CN102533859A - 携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域。造血干细胞移植是治愈恶性血液疾病的唯一途径，但是造血干细胞移植过程中的并发症仍是导致患者死亡的重要因素，其中最突出的就是移植物抗宿主病(GVHD)。如何防治GVHD是造血干细胞移植面临的严峻挑战。本发明提供一种携带可诱导性共刺激分子(ICOS)基因的腺病毒载体及其构建方法，本发明的腺病毒载体转染间充质干细胞(MSCs)后利用可诱导性共刺激分子在T淋巴细胞活化过程中的作用与间充质干细胞在免疫调节过程中的作用相结合的方法，达到防治GVHD的目的。

Description

携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体及其构建方法，以及该腺病毒载体在制备预防和治疗移植物抗宿主疾病中的应用。

背景技术

基因治疗是指运用DNA转移来治疗或预防人类疾病，是在20世纪60年代随着多学科的发展而逐渐酝酿形成的。基因治疗最初是以治疗单基因遗传病为主，而今已广泛应用于肿瘤等疾病的治疗研究。基因治疗涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。在基因治疗过程中，正常基因如何导入靶细胞是能否实现治疗目的的关键。

基因治疗的途径有两类。一类是in vivo途径，即直接体内途径，把带有目的基因的重组表达载体直接导入患者体内有关的器官组织或细胞内以达到治疗目的。这种途径简便，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌注、皮下包埋等，但在技术上还不太成熟，转染效率往往较低，还存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题。另一类是ex vivo途径，即先体外后体内途径，先在体外将目的基因导入载体细胞，然后再把转基因的载体细胞回输给患者，载体细胞在体内表达目的基因达到治疗目的。这种途径在技术上比较成熟、安全、易控制，但步骤多、复杂。

基因转移的方法包括：物理方法，如电穿孔法、基因枪法等；化学方法，如脂质体法、磷酸钙共沉淀法等；生物学方法，主要指应用病毒载体介导的基因转移，这是目前基因治疗中应用最多的基因转移方法。目前比较常用的病毒载体是经过改造的无害病毒，如逆转录病毒、腺病毒(adenovirus，Ad)、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等，它们转移DNA非常有效，可以通过其特定机制把目的基因转移到细胞中，但各种病毒载体均有其各自的优缺点

腺病毒是呈二十面体对称的双链DNA(dsDNA)病毒。病毒颗粒具有252个壳粒，其中12个位于顶角的壳粒称五邻体，其余的称六邻体。每个顶角壳粒上有一条长度为10～30nm的纤维蛋白，纤维蛋白的抗原决定簇决定了病毒的种特异性和亚属特异性。腺病毒进入人体细胞进行复制，是以纤维蛋白的节区与细胞表面CAR相接触开始的。五邻体基底部含有5个Arg-Gly-Asp(RGD)序列，与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合，介导腺病毒的内移。腺病毒的吸附和内化是两个不同的过程，需要五邻体的纤毛和基体分别与其相应的受体结合。腺病毒通过内吞小泡通路进入细胞的方法可以避免被溶酶体降解，随着内吞小泡中的PH值降低，纤毛从病毒外壳脱落，紧接着五邻体基部也从外壳解开，整个病毒外壳崩解，腺病毒的DNA从溶解的内吞小泡释放到宿主细胞的核中，这个过程需时约40分钟。

腺病毒载体是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一，其使用率仅次于逆转录病毒载体。腺病毒具有如下优势：1、宿主范围宽广；2、转染效率高；3、可插入外源基因片段大，外源基因表达稳定；4、制备滴度高(病毒滴度可达到1012～1013pfu/ml)，易于纯化；5、既可感染分裂期细胞又可感染分裂后细胞；6、不整合到宿主染色体，无插入突变。但其也有不足之处：1、能引起宿主细胞免疫和体液免疫，使腺病毒及外源基因表达产物易被清除；2、不能充分感染某些具有临床重要性的细胞类型；3、不能专一杀伤靶细胞，特异性较低。

目前应用的第一代腺病毒载体(Ad 5型)是用目的基因及其增强子/启动子序列插入其E1区或E3区得到的复制缺陷型腺病毒载体，由含E1基因的人胚肾细胞293包装成重组腺病毒。人腺病毒已发现51种血清型，分为A、B、C、D、E、F六个亚群，Ad5属于C亚群，这类以CAR为受体的腺病毒存在如下问题：1、对靶细胞感染效率不高；2、在体内会引起严重毒副作用；3、人体内广泛存在5型腺病毒的中和抗体，导致病毒在体内很快被免疫系统清除；4、病毒对细胞的感染效率依赖于细胞表面CAR受体的表达水平，而造血系统细胞、骨骼肌细胞、干细胞、树突状细胞、原代肿瘤细胞等重要细胞表面CAR表达量很低。这些问题限制了Ad5的广泛应用。

造血干细胞移植是治愈恶性血液疾病的重要途径，但是造血干细胞移植过程中的并发症仍是导致患者死亡的重要因素，其中最突出的就是移植物抗宿主病(graft-versus-host disease GVHD)。如何防治GVHD是造血干细胞移植面临的严峻挑战。急性GVHD的病理过程主要分为三阶段：移植预处理引起宿主组织的炎症反应；宿主抗原递呈细胞激活供体T淋巴细胞，引起相应的细胞因子分泌；这些细胞因子激活末期炎症介质(TNF-α、IL-1)，联合细胞毒性T细胞和NK细胞毒性杀伤作用，攻击肝脏、皮肤、胃肠道等移植GVHD靶器官，出现相应GVHD表现。因此，供体来源的T淋巴细胞是引起GVHD的重要因素(Appelbaum F.R.Haematopoietic cell transplantation asimmunotherapy.Nature.2001；411：385-389)。

T细胞发挥效应，除了特异性抗原信号作用于T细胞受体外，还需要抗原提呈细胞(APC)提呈的共刺激信号激活，其中最主要的是CD28/CTLA4-B7、CD40L-CD40，但阻断这两个通路并不能避免移植排斥的发生。ICOS是T细胞上发现的可诱导性共刺激因子(Inducible Co-stimulator，ICOS)，其结构与CD28相似、基因位点相近，其配体为B7h(Jun li，Kenrick Semple，Woong-Kyung Suh，et al.Roles of CD 18，CTLA4 and Inducible Costimulator in AcuteGraft-versus-disease in mice.Biol Blood Marrow Transplant.2011；17：962-969)。ICOS表达在激活的CD4+和CD8+T细胞表面，主要功能为增强回忆增殖反应，以及使刚激活的T细胞产生细胞因子，如IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-α等，起着介导T细胞效应的功能。因此如果阻断ICOS-B7h的信号传导途径，即可抑制移植物中的T细胞活化以及相关细胞因子的生成，减轻GVHD的发生(Nanji SA，Hancock WW，Luo B，et al.Costimulation blockade of both inducible costimulatorand CD40 ligand induces dominant tolerance to islet allografts and preventsspontaneous autoimmune diabetes in the NOD mouse.Diabetes.2006；55：27-33.Chen Y，Liu H，Liu Z，et al.Blockade of inducible costimulator pathway to preventacute rejection in rat liver transplantation.Am J Surg.2009；198：244-249)。

目前尚未见有关携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体，本发明的另一目的是提供上述腺病毒载体的构建方法及其应用。

为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：

本发明提供一种腺病毒载体：本发明人发现腺病毒的组织嗜向性主要由其Fiber决定，因此将Ad5 Fiber的knob和Shaft替换为Ad11 Fiber的knob和shaft构建而成的嵌合型腺病毒载体Ad5/11仍具有Ad11的感染特性，能有效感染低表达CAR的细胞，对MSCs等干细胞有很高的感染效率，基因表达水平很高，且细胞毒性较低。本发明采用Ad5和Ad11嵌合型病毒载体，以提高对MSCs的感染效率。其携带的增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)作为报告基因可用于荧光显微镜观察，直接判断转染效率。并将mICOS基因插入上述的改造后的腺病毒载体。

引物合成方法：采用PCGENE软件中的PCRPLAN程序，设置各参数：最适Tm＝66，Tm允许范围50～80，引物长度15～25，G-C含量40％～60％，引物内互补最大值为3，3’端G-C添加为1，引物与模板其它位点同源最大值为60％。经过运算，获得较佳的引物序列，具体如下，并由基康基因公司合成。

mICOS基因的上游引物GT144：

5′CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3′(SEQ ID NO：1)

mICOS基因的下游引物GT145：

5′GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3′(SEQ ID NO：2)

mICOS基因的获得方法：合成GT144、GT145引物，pEGFP-N1-mICOS质粒行PCR扩增，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(QIAquickGel Extraction)回收大小为621bp的mICOS片段(SEQ ID NO：3)。

本发明提供了一种携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体，其构建方法如下：将腺病毒载体Ad5 Fiber的knob和Shaft替换为Ad11 Fiber的knob和shaft构建而成的嵌合型腺病毒载体Ad5/11，并携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，在嵌合型腺病毒载体Ad5右臂的E1区位置插入携带可诱导性共刺激分子基因(mICOS)。

所述的携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体，详细的构建方法如下：

1、PDC318-mICOS载体的构建：

a.引物合成：

mICOS基因的上游引物GT144：

5′CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3′

mICOS基因的下游引物GT145：

5′GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3′

b.mICOS基因的获得：pEGFP-N1-mICOS质粒行PCR扩增，引物为步骤a所获得的GT144、GT145，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收大小为621bp的mICOS片段。

c.mICOS基因获得后的酶切：将步骤b中所获得的mICOS片段于37℃水浴2小时后，用QIAquick柱回收，得到大小为621bp的mICOS目的片段。

d.PDC318载体的酶切：用EcoR I和Sal I酶切，37℃水浴4小时后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(MN Gel Extraction)回收大小为3895bp的DNA片段。

e.PDC318-mICOS的合成：将步骤c中所获得的mICOS目的基因片段与步骤d中所获得的PDC318载体进行连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP)后，37℃生化培养箱内培养10～12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名PDC318-mICOS。

2、Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒的重组及鉴定，其特征在于：将质粒PDC318-mICOS与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11B-EGFP通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞，mICOS基因被插入到腺病毒基因组的E1区。共转染后9～14天细胞出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定，经鉴定正确的腺病毒命名为Ad5/F11b-mICOS-EGFP，即携带mICOS基因的非增殖型腺病毒。

3、病毒的扩增、滴度测定及纯化，其特征在于，该方法的具体步骤为：

a.293细胞的培养

b.病毒的扩增，其特征在于：步骤3a中所培养细胞5×10⁶，取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入10％NCS/DMEM至1ml，混匀。移去培养液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃动3次，37℃、5％CO₂孵箱中培养120分钟，加入9ml 10％NCS/DMEM，再培养72小时，收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，用病毒保存溶液重悬细胞，-20℃至37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心20分钟去除细胞碎片，收集上清，反复扩增至需要病毒量。

c.50％组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。测得重组腺病毒滴度达到4.9×10⁹pfu/ml。

d.氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。病毒置于-80℃保存。

本发明还提供了上述的携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体在制备预防和治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)中的应用。

本发明人选择了骨髓间充质干细胞(MSCs)作为携带ICOS基因的载体细胞。MSCs是一种来源于骨髓基质的中胚层干细胞，也能从其他组织，如脂肪、视网膜、肝脏、内耳、胃上皮、羊水、胎盘、脐带、毛囊、牙齿中分离出来。MSCs具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，可以在体外被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞等，具有干细胞特性。它易于在体外培养扩增，细胞表面表达Sca-1、CD44、CD29、CD73、CD90、CD105、CD106，不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD19、CD79、CD31、HLA DR，其免疫表型普遍表现为MHC-I+、MHC-II-、CD40-、CD80-、CD86-，因此不具有免疫原性。这些优势使MSCs在基因治疗中具有较好的应用前景，是目前基因治疗中应用较广的载体细胞。选用MSCs作为载体细胞更为重要的原因是，国内外多数研究发现MSCs还具有很多特性：1、促进造血干细胞植入、加速造血重建；2、具有免疫调节作用，减轻GVHD；3、体内向炎症组织、受损伤的GVHD靶组织聚集，参与受损组织的修复。MSCs的这些特性不仅利于将携带的目的基因ICOS带到aGVHD受损的靶组织，增加目的基因在体内的靶向性，而且利于移植后小鼠造血恢复、预防aGVHD，实现了细胞治疗和基因治疗的完美结合。

体外实验证实MSCs作为靶细胞具有很高的基因转染效率及可以长期获得表达。体内实验证实，MSCs具有向受损伤组织归巢的特性。目前，已有很多研究将MSCs作为基因治疗的载体细胞，治疗某些缺陷性疾病、肿瘤和急性GVHD等。

本发明构建的携带ICOS基因的腺病毒载体，转染至小鼠骨髓来源、人骨髓来源、人脐带组织来源的间充质干细胞，形成MSC-ICOS细胞，具体技术方案如下：

1、Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染小鼠骨髓来源MSC

A、ICOS转染小鼠骨髓来源MSCs：

转染：将所培养小鼠骨髓来源MSCs细胞以1×10⁵/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全贴壁后，移去培养液，每孔加入0.5ml新鲜的DMEM完全培养基，取1ul、2ul、5ul、10ul、20ul、50ul Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒液分别加入各孔，十字形慢慢晃动混匀，37℃、5％CO₂培养箱中培养，4小时后更换新鲜的mMSCs维持培养基，继续培养。转染后不同时间点于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

B、转染后细胞生物学特性的鉴定：

每日在倒置显微镜下观察MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs的形态及生长状态，三种细胞形态无明显差异；三种细胞接种后每天计数细胞数，绘制三种细胞的生长曲线，生长曲线基本一致。

流式细胞仪检测MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs表面抗原表达，主要为：Sca-1、CD29、CD44、CD90.2、Flk-1、CD117、CD34、MHC-I、MHC-II类抗原。

三种细胞经成脂肪诱导培养基培养10～14天后，光镜下均呈现脂肪细胞形态，油红O染色均呈现橙红色脂滴；经成骨细胞培养10～14天后，光镜下均呈现多角形、不规则性、体积增大的细胞形态，AKP染色均见胞浆有深紫色沉淀。

2、Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染正常人骨髓来源MSC

A、ICOS转染人骨髓来源MSCs：

转染：将所培养人骨髓来源MSCs细胞以1×10⁴/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全贴壁后，移去培养液，每孔加入0.2ml新鲜的DMEM完全培养基，取0.1ul、0.2ul、0.5ul、1ul、1.5ul、2ul Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒液分别加入各孔，十字形慢慢晃动混匀，37℃、5％CO₂培养箱中培养，4小时后更换新鲜的MSCs维持培养基，继续培养。转染后不同时间点于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

B、转染后细胞生物学特性的鉴定：

每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，三种细胞形态无明显差异；三种细胞接种后每天计数细胞数，绘制三种细胞的生长曲线，生长曲线基本一致。

流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，主要为：Sca-1、CD29、CD44、CD90.2、Flk-1、CD117、CD34、MHC-I、MHC-II类抗原。

三种细胞经成脂肪诱导培养基培养10～14天后，光镜下均呈现脂肪细胞形态，油红O染色均呈现橙红色脂滴；经成骨细胞培养10～14天后，光镜下均呈现多角形、不规则性、体积增大的细胞形态，AKP染色均见胞浆有深紫色沉淀。

3、Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染人脐带组织来源MSC

A、ICOS转染人脐带组织来源MSCs：

转染：将所培养人脐带组织来源MSCs细胞以1×10⁴/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全贴壁后，移去培养液，每孔加入0.2ml新鲜的DMEM完全培养基，取0.1ul、0.2ul、0.5ul、1ul、1.5ul、2ul Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒液分别加入各孔，十字形慢慢晃动混匀，37℃、5％CO₂培养箱中培养，4小时后更换新鲜的MSCs维持培养基，继续培养。转染后不同时间点于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

B、转染后细胞生物学特性的鉴定：

每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，三种细胞形态无明显差异；三种细胞接种后每天计数细胞数，绘制三种细胞的生长曲线，生长曲线基本一致。

流式细胞仪检测细胞表面抗原表达，主要为：Sca-1、CD29、CD44、CD90.2、Flk-1、CD117、CD34、MHC-I、MHC-II类抗原。

三种细胞经成脂肪诱导培养基培养10～14天后，光镜下均呈现脂肪细胞形态，油红O染色均呈现橙红色脂滴；经成骨细胞培养10～14天后，光镜下均呈现多角形、不规则性、体积增大的细胞形态，AKP染色均见胞浆有深紫色沉淀。

本发明构建了携带ICOS基因的腺病毒载体，并且可以高效稳定的转染至小鼠骨髓来源、人骨髓来源、人脐带组织来源的间充质干细胞，形成MSC-ICOS细胞，再将MSC-ICOS细胞输入急性GVHD模型小鼠体内，通过mMSCs表达ICOS，竞争性结合抗原递呈细胞(单核巨噬细胞及B淋巴细胞、DC等)上的B7h配体，阻断ICOS/B7h通路，减弱或移植T淋巴细胞活性，起到减轻急性GVHD的作用。这种基因治疗的方法属于ex vivo途径，比较安全。

本发明利用可诱导性共刺激分子在T淋巴细胞活化过程中的作用与间充质干细胞在免疫调节过程中的作用相结合的方法，达到防治移植物抗宿主病(GVHD)的目的，最终为临床疾病的治疗提供依据。

附图说明

图1是PDC318-mICOS载体构建流程示意图

图2是PDC318双酶切回收图

图3是mICOS PCR电泳图

图4是PDC318-mICOS酶切鉴定图

图5是PCR鉴定Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒DNA包含mICOS基因

图6是PCR鉴定Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒DNA包含Ad11的fiber

图7是PCR鉴定Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒中无野病毒存在

图8是流式检测mMSC-ICOS(A)、mMSC-EGFP(B)上mICOS、EGFP表达率

图9是mMSC-ICOS、mMSC-EGFP和mMSCs的生长曲线

图10是人骨髓MSC(A)、人脐带组织MSC(B)转染后流式检测mICOS、EGFP表达率。

图11是体外混合淋巴细胞反应实验证实转染后的MSC-ICOS可抑制T淋巴细胞增殖

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

腺病毒载体pXC1：加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司

腺病毒载体PDC318：上海医元生物基因科技发展有限公司构建

人血清5型腺病毒(WAd5)：上海医元生物基因科技发展有限公司保存

腺病毒载体PSUCMV：上海医元生物基因科技发展有限公司构建

pEGFPN1-ICOS质粒：上海基康基因公司合成

实施例1：携带mICOS基因的非增殖型腺病毒Ad5/F11b-mICOS-EGFP的构建。

1、PDC318-mICOS载体的构建：采用PCGENE软件中的PCRPLAN程序，设置各参数：最适Tm＝66，Tm允许范围50～80，引物长度15～25，G-C含量40％～60％，引物内互补最大值为3，3’端G-C添加为1，引物与模板其它位点同源最大值为60％。经过运算，获得较佳的引物序列GT144和GT145。

mICOS基因的上游引物GT144：

5′CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3′(SEQ ID NO：1)

mICOS基因的下游引物GT145：

5′GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3′(SEQ ID NO：2)

2、mICOS目的基因的获得：pEGFP-N1-mICOS质粒行PCR扩增，引物为GT144、GT145，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收大小为621bp的mICOS片段。将mICOS片段于37℃水浴2小时后，用QIAquick柱回收，得到大小为621bp的mICOS目的片段，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，上海基康基因公司测序正确。

mICOS：

GAATTC

ATGAAGCCGTACTTCTGCCATGTCTTTGTCTTCTGCTTCCTAATCAGACTTTTAACAGGAGAAATCAATGGCTCGGCCGATCATAGGATGTTTTCATTTCACAATGGAGGTGTACAGATTTCTTGTAAATACCCTGAGACTGTCCAGCAGTTAAAAATGCGATTGTTCAGAGAGAGAGAAGTCCTCTGCGAACTCACCAAGACCAAGGGAAGCGGAAATGCGGTGTCCATCAAGAATCCAATGCTCTGTCTATATCATCTGTCAAACAACAGCGTCTCTTTTTTCCTAAACAACCCAGACAGCTCCCAGGGAAGCTATTACTTCTGCAGCCTGTCCATTTTTGACCCACCTCCTTTTCAAGAAAGGAACCTTAGTGGAGGATATTTGCATATTTATGAATCCCAGCTCTGCTGCCAGCTGAAGCTCTGGCTACCCGTAGGGTGTGCAGCTTTCGTTGTGGTACTCCTTTTTGGATGCATACTTATCATCTGGTTTTCAAAAAAGAAATACGGATCCAGTGTGCATGACCCTAATAGTGAATACATGTTCATGGCGGCAGTCAACACAAACAAAAAGTCTAGACTTGCAGGTGTGACCTCATAAGTCGAC

(注：下划线标注的碱基为酶切位点；加框的为保护碱基。)

3、PDC318载体的酶切：用EcoR I和Sal I酶切，37℃水浴4小时后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(MN Gel Extraction)回收大小为3895bp的DNA片段，上海基康基因公司测序正确。

4、PDC318-mICOS的形成：将mICOS目的基因片段与PDC318载体进行连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP)后，37℃生化培养箱内培养10～12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名PDC318-mICOS。

图1、2、3和4表示PDC318-mICOS的形成过程，通过此方法为下一步腺病毒的构建做准备。

实施例2：Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒的重组及鉴定。

1、将质粒PDC318-mICOS与含有5型腺病毒右臂的质粒

pPE3-F11B-EGFP通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞，mICOS基因被插入到腺病毒基因组的E1区。共转染后9～14天细胞出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定，经鉴定正确的腺病毒命名为Ad5/F11b-mICOS-EGFP，即携带mICOS基因的非增殖型腺病毒。

2、病毒的扩增、滴度测定及纯化：

(1)293细胞的复苏及传代培养：将冻存的293细胞在37℃水浴轻轻晃动融化后，加入10mL10％FBS/DMEM，1000×g离心5分钟，弃去上清。将细胞用10mL 10％FBS/DMEM重悬，轻轻打匀，转入75cm2培养瓶中，在5％CO₂孵箱中37℃培养。将复苏培养的293细胞胰酶消化2分钟使贴壁细胞脱落，倒置显微镜下观察细胞变圆、脱落，离心，培养液重悬细胞，以1∶3～5分瓶培养。

(2)取所培养细胞5×10⁶，取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入10％NCS/DMEM至1ml，混匀。移去培养液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃动3次，37℃、5％CO₂孵箱中培养120分钟，加入9ml 10％NCS/DMEM，再培养72小时，收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，用病毒保存溶液重悬细胞，-20℃至37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心20分钟去除细胞碎片，收集上清，反复扩增至需要病毒量。

(3)50％组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度：收集步骤3-a所得293细胞，计数，用2％NCS/DMEM准备10⁵/ml细胞共20ml。96孔板中每孔加入100ul细胞悬液，准备稀释病毒液。第1管中加入0.9ml 2％NCS/DMEM，其余7管各加入1.8ml 2％NCS/DMEM，第1管中再加入0.1ml病毒保存液，上下吸打5次混匀。从第1管中吸取0.2ml加入第2管中，反复稀释至最高稀释度，最终形成8个不同稀释度的稀释液。加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照，37℃培养10天。10天后，倒置显微镜下观察，计算每一排中出现细胞病变效应(CPE)的孔数，Karbers公式计算病毒滴度。测得重组腺病毒滴度达到4.9×10⁹pfu/ml。

(4)氯化铯密度梯度离心法纯化病毒：50ml离心管4℃，12500g，离心30分钟，取上清，弃沉淀。每1ml上清加入1ml20％PEG8000/2.5M NaCl，混匀，冰浴1小时，4℃，12500g，离心30分钟。弃上清，沉淀充分重悬于5ml CsCl(1.1g/ml)，4℃，8000g，离心5分钟。取上清，在超速离心管中缓慢加入2mlCsCl(1.4g/ml)，非常小心轻轻顺管壁加入另一层3ml CsCl(1.3g/ml)，沿管壁小心加满病毒颗粒，约5ml上清(1.1g/ml)。平衡离心管，4℃，60,000g离心2小时，取出离心管，固定于离心管架上，用5ml注射器，18G针头，在病毒层的最低点刺破管壁，在CsCl(1.3g/ml)和CsCl(1.4g/ml)交界处吸出病毒颗粒层。病毒层溶液转移到一个无菌的容器，4℃，透析过夜。病毒置于-80℃保存。

图5、6和7表示携带ICOS基因的腺病毒载体Ad5/F11b-mICOS-EGFP构建成功，能有效感染低表达CAR的细胞，对MSCs等干细胞有很高的感染效率，基因表达水平很高，且细胞毒性较低。本实验采用Ad5和Ad11嵌合型病毒载体，以提高对MSCs的感染效率。其携带的增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreen fluorescent protein，EGFP)作为报告基因可用于荧光显微镜观察，直接判断转染效率。

实施例3：Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染小鼠骨髓来源MSC。

(1)MSC细胞传代：吸弃培养液，2ml PBS洗涤两遍，加入适量0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化细胞，倒置显微镜下见大多数细胞变圆、脱落后，加入两倍体积的培养液中和胰酶，低速离心后弃上清，新鲜mMSCs维持培养基重悬后接种于培养皿。

(2)将细胞以1×10⁵/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全贴壁后，移去培养液，每孔加入0.5ml新鲜的DMEM完全培养基，取1ul、2ul、5ul、10ul、20ul、50ul Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒液分别加入各孔，十字形慢慢晃动混匀，37℃、5％CO₂培养箱中培养，4小时后更换新鲜的mMSCs维持培养基，继续培养。转染后不同时间点于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。发现转染后6小时即有绿色荧光蛋白表达，8～14小时达高峰，Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染MSCs的最佳MOI＝1000。收集细胞，用anti-mICOS-PE孵育后，流式细胞仪检测MSCs-ICOS上mICOS表达率为90.16％，同法获得Ad5/F11b-EGFP转染MSCs的最佳MOI＝1200，EGFP表达率为57.18％。

图8表示构建含ICOS的腺病毒载体可稳定高效转染MSC，形成MSC-ICOS细胞群。

实施例4：转染后细胞生物学特性的鉴定。

(1)每日在倒置显微镜下观察MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs的形态及生长状态，分别取mMSCs、mMSC-ICOS和mMSC-EGFP，以5000/孔的密度接种于24孔板，每孔加1ml维持培养基，置37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的培养箱中培养，依次于培养第1天至第8天分别消化3复孔细胞，取3孔细胞数均值与标准差绘制三种细胞的生长曲线。结果见表1及图9。

表1mMSC-ICOS、mMSC-EGFP和mMSCs体外扩增计数(×10³)

根据表1的结果可以得出：三种细胞生长曲线基本一致，提示腺病毒载体转染mMSCs后不改变mMSCs的生长特性。

(2)流式细胞仪检测MSCs-ICOS、MSCs-EGFP和MSCs表面抗原表达，收集mMSCs，以0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化收获细胞，PBS洗涤后制成1.0×10⁶/ml的单细胞悬液，每个流式管取0.1ml，分别加入荧光标记抗体CD29-PE、CD44-PE、CD90.2-PE、CD117-PE、Sca-1-PE、FLK-1-PE、MHC-II-PE、CD45-PE/Cy5、CD34-PE、MHC-I-PE、mICOS-PE，室温避光孵育30分钟，PBS洗去未标记抗体，加入200ul PBS重悬细胞，设阴性对照组，流式细胞仪检测表面标记。同法标记mMSC-ICOS和mMSC-EGFP，流式细胞仪检测表面标记。结果见表2。

表2mMSC-ICOS、mMSC-EGFP和mMSCs流式检测表面抗原

*表达EGFP的细胞上某种检测分子的阳性率

#所有细胞上某种检测分子的阳性率

根据表2的结果可以得出：三种细胞均高表达Sca-1、CD29、CD44，中度表达CD90.2、Flk-1，不表达或低表达CD117、CD34、MHC-I、MHC-II类抗原。三种细胞表面标志的流式检测结果无显著差异，提示腺病毒载体转染mMSCs后不改变mMSCs的免疫表型。

(3)三种细胞经成脂肪诱导培养基培养：取mMSCs、以1×10⁴/cm²的密度接种于6孔板中，待细胞生长融合达70～80％后更换脂肪细胞诱导培养基(DMEM-LG、10％FBS，10ug/mL牛胰岛素、0.25uM地塞米松、0.5mMIBXM、50uM吲哚美辛、100IU/ml青霉素100ug/mL链霉素、4mM L-谷氨酰胺)，每3～4天换液，10～14天后鉴定。油红O染色鉴定：吸出细胞培养上清，PBS洗涤，室温下10％甲醛固定10分钟，加入油红O染液中孵育30分钟，60％异丙醇洗去多余染液，蒸馏水清洗，光镜观察。

实验结果：光镜下均呈现脂肪细胞形态，油红O染色均呈现橙红色脂滴。(4)三种细胞经成骨诱导培养基培养：取mMSCs以1×10⁴/cm2的密度接种于6孔板中，待细胞生长融合达70～80％后分别更换成骨细胞诱导培养基(DMEM-LG、5％FBS、0.25uM地塞米松、0.2mM维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠、100IU/ml青霉素100ug/mL链霉素)，每3～4天换液，10～14天后鉴定。AKP(碱性磷酸酶)检测：原理：偶氮耦联染色法，磷酸根与偶氮盐偶合，形成紫色沉淀。步骤：吸出细胞培养上清，去离子水冲洗，晾干；配置新鲜工作液，将二甲基甲酰溶解底物倒入缓冲液中，再加入固紫B混匀；加入工作液，置37℃，45分钟，去离子水清洗3次；1％苏木素复染3分钟，去离子水清洗，干燥，光镜观察。

实验结果：经成骨细胞培养10～14天后，光镜下均呈现多角形、不规则性、体积增大的细胞形态，AKP染色均见胞浆有深紫色沉淀。

实施例5：Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染人骨髓来源MSC。

(1)MSC细胞传代：吸弃培养液，2ml PBS洗涤两遍，加入适量0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化细胞，倒置显微镜下见大多数细胞变圆、脱落后，加入两倍体积的培养液中和胰酶，低速离心后弃上清，新鲜mMSCs维持培养基重悬后接种于培养皿。

(2)以1×10⁴/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全贴壁后，移去培养液，每孔加入0.2ml新鲜的DMEM完全培养基，取0.1ul、0.2ul、0.5ul、1ul、1.5ul、2ul Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒液分别加入各孔，十字形慢慢晃动混匀，37℃、5％CO₂培养箱中培养，4小时后更换新鲜的MSCs维持培养基，继续培养。转染后不同时间点于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。发现转染后5小时即有绿色荧光蛋白表达，6～18小时持续高峰状态，Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染MSCs的最佳MOI＝750。收集细胞，用anti-mICOS-PE孵育后，流式细胞仪检测MSCs-ICOS上mICOS表达率为95.19％。同法获得Ad5/F11b-EGFP转染MSCs的最佳MOI＝900，EGFP表达率为99.91％。

实施例6：Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染人脐血来源MSC。

 (1)MSC细胞传代：吸弃培养液，2ml PBS洗涤两遍，加入适量0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化细胞，倒置显微镜下见大多数细胞变圆、脱落后，加入两倍体积的培养液中和胰酶，低速离心后弃上清，新鲜mMSCs维持培养基重悬后接种于培养皿。

(2)将细胞以1×10⁴/孔的密度接种于24孔板中，待细胞完全贴壁后，移去培养液，每孔加入0.2ml新鲜的DMEM完全培养基，取0.1ul、0.2ul、0.5ul、1ul、1.5ul、2ul Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒液分别加入各孔，十字形慢慢晃动混匀，37℃、5％CO₂培养箱中培养，4小时后更换新鲜的MSCs维持培养基，继续培养。转染后不同时间点于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。发现转染后5小时即有绿色荧光蛋白表达，6～18小时持续高峰状态，Ad5/F11b-mICOS-EGFP转染MSCs的最佳MOI＝500。收集细胞，用anti-mICOS-PE孵育后，流式细胞仪检测MSCs-ICOS上mICOS表达率为99.46％。同法获得Ad5/F11b-EGFP转染MSCs的最佳MOI＝750，EGFP表达率为92.24％。

图10示所构建的腺病毒载体亦可高效稳定的转染至人脐带组织来源MSC，这可以为临床采用MSC-ICOS作为GVHD的干预措施提供实验基础。

实施例7：体外混合淋巴细胞反应实验证实转染后的MSC-ICOS可抑制T淋巴细胞增殖

(1)刺激细胞获取：BALB/C雌性小鼠骨髓来源树突状细胞的培养：PBS冲洗小鼠股骨、胫骨内骨髓细胞，无菌裂红液处理，PBS洗涤两遍，洗涤后的细胞用含10％FCS，10ng/ml GM-CSF，1ng/ml mIL-4的RPMI1640培养基悬液，分至六孔板内培养，48小时后去除悬浮细胞，仅保留疏松贴壁细胞，加入新鲜的培养基培养5-6天即可。最后4小时加入丝裂霉素(5ug/ml)孵育。

(2)反应细胞获取：C57BL/6雄性小鼠脾脏CD4+T细胞获取：取小鼠脾脏碾磨，细胞悬液使用CD4+磁珠进行分选，所获细胞流式检测CD4+细胞比例为98％至99％。

(3)混合细胞反应：将刺激细胞、反应细胞及MSC-ICOS共同放置于培养皿中，细胞比例为1∶10∶0.5。共同培养48小时后，CCK-8法检测CD4+T淋巴细胞增殖情况。

图11示MSC-ICOS干预下CD4+T细胞增殖显著受抑制。表明MSC-ICOS干预可减弱或移植CD4+T淋巴细胞增殖活性，从而改善GVHD表现，为临床采用MSC-ICOS作为GVHD的干预措施提供实验基础。

上述实验例结果表明：构建携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体，并将其高效稳定转染小鼠骨髓来源间充质干细胞后并不影响其细胞原有生物学特性，并且该腺病毒载体也可高效稳定转染人骨髓来源、人脐带组织来源间充质干细胞，为进一步利用MSC-ICOS作为干预措施防止GVHD提供可靠的实验依据。

Claims (6)

1.一种携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体，其特征在于，先将腺病毒载体Ad5 Fiber的knob和Shaft替换为Ad11 Fiber的knob和shaft构建而成的嵌合型腺病毒载体，并携带增强型绿色荧光蛋白，再在嵌合型腺病毒载体Ad5右臂的E1区位置插入如SEQ ID NO：3所示的mICOS基因。

2.一种如权利要求1所述的携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：先将腺病毒载体Ad5 Fiber的knob和Shaft替换为Ad11 Fiber的knob和shaft构建而成的嵌合型腺病毒载体，并携带增强型绿色荧光蛋白，再在嵌合型腺病毒载体Ad5右臂的E1区位置插入如SEQ ID NO：3所示的mICOS基因。

3.根据权利要求2所述的携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体的构建方法，其特征在于，其中的mICOS基因的获得方法如下：

合成如SEQ ID NO：1或2所示的引物，pEGFP-N1-mICOS质粒行PCR扩增，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收如SEQ ID NO：3所示的mICOS基因片段。

4.根据权利要求3所述的携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体的构建方法，其特征在于，该腺病毒载体的构建方法如下：

A、PDC318-mICOS载体的构建

a.合成引物：

mICOS基因的上游引物GT144：

5′CCG GAA TT CAC CAT GAA GCC GTA CTT C 3′

mICOS基因的下游引物GT145：

5′GCG TCG ACT TAT CAG GGG CTG TTG GTG 3′

b.mICOS基因的获得：pEGFP-N1-mICOS质粒行PCR扩增，引物为步骤a所获得的GT144、GT145，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收大小为621bp的mICOS片段；

c.mICOS基因获得后的酶切：将步骤b中所获得的mICOS片段于37℃水浴2小时后，用QIAquick柱回收，得到大小为621bp的mICOS目的片段；

d.PDC318载体的酶切：用EcoR I和Sal I酶切，37℃水浴4小时后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收大小为3895bp的DNA片段；

e.PDC318-mICOS的合成：将步骤c中所获得的mICOS目的基因片段与步骤d中所获得的PDC318载体进行连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，铺含AMP琼脂板后，37℃生化培养箱内培养10～12小时；挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12小时；抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名PDC318-mICOS；

B、Ad5/F11b-mICOS-EGFP病毒的重组及鉴定

将质粒PDC318-mICOS与含有Ad5腺病毒右臂的质粒pPE3-F11B-EGFP通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞，mICOS基因被插入到腺病毒基因组的E1区；共转染后9～14天细胞出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，应用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，进行PCR鉴定，经鉴定正确的腺病毒命名为Ad5/F11b-mICOS-EGFP。

5.一种如权利要求1所述的携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体在制备预防和治疗移植物抗宿主疾病中的应用。

6.根据权利要求5所述的携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体在制备预防和治疗移植物抗宿主疾病中的应用，是将携带可诱导性共刺激分子基因的腺病毒载体转染至小鼠骨髓来源、人骨髓来源、人脐带组织来源的间充质干细胞，形成MSC-ICOS细胞。

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