JP6535337B2 - 腫瘍抗原を発現するポックスウイルスならびに免疫チェックポイント阻害剤のアンタゴニスト及び/またはアゴニストにより癌を治療するための組み合わせ療法 - Google Patents

腫瘍抗原を発現するポックスウイルスならびに免疫チェックポイント阻害剤のアンタゴニスト及び/またはアゴニストにより癌を治療するための組み合わせ療法 Download PDF

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Description

本発明は、腫瘍抗原をコードする組換えポックスウイルスを使用する癌の治療に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍抗原をコードする1つまたは複数の組換えポックスウイルスを、免疫チェックポイント阻害剤の1つまたは複数のアゴニスト及び/またはアンタゴニストと組み合わせて使用する癌の治療に関する。
組換えポックスウイルスは、感染性生物及びより最近は腫瘍のためのワクチンとして使用された。Mastrangelo et al.J Clin Invest.2000;105(8):1031−1034。これらのポックスウイルス群のうちの2つ(アビポックスウイルス及びオルソポックスウイルス)は、腫瘍との戦いに効果的であり、癌治療の可能性に関わることが示された。
1つの例示的なアビポックスウイルス種(鶏痘)は、ヒト投与のための安全なベヒクルであることが示されており、これは、鶏痘ウイルスが哺乳類細胞に入りタンパク質を発現するが、複製は不成功に終わる為である。Skinner et al.Expert Rev Vaccines.2005 Feb;4(1):63−76。加えて、発現のためのベヒクルとしての鶏痘ウイルスの使用は、癌、マラリア、結核及びAIDSに対するワクチンについての多数の臨床試験において評価された。同文献。
オルソポックスウイルスは、抗原を患者へ投与して抗原に対する免疫応答を誘導するために有用なベクターであることが示された。ワクシニア(オルソポックスウイルスの最もよく知られたもの)は天然痘の世界中での撲滅において使用され、ベクター及び/またはワクチンとしての有用性を示した。組換えワクシニアベクターは、複数の腫瘍関連遺伝子(p97、HER−2/neu、p53及びETA等)が含まれる、広範囲の挿入遺伝子を発現するように操作された(Paoletti,et al.,1993)。
別の公知のオルソポックスウイルスは修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルスである。MVAは、Poxviridae科中のオルソポックスウイルス属のメンバーのワクシニアウイルスに関連する。MVAは、ワクシニアウイルスのAnkara株(CVA)をトリ胚線維芽細胞上で516連続継代することによって生成された(総説については、Mayr,A.,et al.Infection 3,6−14(1975)を参照)。これらの長期継代の結果として、もたらされたMVAウイルスのゲノムは約31キロベースのゲノムの配列を欠失し、したがって複製のための宿主細胞は鳥類細胞に高度に制限されるものとして記述された(Meyer,H.et al.,J.Gen.Virol.72,1031−1038(1991))。もたらされたMVAが有意に無毒であることは多様な動物モデルにおいて示された(Mayr,A.&Danner,K.,Dev.Biol.Stand.41:225−34(1978))。加えて、このMVA株は、ヒト天然痘疾患に対して免疫付与するワクチンとして臨床試験において試験された(Mayr et al.,Zbl.Bakt.Hyg.I,Abt.Org.B 167,375−390(1987);Stickl et al.,Dtsch.med.Wschr.99,2386−2392(1974))。これらのヒトでの研究において、ワクシニアに基づくワクチンと比較して、MVAの毒性または感染性は減退する一方で、MVAはまだ良好な特異的免疫応答を誘導した。
その後の数十年間、MVAは、組換え遺伝子発現のためのウイルスベクターまたは組換えワクチンとしての使用のために操作された(Sutter,G.et al.,Vaccine 12:1032−40(1994))。
たとえ、MVAが高度に弱毒化され、ヒト及び哺乳類において無毒であることを1970年代の間にMayr et al.が実証しても、若干の研究者は、残存する複製がこれらの細胞において起こるかもしれないので、MVAが哺乳類及びヒトの細胞株において完全には弱毒化されないと報告した(Blanchard et al.,J Gen Virol 79,I159−1167(1998);Carroll&Moss,Virology 238,198−211(1997);Altenberger、米国特許第5,185,146号;Ambrosini et al.,J Neurosci Res 55(5),569(1999))。使用されるウイルスの特性(特に様々な細胞株における増殖挙動)が異なるので、これらの出版物中で報告された結果がMVAの様々な公知の株により得られたと推測される。かかる残存する複製は、様々な理由(ヒトにおける使用に関連する安全性についての懸念が含まれる)のために所望されない。
より安全な製品(ワクチンまたは医薬品等)の開発のための向上した安全性プロフィールを有するMVAの株が記述された。米国特許第6,761,893号及び第6,193,752号を参照されたい。かかる株は、非ヒト細胞及び細胞株(とりわけトリ胚線維芽細胞(CEF))における繁殖複製は可能であるが、公知のワクシニア株による複製を可能にすることが知られている特定のヒト細胞株における有意な繁殖複製は可能ではない。かかる細胞株には、ヒト角化細胞の細胞株、HaCat(Boukamp et al.J Cell Biol 106(3):761−71(1988))、ヒト頚部腺癌細胞株、HeLa(ATCC番号CCL−2)、ヒト胎児腎臓細胞株、293(ECACC番号85120602)及びヒト骨の骨肉腫細胞株、143B(ECACC番号91112502)が含まれる。かかる株は、例えば特定のマウス系統(重度に免疫力が低下し複製ウイルスへ高度に感染しやすい、遺伝子導入マウスモデルAGR 129等)においてもインビボで有意な繁殖複製は可能ではない。米国特許第6,761,893号を参照されたい。「MVA−BN」と称される1つのかかるMVA株ならびにその誘導体及び組換え体が記述された。米国特許第6,761,893号及び第6,193,752号(それらは参照することにより本明細書に援用される)を参照されたい。
MVA及びMVA−BNは、それぞれ組換え遺伝子発現のためのウイルスベクターまたは組換えワクチンとしての使用のために操作された。例えばSutter,G.et al.,Vaccine 12:1032−40(1994)、米国特許第6,761,893号及び第6,193,752号を参照されたい。
癌免疫療法への特定のアプローチには腫瘍関連抗原によるワクチン接種が含まれていた。特定の事例において、かかるアプローチには、腫瘍関連抗原への宿主免疫応答を促進する送達システムの使用が含まれていた。特定の事例において、かかる送達システムには組換えウイルスベクターが含まれていた。例えばHarrop et al.,Front.Biosci.11:804−817(2006);Arlen et al.,Semin.Oncol.32:549−555(2005);Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(suppl.2):14567−14571(2004)を参照されたい。
HER−2は、多数の癌患者の腫瘍細胞において過剰発現される腫瘍関連抗原である。様々なHER−2ポリペプチドによる免疫付与を使用して、この抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答が生成された。例えばRenard et al.,J.Immunology 171:1588−1595(2003);Mittendorf et al.,Cancer 106:2309−2317(2006)を参照されたい。
肺における高頻度の調節性T細胞(Treg)によって特徴づけられる、強い腫瘍媒介性免疫抑制環境にもかかわらず、HER−2抗原(MVA−BN−HER2)をコードするMVAは、実験的肺転移のマウスモデルにおいて強力な抗腫瘍有効性を発揮することが示された。Mandl et al.,Cancer Immunol Immunother(2012)61:19−29。組換えMVAは、Th1優位のHER−2特異的抗体及びT細胞応答を強く誘導することが報告された。同文献。抗腫瘍活性は、高度に活性化されたHER−2特異的なCD8+CD11c+T細胞による肺の浸潤の増加、及び肺におけるTreg細胞の頻度の減少の付随によって特徴づけられ、エフェクターT細胞対Treg細胞の比の有意な増加がもたらされる。同文献。
MVA−BN−HER2が安全であり、転移性設定のヒト臨床研究において特異的なT細胞及びB細胞の反応を誘導するように寛容を破壊することも示された。Guardino et al.,Cancer Research:December 15,2009;Volume 69,Issue 24,Supplement 3。
トラスツズマブ(ハーセプチン)は、HER2の細胞外ドメインを標的化するヒト化モノクローナル抗体(mAb)であり、HER2陽性乳癌において臨床的有効性を示した。Wang et al.,Cancer Res.2012 September 1;72(17):4417−4428。しかしながら、かなりの数の患者は初期のトラスツズマブ治療へ応答せず、継続的な治療後に、多くのトラスツズマブ応答性の腫瘍は耐性を発達させる。同文献。
免疫細胞上の抑制性受容体は癌における免疫回避の極めて重要な調節因子である。Woo et al.,Cancer Res;72(4);917−27,2011。これらの抑制性受容体の中で、CTLA−4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4)は優性のオフスイッチとして供される一方で、他の受容体(PD−1(プログラムドデス((programmed death)1、CD279)及びLAG−3(リンパ球活性化遺伝子、CD223)等)は、より微妙なレオスタット機能を供すると思われる。同文献。
CTLA−4は免疫チェックポイント分子であり、それは活性化されたT細胞上でアップレギュレートされる。Mackiewicz,Wspolczesna onkol 2012;I6(5):363−370。抗CTLA4のmAbは、CD80/86とCTLA−4の相互作用をブロックし、免疫抑制のメカニズムをスイッチオフにし、DCによるT細胞の継続的な刺激を可能にすることができる。CTLA−4に対して作製された2つのIgG mAb(イピリムマブ及びトレメリムマブ)は、黒色腫に罹患した患者の臨床試験において使用された。しかしながら、抗CTLA−4抗体による治療は高レベルの免疫関連性有害事象を示した。同文献。
免疫系を修飾する別のヒトmAbは、デス−1受容体(PD−1R)に対して作製されたBMS−936558(MDX−1106)であり、そのリガンド(PD−1L)はメラノーマ細胞上で直接発現され得る。同文献。PD−1Rは、T細胞活性化及び寛容を調整する、共刺激分子のB7:CD28ファミリーの一部であり、したがって抗PD−1Rは寛容の破壊において役割を果たすことができる。同文献。
PD−1/PD−L1経路の連動は、T細胞のエフェクター機能、サイトカイン分泌及び増殖の阻害をもたらす。Turnis et al.,OncoImmunology 1:7,1172−1174;2012。高レベルのPD−1は、消耗したかまたは慢性的に刺激されたT細胞に関連する。同文献。さらに、PD−1発現の増加は癌患者における生存の低減と相関する。同文献。
これらの最近の研究は、PD−1発現を癌における生存率に結びつけられることを示唆しているが、癌の治療におけるPD−1の阻害による初期の研究は様々な有害な副作用を示した。Mellman et al.Nature 2011;480(7378):480−489;Chow、Am Soc Clin Oncol Educ Book、2013年、「Exploring novel immune−related toxicities and endpoints with immune−checkpoint inhibitors in non−small cell lung cancer」も参照されたい。
LAG−3は、様々なリンパ系組織タイプの活性化に際して発現される負の調節分子である。同文献。LAG−3は、生来の免疫抑制性Treg細胞及び誘導された免疫抑制性Treg細胞の最適な機能のために要求される。同文献。
モノクローナル抗体によるPD−1及びLAG−3のコンビナトリアルブロックは、確立された腫瘍の増殖を相乗的に限定した。Woo et al.,Cancer Res;72(4);917−27,2011。抗LAG−3/抗PD−1のコンビナトリアル免疫療法は確立されたSa1N腫瘍及びMC38腫瘍を効果的に消去したが、この療法は確立されたB16腫瘍に対して効果的ではなかった。同文献。Turnis et al.は、彼らの研究は「組み合わせ治療のアウトカムを予測する際の困難さを強調する」と報告した。Turnis et al.,OncoImmunology 1:7,1172−1174;2012。
誘導可能な共刺激分子(ICOS)は、黒色腫及び卵巣癌が含まれる様々な腫瘍に浸潤するTreg上で高度に発現されることが報告された。Faget et al.,OncoImmunology 2:3,e23185;March 2013。乳癌におけるTA−pDCとTA−Tregの相互作用の間にICOS/ICOSLの相互作用が起こることも報告された。同文献。ICOSに対するアンタゴニスト抗体を使用して、ICOS:ICOS−L相互作用を阻害し、pDCによって誘導されたTregの増殖を無効にした。WO2012/131004。アンタゴニスト抗体を乳腺腫瘍のマウスモデルにおいて使用して、腫瘍進行を低減させた。同文献。
ICOSに対して作製されたアゴニスト抗体は、腫瘍の治療のためのブロッキング用抗CTLA−4抗体及びブロッキング用抗PD−1抗体と組み合わせて有用であることが示唆された。WO2011/041613。
活性のある免疫療法及び癌ワクチンが含まれる追加の癌治療についての実質的に満たされていない医学的必要性が明らかにある。多くの態様において、本開示の実施形態は、現在利用可能な癌治療を増加及び改善する組み合わせ療法の提供によって、これらの必要性に対処する。
1つの一般的態様において、本発明は、少なくとも1つの腫瘍抗原をコードする組換えポックスウイルスを、免疫チェックポイント阻害剤の1つまたは複数のアンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせて使用して、癌患者を治療するための治療法、組成物及び方法を包含する。
より特定の態様において、本発明は、腫瘍抗原を発現するオルソポックスウイルス及び/またはアビポックスウイルスの組み合わせを、PD−1、LAG−3のアンタゴニスト及び/またはICOSのアゴニストのうちの1つまたは複数の組み合わせと共に利用する、使用、方法及び組成物を包含する。
一実施形態において、本発明はヒト癌患者の治療のための治療法を含む。治療法は、以下の、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを含む。(a)及び(b)が組み合わせとして投与されることが本発明によって企図される。
別の実施形態において、本発明には、ヒト癌患者を治療する方法であって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスを患者へ投与することと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つを患者へ投与することとを含む、該方法が含まれる。
さらに別の実施形態において、ヒト癌患者の治療のための治療法及び方法は、少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルス、及び抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つと組み合わせたヒト癌患者へのその投与を更に含む。
さらになお別の実施形態において、ヒト癌患者の治療のための治療法及び方法は、少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む2つ以上の組換えオルソポックスウイルス、及び抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つと組み合わせたヒト癌患者へのその投与を更に含む。
追加の実施形態において、本発明は、ヒト癌患者の治療における使用のための医薬品または組成物を包含する。医薬品または組成物は、以下の、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを含む。追加の実施形態において、医薬品または組成物は、以下の、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを更に含む。
さらに別の実施形態において、本発明には、ヒト癌患者の治療のための医薬組成物または医薬品の調製における、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを含む組成物の使用が含まれる。追加の実施形態において、医薬品または組成物は、以下の、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを更に含む。
特定の実施形態において、本明細書において記述されるように、組換えオルソポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス、及び/またはMVA−BNから選択される。特定の追加の実施形態において、組換えアビポックスウイルスは鶏痘ウイルスである。
特定の実施形態において、本明細書において記述されるように、抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニスト及び抗ICOSアゴニストは、それぞれ抗体を含む。
特定の実施形態において、本明細書において記述されるように、組換えオルソポックスウイルス及び組換えアビポックスウイルスによってコードされる少なくとも1つの腫瘍抗原は、CEA、MUC−1、PAP、PSA及びHER−2抗原から選択され得る。好ましい実施形態において、少なくとも1つの腫瘍抗原はPAP及びPSAから選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも1つの腫瘍抗原はCEA及びMUC−1から選択される。なお別の好ましい実施形態において、少なくとも1つの腫瘍抗原はHER−2抗原である。
特定の追加の実施形態において、ヒト癌患者の治療は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌及び/または卵巣癌から選択される癌を包含する。
本発明の追加の目的及び利点は、続く記述において部分的に説明され、記述から部分的に明らかになるか、または本発明の実践によって学習され得る。本発明の目的及び利点は、添付の請求項中で特に指摘された要素及び組み合わせを用いて実現及び達成されるだろう。
前述の概要及び以下の詳述の両方は、単なる例示及び説明であり、請求されるように、本発明を制限しないことを理解すべきである。
本明細書中で援用され、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の1つまたは複数の実施形態を例証し、記述と共に、本発明の原理について説明する役目を果たす。
MVA−BN−HER2による処理後の肺、脾臓及び血液中のT細胞上のICOSの発現を示す。ナイーブ(腫瘍なしの)マウスを、1日目(A及びB)または1及び15日目(C及びD)に、MVA−BN−HER2により処理した。CD8+ T細胞(A及びC)及びCD4+ T細胞(B及びD)上でのICOSの発現。データは、各々のタイムポイントで1群あたり3匹のマウスで、平均±SEMとして示される。 MVA−BN−HER2を抗ICOSアゴニストと組み合わせて投与した後の腫瘍体積を示す。CT26−HER−2固形腫瘍に罹患したマウスを、1及び15日目にMVA−BN−HER2、ならびに1、4、8、11、15、18、22、25日目に抗ICOSにより処理した(腹腔内)。A)平均腫瘍増殖。B)個別のマウスにおける腫瘍増殖。 MVA−BN−HER2が抗CTLA−4と相乗して、腫瘍を消失させ、実験的肺転移モデルにおける生存を増加させることを示す。肺においてCT26−HER−2腫瘍に罹患したマウスを、4及び18日目にMVA−BN−HER2、ならびに3及び17日目に抗CTLA−4により処理した。 MVA−BN−HER2は、単独で及び抗CTLA−4と組み合わせて、腫瘍移植の25日後にCT26−HER2肺腫瘍量を低減させることを示す。肺においてCT26−HER−2腫瘍に罹患したマウスを、4及び18日目にMVA−BN−HER2、ならびに3及び17日目に抗CTLA−4により処理し、腫瘍量を25日目に分析した。A)各々の群からの代表的な肺は、無処理肺及び抗CTLA−4処理肺において小さな塊として目視可能な腫瘍を示す。MVA−BN−HER2により処理したマウスにおいて目視可能な腫瘍はなかった。スケールバーは1cmと等しい。B)MVA−BN−HER2により処理したマウスは25日目にナイーブマウスに類似の肺重量を有する一方で、肺重量は25日目に無処理マウス及び抗CTLA−4処理マウスにおいて有意により高い。 MVA−BN−HER2により処理されたマウスにおける腫瘍/肺からのT細胞上で及び周辺部中で、ならびに高腫瘍量のマウスの腫瘍/肺中で、ICOSの発現の増加を示す。肺においてCT26−HER−2腫瘍に罹患したマウスを、4及び18日目にMVA−BN−HER2、ならびに3及び17日目に抗CTLA−4により処理した。A)11及び25日目でのCD4+ T細胞上のICOSの発現。B)11及び25日目でのCD8+ T細胞上のICOSの発現。C)1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からの、25日目でのCD4+ T細胞上の平均のICOSの発現。D)1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からの、25日目でのCD8+ T細胞上の平均のICOSの発現。 ICOS+ CD4+ T細胞は腫瘍を持ったマウスにおいておよそ等しいFoxP3+の割合であるが、処理へ応答するマウスにおいてFoxP3−が主であることを示す。肺においてCT26−HER−2腫瘍に罹患したマウスを、4及び18日目にMVA−BN−HER2、ならびに3及び17日目に抗CTLA−4により処理し、FACS分析を腫瘍移植後24または25日目に遂行した。A)FoxP3+ Treg上のICOSの発現。B)FoxP3− CD4 T細胞上のICOSの発現。C)1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からのFoxP3+ Treg上の平均ICOSの発現。D)1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からのFoxP3− CD4 T上のICOSの発現。 MVA−BN−HER2と抗CTLA−4との組み合わせ処理が、エフェクターT細胞対調節性T細胞の比を増加させることを示す。肺においてCT26−HER−2腫瘍に罹患したマウスを、4及び18日目にMVA−BN−HER2、ならびに3及び17日目に抗CTLA−4により処理し、FACS分析を腫瘍移植後24または25日目に遂行した。1群あたり3〜4匹のマウスによる単一実験からの、A)CD8 Teff:Tregの比(CD8+ICOS+FoxP3−/CD4+ICOS+FoxP3+)及びB)CD4 Teff:Tregの比(CD4+ICOS+FoxP3−/CD4+ICOS+FoxP3)。1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からの、C)平均のCD8 Teff:Tregの比及びD)平均のCD4 Teff:Tregの比。 MVA−BN−HER2による処理後の肺、脾臓及び血液中のT細胞上のPD−1発現を示す。ナイーブ(腫瘍なしの)マウスを、1日目(A及びB)または1及び15日目(C及びD)に、MVA−BN−HER2により処理した。CD8+ T細胞(A及びC)及びCD4+ T細胞(B及びD)上のPD−1の発現。データは、各々のタイムポイントで1群あたり3匹のマウスで、平均±SEMとして示される。 MVA−BN−HER2処理及び抗PD−1が腫瘍増殖を減速し生存を増加させることを示す。マウスにCT26−HER−2固形腫瘍を移植し、1及び15日目にMVA−BN−HER2及び抗PD−1により処理した。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)腫瘍体積<2000mmに基づくマウスの生存%。C)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 MVA−BN−HER2による処理後の肺、脾臓及び血液中のT細胞上のLAG−3発現を示す。ナイーブ(腫瘍なしの)マウスを、1日目(A及びB)または1及び15日目(C及びD)に、MVA−BN−HER2により処理した。CD8+ T細胞(A及びC)及びCD4+ T細胞(B及びD)上のLAG−3の発現。データは、各々のタイムポイントで1群あたり3匹のマウスで、平均±SEMとして示される。 MVA−BN−HER2及び抗LAG−3が腫瘍増殖を減速し、生存を増加させることを示す。マウスにCT26−HER−2固形腫瘍を移植し、1及び15日目にMVA−BN−HER2及び抗LAG−3により処理した。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)腫瘍体積<2000mmに基づくマウスの生存%。C)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 MVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3処理がマウス中の腫瘍の完全な退縮をもたらすことを示す。マウスにCT26−HER−2腫瘍を1日目に移植し、1及び15日目にMVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3により処理した。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)腫瘍体積<2000mmに基づくマウスの生存%。C)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 MVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3処理がマウス中の腫瘍の退縮をもたらすことを示す。マウスにCT26−HER−2腫瘍を移植し、4及び18日目にMVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3により処理した。図12と比較して、処理は4及び18日目へ遅れた(図12は1及び15日目)。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)腫瘍体積<2000mmに基づくマウスの生存%。C)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 MVA−BN−HER2は、単独でならびに抗PD−1及び抗LAG−3と組み合わせて、実験的肺転移モデルにおける生存を増加させることを示す。肺においてCT26−HER−2腫瘍に罹患したマウスを、4及び18日目にMVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3により処理した。 MVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3抗体により処理されたマウスのHER2の特異的なT細胞応答がトリプル組み合わせ療法でより高いことを示す。マウスにCT26−HER−2腫瘍を1日目に移植し、4及び18日目にMVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3により処理し、最後の処理の4週間後にIFN−γをELISPOTによって測定した。腫瘍なしのマウスからの脾細胞を、HER−2 ECDオーバーラップペプチドライブラリー(A、166のオーバーラップ15mer)またはK結合HER−2ペプチドp63(B)により再び刺激した。 増殖中のCT26−HER−2腫瘍は、すべての処理群の中で類似するHER2特異的抗体を誘導することを示す。マウスにCT26−HER−2腫瘍を1日目に移植し、4及び18日目にMVA−BN−HER2、抗PD−1及び抗LAG−3により処理した。血清をマウスから25日目に収集し、HER−2力価をELISAによって測定した。 MVA−BN−CV301及び抗PD−1は腫瘍増殖を減速させることを示す。マウスにMC38−CEA固形腫瘍を移植し、1及び15日目にMVA−BN−CV301及び抗PD−1により処理した。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 MVA−BN−CV301及び抗LAG−3の投与後の腫瘍体積を示す。マウスにMC38−CEA固形腫瘍を移植し、1及び15日目にMVA−BN−CV301及び抗LAG−3により処理した。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 MVA−BN−CV301を抗PD−1及び抗LAG−3と組み合わせて投与した後の腫瘍体積を示す。マウスにMC38−CEA固形腫瘍を移植し、1及び15日目にMVA−BN−CV301、抗PD−1及び抗LAG−3により処理した。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 PROSTVAC及び抗PD−1の投与後の腫瘍体積を示す。マウスにE6(RM11−PSA)固形腫瘍を移植し、1日目にPROSTVAC−V、ならびに8及び15日目にPROSTVAC−Fにより処理した。抗PD−1を1及び15日目に与えた。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 PROSTVAC及び抗LAG−3の投与後の腫瘍体積を示す。マウスにE6(RM11−PSA)固形腫瘍を移植し、1日目にPROSTVAC−V、ならびに8及び15日目にPROSTVAC−Fにより処理した。抗LAG−3を1及び15日目に与えた。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 PROSTVAC、抗PD−1及び抗LAG−3の投与後の腫瘍体積を示す。マウスにE6(RM11−PSA)固形腫瘍を移植し、1日目にPROSTVAC−V、ならびに8及び15日目にPROSTVAC−Fにより処理した。抗PD−1及び抗LAG−3を1及び15日目に与えた。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)マウスにおける個別の腫瘍増殖。 CV301及び抗PD−1の投与後の腫瘍体積を示す。CEA遺伝子導入マウスにMC38−CEA固形腫瘍を移植し、4日目にCV301−V、11及び18日目にCV301−Fにより処理した。鶏痘GM−CSF(CV301−V/Fと混合した)及び抗PD−1を、4、11及び18日目に与えた。A)マウスにおける平均腫瘍体積。B)マウスにおける個別の腫瘍増殖。
[配列の簡潔な記述]
配列番号:1は、破傷風毒素に由来する2つのT細胞エピトープを含むHER2タンパク質をコードするコンストラクトのヌクレオチド配列である。
配列番号:2は、配列番号:1のヌクレオチド配列によってコードされる修飾されたHER2タンパク質のアミノ酸配列である。
多数の現在の臨床試験は、1つまたは複数の腫瘍関連抗原(TAA)を発現する操作された、ワクシニア、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)及び鶏痘ベースのベクターを用いる治療法を含む。これらのベクターは単独で、または多様な癌に対する活性のある免疫応答を生成するプライム−ブースト戦略において使用される。PROSTVAC(登録商標)は、PSA及びTRICOM(商標)を発現するワクシニア及び鶏痘を使用する異種プライム−ブースト戦略を用い、去勢抵抗性転移性前立腺癌について現在世界レベルでの第III相臨床試験(PROSPECT)中である。
MVA−BN−HER2(Mandl et al,2012)は、HER−2乳癌の治療について第I相臨床試験中である。本組換えベクターは、MVA−BNとして公知の非常に弱毒化された修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルスストックに由来する。それは、HER−2に対する効果的な免疫応答の誘導を促進する破傷風毒素(TTp2及びTTp30)からの2つのユニバーサルT細胞エピトープを含むように操作されたHER−2の細胞外ドメインからなるHER−2(HER2と表記される)の修飾された形状を発現する。
ポックスウイルスベースの免疫療法の抗腫瘍有効性を更に向上させるために、MVA−BN−HER2を、CTLA−4(T細胞活性化をダウンレギュレートする免疫チェックポイントタンパク質)の活性をブロックするモノクローナル抗体と組み合わせた。CT26−HER−2の実験的肺転移モデルにおいて、中央生存時間は、無処理マウスでの30日からMVA−BN−HER2処理により49.5日へ増加する一方で、抗CTLA−4単独の処理は少ない生存利益(中央生存35日)を示した。これとは対照的に、抗CTLA−4と組み合わせたMVA−BN−HER2は、50%より多くのマウスにおいて100日を超えて(p<0.0001)生存を有意に増加させた。100日目に、生存マウスの肺を検査し、目視可能な腫瘍はなかった。分離した実験において、表現型分析を遂行した。MVA−BN−HER2療法は、ナイーブマウス(腫瘍なし)の肺においてCD8T細胞上の誘導可能な共刺激分子(ICOS)の劇的な増加をもたらした。25日目の腫瘍を持ったマウスにおいて、無処理マウス及び抗CTLA−4処理マウスの肺において調節性T細胞(CD4FoxP3)の数の増加があり、それは肺腫瘍量の増加と相関した。調節性T細胞はICOSについて陽性であった。MVA−BN−HER2により処理されたマウスは、FoxP3陰性のICOSCD4T細胞の増加があった。
MVA−BN−HER2は、様々な腫瘍モデルにおいて、PD−1、LAG−3及びICOSに対して作製された様々なアゴニスト抗体及びアンタゴニスト抗体と組み合わせて試験された。組み合わせはMVA−BN−HER2の効果を向上させることが見出された。
加えて、PD−1及びLAG−3に対して作製された様々なアンタゴニスト抗体を、組換えオルソポックスウイルス及び組換えアビポックスウイルスを利用する異種プライムブースト投薬レジメンと組み合わせて、試験した。例えば、PROSTVAC(登録商標)(各々がPSA及びTRICOMを発現するワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルスを含む)を、様々なアンタゴニスト抗体と組み合わせて試験した。CV301(PANVACとしても公知であり、各々がCEA、MUC−1及びTRICOMを発現するワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルスを含む)も、様々なアンタゴニスト抗体と組み合わせて試験した。様々なアンタゴニスト抗体と組み合わせて投与した場合に、異種プライム−ブースト投薬レジメンの有効性は増加した。
加えて、PD−1及びLAG−3に対して作製された様々なアンタゴニスト抗体を、MVA−CV301の同種プライム−ブーストレジメンにおいて試験した。MVA−CV301(CEA、MUC−1及びTRICOMを発現するMVAウイルスのプライム投薬及びブースト投薬を含む)の有効性は、PD−1及び/またはLAG−3に対して作製された抗体と組み合わせて試験した場合に、改善されることが見出された。
腫瘍抗原を含むポリペプチドをコードするオルソポックスウイルス及び/またはアビポックスウイルス
様々な態様において、本開示は、各々が腫瘍抗原をコード及び/または発現する、組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスを含む。1つまたは複数の好ましい態様において、オルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスはそれぞれワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルスである。
「アビポックスウイルス」という用語は、任意のアビポックスウイルス(鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アンコポックスウイルス(Uncopoxvirus)、九官鳥痘ウイルス、鳩痘ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、クジャク痘ウイルス、ペンギン痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス及び七面鳥痘ウイルス等)を指す。好ましいアビポックスウイルスは、カナリア痘ウイルス及び鶏痘ウイルスである。
カナリア痘ウイルスの一例はRentschler株である。ALVACと称されるプラーク精製したカナリア痘株(米国特許第5,766,598号)は、American Type Culture Collection(ATCC)のアクセッション番号VR−2547でブダペスト条約の条項下で寄託されていた。別のカナリア痘株は、Institute Merieux,Inc.から入手可能なLF2 CEP 524 24 10(75)と表記される商業的なカナリア痘ワクチン株である。
鶏痘ウイルスの例には、株FP−1、FP−5、TROVAC(米国特許第5,766,598号)及びPOXVAC−TC(米国特許第7,410,644号)が含まれるが、これらに限定されない。FP−1は、1日齢のニワトリにおいてワクチンとして使用されるように修飾されたDuvette株である。この株は、O DCEP 25/CEP67/2309 October 1980と表記される市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、Institute Merieux,Inc.から入手可能である。FP−5はトリ胚起源の市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、American Scientific Laboratories(Division of Schering Corp.)、Madison、Wisconsin、United States Veterinary License No.165、serial No.30321から入手可能である。
1つまたは複数の実施形態において、組換えオルソポックスウイルスは、好ましくはワクシニアウイルス、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス及びMVA−BNから選択される。
ワクシニアウイルス株の例には、株Temple of Heaven及びCopenhagen、Paris、Budapest、Dairen、Gam、MRIVP、Per、Tashkent、TBK、Tom、Bern、Patwadangar、BIEM、B−15、Lister、EM−63、New York City Board of Health、Elstree、Ikeda及びWRが含まれるが、これらに限定されない。好ましいワクシニアウイルス(VV)株は、Wyeth(DRYVAX)株(米国特許第7,410,644号)である。
別の好ましいVV株は、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス(Sutter,G.et al.[1994],Vaccine 12:1032−40)である。本発明の実践において有用であり、ブダペスト条約の要求に従って寄託されたMVAウイルス株の例には、European Collection of Animal CellCultures(ECACC)、Vaccine Research and Production Laboratory、Public Health Laboratory Service、Centre for Applied Microbiology and Research、Porton Down,Salisbury、Wiltshire SP4 0JG、United Kingdomに、1994年1月27日に寄託番号ECACC 94012707で寄託された株MVA 572、及び2000年12月7日にECACC 00120707下で寄託されたMVA 575が含まれるが、これらに限定されない。番号V00083008下でEuropean Collection of Cell Cultures (ECACC)に2000年8月30日に寄託されたMVA−BN及びその誘導体は、追加の例示的な株である。
MVA−BNはより高い安全性(より少ない複製能力)のために好ましいが、すべてのMVAは本発明に好適である。本発明の実施形態によれば、MVA株はMVA−BN及びその誘導体である。MVA−BN及びその誘導体の定義はPCT/EP01/13628(それは参照により援用される)中で与えられる。
特定の実施形態において、MVAはMVA−BNであり、V00083008番号下でEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC)に2000年8月30日に寄託され、国際PCT公開WO2002042480(例えば米国特許第6,761,893号及び第6,913,752号も参照)中で記述され、そのすべては参照により援用される。それらの特許公開中で記述されるように、MVA−BNは、細胞株293、143B、HeLa及びHaCat中で繁殖的に複製しない。特に、MVA−BNは、ヒト胚腎臓細胞株293において0.05〜0.2の増幅比を示す。ヒト骨肉腫細胞株143Bにおいて、MVA−BNは、0.0〜0.6の増幅比を示す。MVA−BNは、ヒト頚部腺癌細胞株HeLaにおいて0.04〜0.8、及びヒト角化細胞の細胞株HaCatにおいて0.02〜0.8の増幅比を示す。MVA−BNは、アフリカミドリザル腎臓細胞(CV1:ATCC番号CCL−70)において0.01〜0.06の増幅比を有する。
MVA−BNの増幅比は、PCT公開WO2002042480中で記述されるようにトリ胚線維芽細胞(CEF:初代培養)において1を超える(例えば米国特許第6,761,893号及び第6,913,752号も参照)。ウイルスは、500より上の比でCEF初代培養において容易に繁殖及び増幅することができる。
特定の実施形態において、組換えMVAはMVA−BNの誘導体である。かかる「誘導体」には、寄託された株(ECACC番号V00083008)と本質的に同じ複製特徴を示すがそのゲノムのうちの1つまたは複数の部分中の差を示すウイルスが含まれる。寄託したウイルスと同じ「複製特徴」を有するウイルスは、CEF細胞ならびに細胞株のHeLa、HaCat及び143Bにおいて、寄託した株と類似する増幅比で複製するウイルス;ならびに、例えばAGR129遺伝子導入マウスモデルにおいて決定されるように、生体内で類似する複製特徴を示すウイルスである。
特定の実施形態において、オルソポックスウイルスは、オルソポックスウイルスに対して異種の追加ヌクレオチド配列を含有する組換えワクシニアウイルスである。特定のかかる実施形態において、異種配列は、免疫系による応答を誘導するエピトープをコードする。したがって、特定の実施形態において、組換えオルソポックスウイルスは、タンパク質またはエピトープを含む薬剤に対するワクチン作製に使用される。
特定の実施形態において、本開示に従うオルソポックスウイルス及びアビポックスウイルスは少なくとも1つの腫瘍関連抗原を含む。好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原には、HER−2、PSA、PAP、CEAまたはMUC−1抗原が、単独または組み合わせで(例えばCEA及びMUC−1またはPAP及びPSA)、含まれるが、これらに限定されない。
さらなる実施形態において、腫瘍関連抗原は1つまたは複数の外来のTエピトープを含むように修飾される。かかる癌免疫療法剤は非限定的実施例中で本明細書において記述され、「MVA−BN−mHER2」と称される。本明細書において記述されるように、かかる癌免疫療法剤(MVA−BN−mHER2が含まれるがこれらに限定されない)は癌の治療のために有用である。本発明は、免疫不全患者が含まれるヒト及び他の哺乳類のプライム/ブーストワクチン接種レジメンにおけるかかる薬剤の使用;及び体液性免疫反応及び細胞性免疫反応の両方を誘導すること(既存のTh2環境中でTh1免疫応答を誘導すること等)を可能にする。
特定の実施形態において、腫瘍関連抗原は、ウイルスゲノムの非必須領域の中へ挿入される異種核酸配列により実施される。それらの実施形態のうちの特定のものにおいて、異種核酸配列は、PCT/EP96/02926中で記述されるようにMVAゲノムの天然に存在する欠失部位に挿入される。ポックスウイルスゲノムの中へ異種配列を挿入する方法は、当業者に公知である。
特定の実施形態において、医薬組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容及び/または承認される担体、添加剤、抗生物質、防腐剤、補助剤、希釈剤及び/または安定剤を含む。かかる添加剤には、例えば水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤及びpH緩衝物質が含まれるが、これらに限定されない。例示的な担体は、典型的には大きな緩慢に代謝される分子(タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物または同種のもの等)である。
ワクチンの調製のために、オルソポックスウイルスは生理学的に許容される形状へと転換することができる。特定の実施形態において、かかる調製は、例えばStickl,H.et al.,Dtsch.med.Wschr.99,2386−2392(1974)中で記述されるように、天然痘のワクチン接種のために使用されるポックスウイルスワクチンの調製における経験に基づく。
例示的な調製は以下の通りである。精製ウイルスを10mMトリス、140mM NaCl、pH7.4中で製剤化して、5×10TCID50/mlの力価により−80℃で保存する。ワクチン注射の調製のために、例えば、10〜10のウイルスの粒子を、アンプル(好ましくはガラス製アンプル)中で、2%ペプトン及び1%ヒトアルブミンの存在下においてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で凍結乾燥することができる。あるいは、ワクチン注射は製剤中でウイルスを段階的に冷凍乾燥することによって調製できる。特定の実施形態において、製剤は、追加の添加剤(マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドン等)、または他の添加剤(インビボの投与のために好適な抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質(例えばヒト血清アルブミン)が含まれるが、これらに限定されないもの等)を含有する。次いでアンプルを密封し、例えば4℃〜室温の間の適切な温度で数か月間保存することができる。しかしながら、必要性が存在しない限り、アンプルは好ましくは−20℃未満の温度で保存される。
ワクチン接種または治療法に関する様々な実施形態において、凍結乾燥物を0.1〜0.5mlの水溶液(好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液)中で溶解し、全身的または局所的のいずれか、すなわち非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、または当業者に公知の他の投与の経路によって投与した。投与のモード、用量及び投与の数の至適化は、当業者の技能及び知識内である。
特定の実施形態において、弱毒化されたワクシニアウイルス株は、免疫力が低下した動物(例えばSIVに感染したサル(CD4<400/μlの血液))または免疫力が低下したヒトにおいて免疫応答を誘導するのに有用である。「免疫力が低下した」という用語は、不完全な免疫応答のみを示すか、または病原菌に対する防御効率の低減を有する個体の免疫系の状況を記述する。
特定の例示的な腫瘍関連抗原
特定の実施形態において、免疫応答は細胞関連ポリペプチド抗原に対して被験体中で生産される。特定のかかる実施形態において、細胞関連ポリペプチド抗原は腫瘍関連抗原である。
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに連結された2つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。アミノ酸は、天然に存在するものに加えて、天然に存在しないもの、または天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であり得る。この用語は、タンパク質(すなわち少なくとも1つのポリペプチドを含む機能性生体分子)も指し、少なくとも2つポリペプチドを含む場合、これらは複合体を形成するか、共有結合で連結されるか、または共有結合で連結されない。タンパク質中のポリペプチド(複数可)は、糖鎖付加される及び/または脂質付加される及び/または補欠分子族を含む。
本明細書において記述されるように、好ましくは、腫瘍関連抗原は、HER−2、PSA、PAP、CEAまたはMUC−1の単独または組み合わせ(例えばCEA及びMUC−1またはPAP及びPSA)である。
多数の腫瘍関連抗原は当技術分野において公知である。例示的な腫瘍関連抗原には、5αリダクターゼ、α−フェトプロテイン、AM−1、APC、April、BAGE、β−カテニン、Bcl12、bcr−abl、CA−125、CASP−8/FLICE、カテプシン、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD33、CD35、CD44、CD45、CD46、CD5、CD52、CD55、CD59、CDC27、CDK4、CEA、c−myc、Cox−2、DCC、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、ファルネシル転移酵素、FGF8b、FGF8a、FLK−1/KDR、葉酸受容体、G250、GAGEファミリー、ガストリン17、ガストリン放出ホルモン、GD2/GD3/GM2、GnRH、GnTV、GP1、gp100/Pmel17、gp−100−in4、gp15、gp75/TRP−1、hCG、ヘパラナーゼ、Her2/neu、HMTV、Hsp70、hTERT、IGFR1、IL−13R、iNOS、Ki67、KIAA0205、K−ras、H−ras、N−ras、KSA、LKLR−FUT、MAGEファミリー、マンマグロビン、MAP17、メラン−A/MART−1、メソテリン、MIC A/B、MT−MMP、ムチン、NY−ESO−1、オステオネクチン、p15、P170/MDR1、p53、p97/メラノトランスフェリン、PAI−1、PDGF、uPA、PRAME、プロバシン、プロジェニポイエンチン(progenipoientin)、PSA、PSM、RAGE−1、Rb、RCAS1、SART−1、SSXファミリー、STAT3、STn、TAG−72、TGF−α、TGF−β、チモシン−β−15、TNF−α、TRP−1、TRP−2、チロシナーゼ、VEGF、ZAG、p16INK4、及びグルタチオン−S−トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
米国特許第7,247,615号(参照として本明細書に援用される)中で記述されるように、好ましいPSA抗原は位置155でイソロイシンからロイシンへのアミノ酸変化を含む。
1つまたは複数の好ましいCEA抗原には、米国特許第7,723,096号ならびにPCT出願第PCT/US2004/037810号及び第PCT/US2004/038643号(そのすべては参照により援用される)中で記述されるCEA抗原が含まれるが、これらに限定されない。
1つまたは複数の好ましいMUC−1抗原には、米国特許第7,118,738号ならびにPCT出願第PCT/US2013/020058号、第PCT/US2004/037810号及び第PCT/US2004/038643号(そのすべては参照により援用される)中で記述されるMUC−1抗原が含まれるが、これらに限定されない。
別の例示的な腫瘍関連抗原はHER−2である。HER−2は、現在4つの異なる受容体(c−erbB−1(EGFr)、c−erbB−2(HER−2、c−Neu)、c−erbB−3及びc−erbB−4で)からなる表皮増殖因子受容体ファミリー(c−erbB)のメンバーである(Salomon et al,1995)。C−erbB−3及びc−erbB−4は、EGFr及びHER−2よりも十分に特徴づけられていない。HER−2は膜内糖タンパク質である。成熟タンパク質はEGFr受容体に非常によく類似する構造上の特色があり、185kDの分子量を有する(Prigent et al,1992)。EGFrも1つのサブユニットからなる膜内受容体である。それは、170kDの見かけ上の分子量を有し、621アミノ酸の表面リガンド結合領域、23アミノ酸の単一疎水性膜貫通ドメイン、及び542アミノ酸の高度に保存された細胞質チロシンキナーゼドメインからなる。タンパク質はN型糖鎖が付加される(Prigent et al,1994)。
このファミリー中のすべてのタンパク質はチロシンキナーゼである。リガンドとの相互作用は受容体の二量体化をもたらし、それはチロシンキナーゼの触媒作用を増加させる(Bernard.1995、Chantry 1995)。ファミリー内のタンパク質はホモ二量体化及びヘテロ二量体化することができ、それは活性のために重要である。EGFrは増殖促進効果を伝え、細胞によるグルコース及びアミノの酸の取り込みを刺激する(Prigent et al 1992)。HER−2は増殖促進シグナルも伝える。
表皮増殖因子受容体は低量で正常組織上で発現されるが、多くのタイプの癌では過剰発現される。EGFrは、乳癌(Earp et al,1993、Eppenberger 1994)、神経膠腫(Schlegel et al,1994)、胃癌(Tkunaga et al,1995)、皮膚扁平上皮癌(Fujii 1995)、卵巣癌(van Dam et al,1994)及びその他で過剰発現される。HER−2も、低量で少数の正常ヒト組織上で、最も特徴的には腺上皮上で発現される。HER−2の過剰発現は、乳癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌及び卵巣癌の約30%において起こる。
これらの受容体の発現は、腫瘍及び癌タイプの分化の程度に依存して変動し、例えば乳癌では原発性腫瘍は両方の受容体を過剰発現するが、胃癌では転移性腫瘍の後のステージで過剰発現が起こる(Salomon et al,1995)。癌細胞上で過剰発現された受容体の数は、患者から単離された複数の頭頸部癌、外陰癌株、乳癌株及び卵巣癌株について10/細胞より大きい(Dean et al, 1994)。
受容体EGFrファミリーが腫瘍免疫療法のために好適な標的を構成する複数の理由がある。第一に、それらは多くのタイプの癌において過剰発現され、それは腫瘍に向けた免疫応答を指令するにちがいない。第二に、腫瘍は、この受容体のファミリーについてのリガンドをしばしば発現または過剰発現し、いくつかはリガンドによって媒介される増殖性効果に高感受性がある。第三に、増殖因子受容体を過剰発現する腫瘍に罹患した患者はしばしば予後不良である。過剰発現は、とりわけ乳癌、肺癌及び膀胱癌における予後不良と密接に結びつけられており、むしろ従来の治療法へ非感受性である浸潤性表現型/転移性表現型と関連し得る(Eccles et al,1994)。
腫瘍抗原(または腫瘍関連抗原)をコードする核酸が発現制御配列へ操作可能に連結され得ることが企図される。コード配列へ作動可能に連結された発現制御配列は、コード配列の発現が発現制御配列と適合性のある条件下で達成されるように、つながれる。発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、始まりでの開始コドン、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、イントロンのためのスプライシングシグナル、及びインフレームの終止コドンが含まれるが、これらに限定されない。適切なプロモーターには、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、レトロウイルスLTR、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトCMV最初期Iプロモーター、及び様々なポックスウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されず、様々なポックスウイルスプロモーターには、以下のワクシニアウイルスプロモーターまたはMVA由来プロモーター(ATIプロモーター、30Kプロモーター、I3プロモーター、PrSプロモーター、Pr7.5K、40Kプロモーター、PrSynIImプロモーター、PrLE1プロモーター及びPrSSLプロモーター(PCT出願PCT/EP2009/008459中で記述されるように))が含まれるが、これらに限定されない。
追加の発現制御配列には、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び所望されるホスト系中での所望される組換えタンパク質(例えばHER−2、PSA、PAP、CEAまたはMUC−1)をコードする核酸配列の適切な転写及び後続する翻訳のために必要な他の配列が含まれるが、これらに限定されない。ポックスウイルスベクターは、所望されるホスト系中での核酸配列を含有する発現ベクターの移動及び後続する複製のために必要な追加の要素も含有し得る。かかるベクターが、従来の方法(Ausubel et al.、「Current Protocols in Molecular Biology」中で、John Wiley and Sons、New York、N.Y.(1987))を使用して容易に構築され、市販で入手可能であることは、当業者によって更に理解されるだろう。
修飾された腫瘍関連抗原
特定の実施形態において、APCの表面上でMHCクラスI分子と会合して提示された場合にポリペプチド抗原に由来するエピトープを表面上で提示する細胞に対して、CTL応答が誘導されるように、細胞関連ポリペプチド抗原は修飾される。特定のかかる実施形態において、少なくとも1つの第1の外来のTエピトープは、提示された場合に、APCの表面上でMHCクラスII分子と会合する。特定のかかる実施形態において、細胞関連抗原は腫瘍関連抗原(TAA)である。
エピトープを提示することができる例示的なAPCには、樹状細胞及びマクロファージが含まれる。追加の例示的なAPCは、任意の飲作用をするAPCまたは食菌をするAPCを含み、それは、1)MHCクラスI分子へ結合されたCTLエピトープ、及び2)MHCクラスII分子へ結合されたTエピトープを同時に提示することができる。
特定の実施形態において、被験体への投与後に、本明細書において記述される腫瘍関連抗原(TAA)の1つまたは複数と優先的に反応するポリクローナル抗体が誘発されるように、本明細書において提示されるTAAのうちの1つまたは複数(CEA、MUC−1、PAP、PSA、HER2等であるが、これらに限定されない)へ修飾が行われる。かかる抗体は、転移細胞が転移型へと発生することを防止でき、加えて腫瘍細胞を攻撃し消失させることができた。この抗腫瘍効果のエフェクター機構は補体及び抗体依存性細胞性細胞傷害を介して媒介されるだろう。加えて、誘導された抗体は、増殖因子依存性オリゴ二量体化及び受容体の内部移行の阻害を介して癌細胞増殖も阻害することができた。特定の実施形態において、かかる修飾されたポリペプチド抗原は、腫瘍細胞によってディスプレイされる公知の及び/または予測されるTAAエピトープに対して向けられたCTL応答を誘導することができた。
特定の実施形態において、修飾されたTAAポリペプチド抗原は、細胞関連ポリペプチド抗原のCTLエピトープ及びバリエーションを含み、そこでバリエーションは外来のTエピトープのうちの少なくとも1つのCTLエピトープを含む。特定のかかる修飾されたTAAには、一非限定的例において、少なくとも1つのCTLエピトープを含む1つまたは複数の修飾されたHER−2ポリペプチド抗原、及び外来のTエピトープのうちの少なくとも1つのCTLエピトープを含むバリエーションが含まれ得る。これらを生産する方法は、米国特許第7,005,498号ならびに米国特許第2004/0141958号及び第2006/0008465号中で記述される。
特定の実施形態において、外来のTエピトープは、天然に存在する「無差別性」T細胞エピトープである。かかる無差別性T細胞エピトープは、動物種または動物集団の個体の大部分において活性がある。特定の実施形態において、ワクチンはかかる無差別性T細胞エピトープを含む。特定のかかる実施形態において、無差別性T細胞エピトープの使用は、同じワクチン中での非常に多数の異なるCTLエピトープについての必要性を低減させる。例示的な無差別性T細胞エピトープには、破傷風毒素(P2エピトープ及びP30エピトープ(Panina−Bordignon et al.,1989)が含まれるがこれらに限定されない)、ジフテリア毒素、インフルエンザウイルス赤血球凝集素(HA)及び熱帯熱マラリア原虫CS抗原からのエピトープが含まれるが、これらに限定されない。
追加の無差別性T細胞エピトープには、異なるHLA−DRによってコードされたHLA−DR分子の大部分を結合することができるペプチドが含まれる。例えばWO98/23635(Frazer IH et al.、The University of Queenslandへ譲渡された);Southwood S et.al,1998,J.Immunol.160:3363 3373;Sinigaglia F et al.,1988,Nature 336:778 780;Rammensee HG et al.,1995,Immunogenetics 41:4 178 228;Chicz RM et al.,1993,J.Exp.Med 178:27 47;Hammer J et al.,1993,Cell 74:197 203;及びFalk K et al.,1994,Immunogenetics 39:230 242を参照されたい。後者の参照はHLA−DQ及びHLA−DPリガンドも扱う。これらの参照中でリストされたすべてのエピトープは、本明細書において記述されるような候補の天然エピトープ、これらと一般的なモチーフを共有するエピトープと関連する。
特定の他の実施形態において、無差別性T細胞エピトープは、ハプロタイプの大部分を結合できる人工のT細胞エピトープである。特定のかかる実施形態において、人工のT細胞エピトープは、WO95/07707及び対応する論文Alexander J et al.,1994,Immunity 1:751 761中で記述されるような汎DRエピトープペプチド(「PADRE」)である。
mHER2
様々な修飾されたHER−2ポリペプチド抗原及びそれを生産する方法は、米国特許第7,005,498号ならびに米国特許第2004/0141958号及び第2006/0008465号(それらは参照することにより本明細書に援用される)中で記述される。それらの文書は、HER−2ポリペプチド中の異なる位置で無差別性T細胞エピトープを含む様々な修飾されたHER−2ポリペプチド抗原を記述する。
ヒトHER−2配列は、もっぱらタンパク質の一次構造に基づいて多数のドメインへと分割することができる。それらのドメインは以下の通りである。細胞外(受容体)ドメインは、アミノ酸1〜654にわたり、以下の、アミノ酸1〜173にわたるドメインI(成熟ポリペプチドのN末端ドメイン);アミノ酸174〜323にわたるドメインII(システインリッチドメイン、24システイン残基);アミノ酸324〜483にわたるドメインIII(相同なEGF受容体中でのリガンド結合ドメイン);及びアミノ酸484〜623にわたるドメインIV(システインリッチドメイン、20システイン残基)の複数のサブドメインを含有する。膜貫通残基はアミノ酸654〜675にわたる。細胞内(キナーゼ)ドメインはアミノ酸655〜1235にわたり、アミノ酸655〜1010にわたるチロシンキナーゼドメイン(コアTKドメインは725〜992にわたる);及びアミノ酸1011〜1235にわたるC末端のドメインを含有する。
P2またはP30のヒトTヘルパーエピトープのいずれかによって置き換えられるHER−2のアミノ酸配列中の部位の選択は、米国特許第7,005,498号ならびに米国特許第2004/0141958号及び第2006/0008465号中で記述される。要約のために、以下のパラメーターを考慮した。
1.公知の及び予測されるCTLエピトープ;
2.関連する受容体(特定のEGFR)への相同性;
3.システイン残基の保存;
4.予測されるループ構造、α−ヘリックス構造及びβ−シート構造;
5.可能性のあるN型糖鎖付加部位;
6.露出するアミノ酸残基及び埋没するアミノ酸残基の予測;
7.ドメイン構成。
CTLエピトープは、ドメインI、ドメインIII、TMドメイン、及びTKドメイン中の2または3の「ホットスポット」中に密集するように思われる。米国特許第7,005,498号ならびに米国特許第2004/0141958号及び第2006/0008465号中で記述されるように、これらは大部分は保存されなくてはならない。
他の受容体との高度の相同性を備えた領域は、HER−2の「全体的な」三次構造のために、及びしたがって抗体認識のために構造的に重要であるだろうが、恐らく結果として構造の局所的変更のみにより低い相同性を備えた領域を交換することができる。
システイン残基はしばしば分子内のジスルフィド架橋形成に関与し、したがって三次構造に関与し、変化させるべきではない。α−へリックス構造またはβ−シート構造を形成することが予測される領域は、これらの領域がタンパク質の折り畳みに関与すると考えられるので、外来のエピトープの挿入点として避けるべきである。
タンパク質のマンノシル化が所望されるならば、可能性のあるN型糖鎖付加部位は保存されるべきである。
分子中で内部であると(それらの疎水性特性によって)予測される領域は、これらが折り畳みに関与し得るので、好ましくは保存されるべきである。これとは対照的に、溶媒に露出される領域は、モデルTエピトープのP2及びP30の挿入のための候補位置として供することができる。
最終的に、タンパク質のドメイン構成は、タンパク質の構造及び機能について関連性があるので、考慮に入れるべきである。
米国特許第7,005,498号ならびに米国特許第2004/0141958号及び第2006/0008465号中で記述されるように、戦略の焦点は、HER−2の細胞外部分の構造を可能な限り保存することであり、この構造が抗体の中和のための標的として関連するタンパク質の部分であるからである。これとは対照的に、癌細胞の表面上の天然の膜結合型HER−2の細胞内部分は、液性免疫系については接近不能である。
HER−2の様々なドメイン中に挿入された破傷風毒素のP2エピトープ及びP30エピトープを使用する様々な例示的なコンストラクトは、米国特許第7,005,498号ならびに米国特許第2004/0141958号及び第2006/0008465号中で提供される。「mHER2」と称される1つの例示的な修飾されたHER−2ポリペプチド抗原は、細胞外ドメイン及び9アミノ酸の膜貫通ドメイン;修飾されたHER−2ポリペプチドのドメインII中のアミノ酸残基273〜287の間に挿入されたP2エピトープ;ならびに修飾されたHER−2ポリペプチドのドメインIV中のアミノ酸残基655〜675の間に挿入されたP30エピトープを含む。
組換えMVA−BN−mHER2
非限定的実施形態において、腫瘍関連抗原を含む組換えMVA(例えばMVA−BN−mHER2)を、以下の通り構築する。最初のウイルスストックは、複製について許容する細胞タイプ(例えばCEF細胞)を使用して、細胞培養中での組換えによって生成する。細胞を、弱毒化したワクシニアウイルス(例えばMVA−BN)により接種し、腫瘍関連抗原(例えばmHER2)配列及びウイルスゲノムの隣接領域をコードする組換えプラスミド(例えばpBN279)によりトランスフェクションする。1つの非限定的実施形態において、プラスミドpBN279は、MVA−BN中にも存在する配列(ORF64と65との間の隣接遺伝子間領域、IGR64/65)を含有する。mHER2配列は、MVA−BNウイルスゲノムの中への組換えを可能にするようにMVA−BN配列の間に挿入される。特定の実施形態において、プラスミドは、CEF細胞中の組換えコンストラクトの選択を可能にする1つまたは複数の選択遺伝子を含む選択カセットも含有する。好ましい実施形態において、組換えMVAは、配列番号:2を含むポリペプチドをコードする。
培養で同時に感染及びトランスフェクションを行うことは、相同組換えがウイルスゲノムと組換えプラスミドとの間で起こることを可能にする。次いでインサートを保有するウイルスを単離し、特徴づけし、ウイルスストックを調製した。特定の実施形態において、ウイルスを選択の非存在下においてCEF細胞培養で継代して、選択遺伝子、GPT及びmRFP1をコードする領域の喪失を可能にする。
PD−1及びLAG−3のアンタゴニスト
特定の実施形態において、本発明は、PD−1及びLAG−3のアンタゴニストを包含する。PD−1及びLAG−3のアンタゴニストは、PD−1及びLAG−3をそれぞれ妨害する。
かかるアンタゴニストには、PD−1またはLAG−3へ特異的に結合し、PD−1またはLAG−3の生物学的活性を阻害する抗体;PD−1またはLAG−3の発現を妨害するアンチセンス核酸RNA;PD−1、LAG−3の発現を妨害する小型干渉RNA;及びPD−1またはLAG−3の小分子阻害剤が含まれる。
PD−1またはLAG−3の候補アンタゴニストは、当技術分野において公知の及び/または本出願内で開示される多様な技法によって機能について検査することができる(インビトロモデルまたはマウスモデルにおいてPD−1またはLAG−3の機能による阻害を妨害する能力等)。
ICOSのアゴニスト
本発明は、ICOSのアゴニストを更に包含する。ICOSのアゴニストはICOSを活性化する。一実施形態において、アゴニストはICOS−L(ICOSの天然リガンド)である。アゴニストは、結合特性及び活性化特性を保持するICOS−Lの変異型であり得る。ICOS−Lの変異型はインビトロでICOSを刺激することで活性についてスクリーニングすることができる。
好ましくは、ICOSのアゴニストは抗体である。
抗体
一実施形態において、PD−1もしくはLAG−3のアンタゴニストまたはICOSのアゴニストは、抗体である。抗体は、合成、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、当技術分野において周知の技法によって作製することができる。かかる抗体は、抗体の抗原結合部位を介してPD−1、LAG−3またはICOSへ特異的に結合する(非特異的結合とは対照的に)。PD−1、LAG−3またはICOSのポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などは、それと免疫反応性のある抗体の生産における免疫原として用いることができる。より具体的には、ポリペプチド、断片、バリアント、融合タンパク質などは、抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含有する。
これらの抗原決定基またはエピトープは直線状または立体配座的(不連続)のいずれかであり得る。直線状エピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一セクションから構成される一方で、立体配座的エピトープまたは不連続エピトープは、タンパク質の折り畳みに際して近傍に近接させられるポリペプチド鎖の異なる領域からのアミノ酸セクションから構成される(C.A.Janeway,Jr.and P.Travers、Immuno Biology 3:9(Garland Publishing Inc.、第2版1996))。折り畳まれたタンパク質は複雑な表面を有するので、利用可能なエピトープの数はかなり多数である。しかしながら、タンパク質の立体配座及び立体障害に起因して、エピトープへ実際に結合する抗体の数は、入手可能なエピトープの数よりも少ない(C.A.Janeway,Jr.and P.Travers、Immuno Biology 2:14(Garland Publishing Inc.、第2版1996))。エピトープは、当技術分野において公知の任意の方法によって同定することができる。
PD−1、LAG−3またはICOSへ特異的に結合し、その機能をブロックする(「アンタゴニスト抗体」)か、またはその機能を活性化する(アゴニスト抗体)のいずれかである抗体(scFV断片が含まれる)は、本発明によって包含される。かかる抗体は従来の手段によって生成することができる。
本発明は、その機能をブロックする(「アンタゴニスト抗体」)か、その機能を活性化する(アゴニスト抗体)PD−1、LAG−3またはICOSに対するモノクローナル抗体を包含する。PD−1、LAG−3及びICOSに対する例示的なブロッキングモノクローナル抗体は、WO2012/131004及びWO2011/041613(それらは参照することにより本明細書に援用される)中で記述される。
抗体は高い親和性及び特異性の両方を備えてそれらの標的へ結合できる。それらは比較的大きな分子(約150kDa)であり、抗体結合部位がタンパク質−タンパク質相互作用部位の近傍内にある場合、それは立体的に2つのタンパク質(例えばPD−1、LAG−3またはICOSとその標的リガンド)の間の相互作用を阻害することができる。本発明は、PD−1、LAG−3またはICOSのリガンド結合部位に近接した近傍内のエピトープへ結合する抗体を更に包含する。
様々な実施形態において、本発明は、分子間相互作用(例えばタンパク質−タンパク質相互作用)を妨害する抗体に加えて、分子内相互作用(例えば分子内の立体配座的変化)を乱す抗体を包含する。抗体は、PD−1もしくはLAG−3の生物学的活性をブロックする能力、もしくはリガンドへのPD−1もしくはLAG−3の結合、及び/または他の特性についてスクリーニングすることができる。アゴニスト抗体は、ICOSの生物学的活性を活性化する能力について更にスクリーニングすることができる。
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方は従来の技法によって調製することができる。
PD−1、LAG−3及びICOS、ならびにPD−1、LAG−3及びICOSのアミノ酸配列に基づくペプチドを利用して、PD−1、LAG−3またはICOSへ特異的に結合する抗体を調製することができる。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片(F(ab’)2及びFab断片、一本鎖可変断片(scFvs)、単一ドメイン抗体断片(VHHまたはナノボディ)、二価抗体断片(ダイアボディ)等)に加えて、任意の組換え的及び合成的に生産された結合パートナーが含まれることを意味する。
抗体は、それらがPD−1、LAG−3またはICOSポリペプチドに約10−1Ka以上で結合するならば、特異的に結合していると定義される。結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技法(例えばScatchard et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,51:660(1949)によって記述されるもの)を使用して容易に決定することができる。
ポリクローナル抗体は、当技術分野において周知の手順を使用して、多様な源(例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラット)から容易に生成することができる。一般に、精製されたPD−1、LAG−3もしくはICOS、または適切にコンジュゲートされたPD−1、LAG−3もしくはICOSのアミノ酸配列に基づいたペプチドは、典型的には非経口の注射を介して宿主動物へ投与される。PD−1、LAG−3またはICOSの免疫原性は、アジュバント(例えばFreundの完全または不完全アジュバント)の使用を介して促進することができる。ブースター免疫付与に続いて、少量の血清サンプルを収集し、PD−1、LAG−3またはICOSポリペプチドへの反応性について試験する。かかる決定のために有用な様々なアッセイの例には、Antibodies:A Laboratory Manual、Harlow and Lane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988中で記述されるものに加えて、向流免疫電気泳動法(CIEP)、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロット分析及びサンドイッチ分析等の手順が含まれる。米国特許第4,376,110号及び第4,486,530号を参照されたい。
モノクローナル抗体は容易に周知の手順を使用して調製することができる。例えば、米国特許第RE32,011号、第4,902,614号、第4,543,439号及び第4,411,993号中で記述される手順;Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses、Plenum Press、Kennett,McKeam,and Bechtol(編)、1980年を参照されたい。
例えば、宿主動物(マウス等)に、単離及び精製されたPD−1、LAG−3もしくはICOSまたはコンジュゲートされたPD−1、LAG−3もしくはICOSペプチドを、随意にアジュバントの存在下において、少なくとも1回及び約3週間の間隔で好ましくは少なくとも2回、腹腔内に注射することができる。次いでマウス血清を従来のドットブロット技法または抗体捕捉(ABC)によってアッセイして、どの動物を融合させることが最も好適か決定する。およそ2〜3週間後に、マウスに、PD−1、LAG−3もしくはICOSまたはコンジュゲートされたPD−1、LAG−3もしくはICOSペプチドの静脈内ブーストを与える。後にマウスを屠殺し、確立されたプロトコルに従って商業的に入手可能なミエローマ細胞(Ag8.653(ATCC)等)と脾臓細胞を融合させる。簡潔には、ミエローマ細胞を培地中で複数回洗浄し、約3の脾臓細胞対1のミエローマ細胞の比でマウス脾臓細胞へ融合させる。融合剤は、当技術分野において使用される任意の適切な薬剤(例えばポリエチレングリコール(PEG))であり得る。融合物を、融合させた細胞の選択的な増殖を可能にする培地を含有するプレートの中へプレーティングする。次いで融合させた細胞をおよそ8日間増殖させることができる。生じたハイブリドーマから上清を収集し、ヤギ抗マウスIgにより最初にコーティングされたプレートへ添加する。洗浄に続いて、標識(標識したPD−1、LAG−3またはICOSポリペプチド等)を各々のウェルへ添加し、続いてインキュベーションした。引き続き陽性ウェルを検出することができる。陽性クローンはバルク培養中で増殖させることができ、引き続き上清をプロテインAカラム(Pharmacia)の上で精製する。
本発明のモノクローナル抗体は、代替の技法(Alting−Mees et al.、「Monoclonal Antibody Expression Libraries:A Rapid Alternative to Hybridomas」、Strategies in Molecular Biology 3:1−9(1990)(参照として本明細書に援用される)によって記述されるもの等)を使用して、生産することができる。同様に、結合パートナーは、特異的な結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込む組換えDNA技法を使用して構築することができる。かかる技法はLarrick et al.,Biotechnology,7:394(1989)中で記述される。
かかる抗体の抗原結合断片(従来の技法によって生産できる)も、本発明によって包含される。かかる断片の例にはFab及びF(ab’)2の断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子操作技法によって生産された抗体断片及び誘導体も提供される。
本発明のモノクローナル抗体はキメラ抗体(例えばマウスモノクローナル抗体のヒト化バージョン)を含む。かかるヒト化抗体は公知の技法によって調製することができ、抗体がヒトへ投与される場合、免疫原性の低減という利点がありえる。一実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域(または単にその抗原結合部位)及びヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位及びヒト抗体に由来する可変領域断片(抗原結合部位を欠損する)を含むことができる。キメラモノクローナル抗体及び更に操作されたモノクローナル抗体の生産のための手順には、Riechmann et al.(Nature 332:323,1988)、Liu et al.(PNAS 84:3439,1987)、Larrick et al.(Bio/Technology 7:934,1989)及びWinter and Harris(TIPS 14:139,May,1993)中で記述されるものが含まれる。抗体を遺伝子導入により生成する手順は、GB2,272,440、米国特許第5,569,825号及び第5,545,806号中で見出すことができる。
遺伝子操作方法によって生産された抗体(標準的な組換えDNA技法を使用して作製できる、ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体等)を、使用することができる。かかるキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の標準的なDNA技法を使用して、例えば、Robinson et al.国際公開第WO87/02671号;Akira,et al.欧州特許出願0184187;Taniguchi,M.欧州特許出願0171496;Morrison et al.欧州特許出願0173494;Neuberger et al.PCT国際公開第WO86/01533号;Cabilly et al.米国特許第4,816,567号;Cabilly et al.欧州特許出願0125023;Better et al.,Science 240:1041 1043,1988;Liu et al.,PNAS 84:3439 3443,1987;Liu et al.,J.Immunol.139:3521 3526,1987;Sun et al.PNAS 84:214 218,1987;Nishimura et al.,Canc.Res.47:999 1005,1987;Wood et al.,Nature 314:446 449,1985;及びShaw et al.,J.Natl.Cancer Inst.80:1553 1559,1988;Morrison,S.L.,Science 229:1202 1207,1985;Oi et al.,BioTechniques 4:214,1986;Winter米国特許第5,225,539号;Jones et al.,Nature 321:552 525,1986;Verhoeyan et al.,Science 239:1534,1988;及びBeidler et al.,J.Immunol.141:4053 4060,1988中で記述される方法を使用して、遺伝子操作によって生産することができる。
合成抗体及び準合成抗体に関連して、かかる用語は、抗体断片、アイソタイプスイッチした抗体、ヒト化抗体(例えばマウス−ヒト、ヒト−マウス)、ハイブリッド、複数の特異性を有する抗体、及び完全合成抗体様分子をカバーするが、これらに限定されないことが意図される。
治療法上の適用のために、ヒト定常領域及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体は、抗体に対する患者の免疫応答を最小限にするために多くの場合好ましい。かかる抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子を含有する遺伝子導入動物の免疫付与によって生成することができる。Jakobovits et al.Ann NY Acad Sci 764:525−535(1995)を参照されたい。
PD−1、LAG−3またはICOSポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体は、被験体のリンパ細胞に由来するmRNAから調製された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖cDNAを使用して、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(FabファージディスプレイライブラリーまたはscFvファージディスプレイライブラリー等)を構築することによっても調製することができる。例えばMcCafferty et al.PCT公開WO92/01047;Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581 597;及びGriffths et al.(1993)EMBO J 12:725 734を参照されたい。加えて、抗体可変領域のコンビナトリアルライブラリーは公知のヒト抗体の変異によって生成することができる。例えば、PD−1、LAG−3またはICOSを結合することが公知であるヒト抗体の可変領域を、例えばランダムに改変された変異オリゴヌクレオチドを使用することによって変異させて、変異させた可変領域のライブラリーを生成することができ、次いでそれはPD−1、LAG−3またはICOSへの結合をスクリーニングすることができる。免疫グロブリン重鎖及び/または軽鎖のCDR領域内でランダム変異誘発を誘導する方法、ランダム化した重鎖及び軽鎖を掛け合わせてペアリングを形成する方法、ならびにスクリーニング方法は、例えばBarbas et al.PCT公開WO96/07754;Barbas et al.(1992)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89:4457 4461中で見出すことができる。
免疫グロブリンライブラリーをディスプレイパッケージ(好ましくは線状ファージに由来する)の集団によって発現させて、抗体ディスプレイライブラリーを形成することができる。抗体ディスプレイライブラリーの生成における使用のために特に適用可能な方法及び試薬の例は、例えばLadner et al.米国特許第5,223,409号;Kang et al.PCT公開WO92/18619;Dower et al.PCT公開WO91/17271;Winter et al.PCT公開WO92/20791;Markland et al.PCT公開WO92/15679;Breitling et al.PCT公開WO93/01288;McCafferty et al.PCT公開WO92/01047;Garrard et al.PCT公開WO92/09690;Ladner et al.PCT公開WO90/02809;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370 1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81 85;Huse et al.(1989) Science 246:1275 1281;Griffths et al.(1993)前出;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889 896;Clackson et al.(1991)Nature 352:624 628;Gram et al.(1992)PNAS 89:3576 3580;Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373 1377;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133 4137;及びBarbas et al.(1991)PNAS 88:7978 7982中で見出すことができる。一旦ディスプレイパッケージ(例えば線状ファージ)の表面上にディスプレイされたならば、抗体ライブラリーをスクリーニングして、PD−1、LAG−3またはICOSポリペプチドを結合する抗体を発現するパッケージを同定及び単離する。好ましい実施形態において、ライブラリーの一次スクリーニングは、固定化されたPD−1、LAG−3またはICOSポリペプチドによるパニングを含み、固定化されたPD−1、LAG−3またはICOSポリペプチドを結合する抗体を発現するディスプレイパッケージを選択する。
腫瘍抗原を発現する組換えオルソポックスウイルスとPD−1、LAG−3及びICOSのアゴニスト/アンタゴニストによる例示的な組み合わせ療法
少なくとも1つの態様において、本発明は、各々が腫瘍抗原をコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスを、本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせて用いる治療の方法を包含する。
1つの例示的な実施形態において、腫瘍関連抗原HER−2を過剰発現する細胞によって媒介される癌(例えば乳癌)に罹患する患者は、以下の組み合わせによって治療することができる。1)1つまたは複数の組換えオルソポックスウイルス、例えばHER−2抗原をコードするワクシニアウイルス(例えばWyethまたはMVA)、または2)HER−2抗原をコードする組換えオルソポックスウイルス及び組換えアビポックスウイルス(例えば鶏痘ウイルス、POXVAC−TC)の組み合わせを、本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニスト及び/またはアンタゴニストと、1)または2)の組み合わせで投与する。好ましい実施形態において、MVAはMVA−BNである。特に好ましい実施形態において、MVAは配列番号:2を含むポリペプチドをコードする。
追加の例示的な実施形態において、前立腺癌に罹患する患者は、PSA抗原及び/またはPAP抗原をコードする、組換えオルソポックスウイルス(例えばワクシニアウイルス(例えばWyethまたはMVA))及び組換えアビポックスウイルス(例えば鶏痘ウイルス、POXVAC−TC)を、本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせることによって治療することができる。特に好ましい実施形態において、組換えワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルスの組み合わせは、PROSTVAC(登録商標)(各々がPSA及びTRICOMを発現するワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルス)であり、本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニスト及び/またはアンタゴニストと共に投与される。
さらに追加の実施形態において、腫瘍関連抗原CEA及び/またはMUC−1を過剰発現する細胞によって媒介される癌に罹患する患者は、各々がCEA抗原及びMUC−1抗原をコードする、組換えオルソポックスウイルス(例えばワクシニアウイルス(例えばWyeth、MVAまたはMVA−BN))及び組換えアビポックスウイルス(例えば鶏痘ウイルス、POXVAC−TC)を、本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニストまたはアンタゴニストと、組み合わせることによって治療することができる。CEA及びMUC−1を過剰発現する細胞によって媒介される癌のいくつかの非限定的例には、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌及び卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。1つまたは複数の好ましい実施形態において、組み合わせ療法には、CV301(各々がCEA、MUC−1及びTRICOMを発現するワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルス)が含まれる。別の好ましい実施形態において、組み合わせ療法には、MVA/鶏痘−CV301(各々がCEA、MUC−1及びTRICOMを発現するMVA(またはMVA−BN)及び鶏痘を含む、異種プライム−ブースト)が含まれる。
さらに別の実施形態において、腫瘍関連抗原CEA及び/またはMUC−1を過剰発現する細胞によって媒介される癌に罹患する患者は、同種プライム−ブースト(本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせたコードされたCEA抗原及び/またはMUC−1抗原)によって治療することができる。2つ以上の組換えオルソポックスウイルスはワクシニアウイルス(例えばWyeth、MVAまたはMVA−BN)であり得ることが企図される。CEA及びMUC−1を過剰発現する細胞によって媒介される癌のいくつかの非限定的例には、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌及び卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。1つまたは複数の好ましい実施形態において、治療はMVA−CV301であり得、それは、各々が同種プライム−ブーストとして投与されるCEA、MUC−1及びTRICOMを発現する2つ以上のMVA(またはMVA−BN)ウイルスを含む。
組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスは、全身的または局所的のいずれか、すなわち非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、傷付処理、または当業者に公知の他の投与の経路によって投与することができる。好ましくは、投与は傷付処理を経由する。より好ましくは、投与は皮下または筋肉内を経由する。一実施形態において、10〜1010TCID50の組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスを患者へ投与する。好ましくは、10〜1010TCID50の組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスを患者へ投与する。より好ましくは、10〜1010TCID50の組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスを患者へ投与する。最も好ましくは、10〜10TCID50の組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスを患者へ投与する。
上で定義されるような組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスの単一投与により免疫応答を誘導することは可能である。本発明に記載のオルソポックスウイルス及び/またはアビポックスウイルスを、第1のワクチン接種のために、ならびに同じものまたは第1のワクチン接種において使用されるものではなく関連する組換えオルソポックスウイルス及び/またはアビポックスウイルスの投与によって第1のワクチン接種において生成された免疫応答をブーストするために、使用することもできる。本発明に記載の組換えオルソポックスウイルス及び/またはアビポックスウイルスを異種プライム−ブーストレジームにおいて使用することもでき、そこで、プライムワクチン接種のうちの1つまたは複数は、上で定義されるようなオルソポックスウイルスにより行われ、ブーストワクチン接種のうちの1つまたは複数は、別のタイプのワクチン(例えば本明細書において定義されるようなアビポックスウイルスワクチンまたは別のウイルスワクチン、タンパク質ワクチンまたは核酸ワクチン)により行われる。
癌には、好ましくは乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌及び卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。
癌患者は、マウスまたはラットが含まれる任意の哺乳類であり得る。好ましくは、癌患者は霊長目の動物であり、最も好ましくはヒトである。
一実施形態において、本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニストまたはアンタゴニスト、及び腫瘍抗原を含むポリペプチドをコードするオルソポックスウイルスは、同時に投与される。組み合わせ治療はいずれかの治療単独より優れている。
好ましい実施形態において、オルソポックスウイルスは、アゴニスト及び/またはアンタゴニスト投与の1、2、3、4、5、6または7日以内の投与のためのものである。オルソポックスウイルスはアゴニスト及び/またはアンタゴニストの前または後に投与することができる。
患者へ投与される投薬アゴニストまたはアンタゴニストは、典型的には0.1mg/kg〜100mg/kg患者体重である。好ましくは、患者へ投与される投薬は、0.1mg/kg〜20mg/kg患者体重、より好ましくは1mg/kg〜10mg/kg患者体重、最も好ましくは3mg/kg〜10mg/kg患者体重の間である。一般的に、ヒト抗体及びヒト化抗体は、外来のポリペプチドへの免疫応答に起因して他の種からの抗体よりも人体内で長い半減期を有する。したがって、ヒト抗体のより少ない投薬及びより低頻度の投与は多くの場合可能である。
効果的な治療法のために必要な活性成分の量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、及び投与される他の医薬品が含まれる様々な因子に依存するだろう。したがって、治療投薬は安全性及び有効性を至適化するようにタイトレーションすべきである。典型的には、インビトロで使用される投薬は、活性成分のインシトゥーの投与のために有用な量における有用な指針を提供することができる。特定の障害の治療のための効果的な用量の動物試験は、ヒト投薬の更なる予測的な指標を提供するだろう。様々な考察は、例えばGoodman and Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics、第7版(1985)、MacMillan Publishing Company、New York及びRemington’s Pharmaceutical Sciences、第18版(1990)、Mack Publishing Co、Easton Pa中で記述される。投与のための方法はその中で論じられ、それらには、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、鼻腔、イオン導入投与及び同種のものが含まれる。
本発明の組成物は、投与の方法に依存して多様な単位投薬形状で投与することができる。例えば、経口投与のために好適な単位投薬形状には、固体投薬形状(粉末、錠剤、ピル、カプセル及び糖衣錠等)及び液体投薬形状(エリキシル、シロップ及び懸濁物等)が含まれる。活性成分は、滅菌済み液体投薬形状で非経口的に投与することもできる。ゼラチンカプセルは、活性成分、及び非活性成分として粉末担体(グルコース、ラクトース、ショ糖、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウム及び同種のもの等)を含有する。所望される色、味覚、安定性、緩衝能力、分散または他の公知の所望される特色を提供するために添加できる追加の非活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク及び同種のものである。類似する希釈剤は圧縮錠剤の作製に使用することができる。錠剤及びカプセルの両方は、数時間の期間にわたる医薬物の継続的な放出を提供する徐放性製剤として製造することができる。圧縮錠剤は、任意の不快な味覚をマスクし、大気から錠剤を保護するように糖コーティングもしくはフィルムコーティングするか、または胃腸管中での選択的分解のために腸溶性コーティングすることができる。経口投与のための液体投薬形状は、患者への受け入れを増加させるために着色剤及び風味添加物を含有することができる。
医薬製剤中の本発明の組成物の濃度は、広く変動し、すなわち重量で約0.1%未満から、通常約2%で、または少なくとも約2%で、20%程度から50%以上であり得、選択された投与の特定のモードに従って主として液体体積、粘度などによって選択されるだろう。
固体組成物については、従来の非毒性固体担体を使用することができ、それには、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム及び同種のものが含まれる。経口投与については、薬学的に許容される非毒性組成物は、通常用いられる賦形剤(以前にリストされた担体等)のうちの任意のもの、ならびに一般的には10〜95%及びより好ましくは25%〜75%の濃度の活性成分(すなわち本発明の1つまたは複数の組成物)を取り込むことによって形成される。
エアロゾル投与については、本発明の組成物は、好ましくは界面活性剤及び噴射剤と共に微細に分割された形状で供給される。本発明の組成物の好ましいパーセンテージは、重量で0.01%〜20%、好ましくは1〜10%である。界面活性剤は当然非毒性であるべきであり、好ましくは噴霧剤中で可溶性である。かかる薬剤の代表は、6〜22の炭素原子を含有する脂肪酸(カプロン酸(c−aproic acid)、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸(olesteric acid)及びオレイン酸等)と、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分的なエステルである。混合エステル(混合グリセリドまたは天然グリセリド等)を用いることができる。界面活性剤は、組成物の重量で0.1%〜20%、好ましくは0.25〜5%を構成することができる。組成物のバランスは通常噴射剤で行われる。鼻腔内送達のために所望に応じて例えば担体としてレシチンを含むことができる。
本発明のコンストラクトは、加えて当技術分野において周知の技法によってデポータイプシステム、カプセル化形状、または移植で送達することができる。同様に、コンストラクトは、対象となる組織へポンプ経由で送達することができる。
製剤中で活性薬剤が製剤によって不活性化されず、製剤が生理的に適合性であれば、前述の製剤のうちの任意のものは本発明に従う治療及び療法において適切であり得る。
治療法用の組成物及び使用
本発明は、腫瘍エピトープに対する免疫学的反応の出現または改善を誘導するかまたはそれらに寄与することができる、治療法用の組成物またはワクチンの調製のための、本発明に記載のオルソポックスウイルスベクター及びアビポックスウイルスベクターの使用に更に関する。本発明は、したがって医薬品またはワクチンとして有用なウイルスまたはベクターを提供する。
したがって、本発明は、本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせた、本発明に記載の組換えオルソポックスウイルスベクター(ワクシニア、MVAまたはMVA−BN等)及び/または組換えアビポックスウイルスベクターを含む免疫原性組成物に関する。
したがって、本発明に記載の組換えオルソポックスウイルスベクター及び組換えアビポックスウイルスベクターは、癌の治療のための治療法用の組成物または医薬品の調製のために使用することができる。
本発明は、腫瘍の治療のために、及びとりわけ抗癌治療として、予防用及び/または治療法用のワクチン接種プロトコルにおける使用のための組成物を包含する。
一実施形態において、本発明は、癌患者(前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌または卵巣癌の患者等であるが、これらに限定されない)への投与または治療のための組成物を包含する。
1つまたは複数の好ましい実施形態において、本発明は、癌患者(特に乳癌患者または前立腺癌患者)への投与または治療のための組成物の使用を包含する。
一実施形態において、同時または連続的な投与のための組成物は、本発明に記載のMVAベクター、及び本発明に記載の1つまたは複数の抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを含む。
加えてまたはあるいは本明細書において記述される組成物及び方法は、1つまたは複数の免疫刺激分子/調節分子含むことができる。任意の適切な免疫刺激分子/調節分子を使用することができ、それらはインターロイキン(IL)−2、IL−4、IL−6、IL−12、IL−15、IL−15/IL−15Ra、IL−15/IL−15Ra−Fc、インターフェロン(IFN)−γ、腫瘍壊死因子(TNF)−α、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、LFA−1、LFA−2、LFA−3、CD70、CD−72、RANTES、G−CSF、GM−CSF、OX−40L、41 BBL、抗CTLA−4、IDO阻害剤、抗PDL1、抗PD1及びその組み合わせ等である。好ましくは、組成物は、B7.1、ICAM−1及びLFA−3(TRICOMとも称される)の組み合わせを含む。1つまたは複数の免疫刺激分子/調節分子は、1つまたは複数の免疫刺激分子/調節分子をコードする核酸を含むベクター(例えばポックスウイルスベクター等の組換えウイルスベクター)の形状で投与することができる。例えば、1つまたは複数の免疫刺激分子/調節分子(例えばIL−12)は、キトサン有りまたは無しでDNAプラスミドの形状で投与することができる。
より好ましい実施形態において、少なくとも1つの腫瘍抗原を含むことに加えて、組換えオルソポックスウイルス及び/または組換えアビポックスウイルスは、B7.1、ICAM−1及び/またはLFA−3(TRICOMとも称される)の組み合わせをコードする1つまたは複数の核酸を含む。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
1.ヒト癌患者の治療のための治療法であって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを含み、(a)及び(b)が組み合わせ治療として投与される、該治療法。
2.前記組換えオルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルスまたはMVA−BNから選択される、上記1に記載の治療法。
3.上記1〜2のいずれか一項に記載の治療法であって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを更に含み、(a)及び(b)が組み合わせ治療として投与される、該治療法。
4.前記組換えアビポックスウイルス及びアンタゴニストまたはアゴニストの組み合わせが、上記3に記載の組換えオルソポックスウイルス及びアンタゴニストまたはアゴニストの組み合わせの後に投与される、上記1〜3のいずれか一項に記載の治療法。
5.前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、上記3または4に記載の治療法。6.上記1〜2のいずれか一項に記載の治療法であって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む2つ以上の組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを更に含み、(a)及び(b)が組み合わせ治療として投与される、該治療法。
7.前記抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストが抗体を含む、上記1〜6のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
8.少なくとも1つの腫瘍抗原が、CEA抗原、MUC−1抗原、PAP抗原、PSA抗原及びHER−2抗原から選択される、上記1〜7のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
9.前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌または卵巣癌である、上記1〜8のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
10.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がPAP抗原である、上記1〜7のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
11.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がPSA抗原である、上記1〜7のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
12.前記癌が前立腺癌である、上記10または11に記載の組み合わせ療法。
13.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がMUC−1抗原及びCEA抗原から選択される、上記1〜7のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
14.前記癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌及び卵巣癌から選択される、上記13に記載の組み合わせ療法。
15.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がHER−2抗原である、上記1〜7のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
16.前記癌が乳癌である、上記15に記載の組み合わせ療法。
17.ヒト癌患者を治療する方法であって、
(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスを患者へ投与することと;
(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つを患者へ投与することと
を含む、該方法。
18.上記17に記載の方法であって、
(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスと;
(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つと
を更に含む、該方法。
19.前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、上記18に記載の方法。
20.少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む1つまたは複数の後続する組換えオルソポックスウイルス、及び抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つを、患者へ投与することを更に含む、上記17に記載の方法。
21.前記オルソポックスウイルスがワクシニアウイルスである、上記17及び上記20のいずれか一項に記載の方法。
22.前記ワクシニアウイルスが修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス及びMVA−BNから選択される、上記21に記載の方法。
23.抗PD−1アンタゴニスト抗体を患者へ投与することを含む、上記17〜22のいずれか一項に記載の方法。
24.抗LAG−3アンタゴニスト抗体を患者へ投与することを含む、上記17〜22のいずれか一項に記載の方法。
25.抗ICOSアゴニスト抗体を患者へ投与することを含む、上記17〜22のいずれか一項に記載の方法。
26.抗PD−1アンタゴニスト抗体及び抗LAG−3アンタゴニスト抗体を患者へ投与することを含む、上記17〜22のいずれか一項に記載の方法。
27.前記少なくとも1つの腫瘍抗原が、CEA抗原、MUC−1抗原、PAP抗原、PSA抗原またはHER−2抗原である、上記17〜26のいずれか一項に記載の方法。
28.前記癌治療が、前立腺癌、乳癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌または卵巣癌に対して向けられる、上記17〜27のいずれか一項に記載の方法。
29.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がCEA抗原またはMUC−1抗原である、上記17〜26のいずれか一項に記載の方法。
30.前記癌治療が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌または卵巣癌に対して向けられる、上記29に記載の方法。
31.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がPAP抗原である、上記17〜26のいずれか一項に記載の方法。
32.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がPSA抗原である、上記17〜26のいずれか一項に記載の方法。
33.前記癌治療が前立腺癌に対して向けられる、上記31または32に記載の方法。
34.前記少なくとも1つの腫瘍抗原がHER−2抗原である、上記17〜26のいずれか一項に記載の方法。
35.前記癌治療が乳癌に対して向けられる、上記34に記載の方法。
36.抗PD−1アンタゴニスト;抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つと組み合わせた、前記組換えオルソポックスウイルス及び前記組換えアビポックスウイルスが、異種プライム−ブーストレジメンの一部として投与され;該異種プライム−ブーストレジメンが、該アンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせた該組換えオルソポックスウイルスの第1のプライム用量、及び該アンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせた該組換えアビポックスウイルスの1つまたは複数の後続するブースト用量を含む、
上記17〜18及び上記23〜35のいずれか一項に記載の方法。
37.前記異種プライム−ブーストレジメンがPROSTVACまたはCV301である、上記36に記載の方法。
38.抗PD−1アンタゴニスト;抗LAG−3抗体または抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つと組み合わせた、前記組換えオルソポックスウイルスが、同種プライム−ブーストレジメンの一部として投与され;
該同種プライム−ブーストレジメンが、該アンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせた該組換えオルソポックスウイルスの第1のプライム用量、及び該アンタゴニストまたはアゴニストと組み合わせた同じ組換えオルソポックスウイルスの1つまたは複数の後続するブースト用量を含む、
上記17〜35のいずれか一項に記載の方法。
39.ヒト癌患者の治療のための組み合わせ療法であって、
(a)各々が少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスまたは組換えアビポックスウイルスと;
(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストと
を含む、該組合せ療法。
40.前記組換えオルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルスまたはMVA−BNから選択される、上記40に記載の組み合わせ療法。
41.前記組換えアビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、上記39に記載の組み合わせ療法。
42.(b)が抗PD−1アンタゴニスト抗体を含む、上記39〜41のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
43.(b)が抗LAG−3アンタゴニスト抗体を含む、上記39〜41のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
44.(b)が抗PD−1アンタゴニスト抗体及び抗LAG−3アンタゴニスト抗体を含む、上記39〜41のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
45.前記少なくとも1つの腫瘍抗原が、CEA抗原、MUC−1抗原、PAP抗原、PSA抗原及びHER−2抗原から選択される、上記39〜44のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
46.抗PD−1アンタゴニスト抗体、抗LAG−3アンタゴニスト抗体または抗ICOSアゴニスト抗体のうちの少なくとも1つと組み合わせた、各々が少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む1つまたは複数の後続する組換えオルソポックスウイルスまたはアビポックスウイルスを更に含む、上記39〜45のいずれか一項に記載の組み合わせ療法。
47.ヒト癌患者における癌の治療のためのキットであって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸(nucleic)を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト抗体、抗LAG−3アンタゴニスト抗体または抗ICOSアゴニスト抗体のうちの少なくとも1つとを含む、該キット。
48.少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸(nucleic)を含む組換えアビポックスウイルスを更に含む、上記47に記載のキット。
49.前記少なくとも1つの腫瘍抗原が、CEA抗原、MUC−1抗原、PAP抗原、PSA抗原HER−2抗原から選択される、上記47または48に記載のキット。
50.ヒト癌患者の治療における使用のための医薬品または組成物であって、a少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを含み、(a)及び(b)が組み合わせとして投与される、該医薬品または組成物。
51.上記50に記載の医薬品または組成物であって、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを更に含み、(a)及び(b)が組み合わせとして投与される、該医薬品または組成物。
52.ヒト癌患者の治療のための医薬組成物または医薬品の調製における組成物の使用であって、該組成物が(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストとを含む、該使用。
53.前記組成物が、(a)少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスと;(b)抗PD−1アンタゴニスト、抗LAG−3アンタゴニストまたは抗ICOSアゴニストのうちの少なくとも1つとを更に含み、(a)及び(b)が組み合わせとして投与される、上記52に記載の使用。
54.前記組換えオルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)及びMVA−BNから選択される、上記50もしくは51に記載の医薬品もしくは組成物または上記52もしくは53に記載の使用。
55.前記組換えアビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、上記51に記載の医薬品もしくは組成物または上記53に記載の使用。
56.前記少なくとも1つの腫瘍抗原が、CEA抗原、MUC−1抗原、PAP抗原、PSA抗原及びHER−2抗原から選択される、上記50〜55に記載の医薬品または組成物。
実施例1
MVA−BN−mHER2の構築
培養で同時に感染及びトランスフェクションを行うことは、相同組換えがウイルスゲノムと組換えプラスミドとの間で起こることを可能にした。インサートを保有するウイルスを特徴づけし、単離し、ウイルスストックを調製した。
プラスミドpBN279は、MVA−BN中にも存在する配列(ORF64と65との間の遺伝子間領域、IGR64/65)を含有する。mHER2配列は、MVA−BNウイルスゲノムの中への組換えを可能にするようにMVA−BN配列の間に挿入された。したがって、ポックスウイルスプロモーター(特に合成ワクシニアウイルスプロモーター(PrS))の下流にmHER2配列を含有するプラスミドを構築した。プラスミドは、薬物耐性遺伝子(グアニン−キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ;EcoGPT)の上流にPrSプロモーター、及び単量体赤色蛍光タンパク質1(mRFP1)の上流にPrSプロモーターを含む選択カセットも含有していた。
HER−2配列をp2及びp30の破傷風毒素エピトープをコードするヌクレオチド配列の添加によって修飾して、それに対する免疫応答を増加させた(mHER2)。mHER2がMVA−BNゲノムの中へ挿入され、選択カセットが除去された後に、ウイルス「挿入領域」は、以下の構造を有していた(周囲のウイルスリーディングフレームと比較して、反対の方向性で示される)。
PrSプロモーター−mHER2配列。挿入領域は、細菌組換えプラスミドpBN279中でのように、MVA−BN遺伝子間領域配列64/65(隣接部1(64)及び隣接部2(65))が隣接していた。コンストラクトのヌクレオチド配列を以下に示す。
Figure 0006535337
(配列番号:1)。
HER2開始コドン及び終止コドンを太字で示す。隣接配列はイタリック体で示す。隣接部1(64):451〜1052、下線、HER2:3298〜1247(太字)、開始:3298〜3296(太字+下線)、終止:1249〜1247(太字+下線)、PrSプロモーター:3442〜3403(イタリック体+下線)、隣接部(65):3463〜4065(下線).
コードされたmHER2ポリペプチドの翻訳を以下に示す。
Figure 0006535337
(配列番号:2)。
p2及びp30の破傷風毒素エピトープの配列を太字で示す。
CEF培養をMVA−BNにより接種し、さらにpBN279プラスミドDNAによりトランスフェクションした。そして、これらの細胞培養からのサンプルを、選択薬物を含有する培地中のCEF培養へと接種し、mRFP1発現ウイルスクローンをプラーク精製によって単離した。選択薬物の存在下において増殖しmRFP1を発現するウイルスストックを、MVA−BN−mHER2と表記した。MVA−BN−mHER2の生成及びウイルスストックの調製は9回の連続的な継代を伴っており、4回のプラーク精製が含まれる。
MVA−BN−mHER2を選択薬物の非存在下においてCEF細胞培養中で継代した。選択薬物の非存在は、挿入された配列からの選択遺伝子(gpt及びmRFP1)をコードする領域及び関連するプロモーター(選択カセット)の喪失を可能にした。選択カセットの喪失をもたらす組換えは、プラスミドpBN279中の選択カセットに隣接する隣接部1(F1)領域及びその領域のサブセクション(F1反復(F1 rpt))によって媒介される。これらの重複配列が含まれて、選択カセットの喪失をもたらす組換えを媒介し、64/65遺伝子間領域中に挿入されたmHER2配列のみを残す。
選択カセットを欠損するプラーク精製ウイルスを調製した。かかる調製は15回の継代を伴っており、5回のプラーク精製が含まれる。
MVA−BN−mHER2ストック中のmHER2配列の存在及び親MVA−BNウイルスの非存在をPCR分析によって確認し、ネステッドPCRを使用して選択カセット(gpt遺伝子及びmRFP1遺伝子)の非存在を検証した。
mHER2タンパク質の発現を、MVA−BN−mHER2によりインビトロで接種した細胞中で実証した。
実施例2
MVA−BN−HER2及び抗体により処理されたマウス中での抗腫瘍応答の誘導
メスBALB/cマウス(6〜8週齢、約20g)を、Simonsen Laboratories、Gilroy、CAから購入した。実験的肺転移モデルのために、300μLのDPBS中の5.0×10のCT26−HER−2細胞(肺中で腫瘍を形成する)をマウスに静脈内移植した。固形腫瘍モデルにおいて、100μLのDPBS中の1.0×10のCT26−HER−2細胞をマウスの背中に皮内移植した。腫瘍を週に2回測定し、腫瘍体積を以下の式に従って計算した。腫瘍体積(mm)=(長さ×幅)/2。
以下の抗体、抗ICOS(クローン17G9)、抗CTLA−4(9D9)、抗PD−1(RMP1−14)及び抗LAG−3(C9B7W)を、Bio X Cell(West,Lebanon,NH)から購入した。すべての抗体を、図の凡例中で指示された日に100μLのPBS中で1マウスあたり200μgで腹腔内注射した。ウイルス処理について、マウスを、尾部傷付処理(t.s.、Bavarian Nordic[BN]、Martinsried、Germanyによって行われる)によって7.1μLの1.0×10感染単位のMVA−BN−mHER2で処理した。
Mandl et al.,Cancer Immunol Immunother(2012)61:19−29中で記述されるように、血清抗体価はELISAによって、及びIFN−γはELISPOTによって、決定した。全血、脾臓及び肺をFACS分析のために収集した。肺を1〜2mmの片へ切断し、10%のFBS、50U/mLのDNAseI及び250U/mLのコラゲナーゼI(Worthington Biochemical Corporation、Lakewood、NJ)を含有するDMEM中で37℃で1時間インキュベーションした。肺、脾細胞及び全血からの赤色血球を溶解し、単一細胞懸濁液をBiolegend(San Diego、CA)から購入した抗体、CD3e(145−2c11または500A2)、CD4(RM4−5)、CD8(53−6.7)、CD278(ICOS(7E.17G9))、CD279(PD−1、29F.1AA12)及びCD223(LAG−3、C9B7W)により標準的なプロトコルに従って染色した。製造者の説明書(eBioscience、San Diego、CA)に従ってFoxP3/転写因子染色緩衝液セット及びFoxP3抗体(FJK16s)を使用して、調節性T細胞を同定した。
WindowsのためのGraphPad Prismバージョン6.01(GraphPad Software、La Jolla、CA)を使用して、図の凡例中で記述されるように、すべての統計的分析を遂行した。
実施例3
MVA−BN−HER2処理は、CD8T細胞及びCD4T細胞上のICOSを増加させる
ナイーブの腫瘍なしのマウスを、1日目または1及び15日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)により処理した。器官は各々のタイムポイントで3匹のマウスからのものである。図1中で示されるように、MV−BN−mHER2による処理は、CD8+T細胞及びCD4+T細胞上のICOSの発現を増加させた。
実施例4
抗ICOSと共にMVA−BN−HER2により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導。
Balb/cマウスに1日目に10のCT26−HER2細胞を皮内移植した。1及び15日目に尾部傷付処理(t.s.)によって10感染単位のMVA−BN−mHER2、ならびに1、4、8、11、15、18、22及び25日目に抗ICOS(200μg、腹腔内)により、マウスを処理した。** p<0.01、**** p<0.0001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。図2中で示されるように、MVA−BN−mHER2単独と比較して、腫瘍体積はMVA−BN−mHER2+抗ICOSにより有意に減少した。
実施例5
抗CTLA−4と共にMVA−BN−HER2により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導。
CT26−HER−2の実験的肺転移モデルにおいて、1日目に5×10のCT26−HER−2細胞(肺中で腫瘍を形成する)をマウスに静脈内移植した。マウスを、4及び18日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)ならびに3及び17日目に抗CTLA−4(200μg、腹腔内)により処理した。**** p<0.0001、ログランク検定。図3中で示されるように、MVA−BN−mHER2及び抗CTLA−4による処理は粗生存率を増加させることに効果的であった。
実施例6
MVA−BN−HER2は25日目までに肺腫瘍量を有意に低減させる
1日目に5×10のCT26−HER−2細胞(肺中で腫瘍を形成する)をマウスに静脈内移植した。マウスを、4及び18日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)ならびに3及び17日目に抗CTLA−4(200μg、腹腔内)により処理した。A)25日目に、マウスを安楽死させ、気管を介してトリパンブルーを潅流した。肺を取り出し、過酸化水素中に短時間沈め、PBS中で洗浄した。腫瘍は、無処理マウス及び抗CTLA−4処理マウスにおいて小さな塊として目視可能であった。MVA−BN−mHER2により処理されたマウスの肺中で目視可能な腫瘍はなかった。スケールバーは1cmと等しい。B)25日目の肺重量。**** p<0.0001、Dunnettの多重比較検定による一元配置ANOVA。結果を図4中で示す。
実施例7
肺のICOSはMVA−BN−HER2処理または肺腫瘍により増加する。
1日目に5×10のCT26−HER−2細胞(肺中で腫瘍を形成する)をマウスに静脈内移植した。マウスを、4及び18日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)ならびに3及び17日目に抗CTLA−4(200μg、腹腔内)により処理した。各々のタイムポイントで3匹のマウスからの器官を分析(A及びB)のためにプールした。データは、1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からの平均±SEMとして示す(C及びD)。図5中で示されるように、肺のICOSはMVA−BN−mHER2による処理に際して増加した。
実施例8
腫瘍を持ったマウスにおいて、ICOSCD4T細胞はFoxP3である
1日目に5×10のCT26−HER−2細胞(肺中で腫瘍を形成する)をマウスに静脈内移植した。マウスを、4及び18日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)ならびに3及び17日目に抗CTLA−4(200μg、腹腔内)により処理した。各々のタイムポイントで3匹のマウスからの器官を分析(A及びB)のためにプールした。データは、1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からの平均±SEMとして示す(C及びD)。図6中で示されるように、ICOSの発現は、腫瘍を持った対照マウス及び腫瘍量が多い抗CTLA−4処理マウスにおいて、FoxP3+ Treg及びFoxP3− Teff細胞の両方で増加した。ICOSは、MVA−BN−mHER2処理後のFoxP3− Teff細胞上でのみ増加し、抗CTLA−4との組み合わせ後により顕著であった。
実施例9
抗CTLA−4とMVA−BN−HER2はエフェクターT細胞対調節性T細胞の比を増加させる
1日目に5×10のCT26−HER−2細胞(肺中で腫瘍を形成する)をマウスに静脈内移植した。マウスを、4及び18日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)ならびに3及び17日目に抗CTLA−4(200μg、腹腔内)により処理した。各々のタイムポイントで3匹のマウスからの器官を分析(A及びB)のためにプールした。データは、1群あたり3〜4匹のマウスによる3つの独立した実験からの平均±SEMとして示す(C及びD)。図7中で示されるように、MVA−BN−mHER2及び抗CTLA−4による処理は、脾臓及び血液に加えて腫瘍部位において、CD8及びCD4のエフェクターT細胞対調節性T細胞の比の両方を増加させた。
実施例10
PD−1の発現はMVA−BN−HER2処理により増加する
ナイーブの腫瘍なしのマウスを、1日目または1及び15日目にMVA−BN−HER2(10感染単位、t.s.)により処理した。器官は各々のタイムポイントで3匹のマウスからのものである。図8中で示されるように、MV−BN−mHER2による処理は、CD8及びCD4のT細胞上のPD−1の発現を増加させた。
実施例11
MVA−BN−HER2及び抗PD1により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目に10のCT26−HER−2細胞をBalb/cマウスに、皮内移植した。1及び15日目に尾部傷付処理(t.s.)によって10感染単位のMVA−BN−mHER2、ならびに1及び15日目に抗PD1(200μg、腹腔内)により、マウスを処理した。**** p<0.0001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。図9中で示されるように、抗PD−1単独による処理と比較して、腫瘍体積はMVA−BN−mHER2+抗PD1により有意に減少し、生存はMVA−BN−mHER2単独と比較して有意に増加した。
実施例12
MVA−BN−HER2へのLAG−3免疫応答
ナイーブの腫瘍なしのマウスを、1日目または1及び15日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)により処理した。器官は各々のタイムポイントで3匹のマウスからのものである。図10中で示されるように、CD8T細胞及びCD4T細胞上でLAG−3が発現される。
実施例13
MVA−BN−HER2及び抗LAG−3により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目に10のCT26−HER−2細胞をBalb/cマウスに、皮内移植した。1及び15日目に尾部傷付処理(t.s.)によって10感染単位のMVA−BN−mHER2、ならびに1及び15日目に抗LAG−3(200μg、腹腔内)により、マウスを処理した。**** p<0.0001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。図11中で示されるように、MVA−BN−mHER2単独及び抗LAG3単独と比較して、抗LAG3と組み合わせたMVA−BN−mHER2による処理は粗生存率を増加させた。
実施例14
MVA−BN−HER2ならびに抗PD−1及び抗LAG−3により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目に10のCT26−HER−2細胞をBalb/cマウスに、皮内移植した。図12において、1及び15日目に尾部傷付処理(t.s.)によって10感染単位のMVA−BN−mHER2、ならびに1及び15日目に抗PD1及び抗LAG−3(各々200μg、腹腔内)により、マウスを処理した。図13において、4及び18日目にt.s.によって10感染単位のMVA−BN−mHER2、ならびに4及び18日目に抗PD−1及び抗LAG−3(200μg、腹腔内)により、マウスを処理した。**** p<0.0001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。図12及び13中で示されるように、MVA−BN−mHER2単独ならびに抗PD1及び抗LAG3単独と比較して、抗PD1及び抗LAG3の両方と組み合わせたMVA−BN−mHER2による処理は、腫瘍体積を減少させ(図12A及び13A)、粗生存率を増加させた(図12B及び13B)。
実施例15
MVA−BN−HER2ならびに抗PD−1及び抗LAG−3により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
CT26−HER−2の実験的肺転移モデルにおいて、1日目に5×10のCT26−HER−2細胞(肺中で腫瘍を形成する)をマウスに静脈内移植した。マウスを、4及び18日目にMVA−BN−mHER2(10感染単位、t.s.)ならびに4及び18日目に抗PD−1及び抗LAG−3(各々200μg、腹腔内)により処理した。P<0.05、*** p<0.001、ログランク検定。図14中で示されるように、抗体PD1及び抗LAG3単独と比較して、抗PD−1及び抗LAG3と組み合わせたMVA−BN−mHER2による処理は粗生存率を増加させた。
実施例16
ELISPOT MVA応答
1日目に10のCT26−HER−2細胞をBalb/cマウスに、皮内移植した。4及び18日目に尾部傷付処理(t.s.)によって10感染単位のMVA−BN−mHER2、ならびに4及び18日目に抗PD1及び抗LAG−3(200μg、腹腔内)により、マウスを処理した。最後の処理後に4週間、特異的なT細胞応答は、Mandl et al.,Cancer Immunol Immunother(2012)61:19−29中で記述されるようにIFN−γのELISPOTによって決定した。図15中で示されるように、抗PD1及び抗LAG3単独と比較して、抗PD−1及び抗LAG3と組み合わせたMVA−BN−mHER2による処理は、腫瘍抗原特異的なIFN−γレベルを増加させた。
実施例17
抗体力価
1日目に10のCT26−HER−2細胞をBalb/cマウスに、皮内移植した。4及び18日目に尾部傷付処理(t.s.)によって10感染単位のMVA−BN−mHER2、ならびに4及び18日目に抗PD1及び抗LAG−3(200μg、腹腔内)により、マウスを処理した。Mandl et al.,Cancer Immunol Immunother(2012)61:19−29.2中で記述されるように、血清抗体価はELISAによって決定した。結果を図16中で示す。
実施例18
MVA−BN−CV301及び抗PD−1により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目にメスC57/BL6マウス(6〜8週齢、約20g、Simonsen Laboratories、Gilroy、CA)に、MC38−CEA細胞(2×10、皮内、後部脇腹中)を移植した。マウスを、1及び15日目にMVA−BN−CV301(10感染単位、皮下、尾部根元上部)により処理した。1及び15日目に抗PD−1(200μg、腹腔内)によりマウスを処理した。結果を図17中で示す。p<0.05、**** p<0.0001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。
実施例19
MVA−BN−CV301及び抗LAG−3により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目にメスC57BL/6マウス(6〜8週齢、約20g、Simonsen Laboratories、Gilroy、CA)に、MC38−CEA細胞(2×10、皮内、後部脇腹中)を移植した。マウスを、1及び15日目にMVA−BN−CV301(10感染単位、皮下、尾部根元上部)により処理した。1及び15日目に抗LAG−3(200μg、腹腔内)によりマウスを処理した。結果を図18中で示す。** p<0.01、*** p<0.001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。
実施例20
MVA−BN−CV301ならびに抗PD−1及び抗LAG−3により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目にメスC57BL/6マウス(6〜8週齢、約20g、Simonsen Laboratories、Gilroy、CA)に、MC38−CEA細胞(2×10、皮内、後部脇腹中)を移植した。マウスを、1及び15日目にMVA−BN−CV301(10感染単位、皮下、尾部根元上部)により処理した。1及び15日目に抗PD1及び抗LAG−3(各々200μg、腹腔内)によりマウスを処理した。** p<0.01、**** p<0.0001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。図19中で示されるように、抗PD1及び抗LAG3単独またはMVA−BN−CV301単独と比較して、MVA−BN CV301ならびに抗PD1及び抗LAG3の組み合わせ処理は、腫瘍体積の減少をもたらした。
実施例21
PROSTVAC及び抗PD−1により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目にオスBALB/cマウス(6〜8週齢、約20g、Simonsen Laboratories、Gilroy、CA)に、E6細胞(RM11−PSA、1.5×10、皮内、後部脇腹中)を移植した。マウスを、1日目にPROSTVAC−V(2×10感染単位、皮下、尾部根元)ならびに8及び15日目にPROSTVAC−F(10感染単位、皮下、尾部根元)により処理した。1及び15日目に抗PD−1(200μg、腹腔内)によりマウスを処理した。処理の結果を図20中で示す。
実施例22
PROSTVAC及び抗LAG−3により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目にオスBALB/cマウス(6〜8週齢、約20g、Simonsen Laboratories、Gilroy、CA)に、E6細胞(RM11−PSA、1.5×10、皮内、後部脇腹中)を移植した。マウスを、1日目にPROSTVAC−V(2×10感染単位、皮下、尾部根元)ならびに8及び15日目にPROSTVAC−F(10感染単位、皮下、尾部根元)により処理した。1及び15日目に抗LAG−3(200μg、腹腔内)によりマウスを処理した。処理の結果を図21中で示す。
実施例23
PROSTVACならびに抗PD−1及び抗LAG−3により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目にオスBALB/cマウス(6〜8週齢、約20g、Simonsen Laboratories、Gilroy、CA)に、E6細胞(RM11−PSA、1.5×10、皮内、後部脇腹中)を移植した。マウスを、1日目にPROSTVAC−V(2×10感染単位、皮下、尾部根元)ならびに8及び15日目にPROSTVAC−F(10感染単位、皮下、尾部根元)により処理した。1及び15日目に抗PD−1及び抗LAG−3(それぞれ200μg、腹腔内)によりマウスを処理した。図22中で示されるように、抗PD−1及び抗LAG−3単独またはPROSTVAC単独と比較して、PROSTVACと抗PD−1及び抗LAG−3との組み合わせ処理は、腫瘍体積の減少をもたらした。
実施例24
PANVAC(CV301−V/F)及び抗PD−1により処理されたマウスにおける抗腫瘍応答の誘導
1日目に、ヒトCEAについてのトランスジェニックのメスC57/BL6マウス(Tg(CEA)18/B6j、City of Hope National Medical CenterのJack Shivelyから受け取った、Clarke et a.Cancer Research,58:1469ff.,1998も参照)に、MC38−CEA細胞(3.0×10、皮内、後部脇腹中)を移植した。マウスを、4日目にCV301−ワクシニア(CV301−V)(PANVAC−Vとしても公知である)(2×10感染単位、皮下、尾部根元)、ならびに11及び18日目にCV301−鶏痘(CV301−F)(PANVAC−Fとしても公知である)(10感染単位、皮下、尾部根元)により処理した。CV301−V/F処理を、4、11及び18日目に鶏痘GM−CSF(10感染単位)と混合した。4、11及び18日目に抗PD−1(200μg、腹腔内)によりマウスを処理した。** p<0.01、**** p<0.0001、Tukeyの事後多重比較検定による反復測定の二元配置ANOVA。図23中で示されるように、対照マウスと比較して、CV301−V/Fと抗PD−1との組み合わせ処理は腫瘍増殖を遅延させた。
本明細書において記述される方法または組成物の正確な詳細は、記述された発明の趣旨から逸脱せずに、変更または修飾され得ることは明白であろう。以下の請求項の範囲及び趣旨内にあるすべてのかかる修飾及び変更が請求される。

Claims (22)

  1. (a)CEA抗原のポリペプチドをコードする核酸およびMUC−1抗原ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)PD−1の生物学的活性をブロックする抗体を含む抗PD−1アンタゴニストとを含む、ヒト癌患者に投与するための免疫原性組み合わせ物。
  2. 前記組換えオルソポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、修飾型ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス、MVA−BNまたはMVA−BNの誘導体から選択される、請求項1に記載の免疫原性組み合わせ物。
  3. 請求項1〜2のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物であって、(c)CEA抗原およびMUC−1抗原から選択される少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアビポックスウイルスと;(d)PD−1の生物学的活性をブロックする抗体を含む抗PD−1アンタゴニストとを更に含む、免疫原性組み合わせ物。
  4. 前記アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項3に記載の免疫原性組み合わせ物。
  5. 前記少なくとも1つの腫瘍抗原がCEA抗原である、請求項3〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物。
  6. 前記少なくとも1つの腫瘍抗原がMUC−1抗原である、請求項3〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物。
  7. 前記少なくとも1つの腫瘍抗原がCEA抗原およびMUC−1抗原である、請求項3〜4のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物。
  8. ヒト癌患者を治療する方法において使用するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物。
  9. 少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む1つまたは複数の後続する組換えオルソポックスウイルス、及びPD−1の生物学的活性をブロックする抗体を含む抗PD−1アンタゴニストを、患者へ投与することを更に含む、請求項8に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  10. 前記癌治療が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌または卵巣癌に対して向けられる、請求項8〜9のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  11. 前記癌治療が、乳癌に対して向けられる、請求項10に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  12. 前記癌治療が、肺癌に対して向けられる、請求項10に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  13. 前記癌治療が、前立腺癌に対して向けられる、請求項10に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  14. 組み合わせ物が異種プライム−ブーストレジメンの一部として投与され;該異種プライム−ブーストレジメンが、抗PD−1アンタゴニストと組み合わせた該組換えオルソポックスウイルスの第1のプライム用量、及び抗PD−1アンタゴニストと組み合わせた該組換えアビポックスウイルスの1つまたは複数の後続するブースト用量を含む、
    請求項10〜13のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  15. 前記異種プライム−ブーストレジメンがCV301の投与を含む、請求項14に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  16. 組み合わせ物が同種プライム−ブーストレジメンの一部として投与され;
    該同種プライム−ブーストレジメンが、抗PD−1アンタゴニストと組み合わせた該組換えオルソポックスウイルスの第1のプライム用量、及び抗PD−1アンタゴニストと組み合わせた同じ組換えオルソポックスウイルスの1つまたは複数の後続するブースト用量を含む、
    請求項10〜13のいずれか一項に記載の使用のための免疫原性組み合わせ物。
  17. ヒト癌患者における癌の治療に使用するためのキットであって、(a)CEA抗原のポリペプチドをコードする核酸およびMUC−1抗原ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスと;(b)PD−1の生物学的活性をブロックする抗体を含む抗PD−1アンタゴニストとを含む、該キット。
  18. 少なくとも1つの腫瘍抗原のポリペプチドをコードする核酸(nucleic)を含む組換えアビポックスウイルスを更に含む、請求項17に記載のキット。
  19. 請求項1〜7のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物を含むヒト癌患者の治療における使用のための医薬品または組成物。
  20. 前記癌治療が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌または卵巣癌に対して向けられる、請求項19の使用のための医薬品または組成物。
  21. ヒト癌患者における癌の治療に使用するための、CEA抗原のポリペプチドをコードする核酸およびMUC−1抗原のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えオルソポックスウイルスを含むワクチンであって、PD−1の生物学的活性をブロックする抗体を含む抗PD−1アンタゴニストと組み合わせて使用されるワクチン。
  22. 前記癌治療が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌または卵巣癌に対して向けられる、請求項21に記載のワクチン。
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