EP1441758A2 - Allogene vakzine enthaltend eine ein costimulatorisches polypeptid exprimierende tumorzelle - Google Patents

Allogene vakzine enthaltend eine ein costimulatorisches polypeptid exprimierende tumorzelle

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EP1441758A2
EP1441758A2 EP02787620A EP02787620A EP1441758A2 EP 1441758 A2 EP1441758 A2 EP 1441758A2 EP 02787620 A EP02787620 A EP 02787620A EP 02787620 A EP02787620 A EP 02787620A EP 1441758 A2 EP1441758 A2 EP 1441758A2
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EP
European Patent Office
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cells
tumor
use according
tumor cell
cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02787620A
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English (en)
French (fr)
Inventor
John Nieland
Claudia Breidenstein
Ute Sartorius
Ulrich Moebius
Christoph Bogedain
Adelheid Dinkel
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Medigene AG
Original Assignee
Medigene AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer

Definitions

  • the present invention relates to the use of genetically modified tumor cells for the production of vaccines.
  • the autologous vaccine cells from the patient's own tumor are used to produce the vaccine.
  • the tumor cells are removed from the body, genetically modified if necessary, and made proliferation incompetent, for example by radiation, before they are re-administered to the patient.
  • the aim is that immune cells, in particular cytotoxic T cells and helper T cells, recognize the administered cells and thus build up an immune response that can then also be directed against the tumor.
  • autologous cell vaccines also have a number of strong disadvantages. Often, especially with smaller neoplasms, it is very difficult or almost impossible to cultivate the tumor cells. In addition, a vaccine must be made individually for each patient. It is therefore very difficult to standardize the production of autologous vaccines, which can be a considerable disadvantage for the approval of such a vaccine. Further The production of an autologous vaccine means a long waiting time for the patient, since after the tumor material has been removed, the cells must first be processed and manipulated before they can be administered to the patient again. In the meantime there is a risk that (further) metastases have formed in the patient's body.
  • allogeneic immunization i.e. immunization with non-patient cells.
  • the vaccine cells differ from the patient's own cells, since they usually do not have the identical transplantation antigens (MHC genes).
  • MHC complex on the surface of cells is of particular importance for the development of the specific immune response, since peptides are presented in the MHC complex, which are then recognized by T cells specific for these peptides.
  • MHC complexes There are two classes of MHC complexes - Class I and Class II.
  • a T cell When a specific immune response is formed, a T cell recognizes the MHC complex through its T cell receptor and is thereby stimulated to form an immune response.
  • the binding of the T cell receptor to the MHC complex is usually not sufficient for the development of a specific immune response. Rather, further so-called costimulatory molecules are required which increase the signal exchange between the T cell and the MHC-carrying cell.
  • the MHC complexes of class I are of particular importance for triggering an immune response against tumor cells, since tumor cells in their MHC I complexes present peptides that (almost) exclusively occur on tumor cells, so-called tumor antigens or peptides derived from them. It is known in the prior art that the detection of peptides by tumor antigen are derived from MHC class I molecules and cause certain T cells to proliferate cytotoxic T cells, which in turn can kill tumor cells. (Janeway C. et al. (1999) in: Immunobiology; Current Biology Publications, pages 551-554)
  • HLA A There are three genes in humans that code for three different MHC class I molecules, HLA A, HLA B and HLA C. Each of these genes is highly polymorphic, i.e. for each of the genes there are a number of different alleles in the population that lead to different MHC molecules. In the Caucasian population, for example, there are 95 different HLA A, 207 HLA B and 50 HLA C alleles according to current knowledge. Some of the alleles are very common, such as the allele HLA A2, which occurs in approximately 50% of the population, while others are very rare.
  • a person's HLA type can be determined by two different methods. On the one hand, antibodies are available which specifically recognize certain MHC proteins which are encoded by HLA alleles and which are thus used for a specific staining of cells in a subject. On the other hand, there are specific oligonucleotide primers for the various alleles, which are used in PCR reactions to determine the HLA type of a test person. (Welsh K and Bunce M (1999) Rev Immunogenet 1 (2): 157-76; Parham P (1992) Eur J Immunogenet 19 (5): 347-59)
  • T cell recognizes only one type of MHC complex, usually the body's own MHC complex. This is due to the fact that in the context of the positive selection of T cells in the thymus, the production site of the T cells, only those T cells that recognize the body's own MHC complexes survive. However, there are also alloreactive T cells in the body that recognize foreign MHC complexes, for example on organs transplanted on cells.
  • one (or more) established tumor cell line is usually used to vaccinate the patient (see WO 97/24132).
  • the object is achieved by using a tumor cell to produce a vaccine for the treatment or prevention of a tumor in a patient, characterized in that the tumor cell expresses a stimulatory polypeptide and that the tumor cell and the patient do not match their MHC molecules exhibit.
  • the term “allogeneic” in the context of the present invention means that two individuals (or one individual and the cell used for vaccination) are different with respect to their antigens. This usually, but not necessarily, means that they their HLA antigens are different, expressly including the fact that the two individuals partially match in their HLA genes, or complete or no match of the HLA genes is included, in the former case there is at least one other antigen between the Individuals (or the cell and the patient) differ.
  • no match between their MHC / HLA molecules means that two individuals (or one individual and the cell used for vaccination) have no alleles in common with regard to their MHC-I complexes.
  • the costimulatory polypeptide is selected from the group consisting of B7.1, B7.2, CD40, Light, Ox40, 4.1.BB, Icos L, SLAM, ICAM 1, LFA-3, B7.3, CD70, HSA, CD84, CD7, B7 RP-1 L, MAdCAM-1, VCAM-1, CS-1, CD82, CD30, CD120a, CD120b and TNFR-RP, CD40L.
  • the costimulatory polypeptide is selected from the group consisting of B7.1 and B7.2. According to a very particularly preferred embodiment, the costimulatory polypeptide is B7.2. According to a preferred embodiment of the use according to the invention, the patient has at least one tumor or is to be protected against a tumor which is of the same type as that from which the tumor cell is derived. Methods for determining the type of tumor are known from pathological textbooks.
  • tumor antigens which are presented in the MHC complexes of the tumor cell used for vaccination.
  • the immune response can also be based on the recognition of other molecules, e.g. tissue-specific differentiation antigens or glycoproteins / peptides.
  • the tumor cell used according to the invention is of a different type than the tumor which is to be treated in the patient or is to be prevented from occurring.
  • the immune cells recognize the proteins / peptides on the tumor cell surface, which are also present on the surface of the tumors. These can be bound to MHC molecules or not bound.
  • the tumor cell is derived from a primary tumor or a metastasis.
  • the tumor cell preferably originates from a tumor which is selected from the group consisting of melanoma, breast cancer, colon cancer, ovarian cancer, lymphoma, leukemia, prostate cancer, lung cancer, bronchial cancer or pancreatic cancer.
  • the tumor cell used according to the invention expresses at least one tumor antigen which is characteristic of the respective tumor, for example a cellular or viral tumor antigen.
  • This tumor antigen is preferably recognized by the immune system, which leads to activation of the immune system and then to treatment or prevention of the patient.
  • the tumor antigen is selected from the group consisting of MART, Her2neu, tyrosinase, tyrosinase-related proteins (TRP), MARTl / MelanA, Ny-ESO-1, CEAl, CEA2, CEA3, ⁇ -feto protein, MAGE X2, BAGE, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE7a, GAGE8, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE AI 1, MAGE A12, MAGE1, MAGE2, MAGE3, MAGE3b, MAGE4a, MAGE4b, MAGE5, MAGE5a, MAGE5b, MAGE6, MAGE7, MAGE8, MAGE9, PAGE1, PAGE4, CAMEL, PRAME, LAGE1, g lOO, Her2neu, ras, p53, E6, E7 as well as SV40 large and small T-ant
  • the tumor cell is derived from a melanoma and the tumor antigen is selected from the group consisting of tyrosinase, MARTl / MelanA, Ny-ESO-1, MAGE3 and gplOO.
  • the tumor cell expresses at least one cytokine and / or one chemokine, preferably selected from the group consisting of GM-CSF, G-CSF, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ILl l, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IFN ⁇ , IFNß, IFN ⁇ , Flt3 L, Flt3, TNF, RANTES, MlPl ⁇ , MlPlß, MlPl ⁇ , MlPl ⁇ , MIP2, MIP2, MIP2ß, MIP3 ⁇ , MIP3ß, MIP4, MIP5, MCP1, MCPlß, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, 6cykine, Dcckl and DCDF.
  • cytokine and chemokine preferably
  • the tumor cell used according to the invention can also express a fusion protein from the abovementioned polypeptides. It is furthermore included according to the invention that the tumor cell expresses functional variants of the above-mentioned polypeptides, functional variants being characterized in that they have essentially the same biological activity as the mentioned polypeptides. In the prior art, tests are known for the respective polypeptides, how these can be detected or their respective activity can be measured.
  • the tumor cell used according to the invention expresses B7.2 and GM-CSF.
  • B7.2 and GM-CSF expresses B7.2 and GM-CSF.
  • melanoma cells that have been genetically modified to express the two polypeptides B7.2 and GMCSF are more effective than tumor cells that only express GMCSF even in the context of allogeneic vaccination without agreement of the MHC molecules.
  • mice were injected intravenously with vital, unchanged tumor cells to provoke the formation of lung metastases.
  • the animals were then vaccinated twice with irradiated tumor cells which either expressed unchanged or expressed GMCSF, or B7.2 and GMCSF.
  • GMCSF GMCSF
  • B7.2 and GMCSF irradiated tumor cells which either expressed unchanged or expressed GMCSF, or B7.2 and GMCSF.
  • antigen-specific T cells takes place according to the general state of knowledge via two signaling pathways: On the one hand the antigen fragment loaded on the body's own MHC is presented to the T cell receptor, on the other hand there is a receptor-ligand binding between the B7.2 on the Antigen-presenting cell and CD28 are held on the T cell. Both signals are required to activate the T cell (two-signal model, see e.g. Bretscher P (1992) Immunol Today 1992 Feb; 13 (2): 74-6).
  • NK cells natural killer cells
  • CD28 i.e. the receptor for B7.2
  • NK cells are also activated by B7.2 interaction. However, it is generally believed that this interaction only increases the cytokine pro- production leads (see Nandi D supra, Amakata Y supra, Marin-Fontecha A supra and Yeh KY supra), but not to an increased lytic activity. This increase in the lytic activity of NK cells was surprisingly demonstrated in the context of the present invention. In the case of an allogeneic vaccination without agreement of the MHC molecules, this can lead to increased lysis of the vaccine cells and thus to the release of antigens, which can subsequently be more effectively taken up by the patient's antigen-presenting cells and presented to T cells, as well for the already observed release of various cytokines that stimulate T cells and antigen-presenting cells.
  • the tumor cell used according to the invention contains one or more vectors which cause the expression of one or more of the polypeptides defined above.
  • the vector can comprise control sequences which bring about the expression of the polypeptide starting from the endogenous gene of the polypeptide.
  • control sequences which bring about the expression of the polypeptide starting from the endogenous gene of the polypeptide.
  • the vector comprises nucleic acid sequences which code for the above-mentioned polypeptides.
  • the respective nucleic acid sequences are known in the prior art and can be found, for example, in the literature references listed above. The state of the art basically knows how to construct a vector so that a polypeptide can be expressed. (Sambrook J et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ⁇ d ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory).
  • the vector is of non-viral origin, for example common expression plasmids, or viral origin, preferably derived from AAV, HSV, retrovirus, lentivirus, adenovirus, SV40.
  • the vector is episomal or integrated into the genome of the cell.
  • the vector derives from AAV.
  • AAV vectors and vectors derived therefrom are known in the prior art (see, for example, WO 00/47757, WO 02/20748).
  • the AAV vector contained in the tumor cell used according to the invention is present as a concatemer in the AAV-S1 acceptor site.
  • expression of the polypeptide is carried out by a constitutive, for example the CMN promoter (Vincent et al (1990) Vaccine 90, 353, the SV40 promoter (Samulski et al (1989) J Virol 63, 3822) or the LTR Promoter of retroviruses (Lipkowski et al (1988) Mol Cell Biol 8, 3988), an inducible, for example the tet promoter, and / or a tissue-specific, for example the elongation factor promoter, the Ig promoter or the IL2 / ⁇ FAT Promoter controlled.
  • a constitutive for example the CMN promoter (Vincent et al (1990) Vaccine 90, 353, the SV40 promoter (Samulski et al (1989) J Virol 63, 3822) or the LTR Promoter of retroviruses (Lipkowski et al (1988) Mol Cell Biol 8, 3988), an inducible, for example the
  • the promoters can control the expression by either controlling the expression of the polypeptide starting from the endogenous genes or by coding the expression of the polypeptides starting from the nucleic acid sequences included in the vector.
  • a variety Known number of promoters that can be used according to the invention are known. (Sambrook J supra).
  • the tumor cell used according to the invention is incapable of proliferation, for example by radiation or chemical inactivation.
  • proliferation incompetent means that the tumor cell is no longer able to proliferate.
  • tumor cells become incompetent for proliferation by garnma radiation with 25-100 Gy (see, for example, WO 97/32988).
  • chemical inactivation for example, the addition of 40 ⁇ g / ml mitomycin can be used.
  • an adjuvant is defined as a compound which can intensify the triggering of an immune reaction.
  • the drug also contains an adjuvant.
  • the medicament thus contains an adjuvant, preferably those adjuvants which act as toll-like receptor agonists. These are e.g. CpG oligonucleotides. These are oligonucleotides that contain at least one CpG motif (see e.g. Wagner H (2001) Immunity 14, 499-502).
  • the adjuvant is derived from Bacillus Calmette-Guerin cell wall structure (BCG-CWS).
  • BCG-CWS is known to be a ligand of toll-like receptors 2 and 4 and to differentiate Im- can trigger mun cells (Matsumoto M et al (2001) Int Immunopharmacol 1, 8, 1559-69).
  • the adjuvant is a superantigen.
  • Superantigens are antigens that bind directly to T cell receptors and MHC molecules and cause direct activation of the T cells.
  • Superantigens are known to have an adjuvant effect (see e.g. Okamoto S et al (2001) Infect. Immun. 69, 11, 6633-42).
  • Known superantigens are e.g. Staphylococcus aureus Enterotoxins A, B, C, D and E (SEA, SEB, SEC, SED, SEE), Staphylococcal aureus toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1), Staphylococcal exfoliating toxin or Streptococcal pyrogenic exotoxins.
  • the adjuvant is an agent that inhibits the signaling effect of CTLA-4.
  • the medicament contains suitable additives and / or binders.
  • the additive or binder preferably comprises 0.3 to approx. 4 M, preferably 0.4 to approx. 3 M, in particular approx. 0.5 to 2 M, very particularly preferably approx. 1 to approx. 2 M of a salt a pH of approx. 7.3-7.45, in particular 7.4.
  • the salt is preferably an alkali or an alkaline earth metal salt, in particular a halogenite or a phosphate, in particular an alkali metal halite, very particularly preferably NaCl or KCl.
  • the pH is adjusted by means of a buffer, for example by means of a phosphate buffer, a Tris buffer, a HEPES buffer or a MOPS buffer.
  • the tumor cells are administered in amounts of preferably at least 1 ⁇ 10 5 , preferably 1 ⁇ 0 6 , in particular 1 ⁇ 0 7 cell per dose. These amounts apply to both prophylactic and therapeutic vaccination.
  • the cells are preferably administered at least twice, particularly preferably at least three times at intervals of at least 2 weeks, preferably 4 weeks, in particular 8 weeks.
  • Administration is usually subcutaneous, intracutaneous or intranodal.
  • the tumor cell is derived from an individual of the same species as the patient.
  • the patient is a mammal, preferably a human.
  • the vaccine produced in the context of the use according to the invention activates the lytic activity of NK cells.
  • the invention further relates to the use of a tumor cell expressing a costimulatory polypeptide for the production of a vaccine for increasing the lytic activity of NK cells in the treatment or prevention of a tumor in a patient allogeneic to the tumor cell.
  • the term "allogeneic" in the context of the present invention means that two individuals (or one individual and those for Cell used) are different with respect to their antigens. This usually, but not necessarily, means that they are different in their HLA antigens. It is expressly included that the two individuals partially agree in their HLA genes. Full or no match of the HLA genes is also included. In the former case, at least one other antigen is then different between the individuals (or the cell and the patient).
  • the same embodiments apply to the costimulatory polypeptide, the tumor cell, the tumor, the vaccine and the patient as described above in the context of the other use according to the invention. According to the invention, it is also included that the patient and the tumor cell partially agree in their HLA antigens.
  • the invention further relates to a method for treatment or prevention in a patient, in which the patient is administered a therapeutically effective amount of a tumor cell expressing a costimulatory polypeptide, the tumor cell and the patient having no match in their MHC complexes.
  • the invention further relates to a method for treatment or prevention in a patient, in which the patient is administered a therapeutically effective amount of a tumor cell expressing a costimulatory polypeptide, which activates the lytic activity of NK cells, whereby the tumor cell is used Patient is allogeneic.
  • the invention opens up completely new perspectives for the treatment of tumor patients.
  • IFN- ⁇ test describes the graphical evaluation of an intracellular IFN- ⁇ test.
  • the IFN ⁇ release measured by immunostaining was determined from HLA-A2 positive donor T cells which had been stimulated with Mel29 tumor cells with HLA agreement (top) or with Mel 62 tumor cells without HLA agreement (bottom). In both cases, B7.2 transduced and untransduced tumor cells were compared.
  • NK cells effector cells
  • target cells melanoma cells
  • FIG. 5 describes the graphical evaluation of an experiment in which untransduced melanoma cells or transduced by means of rAAV with B7.2 or with B7.2 and GM-CSF were incubated with PBLs for 5 days and their proliferation on the basis of the incorporation of H- Tdr was measured.
  • FIG. 6 describes the graphic evaluation of a mouse vaccination experiment with pre-implanted tumors, in which autologous and allogeneic vaccination strategies are compared with one another.
  • Cell lines used for vaccination and transgenes expressed by them are plotted on the X axis; the relative tumor load was evaluated in%.
  • Mel 29 Melanoma cell line derived from melanoma patient, HLA-A2.01 positive, untransduced or B7.2 / GMCSF transduced;
  • Mel 62 Melanoma cell line derived from melanoma patient, HLA-A2.01 negative, untransduced or B7.2 / GMCSF transduced;
  • TAP-deficient lymphoblastoid cells TAP-deficient lymphoblastoid cells; these were loaded with a complex of HLA-A2.01 restricted melanoma peptides;
  • PBLs Peripheral Blood Lymphocytes
  • Melanoma cells are sown at a density of 3.8x10 4 cells in 1 ml medium (DMEM with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 1 x antibiotic-antimycotic, 1 x MEM vitamins; Gibco-BRL) in three wells of a 24-well Plate. The next day, the cells are irradiated with 100 Gy and infected with 20 ⁇ L rAAVB7.2 / GM-CSF virus (corresponds to MOI 84). After incubation for 48 h at 37 ° C., 5% CO 2 , the culture supernatant is aspirated from the transduced melanoma cells and 2.5x10 6 PBMC from an HLA-A2 positive donor are added.
  • DMEM 1 ml medium
  • FCS 1 mM L-glutamine
  • 1 x antibiotic-antimycotic 1 x MEM vitamins
  • Gibco-BRL Gibco-BRL
  • the PBMC are restimulated with peptide-loaded PBMC.
  • 1.5 ⁇ 10 7 PBMC from the same donor are mixed with 10 ⁇ g / ⁇ l MART mut peptide with the sequence ELAGIGILTV and incubated for 4 h at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • the cells are then diluted with T-cell medium with 10% human serum and 0.4 U / mL IL-2 (Boehringer Ingelheim) to the final concentration of the peptides of 0.5 ⁇ g / ml and cells of 3-4x10 5 / ml , From the primary stimulation approach, 1 ml of culture supernatant is aspirated and 3 ⁇ 4 ⁇ 10 5 peptide-loaded PBMC in 1 ml are added.
  • T2 cells T2 cells (TAP-deficient B-cell lymphoma) are loaded with peptide as described above, then irradiated with 100 Gy and 1 ⁇ 10 5 cells are added to the stimulation approach. The restimulation takes place without IL-2.
  • An intracellular IFN- ⁇ staining is performed the day after the third restimulation.
  • the cells are cultured further and the assay is repeated a week later.
  • T2 cells In order to stimulate the production of IFN- ⁇ in the T cells, they are incubated with peptide-loaded antigen-presenting cells. T2 cells are adjusted to a concentration of lxl 0 6 cells / ml, and 10 ug / ml Mart mu t- peptide or HIV peptide. 50 ⁇ l of this are sown per well in a 96-well round-bottom plate and incubated overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • PBMC restimulated PBMC
  • assay medium RPMI 1640, Gibco BRL, Cat # 21875-034; 1 mM Na pyruvate; 2 mM L-glutamine; 1 x MEM non-essential amino acids; 50 ⁇ g / ml gentamicin ; freshly mixed with 10% human serum; 0.8 U / ml IL-2) resuspended and adjusted to lx 10 7 / ml. 50 ⁇ l of this cell suspension are added to the T2 cells loaded with peptide. To improve the interaction of the cells, the plate is centrifuged for 1 min at 1200 rpm, 4 ° C. After incubation for 1 h at 37 ° C.
  • the cells are stained.
  • 20 ⁇ l of the following antibodies, diluted 1/50 in 1 ⁇ perm / wash solution, are added: anti-IFN- ⁇ -FITC (Caltag, Cat # MHCIFG01), anti-CD8-PE (Becton Dickinson, Cat # 30325X) and anti-CD4-Cychrome (Becton Dickinson, Cat # 30158X), the plate vortexed briefly and incubated for 30 min on ice.
  • the cells are washed 2x with 100 ⁇ l perm / wash solution each, the cell pellets resuspended in 150 ⁇ l PBS / 0.5% BSA and transferred to Micronic tubes. The samples are then measured in the FACS.
  • IFN- ⁇ staining was found in T cells which had originally been stimulated with Mel62-B7.2 / GM-CSF, while stimulation with untransduced Mel62 had no effect. IFN- ⁇ production was peptide-specific because T2 cells loaded with HIV peptide were ineffective. The result was confirmed a week later.
  • the antigenic signal comes from tumor antigens that are endogenously expressed by the melanoma cell and are presented by an MHC molecule that is common to both the stimulator cell and the T cell (HLA-A2 agreement) .
  • HLA-A2 agreement the activation of a T cell is dependent on the presentation of the melanoma antigens by induced antigen-presenting cells (APCs), such as, for example, dendritic cells (“cross-priming”).
  • APCs induced antigen-presenting cells
  • Test components B16F10-HEL-wt cells (H-2b) transfected with B7.2 and / or GM-CSF pAAV plasmid K-1735-HEL (H-2k), transduced with rAAV-B7.2 / GM-CSF
  • the expression vector pcDNA3neo-HEL was cloned for the production of stable transfectants of the melanoma cell lines B16F10 (Prof. Judith J. Fidler, MD Anderson Cancer Center, Texas, USA) and K-1735 (Dr. Souberbielle, King's College, London).
  • the HEL gene was cut out of the vector pcDNA1-HEL (Shastri, University of CA, Berkeley, CA, USA) and ligated into the expression vector pcDNA3neo (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), which contains a neomycin resistance gene, which makes the selection more positive Serves clones.
  • the transfection of B16F10 and K-1735 cells was carried out using Lipofectamine® (# 11668, Invitrogen, Carlsbad CA, USA) on 15 cm culture dishes. Positive cells were selected using medium containing G418 (800 ⁇ g / ml). After 2-3 weeks, individual clones were picked and expanded. The clones were tested for expression of the transgene using RT-PCR and Western blot examined. The two clones with the best expression rate were selected for vaccination experiments.
  • RNA preparation was prepared from 2 - 5 x 10 6 cells performed with QIAshredder column (# 79654, Qiagen ®, Hilden) and the RNeasy Kit (# 74104, Qiagen ®, Hilden).
  • DNA eg episomal plasmid DNA
  • RNAse-free DNAse # 776785, Röche ® , Basel
  • the amplified HEL fragment had a length of 430 bp
  • the amplified fragment of murine ⁇ -actin had a length of 290 bp.
  • Antibodies biotinylated anti HEL used in a dilution of 1: 200 (RDI, # RDI-Lyszym-BT, Flanders, NJ). Streptavidin-HRP: used in a dilution of 1: 5,000 (Sigma ® , # S-5512, Deisenhofen)
  • K1735-HEL cells expressing murine B7.2, GM-CSF or both molecules were generated by transduction with recombinant adeno-associated virus (AAV).
  • AAV adeno-associated virus
  • the plasmids pAAV-muGMCSF and pAAV-muB7.2 were cloned: The cDNA of GM-CSF and B7.2 were cloned into the vector pCI (Promega, Madison, WI, USA), which contains one CMV promoter and one SV40 3'- untranslated region.
  • plasmid pAAV-GM-CSF two expression cassettes - which contain GM-CSF with the CMV promoter and the SV40-pA site - were ligated in tandem into the plasmid pAAV base vector (see WO 00/47757, Example 4 ).
  • an additional 400 bp from pUC19 (bp 1516-1910) were also integrated into the vector.
  • the expression cassette - with B7.2, the CMV promoter and the S V40-pA site - was ligated into the plasmid pAAV base vector.
  • An additional 700 bp from pUC19 (bp 1201-1910) were required to generate the optimal size of the vector.
  • Heia T cells were transfected simultaneously with 2 plasmids by means of calcium phosphate coprecipitation: with the vector plasmid pAAV-muGM-CSF or pAAV-muB7.2 and the AAV helper plasmid pUC "rep / cap” (RBS) D37, which contains the AAV genes for 'rep' and 'cap' of AAV2 wears (see WO 00/47757).
  • K-1735-HEL cells were irradiated (10OGy) and infected with the AAV.
  • GM-CSF expression 200-300 ng / 10 6 cells in 48 h
  • approximately 700 ⁇ l of the virus rAAV-muGMCSF for 5 ⁇ 10 6 cells were normally used.
  • B7.2 expression 70% - 96%)
  • approx. 4 ml of the virus rAAV-muB7.2 was necessary for 5 x 10 6 cells.
  • the cells were harvested, frozen (FCS, 10% DMSO) and stored in liquid nitrogen.
  • mice To prepare cells for application to mice, these were thawed in a 37 ° C. water bath, washed three times in PBS and adjusted to the correct number of cells (3 ⁇ 10 5 cells per dose in PBS).
  • B16F10 cells cannot be efficiently transduced with rAAN. Therefore, the transfection with the Liposome Polyfect (QIAgen ® 'Hilden) was carried out in order to generate vaccine cells for allogeneic vaccination experiments.
  • the melanoma cell line B16F10-HEL was transfected individually or in combination with the vectors pAAV-muGMCSF and pAAV-muB7.2. The cells were seeded in cell culture flasks (1.66 x 10 per T75) and transfected the following day according to the manufacturer's instructions.
  • the expression of the transgenes was measured for GM-CSF using ELISA and for B7.2 using flow cytometry.
  • mice To prepare cells for injection into mice, these were thawed in a 37 ° C. water bath, washed three times in PBS and adjusted to the correct cell number (3 ⁇ 10 5 cells per dose in PBS).
  • GM-CSF Secreted GM-CSF was determined 48 hours after sowing in the supernatant of transduced or transfected cells.
  • mice were sacrificed by cervical dislocation on day 21 after challenge. The lungs were removed immediately afterwards, weighed on an analytical balance and then fixed in Bouin's Solution (85% picric acid, 10% formaldehyde, 5% glacial acetic acid). The number of metastasis nodes was determined by counting under a microscope.
  • Bouin's Solution 85% picric acid, 10% formaldehyde, 5% glacial acetic acid. The number of metastasis nodes was determined by counting under a microscope.
  • Fig. 2 shows that the group B16 B7.2 / GMCSF (allogeneic) does not differ statistically from the group Kl 735 B7.2 / GM-CSF (autologous).
  • the coexpression of B7.2 and GM-CSF also shows a synergistic effect.
  • FIG. 6 The joint evaluation of three similar but independent animal experiments is shown in FIG. 6. This shows the clear superiority of the combination of B7.2 and GMCSF over the single molecules. This synergistic effect is particularly significant.
  • the synergistic effect of the molecules occurs both in autologous vaccination, where B7.2 can have a direct effect on T cell activation, and in allogeneic vaccination without agreement of the MHC molecules, where only indirect effects via NK cells and allo- reactive T cells are conceivable. This underscores the interesting discovery that B7.2 has an immunostimulatory effect even with allogeneic vaccination, despite the contrary opinion to date.
  • results of the three experiments were weighted relative to one another by setting the mean lung weight of the groups in animals without any manipulation (blank value) to be 0% and that of the group which had been vaccinated with wild-type cells to be 100%.
  • the individual test groups were then weighted as a percentage of their lung weight. An average was then formed for all three experiments.
  • the experimental analysis of a postulated function of a melanoma vaccine in a human experimental setup harbors several restrictions with regard to the methods that can be used and the parameters that can be investigated.
  • the measurement of an effect of cellular-produced GM-CSF is limited to the induction of the differentiation of monocytes to (pre-) dendritic cells.
  • the chemotactic effect is a parameter that can only be analyzed in vivo.
  • B7.2 CD86
  • Cells / material Melanoma cell line Mel 29 derived from a patient
  • PBLs Peripheral blood lymphocytes
  • Test components Mel 29 cells: untransduced or transduced with B7.2. Aim of the experiment: Analysis of the effect of B7.2 on the NK cell-mediated
  • Lysis of melanoma cells Design PBLs were freshly isolated, purified using a Ficoll gradient and incubated overnight at different E / T ratios with 2x10 3 51 Cr-labeled cells that were either untransduced or transduced with B7.2. The release of 51 Cr from lysed cells was measured.
  • Cells in a T80 bottle are detached and centrifuged at 175xg for 5 min.
  • the cell pellet is resuspended in 2-5 ml assay medium (RPMI1640, Gibco with 5% FCS, 2 mM L-glutamine, 1 mM Na pyruvate, 1 x non-essential arninoacids, 50 ⁇ g / ml gentamicin) and the cells are counted ,
  • 2-5 ml assay medium RPMI1640, Gibco with 5% FCS, 2 mM L-glutamine, 1 mM Na pyruvate, 1 x non-essential arninoacids, 50 ⁇ g / ml gentamicin
  • 100-200 ⁇ l of the cell suspension are transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube (cell number: up to 1E + 6). After adding 20-50 ⁇ l 51 Cr, the cells are incubated for 45 min to 60 min at 37 ° C., 5% CO2. The cells are washed twice and diluted to 2000 cells per 100 ⁇ l medium.
  • PBMNC are adjusted to a cell number of 6.7E + 6 / ml in assay medium, of which 150 ⁇ l are pipetted into the first row of a 96-well round-bottom MTP. A total of 6 titer levels are produced in 1: 3 dilution steps.
  • 100 ⁇ l of target cell suspension are pipetted into 100 ⁇ l effector titration per well.
  • 100 ⁇ l target cell suspension mixed with 100 ⁇ l assay medium.
  • the cells are incubated for about 16 h at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • 100 ⁇ l of target cell suspension are mixed with 100 ⁇ l of 2% Triton X-100 to determine the maximum release.
  • the NK cell-mediated lysis of melanoma cells was significantly increased by the expression of B7.2 by the Mel29 cells. Similar results were obtained with a second melanoma cell line, Mel 62 (data not shown). In total, three out of five donors showed a comparable increase in their NK cell activity comparable to that from FIG. 4. These results thus show the increase in NK cell-mediated lysis of tumor cells as a result of B7.2 expression on corresponding tumor cells. Consequences of such an increase in NK cell activity are (1) the release of cytokines, (2) the release of tumor antigen and (3) the activation of DC cells through the interaction of CD40 and CD40L. As already stated, it is known that these consequences support the efficient activation of T cells against the tumor antigens derived from the melanoma cells.
  • Test summary Cells / material Melanoma cell lines Mel derived from a patient
  • Test components Melanoma cells derived from a patient, transduced with:
  • the samples are precipitated on glass fiber filter mats using a semi-automatic sample harvesting device.
  • the filters are dried in a drying cabinet at 60 ° C for at least 1 h (or overnight).
  • the dried filters are sealed in foil and wetted with ⁇ -scintillator liquid.
  • the ⁇ -radiation of the samples in the filter is then measured in a radioactivity meter for ⁇ -radiation (cpm).
  • melanoma cells with increasing amounts of B7.2 expression were used to induce T cell proliferation. It was found that the maximum of the measured T cell activation was close to a B7.2 expression rate of 30% positive cells (data not shown). It should also be noted that the transduction of melanoma cells with the control proteins GFP (green fluorescence protein) or lacZ (due to infection with rAAV) had only an insignificant influence on T cell proliferation, and significantly less than the influence by B7. 2 Expression. This confirms that the observed increase in T cell proliferation was dependent on the expression of B7.2.
  • GFP green fluorescence protein
  • lacZ due to infection with rAAV
  • Cells / material Melanoma cell lines derived from a patient Mel 29 (HLA A2.01 positive), Mel 62 (HLA A2.01 negative) T2 cells: TAP-deficient lymphoblastoid cells PBLs from a healthy, HLA A2.01 positive donor Test components: Mel 62, Mel 29 cells:
  • Aim of the experiment induction of an immune response against peptide epitopes from known tumor antigens in a test arrangement with and without match of the MHC haplotypes (“match” or “mismatched”) between melanoma cell lines and PBLs.
  • Melanoma cells transduced with rAAV-B7.2 induced the activation of T cell lines (Mel29 and Mel62) with higher efficiency than non-transduced cells, which recognized specifically known peptide epitopes from known melanoma antigens (see FIG. 6).
  • control vectors showed that this effect was dependent on B7.2 expression.
  • the antigens tested here included Marti / MelanA, gplOO and tyrosinase (together in the peptide pool).
  • the specificity for these melanoma-derived antigens was demonstrated by comparison to a ControUpeptide derived from HIV-gpl20.
  • Increasing amounts of specific T cells were observed when either HLA-A2 matched allogeneic stimulation (with Mel29, left diagram of FIG. 6) or HLA mismatched stimulation (Mel62, right diagram of FIG. 6) of the T cellsteurkelt.
  • the antigen-acting signal is derived from endogenously expressed tumor antigens of a melanoma cell (stimulator cell), which are presented on the cell surface by MHC molecules.
  • the T cells also originate from an HLA-A2 positive donor and thus the T cell receptor of the T cells recognizes the antigenic peptide directly by presenting the antigen with an appropriate MHC molecule that is common to the stimulation cell and the donor of the T cells.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Tumorzelle zur Herstellung einer Vakzine für die Behandlung oder Vorbeugung von Tumoren in Patienten, wobei die Tumorzelle ein costimulatorisches Polypeptid exprimiert und die Tumorzelle und der Patient keine Übereinstimmung ihrer MHC-Moleküle aufweisen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung einer ein costimulatorisches Polypeptid exprimierenden Tumorzelle zur Herstellung einer Vakzine zur Erhöhung der lytischen Aktivität von NK-Zellen bei der Behandlung oder Vorbeugung eines Tumors in einem zur Tumorzelle allogenen Patienten.

Description

AUogene Vakzine enthaltend eine ein costimulatorisches Polypeptid expri- mierende Tumorzelle
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von genetisch modifizierten Tumorzellen zur Herstellung von Vakzinen.
Die Aktivierung des körpereigenen Immunsystems zur Behandlung und Prävention von Tumoren ist ein vielversprechender Ansatz in der modernen Krebsthera- pie.
Zur Aktivierung des körpereigenen Immunsystems sind im Stand der Technik u.a. autologe und allogene Vakzine bekannt. (Pardoll DM (1998) Nat Med 4(5 Suppl): 525-31; Wolchock JD and Livingston PO (2001) Lancet Ocol 2 (4): 205-11; Schadendorf D et al. (2000) Immunol Lett 15; 74(1): 67-74)
Bei der autologen Vakzine werden Zellen vom patienteneigenen Tumor für die Herstellung der Vakzine verwendet. Dabei werden die Tumorzellen dem Körper entnommen, ggf. genetisch modifiziert und beispielsweise durch Bestrahlung pro- liferationsinkompetent gemacht, bevor sie dem Patienten wieder verabreicht werden. Ziel ist es, dass Immunzellen, insbesondere cytotoxische T-Zellen und Hel- fer-T-Zellen, die verabreichten Zellen erkennen und so eine Immunantwort aufgebaut wird, die sich dann auch gegen den Tumor richten kann.
Autologe Zellvakzine besitzen neben vielen Vorteilen auch eine Reihe von starken Nachteilen. Häufig, insbesondere bei kleineren Neoplasien, ist es sehr schwierig oder nahezu unmöglich, die Tumorzellen zu kultivieren. Zudem muss für jeden Patienten eine Vakzine individuell angefertigt werden. Damit ist es sehr schwierig, die Herstellung autologer Vakzine zu standardisieren, was für die Zu- lassung einer solchen Vakzine einen erheblichen Nachteil darstellen kann. Ferner bedeutet die Herstellung einer autologen Vakzine für den Patienten eine lange Wartezeit, da nach Entnahme des Tumormaterials die Zellen zunächst aufbereitet und manipuliert werden müssen, bevor sie dem Patienten wieder verabreicht werden können. In der Zwischenzeit besteht die Gefahr, dass sich im Körper des Pati- enten (weitere) Metastasen gebildet haben.
Eine Alternative zur autologen Vakzinierung ist die sog. allogene Immunisierung, d.h. die hrimunisierung mit Zellen, die nicht vom Patienten stammen. Somit unterscheiden sich die Vakzinezellen von den körpereigenen Zellen des Patienten, da sie in der Regel nicht die identischen Transplantationsantigene (MHC-Gene) besitzen.
Der MHC-Komplex auf der Oberfläche von Zellen ist für die Ausbildung der spezifischen Immunantwort von besonderer Bedeutung, da im MHC-Komplex Pepti- de präsentiert werden, die dann von für diese Peptide spezifischen T-Zellen erkannt werden. Dabei gibt zwei Klassen von MHC Komplexen - Klasse I und Klasse II.
Bei der Ausbildung einer spezifischen Immunantwort erkennt eine T-Zelle durch ihren T-Zellrezeptor den MHC-Komplex und wird dadurch zur Ausbildung einer Immunantwort angeregt. Allerdings genügt meistens die Bindung des T- Zellrezeptors an den MHC-Komplex nicht für die Ausbildung einer spezifischen Immunantwort. Vielmehr werden weitere sog. costimulatorische Moleküle benötigt, die den Signalaustausch zwischen T-Zelle und MHC-tragender Zelle verstär- ken.
Für die Auslösung einer Immunantwort gegen Tumorzellen sind die MHC Komplexe der Klasse I von besonderer Bedeutung, da Tumorzellen in ihren MHC I Komplexen Peptide präsentieren, die (nahezu) ausschließlich auf Tumorzellen vorkommen, sog. Tumorantigene oder von diesen abgeleitete Peptide. Im Stand der Technik ist bekannt, dass die Erkennung von Peptiden, die von Tumorantigen abgeleitet sind und die von MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden, durch bestimmte T-Zellen die Proliferation von zytotoxischen T-Zellen bewirkt, die wiederum Tumorzellen abtöten können. (Janeway C. et al. (1999) in: Immuno- biology; Current Biology Publications, Seiten 551-554)
Im Menschen gibt es drei Gene, die für drei verschiedene MHC Klasse I Moleküle kodieren, HLA A, HLA B und HLA C. Jedes dieser Gene ist hoch polymorph, d.h. für jedes der Gene existiert eine Reihe verschiedener Allele in der Bevölkerung, die zu unterschiedlichen MHC Molekülen führen. In der kaukasischen Population beispielsweise gibt es nach heutigem Wissensstand 95 verschiedene HLA A, 207 HLA B und 50 HLA C Allele. Einige der Allele kommen sehr häufig vor, wie z.B. das Allel HLA A2, das ca. in 50% der Bevölkerung vorkommt, während andere nur sehr selten vorkommen.
Der HLA-Typ einer Person kann durch zwei verschiedene Methoden bestimmt werden. Zum einen sind Antikörper verfügbar, die bestimmte MHC-Proteine, die von HLA Allelen kodiert werden, spezifisch erkennen und die somit für eine spezifische Anfärbung von Zellen eines Probanden eingesetzt werden. Zum anderen gibt es für die verschiedenen Allele spezifische Oligonukleotid-Primer, die in PCR Reaktionen eingesetzt werden, um den HLA-Typ einer Testperson zu bestimmen. (Welsh K and Bunce M (1999) Rev Immunogenet 1(2): 157-76; Parham P (1992) Eur J Immunogenet 19(5): 347-59)
Wenn man nun verschiedene, nicht-verwandte Individuen vergleicht, haben diese bezüglich des MHC-I Komplexes häufig kein Allel gemeinsam, so dass man von keiner Übereinstimmung ihrer MHC- bzw. HLA-Moleküle spricht. Wenn zumindest ein HLA Allel den beiden Individuen gemeinsam ist, so sind die Individuen zwar allogen, haben aber eine teilweise Übereinstimmung ihrer MHC- bzw. HLA- Moleküle. Eine vollständige Übereinstimmung ihrer MHC- bzw. HLA-Moleküle liegt dann vor, wenn alle HLA Allele den beiden Individuen gemeinsam sind, was in der Regel nur zwischen engen Verwandten, insbesondere bei eineiigen Zwillingen vorkommt.
Im Stand der Technik wird davon ausgegangen, dass eine bestimmte T-Zelle nur einen Typ MHC-Komplex erkennt, in der Regel den körpereigenen MHC- Komplex. Dies liegt daran, dass im Rahmen der positiven Selektion von T-Zellen im Thymus, dem Produktionsort der T-Zellen, nur diejenigen T-Zellen überleben, die körpereigene MHC-Komplexe erkennen. Allerdings gibt es im Körper auch alloreaktive T-Zellen, die fremde MHC-Komplexe erkennen, beispielsweise auf Zellen transplantierter Organe.
Diese und weitere Informationen sind dem Lehrbuch „Immunobiology", Charles Janeway et al., Current Biology Publications, 1999, Seiten 115-147, insbesondere Seiten 115-117 und 135-140 zu entnehmen.
Bei der allogenen Vakzinierung wird in der Regel eine (oder auch mehrere) etablierte Tumorzelllinie zur Vakzinierung des Patienten verwendet (siehe WO 97/24132).
Obwohl allein durch die Verabreichung einer allogenen Tumorzelllinie bereits im Patientenkörper eine gewisse Immunreaktion hervorgerufen wird, ist diese Immunreaktion in aller Regel nicht ausreichend, um den patienteneigenen Tumor zu bekämpfen. Daher sind im Stand der Technik verschiedene Versuche unternommen worden, durch genetische Manipulierung der verabreichten Tumorzelllinie eine Verstärkung der Immunantwort hervorzurufen. Beispielsweise ist im Stand der Technik bekannt (siehe WO 97/24132), dass eine Verstärkung der Immunantwort dadurch erzielt werden kann, dass eine genetisch modifizierte Tumorzelle verabreicht wird, die GM-CSF exprimiert. Insgesamt sind im Stand der Technik eine Vielzahl von allogenen Vakzinen bekannt, die genetisch modifi- zierte Tumorzellen umfassen. (Nawrocki S. etal. (2001) Expert Opin Biol Ther 1(2): 193-204. Trotz dieser Vielzahl potentieller allogener Vakzine ist im Stand der Technik keine allogene Vakzine bekannt, die beim Einsatz im Patienten eine befriedigende Wirkung erzielt. Allen im Stand der Technik bekannten allogenen Vakzinen ist gemeinsam, dass die im Patienten ausgelöste Immunantwort in aller Regel zu schwach ist, um den patienteneigenen Tumor wirksam zu bekämpfen. (Bodey B. et al. (2000) Anticancer Res 20(4): 2665-76).
Damit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte allogene Vak- zine bereitzustellen, die im Patienten eine stärkere Immunantwort auslöst als die im Stand der Technik bekannten allogenen Vakzine.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung einer Tumorzelle zur Herstellung einer Vakzine für die Behandlung oder Vorbeugung eines Tumors in einem Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle ein co- stimulatorisches Polypeptid exprimiert und dass die Tumorzelle und der Patient keine Übereinstimmung ihrer MHC-Moleküle aufweisen.
Überraschenderweise hat sich im Zuge der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass die Wirksamkeit einer Vakzine ohne Übereinstimmung der MHC-Komplexe dadurch erhöht werden kann, dass die Tumorzelle ein costimulatorisches Polypeptid exprimierte. Dies führt zu einer Effizienzsteigerung von ca. 30 %, bevorzugterweise von ca. 40 %, was beispielsweise im Falle der sehr aggressiven Kl 735- Tumor eine sehr deutliche Effizienzsteigerung darstellt.
Dies ist deswegen so überraschend, weil im Stand der Technik bislang davon ausgegangen wurde, dass costimulatorische Moleküle nur dann eine Steigerung der Immunantwort bewirken können, wenn die als allogene Vakzine verwendeten Tumorzellen und der Patient und damit auch der Tumor zumindest eine teilweise Übereinstimmung ihrer MHC-Moleküle aufweisen. Es wurde angenommen, dass das Vorliegen einer Übereinstimmung im MHC-I Komplex Voraussetzung dafür ist, dass durch allogene Tumorzellen aktivierte T-Zellen den mit körpereigenen MHC Molekülen bestückten Tumor bekämpfen können, da die einzelne T-Zellen nach herkömmlicher Meinung nur einen MHC-Typ erkennen kann. (Fabre JW (2001) Nature Medicine 7(6): 649-52.
Wie bereits oben aufgeführt bedeutet der Ausdruck „allogen" im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass zwei Individuen (oder ein Individuum und die zur Vakzinierung verwendete Zelle) bzgl. ihrer Antigene unterschiedlich sind. Dies bedeutet in der Regel, aber nicht notwendigerweise, dass sie bzgl. ihren HLA- Antigene unterschiedlich sind. Dabei ist ausdrücklich eingeschlossen, dass die beiden Individuen teilweise in ihren HLA-Genen übereinstimmen. Ebenso ist eine vollständige Übereinstimmung oder keine Übereinstimmung der HLA-Gene eingeschlossen. In ersterem Fall ist dann zumindest ein weiteres Antigen zwischen den Individuen (oder der Zelle und dem Patienten) unterschiedlich.
Der Begriff „keine Übereinstimmung ihrer MHC-/HLA-Moleküle" bedeutet, dass zwei Individuen (oder ein Individuum und die zur Vakzinierung verwendete Zelle) bzgl. ihrer MHC-I Komplexe keine Allele gemeinsam haben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das costimulatorische Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus B7.1, B7.2, CD40, Light, Ox40, 4.1.BB, Icos L, SLAM, ICAM 1, LFA-3, B7.3, CD70, HSA, CD84, CD7, B7 RP- 1 L, MAdCAM-1, VCAM-1, CS-1, CD82, CD30, CD120a, CD120b und TNFR- RP, CD40L.
Gemäß einer besonders bevorzugten AusfuLirungsform ist das costimulatorische Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus B7.1 und B7.2. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist das costimulatorische Polypeptid B7.2. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung weist der Patient mindestens einen Tumor auf oder soll vor einem Tumor geschützt werden, der von demselben Typ wie derjenige ist, von dem die Tumorzelle abstammt. Verfahren zum Bestimmen des Tumortyps sind aus pathologi- sehen Lehrbüchern bekannt.
Dies bedeutet, dass durch Vakzinierung mit der Tumorzelle im Patienten eine Immunantwort gegen denselben Tumortyp wie denjenigen der Tumorzelle ausgelöst wird. Diese Immunantwort basiert dann in der Regel auf für den Tumor spezifischen Antigenen (sog. Tumorantigene, siehe unten), die in den MHC- Komplexen der zur Vakzinierung verwendeten Tumorzelle präsentiert werden. Die Immunantwort kann aber auch auf der Erkennung anderer Moleküle, z.B. gewebespezifischer Differenzierungsantigene oder Glycoproteine/-peptide, beruhen.
Erfindungsgemäß ist aber auch eingeschlossen, dass die erfindungsgemäß verwendete Tumorzelle von einem anderen Typ als derjenige Tumor ist, der im Patienten behandelt werden soll oder vor dem vorgebeugt werden soll. In diesem Fall erkennen die Immunzellen die Proteine/Peptide auf der Tumorzelloberfläche, die ebenfalls auf der Oberfläche der Tumoren vorhanden sind. Diese können an MHC Moleküle gebunden oder nicht gebunden vorliegen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Primärtumor oder einer Metastase ab.
Vorzugsweise stammt die Tumorzelle von einem Tumor ab, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Melanom, Mammakarzinom, Colonkarzinom Ova- rialkarzinom, Lymphom, Leukämie, Prostatakarzinom, Lungenkarzinom, Bronchialkarzinom oder Pankreaskarzinom. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform exprimiert die erfindungsgemäß verwendete Tumorzelle mindestens ein für den jeweiligen Tumor charakteristisches Tumorantigen, beispielsweise ein zelluläres oder virales Tumorantigen. Vorzugsweise wird dieses Tumorantigen vom Immunsystem erkannt, was zur Aktivierung des Immunsystems und dann zur Behandlung oder Vorbeugung des Patienten führt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Tumorantigen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MART, Her2neu, Tyrosinase, tyrosinase- related proteins (TRP), MARTl/MelanA, Ny-ESO-1, CEAl, CEA2, CEA3, α- feto Protein, MAGE X2, BAGE, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE7a, GAGE8, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE AI 1, MAGE A12, MAGE1, MAGE2, MAGE3, MAGE3b, MAGE4a, MAGE4b, MAGE5, MAGE5a, MAGE5b, MAGE6, MAGE7, MAGE8, MAGE9, PAGE1, PAGE4, CAMEL, PRAME, LAGE1, g lOO, Her2neu, ras, p53, E6, E7 sowie SV40 large und small T-Antigen.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Melanom ab und das Tumorantigen ist ausgewählt aus der Grup- pe bestehend aus Tyrosinase, MARTl/MelanA, Ny-ESO-1, MAGE3 und gplOO.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform exprimiert die Tumorzelle mindestens ein Cytokin und/oder ein Chemokin, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GM-CSF, G-CSF, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ILl l, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IFNα, IFNß, IFNγ, Flt3 L, Flt3, TNF , RANTES, MlPlα, MlPlß, MlPlγ, MlPlδ, MIP2, MIP2 , MIP2ß, MIP3α, MIP3ß, MIP4, MIP5, MCP1, MCPlß, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, 6cykine, Dcckl und DCDF. Bevorzugte Cytokine/Chemokine sind GM-CSF, RANTES und/oder MlPlα. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäß verwendete Tumorzelle auch ein Fusionsprotein aus den oben genannten Poly- peptiden exprimieren. Ferner ist erfindungsgemäß eingeschlossen, dass die Tumorzelle funktionelle Varianten der oben genannten Polypeptide exprimiert, wo- bei sich funktionelle Varianten dadurch auszeichnen, dass sie im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die genannten Polypeptide aufweisen. Im Stand der Technik sind zu den jeweiligen Polypeptiden Tests bekannt, wie diese nachgewiesen bzw. deren jeweilige Aktivität gemessen werden kann.
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform exprimiert die erfindungsgemäß verwendete Tumorzelle B7.2 und GM-CSF. Wie Beispiel 2 zu entnehmen ist, führt die Kombination dieser beiden Polypeptide zu einer überraschend hohen Wirksamkeit der Tumorzelle in den Patienten.
In einem Mausmodell konnte gezeigt werden, dass Melanomzellen, die gentechnisch dahingehend verändert wurden, dass sie die beiden Polypeptide B7.2 und GMCSF exprimieren, auch im Rahmen einer allogenen Vakzinierung ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle wirksamer sind als Tumorzellen, die nur GMCSF exprimieren.
Im Detail erhielten Mäuse eine intravenöse Injektion mit vitalen unveränderten Tumorzellen, um die Bildung von Lungenmetastasen zu provozieren. Anschließend erfolgte eine zweimalige Vakzinierung der Tiere mit bestrahlten Tumorzellen, die entweder unverändert oder GMCSF, oder B7.2 und GMCSF exprimierten. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl in der autologen Vakzinierungssituation - Tumorzellen (Vakzine) vom gleichen Tier - als auch in der allogenen Situation ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle - Tumorzellen von einem Tier mit anderem MHC-Typ - eine synergistische Wirkung der beiden Polypeptide entstand. Während dieses Ergebnis für die autologe Situation wie auch für eine allo- gene Situation mit einer teilweisen Übereinstimmung der MHC-Moleküle bekannt ist, ist dieses Ergebnis für eine allogene Situation ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle vollkommen überraschend.
Eine solche Wirkung ist nicht vereinbar mit der bisher bekannten Wirkungsweise costimulatorischer Moleküle. Die Aktivierung Antigen-spezifischer T-Zellen findet gemäß dem allgemeinen Wissensstand über zwei Signalwege statt: Zum einen wird das auf körpereigenen MHC geladene Antigenfragment an den T- Zellrezeptor präsentiert, zum anderen findet eine Rezeptor-Ligand-Bindung zwischen dem B7.2 auf der Antigen-präsentierenden Zelle und CD28 auf der T-Zelle statt. Beide Signale sind für eine Aktivierung der T-Zelle erforderlich (Two- Signal-Model, siehe z.B. Bretscher P (1992) Immunol Today 1992 Feb;13(2):74- 6).
Eine Interaktion zwischen dem Tumorantigen-spezifischen T-Zellrezeptor und dem MHC-Molekül ist aber nach herrschender Meinung nur möglich, wenn beide Zellen denselben MHC-Typ tragen, also vom gleichen Patienten stammen. Im allogenen Fall ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle ist eine solche Interaktion bisher nicht bekannt, bzw. nachgewiesen worden. Somit ist der in den vorliegenden Experimenten nachgewiesene synergistische Effekt vollkommen über- raschend.
Die im obigen Beispiel gezeigte synergistische Wirkung der zwei Moleküle muss daher einen anderen Weg der T-Zellaktivierung nutzen. Ohne an irgendwelche Theorien gebunden zu sein, ist bekannt, dass NK-Zellen (natural killer cells) ebenfalls CD28 tragen, also den Rezeptor für B7.2 (Nandi D et al. (1994) J Immunol. l;152(7):3361-9; Amakata Y et al (2001) Clin Exp Immunol. 124(2):214- 22; Martin-Fontecha A et al. (1999) J Immunol. 15;162(10):5910-6; Yeh KY et al. (1995) Cell Immunol. 15;165(2):217-24).
NK-Zellen werden auch durch B7.2-Interaktion aktiviert. Allgemein wird jedoch angenommen, dass diese Interaktion lediglich zu einer Erhöhung der Zytokinpro- duktion führt (siehe Nandi D supra, Amakata Y supra, Marin-Fontecha A supra und Yeh KY supra), nicht jedoch zu einer erhöhten lytischen Aktivität. Diese Erhöhung der lytischen Aktivität von NK-Zellen konnte im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise nachgewiesen werden. Dadurch kann es im Falle einer allogenen Vakzinierung ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle zu einer verstärkten Lyse der Vakzinezellen und damit zur Freisetzung von Antigenen kommen, die anschließend effektiver von Antigen-präsentierenden Zellen des Patienten aufgenommen und an T-Zellen präsentiert werden können, als auch zur bereits beobachteten Ausschüttung verschiedener Zytokine, die T-Zellen und Antigen-präsentierende Zellen stimulieren. Diese Wirkung ist auch deshalb überraschend, da im Stand der Technik ein stimulierender Effekt von co- stimulatorischen Molekülen bei allogenen Vakzinen ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle bisher immer verneint wurde (Wu TC et al (1995) J Exp Med. 1;182(5):1415-21; Huang AY et al (1996) J Exp Med. 1;183 (3): 769-76), da ge- maß dieser Versuche eine Expression von B7 bei einer ersten Vakzinierung keinen Effekt zeigte.
Ferner trägt vermutlich zur Wirkung der allogenen Vakzine bei, dass anti- Allogen-reaktive T-Zellen, die fremden MHC-Moleküle erkennen, über B7.2 auf den allogenen Vakzinezellen stärker aktiviert werden. Dadurch werden erneut die Vakzinezellen besser lysiert und als Antigen-Quelle für Antigen-präsentierende Zellen zur Verfügung gestellt. Hierbei stellt das B7.2 einen Adjuvans-Effekt dar.
Dies bedeutet, dass im Gegensatz zu einer autologen Vakzine bzw. einer alloge- nen Vakzine mit einer zumindest teilweisen Übereinstimmung der MHC- Moleküle die immunstimulatorische Wirkung primär durch T-Zellen, hingegen bei einer allogenen Vakzine ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle durch NK-Zellen und allospezifische T-Zellen vermittelt wird, wobei die allospezifischen T-Zellen vermutlich nicht in der Lage sind, spezifisch die eigenen Tumor- zellen zu erkennen (Schnurr M et al. (2002) Cancer Res. 15;62(8):2347-52). Gemäß einer bevorzugten Ausfülirungsform enthält die erfindungsgemäß verwendete Tumorzelle einen oder mehrere Vektor/ Vektoren, der/die die Expression eines oder mehrerer der oben definierten Polypeptide bewirkt/bewirken.
Damit haben diese Vektoren oder dieser Vektor die Wirkung, dass in der Tumorzelle das Polypeptid exprimiert wird. Dies kann auf verschiedene Art und Weise geschehen. Zum einen kann der Vektor Kontrollsequenzen umfassen, welche die Expression des Polypeptids ausgehend von dem endogenen Gen des Polypeptids bewirken. Derartige Vektoren sind im Stand der Technik bekannt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor Nu- kleinsäuresequenzen, die für die oben genannten Polypeptide kodieren. Dabei sind die jeweiligen Nukleinsäuresequenzen im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise den oben aufgeführten Literaturangaben zu entnehmen. Im Stand der Technik ist grundsätzlich bekannt, wie ein Vektor zu konstruieren ist, damit ein Polypeptid exprimiert werden kann. (Sambrook J et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2πd ed., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor nicht- viralen Ursprungs, beispielsweise gängige Expressionsplasmide, oder viralen Ursprungs, vorzugsweise abstammend von AAV, HSV, Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, SV40.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt der Vektor episomal oder in das Genom der Zelle integriert vor.
Dies hängt in der Regel von dem Vektor selber ab. Im Stand der Technik ist bekannt, wie Vektoren konstruiert werden sollen, damit sie entweder episomal oder im Genom der Zelle integriert vorliegen (Sambrook J supra). Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der Vektor von AAV ab. AAV- Vektoren sowie davon abgeleitete Vektoren sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. WO 00/47757, WO 02/20748).
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform liegt der in der erfindungsgemäß verwendeten Tumorzelle enthaltene AAV- Vektor als Konkatemer in der AAV-Sl Akzeptorstelle vor.
Dies hätte den Vorteil, dass entsprechende AAV- Vektoren an einer Stelle im Ge- nom integriert vorliegen, von der bekannt ist, dass keine negativen Positionseffekte auftreten. Als Konkatemer vorliegend sind derartige Insertionen in das Genom zusätzlich stabiler und weisen durch die erhöhte Anzahl an Kopien eine stärkere Expression der Transgene auf. Der Nachweis des Vorliegens von Konka- temeren ist im Stand der Technik bekannt. Er kann beispielsweise über quantitati- ve PCR / Taqman PCR, quantitative in situ Hybridisierung oder Amplifizierung der Insertionstelle mit nachfolgender Längenbestimmung der amplifizierten DNA-Fragmente erfolgen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des Polypeptids durch einen konstitutiven, beispielsweise den CMN Promotor (Vincent et al (1990) Vaccine 90, 353, den SV40-Promotor (Samulski et al (1989) J Virol 63, 3822) oder den LTR-Promotor von Retroviren (Lipkowski et al (1988) Mol Cell Biol 8, 3988), einen induzierbaren, beispielsweise den tet-Promotor, und/oder einen gewebespezifischen, beispielsweise den Elongation Factor Pro- motor, den Ig Promotor oder den IL2/ΝFAT Promotor kontrolliert.
Die Promotoren können dadurch die Expression kontrollieren, dass sie entweder die Expression des Polypeptids ausgehend von den endogenen Genen kontrollieren oder dass sie die Expression der Polypeptide ausgehend von den im Vektor umfassten Nukleinsäuresequenzen kodieren. Im Stand der Technik ist eine Viel- zahl von Promotoren bekannt, die erfindungsgemäß verwendet werden können. (Sambrook J supra).
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsge- maß verwendete Tumorzelle proliferationsinkompetent, beispielsweise durch Bestrahlung oder chemische Inaktivierung.
Unter „proliferationsinkompetent" wird erfindungsgemäß verstanden, dass die Tumorzelle nicht mehr in der Lage ist, zu proliferieren.
Es ist beispielsweise bekannt, dass Tumorzellen durch eine garnma-Bestrahlung mit 25 - 100 Gy proliferationsinkompetent werden (siehe z.B. WO 97/32988). Für eine chemische Inaktivierung kann beispielsweise die Zugabe von 40 μg/ml Mi- tomycin verwendet werden.
Die durch die erfindungsgemäße Verwendung hergestellte Vakzine dient dazu, im Patienten eine Immunantwort auszulösen. In manchen Fällen ist es dazu nicht erforderlich, dass das Arzneimittel zusätzlich ein Adjuvans enthält. Dabei ist im Rahmen der Erfindung ein Adjuvans als eine Verbindung definiert, welche das Auslösen einer Immunreaktion verstärken kann.
In vielen Fällen ist es jedoch erforderlich, dass das Arzneimittel zusätzlich ein Adjuvans enthält. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält damit das Arzneimittel ein Adjuvans, vorzugsweise solche Adjuvantien, die als Toll-Like- Receptor-Agonisten wirken. Dies sind z.B. CpG Oligonukleotide. Hierbei handelt es sich um Oligonukleotide, die mindestens ein CpG Motiv enthalten (siehe z.B. Wagner H (2001) Immunity 14, 499-502).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Adjuvans von Bacillus Calmette- Guerin Zellwandgerüst (BCG-CWS) abgeleitet. Von BCG-CWS ist bekannt, dass es ein Ligand der Toll-like-receptors 2 und 4 ist und die Differenzierung von Im- munzellen auslösen kann (Matsumoto M et al (2001) Int Immunopharmacol 1, 8, 1559-69).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Adjuvans ein Supe- rantigen. Superantigene sind Antigene, die direkt an T-Zellrezeptoren und MHC- Moleküle binden und eine direkte Aktivierung der T-Zellen bewirken. Von Superantigenen ist bekannt, dass diese auch eine adjuvante Wirkung haben können (siehe z.B. Okamoto S et al (2001) Infect. Immun. 69,11, 6633-42). Bekannte Superantigene sind z.B. Staphylococcus aureus Enterotoxine A, B, C, D und E (SEA, SEB, SEC, SED, SEE), Staphylococcal aureus toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1), Staphylococcal exfoliating toxin oder Streptococcal pyrogenic exoto- xins.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Adjuvans ein Agens, das die Signal Wirkung von CTLA-4 inhibiert.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Arzneimittel geeignete Additive und/oder Bindemittel. Dabei umfasst das Additiv oder Bindemittel vorzugsweise 0,3 bis ca. 4 M, bevorzugt 0,4 bis ca. 3 M, insbesondere ca. 0,5 bis 2 M, ganz besonders bevorzugt ca. 1 bis ca. 2 M eines Salzes bei einem pH- Wert von ca. 7,3-7,45, insbesondere 7,4.
Vorzugsweise ist das Salz ein Alkali- oder ein Erdalkalisalz, insbesondere ein Halogenit oder ein Phosphat, insbesondere ein Alkalihalogenit, ganz besonders bevorzugt NaCl oder KC1.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pH- Wert mittels eines Puffers eingestellt, beispielsweise mittels eines Phosphatpuffers, eines Trispuffers, eines HEPES-Puffers oder eines MOPS-Puffers. Die Tumorzellen werden im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendungen in Mengen von vorzugsweise mindestens lxl 05, bevorzugt lxl 06, insbesondere lxl 07 Zelle pro Dosis verabreicht. Diese Mengen gelten sowohl für die prophylaktische als auch für die therapeutische Vakzinierung. Bei der prophylaktischen Vakzinierung werden die Zellen bevorzugt mindestens zweimal, besonders bevorzugt mindestens dreimal in Abständen von mindestens 2 Wochen, bevorzugt 4 Wochen, insbesondere 8 Wochen verabreicht.
Die Verabreichung ist in der Regel subkutan, intrakutan oder intranodal.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Individuum derselben Spezies wie der Patient ab.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Patient ein Säu- getier, vorzugsweise ein Mensch.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform bewirkt die im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung hergestellte Vakzine eine Aktivierung der lytischen Aktivität von NK-Zellen.
Verfahren zum Messen der Aktivierung der lytischen Aktivität von NK-Zellen sind im Stand der Technik bekannt (Current Protocols in Immunology, Kapitel 7.18, 7.7.4-7.7.5, 7.7.8-7.7.10, John Wiley & Sons, 2002).
Gegenstand der Erfindung ist femer die Verwendung einer ein costimulatorisches Polypeptid exprimierenden Tumorzelle zur Herstellung einer Vakzine zur Erhöhung der lytischen Aktivität von NK-Zellen bei der Behandlung oder Vorbeugung eines Tumors in einem zur Tumorzelle allogenen Patienten.
Wie bereits oben aufgeführt bedeutet der Ausdruck „allogen" im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass zwei Individuen (oder ein Individuum und die zur Nakzinierung verwendete Zelle) bzgl. ihrer Antigene unterschiedlich sind. Dies bedeutet in der Regel, aber nicht notwendigerweise, dass sie bzgl. ihren HLA- Antigenen unterschiedlich sind. Dabei ist ausdrücklich eingeschlossen, dass die beiden Individuen teilweise in ihren HLA-Genen übereinstimmen. Ebenso ist eine vollständige Übereinstimmung oder keine Übereinstimmung der HLA-Gene eingeschlossen. In ersterem Fall ist dann zumindest ein weiteres Antigen zwischen den Individuen (oder der Zelle und dem Patienten) unterschiedlich.
Im Rahmen der Erfindung hat es sich wie oben dargestellt überraschenderweise gezeigt, dass die durch das costimulatorische Molekül bewirkte Aktivierung der lytischen Aktivität von ΝK-Zellen eine Behandlung von bzw. eine Vorbeugung vor Tumoren ermöglicht. Dies ermöglicht erstmals, ein Patientenkollektiv mit einer allogenen Vakzine zu behandeln, die eine ein costimulatorisches Polypeptid exprimierende Tumorzelle umfasst, ohne dass es erforderlich ist, den HLA-Typ des Patienten zu bestimmen und die allogene Vakzine an den HLA-Typ anzupassen. Damit ist es erstmals möglich, dass alle Patienten unabhängig von ihrem HLA-Typ von einer derartigen allogenen Vakzine profitieren können.
Für das costimulatorische Polypeptid, die Tumorzelle, den Tumor, die Vakzine und den Patienten gelten dieselben Ausführungsformen wie oben im Rahmen der anderen erfindungsgemäßen Verwendung dargestellt. Erfindungsgemäß ist ebenfalls eingeschlossen, dass Patient und Tumorzelle in ihren HLA-Antigenen teilweise übereinstimmen.
Gegenstand der Erfindung ist femer ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung in einem Patienten, bei dem man dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge einer ein costimulatorisches Polypeptid exprimierenden Tumorzelle verabreicht, wobei die Tumorzelle und der Patient keine Übereinstimmung ihrer MHC- Komplexe aufweisen. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung in einem Patienten, bei dem man dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge einer ein costimulatorisches Polypeptid exprimierenden Tumorzelle verabreicht, was eine Aktivierung der lytischen Aktivität von NK-Zellen bewirkt, wo- bei die Tumorzelle zum Patienten allogen ist.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren gelten für das costimulatorische Polypeptid, die Tumorzelle, den Tumor, die Vakzine und den Patienten dieselben Ausführungsformen wie oben im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendungen dargestellt.
Die Erfindung eröffnet völlig neue Perspektiven für die Behandlung von Tumorpatienten.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 beschreibt die graphische Auswertung eines intrazellulären IFN-γ-Tests. Die anhand von Immunfärbung gemessene IFNγ-Ausschüttung wurde von HLA- A2-positiven Spender-T-Zellen ermittelt, die mit Mel29 Tumorzellen mit HLA- Übereinstimmung (oben) oder mit Mel 62 Tumorzellen ohne HLA- Übereinstimmung (unten) stimuliert worden waren. In beiden Fällen wurden B7.2 transduzierte mit untransduzierten Tumorzellen verglichen.
Fig. 2 beschreibt bei einer therapeutischen Vakzinierung im Lungenmetastasen- modell die durchschnittliche Anzahl der Lungenmetastasen pro Gruppe.
Fig. 3 beschreibt bei einer therapeutischen Vakzinierung im Lungenmethastasen- modell das durchschnittliche Lungengewicht der Gruppen. Fig. 4 beschreibt die graphische Auswertung eines Chromiumfrei- setzungsexperiments, bei dem die Freisetzung von 51Cr aus entsprechend markierten Melanomzellen in unterschiedlichen Verhältnissen von Effektor (NK- Zellen) und Target-Zellen (Melanomzellen) gemessen wurde. Die NK-Zellen waren aus der Inkubation von PBLs mit untransduzierten oder B7.2 transduzierten Melanomzellen hervorgegangen.
Fig. 5 beschreibt die graphische Auswertung eines Experiments, bei dem untrans- duzierte bzw. mittels rAAV mit B7.2 oder mit B7.2 und GM-CSF transduzierte Melanomzellen für 5 Tage mit PBLs inkubiert wurden und deren Proliferation anhand des Einbaus von H-Tdr gemessen wurde.
Fig. 6 beschreibt die graphische Auswertung eines Maus-Vakzinierungs- experiments mit präimplantierten Tumoren, in dem autologe und allogene Vakzi- nierungsstrategien miteinander verglichen werden. Für die Vakzinierung verwendete Zelllinien sowie von diesen exprimierte Transgene sind auf der X-Achse aufgetragen; ausgewertet wurde die relative Tumorlast in %.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von für Melanom- Antigene spezifischen T-Lymphozyten
Zellen/Material:
- Mel 29: von Melanom-Patient abgeleitete Melanom Zellinie, HLA-A2.01 positiv, Untransduziert oder B7.2/GMCSF-transduziert; - Mel 62: von Melanom-Patient abgeleitete Melanom Zellinie, HLA-A2.01 negativ, Untransduziert oder B7.2/GMCSF-transduziert;
- T2 Zellen: TAP-defiziente lymphoblastoide Zellen; diese wurden mit einem Komplex aus HLA-A2.01 restringierten Melanom-Peptiden beladen;
Peripheral Blood Lymphocytes (PBLs) eines gesunden Spenders, HLA-A2.01 positiv;
rAAV B7.2
Primäre Stimulation der PBMC
Melanomzellen werden ausgesät in einer Dichte von 3,8x104 Zellen in jeweils 1 ml Medium (DMEM mit 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, lx Antibiotic- Antimycotic, lx MEM Vitamins; Gibco-BRL) in drei Wells einer 24-Well Platte. Am nächsten Tag werden die Zellen mit 100 Gy bestrahlt und mit 20 μL rAAVB7.2/GM-CSF-Virus (entspricht MOI 84) infiziert. Nach Inkubation für 48 h bei 37°C, 5 % CO2 wird der Kulturüberstand von den transduzierten Melanomzellen abgesaugt und 2,5x106 PBMC von einem HLA- A2 -positiven Spender zugegeben.
B. Restimulation der PBMC
Nach 1 Woche werden die PBMC mit peptidbeladenen PBMC restimuliert. Hierzu werden l,5xl07 PBMC des selben Spenders mit 10 μg/μl MARTmut-Peptid mit der Sequenz ELAGIGILTV versetzt und für 4 h bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Danach werden die Zellen mit T-Zell-Medium mit 10 % Humanserum und 0,4 U/mL IL-2 (Boehringer Ingelheim) verdünnt bis zur Endkonzentration der Peptide von 0,5 μg/ml und Zellen von 3-4x105/ml. Vo primären Stimulations- Ansatz wird 1 ml Kulturüberstand abgesaugt und 3- 4xl05 peptidbeladene PBMC in 1 ml hinzugefügt.
Zwei Wochen nach primärer Stimulation werden die Zellen wie oben beschrieben restimuliert. Sechs Tage später werden die Zellen zum dritten Mal restimuliert. Zu diesem Zweck werden T2-Zellen (TAP-defizientes B-Zell-Lymphom) wie oben beschrieben mit Peptid beladen, danach mit 100 Gy bestrahlt und lxl 05 Zellen dem Stimulations-Ansatz zugefügt. Die Restimulation erfolgt ohne IL-2.
C. Analyse der Produktion von IFN-γ in CD8+ T-Zellen durch intrazelluläre FACS-Färbung
Am Tag nach der dritten Restimulation wird eine intrazelluläre IFN-γ-Färbung durchgeführt. Die Zellen werden weiter kultiviert und der Assay wird eine Woche später wiederholt.
Um die Produktion von IFN-γ in den T-Zellen zu stimulieren, werden sie mit peptidbeladenen Antigen-präsentierenden Zellen inkubiert. T2-Zellen werden auf eine Konzentration von lxl 06 Zellen/ml eingestellt und mit 10 μg/ml Martmut- Peptid bzw. HIV-Peptid versetzt. Davon werden 50 μl pro Well in einer 96-well Rundbodenplatte ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.
Ein Aliquot der restimulierten PBMC wird geemtet, in Assay-Medium (RPMI 1640, Gibco BRL, Cat# 21875-034; 1 mM Na-Pyruvat; 2 mM L-Glutamin; lx MEM Non-Essential Amino Acids; 50 μg/ml Gentamicin; frisch versetzt mit 10 % Humanserum; 0,8 U/ml IL-2) resuspendiert und auf lx 107/ml eingestellt. Davon werden 50 μl Zellsuspension zu den mit Peptid beladenen T2-Zellen hinzugefügt. Um die Interaktion der Zellen zu verbessern, wird die Platte für 1 min bei 1200 rpm, 4°C zentrifugiert. Nach Inkubation für 1 h bei 37°C und 5 % CO2 werden 10 μl einer 1:100 in RPMI verdünnten Monensin-Lösung (3 mM Monensin in 100 % Ethanol, Sigma) zugegeben. Die Zellen werden für 5 h bei 37°C und 5 % CO inkubiert, für 2 min bei 1200 rpm, 4°C zentrifugiert und der Überstand entfernt. Danach werden pro Well 100 μl Cytofix/Cytoperm-Lösung (Pharmingen) zugegeben, die Zellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut resuspen- diert und für 20 min auf Eis inkubiert. Durch Zentrifugation für 2 min bei 1200 rpm werden die Zellen geerntet, der Überstand wird abgekippt und die Zellen durch leichtes Nortexen resuspendiert. Nach 2maligem Waschen mit jeweils 100 μl Perm/Wash-Lösung (Pharmingen; 1:10 verdünnt in Aqua bidest.) und Zentrifu- gieren (wie oben beschrieben) werden die Zellen gefärbt. Es werden jeweils 20 μl folgender Antikörper, 1/50 verdünnt in lx Perm/Wash-Lösung, zugegeben: anti- IFN-γ-FITC (Caltag, Cat# MHCIFG01), anti-CD8-PE (Becton Dickinson, Cat# 30325X) und anti-CD4-Cychrome (Becton Dickinson, Cat# 30158X), die Platte kurz gevortext und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden 2x mit jeweils 100 μl Perm/Wash-Lösung gewaschen, die Zellpellets in jeweils 150 μl PBS/0,5 % BSA resuspendiert und in Micronic-Röhrchen überfuhrt. Danach werden die Proben im FACS vermessen.
Bei T-Zellen, die ursprünglich mit Mel62-B7.2/GM-CSF stimuliert worden waren, zeigte sich eine spezifische intrazelluläre IFN-γ-Färbung, während die Sti- mulation mit untransduzierten Mel62 keinen Effekt hatte. Die Produktion von IFN-γ war Peptid-spezifisch, da mit HlV-Peptid beladene T2-Zellen wirkungslos waren. Das Ergebnis wurde eine Woche später bestätigt.
Aus Fig. 1 wird deutlich, dass die Aktivierung der T-Zellen unabhängig davon ist, ob die Spender-T-Zellen mit den Stimulationszellen (Mel29 oder Mel62) eine Übereinstimmung der HLA-Haplotypen besitzen oder nicht. In beiden Fällen wurde deutlich, dass die Aktivierung der T-Zellen durch B7.2-transduzierten Melanomzellen erheblich stärker ausfiel als durch untransduzierte Melanomzellen. In weiteren Experimenten mit Kontroll- Vektoren konnte gezeigt werden, dass dieser Effekt von der B7.2-Expression abhängig war. Die getesteten Antigene waren Martl/MelanA, gplOO, und Tyrosinase (Peptid-Pool).
Die Spezifität für diese Melanom-abgeleiteten Antigene wurde im Vergleich zu einem Kontroll-Peptid vom HIV-gpl20 gezeigt. Ansteigende Zahlen spezifischer T-Zellen wurden beobachtet, wenn eine allogene Stimulation mit HLA-A2- Übereinstimmung (Mel29, Figur 1 oben) als auch wenn eine allogene Stimulation ohne HLA-Übereinstimmung (Mel62, Fig. 1 unten) durchgeführt wurde. In die- sem experimentellen System kommt das antigene Signal von Tumorantigenen, die endogen von der Melanomzelle exprimiert werden und von einem MHC-Molekül präsentiert werden, das sowohl der Stimulator-Zelle als auch der T-Zelle gemeinsam ist (HLA-A2-Übereinstimmung). In der Situation ohne HLA- Übereinstimmung ist die Aktivierung einer T-Zelle abhängig von der Präsentation der Melanomantigen durch induzierte Antigen-präsentierende Zellen (APCs), wie zum Beispiel Dendritische Zellen („Cross-Priming").
Beispiel 2
Vergleich autologe/allogene Vakzinierung zur Behandlung von präimplantierten Tumoren im Tiermodell
Versuchszusammenfassung: Art/Stamm: Maus, C3H/He (H-2k) Alter. Geschlecht: 6-10 Wochen, weiblich Körpergewicht: 30 g
Testkomponenten: B16F10-HEL-wt Zellen (H-2b), transfiziert mit B7.2 und/oder GM-CSF pAAV-Plasmid K-1735-HEL (H-2k), transduziert mit rAAV-B7.2/GM-CSF
Dosis, Route: s.c, 3xl05 Zellen Versuchsziel: Prävention/Herauszögern der Tumoransiedelung bzw. des Tumorwachstums bei B7.2/GM-CSF Vakzinierung im Vergleich zu Kontrollvakzinen.
Design: 1,2 x 105 unmodifizierte K1735-HEL Zellen (außer Experiment TV19: 1,0 x 105 Zellen) wurden i.v. in C3H/He Mäuse injiziert. Vier und 11 Tage später wurden die Tiere mit genetisch modifizierten (Shastri,University of CA, Berkeley, CA, USA) und bestrahlten Varianten der allogenen Linie B16F10-HEL und syngenen (entsprechend einer autologen) Linie K1735-HEL s.c. immunisiert (Dosis: 3xl05 Zellen). Die Entstehung von Tumom etastasen in der Lunge wurde an Tag 21 nach Challenge mittels Sektion und auswiegen der Lungen untersucht.
Herstellung HEL-exprimierender Tumorzellen:
Für die Herstellung stabiler Transfektanten der Melanomzellinien B16F10 (Prof. Isaiah J. Fidler, MD Anderson Cancer Centre, Texas, USA), und K-1735 (Dr. Souberbielle, King's College, London) wurde der Expressionsvektor pcDNA3neo-HEL kloniert. Dazu wurde das HEL-Gen aus dem Vektor pcDNAl- HEL (Shastri,University of CA, Berkeley, CA, USA) herausgeschnitten und in den Expressionsvektor pcDNA3neo (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) ligiert, der eine Neomycinrestistenzgen beinhaltet, das der Selektion positiver Klone dient.
Die Transfektion von B16F10 und K-1735 Zellen wurde mittels Lipofectamine® (# 11668, Invitrogen, Carlsbad CA, USA) auf 15cm-Kulturschalen durchgeführt. Positive Zellen wurden mittels G418-enthaltendem Medium selektiert (800 μg/ml). Nach 2-3 Wochen wurden einzelne Klone gepickt und expandiert. Die Klone wurden auf Expression des Transgens mittels RT-PCR und Westem Blot untersucht. Die beiden Klone mit der besten Expressionrate wurden für Vakzinie- rungsexperimente ausgewählt.
RT-PCR:
RNA Präparation wurde aus 2 - 5 x 106 Zellen mit QIAshredder Säulen (# 79654, QIAgen®, Hilden) und dem RNeasy Kit (# 74104, QIAgen®, Hilden) durchgeführt.
DNA (z.B. episomale Plasmid DNA) wurde mit RNAse-freier DNAse entfernt (# 776785, Röche®, Basel).
RNA wurde in cDNA transkribiert mit dem Kit 'Gene Amp RNA PCR Core Kit' (Applied Biosystems for Röche®, # N 808-0143, Foster City, CA, USA)
PCR auf HEL und ß-Actin wurde mit dem 'Taq-Mastermix Kit' (# 1007 544, QIAgen, Hilden) und den folgenden Primem durchgeführt:
HEL-up 5*- AGG TCT TTG CTA ATC TTG GTG C - 3' HEL-down 5'- GGC AGC CTC TGA TCC ACG - 3' mu ß-Actin-up 5*- GAT CCT GAC CGA GCGTGG CTAC - 3' mu ß-Actin-down 5'- CAA CGT CAC ACT TCA TGA TGGAAT TG - 3'
Das amplifizierte HEL Fragment hatte ein Länge von 430 bp, das amplifi- zierte Fragment von murinem ß-Actin eine Länge von 290 bp.
Western Blot:
• Zellen wurden mit 'cell lysis buffer' lysiert • Lysate wurden mit DTT-haltigem Ladepuffer auf 12%ige Polyacrylamid- Gele geladen. • Hen egg lysozyme (Sigma®, # L-6876, Deisenhofen) wurde als Standard verwendet.
• Transfer auf Nitrocellulosemembranen wurde mittels eines 'semi-dry'- Transfersystems durchgeführt. • Blockieren unerwünschten Hintergrundes, sowie Antikörper-
Inkubationsschritte wurde in 5% Milchpulver in TBST durchgeführt (Tris- buffered saline, 0,01% Tween (TBST))
• Antikörper: biotinylated anti HEL in einer Verdünnung von 1 :200 eingesetzt (RDI, # RDI-Lyszym-BT, Flanders, NJ). • Streptavidin-HRP: in einer Verdünnung von 1 :5.000 eingesetzt (Sigma®, # S- 5512, Deisenhofen)
• Super Signal (Pierce®, # 34080, Rockford IL, USA) wurde als Substrat für die Chemillumineszenzreaktion eingesetzt. Röntgenfilme wurden zwischen 30 Sekunden und bis zu 1 Stunde mit den Blots belichtet.
Herstellung B7.2 und GM-CSF exprimierender K1735-HEL Vakzinezellen:
K1735-HEL Zellen, die murines B7.2, GM-CSF oder beide Moleküle exprimieren, wurden durch Transduktion mit rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (AAV) erzeugt. Dafür wurden die Plasmide pAAV-muGMCSF und pAAV-muB7.2 klo- niert: Die cDNA von GM-CSF und B7.2 wurden in den Vektor pCI (Promega, Madison, WI, USA) kloniert, der einen CMV-Promotor und eine SV40 3'- untranslatierte Region zur Verfügung stellt. Für das Plasmid pAAV-GM-CSF wurden zwei Expressionskassetten - die GM-CSF mit dem CMV-Promoter und der SV40-pA-site beinhalten - in Tandem in das Plasmid pAAV-Basisvektor li- giert (siehe WO 00/47757, Beispiel 4). Um die ideale Größe für die Virusverpak- kung zu gewährleisten, wurden zudem weitere 400 bp aus pUC19 (bp 1516-1910) in den Vektor integriert.
Für das Plasmid pAAV-B7.2 wurde die Expressionskassette - mit B7.2, dem CMV-Promotor und der S V40-pA-site - in das Plasmid pAAV-Basisvektor ligiert. Weitere 700 bp aus pUC19 (bp 1201-1910) waren nötig, um die optimale Größe des Vektors zu erzeugen.
Produktion von rekombinantem AAV:
Heia T Zellen wurden mittels Calciumphosphat-Copräzipitation mit 2 Plasmiden gleichzeitig transfiziert: mit dem Vektorplasmid pAAV-muGM-CSF oder pAAV- muB7.2 und dem AAV-Helferplasmid pUC"rep/cap"(RBS)D37, das die AAV- Gene für 'rep' und 'cap' von AAV2 trägt (siehe WO 00/47757).
Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit Adenovirus infiziert. Vier Tage später erfolgte die Lyse der Zellen durch einen 3maligen Frier-tau-Zyklus bei -20°C und 37°C. Überstände wurden abgenommen, Debris abzentrifugiert und kontaminierender Adenovirus durch Behandlung bei 60°C für 30 Minuten inaktiviert. Nähere Angaben zur AAV-Herstellung sind der Patentpublikation WO 00/47757 zu entnehmen.
K-1735-HEL Zellen wurden bestrahlt (lOOGy) und mit dem AAV infiziert. Für optimale GM-CSF Expression (200-300 ng/106 Zellen in 48h) wurden normaler- weise ca. 700 μl des Virus rAAV-muGMCSF für 5 x 106 Zellen eingesetzt. Für optimale B7.2 Expression (70% - 96%) waren ca. 4 ml des Virus rAAV-muB7.2 für 5 x 106 Zellen nötig. Nach 2 Tagen wurden die Zellen geerntet, eingefroren (FCS, 10% DMSO) und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Um Zellen für die Applikation an Mäuse vorzubereiten, wurden diese im 37°C- Wasserbad aufgetaut, dreimal in PBS gewaschen und auf die richtige Zellzahl eingestellt (3 x 105 Zellen pro Dosis in PBS).
Herstellung von B7.2 und GM-CSF exprimierenden B16F10-HEL Vakzinie- rungszellen: B16F10 Zellen können mit rAAN nicht effizient transduziert werden. Daher wurde die Transfektion mit dem Liposom Polyfect (QIAgen®' Hilden) durchgeführt, um Vakzinezellen für allogene Vakzinierungsexperimente zu erzeugen. Für die Herstellung transienter Transfektanten wurde die Melanomzelllinie B16F10-HEL mit den Vektoren pAAV-muGMCSF und pAAV-muB7.2 einzeln oder in Kombination transfiziert. Die Zellen wurden in Zellkulturflaschen ausgesäht (1,66 x 10 pro T75) und am folgenden Tag nach Herstelleranweisung transfiziert. Für die Expression von B7.2 wurden 9 μg Plasmid, für GMCSF 8 μg und für die Kombination der Moleküle 8μg B7.2- und 6 μg GMCSF-Plasmid eingesetzt. Am folgen- den Tag wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. An Tag 2 wurden die Zellen mittels Trypsinierung geemtet, bestrahlt (100 Gy) und eingefroren. Die Lagerung der Zellen erfolgte in flüssigem Stickstoff. Als Νegativkontrolle dienten Wildtyptumorzellen, da eine Transfektion mit dem pAAV-Basisvektor aufgrund toxischer Nebenwirkungen nicht möglich war.
Die Expression der Transgene wurde für GM-CSF mittels ELISA und für B7.2 mittels Durchflusszytometrie gemessen.
Um Zellen für die Injektion in Mäuse vorzubereiten, wurden diese im 37°C- Wasserbad aufgetaut, dreimal in PBS gewaschen und auf die richtige Zellzahl eingestellt (3 x 105 Zellen pro Dosis in PBS).
Detektion von GM-CSF und B7.2 Expression:
Sezemiertes GM-CSF wurde 48h nach Aussaat im Überstand transduzierter oder transfizierter Zellen bestimmt. Verwendet wurde der 'Enzyme linked immuno sorbent assay' (ELISA) Kit OptEIA Mouse GM-CSF Set von Pharmingen (San Diego, USA). B7.2 Expression wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des Antikörpers GL1 gemessen (Pharmingen, Heidelberg).
Analyse der Lungenmetastasen: Die Mäuse wurden mittels zervikaler Dislokation an Tag 21 nach Challenge getötet. Die Lungen wurden unmittelbar danach entnommen, auf einer Analysenwaage gewogen und anschließend in Bouin's Solution fixiert (85% Pikrinsäure, 10% Formaldehyd, 5% Eisessig). Die Anzahl an Metastasenknoten wurde unter einen Mikroskop bestimmt durch Auszählen bestimmt.
Auswertung
In den untersuchten Tiermodellen der Maus konnte beobachtet werden, dass bei der Therapie von präimplantierten Tumoren der allogene Vakzinierungsansatz ebenso gut funktioniert wie der autologe Ansatz. Fig. 2 zeigt, dass sich die Gruppe B16 B7.2/GMCSF (allogen) statistisch nicht von der Gruppe Kl 735 B7.2/GM- CSF (autolog) unterscheidet. Femer zeigt die Koexpression von B7.2 und GM- CSF einen synergistischen Effekt.
Dies ist insbesondere im Hinblick auf die Wirkung von B7.2 bei allogener Vakzinierung von Belangen. Wie bereits zuvor erläutert, ist eine Wirkung von B7.2 bei allogener Vakzinierung ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle durch direkte Aktivierang von Antigen-spezifischen T-Zellen nicht möglich. Dass dennoch ein Effekt eintritt, aber nur in Kombination mit einem weiteren immunstimulatori- schen Prinzip - hier zusammen mit GMCSF - zeigt dieses Beispiel. Als Wirkungsweise wird wie bereits erläutert, die Aktivierung von Natürlichen Killerzellen und die Stimulation anti-allogen-spezifϊscher T-Zellen angesehen.
Die statistische Auswertung des Experimentes im Student's T-Test ergab folgende p-Werte für den Vergleich der jeweils aufgeführten Gruppen:
Dies zeigt die deutliche Überlegenheit der Kombination von B7.2 und GMCSF gegenüber alleiniger Anwendung der beiden Transgene bei allogener Vakzinierung. Die Unterschiede sind statistisch signifikant.
Fig. 3 zeigt, dass die Expression von B7.2 alleine einen positiven Effekt hat. Sie zeigt den Einfluss von B7.2 auf die Ausbildung einer Antitumorantwort auch im allogenen System ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle. Dennoch ist die Kombination mit dem Zytokin GMCSF von Nutzen, da hierbei eine stärkere Im- munantwort ausgelöst wird, die sich in einer reduzierten Tumorlast manifestiert.
Die gemeinsame Auswertung von drei gleichartigen, aber unabhängigen Tierexperimenten ist in Figur 6 dargestellt. Hierbei zeigt sich die klare Überlegenheit der Kombination von B7.2 und GMCSF gegenüber den Einzelmolekülen. Dieser sy- nergistische Effekt ist besonders bedeutsam. Die synergistische Wirkung der Moleküle tritt sowohl bei autologer Vakzinierung, wo B7.2 einen direkten Effekt auf die T-Zellaktivierung ausüben kann, als auch bei allogener Vakzinierung ohne Übereinstimmung der MHC-Moleküle auf, wo lediglich indirekte Effekte über NK-Zellen und allo-reaktive T-Zellen denkbar sind. Dies unterstreicht die interes- sante Entdeckung, dass B7.2 trotz bisher gegenteiliger Meinung auch bei allogener Vakzinierung eine immunstimulatorische Wirkung ausübt. Die Ergebnisse der drei Experimente wurden relativ zueinander gewichtet, indem jeweils das mittlerer Lungengewicht der Gruppen bei Tieren ohne jegliche Manipulation (Leerwert) gleich 0 % und das der Gruppe, die mit Wildtypzellen vakziniert wurden als 100 % gesetzt wurden. Die einzelnen Versuchsgruppen wurden dann bezüglich ihres Lungengewichtes prozentual dazu gewichtet. Für alle drei Experimente wurde dann ein Mittelwert gebildet.
Die statistische Auswertung dieser Werte im Student's T-Test ergab folgende p- Werte für den Vergleich der jeweils aufgeführten Gruppen:
Die Unterschiede sind somit statistisch signifikant.
Beispiel 3
Effekt von B7.2-exprimierenden Zellen auf NK-Zell-induzierte Zelllyse
Die experimentelle Analyse einer postulierten Funktion einer Melanomvakzine in einem humanen Versuchsauf bau birgt mehrere Einschränkungen bezüglich zu den einsetzbaren Methoden und den Parametern, die untersucht werden können. Die Messung eines Effekts von zellulär-produziertem GM-CSF ist beschränkt auf die Induktion der Differenzierung von Monozyten zu (Prä)-Dendritischen Zellen. Der chemotaktische Effekt ist ein Parameter, der lediglich in vivo analysiert werden kann. Der Effekt von B7.2 (CD86) hingegen kann einfach in T-Zell Aktivierungsversuchen und NK-Zell Assays untersucht werden, wie diese in den folgenden Beispielen beschrieben sind.
Versuchszusammenfassung
Zellen/Material: von einem Patienten abgeleitete Melanomzelllinie Mel 29
Periphere Blut Lymphozyten (PBLs) eines gesunden Do- nors
Testkomponenten: Mel 29 Zellen: untransduziert bzw. transduziert mit B7.2 Versuchsziel: Analyse des Effekts von B7.2 auf die NK-Zell-vermittelte
Lyse von Melanomzellen Design: PBLs wurden frisch isoliert, über einen Ficoll-Gradienten aufgereinigt und über Nacht bei verschiedenen E/T- Verhältnissen mit 2x103 51Cr-markierten Zellen, die entweder untransduziert oder mit B7.2 transduziert waren, inkubiert. Die Freisetzung von 51Cr von lysierten Zellen wurde gemessen.
Durchführung
Ernten der Melanomzellen und Markieren mit 51Chrom (Targetzellen):
Zellen in einer T80-Flasche werden abgelöst und bei 175xg für 5 min abzentrifu- giert. Das Zellpellet wird in 2-5 ml Assay-Medium (RPMI1640, Gibco mit 5% FCS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Na-Pyruvat, lx Non-essential Arninoacids, 50 μg/ml Gentamicin) resuspendiert und die Zellen werden gezählt.
Zum Markieren mit Chrom werden 100-200 μl der Zellsuspension in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt (Zellzahl: bis 1E+6). Nach Zugabe von 20-50 μl 51Cr werden die Zellen für 45 min bis 60 min bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Die Zellen werden 2 x gewaschen und auf 2000 Zellen pro 100 μl Medium verdünnt.
Titration der Effektorzellen = PBMNC aus buffy coat, frisch isoliert:
PBMNC werden auf eine Zellzahl von 6,7E+6/ml in Assay-Medium eingestellt, davon werden 150 μl in die erste Reihe einer 96-well Rundboden-MTP pipettiert. Es werden daraus insgesamt 6 Titerstufen hergestellt in 1:3 Verdünnungschritten.
Zusammenpipettieren von Effektor- und Targetzellen:
Jeweils 100 μl Targetzellsuspension werden zu 100 μl Effektor-Titration pro well pipettiert. Zur Ermittlung des Spontan-Release der Zellen werden 100 μl Target- zellsuspension mit 100 μl Assay-Medium versetzt. Die Zellen werden für ca. 16 h bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Danach werden 100 μl Targetzellsuspension mit 100 μl 2%igem Triton X-100 versetzt zur Ermittlung des Maximal-Release.
Ernten der Kulturüberstände und Messung am Top Count:
Fünfzig μl der Kulturüberstände werden in Luma-Plates überpipettiert und die Platten werden über Nacht getrocknet. Die getrockneten Platten werden im Top Count gemessen.
Ergebnisse
Wie in Fig. 4 ersichtlich wurde die NK-Zell-vermittelte Lyse von Melanom- Zellen durch die Expression von B7.2 durch die Mel29-Zellen deutlich verstärkt. Ähnliche Ergebisse wurden mit einer zweiten Melanomzelllinie, Mel 62, erhalten (Daten nicht gezeigt). Insgesamt zeigten drei von fünf Spendern eine vergleichbare Zunahme ihrer NK-Zell-Aktivität vergleichbar mit der aus Fig. 4. Diese Ergebnisse zeigen somit die Zunahme der NK-Zell-vermittelten Lyse von Tumorzellen als Folge der B7.2-Expression auf entsprechenden Tumorzellen. Folgen einer der- artigen Zunahme der NK-Zell-Aktivität sind (1) die Freisetzung von Cytokinen, (2) die Freisetzung von Tumorantigen und (3) die Aktivierung von DC Zellen durch die Interaktion von CD40 und CD40L. Wie bereits ausgeführt, ist es bekannt, dass diese Folgen die effiziente Aktivierung von T-Zellen gegen die von den Melanomzellen abgeleiteten Tumorantigene unterstützen.
Beispiel 4
Direkte Aktivierung von humanen T-Lymphozyten (alloreaktive T-Zell- Antwort)
Versuchszusammenfassung Zellen/Material: von einem Patienten abgeleitete Melanomzelllinien Mel
R3, Mel 29, Mel 66, Mel 68, SkMel63
PBLs eines gesunden Spenders
Testkomponenten: von einem Patienten abgeleitete Melanomzellen trans- duziert mit:
B7.2
B7.2/GM-CSF ■ Untransduziert
Versuchsziel: Analyse der T-Zellproliferation durch 3H-Tdr Einbau Design: 104 Melanomzellen wurden mit 100 Gy bestrahlt und wurden mit 2.5x105 PBLs in 96 Wellplatten für 5 Tage bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde 3H-Tdr (0.5 μCi) pro well zugegeben und die Inkubation für 18 Stunden fortgesetzt. 3H-Tdr Einbau wurde durch Flüssig- Scintillationszählung bestimmt.
Durchführung
Stimulation:
Pro well einer 96-well Rundboden-Mikrotiterplatte werden 1E+5 PBMNC/100 μl mit 1E+4 bestrahlten (100 Gy) Melanomzellen/100 μl (Endvolumen 200 μl) für 5 d bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Kulturmedium = RPMI1640 mit L-Glutamin mit Zusätzen: 10 % Humanserum, 1 % L-Glutamin, 1 % Natrium-Pyruvat, 1 % Non- essential-Aminoacids und 0,1 % Gentamicin.
Inkubation der Proben mit H-Thymidin
Von jedem well werden 100 μl des Kulturüberstandes abpipettiert, danach 50 μl Kulturmedium mit 1 μCi 3H-Tymidin pro well zugegeben und anschließend für 16 h bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Ernte der Proben und Messung der Radioaktivität:
Die Proben werden mit einem halbautomatischen Probenernte-Gerät auf Glasfi- ber-Filtermatten gefällt. Die Filter werden im Trockenschrank bei 60 °C mindestens 1 h getrocknet (oder über Nacht). Die getrockneten Filter werden in Folie eingeschweißt und mit μ-Scintillatorflüssigkeit benetzt. Anschließend wird die μ- Strahlung der Proben im Filter in einem Radioaktivitätsmessgerät für μ-Strahlung gemessen (cpm).
Ergebnisse
Melanomzelllinien, die mit B7.2 alleine oder mit B7.2/GM-CSF transduziert waren, führten zu einer deutlich stärkeren Proliferation der T-Zellen als untransdu- zierte Kontroll-Zelllinien (siehe Fig. 5). Dabei wird der antigene Stimulus primär durch die fremden MHC Moleküle geliefert.
In einer getrennten Versuchsreihe wurden Melanomzellen mit ansteigenden Mengen an B7.2-Expression verwendet, um T-Zell-Proliferation zu induzieren. Dabei wurde herausgefunden, dass das Maximum der gemessenen T-Zellaktivierung nahe bei einer B7.2 Expressionsrate von 30% positiven Zellen lag (Daten nicht gezeigt). Ferner soll angemerkt werden, dass die Transduktion von Melanomzellen mit den Kontrollproteinen GFP (green fluorescence protein) oder lacZ (durch Infektion mit rAAV) lediglich unbedeutenden Einfluss auf die T-Zell- Proliferation hatte, und zwar signifikant weniger als der Einfluss durch die B7.2 Expression. Dies bestätigt dass der beobachtete Anstieg der T-Zell-Proliferation von der Expression des B7.2 abhängig war.
In dem vorliegenden in vitro Versuch konnte kein Unterschied zwischen B7.2 und B7.2/GM-CSF transduzierten Zellen beobachtet werden (siehe Fig. 5). Dies kann dadurch erklärt werden, dass GM-CSF chemotaktische und aktivierende Effekte auf Monozyten und DCs ausübt, hingegen kaum Effekte auf die Proliferation vom T-Lymphozyten hat. Derartige positive Effekte durch die GM-CSF Expression müssen somit in in vivo Modellen untersucht werden.
Beispiel 5
Generierung von Melanomantigen-spezifischen T-Lymphozyten
Versuchszusammenfassung
Zellen/Material: von einem Patienten abgeleitete Melanomzelllinien Mel 29 (HLA A2.01 positiv), Mel 62 (HLA A2.01 negativ) T2-Zellen: TAP-defiziente lymphoblastoide Zellen PBLs eines gesunden, HLA A2.01 positiven Spenders Testkomponenten: Mel 62, Mel 29 Zellen:
Untransduziert oder mit B7.2/GM-CSF-transduziert
Versuchsziel: Induktion einer Immunantwort gegen Peptidepitope von bekannten Tumorantigenen in einer Versuchsanordnung mit und ohne Übereinstimmung der MHC-Haplotypen („match" oder „mismatched") zwischen Melanomzelllinien und PBLs.
Design: 2,5 x 106 Mel 29 bzw. Mel 62 Zellen wurden mit 5 x 106 allogenen HLA-A2.01 positiven PBLs (somit „match") in T25 Zellkulturflaschen für 7 Tage bei 37°C inkubiert. Die darin befindlichen T-Zellen wurden über einen Zeitraum von 2 Wochen mit 2,5 x 106 T2-Zellen, die wöchentlich mit HLA A2.01 bindenden Melanomantigen-Peptiden (MART-1: AAGIGILTV, gplOO: YLEPGPVTA, Tyrosinase: YMDGTMSQV) beladen worden waren, restimuliert. Die T2-stimulierten T-Zellen wurden anschließend bezüglich ihrer spezifischen Reaktivität analysiert. Hierfür wurden sie mit 104 T2-Zellen, die für 6 Stunden mit Tumorantigenen beladen worden waren [(entweder mit einem Peptidpool bestehend aus HLA A2 bindenden Melano- mantigenen Peptiden oder aus Kontrollpeptiden (HIV -RT (?) HLA A2 bindende Peptide mit der Sequenz ILKEPVHGV)] inkubiert. Abschließend wurde die IFNγ- Produktion durch antikörpervermitteltes, intrazelluläres Anfärben und anschließende Durchflusszytometrie gemessen.
Ergebnisse
Melanomzellen, die mit rAAV-B7.2 transduziert worden waren, induzierten mit höherer Effizienz als nicht-transduzierte Zellen die Aktivierung von T-Zelllinien (Mel29 und Mel62), die spezifisch bekannte Peptidepitope von bekannten Melanomantigen erkannten (siehe Fig. 6). In weiteren Versuchen konnte durch Kontroll-Vektoren gezeigt werden, dass dieser Effekt von der B7.2-Expression abhän- gig war.
Die hier getesteten Antigene umfassten Marti /MelanA, gplOO und Tyrosinase (gemeinsam im Peptid Pool). Die Spezifizität für diese vom Melanom abgeleiteten Antigene wurde durch einen Vergleich zu einem KontroUpeptid, abgeleitet von HIV-gpl20, nachgewiesen. Ansteigende Mengen von spezifischen T-Zellen wurden beobachtet, wenn man entweder eine HLA-A2 matched allogene Stimulation (mit Mel29, linkes Diagramm der Fig. 6) oder eine HLA mismatched Stimulation (Mel62, rechtes Diagramm der Fig. 6) der T-Zellen durchfuhrt.
In diesem experimentellen System ist das antigen-wirkende Signal von endogen exprimierten Tumorantigenen einer Melanomzelle (Stimulatorzelle) abgeleitet, die durch MHC Moleküle auf der Zelloberfläche präsentiert werden. In der HLA-A2 „matched" Situation stammen die T-Zellen ebenfalls aus einem HLA-A2- positiven Spender und somit erkennt der T-Zell-Rezeptor der T-Zellen das antigene Peptid direkt durch das Präsentieren des Antigens durch ein entsprechendes MHC Molekül, das der Stimulationszelle und dem Spender der T-Zellen gemeinsam ist.
Die überraschende Tatsache, dass in der „mismatch" Situation eine vergleichbare Aktivierung der T-Zellen zu beobachten ist, sowie dass T-Zellen und Stimulator- zellen keine gemeinsamen MHC-Moleküle besitzen, führt zu dem Schluss, dass die Aktivierung der T-Zellen indirekt zu erfolgen hat. Dies muss der Fall sein, da in der mismatch Situation die T-Zellen nicht in der Lage sind, die durch die MHC-Moleküle der Stimulatorzelle präsentierten Antigene direkt zu erkennen. Diese indirekte Aktivierung ist vermutlich abhängig von der Präsentation der Melanomantigene durch induzierte Dendritische Zellen (auch Cross-Priming genannt).
Somit konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass spezifische MHC restringierte T-Lymphozyten durch direkten Kontakt zwischen T-Zellen und Me- lanom-Zellen, die B7.2 exprimieren, mittels indirektem Cross-Priming durch Antigen-präsentierende Zellen (APC) induziert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Tumorzelle zur Herstellung einer Vakzine für die Behandlung oder Vorbeugung eines Tumors in einem Patienten,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Tumorzelle ein costimulatorisches Polypeptid exprimiert und dass die Tumorzelle und der Patient keine Übereinstimmung ihrer MHC- Moleküle aufweisen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das costimulatorisches Polypeptid ausgewählt ist aus der Grappe bestehend aus B7.1, B7.2, LIGHT, CD40L, Ox40, 4.1.BB, Icos L, SLAM, ICAM 1, LFA-3, B7.3, CD70, HSA, CD84, CD7, B7 RP-1 L, MAdCAM-1,
VCAM-1, CS-1, CD82, CD30, CD120a, CD120b und TNFR-RP, CD40L.
3. Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Patient mindestens einen Tumor aufweist oder vor einem Tumor ge- schützt werden soll, der von demselben Typ wie derjenige ist, von dem die
Tumorzelle abstammt.
4. Verwendung nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle von einem Primärtumor oder einer Metastase abstammt.
5. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle von einem Tumor ausgewählt aus der Grappe bestehend aus Melanom, Mammakarzinom, Colonkarzinom Ovarialkarzinom, Lym- phom, Leukämie, Prostatakarzinom, Lungenkarzinom, Bronchialkarzinom oder Pankreaskarzinom abstammt.
6. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle mindestens ein für den jeweiligen Tumor charakteristischen Tumorantigen exprimiert.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Tumorantigen ausgewählt ist aus der Grappe bestehend aus MART, Her2neu, MART, Her2neu, Tyrosinase, tyrosinase-related proteins (TRP), MARTl/MelanA, Ny-ESO-1, CEAl, CEA2, CEA3, α-feto Protein, MAGE X2, BAGE, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE7a, GAGE8, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A8,
MAGE A9, MAGE A10, MAGE All, MAGE A12, MAGE1, MAGE2, MAGE3, MAGE3b, MAGE4a, MAGE4b, MAGE5, MAGE5a, MAGE5b, MAGE6, MAGE7, MAGE8, MAGE9, PAGE1, PAGE4, CAMEL, PRAME, LAGEl, gplOO, Her2neu, ras, p53, E6, E7 sowie SV40 large und small T-Antigen.
8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle von einem Melanom abstammt und dass das Tumorantigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tyrosinase, MARTl/MelanA, Ny- ESO- 1 , MAGE3 und gp 100.
9. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch kennzeichnet, dass die Tumorzelle mindestens ein Cytokin und/oder ein Chemokin exprimiert, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GM-CSF, G-CSF, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14,
IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IFN , IFNß, IFNγ, Flt3 L, Flt3, TNFα, RANTES, MlPlα, MlPlß, MlPlγ, MlPlδ, MIP2, MIP2α, MIP2ß, MIP3 , MIP3ß, MIP4, MIP5, MCP1, MCPlß, MCP2, MCP3, MCP4, MCP5, MCP6, 6cykine, Dcckl und DCDF, besonders bevorzugt GM-CSF, RANTES und MlPlα.
10. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle B7.2 und GM-CSF exprimiert.
11. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle einen oder mehrere Vektor/Vektoren enthält, der/die die
Expression eines oder mehrerer der in den Ansprüchen 1 bis 10 definierten Polypeptide bewirkt/bewirken.
12. Verwendung nach Ansprach 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor Nukleinsäuresequenzen umfasst, die für die in den Ansprüchen 1 bis 10 definierten Polypeptide kodieren.
13. Verwendung nach den Ansprüchen 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor nicht-viralen oder viralen Ursprungs, vorzugsweise ab- stammend von AAV, HSV, Retroviras, Lentiviras, Adenovirus, SV40, ist.
14. Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor episomal oder in das Genom der Zelle integriert vorliegt.
15. Verwendung nach den Ansprüchen 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor von AAV abstammt.
16. Verwendung nach Ansprach 15, dadurch gekennzeichnet, dass der AAV- Vektor als Konkatemer in der AAV Sl Akzeptorstelle integriert vorliegt.
17. Verwendung nach Ansprüchen 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression durch einen konstitutiven, induzierbaren und/oder gewebespezifischen, Promotor kontrolliert wird.
18. Nerwendung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle proliferationsinkompetent ist, beispielsweise durch Bestrahlung oder chemische Inaktivierung.
19. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel kein Adjuvans enthält.
20. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel ein Adjuvans, vorzugsweise CpG, enthält.
21. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel geeignete Additive und/oder Bindemittel enthält.
22. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Patient ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch ist.
23. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Vakzine eine Aktivierung der lytischen Aktivität von ΝK-Zellen bewirkt.
24. Verwendung einer ein costimulatorisches Polypeptid exprimierenden Tumorzelle zur Herstellung einer Vakzine zur Erhöhung der lytischen Aktivität von ΝK-Zellen bei der Behandlung oder Vorbeugung eines Tumors in einem zur Tumorzelle allogenen Patienten.
25. Verwendung nach Ansprach 24, dadurch gekennzeichnet, dass das costimulatorische Polypeptid wie in Ansprach 2 definiert ist.
26. Verwendung nach den Ansprüchen 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, der Patient mindestens einen Tumor aufweist oder vor einem Tumor ge- schützt werden soll, der von demselben Typ wie derjenige ist, von dem die Tumorzelle abstammt.
27. Verwendung nach den Ansprüchen 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumorzelle wie in den Ansprüchen 4 bis 18 definiert ist.
28. Verwendung nach den Ansprüchen 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel wie in den Ansprüchen 19 bis 21 ist.
29. Verwendung nach den Ansprüchen 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Patient ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch ist.
30. Verwendung nach den Ansprüchen 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass Patient und Tumorzelle in ihrem HLA-Typ teilweise übereinstimmen.
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