KR20180118198A - 수지상 세포 감염을 위한 멀티모달 벡터(multimodal vector for dendritic cell infection) - Google Patents

수지상 세포 감염을 위한 멀티모달 벡터(multimodal vector for dendritic cell infection) Download PDF

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케이반 니아지
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난트셀, 인크.
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Abstract

T-세포 및 NK-세포 활성을 자극하고 그리고 T-세포 및 NK-세포 활성의 억제를 제한하는 다양한 조절 분자들을 감염된 세포에 제공하는 재조합 바이러스들 및 바이러스성 핵산들이 고려된다. 가장 바람직하게는, 바이러스 및 바이러스성 핵산은 인간 암-연관 서열, 특히 다수의 암-연관 항원들, 암 특이적 항원들 및/또는 환자 및 종양 특이적 네오항원(neoantigen)들을 인코딩(encoding)하는 서열을 더 포함할 것이다. 특히 바람직한 조절 분자들은 CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2), CD11(LFA-1) 및 CTLA-4의 억제제를 포함한다.

Description

수지상 세포 감염을 위한 멀티모달 벡터(MULTIMODAL VECTOR FOR DENDRITIC CELL INFECTION)
본 발명은 재조합 핵산 벡터들에 관한 것으로, 보다 구체적으로 적어도 이중 기능(dual function)을 갖는 세포 트랜스펙션(transfection)용 아데노바이러스 벡터들에 관한 것이다.
배경 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보 중 임의의 것이 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나 또는 구체적으로 또는 암시적으로 참조된 임의의 간행물이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.
본원의 모든 간행물들 및 특허 출원들은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것과 같이 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 포함된 참조에서의 용어의 정의 또는 사용이 일관성이 없거나 본원에 제공된 상기 용어의 정의와 상반되는 경우, 본원에 제공된 상기 용어의 정의가 적용되며, 참조에서의 상기 용어의 정의는 적용되지 않는다.
암에 대한 면역 요법의 최근 발전으로 치료 결과가 현저히 개선되었다. 예를 들어, 분자 수준에서 암세포를 특성화하는 능력이 향상되어 보다 표적화된 치료가 가능해졌다. 다른 표적들 중에서, 면역 요법은 유전적으로 변형된 면역 수용성 세포들을 암으로 유도하기 위한 일환에서 암 연관 항원들(예컨대, CEA-1), 암 특이적 항원들(예컨대, HER2), 또는 환자 및 종양 특이적 네오에피토프들을 사용해 왔다.
그러나, 면역 수용성 세포들의 활성을 조절하는데 있어서의 경험이 증가함에 따라, 치료적으로 유효한 면역 반응을 발생시키는데 필요한 조절 공정들의 방대한 복잡성이 명백해졌다. 예를 들어, 암 관련 항원들의 유형에 따라, 일부 항원들은 환자의 MHC-I 및 MHC-II 시스템에 의해 제시되지 않거나 단지 불충분하게 제시될 것이다. 다른 예에서, 종양들은 암세포들에 달리 세포독성이 있는 세포들의 활성을 하향 조절하는 미세 환경을 종종 발생시킨다. 추가적으로, 공동자극 신호들은 강력한 면역 반응을 촉진하기 위해 종종 필요하지만, 항상 존재하는 것은 아니거나 충분한 양으로 존재하는 것은 아니다. 그러므로, 유전적으로 변형된 면역 수용성 세포들(예컨대, CAR-T)의 생산은 종종 비교적 간단한 반면에, 생체 내에서의 그 유효성은 용이하게 보상되지 않는 인자에 의해 종종 감소된다. 다른 어려움들 중에서, 적절한 항원 제시, 활성화 및 억제 신호들의 감소는 종종 적절한 면역 반응을 방해한다.
T 세포들의 효과적인 자극은 수많은 단백질들의 잘 구성된 집합체를 포함하는 내구성(durable) 면역 시냅스의 형성을 필요로 한다고 여겨진다 (Science (1999) 285 (5425): 221-227; Science (2002) 295 (5559): 1539-1542). 면역 시냅스의 형성을 자극하는 일환에서, T 세포들을 자극하기 위한 다양한 신호전달(signaling) 분자들은 US 2008/0317724에 기재된 바와 같이 간격, 분포 및 패턴에 대해 미리 배향된 방식으로 캐리어 상에 고정되었다. 특히, 본 발명자들은 그러한 시스템들에서의 T 세포 활성화가 CD28 및 T 세포 수용체들의 특이적인 공간적 배열들을 필요로 한다는 것을 관찰하였다. 그러나, 다양한 다른 인자들과 항원 제시 세포 및 T 세포들 사이의 세포-세포 상호작용은 존재하지 않았으며, 그러므로, 신호전달 및 활성화는 생체 내에서의 효과에 못 미칠 수 있다.
T 세포 활성화의 다른 알려진 방법들에 있어서, 세포들 내에서 분비된 항원 및 선택된 공동자극 분자들의 공동-발현은 WO 2016/127015에 보고되었다. 그러나, 상기 공동자극 분자들이 분비된 융합 분자들이었으며 상기 항원도 분비되었고 특이적인 HLA 유형과 정합되지 않음에 따라, 적절한 항원 제시는 공동자극 분자들의 문맥에서 보장되지 않을 것 같았다.
폭스바이러스성 벡터로부터 특정 공동자극 분자들 (B7-1/ICAM-1/LFA-3) 및 암 또는 종양 연관 항원의 발현은 CD8+ 및 CD4+ 세포들을 활성화시키는 것으로 보고되었지만, B7-1만을 발현시킨 비교가능한 시스템들에 대하여 세포자살을 증가시키는 것에 실패하였다(Cancer Research (1999) Vol 59, 5800-5807; Biomedicines (2016), Vol 4, 19). 이러한 시스템들 내에서의 항원은 CEA였으며, 모든 CEA 단편들이 상이한 HLA 유형들에 의해 동등하게 제공되는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 또한, CEA는 또한 정상 비-암 세포들에서 발현되기 때문에, 자가면역 반응들은 가능한 한 배제될 수 없다. 또한, 이러한 연구들에서 채용된 바이러스는 면역원성이므로 단일 투여만이 허용되었다.
또 다른 접근법에서, 작용제 항-OX40 mAb를 갖는 OX40(CD134)은 T 세포 분화 및 체크포인트(checkpoint) 억제제 CTLA-4의 전신 항체 매개된 봉쇄를 증가시킴으로써 항종양 면역을 증강시켰다(Cancer Immunol Res (2014) Vol 2(2): 142-153). 특히, 조합된 항-OX40/항-CTLA-4 면역요법은 CD4 및 CD8 T 세포 의존적 방식으로 종양-보유 숙주들의 종양 퇴행 및 생존을 유의적으로 향상시켰다. 그러나, 전신 항-CTLA-4 면역요법은 사이토카인 폭풍의 높은 위험과 연관되어 있다. 유사한 접근법에서, 수지상 세포들의 교차 제시를 향하여 종양 연관 항원을 표적으로 하는 백신 접종은 항OX40/항CTLA-4 면역요법과 조합되었다(Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2016) 4:31). 불행하게도, 유망한 결과들이 실제로 달성되었지만, 방어 면역 반응의 발달은 많은 환자들에서 (예컨대, 반복된 화학요법 및/또는 방사선으로 인해) 더 이상 이용 가능하지 않은 실질적으로 손상되지 않은 면역 시스템을 필요로 한다.
또한, 바이러스성 비히클들을 사용하여 전달되는 많은 암 백신들은 바이러스성 벡터에 대한 숙주 반응으로 인해 항원화물(antigenic cargo)에 대한 면역 반응을 도출하는데 효과적이지 않는 경향이 있으며, 따라서 종양에 대한 면역 반응을 일으키도록 설계된 암 에피토프들을 생성하기 위하여 DNA 페이로드(payload)를 전달하는 가능성을 종종 감소시킨다. 결과적으로, 바이러스성 백신의 투여는 일반적으로 단일 시도에 한정된다. 또한, 재조합 DNA가 전사되고 번역됨에 따라서, 얻어진 생성물들은 MHC-I 시스템을 통한 면역 반응을 더 선호하는 경향이 있다. 그러나, 효과적인 면역요법은 또한 MHC-II 시스템에 의해 활성화되는 "유형 I" CD4+ T 세포들에 의해 일반적으로 자극되는 강한 T-세포 및 NK 세포 반응을 필요로 한다.
그러므로, 항-종양 면역 반응을 발생하기 위해 수많은 방법들 및 조성물들이 업계에 알려져 있더라도, 이들 모두 또는 거의 모두가 하나 이상의 단점들을 갖는다. 결과적으로, 암의 면역요법에 대한 개선된 조성물들 및 방법들에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 출원은 2016년 3월 18일 출원된 미국 가출원 제62/310551호에 대한 우선권을 주장하고 그리고 2016년 3월 25일에 출원된 미국 가출원 제62/313596호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 주제는 재조합 (바람직하게는 복제 결핍(replication deficient)인 그리고 비-면역원성인) 바이러스 또는 재조합 바이러스성 핵산이 상기 바이러스를 대상체에 투여시에 내구성 및 치료학적으로 유효한 면역 반응의 도출을 보조하도록 다수의 자극(stimulatory) 분자들, 면역 체크포인트 수용체(immune checkpoint receptor)의 억제제, 및 하나 이상의 인간 암-연관 서열들을 인코딩하는 조성물들 및 방법들에 관한 것이다. 가장 통상적으로는, 이후 CD8+ 및 CD4+ T 세포들과 상호작용하여 강한 면역 반응을 생성하고 면역 기억을 발생하게 되는 수지상 세포들을 감염시키기 위해 상기 바이러스가 투여될 것이다. 면역 요법을 위해 표적으로서 네오에피토프들만을 사용하는 것에 더하여, 면역 억제의 자극제들 및/또는 억제제들의 이중-모드 투여는 (그리고 특히 재조합 발현 및 주사를 통해) 그러한 요법들의 효능을 더욱 더 향상시키는 것으로 여겨진다.
본 발명의 주제의 일 양태에서, 본 발명자들은 다수의 유전자들을 인코딩하는 재조합 서열 부분을 포함하는 바이러스성 게놈의 적어도 일부를 포함하는 재조합 핵산 벡터로서, 상기 재조합 서열 부분은 조절 서열(regulatory sequence)에 동작가능하게 결합되어 상기 다수의 유전자들의 발현을 허용하는 재조합 핵산 벡터를 고려한다. 가장 통상적으로는, 상기 다수의 유전자들은, 면역 체크포인트 수용체에 대한 적어도 하나의 (바람직하게는 막 고정된(membrane anchored)) 억제성 리간드 및 4개의 별개의 자극 분자들을 인코딩하며 그리고 상기 바이러스 게놈은, 상기 바이러스성 게놈에 의해 인코딩되는 바이러스의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위해 적어도 하나의 돌연변이화(mutated) 또는 결실된 단백질 코딩 서열을 가진다.
상기 4개의 별개의 자극 분자들에 대하여, 상기 자극 분자들은 CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1) 중 적어도 하나, 또는 적어도 둘, 또는 적어도 셋, 또는 모두를 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. 바람직한 면역 체크포인트 수용체들은 CTLA-4 또는 PD-1을 포함하며, 그리고 상기 억제성 리간드는 상기 리간드를 세포막에 고정시키는 적어도 하나의 막관통 영역을 포함할 것이 일반적으로 고려된다. 또한, 상기 재조합 서열 부분은 하나 이상의 인간 암-연관 서열들(예컨대, 암 연관 항원, 암 특이적 항원, 및 환자 및 종양 특이적 네오항원)을 더 포함하는 것이 일반적으로 바람직하다. 필요한 경우, 상기 인간 암-연관 서열은, 상기 암-연관 서열에 의해 인코딩되는 유전자 산물(gene product)을, 상기 재조합 핵산 벡터를 호스팅(hosting)하는 세포의 세포질 구획(compartment) 또는 리소좀 또는 엔도솜 구획으로 우선적으로 유도하는 트래피킹(trafficking) 서열을 더 포함할 것이다. 추가적으로, 상기 바이러스는 복제-결핍이며 그리고/또는 아데노바이러스이며, 그리고 상기 돌연변이화된 또는 결실된 단백질 코딩 서열은 아데노바이러스 유형 5의 E1, E2b 및/또는 E3인 것이 바람직하다.
그러므로, 본 발명자들은 또한 상기 기재된 재조합 핵산 벡터를 포함하는 바이러스를 고려한다. 가장 바람직하게는, 상기 바이러스는 E2b 유전자 부족(lacking) 재조합 결핍 아데노바이러스(recombination deficient adenovirus)이고, 그리고 상기 별개의 자극 분자들은, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1) 중 하나 이상이고, 상기 면역 체크포인트 수용체는 CTLA-4이며, 그리고 상기 재조합 서열 부분은 인간 암-연관 서열을 더 포함한다.
그러한 재조합 핵산들 및 바이러스들은 항원 제시 세포들 감염시켜 상기 항원 제시 세포와 접촉하는 T 세포에서 T 세포 활성화를 자극시키는 것으로 특히 간주된다. 그러므로, 본 발명자들은 또한 면역 반응을 자극하는데 유효한 프로토콜에 따라 (예컨대, 피하(subcutaneous) 또는 진피하(subdermal) 주입에 의해) 상기 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는 비-인간 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 고려한다. 필요한 경우, 그러한 방법들은 바람직하게는 메트로놈방식으로(in metronomical fashion) 상기 비-인간 대상체에 저용량 화학 요법(low-dose chemotherapy) 또는 저용량 방사선 요법(low-dose radiation therapy)을 투여하는 단계를 더 포함할 것이다.
본 발명의 주제의 다양한 목적들, 특징들, 양태들 및 장점들은 바람직한 실시형태들의 하기 상세한 기재로부터 더 명백해 질 것이다.
본 발명자들은 상기 면역 치료 조성물들은 다수의 (공동-)자극 분자들을 인코딩하는 재조합 핵산 및 항원 제시 세포의 세포막에 바람직하게 고정된 면역 체크포인트 수용체의 적어도 하나의 억제제를 포함하는 바이러스성 벡터, 및 가장 바람직하게는, 아데노바이러스성 벡터를 사용하여 제조될 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 그러한 재조합 바이러스 또는 바이러스성 벡터는 상기 암-연관 서열들에 의해 인코딩되는 단백질들을 제시하는 세포들에 대한 면역 반응을 자극하기 위하여 하나 이상의 인간 암-연관 서열들을 더 포함할 것이다. 따라서, 재조합 단백질들을 발현하는 항원 제시 세포는 그러므로 항원 특이적 T 세포 활성화에 대한 충분한 상호작용을 촉진시키는 자극 인자들 및 항-억제 인자들 양쪽 모두의 문맥에서 상기 항원을 제시할 것이다.
상기 바이러스는 비-면역원성 (즉, 상기 바이러스에 대하여 방어 면역 반응을 도출하지 않으면서 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회 또는 더 이상의 회수로 투여될 수 있다)이고, 복제 결핍이며, 그리고 환자에게 피하로 또는 진피하로 투여되어 우선적으로 수지상 세포들을 감염시키는 것이 더욱 더 바람직하다. 특히 바람직한 일 실시예에서, 상기 바이러스성 벡터는 면역원성을 감소시키고 페이로드의 용량을 증가시키기 위하여 결실된 E1, E2b 및 E3 바이러스성 유전자들을 갖는 재조합 아데노바이러스이다. 이후, 그러한 변형된 바이러스성 게놈에 도입된 것은 적합한 제어 요소들(통상적으로 구성적 활성 프로모터) 하에서 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트들이고, 상기 공동자극 분자들은 CD80 (B7.1) 및 CD86 (B7.2), 활성제 분자들 CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1), 그리고 면역 체크포인트 수용체 CTLA-4(예컨대, 임의로 막관통 영역을 갖는 scFv)에 대한 억제제이다. 또한, 상기 자극 분자들 및 상기 억제성 리간드와 공동-발현되는 다수의 암-연관 서열들은 상기 재조합 핵산 내에서 인코딩된다. 필수적이지는 않지만, 상기 암-연관 서열들의 적어도 일부는 적절한 트래피킹 서열들을 사용하여 MHC-I 처리 경로들 및/또는 MHC-II 처리 경로들로 유도되는 것이 통상적으로 바람직하다.
그러므로, 본원에 제시된 바이러스 (또는 바이러스성 벡터) 설계는 상기 암-연관 서열들에 대하여 강하고 내구성인 면역 반응을 촉발시키기 위한 다수의 이점들을 제공할 것이라는 것을 알아야 한다. 우선, 그리고 수지상 세포를 상기 재조합 바이러스로 감염 시에, 상기 암-연관 서열들은 적절하게 활성화된 CD4+ 및 CD8+ 세포들을 생성할 가능성을 증가시킬 MHC-I 및/또는 MHC-II 제시 경로들을 사용하여 발현되고 제시되며, 이는 차례로 적당한 항체 생성 및 적합한 T- 및 B-세포 기억의 가능성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 또한, 상기 암-연관 서열들이 다양한 공동-자극 분자들 (그리고 가장 바람직하게는 CD80, CD86, CD54 및 CD11)과 바람직하게 그리고 조화롭게 발현되기 때문에, 그러한 감염된 세포들에 의한 T-세포 활성화는 이러한 세포들이 공동-자극 분자들과 함께 MHC-결합 에피토프들을 제시함에 따라 증가된다. 추가적으로, 이러한 세포들이 또한 활성화 시에 CD4+ 및 CD8+ 세포들 상에서 CTLA-4 및/또는 PD-1에 (통상적으로 막-결합된) 억제성 리간드를 발현시킴에 따라 그러한 감염된 세포들에 의해 잠재적 억제성 신호전달은 감소된다.
다른 관점에서 볼 때, 본원에 고려된 바이러스들 및 바이러스 벡터 구성체들은 상기 제시된 암-연관 서열들의 문맥에서 CD4+ 및 CD8+ 세포들에 최적화된 활성화를 제공하고 이들 세포들의 억제를 저해하며, 이는 암-연관 서열들을 제시하는 암 세포들에 대하여 강하고 치료적으로 유효한 면역 반응을 생성하는 것으로 여겨진다는 것을 알아야 한다. 수지상 세포들의 감염을 증가시키기 위하여 상기 바이러스가 피하로 또는 진피하로 투여되어, 차례로 면역 수용성 세포들 및 특히, CD4+ T-세포들, CD8+ T-세포들, 및 NK 세포들을 에피토프 특이적 방식으로 활성화시키게 되는 경우, 그러한 장점들이 특히 유익하다.
그러나, 적합한 바이러스성 벡터들 (및 바이러스성 핵산 벡터들)은 상기 기재된 바와 같이 아데노바이러스들에 한정될 필요가 없다는 것을 알아야 하며, 그리고 벡터의 특정한 선택은 본 발명 주제에 대하여 중대하지 않음을 인식해야 한다. 그러므로, 적합한 바이러스들은 아데노바이러스들, 아데노-연관 바이러스들, 알파바이러스들, 헤르페스 바이러스들, 렌티바이러스들 등을 포함한다. 그러나, 아데노바이러스들이 특히 바람직하다. 또한, 상기 바이러스는 선택된 바이러스성 단백질들(예컨대, 아데노바이러스에 대한 E1, E3 단백질들)의 표적화된 결실에 의해 통상적으로 달성되는 복제 결핍 및 비면역원성 바이러스인 것이 더 바람직하다. 그러한 바람직한 성질들은 E2b 유전자 기능을 삭제함으로써 더 향상될 수 있다.
상기 바이러스가 복제 결핍인 경우, 바이러스성 배양물들은 부족한 기능(예컨대, 폴리머라제 유전자)을 제공하는 세포주들을 사용하여 제조될 수 있음을 인식하여야 한다. 예를 들어, 재조합 바이러스들의 상대적으로 높은 역가들은 최근에 보고된 바와 같이(예컨대, J Virol. 1998 Feb; 72(2): 926-933) 유전적으로 변형된 인간 293개 세포들을 사용하여 달성될 수 있다. 적합한 바이러스 구성체들의 더 특히 바람직한 양태들은 US 6083750, US 6063622, US 6057158, US 6451596, US 7820441, US 8298549, 및 US 8637313에 기재되어 있다. 가장 통상적으로, 그리고 상기에서 이미 다뤄진 바와 같이, 바이러스 감염된 세포들로부터 발현용 원하는 핵산 서열들은 업계에 주지된 적절한 조절 요소들의 제어 하에 있다. 바이러스성 게놈들 또는 바이러스성 벡터들의 변형은 업계에 주지된 표준 절차들을 일반적으로 따를 것이다(예컨대, Gene Therapy by Mauro Giacca, Springer Science & Business Media, Nov 1, 2010. Or A Guide To Human Gene Therapy by Roland Herzog (Ph. D.), Sergei Zolotukhin; World Scientific, 2010. Or Gene Therapy Protocols by Paul D. Robbins, Humana Press, 1997 참조).
자극하는 분자들에 대하여, 다른 자극하는 분자들뿐만 아니라 공동-자극 분자들뿐만 아니라 이들의 상응하는 돌연변이단백질(mutein)들, 절단된 형태 및 키메라 형태도 본원에서 사용에 적합한 것으로 간주되는 것이 일반적으로 고려된다. 예를 들어, 특히 적합한 공동-자극 분자들은 CD80, CD86, CD40, ICOS-L, B7-H3, B7-H4, CD70, OX40L, 4-1BBL을 포함하고, 반면에 작용의 정의된 (또는 이해된) 메커니즘이 적은 다른 자극 분자들은 GITR-L, TIM-3, TIM-4, CD48, CD58, ICAM-1, LFA3, 그리고 SLAM 패밀리(family)의 부재들을 포함한다. 그러나, 암-연관 서열들을 갖는 조정된 발현용 특히 바람직한 분자들은 CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD54 (ICAM-1) 및 CD11 (LFA-1)을 포함한다. 고려된 자극 분자들에 대한 서열들은 당업계에 알려져 있으며, 상기 서열들(cDNA 및 게놈성 DNA뿐만 아니라 RNA) 모두는 본원에서 사용에 적합한 것으로 간주된다.
마찬가지로, T-세포 활성화를 위해 알려진 몇몇 억제성 신호 경로들이 있으며, T-세포 활성화의 억제를 감소시키는 모든 화합물들이 본원에서 고려된다. 예를 들어, PD-1, PD1H, TIM1 수용체, 2B4, CTLA-4, BTLA, 및 CD160에 결합하거나 그렇지 않으면 이들을 통해 신호전달을 억제하는 펩타이드 분자들이 고려된다. 그러한 결합 또는 다른 억제는 적합한 길항성 리간드들 또는 결합 단편들(예컨대, scFv)의 발현 및 분비에 의하여 촉발될 수 있고/있거나 발현 및 막 결합 제시에 의하여 매개될 수 있다. 그러므로, 고려된 억제성 리간드들은 또한 펩타이드 리간드에 융합된 막관통 영역을 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 수많은 막관통 영역들이 있으며, 이들 모두는 단일 알파 나선, 다중 알파 나선들, 알파/베타 배럴들(barrels) 등을 갖는 것들을 포함하여, 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 예를 들어, 고려된 막관통 영역들은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8 (예컨대, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, 또는 PAG/Cbp의 알파, 베타 또는 제타(zeta) 사슬의 막관통 부위(region)(들)를(을) 포함할 수 있다. 융합 단백질이 필요한 경우, 재조합 키메라 유전자는 상기 막관통 부위(들)을 인코딩하는 제1 부분을 가지며, 상기 제1 부분은 상기 억제성 단백질을 인코딩하는 제2 부분과 프레임(frame) 내에서 클로닝된다는 것이 고려된다.
상기 주목된 자극 유전자들 및 체크포인트 억제를 간섭/하향-조절하는 억제성 단백질에 대한 유전자들 코딩은 당업계에 주지되어 있으며, 이들 유전자들, 이소형들 및 변이체들의 서열 정보는 NCBI, EMBL, GenBank, RefSeq 등에서 접근 가능한 서열 데이터 베이스들을 포함하는 다양한 공개 자원들로부터 검색될 수 있음을 알아야 한다. 또한, 상기 예시적인 자극분자들은 바람직하게는 인간 내에서 발현되는 바와 같이 전장 길이 형태로 발현되는 반면에, 변형된 형태 및 비-인간 형태는 그러한 형태들이 T-세포들을 자극하거나 활성화하는 것을 보조하는 한 또한 적합한 것으로 간주된다. 그러므로, 돌연변이단백질들, 절단된 형태들 및 키메라 형태들은 본원에서 명시적으로 고려된다.
상기 암-연관 서열들에 대하여, 특히 에피토프가 (바람직하게는 건강한 제어 상에서) 발현되는 경우, 그리고 발현된 에피토프들이 또한 MHC-I 및/또는 MHC-II 복합체의 각각의 결합 모티프들에 결합하는 것으로 증명되거나 예측되는 경우, 암 연관되고, 암 유형에 특이적이거나 환자-특이적 네오에피토프인 임의의 에피토프는 본원에서 사용에 적합한 것을 알아야 한다.
예를 들어, 네오에피토프들은 그렇게 획득된 오믹스(omics) 정보의 동기 비교를 통해 종양 생검 (또는 림프 생검 또는 전이 부위의 생검) 및 정합된 정상 조직(즉, 동일 환자로부터 비-질환 조직)의 전체 게놈 분석에 의해 제 1 단계에서 환자 종양으로부터 식별될 수 있다. 이후, 그렇게 식별된 네오에피토프들은 상기 네오에피토프의 항원 제시의 가능성을 증가시키기 위하여 환자의 HLA 유형에의 정합을 위해 더 여과될 수 있다. 가장 바람직하게, 그리고 하기에서 더 토의되는 바와 같이, 그러한 정합은 인실리코(in silico)로 수행될 수 있다. 가장 통상적으로, 환자-특이적 에피토프들은 환자에게 특이하지만, 적어도 일부 경우들에 있어서 종양 유형-특이적 네오에피토프들(예컨대, Her-2, PSA, 브라큐리(brachyury)) 또는 암-연관 네오에피토프들(예컨대, CEA, MUC-1, CYPB1)를 포함할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스성 핵산 구조체 (또는 다른 전달을 위한 핵산 구조체)는 적어도 하나의 환자-특이적 네오에피토프를 인코딩하고, 가장 통상적으로는 적어도 2개 또는 3개 이상의 네오에피토프들 및/또는 종양 유형-특이적 네오에피토프들 및/또는 암-연관 네오에피토프들을 인코딩하는 재조합 세그먼트(segment)를 포함할 것임을 알아야 한다. 바람직한 네오에피토프들의 개수가 재조합 핵산들을 위한 바이러스 용량보다 더 큰 경우, 다수 및 개별 네오에피토프들은 다수 및 개별 재조합 바이러스들을 통해 전달될 수 있다.
하나 이상의 네오에피토프들을 식별하기 위하여 환자로부터 오믹스 정보를 획득하는 단계에 대하여, 오믹스 데이터는 표준 조직 처리 프로토콜 및 시퀀싱 프로토콜들을 따르는 환자 생검 샘플들로부터 얻어지는 것이 고려된다. 본 발명의 주제를 제한하지 않으면서, 데이터는 환자 정합된 종양 데이터(예컨대, 종양 대 동일 환자 정상)인 것이 통상적으로 바람직하며, 데이터 포맷(format)은 SAM, BAM, GAR 또는 VCF 포맷으로 된 것이 통상적으로 바람직하다. 그러나, 다른 참조(예컨대, 이전의 동일한 환자 정상 또는 이전의 동일한 환자 종양 또는 호모 스태티스티커스(homo statisticus))와의 정합되지 않거나 정합된 것이 또한 본원에서의 사용에 적합하다고 간주된다. 그러므로, 오믹스 데이터는 이전의 절차 (또는 심지어 다른 환자)로부터 얻어졌던 '신선한' 오믹스 데이터 또는 오믹스 데이터일 수 있다.
참조 서열(예컨대, 정합된 표준)의 성질에 관계 없이, 참조 서열은 다수의 에피토프들을 계산하기 위하여 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 가장 통상적으로, 에피토프들은 바람직하게는 중앙에 위치하거나 그렇지 않으면 MHC와의 결합을 개선시키는 방식으로 위치한 변화된 아미노산과 함께 2 내지 50개의 아미노산, 보다 통상적으로는 5 내지 30개의 아미노산, 및 가장 통상적으로는 9 내지 15개의 아미노산의 길이를 가질 것으로 계산될 것이다. 예를 들어, 에피토프가 MHC-I 복합체에 의하여 제시될 수 있는 경우, 통상적인 에피토프 길이는 약 8 내지 11개의 아미노산일 것인 반면에, MHC-II 복합체를 통한 제시를 위한 통상적인 에피토프 길이는 약 13 내지 17개의 아미노산 길이를 가질 것이다. 그렇게 계산된 에피토프들 및 네오에피토프들은 이후 하기에서 더 상세히 더 토의되는 바와 같이 환자-특이적 HLA-유형(MHC-I 및 MHC-II)에 이들의 친화도 여부를 인 실리코로 분석되는 것이 더욱 더 바람직하다. 그러한 네오에피토프들에 대한 HLA 친화도의 지식은 가치있는 정보의 적어도 2개의 항목들: (a) 다른 상황에서는 면역요법에 적합한 에피토프의 결실이 인식될 수 있고 그에 따라 결실된 에피토프를 표적하지 않도록 면역요법이 조절될 수 있으며, 그리고 (b) 면역요법에 적합한 네오에피토프의 발생이 인식될 수 있고 그에 따라 네오에피토프를 표적하도록 면역요법이 조절될 수 있음을 제공하는 것을 알아야 한다.
또한, 그리고 하기에 더 토의되는 바와 같이, 네오에피토프의 선택은 또한 네오에피토프의 발현 수준들 및 하위-세포 위치의 조사에 의해 더 인도되는 것을 알아야 한다. 예를 들어, 상기 네오에피토프가 정합된 정상에 대하여 발현되지 않거나 발현되더라도 아주 약하게 발현되는 경우(예컨대, 정합된 정상 발현의 20% 이하), 상기 네오에피토프는 적합한 네오에피토프들의 선택으로부터 소거될 수 있다. 마찬가지로, 상기 네오에피토프가 핵 단백질로 식별되는 경우, 상기 네오에피토프는 적합한 네오에피토프들의 선택으로부터 소거될 수 있다. 반면, 네오에피토프들에 대한 양성 선택은 상기 네오에피토프의 부분적으로 세포외 또는 막관통 존재 및/또는 정합된 정상과 비교하여 적어도 50%의 발현 수준을 필요로 할 수 있다. 발현 수준들은 당업계에 알려진 수많은 방식들로 측정될 수 있으며, 적합한 방식들은 qPCR, qLCR, 및 다른 정량적 혼성화 기법들을 포함한다.
게놈 분석은 임의의 숫자의 분석적 방법들에 의해 수행될 수 있다, 그러나, 특히 바람직한 분석 방법들은 종양 및 정합된 정상 샘플 양쪽 모두의 WGS(전체 게놈 시퀀싱) 및 엑솜(exome) 시퀀싱을 포함하는 것이 일반적으로 고려된다. 마찬가지로, 서열 데이터의 컴퓨터 분석은 수많은 방식으로 수행될 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 방법들에 있어서, 분석은 예를 들어, BAM 파일들 및 BAM 서버들을 사용하는 US 2012/0059670A1 및 US 2012/0066001A1에 개시된 바와 같이 종양 및 정상 샘플들의 위치 유도 동기 정렬에 의해 인실리코로 수행된다.
이후, 그렇게 식별되고 선택된 네오에피토프들은 식별된 환자 HLA-유형에 대하여 인실리코로 더 여과될 수 있다. 그러한 HLA-정합은 유핵 세포들의 MHC-I 복합체 및 특이적인 항원 제시 세포들의 MHC-II 복합체에 상기 네오에피토프들의 강한 결합을 보장할 것이라고 여겨진다. 양쪽 항원 제시 시스템들을 표적화하는 것은 면역 시스템의 세포성 및 체액성 브랜치(branch) 양쪽 모두를 포함하는 치료적으로 유효하고 내구성인 면역 반응을 생성하는 것으로 특히 여겨진다. MHC-I 및 MHC-II 양쪽 모두의 HLA 결정은 당업계에 주지된 습식 화학에서의 다양한 방법들을 사용하여 수행될 수 있으며, 이 방법들 모두는 본원에서의 사용에 적합하다고 간주된다. 그러나, 특히 바람직한 방법들에 있어서, HLA 유형은 또한 하기에 더 상세히 도시되는 바와 같이 알려지고/지거나 일반적인 HLA 유형들의 대부분 또는 모두를 포함하는 참조 서열을 사용하여 인실리코 오믹스 데이터로부터 예측될 수 있다. 요컨대, 환자의 HLA 유형이 (습식 화학 또는 인실리코 결정을 사용하여) 확인되고, HLA 유형에 대한 구조적 해결책이 이후 네오에피토프의 HLA 구조적 해결책에 대한 결합 친화성을 결정하기 위해 인실리코 도킹 모델(docking model)로서 사용되는 데이터베이스로부터 계산되거나 획득된다. 결합 친화도들의 결정에 대한 적합한 시스템들은 NetMHC 플랫폼(예컨대, Nucleic Acids Res. 2008년 7월 1일; 36(웹 서버 판): W509-W512. 참조), HLAMatchmaker (URL www.epitopes.net/downloads.html 참조), 및 IEDB Analysis Resource (URL tools.immuneepitope.org/mhcii/ 참조)를 포함한다. 이후, 사전에 결정된 HLA-유형에 대한 높은 친화도(예컨대, MHC-I에 대하여 100 nM 미만, 75 nM 미만, 50 nM 미만; MHC-I에 대하여 500 nM 미만, 300 nM 미만, 100 nM 미만)를 갖는 네오에피토프들이 선택된다. 최고의 친화도를 계산하는데 있어서, 네오에피토프들의 변형은 상기 에피토프에 N- 및/또는 C-말단 변형을 추가함으로써 바이러스성으로 발현된 네오에피토프의 HLA-유형에 대한 결합을 더욱 증가시킴으로써 구현될 수 있다. 따라서, 네오에피토프들은 특정 HLA-유형에 보다 잘 정합되도록 식별되거나 더 변형된 바와 같은 천연일 수 있다. HLA-정합된 네오에피토프들의 다른 양태들 및 고려사항들은 본원에 참조로 포함된, US 2017/0028044에 개시되어 있다.
이렇게 식별되고 발현된 네오에피토프를 목적하는 MHC 시스템으로 라우팅(routing)하는 것에 대하여, MHC-1 제시된 펩타이드들은 통상적으로 소포체를 통한 프로테아좀(proteasome) 처리 및 전달을 통해 세포질로부터 발생할 것이라는 것을 알아야 한다. 따라서, MHC-I 제시를 위해 의도된 에피토프들의 발현은 일반적으로 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이 세포질에 관한 것일 것이다. 반면에, MHC-II 제시된 펩타이드들은 통상적으로 세포막으로의 전달 이전에 산성 프로테아제류(예컨대, 레구메인, 카텝신 L 및 카텝신 S)에 의한 분해 및 처리를 통해 엔도솜 및 리소좀 구역으로부터 발생할 것이다. 따라서, MHC-II 제시를 위해 의도된 에피토프들의 발현은 일반적으로 하기에 더 상세히 논의되는 바와 같이 엔도솜 및 리소좀 구역에 관한 것일 것이다.
가장 바람직한 양태들에 있어서, 신호 펩타이드들은 엔도솜 및 리소좀 구획으로의 트래피킹 또는 세포질 공간 내에서의 보유(retention)를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드가 엔도솜 및 리소좀 구획으로 운반되는 경우, 타겟팅 프리(pre)서열들 및 내부 타겟팅 펩타이드들이 채용될 수 있다. 상기 타겟팅 펩타이드의 프리서열들은 바람직하게는 N-말단에 첨가되고 6 내지 136개 사이의 염기성 및 소수성 아미노산들을 포함한다. 퍼옥시좀 타겟팅의 경우, 표적 서열은 C-말단에 있을 수 있다. 다른 신호들(예컨대, 신호 패치들(patches))이 사용될 수 있고 펩타이드 서열 내에서 분리되고 적합한 펩타이드 폴딩(folding) 시에 기능적이 되는 서열 요소들을 포함한다. 또한, 글리코실화와 같은 단백질 변형들은 타겟팅을 유도할 수 있다.
다른 적합한 표적 신호들 중에서, 본 발명자들은 N-말단 근처에 위치한 노나펩타이드(nonapeptide)인 퍼옥시좀 표적 신호 1 (PTS1), C- 말단 트리펩타이드 및 퍼옥시좀 표적 신호 2 (PTS2)를 고려한다. 또한, 단백질들을 엔도솜 및 리소좀에 선별하는 것은 또한 통상적으로 짧은 선형 서열들을 포함하는, 단백질들의 세포질 영역들 내의 신호들에 의해 매개될 수 있다. 일부 신호들은 티로신-기반 선별 신호들이라고 지칭되며 NPXY 또는 YXXØ 컨센서스(consensus) 모티프들을 따른다. 디루신(dileucine)-기반 신호들로서 알려진 다른 신호들은 [DE]XXXL[LI] 또는 DXXLL 컨센서스 모티프들에 적합하다. 이들 신호 모두는 막들의 세포질 표면과 연관된 말단 단백질 코트들(coats)의 성분들에 의해 인식된다. YXXØ 및 [DE]XXXL[LI] 신호들은 어댑터 단백질 (AP) 복합체들 AP-1, AP-2, AP-3 및 AP-4에 의해 특징적인 미세 특이성을 갖는 것으로 인식되는 반면, DXXLL 신호들은 GGA들로 알려진 어댑터들의 다른 패밀리에 의하여 인식된다. 또한, 액상 단백질 선별 및 엔도솜 기능과 연관되어 있는 FYVE 영역이 첨가될 수 있다. 또 다른 양태들에 있어서, 엔도솜 구획들은 또한 인간 CD1 꼬리 서열들을 사용하여 타겟팅될 수 있다(예컨대, Immunology, 122, 522-531 참조).
세포질 구획으로의 트래피킹 또는 세포질 구획에서의 보유는 반드시 하나 이상의 특이적인 서열 요소들을 필요로 하지 않을 수 있다. 그러나, 적어도 일부 양태들에 있어서, 막-고정된 단백질 또는 막- 고정된 단백질의 막 고정 영역을 포함하는 N- 또는 C-말단 세포질 보유 신호들이 첨가될 수 있다. 예를 들어, 막-고정된 단백질들은 SNAP-25, 신텍신(syntaxin), 시냅토프레빈(synaptoprevin), 시냅토타그민(synaptotagmin), 소포 연관 막 단백질들(VAMPs), 시냅스 소포 당단백질들(SV2), 고친화성 콜린 수송체들, 뉴레신들, 전압-게이트된(gated) 칼슘 채널들, 아세틸콜린에스테라아제, 및 NOTCH를 포함한다. 따라서, 펩타이드들은 MHC-I 및/또한 MHC-II를 통한 우선적 또는 심지어 특이적인 제시를 달성할 수 있도록 특이적인 세포성 구획들에 라우팅될 수 있음을 알아야 한다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 하나 이상의 네오에피토프들은 상기 네오에피토프가 MHC-I 및/또는 MHC-II에 의한 복합화 없이 항체 인식을 위해 세포의 표면에서 또는 표면 상에서 제시되도록 세포 내 발현용 재조합 핵산에 의해 인코딩될 수 있음도 알아야 한다. 그러한 접근법은 MHC-I 및/또는 MHC-II 표적된 제시와 조합하여 또는 덜 바람직하게는 단독으로도 수행될 수 있다. 상이한 관점에서 볼 때, 그러한 네오-에피토프들의 포함의 목적은 (비록 동일한 돌연변이화된 단백질은 이의 환자 특이적 에피토프들이 다양한 MHC I 또는 II 구획들로 회피되는 반면에 원칙적으로 표면 상에서 발현될 수 있음에도 불구하고) 단독으로 작용하거나 단백질들의 표적 세트에 대하여 면역 반응을 증가시키기 위하여 클래식한 MHC 제시된 펩타이드 에피토프들과 조합되어 작용할 수 있는 항체들을 발생시키는 것이라는 것을 알아야 한다. 그러한 표면 제시는 펩타이드 에피토프가 막관통 서열에 융합되고, 적합한 막관통 서열들이 상기 토의된 것들을 포함하는 키메라 단백질들을 사용하여 수행될 것이다. 네오에피토프들의 차등적인 제시에 관련된 다른 양태들 및 고려사항들은 본원에 참조로 포함된 공동-소유의 계류중인 미국 가출원 제62/466846호에 개시되어 있다.
면역 체크포인트 수용체에 대한 자극 및 억제성 리간드는 동일한 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있고/있거나 개별 또는 공통 프로모터 요소들을 가질 수 있음을 더 알아야 한다. 마찬가지로, 인간 암-연관 서열들의 발현은 또한 조절 분자들의 발현과 동시적이며, 그러므로 가장 바람직하게는 동일한 제어 (또는 동일한 독립 프로모터 서열들) 하에 있을 것이 바람직하다.
예를 들어, 재조합 유전자들 모두는 구성적 강한 프로모터(예컨대, SV40, CMV, UBC, PGK, CAGG 프로모터)로부터 발현되는 것이 일반적으로 바람직하다, 그러나, 다양한 유도성 프로모터들도 본원에서의 사용에 적합한 것으로 간주된다. 예를 들어, 고려된 유도성 프로모터들은 테트라사이클린-유도성 프로모터, 믹소바이러스 저항성 I(Mx1) 프로모터 등을 포함한다. 또 다른 실시예들에서, 그리고 특히 항원 제시 세포들이 종양 마이크로환경에 존재하는 것으로 예측되는 경우, 유도성 프로모터들은 저산소증에 민감한 프로모터들 및 TGF-β 또는 IL-8 에 민감한 프로모터들(예컨대, TRAF, JNK, Erk, 또는 다른 반응성 요소들을 통한 프로모터)을 포함한다. 또한, 각각의 재조합 유전자들과 함께 자연적으로 발견되는 프로모터들도 고려된다.
가장 통상적이지만, 필수적이지는 않게, 모든 재조합 유전자들은 동일한 프로모터로부터 공동-발현되어서, 예를 들어, 내부 리보솜 진입(internal ribosome entry: IRES) 부위를 갖는 단일 전사체를 발생시키거나 각각의 단일 유전자 전사체로서, 또는 텐덤 미니젠(tandem minigene)들로서, 또는 발현에 적합한 임의의 다른 배열로서 하나 이상의 분리된 프로모터들로부터 전사될 수 있다. 또 다른 고려된 양태들에 있어서, 재조합 핵산은 자극 분자들을 인코딩할 수 있으며, 면역 체크포인트 수용체에 대한 억제성 리간드는 각각의 알려진 mRNA 또는 cDNA 서열들에 기반한 것일 수 있고 (그리고 그 자체로 인트론들을 가지지 않을 것이다), 또는 인공 인트론들을 가질 수 있거나 게놈 서열에 기반할 수 있음 (그리고 그 자체로 연관된 스플라이스 부위들을 갖는 인트론들 및 엑손들을 가질 것)을 알아야 한다. 그러므로, 고려된 재조합 핵산들로부터 전사체는 IRES(내부 리보솜 진입 부위) 또는 2A 서열(절단가능한 2A-유사 펩타이드 서열)을 포함하여 공동-자극 분자들 및 다른 단백질들의 조정된 발현을 허용하게 될 것이라는 것이 고려된다.
재조합 핵산들은 DNA 백신으로서 투여될 수 있음도 주목해야 하지만, 재조합 핵산은 바이러스성 게놈의 일부라는 것이 일반적으로 바람직하다. 그렇게 유전적으로 변형된 바이러스는 이후 유전자 요법에서 주지된 바와 같이 사용될 수 있다. 따라서, 재조합 바이러스들에 대하여, 재조합 바이러스들을 제조하는 모든 알려진 방식들이 본원에서의 사용에 적합하다고 간주되지만, 특히 바람직한 바이러스들은 아데노바이러스들, 아데노-연관 바이러스들, 알파 바이러스들, 헤르페스 바이러스들, 렌티바이러스들 등을 포함하여, 요법에 이미 확립된 것들이라는 것이 고려된다. 다른 적절한 선택들 중에서, 아데노바이러스들이 특히 바람직하다.
또한, 상기 바이러스는 통상적으로 선택된 바이러스 단백질들(예컨대, E1, E3 단백질들)의 타겟팅된 결실에 의해 달성되는 복제 결핍 및 비면역원성 바이러스인 것이 일반적으로 더 바람직하다. 그러한 바람직한 성질들은 E2b 유전자 기능을 결실시킴으로써 더 향상될 수 있으며, 재조합 바이러스들의 높은 역가들은 최근 보고된 바와 같이 유전적으로 변형된 인간 293개 세포들을 사용하여 달성될 수 있다(예컨대, J Virol. 1998 Feb; 72(2): 926-933). 가장 통상적으로, (바이러스 감염된 세포들로부터 발현용) 원하는 핵산 서열들은 당업계에 주지된 적절한 조절 요소들의 제어 하에 있다.
그렇게 생성된 재조합 바이러스들은 투여 단위당 104-1011 바이러스 입자들의 바이러스 역가를 갖는 멸균 주사용 조성물로서 통상적으로 제형화된 약학적 조성물에서 치료 백신으로서 개별적으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 그러나, 대안적인 제제도 본원에 사용하기에 적합한 것으로 간주되며, 모든 알려진 경로들 및 투여 방식들이 본원에서 고려된다. 본원에 사용된 약학적 조성물 또는 약물을 "투여하기"라는 용어는 상기 약학적 조성물 또는 약물의 직접 및 간접 투여로서, 상기 약학적 조성물 또는 약물의 직접 투여는 통상적으로 건강 관리 전문가(예컨대, 외과의사, 간호사 등)에 의해 수행되고, 간접 투여는 직접 투여(예컨대, 주사, 주입, 경구 전달, 국소 전달 등을 통해)를 위해 상기 약학적 조성물 또는 약물을 상기 건강 관리 전문가에게 제공하거나 이용가능하게 하는 단계를 포함하는 직접 투여 및 간접 투여를 지칭한다. 가장 바람직하게는, 상기 재조합 바이러스는 피하 또는 진피하 주입을 통해 투여된다. 그러나, 다른 고려된 양태들에 있어서, 투여는 정맥내 주사일 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원 제시 세포들은 환자의 세포들로부터 단리 또는 성장되고, 체외로 감염된 이후에 환자에게 주입될 수 있다. 그러므로, 고려된 시스템들 및 방법들은 고도의 맞춤형 암 치료를 위한 완전한 약물 발견 시스템(예컨대, 약물 발견, 치료 프로토콜, 검증 등)으로 간주될 수 있음을 알아야 한다.
또한, 상기 바이러스성 벡터의 예방적 또는 치료적 투여는 T-세포들 상에서 가능한 억제 작용을 감소시키기 위하여 면역 체크포인트 억제제들 및/또는 면역 자극 화합물들과 병용-투여에 의하여 달성될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 특히 바람직한 체크포인트 억제제들은 일반적으로 처방된 바와 같이 통상적으로 동일한 프로토콜 및 용량 하에서, 현재 이용 가능한 억제제들(예컨대, 펨브로리주맵, 니볼루맵, 이필리뮤맵)을 포함한다. 체크포인트 억제는 플라스미드/바이러스성 DNA들 상에서의 포함을 통해 억제성 리간드들/생물제제들을 유전적으로 전달함으로써 달성될 수 있음도 고려된다. 마찬가지로, 유전적으로 변형된 NK 세포들은 본원에 고려된 재조합 바이러스의 투여와 동시에 또는 투여 전 또는 투여 이후에 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 고려된 변형된 바이러스들의 투여와 연계하여 또 다른 추가적인 치료들은 바이러스성 벡터 내에서 인코딩되거나 단백질 약물로서 따로 투여될 수 있는 인터류킨-유형 자극 분자들을 포함한다. 예를 들어, 적합한 자극 화합물들은 IL-2, IL-15, IL-21 등을 포함하며, IL-15의 N72D 돌연변이체 유형 또는 IL-15 초작용제(예컨대, ALT803)이 특히 바람직하다. 또한, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성을 증가시키기 위하여 치료적으로 유효한 항체들을 투여함으로써 치료가 보조될 수 있다. 그러한 항체들은 세포 및 환자 특이적 네오에피토프들(예컨대, 상기 기재된 바와 같이 식별된 것들), 암-특이적 항원들(예컨대, PSA, PSMA, HER2 등) 및/또는 암-연관 항원들(예컨대, 표적 MUC5AC 변이체들(예컨대, 엔시툭시맵), CEACAM 변이체들 등)을 타겟팅할 수 있다.
그러므로, 예시적인 일 방법에 있어서, 상기 재조합 핵산은 바람직하게는 수지상 세포들을 타겟팅하도록 피하 또는 진피하 주입을 통해 투여될 수 있는 반면에, 자극 및/또는 항-억제성 조성물들은 바이러스성으로 유도된 공격(challenge)에 대한 면역 반응의 국부 및/또는 전신 증가를 촉진시키기 위하여 (예컨대, 바람직하게는 종양 내 주입 또는 피하 또는 진피하 주입을 통해) 따로 주입될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 자극 조성물들은 바람직하게는 IL-15, IL-2, IL-17, 및/또는 IL-21을 포함할 것이고, 특히 바람직한 IL-15 조성물들은 IL-15 초작용제(예컨대, IL-15의 IL-2Rβγ과의 결합을 향상시키는 N72D 돌연변이체)를 포함할 것이며, 바람직한 항-억제성 조성물들은 이필리뮤맵(Yervoy®) 펨브로리주맵(Keytruda®), 및 니볼루맵(Opdivo®)을 포함할 것이다. 가장 통상적이지만, 필수적이지는 않게, 자극 및/또는 항-억제성 조성물들은 투여량으로 또는 승인되거나 공통적으로 채용된 투여량 미만으로 투여되며, 본 발명의 주제의 일부 양태들에 있어서, 투여는 저용량 처방(예컨대, 표준, 승인 또는 권장 용량의 80-95% 사이, 60-85% 사이, 40-60% 사이, 20-40% 사이 또는 1-20% 사이)일 것이다.
상이한 관점에서 볼 때, 그러므로, 고려된 시스템들 및 방법들은 HLA-결합된 네오에피토프의 제시를 자극하기 위하여 재조합 핵산을 통해 (예컨대, 바이러스성 벡터를 통해) 통상적으로 투여되는 환자 및 암 특이적 성분을 포함할 것이며, 상기 네오에피토프들은 공동-자극 분자 분자 및 면역 체크포인트 억제제 중 적어도 하나의 문맥에서 제시되는 것을 알아야 한다. 물론, 적합한 핵산 벡터들은 바이러스성 벡터들뿐만 아니라 박테리아성 벡터들, 효모 벡터들 및 효모 인공 염색체들을 또한 포함할 수 있음도 알아야 한다. 또한, 고려된 시스템들 및 방법들은 또한 상기 네오에피토프들을 생성하고 제시하는 (감염된) 세포들에 대한 면역 반응의 국부 및/또는 전신 자극을 제공함으로써 향상된 면역 반응을 자극하기 위하여 상기 네오에피토프에 대하여 독립적으로 투여되는 면역 자극 성분을 포함할 것이다. 따라서, 고려된 조성물들 및 방법들은 억제의 네오에피토프-연관 자극/감소를 통해 T-세포 활성화를 직접적으로 자극할 뿐만 아니라, (예컨대, 다른 면역 자극 사이토카인들의 방출을 촉발하기 위하여) 자극 및/또는 항-억제성 조성물들의 국부 및/또는 전신 투여를 통해 상기 네오에피토프들에 대한 면역 반응을 간접적으로 자극할 것이다.
스트레스 신호들의 과발현 또는 전사를 촉발하기 위하여, 환자는 바람직하게는 메트로놈 방식으로, 저용량 화학요법 및/또는 저용량 방사선 요법으로 치료될 수 있음도 고려된다. 예를 들어, 그러한 치료는 단백질 발현, 세포 분열 및 세포 주기 중 적어도 하나에 영향을 주고, 바람직하게는 세포자살을 유도하거나 적어도 스트레스-관련 유전자들 (및 특히 NKG2D 리간드들)의 발현을 유도하거나 증가시키는데 효과적일 것임이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 고려된 일양태들에 있어서, 그러한 치료는 하나 이상의 화학요법제들을 사용하는 저용량 치료를 포함할 것이다. 가장 통상적으로, 저용량 치료는 화학 요법제에 대한 LD50 또는 IC50의 70% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하의 노출에 있을 것이다. 추가적으로, 유리한 경우에, 그러한 저용량 처방은 예를 들어, 미국 특허 제7758891호, 제7771751호, 제7780984호, 제7981445호, 및 제8034375호에 기재된 바와 같이 메트로놈방식으로 수행될 수 있다.
그러한 저용량 처방에서 사용되는 특정한 약물에 대하여, 모든 화학요법제들은 적합한 것으로 간주됨이 고려된다. 다른 적합한 약물들 중에서, 키나아제 억제제들, 수용체 작동제들 및 길항제들, 항-메타볼릭(metabolic), 세포정지(cytostatic) 및 세포독성(cytotoxic) 약물들 모두 본원에 고려된다. 그러나, 특히 바람직한 작용제들은 종양의 성장 또는 발달을 조종하는 경로의 성분을 간섭하거나 억제하기 위해 식별된 것들을 포함한다. 적합한 약물들은 예를 들어, WO 2011/139345 및 WO 2013/062505에 기재된 바와 같은 오믹스 데이터에 대한 경로 분석을 사용하여 식별될 수 있다. 가장 특별하게는, 종양 세포들 내에서 스트레스-관련 유전자들의 그렇게 달성된 발현은 NKG2D, NKP30, NKP44, 및/또는 NKP46 리간드들의 표면 제시로 나타날 것인데, 이는 차례로 NK 세포들을 활성화시켜 종양 세포들을 특이적으로 파괴할 것이다. 따라서, 저용량 화학요법은 스트레스 관련 단백질들을 발현하고 보여주기 위하여 종양 세포들 내에서 방아쇠(trigger)로서 채용될 수 있는데, 이는 차례로 NK-세포 활성화 및/또는 NK_세포 매개 종양 세포 살상을 촉발시킬 것이라는 것을 알아야 한다. 추가적으로, NK-세포 매개 살상은 면역 반응을 더 향상시키는 것으로 간주되는, 세포간 종양 특이적 항원들의 방출과 연관될 것이다.
본원의 설명 및 후속하는 청구범위 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 그리고 "the")의 의미는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용된 바와 같이, "내(in)"의 의미는 문맥이 달리 명시하지 않으면 "내" 및 "상(on)"을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 그리고 문맥이 달리 지시하지 않는 한, "에 결합된(coupled to)"이란 용어는 (서로 결합된 두 개의 요소가 서로 접촉하는) 직접 커플링 및 (적어도 하나의 추가 요소가 두 요소 사이에 위치되는) 간접 커플링을 모두 포함하려는 것이다. 그러므로, "에 결합된" 및 "와 결합된(coupled with)"이라는 용어는 동의어로 사용된다. 본원의 특정 실시형태에 대하여 제공되는 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 언어 (예컨대, "~ 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 예시하려는 것이며, 달리 청구된 본 발명의 범위에 제한을 가하지 않는다. 본 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 지시하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 이미 기재된 것들 이외의 더 많은 수정이 가능하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명의 주제는 첨부된 청구범위의 범위를 제외하고는 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, "포함한다" 및 "포함하는"이라는 용어는 참조된 구성 요소, 성분 또는 단계가 존재할 수 있거나 활용될 수 있거나 명시적으로 참조되지 않은 다른 구성 요소, 성분 또는 단계와 조합될 수 있다는 것을 나타내는 비-배타적인 방식으로 구성 요소, 성분 또는 단계를 언급하는 것으로 해석되어야 한다. 명세서의 청구범위가 A, B, C ... 및 N으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것의 적어도 하나를 언급하는 경우. 텍스트(text)는 A와 N 또는 B와 N, 등이 아닌 그룹으로부터의 구성 요소 하나만 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (22)

  1. 재조합 핵산 벡터(recombinant nucleic acid vector)로서,
    다수의 유전자들을 인코딩(encoding)하는 재조합 서열 부분을 포함하는 바이러스성 게놈;
    을 포함하며,
    상기 재조합 서열 부분은 조절 서열(regulatory sequence)에 동작가능하게 결합되어 상기 다수의 유전자들의 발현을 허용하며;
    상기 다수의 유전자들은, 면역 체크포인트 수용체(immune checkpoint receptor)에 대한 억제성 리간드(inhibitory ligand) 및 4개의 별개의 자극(stimulatory) 분자들을 인코딩하며; 그리고
    상기 바이러스성 게놈은, 상기 바이러스성 게놈에 의해 인코딩되는 바이러스의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위해 적어도 하나의 돌연변이화된(mutated) 또는 결실된 단백질 코딩 서열을 가지는,
    재조합 핵산 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 4개의 별개의 자극 분자들 중 적어도 하나는, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    재조합 핵산 벡터.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 4개의 별개의 자극 분자들 중 적어도 둘은, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    재조합 핵산 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 4개의 별개의 자극 분자들 중 적어도 셋은, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    재조합 핵산 벡터.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 4개의 별개의 자극 분자들은, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1)인,
    재조합 핵산 벡터.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 수용체는 CTLA-4 또는 PD-1이고, 상기 억제성 리간드는 상기 리간드를 세포막에 고정시키는 막관통 영역(transmembrane domain)을 포함하는,
    재조합 핵산 벡터.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 서열 부분은 인간 암-연관 서열을 더 포함하는,
    재조합 핵산 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 인간 암-연관 서열은, 상기 암-연관 서열에 의해 인코딩되는 유전자 산물(gene product)을, 상기 재조합 핵산 벡터를 호스팅(hosting)하는 세포의 세포질 구획(compartment)으로 우선적으로 유도하는 트래피킹(trafficking) 서열을 더 포함하는,
    재조합 핵산 벡터.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 인간 암-연관 서열은, 상기 암-연관 서열에 의해 인코딩된 유전자 산물을, 상기 재조합 핵산 벡터를 호스팅하는 세포의 리소좀 또는 엔도솜 구획으로 우선적으로 유도하는 트래피킹 서열을 더 포함하는,
    재조합 핵산 벡터.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 인간 암-연관 서열은, 암 연관 항원, 암 특이적 항원, 및 환자 및 종양 특이적 네오항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 인코딩하는,
    재조합 핵산 벡터.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이러스는 아데노바이러스인,
    재조합 핵산 벡터.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 돌연변이화된 또는 결실된 단백질 코딩 서열은 E1, E2b 및 E3으로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    재조합 핵산 벡터.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이러스는 복제-결핍(replication-deficient)인,
    재조합 핵산 벡터.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 벡터를 포함하는,
    바이러스.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 바이러스는 E2b 유전자 부족(lacking) 재조합 결핍 아데노바이러스(recombination deficient adenovirus)인,
    바이러스.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 4개의 별개의 자극 분자들은, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD54 (ICAM-1/BB2) 및 CD11 (LFA-1)이며, 상기 면역 체크포인트 수용체는 CTLA-4이며, 그리고 상기 재조합 서열 부분은 인간 암-연관 서열을 더 포함하는,
    바이러스.
  17. 항원 제시 세포(antigen presenting cell)를 감염시켜 상기 항원 제시 세포와 접촉하는 T 세포에서의 T 세포 활성화를 자극하기 위한 용도를 갖는 제 14 항에 따른 바이러스.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 항원 제시 세포는 피부층(cutaneous layer)에서 감염되는,
    상기 항원 제시 세포를 감염시켜 상기 항원 제시 세포와 접촉하는 T 세포에서의 T 세포 활성화를 자극하기 위한 용도를 갖는 바이러스.
  19. 면역 반응을 자극하는데 유효한 프로토콜에 따라 제 14 항에 따른 바이러스를 투여하는 단계를 포함하는,
    비-인간 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 투여하는 단계는, 피하(subcutaneous) 또는 진피하(subdermal) 주입에 의해 수행되는,
    비-인간 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 비-인간 대상체에 저용량 화학 요법(low-dose chemotherapy) 또는 저용량 방사선 요법(low-dose radiation therapy)을 투여하는 단계를 더 포함하는,
    비-인간 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 저용량 화학 요법 또는 저용량 방사 요법은 메트로놈방식으로(metronomically) 투여되는,
    비-인간 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
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