, o vírus pode ser injetado de forma intraperitoneal.

[0079] De fato os presentes inventores mostraram que as células cancerosas estão sendo mortas e que a resposta imunológica pode migrar para localizações remotas, como seria o caso com metástases e ainda exercer um efeito antitumor.

[0080] Devido ao fato de que o MVA e o MVAΔE3L não são substancialmente competentes em relação à replicação na maioria das células de mamífero, estes não exercem seu efeito sobre o sistema imunológico da mesma maneira que vacinas ou vetores competentes em relação à replicação. Assim, embora se acredite que a estimulação do sistema imunológico seja uma barreira para eficácia para oncólise (8)(Kirn et al., Nat Rev Cancer. (1), 64-71 (2009)), o MVA e o MVAΔE3L são capazes de armar o sistema imunológico inato para estimular a imunidade adaptativa, tanto em termos de citotoxicidade quanto de forma mais ampla em termos de ativação de células T efetoras contra o tumor.

[0081] A presente divulgação fornece assim um método para tratamento de um tumor maligno sólido, que compreende o fornecimento a um tumor do indivíduo de uma quantidade de MVA ou MVAΔE3L eficiente para induzir uma resposta imunológica contra o tumor em um indivíduo diagnosticado com tumor sólido.

[0082] A presente divulgação também fornece um método para gerar imunidade sistêmica antitumor em um indivíduo afligido com um tumor maligno sólido, que compreende o fornecimento a um tumor do indivíduo de uma quantidade de MVA ou MVAΔE3L eficiente para realizar uma ou ambas de rejeição de tumores não injetados no dito indivíduo e inibição de metástase de tumor (que os presentes inventores testam através de novo desafio do tumor).

[0083] Como é mostrado aqui, o MVA estimula a indução de IFN do tipo I em células dendríticas convencionais (cDCs) através de uma via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS/STING. O fornecimento intravenoso de MVA em camundongos C57B/6 induziu IFN do tipo I em camundongos do tipo selvagem, mas não em camundongos que não possuem STING ou IRF3. Foi mostrado que o MVAΔE3L induz níveis mais altos de expressão gênica de IFN do tipo I e de fosforilação de IRF3 que o MVA nas cDCs. O MVAΔE3L é detectado tanto na via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS/STING quanto na via de sensibilização de dsRNA mediada por MDA5/MAVS. Em adição, a infecção com MVAΔE3L de células de melanoma B16 e células de adenocarcinoma de cólon MC38 induz IFN do tipo I e citocinas pró- inflamatórias e quimiocinas, bem como a ativação da fosforilação de IRF3. Tanto o MVA quanto o MVAΔE3L induzem apoptose nas células B16 e MC38 como é demonstrado pela clivagem de PARP e Caspase-3. De acordo com a presente divulgação o vírus MVA ou MVAΔE3L é utilizado como terapia anticâncer direta. A injeção intratumoral de MVA ou MVAΔE3L em um modelo de melanoma B16 de camundongo leva à apoptose, à sobrevivência prolongada e à erradicação de tumor, bem como à produção de imunidade antitumor sistêmica.

[0084] Com base na literatura atual e sem desejar ficar restrito à teoria, acredita-se que os mecanismos a seguir contribuam para os efeitos antitumor do MVA e do MVAΔE3L: (i) indução de respostas de IFN do tipo I nas células imunológicas incluindo células dendríticas convencionais e macrófagos; (ii) indução de IFN do tipo I e citocinas pró- inflamatórias e quimiocinas nas células cancerosas; (iii) indução de apoptose nas células cancerosas; e (iv) alteração do ambiente supressor imunológico do tumor para um de ativação imunológica. Vaccinia Modificado Ankara (MVA)

[0085] O vírus vaccinia modificado Ankara (MVA) é um membro do gênero Orthopoxvirus na família Poxviridae. O MVA foi gerado através de aproximadamente 570 passagens em série em fibroblastos de embrião de frango (CEF) da cepa Ankara de vírus vaccinia (CVA) (60)(Mayr et al., Infection 3, 6-14 (1975)). Como uma consequência destas passagens durante longo período, o vírus MVA resultante contém deleções genômicas extensas e é altamente restrito em relação ao hospedeiro às células de aves (61)(Meyer et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). Foi mostrado em uma variedade de modelos com animais que o MVA resultante é significativamente avirulento (57) (Mayr et al., Dev. Biol. Stand. 41, 225-34 (1978)).

[0086] A segurança e a imunogenicidade do MVA foram testadas extensivamente e documentadas em testes clínicos, particularmente contra a doença varíola humana. Estes estudos incluíram mais de 120.000 indivíduos e demonstraram eficácia e segurança excelentes em humanos. Além disso, comparado com outras vacinas à base de vaccinia, o MVA tem virulência (capacidade de infecção) enfraquecida enquanto induz uma boa resposta imunológica específica. Assim, o MVA foi estabelecido com um vetor vacinal seguro, com a capacidade de induzir uma resposta imunológica específica.

[0087] Devido às características mencionadas anteriormente, o MVA se tornou um candidato atraente para o desenvolvimento de vetores de MVA engenheirados, utilizados para expressão gênica recombinante e vacinas. Com um vetor vacinal, o MVA foi investigado contra inúmeras condições patológicas, incluindo HIV, tuberculose e malária, bem como câncer (20, 21 )(Sutter et al., Curr Drug Targets Infect Disord 3: 263271(2003); Gomez et al., Curr Gene Ther 8: 97-120 (2008)).

[0088] Foi demonstrado que a infecção com MVA de células dendríticas (DC) derivadas de monócitos humanos causa ativação de DC, caracterizada pela regulação para mais de moléculas coestimuladoras e secreção de citocinas pró-inflamatórias (18)(Drillien et al., J Gen Virol 85: 2167-2175 (2004)). Sob este aspecto, o MVA difere do vírus Vaccinia do tipo selvagem padronizado (WT-VAC), que falha em ativar as DCs. As células dendríticas podem ser classificadas em dois subtipos principais: células dendríticas convencionais (cDCs) e células dendríticas plasmocitoides (pDCs). As primeiras, especialmente o subtipo CD103+/CD8α+, são particularmente adaptadas à apresentação cruzada de antígenos para as células T; as últimas são fortes produtoras de IFN do tipo I.

[0089] A infecção viral de células humanas resulta na ativação de uma resposta imunológica inata (a primeira linha de defesa) mediada por interferons do tipo I, notavelmente interferon-alfa (α). Isto leva normalmente à ativação de uma “cascata” imunológica, com recrutamento e proliferação de células T ativadas (tanto CTL quanto helper) e eventualmente com produção de anticorpo. Entretanto, os vírus expressam fatores que suprimem as respostas imunológicas do hospedeiro. O MVA é um imunógeno melhor que o WT-VAC e se replica de forma insuficiente nas células de mamífero. (Ver, por exemplo, Brandler et al., J. Virol. 84, 5314-5328 (2010)) (62).

[0090] Entretanto, o MVA não é inteiramente não replicativo e como os presentes inventores mostram, contém alguma atividade imunossupressora residual. Todavia, como mostrado aqui o MVA prolongou significativamente a sobrevivência dos indivíduos tratados. Uma implicação destas descobertas é que através da injeção de um tumor ou do fornecimento de forma sistêmica do MVA (ou MVAΔE3L) é possível aumentar as respostas imunológicas inatas e adaptativas de um hospedeiro e dessa maneira vencer a capacidade do tumor de escapar das respostas imunológicas e restaurar a capacidade do hospedeiro de montar uma resposta imunológica contra o tumor seja a resposta nativa ou induzida ou aumentada por outro agente imunoterapêutico, tal como um inibidor de ponto de verificação. Vaccinia Modificado Ankara com deleção de E3 (MVAΔE3L)

[0091] Os efeitos antitumor do MVA descritos na seção imediatamente anterior também são observadas com o MVAΔE3L. O último é menos imunossupressor que MVA e ainda menos replicativo na maioria das células de mamífero e partindo de tal ponto de vista preferido. Em adição, os efeitos do MVAΔE3L eram de forma geral quantitativamente melhores que aqueles com o MVA como é observado nos experimentos descritos aqui.

Resposta Imunológica

[0092] Em adição à indução da resposta imunológica através da regulação para mais de atividades particulares do sistema imunológico (tal como produção de anticorpos e/ou citocinas ou ativação de imunidade mediada por célula), as respostas imunológicas também podem incluir supressão, atenuação ou qualquer outra regulação para menos de imunidade detectável, de forma a restabelecer a homeostase e prevenir danos excessivos nos próprios órgãos e tecidos do hospedeiro. Em algumas modalidades, uma resposta imunológica que é induzida de acordo com os métodos da presente divulgação gera células T CD8+ efetoras (CD8+ citotóxica antitumor) ou células T helper ativadas ou ambas que provocam diretamente ou indiretamente a morte ou a perda da capacidade de se propagar, de uma célula de tumor.

[0093] A indução de uma resposta imunológica através dos métodos da presente divulgação pode ser determinada através da detecção de uma variedade de parâmetros imunológicos bem conhecidos (63, 64)(Takaoka et al., Cancer Sci. 94:405-11 (2003); Nagorsen et al., Crit. Rev. Immunol. 22:449-62 (2002)). A indução de uma resposta imunológica pode, portanto, ser estabelecida através de qualquer um de um número de ensaios bem conhecidos, incluindo ensaios imunológicos. Tais ensaios incluem, mas não precisam ser limitados à determinação in vivo, ex vivo ou in vitro de imunoglobulinas ou anticorpos solúveis; mediadores solúveis tais como citocinas, quimiocinas, hormônios, fatores de crescimento e similares bem como outros mediadores de peptídeo pequeno, carboidrato, nucleotídeo e/ou lipídeo solúveis; alterações do estado de ativação celular que são determinadas pelas propriedades funcionais ou estruturais alteradas das células do sistema imunológico, por exemplo, proliferação celular, mobilidade alterada, gradiente ou concentração de cátions intracelular alterada (tal como cálcio); fosforilação ou desfosforilação de polipeptídeos celulares; indução de atividades especializadas tal como expressão gênica específica ou comportamento citolítico; diferenciação celular por células do sistema imunológico, incluindo perfis de expressão de antígeno de superfície alterados ou o início da apoptose (morte celular programada); ou qualquer outro critério através do qual a presença de uma resposta imunológica pode ser detectada. Por exemplo, marcadores de superfície celular que distinguem tipos de células imunológicas que podem ser detectados por anticorpos específicos que se ligam às células CD4+, CD8+ ou NK. Outros marcadores e componentes celulares que podem ser detectados incluem, mas sem limitação, interferon y (IFN-y), fator de necrose de tumor (TNF), IFN-α, IFN-β, IL-6 e CCL5. Os métodos comuns para detecção da resposta imunológica incluem, mas sem limitação, citometria de fluxo, ELISA, imunohistoquímica. Os procedimentos para a realização destes e de ensaios similares são amplamente conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, em Letkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Current Protocols in Immunology, 1998).

Composições e preparações farmacêuticas

[0094] As composições farmacêuticas que compreendem MVA ou MVAΔE3L podem conter um carreador ou um diluente, que pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contém, por exemplo, água, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similares), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser realizada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser obtida através do uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monostearato de alumínio e gelatina. Em geral, excipientes adequados para preparações injetáveis podem ser incluídos como é evidente para os peritos na arte.

[0095] As composições e as preparações farmacêuticas que compreendem MVA ou MVAΔE3L podem ser produzidas através de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, emulsificação, encapsulamento, captura ou liofilização. As composições virais farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional utilizando um ou mais carreadores, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam a formulação de preparações virais adequadas para uso in vitro, in vivo ou ex vivo. As composições podem ser combinadas com um ou mais agentes biologicamente ativos adicionais (por exemplo, administração em paralelo de GM-CSF) e podem ser formuladas com um carreador, um diluente ou um excipiente farmaceuticamente aceitável para gerar composições farmacêuticas (incluindo biológicas) ou veterinárias da presente divulgação adequadas para administração parenteral ou intratumoral.

[0096] Muitos tipos de formulação são possíveis como é considerado pelos peritos na arte. O tipo particular escolhido é dependente da rota de administração escolhida, que é bem reconhecida na arte. Por exemplo, formulações sistêmicas serão geralmente planejadas para administração através de injeção, por exemplo, intravenosa, bem como aquelas planejadas para fornecimento intratumoral. Preferencialmente, a formulação sistêmica ou intratumoral é esterilizada.

[0097] As soluções injetáveis esterilizadas são preparadas através da incorporação de MVA ou MVAΔE3L na quantidade requerida do solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados aqui, quando necessário, seguida por meios de esterilização apropriados. De forma geral, as dispersões são preparadas através da incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo esterilizado que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esterilizadas, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo ou de secagem por congelamento, que produzem um pó do vírus mais qualquer ingrediente desejado adicional partindo de uma solução esterilizada por filtração dos mesmos.

[0098] Em algumas modalidades, as composições de MVA e de MVAΔE3L da presente divulgação podem ser formuladas em soluções aquosas ou em soluções ou tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer, soluções de manitol ou tampão salino fisiológico. Em certas modalidades, qualquer uma das composições de MVA e de MVAΔE3L pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, de estabilização, de penetração ou de dispersão, tampões, lioprotetores ou conservantes tais como polietileno glicol, polissorbato 80, 1-dodecilhexahidro-2H-azepin-2-ona (laurocapran), ácido oleico, citrato de sódio, Tris HCl, dextrose, propileno glicol, manitol, monolaurato de polissorbato de polietilenossorbitana (Tween®-20), miristato de isopropila, álcool benzílico, álcool isopropílico, etanol sacarose, trealose e outros tais geralmente conhecidos na arte que podem ser utilizados em qualquer uma das composições da presente divulgação. (Pramanick et al., Pharma Times 45(3), 65-76 (2013))(65).

[0099] As composições biológicas ou farmacêuticas da presente divulgação podem ser formuladas para permitir que o vírus contido nas mesmas fique disponível para infectar células de tumor após a administração da composição a um indivíduo. O nível de vírus no soro, nos tumores e, se desejado, em outros tecidos após a administração pode ser monitorado através de várias técnicas bem estabelecidas, tais como ensaios à base de anticorpo (por exemplo, ELISA, imunohistoquímica etc.).

Dosagem de MVA e MVAΔE3L

[00100] Em geral, é administrada ao indivíduo uma dosagem de MVA e MVAΔE3L na faixa de aproximadamente 105 até aproximadamente 1010 unidades formadoras de placas (ufp), embora uma dose menor ou maior possa ser administrada. Em uma modalidade preferida, a dosagem é de aproximadamente 106-109 ufp. A equivalência de ufp às partículas virais pode diferir de acordo com o método de titulação de ufp específico utilizado. De forma geral, ufp é igual a aproximadamente 5 até 100 partículas virais. Uma quantidade terapeuticamente eficiente de MVA ou de MVAΔE3L pode ser administrada em uma ou mais doses divididas durante um período de tempo prescrito e a uma frequência de administração prescrita.

[00101] Por exemplo, como é evidente para os peritos na arte, uma quantidade terapeuticamente eficiente de MVA ou de MVAΔE3L de acordo com a presente divulgação pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, a idade, o sexo, o peso e a condição geral do indivíduo e a capacidade do MVA ou do MVAΔE3L de induzir uma resposta imunológica desejada no indivíduo particular (a resposta do indivíduo à terapia). No fornecimento do MVA ou do MVAΔE3L a um indivíduo, a dosagem também variará dependendo de fatores tais como a condição médica geral, o histórico médico prévio, a progressão de doença, a carga de tumor e similares.

[00102] Em algumas modalidades, pode ser vantajoso formular as composições da presente divulgação na forma de dosagem unitária para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária como é utilizada aqui se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos que serão tratados; cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao carreador aceitável farmaceuticamente ou na medicina veterinária necessário. Administração e regime terapêutico de MVA e de MVAΔE3L

[00103] A administração de MVA e de MVAΔE3L pode ser conseguida utilizando mais de uma rota, incluindo administração parenteral, por exemplo, intratumoral ou intravenosa. Em uma modalidade, o MVA ou o MVAΔE3L é administrado diretamente dentro do tumor, por exemplo, através de injeção intratumoral, onde é desejada uma reação local direta. Adicionalmente, as rotas de administração de MVA e de MVAΔE3L podem variar, por exemplo, a primeira administração utilizando uma injeção intratumoral e a administração subsequente através de uma injeção intravenosa ou qualquer combinação das mesmas. Uma quantidade terapeuticamente eficiente de injeção de MVA ou de MVAΔE3L pode ser administrada ao longo de um período de tempo prescrito e em uma frequência de administração prescrita. Em certas modalidades, o MVA e o MVAΔE3L podem ser utilizados em associação a outros tratamentos terapêuticos. Por exemplo, o MVA e o MVAΔE3L podem ser administrados em um cenário neoadjuvante (pré-operatório) ou adjuvante (pós- operatório) a indivíduos afligidos com tumores primários volumosos. É previsto que tal regime terapêutico aprimorado irá induzir uma resposta imunológica contra o tumor e irá reduzir a carga de tumor em um indivíduo antes ou depois da terapia primária, tal como cirurgia. Além disso, o MVA ou o MVAΔE3L pode ser administrado em associação a outros tratamentos terapêuticos tal como quimioterapia ou radiação.

[00104] Em certas modalidades, o vírus MVA ou MVAΔE3L é administrado pelo menos uma vez por semana ou por mês, mas pode ser administrado mais frequentemente, se necessário, tal como duas vezes por semana durante várias semanas, meses, anos ou até mesmo indefinidamente enquanto persistirem os benefícios. Administrações mais frequentes são consideradas se toleradas e se resultarem em benefícios prolongados ou maiores. Os benefícios dos presentes métodos incluem, mas sem limitação, os seguintes: redução do número de células cancerosas, redução do tamanho do tumor, erradicação do tumor, inibição de infiltração de células cancerosas nos órgãos periféricos, inibição ou estabilização ou erradicação do crescimento metastásico, inibição ou estabilização do crescimento do tumor e estabilização ou melhora da qualidade de vida. Além disso, os benefícios podem incluir a indução de uma resposta imunológica contra o tumor, a ativação de células T CD4+ efetoras, um aumento de células T CD8+ efetoras ou uma redução de células CD4+ reguladoras. Por exemplo, no contexto de melanoma ou, um benefício pode ser uma falta de recaídas ou metástase dentro de um, dois, três, quatro, cinco ou mais anos do diagnóstico inicial de melanoma. Avaliações similares podem ser feitas para câncer de cólon e outros tumores sólidos.

[00105] Em certas outras modalidades, a massa do tumor ou as células de tumor são tratadas com o MVA ou o MVAΔE3L in vivo, ex vivo ou in vitro.

EXEMPLOS Materiais e Métodos Vírus e Linhagens de células

[00106] Os vírus MVA e MVAΔE3L foram gentilmente fornecidos por Gerd Sutter (University of Munich) e propagados em células BHK-21 (célula renal de hamster bebê, ATCC CCL-10). O MVA está disponível comercialmente e/ou publicamente. O método de produção de Vírus MVAΔE3L foi descrito (28)(Hornemann et al., J Virol 77, 8394-8407 (2003)). Os vírus foram purificados através de uma almofada de sacarose a 36%. As BHK-21 foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo de Eagle (Eagle’s MEM, pode ser obtido na Life Technologies, Cat# 11095-080) contendo 10% de FBS, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais (NEAA) e 50 mg/mL de gentamicina. A linhagem de célula de melanoma de camundongo B16-F10 foi originalmente obtida de I. Fidler (MD Anderson Cancer Center). As células B16-F10 foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100 Unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,1 mM de NEAA, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio e 10 mM de tampão HEPES. As células cancerosas de adenocarcinoma de cólon MC38 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen). Todas as células foram crescidas a 37^C em uma incubadora com 5% de CO2.

[00107] As células e as linhagens de células utilizadas aqui estão disponíveis comercialmente ou publicamente a não ser que seja indicado o contrário.

Camundongos

[00108] Fêmeas de camundongos C57BL/6J entre 6 e 10 semanas de idade foram obtidas no Jackson Laboratory e foram utilizadas para a preparação de células dendríticas derivadas da medula óssea e como os camundongos de controle para experimentos in vivo. Estes camundongos foram mantidos na unidade de animais no Sloan Kettering Institute. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institute of Health. O protocolo foi aprovado pelo Committee on the Etics of Animal Experiments of Sloan-Kettering Cancer Institute. Os camundongos cGAS-/-, IRF3-/-, IRF7-/-, MAVS-/-, MDA5-/- e STINGGt/Gt foram gerados nos laboratórios dos Drs. Zhijian Chen (University of Texas Southwestern Medical Center; cGAS-/- e MAVS-/-), Tadatsugu Taniguchi (University of Tokyo; IRF3-/- e IRF7-/-), Marco Colonna (Washington University, MDA5-/-) e Russell Vance (University of California, Berkeley; STINGGt/Gt).

[00109] As fontes comerciais para estes ou animais comparáveis são as seguintes: Produção de células dendríticas derivadas da medula óssea

[00110] As células da medula óssea da tíbia e do fêmur de camundongos foram coletadas removendo primeiramente os músculos dos ossos e então retirando por lavagem as células utilizando seringas de insulina U-100 de 0,5 cc (Becton Dickinson) com RPMI com 10% de FCS. Após a centrifugação, as células foram ressuspensas em ACK Lysing Buffer (Lonza) para lise das células sanguíneas vermelhas através da incubação das células em gelo durante 1-3 min. As células foram então coletadas, ressuspensas em meio fresco e filtradas através de uma peneira de células de 40 μm (BD Biosciences). O número de células foi contado. Para a produção de GM-CSF-BMDCs, as células da medula óssea (5 milhões de células em cada placa de cultura de células de 15 cm) foram cultivadas em MC na presença de GM-CSF (30 ng/mL, produzido pela unidade Monoclonal Antibody Core no Sloan Kettering Institute) durante 10-12 dias. O MC é o meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 Unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,1 mM de aminoácidos essenciais e não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio e 10 mM de tampão HEPES. As células foram alimentadas a cada 2 dias através da substituição de 50% do meio antigo por meio fresco e replaqueadas a cada 3-4 dias para remover as células aderentes. Somente as células não aderentes foram utilizadas para os experimentos. Isolamento de RNA e PCR em tempo real

[00111] O RNA foi extraído dos lisados de células totais com um kit RNeasy Mini (Qiagen) e foi transcrito de forma inversa com um kit de síntese de cDNA First Strand (Fermentas). A PCR em tempo real quantitativa foi realizada em triplicata com SYBR Green PCR Mater Mix (Life Technologies) e o Equipamento de PCR em Tempo Real Applied Biosystems 7500 (Life Technologies) utilizando iniciadores específicos para o gene. A expressão relativa foi normalizada em relação aos níveis de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH).

[00112] Os iniciadores a seguir foram utilizados para PCR em tempo real: IFNA4 para frente: 5’-CCTGTGTGATGCAGGAACC-3’ (SEQ ID NO: 1), IFNA4 inverso: 5’-TCACCTCCCAGGCACAGA-3’ (SEQ ID NO: 2); IFNB para frente: 5’-TGGAGATGACGGAGAAGATG-3’ (SEQ ID NO: 3), IFNB inverso: 5’-TTGGATGGCAAAGGCAGT-3’ (SEQ ID NO: 4); CCL5 para frente: 5’-GCCCACGTCAAGGAGTATTTCTA-3’ (SEQ ID NO: 5), CCL5 inverso: 5’-ACACACTTGGCGGTTCCTTC-3’ (SEQ ID NO: 6); IL-6 para frente: 5’-AGGCATAACGCACTAGGTTT-3’ (SEQ ID NO: 7), IL-6 inverso: 5’-AGCTGGAGTCACAGAAGGAG-3’ (SEQ ID NO: 8); CXCL10 para frente: 5’ATTCTTTAAGGGCTGGTCTGA 3’ (SEQ ID NO:9) CXCL10 inverso: 5’CACCTCCACA TAGCTTACAGT 3’ (SEQ ID NO: 10) TNF para frente: 5’ GTCAGGTTGCCTCTGTCTCA 3’ (SEQ ID NO: 11) TNF inverso: 5’TCAGGGAAGAGTCTGGAAAG 3’ (SEQ ID NO: 12) GAPDH para frente: 5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3’ (SEQ ID NO: 13), GAPDH inverso: 5’-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3’ (SEQ ID NO: 14).

[00113] A expressão relativa foi normalizada em relação aos níveis de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GADPH).

Ensaios de citocinas

[00114] As células foram infectadas com vários vírus a uma MOI de 10 durante 1 h ou infectadas de forma simulada. O inóculo foi removido e as células foram lavadas com PBS duas vezes e incubadas com meio fresco. Os sobrenadantes foram coletados em vários momentos após a infecção. Os níveis de citocina foram medidos através da utilização de kits de ensaios imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA) para IFN-α/β (PBL Biomedical Laboratories), IL-6, CCL4 e CCL5 (R & D systems).

Análise de Western Blot

[00115] As BMDCs, células B16-F10 ou MC38 (1 x 106) foram infectadas com MVA a uma MOI (multiplicidade de infecção) de 10 ou uma quantidade equivalente de MVA ou MVAΔE3L. Em vários momentos após a infecção, o meio foi removido e as células foram coletadas. Foram preparados lisados de células totais. Quantidades equivalentes de proteínas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio e os polipeptídeos foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose. A fosforilação de IRF3 foi determinada utilizando um anticorpo policlonal de coelho específico para a fosfosserina-396 de IRF3 (Cell Signaling). O nível de IRF3 foi determinado utilizando um anticorpo policlonal de coelho contra IRF3 (Cell Signaling). Os anticorpos anti-STING foram obtidos na Cell Signaling. O nível da proteína E3 de vaccinia foi determinado através da utilização de anticorpo monoclonal anti-E3 (MAb 3015B2) gentilmente fornecido pelo Dr. Stuart N. Isaacs (University of Pennsylvania) (66)(Weaver et al. Virus Res 130: 269-274 (2007)). Os anticorpos anti-PARP e anti-MCL-1 (Cell Signaling) foram utilizados para determinar a clivagem de PARP e a degradação da proteína MCL-1. Anticorpos anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GADPH) ou anti-β-actina (Cell Signaling) foram utilizados como controles de carga.

Implante de tumor e injeção intratumoral com vírus

[00116] Células de melanoma B16-F10 (1x 105) foram implantadas de forma intradermal na pele com os pelos raspados no flanco direito de camundongos C57BL/6J. Depois de 10 até 12 dias após o implante, os tamanhos dos tumores foram medidos e os tumores que tinham 3 mm de diâmetro ou maiores foram injetados com MVA ou MVAΔE3L (2 x 107 ufp) ou PBS quando os camundongos estavam sob anestesia. Os vírus foram injetados semanalmente ou quando especificado em cada experimento. Os camundongos foram monitorados diariamente e os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes por semana. Os volumes dos tumores foram calculados de acordo com a fórmula a seguir: l (comprimento) x w (largura)x h(altura)/2. Os camundongos foram submetidos à eutanásia com sinais de sofrimento ou quando o diâmetro do tumor atingia 10 mm. O soro foi coletado quando os camundongos eram submetidos à eutanásia.

[00117] Células de adenocarcinoma de cólon de camundongo MC38 (2 x 105) foram implantadas de forma intradermal na pele com os pelos raspados no flanco direito de camundongos C57BL/6J. Depois 7 dias após o implante, os tamanhos dos tumores foram medidos e tumores que tinham 2-3 mm de diâmetro foram injetados com PBS ou MVAΔE3L (2 x 107 ufp) quando os camundongos estavam sob anestesia. Os tamanhos dos tumores foram medidos em vários dias após a injeção viral.

Modelo de implante de tumor bilateral e injeção intratumoral com MVA ou MVAΔE3L

[00118] Sucintamente, as células de melanoma B16-F10 foram implantadas de forma intradermal nos flancos esquerdo e direito de camundongos C57B/6 (5 x 105 no flanco direito e 1 x 105 no flanco esquerdo). 8 dias após o implante de tumor, os tumores maiores no flanco direito foram injetados de forma intratumoral com 2 x 107 ufp de MVA ou uma quantidade equivalente de MVAΔE3L. Os tamanhos dos tumores foram medidos e os tumores receberam nova injeção duas vezes por semana. A sobrevivência dos camundongos foi monitorada.

[00119] Em alguns experimentos, as células de adenocarcinoma de cólon MC38 foram implantadas de forma intradermal nos flancos esquerdo e direito de camundongos C57B/6 (5 x 105 no flanco direito e 1 x 105 no flanco esquerdo).

Citometria de fluxo

[00120] Para analisar os fenótipos e as características das células imunológicas nos tumores ou nódulos linfáticos que drenam o tumor, foram geradas suspensões de células antes da análise de FACS de acordo com o protocolo a seguir (46)(Zamarin et al., Science Translational Medicine 6, 226-232 (2014)). Primeiramente, os tumores foram isolados utilizando fórceps e tesouras cirúrgicas três dias após o tratamento com MVA ou PBS. Os tumores foram então pesados. Os tumores ou os nódulos linfáticos que drenam o tumor foram cortados em pedaços antes da incubação com Liberase (1,67 Wünsch U/mL) e DNase (0,2 mg/mL) durante 30 minutos a 37°C. As suspensões de células foram geradas por pipetação repetida, filtradas através de um filtro de nylon de 70 μm e então lavadas com RPMI completo antes da purificação com Ficoll para remover as células mortas. As células foram processadas para marcação da superfície com anticorpos anti-CD3, CD45, CD4 e CD8. As células vivas são distinguidas das células mortas através da utilização de corante fixável eFluor506 (eBioscience). Foram adicionalmente permeabilizada utilizando o kit de fixação e permeabilização de FoxP3 (eBioscience) e coradas para Ki-67, FoxP3 e Granzyme B. Para a coloração da população de células mieloides, anticorpos conjugados com Fluorocromo contra CD45.2 (104), CD11b (M1/70), Ly-6C (HK1.4), MHC II (M5/114,15.2), CD24 (M1/69), F4/80 (BM8), CD103 (2E7) e CD11c (N418) foram obtidos na eBioscience. Todos os anticorpos foram testados com seus respectivos controles de isotipo. Os dados foram adquiridos utilizando o citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences). Os dados foram analisados com o software FlowJo (Treestar).

Reagentes

[00121] As fontes comerciais para os reagentes eram as seguintes: oligodesoxinucleotídeo CpG ODN2216 (Invitrogen); o cGAMP foi obtido na InvivoGen. Os anticorpos anti-PARP, anti-Mcl1 foram obtidos na Cell Signaling. Os anticorpos utilizados para citometria de fluxo foram obtidos na eBioscience (CD45.2 Alexa Fluor 700, CD3 PE-Cy7, CD4 APC- efluor780, CD8 PerCP-efluor710, FOXP3 Alexa Fluor 700, CD45.2 eFluor 450, CD11b APC-eFluor 780, Ly-6C PE, MHC II PE-eFluor 610, CD24 APC, F4/80 PerCP-Cy5.5, CD103 FITC, CD11c Alexa Fluor 700). Invitrogen (CD4 QDot 605, Granzyme B PE-Texas Red, Granzyme B APC), BD Pharmingen (Ki-67-Alexa Fluor 488). Os anticorpos anti-fosfosserina- 396 de IRF3 e anti-IRF3 foram obtidos na Cell Signaling.

Estatística

[00122] O teste t de Student não pareado de duas caudas foi utilizado para comparações de dois grupos nos estudos. Os dados de sobrevivência foram analisados através do teste log-rank (Mantel-Cox). Os valores de p considerados significativos são indicados nas figuras como a seguir: *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ****, P < 0,0001.

Preparação de linfócitos que se infiltram no tumor (TIL)

[00123] Os tumores foram dissociados dos camundongos e o peso total do tumor foi avaliado antes de triturado com tesouras. Os tumores foram então digeridos com 1,7 U/mL de Liberase (Roche) e 100 μg/mL de DNAse (Sigma) em RPMI 1640 e incubados no agitador a 37oC durante 30 min. Após a digestão, as amostras de células foram diluídas em RPMI 1640 e passadas através de uma peneira de células. A seguir, as células foram lavadas com RPMI 1640 e ressuspensas em tampão de FACS. As células isoladas foram mantidas em gelo antes da coloração para análise de citometria de fluxo.

Citometria de fluxo de TIL

[00124] Os TILs foram pré-incubados com 2.4G2 mAb para bloquear a ligação de FCYR e corados com conjuntos de anticorpos durante 30 min em gelo. Os anticorpos conjugados com fluorocromo contra CD45.2 (104), CD11b (M1/70), Ly-6C (HK1.4), MHC D (M5/114,15.2), CD24 (M1/69), F4/80 (BM8), CD103 (2E7) e CD11c (N418) foram obtidos na eBioscience. Todos os anticorpos foram testados com seus respectivos controles de isotipo. A viabilidade foi avaliada através da coloração com o kit LIVE/DEAD (Invitrogen). Todas as amostras foram adquiridas com um citômetro de fluxo LSRII (Becton Dickinson) e analisadas com o software FlowJo (Tree Star). Protocolo para a Produção de Fibroblastos Primários da Pele de Camundongo

[00125] Os camundongos foram submetidos à eutanásia através da inalação de CO2, raspados e quimicamente depilados. Foram submersos em etanol a 70% durante 1-2 min. A pele do tronco foi cortada e colocada em PBS sobre a tampa de uma placa de cultura de tecido de 100 mm e esticada com a face da epiderme para baixo. Após a remoção do tecido subcutâneo por raspagem da face de derme utilizando dois pares de fórceps, as amostras de pele foram incubadas com 500 μL de dispase (0,5 U/mL)/PBS durante 45 min a 37°C. As amostras de pele foram colocadas sobre a tampa de uma placa de cultura de tecido de 100 mm com a face da epiderme voltada para cima e a epiderme foi removida mecanicamente utilizando dois pares de fórceps. As lâminas da derme foram lavadas com PBS quatro vezes antes de serem digeridas em colagenase do tipo I (4mg/mL em PBS com 1% de BSA) durante três horas a 37°C. As células foram cultivadas em meio DME com 20% de FBS durante 1-2 semanas.

Exemplo 1 MVA induz a produção de IFN do tipo I em cDCs de camundongo

[00126] Para testar se o MVA pode provocar a indução de IFN do tipo I, as células dendríticas derivadas da medula óssea foram cultivadas na presença de GM-CSF (GM-CSF-BMDCs ou cDCs) e infectadas com WT VAC ou MVA a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. Os sobrenadantes foram coletados em vários pontos de tempo após a infecção (1, 4, 8, 14 e 22 horas) e os níveis das proteínas IFN-α e IFN-β foram avaliados por ELISA. Como mostrado na Figura 1A, tanto IFN-α quanto IFN-β foram detectados em 8 h após a infecção com MVA e continuavam a se acumular até 24 h após a infecção.

[00127] Para testar se a infecção com WT VAC ou com MVA das cDCs afeta a expressão gênica de IFN do tipo I, uma análise de PCR em tempo real quantitativa foi realizada utilizando RNA isolado de cDCs cultivadas com GM-CSF infectadas com WT VAC ou MVA em 6 h após a infecção. Controles de infecção simulada também foram incluídos no experimento. Como demonstrado na Figura 1B, a infecção das cDCs com MVA aumentou os níveis de mRNA de IFNA4 e IFNB em 6 vezes e 105 vezes, respectivamente, quando comparados com os das células não tratadas. Em contraste, a infecção com WT VAC aumentou os níveis de mRNA de IFNA4 e IFNB em 2 vezes e 6 vezes, respectivamente (Figura 1B). Estes resultados indicam que o MVA é um indutor substancialmente mais forte da expressão gênica de IFNA4 e IFNB que o WT VAC (p < 0,001). Este experimento ilustra que WT VAC e MVA possuem efeitos diferentes sobre o sistema imunológico do hospedeiro (aqui avaliados através do efeito sobre as células dendríticas) partindo da capacidade de MVA, mas não de WT VAC, de induzir a expressão de interferons do Tipo I representados por IFN-α e IFN-β. Exemplo 2 A produção de IFN do tipo I induzida por MVA em cDCs de camundongo é dependente de IRF3/IRF7/IFNAR1

[00128] Os fatores de transcrição IRF3 e IRF7 são reguladores importantes da indução de IFN do tipo I e são críticos para a defesa do hospedeiro contra infecções virais (67)(Sato et al., Immunity 13: 539-548, 2000). Para testar se a indução de IFN do tipo I pelo MVA requer IRF3 e IRF7, foram geradas cDC partindo de camundongos IRF3-/-, IRF7-/- e WT (de idade correspondente) e infectados com MVA. A secreção de IFN-α/β induzida pelo MVA foi abolida nas cDCs deficientes em relação a IRF3 (Figura 2A). As células IRF7-/- falham em produzir IFN-α em resposta à infecção com MVA, enquanto que a indução de IFN-β era reduzida em 57% nas células IRF7-/- infectadas com MVA (Figura 2B).

[00129] Para avaliar se a alça de retroalimentação positiva do IFN do tipo I mediada por IFNAR1 é necessária para a indução de IFN, cDCs IFNAR1-/- e controles WT foram infectados com MVA a uma MOI de 10 e os níveis de secreções de IFN-α/β foram avaliados por ELISA. A indução de IFN-α por MVA foi abolida nas células IFNAR1-/-, enquanto que a indução de IFN-β por MVA foi reduzida em 45% nas células IFNAR1-/- comparadas com os controles WT (Figura 2C). Coletivamente, estes resultados indicam que: (i) IRF3 é o fator de transcrição crítico para a produção de IFN do tipo I induzida por MVA e (ii) IRF7 e IFNAR1 desempenham funções na amplificação da sinalização de IFN do tipo I induzida pela infecção com MVA. Estes resultados, portanto, confirma a capacidade de MVA de induzir IFN do tipo I através de um mecanismo relevante na ativação do sistema imunológico. Exemplo 3 A indução do IFN do tipo I provocada por MVA é dependente de STING

[00130] STING é uma proteína associada ao retículo endoplasmático essencial para a indução do IFN do tipo I em resposta ao DNA ou a agentes patogênicos intracelulares incluindo bactérias e vírus de DNA (68, 69)(Ishikawa et al. Nature 455: 674-678 (2008); Barber et al. Curr Opin Immunol 23: 10-20 (2011). Para testar se STING é necessário para a indução do IFN do tipo I nas cDCs pelo MVA, as cDCs foram geradas partindo dos camundongos mutantes Goldenticket (Gt) induzidos por N- etil-N-nitrosoureia (ENU) (StingGt/Gt) que carregam um variante nucleotídico único de Sting resultando em um alelo funcionalmente nulo (70)(Sauer et al. Infect Immun 79: 688-694 (2011)). As cDCs de camundongos WT de idade correspondente foram utilizadas como um controle. As células foram infectadas com MVA a uma MOI de 10 ou tratadas com lipopolissacarídeo (LPS). A indução de IFN-α/β com MVA foi abolida nas células StingGt/Gt, enquanto que a produção de IFN-α/β induzida por LPS não foi afetada (Figura 3A). A indução do mRNA de IFNA4 por MVA foi reduzida de 6 vezes nas células WT para 2 vezes nas células StingGt/Gt, enquanto que a indução do mRNA de IFNB por MVA foi reduzida de 133 vezes nas células WT para 14 vezes nas células StingGt/Gt (Figura 3B). Além disso, a análise de Western blot demonstrou que a fosforilação de IRF3 induzida por MVA atingia o máximo em 4 e 6 h após a infecção nas cDCs WT e era ausente nas cDCs StingGt/Gt (Figura 3C). Juntos, estes resultados demonstram que STING é essencial para a produção de IFN do tipo I induzida por MVA e a fosforilação de IRF3 nas cDCs.

[00131] A capacidade de MVA de ativar STING e sua via de sinalização a jusante incluindo o fator de transcrição IRF3 o tornam diferente do WT VAC competente em relação à replicação, que é incapaz de ativar STING/IRF3. Os inventores pressupõem que o mecanismo de imunidade antitumor mediado por MVA seria diferente do mecanismo de efeitos oncolíticos mediado por WT VAC ou VAC competente em relação à replicação recombinante com deleção da timidina quinase. Exemplo 4 MVA provoca a produção de IFN do tipo I in vivo de uma maneira dependente de STING/IRF3

[00132] Para testar se o MVA provoca a produção de IFN do tipo I in vivo de uma maneira dependente de STING/IRF3, Sting+/+, StingGt/Gt e IRF3-/- foram infectadas com 2 x 107 ufp através de injeção na veia caudal. O soro foi coletado 6 h após a infecção. A infecção com MVA de camundongos Sting+/+ induziu a produção de IFN-α e IFN-β até os níveis de 798 pg/mL e 1017 pg/mL, respectivamente, que foi abolida em camundongos StingGt/Gt e IRF3-/- (Figura 3D). Estes resultados indicam que a produção de IFN do tipo I induzida por MVA in vivo também é dependente de STING e do fator de transcrição IRF3.

[00133] A capacidade de MVA de induzir a produção de IFN do tipo I de uma maneira dependente de STING/IRF3, através do fornecimento intravenoso, também aponta para os efeitos terapêuticos dependentes de IFN mediados por MVA. Exemplo 5 cGAS é necessária para a indução de IFN do tipo I por MVA nas cDCs

[00134] A via de STING/IRF3 pode ser ativada por GMP-AMP cíclico (cGAMP), um segundo mensageiro produzido pela GMP-AMP cíclico sintase (cGAS) em resposta à infecção com vírus de DNA (71)(Sun et al. Science 339: 786-791 (2013). Para testar se a infecção com MVA de cDCs provoca a indução de IFN do tipo I através da via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada pelo sensor de DNA citoplasmático cGAS, as cDCs foram geradas partindo de camundongos cGAS-/- (72)(Li et al., Science 341(6152): 1390-1394 (2013)) e controles WT de idade correspondente e infectados com MVA. Como mostrado na Figura 4A, a produção de IFN-α/β induzida por MVA foi abolida nas células cGAS-/-. A indução de mRNA de IFNA4 e IFNB pelo MVA também foi reduzida em células cGAS-/- comparas com as células WT (Figura 4B). Finalmente, a análise de Western blot demonstrou que a fosforilação de TBK1 e IRF3 induzida por MVA estava ausente nas células cGAS-/- (Figura 4C). Estes resultados demonstram que cGAS é um sensor de DNA citoplasmático crítico para MVA. Exemplo 6 MVAΔE3L induz níveis mais altos de produção de IFN do tipo I em cDCs de camundongo que MVA

[00135] E3 é um fator de virulência importante que atenua várias respostas imunológicas inatas, inclusive a indução de IFN do tipo I. O MVA mantém o gene E3L. A análise de Western blot mostrou que a proteína E3 era produzida nas BMDCs infectadas com WT VAC e MVA, mas não nas células infectadas com MVAΔE3L (Figura 5A). Para testar se E3 desempenha uma função inibidora na sensibilização de MVA nas cDCs, a indução da expressão gênica de IFN do tipo I foi comparada entre MVA e MVAΔE3L. Foi descoberto que o MVAΔE3L induzia níveis mais altos de mRNAs de IFNA4 e IFNB que o MVA (Figura 5B) (P < 0,001). Esta indução foi abolida nas células que não possuem o fator de transcrição IRF3 (Figura 5C). Além disso, a análise de Western blot demonstrou que a infecção com MVAΔE3L induzia nível mais alto de fosfo-IRF3 que o MVA tanto em 4 quanto em 8 h após a infecção (Figura 5D). Estes resultados sugerem que E3 suprime a sensibilização imunológica inata de MVA e que a remoção de E3 do MVA resulta na maior ativação da expressão gênica de IFN do tipo I. Os inventores pressupõem que o MVAΔE3L pode efeitos antitumor mais fortes que o MVA devido a sua capacidade superior de induzir IFN do tipo I comparada com a do MVA. Exemplo 7 A via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS desempenha uma função importante na indução de IFN do tipo I provocada por MVAΔE3L nas cDCs

[00136] Para testar se a infecção com MVAΔE3L das cDCs provoca indução de IFN do tipo I através da via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada pelo sensor de DNA citoplasmático cGAS (GMP- AMP cíclico sintase) (71, 73)(Sun et al., Science 339(6121): 786-791 (2013); Wu et al., Science 339(6121): 826-830 (2013)) e seu adaptador STING (68, 74)(Ishikawa et al., Nature 455(7213): 674-678 (2008); Gao et al., Cell 154(4): 748-762 (2013)), as cDCs foram geradas partindo de camundongos cGAS-/- (72)(Li et al., Science 341(6152): 1390-1394 (2013)) e controles WT de idade correspondente e infectados com MVAΔE3L. Utilizando a análise de PCR em tempo real quantitativa, foi descoberto que a expressão gênica de IFNA4 e IFN-β induzida por MVAΔE3L em 6 h após a infecção era reduzida nas células deficientes em relação à cGAS (Figura 6A, P <0,001). A análise de ELISA dos sobrenadantes coletados 22 h após a infecção também mostrou que a secreção de IFN-α/β induzida por MVAΔE3L era significativamente reduzida em células deficientes em relação à cGAS (Figura 6B, P <0,001). Em contraste, o tratamento com cGAMP à concentração final de 15 μM induziu a secreção de IFN-α/β em ambas as cDCs WT e cGAS-/- em níveis similares. Finalmente, a análise de Western blot demonstrou que a fosforilação de IRF3 induzida por MVAΔE3L estava ausente em 2 e 4 h após a infecção e era significativamente reduzida em 6 e 8 h após a infecção nas células cGAS-/- (Figura 4C). Estes resultados demonstram que cGAS é um sensor de DNA citoplasmático crítico para MVAΔE3L. Estes resultados também implicam que a capacidade de MVAΔE3L de induzir a via de cGAS/STING nas células dendríticas pode contribuir para seus benefícios terapêutico. Com base nos resultados obtidos pelos presentes inventores com MVA inativado e descritos na PCT US2016/019663 depositada em 25 de fevereiro de 2016, incorporada como referência em sua totalidade para todas as finalidades, os inventores esperam que os efeitos antitumor de MVAΔE3L serão reduzidos em camundongos que são deficientes em relação a cGAS ou STING. WT VAC com deleção de E3 é incapaz de induzir IFN do tipo I nas células dendríticas (dados não mostrados), indicando que o(s) inibidor(es) viral(is) da via de cGAS/STING expresso(s) pelo WT VAC poderia(m) estar ausente(s) no MVA. Exemplo 8 A via de sensibilização de dsRNA citoplasmático mediada por MDA5/MAVS também contribui para a produção de IFN do tipo I induzida por MVAΔE3L nas cDCs

[00137] A análise de Western blot mostrou que a fosforilação de IRF3 induzida por MVAΔE3 era diminuída em 4 h e reduzida em 8 h após a infecção nas cDCs derivadas da medula óssea deficiente em relação a STING geradas partindo de camundongos STINGGt/Gt comparadas com células WT (Figura 7A). A fosforilação de IRF3 induzida por MVAΔE3L também era reduzida em 8 h após a infecção nas cDCs MAVS-/- comparadas com células WT (Figura 7A). Estes resultados sugerem que a infecção das cDCs com MVAΔE3L poderia ser detectada tanto através da via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS/STING bem como através da via de sensibilização de dsRNA citoplasmático mediada por MDA5/MAVS. Para testar tal hipótese, foram gerados camundongos STINGGt/Gt/MDA5-/- e foram isoladas cDCs duplo deficientes. A fosforilação induzida por MVAΔE3L de TBK1 e IRF3 foi abolida nas células STINGGt/Gt/MDA5-/- (Figura 7B). Estes resultados indicam que a via de sensibilização de dsRNA citoplasmático também desempenha uma função na sensibilização do dsRNA produzido por MVAΔE3L. Considerados juntos, estes resultados demonstram que a infecção com MVAΔE3L nas cDCs leva à detecção citoplasmática de DNA e dsRNA do vírus através das vias de sinalização de cGAS/STING e MDA5/MAVS, respectivamente, que resulta na ativação de TBK1 e IRF3 e na indução de expressão gênica de IFN do tipo I. Foi mostrado que o fornecimento intravenoso de dsRNA sintético ativa MDA5 e induz efeitos antitumor (Tormo et al., 2009). A capacidade de MVAΔE3L de induzir MDA5 ativado através da produção de dsRNA tanto nas células imunológicas, fibroblastos (ver exemplo) quanto nas células de tumor (ver exemplo) também pode contribuir para seus benefícios terapêuticos. Exemplo 9 A via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS/STING desempenha uma função importante na expressão do gene induzida por MVAΔE3L nos fibroblastos primários de camundongo

[00138] Os fibroblastos dérmicos da pele constituem um tipo de célula importante nas células de melanoma de estroma, que contribuem para a progressão e a metástase do melanoma através da produção de fatores de crescimento e outros mediadores solúveis (Li et al., Oncogene 2003; Inada et al., 2015). Para investigar se os fibroblastos dérmicos da pele também respondem ao MVA ou ao MVAΔE3L, os inventores geraram fibroblastos primários da pele partindo de camundongos WT e cGAS-/- e infectaram os mesmos com MVA ou MVAΔE3L a uma MOI de 10. As células foram coletadas 6 h após a infecção. Utilizando a análise de PCR em tempo real quantitativa, os inventores descobriram que a infecção com MVAΔE3L induzia níveis mais altos de expressão gênica de Ifnb, Ccl4 e Il6 6 h após a infecção que o MVA (Figuras 8 A-D). A indução da expressão gênica de Ifnb, Ccl4, Ccl5 e Il6 por MVA e por MVAΔE3L foi reduzida nos fibroblastos deficientes em relação à cGAS (Figuras 8 A-D). Estes resultados demonstram que a infecção dos fibroblastos com MVA e com MVAΔE3L pode ser detectada pelo sensor de DNA citoplasmático cGAS, que leva à indução de IFNB e outras citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. STING é um adaptador crítico para a via de sensibilização de DNA citoplasmático. MDA5 é um sensor de dsRNA citoplasmático (Gitlin et al., PNAS 2006). Para testar se STING ou MDA5 ou ambos estão envolvidos na sensibilização de MVA ou MVAΔE3L nos fibroblastos da pele, os inventores geraram fibroblastos primários da pele partindo de camundongos WT, STINGGt/Gt, MDA5-/- e STINGGt/Gt MDA5-/- e infectaram os mesmos com MVA ou com MVAΔE3L. A análise de PCR em tempo real quantitativa mostrou que a expressão gênica de Ifnb, Ccl4, Ccl5 e Il6 induzida por MVA ou por MVAΔE3L era enormemente reduzida nas células deficientes em relação a STING, confirmando que a via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS/STING é crítica para a detecção de infecção viral e para a indução de uma imunidade inata antiviral. Havia alguns níveis residuais baixos da expressão gênica de Il6 e Ccl4 induzidos por MVAΔE3L nas células deficientes em relação a STING e tais níveis tinham desaparecido nas células duplo deficientes em relação a STING e a MDA5, indicando que MDA5 desempenha uma função secundária na detecção de dsRNA produzido pelo vírus MVAΔE3L. Os inventores concluem que nos fibroblastos primários dérmicos da pele, o MVA é detectado através da via de sensibilização de DNA citoplasmático de cGAS/STNG por induzir a expressão gênica de Ifnb, Ccl4, Ccl5 e Il6, enquanto que o MVAΔE3L ativa ambas as vias de cGAS/STING e de MDA5 por induzir imunidade inata. Exemplo 10 A via de sensibilização de DNA citoplasmático mediada por cGAS/STING desempenha uma função importante na produção de IFN do tipo I, citocinas inflamatórias e quimiocinas induzida por MVA e por MVAΔE3L nos fibroblastos primários de camundongo

[00139] Para correlacionar a secreção de proteínas partindo dos fibroblastos da pele infectados, os inventores coletaram os sobrenadantes de fibroblastos da pele de camundongos WT, STINGGt/Gt, MDA5-/- e STINGGt/Gt MDA5-/- infectados com MVA ou com MVAΔE3L e realizaram a análise de ELISA. Foi observado que a infecção com MVAΔE3L induzia níveis mais altos de secreção de IFN-β, IL-6 e CCL4 que o MVA. Similar ao que foi observado com a análise de expressão gênica, a secreção de IFN-β, IL-6 e CCL5 induzida por MVA foi abolida nas células deficientes em relação a STING. Embora IFN-β e CCL5 induzidos por MVAΔE3L fossem reduzidos nas células deficientes em relação a STING, havia níveis residuais de IL-6 e CCL4 nos sobrenadantes de células deficientes em relação a STING infectadas com o vírus MVAΔE3L, que foram abolidos nas células duplo deficientes em relação a STING e MDA5. Considerados juntos, estes resultados mostraram que os fibroblastos da pele são uma fonte importante para a produção de IFN-β, IL-6, CCL4 e CCL5 em resposta à infecção com MVA ou com MVAΔE3L, que é dependente da via de sensibilização de DNA citoplasmático. Os inventores pressupõem que os fibroblastos do estroma de tumor também são capazes de induzir IFN do tipo I e citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas em resposta aos vírus de ativação imunológica tal como MVA ou MVAΔE3L. Exemplo 11 A infecção de células de melanoma B16 com MVAΔE3L induz a produção de IFN do tipo I e citocinas inflamatórias/quimiocinas

[00140] Para testar se a infecção de células de melanoma B16 com MVAΔE3L também induz a produção de IFN do tipo I e citocinas inflamatórias/quimiocinas, as células de melanoma B16 foram infectadas com MVA ou MVAΔE3L a uma MOI de 10 ou infectadas de forma simulada (NT). As células foram coletadas 6 h após a infecção e a análise de PCR em tempo real foi realizada para analisar a expressão gênica. Como mostrado nas Figuras 10A-F, a infecção com MVAΔE3L induziu níveis mais altos de expressão dos genes IFNA4 (Figura 10A), IFNb (Figura 10B), Il6 (Figura 10C), TNF (Figura 10D), CCL5 (Figura 10E) e CXCL-10 (Figura 10F) que o MVA. Exemplo 12 A infecção de células de melanoma B16 com MVA ou MVAΔE3L induz a apoptose

[00141] A clivagem proteolítica da poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) pelas caspases é uma particularidade da apoptose. Foi mostrado que a E3 de vaccinia inibe a apoptose induzida pelo dsRNA em células HeLa (75, 76)(Kibler et al., J Virol 71, 1992-2003 (1997); Lee et al., Virology 199, 491-496 (1994)). O MVAΔE3L induz mais apoptose em fibroblastos embrionários de frango (CEFs) que o MVA (28)(Hornemann et al., J Virol 77, 8394-8407 (2003)). Para avaliar se o MVA e o MVAΔE3L induzem apoptose nas células de melanoma, as células de melanoma B16 foram infectadas com MVA ou com MVAΔE3L a uma MOI de 10 e a clivagem de PARP foi determinada utilizando a análise de Western blot. Como mostrado nas Figuras 9A, a infecção tanto com MVA quanto com MVAΔE3L provocou a clivagem de PARP da proteína de comprimento completo de 116 kDa no fragmento de 89 kDa 22 h após a infecção. Além disso, o MVAΔE3L induziu a clivagem de PARP de forma mais eficiente que o MVA (Figura 11A).

[00142] De acordo com a observação de que o MVA e o MVAΔE3L provocam apoptose, a infecção com MVA e com MVAΔE3L causava a degradação da proteína de leucemia de célula mieloide-1 (Mcl-1), um membro importante da família Bcl-2 antiapoptótica (Figura 11B). Considerados juntos, estes resultados mostram que a infecção de células de melanoma com MVAΔE3L provoca apoptose até a mesma ou ainda a uma extensão maior que o MVA. Exemplo 13 A injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L leva à sobrevivência prolongada de camundongos que carregam tumor e à produção de imunidade antitumor sistêmica

[00143] O modelo de melanoma B16 in vivo transplantável envolve o implante intradermal de células de melanoma B16F10 de camundongo (1 x 105) em um flanco dos camundongos C57B/6. Doze dias após o implante de tumor, quando os tumores tinham aproximadamente 3 mm de diâmetro, o MVA ou o MVAΔE3L (2 x 107 ufp) ou PBS foi injetado nos tumores semanalmente. A injeção intratumoral de MVA resultou na erradicação de tumor em 60% dos camundongos tratados e na sobrevivência prolongada no restante (Figuras 12B-D), enquanto que a injeção intratumoral de MVAΔE3L resultou na erradicação de tumor em 57% dos camundongos tratados e na sobrevivência prolongada no restante (Figuras 12B-D), demonstrando a excelente eficácia terapêutica com ambos os agentes. Em contraste, todos os camundongos com injeção intratumoral de PBS tiveram crescimento de tumor mantido e foram submetidos à eutanásia em uma média de 21 dias após o implante de tumor (Figuras 12A e D). No experimento inicial, a injeção intratumoral de MVA parecia ter eficácia antitumor pelo menos similar à do vírus MVAΔE3L.

[00144] Para testar se os camundongos cujos tumores foram erradicados após a injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L desenvolviam imunidade antitumoral sistêmica nos animais, os animais foram desafiados através da injeção intradermal de uma dose letal de células de melanoma B16 (5 x 104) na superfície contralateral 8 semanas após a erradicação dos tumores iniciais. Camundongos naive que nunca foram expostos às células de melanoma B16 ou aos vírus foram utilizados como um controle no experimento de desafio. Os animais foram acompanhados durante 70 dias após o desafio com tumor. 80% dos camundongos tratados com MVA e 100% dos camundongos tratados com MVAΔE3L sobreviveram ao desafio com tumor, enquanto que todos os camundongos naive desenvolveram tumores em crescimento e foram eventualmente submetidos à eutanásia (Figura 10E). Coletivamente, estes resultados sugerem que a injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L leva à erradicação de tumor, à sobrevivência prolongada, bem como ao desenvolvimento de imunidade antitumor sistêmica. Em adição, este experimento indica a eficácia dos tratamentos divulgados na inibição da metástase representada pelo desafio com tumor. Exemplo 14 A injeção intratumoral de MVA leva a alterações imunológicas no ambiente de tumor

[00145] Para investigar as alterações imunológicas dentro dos tumores induzidos pela injeção intratumoral de MVA, os tumores foram coletados 3 dias após a injeção intratumoral de MVA ou PBS e os infiltrados de células imunológicas foram analisados por FACS. Foi observado que a porcentagem de células T Foxp3+CD4+ (isto é, células T CD4+ reguladoras) diminuiu de 34,7% nos tumores tratados com PBS para 7,0% nos tumores tratados com MVA (P<0,0001, Figuras 13A-C). Também foi observado um aumento na porcentagem de células T CD8+ que expressavam Granzyme B (isto é, que expressavam o fenótipo citotóxico) dentro dos tumores tratados com MVA (89%) comparados com aqueles tratados com PBS (31%) (P<0,0001, Figuras 13D-F). A porcentagem de células T Ki-67+CD8+ (isto é, células T CD8+ proliferativas) foi aumentada de 51% nos tumores tratados com PBS para 76% nos tumores tratados com MVA (P=0,0004, Figura 11, G-I). Estes resultados indicam que a injeção intratumoral de MVA regula substancialmente para mais as respostas imunológicas no microambiente de tumor, incluindo a proliferação e a ativação das células T CD8+ citotóxicas e uma redução concomitante de células T CD4+ reguladoras dentro dos tumores. É esperado observar alterações similares nos infiltrados de células imunológicas dentro dos tumores tratados com MVAΔE3L. Estes experimentos foram planejados. Exemplo 15 A injeção intratumoral de MVA também induz alterações imunológicas nos nódulos linfáticos que drenam o tumor (TDLNs)

[00146] Para testar se a injeção intratumoral de MVA causa também alterações imunológicas nos TDLNs, foram isolados os TDLNs dos camundongos injetados com MVA ou PBS três dias após o tratamento e foram analisados por FACS. A porcentagem de células T Granzyme B+CD8+ nos TDLNs aumentou de 0,15% nos camundongos tratados com PBS para 4,6% nos camundongos tratados com MVA (P=0,0002, Figuras 14A-C). Em adição, a porcentagem de células T Ki-67+CD8+ aumentou de 7,2% nos camundongos tratados com PBS para 15% nos camundongos tratados com MVA (P=0,0008, Figuras 14D-F). Estes resultados indicam que há mais células T CD8+ ativadas e replicantes nos TDLNs em camundongos tratados com MVA que nos camundongos tratados com PBS. Considerados juntos, estes resultados indicam que a injeção intratumoral de MVA leva à ativação e à proliferação de ambas as células T CD8+ não somente localmente dentro do tumor, mas também de forma sistêmica no hospedeiro. Exemplo 16 A infecção com MVA e com MVAΔE3L de células de adenocarcinoma de cólon de camundongo MC38 induz a produção de IFN do tipo I e citocinas inflamatórias/quimiocinas

[00147] Para se dirigir ao fato de que o MVA e o MVAΔE3L também provocam respostas similares em outros tipos de células de tumores sólidos, as capacidades do MVA e do MVAΔE3L de induzir a via do IFN do tipo I foram testadas nas células de adenocarcinoma de cólon MC38. As células MC38 foram infectadas com MVA ou MVAΔE3L a uma MOI de 10 ou controle de infecção simulada. Os sobrenadantes foram coletados 22 h após a infecção. Utilizando ELISA, foi determinado que o MVAΔE3L induzia níveis mais altos de produção de IFN-β, IL-6, CCL4 e CCL5 nas células MC38 que o MVA (Figuras 15A-D). Similarmente, a análise de PCR em tempo real revelou que a infecção com MVAΔE3L provocava níveis mais altos de expressão dos genes Ifnb, Il6, Ccl4 e Ccl5 nas células MC38 que o MVA (Figuras 15E-H). A análise de Western blot demonstrou que a infecção com MVAΔE3L provocava níveis mais altos de fosforilação de IRF3 que o MVA nas células MC38 22 h após a infecção (Figura 15I). Estes resultados mostram que a eficácia do presente tratamento não fica limitada a melanoma. Além disso, porque a escolha do carcinoma de cólon foi arbitrária e porque os dois tumores não eram relacionados. Além do fato de ambos serem tumores sólidos e de origem de células basais (carcinomas), os presentes resultados podem ser extrapolados para todos os carcinomas. Além disso, devido ao fato de que os presentes inventores mostraram que MVA e MVAΔE3L exercem sua atividade sobre o sistema imunológico de forma sistêmica e de uma maneira independente de antígeno de tumor, as presentes descobertas podem ser adicionalmente extrapoladas para tumores sólidos. Exemplo 17 A infecção de células de adenocarcinoma de cólon de camundongo MC38 com MVAΔE3L induz a apoptose

[00148] Para investigar se o MVA e o MVAΔE3L também provocam apoptose nas células de adenocarcinoma de cólon de camundongo MC38, as células MC38 foram infectadas com MVA ou com MVAΔE3L a uma MOI de 10 ou controle de infecção simulada. Como é observado nas células de melanoma B16, a análise de Western blot mostrou que tanto o MVA quanto o MVAΔE3L provocavam clivagem de PARP da proteína de comprimento completo de 116 kDa no fragmento de 89 kDa (em 22 horas, Figura 15I). Juntos, os Exemplos 16 e 17 indicam que cada um de MVA e de MVAΔE3L tem a capacidade de induzir a produção de IFN do tipo I e citocinas inflamatórias/quimiocinas, bem como a apoptose em tipos de células cancerosas diferentes. O MVAΔE3L parece ser um indutor mais forte tanto da produção de IFN do tipo I quanto de pró-citocinas inflamatórias e quimiocinas, bem como da apoptose comparado com o MVA. Todavia, ambos os resultados indicam que a resposta imunológica induzida pelos presentes vírus leva à apoptose, resultando na morte das células cancerosas. Isto estabelece adicionalmente os tratamentos divulgados aqui como uma abordagem viável de terapia de melanoma, câncer de cólon, carcinomas em geral e, de fato, tumores sólidos. Exemplo 18 MVAΔE3L inibe a tumorigênese no modelo de carcinoma de cólon de camundongo

[00149] Estudos experimentais divulgados no Exemplo 11 mostraram que a injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L leva à erradicação de tumor e à imunidade antitumoral sistêmica em um modelo de melanoma B16 transplantável de camundongo. Para testar se o MVAΔE3L é capaz de inibir o crescimento de tumor em outros tumores sólidos, os inventores testaram os efeitos antitumor do MVAΔE3L em um modelo de implante de carcinoma de cólon de camundongo. O carcinoma de cólon é representativo de um tumor não relacionado a melanoma, mas ao invés disso foi uma escolha aleatória. 2 x105 células de carcinoma de cólon MC38 foram implantadas de forma intradermal no flanco direito de camundongos C57B/6. Foi permitido que os tumores se formassem durante 7 dias, após os quais o MVAΔE3L (2 x 107) ou o controle de PBS foi injetado de forma intratumoral nos camundongos. Os tumores foram medidos antes da injeção (dia 0) e durante até 45 dias após a injeção e o volume de tumor foi calculado de acordo a fórmula a seguir: l (comprimento) x w (largura)x h(altura)/2. Como mostrado na Figura 16 (A e B), os tumores tratados com MVAΔE3L eram menores que os tumores tratados com PBS. Além disso, os camundongos tratados com MVAΔE3L exibiam maior sobrevivência que é demonstrada pela curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos carregando tumor que receberam injeção de PBS ou de MVAΔE3L (Figura 16C). Coletivamente, estas descobertas revelam que no contexto de câncer de cólon bem como de melanoma, o MVAΔE3L mantém a capacidade de inibir a tumorigênese e o crescimento de tumor. Coletivamente, os resultados observados aqui bem como no Exemplo 13 e no Exemplo 17 demonstram e ilustram que o MVAΔE3L é eficiente em promover efeitos antitumor em vários tumores sólidos e que as descobertas descritas nesta divulgação não são limitadas a melanoma, mas podem ser extrapoladas para outros tumores sólidos de origens diversas. Exemplo 19 A injeção intratumoral de MVA e de MVAΔE3L leva a efeitos antitumor tanto nos tumores injetados quando tumores distantes não injetados e maior sobrevivência

[00150] A seguir, os inventores investigaram os efeitos da injeção intratumoral de MVA e de MVAΔE3L sobre o crescimento metastásico utilizando um modelo de implantação bilateral de melanoma B16-F10 de camundongo. Sucintamente, as células de melanoma B16-F10 foram implantadas de forma intradermal nos flancos esquerdo e direito de camundongos C57B/6 (5 x 105 no flanco direito e 1 x 105 no flanco esquerdo). 8 dias após o implante de tumor, os inventores injetaram de forma intratumoral o MVA ou o MVAΔE3L (2 x 107 ufp) ou PBS nos tumores maiores no flanco direito duas vezes por semana. Os tamanhos dos tumores foram medidos e a sobrevivência dos camundongos foi monitorada (Figura 17). Enquanto os camundongos tratados com PBS morriam rapidamente com maior crescimento de tumor ao longo dos 1014 dias seguintes (Figuras 17A e B), os camundongos tratados com MVA e com MVAΔE3L exibiam crescimento de tumor retardado tanto de tumores injetados quanto não injetados na superfície contralateral (Figuras 17A-F).

[00151] A capacidade de controlar o crescimento de tumores distantes não injetados se correlacionava com a maior sobrevivência de animais tratados com MVA e com MVAΔE3L (Figura 17G, ***, P < 0,001 para MVA vs. PBS, ****, P < 0,0001 para MVAΔE3L vs. PBS). Coletivamente, estes resultados ilustram a eficiência de uma abordagem terapêutica para o tratamento de tumores sólidos metastásicos. Exemplo 20 A injeção intratumoral de MVA e de MVAΔE3L leva a alterações imunológicas tanto em tumores injetados quanto distantes não injetados

[00152] Para entender os mecanismos imunológicos que fundamentam os efeitos antitumor de MVA e de MVAΔE3L, os inventores investigaram os infiltrados de células imunológicas tanto em tumores injetados quanto não injetados nos camundongos tratados com MVA ou com MVAΔE3L comparados com o controle com PBS. Sucintamente, 2,5 x 105 células de melanoma B16-F10 foram implantadas de forma intradermal no flanco esquerdo e 5 x 105 células de melanoma B16-F10 no flanco direito dos camundongos. 7 dias após o implante, 2x 107 ufp de MVA ou de MVAΔE3L ou PBS foram injetadas dentro dos tumores maiores no flanco direito. A injeção foi repetida três dias depois. Os tumores não injetados foram coletados e foram geradas suspensões de células. Os infiltrados de células imunológicas vivas nos tumores foram analisados por citometria de fluxo (FACS). Os inventores observaram um aumento substancial das células imunológicas CD8+CD3+ tanto nos tumores injetados quanto não injetados de camundongos tratados com MVA ou com MVAΔE3L comparadas com aquelas nos camundongos tratados com PBS (Figuras 18 A e B). O MVAΔE3L é mais eficiente que o MVA no recrutamento de CD8+CD3+ tanto em tumores injetados quanto não injetados (Figuras 18 A e B). O tratamento com MVA ou com MVAΔE3L resultou no aumento de números de células T CD8+ e CD4+ que expressam Granzyme B tanto em tumores injetados quanto não injetados (Figuras 18 C, D, I e J). Em adição, o tratamento com MVA ou com MVAΔE3L resultou na proliferação de células T CD8+ e CD4+ efetoras tanto em tumores injetados quanto não injetados que é medida através da expressão do marcador de proliferação Ki-67 (Figuras 18 E, F, K e L). Finalmente, a injeção intratumoral de MVA e de MVAΔE3L resultou na redução da porcentagem de células T CD4+ que expressam FoxP3 nos tumores injetados e não injetados (Figuras 18 G e H). Estes resultados indicam que tanto MVA quanto MVAΔE3L são capazes de recrutar, ativar e induzir a proliferação de CD8+ e CD4+ efetoras, bem como de reduzir as células T CD4+ reguladoras supressoras imunológicas nos tumores injetados e não injetados. Isto se correlaciona com suas eficácias de erradicar ou de retardar o crescimento de tumores injetados e não injetados e de prolongar a sobrevivência. Na maioria dos casos, o MVAΔE3L é mais potente que o MVA na indução de alterações imunológicas dentro dos tumores injetados e não injetados. Isto poderia ser devido às capacidades melhoradas do MVAΔE3L de induzir IFN do tipo I nas células imunológicas, nas células de tumor, bem como nas células de estroma comparado com o MVA. Exemplo 21 A injeção intratumoral de MVA e de MVAΔE3L leva à redução substancial de macrófagos associados ao tumor nos tumores injetados

[00153] Para investigar se os macrófagos associados ao tumor (TAM) nos tumores de melanoma eram influenciados pela terapia com MVA ou com MVAΔE3L, os inventores aplicaram conjuntos de anticorpos para definir os TAMs com base na estratégia relatada anteriormente (Broz et al., Cancer Cell 2014). De forma geral, foram primeiramente definidas as células CD45+ e Ly6C- vivas. Dentro das células MHCII+, os macrófagos foram distinguidos das DCs com base na expressão de CD24hi e F4/80lo. As populações de TAM revelaram ainda dois tipos de macrófagos (TAM1 e TAM2) através da expressão diferencial de CD11c e CD11b. Após a terapia com MVA ou com MVAΔE3L, a população de TAM foi diminuída no tumor de melanoma comparado com o controle (Figs 19A e B). Enquanto isso, ambas as populações de TAM1 e TAM2 foram reduzidas para níveis baixos (Figs 19A, C e D). Estas observações indicam que a injeção intratumor de MVA e de MVAΔE3L leva à redução de TAMs, que induzem efeitos supressores imunológicos dentro do microambiente de tumor. Exemplo Profético 22 A combinação de injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com fornecimento intraperitoneal de anticorpo de bloqueio de ponto de verificação imunológico em um modelo de implante de melanoma unilateral

[00154] A injeção intratumoral dos presentes vírus será utilizada para aumentar os efeitos terapêuticos das imunoterapias atuais, tal como o bloqueio de pontos de verificação imunológicos (por exemplo, anticorpo anti-CTLA-4). Os camundongos que carregam tumor serão tratados com injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L em combinação com o fornecimento intraperitoneal de anticorpo anti-CTLA-4. Sucintamente, as células de melanoma B16-F10 (2 x 105) serão implantadas de forma intradermal no flanco direito de camundongos C57B/6 WT. Dez dias após o implante de tumor, quando os tumores cresceram mais do que aqueles no Exemplo 11, os camundongos serão tratados com as combinações a seguir: PBS + controle de isotipo, PBS + anticorpo anti-CTLA-4, MVA + controle de isotipo, MVA + anti-CTLA-4, MVAΔE3L + controle de isotipo e MVAΔE3L + anti-CTLA. Os inventores garantirão que o volume de tumor é coerente entre os grupos testados no início das injeções de vírus. É previsto que o tratamento com MVA e anticorpo anti-CTLA-4 ou MVAΔE3L e anticorpo anti-CTLA-4 levará à eficácia terapêutica superior comparada à do bloqueio de ponto de verificação imunológico individualmente ou do tratamento com MVA ou com MVAΔE3L individualmente. Exemplo Profético 23 A combinação de injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com fornecimento intraperitoneal de bloqueio de ponto de verificação imunológico em um modelo de implante de melanoma bilateral

[00155] Os inventores irão também injetar de forma intratumoral o MVA ou o MVAΔE3L que aumenta os efeitos terapêuticos da terapia de bloqueio de ponto de verificação imunológico tal como anticorpos anti- CTLA-4, anti-PD-1 ou anti-PD-L1 em um modelo de melanoma B16-F10 bilateral, que também simula um indivíduo com doença metastásica. Sucintamente, as células de melanoma B16-F10 serão implantadas de forma intradermal nos flancos esquerdo e direito de camundongos C57B/6 (5 x 105 no flanco direito e 1 x 105 no flanco esquerdo). 8 dias após o implante de tumor, o MVA ou o MVAΔE3L será injetado de forma intratumoral (2 x 107 ufp de MVA ou de MVAΔE3L) ou PBS nos tumores maiores no flanco direito duas vezes por semana. Quatro grupos de camundongos foram tratados com o MVA e quatro grupos com o MVAΔE3L, com cada grupo recebendo fornecimento intraperitoneal de controle de isotipo ou anticorpos anti-CTLA-4 ou anti-PD-1 ou anti-PD- L1.

[00156] Os inventores preveem que a combinação de injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L e o fornecimento sistêmico de inibidores de ponto de verificação (representados pelos anticorpos anti- CTLcomA-4, anti-PD-1 e anti-PD-L1) retardará adicionalmente o crescimento e erradicará os tumores não injetados comparada com a injeção intratumoral do inibidor de ponto de verificação ou do MVA ou do MVAΔE3L individualmente.

[00157] É previsto que os resultados mostrarão que o fornecimento intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L superará a resistência ao tratamento ao bloqueio de ponto de verificação imunológico em um modelo de melanoma B16 metastásico que é bom prognóstico para transferir esta abordagem para terapia humana com resultados benéficos. Exemplo Profético 24 Combinação de injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com fornecimento intraperitoneal de bloqueio de ponto de verificação imunológico em um modelo de implante de adenocarcinoma de cólon MC38 bilateral

[00158] Os inventores realizarão adicionalmente experimentos que envolvem a injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L que aumenta os efeitos terapêuticos da terapia de bloqueio de ponto de verificação imunológico tal como anticorpos anti-CTLA-4, anti- ou anti-PD-L1 em outro modelo de implante de tumor bilateral, que simula um indivíduo com doença metastásica. Sucintamente, as células de adenocarcinoma de cólon MC38 serão implantadas de forma intradermal nos flancos esquerdo e direito de camundongos C57B/6 (5 x 105 no flanco direito e 1 x 105 no flanco esquerdo). 8 dias após o implante de tumor, o MVA ou o MVAΔE3L será injetado de forma intratumoral (2 x 107 ufp de MVA ou de MVAΔE3L) ou PBS nos tumores maiores no flanco direito duas vezes por semana. Três grupos de camundongos serão tratados com PBS, com cada grupo recebendo fornecimento intraperitoneal de controle de isotipo ou de anticorpos anti-CTLA-4 ou anti-PD-L1. Haverá três grupos de camundongos adicionais que serão tratados com MVA, com cada grupo recebendo fornecimento intraperitoneal de controle de isotipo ou de anticorpos anti-CTLA-4 ou anti-PD-L1. Finalmente, os camundongos tratados com MVAΔE3L serão divididos em três grupos, com cada grupo tratado com o controle de isotipo ou com anticorpos anti-CTLA-4 ou anti- PD-L1. Cada grupo será então dividido em um subgrupo também tratado com MVA ou com MVAΔE3L. Também serão fornecidos controles tratados somente com vírus.

[00159] O volume de tumor tanto de tumores injetados quanto não injetados de cada grupo de camundongos será monitorado e avaliado. Adicionalmente, os inventores irão monitorar a sobrevivência de cada grupo de tratamento.

[00160] É previsto que a combinação de fornecimento intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com bloqueio de ponto de verificação representado pelo fornecimento intraperitoneal de anticorpo anti-CTLA- 4 ou fornecimento intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com fornecimento intraperitoneal de anti-PD-1/PD-L1 levará à erradicação de tumores distantes não injetados com uma eficiência mais alta que o MVA ou o MVAΔE3L. Assim, é previsto que estes resultados mostram aprimoramento no tratamento de tumores sólidos metastásicos utilizando uma combinação do MVA ou do MVAΔE3L e bloqueio de ponto de verificação imunológico comparado com o bloqueio de ponto de verificação individualmente ou o vírus individualmente. Mais especificamente, é previsto que tanto os tumores injetados quanto não injetados serão reduzidos em tamanho e até mesmo erradicados até um grau superior àquele atingido com qualquer tipo de monoterapia e que os resultados persistirão durante pelo menos 45 dias e mais tempo, validando assim a abordagem de combinação para o tratamento de tumores sólidos primários e metastásicos. Exemplo Profético 25 Combinação de injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com fornecimento intratumoral de anticorpo anti-CTLA-4 de bloqueio de ponto de verificação imunológico em um modelo de implante de B16-F10 bilateral

[00161] Nos Exemplos Proféticos 22, 23 e 24, os inventores testarão a combinação de injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com o fornecimento sistêmico de bloqueio de ponto de verificação imunológico em ambos os modelos de melanoma e de adenocarcinoma de cólon. Neste Exemplo, os inventores testarão se a coadministração de MVA ou de MVAΔE3L e de bloqueio de ponto de verificação representado pelo anticorpo anti-CTLA-4 (a 1/10 da dose utilizada para o fornecimento intraperitoneal) atingirá os efeitos antitumor em um modelo de implante de tumor bilateral rigoroso. Sucintamente, as células de melanoma B16- F10 serão implantadas de forma intradermal nos flancos esquerdo e direito de camundongos C57B/6 (5 x 105 no flanco direito e 1 x 105 no flanco esquerdo). 8 dias após o implante de tumor, o MVA ou o MVAΔE3L serão injetados de forma intratumoral (2 x 107 ufp de MVA ou de MVAΔE3L ou PBS) nos tumores maiores no flanco direito duas vezes por semana. Três grupos de camundongos serão tratados com MVA, com cada grupo recebendo: (i) fornecimento intraperitoneal de anti-CTLA-4 (100 μg/camundongo) (ii) fornecimento intratumoral of anticorpo de isotipo (10 μg/camundongo) ou (iii) fornecimento intratumoral de anticorpo anti-CTLA-4 (10 μg/camundongo). Três grupos de camundongos adicionais serão tratados com o MVAΔE3L, com cada grupo recebendo: (i) fornecimento intraperitoneal de anti-CTLA-4 (100 μg/camundongo) (ii) fornecimento intratumoral de anticorpo de isotipo (10 μg/camundongo) ou (iii) fornecimento intratumoral de anticorpo anti- CTLA-4 (10 μg/camundongo).

[00162] Os volumes de tumor tanto dos tumores injetados quanto não injetados serão monitorados e avaliados. Os inventores preveem que a coinjeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L e bloqueio de ponto de verificação (anticorpo anti-CTLA-4 a 10 μg/camundongo) será comparável aos efeitos terapêuticos da combinação de injeção intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L e de fornecimento intraperitoneal de anticorpo anti-CTLA-4 (100 μg/camundongo). É previsto que a coadministração de MVA ou de MVAΔE3L e um bloqueio de ponto de verificação imunológico em uma dose substancialmente menor pode atingir efeitos antitumor sistêmicos similares ao da combinação de fornecimento intratumoral de MVA ou de MVAΔE3L com fornecimento sistêmico de anticorpo anti-CTLA-4 em uma dose mais alta. * *

[00163] O Relatório Descritivo, os exemplos e os dados anteriores fornecem uma descrição completa da produção e do uso da composição da invenção. Entretanto, estes são ilustrativos e não limitantes. A amplitude da presente invenção reside nas Reivindicações.

[00164] Todas as patentes e documentos da literatura citados aqui são incorporados como referência em sua totalidade para todas as finalidades. Qualquer modalidade ou aspecto reivindicado divulgado aqui pode ser renunciado a critério da Requerente.

Claims (16)

1. Uso de Composição, caracterizada por que é no fabrico de um medicamento para tratar um tumor sólido maligno num indivíduo em necessidade do mesmo, em que compreende um vírus vaccinia Ankara modificado com deleção do fator de virulência vaccinia E3 (MVAΔE3L).

2. Uso de Composição, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a composição compreende ainda um vírus vaccinia Ankara modificado (MVA).

3. Uso de Composição, de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizada por que a composição compreende ainda um agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico ou um agonista de bloqueio de ponto de verificação imunológico.

4. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o tratamento compreende um ou mais dos seguintes: induzir o sistema imunológico do indivíduo a montar uma resposta imunológica contra o tumor ou para aumentar uma resposta em andamento pelo sistema imunológico contra o tumor; reduzir o tamanho do tumor; erradicar o tumor; inibir o crescimento do tumor; inibir a metástase do tumor; reduzir ou erradicar o tumor metastático; induzir a apoptose das células tumorais; e prolongar a sobrevivência do indivíduo; conforme comparado com um indivíduo controle não tratado.

5. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o medicamento induz uma resposta imunológica antitumoral compreendendo um ou mais dos seguintes: aumentar pelo menos uma de células CD8+ T citotóxicas antitumor e células CD4+ T efetoras dentro do tumor e/ou nos nódulos linfáticos que drenam o tumor; induzir a maturação de células dendríticas que infiltram o tumor através da indução de IFN do tipo I; reduzir células CD4+ T supressoras (reguladoras) imunológicas dentro do tumor; reduzir macrófagos supressores imunológicos associados ao tumor (TAMs) dentro do tumor; e induzir a produção de IFN do tipo I, citocinas inflamatórias e quimiocinas nas células imunológicas e fibroblastos do estroma, conforme comparado com um indivíduo controle não tratado.

6. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o MVAΔE3L deixa de estar carregando ácido nucleico que codifica ou que expressa um antígeno de tumor.

7. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o tumor inclui tumor localizado no local de entrega do MVAΔE3L, tumor localizado em qualquer lugar no corpo do indivíduo ou tumor localizado tanto no local quanto em qualquer lugar do corpo do indivíduo.

8. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o MVAΔE3L é efetivo para recrutar e ativar células T CD4+ efetoras acompanhadas por uma redução de células CD4+ reguladoras no tumor.

9. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o tumor é melanoma, carcinoma de cólon ou outro tumor sólido.

10. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o MVAΔE3L é formulado para ser entregue parentericamente, intratumoralmente, intravenosamente ou intraperitonealmente ao indivíduo.

11. Uso de Composição, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que o MVA e/ou o MVAΔE3L é formulado para ser entregue parentericamente, intratumoralmente, intravenosamente e/ou intraperitonealmente ao indivíduo e em que o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico ou o agonista de ponto de verificação imunológico são formulados para serem entregues parentericamente, intratumoralmente, intravenosamente e/ou intraperitonealmente ao indivíduo.

12. Uso de Composição, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico é selecionado do grupo que consiste em inibidores de PD-1, inibidores de PD-L1, inibidores de CTLA4, anticorpos inibidores contra LAG-3 (gene de ativação de linfócito 3), TIM3 (Imunoglobulina de célula T e Mucina-3), B7-H3 e TIGIT (imunorreceptor de célula T com Ig e domínios ITIM); e o agonista de ponto de verificação imunológico é selecionado do grupo que consiste em anticorpo anti-ICOS, anticorpo anti-OX40, anticorpo agonista contra 4-1BB (CD137) e anticorpo agonista contra GITR.

13. Uso de Composição, de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por que o vírus é entregue ao indivíduo separada, sequencial ou simultaneamente com o agente de bloqueio de ponto de verificação imunológico ou com o agonista de ponto de verificação imunológico.

14. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o medicamento é administrado repetidamente com uma frequência dentro do intervalo de a partir de uma vez por mês a uma vez por semana ou mais e continua durante várias semanas, meses, anos ou indefinidamente desde que os benefícios persistam ou uma dose máxima tolerada seja atingida.

15. Uso de Composição, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o MVAΔE3L é formulado para entregar ao indivíduo a uma dosagem por administração de 105 a 1010 unidades que formam placas (pfu).

16. Uso de MVAΔE3L e Veículo ou Diluente Farmaceuticamente Aceitável, caracterizado por que é no fabrico de um medicamento para o tratamento de um tumor sólido num indivíduo em necessidade do mesmo, em que o MVAΔE3L deixa de compreender um ácido nucleico heterólogo que codifica ou expressa um antígeno de tumor.